ビタミンＥ誘導体を有効成分とする抗サイトカイン介在疾患剤
【課題】炎症性サイトカインが介在して発症または悪化する疾患、特に敗血症性ショック、急性臓器障害や臓器不全、虚血再還流によって生じる各種臓器障害の予防または治療に有効な医薬組成物を提供することを目的とする。
【解決手段】下記一般式で示される水溶性ビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする：
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３およびＲ５は、異なって、水素原子であるか、またはＳ結合したＳＨ化合物若しくはそのエステル（但し、システアミンは除く。）を示し、Ｒ４は水酸基、Ｎ−置換アミノ酸またはそのエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）またはアミン化合物を示す〕。
【解決手段】下記一般式で示される水溶性ビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする：
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３およびＲ５は、異なって、水素原子であるか、またはＳ結合したＳＨ化合物若しくはそのエステル（但し、システアミンは除く。）を示し、Ｒ４は水酸基、Ｎ−置換アミノ酸またはそのエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）またはアミン化合物を示す〕。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にＴＮＦ−α及びＩＬ−６等のサイトカインが介在して発症または悪化する疾患（サイトカイン介在疾患）の予防及び治療に有効な抗サイトカイン介在疾患剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの病態においてサイトカインの増加はその病態悪化に密接な関係があることが示されている。サイトカインの種類としては多数存在するが、腫瘍壊死因子α（以下、「ＴＮＦ−α」という）は、様々な細胞への刺激（例えば、リポ多糖体（ＬＰＳ））または外部細胞性ストレス（例えば、浸透圧ショックおよび過酸化物）に応答して、単球およびマクロファージを含む様々な細胞によって分泌される重要なサイトカインである。
【０００３】
基底レベルを上回るＴＮＦ−αのレベルの上昇は幾つかの疾患状態への介在またはこの悪化に関連付けられており、これらの疾患状態にはパジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛が含まれる。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２を含む）、および帯状疱疹もＴＮＦ−αの上昇によって悪化することが知られている。
【０００４】
更に、ＴＮＦ−αは頭部外傷、脳卒中、および虚血においてもその臓器障害に重要な役割を果たすことが報告されている。例えば、頭部外傷ラットにおいて、ＴＮＦ−αのレベルは打撲を負った半球において増加した（非特許文献１）、中央脳動脈が閉塞された虚血ラットにおいては、ＴＮＦ−αの ｍＲＮＡが増加した（非特許文献２）、との報告があり、この点においてもサイトカインが臓器障害に重要な役割を演じていることが示されている。
【０００５】
具体的な組織におけるＴＮＦ−αの働きとしては、ラット皮質へのＴＮＦ−αの投与による毛細血管における好中球の著しい堆積および小血管内での付着を生じることが報告されている。このＴＮＦ−αは複雑なサイトカインカスケードにおける上流因子である。結果として、ＴＮＦ−αのレベルの上昇は他の様々なサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＩＬ−８のレベルの上昇につながり得る。よってＴＮＦ−αは、他のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６）やケモカインの浸潤を促進し、これが梗塞領域への好中球浸潤を促進することが報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
ＩＬ−６はT細胞やマクロファージ等の細胞により産生されるレクチンであり、液性免疫を制御するサイトカインの一つである。ＩＬ−６は１９８６年に相補的ＤＮＡ（cDNA）がクローニングされ、その後、ＩＬ−６は種々の生理現象や炎症・免疫疾患の発症メカニズムに関与していることが明らかになった。また炎症部位または傷害（例えば虚血）部位でのＩＬ−６の産生が介在する多くの疾患状態の悪化および／または発症が関連付けられている(非特許文献４)。さらに、虚血再還流障害においてもＩＬ−６の抑制が臓器障害改善効果をもたらすことが報告されている（非特許文献５）。これらのことからこのような疾患状態には、例えば喘息、炎症性腸疾患、乾癬、成人呼吸促進症候群、心臓および腎臓再還流傷害、血栓症並びに糸球体腎炎が含まれるといえる。
【０００７】
ＴＮＦ−αの効果を遮断するのに幾つかのアプローチが採用されている。１つのアプローチは、ＴＮＦ−αの可溶性受容体（例えば、ＴＮＦＲ−５５またはＴＮＦＲ−７５）の使用であり、ＴＮＦ−α介在疾患状態の動物モデルにおいて効力が認められている。第２のアプローチはＴＮＦ−αに特異的なモノクローナル抗体、ｃＡ２を用いてＴＮＦ−αを中和する方法である（非特許文献６）。また、ＩＬ−６の抑制が虚血再還流障害における病態を改善することも報告されており（非特許文献５）、これらのアプローチは、タンパク質分離または受容体拮抗のいずれかによってＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の効果を遮断するというものである。
【０００８】
またＴＮＦ−αを始めとするサイトカインが介在する疾患の治療に１，４，５−トリ置換イミダゾール、縮合トリアゾール、及びインダゾールなどの複素環化合物を用いることも提案されている（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Shohamiら、J. Cereb. Blood Flow Metab. 14, 615(1994)
【非特許文献２】Feursteinら、Neurosci. Lett. 165, 125 (1993)
【非特許文献３】Feurstein、Stroke 25, 1481 (1994)
【非特許文献４】Frink Mら、Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.
【非特許文献５】Kimizuka Kら、Am J Transplant. 2004 Apr;4(4):482-94.
【非特許文献６】Feldmannら．5 Immunological Reviews, pp.195-223 (1995)
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2004-99622号公報
【特許文献２】特表2008-504294号公報
【特許文献３】WO99/33818号公報
【特許文献４】特開2000-191528号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、炎症性サイトカイン（特に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）が介在して発症または悪化する疾患（本発明ではこれを「サイトカイン介在疾患」と称する）の予防または治療に有効な医薬組成物（本発明ではこれを「抗サイトカイン介在疾患剤」と称する）を提供することを目的とする。より詳細には、敗血症性ショック、急性臓器障害や臓器不全を予防または治療したり、また虚血再還流によって生じる各種臓器障害を保護するために有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねていたところ、下記の一般式（１）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体に、細胞刺激因子（リポ多糖体（ＬＰＳ））によって生じる細胞内シグナル（NF-ｋB）の活性化抑制を介して、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）の誘導を有意に抑制する作用があり、その結果、ＬＰＳ誘導の臓器障害を減じることから、敗血症性ショック、急性臓器障害や臓器不全の予防及び改善に有効であること、また虚血再還流によって生じる各種臓器障害の保護や改善にも有効であること見出した。
【００１３】
ちなみに当該ビタミンＥ誘導体は公知の化合物であるが（例えば特許文献３及び４等参照）、サイトカインとの関連性ならびにサイトカイン介在疾患に対する予防及び治療作用については知られていない。
【００１４】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含する。
（I-1）下記一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容
される塩を有効成分とする、抗サイトカイン介在疾患剤：
【００１５】
【化１】
【００１６】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示し、Ｒ３およびＲ５は、異なって、水素原子であるか、またはＳ結合した下記式（１）〜（５）のいずれかに示されるＳＨ化合物若しくはそのエステル（但し、システアミンは除く。）を示し、Ｒ４は水酸基、下記式（６）〜（１１）のいずれかに示されるＮ−置換アミノ酸、そのエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）または下記式（１２）に示されるアミンを示す〕
【００１７】
【化２】
【００１８】
（I-2）一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体が下記（ａ）〜（ｏ）からなる群から選択されるいずれかである、（I-1）に記載する抗サイトカイン介在疾患剤：
（ａ）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン、
（ｂ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｃ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｄ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル] -3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ] プロピル]システニイルグリシン、
（ｅ）Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（2-スルフォエチル）アミノ] プロピル]システイン、
（ｆ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[[２-(1H-インドール-3-イル)エチル]アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｇ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（5-カルボキシペンチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｈ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（トランス-4-カルボキシシクロヘキシルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｉ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システイン、
（ｊ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]ペニシラミン、
（ｋ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システナミン、
（ｌ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（エトキシカルボニルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｍ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン イソプロピルエステル、
（ｎ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフィノエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｏ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-（2-カルボキシピロリジノ）プロピル]システニイルグリシン。
【００１９】
（I-3）サイトカイン介在疾患が、パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性およ慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛からなる群から選択されるいずれか少なくとも１つである（I-1）または（I-2）に記載する 抗サイトカイン介在疾患剤。
【００２０】
（I-4）抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全の予防又は治療剤である（I-1）または（I-2）に記載する抗サイトカイン介在疾患剤。
【００２１】
（I-5）抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショックによる臓器障害または虚血再還流障害に対する臓器若しくは組織の保護剤である（I-1）または（I-2）に記載する抗サイトカイン介在疾患剤。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】LPS処置したラットの肺および肝臓組織の光学顕微鏡画像を示す（実験例１）。ＡとＤ：生理食塩水で処理した対照群の代表的な標本（A:肺、D:肝臓)、ＢとＥ：LPS(7.5mg/kg)で処理したLPS群の代表的な標本（B: 肺、E:肝臓）、およびＣとＦ：ETS-GS(10mg/kg)およびLPS(7.5mg/kg)で処理した ETS-GS+LPS群の代表的な標本(C:肺、F:肝臓)である。
【図２】図１の肺組織の結果を、鬱血、浮腫、炎症及び出血のパラメーター毎に各群の組織学的スコアで示したものである（黒棒：対照群、白棒：LPS群、斜線棒：ETS-GS+LPS群）。結果は平均値±SDとして示す。* は、LPS群に対して有意差（p<0.05）があることを示す。
【図３】図１の肝臓組織の結果を、組織学的スコアで示したものである。左端から、対照群（黒棒）、LPS群（白棒）、ETS-GS+LPS群（斜線棒）の結果である。データは平均値+SDとして示す。 * はLPS群に対して有意差(p<0.05)があることを示す。
【図４】対照群、LPS群（―■―）およびETS-GS+LPS群（―●―）について、LPS投与後、24時間に亘ってIL-6およびTNF-αの血清濃度を経時的に観察した結果を示す（実験例２）。（Ａ）IL-6の血清濃度 、（Ｂ）TNF-αの血清濃度をそれぞれ示す。データは、平均値±SDとして示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図５】LPSで刺激したマウスマクロファージ様細胞（RAW264.7）におけるIL-6、TNF-α及びHMGB1生成の結果を示す（実験例３）。LPSで刺激された(100ng/ml)マウスマクロファージを、図に示す投与量(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、100μg/ml)のETS-GSで20時間同時に処理した。（Ａ）TNF-α生成量（pg/ml）、（Ｂ）IL-6生成量（pg/ml）、（Ｃ）HMGB1生成量（ng/ml）をそれぞれ示す。データは、平均値±SDとして示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図６】LPS誘導マウスマクロファージにおける核分画中のNF-κB（p50/p65）のDNA結合活性を示す（実験例５（１））。LPS誘導によって増加したNF-κB（p50/p65）のDNA結合活性が（左から２番目）、ETS-GS処置によって減少することがわかる（左から３番目）。データは、平均値±SDで示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図７】LPS誘導IkBリン酸化に対するETS-GSの影響を調べた結果を示す（実験例５（２））。
【図８−１】各種タンパク質のLPS誘導リン酸化を調べた結果を示す（実験例５（２））。Ａ：Akt、Ｂ：extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2)のリン酸化、Ｃ：c-jun N-terminal kinase (JNK) のリン酸化。黒棒は対照群、白棒はLPS群、灰色棒はETS-GS＋LPS群を示す。データは、平均値±SDで示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図８−２】各種タンパク質のLPS誘導リン酸化を調べた結果を示す（実験例５（２））。Ｄ：p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) のリン酸化、Ｅ：IκBαのリン酸化。黒棒は対照群、白棒はLPS群、灰色棒はETS-GS＋LPS群を示す。データは、平均値±SDで示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図９】脳虚血再還流処置から24時間後に観察された組織の変化（細胞の壊死、細胞質内空胞形成、出血）を示す、脳組織の染色画像である（実験例６）。
【図１０】腎虚血再還流処置から24時間後に観察された組織の変化（尿細管細胞の壊死、細胞質内空胞形成、出血および尿細管の拡大）を示す、腎臓組織の染色画像である（実験例７（１））。ＡとＢ）：生理食塩水で処理した対照群の代表的な標本（A: 40×倍; B: 100×倍)、ＣとＤ：生理食塩水で処理した腎虚血再還流(I/R)群の代表的な標本（C: 40×倍; D: 100×倍）、およびＥとＦ：体重1kg当たり100mgのETS-GSで処理した腎虚血再還流(I/R)群の代表的な標本(E: 40×倍; F: 100×倍)である。
【図１１】図１０の結果を組織学的スコアで示したものである。各群（左端から対照群、I/R群、ETS-GS処置したI/R群（ETS-GS＋I/R群））のスコアを平均値±SDとして示す。* I/R群に対して有意差(p<0.05)があることを示す。
【図１２】腎虚血再還流処置から24時間後に観察された組織の透過性電子顕微鏡画像（10,000×倍）を示す（実験例８（２））。対照群（A、B）;腎虚血再還流(I/R)群(C、D); ETS-GS処置したI/R群(E、F)。
【図１３】腎虚血再還流処置から24時間後に採取したラット腎臓組織中のマロンジアルデヒド濃度（μＭ）を示す（実験例８）。左端から対照群（黒棒）；I/R群（白棒）; ETS-GS処理したI/R群（灰色棒）の結果である。データは各群（n=6）の平均値±SDとして示す。* はI/R群に対して有意差(p<0.05)があることを示す。
【図１４】肝虚血再還流処置から24時間後に観察された組織の変化（細胞の壊死、核濃縮、出血、小葉体構造の乱れ）を示す、肝臓組織の染色画像である（実験例８）。
【図１５】対照群、LPS群およびETS-GS+LPS群について、肝虚血再還流処置から２４時間後に採取した血液を対象として測定した、血清中のＩＬ−６濃度（図１５（Ａ））、ＴＮＦ−α濃度（図１５（Ｂ））を示す。
【図１６】対照群、LPS群およびETS-GS+LPS群について、肝虚血再還流処置から２４時間後に採取した血液を対象として測定した、血清中のＨＭＧＢ１濃度を示す。
【図１７】対照群、LPS群およびETS-GS+LPS群について、肝虚血再還流処置から２４時間後に採取した血液を対象として測定した、血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）濃度（図１７（Ａ））、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）濃度（図１７（Ｂ））、乳酸脱水素酵素（LDH）濃度（図１７（Ｃ））を示す。
【図１８】CLP（cecal ligation and puncture）処置から12時間後に観察した肺組織標本（ＡとＢ：疑似手術群、ＣとＤ： CLP群、ＥとＦ：ETS-GS＋CLP群）の光学顕微鏡画像を示す（実験例９（3-1））。
【図１９】図１８の結果に基づいて、肺障害を４つのパラメーター（鬱血、浮腫、炎症及び出血）の点から組織学的スコアで示したものである。
【図２０】CLP処置から12時間後に観察した肺組織標本（上段：左から疑似手術群、CLP群、E-Ant-S-GS＋CLP群）および肝組織標本（下段：左から疑似手術群（Sham）、CLP群、E-Ant-S-GS＋CLP群）の光学顕微鏡画像を示す（実験例９（3-2））。
【図２１】CLP処置から12時間後に採取した肺組織及び肝臓組織中のミエロペルオキシダーゼ活性（MPO活性）を測定した結果を示す（実験例９（４））。
【図２２】CLP処置した各群のラット（CLP群、ETS-GS＋CLP群）から経時的に血液を採取し、サイトカイン（IL-6及びTNF-α）濃度及びHMGB1濃度を測定した結果を示す（実験例９（5-1））。
【図２３】CLP処置した各群のラット（疑似手術群（Sham）、CLP群、E-Ant-S＋CLP群）から経時的に血液を採取し、サイトカイン（IL-6）濃度を測定した結果を示す（実験例９（5-2））。
【図２４】CLP処置した各群のラット（疑似手術群（Sham）、CLP群、E-Ant-S＋CLP群）の肺組織中のＰＡＲ１及びＨＭＧＢ１の発現を測定した結果を示す（実験例９（5-2））。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の抗サイトカイン介在疾患剤は、下記一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするものである。
【００２４】
【化３】
【００２５】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示し、Ｒ３およびＲ５は、異なって、水素原子であるか、またはＳ結合した下記式（１）〜（５）のいずれかに示されるＳＨ化合物若しくはそのエステル（但し、システアミンは除く。）を示し、Ｒ４は水酸基、下記式（６）〜（１１）のいずれかに示されるＮ−置換アミノ酸、そのエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）または下記式（１２）に示されるアミンを示す〕
【００２６】
【化４】
【００２７】
当該ビタミンＥ誘導体（以下、これを「本化合物」ともいう）は、式（Ｉ）で表されるように、ビタミンＥ（α，β，γ，δ−トコフェロール）マレイン酸（またはフマール酸）とＳＨ化合物とがＳ結合した化学構造、並びにこれらにさらにアミノ酸またはアミンが結合した化学構造を有している。
【００２８】
なお、上記式（Ｉ）中、Ｒ１またはＲ２で示される低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、及びイソプロピル基を挙げることができる。好ましくはメチル基及びエチル基であり、より好ましくはメチル基である。
【００２９】
また、上記式（Ｉ）中、Ｒ３またはＲ５で示されるＳＨ化合物としては、上記式に対応して（１）グルタチオン、（２）γ−グルタミルシステイン、（３）システイン、（４）ペニシラミン、これらのエステルまたは（５）システナミンを挙げることができる。なお、Ｒ３およびＲ５は、いずれか一方が水素原子である場合は、他方は水素原子ではなく、ＳＨ化合物またはそのエステルである。
【００３０】
また、上記式（Ｉ）中、Ｒ４で示されるＮ−置換アミノ酸としては、上記式に対応して（６）グリシン（式中ｎ＝１）、β−アラニン（式中ｎ＝２）、γ−アミノ酪酸（式中ｎ＝３）、５−アミノ吉草酸（式中ｎ＝４）、ε−アミノカプロン酸（式中ｎ＝５）、（７）アントラニル酸、（８）トラネキサム酸、（９）プロリン、これらのエステル、（１０）２−アミノエタンスルホン酸、（１１）２−アミノエタンスルフィン酸を挙げることができる。なお、本発明において「Ｎ−置換アミノ酸」とは、上記の各アミノ酸が、その分子内の窒素原子（Ｎ）を介して、式（Ｉ）で示される化合物の基本骨格に結合していることを意味する用語である。
【００３１】
また、上記式（Ｉ）中、Ｒ４で示されるアミンとしては、上記式に対応して（１２）セロトニンを挙げることができる。
【００３２】
本化合物の具体例としては、下記の化合物を挙げることができる。
（ａ）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン、
（ｂ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｃ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｄ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル] -3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ] プロピル]システニイルグリシン、
（ｅ）Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（2-スルフォエチル）アミノ] プロピル]システイン、
（ｆ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[[２-(1H-インドール-3-イル)エチル]アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｇ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（5-カルボキシペンチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｈ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（トランス-4-カルボキシシクロヘキシルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｉ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システイン、
（ｊ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]ペニシラミン、
（ｋ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システナミン、
（ｌ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（エトキシカルボニルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｍ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン イソプロピルエステル、
（ｎ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフィノエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｏ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-（2-カルボキシピロリジノ）プロピル]システニイルグリシン。
【００３３】
本化合物は、遊離のものであっても、その薬理学的に許容できる塩であっても、本発明の目的のため適宜に用いることができる。その薬理学的に許容できる塩としては、たとえばナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、およびカルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、さらに有機アミン塩としてエタノールアミン塩やリジン塩などが例示される。これら以外の塩であっても薬理学的に許容できる塩であればいずれのものであっても適宜に使用することができる。
【００３４】
本化合物の第一の構成成分であるビタミンＥとしては、α，β，γ，δ−トコフェロールのいずれもが適宜使用することができる。
【００３５】
本化合物の第二の構成成分であるＳＨ化合物としては、上記のように、（１）グルタチオン、（２）γ−グルタミルシステイン、（３）システイン、（４）ペニシラミン、これらのエステルまたは（５）システナミンが用いられる。グルタチオン、γ−グルタミルシステイン、システイン、ペニシラミンのエステルとしては、炭素数２〜６のアルキルエステルが挙げられる。具体的には、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、シクロプロピル、ｎ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、ｌ−エチルプロピルエステルおよびｉｓｏ−ペンチルエステルなどが挙げられる。
【００３６】
さらに、本化合物の第三の構成成分であるＮ−置換アミノ酸としては、上記のように、（６）グリシン（式中ｎ＝１）、β−アラニン（式中ｎ＝２）、γ−アミノ酪酸（式中ｎ＝３）、５−アミノ吉草酸（式中ｎ＝４）、ε−アミノカプロン酸（式中ｎ＝５）、（７）アントラニル酸、（８）トラネキサム酸、（９）プロリン、これらのエステル、（１０）２−アミノエタンスルホン酸、（１１）２−アミノエタンスルフィン酸が用いられる。
【００３７】
Ｎ−置換アミノ酸のエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）としては、炭素数２〜６のアルキルエステルが挙げられる。具体的には、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、シクロプロピル、ｎ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、ｌ−エチルプロピルエステルおよびｉｓｏ−ペンチルエステルなどが挙げられる。
【００３８】
本化合物の第四の構成成分であるアミンとしては、（１２）セロトニンが用いられる。
【００３９】
本化合物は、例えば次の合成経路により、またはこれに準じて適宜合成することができる。
【００４０】
【化５】
【００４１】
具体的には以下のとおりである。まずビタミンＥ（II）を無水マレイン酸（III）と炭酸アルカリ（炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなど）または酢酸アルカリ（酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなど）の存在下でアセトン、アセトニトリルまたはテトラハイドフラン（THE）などの無極性溶媒中で加熱して約１〜３時間反応させて、マレイン酸（またはフマール酸）モノトコフェロール（IV）とする。さらに、このように生成した化合物（IV）とアミノ酸（グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、ε−アミノカプロン酸、アントラニル酸、トラネキサム酸、プロリン、これらのエステル、２−アミノエタンスルホン酸、２−アミノエタンスルフィン酸）またはアミン（セロトニン）とを、クロロホルムまたはテトラヒドロフランなどの溶媒中、有機アミン（ピリジン、トリエチルアミンなど）の存在下、クロル炭酸エチルなどによる混合酸無水物法により縮合し、マレイン酸（またはフマール酸）モノトコフェロール（IV）のそれぞれ対応する酸アミド（V）とする。次に、これらの化合物（IV）または（V）と本化合物の構成成分であるＳＨ化合物（グルタチオン、γ−グルタミルシステイン、システイン、ペニシラミン、これらのエステルまたはシステナミン）とを室温下で約３〜６時間、加温下で約１〜３時間付加反応させることにより本化合物（Ｉ）を得ることができる。この際の反応溶媒としては、水または水と混和できる溶媒、たとえばアルコール、アセトニトリル、ジオキサンなどが挙げられ、好ましくは水との混合液がよい。
【００４２】
このようにして得られた本化合物（Ｉ）は、公知の方法により、薬理学的に許容できる塩として得てもよい。
【００４３】
後述する実験例２〜４に示すように、ビタミンＥ、グルタチオンから構成される化合物（上記化合物（a）、以下「EM-GS」ともいう）、ビタミンＥ、タウリン（アミノエタンスルホン酸）及びグルタチオンから構成される化合物（上記化合物（ｂ）、以下「ETS-GS」ともいう）、及びビタミンＥ、GABA（γ―アミノ酪酸）及びグルタチオンから構成される化合物（上記化合物（d）、以下「EGABA-GS」ともいう）を始めとする本化合物は、ＬＰＳで誘導されたサイトカイン(IL-6およびTNF-α)の生成または分泌を、完全ではないものの抑制することができる。これらのサイトカインは、通常ＬＰＳによって強く誘導され、炎症反応の初期の段階で生成分泌される。特にＴＮＦ−αは炎症を仲介する主要因子であり、その放出はさらにＩＫ−１βおよびＩＬ−６のような他のサイトカインを活性化し、細胞の損傷に関わることも知られている(Bone RC. Crit Care Med1996;24:163-172)。またＴＮＦ−αは、敗血症性ショックと関係する初期のショック状態(つまり低血圧、熱)や臓器不全の病因に極めて重要な役割を果たしている(Russell JA. N Engl J Med2006;355:1699-1713)。実験例２〜４に示すように、上記本化合物は、これらのサイトカインの生成または分泌を顕著に抑制することから、当該化合物によれば、かかるサイトカインが介在して発症したり悪化したりする疾患（サイトカイン介在疾患）を予防または改善できると考えられる。
【００４４】
一方、ＩＬ−６は敗血症の重篤度や致死によく関連しており、敗血症の予測因子でもある(Remick DG, et al., Shock2002;17:463-467)。ＩＬ−６もまた、敗血症性ショックおよび臓器障害の病因に重要な役割を果たすと考えられている(Frink M, et al., Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.)。あるデータは、ＩＬ−６の上昇制御が、その後に生じるＩＬ−６上昇に関連した細胞毒性や臓器障害に関係していることを示している（Frink M, et al., Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.）。さらには、ＩＬ−６の制御が臓器障害の軽減作用を有している可能性が示唆されている（Kimizuka K, et al., Am J Transplant. 2004 Apr;4(4):482-94.）。後述する実験例２〜３において、ＬＰＳで誘導されたＩＬ−６が、インビボ及びインビトロの両方で、本化合物の投与で減少することが確認された。本化合物投与によるＩＬ−６の抑制は、細胞に対する直接効果、あるいはサイトカイン生成を抑制することによる間接的な効果によるものであるかもしれないが、いずれにしても本化合物によれば、ＩＬ−６の生成が抑制され、ＩＬ−６による細胞毒性は低下し、敗血症性ショックや臓器障害を改善することができると考えられる。
【００４５】
これを裏付ける実験として、後述の実験例１では、本化合物がＬＰＳで誘導した全身性炎症モデルラットにおける肺および肝臓における急性臓器障害が改善することを示している。
【００４６】
以上のことから、本化合物は、炎症性サイトカインが介在する様々な疾患、特に全身性炎症及びそれに付随する疾病（例えば、敗血症性ショック、急性臓器障害、臓器不全等）を治療する潜在的可能性を有している。
【００４７】
また後述する実験例６〜８の結果は、本化合物の投与によって虚血再還流による腎臓や脳などの組織障害が保護改善されることを示している。従来から、虚血再還流に起因する臓器障害がサイトカイン生成に関係していることが示唆されており、心筋と大脳の虚血再還流（I/R）によってサイトカインが増加することが報告されている(Zhang M, Chen L. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2008 Sep;8(3):161-72.)。前述するよう本化合物は、サイトカイン低減作用を有するが、当該サイトカイン低減作用に基づいて血清サイトカイン濃度を著しく低下させる結果、腎虚血再還流障害や脳虚血再還流障害等の虚血性再還流障害が保護され防止できるものと考えられる。
【００４８】
また後述する実験例５の結果は、本薬剤投与により臓器障害における重要な細胞内因子であるＮＦ-kＢの抑制効果が示されている。各種臓器障害においてその病態形成には、前述のようにサイトカインの産生が重要であるが、これらの因子の発現には細胞内シグナルであるＮＦ-kＢの活性化が重要な役割を担っていることが報告されている（Karrasch T, et al., Inflamm Bowel Dis. 2008 Jan;14(1):114-24.）。前述する本化合物は、ＮＦ-kＢの活性化をほぼ完全に抑制することから、サイトカインの抑制を生じ、各種臓器障害に対する保護効果が得られたものと考えられる。
【００４９】
また、同実験結果より、本化合物によるＮＦ-kＢの抑制にはＩｋＢ系の抑制を介していることが示されている。各種細胞障害時に活性化されるＮＦ-kＢにおいては、ＩＫＫ系を介した活性化が重要であることが報告されており（Schottelius AJ, et al., J.Biol.Chem 274:31868-31874. 1999.）、本発明においても本化合物が細胞内シグナルであるＩＫＫ系の抑制を行ない、最終的な核内蛋白であるＮＦ-kＢの抑制が生じていると考えられる。
【００５０】
従って、本化合物は、サイトカイン、特にＴＮＦαやＩＬ−６が介在して発症若しくは悪化する疾患（サイトカイン介在疾患）を予防または治療するための有効成分として有用であり、当該本化合物を有効成分とする本発明の医薬組成物は、かかるサイトカイン介在疾患の予防または治療剤、またサイトカイン介在疾患から保護する保護剤として有用である。
【００５１】
本発明が対象とするサイトカイン介在疾患としては、パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛を挙げることができる。
【００５２】
特に本発明のサイトカイン介在疾患剤は、サイトカインが介在して発生する敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全を予防又は治療する薬剤として、またさらに虚血再還流障害に対する臓器または組織の保護剤として有効に利用することができる。なお、虚血再還流障害（「虚血再灌流障害」ともいう）とは、虚血状態にある臓器や組織に血液再還流が生じたときに、その臓器や組織内の微小循環において種々の毒性物質の産生が惹起されることで引き起こされる障害である。かかる虚血再還流障害は、例えば脳梗塞、心筋梗塞及び腸間膜血管閉塞症などに対する再還流障害後や、臓器移植後にみられることが多い。その発生機序としては、スーパーオキシドやヒドロキシラジカル等の活性酸素や一酸化窒素などのフリーラジカル産生による障害、及び活性化好中球と血管内皮細胞の相互作用に基づく障害のほか、各種サイトカインなどのケミカルメディエーター産生による障害などが考えられている。虚血再還流障害は、虚血状態に陥った局所だけでなく、二次的に全身の主要臓器にも障害（遠隔臓器障害）をきたすことが知られている。特に脳、肺、肝臓、腎臓などが標的臓器となり、多臓器不全をもたらすこともある。
【００５３】
本化合物を抗サイトカイン介在疾患剤の有効成分として用いる場合、目的と必要に応じて、本化合物のうち１種または２種以上を適宜組み合わせて含有させることもできる。本化合物のうち、好ましくは上記化合物（ａ）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン〔R1及びR2はメチル基、R3は水素原子、R4は水酸基、R5は(1)で示されるSH化合物(グルタチオン)である化合物(I)に相当する〕、（ｂ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン〔R1及びR2はメチル基、R3は(1)で示されるSH化合物(グルタチオン)、R4は(10)で示されるN-置換アミノ酸(2-アミノエタンスルホン酸)、R5は水素原子である化合物(I)に相当する〕、（ｄ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ] プロピル]システニイルグリシン〔R1及びR2はメチル基、R3は(1)で示されるSH化合物(グルタチオン)、R4は(6)で示されるN-置換アミノ酸(γ-アミノ酸酪酸：n=3)、R5は水素原子である化合物(I)に相当する〕であり、より好ましくは化合物（ｂ）である。
【００５４】
ちなみに、化合物（a）、（b）および（d）の化学的な相違は（a）はビタミンＥマレイン酸エステルに対して１位にグルタチオンが付加したものである。（b）、および（d）は２位にグルタチオンがそれぞれ付加し、更に３位のカルボン酸に２−アミノエタンスルホン酸（タウリン）またはγ−アミノ酪酸（GABA）がそれぞれ縮合したものである。
【００５５】
本化合物は、抗サイトカイン介在疾患剤として、経口的にあるいは非経口的〔静脈投与、皮下投与、経皮投与、経肺投与、経粘膜投与（点鼻など）、直腸投与など〕に投与される。抗サイトカイン介在疾患剤は、本化合物を、経口または非経口投与に通常用いられる薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、湿潤剤など）や添加剤などと混合し、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、バッカル剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤、注射剤、点滴剤、点鼻剤などの所望の形態に製剤化することにより調製することができる。
【００５６】
特に本化合物は、水に不溶性のビタミンＥと異なり、非吸湿性の安定な結晶であって、且つ、水溶性であるので、経口液剤（アンプル剤、シロップ剤）、注射剤または点眼剤などの水性液剤としての適用も可能である。さらには、外用薬としての使用も可能である。
【００５７】
これらの製剤には通常用いられる薬学的に許容される担体、例えば、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドン）、賦形剤（例えば、乳糖、砂糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、増粘剤、分散剤等、またその他の添加剤として、再吸収促進剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤等を適宜使用してもよい。
【００５８】
本化合物を抗サイトカイン介在疾患剤として使用する際の投与量は、使用する本化合物の種類、患者の体重や年齢、対象とする疾患の種類やその状態および投与方法などによっても異なるが、たとえば、本化合物の量に換算して、注射剤の場合は成人１日１回約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、錠剤等の経口投与剤の場合は、成人１日数回、１回量約１ｍｇ〜約１００ｍｇ程度投与するのがよい。また、点眼剤等のような粘膜投与剤の場合は、成人１日数回、１回数滴、濃度が約０．０１〜５（ｗ／ｖ）％の製剤を投与するのがよい。
【００５９】
本化合物を含有する医薬組成物（抗サイトカイン介在疾患剤）には、本発明の目的に反しない限り、その他の抗サイトカイン介在疾患剤または別種の薬効成分を適宜含有させてもよい。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明の構成および効果を製造例及び実験例に基づいてより詳細に説明する。但し、これらの実験例等は一例であり、本発明はかかる実験例によって何ら拘束されるものではない。
【００６１】
[製造例]
製造例１
（１）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン（略称：EM-GS）のモノナトリウム塩の製造
ｄｌ−α−トコフェロール４．３ｇ（0.01モル）、無水マレイン酸２．０ｇ（0.02モル）および炭酸ナトリウム２．１ｇ（0.02モル）にアセトン８０ｍｌを加えて１時間、加熱還流した後、無機塩を濾別し、溶媒を留去した。残渣油状物に水６０ｍｌを加え、さらに塩酸で酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。次にこれを水で洗浄した後、酢酸エチルを留去させ、残渣油状物のマレイン酸モノα−トコフェロールエステル約５ｇを得た。次に７０％メタノール１００ｍｌに水酸化ナトリウム０．６ｇおよびグルタチオン３．４ｇ（0.011モル）を加えて溶解し、これに上記のマレイン酸モノα−トコフェロールエステルをメタノール３０ｍｌに溶解したものを加えて、４０℃、３時間攪拌した。次にこれを冷却し析出した半固型油状物を集め、８０％含水メタノールで２〜３回洗い、次にメタノールを加えて結晶化させ、結晶を濾取しアセトンで洗い４．０ｇを得た。これを水−エタノールから再結晶して、標題の化合物のモノナトリウム塩２．８ｇを得た。
【００６２】
（２）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシンの製造
ｄｌ−α−トコフェロール４．３ｇ、無水マレイン酸３．０ｇおよび酢酸ナトリウム１．５ｇにアセトン８０ｍｌを加えて３時間、加熱還流した後、溶媒を留去し、残渣油状物に水６０ｍｌを加え、さらに塩酸で酸性とした後、ジイソプロピルエーテルで抽出し、水洗後、ジイソプロピルエーテルを留去させ、残渣油状物のマレイン酸モノα−トコフェロールエステル（放置すると結晶化）５．１ｇを得た。（これをｎ−ヘキサンから再結晶すると融点７０〜７２℃の白色結晶３．８ｇを得ることができる。）次にメタノール８０ｍｌに水酸化ナトリウム０．６ｇを加えて溶解し、これにグルタチオン３．４ｇおよび上記のマレイン酸モノα−トコフェロールエステルをエタノール３０ｍｌに溶解したものを加えて、５０℃、３時間攪拌した。次に、これを冷却し析出した白色結晶を濾取し、アセトンで洗浄後、この結晶に水１００ｍｌを加えてのり状とし、これに塩酸を加えてｐＨ３とし、析出する白色結晶を濾取、水洗し、乾燥後テトラハイドロフラン／エタノールから再結晶して、標題の遊離酸３．５ｇを得た。
【００６３】
（３）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン ２ナトリウム塩の製造
上記（２）で得られた遊離酸を３．５ｇテトラハイドロフラン６０ｍｌに溶かし、これに水酸化ナトリウム／メタノールを徐々に加えてｐＨ６．５とした後、溶媒を留去し、これにメタノールを加えて析出する白色結晶を濾取し、これを水−メタノールから再結晶して、標題の化合物の２ナトリウム塩３．０ｇを得た。
【００６４】
製造例２ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（略称：ETS-GS)のナトリウム塩の製造
製造例１の製造過程で得られたマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇをクロロホルム３０ｍｌに溶かし、これにトリエチルアミン１．２ｇを加えて−５℃に冷却して置き、これにクロル炭酸エチル１．３ｇを徐々に滴下した後、１５分後にこれにタウリン（２−アミノエタンスルホン酸）１．６ｇおよび水酸化ナトリウム０．５ｇをメタノール５０ｍｌに溶かしたものを一挙に加えて３０分間攪拌し、更に室温にもどして１時間攪拌した。次に溶媒を留去させ、これにアセトンを加えて析出する白色結晶を濾取し、４．０ｇを得た。更に母液に水酸化ナトリウム／メタノールを加えてｐＨ８として析出する結晶を濾取し１．６ｇを得た。これらを合わせてメタノール／エタノールから再結晶して、白色結晶のＮ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸ナトリウム塩４．５ｇを得た。
【００６５】
次に、９０（Ｖ／Ｖ）％メタノール溶液６０ｍｌに水酸化ナトリウム０．４５ｇおよびグルタチオン３．３ｇを加えて溶解し、これに上記の化合物４．５ｇをメタノール５０ｍｌに溶解したものを加えて、５０℃、３時間攪拌し、冷却後析出した白色結晶を濾取し、メタノールで洗浄し６．０ｇを得た。これを水２００ｍｌに溶かし、これに酢酸銅２．５ｇを水５０ｍｌ、酢酸２ｍｌに溶解したものを加えて析出する銅塩を濾取し、水洗後アセトン、メタノールで洗い５．３ｇを得た。これをテトロラハイドロフラン／メタノール（３：５）の混液１００ｍｌに懸濁して置き、これに硫化水素を通じて硫化銅として濾別後、濾液に水酸化ナトリウム／メタノールを加えてｐＨ５として析出する白色結晶を濾取し、メタノールで洗浄して乾燥させて、標題の目的化合物のナトリウム塩３．９ｇを得た。
【００６６】
製造例３ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（略称：Ｅ-Ant-S-ＧＳ）のナトリウム塩の製造
製造例１の製造過程で得られたマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、製造例１と同様にトリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇを用いて混合酸無水物法によりアントラニル酸１．５ｇ、ピリジン３ｍｌをテトラハイドロフラン４０ｍｌに溶かしたものを反応させ、溶媒留去後、塩酸酸性として酢酸エチルで抽出、水洗後、酢酸エチルを留去し、残渣油状物７．５ｇを得た。
【００６７】
一方、メタノール７０ｍｌに水酸化ナトリウム０．８ｇを加えて溶かし、これにグルタチオン３．３ｇおよび上記の油秋物７．５ｇをメタノール２０ｍｌに溶かしたものを加えて、５０℃、３時間攪拌する。次に冷却後、析出した白色結晶を濾取した。これに水５０ｍｌを加えてゲル状とし、これに酢酸３ｍｌを加えて析出する白色結晶を濾取し、これを酢酸エチル／エタノールの混液に溶解し、水酸化ナトリウム／メタノール液を加えてＰＨ６．５として析出する白色結晶を濾取し、テトラハイドロフラン／エタノールから再結晶して、標題の目的化合物のナトリウム塩３．７ｇを得た。
【００６８】
製造例４ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（略称：EGABA-GS)のナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇをクロロホルム３０ｍｌに溶かし、前記と同様にトリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇを用いて混合酸無水物法によりγ−アミノ酪酸 (GABA)１．３ｇ、水酸化カリウム０．６ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド５０ｍｌに溶解したものを加えて、以下製造例３と同様に反応処理して標題の目的化合物のナトリウム塩４．０ｇを得た。
【００６９】
製造例５ Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（2-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システインのナトリウム塩の製造
製造例２で示したＮ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸のナトリウム塩２．４ｇをメタノール５０ｍｌに溶かし、これにＬ−システイン０．６ｇを加えて、５０℃、２時間攪拌する。次に冷却後析出する白色結晶を濾取し、水／メタノールから再結晶して、白色結晶の標題の目的化合物のナトリウム塩１．８ｇを得た。
【００７０】
製造例６ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[[２-(1H-インドール-3-イル)エチル]アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇ、トリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇをクロロホルム中で製造例１と同様に混合酸無水物法によりセロトニン塩酸塩２．４ｇ、トリエチルアミン１．５ｇをメタノール４０ｍｌに溶かしたものを加え、製造例２と同様に反応させ、溶媒を留去後、残渣油状物を酢酸エチルで抽出し、１％酢酸、水で洗った後、酢酸エチルを留去した。これにメタノールを加えて放置し、析出する白色結晶をメタノールから再結晶して、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）セロトニンなる化合物４．５ｇを得た。次に、これとグルタチオン３．４ｇ、水酸化ナトリウム０．４ｇにメタノール７０ｍｌを加えて、５０℃、３時間攪拌後、反応液を３０ｍｌまで濃縮し、析出した結晶を濾取し、以下製造例３と同様に処理して、標題の目的化合物のナトリウム塩３．７ｇを得た。
【００７１】
製造例７ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（5-カルボキシペンチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇ、トリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇおよびε−アミノカプロン酸１．５ｇを用いて、製造例２と同様に混合酸無水物法により反応処理して、溶媒を留去後残渣に水を加え、更に塩酸酸性として酢酸エチルで抽出し水洗後留去した。これをメタノール７０ｍｌに溶かし、これにグルタチオン３．３ｇを加え、さらに水酸化ナトリウム／メタノールでｐＨ６．５として、５０℃、３時間攪拌した後冷却し、析出する結晶を濾取し、これに水５０ｍｌを加えた。更にこれを酢酸酸性として結晶を濾取し、水洗後ＴＨＦ／エタノールに溶解し、ＴＨＦ留去後、水酸化ナトリウム／メタノールでｐＨ７として析出する白色結晶を濾取し、これをメタノール／エタノールから再結晶して標題の目的化合物の２−ナトリウム塩２．５ｇを得た。
【００７２】
製造例８ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（トランス-4-カルボキシシクロヘキシルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇ、トリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇおよびトラネキサム酸（トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸）１．７ｇを用いて、製造例７と同様に反応処理して目的化合物の２−ナトリウム塩２．２ｇを得た。
【００７３】
製造例９ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システインのナトリウム塩の製造
製造例２で得た中間体、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸ナトリウム塩２．６ｇおよびγ−グルタミルシステイン１．０ｇにメタノール５０ｍｌを加え、更に水酸化ナトリウム／メタノールでＰＨ６．５として、５０℃、３時間攪拌した。次に反応液を２０ｍｌまで濃縮し、析出した白色結晶を濾取し、これに水７０ｍｌを加えて溶かし、塩酸でｐＨ３として析出する白色結晶を濾取した。次に、これをＴＨＦ／エタノールに溶かし、水酸化ナトリウム／メタノールでｐＨ６．５として、ＴＨＥを留去後、析出した結晶を濾取し、少量のメタノールで洗い、メタノール／エタノールから再結晶して、標題の目的化合物の２−ナトリウム塩１．３ｇを得た。
【００７４】
製造例１０ Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]ペニシラミンのナトリウム塩の製造
製造例２で得た中間体、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸ナトリウム塩３．２ｇおよびＤ−ペニシラミン０．８ｇを用いて、製造例５と同様に反応処理して得られる結晶をメタノール／エタノールから再結晶させて、目的化合物のナトリウム塩２．５ｇを得た。
【００７５】
製造例１１ Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システナミンの製造
製造例２で得た中間体、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸ナトリウム塩２．４ｇおよびシステナミン０．５ｇをメタノール７０ｍｌに溶解し、酢酸を加えてｐＨ６とし、５０℃、３時間攪拌した。冷後析出した結晶を濾取し、これをメタノールに懸濁しておき、水酸化ナトリウム／メタノールでｐＨ７として溶解後、酢酸酸性として析出する白色結晶を濾取し、メタノールで洗って乾燥させて、白色結晶の標題の目的化合物１．３ｇを得た。
【００７６】
製造例１２ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（エトキシカルボニルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇ、トリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇおよびグリシンエチル塩酸塩１．５ｇを用いて、製造例２と同様に混合酸無水物法により反応処理して、溶媒を留去後、酢酸エチルで抽出し、３％炭酸水素ナトリウム、１Ｎ−塩酸、水の順で洗浄し、酢酸エチル留去後、残渣油状物約６ｇを得た。これをメタノール５０ｍｌに溶かした。一方、グルタチオン３．３ｇ、水酸化ナトリウム０．５ｇを７０％メタノール５０ｍｌに溶かし、上記のメタノール溶液に加えて５０℃、２時間攪拌する。次に溶媒を留去しエタノールを加えて析出した結晶を濾取し、これに水５０ｍｌを加えて溶解し、これに塩酸を加えて析出する白色結晶を濾取し、ＴＨＦ／エタノール（１：１）に溶解し、製造例７と同様にして標題の目的化合物のナトリウム塩２．０ｇを得た。
【００７７】
製造例１３ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン イソプロピルエステルのナトリウム塩の製造
グルタチオンイソプロピルエステル硫酸塩（γ−グルタミル−システニルグリジンイソプロピルエステル硫酸塩）４．０ｇを水６０ｍｌに懸濁しておき、これに２Ｎ−水酸化ナトリウムを徐々に加えてｐＨ４として溶解後、濃縮した。これに８０％メタノール１００ｍｌを加え、更に製造例２で得た中間体、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸のナトリウム塩４．８ｇを加えて、５０℃、３時間攪拌する。次に溶媒を約６０ｍｌ留去し、析出する結晶を濾取した。これにＴＨＥ−メタノール（１：１）に溶解し、不溶物を濾別した後、溶媒を留去、残渣結晶物にエタノールを加えて結晶を濾取した。これをメタノール／エタノールから再結晶させて白色結晶の標題の目的化合物のナトリウム塩３．６ｇを得た。
【００７８】
製造例１４ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフィノエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例７のε−アミノカプロン酸の代わりにヒポタウリン（２−アミノエタンスルフィン酸）１．５ｇを用いて、製造例２と同様に反応処理して、標題の目的化合物のナトリウム塩３．９ｇを得た。
【００７９】
製造例１５ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-（２-カルボキシピロリジノ）プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例７のε−アミノカプロン酸の代わりにＬ−プロリン１．５ｇを用いて、製造例２と同様に反応処理して、標題の目的化合物のナトリウム塩３．９ｇを得た。
【００８０】
［実験例］
下記の実験において、本化合物の一例として、下式で示される化合物を用いた。これらの化合物はいずれも水溶性で、安定であることを特徴とする。
（１）式（VI）で示す構造を有するＥＴＳ−ＧＳ（製造例２のγ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（上記（ｂ）の化合物）のナトリウム塩）：
【００８１】
【化６】
【００８２】
（２）式（VII）で示す構造を有するＥＭ−ＧＳ（製造例1のγ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル] -3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン（上記（a）の化合物）のナトリウム塩）：
【００８３】
【化７】
【００８４】
（３）式（VIII）で示す構造を有するＥＧＡＢＡ−ＧＳ（製造例４のγ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（上記（d）の化合物）のナトリウム塩）：
【００８５】
【化８】
【００８６】
（４）式（IX）で示す構造を有するＥ-Ant-S-ＧＳ（製造例３のγ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（上記（c）の化合物）のナトリウム塩）：
【００８７】
【化９】
【００８８】
実験例１〜４
腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン-6（IL-6）のような前炎症性サイトカインの過剰発現は、ショックや臓器障害に関与している(Bhatia M, et al., J Pathol2004;202:145-156)。
【００８９】
そこで下記の実験例１〜４では、本化合物が、サイトカイン（TNF-α、IL-6）の生成または分泌を阻害し、それにより、リポ多糖体で誘導した全身性炎症モデルラット（敗血症モデルラット）における臓器障害を改善するかどうかについて調べた。
【００９０】
なお、この実験には、下記の方法によりＥＴＳ−ＧＳの存在下または非存在下でＬＰＳ処置したラット（LPS誘導敗血症モデル動物）を使用した。
【００９１】
なお、データはすべて平均値±ＳＤとして示し、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して評価した。 p-値<0.05を統計的有意とした。
【００９２】
（１）被験動物
体重２５０-３００ｇの雄ラット（Wister rat）を使用した。ラットはすべて、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。研究は大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認された。すべてのプロトコルは国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに沿って行った。麻酔は4%のセボフルラン（丸石製薬（株）製）を用いて行った。
【００９３】
（２）被験動物のＬＰＳ処置（LPS誘導敗血症モデル動物の調製）
ラットは、無作為に３つのグループに分けた（LPS群、ETS-GS+LPS群、対照群）。１)ＬＰＳ群には、ＬＰＳ(7.5mg/kg)を尾静脈に静脈注射、２)ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群には、ＥＴＳ―ＧＳ(10mg/kg)およびＬＰＳ(7.5mg/kg)を同時に尾静脈に静脈注射、３)対照群には０.９％のＮａＣｌ水溶液を尾静脈に静脈注射した。
【００９４】
実験例１ ＬＰＳ処置後の肺および肝臓組織に対するＥＴＳ−ＧＳの影響
（１）光学顕微鏡分析
ＬＰＳ投与から２４時間後に採取したラットの肺及び肝臓の組織標本（LPS群、ETS-GS+LPS群、対照群）を定法に従ってホルマリンに固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した。そのサンプルを分析し、村上の技術 (Murakami K, et al., Shock2002;18:236-241)に基づいて肺障害の程度を決定した。肺実質中の24のエリアを、４つのパラメーター（鬱血、浮腫、炎症および出血）に関して０〜４の５段階に類別した（０：無しまたは正常にみえる、１：軽度、２：中度、３：重度、４：非常に重度）。またHeijnenの技術(Heijnen BH, et al., Surgery 2003;134:806-817)に従って肝障害の程度を評価した。肝障害は、6つのパラメーター（細胞質の退色、液胞化、核凝縮、核分割、核フェージングおよび赤血球鬱滞）について０(認められない)から１(軽度)、２(中度)および３(重度)までの４段階にスコア化した。
【００９５】
各染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図１に示す。
【００９６】
肺の組織変化は対照群(図１Ａ)では観察されなかったが、ＬＰＳ群の肺組織で顕著な間質性の浮腫および炎症細胞の浸潤がみとめられた(図１Ｂ)。ＥＴＳ−ＧＳ処置したＬＰＳ群（ETS-GS+LPS群）では、間質性の浮腫および炎症細胞の浸潤が、ＬＰＳ群と比較して、顕著に低減されていた(図１Ｃ)。肺組織に関する組織学的スコアの結果を図２に示す。これからわかるように、ＬＰＳ群（白棒）の肺組織の組織学的スコアは、対照群（黒棒）のスコアと比較して、すべて著しく高く、ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群（斜線棒）のスコアはその中間であった。
【００９７】
一方、肝臓組織に関しては、ＬＰＳ群の肝臓組織で、対照群(図１Ｄ)と比較して、顕著な出血および炎症細胞の浸潤が見られた(図１Ｅ)。ＥＴＳ−ＧＳ処置したＬＰＳ群（ETS-GS+LPS群）では、ＬＰＳ群と比較して、間質性の出血および炎症細胞の浸潤が、著しく低減していた(図１Ｆ)。肝臓組織に関する組織学的スコアの結果を図３に示すが、上記と同様に、ＬＰＳ群において、対照群と比較して、組織学的スコアはすべて著しく高く、ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群のスコアはその中間であった。
【００９８】
この結果から、ＬＰＳ投与で誘導される全身性炎症モデル動物（敗血症モデル動物）における肺組織及び肝臓組織の急性障害が、ＥＴＳ−ＧＳの投与により有意に予防若しくは改善されることが判明した。
【００９９】
実験例２ ＬＰＳ投与後の血清ＩＬ−６およびＴＮＦ−αレベルに対するＥＴＳ−ＧＳの影響
ＬＰＳで誘導したサイトカイン（IL-6、TNF-α）に対するＥＴＳ−ＧＳの影響を調べた。実験はＬＰＳ投与後、１２時間に亘って血清サンプル（LPS群、ETS-GS+LPS群、対照群）を採取することで実施した。
【０１００】
（１）サイトカインの測定
血清中のＩＬ−６およびＴＮＦ-αの濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットとＩＬ−６およびＴＮＦ-αのそれぞれに対するラット特異的モノクローナル抗体（Invitrogen社）を用いて分析した。吸光度は540nmで測定した(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)。
【０１０１】
（２）結果
血清中のＴＮＦ-α濃度、ＩＬ−６濃度の経時的変化を図４Ａ及びＢにそれぞれ示す。
【０１０２】
血清中のＴＮＦ−α濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、ＬＰＳ群とＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群では増加が認められ、いずれもＬＰＳ投与後３時間でピークに達した。しかし、その増加の程度は、ＬＰＳ群と比較して、ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群では著しく低かった(図４Ａ)。同様に、血清中のＩＬ−６濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、ＬＰＳ群およびＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群ともに、ＬＰＳ投与後３時間でピークに達した (図４Ｂ)。しかし、その増加の程度は、ＴＮＦ−α濃度と同様に、ＬＰＳ群と比較して、ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群では著しく低かった(図４Ｂ)。
【０１０３】
これらの結果から、ＬＰＳ投与（LPS刺激）によって誘導されるサイトカイン（IL-6、TNF-α）はいずれもＥＴＳ-ＧＳにより有意に抑制されることが判明した。
【０１０４】
実験例３ ＬＰＳで刺激したマウスマクロファージによるサイトカイン（IL-6及びTNF-α）及びＨＭＧＢ１生成に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7（1×106細胞）を、５％の加熱不活性化したウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン(50units/ml、Gibco BRL) およびストレプトマイシン(50μg/ml、Gibco BRL)を含むRPMI 1640培地(和光純薬工業)中で、５％のＣＯ2の下、３７℃で培養して、培地に分泌されたＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＨＭＧＢ１（high-mobility group box1 protein）の量を測定した（対照群）。またＬＰＳ群として、上記の培地にＬＰＳ(100ng/ml)を添加し、またＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群として、上記の培地にＥＴＳ-ＧＳ（0.0001〜100μg/ml）とＬＰＳ(100ng/ml)を添加し、上記と同様に培養して培地に分泌されたＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＨＭＧＢ１の量を測定した。なお、ＨＭＧＢ１は、３０ｋＤの非ヒストン性染色体関連タンパク質であり（Bianchi ME, et al., Science, 1898;243:1056-1059）、その血清中の濃度は、重度の敗血症や敗血症ショックにより増加することが報告されている（Wang H, et al., Science 1999; 285:248-251）。また、ＨＭＧＢ１は、後期の炎症応答を増幅し、サイトカイン分泌を促進することが知られているが（サイトカインメディエーター）（van Zoelen MA, et al., Shock 2009;31:280-284）、最近、致死性敗血症の末期のメディエーターとして、また虚血再還流障害の初期のメディエーターとして機能することがわかっている（Tsung A, et al., J Exp Med 2005; 201:1135-1143）。
【０１０５】
ＴＮＦ-α生成量（pg/ml）を図５（Ａ）に、ＩＬ-６生成量（pg/ml）を図５（Ｂ）に、ＨＭＧＢ１生成量（ng/ml）を図５（Ｃ）それぞれ示す。
【０１０６】
結果からわかるように、培地にＬＰＳを添加することで（LPS群）（図中、LPS：＋、ETS-GS：0）培地に大量のＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＨＭＧＢ１が分泌されたが、ＬＰＳと共にＥＴＳ-ＧＳを添加することでその分泌量はいずれも低減した（ETS-GS＋LPS群）（図中、LPS：＋、ETS-GS：100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001μg/ml）。ＥＴＳ-ＧＳ添加によるＩＬ-６、ＴＮＦ-α及びＨＭＧＢ１分泌の抑制効果は、いずれも用量依存的であり、100μg/mlのＥＴＳ-ＧＳ添加で最も大きかった。
【０１０７】
これらの結果から、ＬＰＳ投与（LPS刺激）によって誘導されるＨＭＧＢ１（サイトカインメディエーター）及びサイトカイン（IL-6、TNF-α）は、いずれもＥＴＳ-ＧＳにより有意に抑制されることが確認された。
【０１０８】
実験例４ 各種水溶性ビタミンＥ誘導体による抗サイトカイン効果
上記実験例３と同様の方法で、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7を用いて、各種のビタミンＥ誘導体（ETS-GS、EM-GS、EGABA-GS）の抗サイトカイン効果を調べた。なお、サイトカインとしてＴＮＦ-αを用いた。
【０１０９】
具体的には、RAW264.7細胞培養の上清液中にＬＰＳ100ng/mlの添加を行うと同時に各種ビタミンＥ誘導体（VE誘導体）を表１に示す濃度にて添加し、２０時間培養した後の培養液中のＴＮＦ-α濃度をＥＬＩＳＡ法にて検討した。結果を表１に示す。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
この結果、ＥＭ−ＧＳやＥＧＡＢＡ-ＧＳといったビタミンＥ誘導体も、ＥＴＳ-ＧＳとほぼ同程度の抗サイトカイン作用（サイトカイン低減作用）を有していることが示された。つまり、これらのビタミンＥ誘導体はいずれの濃度および誘導体においてもＬＰＳのみの投与（培養液中のTNF-α濃度：812.3 ± 25.6 (pg/ml)）に比べて、有意にサイトカインの生成を抑制できることが示された（ｐ＜０．０５））。
【０１１２】
実験例５ ＬＰＳ誘導によるｐ５０/ｐ６５ＤＮＡ結合増加に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（１）ＬＰＳで誘導したp50/p65 ＤＮＡ結合の増加に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7（1×106細胞）を、５％の加熱不活性化したウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン(50units/ml、Gibco BRL) およびストレプトマイシン(50μg/ml、Gibco BRL)を含むRPMI 1640培地(和光純薬工業)中で、５％のＣＯ2の下、３７℃で１時間培養した（対照群）。またＬＰＳ群として、培地にＬＰＳ(100ng/ml)を添加し同様に１時間培養した。またＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群として、培地にＬＰＳ(100ng/ml)とともにＥＴＳ-ＧＳ（100μg/ml）を添加し、同様に１時間培養した。
【０１１３】
斯くして培養したマウスマクロファージ細胞株RAW264.7（対照群、LPS群、ETS-GS＋LPS群）を回収した後Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(PIERCE）を用いて核内蛋白質のみを抽出し、得られた核溶解物中でのＮＦ-kＢ(p50/p65)のＤＮＡ結合活性を、ＥＬＩＳＡに基づく非放射性のＮＦ-kＢ (p50/p65) transcription factor assay kit (Millipore)を使用して測定した。
【０１１４】
結果を図６に示す。この結果からわかるように、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7の核分画中のＮＦ-kＢ(p50/p65)のＤＮＡ結合活性はＬＰＳ刺激後１時間で増加した（図中、白棒、LPS：＋、ETS-GS：0）。 しかし、ＬＰＳとＥＴＳ-ＧＳの両方で処置すると、この増加は有意に抑制された（図中、灰色棒、LPS：＋、ETS-GS：100μg/ml）。このことから、ＬＰＳ刺激により増加したRAW264.7細胞核分画中のＮＦ-kＢ(p50/p65)のＤＮＡ結合活性は、ＥＴＳ-ＧＳによって低減することがわかる。
【０１１５】
（２）ＬＰＳで誘導したタンパク質のリン酸化に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（2-1）ＬＰＳで誘導したＩkＢリン酸化に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
上記で培養したマウスマクロファージ細胞株RAW264.7（対照群、LPS群、ETS-GS＋LPS群）を回収した後Mammalian Extraction Reagents(PIERCE）を用いて細胞蛋白を調製し、細胞質のリン酸化ＩｋＢレベルを測定した。リン酸化ＩｋＢ レベルは、ＩｋＢα、リン酸化ＩｋＢα、及びβアクチンにそれぞれ特異的な抗体（抗phospho-IKBα (p-IkBα)抗体、IkB alpha抗体：Cell Signaling Technology、抗βアクチン抗体：Abcam）を使用して、ウエスタンブロッティング分析により測定した。
【０１１６】
なお、ウエスタンブロッティング分析は、各細胞株（対照群、LPS群、ETS-GS＋LPS群）から調製したタンパク質をSDS-PAGEゲル電気泳動に供し、まずポリビニリデン・ジフルオリド膜(ミリポア)に転写した。次いで転写した膜を第１抗体(1:1000稀釈)で培養し、第２抗体で培養した後、enhanced chemiluminescence detection kit (Amersham)を使用して発色させて、Hyperfilm ECL(アマシャム)に供した。
【０１１７】
結果を図７に示す。図に示すようにＬＰＳによる処置は、ＩkＢαをリン酸化し、結果としてＩkＢαの低下をもたらした（図中、LPS：＋、ETS-GS：0）。このＩkＢαリン酸化、及びそれに伴うＩkＢαの低下は、ＥＴＳ-ＧＳを投与することで抑制された（図中、LPS：＋、ETS-GS：100μg/ml）。
【０１１８】
（2-2）AKt、ERK1/2、JNK、MAPK、及びIkBのリン酸化に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
上記で培養したマウスマクロファージ細胞株RAW264.7（対照群、LPS群、ETS-GS＋LPS群）を回収した後Mammalian Extraction Reagents(PIERCE）を用いて細胞蛋白を調製し、Aktのレベル、及び各種タンパク質（A：Akt、B:extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2)、C:c-jun N-terminal kinase (JNK)、D:p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK)、Ｅ：IκBα）のリン酸化レベルをBio-Plexアッセイにより測定した。結果をそれぞれ図８（Ａ）〜（Ｅ）に示す。
【０１１９】
図８（Ａ）に示すようにＬＰＳによって減少したAktのリン酸化、つまりAktのシグナル活性がＥＴＳ-ＧＳの投与により回復することがわかった。このことはＥＴＳ-ＧＳの作用が、P13K-Akt経路の活性化に関係していることを示唆する。P13K-Aktシグナル経路は、抗壊死性でまた抗アポトーシス性である。このことから、ＥＴＳ-ＧＳは、P13K-Akt経路の活性化を介して、内毒素血症や敗血性ショックの予防及び改善に有効に働くことが示唆される。
【０１２０】
一方、図８（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、ＬＰＳによって誘導された各種タンパク質（ERK1/2、JNK、p38 MAPK）のリン酸化は、ＥＴＳ-ＧＳの投与により抑制された。これらのタンパク質（ERK1/2、JNK、及びp38 MAPK）は、MAPKファミリーに属するタンパク質であり、このことからＥＴＳ-ＧＳの投与によりMAPK経路の活性化が阻害されることが判明された。MAPK経路が活性化することによって、炎症応答を増強するNF-κB（炎症に重要な細胞内メディエーター）が活性化されることから（kyriakis JM et al., Physiol Rev 2001; 81:807-869）、ＥＴＳ-ＧＳはMAPK経路の活性化を阻害することで抗炎症作用を発揮すると考えられる。
【０１２１】
また、図８（Ｅ）に示すように、ＬＰＳによってIκBαのリン酸化が誘導されリン酸化IκBαが増加したが、それは、ＥＴＳ-ＧＳの投与により顕著に減少した。P13K-Aktの阻害は、IκBαのリン酸化及びNF-κBの核移行を増強する（Diaz-Guerra MJ et al., J Immunol 1999, 162:6184-6190）。加えて、MARK経路とNF-κB活性化との関連性は、ストレスや炎症応答に重要である（Ci X, et al., Inflammation 2010, 33:126-136）。従って、図８（Ｅ）に示すように、ＬＰＳによって誘導されたIκBαのリン酸化がＥＴＳ−ＧＳ投与により抑制されたことは、ＥＴＳ−ＧＳがP13K-Aktを誘導し、またMAPKを阻害することを示唆する。
【０１２２】
以上説明するように、ＥＴＳ-ＧＳがＬＰＳで誘導した全身性炎症モデルラットにおける肺および肝障害を改善することが判明した。さらに、ＥＴＳ-ＧＳは、ＬＰＳ投与によるサイトカインメディエーターであるＨＭＧＢ１やサイトカイン(IL-6およびTNF-α)の生成または分泌を、完全ではないものの抑制することも判明した。
【０１２３】
前述するように、これらのサイトカインは、通常ＬＰＳによって強く誘導され、炎症反応の初期の段階で生成分泌され、これにより、敗血症性ショックの進展に重要な役割を果たすことが知られている(Nasraway SA. Chest2003;123:451S-459S)。特にＴＮＦ-αは炎症を仲介する主要因子であり、その放出はさらにＩＬ-１βおよびＩＬ-６のような他のサイトカインを活性化し、細胞の損傷に関わることも知られている(Bone RC. Crit Care Med1996;24:163-172)。またＴＮＦ-αは、敗血症性ショックと関係する初期のショック状態(つまり低血圧、熱)や臓器不全の病因に極めて重要な役割を果たしている(Russell JA. NEngl J Med2006;355:1699-1713)。一方、ＩＬ−６は敗血症の重篤度や致死によく関連しており、敗血症の予測因子でもある(Remick DG, et al., Shock2002;17:463-467)。
【０１２４】
上記実験例２〜４で示したように、ＥＴＳ-ＧＳ、ＥＭ−ＧＳ、ＥＧＡＢＡ−ＧＳ等の本化合物の投与が、これらのサイトカイン（TNF-αやIL-6）の生成または分泌を顕著に抑制することから、本化合物によって、サイトカインが介在して発症したり悪化したりする疾患（サイトカイン介在疾患）を予防または改善できると考えられる。
【０１２５】
実験例５でのインビトロ実験において、ＮＦ-kＢ活性化はＩkＢリン酸化をブロックすることで阻害されることを示した。このことから、本化合物の投与によるサイトカイン(IL-6およびTNF-α)の抑制は、さらにＮＦ-kＢ不活性化に基づいている可能性がある。
【０１２６】
結論として、本化合物により、炎症性サイトカインが介在する全身性炎症や臓器障害（急性臓器障害）を改善できる可能性がある。具体的には、上記実験例１〜５の実験結果は、本化合物がＮＦ-kＢ活性化を抑制することによって、炎症性サイトカインが介在する様々な疾患、特に全身性炎症及びそれに付随する疾病（敗血症性ショック、急性臓器障害、臓器不全等）を治療する潜在的可能性を有することを示している。
【０１２７】
実験例６〜８
上記実験例１では、ＬＰＳ投与で誘導された全身性炎症モデル動物（敗血症モデル動物）における急性臓器障害が、ＥＴＳ-ＧＳの投与により有意に改善されることを示した。
【０１２８】
急性腎障害の原因は多岐に亘るが、その一つとして虚血再還流を挙げることができる。そこで下記の実験例６〜８では、脳虚血再還流障害、腎虚血再還流障害及び肝虚血再還流障害に対する本化合物の影響をＥＴＳ-ＧＳを用いて調べた。なお、この実験には、下記の方法によりＥＴＳ-ＧＳの存在下または非存在下で脳虚血再還流処置、腎虚血再還流処置、または肝虚血再還流処置をしたラット（脳虚血再還流障害モデル動物、腎虚血再還流障害モデル動物、肝虚血再還流障害モデル動物）を使用した。
【０１２９】
なお、データはすべて平均値±ＳＤとして示し、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して評価した。p-値<0.05を統計的有意とした。
【０１３０】
（１）被験動物
体重250-300gの雄ラット（Wister rat）を使用した。ラットはすべて、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。研究は大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認された。すべてのプロトコルは国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに沿って行った。麻酔は４％のセボフルラン（丸石製薬（株）製）を用いて行った。
【０１３１】
（２）被験動物の脳虚血再還流処置（脳虚血再還流障害モデル動物の調製）
ラットは、無作為に３つのグループに分けた（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）。Ｉ/Ｒ群には、体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを静脈注射した後に、呼吸を７分間停止することで心肺停止させることで脳を虚血にさせ、その後蘇生を行った（ETS-GS非存在下で脳虚血再還流）。ＥＴＳ-ＧＳ＋Ｉ/Ｒ群には、体重１ｋｇ当たり１０mg/mlのＥＴＳ−ＧＳ水溶液を１.０ml(10mg/kg)静脈注射した後、呼吸を７分間停止することで心肺停止させることで脳を虚血にさせ、その後蘇生を行った（ETS-GS存在下で脳虚血再還流）。対照群には体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを静脈注射した。
【０１３２】
（３）被験動物の腎虚血再還流処置（腎虚血再還流障害モデル動物の調製）
ラットは、無作為に3つのグループに分けた（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）。Ｉ/Ｒ群には、右の腎臓を外科的に削除し、左の腎動脈を閉塞させた状態で、体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを静脈注射した（ETS-GS非存在下で腎虚血再還流）。ＥＴＳ-ＧＳ＋Ｉ/Ｒ群には、右の腎臓を外科的に削除し、左の腎動脈を閉塞させた状態で、体重１ｋｇ当たり１０mg/mlのＥＴＳ-ＧＳ水溶液を１.０ｍｌ(10mg/kg)静脈注射した（ETS-GS存在下で腎虚血再還流）。対照群には体重１ｋｇ当たり０.９％ のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを静脈注射した。
【０１３３】
（４）被験動物の肝虚血再還流処置（肝虚血再還流障害モデル動物の調製）
ラットは、無作為に3つのグループに分けた（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）。Ｉ/Ｒ群には、体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを皮下注射し、その３０分後に門脈と肝臓動脈の枝をそれぞれ３５ｍｍのクリップで閉塞し、６０分間そのままにした後にクリップを外した（ETS-GS非存在下で肝虚血再還流）。ＥＴＳ-ＧＳ＋Ｉ/Ｒ群には、体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌとともに、生理食塩水に溶解したＥＴＳ-ＧＳ水溶液を１.０ｍｌ(10mg/kg)皮下注射し、その３０分後にＩ/Ｒ群と同様に６０分間、門脈と肝臓動脈の枝を閉塞し、その後開放した（ETS-GS存在下で肝虚血再還流）。対照群には体重１ｋｇ当たり０.９％ のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを皮下注射した。
【０１３４】
実験例６ 脳虚血再還流後の脳組織に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（１）光学顕微鏡による組織分析
脳虚血再還流処置の２４時間後に採取したラット脳組織標本（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を定法に従って固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した各染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図９に示す。光学顕微鏡検査の結果、対照群では正常な脳細胞の形態が認められた (図９Ａ)。しかしながら、Ｉ/Ｒ群では明らかな細胞の壊死、細胞質内の空砲化、出血が認められた(図９Ｂ)。しかしこれらの３つの組織変化（細胞の壊死、細胞質内の空砲化、出血）は、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）では顕著に減少していた(図９Ｃ)。
【０１３５】
実験例７ 腎虚血再還流後の腎臓組織に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（１）光学顕微鏡による組織分析
腎虚血再還流処置の２４時間後に採取したラット腎臓組織標本（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を定法に従って固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した。そのサンプルを分析し、Erdogan’s 技術(Erdogan H,et al., Urol Res34: 41-46, 2006)に基づいて腎障害の程度を決定した。腎実質中の24のエリアを、４つのパラメーター（尿細管細胞の壊死、細胞質内空胞の形成、出血および尿細管拡張）に基づいて腎障害の程度を類別した。その半定量的スケールを、０〜４の５段階に設定した（０：正常な腎臓、１：微細損傷（0-5%障害）、２：軽度の損害（5-25%障害）、３：中程度の損害(25-75%障害)、４：重度の損害（75-100%障害））。各パラメーターについて平均スコアを求めた。
【０１３６】
各染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図１０に示す。光学顕微鏡検査の結果、対照群では正常な腎細胞の形態が認められた (図１０ＡおよびＢ)。しかしながら、Ｉ/Ｒ群では明らかな尿細管細胞の壊死、細胞質内の空砲化、出血および尿細管の拡張が認められた(図１０ＣおよびＤ)。しかしこれらの４つの組織変化（尿細管細胞の壊死、細胞質内の空砲化、出血および尿細管の拡張）は、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）では顕著に減少していた(図１０ＥおよびＦ)。図１１に示すように、対照群の標本（Renal I/R：-、ETS-GS：-）と比較してＩ/Ｒ群の標本（Renal I/R：＋、ETS-GS：-）は、腎障害の組織学的スコアのすべてが著しく高かったのに対して、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）の標本（Renal I/R：＋、ETS-GS：＋）のスコアはその中間であった(図１１;p<0.05)。
【０１３７】
（２）透過電子顕微鏡分析
腎虚血再還流処置の24時間後に採取したラット腎臓組織標本（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を、４％のパラホルムアルデヒド、１％のCaCl2および7％の蔗糖を含む固定液に、４℃で30分間浸漬した。固定した標本を、カミソリ刀で小片にカットし、２％のオスミウムに４℃で2時間浸漬してポスト固定化し、次いで段階的に濃度を変えたエタノールで処理して脱水して、Epok 812（応研商事)中に埋設した。これを超ミクロトーム（Reichert-Nissei Ultracut S）上でダイヤモンド・ナイフを用いて、超薄切片（90-95nm）にカットし、透過電子顕微鏡（JEM-1200 EX II電子顕微鏡：JEOL）で観察した。
【０１３８】
結果を図１２に示す。対照群の腎臓標本は、基底膜に垂直に配向したミトコンドリアを有する完全な尿細管細胞を示した(図１２ＡおよびＢ)。Ｉ/Ｒ群では、正常な管状構造が損失し、基底膜からの尿細管細胞の分離および管状の細胞側底膜の崩壊が認められた(図１２ＣおよびＤ)。また尿細管細胞中に様々なサイズの多数の気泡および液胞が認められた。ミトコンドリアは、異常なクリスタおよび小さな柔毛性粒子を含んで膨脹しているように見えた。さらに、絨毛様突起が、細管の内腔中に流されていた(図１２ＣおよびＤ)。
【０１３９】
しかしながら、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）の標本の電子顕微鏡の画像では、尿細管細胞は殆どダメージを受けずに、管状の基底膜および側底膜は完全なままであった(図１１ＥおよびＦ)。サイズの異なる複数の液胞が、尿細管細胞の中で観察された。正常なミトコンドリアと膨脹したミトコンドリアの両方が観察された(図１２ＥおよびＦ)。
【０１４０】
以上の結果は、ＥＴＳ-ＧＳの投与によって腎虚血再還流による組織障害が抑制できること、また腎虚血再還流障害によるミトコンドリアの形態が改善されることを示している。
【０１４１】
（３）腎機能に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
腎虚血再還流処置から24時間目にラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）から血液を採取して血清を調製した。血清中の血中尿素窒素(BUN)値およびクレアチニン値を、i-STAT 300F autoanalyzer（扶桑薬品工業製）の標準方法を用いて測定した。
【０１４２】
結果を表２に示す。
【０１４３】
表２に示すように、対照群では、クレアチニンとBUNの平均血清濃度は、それぞれ0.357±0.053mg/dlおよび15.286±1.976mg/dlであった。腎臓機能のこれらの値は、Ｉ/Ｒ群で顕著に増加していた(クレアチニン: 4.800±0.586mg/dl; BUN: 196.889±8.294mg/dl)。これに対してＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）ではこれらの値がいずれも低下したことから（クレアチニン：3.517±0.392mg/dl、BUN：161.429±5.719mg/dl;p<0.05)、腎虚血再還流処置で低下した腎機能がＥＴＳ-ＧＳ処置により改善することが判明した。
【０１４４】
【表２】
（４）マロンジアルデヒド分析
ＥＴＳ-ＧＳの存在下または非存在下で腎虚血再還流した２４時間後にラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）から腎臓組織を採取し腎臓組織中のマロンジアルデヒド(MDA)濃度を、チオバルビツール酸反応基質用の市販キット（TBARS; Cayman Chemical）を用いて測定した。530nmの吸光度をELISAリーダ（Bio-Rad Laboratories）を用いて測定した。
【０１４５】
ＴＢＡＲＫアッセイの結果を図１３に示す。図１３に示すように、腎臓組織中のＭＤＡ濃度はI/R群（Renal I/R：＋、ETS-GS：-）、すなわち腎虚血再還流後に増加したが、ＥＴＳ−ＧＳ処置したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群、Renal I/R：＋、ETS-GS：＋）では、このＭＤＡ誘導が顕著に低下することが明らかになった (図１３;p<0.05)。
【０１４６】
実験例８ 肝虚血再還流後の肝臓組織に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（１）光学顕微鏡による組織分析
肝虚血再還流処置の２４時間後に採取したラット肝臓組織標本（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を定法に従って固定し、作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した各染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図１４に示す。光学顕微鏡検査の結果、対照群では正常な肝細胞の形態が認められた (図１４Ａ及びＢ)。しかしながら、Ｉ/Ｒ群では明らかな細胞の壊死、核濃縮、出血及び小葉状構造の乱れが認められた(図１４Ｃ及びＤ)。しかしこれらの３つの組織変化（細胞の壊死、核濃縮、出血、及び小葉状構造の乱れ）は、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）では顕著に減少していた(図１４Ｅ及びＦ)。
【０１４７】
（２）血清サイトカイン量に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
肝虚血再還流処置から２４時間目にラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を４％のセボフルラン麻酔下で犠牲にし、右心室から血液を採取して血清を調製した。血清中の各サイトカイン（IL-6、TNF-α）濃度を、実験例２と同様の方法で、モノクローナル抗体を用いて測定した。結果を図１５に示す（Ａ：IL-6、Ｂ：TNF-α）。
これからわかるように、いずれのサイトカインも、血中濃度がＩ/Ｒ群で顕著に増加したのに対してＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）ではこれらの値がいずれも顕著に低下した。このことから、肝虚血再還流処置によってサイトカイン（IL-6、TNF-α）の分泌が誘導されること、また肝虚血再還流処置によって誘導されるサイトカインは、いずれもＥＴＳ-ＧＳにより有意に抑制されることが判明した。
【０１４８】
（３）血清ＨＭＧＢ１量に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
上記（２）で肝虚血再還流処置後に各ラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）から採取した血清サンプルについて、血清中のＨＭＧＢ１[high-mobility group box1 protein]濃度を、当該HMGB1に対するモノクローナル抗体（シノテスト社）を用いてELISA法により測定した。吸光度は540nmで測定した(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)。なお、ＨＭＧＢ１は、３０ｋＤの非ヒストン性染色体関連タンパク質であり（Bianchi ME, et al., Science, 1898;243:1056-1059）、その血清中の濃度は、重度の敗血症や敗血症ショックにより増加することが報告されている（Wang H, et al., Science 1999; 285:248-251）。また、ＨＭＧＢ１は、かねてから後期の炎症応答を増幅し、サイトカイン分泌を促進することが知られているが（van Zoelen MA, et al., Shock 2009;31:280-284）、最近、致死性敗血症の末期のメディエーターとして、また虚血再還流障害の初期のメディエーターとして機能することがわかっている（Tsung A, et al., J Exp Med 2005; 201:1135-1143）。
結果を図１６に示す。これからわかるように、血清ＨＭＧＢ１濃度は、Ｉ/Ｒ群で顕著に増加したのに対してＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）では顕著に低下した。このことから、肝虚血再還流処置によってＨＭＧＢ１が誘導されること、また肝虚血再還流処置によって誘導されるＨＭＧＢ１は、ＥＴＳ-ＧＳ処置により有意に抑制されることが判明した。つまり、ＥＴＳ-ＧＳにより、肝虚血再還流処置によるＨＭＧＢ１の誘導増加が抑制されて、その結果、サイトカイン分泌が抑えられ、障害から肝細胞を保護することができることが判明した。
【０１４９】
（４）肝機能に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
上記（２）で肝虚血再還流処置後に各ラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）から採取した血清サンプルについて、血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）濃度、乳酸脱水素酵素（LDH）濃度を、自動分析装置（TBA-200FR NEO：東芝メディカルシステムズ社）を用いて標準方法に従って測定した。血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、及びＬＤＨ濃度を、それぞれ図１７（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
これからわかるように、肝機能を示すこれらの値は、Ｉ/Ｒ群で顕著に増加したのに対してＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）ではこれらの値がいずれも顕著に低下した。つまり、肝虚血再還流処置で低下した肝機能がＥＴＳ-ＧＳ処置により改善することが判明した。
【０１５０】
以上の実験例６〜８の結果は、虚血再還流障害後の腎障害、脳障害及び肝障害がＥＴＳ−ＧＳ処置によって改善することを示している。より詳細には、実験例７及び８において、虚血再還流処置によって、（ＨＭＧＢ１を介して）炎症性サイトカインが誘導されること、ＥＴＳ−ＧＳは当該虚血再還流処置によって誘導されるＨＭＧＢ１及び炎症性サイトカインを有意に抑制することが確認された。実験例７において、ＥＴＳ−ＧＳの投与により、虚血再還流処置によって増加した腎臓のＭＤＡレベルが顕著に低下し、ミトコンドリアの形態が非常に改善され、さらに腎虚血再還流障害後の腎機能障害が改善されることが確認された。また実験例８においても、ＥＴＳ−ＧＳ投与により虚血再還流処置によって増加した血清のＡＳＴ、ＡＬＴ及びＬＤＨ濃度が有意に低下し、虚血再還流によって誘導された肝機能障害が有意に改善されることが確認された。これらのことから、虚血再還流処置による組織の機能低下は、虚血再還流処置によって誘導されるサイトカインの分泌が一因となっており、ＥＴＳ−ＧＳは、当該サイトカインの分泌を抑制することにより、臓器や組織が虚血再還流障害を受けることから抑制若しくは保護していると考えられる。
【０１５１】
結論として、上記の実験例から、ＥＴＳ−ＧＳを始めとする本化合物は、サイトカインの分泌を抑制することで、虚血再還流における障害の発生を阻止する作用を有していると考えられる。つまり、上記の実験例からＥＴＳ−ＧＳを始めとする本化合物による処置で、虚血再還流によって生じる脳障害、腎障害及び肝障害を保護し防止できることが示された。
【０１５２】
実験例９ 腹膜炎性敗血症に対する本化合物の作用
汎発性腹膜炎に起因する敗血症性ショック状態における致死的な合併症には、急性肺障害や急性肝障害などの多臓器不全症候群があり、その死亡率はいまだ高いのが現状である。敗血症には、サイトカインの活性化と、それに続く活性酸素種の発生が臓器障害の中心的な役割を担っており、その意味でサイトカイン介在疾患といえる。
本実験例９は、CLP手技（Cecal ligation and puncture method）により腹膜炎モデル動物を作製し、当該モデル動物の臓器障害に対する本化合物の影響をＥＴＳ-ＧＳ及びＥ-Ant-S-ＧＳを用いて調べた。なお、データはすべて平均値±ＳＤとして示し、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して評価した。p-値<0.05を統計的有意とした。
【０１５３】
（１）被験動物
体重250-300gの雄ラット（Wister rat）を使用した。ラットはすべて、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。研究は大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認された。すべてのプロトコルは国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに沿って行った。麻酔は４％のセボフルラン（丸石製薬（株）製）を用いて行った。
【０１５４】
（２）腹膜炎モデル動物の作製
ラットは、無作為に３つのグループに分けた（本化合物＋CLP群、CLP群、疑似手術群（対照群））。本化合物＋CLP群には、まず毎日３週間に亘って本化合物（ETS-GSまたはE-Ant-S-GS）を経口投与（10mg/kg）した。３週間後に麻酔下で開腹し、回盲部近傍で盲腸を結紮し、結紮部遠位で盲腸を18-gauge針で穿刺して便を排出し、腹腔内に盲腸を還納し閉腹した。CLP群には、まず毎日３週間に亘って水を経口投与（1ml/kg）し、次いで３週間後に本化合物＋CLP群と同様に、麻酔下で開腹し、回盲部近傍で盲腸を結紮して閉腹した。疑似手術群は、開腹し盲腸を一旦腹腔外に取り出した後、再び腹腔内に還納し閉腹した（疑似の外科的手術処置）。
【０１５５】
（３）光学顕微鏡による組織分析
CLP処置の１２時間後に採取したラット肺または肝臓の組織標本（本化合物＋CLP群、CLP群、疑似手術群）を定法に従って固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した各染色切片を光学顕微鏡で観察した。
【０１５６】
（3-1）ＥＴＳ−ＧＳによる効果（肺組織）
図１８に本化合物としてＥＴＳ−ＧＳを用いて試験した場合の肺組織標本（ＡとＢ：疑似手術群、ＣとＤ： CLP群、ＥとＦ：本化合物＋CLP群）の光学顕微鏡画像を示す。光学顕微鏡観察の結果、疑似手術群では組織学上の変化は認められなかったが(図１８Ａ及びＢ)、ＣＬＰ群では明らかな間質浮腫と白血球浸潤が認められた(図１８Ｃ及びＤ)。しかしこれらの組織変化は、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＣＬＰ群（ETS-GS＋CLP群）では顕著に減少していた(図１８Ｅ及びＦ)。
次いで、そのサンプルを分析し、Murakami’s 技術 (Murakami K,et al., Shock 2002; 18: 236-241)に基づいて肺障害の程度を決定した。肺柔組織の24のエリアを、４つのパラメーター（鬱血、浮腫、炎症及び出血）に基づいて肺障害の程度を類別した。その半定量的スケールを、０〜４の５段階に設定した（０：異常なし、または正常にみえる、１：軽度障害、２：中程度障害、３：高程度障害、４：重度障害）。各パラメーターについて平均スコアを求めた。結果を図１９に示す。図１９に示すように、疑似手術群の標本（黒棒：Control）と比較してＣＬＰ群の標本（白棒）は、肺障害の組織学的スコアのすべてが著しく高かったのに対して、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＣＬＰ群の標本（斜線棒：ETS-GS+CLP群）のスコアはその半分以下まで低下していた(図１９;p<0.05)。
【０１５７】
（3-2）Ｅ-Ant-S-ＧＳによる効果（肺組織及び肝組織）
図２０に、本化合物としてＥ-Ant-S-ＧＳを用いて試験した場合の肺組織標本（上段）と肝組織標本（下段）の光学顕微鏡画像を示す。肺組織について、光学顕微鏡観察の結果、疑似手術群では組織学上の変化は認められなかったが(図２０の上段左)、ＣＬＰ群では明らかな間質浮腫と白血球浸潤が認められた(図２０の上段中央)。しかしこれらの組織変化は、Ｅ-Ant-S-ＧＳ処理したＣＬＰ群（E-Ant-S-GS＋CLP群）では顕著に減少していた(図２０の上段右)。肝組織については、疑似手術群では組織学上の変化は認められなかったが(図２０の下段左)、ＣＬＰ群では明らかな肝細胞の核の濃縮と細胞索の配列に乱れが認められた(図２０の下段中央)。しかしこれらの組織変化は、Ｅ-Ant-S-ＧＳ処理したＣＬＰ群（E-Ant-S-GS＋CLP群）では顕著に減少していた(図２０の下段右)。
【０１５８】
（４）Ｅ-Ant-S-ＧＳによる抗炎症作用（肺組織及び肝組織）
上記（3-2）でＣＬＰ処置により組織の変化が認められた肺及び肝組織について、組織中のＭＰＯ（myeloperoxidase）活性を測定し、Ｅ-Ant-S-ＧＳの抗炎症作用を評価した。結果を図２１に示す。これからわかるように、組織中ＭＰＯ活性は、肺と肝臓の両方において、疑似手術群に比べてＣＬＰ群では１.５倍程度増加したのに対して、Ｅ-Ant-S-ＧＳ投与群（E-Ant-S-GS＋CLP群）では疑似手術群と同レベルまで低下していた。このことから、Ｅ-Ant-S-ＧＳには抗炎症作用があり、ＣＬＰ処置によって生じる炎症が、Ｅ-Ant-S-ＧＳの投与により抑制若しくは改善できることが判明した。
【０１５９】
（５）ＣＬＰ処置後の血清サイトカイン及びＨＭＧＢ１濃度に対するＥＴＳ-ＧＳ及びＥ-Ant-S-ＧＳの影響
ＣＬＰ処置したラット（本化合物[ETS-GS、E-Ant-S-GS]＋CLP群、CLP群、疑似手術群（対照群））から経時的に血液を採取して血清を調製した。血清中の各サイトカイン（IL-6、TNF-α）及びＨＭＧＢ１の濃度を、実験例９と同様の方法で、モノクローナル抗体を用いて測定した。
【０１６０】
（5-1）ＥＴＳ−ＧＳの影響
本化合物としてＥＴＳ−ＧＳを用いた場合の結果を図２２に示す（Ａ：IL-6、Ｂ：TNF-α、Ｃ：HMGB1）。これからわかるように、サイトカイン（IL-6及びTNF-α）及びＨＭＧＢ１の血中濃度はいずれもＣＬＰ処理で顕著に増加したのに対して、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＣＬＰ群（ETS-GS+CLP群）ではこれらの値がいずれも顕著に低下した。このことから、腹膜炎によって誘導されるＨＭＧＢ１やサイトカイン（IL-6、TNF-α）は、いずれもＥＴＳ-ＧＳにより有意に抑制されることが判明した。
【０１６１】
（5-2）Ｅ-Ant-S-ＧＳの影響
本化合物としてＥ-Ant-S-ＧＳを用いた場合の、ＣＬＰ後の血清ＩＬ−６濃度の経時的変化を図２３に示す。これからわかるように、血中ＩＬ−６濃度はＣＬＰ処理で経時的に漸増するものの、Ｅ-Ant-S-ＧＳ処理したＣＬＰ群（E-Ant-S-GS+CLP群）ではこの漸増幅が顕著に低下した。また、各群（E-Ant-S-GS＋CLP群、CLP群、疑似手術群）のラットの肺組織中のＨＭＧＢ１の発現状況をWestern blottingを用いて調べた結果を図２４に示す。これからわかるように、ＣＬＰ群でＨＭＧＢ１の発現が激増していたのに対して、Ｅ-Ant-S-ＧＳ処理したＣＬＰ群（E-Ant-S-GS+CLP群）では、その発現量は顕著に低下しており、疑似手術群と同程度であった。このことから、腹膜炎によって誘導されるＨＭＧＢ１やサイトカイン（IL-6）は、いずれもＥ-Ant-S-ＧＳの投与により有意に抑制されることが判明した。
さらに図２４には、各群（E-Ant-S-GS＋CLP群、CLP群、疑似手術群）のラットの肺組織中のＰＡＲ１（Protease-Activated Receptor 1）の発現状況をWestern blottingを用いて調べた結果を併せて示す。ＰＡＲは、プロテアーゼに対する受容体であり、血管内皮細胞や平滑筋組織を含む全身の種々の臓器組織に発現している。なかでもＰＡＲ１はトロンビンに対する受容体であり、敗血症などによって発現が増加し、炎症反応の進行に関与していることが知られている。図２２の結果は、ＣＬＰ処置（腹膜炎症）によって増加するＰＡＲ１の発現が本化合物（E-Ant-S-GS）の投与により低減することを示している。つまり、本化合物（Ｅ-Ant-S-GS）により、腹膜炎性敗血症によるＰＡＲ１の発現増加が抑制されて、その結果、炎症反応（血管拡張や好中球の集積湿潤の惹起）が抑えられて、障害から細胞や組織が保護されることができることが判明した。
【０１６２】
結論として、上記の実験例から、ＥＴＳ−ＧＳやＥ-Ant-S-ＧＳ等を始めとする本化合物は、サイトカインの分泌を抑制することで、サイトカインが介在する各種の疾患、特に炎症が関係する疾患並びにそれによって生じる臓器や組織の障害の発生を阻止する作用を有していると考えられる。つまり、ＥＴＳ−ＧＳを始めとする本化合物による処置で、敗血症性ショックや虚血再還流によって生じる各種臓器の障害（急性臓器障害、臓器不全）を保護し防止できると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にＴＮＦ−α及びＩＬ−６等のサイトカインが介在して発症または悪化する疾患（サイトカイン介在疾患）の予防及び治療に有効な抗サイトカイン介在疾患剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの病態においてサイトカインの増加はその病態悪化に密接な関係があることが示されている。サイトカインの種類としては多数存在するが、腫瘍壊死因子α（以下、「ＴＮＦ−α」という）は、様々な細胞への刺激（例えば、リポ多糖体（ＬＰＳ））または外部細胞性ストレス（例えば、浸透圧ショックおよび過酸化物）に応答して、単球およびマクロファージを含む様々な細胞によって分泌される重要なサイトカインである。
【０００３】
基底レベルを上回るＴＮＦ−αのレベルの上昇は幾つかの疾患状態への介在またはこの悪化に関連付けられており、これらの疾患状態にはパジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛が含まれる。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２を含む）、および帯状疱疹もＴＮＦ−αの上昇によって悪化することが知られている。
【０００４】
更に、ＴＮＦ−αは頭部外傷、脳卒中、および虚血においてもその臓器障害に重要な役割を果たすことが報告されている。例えば、頭部外傷ラットにおいて、ＴＮＦ−αのレベルは打撲を負った半球において増加した（非特許文献１）、中央脳動脈が閉塞された虚血ラットにおいては、ＴＮＦ−αの ｍＲＮＡが増加した（非特許文献２）、との報告があり、この点においてもサイトカインが臓器障害に重要な役割を演じていることが示されている。
【０００５】
具体的な組織におけるＴＮＦ−αの働きとしては、ラット皮質へのＴＮＦ−αの投与による毛細血管における好中球の著しい堆積および小血管内での付着を生じることが報告されている。このＴＮＦ−αは複雑なサイトカインカスケードにおける上流因子である。結果として、ＴＮＦ−αのレベルの上昇は他の様々なサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＩＬ−８のレベルの上昇につながり得る。よってＴＮＦ−αは、他のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６）やケモカインの浸潤を促進し、これが梗塞領域への好中球浸潤を促進することが報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
ＩＬ−６はT細胞やマクロファージ等の細胞により産生されるレクチンであり、液性免疫を制御するサイトカインの一つである。ＩＬ−６は１９８６年に相補的ＤＮＡ（cDNA）がクローニングされ、その後、ＩＬ−６は種々の生理現象や炎症・免疫疾患の発症メカニズムに関与していることが明らかになった。また炎症部位または傷害（例えば虚血）部位でのＩＬ−６の産生が介在する多くの疾患状態の悪化および／または発症が関連付けられている(非特許文献４)。さらに、虚血再還流障害においてもＩＬ−６の抑制が臓器障害改善効果をもたらすことが報告されている（非特許文献５）。これらのことからこのような疾患状態には、例えば喘息、炎症性腸疾患、乾癬、成人呼吸促進症候群、心臓および腎臓再還流傷害、血栓症並びに糸球体腎炎が含まれるといえる。
【０００７】
ＴＮＦ−αの効果を遮断するのに幾つかのアプローチが採用されている。１つのアプローチは、ＴＮＦ−αの可溶性受容体（例えば、ＴＮＦＲ−５５またはＴＮＦＲ−７５）の使用であり、ＴＮＦ−α介在疾患状態の動物モデルにおいて効力が認められている。第２のアプローチはＴＮＦ−αに特異的なモノクローナル抗体、ｃＡ２を用いてＴＮＦ−αを中和する方法である（非特許文献６）。また、ＩＬ−６の抑制が虚血再還流障害における病態を改善することも報告されており（非特許文献５）、これらのアプローチは、タンパク質分離または受容体拮抗のいずれかによってＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の効果を遮断するというものである。
【０００８】
またＴＮＦ−αを始めとするサイトカインが介在する疾患の治療に１，４，５−トリ置換イミダゾール、縮合トリアゾール、及びインダゾールなどの複素環化合物を用いることも提案されている（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Shohamiら、J. Cereb. Blood Flow Metab. 14, 615(1994)
【非特許文献２】Feursteinら、Neurosci. Lett. 165, 125 (1993)
【非特許文献３】Feurstein、Stroke 25, 1481 (1994)
【非特許文献４】Frink Mら、Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.
【非特許文献５】Kimizuka Kら、Am J Transplant. 2004 Apr;4(4):482-94.
【非特許文献６】Feldmannら．5 Immunological Reviews, pp.195-223 (1995)
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2004-99622号公報
【特許文献２】特表2008-504294号公報
【特許文献３】WO99/33818号公報
【特許文献４】特開2000-191528号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、炎症性サイトカイン（特に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）が介在して発症または悪化する疾患（本発明ではこれを「サイトカイン介在疾患」と称する）の予防または治療に有効な医薬組成物（本発明ではこれを「抗サイトカイン介在疾患剤」と称する）を提供することを目的とする。より詳細には、敗血症性ショック、急性臓器障害や臓器不全を予防または治療したり、また虚血再還流によって生じる各種臓器障害を保護するために有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねていたところ、下記の一般式（１）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体に、細胞刺激因子（リポ多糖体（ＬＰＳ））によって生じる細胞内シグナル（NF-ｋB）の活性化抑制を介して、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）の誘導を有意に抑制する作用があり、その結果、ＬＰＳ誘導の臓器障害を減じることから、敗血症性ショック、急性臓器障害や臓器不全の予防及び改善に有効であること、また虚血再還流によって生じる各種臓器障害の保護や改善にも有効であること見出した。
【００１３】
ちなみに当該ビタミンＥ誘導体は公知の化合物であるが（例えば特許文献３及び４等参照）、サイトカインとの関連性ならびにサイトカイン介在疾患に対する予防及び治療作用については知られていない。
【００１４】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含する。
（I-1）下記一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容
される塩を有効成分とする、抗サイトカイン介在疾患剤：
【００１５】
【化１】
【００１６】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示し、Ｒ３およびＲ５は、異なって、水素原子であるか、またはＳ結合した下記式（１）〜（５）のいずれかに示されるＳＨ化合物若しくはそのエステル（但し、システアミンは除く。）を示し、Ｒ４は水酸基、下記式（６）〜（１１）のいずれかに示されるＮ−置換アミノ酸、そのエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）または下記式（１２）に示されるアミンを示す〕
【００１７】
【化２】
【００１８】
（I-2）一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体が下記（ａ）〜（ｏ）からなる群から選択されるいずれかである、（I-1）に記載する抗サイトカイン介在疾患剤：
（ａ）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン、
（ｂ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｃ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｄ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル] -3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ] プロピル]システニイルグリシン、
（ｅ）Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（2-スルフォエチル）アミノ] プロピル]システイン、
（ｆ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[[２-(1H-インドール-3-イル)エチル]アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｇ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（5-カルボキシペンチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｈ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（トランス-4-カルボキシシクロヘキシルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｉ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システイン、
（ｊ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]ペニシラミン、
（ｋ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システナミン、
（ｌ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（エトキシカルボニルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｍ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン イソプロピルエステル、
（ｎ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフィノエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｏ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-（2-カルボキシピロリジノ）プロピル]システニイルグリシン。
【００１９】
（I-3）サイトカイン介在疾患が、パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性およ慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛からなる群から選択されるいずれか少なくとも１つである（I-1）または（I-2）に記載する 抗サイトカイン介在疾患剤。
【００２０】
（I-4）抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全の予防又は治療剤である（I-1）または（I-2）に記載する抗サイトカイン介在疾患剤。
【００２１】
（I-5）抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショックによる臓器障害または虚血再還流障害に対する臓器若しくは組織の保護剤である（I-1）または（I-2）に記載する抗サイトカイン介在疾患剤。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】LPS処置したラットの肺および肝臓組織の光学顕微鏡画像を示す（実験例１）。ＡとＤ：生理食塩水で処理した対照群の代表的な標本（A:肺、D:肝臓)、ＢとＥ：LPS(7.5mg/kg)で処理したLPS群の代表的な標本（B: 肺、E:肝臓）、およびＣとＦ：ETS-GS(10mg/kg)およびLPS(7.5mg/kg)で処理した ETS-GS+LPS群の代表的な標本(C:肺、F:肝臓)である。
【図２】図１の肺組織の結果を、鬱血、浮腫、炎症及び出血のパラメーター毎に各群の組織学的スコアで示したものである（黒棒：対照群、白棒：LPS群、斜線棒：ETS-GS+LPS群）。結果は平均値±SDとして示す。* は、LPS群に対して有意差（p<0.05）があることを示す。
【図３】図１の肝臓組織の結果を、組織学的スコアで示したものである。左端から、対照群（黒棒）、LPS群（白棒）、ETS-GS+LPS群（斜線棒）の結果である。データは平均値+SDとして示す。 * はLPS群に対して有意差(p<0.05)があることを示す。
【図４】対照群、LPS群（―■―）およびETS-GS+LPS群（―●―）について、LPS投与後、24時間に亘ってIL-6およびTNF-αの血清濃度を経時的に観察した結果を示す（実験例２）。（Ａ）IL-6の血清濃度 、（Ｂ）TNF-αの血清濃度をそれぞれ示す。データは、平均値±SDとして示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図５】LPSで刺激したマウスマクロファージ様細胞（RAW264.7）におけるIL-6、TNF-α及びHMGB1生成の結果を示す（実験例３）。LPSで刺激された(100ng/ml)マウスマクロファージを、図に示す投与量(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、100μg/ml)のETS-GSで20時間同時に処理した。（Ａ）TNF-α生成量（pg/ml）、（Ｂ）IL-6生成量（pg/ml）、（Ｃ）HMGB1生成量（ng/ml）をそれぞれ示す。データは、平均値±SDとして示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図６】LPS誘導マウスマクロファージにおける核分画中のNF-κB（p50/p65）のDNA結合活性を示す（実験例５（１））。LPS誘導によって増加したNF-κB（p50/p65）のDNA結合活性が（左から２番目）、ETS-GS処置によって減少することがわかる（左から３番目）。データは、平均値±SDで示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図７】LPS誘導IkBリン酸化に対するETS-GSの影響を調べた結果を示す（実験例５（２））。
【図８−１】各種タンパク質のLPS誘導リン酸化を調べた結果を示す（実験例５（２））。Ａ：Akt、Ｂ：extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2)のリン酸化、Ｃ：c-jun N-terminal kinase (JNK) のリン酸化。黒棒は対照群、白棒はLPS群、灰色棒はETS-GS＋LPS群を示す。データは、平均値±SDで示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図８−２】各種タンパク質のLPS誘導リン酸化を調べた結果を示す（実験例５（２））。Ｄ：p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) のリン酸化、Ｅ：IκBαのリン酸化。黒棒は対照群、白棒はLPS群、灰色棒はETS-GS＋LPS群を示す。データは、平均値±SDで示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図９】脳虚血再還流処置から24時間後に観察された組織の変化（細胞の壊死、細胞質内空胞形成、出血）を示す、脳組織の染色画像である（実験例６）。
【図１０】腎虚血再還流処置から24時間後に観察された組織の変化（尿細管細胞の壊死、細胞質内空胞形成、出血および尿細管の拡大）を示す、腎臓組織の染色画像である（実験例７（１））。ＡとＢ）：生理食塩水で処理した対照群の代表的な標本（A: 40×倍; B: 100×倍)、ＣとＤ：生理食塩水で処理した腎虚血再還流(I/R)群の代表的な標本（C: 40×倍; D: 100×倍）、およびＥとＦ：体重1kg当たり100mgのETS-GSで処理した腎虚血再還流(I/R)群の代表的な標本(E: 40×倍; F: 100×倍)である。
【図１１】図１０の結果を組織学的スコアで示したものである。各群（左端から対照群、I/R群、ETS-GS処置したI/R群（ETS-GS＋I/R群））のスコアを平均値±SDとして示す。* I/R群に対して有意差(p<0.05)があることを示す。
【図１２】腎虚血再還流処置から24時間後に観察された組織の透過性電子顕微鏡画像（10,000×倍）を示す（実験例８（２））。対照群（A、B）;腎虚血再還流(I/R)群(C、D); ETS-GS処置したI/R群(E、F)。
【図１３】腎虚血再還流処置から24時間後に採取したラット腎臓組織中のマロンジアルデヒド濃度（μＭ）を示す（実験例８）。左端から対照群（黒棒）；I/R群（白棒）; ETS-GS処理したI/R群（灰色棒）の結果である。データは各群（n=6）の平均値±SDとして示す。* はI/R群に対して有意差(p<0.05)があることを示す。
【図１４】肝虚血再還流処置から24時間後に観察された組織の変化（細胞の壊死、核濃縮、出血、小葉体構造の乱れ）を示す、肝臓組織の染色画像である（実験例８）。
【図１５】対照群、LPS群およびETS-GS+LPS群について、肝虚血再還流処置から２４時間後に採取した血液を対象として測定した、血清中のＩＬ−６濃度（図１５（Ａ））、ＴＮＦ−α濃度（図１５（Ｂ））を示す。
【図１６】対照群、LPS群およびETS-GS+LPS群について、肝虚血再還流処置から２４時間後に採取した血液を対象として測定した、血清中のＨＭＧＢ１濃度を示す。
【図１７】対照群、LPS群およびETS-GS+LPS群について、肝虚血再還流処置から２４時間後に採取した血液を対象として測定した、血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）濃度（図１７（Ａ））、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）濃度（図１７（Ｂ））、乳酸脱水素酵素（LDH）濃度（図１７（Ｃ））を示す。
【図１８】CLP（cecal ligation and puncture）処置から12時間後に観察した肺組織標本（ＡとＢ：疑似手術群、ＣとＤ： CLP群、ＥとＦ：ETS-GS＋CLP群）の光学顕微鏡画像を示す（実験例９（3-1））。
【図１９】図１８の結果に基づいて、肺障害を４つのパラメーター（鬱血、浮腫、炎症及び出血）の点から組織学的スコアで示したものである。
【図２０】CLP処置から12時間後に観察した肺組織標本（上段：左から疑似手術群、CLP群、E-Ant-S-GS＋CLP群）および肝組織標本（下段：左から疑似手術群（Sham）、CLP群、E-Ant-S-GS＋CLP群）の光学顕微鏡画像を示す（実験例９（3-2））。
【図２１】CLP処置から12時間後に採取した肺組織及び肝臓組織中のミエロペルオキシダーゼ活性（MPO活性）を測定した結果を示す（実験例９（４））。
【図２２】CLP処置した各群のラット（CLP群、ETS-GS＋CLP群）から経時的に血液を採取し、サイトカイン（IL-6及びTNF-α）濃度及びHMGB1濃度を測定した結果を示す（実験例９（5-1））。
【図２３】CLP処置した各群のラット（疑似手術群（Sham）、CLP群、E-Ant-S＋CLP群）から経時的に血液を採取し、サイトカイン（IL-6）濃度を測定した結果を示す（実験例９（5-2））。
【図２４】CLP処置した各群のラット（疑似手術群（Sham）、CLP群、E-Ant-S＋CLP群）の肺組織中のＰＡＲ１及びＨＭＧＢ１の発現を測定した結果を示す（実験例９（5-2））。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の抗サイトカイン介在疾患剤は、下記一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするものである。
【００２４】
【化３】
【００２５】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示し、Ｒ３およびＲ５は、異なって、水素原子であるか、またはＳ結合した下記式（１）〜（５）のいずれかに示されるＳＨ化合物若しくはそのエステル（但し、システアミンは除く。）を示し、Ｒ４は水酸基、下記式（６）〜（１１）のいずれかに示されるＮ−置換アミノ酸、そのエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）または下記式（１２）に示されるアミンを示す〕
【００２６】
【化４】
【００２７】
当該ビタミンＥ誘導体（以下、これを「本化合物」ともいう）は、式（Ｉ）で表されるように、ビタミンＥ（α，β，γ，δ−トコフェロール）マレイン酸（またはフマール酸）とＳＨ化合物とがＳ結合した化学構造、並びにこれらにさらにアミノ酸またはアミンが結合した化学構造を有している。
【００２８】
なお、上記式（Ｉ）中、Ｒ１またはＲ２で示される低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、及びイソプロピル基を挙げることができる。好ましくはメチル基及びエチル基であり、より好ましくはメチル基である。
【００２９】
また、上記式（Ｉ）中、Ｒ３またはＲ５で示されるＳＨ化合物としては、上記式に対応して（１）グルタチオン、（２）γ−グルタミルシステイン、（３）システイン、（４）ペニシラミン、これらのエステルまたは（５）システナミンを挙げることができる。なお、Ｒ３およびＲ５は、いずれか一方が水素原子である場合は、他方は水素原子ではなく、ＳＨ化合物またはそのエステルである。
【００３０】
また、上記式（Ｉ）中、Ｒ４で示されるＮ−置換アミノ酸としては、上記式に対応して（６）グリシン（式中ｎ＝１）、β−アラニン（式中ｎ＝２）、γ−アミノ酪酸（式中ｎ＝３）、５−アミノ吉草酸（式中ｎ＝４）、ε−アミノカプロン酸（式中ｎ＝５）、（７）アントラニル酸、（８）トラネキサム酸、（９）プロリン、これらのエステル、（１０）２−アミノエタンスルホン酸、（１１）２−アミノエタンスルフィン酸を挙げることができる。なお、本発明において「Ｎ−置換アミノ酸」とは、上記の各アミノ酸が、その分子内の窒素原子（Ｎ）を介して、式（Ｉ）で示される化合物の基本骨格に結合していることを意味する用語である。
【００３１】
また、上記式（Ｉ）中、Ｒ４で示されるアミンとしては、上記式に対応して（１２）セロトニンを挙げることができる。
【００３２】
本化合物の具体例としては、下記の化合物を挙げることができる。
（ａ）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン、
（ｂ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｃ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｄ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル] -3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ] プロピル]システニイルグリシン、
（ｅ）Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（2-スルフォエチル）アミノ] プロピル]システイン、
（ｆ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[[２-(1H-インドール-3-イル)エチル]アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｇ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（5-カルボキシペンチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｈ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（トランス-4-カルボキシシクロヘキシルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｉ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システイン、
（ｊ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]ペニシラミン、
（ｋ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システナミン、
（ｌ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（エトキシカルボニルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｍ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン イソプロピルエステル、
（ｎ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフィノエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｏ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-（2-カルボキシピロリジノ）プロピル]システニイルグリシン。
【００３３】
本化合物は、遊離のものであっても、その薬理学的に許容できる塩であっても、本発明の目的のため適宜に用いることができる。その薬理学的に許容できる塩としては、たとえばナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、およびカルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、さらに有機アミン塩としてエタノールアミン塩やリジン塩などが例示される。これら以外の塩であっても薬理学的に許容できる塩であればいずれのものであっても適宜に使用することができる。
【００３４】
本化合物の第一の構成成分であるビタミンＥとしては、α，β，γ，δ−トコフェロールのいずれもが適宜使用することができる。
【００３５】
本化合物の第二の構成成分であるＳＨ化合物としては、上記のように、（１）グルタチオン、（２）γ−グルタミルシステイン、（３）システイン、（４）ペニシラミン、これらのエステルまたは（５）システナミンが用いられる。グルタチオン、γ−グルタミルシステイン、システイン、ペニシラミンのエステルとしては、炭素数２〜６のアルキルエステルが挙げられる。具体的には、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、シクロプロピル、ｎ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、ｌ−エチルプロピルエステルおよびｉｓｏ−ペンチルエステルなどが挙げられる。
【００３６】
さらに、本化合物の第三の構成成分であるＮ−置換アミノ酸としては、上記のように、（６）グリシン（式中ｎ＝１）、β−アラニン（式中ｎ＝２）、γ−アミノ酪酸（式中ｎ＝３）、５−アミノ吉草酸（式中ｎ＝４）、ε−アミノカプロン酸（式中ｎ＝５）、（７）アントラニル酸、（８）トラネキサム酸、（９）プロリン、これらのエステル、（１０）２−アミノエタンスルホン酸、（１１）２−アミノエタンスルフィン酸が用いられる。
【００３７】
Ｎ−置換アミノ酸のエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）としては、炭素数２〜６のアルキルエステルが挙げられる。具体的には、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、シクロプロピル、ｎ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、ｌ−エチルプロピルエステルおよびｉｓｏ−ペンチルエステルなどが挙げられる。
【００３８】
本化合物の第四の構成成分であるアミンとしては、（１２）セロトニンが用いられる。
【００３９】
本化合物は、例えば次の合成経路により、またはこれに準じて適宜合成することができる。
【００４０】
【化５】
【００４１】
具体的には以下のとおりである。まずビタミンＥ（II）を無水マレイン酸（III）と炭酸アルカリ（炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなど）または酢酸アルカリ（酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなど）の存在下でアセトン、アセトニトリルまたはテトラハイドフラン（THE）などの無極性溶媒中で加熱して約１〜３時間反応させて、マレイン酸（またはフマール酸）モノトコフェロール（IV）とする。さらに、このように生成した化合物（IV）とアミノ酸（グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、ε−アミノカプロン酸、アントラニル酸、トラネキサム酸、プロリン、これらのエステル、２−アミノエタンスルホン酸、２−アミノエタンスルフィン酸）またはアミン（セロトニン）とを、クロロホルムまたはテトラヒドロフランなどの溶媒中、有機アミン（ピリジン、トリエチルアミンなど）の存在下、クロル炭酸エチルなどによる混合酸無水物法により縮合し、マレイン酸（またはフマール酸）モノトコフェロール（IV）のそれぞれ対応する酸アミド（V）とする。次に、これらの化合物（IV）または（V）と本化合物の構成成分であるＳＨ化合物（グルタチオン、γ−グルタミルシステイン、システイン、ペニシラミン、これらのエステルまたはシステナミン）とを室温下で約３〜６時間、加温下で約１〜３時間付加反応させることにより本化合物（Ｉ）を得ることができる。この際の反応溶媒としては、水または水と混和できる溶媒、たとえばアルコール、アセトニトリル、ジオキサンなどが挙げられ、好ましくは水との混合液がよい。
【００４２】
このようにして得られた本化合物（Ｉ）は、公知の方法により、薬理学的に許容できる塩として得てもよい。
【００４３】
後述する実験例２〜４に示すように、ビタミンＥ、グルタチオンから構成される化合物（上記化合物（a）、以下「EM-GS」ともいう）、ビタミンＥ、タウリン（アミノエタンスルホン酸）及びグルタチオンから構成される化合物（上記化合物（ｂ）、以下「ETS-GS」ともいう）、及びビタミンＥ、GABA（γ―アミノ酪酸）及びグルタチオンから構成される化合物（上記化合物（d）、以下「EGABA-GS」ともいう）を始めとする本化合物は、ＬＰＳで誘導されたサイトカイン(IL-6およびTNF-α)の生成または分泌を、完全ではないものの抑制することができる。これらのサイトカインは、通常ＬＰＳによって強く誘導され、炎症反応の初期の段階で生成分泌される。特にＴＮＦ−αは炎症を仲介する主要因子であり、その放出はさらにＩＫ−１βおよびＩＬ−６のような他のサイトカインを活性化し、細胞の損傷に関わることも知られている(Bone RC. Crit Care Med1996;24:163-172)。またＴＮＦ−αは、敗血症性ショックと関係する初期のショック状態(つまり低血圧、熱)や臓器不全の病因に極めて重要な役割を果たしている(Russell JA. N Engl J Med2006;355:1699-1713)。実験例２〜４に示すように、上記本化合物は、これらのサイトカインの生成または分泌を顕著に抑制することから、当該化合物によれば、かかるサイトカインが介在して発症したり悪化したりする疾患（サイトカイン介在疾患）を予防または改善できると考えられる。
【００４４】
一方、ＩＬ−６は敗血症の重篤度や致死によく関連しており、敗血症の予測因子でもある(Remick DG, et al., Shock2002;17:463-467)。ＩＬ−６もまた、敗血症性ショックおよび臓器障害の病因に重要な役割を果たすと考えられている(Frink M, et al., Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.)。あるデータは、ＩＬ−６の上昇制御が、その後に生じるＩＬ−６上昇に関連した細胞毒性や臓器障害に関係していることを示している（Frink M, et al., Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.）。さらには、ＩＬ−６の制御が臓器障害の軽減作用を有している可能性が示唆されている（Kimizuka K, et al., Am J Transplant. 2004 Apr;4(4):482-94.）。後述する実験例２〜３において、ＬＰＳで誘導されたＩＬ−６が、インビボ及びインビトロの両方で、本化合物の投与で減少することが確認された。本化合物投与によるＩＬ−６の抑制は、細胞に対する直接効果、あるいはサイトカイン生成を抑制することによる間接的な効果によるものであるかもしれないが、いずれにしても本化合物によれば、ＩＬ−６の生成が抑制され、ＩＬ−６による細胞毒性は低下し、敗血症性ショックや臓器障害を改善することができると考えられる。
【００４５】
これを裏付ける実験として、後述の実験例１では、本化合物がＬＰＳで誘導した全身性炎症モデルラットにおける肺および肝臓における急性臓器障害が改善することを示している。
【００４６】
以上のことから、本化合物は、炎症性サイトカインが介在する様々な疾患、特に全身性炎症及びそれに付随する疾病（例えば、敗血症性ショック、急性臓器障害、臓器不全等）を治療する潜在的可能性を有している。
【００４７】
また後述する実験例６〜８の結果は、本化合物の投与によって虚血再還流による腎臓や脳などの組織障害が保護改善されることを示している。従来から、虚血再還流に起因する臓器障害がサイトカイン生成に関係していることが示唆されており、心筋と大脳の虚血再還流（I/R）によってサイトカインが増加することが報告されている(Zhang M, Chen L. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2008 Sep;8(3):161-72.)。前述するよう本化合物は、サイトカイン低減作用を有するが、当該サイトカイン低減作用に基づいて血清サイトカイン濃度を著しく低下させる結果、腎虚血再還流障害や脳虚血再還流障害等の虚血性再還流障害が保護され防止できるものと考えられる。
【００４８】
また後述する実験例５の結果は、本薬剤投与により臓器障害における重要な細胞内因子であるＮＦ-kＢの抑制効果が示されている。各種臓器障害においてその病態形成には、前述のようにサイトカインの産生が重要であるが、これらの因子の発現には細胞内シグナルであるＮＦ-kＢの活性化が重要な役割を担っていることが報告されている（Karrasch T, et al., Inflamm Bowel Dis. 2008 Jan;14(1):114-24.）。前述する本化合物は、ＮＦ-kＢの活性化をほぼ完全に抑制することから、サイトカインの抑制を生じ、各種臓器障害に対する保護効果が得られたものと考えられる。
【００４９】
また、同実験結果より、本化合物によるＮＦ-kＢの抑制にはＩｋＢ系の抑制を介していることが示されている。各種細胞障害時に活性化されるＮＦ-kＢにおいては、ＩＫＫ系を介した活性化が重要であることが報告されており（Schottelius AJ, et al., J.Biol.Chem 274:31868-31874. 1999.）、本発明においても本化合物が細胞内シグナルであるＩＫＫ系の抑制を行ない、最終的な核内蛋白であるＮＦ-kＢの抑制が生じていると考えられる。
【００５０】
従って、本化合物は、サイトカイン、特にＴＮＦαやＩＬ−６が介在して発症若しくは悪化する疾患（サイトカイン介在疾患）を予防または治療するための有効成分として有用であり、当該本化合物を有効成分とする本発明の医薬組成物は、かかるサイトカイン介在疾患の予防または治療剤、またサイトカイン介在疾患から保護する保護剤として有用である。
【００５１】
本発明が対象とするサイトカイン介在疾患としては、パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛を挙げることができる。
【００５２】
特に本発明のサイトカイン介在疾患剤は、サイトカインが介在して発生する敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全を予防又は治療する薬剤として、またさらに虚血再還流障害に対する臓器または組織の保護剤として有効に利用することができる。なお、虚血再還流障害（「虚血再灌流障害」ともいう）とは、虚血状態にある臓器や組織に血液再還流が生じたときに、その臓器や組織内の微小循環において種々の毒性物質の産生が惹起されることで引き起こされる障害である。かかる虚血再還流障害は、例えば脳梗塞、心筋梗塞及び腸間膜血管閉塞症などに対する再還流障害後や、臓器移植後にみられることが多い。その発生機序としては、スーパーオキシドやヒドロキシラジカル等の活性酸素や一酸化窒素などのフリーラジカル産生による障害、及び活性化好中球と血管内皮細胞の相互作用に基づく障害のほか、各種サイトカインなどのケミカルメディエーター産生による障害などが考えられている。虚血再還流障害は、虚血状態に陥った局所だけでなく、二次的に全身の主要臓器にも障害（遠隔臓器障害）をきたすことが知られている。特に脳、肺、肝臓、腎臓などが標的臓器となり、多臓器不全をもたらすこともある。
【００５３】
本化合物を抗サイトカイン介在疾患剤の有効成分として用いる場合、目的と必要に応じて、本化合物のうち１種または２種以上を適宜組み合わせて含有させることもできる。本化合物のうち、好ましくは上記化合物（ａ）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン〔R1及びR2はメチル基、R3は水素原子、R4は水酸基、R5は(1)で示されるSH化合物(グルタチオン)である化合物(I)に相当する〕、（ｂ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン〔R1及びR2はメチル基、R3は(1)で示されるSH化合物(グルタチオン)、R4は(10)で示されるN-置換アミノ酸(2-アミノエタンスルホン酸)、R5は水素原子である化合物(I)に相当する〕、（ｄ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ] プロピル]システニイルグリシン〔R1及びR2はメチル基、R3は(1)で示されるSH化合物(グルタチオン)、R4は(6)で示されるN-置換アミノ酸(γ-アミノ酸酪酸：n=3)、R5は水素原子である化合物(I)に相当する〕であり、より好ましくは化合物（ｂ）である。
【００５４】
ちなみに、化合物（a）、（b）および（d）の化学的な相違は（a）はビタミンＥマレイン酸エステルに対して１位にグルタチオンが付加したものである。（b）、および（d）は２位にグルタチオンがそれぞれ付加し、更に３位のカルボン酸に２−アミノエタンスルホン酸（タウリン）またはγ−アミノ酪酸（GABA）がそれぞれ縮合したものである。
【００５５】
本化合物は、抗サイトカイン介在疾患剤として、経口的にあるいは非経口的〔静脈投与、皮下投与、経皮投与、経肺投与、経粘膜投与（点鼻など）、直腸投与など〕に投与される。抗サイトカイン介在疾患剤は、本化合物を、経口または非経口投与に通常用いられる薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、湿潤剤など）や添加剤などと混合し、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、バッカル剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤、注射剤、点滴剤、点鼻剤などの所望の形態に製剤化することにより調製することができる。
【００５６】
特に本化合物は、水に不溶性のビタミンＥと異なり、非吸湿性の安定な結晶であって、且つ、水溶性であるので、経口液剤（アンプル剤、シロップ剤）、注射剤または点眼剤などの水性液剤としての適用も可能である。さらには、外用薬としての使用も可能である。
【００５７】
これらの製剤には通常用いられる薬学的に許容される担体、例えば、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドン）、賦形剤（例えば、乳糖、砂糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、増粘剤、分散剤等、またその他の添加剤として、再吸収促進剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤等を適宜使用してもよい。
【００５８】
本化合物を抗サイトカイン介在疾患剤として使用する際の投与量は、使用する本化合物の種類、患者の体重や年齢、対象とする疾患の種類やその状態および投与方法などによっても異なるが、たとえば、本化合物の量に換算して、注射剤の場合は成人１日１回約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、錠剤等の経口投与剤の場合は、成人１日数回、１回量約１ｍｇ〜約１００ｍｇ程度投与するのがよい。また、点眼剤等のような粘膜投与剤の場合は、成人１日数回、１回数滴、濃度が約０．０１〜５（ｗ／ｖ）％の製剤を投与するのがよい。
【００５９】
本化合物を含有する医薬組成物（抗サイトカイン介在疾患剤）には、本発明の目的に反しない限り、その他の抗サイトカイン介在疾患剤または別種の薬効成分を適宜含有させてもよい。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明の構成および効果を製造例及び実験例に基づいてより詳細に説明する。但し、これらの実験例等は一例であり、本発明はかかる実験例によって何ら拘束されるものではない。
【００６１】
[製造例]
製造例１
（１）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン（略称：EM-GS）のモノナトリウム塩の製造
ｄｌ−α−トコフェロール４．３ｇ（0.01モル）、無水マレイン酸２．０ｇ（0.02モル）および炭酸ナトリウム２．１ｇ（0.02モル）にアセトン８０ｍｌを加えて１時間、加熱還流した後、無機塩を濾別し、溶媒を留去した。残渣油状物に水６０ｍｌを加え、さらに塩酸で酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。次にこれを水で洗浄した後、酢酸エチルを留去させ、残渣油状物のマレイン酸モノα−トコフェロールエステル約５ｇを得た。次に７０％メタノール１００ｍｌに水酸化ナトリウム０．６ｇおよびグルタチオン３．４ｇ（0.011モル）を加えて溶解し、これに上記のマレイン酸モノα−トコフェロールエステルをメタノール３０ｍｌに溶解したものを加えて、４０℃、３時間攪拌した。次にこれを冷却し析出した半固型油状物を集め、８０％含水メタノールで２〜３回洗い、次にメタノールを加えて結晶化させ、結晶を濾取しアセトンで洗い４．０ｇを得た。これを水−エタノールから再結晶して、標題の化合物のモノナトリウム塩２．８ｇを得た。
【００６２】
（２）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシンの製造
ｄｌ−α−トコフェロール４．３ｇ、無水マレイン酸３．０ｇおよび酢酸ナトリウム１．５ｇにアセトン８０ｍｌを加えて３時間、加熱還流した後、溶媒を留去し、残渣油状物に水６０ｍｌを加え、さらに塩酸で酸性とした後、ジイソプロピルエーテルで抽出し、水洗後、ジイソプロピルエーテルを留去させ、残渣油状物のマレイン酸モノα−トコフェロールエステル（放置すると結晶化）５．１ｇを得た。（これをｎ−ヘキサンから再結晶すると融点７０〜７２℃の白色結晶３．８ｇを得ることができる。）次にメタノール８０ｍｌに水酸化ナトリウム０．６ｇを加えて溶解し、これにグルタチオン３．４ｇおよび上記のマレイン酸モノα−トコフェロールエステルをエタノール３０ｍｌに溶解したものを加えて、５０℃、３時間攪拌した。次に、これを冷却し析出した白色結晶を濾取し、アセトンで洗浄後、この結晶に水１００ｍｌを加えてのり状とし、これに塩酸を加えてｐＨ３とし、析出する白色結晶を濾取、水洗し、乾燥後テトラハイドロフラン／エタノールから再結晶して、標題の遊離酸３．５ｇを得た。
【００６３】
（３）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン ２ナトリウム塩の製造
上記（２）で得られた遊離酸を３．５ｇテトラハイドロフラン６０ｍｌに溶かし、これに水酸化ナトリウム／メタノールを徐々に加えてｐＨ６．５とした後、溶媒を留去し、これにメタノールを加えて析出する白色結晶を濾取し、これを水−メタノールから再結晶して、標題の化合物の２ナトリウム塩３．０ｇを得た。
【００６４】
製造例２ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（略称：ETS-GS)のナトリウム塩の製造
製造例１の製造過程で得られたマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇをクロロホルム３０ｍｌに溶かし、これにトリエチルアミン１．２ｇを加えて−５℃に冷却して置き、これにクロル炭酸エチル１．３ｇを徐々に滴下した後、１５分後にこれにタウリン（２−アミノエタンスルホン酸）１．６ｇおよび水酸化ナトリウム０．５ｇをメタノール５０ｍｌに溶かしたものを一挙に加えて３０分間攪拌し、更に室温にもどして１時間攪拌した。次に溶媒を留去させ、これにアセトンを加えて析出する白色結晶を濾取し、４．０ｇを得た。更に母液に水酸化ナトリウム／メタノールを加えてｐＨ８として析出する結晶を濾取し１．６ｇを得た。これらを合わせてメタノール／エタノールから再結晶して、白色結晶のＮ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸ナトリウム塩４．５ｇを得た。
【００６５】
次に、９０（Ｖ／Ｖ）％メタノール溶液６０ｍｌに水酸化ナトリウム０．４５ｇおよびグルタチオン３．３ｇを加えて溶解し、これに上記の化合物４．５ｇをメタノール５０ｍｌに溶解したものを加えて、５０℃、３時間攪拌し、冷却後析出した白色結晶を濾取し、メタノールで洗浄し６．０ｇを得た。これを水２００ｍｌに溶かし、これに酢酸銅２．５ｇを水５０ｍｌ、酢酸２ｍｌに溶解したものを加えて析出する銅塩を濾取し、水洗後アセトン、メタノールで洗い５．３ｇを得た。これをテトロラハイドロフラン／メタノール（３：５）の混液１００ｍｌに懸濁して置き、これに硫化水素を通じて硫化銅として濾別後、濾液に水酸化ナトリウム／メタノールを加えてｐＨ５として析出する白色結晶を濾取し、メタノールで洗浄して乾燥させて、標題の目的化合物のナトリウム塩３．９ｇを得た。
【００６６】
製造例３ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（略称：Ｅ-Ant-S-ＧＳ）のナトリウム塩の製造
製造例１の製造過程で得られたマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、製造例１と同様にトリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇを用いて混合酸無水物法によりアントラニル酸１．５ｇ、ピリジン３ｍｌをテトラハイドロフラン４０ｍｌに溶かしたものを反応させ、溶媒留去後、塩酸酸性として酢酸エチルで抽出、水洗後、酢酸エチルを留去し、残渣油状物７．５ｇを得た。
【００６７】
一方、メタノール７０ｍｌに水酸化ナトリウム０．８ｇを加えて溶かし、これにグルタチオン３．３ｇおよび上記の油秋物７．５ｇをメタノール２０ｍｌに溶かしたものを加えて、５０℃、３時間攪拌する。次に冷却後、析出した白色結晶を濾取した。これに水５０ｍｌを加えてゲル状とし、これに酢酸３ｍｌを加えて析出する白色結晶を濾取し、これを酢酸エチル／エタノールの混液に溶解し、水酸化ナトリウム／メタノール液を加えてＰＨ６．５として析出する白色結晶を濾取し、テトラハイドロフラン／エタノールから再結晶して、標題の目的化合物のナトリウム塩３．７ｇを得た。
【００６８】
製造例４ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（略称：EGABA-GS)のナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇをクロロホルム３０ｍｌに溶かし、前記と同様にトリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇを用いて混合酸無水物法によりγ−アミノ酪酸 (GABA)１．３ｇ、水酸化カリウム０．６ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド５０ｍｌに溶解したものを加えて、以下製造例３と同様に反応処理して標題の目的化合物のナトリウム塩４．０ｇを得た。
【００６９】
製造例５ Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（2-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システインのナトリウム塩の製造
製造例２で示したＮ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸のナトリウム塩２．４ｇをメタノール５０ｍｌに溶かし、これにＬ−システイン０．６ｇを加えて、５０℃、２時間攪拌する。次に冷却後析出する白色結晶を濾取し、水／メタノールから再結晶して、白色結晶の標題の目的化合物のナトリウム塩１．８ｇを得た。
【００７０】
製造例６ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[[２-(1H-インドール-3-イル)エチル]アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇ、トリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇをクロロホルム中で製造例１と同様に混合酸無水物法によりセロトニン塩酸塩２．４ｇ、トリエチルアミン１．５ｇをメタノール４０ｍｌに溶かしたものを加え、製造例２と同様に反応させ、溶媒を留去後、残渣油状物を酢酸エチルで抽出し、１％酢酸、水で洗った後、酢酸エチルを留去した。これにメタノールを加えて放置し、析出する白色結晶をメタノールから再結晶して、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）セロトニンなる化合物４．５ｇを得た。次に、これとグルタチオン３．４ｇ、水酸化ナトリウム０．４ｇにメタノール７０ｍｌを加えて、５０℃、３時間攪拌後、反応液を３０ｍｌまで濃縮し、析出した結晶を濾取し、以下製造例３と同様に処理して、標題の目的化合物のナトリウム塩３．７ｇを得た。
【００７１】
製造例７ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（5-カルボキシペンチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇ、トリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇおよびε−アミノカプロン酸１．５ｇを用いて、製造例２と同様に混合酸無水物法により反応処理して、溶媒を留去後残渣に水を加え、更に塩酸酸性として酢酸エチルで抽出し水洗後留去した。これをメタノール７０ｍｌに溶かし、これにグルタチオン３．３ｇを加え、さらに水酸化ナトリウム／メタノールでｐＨ６．５として、５０℃、３時間攪拌した後冷却し、析出する結晶を濾取し、これに水５０ｍｌを加えた。更にこれを酢酸酸性として結晶を濾取し、水洗後ＴＨＦ／エタノールに溶解し、ＴＨＦ留去後、水酸化ナトリウム／メタノールでｐＨ７として析出する白色結晶を濾取し、これをメタノール／エタノールから再結晶して標題の目的化合物の２−ナトリウム塩２．５ｇを得た。
【００７２】
製造例８ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（トランス-4-カルボキシシクロヘキシルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇ、トリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇおよびトラネキサム酸（トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸）１．７ｇを用いて、製造例７と同様に反応処理して目的化合物の２−ナトリウム塩２．２ｇを得た。
【００７３】
製造例９ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システインのナトリウム塩の製造
製造例２で得た中間体、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸ナトリウム塩２．６ｇおよびγ−グルタミルシステイン１．０ｇにメタノール５０ｍｌを加え、更に水酸化ナトリウム／メタノールでＰＨ６．５として、５０℃、３時間攪拌した。次に反応液を２０ｍｌまで濃縮し、析出した白色結晶を濾取し、これに水７０ｍｌを加えて溶かし、塩酸でｐＨ３として析出する白色結晶を濾取した。次に、これをＴＨＦ／エタノールに溶かし、水酸化ナトリウム／メタノールでｐＨ６．５として、ＴＨＥを留去後、析出した結晶を濾取し、少量のメタノールで洗い、メタノール／エタノールから再結晶して、標題の目的化合物の２−ナトリウム塩１．３ｇを得た。
【００７４】
製造例１０ Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]ペニシラミンのナトリウム塩の製造
製造例２で得た中間体、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸ナトリウム塩３．２ｇおよびＤ−ペニシラミン０．８ｇを用いて、製造例５と同様に反応処理して得られる結晶をメタノール／エタノールから再結晶させて、目的化合物のナトリウム塩２．５ｇを得た。
【００７５】
製造例１１ Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システナミンの製造
製造例２で得た中間体、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸ナトリウム塩２．４ｇおよびシステナミン０．５ｇをメタノール７０ｍｌに溶解し、酢酸を加えてｐＨ６とし、５０℃、３時間攪拌した。冷後析出した結晶を濾取し、これをメタノールに懸濁しておき、水酸化ナトリウム／メタノールでｐＨ７として溶解後、酢酸酸性として析出する白色結晶を濾取し、メタノールで洗って乾燥させて、白色結晶の標題の目的化合物１．３ｇを得た。
【００７６】
製造例１２ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（エトキシカルボニルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例１で得たマレイン酸モノα−トコフェロールエステル５．３ｇ、トリエチルアミン１．２ｇ、クロル炭酸エチル１．３ｇおよびグリシンエチル塩酸塩１．５ｇを用いて、製造例２と同様に混合酸無水物法により反応処理して、溶媒を留去後、酢酸エチルで抽出し、３％炭酸水素ナトリウム、１Ｎ−塩酸、水の順で洗浄し、酢酸エチル留去後、残渣油状物約６ｇを得た。これをメタノール５０ｍｌに溶かした。一方、グルタチオン３．３ｇ、水酸化ナトリウム０．５ｇを７０％メタノール５０ｍｌに溶かし、上記のメタノール溶液に加えて５０℃、２時間攪拌する。次に溶媒を留去しエタノールを加えて析出した結晶を濾取し、これに水５０ｍｌを加えて溶解し、これに塩酸を加えて析出する白色結晶を濾取し、ＴＨＦ／エタノール（１：１）に溶解し、製造例７と同様にして標題の目的化合物のナトリウム塩２．０ｇを得た。
【００７７】
製造例１３ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン イソプロピルエステルのナトリウム塩の製造
グルタチオンイソプロピルエステル硫酸塩（γ−グルタミル−システニルグリジンイソプロピルエステル硫酸塩）４．０ｇを水６０ｍｌに懸濁しておき、これに２Ｎ−水酸化ナトリウムを徐々に加えてｐＨ４として溶解後、濃縮した。これに８０％メタノール１００ｍｌを加え、更に製造例２で得た中間体、Ｎ−（α−トコフェロールマレイニル）アミノエタンスルホン酸のナトリウム塩４．８ｇを加えて、５０℃、３時間攪拌する。次に溶媒を約６０ｍｌ留去し、析出する結晶を濾取した。これにＴＨＥ−メタノール（１：１）に溶解し、不溶物を濾別した後、溶媒を留去、残渣結晶物にエタノールを加えて結晶を濾取した。これをメタノール／エタノールから再結晶させて白色結晶の標題の目的化合物のナトリウム塩３．６ｇを得た。
【００７８】
製造例１４ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフィノエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例７のε−アミノカプロン酸の代わりにヒポタウリン（２−アミノエタンスルフィン酸）１．５ｇを用いて、製造例２と同様に反応処理して、標題の目的化合物のナトリウム塩３．９ｇを得た。
【００７９】
製造例１５ γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-（２-カルボキシピロリジノ）プロピル]システニイルグリシンのナトリウム塩の製造
製造例７のε−アミノカプロン酸の代わりにＬ−プロリン１．５ｇを用いて、製造例２と同様に反応処理して、標題の目的化合物のナトリウム塩３．９ｇを得た。
【００８０】
［実験例］
下記の実験において、本化合物の一例として、下式で示される化合物を用いた。これらの化合物はいずれも水溶性で、安定であることを特徴とする。
（１）式（VI）で示す構造を有するＥＴＳ−ＧＳ（製造例２のγ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（上記（ｂ）の化合物）のナトリウム塩）：
【００８１】
【化６】
【００８２】
（２）式（VII）で示す構造を有するＥＭ−ＧＳ（製造例1のγ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル] -3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン（上記（a）の化合物）のナトリウム塩）：
【００８３】
【化７】
【００８４】
（３）式（VIII）で示す構造を有するＥＧＡＢＡ−ＧＳ（製造例４のγ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（3-カルボキシプロピル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（上記（d）の化合物）のナトリウム塩）：
【００８５】
【化８】
【００８６】
（４）式（IX）で示す構造を有するＥ-Ant-S-ＧＳ（製造例３のγ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン（上記（c）の化合物）のナトリウム塩）：
【００８７】
【化９】
【００８８】
実験例１〜４
腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン-6（IL-6）のような前炎症性サイトカインの過剰発現は、ショックや臓器障害に関与している(Bhatia M, et al., J Pathol2004;202:145-156)。
【００８９】
そこで下記の実験例１〜４では、本化合物が、サイトカイン（TNF-α、IL-6）の生成または分泌を阻害し、それにより、リポ多糖体で誘導した全身性炎症モデルラット（敗血症モデルラット）における臓器障害を改善するかどうかについて調べた。
【００９０】
なお、この実験には、下記の方法によりＥＴＳ−ＧＳの存在下または非存在下でＬＰＳ処置したラット（LPS誘導敗血症モデル動物）を使用した。
【００９１】
なお、データはすべて平均値±ＳＤとして示し、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して評価した。 p-値<0.05を統計的有意とした。
【００９２】
（１）被験動物
体重２５０-３００ｇの雄ラット（Wister rat）を使用した。ラットはすべて、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。研究は大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認された。すべてのプロトコルは国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに沿って行った。麻酔は4%のセボフルラン（丸石製薬（株）製）を用いて行った。
【００９３】
（２）被験動物のＬＰＳ処置（LPS誘導敗血症モデル動物の調製）
ラットは、無作為に３つのグループに分けた（LPS群、ETS-GS+LPS群、対照群）。１)ＬＰＳ群には、ＬＰＳ(7.5mg/kg)を尾静脈に静脈注射、２)ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群には、ＥＴＳ―ＧＳ(10mg/kg)およびＬＰＳ(7.5mg/kg)を同時に尾静脈に静脈注射、３)対照群には０.９％のＮａＣｌ水溶液を尾静脈に静脈注射した。
【００９４】
実験例１ ＬＰＳ処置後の肺および肝臓組織に対するＥＴＳ−ＧＳの影響
（１）光学顕微鏡分析
ＬＰＳ投与から２４時間後に採取したラットの肺及び肝臓の組織標本（LPS群、ETS-GS+LPS群、対照群）を定法に従ってホルマリンに固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した。そのサンプルを分析し、村上の技術 (Murakami K, et al., Shock2002;18:236-241)に基づいて肺障害の程度を決定した。肺実質中の24のエリアを、４つのパラメーター（鬱血、浮腫、炎症および出血）に関して０〜４の５段階に類別した（０：無しまたは正常にみえる、１：軽度、２：中度、３：重度、４：非常に重度）。またHeijnenの技術(Heijnen BH, et al., Surgery 2003;134:806-817)に従って肝障害の程度を評価した。肝障害は、6つのパラメーター（細胞質の退色、液胞化、核凝縮、核分割、核フェージングおよび赤血球鬱滞）について０(認められない)から１(軽度)、２(中度)および３(重度)までの４段階にスコア化した。
【００９５】
各染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図１に示す。
【００９６】
肺の組織変化は対照群(図１Ａ)では観察されなかったが、ＬＰＳ群の肺組織で顕著な間質性の浮腫および炎症細胞の浸潤がみとめられた(図１Ｂ)。ＥＴＳ−ＧＳ処置したＬＰＳ群（ETS-GS+LPS群）では、間質性の浮腫および炎症細胞の浸潤が、ＬＰＳ群と比較して、顕著に低減されていた(図１Ｃ)。肺組織に関する組織学的スコアの結果を図２に示す。これからわかるように、ＬＰＳ群（白棒）の肺組織の組織学的スコアは、対照群（黒棒）のスコアと比較して、すべて著しく高く、ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群（斜線棒）のスコアはその中間であった。
【００９７】
一方、肝臓組織に関しては、ＬＰＳ群の肝臓組織で、対照群(図１Ｄ)と比較して、顕著な出血および炎症細胞の浸潤が見られた(図１Ｅ)。ＥＴＳ−ＧＳ処置したＬＰＳ群（ETS-GS+LPS群）では、ＬＰＳ群と比較して、間質性の出血および炎症細胞の浸潤が、著しく低減していた(図１Ｆ)。肝臓組織に関する組織学的スコアの結果を図３に示すが、上記と同様に、ＬＰＳ群において、対照群と比較して、組織学的スコアはすべて著しく高く、ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群のスコアはその中間であった。
【００９８】
この結果から、ＬＰＳ投与で誘導される全身性炎症モデル動物（敗血症モデル動物）における肺組織及び肝臓組織の急性障害が、ＥＴＳ−ＧＳの投与により有意に予防若しくは改善されることが判明した。
【００９９】
実験例２ ＬＰＳ投与後の血清ＩＬ−６およびＴＮＦ−αレベルに対するＥＴＳ−ＧＳの影響
ＬＰＳで誘導したサイトカイン（IL-6、TNF-α）に対するＥＴＳ−ＧＳの影響を調べた。実験はＬＰＳ投与後、１２時間に亘って血清サンプル（LPS群、ETS-GS+LPS群、対照群）を採取することで実施した。
【０１００】
（１）サイトカインの測定
血清中のＩＬ−６およびＴＮＦ-αの濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットとＩＬ−６およびＴＮＦ-αのそれぞれに対するラット特異的モノクローナル抗体（Invitrogen社）を用いて分析した。吸光度は540nmで測定した(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)。
【０１０１】
（２）結果
血清中のＴＮＦ-α濃度、ＩＬ−６濃度の経時的変化を図４Ａ及びＢにそれぞれ示す。
【０１０２】
血清中のＴＮＦ−α濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、ＬＰＳ群とＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群では増加が認められ、いずれもＬＰＳ投与後３時間でピークに達した。しかし、その増加の程度は、ＬＰＳ群と比較して、ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群では著しく低かった(図４Ａ)。同様に、血清中のＩＬ−６濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、ＬＰＳ群およびＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群ともに、ＬＰＳ投与後３時間でピークに達した (図４Ｂ)。しかし、その増加の程度は、ＴＮＦ−α濃度と同様に、ＬＰＳ群と比較して、ＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群では著しく低かった(図４Ｂ)。
【０１０３】
これらの結果から、ＬＰＳ投与（LPS刺激）によって誘導されるサイトカイン（IL-6、TNF-α）はいずれもＥＴＳ-ＧＳにより有意に抑制されることが判明した。
【０１０４】
実験例３ ＬＰＳで刺激したマウスマクロファージによるサイトカイン（IL-6及びTNF-α）及びＨＭＧＢ１生成に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7（1×106細胞）を、５％の加熱不活性化したウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン(50units/ml、Gibco BRL) およびストレプトマイシン(50μg/ml、Gibco BRL)を含むRPMI 1640培地(和光純薬工業)中で、５％のＣＯ2の下、３７℃で培養して、培地に分泌されたＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＨＭＧＢ１（high-mobility group box1 protein）の量を測定した（対照群）。またＬＰＳ群として、上記の培地にＬＰＳ(100ng/ml)を添加し、またＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群として、上記の培地にＥＴＳ-ＧＳ（0.0001〜100μg/ml）とＬＰＳ(100ng/ml)を添加し、上記と同様に培養して培地に分泌されたＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＨＭＧＢ１の量を測定した。なお、ＨＭＧＢ１は、３０ｋＤの非ヒストン性染色体関連タンパク質であり（Bianchi ME, et al., Science, 1898;243:1056-1059）、その血清中の濃度は、重度の敗血症や敗血症ショックにより増加することが報告されている（Wang H, et al., Science 1999; 285:248-251）。また、ＨＭＧＢ１は、後期の炎症応答を増幅し、サイトカイン分泌を促進することが知られているが（サイトカインメディエーター）（van Zoelen MA, et al., Shock 2009;31:280-284）、最近、致死性敗血症の末期のメディエーターとして、また虚血再還流障害の初期のメディエーターとして機能することがわかっている（Tsung A, et al., J Exp Med 2005; 201:1135-1143）。
【０１０５】
ＴＮＦ-α生成量（pg/ml）を図５（Ａ）に、ＩＬ-６生成量（pg/ml）を図５（Ｂ）に、ＨＭＧＢ１生成量（ng/ml）を図５（Ｃ）それぞれ示す。
【０１０６】
結果からわかるように、培地にＬＰＳを添加することで（LPS群）（図中、LPS：＋、ETS-GS：0）培地に大量のＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＨＭＧＢ１が分泌されたが、ＬＰＳと共にＥＴＳ-ＧＳを添加することでその分泌量はいずれも低減した（ETS-GS＋LPS群）（図中、LPS：＋、ETS-GS：100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001μg/ml）。ＥＴＳ-ＧＳ添加によるＩＬ-６、ＴＮＦ-α及びＨＭＧＢ１分泌の抑制効果は、いずれも用量依存的であり、100μg/mlのＥＴＳ-ＧＳ添加で最も大きかった。
【０１０７】
これらの結果から、ＬＰＳ投与（LPS刺激）によって誘導されるＨＭＧＢ１（サイトカインメディエーター）及びサイトカイン（IL-6、TNF-α）は、いずれもＥＴＳ-ＧＳにより有意に抑制されることが確認された。
【０１０８】
実験例４ 各種水溶性ビタミンＥ誘導体による抗サイトカイン効果
上記実験例３と同様の方法で、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7を用いて、各種のビタミンＥ誘導体（ETS-GS、EM-GS、EGABA-GS）の抗サイトカイン効果を調べた。なお、サイトカインとしてＴＮＦ-αを用いた。
【０１０９】
具体的には、RAW264.7細胞培養の上清液中にＬＰＳ100ng/mlの添加を行うと同時に各種ビタミンＥ誘導体（VE誘導体）を表１に示す濃度にて添加し、２０時間培養した後の培養液中のＴＮＦ-α濃度をＥＬＩＳＡ法にて検討した。結果を表１に示す。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
この結果、ＥＭ−ＧＳやＥＧＡＢＡ-ＧＳといったビタミンＥ誘導体も、ＥＴＳ-ＧＳとほぼ同程度の抗サイトカイン作用（サイトカイン低減作用）を有していることが示された。つまり、これらのビタミンＥ誘導体はいずれの濃度および誘導体においてもＬＰＳのみの投与（培養液中のTNF-α濃度：812.3 ± 25.6 (pg/ml)）に比べて、有意にサイトカインの生成を抑制できることが示された（ｐ＜０．０５））。
【０１１２】
実験例５ ＬＰＳ誘導によるｐ５０/ｐ６５ＤＮＡ結合増加に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（１）ＬＰＳで誘導したp50/p65 ＤＮＡ結合の増加に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7（1×106細胞）を、５％の加熱不活性化したウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン(50units/ml、Gibco BRL) およびストレプトマイシン(50μg/ml、Gibco BRL)を含むRPMI 1640培地(和光純薬工業)中で、５％のＣＯ2の下、３７℃で１時間培養した（対照群）。またＬＰＳ群として、培地にＬＰＳ(100ng/ml)を添加し同様に１時間培養した。またＥＴＳ-ＧＳ＋ＬＰＳ群として、培地にＬＰＳ(100ng/ml)とともにＥＴＳ-ＧＳ（100μg/ml）を添加し、同様に１時間培養した。
【０１１３】
斯くして培養したマウスマクロファージ細胞株RAW264.7（対照群、LPS群、ETS-GS＋LPS群）を回収した後Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(PIERCE）を用いて核内蛋白質のみを抽出し、得られた核溶解物中でのＮＦ-kＢ(p50/p65)のＤＮＡ結合活性を、ＥＬＩＳＡに基づく非放射性のＮＦ-kＢ (p50/p65) transcription factor assay kit (Millipore)を使用して測定した。
【０１１４】
結果を図６に示す。この結果からわかるように、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7の核分画中のＮＦ-kＢ(p50/p65)のＤＮＡ結合活性はＬＰＳ刺激後１時間で増加した（図中、白棒、LPS：＋、ETS-GS：0）。 しかし、ＬＰＳとＥＴＳ-ＧＳの両方で処置すると、この増加は有意に抑制された（図中、灰色棒、LPS：＋、ETS-GS：100μg/ml）。このことから、ＬＰＳ刺激により増加したRAW264.7細胞核分画中のＮＦ-kＢ(p50/p65)のＤＮＡ結合活性は、ＥＴＳ-ＧＳによって低減することがわかる。
【０１１５】
（２）ＬＰＳで誘導したタンパク質のリン酸化に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（2-1）ＬＰＳで誘導したＩkＢリン酸化に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
上記で培養したマウスマクロファージ細胞株RAW264.7（対照群、LPS群、ETS-GS＋LPS群）を回収した後Mammalian Extraction Reagents(PIERCE）を用いて細胞蛋白を調製し、細胞質のリン酸化ＩｋＢレベルを測定した。リン酸化ＩｋＢ レベルは、ＩｋＢα、リン酸化ＩｋＢα、及びβアクチンにそれぞれ特異的な抗体（抗phospho-IKBα (p-IkBα)抗体、IkB alpha抗体：Cell Signaling Technology、抗βアクチン抗体：Abcam）を使用して、ウエスタンブロッティング分析により測定した。
【０１１６】
なお、ウエスタンブロッティング分析は、各細胞株（対照群、LPS群、ETS-GS＋LPS群）から調製したタンパク質をSDS-PAGEゲル電気泳動に供し、まずポリビニリデン・ジフルオリド膜(ミリポア)に転写した。次いで転写した膜を第１抗体(1:1000稀釈)で培養し、第２抗体で培養した後、enhanced chemiluminescence detection kit (Amersham)を使用して発色させて、Hyperfilm ECL(アマシャム)に供した。
【０１１７】
結果を図７に示す。図に示すようにＬＰＳによる処置は、ＩkＢαをリン酸化し、結果としてＩkＢαの低下をもたらした（図中、LPS：＋、ETS-GS：0）。このＩkＢαリン酸化、及びそれに伴うＩkＢαの低下は、ＥＴＳ-ＧＳを投与することで抑制された（図中、LPS：＋、ETS-GS：100μg/ml）。
【０１１８】
（2-2）AKt、ERK1/2、JNK、MAPK、及びIkBのリン酸化に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
上記で培養したマウスマクロファージ細胞株RAW264.7（対照群、LPS群、ETS-GS＋LPS群）を回収した後Mammalian Extraction Reagents(PIERCE）を用いて細胞蛋白を調製し、Aktのレベル、及び各種タンパク質（A：Akt、B:extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2)、C:c-jun N-terminal kinase (JNK)、D:p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK)、Ｅ：IκBα）のリン酸化レベルをBio-Plexアッセイにより測定した。結果をそれぞれ図８（Ａ）〜（Ｅ）に示す。
【０１１９】
図８（Ａ）に示すようにＬＰＳによって減少したAktのリン酸化、つまりAktのシグナル活性がＥＴＳ-ＧＳの投与により回復することがわかった。このことはＥＴＳ-ＧＳの作用が、P13K-Akt経路の活性化に関係していることを示唆する。P13K-Aktシグナル経路は、抗壊死性でまた抗アポトーシス性である。このことから、ＥＴＳ-ＧＳは、P13K-Akt経路の活性化を介して、内毒素血症や敗血性ショックの予防及び改善に有効に働くことが示唆される。
【０１２０】
一方、図８（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、ＬＰＳによって誘導された各種タンパク質（ERK1/2、JNK、p38 MAPK）のリン酸化は、ＥＴＳ-ＧＳの投与により抑制された。これらのタンパク質（ERK1/2、JNK、及びp38 MAPK）は、MAPKファミリーに属するタンパク質であり、このことからＥＴＳ-ＧＳの投与によりMAPK経路の活性化が阻害されることが判明された。MAPK経路が活性化することによって、炎症応答を増強するNF-κB（炎症に重要な細胞内メディエーター）が活性化されることから（kyriakis JM et al., Physiol Rev 2001; 81:807-869）、ＥＴＳ-ＧＳはMAPK経路の活性化を阻害することで抗炎症作用を発揮すると考えられる。
【０１２１】
また、図８（Ｅ）に示すように、ＬＰＳによってIκBαのリン酸化が誘導されリン酸化IκBαが増加したが、それは、ＥＴＳ-ＧＳの投与により顕著に減少した。P13K-Aktの阻害は、IκBαのリン酸化及びNF-κBの核移行を増強する（Diaz-Guerra MJ et al., J Immunol 1999, 162:6184-6190）。加えて、MARK経路とNF-κB活性化との関連性は、ストレスや炎症応答に重要である（Ci X, et al., Inflammation 2010, 33:126-136）。従って、図８（Ｅ）に示すように、ＬＰＳによって誘導されたIκBαのリン酸化がＥＴＳ−ＧＳ投与により抑制されたことは、ＥＴＳ−ＧＳがP13K-Aktを誘導し、またMAPKを阻害することを示唆する。
【０１２２】
以上説明するように、ＥＴＳ-ＧＳがＬＰＳで誘導した全身性炎症モデルラットにおける肺および肝障害を改善することが判明した。さらに、ＥＴＳ-ＧＳは、ＬＰＳ投与によるサイトカインメディエーターであるＨＭＧＢ１やサイトカイン(IL-6およびTNF-α)の生成または分泌を、完全ではないものの抑制することも判明した。
【０１２３】
前述するように、これらのサイトカインは、通常ＬＰＳによって強く誘導され、炎症反応の初期の段階で生成分泌され、これにより、敗血症性ショックの進展に重要な役割を果たすことが知られている(Nasraway SA. Chest2003;123:451S-459S)。特にＴＮＦ-αは炎症を仲介する主要因子であり、その放出はさらにＩＬ-１βおよびＩＬ-６のような他のサイトカインを活性化し、細胞の損傷に関わることも知られている(Bone RC. Crit Care Med1996;24:163-172)。またＴＮＦ-αは、敗血症性ショックと関係する初期のショック状態(つまり低血圧、熱)や臓器不全の病因に極めて重要な役割を果たしている(Russell JA. NEngl J Med2006;355:1699-1713)。一方、ＩＬ−６は敗血症の重篤度や致死によく関連しており、敗血症の予測因子でもある(Remick DG, et al., Shock2002;17:463-467)。
【０１２４】
上記実験例２〜４で示したように、ＥＴＳ-ＧＳ、ＥＭ−ＧＳ、ＥＧＡＢＡ−ＧＳ等の本化合物の投与が、これらのサイトカイン（TNF-αやIL-6）の生成または分泌を顕著に抑制することから、本化合物によって、サイトカインが介在して発症したり悪化したりする疾患（サイトカイン介在疾患）を予防または改善できると考えられる。
【０１２５】
実験例５でのインビトロ実験において、ＮＦ-kＢ活性化はＩkＢリン酸化をブロックすることで阻害されることを示した。このことから、本化合物の投与によるサイトカイン(IL-6およびTNF-α)の抑制は、さらにＮＦ-kＢ不活性化に基づいている可能性がある。
【０１２６】
結論として、本化合物により、炎症性サイトカインが介在する全身性炎症や臓器障害（急性臓器障害）を改善できる可能性がある。具体的には、上記実験例１〜５の実験結果は、本化合物がＮＦ-kＢ活性化を抑制することによって、炎症性サイトカインが介在する様々な疾患、特に全身性炎症及びそれに付随する疾病（敗血症性ショック、急性臓器障害、臓器不全等）を治療する潜在的可能性を有することを示している。
【０１２７】
実験例６〜８
上記実験例１では、ＬＰＳ投与で誘導された全身性炎症モデル動物（敗血症モデル動物）における急性臓器障害が、ＥＴＳ-ＧＳの投与により有意に改善されることを示した。
【０１２８】
急性腎障害の原因は多岐に亘るが、その一つとして虚血再還流を挙げることができる。そこで下記の実験例６〜８では、脳虚血再還流障害、腎虚血再還流障害及び肝虚血再還流障害に対する本化合物の影響をＥＴＳ-ＧＳを用いて調べた。なお、この実験には、下記の方法によりＥＴＳ-ＧＳの存在下または非存在下で脳虚血再還流処置、腎虚血再還流処置、または肝虚血再還流処置をしたラット（脳虚血再還流障害モデル動物、腎虚血再還流障害モデル動物、肝虚血再還流障害モデル動物）を使用した。
【０１２９】
なお、データはすべて平均値±ＳＤとして示し、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して評価した。p-値<0.05を統計的有意とした。
【０１３０】
（１）被験動物
体重250-300gの雄ラット（Wister rat）を使用した。ラットはすべて、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。研究は大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認された。すべてのプロトコルは国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに沿って行った。麻酔は４％のセボフルラン（丸石製薬（株）製）を用いて行った。
【０１３１】
（２）被験動物の脳虚血再還流処置（脳虚血再還流障害モデル動物の調製）
ラットは、無作為に３つのグループに分けた（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）。Ｉ/Ｒ群には、体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを静脈注射した後に、呼吸を７分間停止することで心肺停止させることで脳を虚血にさせ、その後蘇生を行った（ETS-GS非存在下で脳虚血再還流）。ＥＴＳ-ＧＳ＋Ｉ/Ｒ群には、体重１ｋｇ当たり１０mg/mlのＥＴＳ−ＧＳ水溶液を１.０ml(10mg/kg)静脈注射した後、呼吸を７分間停止することで心肺停止させることで脳を虚血にさせ、その後蘇生を行った（ETS-GS存在下で脳虚血再還流）。対照群には体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを静脈注射した。
【０１３２】
（３）被験動物の腎虚血再還流処置（腎虚血再還流障害モデル動物の調製）
ラットは、無作為に3つのグループに分けた（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）。Ｉ/Ｒ群には、右の腎臓を外科的に削除し、左の腎動脈を閉塞させた状態で、体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを静脈注射した（ETS-GS非存在下で腎虚血再還流）。ＥＴＳ-ＧＳ＋Ｉ/Ｒ群には、右の腎臓を外科的に削除し、左の腎動脈を閉塞させた状態で、体重１ｋｇ当たり１０mg/mlのＥＴＳ-ＧＳ水溶液を１.０ｍｌ(10mg/kg)静脈注射した（ETS-GS存在下で腎虚血再還流）。対照群には体重１ｋｇ当たり０.９％ のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを静脈注射した。
【０１３３】
（４）被験動物の肝虚血再還流処置（肝虚血再還流障害モデル動物の調製）
ラットは、無作為に3つのグループに分けた（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）。Ｉ/Ｒ群には、体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを皮下注射し、その３０分後に門脈と肝臓動脈の枝をそれぞれ３５ｍｍのクリップで閉塞し、６０分間そのままにした後にクリップを外した（ETS-GS非存在下で肝虚血再還流）。ＥＴＳ-ＧＳ＋Ｉ/Ｒ群には、体重１ｋｇ当たり０.９％のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌとともに、生理食塩水に溶解したＥＴＳ-ＧＳ水溶液を１.０ｍｌ(10mg/kg)皮下注射し、その３０分後にＩ/Ｒ群と同様に６０分間、門脈と肝臓動脈の枝を閉塞し、その後開放した（ETS-GS存在下で肝虚血再還流）。対照群には体重１ｋｇ当たり０.９％ のＮａＣｌ水溶液１.０ｍｌを皮下注射した。
【０１３４】
実験例６ 脳虚血再還流後の脳組織に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（１）光学顕微鏡による組織分析
脳虚血再還流処置の２４時間後に採取したラット脳組織標本（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を定法に従って固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した各染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図９に示す。光学顕微鏡検査の結果、対照群では正常な脳細胞の形態が認められた (図９Ａ)。しかしながら、Ｉ/Ｒ群では明らかな細胞の壊死、細胞質内の空砲化、出血が認められた(図９Ｂ)。しかしこれらの３つの組織変化（細胞の壊死、細胞質内の空砲化、出血）は、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）では顕著に減少していた(図９Ｃ)。
【０１３５】
実験例７ 腎虚血再還流後の腎臓組織に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（１）光学顕微鏡による組織分析
腎虚血再還流処置の２４時間後に採取したラット腎臓組織標本（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を定法に従って固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した。そのサンプルを分析し、Erdogan’s 技術(Erdogan H,et al., Urol Res34: 41-46, 2006)に基づいて腎障害の程度を決定した。腎実質中の24のエリアを、４つのパラメーター（尿細管細胞の壊死、細胞質内空胞の形成、出血および尿細管拡張）に基づいて腎障害の程度を類別した。その半定量的スケールを、０〜４の５段階に設定した（０：正常な腎臓、１：微細損傷（0-5%障害）、２：軽度の損害（5-25%障害）、３：中程度の損害(25-75%障害)、４：重度の損害（75-100%障害））。各パラメーターについて平均スコアを求めた。
【０１３６】
各染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図１０に示す。光学顕微鏡検査の結果、対照群では正常な腎細胞の形態が認められた (図１０ＡおよびＢ)。しかしながら、Ｉ/Ｒ群では明らかな尿細管細胞の壊死、細胞質内の空砲化、出血および尿細管の拡張が認められた(図１０ＣおよびＤ)。しかしこれらの４つの組織変化（尿細管細胞の壊死、細胞質内の空砲化、出血および尿細管の拡張）は、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）では顕著に減少していた(図１０ＥおよびＦ)。図１１に示すように、対照群の標本（Renal I/R：-、ETS-GS：-）と比較してＩ/Ｒ群の標本（Renal I/R：＋、ETS-GS：-）は、腎障害の組織学的スコアのすべてが著しく高かったのに対して、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）の標本（Renal I/R：＋、ETS-GS：＋）のスコアはその中間であった(図１１;p<0.05)。
【０１３７】
（２）透過電子顕微鏡分析
腎虚血再還流処置の24時間後に採取したラット腎臓組織標本（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を、４％のパラホルムアルデヒド、１％のCaCl2および7％の蔗糖を含む固定液に、４℃で30分間浸漬した。固定した標本を、カミソリ刀で小片にカットし、２％のオスミウムに４℃で2時間浸漬してポスト固定化し、次いで段階的に濃度を変えたエタノールで処理して脱水して、Epok 812（応研商事)中に埋設した。これを超ミクロトーム（Reichert-Nissei Ultracut S）上でダイヤモンド・ナイフを用いて、超薄切片（90-95nm）にカットし、透過電子顕微鏡（JEM-1200 EX II電子顕微鏡：JEOL）で観察した。
【０１３８】
結果を図１２に示す。対照群の腎臓標本は、基底膜に垂直に配向したミトコンドリアを有する完全な尿細管細胞を示した(図１２ＡおよびＢ)。Ｉ/Ｒ群では、正常な管状構造が損失し、基底膜からの尿細管細胞の分離および管状の細胞側底膜の崩壊が認められた(図１２ＣおよびＤ)。また尿細管細胞中に様々なサイズの多数の気泡および液胞が認められた。ミトコンドリアは、異常なクリスタおよび小さな柔毛性粒子を含んで膨脹しているように見えた。さらに、絨毛様突起が、細管の内腔中に流されていた(図１２ＣおよびＤ)。
【０１３９】
しかしながら、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）の標本の電子顕微鏡の画像では、尿細管細胞は殆どダメージを受けずに、管状の基底膜および側底膜は完全なままであった(図１１ＥおよびＦ)。サイズの異なる複数の液胞が、尿細管細胞の中で観察された。正常なミトコンドリアと膨脹したミトコンドリアの両方が観察された(図１２ＥおよびＦ)。
【０１４０】
以上の結果は、ＥＴＳ-ＧＳの投与によって腎虚血再還流による組織障害が抑制できること、また腎虚血再還流障害によるミトコンドリアの形態が改善されることを示している。
【０１４１】
（３）腎機能に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
腎虚血再還流処置から24時間目にラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）から血液を採取して血清を調製した。血清中の血中尿素窒素(BUN)値およびクレアチニン値を、i-STAT 300F autoanalyzer（扶桑薬品工業製）の標準方法を用いて測定した。
【０１４２】
結果を表２に示す。
【０１４３】
表２に示すように、対照群では、クレアチニンとBUNの平均血清濃度は、それぞれ0.357±0.053mg/dlおよび15.286±1.976mg/dlであった。腎臓機能のこれらの値は、Ｉ/Ｒ群で顕著に増加していた(クレアチニン: 4.800±0.586mg/dl; BUN: 196.889±8.294mg/dl)。これに対してＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）ではこれらの値がいずれも低下したことから（クレアチニン：3.517±0.392mg/dl、BUN：161.429±5.719mg/dl;p<0.05)、腎虚血再還流処置で低下した腎機能がＥＴＳ-ＧＳ処置により改善することが判明した。
【０１４４】
【表２】
（４）マロンジアルデヒド分析
ＥＴＳ-ＧＳの存在下または非存在下で腎虚血再還流した２４時間後にラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）から腎臓組織を採取し腎臓組織中のマロンジアルデヒド(MDA)濃度を、チオバルビツール酸反応基質用の市販キット（TBARS; Cayman Chemical）を用いて測定した。530nmの吸光度をELISAリーダ（Bio-Rad Laboratories）を用いて測定した。
【０１４５】
ＴＢＡＲＫアッセイの結果を図１３に示す。図１３に示すように、腎臓組織中のＭＤＡ濃度はI/R群（Renal I/R：＋、ETS-GS：-）、すなわち腎虚血再還流後に増加したが、ＥＴＳ−ＧＳ処置したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群、Renal I/R：＋、ETS-GS：＋）では、このＭＤＡ誘導が顕著に低下することが明らかになった (図１３;p<0.05)。
【０１４６】
実験例８ 肝虚血再還流後の肝臓組織に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
（１）光学顕微鏡による組織分析
肝虚血再還流処置の２４時間後に採取したラット肝臓組織標本（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を定法に従って固定し、作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した各染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図１４に示す。光学顕微鏡検査の結果、対照群では正常な肝細胞の形態が認められた (図１４Ａ及びＢ)。しかしながら、Ｉ/Ｒ群では明らかな細胞の壊死、核濃縮、出血及び小葉状構造の乱れが認められた(図１４Ｃ及びＤ)。しかしこれらの３つの組織変化（細胞の壊死、核濃縮、出血、及び小葉状構造の乱れ）は、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）では顕著に減少していた(図１４Ｅ及びＦ)。
【０１４７】
（２）血清サイトカイン量に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
肝虚血再還流処置から２４時間目にラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）を４％のセボフルラン麻酔下で犠牲にし、右心室から血液を採取して血清を調製した。血清中の各サイトカイン（IL-6、TNF-α）濃度を、実験例２と同様の方法で、モノクローナル抗体を用いて測定した。結果を図１５に示す（Ａ：IL-6、Ｂ：TNF-α）。
これからわかるように、いずれのサイトカインも、血中濃度がＩ/Ｒ群で顕著に増加したのに対してＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）ではこれらの値がいずれも顕著に低下した。このことから、肝虚血再還流処置によってサイトカイン（IL-6、TNF-α）の分泌が誘導されること、また肝虚血再還流処置によって誘導されるサイトカインは、いずれもＥＴＳ-ＧＳにより有意に抑制されることが判明した。
【０１４８】
（３）血清ＨＭＧＢ１量に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
上記（２）で肝虚血再還流処置後に各ラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）から採取した血清サンプルについて、血清中のＨＭＧＢ１[high-mobility group box1 protein]濃度を、当該HMGB1に対するモノクローナル抗体（シノテスト社）を用いてELISA法により測定した。吸光度は540nmで測定した(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)。なお、ＨＭＧＢ１は、３０ｋＤの非ヒストン性染色体関連タンパク質であり（Bianchi ME, et al., Science, 1898;243:1056-1059）、その血清中の濃度は、重度の敗血症や敗血症ショックにより増加することが報告されている（Wang H, et al., Science 1999; 285:248-251）。また、ＨＭＧＢ１は、かねてから後期の炎症応答を増幅し、サイトカイン分泌を促進することが知られているが（van Zoelen MA, et al., Shock 2009;31:280-284）、最近、致死性敗血症の末期のメディエーターとして、また虚血再還流障害の初期のメディエーターとして機能することがわかっている（Tsung A, et al., J Exp Med 2005; 201:1135-1143）。
結果を図１６に示す。これからわかるように、血清ＨＭＧＢ１濃度は、Ｉ/Ｒ群で顕著に増加したのに対してＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）では顕著に低下した。このことから、肝虚血再還流処置によってＨＭＧＢ１が誘導されること、また肝虚血再還流処置によって誘導されるＨＭＧＢ１は、ＥＴＳ-ＧＳ処置により有意に抑制されることが判明した。つまり、ＥＴＳ-ＧＳにより、肝虚血再還流処置によるＨＭＧＢ１の誘導増加が抑制されて、その結果、サイトカイン分泌が抑えられ、障害から肝細胞を保護することができることが判明した。
【０１４９】
（４）肝機能に対するＥＴＳ-ＧＳの影響
上記（２）で肝虚血再還流処置後に各ラット（I/R群、ETS-GS+I/R群、対照群）から採取した血清サンプルについて、血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）濃度、乳酸脱水素酵素（LDH）濃度を、自動分析装置（TBA-200FR NEO：東芝メディカルシステムズ社）を用いて標準方法に従って測定した。血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、及びＬＤＨ濃度を、それぞれ図１７（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
これからわかるように、肝機能を示すこれらの値は、Ｉ/Ｒ群で顕著に増加したのに対してＥＴＳ-ＧＳ処理したＩ/Ｒ群（ETS-GS+I/R群）ではこれらの値がいずれも顕著に低下した。つまり、肝虚血再還流処置で低下した肝機能がＥＴＳ-ＧＳ処置により改善することが判明した。
【０１５０】
以上の実験例６〜８の結果は、虚血再還流障害後の腎障害、脳障害及び肝障害がＥＴＳ−ＧＳ処置によって改善することを示している。より詳細には、実験例７及び８において、虚血再還流処置によって、（ＨＭＧＢ１を介して）炎症性サイトカインが誘導されること、ＥＴＳ−ＧＳは当該虚血再還流処置によって誘導されるＨＭＧＢ１及び炎症性サイトカインを有意に抑制することが確認された。実験例７において、ＥＴＳ−ＧＳの投与により、虚血再還流処置によって増加した腎臓のＭＤＡレベルが顕著に低下し、ミトコンドリアの形態が非常に改善され、さらに腎虚血再還流障害後の腎機能障害が改善されることが確認された。また実験例８においても、ＥＴＳ−ＧＳ投与により虚血再還流処置によって増加した血清のＡＳＴ、ＡＬＴ及びＬＤＨ濃度が有意に低下し、虚血再還流によって誘導された肝機能障害が有意に改善されることが確認された。これらのことから、虚血再還流処置による組織の機能低下は、虚血再還流処置によって誘導されるサイトカインの分泌が一因となっており、ＥＴＳ−ＧＳは、当該サイトカインの分泌を抑制することにより、臓器や組織が虚血再還流障害を受けることから抑制若しくは保護していると考えられる。
【０１５１】
結論として、上記の実験例から、ＥＴＳ−ＧＳを始めとする本化合物は、サイトカインの分泌を抑制することで、虚血再還流における障害の発生を阻止する作用を有していると考えられる。つまり、上記の実験例からＥＴＳ−ＧＳを始めとする本化合物による処置で、虚血再還流によって生じる脳障害、腎障害及び肝障害を保護し防止できることが示された。
【０１５２】
実験例９ 腹膜炎性敗血症に対する本化合物の作用
汎発性腹膜炎に起因する敗血症性ショック状態における致死的な合併症には、急性肺障害や急性肝障害などの多臓器不全症候群があり、その死亡率はいまだ高いのが現状である。敗血症には、サイトカインの活性化と、それに続く活性酸素種の発生が臓器障害の中心的な役割を担っており、その意味でサイトカイン介在疾患といえる。
本実験例９は、CLP手技（Cecal ligation and puncture method）により腹膜炎モデル動物を作製し、当該モデル動物の臓器障害に対する本化合物の影響をＥＴＳ-ＧＳ及びＥ-Ant-S-ＧＳを用いて調べた。なお、データはすべて平均値±ＳＤとして示し、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して評価した。p-値<0.05を統計的有意とした。
【０１５３】
（１）被験動物
体重250-300gの雄ラット（Wister rat）を使用した。ラットはすべて、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。研究は大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認された。すべてのプロトコルは国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに沿って行った。麻酔は４％のセボフルラン（丸石製薬（株）製）を用いて行った。
【０１５４】
（２）腹膜炎モデル動物の作製
ラットは、無作為に３つのグループに分けた（本化合物＋CLP群、CLP群、疑似手術群（対照群））。本化合物＋CLP群には、まず毎日３週間に亘って本化合物（ETS-GSまたはE-Ant-S-GS）を経口投与（10mg/kg）した。３週間後に麻酔下で開腹し、回盲部近傍で盲腸を結紮し、結紮部遠位で盲腸を18-gauge針で穿刺して便を排出し、腹腔内に盲腸を還納し閉腹した。CLP群には、まず毎日３週間に亘って水を経口投与（1ml/kg）し、次いで３週間後に本化合物＋CLP群と同様に、麻酔下で開腹し、回盲部近傍で盲腸を結紮して閉腹した。疑似手術群は、開腹し盲腸を一旦腹腔外に取り出した後、再び腹腔内に還納し閉腹した（疑似の外科的手術処置）。
【０１５５】
（３）光学顕微鏡による組織分析
CLP処置の１２時間後に採取したラット肺または肝臓の組織標本（本化合物＋CLP群、CLP群、疑似手術群）を定法に従って固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した各染色切片を光学顕微鏡で観察した。
【０１５６】
（3-1）ＥＴＳ−ＧＳによる効果（肺組織）
図１８に本化合物としてＥＴＳ−ＧＳを用いて試験した場合の肺組織標本（ＡとＢ：疑似手術群、ＣとＤ： CLP群、ＥとＦ：本化合物＋CLP群）の光学顕微鏡画像を示す。光学顕微鏡観察の結果、疑似手術群では組織学上の変化は認められなかったが(図１８Ａ及びＢ)、ＣＬＰ群では明らかな間質浮腫と白血球浸潤が認められた(図１８Ｃ及びＤ)。しかしこれらの組織変化は、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＣＬＰ群（ETS-GS＋CLP群）では顕著に減少していた(図１８Ｅ及びＦ)。
次いで、そのサンプルを分析し、Murakami’s 技術 (Murakami K,et al., Shock 2002; 18: 236-241)に基づいて肺障害の程度を決定した。肺柔組織の24のエリアを、４つのパラメーター（鬱血、浮腫、炎症及び出血）に基づいて肺障害の程度を類別した。その半定量的スケールを、０〜４の５段階に設定した（０：異常なし、または正常にみえる、１：軽度障害、２：中程度障害、３：高程度障害、４：重度障害）。各パラメーターについて平均スコアを求めた。結果を図１９に示す。図１９に示すように、疑似手術群の標本（黒棒：Control）と比較してＣＬＰ群の標本（白棒）は、肺障害の組織学的スコアのすべてが著しく高かったのに対して、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＣＬＰ群の標本（斜線棒：ETS-GS+CLP群）のスコアはその半分以下まで低下していた(図１９;p<0.05)。
【０１５７】
（3-2）Ｅ-Ant-S-ＧＳによる効果（肺組織及び肝組織）
図２０に、本化合物としてＥ-Ant-S-ＧＳを用いて試験した場合の肺組織標本（上段）と肝組織標本（下段）の光学顕微鏡画像を示す。肺組織について、光学顕微鏡観察の結果、疑似手術群では組織学上の変化は認められなかったが(図２０の上段左)、ＣＬＰ群では明らかな間質浮腫と白血球浸潤が認められた(図２０の上段中央)。しかしこれらの組織変化は、Ｅ-Ant-S-ＧＳ処理したＣＬＰ群（E-Ant-S-GS＋CLP群）では顕著に減少していた(図２０の上段右)。肝組織については、疑似手術群では組織学上の変化は認められなかったが(図２０の下段左)、ＣＬＰ群では明らかな肝細胞の核の濃縮と細胞索の配列に乱れが認められた(図２０の下段中央)。しかしこれらの組織変化は、Ｅ-Ant-S-ＧＳ処理したＣＬＰ群（E-Ant-S-GS＋CLP群）では顕著に減少していた(図２０の下段右)。
【０１５８】
（４）Ｅ-Ant-S-ＧＳによる抗炎症作用（肺組織及び肝組織）
上記（3-2）でＣＬＰ処置により組織の変化が認められた肺及び肝組織について、組織中のＭＰＯ（myeloperoxidase）活性を測定し、Ｅ-Ant-S-ＧＳの抗炎症作用を評価した。結果を図２１に示す。これからわかるように、組織中ＭＰＯ活性は、肺と肝臓の両方において、疑似手術群に比べてＣＬＰ群では１.５倍程度増加したのに対して、Ｅ-Ant-S-ＧＳ投与群（E-Ant-S-GS＋CLP群）では疑似手術群と同レベルまで低下していた。このことから、Ｅ-Ant-S-ＧＳには抗炎症作用があり、ＣＬＰ処置によって生じる炎症が、Ｅ-Ant-S-ＧＳの投与により抑制若しくは改善できることが判明した。
【０１５９】
（５）ＣＬＰ処置後の血清サイトカイン及びＨＭＧＢ１濃度に対するＥＴＳ-ＧＳ及びＥ-Ant-S-ＧＳの影響
ＣＬＰ処置したラット（本化合物[ETS-GS、E-Ant-S-GS]＋CLP群、CLP群、疑似手術群（対照群））から経時的に血液を採取して血清を調製した。血清中の各サイトカイン（IL-6、TNF-α）及びＨＭＧＢ１の濃度を、実験例９と同様の方法で、モノクローナル抗体を用いて測定した。
【０１６０】
（5-1）ＥＴＳ−ＧＳの影響
本化合物としてＥＴＳ−ＧＳを用いた場合の結果を図２２に示す（Ａ：IL-6、Ｂ：TNF-α、Ｃ：HMGB1）。これからわかるように、サイトカイン（IL-6及びTNF-α）及びＨＭＧＢ１の血中濃度はいずれもＣＬＰ処理で顕著に増加したのに対して、ＥＴＳ-ＧＳ処理したＣＬＰ群（ETS-GS+CLP群）ではこれらの値がいずれも顕著に低下した。このことから、腹膜炎によって誘導されるＨＭＧＢ１やサイトカイン（IL-6、TNF-α）は、いずれもＥＴＳ-ＧＳにより有意に抑制されることが判明した。
【０１６１】
（5-2）Ｅ-Ant-S-ＧＳの影響
本化合物としてＥ-Ant-S-ＧＳを用いた場合の、ＣＬＰ後の血清ＩＬ−６濃度の経時的変化を図２３に示す。これからわかるように、血中ＩＬ−６濃度はＣＬＰ処理で経時的に漸増するものの、Ｅ-Ant-S-ＧＳ処理したＣＬＰ群（E-Ant-S-GS+CLP群）ではこの漸増幅が顕著に低下した。また、各群（E-Ant-S-GS＋CLP群、CLP群、疑似手術群）のラットの肺組織中のＨＭＧＢ１の発現状況をWestern blottingを用いて調べた結果を図２４に示す。これからわかるように、ＣＬＰ群でＨＭＧＢ１の発現が激増していたのに対して、Ｅ-Ant-S-ＧＳ処理したＣＬＰ群（E-Ant-S-GS+CLP群）では、その発現量は顕著に低下しており、疑似手術群と同程度であった。このことから、腹膜炎によって誘導されるＨＭＧＢ１やサイトカイン（IL-6）は、いずれもＥ-Ant-S-ＧＳの投与により有意に抑制されることが判明した。
さらに図２４には、各群（E-Ant-S-GS＋CLP群、CLP群、疑似手術群）のラットの肺組織中のＰＡＲ１（Protease-Activated Receptor 1）の発現状況をWestern blottingを用いて調べた結果を併せて示す。ＰＡＲは、プロテアーゼに対する受容体であり、血管内皮細胞や平滑筋組織を含む全身の種々の臓器組織に発現している。なかでもＰＡＲ１はトロンビンに対する受容体であり、敗血症などによって発現が増加し、炎症反応の進行に関与していることが知られている。図２２の結果は、ＣＬＰ処置（腹膜炎症）によって増加するＰＡＲ１の発現が本化合物（E-Ant-S-GS）の投与により低減することを示している。つまり、本化合物（Ｅ-Ant-S-GS）により、腹膜炎性敗血症によるＰＡＲ１の発現増加が抑制されて、その結果、炎症反応（血管拡張や好中球の集積湿潤の惹起）が抑えられて、障害から細胞や組織が保護されることができることが判明した。
【０１６２】
結論として、上記の実験例から、ＥＴＳ−ＧＳやＥ-Ant-S-ＧＳ等を始めとする本化合物は、サイトカインの分泌を抑制することで、サイトカインが介在する各種の疾患、特に炎症が関係する疾患並びにそれによって生じる臓器や組織の障害の発生を阻止する作用を有していると考えられる。つまり、ＥＴＳ−ＧＳを始めとする本化合物による処置で、敗血症性ショックや虚血再還流によって生じる各種臓器の障害（急性臓器障害、臓器不全）を保護し防止できると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、抗サイトカイン介在疾患剤：
【化１】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示し、Ｒ３およびＲ５は、異なって、水素原子であるか、またはＳ結合した下記式（１）〜（５）のいずれかに示されるＳＨ化合物若しくはそのエステル（但し、システアミンは除く。）を示し、Ｒ４は水酸基、下記式（６）〜（１１）のいずれかに示されるＮ−置換アミノ酸、そのエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）または下記式（１２）に示されるアミンを示す〕
【化２】
【請求項２】
一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体が下記（ａ）〜（ｏ）からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載する抗サイトカイン介在疾患剤：
（ａ）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン、
（ｂ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-ス
ルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｃ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カ
ルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｄ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル] -3-オキソ-3-[（3-カ
ルボキシプロピル）アミノ] プロピル]システニイルグリシン、
（ｅ）Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（2-スルフォエチル）ア
ミノ] プロピル]システイン、
（ｆ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[[２-(1H-インドール-3-イル)エチル]アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｇ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（5-カルボキシペンチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｈ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（トランス-4-カルボキシシクロヘキシルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｉ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-ス
ルフォエチル）アミノ]プロピル]システイン、
（ｊ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）
アミノ]プロピル]ペニシラミン、
（ｋ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）
アミノ]プロピル]システナミン、
（ｌ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（エトキシカルボニルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｍ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-ス
ルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン イソプロピルエステル、
（ｎ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-ス
ルフィノエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｏ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-（2-カル
ボキシピロリジノ）プロピル]システニイルグリシン。
【請求項３】
サイトカイン介在疾患が、パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛からなる群から選択されるいずれか少なくとも１つである請求項１または２に記載する 抗サイトカイン介在疾患剤。
【請求項４】
抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全の予防又は治療剤である請求項１または２に記載する抗サイトカイン介在疾患剤。
【請求項５】
抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショックによる臓器障害または虚血再還流障害に対する臓器若しくは組織の保護剤である請求項１または２に記載する抗サイトカイン介在疾患剤。
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、抗サイトカイン介在疾患剤：
【化１】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示し、Ｒ３およびＲ５は、異なって、水素原子であるか、またはＳ結合した下記式（１）〜（５）のいずれかに示されるＳＨ化合物若しくはそのエステル（但し、システアミンは除く。）を示し、Ｒ４は水酸基、下記式（６）〜（１１）のいずれかに示されるＮ−置換アミノ酸、そのエステル（但し、アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルフィン酸は除く。）または下記式（１２）に示されるアミンを示す〕
【化２】
【請求項２】
一般式（Ｉ）で示される水溶性ビタミンＥ誘導体が下記（ａ）〜（ｏ）からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載する抗サイトカイン介在疾患剤：
（ａ）γ-グルタミル-Ｓ-[1-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-カルボキシプロピル]システニイルグリシン、
（ｂ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-ス
ルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｃ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-カ
ルボキシフェニル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｄ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル] -3-オキソ-3-[（3-カ
ルボキシプロピル）アミノ] プロピル]システニイルグリシン、
（ｅ）Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（2-スルフォエチル）ア
ミノ] プロピル]システイン、
（ｆ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[[２-(1H-インドール-3-イル)エチル]アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｇ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（5-カルボキシペンチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｈ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（トランス-4-カルボキシシクロヘキシルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｉ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-ス
ルフォエチル）アミノ]プロピル]システイン、
（ｊ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）
アミノ]プロピル]ペニシラミン、
（ｋ）Ｓ-[２-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメチルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-スルフォエチル）
アミノ]プロピル]システナミン、
（ｌ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（エトキシカルボニルメチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｍ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-ス
ルフォエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン イソプロピルエステル、
（ｎ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-[（２-ス
ルフィノエチル）アミノ]プロピル]システニイルグリシン、
（ｏ）γ-グルタミル-Ｓ-[2-[[[3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2-(4,8,12-トリメ
チルトリデシル)-2H-1-ベンゾピラン-6-イル]オキシ]カルボニル]-3-オキソ-3-（2-カル
ボキシピロリジノ）プロピル]システニイルグリシン。
【請求項３】
サイトカイン介在疾患が、パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛からなる群から選択されるいずれか少なくとも１つである請求項１または２に記載する 抗サイトカイン介在疾患剤。
【請求項４】
抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全の予防又は治療剤である請求項１または２に記載する抗サイトカイン介在疾患剤。
【請求項５】
抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショックによる臓器障害または虚血再還流障害に対する臓器若しくは組織の保護剤である請求項１または２に記載する抗サイトカイン介在疾患剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公開番号】特開２０１１−１５３１３９（Ｐ２０１１−１５３１３９Ａ）
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０８（Ｐ２０１１−２０８）
【出願日】平成２３年１月４日（２０１１．１．４）
【出願人】（３０４０２８７２６）国立大学法人 大分大学 (181)
【出願人】（５０２３８４０６０）有限会社オガ リサーチ (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月４日（２０１１．１．４）
【出願人】（３０４０２８７２６）国立大学法人 大分大学 (181)
【出願人】（５０２３８４０６０）有限会社オガ リサーチ (14)
【Ｆターム（参考）】
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