プロテオースペプトン及びリパーゼ活性
本発明は、一般に、脂質画分を含有する食品組成物及び飲料組成物の分野に関する。本発明の実施形態は、摂取した製品からの脂肪の取り込みを遅延させる組成物及び使用に関する。例えば、本発明は、脂肪の加水分解を遅延させる特定のプロテオースペプトン画分及びその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般に、脂質画分を含有する食品組成物の分野に関する。本発明の実施形態は、摂取した製品からの脂肪の取り込みを遅延させる組成物及び使用に関する。例えば、本発明は、脂肪の加水分解を遅延させる特定のプロテオースペプトン画分及びその使用に関する。
【０００２】
油脂は、腸管腔内の腸細胞の刷子縁膜での吸収のためにバイオアクセシブルになる前にリパーゼで酵素的に加水分解される必要がある。食事性脂肪は、主にトリアシルグリセリン（大部分で、約９５％）から成る。リパーゼによる酵素作用で、トリアシルグリセリン(ＴＡＧ)は、最終的に、体に吸収され易い遊離脂肪酸(ＦＦＡ)及びモノグリセリド(ＭＡＧ)に加水分解される。
【０００３】
リパーゼの水溶性並びに油脂の低親水性が影響して、リパーゼの触媒反応は油／水の界面で起こる。
【０００４】
過度の脂質の吸収は、最終的に太り過ぎや肥満を引き起こし、結果的に更に、代謝性疾患の原因となる。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈで公表された調査によると、英国だけで、２０１２年までに３人に１人の大人、つまり１３００万人の人々が肥満になることが予想される。
【０００５】
高脂肪食の組成物や高脂肪飲料を摂取する場合には、体重の増加及び最終的には肥満のリスクを軽減するために、食品中の脂質画分がもたらす心地よい食感や風味及び健康上の利益を保ちながら、摂取した食物からの脂肪の吸収を遅延できる利用可能な手段を持つことが望ましい。
【０００６】
Ｃａｒｔｉｅｒらは、成分ＰＰ３に富む従来の乳由来のプロテオースペプトンは、乳の自然な脂肪分解を低下させるが、一方で、ＰＰ３が欠乏したプロテオースペプトン画分は、乳の脂肪分解を促進するという事実を述べてきた（１９９０、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ ７３：１１７３〜１１７７）。Ｇｉｒａｒｄｅｔは、更に、現状技術である乳由来のＰＰ３は、ブタ膵臓のリパーゼ及び乳の内因性リパーゼに効果があると述べている。彼らは、ＰＰ３画分は、リパーゼ活性に直接は影響しないが、油／水の界面に対してより界面活性であり、競合メカニズムにより、リパーゼの吸着を阻止すると結論付けた（１９９３、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ ７６：２１５６〜２１６３）。
【０００７】
発泡が乳蛋白質の典型的な特徴であることは良く知られている。しかし、カゼインを除去した後でさえ、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリン乳は、かなりの界面活性を伝える（Ｒ．Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．１４（１９４５）、３１６〜３２８）。残りの画分は、非常に多量の界面活性成分を含むプロテオースペプトン画分（ＰＰｆ）を含有する。
【０００８】
ＰＰｆは、特性のはっきりしない蛋白質性化合物の不均一混合物を示す。この蛋白質性化合物は、本明細書に参考として組み込まれるＧｉｒａｒｄｅｔら著、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．６３（１９９６）、３３３〜３５０の主題の検討で要約されている。
【０００９】
多くの蛋白質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエンテロトキシンに対する結合親和性を有するｐｐ１６ｋ及びｐｐ２０ｋの２個の糖蛋白質などのＰＰｆで説明された。それらは、それぞれα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンのグリコシル化形態として特定された。オステオポンチン、酸性６０ｋＤａリン糖蛋白質、及び８８ｋＤａラクトフェリンは、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により検出される大型の蛋白質に属する。
【００１０】
乳試料中の成分３、５、及び８（ＰＰ３、ＰＰ５、ＰＰ８）で示される主要なＰＰｆ成分の量は、そのプラスミン活性と関連する。以下の成分が、β−カゼインに対するプラスミン活性により生じる。その成分は、ＰＰ５すなわちβ−ＣＮ−５Ｐ ｆ（１〜１０５／７、β−カゼインのＮ末端ペプチド１〜１０５及び１〜１０７）、ＰＰ８−ｆａｓｔすなわちβ−ＣＮ−４Ｐ ｆ（１〜２８、β−カゼインのＮ末端ペプチド１〜２８）である。成分ＰＰ８−ｓｌｏｗとβ−ＣＮ−１Ｐ ｆ（２９〜１０５／７、β−カゼインのＮ末端ペプチド２９〜１０５及び２９〜１０７）は別個の要素であるが、電気泳動度により区別するのが難しい。
【００１１】
ＰＰ３成分の不均一な分子構造を下記の見解により説明する。ＰＰ３リン糖蛋白質は、５Ｍ−グアニジンを使用して、４０ｋＤａの見かけの分子量を有するサブユニットに分離できる１６３ｋＤａ（ｐＨ８．６で超遠心分離により計測）の大きさを有する複合体を形成する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、ジスルフィド結合還元剤２−メルカプトエタノールの存在下で実施され、それぞれ２４．６〜３３．４ｋＤａと１７〜２０．９ｋＤａの２つの主要な糖蛋白質成分の存在が明らかとなった。２８ｋＤａ及び１８ｋＤａの見かけの分子量を有する主要な糖蛋白質が、実質的に常に観察され、１１ｋＤａのバンドを伴うことが見出された。それらは、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（２Ｄ−ＰＡＧＥ）により分離されると、それぞれ、ｐＨ４．９〜６．１の範囲の見かけの等電点を有する４つ及び２つのスポットとして現われる。複合体は、約７ｋＤａの分子量を有する非グリコシル化ポリペプチドと結合した、２８ｋＤａ、１８ｋＤａ、及び１１ｋＤａの分子量を有する糖蛋白質から構成されている。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を有するレクチンアフィニティークロマトグラフィーで分離することにより、１１ｋＤａ、１８ｋＤａ及び２８ｋＤａの糖蛋白質の複雑な挙動が明確となる。１１ｋＤａの糖蛋白質はＣｏｎＡに結合しないが、より大型の１８ｋＤａ及び２８ｋＤａの糖蛋白質は、非結合画分（糖蛋白質ｐｐ１８−とｐｐ２８−と呼ばれる）と結合画分（糖蛋白質ｐｐ１８＋とｐｐ２８＋と呼ばれる）とに分配された。
【００１２】
当技術分野では、通常脱脂粉乳からＰＰｆを得る。牛乳は、約４重量％の脂肪、約３．５重量％の蛋白質、約０．６重量％のホエイ蛋白質、及び約０．００３重量％のプロテオースペプトンを含有する。
【００１３】
しかしながら、現状技術に従ってＰＰｆを単離するには、カゼイン及び変性ホエイ蛋白質を沈殿／遠心分離によって除去するための乳の熱処理（例えば９０℃で１０分間）及びかなりの酸性化を要する。
【００１４】
この従来の手法は費用がかかり、工業的規模では適用できない。
【００１５】
特に、現状技術の酸性化の工程は、通常、あまり特定されないが低いｐＨ値で実施される。このことは、乳蛋白質の実質的な凝固を引き起こす。こうした条件で、乳に存在する９０％超の蛋白質が凝固する。プロテオースペプトン画分の大規模な精製を試みた場合、これらの凝固蛋白質を除去すれば、重大な問題が発生する。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、遅延型遊離脂肪酸及び／又はモノグリセリドの体への取り込みをもたらす脂質画分を含有し、工業的規模で容易に調製できる食品組成物を提供することであった。
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、この目的が、独立請求項の主題によって解決できることを発見した。
【００１８】
本発明者らは、当技術分野において公知のプロテオースペプトン画分と比較して、改良されたプロテオースペプトン画分を提供することが既に可能だった。
【００１９】
この改良されたプロテオースペプトン画分は、本明細書に参考として組み込まれる特許出願ＥＰ０８１０１８０５．３に記載しているように得ることができる。
【００２０】
当技術分野において公知のプロテオースペプトン画分とは対照的に、この改良されたプロテオースペプトン画分の生産は、酸性化の工程中の著しい蛋白質の凝集化が回避されるので工業的に適用可能である。熱処理前にｐＨの値を正確（±０．１ｐＨ単位）に調整すると、従来技術のバルク蛋白質の凝集体ではなく、１μｍ未満の直径を有する、ホエイ蛋白質の球状粒子が生成される。これらのホエイ蛋白質の球状粒子は、従来技術のバルク蛋白質沈殿物よりもプロテオースペプトン画分から除去するのが、はるかに容易である。
【００２１】
得られたプロテオースペプトン画分はまた、熱安定性の向上を示す。更に、これは、現在の従来からの技術で得られるプロテオースペプトン画分と同様に、油／水の界面を安定させるために使用できる。
【００２２】
更に本発明者らは、当技術分野において現在示されているのとは反対に、プロテオースペプトン画分は、油と水の界面に存在する場合だけでなく、バルク相に存在する場合にも、脂肪分解を遅らせることが可能なことを実証することができた。
【００２３】
本発明で使用されるプロテオースペプトン画分は、油と水の境界でリパーゼ作用を阻害した。その結果、脂肪分解、つまりトリアシルグリセリン(ＴＡＧ)からの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）及びモノグリセリド(ＭＡＧ)の生成を防止又は少なくとも遅らせた。
【００２４】
該プロテオースペプトン画分はまた、水性バルク相中に存在している場合でもリパーゼ作用を阻害し、その結果、水性バルク相中でのトリアシルグリセリン(ＴＡＧ)からの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）及びモノグリセリド(ＭＡＧ)の生成を遅らせた。
【００２５】
重要なことだが、本発明者らは、脂肪の吸収を遅らせることについて、プロテオースペプトン画分を添加すれば、他の蛋白質画分、例えばβ−ラクトグロブリン、β−カゼイン、そしてホエイ蛋白質分離物よりもはるかに顕著に効果が出たことを示すことができた。
【００２６】
例えば、本発明のプロテオースペプトン画分を、食品のバルク水相に添加してもよい。本発明のプロテオースペプトン画分はまた、既に被覆された油滴の消化を更に遅らせるために、既存の被膜が乳化剤を含有するＯ／Ｗエマルションのバルク水相に添加してもよい。乳化剤は、低分子量及び／又は高分子量の乳化剤でも可能である。例えば、界面活性剤、蛋白質、及び／又は多糖類を使用してもよい。
【００２７】
説明した効果の証拠は、食物中の脂質の模擬インビトロ消化実験により得られた。
【００２８】
本発明のプロテオースペプトン画分は、バルク相に存在している場合だけでなく、油滴の被覆層として存在する場合も脂質の加水分解を遅らせるという点で有効であった。
【００２９】
したがって、本発明の一実施形態は、脂質消化の遅延を示す脂質含有食品の調製のための、
ミネラル除去された天然蛋白質水分散液のｐＨを約５．６〜８．４、又は約３．５〜５．０に調整するステップ、
天然蛋白質水分散液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とするステップ、
加熱後に、蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも一部を除去するステップ、及び
分散液の残りの液体画分を回収するステップ
を含む方法により得ることができるプロテオースペプトンの使用である。
【００３０】
本発明の更なる実施形態は、
ミネラル含有量を少なくとも２５％減少させた天然蛋白質水分散液のｐＨをｐＨ５．６〜８．４、又はｐＨ３．５〜５．０に調整するステップ、
天然蛋白質水分散液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とするステップ、
加熱後に、蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも９０重量％を除去するステップ、及び
分散液の残りの液体画分を回収するステップ
を含む方法により得ることができるプロテオースペプトン画分、及び少なくとも１つの脂質を含む食品であって、食品中のプロテオースペプトン画分及び少なくとも１つの脂質は、プロテオースペプトンを含有する少なくとも１つの被覆層を含む被覆油滴として、少なくとも部分的に提供される、食品である。
【００３１】
本発明における少なくとも１つの脂質及び／又は油脂については、どのような種類の食用油でもよい。材料は、ヒト又は動物の摂取用として認可されている場合、食用であると考えられる。
【００３２】
例えば、油脂は、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、乳脂肪、亜麻仁油、桐油、大豆油、オリーブ油、パーム油、ひまわり油、くるみ油、へんとう油、落花生油、ヘーゼルナッツ油、イーノ油、月見草油、チェリー核油、グレープシード油、ゴマ油、トウモロコシ油、菜種油、綿実油、コメヌカ油、コーン油、ライ麦油、小麦芽油、アボカド油、ツバキ油、マカダミアナッツ油、いわし油、サバ油、ニシン油、タラ肝油及びカキ油、あんず油、べにばな油、菜種油、ルビナス油、桃油、トマト油、亜麻仁油、かんきつ油又はこれらの組合せから成る群より選択されてもよい。
【００３３】
記載した方法により得ることができる改良されたプロテオースペプトン画分は、ミネラル除去された蛋白質画分、例えばミネラル除去された球状蛋白質画分、特にホエイ蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）又は、ホエイ蛋白質分離物（ＷＰＩ）から生産できる。
【００３４】
ホエイは、安価な原料であり、通常は、例えばチーズ製造における廃棄物である。チーズの生産過程では、乳を凝固させて、凝乳（後のチーズ）と可溶性ホエイ画分に分離させる蛋白質加水分解酵素であるレンネットの添加が必要である。
【００３５】
ホエイは、ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、若しくはラクダ起源のもの又はそれらの混合物から入手したいずれかのホエイを含めてもよい。
【００３６】
更に、ＷＰＩは殆ど脂肪を含んでいないので、ＰＰｆの生産中に脂肪の除去は不要であり、したがって、該プロセスを単純化させ更にＰＰｆのコンタミネーションを防止する。
【００３７】
本発明で使用されるプロテオースペプトン画分は、β−ラクトグロブリンが欠乏し、ミネラル除去されてもよい。
【００３８】
本発明の目的において「ミネラル除去された」とは、ミネラルの含有量を、スイートホエイ又は酸ホエイと比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％減少させたことを意味する。スイートホエイ又は酸ホエイの乾燥物質は平均で、０．９％のカルシウム、０．８％のナトリウム、２．２％のカリウム、０．１％のマグネシウム、０．７％のリン及び２．０％の塩化物を含む、８．８％のミネラルを含有している。
【００３９】
本発明の文脈において、「β−ラクトグロブリンが欠乏した」とは、抽出物中の蛋白質の全重量に対するβ−ラクトグロブリンの含有重量が、天然球状蛋白質溶液中の蛋白質の全重量に対するβ−ラクトグロブリンの含有重量と比較して、多くても７０％、好ましくは多くても５０％、さらにより好ましくは多くても２０％であることを意味する。
【００４０】
したがって、β−ラクトグロブリンが欠乏した抽出物は、天然球状蛋白質溶液中に存在するβ−ラクトグロブリンの量の多くても７０重量％、好ましくは多くても５０重量％、さらにより好ましくは多くても２０重量％を含む。
【００４１】
本発明で使用されるプロテオースペプトン画分はまた、α−ラクトアルブミンに富んでいてもよい。α−ラクトアルブミンに富むとは、抽出物中の蛋白質の全重量に対するα−ラクトアルブミンの含有重量が、最初の天然球状蛋白質分散液中の蛋白質の全重量に対するα−ラクトアルブミンの含有重量と比較して、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、さらにより好ましくは少なくとも２倍増加していることを意味する。
【００４２】
本発明のプロテオースペプトン画分に至る方法において、ミネラル除去された天然蛋白質水分散液のｐＨを、約５．６〜８．４、又は約３．５〜５．０に調整する。
【００４３】
より厳密には、ｐＨは、約３．５〜５．０、又は約５．６〜６．４、好ましくは約５．８〜６．０、又は約７．５〜８．４、好ましくは約７．６〜８．０、又は約６．４〜７．４、好ましくは約６．６〜７．２に調製してもよい。
【００４４】
本発明に至る長い実験の過程で、本発明者らは、驚くべきことに、熱処理前にｐＨを厳密なｐＨ値（±０．１ｐＨ単位）に調整すると、１μｍ未満の直径を有する、ホエイ蛋白質凝集体の球状粒子が得られることを見出した。
【００４５】
最適ｐＨ値は出発物質、例えばＷＰＩの濃度及び組成に依存することが見出された。この方法には、例えば剪断などの、いかなる機械的ストレスもない状態で、ホエイ蛋白質粒子を生成するという利点がある。得られた粒状物質により、本発明のＰＰｆ含有画分からこれら粒子を形成する化合物が容易に除去される。
【００４６】
ｐＨ及びイオン強度が本発明の方法にとって２つの大切な要因であることが明らかとなった。したがって、十分に透析して、Ｃａ＋＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｍｇ＋＋等の遊離のカチオンが極めて欠乏した試料では、上記の熱処理を適用した後、５．４未満のｐＨでは凝乳を生成し、６．８を超えるｐＨでは可溶性ホエイ蛋白質凝集体を生成する傾向がある。
【００４７】
したがって、ｐＨ値の範囲がかなり狭い場合でのみ、本発明で使用されるプロテオースペプトン画分の調製で、工業的に除去するのが容易なタイプの固形ホエイ蛋白質粒子が得られる。
【００４８】
類似したホエイ蛋白質粒子は、ホエイの等電ｐＨ未満の対称的なｐＨ値、すなわち３．５〜５．０までを使用することで生産される。
【００４９】
二価カチオンの低濃度（最初のホエイ蛋白質粉末１００ｇに対して０．２ｇ未満）に対して、ｐＨが５．６〜６．４、より好ましくは５．８〜６．０のｐＨ範囲に調整される場合、負に帯電したホエイ粒子が得られる。ｐＨは、ホエイ蛋白質源（例えばＷＰＣ又はＷＰＩ）のミネラルの含有量によって、８．４まで高くしてもよい。
【００５０】
特に、大量の遊離ミネラルの存在下で負に帯電した粒子を得るためには、ｐＨを７．５〜８．４、好ましくは７．６〜８．０に調整してもよい。
【００５１】
中程度の濃度の遊離ミネラルの存在下で負に帯電した粒子を得るためには、ｐＨを６．４〜７．４、好ましくは６．６〜７．２に調整してもよい。
【００５２】
天然蛋白質粉末１００ｇ中に存在する遊離ミネラルが、２ｇ未満である場合、遊離ミネラルの濃度は低いと考えられる。
【００５３】
天然蛋白質粉末１００ｇ中に存在する遊離ミネラルが、２ｇ〜５ｇの間である場合、遊離ミネラルの濃度は中程度と考えられる。
【００５４】
天然蛋白質粉末１００ｇ中に存在する遊離ミネラルが、５ｇを超える場合、遊離ミネラルの濃度は高いと考えられる。
【００５５】
もちろん、粒子の電荷は、本発明で使用するプロテオースペプトン画分からこれらの粒子を分ける手段として、さらに使用することができる。
【００５６】
ｐＨは一般に、好ましくは食品等級の酸、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸又は乳酸などの添加によって調整することができる。ミネラル含有量が高い場合は、ｐＨは一般に、好ましくは食品等級のアルカリ性溶液、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化アンモニウムの添加によって調整する。
【００５７】
本発明の方法には、本質的に塩を含まない天然ホエイ蛋白質水分散液が好ましい。「本質的に塩を含まない」とは、約４重量％の蛋白質濃度に対して塩の含有量が１ｇ／Ｌ以下であることを意味する。例えば、ホエイ蛋白質水溶液は二価カチオンを、全乾燥質量で２．５重量％未満、より好ましくは２重量％未満含有してもよい。
【００５８】
天然蛋白質水分散液中に天然蛋白質、好ましくは天然球状蛋白質、さらにより好ましくはホエイ蛋白質が、溶液の全重量に対して約０．１重量％〜１２重量％、好ましくは約０．１重量％〜８重量％、より好ましくは約０．２重量％〜７重量％、さらにより好ましくは約１重量％〜５重量％の量で存在する。
【００５９】
本発明の方法では、天然ホエイ蛋白質水分散液は、約８５℃になるまで約１５分間加熱することが好ましい。
【００６０】
原理的に、加熱後に、当技術分野において知られる任意の手段により、ホエイ蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する、形成された固形高分子量凝集体を除去することができる。しかしながら、好ましくは、沈殿、遠心分離、濾過、精密濾過、又はこれらの方法の組合せによって高分子量凝集体を除去することができる。この除去工程に、ｐＨ調整をさらに加えてもよい。
【００６１】
沈殿には、必要な実験装置が最小であり、最低限のエネルギー入力で実行することができるという利点がある。
【００６２】
遠心分離はエネルギー入力が必要となるが高速の方法である。連続遠心分離は、例えば白チーズ製造の工場において既に使用されているプロセスである。
【００６３】
濾過及び精密濾過は、大規模生産にはよく応用されており、高分子量凝集体の除去において非常に信頼性が高い。
【００６４】
これらの方法をいくつか併用することでそれぞれの利点を兼ね備えることができる。
【００６５】
例えば、最後の工程である精密濾過の手順を適用することで、少なくとも１００ｎｍの直径を有する高分子量凝集体を実質的に完全に除去することができる。
【００６６】
加熱後に、ホエイ蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する固形高分子量凝集体の好ましくは少なくとも９０重量％、さらに好ましくは９５重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％、理想的には１００重量％を除去する。
【００６７】
本発明の方法は、限外濾過及び／又は蒸発の工程をさらに含んでもよい。
【００６８】
限外濾過は、静水圧を利用して、半透膜に液体を通す膜濾過技術である。水及び低分子量の溶質が膜を通過する一方、懸濁固体及び高分子量の溶質が残る。この分離プロセスは、高分子量の分子（１０３〜１０６Ｄａ）、特に蛋白質を含有する溶液の精製及び濃縮のために、産業及び研究において使用される。限外濾過は、産業環境において定評があるという利点があり、高分子量の蛋白質を効率的でありながら穏やかに分離でき、これによってストレス誘発性の蛋白質変性を防ぐ。
【００６９】
蒸発は、蛋白質溶液を濃縮できる穏やかな方法である。例えば、少なくとも４０℃に、又は好ましくは少なくとも６０℃に加熱することで蒸発を起こしてもよい。例えば、ＰＰｆを含む組成物を乾燥させて、含水量を全組成物の重量に対して１０重量％未満、好ましくは５重量％未満、さらにより好ましくは２重量％未満に減少させてもよい。この乾燥工程には、得られたプロテオースペプトン画分を、その完全な活性を維持しつつ組成物の重量を減らし高濃度で貯蔵できるという利点がある。また、蒸発により水分活性が低くなるため、製品の安定性は確実に増す。
【００７０】
上述の方法により得ることができるプロテオースペプトン画分は、全アミノ酸組成に対する百分率として、下記のようなアミノ酸組成を有する：約６〜９％のＡＳＰ、約４〜７％のＴＨＲ、約４〜７％のＳＥＲ、約２２〜２５％のＧＬＵ、約９〜１２％のＰＲＯ、約０〜３％のＧＬＹ、約１．５〜４．５％のＡＬＡ、約４〜７％のＶＡＬ、約０〜２％のＣＹＳ、約１〜４％のＭＥＴ、約４〜７％のＩＬＥ、約７．５〜１０．５％のＬＥＵ、約０〜３％のＴＹＲ、約６．７〜９．７％のＬＹＳ、約１．５〜４．５％のＨＩＳ、約１〜４％のＡＲＧ。
【００７１】
このアミノ酸組成は、従来の方法によって得られたＰＰｆの典型的な組成とは異なる。
【００７２】
表１には、従来の方法（試料１）及びＰＰｆ（本発明で使用、試料２）に対応する典型的なＰＰｆ−アミノ酸プロフィールが示され、両方を比較することができる。
【００７３】
試料１は、Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．Ｎｅｊｊａｒ，Ｙ．、及びＬｉｎｄｅｎ，Ｇ．（１９８８）；Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｏｓｅ−ｐｅｐｔｏｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１、１４６４〜１４７１）に従って従来の方法を使用して試料２と同じＷＰＩから調製した。
【００７４】
簡潔に述べると、プロラクタ（Ｐｒｏｌａｃｔａ）９０を出発物質として使用した。プロラクタ９０（蛋白質を８４％含有する粉末４２８ｇ：Ｎｘ６．３８）をＭｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏ ５Ｌでもどした。この溶液を計測するとｐＨ６．４３であったが、その後、１ＮのＮａＯＨを約１５ｍＬ添加しｐＨ７．００に調整した。この溶液の体積を調整して、６Ｌ（最終蛋白質濃度は６％（ｗ／ｗ）であった）とし、６本の１Ｌビンに等分し、これらのビンを９３℃に設定した水浴に３０分間置き、蛋白質を変性させた。２０分間、インキュベートした後、ビンの内側の温度は９０℃となった。インキュベートの終わりに、ビンを氷浴に入れ、２０℃まで冷却した。ｐＨを４．６に調整して、蛋白質性化合物の等電沈殿を実施した。実際には、１Ｌビン３本の内容物を一緒にし（ｐＨ７．１７）、１ＮのＨＣｌ約８８ｍＬを使用してｐＨを４．６に調整した。他の１Ｌビン３本も同様に処理した。得られた２つの酸性化された溶液を一緒にして４℃で１８時間貯蔵し、１Ｌプラスチックビン６本に等分した。ビンを遠心分離後（６℃、５０００ｒｐｍ／７２００ｇで６０分、Ｈ ６０００Ａローターを備えたＳｏｒｖａｌ ＲＣ３Ｃ Ｐｌｕｓ）、ＰＰｆを含有する上清を回収した。次に、ＰＰｆの硫酸アンモニウム沈殿を、半飽和（３１３ｇ／Ｌ）で２時間実施した。沈殿物を、遠心分離（ＳｏｒｖａｌＲＣ３Ｃ Ｐｌｕｓを使用して６℃、５０００ｒｐｍで６０分）後に回収し、一緒にして、Ｍｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏ ３５０ｍＬ内に再度分散した。濁った懸濁液／溶液を、１０００のＭＷカットオフのＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｉｎｃ．）を使用して、２２ＬのＭｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏに対し４回透析した。透析後、ＰＰｆを含有する抽出物を遠心分離し（６℃、５０００ｒｐｍで６０分）、上清を濾過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製０．２２μｍフィルター、ＧＰステリカップ（ＧＰ Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）（登録商標）エクスプレスプラス（Ｅｘｐｒｅｓｓ ｐｌｕｓ）（商標））、フリーズドライした。ＰＰｆの収量はホエイ蛋白質全荷重３６０ｇから６ｇ（１．６％）であった。
【００７５】
例えば、次の２つの基準により現況技術で得られるＰＰｆと本発明で記載の改良されたプロテオースペプトン画分とを区別することができる。つまり、アミノ酸プロフィール（表１）及び２Ｄ−ＰＡＧＥによって決定される蛋白質プロフィール（図１及び図２）である。
【００７６】
表１：従来のＰＰｆ（試料１）及び本発明で使用される改良されたプロテオースペプトン画分（試料２）のアミノ酸組成（１００ｇ粉末当たり各アミノ酸のｇで、又は全アミノ酸組成に対する百分率で表した）。
【表１】
【００７７】
２Ｄ−ＰＡＧＥは複合蛋白質混合物を分析し比較する強力な方法である。この方法では、一次元目では蛋白質の電荷によって、二次元目では分子量によって蛋白質を分離する。
【００７８】
本発明者らは、この２Ｄ−ＰＡＧＥを使用して、従来の方法を使用して得られたＰＰｆと本発明で使用されるＰＰｆとの間にある差異を分析した。同じＷＰＩを使用して従来の方法によって調製されたＰＰｆと本発明で使用させるＰＰｆとの両方を生産した。Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．Ｎｅｊｊａｒ，Ｙ．、及びＬｉｎｄｅｎ，Ｇ．（１９８８）；Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｏｓｅ−ｐｅｐｔｏｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ、７１、１４６４〜１４７１）に記載された方法によって、従来のＰＰｆを調製した。図１は、本発明によって得られたＰＰｆの２Ｄ−ＰＡＧＥ蛋白質プロフィールを示す。図１の２Ｄゲルの標識された蛋白質スポットはすべて、従来の方法で調製されたＰＰｆによって生成された２Ｄゲルの蛋白質スポットとは質的及び／又は量的に異なる。図２は、観察された差異の定量化を示す。
【００７９】
ＰＰｆの分析が、以下の手順に従って実施された。
蛋白質溶液、特にＰＰｆからの２５０μｇ蛋白質当量を、最終濃度がそれぞれ７Ｍ、２Ｍ、６５ｍＭ、２０ｍＭ、６５ｍＭ、０．４％（ｗ／ｖ）で使用される尿素、チオ尿素、ＣＨＡＰＳ、トリス、ＤＴＴ、アンフォライトと、染色のためのブロモフェノールブルーとから成る変性溶液３４０μｌに溶解し、
１．５Ｍトリス緩衝液で調製された９〜１６％アクリルアミドゲル上のｐＨ３〜ｐＨ１０のｐＨ勾配のイモビラインストリップにこの試料を載せ、
イモビラインストリップゲルに３００ボルトの電圧を１１．６時間印加し、次いで５０００ボルトの電圧を１２．４時間印加して、電荷で蛋白質を分離し、
２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン／０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、ｐＨ８．３の緩衝液中でアクリルアミドが９〜１６％の範囲にあるアクリルアミド勾配ゲル上にイモビラインストリップゲルを配置し、
ゲルに４０ｍＡの電流を一晩流して、事前にイモビラインストリップゲル上で分離した蛋白質をアクリルアミドマトリックスに流して、さらに大きさにより蛋白質を分離し、
クマシーブルー染色法で蛋白質スポットを視覚化する。
【００８０】
この手順により、図１に示されるようなゲルが得られた。
【００８１】
改良されたプロテオースペプトン画分が脂質消化の遅延を示す脂質含有食品の調製に使用される場合、プロテオースペプトン画分及び脂質を、１：２〜１：２０００の範囲、例えば、１：２〜１：１０００の範囲、好ましくは、１：１０〜１：１００の範囲の重量比で提供することができる。
【００８２】
リパーゼ活性は、リパーゼが活性化する油水界面で効率的な阻害のみが可能なことを事前に想定されていたが、本発明者らは、プロテオースペプトン画分が水性バルク相に添加された場合、リパーゼ活性はまた阻害可能であることを示すことができた。プロテオースペプトンを単に水性バルク相に添加することは、プロテオースペプトン画分を油と水との間の界面に設置しなければならないことよりも、はるかに容易に達成できるので工業的な適用にとって、このことは重要である。
【００８３】
しかしながら、プロテオースペプトン画分はまた、油水界面で有効であることも見出された。エマルションや発泡エマルション等の多くの油／水の界面が存在する製品では、プロテオースペプトン画分は効果的に使用できる。
【００８４】
したがって、プロテオースペプトンを含有する少なくとも１つの被覆層を含む被覆油滴として、少なくとも部分的には、食品中のプロテオースペプトン画分及び脂質が提供される。
【００８５】
油粒子が２つ以上の被覆層で覆われている場合は、プロテオースペプトンはこれらの被覆層のいずれか１つに存在してもよい。
【００８６】
被覆油滴はまた、プロテオースペプトン画分から成る少なくとも１つの被覆層を含んでもよい。
【００８７】
油滴がプロテオースペプトン画分を含む層に覆われている場合、油滴に作用しようとするリパーゼ活性は、著しく妨げられていることが視覚化できる。
【００８８】
２つ以上の被覆層を有する油滴の場合、プロテオースペプトンを含有する被覆層が外側の被覆層であることが好ましい。
【００８９】
存在すれば、更なる被覆層は、任意の種類の乳化剤、好ましくは食用乳化剤を含有してもよい。このような乳化剤は、低分子量又は高分子量を有してもよい。低分子量乳化剤は、１０００Ｄａ未満の分子量を有し、高分子量乳化剤は、１０００Ｄａを超える分子量を有する。
【００９０】
乳化剤は、例えば、蛋白質、又は多糖類などの界面活性剤でもよい。
【００９１】
存在すれば、更なる被覆層は、少なくとも１つの蛋白質画分を含有しても、又はこれから成ってもよい。これらの蛋白質画分は、乳、ホエイ、又は大豆から得てもよい。好ましい蛋白質画分は、ホエイ蛋白質、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、酸カゼイン、カゼイン塩、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、又はこれらの組合せを含んでもよい。
【００９２】
少なくとも１つの更なる被覆層に含有される蛋白質画分は、例えばβ−ラクトグロブリン、ホエイ蛋白質分離物、及びβ−カゼインから成る群より選択されてもよい。
【００９３】
被覆油滴は、いかなるサイズでもよい。油滴の大きさは、脂肪分解の全体速度に影響を及ぼし得る。しかしながら、プロテオースペプトンが、油滴の大きさとは無関係に常に脂肪分解の速度を落とすことになる。
【００９４】
しかし、被覆油滴は、食品に適用できるサイズを有するのが好ましい。例えば、油滴はエマルションや発泡エマルション中に存在してもよい。
【００９５】
エマルション又は発泡エマルションは、例えば、マヨネーズ、アイスクリーム、ソース又はクリーマーとして食品で使用される。
【００９６】
一般的に、被覆油滴は、０．１〜１００μｍの範囲、好ましくは０．５〜５０μｍの範囲の直径を有してもよい。
【００９７】
通常、被覆油滴の大きさは、いくつかのＧａｕｓｓ粒度分布を示してもよい。単分散エマルションを使用する場合は、この分布は多少は絞り込んでもよい。
【００９８】
したがって、被覆油滴の提示された大きさは平均値を示す。
【００９９】
例えば、プロテオースペプトン画分被膜などの乳化剤被膜の厚さは可変であり、所望する効果に応じて調整することができる。
【０１００】
リパーゼ作用を遅延させる程度は、用量に依存することが見出された。したがって、プロテオースペプトン画分の用量が多くなれば、より著しい効果をもたらす。
【０１０１】
したがって、油／プロテオースペプトン画分の比率を調節することにより、脂肪を代謝するのに要する時間を調節することができる。
【０１０２】
また一般に、油表面が大きくなれば、この表面を有効に覆うために、重量％で、より多くのプロテオースペプトン画分が必要になる。
【０１０３】
したがって当業者は、例えば、目標とする液滴の大きさ直径及びリパーゼの遅延に基づいて、特定の製品のための好ましい油／プロテオースペプトン画分の重量比を決定することができる。
【０１０４】
しかしながら、通常、プロテオースペプトン画分及び油は、重量比で、１：２〜１：２０００の範囲で油滴中に存在している。
【０１０５】
本発明の使用により調製される食品は、食品組成物、動物用食品、医薬組成物、栄養組成物、栄養補助食品、飲料、又は食品添加物でもよい。
【０１０６】
代表的な食品として、特にコーヒー用クリーマーなどのクリーマー、カプチーノなどの発泡飲料、カフェラテ、チョコレート、ヨーグルト、殺菌されたＵＨＴ乳、加糖練乳、発酵乳、ミルクを加えた発酵乳、ミルクチョコレート、ムース、発泡体、エマルション、アイスクリーム、飲料調製に使用する凝集粉、ミルク粉、乳児用フォーミュラ、ダイエット強化剤、ペットフード、錠剤、乾燥経口サプリメント、湿性経口サプリメント、及び／又は、健康管理栄養処方剤及び化粧品などの製品が挙げられる。
【０１０７】
本発明による代表的な食品は、被覆油滴として脂質を、例えば、少なくとも２０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも７５重量％含むことができる。
【０１０８】
プロテオースペプトン画分及び脂質は、少なくとも部分的にエマルションの形態で食品に存在してもよい。
【０１０９】
更に／或いは、プロテオースペプトン画分及び脂質は、少なくとも部分的には、泡状で食品に存在してもよい。
【０１１０】
食品の製造過程で、プロテオースペプトン画分を脂質と一緒に使用すれば、脂質の加水分解が遅延及び／又は減少した食品が得られる。
【０１１１】
したがって、脂質は長時間に渡り未消化に保たれ、その結果、食品を摂取した後、満腹感を長引かせる。
【０１１２】
更に、摂取した脂質の百分率が増加しても、全てが消化されるわけではなく、分泌され、その結果摂取した食物からのカロリーの使用量を減らすことになる。
【０１１３】
例えば、これらの特性により、本発明の使用により調製される食品は、体重管理製品として理想的なものになる。
【０１１４】
したがって、本発明の実施形態は、ヒト及び／又は動物における体重減少及び／又は体重維持を支援するために本発明の使用により調製される食品に関する。
【０１１５】
本発明はまた、組成物、例えば、体重減少及び／又は体重維持を支援するための食品の調製のための上述した方法により得ることができるプロテオースペプトン画分の使用に関する。
【０１１６】
本発明の実施形態はまた、本発明の使用により調製される、太り過ぎ及び／又は肥満の治療又は予防で使用する食品に関する。
【０１１７】
「太り過ぎ」は、ＢＭＩが２５〜３０の間である成人に対して定義する。
【０１１８】
「肥満」は、動物、特にヒト及びその他の哺乳動物の脂肪組織に蓄えられる自然エネルギーの蓄えが特定の健康状態又は死亡率の増加と関係する程度に増加した状態である。「肥満の」は、ＢＭＩが３０を越える成人に対して定義する。
【０１１９】
「ボディマス指数」つまり、「ＢＭＩ」は、体重ｋｇを身長ｍの２乗で割った比率を意味する。
【０１２０】
典型的には代謝性疾患は直接、肥満と関係がある。
【０１２１】
したがって、本発明の使用により調製される食品はまた、代謝性疾患の治療又は予防のために使用することができる。代謝性疾患は、例えば糖尿病、高血圧症、及び心臓血管疾患から成る群より選択されてもよい。
【０１２２】
当業者は、本明細書で記載の本発明の全ての特徴を、開示した本発明の範囲から逸脱することなく、自由に組み合わせできることを理解するであろう。特に、本発明の使用のために記載された特徴は、本発明の食品に適用してもよく、この逆も同様である。
【０１２３】
本発明の別の利点及び特徴は、以下の実施例及び図から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明で使用されるＰＰｆの２Ｄ−ＰＡＧＥ示す図である。
【図２】図１のゲルにおいて標識された蛋白質の定量化を示す図である。
【図３】ａ）インビトロのインテスティナルメディウム（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ）下での染色したＯ／Ｗエマルション滴から記録した、時間経過した一連の顕微鏡検査画像を示す図であり、ｂ）長時間に渡る正規化した平均液滴直径の減少として得られたエマルションの消化速度を示す図である。
【図４】水中油エマルション（ＭＣＴ／ＷＰＩ）の消化速度を示す図であり、この水中油エマルションに対して、腸の疑似インビトロ消化実験の実施中に同一濃度（ｗ／ｗ）で種々の異なる蛋白質がバルク水相に添加されていた。ＰＰＣは、従来のプロテオースペプトン画分であるが、ＰＰ画分は、本発明で使用されるプロテオースペプトン画分の略である。
【図５】水中油エマルション（ＭＣＴ／ＷＰＩ）の消化速度を示す図であり、この水中油エマルションに対して、腸の疑似インビトロ消化実験の実施中に同一濃度（ｗ／ｗ）で種々の異なる蛋白質がバルク水相に添加されていた。本発明で使用されるプロテオースペプトン画分（ＰＰ）及び従来のプロテオースペプトン画分（ＰＰＣ）の結果は、２つの異なる濃度（０．１２５ｗｔ％及び１．５ｗｔ％）で示されている。
【図６】インビトロ胃腸モデルであるＴＩＭの概略図である：（Ａ）胃コンパートメント、（Ｂ）十二指腸コンパートメント、（Ｃ）空腸コンパートメント、（Ｄ）回腸コンパートメント、（Ｅ）ガラスジャケット、（Ｆ）柔軟壁、（Ｇ）回転ポンプ、（Ｈ）幽門弁、（Ｉ）ｐＨ電極、（Ｊ）分泌ポンプ、（Ｋ）前置フィルター、（Ｌ）中空繊維膜、（Ｍ）空腸からの濾過液、（Ｎ）回腸の送り出し弁。
【図７】β−ＬＧ（白四角）及びＰＰ画分（黒四角）を有するひまわり油の消化実験についてのオクタデカン酸シグナルのピーク表面積を示す図である。表面積は、体積の相違について補正されている。
【実施例】
【０１２５】
プロテオースペプトン画分
１．本発明に対応するＰＰｆに富む画分の抽出
１１０ｋｇのプロラクタ９０（ロット７、Ｌａｃｔａｌｉｓ、Ｒｅｔｉｅｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、２３９０ｋｇの軟水（Ｎａ＋を１６０ｍｇ．Ｌ−１含有する）に１５℃で分散させた。これを、ｐＨプローブを装備した３０００Ｌ水槽内で一定の撹拌及び再循環の下で１時間維持した。結果、蛋白質分散液のｐＨは６．６８となり、全固形物含有量（ＴＳ）は４．５％となった。その後、約１０ｋｇの１ＭのＨＣｌを添加しｐＨを５．９５±０．０５に調整した。この特定のｐＨ値は、実験室規模の環境において軟水を使用したホエイ蛋白質凝集体（ＷＰＡ）の形成に最適であることが見出された（ＷＰＡの平均直径：２５０ｎｍ、５００ｎｍの濁度：＞７０）。最適ｐＨ値がこれらの処理条件下で非常に安定であることが見出された。その後、プロラクタ９０分散液を１２００Ｌ．ｈ−１の流速で汲み出し、８５℃で平板熱交換器を使用して熱処理し、続いて、１５分間保持し、４℃に冷却した。結果として生じたＷＰＡ含有ホエイ分散液（ＴＳは４．２％）を、４℃で貯蔵した。
【０１２６】
次に、全表面積が６．８ｍ２のＣａｒｂｏｓｅｐ Ｍ１４セラミック／カーボン膜（孔径０．１４ミクロン）２つを使用して、精密濾過（ＭＦ）により、５００ｋｇのＷＰＡ含有ホエイ分散液からＷＰＡを取り除いた。測定基準（ｍｏｄｕｌｅ）の温度は、５５℃の温度に設定し、圧力は２．３バールに設定した。透過液の流速は５時間の精密濾過後に約４００ｌ．ｈ−１に保った。主にＷＰＡを含有する、廃棄されることとなる保持液の最終全固形物（ＴＳ）は２０％だった。本発明のＰＰｆに対応する精密濾過透過液には全固形物含有量が約０．４３％あった。追加の濃縮工程で、精密濾過透過液をさらに１０℃で２０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、限外濾過プロセスにかけて、抽出物の乾燥量基準で、ＴＳを０．４３〜２．４％に増加させ、蛋白質含有量を１９〜８２％に増加させた。
【０１２７】
プロテオースペプトン画分による脂肪消化の遅延
インビトロ及びインビボ研究から、脂肪滴の大きさは、リパーゼ活性に影響することが知られている。したがって、本発明者らは、液滴の大きさの変動により生じるいかなる不具合も回避するために、且つ油滴の大きさに依存せずに脂肪消化速度を決定するために単分散Ｏ／Ｗエマルション（大きさ３７μｍ）のインビトロ実験を利用した。
【０１２８】
単分散Ｏ／Ｗエマルションは、テーパ毛細管からの油滴の破壊に基づく並行流方式で調製された。この方式は連続相として水−乳化剤溶液を含有する並行流に導入される。
【０１２９】
該インビトロ消化実験は、蛍光顕微鏡検査により実施された。時間経過した一連の画像が、消化力のあるインテスティナルメディウム（ｐＨ７、胆汁酸塩、及びＳｉｇｍａからの膵臓リパーゼＰ１７５０）における染色した（ナイルレッド染料による）エマルション滴から記録された。エマルション滴の大きさの減少における時間依存性を決定することにより、エマルションの消化速度が得られた。図３は、インビトロＧＩ条件下で、２時間に渡る時間をかけて顕微鏡検査により撮像された蛍光標識エマルションの典型的な一連の画像を示している（ａ）。（ａ）から、エマルションの消化速度が、時間に対する液滴直径の減少として得られる（ｂ）。
【０１３０】
１．プロテオースペプトン画分を有する油／水の界面の安定化による脂質の加水分解の遅延の証拠
Ｏ／Ｗ界面で、種々のタイプの乳蛋白質を有する単分散Ｏ／Ｗエマルションは、並行流方式で調製されてきた。中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）は、油相として使用されてきた。また、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、β−カゼイン（ＢＣＮ）、ホエイ蛋白質分離物（ＷＰＩ）及びプロテオースペプトン画分は、水相に溶解した安定剤として使用されてきた。インビトロ消化実験は、染められたエマルション滴を消化力のあるインテスティナルメディウム（胆汁酸塩、膵臓リパーゼの存在下、ｐＨ７で）に入れて実施されてきた。エマルション滴の大きさの減少（膵臓リパーゼによる油滴消化に起因する）の後に、２時間に渡る顕微鏡検査が実施され、エマルションの消化速度の曲線プロフィールが、長時間にわたる平均液滴直径として得られた。図４では、安定化していないＭＣＴ油（対照）の消化から得られた曲線プロフィールと共に４つのＯ／Ｗエマルションの消化速度が示されている。この対照実験のために、消化力のあるインテスティナルメディウムがＭＣＴ油に添加された。胆汁酸塩は、油の乳化を引き起こし（液滴の形成により顕微鏡下で見ることができる）、このことが、エマルション滴と同じ大きさを有する選択された油滴の蛍光実験の実施を可能にした。
【０１３１】
図４の結果は、ＭＣＴ油がプロテオースペプトン画分により安定化した場合、消化速度の低下の証拠となる。特に、ＭＣＴ油の場合、３０分後に油滴は初期直径の５０％が消滅したが、ＭＣＴ／ＷＰＩエマルションの場合は、約１時間３０分を必要とし、ＭＣＴ／プロテオースペプトン画分の場合は、３時間３０分を必要とすることが分かる。
【０１３２】
２．エマルションのバルク水相へのプロテオースペプトン画分の添加による脂質の加水分解の遅延の証拠は、プロテオースペプトン画分による油／水の界面が安定化していないことであった。
【０１３３】
単分散Ｏ／Ｗエマルション（ＭＣＴ／ＷＰＩ）が、前述の並行流方式で調製された。
【０１３４】
インビトロ消化実験は、比較蛋白質（アルブミン、ホエイ蛋白質分離物）及びプロテオースペプトン画分を添加したＭＣＴ／ＷＰＩエマルションについて、腸の模擬消化の条件下で実施された。図５では、ＭＣＴ／ＷＰＩエマルション（対照）の消化速度がバルク水相中で同一濃度（１．５％、ｗ／ｗ）で、アルブミン、ＷＰＩ及びプロテオースペプトン画分を添加したＭＣＴ／ＷＰＩエマルションの消化から得られた曲線プロフィールと共に示されている。図５のデータはまた、プロテオースペプトン（ＰＰ）画分が、蛋白質層で事前に被覆された油滴の水相に添加された場合の脂肪分解のより著しい遅延を示している。
【０１３５】
３．インビトロ胃腸モデルでのプロテオースペプトン画分による油／水の界面の安定化による脂質の加水分解の遅延の証拠
動的なインビトロ胃腸モデル（ＴＮＯ胃腸モデル１、ＴＮＯ製のＴＩＭ１、オランダ）が、トリグリセリドの消化に対するβ−ラクトグロブリン（β−ＬＧ、Ｂｉｏｐｕｒｅ）又はプロテオースペプトン画分（ＰＰｆ）の影響を評価するために使用された。このモデルは、胃、十二指腸、空腸、及び回腸を模擬した４つの連続したコンパートメントから成る（図６）。空腸及び回腸のコンパートメントは、各々濾過ユニット（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓのミニクロス（Ｍｉｎｉｋｒｏｓ）（登録商標）、Ｍ２０Ｓ−３００−０１Ｐ）に連結されている。回腸弁の後に、流出物が回収される。
【０１３６】
食事の調製
蛋白質（β−ＬＧ又はＰＰｆ）溶液をＰＢＳ（ｐＨ７）で調製し、この溶液をマグネティックスターラーで１時間撹拌した。ひまわり油（Ｃｏｏｐ ＡＧ、スイス）を、油１０％（ｗ／ｗ）及び蛋白質１％の濃度を得るような量で蛋白質溶液に加えた。この溶液を、５００ｒｐｍ／３分で最初のポリトロン処理（モデルＰＴ３１００Ｄ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＡＧ製）により乳化させ、次いでＲａｎｎｉｅホモジェナイザー（Ｍｉｎｉ−Ｌａｂ、型７．３０ ＡＰＶ製、スイス）に４００バールで、２度通過させることにより、マイクロ流動化させた。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ光散乱装置を使用して、得られたエマルションの液滴直径を測定し、粒径が０．１〜９．８μｍの間であるという結果を得た。
【０１３７】
６時間に渡るＴＩＭモデルでの実験で、食事の検査が行われ、脂肪食の摂取後の胃腸管の標準の生理学的条件を模擬した。最初の胃液量を模擬するために、胃液分泌物５ｍｌを食事に加えた。次に、食事を直接、胃のコンパートメントに導入した。胃液分泌物は、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で分泌される胃の電解質溶液（ＮａＣｌ ４．８ｇ／ｌ、ＫＣｌ ２．２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２ ０．２２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３ １．５ｇ／ｌ）中で、ペプシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ７０１２、６００Ｕ／ｍｌ）及びリパーゼ（Ａｍａｎｏ Ｆ−ＡＰ１５、４０Ｕ／ｍｌ）から成った。塩酸（１Ｍ）を分泌することにより、既定の曲線に従うようにｐＨを調節した。胃内容物の排出は、生体内データに従って実施された。
【０１３８】
十二指腸分泌物は、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量の新鮮なブタ胆汁、０．２５ｍｌ／ｍｉｎの流量の７％のパンクレアチン溶液（Ｐａｎｃｒｅｘ Ｖ粉末、Ｐａｉｎｅｓ＆Ｂｙｒｎｅ、ＵＫ）及び０．1５ｍｌ／ｍｉｎの流量の小腸の電解質溶液（ＳＩＥＳ：ＮａＣｌ、５ｇ／ｌ；ＫＣｌ、０．６ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２、０．２５ｇ／ｌ）から成った。空腸分泌液は、３．２ｍｌ／ｍｉｎの流量の１０％の新鮮なブタ胆汁を含有するＳＩＥＳから成った。回腸分泌液は、３．０ｍｌ／ｍｉｎの流量のＳＩＥＳから成った。
【０１３９】
十二指腸、空腸、及び回腸のコンパートメント内のｐＨを、１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液で調節して、設定値６．５、６．８及び７．２にした。実験を実施する前に、最初の腸の内容物の模擬のために、十二指腸コンパートメントを、ＳＩＥＳ１５ｇ、７％のパンクレアチン溶液１５ｇ、新鮮なブタ胆汁３０ｇ、及びトリプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ４６６５−５Ｇ）２ｍｇから成る溶液で満たした。空腸コンパートメントを、ＳＩＥＳ３０ｇ、７％のパンクレアチン溶液３０ｇ及び新鮮なブタ胆汁６０ｇから成る溶液で満たした。回腸コンパートメントを、ＳＩＥＳ溶液で満たした。
【０１４０】
実験中、空腸（ＦＪ）及び回腸（ＦＩ）からの濾液と流出物（Ｅｆｆ）を０〜２時間、２〜４時間、４〜６時間の間に回収し、遊離オクタデカン酸の含有量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した。
【０１４１】
インビトロ消化実験の濾液又は廃水試料１００μＬをクロロホルム９００μＬ及び０．１ＮのＨＣｌ １００μＬで希釈した。次に、試料を１０分間、１４０００ｒｐｍの速度で遠心分離機にかけた。有機相をＧＣで分析した。
【０１４２】
ＦＩＤ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ガスクロマトグラフィーにより、スプリットモードでＧＣ分析を実施した。長さ１５ｍ、内径０．２５ｍｍ、型番Ｊ＆Ｗ１２２−５７１１の無極性の溶融石英ＤＢ５−ＨＴカラムを使用した。実験中のガス流量はＦＩＤ検出器用に水素５０ｍＬ／ｍｉｎ、空気流量４５０ｍＬ／ｍｉｎ、及びカラム用に窒素４５ｍＬ／ｍｉｎであった。カラムの初期温度を、２分間４０℃に保ち、その後２０℃／ｍｉｎで温度を２２０℃まで上げ１分間保った後、再び１０℃／ｍｉｎの速度で最終温度３２０℃まで上げ、この温度を１０分間保った。
【０１４３】
同一手順に従って、オクタデカン酸シグナルの全体が、インストールされたソフトウェアＨＰＣＨＥＭを使用して測定され、標準を使用して同定された。
【０１４４】
図７は、数回の消化の後に、検査を経た３つの消化コンパートメント中でひまわり油の加水分解中に放出されるオクタデカン酸に相当する（量に比例する）表面積を示している。本発明によるプロテオースペプトン画分により安定化したエマルション中では、β−ラクトグロブリンにより安定化した対照エマルションと比較して、全体的に約３０％少ないオクタデカン酸が放出されたことが明白に認識され得る。この脂肪分解促進の低下は、脂肪酸の大部分が生体内で吸収される空腸コンパートメント及び回腸コンパートメントの両方で観察された。興味深いことに、両コンパートメントも、最初の２時間以内に、最も強く脂肪分解の低下（７５％）が起こった。ＰＰｆを使用した脂肪分解の低下の結果は、β−ＬＧの使用による調節と比較して、モデル消化システムの廃水コンパートメントにおけるオクタデカン酸の含有量（２５％）がより多いことで確証される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般に、脂質画分を含有する食品組成物の分野に関する。本発明の実施形態は、摂取した製品からの脂肪の取り込みを遅延させる組成物及び使用に関する。例えば、本発明は、脂肪の加水分解を遅延させる特定のプロテオースペプトン画分及びその使用に関する。
【０００２】
油脂は、腸管腔内の腸細胞の刷子縁膜での吸収のためにバイオアクセシブルになる前にリパーゼで酵素的に加水分解される必要がある。食事性脂肪は、主にトリアシルグリセリン（大部分で、約９５％）から成る。リパーゼによる酵素作用で、トリアシルグリセリン(ＴＡＧ)は、最終的に、体に吸収され易い遊離脂肪酸(ＦＦＡ)及びモノグリセリド(ＭＡＧ)に加水分解される。
【０００３】
リパーゼの水溶性並びに油脂の低親水性が影響して、リパーゼの触媒反応は油／水の界面で起こる。
【０００４】
過度の脂質の吸収は、最終的に太り過ぎや肥満を引き起こし、結果的に更に、代謝性疾患の原因となる。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈで公表された調査によると、英国だけで、２０１２年までに３人に１人の大人、つまり１３００万人の人々が肥満になることが予想される。
【０００５】
高脂肪食の組成物や高脂肪飲料を摂取する場合には、体重の増加及び最終的には肥満のリスクを軽減するために、食品中の脂質画分がもたらす心地よい食感や風味及び健康上の利益を保ちながら、摂取した食物からの脂肪の吸収を遅延できる利用可能な手段を持つことが望ましい。
【０００６】
Ｃａｒｔｉｅｒらは、成分ＰＰ３に富む従来の乳由来のプロテオースペプトンは、乳の自然な脂肪分解を低下させるが、一方で、ＰＰ３が欠乏したプロテオースペプトン画分は、乳の脂肪分解を促進するという事実を述べてきた（１９９０、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ ７３：１１７３〜１１７７）。Ｇｉｒａｒｄｅｔは、更に、現状技術である乳由来のＰＰ３は、ブタ膵臓のリパーゼ及び乳の内因性リパーゼに効果があると述べている。彼らは、ＰＰ３画分は、リパーゼ活性に直接は影響しないが、油／水の界面に対してより界面活性であり、競合メカニズムにより、リパーゼの吸着を阻止すると結論付けた（１９９３、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ ７６：２１５６〜２１６３）。
【０００７】
発泡が乳蛋白質の典型的な特徴であることは良く知られている。しかし、カゼインを除去した後でさえ、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリン乳は、かなりの界面活性を伝える（Ｒ．Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．１４（１９４５）、３１６〜３２８）。残りの画分は、非常に多量の界面活性成分を含むプロテオースペプトン画分（ＰＰｆ）を含有する。
【０００８】
ＰＰｆは、特性のはっきりしない蛋白質性化合物の不均一混合物を示す。この蛋白質性化合物は、本明細書に参考として組み込まれるＧｉｒａｒｄｅｔら著、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．６３（１９９６）、３３３〜３５０の主題の検討で要約されている。
【０００９】
多くの蛋白質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエンテロトキシンに対する結合親和性を有するｐｐ１６ｋ及びｐｐ２０ｋの２個の糖蛋白質などのＰＰｆで説明された。それらは、それぞれα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンのグリコシル化形態として特定された。オステオポンチン、酸性６０ｋＤａリン糖蛋白質、及び８８ｋＤａラクトフェリンは、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により検出される大型の蛋白質に属する。
【００１０】
乳試料中の成分３、５、及び８（ＰＰ３、ＰＰ５、ＰＰ８）で示される主要なＰＰｆ成分の量は、そのプラスミン活性と関連する。以下の成分が、β−カゼインに対するプラスミン活性により生じる。その成分は、ＰＰ５すなわちβ−ＣＮ−５Ｐ ｆ（１〜１０５／７、β−カゼインのＮ末端ペプチド１〜１０５及び１〜１０７）、ＰＰ８−ｆａｓｔすなわちβ−ＣＮ−４Ｐ ｆ（１〜２８、β−カゼインのＮ末端ペプチド１〜２８）である。成分ＰＰ８−ｓｌｏｗとβ−ＣＮ−１Ｐ ｆ（２９〜１０５／７、β−カゼインのＮ末端ペプチド２９〜１０５及び２９〜１０７）は別個の要素であるが、電気泳動度により区別するのが難しい。
【００１１】
ＰＰ３成分の不均一な分子構造を下記の見解により説明する。ＰＰ３リン糖蛋白質は、５Ｍ−グアニジンを使用して、４０ｋＤａの見かけの分子量を有するサブユニットに分離できる１６３ｋＤａ（ｐＨ８．６で超遠心分離により計測）の大きさを有する複合体を形成する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、ジスルフィド結合還元剤２−メルカプトエタノールの存在下で実施され、それぞれ２４．６〜３３．４ｋＤａと１７〜２０．９ｋＤａの２つの主要な糖蛋白質成分の存在が明らかとなった。２８ｋＤａ及び１８ｋＤａの見かけの分子量を有する主要な糖蛋白質が、実質的に常に観察され、１１ｋＤａのバンドを伴うことが見出された。それらは、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（２Ｄ−ＰＡＧＥ）により分離されると、それぞれ、ｐＨ４．９〜６．１の範囲の見かけの等電点を有する４つ及び２つのスポットとして現われる。複合体は、約７ｋＤａの分子量を有する非グリコシル化ポリペプチドと結合した、２８ｋＤａ、１８ｋＤａ、及び１１ｋＤａの分子量を有する糖蛋白質から構成されている。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を有するレクチンアフィニティークロマトグラフィーで分離することにより、１１ｋＤａ、１８ｋＤａ及び２８ｋＤａの糖蛋白質の複雑な挙動が明確となる。１１ｋＤａの糖蛋白質はＣｏｎＡに結合しないが、より大型の１８ｋＤａ及び２８ｋＤａの糖蛋白質は、非結合画分（糖蛋白質ｐｐ１８−とｐｐ２８−と呼ばれる）と結合画分（糖蛋白質ｐｐ１８＋とｐｐ２８＋と呼ばれる）とに分配された。
【００１２】
当技術分野では、通常脱脂粉乳からＰＰｆを得る。牛乳は、約４重量％の脂肪、約３．５重量％の蛋白質、約０．６重量％のホエイ蛋白質、及び約０．００３重量％のプロテオースペプトンを含有する。
【００１３】
しかしながら、現状技術に従ってＰＰｆを単離するには、カゼイン及び変性ホエイ蛋白質を沈殿／遠心分離によって除去するための乳の熱処理（例えば９０℃で１０分間）及びかなりの酸性化を要する。
【００１４】
この従来の手法は費用がかかり、工業的規模では適用できない。
【００１５】
特に、現状技術の酸性化の工程は、通常、あまり特定されないが低いｐＨ値で実施される。このことは、乳蛋白質の実質的な凝固を引き起こす。こうした条件で、乳に存在する９０％超の蛋白質が凝固する。プロテオースペプトン画分の大規模な精製を試みた場合、これらの凝固蛋白質を除去すれば、重大な問題が発生する。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、遅延型遊離脂肪酸及び／又はモノグリセリドの体への取り込みをもたらす脂質画分を含有し、工業的規模で容易に調製できる食品組成物を提供することであった。
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、この目的が、独立請求項の主題によって解決できることを発見した。
【００１８】
本発明者らは、当技術分野において公知のプロテオースペプトン画分と比較して、改良されたプロテオースペプトン画分を提供することが既に可能だった。
【００１９】
この改良されたプロテオースペプトン画分は、本明細書に参考として組み込まれる特許出願ＥＰ０８１０１８０５．３に記載しているように得ることができる。
【００２０】
当技術分野において公知のプロテオースペプトン画分とは対照的に、この改良されたプロテオースペプトン画分の生産は、酸性化の工程中の著しい蛋白質の凝集化が回避されるので工業的に適用可能である。熱処理前にｐＨの値を正確（±０．１ｐＨ単位）に調整すると、従来技術のバルク蛋白質の凝集体ではなく、１μｍ未満の直径を有する、ホエイ蛋白質の球状粒子が生成される。これらのホエイ蛋白質の球状粒子は、従来技術のバルク蛋白質沈殿物よりもプロテオースペプトン画分から除去するのが、はるかに容易である。
【００２１】
得られたプロテオースペプトン画分はまた、熱安定性の向上を示す。更に、これは、現在の従来からの技術で得られるプロテオースペプトン画分と同様に、油／水の界面を安定させるために使用できる。
【００２２】
更に本発明者らは、当技術分野において現在示されているのとは反対に、プロテオースペプトン画分は、油と水の界面に存在する場合だけでなく、バルク相に存在する場合にも、脂肪分解を遅らせることが可能なことを実証することができた。
【００２３】
本発明で使用されるプロテオースペプトン画分は、油と水の境界でリパーゼ作用を阻害した。その結果、脂肪分解、つまりトリアシルグリセリン(ＴＡＧ)からの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）及びモノグリセリド(ＭＡＧ)の生成を防止又は少なくとも遅らせた。
【００２４】
該プロテオースペプトン画分はまた、水性バルク相中に存在している場合でもリパーゼ作用を阻害し、その結果、水性バルク相中でのトリアシルグリセリン(ＴＡＧ)からの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）及びモノグリセリド(ＭＡＧ)の生成を遅らせた。
【００２５】
重要なことだが、本発明者らは、脂肪の吸収を遅らせることについて、プロテオースペプトン画分を添加すれば、他の蛋白質画分、例えばβ−ラクトグロブリン、β−カゼイン、そしてホエイ蛋白質分離物よりもはるかに顕著に効果が出たことを示すことができた。
【００２６】
例えば、本発明のプロテオースペプトン画分を、食品のバルク水相に添加してもよい。本発明のプロテオースペプトン画分はまた、既に被覆された油滴の消化を更に遅らせるために、既存の被膜が乳化剤を含有するＯ／Ｗエマルションのバルク水相に添加してもよい。乳化剤は、低分子量及び／又は高分子量の乳化剤でも可能である。例えば、界面活性剤、蛋白質、及び／又は多糖類を使用してもよい。
【００２７】
説明した効果の証拠は、食物中の脂質の模擬インビトロ消化実験により得られた。
【００２８】
本発明のプロテオースペプトン画分は、バルク相に存在している場合だけでなく、油滴の被覆層として存在する場合も脂質の加水分解を遅らせるという点で有効であった。
【００２９】
したがって、本発明の一実施形態は、脂質消化の遅延を示す脂質含有食品の調製のための、
ミネラル除去された天然蛋白質水分散液のｐＨを約５．６〜８．４、又は約３．５〜５．０に調整するステップ、
天然蛋白質水分散液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とするステップ、
加熱後に、蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも一部を除去するステップ、及び
分散液の残りの液体画分を回収するステップ
を含む方法により得ることができるプロテオースペプトンの使用である。
【００３０】
本発明の更なる実施形態は、
ミネラル含有量を少なくとも２５％減少させた天然蛋白質水分散液のｐＨをｐＨ５．６〜８．４、又はｐＨ３．５〜５．０に調整するステップ、
天然蛋白質水分散液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とするステップ、
加熱後に、蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも９０重量％を除去するステップ、及び
分散液の残りの液体画分を回収するステップ
を含む方法により得ることができるプロテオースペプトン画分、及び少なくとも１つの脂質を含む食品であって、食品中のプロテオースペプトン画分及び少なくとも１つの脂質は、プロテオースペプトンを含有する少なくとも１つの被覆層を含む被覆油滴として、少なくとも部分的に提供される、食品である。
【００３１】
本発明における少なくとも１つの脂質及び／又は油脂については、どのような種類の食用油でもよい。材料は、ヒト又は動物の摂取用として認可されている場合、食用であると考えられる。
【００３２】
例えば、油脂は、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、乳脂肪、亜麻仁油、桐油、大豆油、オリーブ油、パーム油、ひまわり油、くるみ油、へんとう油、落花生油、ヘーゼルナッツ油、イーノ油、月見草油、チェリー核油、グレープシード油、ゴマ油、トウモロコシ油、菜種油、綿実油、コメヌカ油、コーン油、ライ麦油、小麦芽油、アボカド油、ツバキ油、マカダミアナッツ油、いわし油、サバ油、ニシン油、タラ肝油及びカキ油、あんず油、べにばな油、菜種油、ルビナス油、桃油、トマト油、亜麻仁油、かんきつ油又はこれらの組合せから成る群より選択されてもよい。
【００３３】
記載した方法により得ることができる改良されたプロテオースペプトン画分は、ミネラル除去された蛋白質画分、例えばミネラル除去された球状蛋白質画分、特にホエイ蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）又は、ホエイ蛋白質分離物（ＷＰＩ）から生産できる。
【００３４】
ホエイは、安価な原料であり、通常は、例えばチーズ製造における廃棄物である。チーズの生産過程では、乳を凝固させて、凝乳（後のチーズ）と可溶性ホエイ画分に分離させる蛋白質加水分解酵素であるレンネットの添加が必要である。
【００３５】
ホエイは、ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、若しくはラクダ起源のもの又はそれらの混合物から入手したいずれかのホエイを含めてもよい。
【００３６】
更に、ＷＰＩは殆ど脂肪を含んでいないので、ＰＰｆの生産中に脂肪の除去は不要であり、したがって、該プロセスを単純化させ更にＰＰｆのコンタミネーションを防止する。
【００３７】
本発明で使用されるプロテオースペプトン画分は、β−ラクトグロブリンが欠乏し、ミネラル除去されてもよい。
【００３８】
本発明の目的において「ミネラル除去された」とは、ミネラルの含有量を、スイートホエイ又は酸ホエイと比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％減少させたことを意味する。スイートホエイ又は酸ホエイの乾燥物質は平均で、０．９％のカルシウム、０．８％のナトリウム、２．２％のカリウム、０．１％のマグネシウム、０．７％のリン及び２．０％の塩化物を含む、８．８％のミネラルを含有している。
【００３９】
本発明の文脈において、「β−ラクトグロブリンが欠乏した」とは、抽出物中の蛋白質の全重量に対するβ−ラクトグロブリンの含有重量が、天然球状蛋白質溶液中の蛋白質の全重量に対するβ−ラクトグロブリンの含有重量と比較して、多くても７０％、好ましくは多くても５０％、さらにより好ましくは多くても２０％であることを意味する。
【００４０】
したがって、β−ラクトグロブリンが欠乏した抽出物は、天然球状蛋白質溶液中に存在するβ−ラクトグロブリンの量の多くても７０重量％、好ましくは多くても５０重量％、さらにより好ましくは多くても２０重量％を含む。
【００４１】
本発明で使用されるプロテオースペプトン画分はまた、α−ラクトアルブミンに富んでいてもよい。α−ラクトアルブミンに富むとは、抽出物中の蛋白質の全重量に対するα−ラクトアルブミンの含有重量が、最初の天然球状蛋白質分散液中の蛋白質の全重量に対するα−ラクトアルブミンの含有重量と比較して、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、さらにより好ましくは少なくとも２倍増加していることを意味する。
【００４２】
本発明のプロテオースペプトン画分に至る方法において、ミネラル除去された天然蛋白質水分散液のｐＨを、約５．６〜８．４、又は約３．５〜５．０に調整する。
【００４３】
より厳密には、ｐＨは、約３．５〜５．０、又は約５．６〜６．４、好ましくは約５．８〜６．０、又は約７．５〜８．４、好ましくは約７．６〜８．０、又は約６．４〜７．４、好ましくは約６．６〜７．２に調製してもよい。
【００４４】
本発明に至る長い実験の過程で、本発明者らは、驚くべきことに、熱処理前にｐＨを厳密なｐＨ値（±０．１ｐＨ単位）に調整すると、１μｍ未満の直径を有する、ホエイ蛋白質凝集体の球状粒子が得られることを見出した。
【００４５】
最適ｐＨ値は出発物質、例えばＷＰＩの濃度及び組成に依存することが見出された。この方法には、例えば剪断などの、いかなる機械的ストレスもない状態で、ホエイ蛋白質粒子を生成するという利点がある。得られた粒状物質により、本発明のＰＰｆ含有画分からこれら粒子を形成する化合物が容易に除去される。
【００４６】
ｐＨ及びイオン強度が本発明の方法にとって２つの大切な要因であることが明らかとなった。したがって、十分に透析して、Ｃａ＋＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｍｇ＋＋等の遊離のカチオンが極めて欠乏した試料では、上記の熱処理を適用した後、５．４未満のｐＨでは凝乳を生成し、６．８を超えるｐＨでは可溶性ホエイ蛋白質凝集体を生成する傾向がある。
【００４７】
したがって、ｐＨ値の範囲がかなり狭い場合でのみ、本発明で使用されるプロテオースペプトン画分の調製で、工業的に除去するのが容易なタイプの固形ホエイ蛋白質粒子が得られる。
【００４８】
類似したホエイ蛋白質粒子は、ホエイの等電ｐＨ未満の対称的なｐＨ値、すなわち３．５〜５．０までを使用することで生産される。
【００４９】
二価カチオンの低濃度（最初のホエイ蛋白質粉末１００ｇに対して０．２ｇ未満）に対して、ｐＨが５．６〜６．４、より好ましくは５．８〜６．０のｐＨ範囲に調整される場合、負に帯電したホエイ粒子が得られる。ｐＨは、ホエイ蛋白質源（例えばＷＰＣ又はＷＰＩ）のミネラルの含有量によって、８．４まで高くしてもよい。
【００５０】
特に、大量の遊離ミネラルの存在下で負に帯電した粒子を得るためには、ｐＨを７．５〜８．４、好ましくは７．６〜８．０に調整してもよい。
【００５１】
中程度の濃度の遊離ミネラルの存在下で負に帯電した粒子を得るためには、ｐＨを６．４〜７．４、好ましくは６．６〜７．２に調整してもよい。
【００５２】
天然蛋白質粉末１００ｇ中に存在する遊離ミネラルが、２ｇ未満である場合、遊離ミネラルの濃度は低いと考えられる。
【００５３】
天然蛋白質粉末１００ｇ中に存在する遊離ミネラルが、２ｇ〜５ｇの間である場合、遊離ミネラルの濃度は中程度と考えられる。
【００５４】
天然蛋白質粉末１００ｇ中に存在する遊離ミネラルが、５ｇを超える場合、遊離ミネラルの濃度は高いと考えられる。
【００５５】
もちろん、粒子の電荷は、本発明で使用するプロテオースペプトン画分からこれらの粒子を分ける手段として、さらに使用することができる。
【００５６】
ｐＨは一般に、好ましくは食品等級の酸、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸又は乳酸などの添加によって調整することができる。ミネラル含有量が高い場合は、ｐＨは一般に、好ましくは食品等級のアルカリ性溶液、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化アンモニウムの添加によって調整する。
【００５７】
本発明の方法には、本質的に塩を含まない天然ホエイ蛋白質水分散液が好ましい。「本質的に塩を含まない」とは、約４重量％の蛋白質濃度に対して塩の含有量が１ｇ／Ｌ以下であることを意味する。例えば、ホエイ蛋白質水溶液は二価カチオンを、全乾燥質量で２．５重量％未満、より好ましくは２重量％未満含有してもよい。
【００５８】
天然蛋白質水分散液中に天然蛋白質、好ましくは天然球状蛋白質、さらにより好ましくはホエイ蛋白質が、溶液の全重量に対して約０．１重量％〜１２重量％、好ましくは約０．１重量％〜８重量％、より好ましくは約０．２重量％〜７重量％、さらにより好ましくは約１重量％〜５重量％の量で存在する。
【００５９】
本発明の方法では、天然ホエイ蛋白質水分散液は、約８５℃になるまで約１５分間加熱することが好ましい。
【００６０】
原理的に、加熱後に、当技術分野において知られる任意の手段により、ホエイ蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する、形成された固形高分子量凝集体を除去することができる。しかしながら、好ましくは、沈殿、遠心分離、濾過、精密濾過、又はこれらの方法の組合せによって高分子量凝集体を除去することができる。この除去工程に、ｐＨ調整をさらに加えてもよい。
【００６１】
沈殿には、必要な実験装置が最小であり、最低限のエネルギー入力で実行することができるという利点がある。
【００６２】
遠心分離はエネルギー入力が必要となるが高速の方法である。連続遠心分離は、例えば白チーズ製造の工場において既に使用されているプロセスである。
【００６３】
濾過及び精密濾過は、大規模生産にはよく応用されており、高分子量凝集体の除去において非常に信頼性が高い。
【００６４】
これらの方法をいくつか併用することでそれぞれの利点を兼ね備えることができる。
【００６５】
例えば、最後の工程である精密濾過の手順を適用することで、少なくとも１００ｎｍの直径を有する高分子量凝集体を実質的に完全に除去することができる。
【００６６】
加熱後に、ホエイ蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する固形高分子量凝集体の好ましくは少なくとも９０重量％、さらに好ましくは９５重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％、理想的には１００重量％を除去する。
【００６７】
本発明の方法は、限外濾過及び／又は蒸発の工程をさらに含んでもよい。
【００６８】
限外濾過は、静水圧を利用して、半透膜に液体を通す膜濾過技術である。水及び低分子量の溶質が膜を通過する一方、懸濁固体及び高分子量の溶質が残る。この分離プロセスは、高分子量の分子（１０３〜１０６Ｄａ）、特に蛋白質を含有する溶液の精製及び濃縮のために、産業及び研究において使用される。限外濾過は、産業環境において定評があるという利点があり、高分子量の蛋白質を効率的でありながら穏やかに分離でき、これによってストレス誘発性の蛋白質変性を防ぐ。
【００６９】
蒸発は、蛋白質溶液を濃縮できる穏やかな方法である。例えば、少なくとも４０℃に、又は好ましくは少なくとも６０℃に加熱することで蒸発を起こしてもよい。例えば、ＰＰｆを含む組成物を乾燥させて、含水量を全組成物の重量に対して１０重量％未満、好ましくは５重量％未満、さらにより好ましくは２重量％未満に減少させてもよい。この乾燥工程には、得られたプロテオースペプトン画分を、その完全な活性を維持しつつ組成物の重量を減らし高濃度で貯蔵できるという利点がある。また、蒸発により水分活性が低くなるため、製品の安定性は確実に増す。
【００７０】
上述の方法により得ることができるプロテオースペプトン画分は、全アミノ酸組成に対する百分率として、下記のようなアミノ酸組成を有する：約６〜９％のＡＳＰ、約４〜７％のＴＨＲ、約４〜７％のＳＥＲ、約２２〜２５％のＧＬＵ、約９〜１２％のＰＲＯ、約０〜３％のＧＬＹ、約１．５〜４．５％のＡＬＡ、約４〜７％のＶＡＬ、約０〜２％のＣＹＳ、約１〜４％のＭＥＴ、約４〜７％のＩＬＥ、約７．５〜１０．５％のＬＥＵ、約０〜３％のＴＹＲ、約６．７〜９．７％のＬＹＳ、約１．５〜４．５％のＨＩＳ、約１〜４％のＡＲＧ。
【００７１】
このアミノ酸組成は、従来の方法によって得られたＰＰｆの典型的な組成とは異なる。
【００７２】
表１には、従来の方法（試料１）及びＰＰｆ（本発明で使用、試料２）に対応する典型的なＰＰｆ−アミノ酸プロフィールが示され、両方を比較することができる。
【００７３】
試料１は、Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．Ｎｅｊｊａｒ，Ｙ．、及びＬｉｎｄｅｎ，Ｇ．（１９８８）；Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｏｓｅ−ｐｅｐｔｏｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１、１４６４〜１４７１）に従って従来の方法を使用して試料２と同じＷＰＩから調製した。
【００７４】
簡潔に述べると、プロラクタ（Ｐｒｏｌａｃｔａ）９０を出発物質として使用した。プロラクタ９０（蛋白質を８４％含有する粉末４２８ｇ：Ｎｘ６．３８）をＭｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏ ５Ｌでもどした。この溶液を計測するとｐＨ６．４３であったが、その後、１ＮのＮａＯＨを約１５ｍＬ添加しｐＨ７．００に調整した。この溶液の体積を調整して、６Ｌ（最終蛋白質濃度は６％（ｗ／ｗ）であった）とし、６本の１Ｌビンに等分し、これらのビンを９３℃に設定した水浴に３０分間置き、蛋白質を変性させた。２０分間、インキュベートした後、ビンの内側の温度は９０℃となった。インキュベートの終わりに、ビンを氷浴に入れ、２０℃まで冷却した。ｐＨを４．６に調整して、蛋白質性化合物の等電沈殿を実施した。実際には、１Ｌビン３本の内容物を一緒にし（ｐＨ７．１７）、１ＮのＨＣｌ約８８ｍＬを使用してｐＨを４．６に調整した。他の１Ｌビン３本も同様に処理した。得られた２つの酸性化された溶液を一緒にして４℃で１８時間貯蔵し、１Ｌプラスチックビン６本に等分した。ビンを遠心分離後（６℃、５０００ｒｐｍ／７２００ｇで６０分、Ｈ ６０００Ａローターを備えたＳｏｒｖａｌ ＲＣ３Ｃ Ｐｌｕｓ）、ＰＰｆを含有する上清を回収した。次に、ＰＰｆの硫酸アンモニウム沈殿を、半飽和（３１３ｇ／Ｌ）で２時間実施した。沈殿物を、遠心分離（ＳｏｒｖａｌＲＣ３Ｃ Ｐｌｕｓを使用して６℃、５０００ｒｐｍで６０分）後に回収し、一緒にして、Ｍｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏ ３５０ｍＬ内に再度分散した。濁った懸濁液／溶液を、１０００のＭＷカットオフのＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｉｎｃ．）を使用して、２２ＬのＭｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏに対し４回透析した。透析後、ＰＰｆを含有する抽出物を遠心分離し（６℃、５０００ｒｐｍで６０分）、上清を濾過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製０．２２μｍフィルター、ＧＰステリカップ（ＧＰ Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）（登録商標）エクスプレスプラス（Ｅｘｐｒｅｓｓ ｐｌｕｓ）（商標））、フリーズドライした。ＰＰｆの収量はホエイ蛋白質全荷重３６０ｇから６ｇ（１．６％）であった。
【００７５】
例えば、次の２つの基準により現況技術で得られるＰＰｆと本発明で記載の改良されたプロテオースペプトン画分とを区別することができる。つまり、アミノ酸プロフィール（表１）及び２Ｄ−ＰＡＧＥによって決定される蛋白質プロフィール（図１及び図２）である。
【００７６】
表１：従来のＰＰｆ（試料１）及び本発明で使用される改良されたプロテオースペプトン画分（試料２）のアミノ酸組成（１００ｇ粉末当たり各アミノ酸のｇで、又は全アミノ酸組成に対する百分率で表した）。
【表１】
【００７７】
２Ｄ−ＰＡＧＥは複合蛋白質混合物を分析し比較する強力な方法である。この方法では、一次元目では蛋白質の電荷によって、二次元目では分子量によって蛋白質を分離する。
【００７８】
本発明者らは、この２Ｄ−ＰＡＧＥを使用して、従来の方法を使用して得られたＰＰｆと本発明で使用されるＰＰｆとの間にある差異を分析した。同じＷＰＩを使用して従来の方法によって調製されたＰＰｆと本発明で使用させるＰＰｆとの両方を生産した。Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．Ｎｅｊｊａｒ，Ｙ．、及びＬｉｎｄｅｎ，Ｇ．（１９８８）；Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｏｓｅ−ｐｅｐｔｏｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ、７１、１４６４〜１４７１）に記載された方法によって、従来のＰＰｆを調製した。図１は、本発明によって得られたＰＰｆの２Ｄ−ＰＡＧＥ蛋白質プロフィールを示す。図１の２Ｄゲルの標識された蛋白質スポットはすべて、従来の方法で調製されたＰＰｆによって生成された２Ｄゲルの蛋白質スポットとは質的及び／又は量的に異なる。図２は、観察された差異の定量化を示す。
【００７９】
ＰＰｆの分析が、以下の手順に従って実施された。
蛋白質溶液、特にＰＰｆからの２５０μｇ蛋白質当量を、最終濃度がそれぞれ７Ｍ、２Ｍ、６５ｍＭ、２０ｍＭ、６５ｍＭ、０．４％（ｗ／ｖ）で使用される尿素、チオ尿素、ＣＨＡＰＳ、トリス、ＤＴＴ、アンフォライトと、染色のためのブロモフェノールブルーとから成る変性溶液３４０μｌに溶解し、
１．５Ｍトリス緩衝液で調製された９〜１６％アクリルアミドゲル上のｐＨ３〜ｐＨ１０のｐＨ勾配のイモビラインストリップにこの試料を載せ、
イモビラインストリップゲルに３００ボルトの電圧を１１．６時間印加し、次いで５０００ボルトの電圧を１２．４時間印加して、電荷で蛋白質を分離し、
２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン／０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、ｐＨ８．３の緩衝液中でアクリルアミドが９〜１６％の範囲にあるアクリルアミド勾配ゲル上にイモビラインストリップゲルを配置し、
ゲルに４０ｍＡの電流を一晩流して、事前にイモビラインストリップゲル上で分離した蛋白質をアクリルアミドマトリックスに流して、さらに大きさにより蛋白質を分離し、
クマシーブルー染色法で蛋白質スポットを視覚化する。
【００８０】
この手順により、図１に示されるようなゲルが得られた。
【００８１】
改良されたプロテオースペプトン画分が脂質消化の遅延を示す脂質含有食品の調製に使用される場合、プロテオースペプトン画分及び脂質を、１：２〜１：２０００の範囲、例えば、１：２〜１：１０００の範囲、好ましくは、１：１０〜１：１００の範囲の重量比で提供することができる。
【００８２】
リパーゼ活性は、リパーゼが活性化する油水界面で効率的な阻害のみが可能なことを事前に想定されていたが、本発明者らは、プロテオースペプトン画分が水性バルク相に添加された場合、リパーゼ活性はまた阻害可能であることを示すことができた。プロテオースペプトンを単に水性バルク相に添加することは、プロテオースペプトン画分を油と水との間の界面に設置しなければならないことよりも、はるかに容易に達成できるので工業的な適用にとって、このことは重要である。
【００８３】
しかしながら、プロテオースペプトン画分はまた、油水界面で有効であることも見出された。エマルションや発泡エマルション等の多くの油／水の界面が存在する製品では、プロテオースペプトン画分は効果的に使用できる。
【００８４】
したがって、プロテオースペプトンを含有する少なくとも１つの被覆層を含む被覆油滴として、少なくとも部分的には、食品中のプロテオースペプトン画分及び脂質が提供される。
【００８５】
油粒子が２つ以上の被覆層で覆われている場合は、プロテオースペプトンはこれらの被覆層のいずれか１つに存在してもよい。
【００８６】
被覆油滴はまた、プロテオースペプトン画分から成る少なくとも１つの被覆層を含んでもよい。
【００８７】
油滴がプロテオースペプトン画分を含む層に覆われている場合、油滴に作用しようとするリパーゼ活性は、著しく妨げられていることが視覚化できる。
【００８８】
２つ以上の被覆層を有する油滴の場合、プロテオースペプトンを含有する被覆層が外側の被覆層であることが好ましい。
【００８９】
存在すれば、更なる被覆層は、任意の種類の乳化剤、好ましくは食用乳化剤を含有してもよい。このような乳化剤は、低分子量又は高分子量を有してもよい。低分子量乳化剤は、１０００Ｄａ未満の分子量を有し、高分子量乳化剤は、１０００Ｄａを超える分子量を有する。
【００９０】
乳化剤は、例えば、蛋白質、又は多糖類などの界面活性剤でもよい。
【００９１】
存在すれば、更なる被覆層は、少なくとも１つの蛋白質画分を含有しても、又はこれから成ってもよい。これらの蛋白質画分は、乳、ホエイ、又は大豆から得てもよい。好ましい蛋白質画分は、ホエイ蛋白質、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、酸カゼイン、カゼイン塩、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、又はこれらの組合せを含んでもよい。
【００９２】
少なくとも１つの更なる被覆層に含有される蛋白質画分は、例えばβ−ラクトグロブリン、ホエイ蛋白質分離物、及びβ−カゼインから成る群より選択されてもよい。
【００９３】
被覆油滴は、いかなるサイズでもよい。油滴の大きさは、脂肪分解の全体速度に影響を及ぼし得る。しかしながら、プロテオースペプトンが、油滴の大きさとは無関係に常に脂肪分解の速度を落とすことになる。
【００９４】
しかし、被覆油滴は、食品に適用できるサイズを有するのが好ましい。例えば、油滴はエマルションや発泡エマルション中に存在してもよい。
【００９５】
エマルション又は発泡エマルションは、例えば、マヨネーズ、アイスクリーム、ソース又はクリーマーとして食品で使用される。
【００９６】
一般的に、被覆油滴は、０．１〜１００μｍの範囲、好ましくは０．５〜５０μｍの範囲の直径を有してもよい。
【００９７】
通常、被覆油滴の大きさは、いくつかのＧａｕｓｓ粒度分布を示してもよい。単分散エマルションを使用する場合は、この分布は多少は絞り込んでもよい。
【００９８】
したがって、被覆油滴の提示された大きさは平均値を示す。
【００９９】
例えば、プロテオースペプトン画分被膜などの乳化剤被膜の厚さは可変であり、所望する効果に応じて調整することができる。
【０１００】
リパーゼ作用を遅延させる程度は、用量に依存することが見出された。したがって、プロテオースペプトン画分の用量が多くなれば、より著しい効果をもたらす。
【０１０１】
したがって、油／プロテオースペプトン画分の比率を調節することにより、脂肪を代謝するのに要する時間を調節することができる。
【０１０２】
また一般に、油表面が大きくなれば、この表面を有効に覆うために、重量％で、より多くのプロテオースペプトン画分が必要になる。
【０１０３】
したがって当業者は、例えば、目標とする液滴の大きさ直径及びリパーゼの遅延に基づいて、特定の製品のための好ましい油／プロテオースペプトン画分の重量比を決定することができる。
【０１０４】
しかしながら、通常、プロテオースペプトン画分及び油は、重量比で、１：２〜１：２０００の範囲で油滴中に存在している。
【０１０５】
本発明の使用により調製される食品は、食品組成物、動物用食品、医薬組成物、栄養組成物、栄養補助食品、飲料、又は食品添加物でもよい。
【０１０６】
代表的な食品として、特にコーヒー用クリーマーなどのクリーマー、カプチーノなどの発泡飲料、カフェラテ、チョコレート、ヨーグルト、殺菌されたＵＨＴ乳、加糖練乳、発酵乳、ミルクを加えた発酵乳、ミルクチョコレート、ムース、発泡体、エマルション、アイスクリーム、飲料調製に使用する凝集粉、ミルク粉、乳児用フォーミュラ、ダイエット強化剤、ペットフード、錠剤、乾燥経口サプリメント、湿性経口サプリメント、及び／又は、健康管理栄養処方剤及び化粧品などの製品が挙げられる。
【０１０７】
本発明による代表的な食品は、被覆油滴として脂質を、例えば、少なくとも２０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも７５重量％含むことができる。
【０１０８】
プロテオースペプトン画分及び脂質は、少なくとも部分的にエマルションの形態で食品に存在してもよい。
【０１０９】
更に／或いは、プロテオースペプトン画分及び脂質は、少なくとも部分的には、泡状で食品に存在してもよい。
【０１１０】
食品の製造過程で、プロテオースペプトン画分を脂質と一緒に使用すれば、脂質の加水分解が遅延及び／又は減少した食品が得られる。
【０１１１】
したがって、脂質は長時間に渡り未消化に保たれ、その結果、食品を摂取した後、満腹感を長引かせる。
【０１１２】
更に、摂取した脂質の百分率が増加しても、全てが消化されるわけではなく、分泌され、その結果摂取した食物からのカロリーの使用量を減らすことになる。
【０１１３】
例えば、これらの特性により、本発明の使用により調製される食品は、体重管理製品として理想的なものになる。
【０１１４】
したがって、本発明の実施形態は、ヒト及び／又は動物における体重減少及び／又は体重維持を支援するために本発明の使用により調製される食品に関する。
【０１１５】
本発明はまた、組成物、例えば、体重減少及び／又は体重維持を支援するための食品の調製のための上述した方法により得ることができるプロテオースペプトン画分の使用に関する。
【０１１６】
本発明の実施形態はまた、本発明の使用により調製される、太り過ぎ及び／又は肥満の治療又は予防で使用する食品に関する。
【０１１７】
「太り過ぎ」は、ＢＭＩが２５〜３０の間である成人に対して定義する。
【０１１８】
「肥満」は、動物、特にヒト及びその他の哺乳動物の脂肪組織に蓄えられる自然エネルギーの蓄えが特定の健康状態又は死亡率の増加と関係する程度に増加した状態である。「肥満の」は、ＢＭＩが３０を越える成人に対して定義する。
【０１１９】
「ボディマス指数」つまり、「ＢＭＩ」は、体重ｋｇを身長ｍの２乗で割った比率を意味する。
【０１２０】
典型的には代謝性疾患は直接、肥満と関係がある。
【０１２１】
したがって、本発明の使用により調製される食品はまた、代謝性疾患の治療又は予防のために使用することができる。代謝性疾患は、例えば糖尿病、高血圧症、及び心臓血管疾患から成る群より選択されてもよい。
【０１２２】
当業者は、本明細書で記載の本発明の全ての特徴を、開示した本発明の範囲から逸脱することなく、自由に組み合わせできることを理解するであろう。特に、本発明の使用のために記載された特徴は、本発明の食品に適用してもよく、この逆も同様である。
【０１２３】
本発明の別の利点及び特徴は、以下の実施例及び図から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明で使用されるＰＰｆの２Ｄ−ＰＡＧＥ示す図である。
【図２】図１のゲルにおいて標識された蛋白質の定量化を示す図である。
【図３】ａ）インビトロのインテスティナルメディウム（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ）下での染色したＯ／Ｗエマルション滴から記録した、時間経過した一連の顕微鏡検査画像を示す図であり、ｂ）長時間に渡る正規化した平均液滴直径の減少として得られたエマルションの消化速度を示す図である。
【図４】水中油エマルション（ＭＣＴ／ＷＰＩ）の消化速度を示す図であり、この水中油エマルションに対して、腸の疑似インビトロ消化実験の実施中に同一濃度（ｗ／ｗ）で種々の異なる蛋白質がバルク水相に添加されていた。ＰＰＣは、従来のプロテオースペプトン画分であるが、ＰＰ画分は、本発明で使用されるプロテオースペプトン画分の略である。
【図５】水中油エマルション（ＭＣＴ／ＷＰＩ）の消化速度を示す図であり、この水中油エマルションに対して、腸の疑似インビトロ消化実験の実施中に同一濃度（ｗ／ｗ）で種々の異なる蛋白質がバルク水相に添加されていた。本発明で使用されるプロテオースペプトン画分（ＰＰ）及び従来のプロテオースペプトン画分（ＰＰＣ）の結果は、２つの異なる濃度（０．１２５ｗｔ％及び１．５ｗｔ％）で示されている。
【図６】インビトロ胃腸モデルであるＴＩＭの概略図である：（Ａ）胃コンパートメント、（Ｂ）十二指腸コンパートメント、（Ｃ）空腸コンパートメント、（Ｄ）回腸コンパートメント、（Ｅ）ガラスジャケット、（Ｆ）柔軟壁、（Ｇ）回転ポンプ、（Ｈ）幽門弁、（Ｉ）ｐＨ電極、（Ｊ）分泌ポンプ、（Ｋ）前置フィルター、（Ｌ）中空繊維膜、（Ｍ）空腸からの濾過液、（Ｎ）回腸の送り出し弁。
【図７】β−ＬＧ（白四角）及びＰＰ画分（黒四角）を有するひまわり油の消化実験についてのオクタデカン酸シグナルのピーク表面積を示す図である。表面積は、体積の相違について補正されている。
【実施例】
【０１２５】
プロテオースペプトン画分
１．本発明に対応するＰＰｆに富む画分の抽出
１１０ｋｇのプロラクタ９０（ロット７、Ｌａｃｔａｌｉｓ、Ｒｅｔｉｅｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、２３９０ｋｇの軟水（Ｎａ＋を１６０ｍｇ．Ｌ−１含有する）に１５℃で分散させた。これを、ｐＨプローブを装備した３０００Ｌ水槽内で一定の撹拌及び再循環の下で１時間維持した。結果、蛋白質分散液のｐＨは６．６８となり、全固形物含有量（ＴＳ）は４．５％となった。その後、約１０ｋｇの１ＭのＨＣｌを添加しｐＨを５．９５±０．０５に調整した。この特定のｐＨ値は、実験室規模の環境において軟水を使用したホエイ蛋白質凝集体（ＷＰＡ）の形成に最適であることが見出された（ＷＰＡの平均直径：２５０ｎｍ、５００ｎｍの濁度：＞７０）。最適ｐＨ値がこれらの処理条件下で非常に安定であることが見出された。その後、プロラクタ９０分散液を１２００Ｌ．ｈ−１の流速で汲み出し、８５℃で平板熱交換器を使用して熱処理し、続いて、１５分間保持し、４℃に冷却した。結果として生じたＷＰＡ含有ホエイ分散液（ＴＳは４．２％）を、４℃で貯蔵した。
【０１２６】
次に、全表面積が６．８ｍ２のＣａｒｂｏｓｅｐ Ｍ１４セラミック／カーボン膜（孔径０．１４ミクロン）２つを使用して、精密濾過（ＭＦ）により、５００ｋｇのＷＰＡ含有ホエイ分散液からＷＰＡを取り除いた。測定基準（ｍｏｄｕｌｅ）の温度は、５５℃の温度に設定し、圧力は２．３バールに設定した。透過液の流速は５時間の精密濾過後に約４００ｌ．ｈ−１に保った。主にＷＰＡを含有する、廃棄されることとなる保持液の最終全固形物（ＴＳ）は２０％だった。本発明のＰＰｆに対応する精密濾過透過液には全固形物含有量が約０．４３％あった。追加の濃縮工程で、精密濾過透過液をさらに１０℃で２０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、限外濾過プロセスにかけて、抽出物の乾燥量基準で、ＴＳを０．４３〜２．４％に増加させ、蛋白質含有量を１９〜８２％に増加させた。
【０１２７】
プロテオースペプトン画分による脂肪消化の遅延
インビトロ及びインビボ研究から、脂肪滴の大きさは、リパーゼ活性に影響することが知られている。したがって、本発明者らは、液滴の大きさの変動により生じるいかなる不具合も回避するために、且つ油滴の大きさに依存せずに脂肪消化速度を決定するために単分散Ｏ／Ｗエマルション（大きさ３７μｍ）のインビトロ実験を利用した。
【０１２８】
単分散Ｏ／Ｗエマルションは、テーパ毛細管からの油滴の破壊に基づく並行流方式で調製された。この方式は連続相として水−乳化剤溶液を含有する並行流に導入される。
【０１２９】
該インビトロ消化実験は、蛍光顕微鏡検査により実施された。時間経過した一連の画像が、消化力のあるインテスティナルメディウム（ｐＨ７、胆汁酸塩、及びＳｉｇｍａからの膵臓リパーゼＰ１７５０）における染色した（ナイルレッド染料による）エマルション滴から記録された。エマルション滴の大きさの減少における時間依存性を決定することにより、エマルションの消化速度が得られた。図３は、インビトロＧＩ条件下で、２時間に渡る時間をかけて顕微鏡検査により撮像された蛍光標識エマルションの典型的な一連の画像を示している（ａ）。（ａ）から、エマルションの消化速度が、時間に対する液滴直径の減少として得られる（ｂ）。
【０１３０】
１．プロテオースペプトン画分を有する油／水の界面の安定化による脂質の加水分解の遅延の証拠
Ｏ／Ｗ界面で、種々のタイプの乳蛋白質を有する単分散Ｏ／Ｗエマルションは、並行流方式で調製されてきた。中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）は、油相として使用されてきた。また、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、β−カゼイン（ＢＣＮ）、ホエイ蛋白質分離物（ＷＰＩ）及びプロテオースペプトン画分は、水相に溶解した安定剤として使用されてきた。インビトロ消化実験は、染められたエマルション滴を消化力のあるインテスティナルメディウム（胆汁酸塩、膵臓リパーゼの存在下、ｐＨ７で）に入れて実施されてきた。エマルション滴の大きさの減少（膵臓リパーゼによる油滴消化に起因する）の後に、２時間に渡る顕微鏡検査が実施され、エマルションの消化速度の曲線プロフィールが、長時間にわたる平均液滴直径として得られた。図４では、安定化していないＭＣＴ油（対照）の消化から得られた曲線プロフィールと共に４つのＯ／Ｗエマルションの消化速度が示されている。この対照実験のために、消化力のあるインテスティナルメディウムがＭＣＴ油に添加された。胆汁酸塩は、油の乳化を引き起こし（液滴の形成により顕微鏡下で見ることができる）、このことが、エマルション滴と同じ大きさを有する選択された油滴の蛍光実験の実施を可能にした。
【０１３１】
図４の結果は、ＭＣＴ油がプロテオースペプトン画分により安定化した場合、消化速度の低下の証拠となる。特に、ＭＣＴ油の場合、３０分後に油滴は初期直径の５０％が消滅したが、ＭＣＴ／ＷＰＩエマルションの場合は、約１時間３０分を必要とし、ＭＣＴ／プロテオースペプトン画分の場合は、３時間３０分を必要とすることが分かる。
【０１３２】
２．エマルションのバルク水相へのプロテオースペプトン画分の添加による脂質の加水分解の遅延の証拠は、プロテオースペプトン画分による油／水の界面が安定化していないことであった。
【０１３３】
単分散Ｏ／Ｗエマルション（ＭＣＴ／ＷＰＩ）が、前述の並行流方式で調製された。
【０１３４】
インビトロ消化実験は、比較蛋白質（アルブミン、ホエイ蛋白質分離物）及びプロテオースペプトン画分を添加したＭＣＴ／ＷＰＩエマルションについて、腸の模擬消化の条件下で実施された。図５では、ＭＣＴ／ＷＰＩエマルション（対照）の消化速度がバルク水相中で同一濃度（１．５％、ｗ／ｗ）で、アルブミン、ＷＰＩ及びプロテオースペプトン画分を添加したＭＣＴ／ＷＰＩエマルションの消化から得られた曲線プロフィールと共に示されている。図５のデータはまた、プロテオースペプトン（ＰＰ）画分が、蛋白質層で事前に被覆された油滴の水相に添加された場合の脂肪分解のより著しい遅延を示している。
【０１３５】
３．インビトロ胃腸モデルでのプロテオースペプトン画分による油／水の界面の安定化による脂質の加水分解の遅延の証拠
動的なインビトロ胃腸モデル（ＴＮＯ胃腸モデル１、ＴＮＯ製のＴＩＭ１、オランダ）が、トリグリセリドの消化に対するβ−ラクトグロブリン（β−ＬＧ、Ｂｉｏｐｕｒｅ）又はプロテオースペプトン画分（ＰＰｆ）の影響を評価するために使用された。このモデルは、胃、十二指腸、空腸、及び回腸を模擬した４つの連続したコンパートメントから成る（図６）。空腸及び回腸のコンパートメントは、各々濾過ユニット（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓのミニクロス（Ｍｉｎｉｋｒｏｓ）（登録商標）、Ｍ２０Ｓ−３００−０１Ｐ）に連結されている。回腸弁の後に、流出物が回収される。
【０１３６】
食事の調製
蛋白質（β−ＬＧ又はＰＰｆ）溶液をＰＢＳ（ｐＨ７）で調製し、この溶液をマグネティックスターラーで１時間撹拌した。ひまわり油（Ｃｏｏｐ ＡＧ、スイス）を、油１０％（ｗ／ｗ）及び蛋白質１％の濃度を得るような量で蛋白質溶液に加えた。この溶液を、５００ｒｐｍ／３分で最初のポリトロン処理（モデルＰＴ３１００Ｄ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＡＧ製）により乳化させ、次いでＲａｎｎｉｅホモジェナイザー（Ｍｉｎｉ−Ｌａｂ、型７．３０ ＡＰＶ製、スイス）に４００バールで、２度通過させることにより、マイクロ流動化させた。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ光散乱装置を使用して、得られたエマルションの液滴直径を測定し、粒径が０．１〜９．８μｍの間であるという結果を得た。
【０１３７】
６時間に渡るＴＩＭモデルでの実験で、食事の検査が行われ、脂肪食の摂取後の胃腸管の標準の生理学的条件を模擬した。最初の胃液量を模擬するために、胃液分泌物５ｍｌを食事に加えた。次に、食事を直接、胃のコンパートメントに導入した。胃液分泌物は、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で分泌される胃の電解質溶液（ＮａＣｌ ４．８ｇ／ｌ、ＫＣｌ ２．２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２ ０．２２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３ １．５ｇ／ｌ）中で、ペプシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ７０１２、６００Ｕ／ｍｌ）及びリパーゼ（Ａｍａｎｏ Ｆ−ＡＰ１５、４０Ｕ／ｍｌ）から成った。塩酸（１Ｍ）を分泌することにより、既定の曲線に従うようにｐＨを調節した。胃内容物の排出は、生体内データに従って実施された。
【０１３８】
十二指腸分泌物は、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量の新鮮なブタ胆汁、０．２５ｍｌ／ｍｉｎの流量の７％のパンクレアチン溶液（Ｐａｎｃｒｅｘ Ｖ粉末、Ｐａｉｎｅｓ＆Ｂｙｒｎｅ、ＵＫ）及び０．1５ｍｌ／ｍｉｎの流量の小腸の電解質溶液（ＳＩＥＳ：ＮａＣｌ、５ｇ／ｌ；ＫＣｌ、０．６ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２、０．２５ｇ／ｌ）から成った。空腸分泌液は、３．２ｍｌ／ｍｉｎの流量の１０％の新鮮なブタ胆汁を含有するＳＩＥＳから成った。回腸分泌液は、３．０ｍｌ／ｍｉｎの流量のＳＩＥＳから成った。
【０１３９】
十二指腸、空腸、及び回腸のコンパートメント内のｐＨを、１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液で調節して、設定値６．５、６．８及び７．２にした。実験を実施する前に、最初の腸の内容物の模擬のために、十二指腸コンパートメントを、ＳＩＥＳ１５ｇ、７％のパンクレアチン溶液１５ｇ、新鮮なブタ胆汁３０ｇ、及びトリプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ４６６５−５Ｇ）２ｍｇから成る溶液で満たした。空腸コンパートメントを、ＳＩＥＳ３０ｇ、７％のパンクレアチン溶液３０ｇ及び新鮮なブタ胆汁６０ｇから成る溶液で満たした。回腸コンパートメントを、ＳＩＥＳ溶液で満たした。
【０１４０】
実験中、空腸（ＦＪ）及び回腸（ＦＩ）からの濾液と流出物（Ｅｆｆ）を０〜２時間、２〜４時間、４〜６時間の間に回収し、遊離オクタデカン酸の含有量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した。
【０１４１】
インビトロ消化実験の濾液又は廃水試料１００μＬをクロロホルム９００μＬ及び０．１ＮのＨＣｌ １００μＬで希釈した。次に、試料を１０分間、１４０００ｒｐｍの速度で遠心分離機にかけた。有機相をＧＣで分析した。
【０１４２】
ＦＩＤ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ガスクロマトグラフィーにより、スプリットモードでＧＣ分析を実施した。長さ１５ｍ、内径０．２５ｍｍ、型番Ｊ＆Ｗ１２２−５７１１の無極性の溶融石英ＤＢ５−ＨＴカラムを使用した。実験中のガス流量はＦＩＤ検出器用に水素５０ｍＬ／ｍｉｎ、空気流量４５０ｍＬ／ｍｉｎ、及びカラム用に窒素４５ｍＬ／ｍｉｎであった。カラムの初期温度を、２分間４０℃に保ち、その後２０℃／ｍｉｎで温度を２２０℃まで上げ１分間保った後、再び１０℃／ｍｉｎの速度で最終温度３２０℃まで上げ、この温度を１０分間保った。
【０１４３】
同一手順に従って、オクタデカン酸シグナルの全体が、インストールされたソフトウェアＨＰＣＨＥＭを使用して測定され、標準を使用して同定された。
【０１４４】
図７は、数回の消化の後に、検査を経た３つの消化コンパートメント中でひまわり油の加水分解中に放出されるオクタデカン酸に相当する（量に比例する）表面積を示している。本発明によるプロテオースペプトン画分により安定化したエマルション中では、β−ラクトグロブリンにより安定化した対照エマルションと比較して、全体的に約３０％少ないオクタデカン酸が放出されたことが明白に認識され得る。この脂肪分解促進の低下は、脂肪酸の大部分が生体内で吸収される空腸コンパートメント及び回腸コンパートメントの両方で観察された。興味深いことに、両コンパートメントも、最初の２時間以内に、最も強く脂肪分解の低下（７５％）が起こった。ＰＰｆを使用した脂肪分解の低下の結果は、β−ＬＧの使用による調節と比較して、モデル消化システムの廃水コンパートメントにおけるオクタデカン酸の含有量（２５％）がより多いことで確証される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミネラル含有量を少なくとも２５％減少させた天然蛋白質水分散液のｐＨをｐＨ５．６〜８．４、又はｐＨ３．５〜５．０に調整するステップ、
前記天然蛋白質水分散液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とするステップと、
加熱後に、前記蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも９０重量％を除去するステップ、及び
前記分散液の残りの液体画分を回収するステップ
を含む方法により得ることができるプロテオースペプトン画分、及び少なくとも１つの脂質を含む食品であって、食品中の前記プロテオースペプトン画分及び前記少なくとも１つの脂質は、プロテオースペプトンを含有する少なくとも１つの被覆層を含む被覆油滴として、少なくとも部分的に提供される、食品。
【請求項２】
前記プロテオースペプトン画分及び前記少なくとも１つの脂質が、１：２〜１：２０００の範囲、好ましくは、１：１０〜１：１００の範囲の重量比で提供される、請求項１に記載の食品。
【請求項３】
プロテオースペプトンを含有する被覆層が外側の被覆層である、請求項１又は２に記載の食品。
【請求項４】
少なくとも１つの蛋白質画分を含有する少なくとも１つの更なる被覆層を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の食品。
【請求項５】
前記少なくとも１つの更なる被覆層に含有される前記蛋白質画分が、β−ラクトグロブリン、ホエイ蛋白質分離物又はβ−カゼインから成る群より選択される、請求項４に記載の食品。
【請求項６】
前記被覆油滴が０．１〜１００μｍの範囲、好ましくは１〜５０μｍの範囲の直径を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７】
前記被覆油滴の油とプロテオースペプトンの重量比が１：２〜１：２０００の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項８】
食品中の前記脂質の少なくとも５０重量％が被覆油滴として提供される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の食品。
【請求項９】
前記プロテオースペプトン及び前記脂質が少なくとも部分的にエマルションの形態で提供される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１０】
ヒト及び／又は動物の体重減少及び／又は体重維持の支援に使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１１】
肥満の治療又は予防に使用する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１２】
代謝性疾患の治療又は予防に使用する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１３】
前記代謝性疾患が糖尿病、高血圧症、及び心臓血管疾患から成る群より選択される、請求項１２に記載の食品。
【請求項１】
ミネラル含有量を少なくとも２５％減少させた天然蛋白質水分散液のｐＨをｐＨ５．６〜８．４、又はｐＨ３．５〜５．０に調整するステップ、
前記天然蛋白質水分散液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とするステップと、
加熱後に、前記蛋白質水分散液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも９０重量％を除去するステップ、及び
前記分散液の残りの液体画分を回収するステップ
を含む方法により得ることができるプロテオースペプトン画分、及び少なくとも１つの脂質を含む食品であって、食品中の前記プロテオースペプトン画分及び前記少なくとも１つの脂質は、プロテオースペプトンを含有する少なくとも１つの被覆層を含む被覆油滴として、少なくとも部分的に提供される、食品。
【請求項２】
前記プロテオースペプトン画分及び前記少なくとも１つの脂質が、１：２〜１：２０００の範囲、好ましくは、１：１０〜１：１００の範囲の重量比で提供される、請求項１に記載の食品。
【請求項３】
プロテオースペプトンを含有する被覆層が外側の被覆層である、請求項１又は２に記載の食品。
【請求項４】
少なくとも１つの蛋白質画分を含有する少なくとも１つの更なる被覆層を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の食品。
【請求項５】
前記少なくとも１つの更なる被覆層に含有される前記蛋白質画分が、β−ラクトグロブリン、ホエイ蛋白質分離物又はβ−カゼインから成る群より選択される、請求項４に記載の食品。
【請求項６】
前記被覆油滴が０．１〜１００μｍの範囲、好ましくは１〜５０μｍの範囲の直径を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７】
前記被覆油滴の油とプロテオースペプトンの重量比が１：２〜１：２０００の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項８】
食品中の前記脂質の少なくとも５０重量％が被覆油滴として提供される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の食品。
【請求項９】
前記プロテオースペプトン及び前記脂質が少なくとも部分的にエマルションの形態で提供される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１０】
ヒト及び／又は動物の体重減少及び／又は体重維持の支援に使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１１】
肥満の治療又は予防に使用する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１２】
代謝性疾患の治療又は予防に使用する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１３】
前記代謝性疾患が糖尿病、高血圧症、及び心臓血管疾患から成る群より選択される、請求項１２に記載の食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０２２０８（Ｐ２０１３−５０２２０８Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５１２８（Ｐ２０１２−５２５１２８）
【出願日】平成２２年８月１０日（２０１０．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６１５８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２０７３６
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１０日（２０１０．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６１５８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２０７３６
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
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