ヒト肺がんの４病態を分類するためのＤＮＡプローブ・セット
【課題】本発明は、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイを提供することを目的とする。
【解決手段】配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイを用いることによって、ヒト肺がんを特定することはもちろんのこと、その４病態を識別してこれを特定することができる。本発明のＤＮＡプローブ・セットは、従来以上に小型化されたＤＮＡマイクロアレイの作製を可能にすることによって、安価で高性能なヒト肺がんの分子診断システムの構築を実現する。
【解決手段】配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイを用いることによって、ヒト肺がんを特定することはもちろんのこと、その４病態を識別してこれを特定することができる。本発明のＤＮＡプローブ・セットは、従来以上に小型化されたＤＮＡマイクロアレイの作製を可能にすることによって、安価で高性能なヒト肺がんの分子診断システムの構築を実現する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットに関し、より詳細には、ヒト肺がんの４病態を分類するためのＤＮＡプローブ・セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、肺がんは、その腫瘍細胞の大きさという病理形態学的診断基準から、小細胞がんまたは非小細胞がんの主な２つの型に分類され、非小細胞がんは、さらに、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんに分類される。従来、肺がんの型を特定する診断においては、手術で摘出した臓器や組織を固定液などで固定して包埋し、適宜の大きさに切り出して作製した顕微鏡標本を病理医が細胞病理組織診断することによって行われていた。
【０００３】
しかしながら、このような細胞病理組織診断には一般に時間がかかり、またそれを正確に行うには経験を要することに加え、その判断に診断を行う病理医の主観が入るという問題があった。そこで、診断者を選ばず、且つ、精度の高い客観的な診断を実現すべく、ヒト肺がんの型の特定診断においてゲノム研究の成果を取り入れた分子診断法の適用が求められていた。ここで、がんの分子診断法とは、がん細胞で特異的に変化する遺伝子発現をマーカーとして、その分子マーカーの変化を定量的に計測することでがん細胞の存在を特定する方法をいう。がんの分子診断法を実現するシステムとして、たとえば、Affymetrix社から１６００遺伝子を搭載したがん関連のカスタム・ＤＮＡマイクロアレイと自動測定システムが提供されているが、この製品は、大集積のＤＮＡマイクロアレイであって非常に高価であり、また、肺がんに特化されたものではなかった。なお、非特許文献１〜７は、ヒト肺がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する知見を開示する。
【非特許文献１】Bhattacharjee A et al ,Proc Natl Acad Sci [2001] 98(24):13790-13795
【非特許文献２】Garber ME et al ,Proc Natl Acad Sci [2001] 98(24):13784-13789
【非特許文献３】Beer DG et al ,Nat Med. [2002] 8(8):816-824、Giordano TJ et al ,Am J Pathol. [2001] 159(4):1231-1238
【非特許文献４】Giordano TJ et al ,Am J Pathol. [2001] 159(4):1231-1238
【非特許文献５】Nacht M et al ,Proc Natl Acad Sci [2001] 98(26):15203-15208
【非特許文献６】McDoniels-Silvers AL etal ,Clin Cancer Res. [2002] 8(4):1127-1138
【非特許文献７】Virtanen C et al ,Proc Natl Acad Sci [2002] 99(19):12357-12362
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、本発明は、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ヒト肺がんの型の特定診断に対し分子診断法の適用を試みるうえで、ＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットであって、ヒト肺がんを特定することができるＤＮＡプローブ・セットにつき鋭意検討した。その結果、精選された８０のマーカー遺伝子由来のＤＮＡプローブからなるセットであって、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群を用いることによって、ヒト肺がんを特定することはもちろんのこと、その４病態を識別してこれを特定することができることを発見し、本発明に至ったのである。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、添付する表２〜５に示した配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セットが提供される。また、発明によれば、上記ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。本発明においては、前記ＤＮＡプローブ・セットを２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのエリアに搭載することができる。さらに、本発明によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを含み、蛍光強度の直線的測定レンジが３桁であることを特徴とする、ヒト肺がん用分子診断システムが提供される。
【０００７】
本発明に別の構成によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号２９、配列番号１３、配列番号５０、配列番号５６、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が腺がんであるか否かを判断する方法が提供される。また、本発明によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、配列番号３６、配列番号５３、配列番号５６、配列番号６９、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が扁平上皮がんであるか否かを判断する方法が提供される。さらに、本発明によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、配列番号１９、配列番号３０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５３、および配列番号５６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が大細胞がんであるか否かを判断する方法が提供される。さらに加えて、本発明によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、配列番号１７、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７１、および配列番号８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が小細胞がんであるか否かを判断する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
上述したように、本発明によれば、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を実施の形態をもって説明するが、本発明は、以下に示す実施の形態に限定されるものではない。本発明者らは、本発明のヒト肺がんの４病態を分類するためのＤＮＡプローブ・セットの設計に際し、ヒト肺がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する先に挙げた論文７報（非特許文献１〜７）に掲載されたマーカー遺伝子について、ヒト肺がんの４病態に対する発現の特異性とその発現量などに鑑みて精査した結果、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、および小細胞がんのそれぞれについて２０ずつ、合計８０のマーカー遺伝子を抽出した。
【００１０】
次に、National Center for Biotechnology Information（NCBI）とEnsembl に登録されているＤＮＡデータベースを参照して、上述した８０のマーカー遺伝子のそれぞれについて、45 ±2 merのオリゴヌクレオチド・シーケンスを抽出した。オリゴヌクレオチド・シーケンスの抽出は、（１）5′末端および3′末端が、ＧまたはＣであること、（２）ＧＣ含有率が４５〜６０％であること、（３）融解温度（Ｔｍ）が６３〜７４°であること、（４）Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）の各塩基が偏在しないこと、（５）NCBIの検索ソフトウェアであるBLASTを用いた検索で、他の遺伝子において部分配列として含まれていないこと、の５つの条件を満たすものについてこれを選択して行った。
【００１１】
添付する表２〜５に、上述した手順で抽出した、本発明のＤＮＡプローブ・セットとして用いられる、８０のオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。表２には、腺がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表３には、扁平上皮がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表４には、大細胞がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表５には、小細胞がんのマーカー遺伝子由来の一群をそれぞれ示す。なお、表２〜５には、ＤＮＡプローブの塩基配列とともに、由来マーカー遺伝子のAccession No.（GenBank）およびSymbol、ならびに、その塩基数、ＧＣ含有率（％）、および融解温度（Ｔｍ）を併せて示す。
【００１２】
本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、表２〜５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが搭載されたわずか８０のスポットによって、ヒト肺がんを特定することはもちろんのこと、その４病態を識別してこれを正確に特定することができるＤＮＡマイクロアレイが実現される。すなわち、本発明のＤＮＡプローブ・セットは、わずか８０のプローブから構成されているにもかかわらず、ヒト肺がんの４病態を絞り込むための解析に必要十分な情報を提供することができることを特徴とするものであり、このような機能を奏する特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群の構成は、本発明者らによって初めて開示されるものである。さらに、本発明のＤＮＡプローブ・セットは、そのプローブ数が８０に精選されているため、その他コントロールを含めても、たとえば、２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのスポットエリアに搭載可能であり、さらに、その解析時間も大幅に短縮される。
【００１３】
さらに好都合なことに、本発明のＤＮＡプローブ・セットを用いたＤＮＡマイクロアレイ解析において、有意な測定値として採用するスポットの蛍光強度が100〜100,000(３桁）の範囲に収まることを本発明者らは発見した。これはすなわち、本発明のＤＮＡプローブ・セットを用いたヒト肺がんの分子診断においては、ＤＮＡマイクロアレイ解析装置におけるスキャナーの直線的測定レンジが３桁あれば必要十分であることを意味する。従来の市販のＤＮＡマイクロアレイは、すくなくとも1000オーダーのプローブを搭載しており、これに伴ってそれらを測定する装置には、低蛍光強度から高蛍光強度に至る広範囲について定量性をもって測定すべく６桁以上の直線的測定レンジが要求されており、その結果、システム全体が高額なものとなっていた。この点、本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、上述したように測定装置に要求される直線的測定レンジが３桁の範囲で必要十分である。したがって、本発明によれば、蛍光強度100〜100,00の範囲が直線的測定レンジであるヒト肺がん用分子診断システムが提供され、これに対応してシステムに関するコストの低減が期待される。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明のＤＮＡプローブ・セットについて、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。
【００１５】
（ＤＮＡマイクロアレイの作製）
上述した手順に従って決定した塩基配列を有する45 ±2 mer のオリゴヌクレオチドを、Invitrogen社（Invitrogen Japan KK.,Tokyo,Japan)から入手した。添付する表２〜５に示す末端未修飾の８０のオリゴヌクレオチドを、３×３ｍｍ基板に対してスポッティングすることによって独自のＤＮＡマイクロアレイを作製した。なお、本実施例におけるＤＮＡマイクロアレイには、表２〜５に示す８０のオリゴヌクレオチドの他に、正常細胞のマーカーとしてhouse-keeping遺伝子由来のＤＮＡプローブである２０種のオリゴヌクレオチドと、陰性対照として植物遺伝子由来のＤＮＡプローブである３種のオリゴヌクレオチドを加え、合計１０３のスポットを搭載した。添付する表６に、house-keeping遺伝子由来の２０種のオリゴヌクレオチドの塩基配列を、表７に、植物遺伝子由来の３種のオリゴヌクレオチドの塩基配列をそれぞれ示す。
【００１６】
（ヒト肺がん培養細胞系への適用）
上述した手順で作製したＤＮＡマイクロアレイをヒト肺がん培養細胞系へ適用し遺伝子発現量の測定を行った。本実施例においては、ヒト肺がんの４種の病態のそれぞれに対し２種類のヒト肺がん由来培養細胞を用い、対照群として正常肺由来培養細胞を用いた。下記表１に、各病態と用いた培養細胞株の対応関係をまとめて示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
表１に示した細胞株を培養してtotal RNAを抽出し、当該total RNAから逆転写酵素によってcDNAを調製した。肺がん細胞群はAlexa555で、対照群はAlexa647でそれぞれ蛍光標識した。ほぼ等量の蛍光標識DNAを本実施例のＤＮＡマイクロアレイへ競合ハイブリダイズさせて、スキャナーで測定して蛍光強度を解析した。なお、測定した蛍光強度は、SLC16A4(配列番号8)の蛍光強度で補正して蛍光値データを得た。本実施例においては、上述した測定を各々の培養細胞について最低３回以上行い、その平均値を蛍光値データとした。得られた蛍光値データについて、（１）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が３以上、（２）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３以下、（３）両細胞において差異がない、（４）蛍光値が低い（蛍光強度が１００以下）、という４段階で評価し、各病態の培養細胞２株に対して共通した評価を得たスポットを抽出した。
【００１９】
図１は、腺がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子（Symbol）とともにまとめて示す。以下同様に、扁平上皮がんについては図２に、大細胞がんについては図３に、小細胞がんについては図４にそれぞれ示す。なお、図１〜４においては、対比のために他の病態の培養細胞２株についての結果を紙面右側に併せて示す。
【００２０】
図１に示されるように、本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、配列番号３（BENE）、配列番号７（DUSP4）、配列番号９（S100P）、配列番号２９（CSTA）、配列番号１３（PLAU）、配列番号５０（IGSF3）、配列番号５６（CDH1）、配列番号７４（INADL）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された８つのスポットのそれぞれが、腺がんの培養細胞２株（A549,ABC-1）について同じ結果を示す一方、上記８つのスポットは、他の３病態の培養細胞株群については、一貫性のない結果を示すことがわかった。ここで同じ結果を示すとは、各病態の２つの培養細胞について、両方とも（１）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が３以上である、両方とも（２）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３以下である、両方とも（３）両細胞において差異がない、両方とも（４）蛍光値が低い、のいずれか１つの結果を示すことをいう（以下、図２〜４についても同様）。
【００２１】
同じく、図２に示されるように、配列番号３６（RAB38）、配列番号５３（RAB25）、配列番号５６（CDH1）、配列番号６９（BEX1）、配列番号７４（INADL）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された５つのスポットのそれぞれが、扁平上皮がんの培養細胞２株（EBC-1, LK-2）ついて同じ結果を示す一方、上記５つのスポットは、他の３病態の培養細胞株群については、一貫性のない結果を示すことがわかった。
【００２２】
同じく、図３に示されるように、配列番号１９（SLCO4A1）、配列番号３０（S100A2）、配列番号４１（HMGA1）、配列番号４２（FOSL1）、配列番号４６（AMY2A）、配列番号５３（RAB25）、配列番号５６（CDH1）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された７つのスポットのそれぞれが、大細胞がんの培養細胞２株（LU65, LU99）ついて同じ結果を示す一方、他の３病態の培養細胞株については、一貫性のない結果を示すことがわかった。
【００２３】
また、図４に示されるように、配列番号６４（APLP1）、配列番号６６（ISL1）、配列番号６７（FOXG1B）、配列番号７１（INA）、配列番号８０（STMN1）、配列番号１７（TGM2）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された６つスポットのそれぞれは、図１〜３について上述したように、小細胞がんの培養細胞２株（STC-1, RERF-LC-MA）ついて同じ結果を示すものではないが、上記６つのスポットは、他の３病態の培養細胞株については、３以上のRatio（肺がん細胞/正常細胞)を一切示さないため、小細胞がんの結果と他の病態の結果は容易に判別しうることが示された。
【００２４】
上述した本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイに対して、蛍光標識したサンプルを競合ハイブリダイズさせ、その蛍光データを元に解析する際、図１〜４にそれぞれ示した配列番号に表されるＤＮＡプローブ群の結果に着目することによって４病態を容易に識別しうることは容易に理解されるところである。すなわち、図１〜４に示した配列番号のＤＮＡプローブ群が搭載されたスポットの結果について、図１〜４に表示した結果との合致率を割り出すことによって４病態を絞り込むことが可能となる。例えば、図１に示した配列番号３（BENE）、配列番号７（DUSP4）、配列番号９（S100P）、配列番号２９（CSTA）、配列番号１３（PLAU）、配列番号５０（IGSF3）、配列番号５６（CDH1）、配列番号７４（INADL）の８つのオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの結果に着目し、その内の５つ以上のスポットで図１に表示された結果と同じの結果を得た場合、すなわち５／８の合致率を得た場合に、当該サンプルを「腺がん」と判定することは十分な妥当性をもつ。なお、上述した合致率は、その診断に求められる精度に鑑みて適宜設定しうることはいうまでもない。以上、説明してきた本実施例によって、本発明のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイによって、ヒト肺がん培養細胞の４病態を正確に識別してこれを特定することができることが示された。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】
【表７】
【００３１】
（ＤＮＡマイクロアレイの妥当性の検証）
図５は、本実施例のＤＮＡプローブ・セットを搭載して独自に作製したＤＮＡマイクロアレイの、ヒト肺腺がん培養細胞とヒト正常培養細胞によるscattering pattern を示す。図５において「×」はプローブが搭載された各スポットを示し、線分ａはRatio（肺がん細胞/正常細胞)が「１」を示している。また、線分ｂと線分ｃの２本の線によって画定される範囲は、Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が「0.5< <2.0」であり、両細胞において有意な差異が認められない範囲を示している。一方、線分ｂの上側にある「×」はヒト肺腺がんで2.0倍以上に発現が増加している遺伝子を示しており、線分ｃの下側にある「×」はヒト肺腺がんで0.5倍以下に発現が減少している遺伝子を示している。
【００３２】
図５に示されるように、「×」で示される各スポットは、蛍光強度101〜105の範囲にほぼ納まっている。一方、蛍光強度101〜102の範囲は、すでに説明したように、本発明の解析方法においては「蛍光値が低い」と評価される範囲であって、その定量化を必要としない。すなわち、本発明の解析方法においては、蛍光強度101〜102の範囲に定量性は要求されず、蛍光強度102〜105の範囲についてのみ定量性をもって測定できれば必要十分なのであり、図５は、蛍光強度102〜105の３桁の範囲についてのみ直線的測定レンジを備える測定装置であっても妥当性をもった診断結果が得られることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上、説明したように、本発明によれば、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。本発明のＤＮＡプローブ・セットは、従来以上に小型化されたＤＮＡマイクロアレイの作製を可能にすることによって、安価で高性能なヒト肺がんの分子診断システムの構築に資することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】腺がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図２】扁平上皮がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図３】大細胞がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図４】小細胞がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図５】本実施例のＤＮＡプローブ・セットを搭載して作製したＤＮＡマイクロアレイの、ヒト肺腺がん培養細胞とヒト正常培養細胞によるscattering pattern を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットに関し、より詳細には、ヒト肺がんの４病態を分類するためのＤＮＡプローブ・セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、肺がんは、その腫瘍細胞の大きさという病理形態学的診断基準から、小細胞がんまたは非小細胞がんの主な２つの型に分類され、非小細胞がんは、さらに、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんに分類される。従来、肺がんの型を特定する診断においては、手術で摘出した臓器や組織を固定液などで固定して包埋し、適宜の大きさに切り出して作製した顕微鏡標本を病理医が細胞病理組織診断することによって行われていた。
【０００３】
しかしながら、このような細胞病理組織診断には一般に時間がかかり、またそれを正確に行うには経験を要することに加え、その判断に診断を行う病理医の主観が入るという問題があった。そこで、診断者を選ばず、且つ、精度の高い客観的な診断を実現すべく、ヒト肺がんの型の特定診断においてゲノム研究の成果を取り入れた分子診断法の適用が求められていた。ここで、がんの分子診断法とは、がん細胞で特異的に変化する遺伝子発現をマーカーとして、その分子マーカーの変化を定量的に計測することでがん細胞の存在を特定する方法をいう。がんの分子診断法を実現するシステムとして、たとえば、Affymetrix社から１６００遺伝子を搭載したがん関連のカスタム・ＤＮＡマイクロアレイと自動測定システムが提供されているが、この製品は、大集積のＤＮＡマイクロアレイであって非常に高価であり、また、肺がんに特化されたものではなかった。なお、非特許文献１〜７は、ヒト肺がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する知見を開示する。
【非特許文献１】Bhattacharjee A et al ,Proc Natl Acad Sci [2001] 98(24):13790-13795
【非特許文献２】Garber ME et al ,Proc Natl Acad Sci [2001] 98(24):13784-13789
【非特許文献３】Beer DG et al ,Nat Med. [2002] 8(8):816-824、Giordano TJ et al ,Am J Pathol. [2001] 159(4):1231-1238
【非特許文献４】Giordano TJ et al ,Am J Pathol. [2001] 159(4):1231-1238
【非特許文献５】Nacht M et al ,Proc Natl Acad Sci [2001] 98(26):15203-15208
【非特許文献６】McDoniels-Silvers AL etal ,Clin Cancer Res. [2002] 8(4):1127-1138
【非特許文献７】Virtanen C et al ,Proc Natl Acad Sci [2002] 99(19):12357-12362
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、本発明は、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ヒト肺がんの型の特定診断に対し分子診断法の適用を試みるうえで、ＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットであって、ヒト肺がんを特定することができるＤＮＡプローブ・セットにつき鋭意検討した。その結果、精選された８０のマーカー遺伝子由来のＤＮＡプローブからなるセットであって、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群を用いることによって、ヒト肺がんを特定することはもちろんのこと、その４病態を識別してこれを特定することができることを発見し、本発明に至ったのである。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、添付する表２〜５に示した配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セットが提供される。また、発明によれば、上記ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。本発明においては、前記ＤＮＡプローブ・セットを２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのエリアに搭載することができる。さらに、本発明によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを含み、蛍光強度の直線的測定レンジが３桁であることを特徴とする、ヒト肺がん用分子診断システムが提供される。
【０００７】
本発明に別の構成によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号２９、配列番号１３、配列番号５０、配列番号５６、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が腺がんであるか否かを判断する方法が提供される。また、本発明によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、配列番号３６、配列番号５３、配列番号５６、配列番号６９、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が扁平上皮がんであるか否かを判断する方法が提供される。さらに、本発明によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、配列番号１９、配列番号３０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５３、および配列番号５６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が大細胞がんであるか否かを判断する方法が提供される。さらに加えて、本発明によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、配列番号１７、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７１、および配列番号８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が小細胞がんであるか否かを判断する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
上述したように、本発明によれば、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を実施の形態をもって説明するが、本発明は、以下に示す実施の形態に限定されるものではない。本発明者らは、本発明のヒト肺がんの４病態を分類するためのＤＮＡプローブ・セットの設計に際し、ヒト肺がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する先に挙げた論文７報（非特許文献１〜７）に掲載されたマーカー遺伝子について、ヒト肺がんの４病態に対する発現の特異性とその発現量などに鑑みて精査した結果、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、および小細胞がんのそれぞれについて２０ずつ、合計８０のマーカー遺伝子を抽出した。
【００１０】
次に、National Center for Biotechnology Information（NCBI）とEnsembl に登録されているＤＮＡデータベースを参照して、上述した８０のマーカー遺伝子のそれぞれについて、45 ±2 merのオリゴヌクレオチド・シーケンスを抽出した。オリゴヌクレオチド・シーケンスの抽出は、（１）5′末端および3′末端が、ＧまたはＣであること、（２）ＧＣ含有率が４５〜６０％であること、（３）融解温度（Ｔｍ）が６３〜７４°であること、（４）Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）の各塩基が偏在しないこと、（５）NCBIの検索ソフトウェアであるBLASTを用いた検索で、他の遺伝子において部分配列として含まれていないこと、の５つの条件を満たすものについてこれを選択して行った。
【００１１】
添付する表２〜５に、上述した手順で抽出した、本発明のＤＮＡプローブ・セットとして用いられる、８０のオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。表２には、腺がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表３には、扁平上皮がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表４には、大細胞がんのマーカー遺伝子由来の一群を、表５には、小細胞がんのマーカー遺伝子由来の一群をそれぞれ示す。なお、表２〜５には、ＤＮＡプローブの塩基配列とともに、由来マーカー遺伝子のAccession No.（GenBank）およびSymbol、ならびに、その塩基数、ＧＣ含有率（％）、および融解温度（Ｔｍ）を併せて示す。
【００１２】
本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、表２〜５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが搭載されたわずか８０のスポットによって、ヒト肺がんを特定することはもちろんのこと、その４病態を識別してこれを正確に特定することができるＤＮＡマイクロアレイが実現される。すなわち、本発明のＤＮＡプローブ・セットは、わずか８０のプローブから構成されているにもかかわらず、ヒト肺がんの４病態を絞り込むための解析に必要十分な情報を提供することができることを特徴とするものであり、このような機能を奏する特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群の構成は、本発明者らによって初めて開示されるものである。さらに、本発明のＤＮＡプローブ・セットは、そのプローブ数が８０に精選されているため、その他コントロールを含めても、たとえば、２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのスポットエリアに搭載可能であり、さらに、その解析時間も大幅に短縮される。
【００１３】
さらに好都合なことに、本発明のＤＮＡプローブ・セットを用いたＤＮＡマイクロアレイ解析において、有意な測定値として採用するスポットの蛍光強度が100〜100,000(３桁）の範囲に収まることを本発明者らは発見した。これはすなわち、本発明のＤＮＡプローブ・セットを用いたヒト肺がんの分子診断においては、ＤＮＡマイクロアレイ解析装置におけるスキャナーの直線的測定レンジが３桁あれば必要十分であることを意味する。従来の市販のＤＮＡマイクロアレイは、すくなくとも1000オーダーのプローブを搭載しており、これに伴ってそれらを測定する装置には、低蛍光強度から高蛍光強度に至る広範囲について定量性をもって測定すべく６桁以上の直線的測定レンジが要求されており、その結果、システム全体が高額なものとなっていた。この点、本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、上述したように測定装置に要求される直線的測定レンジが３桁の範囲で必要十分である。したがって、本発明によれば、蛍光強度100〜100,00の範囲が直線的測定レンジであるヒト肺がん用分子診断システムが提供され、これに対応してシステムに関するコストの低減が期待される。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明のＤＮＡプローブ・セットについて、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。
【００１５】
（ＤＮＡマイクロアレイの作製）
上述した手順に従って決定した塩基配列を有する45 ±2 mer のオリゴヌクレオチドを、Invitrogen社（Invitrogen Japan KK.,Tokyo,Japan)から入手した。添付する表２〜５に示す末端未修飾の８０のオリゴヌクレオチドを、３×３ｍｍ基板に対してスポッティングすることによって独自のＤＮＡマイクロアレイを作製した。なお、本実施例におけるＤＮＡマイクロアレイには、表２〜５に示す８０のオリゴヌクレオチドの他に、正常細胞のマーカーとしてhouse-keeping遺伝子由来のＤＮＡプローブである２０種のオリゴヌクレオチドと、陰性対照として植物遺伝子由来のＤＮＡプローブである３種のオリゴヌクレオチドを加え、合計１０３のスポットを搭載した。添付する表６に、house-keeping遺伝子由来の２０種のオリゴヌクレオチドの塩基配列を、表７に、植物遺伝子由来の３種のオリゴヌクレオチドの塩基配列をそれぞれ示す。
【００１６】
（ヒト肺がん培養細胞系への適用）
上述した手順で作製したＤＮＡマイクロアレイをヒト肺がん培養細胞系へ適用し遺伝子発現量の測定を行った。本実施例においては、ヒト肺がんの４種の病態のそれぞれに対し２種類のヒト肺がん由来培養細胞を用い、対照群として正常肺由来培養細胞を用いた。下記表１に、各病態と用いた培養細胞株の対応関係をまとめて示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
表１に示した細胞株を培養してtotal RNAを抽出し、当該total RNAから逆転写酵素によってcDNAを調製した。肺がん細胞群はAlexa555で、対照群はAlexa647でそれぞれ蛍光標識した。ほぼ等量の蛍光標識DNAを本実施例のＤＮＡマイクロアレイへ競合ハイブリダイズさせて、スキャナーで測定して蛍光強度を解析した。なお、測定した蛍光強度は、SLC16A4(配列番号8)の蛍光強度で補正して蛍光値データを得た。本実施例においては、上述した測定を各々の培養細胞について最低３回以上行い、その平均値を蛍光値データとした。得られた蛍光値データについて、（１）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が３以上、（２）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３以下、（３）両細胞において差異がない、（４）蛍光値が低い（蛍光強度が１００以下）、という４段階で評価し、各病態の培養細胞２株に対して共通した評価を得たスポットを抽出した。
【００１９】
図１は、腺がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子（Symbol）とともにまとめて示す。以下同様に、扁平上皮がんについては図２に、大細胞がんについては図３に、小細胞がんについては図４にそれぞれ示す。なお、図１〜４においては、対比のために他の病態の培養細胞２株についての結果を紙面右側に併せて示す。
【００２０】
図１に示されるように、本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、配列番号３（BENE）、配列番号７（DUSP4）、配列番号９（S100P）、配列番号２９（CSTA）、配列番号１３（PLAU）、配列番号５０（IGSF3）、配列番号５６（CDH1）、配列番号７４（INADL）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された８つのスポットのそれぞれが、腺がんの培養細胞２株（A549,ABC-1）について同じ結果を示す一方、上記８つのスポットは、他の３病態の培養細胞株群については、一貫性のない結果を示すことがわかった。ここで同じ結果を示すとは、各病態の２つの培養細胞について、両方とも（１）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が３以上である、両方とも（２）Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が１／３以下である、両方とも（３）両細胞において差異がない、両方とも（４）蛍光値が低い、のいずれか１つの結果を示すことをいう（以下、図２〜４についても同様）。
【００２１】
同じく、図２に示されるように、配列番号３６（RAB38）、配列番号５３（RAB25）、配列番号５６（CDH1）、配列番号６９（BEX1）、配列番号７４（INADL）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された５つのスポットのそれぞれが、扁平上皮がんの培養細胞２株（EBC-1, LK-2）ついて同じ結果を示す一方、上記５つのスポットは、他の３病態の培養細胞株群については、一貫性のない結果を示すことがわかった。
【００２２】
同じく、図３に示されるように、配列番号１９（SLCO4A1）、配列番号３０（S100A2）、配列番号４１（HMGA1）、配列番号４２（FOSL1）、配列番号４６（AMY2A）、配列番号５３（RAB25）、配列番号５６（CDH1）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された７つのスポットのそれぞれが、大細胞がんの培養細胞２株（LU65, LU99）ついて同じ結果を示す一方、他の３病態の培養細胞株については、一貫性のない結果を示すことがわかった。
【００２３】
また、図４に示されるように、配列番号６４（APLP1）、配列番号６６（ISL1）、配列番号６７（FOXG1B）、配列番号７１（INA）、配列番号８０（STMN1）、配列番号１７（TGM2）で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された６つスポットのそれぞれは、図１〜３について上述したように、小細胞がんの培養細胞２株（STC-1, RERF-LC-MA）ついて同じ結果を示すものではないが、上記６つのスポットは、他の３病態の培養細胞株については、３以上のRatio（肺がん細胞/正常細胞)を一切示さないため、小細胞がんの結果と他の病態の結果は容易に判別しうることが示された。
【００２４】
上述した本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイに対して、蛍光標識したサンプルを競合ハイブリダイズさせ、その蛍光データを元に解析する際、図１〜４にそれぞれ示した配列番号に表されるＤＮＡプローブ群の結果に着目することによって４病態を容易に識別しうることは容易に理解されるところである。すなわち、図１〜４に示した配列番号のＤＮＡプローブ群が搭載されたスポットの結果について、図１〜４に表示した結果との合致率を割り出すことによって４病態を絞り込むことが可能となる。例えば、図１に示した配列番号３（BENE）、配列番号７（DUSP4）、配列番号９（S100P）、配列番号２９（CSTA）、配列番号１３（PLAU）、配列番号５０（IGSF3）、配列番号５６（CDH1）、配列番号７４（INADL）の８つのオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの結果に着目し、その内の５つ以上のスポットで図１に表示された結果と同じの結果を得た場合、すなわち５／８の合致率を得た場合に、当該サンプルを「腺がん」と判定することは十分な妥当性をもつ。なお、上述した合致率は、その診断に求められる精度に鑑みて適宜設定しうることはいうまでもない。以上、説明してきた本実施例によって、本発明のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイによって、ヒト肺がん培養細胞の４病態を正確に識別してこれを特定することができることが示された。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】
【表７】
【００３１】
（ＤＮＡマイクロアレイの妥当性の検証）
図５は、本実施例のＤＮＡプローブ・セットを搭載して独自に作製したＤＮＡマイクロアレイの、ヒト肺腺がん培養細胞とヒト正常培養細胞によるscattering pattern を示す。図５において「×」はプローブが搭載された各スポットを示し、線分ａはRatio（肺がん細胞/正常細胞)が「１」を示している。また、線分ｂと線分ｃの２本の線によって画定される範囲は、Ratio（肺がん細胞/正常細胞)が「0.5< <2.0」であり、両細胞において有意な差異が認められない範囲を示している。一方、線分ｂの上側にある「×」はヒト肺腺がんで2.0倍以上に発現が増加している遺伝子を示しており、線分ｃの下側にある「×」はヒト肺腺がんで0.5倍以下に発現が減少している遺伝子を示している。
【００３２】
図５に示されるように、「×」で示される各スポットは、蛍光強度101〜105の範囲にほぼ納まっている。一方、蛍光強度101〜102の範囲は、すでに説明したように、本発明の解析方法においては「蛍光値が低い」と評価される範囲であって、その定量化を必要としない。すなわち、本発明の解析方法においては、蛍光強度101〜102の範囲に定量性は要求されず、蛍光強度102〜105の範囲についてのみ定量性をもって測定できれば必要十分なのであり、図５は、蛍光強度102〜105の３桁の範囲についてのみ直線的測定レンジを備える測定装置であっても妥当性をもった診断結果が得られることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上、説明したように、本発明によれば、ヒト肺がんの４病態について共通して用いることができ、当該４病態を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。本発明のＤＮＡプローブ・セットは、従来以上に小型化されたＤＮＡマイクロアレイの作製を可能にすることによって、安価で高性能なヒト肺がんの分子診断システムの構築に資することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】腺がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図２】扁平上皮がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図３】大細胞がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図４】小細胞がんの培養細胞２株に対して共通した結果を得たスポットに搭載されたオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子とともに示した図。
【図５】本実施例のＤＮＡプローブ・セットを搭載して作製したＤＮＡマイクロアレイの、ヒト肺腺がん培養細胞とヒト正常培養細胞によるscattering pattern を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セット。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
前記ＤＮＡプローブ・セットが２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのエリアに搭載された、請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡマイクロアレイを含み、蛍光強度の直線的測定レンジが３桁であることを特徴とする、ヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、
配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号２９、配列番号１３、配列番号５０、配列番号５６、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が腺がんであるか否かを判断する方法。
【請求項６】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、
配列番号３６、配列番号５３、配列番号５６、配列番号６９、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が扁平上皮がんであるか否かを判断する方法。
【請求項７】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、
配列番号１９、配列番号３０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５３、および配列番号５６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が大細胞がんであるか否かを判断する方法。
【請求項８】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、
配列番号１７、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７１、および配列番号８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が小細胞がんであるか否かを判断する方法。
【請求項１】
配列番号１〜８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セット。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
前記ＤＮＡプローブ・セットが２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのエリアに搭載された、請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡマイクロアレイを含み、蛍光強度の直線的測定レンジが３桁であることを特徴とする、ヒト肺がん用分子診断システム。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、
配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号２９、配列番号１３、配列番号５０、配列番号５６、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が腺がんであるか否かを判断する方法。
【請求項６】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、
配列番号３６、配列番号５３、配列番号５６、配列番号６９、および配列番号７４で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が扁平上皮がんであるか否かを判断する方法。
【請求項７】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、
配列番号１９、配列番号３０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５３、および配列番号５６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が大細胞がんであるか否かを判断する方法。
【請求項８】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト肺がんの病態を特定する方法であって、
配列番号１７、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７１、および配列番号８０で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞が小細胞がんであるか否かを判断する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２６８１７１（Ｐ２００８−２６８１７１Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３４３６３（Ｐ２００７−２３４３６３）
【出願日】平成１９年９月１０日（２００７．９．１０）
【出願人】（８００００００８０）タマティーエルオー株式会社 (255)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１０日（２００７．９．１０）
【出願人】（８００００００８０）タマティーエルオー株式会社 (255)
【Ｆターム（参考）】
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