ペプチド及びその使用
細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼ活性の阻害方法、並びに癌及び炎症性疾患などの疾患の治療における該方法の使用が記載される。該方法は、カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む。特定の実施形態では、プロペプチドはカテプシンＳプロペプチドである。さらに、Ｆｃタンパク質を有するプロペプチドの使用が記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ペプチド及び治療方法におけるその使用に関する。特に、本出願は、カテプシンプロペプチド、この製造方法及び該プロペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、全遺伝子産物の約２％を占めるタンパク質の大きな集団である（Ｒａｗｌｉｎｇｓ及びＢａｒｒｅｔｔ、１９９９年）。プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、全ての細胞及び生物が適切に機能するために不可欠である。タンパク質分解処理事象は、骨形成、創傷治癒、血管新生及びアポトーシスを含む様々な細胞プロセスにおいて重要である。
【０００３】
リソソームシステインプロテアーゼは、当初、リソソームでのタンパク質の非選択的分解を司る酵素であると考えられた。通常はリソソームでの局在化に関連することから、これらのプロテアーゼは、最初、エンドソーム区画でのタンパク質の非選択的分解に関与するのみであると考えられた。しかし、これらは今では、幾つかの特定の細胞プロセスにおいて説明することができ、抗原提示（Ｈｏｎｅｙ及びＲｕｄｅｎｓｋｙ、２００３年；Ｂｒｙａｎｔ及びＰｌｏｅｇｈ、２００４年）アポトーシス（Ｚｈｅｎｇら、２００５年；Ｂｒｏｋｅｒら、２００５年）、プロホルモンプロセシング（Ｈｏｏｋら、２００４年）及び細胞外マトリックスリモデリング（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９４年；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７年）において役割を果たすことが知られている。
【０００４】
カテプシンは、タンパク質分解酵素である。今までに、１１種類のヒトカテプシンが同定されているが、各々のインビボでの特異的役割は、未だに決定されていない（Ｋａｔｕｎｕｍａら、２００３年）。カテプシンＢ、Ｌ、Ｈ、Ｆ、Ｏ、Ｘ及びＣは、ほとんどの細胞で発現され、タンパク質代謝回転の制御に役割を果たす可能性が示唆されているのに対し、カテプシンＳ、Ｋ、Ｗ及びＶは、特定の細胞及び組織に限定されており、これらはより特異的な役割を果たす可能性が示されている（Ｋｏｓら、２００１年；Ｂｅｒｄｏｗｓｋａ、２００４年）。カテプシンＬ様プロテアーゼ（ＣａｔＬ、Ｓ及びＫを含む）は、システインプロテアーゼのＣＡ族に属するタンパク質分解酵素である。これらのリソソームプロテアーゼの各々は、様々な腫瘍の進行に関与している。腫瘍細胞からのこれらの異常に高い分泌は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解をもたらすと考えられる。エラスチン及びコラーゲンなどのＥＣＭ構成成分のこの異常分解は、周辺正常組織へのこれらの異常細胞の浸透及び浸潤を加速する。
【０００５】
カテプシンＬ様プロテアーゼは、Ｎ末端プロペプチドドメインを含有する不活性前駆体として生成される。このプロペプチドは、新生プロテアーゼのフォールディングのためのシャペロンとしても、活性種の阻害物質としても作用し、未成熟リソソームにおける該プロテアーゼの活性部位に結合することが以前に示されている。阻害試験は、ＣａｔＳプロペプチド（ＣａｔＳＰＰ）が活性化ＣａｔＳに対する低ナノモル範囲のＫ１を有すること、並びに恐らく驚くべきことに、ＣａｔＫ及びＣａｔＬに対する同様の特性も有することを示したが、相同性の低いＣａｔＢ、ＣａｔＨ又はパパインには影響しないことも示された。さらに、Ｋ及びＬのプロペプチドが、同族ファミリーメンバーの各々に対し同様の均一な阻害プロファイルを持たないという点で、ＣａｔＳＰＰのこの特性は独特である。
【０００６】
ＣａｔＳ（カテプシンＳ）は、元々、ウシのリンパ節及び脾臓から同定され、ヒト型は、ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた（Ｓｈｉら、１９９２年）。ＣａｔＳをコードする遺伝子は、ヒト染色体１ｑ２１に位置する。ＣａｔＳ遺伝子にコードされた９９６塩基対転写物は、最初に分子量３７．５ｋＤａを有するプロセシングされていない前駆体タンパク質に翻訳される。プロセシングされていないタンパク質は、３３１個のアミノ酸から成り、１５個のアミノ酸はシグナルペプチド、９９個のアミノ酸はプロペプチド配列及び２１７個のアミノ酸はペプチドである。ＣａｔＳは初めにシグナルペプチドにより発現され、シグナルペプチドは小胞体内腔に入った後除去される。プロペプチド配列は、プロテアーゼの活性部位に結合し、酸性のエンドソーム区画へ輸送されるまでこれを不活化する。この後、プロペプチド配列は除去され、プロテアーゼは活性化される（Ｂａｋｅｒら、２００３年）。
【０００７】
ＣａｔＳは、抗原添加前のインバリアント鎖の切断により、主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）によって媒介される抗原提示における重要な酵素として同定された。複数の研究が、ＣａｔＳが欠損したマウスは、ＡＰＣによる外因性タンパク質を提示する能力が損なわれることを示している（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９９年）。インバリアント鎖ＩｉのプロセシングにおけるＣａｔＳの特異性は、喘息及び自己免疫障害などの状態の治療においてＣａｔＳ特異的治療標的を可能にする（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７年）。
【０００８】
カテプシンＬは、元々、ラット肝臓リソソームから単離された後、１９８８年にヒト型が同定された（Ｇａｌ及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ、１９８８年；Ｊｏｓｅｐｈら、１９８８年）。ＣａｔＬをコードする遺伝子は、ヒト染色体９ｑ２１〜２２にマッピングされ（Ｆａｎら、１９８９年；Ｃｈａｕｈａｎら、１９９３年）、８つのエキソン及び７つのイントロンから成る。遺伝子産物は、分子量３９ｋＤａを有するプレプロタンパク質に翻訳され、２つの酵素活性アイソフォーム、すなわち３１ｋＤａの一本鎖型、並びに２４ｋＤａの重鎖及び５ｋＤａの軽鎖から成る二本鎖型にプロセシングされる（Ｍａｓｏｎら、１９８９年）。成熟活性酵素へのプロＣａｔＬのプロセシングは、自己触媒的活性（Ｓａｌｍｉｎｅｎ及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ、１９９０年）を含む様々な機構を介して、及びＣａｔＤ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８９年；Ｗｉｅｄｅｒａｎｄｅｒｓ及びＫｉｒｓｃｈｋｅ、１９８９年）又はメタロエンドペプチダーゼ（Ｈａｒａら、１９８８年）の活性により起こり得る。
【０００９】
ＣａｔＬは、エンドペプチダーゼ活性を有し、Ｐ２及びＰ３位置で疎水性アミノ酸残基とのペプチド結合を優先的に切断する（Ｋａｒｇｅｌら、１９８０年、１９８１年）。ＣａｔＬは、幾つかのタンパク質をカテプシンＳと同じ特異的活性により加水分解することが示されている（Ｋｉｒｓｃｈｋｅら、１９８９年）。しかし、ＣａｔＬは、Ｐ２位置では芳香族残基を好み、密接に関連したカテプシンＳ及びＫとは異なる（ＭｃＧｒａｔｈ、１９９９年）。
【００１０】
ＣａｔＬは、リソソームタンパク質分解及び骨吸収を含む多くの生物学的プロセス、並びに関節炎及び悪性腫瘍などの幾つかの疾患で主要な役割を果たすと提唱されている（Ｒｕｋａｍｐ及びＰｏｗｅｒｓ、２００２年）。抗原提示におけるリソソームシステインプロテアーゼの役割は、過去数年間で広く研究が行われた。ＣａｔＬは、このプロセスに、皮質胸腺上皮細胞でＩｉタンパク質分解の最終ステップを行うＣａｔＬの能力を介して関与している。さらなるエビデンスは、Ｉｉ鎖のｐ４１アイソフォームが、成熟ＣａｔＬタンパク質と相互作用することができ、この活性を阻害しこれを中性ｐＨ環境に安定させることを示した（Ｏｒｇａｎｉｃら、１９９３年；Ｂｅｖｅｃら、１９９６年）。ＣａｔＬ欠損マウスに関する複数の研究は、胸腺の皮質上皮細胞ではインバリアント鎖を分解できないことが観察され（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９８年）、ＣＤ４＋Ｔ細胞選択において明らかな欠陥を示した（Ｒｏｔｈら、２０００年）。カテプシンＬを欠くマウスは、毛包の形態形成の変化により周期的な脱毛及び表皮過形成も発症した。
【００１１】
腫瘍浸潤及び転移におけるＣａｔＬの役割も、ＣａｔＬの普遍的な発現並びに細胞外マトリックス及び基底膜のコンポーネントを分解する能力のため、極めて詳細に研究されている。ＣａｔＬ発現レベルの上昇は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌及び星状細胞腫を含む様々な悪性腫瘍と関連している。
【００１２】
最近のエビデンスは、ＣａｔＬが転写活性化因子として機能する可能性があることも示唆した。ＣａｔＬの別のアイソフォームが以前に報告されているが（Ｒｅｓｃｈｅｌｅｉｔら、１９９６年；Ｓｅｔｈら、２００３年）、Ｎ末端シグナルペプチドを欠いたアイソフォームは核に局在化することが示され、ＣＤＰ／Ｃｕｘ転写因子のプロセシングにおけるＣａｔＬの役割を示唆している。この理論は、ＣＤＰ／Ｃｕｘプロセシングが著しく低下するように思われた、ＣａｔＬ欠損線維芽細胞に関する研究により強化された（Ｇｏｕｌｅｔら、２００４年）。
【００１３】
カテプシンＫは、１９９４年にウサギｃＤＮＡから初めてクローニングされた（Ｔｅｚｕｋａら、１９９４年）後、幾つかの独立グループによりこの翌年にヒトオルソログが記述された（Ｂｒｏｍｍｅら、１９９５年；Ｓｈｉら、１９９５年；Ｉｎａｏｋａら、１９９５年）。ＣａｔＫをコードする遺伝子は、ＣａｔＳと同じ遺伝子座であるヒト染色体１ｑ２１に位置しており、これら２つのプロテアーゼが共通起源を有する可能性があることを示唆している。ＣａｔＫのプロモーター構造は、ＴＡＴＡボックスは無いが２つのＡＰ−１部位があるＣａｔＳのプロモーター構造と類似しており、両者は限定された発現パターンを示す遺伝子の共通の特徴を有する。ヒトＣａｔＫ発現は限局的であることが示されており、大部分は破骨細胞及び卵巣で見出される（Ｂｒｏｍｍｅら、１９９５年；Ｄｒａｋｅら、１９９６年）。
【００１４】
ＣａｔＫのアミノ酸配列は、カテプシンＳ及びＬと高い配列類似性を示し（それぞれ５２％及び４６％）、これら３つの遺伝子は共に、哺乳動物リソソームシステインプロテアーゼ内で小さなサブファミリーを形成する。ＣａｔＫは、ｐＨ５．５で膵エラスターゼよりも大きな活性を有する、最も強力なエラスチン分解酵素の１つとして特徴付けられている（Ｂｒｏｍｍｅら、１９９６年；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７年）。ＣａｔＫは、コラーゲンタイプＩ、ＩＩ及びＩＶの加水分解を触媒することもできる（Ｋａｆｉｅｎａｈら、１９９８年）。
【００１５】
ＣａｔＫのコラーゲン分解活性の生理的関連性は、骨障害である濃化異骨症との関連を通じて説明される（Ｇｅｌｂら、１９９６年）。濃化異骨症は、骨硬化症及び重度の骨異形成を特徴とする常染色体劣性形態である。骨粗鬆症は、骨吸収及び骨形成の間のバランスが乱され、吸収が有利に働く場合に起こる。吸収は、結合部位に酸性環境をもたらす破骨細胞により媒介され、破骨細胞の結合部位では、基質のタンパク質分解が生じる。ＣａｔＫは、濃化異骨症患者におけるナンセンス変異、ミスセンス変異及びストップコドン変異の同定により、このプロセスに関与していた（Ｇｅｌｂら、１９９６年）。ＣａｔＫノックアウトマウスも、破骨細胞における基質分解活性の低下を示すが、マウス表現型はヒト条件より重度ではない（Ｓａｆｔｉｇら、１９９８年）。
【００１６】
ＣａｔＫ発現は、破骨細胞系では炎症部位で及びレチノイン酸によりアップレギュレートされるように思われる（Ｓａｎｅｓｈｉｇｅら、１９９５年）。ＣａｔＫ発現は、骨癌、前立腺癌及び乳癌の巨細胞腫（Ｂｒｕｂａｋｅｒら、２００３年；Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ−Ｅｖａｎｓら、１９９７年）並びに関節リウマチ患者の滑膜線維芽細胞（Ｈｕｍｍｅｌら、１９９８年）で検出されている。
【００１７】
カテプシンＶは、ＣａｔＬとの相同性が極めて高い（７８％）システインプロテアーゼとしてヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから初めて同定された（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、１９９８年）。さらに、ＣａｔＶをコードする遺伝子は、ヒト染色体９ｑ２１〜２２に、ＣａｔＬに隣接してマッピングされた。ＣａｔＬとＶ遺伝子との間の高い相同性及び近い近接性は、２つのプロテアーゼが共通の先祖の前駆体から進化した可能性があることを示唆する（Ｉｔｏｈら、１９９９年；Ｂｒｏｍｍｅら、１９９９年）。しかし、ＣａｔＬで観察された広範な発現パターンが、胸腺、精巣及び角膜上皮に発現が限定されるＣａｔＶに模倣されることはなかった（Ａｄａｃｈｉら、１９９８年、Ｂｒｏｍｍｅら、１９９９年、Ｔｏｌｏｓａら、２００３年）。このプロテアーゼの限定された組織発現は、特殊化された機能を示すものであり、ＣａｔＶは、特定の細胞タイプにおけるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示に不可欠であると考えられる（Ｓｈｉら、１９９９年；Ｔｏｌｏｓａら、２００３年）。他のヒトカテプシンとの配列アラインメントは、ＣａｔＶをＣａｔＬ、Ｓ及びＫと同じヒトＣ１ペプチダーゼ系統枝に位置づけた（Ｂｕｈｌｉｎｇら、２０００年）。
【００１８】
カテプシンの病理学的関連性
プロテアーゼ発現パターンの変化は、多くのヒト病理過程の基礎をなす。カテプシンの脱制御された（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）発現及び活性は、神経変性障害、自己免疫疾患及び腫瘍形成を含む一連の状態と関連があった。
【００１９】
ＣａｔＳアップレギュレーションは、幾つかの神経変性障害と関連があった。ＣａｔＳは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からのβペプチド（Ａβ）産生に関与すると考えられ（Ｍｕｎｇｅｒら、１９９５年）、ＣａｔＳの発現は、アルツハイマー病及びダウン症候群の両方でアップレギュレートされることが示された（Ｌｅｍｅｒｅら、１９９５年）。ＣａｔＳは、多発性硬化症の病因に関与している可能性のある自己抗原である、ミエリン塩基性タンパク質を分解するＣａｔＳの能力を介して多発性硬化症（Ｂｅｃｋら、２００１）及びクロイツフェルト−ヤコブ病にも関与している可能性があり、クロイツフェルト−ヤコブ病患者では、ＣａｔＳ発現は、４倍を超えて増加することが示された（Ｂａｋｅｒら、２００２年）。
【００２０】
異常ＣａｔＳ発現は、アテローム性動脈硬化症とも関連があった。ＣａｔＳ発現は、正常な動脈ではごくわずかであるが、ヒトアテロームは強力な免疫反応性を示す（Ｓｕｋｈｏｖａら、１９９８年）。ＣａｔＳ及びＬＤＬ受容体の両方が欠損した、ノックアウトマウスを用いたさらなる研究は、アテローム性動脈硬化症の発症が有意に少ないことを示した（Ｓｕｋｈｏｖａら、２００３年）。さらなる研究は、炎症性筋疾患及び関節リウマチとＣａｔＳ発現を関連づけた。炎症性筋疾患患者由来の筋生検標本は、対照筋切片と比べてＣａｔＳ発現が１０倍に増加しており（Ｗｉｅｎｄｌら、２００３年）、ＣａｔＳ発現レベルは、変形性関節症患者と比べて関節リウマチ患者由来の滑液で有意に高かった（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００１年）。
【００２１】
ＣａｔＳの役割は、特定の悪性腫瘍においても研究された。ＣａｔＳ発現は、正常組織と比べて肺腫瘍切片及び前立腺癌切片で有意に高いことが示され（Ｋｏｓら、２００１年、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００１年）、ＣａｔＳが腫瘍浸潤及び疾患進行に関与している可能性のあることが示唆された。
【００２２】
本研究所でのＣａｔＳに関する最近の研究は、ヒト星状細胞腫におけるＣａｔＳ発現の重要性を立証した（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００３年；Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００６年）。免疫組織化学分析は、ＷＨＯグレードＩ〜ＩＶ由来のヒト星状細胞腫生検標本パネルでＣａｔＳ発現を示したが、正常な星状膠細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト及び内皮細胞を欠如するように思われた。ＣａｔＳ発現は、グレードＩＶ腫瘍で最も高いように思われ、細胞外活性レベルは、グレードＩＶ腫瘍由来の培養物において最大であった。
【００２３】
ＣａｔＳは、ラミニン、コラーゲン、エラスチン及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンなどのＥＣＭ巨大分子の分解に活性であることが示され（Ｌｉｕｚｚｏら、１９９９年）、Ｕ２５１ＭＧグレードＩＶグリア芽腫細胞系を用いた浸潤アッセイは、ＣａｔＳ阻害剤ＬＨＶＳ２９の存在下では浸潤が最大６１％減少することを示した（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００３年）。これは、ＣａｔＳが、星状細胞腫における腫瘍浸潤プロセスで重要な役割を果たしている可能性があり、したがって抗浸潤治療の標的となり得ることを示唆する。
【００２４】
ＣａｔＬもまた、腫瘍形成を含む一連の異なる病的状態において重要な役割を果たすことが見出された。ＣａｔＬノックアウトマウスの作製は、表皮恒常性、毛周期の調節、及び胸腺の皮質上皮細胞でのＭＨＣクラスＩＩ媒介抗原提示における重大な役割を明らかにした。
【００２５】
ＣａｔＫ発現は、以前に、骨粗鬆症及び特定の悪性腫瘍を含む一連の異なる病態と関連づけられた。稀な骨格状態である、濃化異骨症は、ＣａｔＫの欠損が原因である。ＣａｔＫは通常、タイプ１コラーゲン及び他の骨タンパク質を分解するために機能する（Ｍｏｔｙｃｋｏｖａ及びＦｉｓｈｅｒ、２００２年）。濃化異骨症患者由来の破骨細胞は、カテプシンＫ遺伝子内の突然変異による機能障害である（Ｇｅｌｂら、１９９６年）。
【００２６】
ＣａｔＫ発現は、肺腺癌と関連しているが、非浸潤性気管支肺胞癌を欠いており、肺癌の浸潤性増殖の潜在的マーカーの役目をする（Ｒａｐａら、２００６年）。さらに、ＣａｔＫもまた、骨の巨大細胞腫における主要なプロテアーゼとして同定され（Ｌｉｎｄｅｍａｎら、２００４年）、乳癌との関連（Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ−Ｅｖａｎｓら、１９９７年）が示された。したがって、ＣａｔＫ阻害剤の開発は、特に骨粗鬆症、骨転移及び多発性骨髄腫など、過剰な破骨細胞活性化及び骨吸収を来す病的状態において大きな可能性を有する。
【００２７】
ＣａｔＶは、元々、ＣａｔＬとの相同性が極めて高い（７８％）システインプロテアーゼとして結腸直腸癌及び乳癌、並びに特定の卵巣癌及び腎細胞癌で同定された（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、１９９８年）。さらに、ＣａｔＶの遺伝子は、ヒト染色体９ｑ２１〜２２に、ＣａｔＬに隣接してマッピングされた。これらのコード遺伝子の高い相同性及び近い近接性は、２つのプロテアーゼが共通の先祖の前駆体から進化した可能性があることを示唆する（Ｉｔｏｈら、１９９９年；Ｂｒｏｍｍｅら、１９９９年）。しかし、ＣａｔＬが広範な組織発現を有するのに対し、ＣａｔＶは通常、胸腺、精巣及び角膜上皮に限定される（Ａｄａｃｈｉら、１９９８年、Ｂｒｏｍｍｅら、１９９９年）。このプロテアーゼの限定された組織発現は、特殊化された機能を示すものであり、ＣａｔＶは、特定の細胞タイプにおけるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示に不可欠であると考えられる（Ｓｈｉら、１９９９年；Ｔｏｌｏｓａら、２００３年）。
【００２８】
カテプシンＬ様プロテアーゼの発現及び活性の増加は、一連の疾患で観察されており、これらの病因に関与していた。したがって、これらのプロテアーゼを特異的に標的にする阻害剤の生成は、治療薬としての可能性を有する。
【００２９】
カテプシンＬ様プロテアーゼの阻害
プロテアーゼが過剰発現されている場合、治療戦略はこの酵素活性を遮断する阻害剤の開発が中心であった。カテプシンに対する特定の小分子阻害剤の生成は、選択性及び特異性の問題のため困難であることが過去に判明している。ＣａｔＳに対する強力な可逆的阻害剤としてＷａｌｋｅｒらにより開発されたジペプチドα−ケト−β−アルデヒドは、ＣａｔＢ及びＬの阻害能力を有してはいたが、効率が低く（Ｗａｌｋｅｒら、２０００年）、ＣａｔＳ阻害剤４−モルホリンウレア−Ｌｅｕ−ＨｏｍｏＰｈｅ−ビニルスルホン（ＬＨＶＳ）も、高濃度で使用した場合、他のカテプシンを阻害することが示された（Ｐａｌｍｅｒら、１９９５年）。
【００３０】
ＣａｔＬ様プロテアーゼ向けの小分子阻害剤の開発は、可逆的阻害剤及び不可逆的阻害剤のいずれも十分に記述されている。こうした化合物の臨床応用は、乏しい特異性、正常組織でのプロテアーゼ阻害、及びバイスタンダータンパク質に反応する可能性のため問題がある（Ｔｕｒｋら、２００４年）。したがって、分泌されたタンパク質分解活性のみを標的にできる代替戦略が魅力的である。さらに、プロテアーゼのこのサブファミリーに高い選択性を有するが、このグループ内での特異性が幅広い阻害剤は、遺伝子ノックアウト試験から明らかになった機能の重複のため、より有用であることが判明する可能性がある（Ｓａｆｔｉｇら、１９９８年；Ｎａｋａｇａｗａら、１９９８年；Ｎａｋａｇａｗａら、１９９９年）。
【００３１】
特徴付けられた全プロペプチドのうち、ＣａｔＳＰＰは、ＣａｔＳに加えてＣａｔＬ及びＣａｔＫ双方の同様に効果的な阻害剤であることから、最も興味深い阻害動態プロファイルを有する。Ｍａｕｂａｃｈ及び共同研究者は競合的酵素結合アッセイにおいて、ＣａｔＳＰＰが、ＣａｔＳ（Ｋｉ０．２７ｎＭ）及びＣａｔＬ（Ｋｉ０．３６ｎＭ）の等効力の阻害剤であることを示した（Ｍａｕｂａｃｈら、１９９７年）のに対し、より最近の研究は、ＣａｔＳＰＰが実際はＣａｔＳ（Ｋｉ７．６ｎＭ）よりもＣａｔＬ（Ｋｉ０．４６ｎＭ）のより強力な阻害剤であり、ＣａｔＫ（Ｋｉ７．０ｎＭ）に対しほぼ同じ効果を有することを示唆している（Ｇｕａｙら、２０００年）。
【００３２】
上述の通り、通常では、天然プロペプチドであるカテプシンの活性化は、コンフォメーション変化を受け、放出される。放出後、プロペプチドは不要になると推測される。
【発明の開示】
【００３３】
本発明者らは、驚くべきことに、外因的に適用したカテプシンＳプロペプチド（ＣａｔＳＰＰ）が、浸潤癌モデルにおいてカテプシンＬ様プロテアーゼ活性に対し強力な特異的阻害作用を有することを示した。システインカテプシンプロテアーゼがインビボで活性化されると、レムナントプロペプチドフラグメントは不要となり、該プロテアーゼに対しもはや効果をもたらすことはできないと考えられることから、この結果は特に予想外であった。インビボでの同じ条件下では、外因的に付加したプロペプチドは、なんの効果も持たないと考えられている。さらに、プロペプチドは本来塩基性であることから、細胞内及び細胞上に存在するトリプシン様活性は、いずれの外因性プロペプチドも分解すると予想されよう。
【００３４】
これらの結果は、予測に反して、カテプシンプロペプチドが癌細胞の浸潤又は転移の進行を弱めるのに使用でき、故に治療の状況で使用できることを示している。
【００３５】
したがって、本発明の第１の態様では、細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼ活性の阻害方法であって、前記細胞又は組織へのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法が提供される。
【００３６】
１つの実施形態では、方法はインビトロである。別の実施形態では、方法はインビボである。
【００３７】
活性は完全に又は部分的に阻害され得る。故に方法は、正常活性に対する異常活性を減少させるのに使用され得る。
【００３８】
本発明の第２の態様では、細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現の阻害方法であって、前記細胞又は組織へのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法が提供される。
【００３９】
さらなる態様では、カテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現及び／又は異常活性に関連した状態の治療を必要とする患者におけるこの状態の治療方法であって、カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法が提供される。
【００４０】
さらに、医薬に使用するためのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸が提供される。
【００４１】
本発明はさらに、カテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現及び／又は異常活性に関連した状態の治療に使用するためのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸を提供する。
【００４２】
また、カテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現及び／又は異常活性に関連した状態を治療するための医薬品の製造におけるカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の使用も提供される。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００４４】
カテプシンＬ様プロテアーゼは、カテプシンＬプロテアーゼ、カテプシンＳプロテアーゼ、カテプシンＫプロテアーゼ及びカテプシンＶプロテアーゼから成る。
【００４５】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドは、任意の種のカテプシンプロペプチドであってもよい。１つの実施形態では、種は、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの哺乳動物種である。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、例えばアクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を有する（図３に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１３から１０９として再現された）ヒトカテプシンプロペプチドなどのヒトカテプシンプロペプチドである。
【００４６】
本発明の状況では、カテプシンプロペプチドには、野生型哺乳動物カテプシンプロペプチドのアミノ酸配列又はこのフラグメント若しくは誘導体を含むカテプシンプロペプチドが含まれる。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、野生型哺乳動物カテプシンプロペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドから成る。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド又はこの誘導体若しくはフラグメントは、例えば、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸１７から１１３から成る（図３ｂに示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１３から１０９として再現された）カテプシンＳプロペプチドである。
【００４８】
カテプシンプロペプチドは、例えばポリＨｉｓタグなどのタグを組み込み得る。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、図３ｂのアミノ酸配列１〜１１８として示されたようなポリＨｉｓタグを有するカテプシンプロペプチドである。
【００４９】
実施例に記載の通り、抗体Ｆｃ部分に融合されたカテプシンプロペプチドを用いる場合、腫瘍浸潤の特に強力な阻害は、腫瘍浸潤アッセイで立証された。カテプシンプロペプチドをＦｃ部分との融合ペプチドとして提供することで、分子の形は変化すると予測されたことから、カテプシンプロペプチドが浸潤を阻害する能力を保持しただけでなく、この阻害活性がＦｃ部分の無いカテプシンプロペプチドの活性よりも有意に高かったことは特に驚きであった。
【００５０】
したがって、本発明の１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは抗体Ｆｃ部分を含む。１つのこうした実施形態では、Ｆｃ部分は、例えばマウスＩｇＧタイプｂ Ｆｃ部分などのＩｇＧタイプｂ Ｆｃ部分である。
【００５１】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドは、カテプシンＬ様プロテアーゼの異常発現が関連した任意の状態の治療において使用され得る。例えば、本発明が使用され得る状態には、腫瘍性疾患、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、喘息、又はアテローム性動脈硬化症が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態では、状態は、カテプシンＳの過剰発現及び／又は異常活性に関連した状態である。
【００５２】
各々の他の態様に関しては、状況が特に求めない限り必要に応じて変更を加えることが、本発明の各態様の好ましい特徴である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
上述の通り、及び実施例で立証されている通り、本発明者らは、予想に反して、カテプシンプロペプチドがカテプシンＬ型プロテアーゼ活性を、特にＣａｔＳ、ＣａｔＬ、ＣａｔＶ及びＣａｔＫの活性を強力に阻害する働きがあることを腫瘍浸潤アッセイで示し、並びにカテプシンプロペプチドが、修正ボイデンチャンバー浸潤アッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）を用いた乳癌、結腸癌、前立腺癌及び星状細胞腫モデルにおいて腫瘍浸潤を強力に遮断することを示した。これらの結果は、この分子が腫瘍形成に対し、浸潤性又は転移性癌細胞の進行を減弱する効果を有することを立証するものである。
【００５４】
カテプシンプロペプチド
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドは、例えば哺乳動物種など、任意の種のカテプシンプロペプチドであってよい。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、例えばＭ９０６９６のアミノ酸残基１７から１１３の配列に相当する配列を有するアミノ酸（図３ｂに示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１３から１０９として再現された）を含むカテプシンプロペプチドなどの、ヒトカテプシンプロペプチドである。
【００５５】
本発明の状況では、カテプシンプロペプチドには、野生型哺乳動物カテプシンプロペプチドのアミノ酸配列又はこのフラグメント若しくは誘導体を含むカテプシンプロペプチドが含まれる。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、野生型哺乳動物カテプシンプロペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドから成る。
【００５６】
１つの実施形態では、本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド又はこの誘導体若しくはフラグメントは、カテプシンＬ型プロテアーゼプロペプチドである。例えば、本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド又はこの誘導体若しくはフラグメントは、カテプシンＳプロペプチドであってよい。
【００５７】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドのフラグメントとは、一般に少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の、例えば、野生型カテプシンプロペプチドの少なくとも５０個以上の連続するアミノ酸といった、少なくとも３０個など、典型的には少なくとも２０個の隣接するアミノ酸の、アミノ酸残基の一続きを意味する。
【００５８】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドの「誘導体」とは、典型的には、野生型カテプシンプロペプチドと比べ、アミノ酸配列を改変することで、例えば、該タンパク質をコードする核酸の操作により、又は該タンパク質自体を変化させて修飾されるポリペプチドを意味する。こうした誘導体は、１個又は複数個のアミノ酸の挿入、付加、欠失及び／又は置換を伴い得る。１つの実施形態では、誘導体は、例えば１５個以下など２５個以下のアミノ酸の、例えば１個又は２個のアミノ酸のみなど５個以下のアミノ酸といった、典型的には１０個以下のアミノ酸の、挿入、付加、欠失及び／又は置換を含み得る。カテプシンプロペプチドペプチドの誘導体は、天然アミノ酸以外のアミノ酸又は置換アミノ酸を含有し得る。例えば、誘導体はペプチド模倣剤から得ることができる。
【００５９】
本発明の１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドはＦｃ部分を含む。
【００６０】
本発明で使用され得るカテプシンプロペプチドのフラグメント又は誘導体は、好ましくはカテプシンプロペプチド機能活性を保持する。前記活性は、例えば修正ボイデンチャンバー浸潤アッセイを用いる、例えば腫瘍モデルにおいて、腫瘍浸潤を阻害する能力である。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドフラグメント又は誘導体は、野生型ヒトカテプシンプロペプチドの腫瘍浸潤阻害活性の少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％を保持する。
【００６１】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド、フラグメント及び誘導体は、当技術分野で既知の任意の方法を用いて生成され得る。
【００６２】
しかし、本発明者らは、カテプシンプロペプチドの簡易化組換え製造のための新規な簡易化方法を開発した。実施例に示された通り、本発明者らは、組換えカテプシンプロペプチドが、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグによりうまく発現され得、リフォールド金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて精製され得ることを立証した。
【００６３】
したがって、本発明の１つの態様では、カテプシンプロペプチドは、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を含む精製ステップを伴う方法により製造される。
【００６４】
実際、本発明のさらなる独立した態様では、カテプシンプロペプチドの組換え製造方法が提供される。前記方法は、Ｎ末端ポリヒスチジンタグによるカテプシンプロペプチドの発現、及び金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いた発現プロペプチドの精製を含む。１つの実施形態では、プロペプチドは尿素含有緩衝液の存在下で精製される。
【００６５】
ＩＭＡＣの原理は、一般に当業者に理解されている。吸着は、吸着マトリックスでのキレート化により固定化された金属イオンと、結合するタンパク質表面の接近可能な電子供与アミノ酸との間の金属配位複合体の形成が前提になると考えられる。
【００６６】
同様に、組換えタンパク質へのポリヒスチジンタグの付加は、当技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第４，５６９，７９４号を参照のこと）。
【００６７】
核酸
本発明の、及び本発明で使用するための核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。核酸は、組換え的に、合成的に、又は標準的方法を用いたクローニングを含む、当業者に利用可能な任意の手段により製造され得る。
【００６８】
核酸は、任意の適切なベクターに挿入され得る。１つの実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、核酸は、宿主細胞での核酸発現を提供できる対照配列に操作可能に結合される。様々なベクターが使用され得る。例えば、適切なベクターには、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）；酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド、又はコスミドＤＮＡが含まれる。
【００６９】
ベクターは、核酸を宿主細胞に導入するのに使用され得る。様々な宿主細胞が、本発明で使用するための核酸の発現に使用され得る。本発明で使用するための適切な宿主細胞は、原核生物又は真核生物であってよい。これらには、例えば大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が含まれる。使用され得る哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、サル及びヒト細胞系及びこの誘導体並びに多くの他の細胞系が含まれる。
【００７０】
遺伝子産物の発現を調節し、修飾し、及び／又は特異的に処理する宿主細胞株が使用され得る。こうしたプロセシングは、グリコシル化、ユビキネーション、ジスルフィド結合形成及び一般的な翻訳後修飾を伴い得る。
【００７１】
例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シークエンシング、細胞へのＤＮＡ導入及び遺伝子発現などにおける核酸操作、並びにタンパク質分析のための既知の方法及びプロトコルに関する詳細は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年及び、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： 第３版 Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００年などを参照のこと。
【００７２】
治療
「治療」には、ヒト又はヒト以外の動物に利益をもたらすことができる任意のレジメンが含まれる。治療は、既存状態に関するものであり得、又は予防（予防治療）であり得る。治療には、治癒的、緩和的又は予防的効果が含まれ得る。
【００７３】
本発明の、並びに本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド、核酸及び方法は、幾つかの病状の治療において使用され得る。これらには、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、癌、喘息及びアテローム性動脈硬化症が含まれる。特に、これらは、カテプシンプロテアーゼの過剰発現（すなわち、類似した同等の正常な健常細胞での発現よりも多い）及び／又は異常活性（例えば類似した同等の正常な健常細胞での活性よりも大きい）に関連した状態の治療において使用され得る。
【００７４】
本発明の、並びに本発明で使用するためのプロペプチド、核酸及び方法は、癌治療において使用され得る。「癌治療」には、癌性増殖が原因である状態の治療が含まれ、腫瘍性増殖又は腫瘍の治療が含まれる。本発明は、特に既存の癌の治療、及び初期治療又は手術後の癌の再発予防において有用であり得る。
【００７５】
本発明を用いて治療することができる腫瘍の例には、例えば、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む肉腫、例えば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌などの悪性腫瘍、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽腫、メラノーマ、骨髄腫、ウイルムス腫瘍、並びに急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病を含む白血病、星状細胞腫、神経膠腫並びに網膜芽細胞腫などが含まれる。
【００７６】
１つの実施形態では、癌は、乳癌、結腸癌、前立腺癌及び星状細胞腫から選択される。
【００７７】
本発明を用いて治療され得る炎症性及び／又は自己免疫障害には、多発性硬化症、グレーブス病、炎症性筋疾患及び関節リウマチが含まれる。
【００７８】
本発明の結合メンバー、核酸及び方法を用いて治療され得る神経変性障害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症及びクロイツフェルト−ヤコブ病が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明の方法を用いて治療され得る他の状態には、アテローム性動脈硬化症及び結核が含まれる。アテローム性動脈硬化症及び肥満を異常ＣａｔＳと結びつけるエビデンスが示されている。カテプシンＬは、感染においてＴＢ抗原を処理することが示されており、故に恐らくこの適正な処理を妨げる。
【００８０】
医薬組成物
本発明の、並びに本発明で使用するためのプロペプチド及び核酸は、医薬組成物として投与され得る。本発明による、及び本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて医薬的に許容な可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、安定剤又は当業者によく知られた他の物質を含み得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年を参照のこと）。こうした物質には、酢酸、トリス、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などの緩衝液；抗酸化剤；防腐剤；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；炭水化物；キレート剤；等張化剤；又は界面活性剤が含まれる。
【００８１】
組成物は、好ましくは本発明のプロペプチド、核酸又は組成物の活性に悪影響を与えない補助活性を有する、特定の治療適応のため必要に応じて選択された１つ又は複数のさらなる活性化合物を含有することもできる。例えば、癌治療では、カテプシンプロペプチドに加えて、製剤は、１つ又は複数のカテプシンＬ様プロテアーゼに結合する抗体、又は例えば特定の癌の増殖に影響を与える増殖因子など、幾つかの他の標的に対する抗体、及び／又は化学療法剤を含んでよい。
【００８２】
活性成分（例えば、プロペプチド及び／又は化学療法剤）は、マイクロスフェア、マイクロカプセルリポソーム、その他の微粒子送達システムを介して投与され得る。例えば、活性成分は、例えば、コアセルベーション技術若しくは界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレートマイクロカプセル）により調製され得るマイクロカプセル内、コロイド薬物送達システム中（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中に封入することができる。さらなる詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲら、編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年を参照のこと。
【００８３】
持続放出製剤は、活性剤の送達に使用され得る。持続放出製剤の適切な例には、マトリックスが、例えばフィルム、座薬又はマイクロカプセルなどの造形品の形態である、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれる。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００８４】
本明細書に記載のプロペプチドは、少なくとも幾つかの実施形態では、内科的治療のためヒト又は他の哺乳動物に投与されることが意図される。
【００８５】
ペプチドは、典型的には非経口的に投与され、血漿プロテアーゼにより容易に代謝され得る。恐らく最も魅力的な投与経路である経口投与は、より問題となり得る。胃では、酸がペプチドを分解し、酵素がペプチドを破壊する。残存して腸管に入るペプチドは、胃及び膵酵素、エキソ及びエンドペプチダーゼ、並びに刷子縁ペプチダーゼを含む、様々な酵素により絶えず攻撃されるため、別のタンパク質分解を受ける。この結果、腸管腔から血流へのペプチドの通過は、著しく制限され得る。しかし、治療ペプチドの非経口及び経口投与を可能にする様々なプロドラッグが開発されている。
【００８６】
ペプチドは、ポリマー部分など様々な部分に結合して、例えば、酸及び酵素分解耐性を増加し、こうした薬剤の粘膜貫通を増大するなど、ペプチド剤の生理化学特性を修飾することができる。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓは、水溶性の、非免疫原性の、インビボで安定化したプロドラッグを得るために酵素を誘導体化する様々な方法を記載している（「Ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ ａｄｄｕｃｔｓ」、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ、編Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ及びＲｏｂｅｒｔｓ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．（１９８１年））。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓは、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリコペプチド、ポリエチレングリコール及びポリアミノ酸などのポリマー材料と酵素を結合させる様々な方法を考察している。得られた結合ポリペプチドは、非経口適用のための生物活性及び水への可溶性を保持する。米国特許第４，１７９，３３７号は、生理学的に活性な非免疫原性の水溶性ポリペプチド組成物を得るため、分子量５００から２０，０００ダルトンを有するポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールにペプチドを結合することを教示する。ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールは、ポリペプチドが活性を喪失するのを防ぎ、実質的な免疫原性応答なしに組成物を哺乳動物循環系に注入することができる。
【００８７】
米国特許第５，６８１，８１１号、米国特許第５，４３８，０４０号及び米国特許第５，３５９，０３０号は、親油性及び親水性部分を含むオリゴマーに結合した治療剤を含む、安定化した、結合ポリペプチド複合体を開示する。Ｇａｒｍｅｎらは、タンパク質−ＰＥＧプロドラッグを記載する（Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．及びＫａｌｉｎｄｊｉａｎ，Ｓ．Ｂ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８７年、２２３、３６１〜３６５頁）。プロドラッグは、先ず多分散ＭＰＥＧ５０００から無水マレイン酸試薬を調製し、次いでこの試薬を本明細書に開示されたペプチドに結合して、この化学を用いて調製することができる。無水マレイン酸とのアミノ酸の反応はよく知られている。アミン含有薬剤を改良するためのマレイル−アミド結合の加水分解は、隣接した遊離カルボキシル基の存在、及び二重結合により生じた攻撃の形状により助長される。ペプチドは、生理学的条件下で（プロドラッグの加水分解により）放出され得る。
【００８８】
このような戦略は、本発明で使用するためのプロペプチドを送達するのに使用することができる。
【００８９】
ペプチドはまた、分解可能な結合、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、２００２年、５４、４５９〜４７６頁に（ペグ化インターフェロンα−２ｂに関して）示された分解可能な結合などを介して、多分散ＰＥＧなどのポリマーに結合することもできる。
【００９０】
ペプチドはまた、１，６又は１，４ベンジル脱離（ＢＥ）戦略（Ｌｅｅ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、（２００１年）、１２、１６３〜１６９頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．ら、米国特許第６，１８０，０９５号、２００１年；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、４２、３６５７〜３６６７頁を参照のこと。）；トリメチルロックラクトン化（ＴＭＬ）の使用（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、４３、４７５〜４８７頁）；水酸基末端カルボン酸リンカーへのＰＥＧカルボン酸リンカーの結合（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９８年、８７（１１）、１４４０〜１４４５頁）、並びにカルバミン酸塩及びＰＥＧアミド又はエーテル間のメタ関係を伴うプロドラッグ構造（米国特許第６，４１３，５０７号）；及び加水分解機構とは反対の還元機構を伴うプロドラッグ（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１９９９年、１０（５）、７０３〜７０７号）を含め、カルバミン酸アリルを介してアミン含有薬剤に結合したＭＰＥＧフェニルエーテル及びＭＰＥＧベンズアミドのファミリーを含むＰＥＧプロドラッグ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、２００２年、５４、４５９〜４７６頁）を用いてＰＥＧなどのポリマーに結合することもできる。
【００９１】
幾つかのアプローチは、胃腸管でのタンパク質及びペプチドの分解速度を遅くする酵素阻害剤の使用を伴い、本明細書に記載のプロペプチドに使用することができる。これらには、局所消化酵素を不活化するｐＨ操作；傍細胞輸送及び経細胞輸送の増加によるペプチド吸収を改善する透過促進剤の使用；腸上皮、特に、パイエル板によるインタクトな吸収を促進し酵素分解耐性を増加する微粒子キャリアとしてのナノ粒子の使用；腸管腔での化学及び酵素分解から薬剤を保護する乳濁液；並びに水溶化しにくい薬剤のためのミセル製剤が挙げられる。
【００９２】
幾つかのケースでは、ペプチドは、ペプチドが胃で放出されないように、腸溶コーティングされた適切なカプセル又は錠剤で提供され得る。或は、又はさらに、ペプチドは、プロドラッグとして提供され得る。１つの実施形態では、ペプチドは、プロドラッグとしてこれらの薬剤送達デバイス中に存在する。
【００９３】
ペプチドの遊離アミノ基、ヒドロキシル基、又はカルボン酸基は、ペプチドをプロドラッグに変換するのに使用することができる。プロドラッグには、１個のアミノ酸残基、又は２個以上（例えば、２、３又は４個）のアミノ酸残基のポリペプチド鎖が、様々なポリマー、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコールの遊離アミノ基、ヒドロキシ基若しくはカルボン酸基にペプチド結合を介して共有結合した化合物が含まれる。プロドラッグには、炭酸塩、カルバミン酸塩、アミド及びアルキルエステルが、Ｃ末端カルボン酸を介して上記ペプチドに共有結合した化合物も含まれる。
【００９４】
本発明のペプチド（プロペプチド）を含むプロドラッグ、又は本発明のペプチド（アナログ及びフラグメントを含む）を放出する若しくは放出可能なプロドラッグは、本発明の誘導体とみなされる。
【００９５】
ペプチド模倣剤
本発明は、さらに、治療ペプチドとして使用することができる模倣プロペプチドの使用を包含する。模倣プロペプチドは、本明細書に記載のカテプシンプロペプチドの生物活性を模倣する短いペプチドである。このような模倣ペプチドは、ファージディスプレイ又はコンビナトリアルケミストリーなど当技術分野で既知の、だがこれらに限定されない方法から得ることができる。例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、Ｓｃｉｎｃｅ ２７３：４５８〜４６３頁（１９９６年）により開示された方法は、模倣ＱＵＢ６９８．８ペプチドを生成するのに使用することができる。
【００９６】
上述の通り、カテプシンプロペプチドをコードする核酸は、治療方法に使用することもできる。こうした核酸は、当技術分野で既知の任意の適切な方法を用いて目的とする細胞に送達され得る。核酸（場合によりベクターに含有される）は、インビボ又はエクスビボ方法を用いて患者の細胞に送達され得る。インビボ方法では、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど）によるトランスフェクション、及び脂質ベース系（遺伝子の脂質媒介導入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌ）が使用され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： ８０８〜８１３頁（１９９２年）を参照のこと。国際公開９３／２５６７３号パンフレットも参照のこと）。
【００９７】
エクスビボ方法では、核酸は、患者に直接投与される又は、例えば、患者に移植される多孔質膜内に封入して投与される修飾細胞により、患者の単離細胞に導入される（例えば米国特許第４，８９２，５３８号及び５，２８３，１８７号を参照のこと）。核酸を生存細胞に導入するのに利用可能な技法には、レトロウイルスベクター、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などの使用が含まれ得る。
【００９８】
プロペプチド、核酸、薬剤、生成物若しくは組成物は、局在化した方法で腫瘍又は他の所望の部位に投与することができ、又は腫瘍若しくは他の細胞を標的にする方法で送達することができる。ターゲティング治療は、抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的系の使用により、活性薬剤を特定の細胞タイプへより特異的に送達するのに使用することができる。ターゲティングは、例えば薬剤が許容し難いほど毒性がある場合、又はそうしなければあまりに高用量を必要とすることになる場合、又はそうしなければ標的細胞に侵入できなくなる場合など、様々な理由のため望ましい場合がある。
【００９９】
用量
本発明のプロペプチド、核酸又は組成物は、好ましくは、個体に対する利益を示すのに十分な量である、「治療有効量」で個体に投与される。実際の投与レジメンは、治療する状態、この重症度、治療する患者、使用する薬剤を含む幾つかの要因に依存し、医師の裁量によるであろう。
【０１００】
最適量は、例えば、年齢、性別、体重、治療する状態の重症度、投与する活性成分及び投与経路を含む幾つかのパラメータを基に、医師により決定され得る。
【０１０１】
本発明は、これより、以下の非限定例においてさらに記載される。添付図を参照する。
【実施例】
【０１０２】
材料及び方法
ＣａｔＳＰＰのクローニング及び発現
残基１７〜１１３のヒトＣａｔＳＰＰを、それぞれＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限部位（下線）を含有するプライマーＣＡＴＳＰＰＦ（５’ ＴＴＴ ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＧＣＡＴＡＡＡＧＡＴＣＣＴＡＣ）及びＣＡＴＳＰＰＲ（５’ ＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＣＧＡＴＴＡＧＧＧＴＴＴＧＡ）を用いて、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｏｒｉｇｅｎｅ社）から増幅した。３３０ｂｐの予測バンドを、アガロース電気泳動で視覚化した。このバンドをゲル精製し、下流操作のためＮ末端ヘキサヒスチジンタグを組み込んだｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ社）にＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを用いてクローニングした。陽性クローンをコロニーＰＣＲで同定し、配列をアクセッション番号Ｍ９０６９６にアラインメントした。単一の確認したクローンを後の実験で使用した。
【０１０３】
ＣａｔＳＰＰ−Ｆｃのクローニング及び発現
ｐＲＳＥＴ−ＦｃベクターへのＣａｔＳＰＰのクローニングでは、やはりそれぞれＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限酵素部位（下線）を有する、プライマーＣＡＴＳＰＰＦＣＦ（５’ ＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＧＣＡＴＡＡＡ ＧＡＴ）及びＣＡＴＳＰＰＦＣＲ（５’ ＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＧＧＴＴ）を用いて、ＤＮＡ配列を増幅した。増幅したバンドをゲル切除し、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含有するように前もって改変したｐＲＳＥＴ細菌発現ベクターにクローニングした。陽性クローンをコロニーＰＣＲで同定し、配列をアクセッション番号Ｍ９０６９６にアラインメントした。単一の確認したクローンを全ての後の実験で使用した。
【０１０４】
ＣａｔＳＰＰ及びＣａｔＳＰＰ−Ｆｃのタンパク質発現及び精製
発現分析では、ＣａｔＳＰＰ陽性クローンをＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換し、対数増殖期中期（Ａ５５０ ０．５、３７℃）に達するまで振盪フラスコ（５００ｍｌ）で培養した。ＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ陽性クローンの発現分析を、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ株を用いて形質転換により行った。組換えタンパク質の発現はいずれも、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）を細菌培養物に添加して誘導し、回収前にさらに４時間増殖させた。細胞ペレットを再懸濁し、８Ｍ尿素含有５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールで溶解した。粗変性溶解物を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃で６０分間）により清澄にした後、Ｎｉ２＋イオンを負荷したＩＭＡＣカラム（ＨｉＴｒａｐ １ｍｌカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｃａｒｅ社）に適用した。非特異的結合物質を８Ｍ尿素含有５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭイミダゾールを用いてカラムから洗浄した後、２００カラム容量にわたって尿素を８Ｍから０Ｍに減らしてオンカラムリフォールディングした。リフォールディングしたカラム結合物質を、さらに２０カラム容量の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭイミダゾールで洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。タンパク質画分を回収し、ＰＢＳで脱塩し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより分析して純度及び完全性を判定した。精製組換えタンパク質のストックを、使用前に−２０℃で貯蔵した。
【０１０５】
ｒＣａｔＳＰＰによるシステインカテプシンの阻害
酵素アッセイを使用して、ヒトカテプシンＳ、Ｌ、Ｋ、Ｖ及びＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）のペプチド分解活性を阻害するｒＣａｔＳＰＰの能力を確認した。アッセイは、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、０．１％ Ｂｒｉｊ及び１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（ｐＨ５．５）の存在下、９６ウェルマイクロタイタープレートで３連で行った。ＣａｔＳ活性を、蛍光発生基質カルボベンジルオキシ−Ｌ−バリニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アルギニルアミド−４−メチルクマリン（Ｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、２５μＭ）を用いてモニターし、カテプシンＬ、Ｋ及びＶのアッセイは、カルボベンジルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニルアミド−４−メチルクマリン（Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、２５μＭ）を用いて行い、ＣａｔＢのアッセイは、基質としてカルボベンジルオキシ−Ｌ−アルギニルアミド−Ｌ−アルギニルアミド−４−メチルクマリン（Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、２５μＭ）を用いて行った。精製ｒＣａｔＳＰＰを、様々な濃度（０〜１０００ｎＭ）で必要に応じてアッセイに添加した。全ての実験は、３９５ｎｍの励起及び４６０ｎｍの発光を有するＣｙｔｏｆｌｕｏｒ（登録商標）４０００蛍光光度計を用いて行った。ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃもまた、ＣａｔＳの活性を阻害する能力を有することを確かめるため、蛍光分析を、ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ（０ｎＭ〜２００ｎＭ）の存在下でＣａｔＳ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、２５μＭ）を用いて行った。
【０１０６】
システインカテプシン発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
ヒト悪性細胞系パネルにおけるシステインカテプシンＳ、Ｌ、Ｋ及びＶの相対発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により判定した。Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、ＲＮＡをＵ２５１ｍｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＴ１１６及びＰＣ３細胞系から抽出し、分光光度計を用いて定量した。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて以下の条件下で行った：５０℃で３０分間、９５℃で１５分間、並びに９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１分３０秒間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間又は本文に詳述した通り。一連のシステインカテプシン増幅は、以下の表に詳述したプライマーを用いて行った。β−アクチン遺伝子増幅を、同等のローディングを立証するための内部対照として使用した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分析し、コダック１Ｄ ３．４ ＵＳＢソフトウェア及びデジタルカメラを用いてＵＶ光下で画像を撮影した。
【０１０７】
遺伝子ＲＴ−ＰＣＲプライマー配列
ＣａｔＳ（Ｆ） ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＴＣ ＡＴＧ ＴＧＡ ＣＡＡ Ｇ
ＣａｔＳ（Ｒ） ＴＡＣ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＴＣＡ ＴＧ
ＣａｔＬ（Ｆ） ＡＴＧ ＡＡＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴＴ ＧＣ
ＣａｔＬ（Ｒ） ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＧＧ ＧＴＡ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＧ
ＣａｔＫ（Ｆ） ＡＴＧ ＴＧＧ ＧＧＧ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＴＴ ＣＴＧ Ｃ
ＣａｔＫ（Ｒ） ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＧＣ Ｃ
ＣａｔＶ（Ｆ） ＡＴＧ ＡＡＴ ＣＴＴ ＴＣＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＣ
ＣａｔＶ（Ｒ） ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＴＴ ＧＧＧ ＧＴＡ ＧＣＴ ＧＧＣ
アクチン（Ｆ） ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧ
アクチン（Ｒ） ＣＧＴ ＣＡＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣ
【０１０８】
インビトロ浸潤アッセイ
インビトロ浸潤アッセイは、１２μｍ細孔膜を有する修正ボイデンチャンバー（Ｃｏｓｔａｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ社、ケンブリッジ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。膜をマトリゲル（１００μｇ／ｃｍ２）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、オックスフォード、ＵＫ）でコートし、層流フードで一晩乾燥させた。
【０１０９】
細胞を、所定濃度のｒＣａｔＳＰＰの存在下、無血清培地５００μｌの各ウェルに添加した。アッセイは全て３連で行い、浸潤プレートは、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、膜の上表面に残っている細胞を除去し、浸潤細胞をカルノワ固定液で１５分間固定した。乾燥後、浸潤細胞の核を、ヘキスト３３２５８（５０ｎｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液で３０分間室温にて染色した。チャンバーインサートをＰＢＳで２度洗浄し、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒにマウントし、浸潤細胞をニコンＥｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００蛍光顕微鏡で眺めた。３連での各膜からの代表的な視野のデジタル画像を、ニコンＤＸＭ１２００デジタルカメラを用いて倍率×２０で撮影した。結果を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍａｇｉｎｇ社によるＬｕｃｉａ ＧＦ ４．６０を用いて分析し、浸潤細胞のパーセンテージで表した。
【０１１０】
細胞生存アッセイ
ｒＣａｔＳＰＰの細胞毒性効果又は増殖効果は、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞系を用いてＭＴＴアッセイにより判定した。細胞を、２００μｌあたり１×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに添加した。２００ｎＭ ｒＣａｔＳＰＰ、同一条件下で同じベクターから生成した対照タンパク質及びビークルのみの対照を、細胞に添加し、２４、４８、及び７２時間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。この後、培地を慎重に除去し、０．５ｍｇ／ｍｌ ３−４，５−ジメチルチアゾール−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）２００μｌを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＭＴＴ試薬を除去し、不溶性ホルマザン結晶をＤＭＳＯ１００μｌで溶解した。吸光度を５７０ｎｍで測定し、結果を各ビークルのみの対照と比較した細胞生存又は増殖のパーセンテージで表した。テストは全て５連で行った。
【０１１１】
結果及び考察
これまで、ＣａｔＳＰＰの精製は、幾つかの異なるアプローチにより達成されてきた。Ｍａｕｂａｃｈ及び共同研究者らは、ＧｄｎＨＣｌ濃度勾配に対するリフォールディングにより封入体から、残基１６〜１１４に相当するペプチドを単離して、大腸菌発現系からＣａｔＳＰＰを生成した（Ｍａｕｂａｃｈら、１９９７年）。Ｇｕａｙ及び同僚らも、ＰＰ（残基１７〜１１４）を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｃ末端融合として生成する別のアプローチを用いて、大腸菌で生成した。組換えタンパク質は、封入体において再度生成した。封入体はこの後、ＧｄｎＨＣｌ濃度勾配に対してリフォールディングした後、ＧＳＴ−セファロースカラムでアフィニティー精製し、トロンビン切断ステップによりＰＰをＧＳＴ融合から除去した（Ｇｕａｙら、２０００年）。この後者の手順は、ＣａｔＫＰＰ及びＣａｔＬＰＰの生成にも使用されている。これらの従来の方法はいずれも、生物活性タンパク質を生成したが、特に封入体の単離及びリフォールディングに手間と時間を要する。ＣａｔＳＰＰ生成のためのより迅速な簡易化方法を決定するため、本発明者らは、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグでペプチド（残基１７〜１１３）を発現させ、リフォールドＩＭＡＣによりこのタンパク質を精製した。
【０１１２】
詳述した遺伝子特異的プライマーＣＡＴＳＰＰＦ及びＣＡＴＳＰＰＲを用いて、プロペプチド領域（残基１７〜１１３）をコードするオープンリーディングフレームを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により市販のｃＤＮＡライブラリーから増幅した。アガロース電気泳動により分析した場合、予測サイズのバンドを視覚化した（図１）。ゲル抽出後、バンドを市販のベクター（ｐＱＥ３０）にクローニングした。コロニーＰＣＲによる１６クローンの分析は、コロニー１０から増幅した約６５０ｂｐのバンドを明らかにする（図２ａ）。これは、コロニー１０のみが、ｐＱＥ３０細菌発現ベクターに首尾よくクローニングされたＣａｔＳＰＰ ｃＤＮＡ配列を含有している可能性を示唆するものであろう。
【０１１３】
ＤＮＡを完全な検証のため配列決定した（アクセッション番号Ｍ９０６９６にアラインメントした配列）（図２ｂを参照のこと）。選択したクローンは、さらなる試験のためｒＣａｔＳＰＰ種を単離する、さらなる増殖及び発酵の全てに使用した。
【０１１４】
次いで、先ずタンパク質の過剰発現について、並びにタンパク質がＮ末端ヒスタグを含有し予測分子量１６ｋＤａであること、及びタンパク質発現がＩＰＴＧで誘導可能な、Ｔ５プロモーターの支配下にあることを検証するため、検証したクローンからのｒＣａｔＳＰＰ発現を分析した。
【０１１５】
ｒＣａｔＳＰＰを、ｐＱＥ３０細菌発現ベクターから発現させ、オンカラムリフォールディングＩＭＡＣを用いて精製した。図３ａ）に示した通り、ｒＣａｔＳＰＰの溶出プロファイルは、幾つかのピーク、すなわち１８５分後の急激な最初のピーク、続く１９０分から１９５分の間の幅広いピークを含有する。図３ｂに矢印で示した第２の幅広いピークからの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、（Ｈｉｓ）６タグ付きｒＣａｔＳＰＰの予測分子量に相当する、分子量約１６ｋＤａを有する単一の高純度なバンドの存在を明らかにした。図３ｃ）は、抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いた精製画分の免疫ブロッティングが、約１６ｋＤａでｈｉｓタグ付き種の存在を確認することを示している。
【０１１６】
ＩＰＴＧによるｒＣａｔＳＰＰ発現の誘導性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより立証した（図４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色による細菌溶解物の分析は、レーンｂの約１６ｋＤａでｒＣａｔＳＰＰの存在を示す。これはレーンｂでは誘導されたが、非誘導レーン（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ ｌａｎｅ）ａでは誘導されなかった（図４ａ）。ニトロセルロース膜への細菌溶解物の移行、及び抗ポリヒスチジンタグ抗体によるブロッティングは、誘導レーンｂのみでこのタンパク質発現を確認する（図４ｂ）。分子量マーカーを各画像の左に示す（ｋＤａ）。
【０１１７】
ＰＢＳでの最終脱塩後、次いでプロペプチドを生物活性についてテストした。ｒＣａｔＳＰＰタンパク質の生物活性は、所定濃度のｒＣａｔＳＰＰの存在下（０ｎＭから５００ｎＭ）、ＣａｔＳ及び蛍光発生基質Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣを用いて蛍光分析により確認した。ｒＣａｔＳＰＰ存在下のＣｂｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣの加水分解に関するプログレス曲線をプロットし、ＣａｔＳ活性の用量依存阻害を観察した（図５）。同じベクターから生成し同じ方法で精製した対照（Ｈｉｓ）６タグ付きタンパク質を対照（５００ｎＭ）に用いて、ＣａｔＳ活性の摂動がｒＣａｔＳＰＰによるものであることを確認した（挿入図）。アッセイは全て３連で行った。
【０１１８】
プログレス曲線は、遅延結合性可逆的阻害剤（ｓｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の作用を示す。作成された見かけの一次反応速度曲線に、次いで、経時的な蛍光の生成［Ｐ］を以下の方程式で表すことができる非線形回帰分析を行った（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＷａｌｓｈ、１９９８年）。
［Ｐ］＝ｖｓｔ−（ｖｓ−ｖｏ）（１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓｔ））／ｋｏｂｓ＋ｄ （１）
【０１１９】
ＧｒａＦｉｔ（登録商標）ソフトウェアを用いて、図７ａに示したプログレス曲線の値を、非線形回帰分析により方程式（１）に合わせ、Ｋｉ（ｏｂｓｅｒｖｅｄ）を判定する、［Ｉ］に対するｖｓのグラフを作成した。次いでこれを、方程式（２）に示した通り、競合基質を説明するため修正した。
｛Ｋｉ＝Ｋｉ（ｏｂｓｅｒｖｅｄ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）｝ （２）
【０１２０】
この分析を用いて、ｒＣａｔＳＰＰによるＣａｔＳの阻害についてＫｉ値を算出した（図６）。
【０１２１】
さらに、図７に示した通り、所定濃度のｒＣａｔＳＰＰの存在下でカテプシンＫ、Ｖ、Ｌ及びＢ（それぞれ、ａ〜ｄ）を用いて蛍光分析を行った。蛍光は３０分間モニターし、ＲＦＵを経時的にプロットして蛍光分析プログレス曲線を作成した。ｒＣａｔＳＰＰによるカテプシン阻害により作成された見かけの一次反応速度定数に非線形回帰分析を行い（挿入図）、阻害定数（Ｋｉ）をそれぞれ、１７．６ｎＭ（±１．３）、４．８ｎＭ（±０．６）、及び０．６２ｎＭ（±０．１４）に決定することが可能となった。蛍光分析は全て、３回繰り返した。
【０１２２】
抗ペプチド分解活性の確立を確認したことで、本発明者らは、次いでＣａｔＳのエラスチン分解活性を遮断するｒＣａｔＳＰＰの能力を立証するのにｒＣａｔＳＰＰを使用した。蛍光発生基質エラスチン−ＤＱを、６０分間のインキュベーションの間、ＣａｔＳＰＰ（５０〜５００ｎＭ）の存在下でＣａｔＳのエラスチン分解代謝をモニターするのに使用し、本発明者らは、この活性の阻害を立証することができた（図８）。
【０１２３】
４つのヒト悪性細胞系におけるＣａｔＳ、Ｌ、Ｋ及びＶの発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。各々のカテプシンは４つの細胞系で発現するように思われ、アクチンの増幅は、内部対照として使用した（図９）。
【０１２４】
ｒＣａｔＳＰＰについて算出した完全なペプチド分解阻害プロファイル、及び少なくともＣａｔＳのエラスチン分解活性が示され得たエビデンスを基に、本発明者らは次に、浸潤癌モデルにおいてこれらのプロテアーゼの活性を遮断するペプチドの有効性を分析した。この実験では、本発明者らは、マトリゲルでコートした修正ボイデンチャンバーを介して腫瘍細胞浸潤を調べる試験を用いた（Ｆｌａｎｎｙら、２００３年）。この実験は、一般的なタイプの癌を代表する細胞系で行った。具体的には、これらはＰＣ３（前立腺細胞系）、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）、Ｕ２５１ＭＧ（星状細胞腫）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）及びＭＣＦ７（乳癌）であり、結果を図１０に示す。図１０ａは、インビトロ浸潤アッセイにおける４つのヒト悪性細胞系の分析を示す。ａ〜ｄ：ＨＣＴ１１６、Ｕ２５１ｍｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＰＣ３。各細胞系は、ＣａｔＳＰＰの存在下では腫瘍細胞浸潤の有意な減少を示した（＊＝ｐ：≦０．００１、＊＊＝ｐ：≦０．００１、＊＊＊＝ｐ：≦０．０００１）。全ての変数（ｖａｒｉａｂｌｅ）は、腫瘍細胞浸潤について記録し分析した１０画像により３連で行った。標準誤差は、平均±誤差としてプロットした。統計的有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて算出した。図１０ｂは、ＣａｔＳＰＰ存在下でのＭＣＦ７腫瘍細胞浸潤の有意な減少（６３％）を示すヒストグラムを示す。
【０１２５】
ｒＣａｔＳＰＰタンパク質の細胞毒性及び増殖効果を評価するため、ＭＴＴアッセイを行った。ＭＴＴアッセイは、２００ｎＭのｒＣａｔＳＰＰ、対照タンパク質及びビークルのみの対照と共にインキュベートした、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞を用いて行った。結果（図１１）は、組換えタンパク質が、細胞増殖に対し有意な効果をもたらさないことを示している。全ての変数は、５連で繰り返した。
【０１２６】
本発明者らは次に、カテプシンプロペプチドのＦｃ部分の提供が、浸潤癌モデルにおけるＬ型カテプシンプロテアーゼの阻害に与える影響を検討した。
【０１２７】
Ｃ末端Ｆｃ部分（ＣａｔＳＰＰ Ｆｃ）を含むカテプシンＳプロペプチドを、上記ＣａｔＳＰＰについて記載した通りの方法を用いてクローニングし発現させた。ＣａｔＳＰＰのｃＤＮＡ配列を、ｐＲＳＥＴ Ａ−Ｆｃベクターにクローニングした。陽性形質転換プレートからの８コロニーのセレクションに、ベクター特異的プライマーを用いてコロニーＰＣＲ分析を行った。８コロニーは全て、約１１００ｂｐのバンドの増幅により陽性であるように見える（図１２）。ｐＲＳＥＴ ＡベクターからのｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの発現を、ＩＰＴＧの添加により誘導した。結果を図１３に示す。レーンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの試料は、非誘導及び誘導試料を含有する（それぞれＢ＝０．２、Ｃ＝０．５及びＤ＝０．７ ＯＤ（Ａ５５０ｎｍ））。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いて行ったウェスタンブロッティングで分離した。ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの予測サイズに等しい、約４６ｋＤａの分子量を有するＨｉｓタグ付きタンパク質種を検出した。ＯＤが０．２の培養物での発現誘導が、タンパク質生成には最適であるように思われた。
【０１２８】
ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃは、Ｎ末端ＨｉｓタグであるためＩＭＡＣを用いて精製した。結果を図１４に示す。ａ）精製プロファイルは、２つの明白なピーク、約２００分後の急激なピーク及び２２５分から２５０分の間の第２の幅広いピークを示す。ｂ）精製から溶出した画分の分析は、第１のピークが、カラムからの非特異的結合タンパク質の溶出を表すのに対し（画分１〜５）、幅広い第２のピークは、ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの予測サイズと一致する、約４６ｋＤａの種の溶出を示す（画分６〜１５）。ｃ）抗ポリヒスチジンタグモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによる精製画分の分析は、ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃに関する予測通り約４６ｋＤａのｈｉｓタグ付き種の存在を示す。
【０１２９】
ＣａｔＳＰＰ ＦｃによるＣａｔＳペプチド分解活性の阻害を測定した。ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃを、蛍光発生基質Ｚ−ＶＶＲ−ＡＭＣを用いて蛍光分析により評価し、この種が、Ｆｃドメインの付加後、動態に何ら負の影響をもたらすことなくＣａｔＳの阻害を保持する能力を有するかどうかを判定した。結果を図１５ａ）に示す。プログレス曲線は、増加する濃度（０ｎＭから２００ｎＭ）のｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ存在下でのＣａｔＳ活性の阻害を示す。ａ、挿入図）Ｆｃ対照タンパク質（２００ｎＭ）は、ＣａｔＳ活性に対する識別可能な効果をもたらさなかった。ｂ）速度はプログレス曲線から外挿し、阻害動態は８．９ｎＭ（±２．５）として算出した。アッセイは３度繰り返した。
【０１３０】
ＣａｔＳ ＰＰの安定性対ＣａｔＳ ＰＰ−Ｆｃの安定性は、以下の通りに評価した。ｒＣａｔＳＰＰ及びｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃタンパク質を、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞と共にインキュベートし、抗体ＩｇＧ２ Ｆｃドメインの付加による組換えタンパク質の安定性を評価した。上清試料をウェスタンブロッティングにより評価し（図１６）、細胞上清内の安定性を判定した。ｒＣａｔＳＰＰは、０時間目でのみ検出できたのに対し、ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの安定性は、２４時間後に検出されたことから改善したように思われる。対照として、添加タンパク質を含有しない（−）細胞上清も評価し、上清の同等の負荷を確認するため膜をポンソーレッドで染色した。実験は３連で実施した。
【０１３１】
前立腺ＰＣ３細胞を用いたインビトロ浸潤アッセイでのカテプシンＳに対するＣａｔＳＰＰ Ｆｃの効果を、次いでテストした。結果を図１７に示す。ヒストグラムは、ＣａｔＳＰＰ Ｆｃ存在下（０〜３２ｎＭ）でのＰＣ３浸潤アッセイの定量的概要を示す。各アッセイは３連で行い、１０個の視野をアッセイ毎にカウントした。
【０１３２】
他の腫瘍細胞系を用いたインビトロ浸潤アッセイでのカテプシンＳに対するＣａｔＳＰＰ Ｆｃの効果を、次いでテストした（図１８）。ｒＣａｔＳＰＰ及びｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃタンパク質を、ＨＣＴ１１６結腸直腸細胞系を用いたインビトロ浸潤アッセイに適用した。アッセイは、増加する濃度のｒＣａｔＳＰＰ（０ｎＭから２５０ｎＭ）又はｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ（０ｎＭから５０ｎＭ）の存在下、及び最大濃度の適切な対照タンパク質の存在下でも行った。標準偏差は、誤差バーとしてプロットする。アッセイを、各々から記録した１０画像により３連で繰り返した。平均腫瘍細胞浸潤における標準偏差を、±誤差バーとしてプロットする。
【０１３３】
同様の結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて行った浸潤アッセイで見られた。図１９は、ｒＣａｔＳ ＰＰ及びｒＣａｔＳ ＰＰ−Ｆｃの相対ＥＣ５０値を示す。様々な濃度のｒＣａｔＳＰＰ又はｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの存在下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞浸潤の相対速度に、非線形回帰分析を行い、Ｓ字用量依存曲線を作成した。得られたＥＣ５０値は、（ａ）ｒＣａｔＳＰＰ及び（ｂ）ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃについてそれぞれ７８．０ｎＭ及び８．３ｎＭであることが分かった。
【０１３４】
以上の通り、ＣａｔＳＰＰ Ｆｃは、Ｆｃ部分の無いＣａｔＳＰＰで生成したものより最大阻害が有意に大きく、阻害濃度は有意に低く、浸潤アッセイにおけるカテプシンＳの強力な阻害剤として作用した。ＣａｔＳＰＰ分子の安定性が、程度は小さいながらＦｃ部分により増大することは予測し得たが、それでもなおＦｃ部分の包含が、阻害効果をこれほど大幅に高めたことは非常に驚きである。故に、結果は、カテプシンプロペプチドによるＦｃ部分の包含が、腫瘍浸潤モデルにおけるカテプシンＬ型プロテアーゼ活性の阻害を高めることを立証するものである。他の試験は、腫瘍形成モデルにおいてカテプシンの広域スペクトル小分子阻害剤を用いて行い、同様の効果を立証した。Ｊｏｙｃｅ及び同僚らは、トランスジェニックＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスでの研究において、広域スペクトルシステインカテプシン阻害剤Ｅ６４の細胞透過性アナログである、ＪＰＭ−ＯＥｔの使用を用いた（Ｊｏｙｃｅら、２００４年）。このマウスは、発癌性ＳＶ４０ Ｔ抗原の存在のため１２〜１４週で膵島腫瘍を発症する。彼らは、このマウスへのこの広域スペクトル阻害剤の投与が、この動物の組織学的分析における高浸潤癌の発生を含む、腫瘍発生の複数の段階を著しく阻害できることを立証した。別の研究では、Ｆｌａｎｎｅｒｙ及び共同研究者らは、星状細胞腫浸潤の遮断における４−モルホリンウレア−Ｌｅｕ−ｈｏｍｏＰｈｅ−ビニルスルホン（ＬＨＶＳ）の使用を調べた。本発明者らが本明細書で使用したのと同じ浸潤モデルを用いて、ＣａｔＳ及び程度は低いもののＣａｔを強力に阻害するＬＨＶＳが、５０ｎＭ濃度で最大６０％のＵ２５ＩＭＧ細胞浸潤を遮断できることを立証した（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００３年）。まとめると、これらの過去の研究は、第１に、ＣａｔＬ様プロテアーゼがこれらの細胞系の浸潤プロセスにおいて果たす役割、及び第２に、癌治療のための治療標的としての可能性を明らかに立証している。
【０１３５】
かなりの研究努力にもかかわらず、これらのプロテアーゼの各々が腫瘍形成に果たす役割の程度は、まだ十分に理解されていない。これらがひとたび発癌性細胞により分泌された場合、エラスチン、コラーゲン及び細胞外マトリックスの他の構成成分の分解におけるこれらの役割を、相当量のエビデンスが示していることは明らかである。しかし、これらの酵素がお互いの、及びメタロプロテアーゼなど、他のあまり密接に関係しないプロテアーゼの活性化及び制御に果たす役割が、現在新たに浮上している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９３年）。さらに、新たなエビデンスは、マトリックス由来抗血管新生因子の分解、及び腫瘍進行中の血管新生促進因子（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の産生におけるＣａｔＳの役割に脚光を当てるようになった（Ｗａｎｇら、２００５年）。これは、これらのプロテアーゼが、周辺ＥＣＭの単純な消化よりも、腫瘍の進行及び転移を可能にする多くの役割を有し得ることを示している。
【０１３６】
結論
本明細書で本発明者らは、例えばＣａｔＳＰＰなど、カテプシンプロペプチドを生成するための新規な発現及び精製方法を記載した。本発明者らは、例えばｒＣａｔＳＰＰなど、カテプシンプロペプチドを用いたカテプシンＬ型プロテアーゼの阻害により、腫瘍形成が減弱され得ることを立証した。本発明者らが、様々な異なる腫瘍細胞系を用いたインビトロ浸潤アッセイにおいて見た阻害プロファイルから、ＣａｔＬ様プロテアーゼの幅広い阻害が、癌の臨床治療に明らかな治療効果を有することは明らかである。特に生体における第２の部位への腫瘍の広がりを遮断することができる薬剤を開発する能力は、細胞毒性剤レジメンの併用にとって魅力的となろう。細菌培養物からｒＣａｔＳＰＰを迅速に生成し、これらの腫瘍浸潤モデルにうまく適用する能力は、これが、治療プロテアーゼ阻害剤のデザインに対する新規のアプローチを提示し得ることを示唆するものである。
【０１３７】
この本明細書で言及された文献は全て、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の記載された実施形態に対する様々な修正形態及び変形形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に理解されよう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求された本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、当業者には明らかな、本発明の記載された実施形態の様々な修正は、本発明により網羅されることが意図される。
【０１３８】
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【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＣａｔＳＰＰの増幅を示す図である。ＣａｔＳＰＰのｃＤＮＡ配列は、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーから増幅された。ＣａｔＳＰＰ ｃＤＮＡ配列の予測サイズに等しい、約３３０ｂｐの単一バンドが生成された。
【図２】ｐＱＥ−３０へのＣａｔＳ ＰＰのクローニングからのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。ｒＣａｔＳＰＰの完全リーディングフレーム用のＤＮＡ及びタンパク質配列が、ｐＱＥ−３０への挿入結果として示されることを示す図である。
【図３】ｒＣａｔＳＰＰタンパク質の精製を示す図である： ａ）ｒＣａｔＳＰＰの溶出プロファイル。ｂ）矢印で示したように、第２の幅広いピークからの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ｃ）抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いた精製画分の免疫ブロット。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングで立証された、ＩＰＴＧによるｒＣａｔＳＰＰ発現の誘導性を示す図である。ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色による細菌溶解物の分析。ｂ）抗ポリヒスチジンタグ抗体によるブロッティング。分子量マーカーを各画像の左に示す（ｋＤａ）。
【図５】ｒＣａｔＳＰＰ存在下のＣｂｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣの加水分解に関するプログレス曲線を示す図である。同じベクターから生成し同じ方法で精製した対照（Ｈｉｓ）６タグ付きタンパク質を、対照（５００ｎＭ）として用いた（挿入図）。
【図６】阻害定数（Ｋｉ）の決定を可能にする非線形回帰分析（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＷａｌｓｈ、１９９８年）のグラフを示す図である。
【図７】蛍光分析を用いたｒＣａｔＳＰＰタンパク質によるカテプシンＫ、Ｖ、Ｌ及びＢの阻害を示す図である。
【図８】ＣａｔＳエラスチン分解活性の阻害を示す図である。蛍光発生基質エラスチン−ＤＱを用いて、６０分間のインキュベーションの間、ＣａｔＳＰＰ（５０〜５００ｎＭ）の存在下でＣａｔＳのエラスチン分解代謝をモニターした。
【図９】悪性細胞系におけるＣａｔＬ様プロテアーゼの相対発現を示す図である。
【図１０】（ａ）４つのヒト悪性細胞系（ｉ〜ｉｖ）： ＨＣＴ１１６、Ｕ２５１ｍｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＰＣ３におけるインビトロ浸潤アッセイの結果を示す図である。（ｂ）ＭＣＦ−７におけるインビトロ浸潤アッセイの結果を示す図である。
【図１１】ｒＣａｔＳＰＰタンパク質の細胞毒性又は増殖効果を評価するＭＴＴアッセイの結果を示す図である。
【図１２】ｐＲＳＥＴ Ａ−ＦｃへのＣａｔＳＰＰのクローニングのコロニーＰＣＲ分析を示す図である。
【図１３】ｐＲＳＥＴ ＡベクターからのｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの発現が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いて行ったウェスタンブロッティングで解明された通り、ＩＰＴＧの添加により誘導されたことを示す図である。
【図１４】ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの精製を示す図である。ａ）は、精製プロファイルが２つの明白なピークである、約２００分後の急激なピーク及び２２５分から２５０分の間の第２の幅広いピークを示すことを示す。ｂ）は、精製から溶出した画分の分析を示す。ｃ）は、抗ポリヒスチジンタグモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによる精製画分の分析を示す。
【図１５】蛍光分析を用いたｒＣａｔＳＰＰ−ＦｃによるＣａｔＳ阻害を示す図である。
【図１６】ＣａｔＳ ＰＰの安定性対ＣａｔＳ ＰＰ−Ｆｃの安定性を立証するウェスタンブロットを示す図である。
【図１７】ＣａｔＳＰＰ Ｆｃ存在下でのＰＣ３浸潤アッセイの定量的概要を示すヒストグラムを示す図である。
【図１８】ＣａｔＳＰＰ及びＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ組換えタンパク質の存在下でのＨＣＴ１１６浸潤アッセイの定量的概要を示すヒストグラムを示す図である。
【図１９】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞におけるｒＣａｔＳ ＰＰ及びｒＣａｔＳ ＰＰ−ＦｃのＥＣ５０値を決定するのに使用された用量依存曲線を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ペプチド及び治療方法におけるその使用に関する。特に、本出願は、カテプシンプロペプチド、この製造方法及び該プロペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、全遺伝子産物の約２％を占めるタンパク質の大きな集団である（Ｒａｗｌｉｎｇｓ及びＢａｒｒｅｔｔ、１９９９年）。プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、全ての細胞及び生物が適切に機能するために不可欠である。タンパク質分解処理事象は、骨形成、創傷治癒、血管新生及びアポトーシスを含む様々な細胞プロセスにおいて重要である。
【０００３】
リソソームシステインプロテアーゼは、当初、リソソームでのタンパク質の非選択的分解を司る酵素であると考えられた。通常はリソソームでの局在化に関連することから、これらのプロテアーゼは、最初、エンドソーム区画でのタンパク質の非選択的分解に関与するのみであると考えられた。しかし、これらは今では、幾つかの特定の細胞プロセスにおいて説明することができ、抗原提示（Ｈｏｎｅｙ及びＲｕｄｅｎｓｋｙ、２００３年；Ｂｒｙａｎｔ及びＰｌｏｅｇｈ、２００４年）アポトーシス（Ｚｈｅｎｇら、２００５年；Ｂｒｏｋｅｒら、２００５年）、プロホルモンプロセシング（Ｈｏｏｋら、２００４年）及び細胞外マトリックスリモデリング（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９４年；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７年）において役割を果たすことが知られている。
【０００４】
カテプシンは、タンパク質分解酵素である。今までに、１１種類のヒトカテプシンが同定されているが、各々のインビボでの特異的役割は、未だに決定されていない（Ｋａｔｕｎｕｍａら、２００３年）。カテプシンＢ、Ｌ、Ｈ、Ｆ、Ｏ、Ｘ及びＣは、ほとんどの細胞で発現され、タンパク質代謝回転の制御に役割を果たす可能性が示唆されているのに対し、カテプシンＳ、Ｋ、Ｗ及びＶは、特定の細胞及び組織に限定されており、これらはより特異的な役割を果たす可能性が示されている（Ｋｏｓら、２００１年；Ｂｅｒｄｏｗｓｋａ、２００４年）。カテプシンＬ様プロテアーゼ（ＣａｔＬ、Ｓ及びＫを含む）は、システインプロテアーゼのＣＡ族に属するタンパク質分解酵素である。これらのリソソームプロテアーゼの各々は、様々な腫瘍の進行に関与している。腫瘍細胞からのこれらの異常に高い分泌は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解をもたらすと考えられる。エラスチン及びコラーゲンなどのＥＣＭ構成成分のこの異常分解は、周辺正常組織へのこれらの異常細胞の浸透及び浸潤を加速する。
【０００５】
カテプシンＬ様プロテアーゼは、Ｎ末端プロペプチドドメインを含有する不活性前駆体として生成される。このプロペプチドは、新生プロテアーゼのフォールディングのためのシャペロンとしても、活性種の阻害物質としても作用し、未成熟リソソームにおける該プロテアーゼの活性部位に結合することが以前に示されている。阻害試験は、ＣａｔＳプロペプチド（ＣａｔＳＰＰ）が活性化ＣａｔＳに対する低ナノモル範囲のＫ１を有すること、並びに恐らく驚くべきことに、ＣａｔＫ及びＣａｔＬに対する同様の特性も有することを示したが、相同性の低いＣａｔＢ、ＣａｔＨ又はパパインには影響しないことも示された。さらに、Ｋ及びＬのプロペプチドが、同族ファミリーメンバーの各々に対し同様の均一な阻害プロファイルを持たないという点で、ＣａｔＳＰＰのこの特性は独特である。
【０００６】
ＣａｔＳ（カテプシンＳ）は、元々、ウシのリンパ節及び脾臓から同定され、ヒト型は、ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた（Ｓｈｉら、１９９２年）。ＣａｔＳをコードする遺伝子は、ヒト染色体１ｑ２１に位置する。ＣａｔＳ遺伝子にコードされた９９６塩基対転写物は、最初に分子量３７．５ｋＤａを有するプロセシングされていない前駆体タンパク質に翻訳される。プロセシングされていないタンパク質は、３３１個のアミノ酸から成り、１５個のアミノ酸はシグナルペプチド、９９個のアミノ酸はプロペプチド配列及び２１７個のアミノ酸はペプチドである。ＣａｔＳは初めにシグナルペプチドにより発現され、シグナルペプチドは小胞体内腔に入った後除去される。プロペプチド配列は、プロテアーゼの活性部位に結合し、酸性のエンドソーム区画へ輸送されるまでこれを不活化する。この後、プロペプチド配列は除去され、プロテアーゼは活性化される（Ｂａｋｅｒら、２００３年）。
【０００７】
ＣａｔＳは、抗原添加前のインバリアント鎖の切断により、主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）によって媒介される抗原提示における重要な酵素として同定された。複数の研究が、ＣａｔＳが欠損したマウスは、ＡＰＣによる外因性タンパク質を提示する能力が損なわれることを示している（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９９年）。インバリアント鎖ＩｉのプロセシングにおけるＣａｔＳの特異性は、喘息及び自己免疫障害などの状態の治療においてＣａｔＳ特異的治療標的を可能にする（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７年）。
【０００８】
カテプシンＬは、元々、ラット肝臓リソソームから単離された後、１９８８年にヒト型が同定された（Ｇａｌ及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ、１９８８年；Ｊｏｓｅｐｈら、１９８８年）。ＣａｔＬをコードする遺伝子は、ヒト染色体９ｑ２１〜２２にマッピングされ（Ｆａｎら、１９８９年；Ｃｈａｕｈａｎら、１９９３年）、８つのエキソン及び７つのイントロンから成る。遺伝子産物は、分子量３９ｋＤａを有するプレプロタンパク質に翻訳され、２つの酵素活性アイソフォーム、すなわち３１ｋＤａの一本鎖型、並びに２４ｋＤａの重鎖及び５ｋＤａの軽鎖から成る二本鎖型にプロセシングされる（Ｍａｓｏｎら、１９８９年）。成熟活性酵素へのプロＣａｔＬのプロセシングは、自己触媒的活性（Ｓａｌｍｉｎｅｎ及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ、１９９０年）を含む様々な機構を介して、及びＣａｔＤ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８９年；Ｗｉｅｄｅｒａｎｄｅｒｓ及びＫｉｒｓｃｈｋｅ、１９８９年）又はメタロエンドペプチダーゼ（Ｈａｒａら、１９８８年）の活性により起こり得る。
【０００９】
ＣａｔＬは、エンドペプチダーゼ活性を有し、Ｐ２及びＰ３位置で疎水性アミノ酸残基とのペプチド結合を優先的に切断する（Ｋａｒｇｅｌら、１９８０年、１９８１年）。ＣａｔＬは、幾つかのタンパク質をカテプシンＳと同じ特異的活性により加水分解することが示されている（Ｋｉｒｓｃｈｋｅら、１９８９年）。しかし、ＣａｔＬは、Ｐ２位置では芳香族残基を好み、密接に関連したカテプシンＳ及びＫとは異なる（ＭｃＧｒａｔｈ、１９９９年）。
【００１０】
ＣａｔＬは、リソソームタンパク質分解及び骨吸収を含む多くの生物学的プロセス、並びに関節炎及び悪性腫瘍などの幾つかの疾患で主要な役割を果たすと提唱されている（Ｒｕｋａｍｐ及びＰｏｗｅｒｓ、２００２年）。抗原提示におけるリソソームシステインプロテアーゼの役割は、過去数年間で広く研究が行われた。ＣａｔＬは、このプロセスに、皮質胸腺上皮細胞でＩｉタンパク質分解の最終ステップを行うＣａｔＬの能力を介して関与している。さらなるエビデンスは、Ｉｉ鎖のｐ４１アイソフォームが、成熟ＣａｔＬタンパク質と相互作用することができ、この活性を阻害しこれを中性ｐＨ環境に安定させることを示した（Ｏｒｇａｎｉｃら、１９９３年；Ｂｅｖｅｃら、１９９６年）。ＣａｔＬ欠損マウスに関する複数の研究は、胸腺の皮質上皮細胞ではインバリアント鎖を分解できないことが観察され（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９８年）、ＣＤ４＋Ｔ細胞選択において明らかな欠陥を示した（Ｒｏｔｈら、２０００年）。カテプシンＬを欠くマウスは、毛包の形態形成の変化により周期的な脱毛及び表皮過形成も発症した。
【００１１】
腫瘍浸潤及び転移におけるＣａｔＬの役割も、ＣａｔＬの普遍的な発現並びに細胞外マトリックス及び基底膜のコンポーネントを分解する能力のため、極めて詳細に研究されている。ＣａｔＬ発現レベルの上昇は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌及び星状細胞腫を含む様々な悪性腫瘍と関連している。
【００１２】
最近のエビデンスは、ＣａｔＬが転写活性化因子として機能する可能性があることも示唆した。ＣａｔＬの別のアイソフォームが以前に報告されているが（Ｒｅｓｃｈｅｌｅｉｔら、１９９６年；Ｓｅｔｈら、２００３年）、Ｎ末端シグナルペプチドを欠いたアイソフォームは核に局在化することが示され、ＣＤＰ／Ｃｕｘ転写因子のプロセシングにおけるＣａｔＬの役割を示唆している。この理論は、ＣＤＰ／Ｃｕｘプロセシングが著しく低下するように思われた、ＣａｔＬ欠損線維芽細胞に関する研究により強化された（Ｇｏｕｌｅｔら、２００４年）。
【００１３】
カテプシンＫは、１９９４年にウサギｃＤＮＡから初めてクローニングされた（Ｔｅｚｕｋａら、１９９４年）後、幾つかの独立グループによりこの翌年にヒトオルソログが記述された（Ｂｒｏｍｍｅら、１９９５年；Ｓｈｉら、１９９５年；Ｉｎａｏｋａら、１９９５年）。ＣａｔＫをコードする遺伝子は、ＣａｔＳと同じ遺伝子座であるヒト染色体１ｑ２１に位置しており、これら２つのプロテアーゼが共通起源を有する可能性があることを示唆している。ＣａｔＫのプロモーター構造は、ＴＡＴＡボックスは無いが２つのＡＰ−１部位があるＣａｔＳのプロモーター構造と類似しており、両者は限定された発現パターンを示す遺伝子の共通の特徴を有する。ヒトＣａｔＫ発現は限局的であることが示されており、大部分は破骨細胞及び卵巣で見出される（Ｂｒｏｍｍｅら、１９９５年；Ｄｒａｋｅら、１９９６年）。
【００１４】
ＣａｔＫのアミノ酸配列は、カテプシンＳ及びＬと高い配列類似性を示し（それぞれ５２％及び４６％）、これら３つの遺伝子は共に、哺乳動物リソソームシステインプロテアーゼ内で小さなサブファミリーを形成する。ＣａｔＫは、ｐＨ５．５で膵エラスターゼよりも大きな活性を有する、最も強力なエラスチン分解酵素の１つとして特徴付けられている（Ｂｒｏｍｍｅら、１９９６年；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７年）。ＣａｔＫは、コラーゲンタイプＩ、ＩＩ及びＩＶの加水分解を触媒することもできる（Ｋａｆｉｅｎａｈら、１９９８年）。
【００１５】
ＣａｔＫのコラーゲン分解活性の生理的関連性は、骨障害である濃化異骨症との関連を通じて説明される（Ｇｅｌｂら、１９９６年）。濃化異骨症は、骨硬化症及び重度の骨異形成を特徴とする常染色体劣性形態である。骨粗鬆症は、骨吸収及び骨形成の間のバランスが乱され、吸収が有利に働く場合に起こる。吸収は、結合部位に酸性環境をもたらす破骨細胞により媒介され、破骨細胞の結合部位では、基質のタンパク質分解が生じる。ＣａｔＫは、濃化異骨症患者におけるナンセンス変異、ミスセンス変異及びストップコドン変異の同定により、このプロセスに関与していた（Ｇｅｌｂら、１９９６年）。ＣａｔＫノックアウトマウスも、破骨細胞における基質分解活性の低下を示すが、マウス表現型はヒト条件より重度ではない（Ｓａｆｔｉｇら、１９９８年）。
【００１６】
ＣａｔＫ発現は、破骨細胞系では炎症部位で及びレチノイン酸によりアップレギュレートされるように思われる（Ｓａｎｅｓｈｉｇｅら、１９９５年）。ＣａｔＫ発現は、骨癌、前立腺癌及び乳癌の巨細胞腫（Ｂｒｕｂａｋｅｒら、２００３年；Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ−Ｅｖａｎｓら、１９９７年）並びに関節リウマチ患者の滑膜線維芽細胞（Ｈｕｍｍｅｌら、１９９８年）で検出されている。
【００１７】
カテプシンＶは、ＣａｔＬとの相同性が極めて高い（７８％）システインプロテアーゼとしてヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから初めて同定された（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、１９９８年）。さらに、ＣａｔＶをコードする遺伝子は、ヒト染色体９ｑ２１〜２２に、ＣａｔＬに隣接してマッピングされた。ＣａｔＬとＶ遺伝子との間の高い相同性及び近い近接性は、２つのプロテアーゼが共通の先祖の前駆体から進化した可能性があることを示唆する（Ｉｔｏｈら、１９９９年；Ｂｒｏｍｍｅら、１９９９年）。しかし、ＣａｔＬで観察された広範な発現パターンが、胸腺、精巣及び角膜上皮に発現が限定されるＣａｔＶに模倣されることはなかった（Ａｄａｃｈｉら、１９９８年、Ｂｒｏｍｍｅら、１９９９年、Ｔｏｌｏｓａら、２００３年）。このプロテアーゼの限定された組織発現は、特殊化された機能を示すものであり、ＣａｔＶは、特定の細胞タイプにおけるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示に不可欠であると考えられる（Ｓｈｉら、１９９９年；Ｔｏｌｏｓａら、２００３年）。他のヒトカテプシンとの配列アラインメントは、ＣａｔＶをＣａｔＬ、Ｓ及びＫと同じヒトＣ１ペプチダーゼ系統枝に位置づけた（Ｂｕｈｌｉｎｇら、２０００年）。
【００１８】
カテプシンの病理学的関連性
プロテアーゼ発現パターンの変化は、多くのヒト病理過程の基礎をなす。カテプシンの脱制御された（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）発現及び活性は、神経変性障害、自己免疫疾患及び腫瘍形成を含む一連の状態と関連があった。
【００１９】
ＣａｔＳアップレギュレーションは、幾つかの神経変性障害と関連があった。ＣａｔＳは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からのβペプチド（Ａβ）産生に関与すると考えられ（Ｍｕｎｇｅｒら、１９９５年）、ＣａｔＳの発現は、アルツハイマー病及びダウン症候群の両方でアップレギュレートされることが示された（Ｌｅｍｅｒｅら、１９９５年）。ＣａｔＳは、多発性硬化症の病因に関与している可能性のある自己抗原である、ミエリン塩基性タンパク質を分解するＣａｔＳの能力を介して多発性硬化症（Ｂｅｃｋら、２００１）及びクロイツフェルト−ヤコブ病にも関与している可能性があり、クロイツフェルト−ヤコブ病患者では、ＣａｔＳ発現は、４倍を超えて増加することが示された（Ｂａｋｅｒら、２００２年）。
【００２０】
異常ＣａｔＳ発現は、アテローム性動脈硬化症とも関連があった。ＣａｔＳ発現は、正常な動脈ではごくわずかであるが、ヒトアテロームは強力な免疫反応性を示す（Ｓｕｋｈｏｖａら、１９９８年）。ＣａｔＳ及びＬＤＬ受容体の両方が欠損した、ノックアウトマウスを用いたさらなる研究は、アテローム性動脈硬化症の発症が有意に少ないことを示した（Ｓｕｋｈｏｖａら、２００３年）。さらなる研究は、炎症性筋疾患及び関節リウマチとＣａｔＳ発現を関連づけた。炎症性筋疾患患者由来の筋生検標本は、対照筋切片と比べてＣａｔＳ発現が１０倍に増加しており（Ｗｉｅｎｄｌら、２００３年）、ＣａｔＳ発現レベルは、変形性関節症患者と比べて関節リウマチ患者由来の滑液で有意に高かった（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００１年）。
【００２１】
ＣａｔＳの役割は、特定の悪性腫瘍においても研究された。ＣａｔＳ発現は、正常組織と比べて肺腫瘍切片及び前立腺癌切片で有意に高いことが示され（Ｋｏｓら、２００１年、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００１年）、ＣａｔＳが腫瘍浸潤及び疾患進行に関与している可能性のあることが示唆された。
【００２２】
本研究所でのＣａｔＳに関する最近の研究は、ヒト星状細胞腫におけるＣａｔＳ発現の重要性を立証した（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００３年；Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００６年）。免疫組織化学分析は、ＷＨＯグレードＩ〜ＩＶ由来のヒト星状細胞腫生検標本パネルでＣａｔＳ発現を示したが、正常な星状膠細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト及び内皮細胞を欠如するように思われた。ＣａｔＳ発現は、グレードＩＶ腫瘍で最も高いように思われ、細胞外活性レベルは、グレードＩＶ腫瘍由来の培養物において最大であった。
【００２３】
ＣａｔＳは、ラミニン、コラーゲン、エラスチン及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンなどのＥＣＭ巨大分子の分解に活性であることが示され（Ｌｉｕｚｚｏら、１９９９年）、Ｕ２５１ＭＧグレードＩＶグリア芽腫細胞系を用いた浸潤アッセイは、ＣａｔＳ阻害剤ＬＨＶＳ２９の存在下では浸潤が最大６１％減少することを示した（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００３年）。これは、ＣａｔＳが、星状細胞腫における腫瘍浸潤プロセスで重要な役割を果たしている可能性があり、したがって抗浸潤治療の標的となり得ることを示唆する。
【００２４】
ＣａｔＬもまた、腫瘍形成を含む一連の異なる病的状態において重要な役割を果たすことが見出された。ＣａｔＬノックアウトマウスの作製は、表皮恒常性、毛周期の調節、及び胸腺の皮質上皮細胞でのＭＨＣクラスＩＩ媒介抗原提示における重大な役割を明らかにした。
【００２５】
ＣａｔＫ発現は、以前に、骨粗鬆症及び特定の悪性腫瘍を含む一連の異なる病態と関連づけられた。稀な骨格状態である、濃化異骨症は、ＣａｔＫの欠損が原因である。ＣａｔＫは通常、タイプ１コラーゲン及び他の骨タンパク質を分解するために機能する（Ｍｏｔｙｃｋｏｖａ及びＦｉｓｈｅｒ、２００２年）。濃化異骨症患者由来の破骨細胞は、カテプシンＫ遺伝子内の突然変異による機能障害である（Ｇｅｌｂら、１９９６年）。
【００２６】
ＣａｔＫ発現は、肺腺癌と関連しているが、非浸潤性気管支肺胞癌を欠いており、肺癌の浸潤性増殖の潜在的マーカーの役目をする（Ｒａｐａら、２００６年）。さらに、ＣａｔＫもまた、骨の巨大細胞腫における主要なプロテアーゼとして同定され（Ｌｉｎｄｅｍａｎら、２００４年）、乳癌との関連（Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ−Ｅｖａｎｓら、１９９７年）が示された。したがって、ＣａｔＫ阻害剤の開発は、特に骨粗鬆症、骨転移及び多発性骨髄腫など、過剰な破骨細胞活性化及び骨吸収を来す病的状態において大きな可能性を有する。
【００２７】
ＣａｔＶは、元々、ＣａｔＬとの相同性が極めて高い（７８％）システインプロテアーゼとして結腸直腸癌及び乳癌、並びに特定の卵巣癌及び腎細胞癌で同定された（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、１９９８年）。さらに、ＣａｔＶの遺伝子は、ヒト染色体９ｑ２１〜２２に、ＣａｔＬに隣接してマッピングされた。これらのコード遺伝子の高い相同性及び近い近接性は、２つのプロテアーゼが共通の先祖の前駆体から進化した可能性があることを示唆する（Ｉｔｏｈら、１９９９年；Ｂｒｏｍｍｅら、１９９９年）。しかし、ＣａｔＬが広範な組織発現を有するのに対し、ＣａｔＶは通常、胸腺、精巣及び角膜上皮に限定される（Ａｄａｃｈｉら、１９９８年、Ｂｒｏｍｍｅら、１９９９年）。このプロテアーゼの限定された組織発現は、特殊化された機能を示すものであり、ＣａｔＶは、特定の細胞タイプにおけるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示に不可欠であると考えられる（Ｓｈｉら、１９９９年；Ｔｏｌｏｓａら、２００３年）。
【００２８】
カテプシンＬ様プロテアーゼの発現及び活性の増加は、一連の疾患で観察されており、これらの病因に関与していた。したがって、これらのプロテアーゼを特異的に標的にする阻害剤の生成は、治療薬としての可能性を有する。
【００２９】
カテプシンＬ様プロテアーゼの阻害
プロテアーゼが過剰発現されている場合、治療戦略はこの酵素活性を遮断する阻害剤の開発が中心であった。カテプシンに対する特定の小分子阻害剤の生成は、選択性及び特異性の問題のため困難であることが過去に判明している。ＣａｔＳに対する強力な可逆的阻害剤としてＷａｌｋｅｒらにより開発されたジペプチドα−ケト−β−アルデヒドは、ＣａｔＢ及びＬの阻害能力を有してはいたが、効率が低く（Ｗａｌｋｅｒら、２０００年）、ＣａｔＳ阻害剤４−モルホリンウレア−Ｌｅｕ−ＨｏｍｏＰｈｅ−ビニルスルホン（ＬＨＶＳ）も、高濃度で使用した場合、他のカテプシンを阻害することが示された（Ｐａｌｍｅｒら、１９９５年）。
【００３０】
ＣａｔＬ様プロテアーゼ向けの小分子阻害剤の開発は、可逆的阻害剤及び不可逆的阻害剤のいずれも十分に記述されている。こうした化合物の臨床応用は、乏しい特異性、正常組織でのプロテアーゼ阻害、及びバイスタンダータンパク質に反応する可能性のため問題がある（Ｔｕｒｋら、２００４年）。したがって、分泌されたタンパク質分解活性のみを標的にできる代替戦略が魅力的である。さらに、プロテアーゼのこのサブファミリーに高い選択性を有するが、このグループ内での特異性が幅広い阻害剤は、遺伝子ノックアウト試験から明らかになった機能の重複のため、より有用であることが判明する可能性がある（Ｓａｆｔｉｇら、１９９８年；Ｎａｋａｇａｗａら、１９９８年；Ｎａｋａｇａｗａら、１９９９年）。
【００３１】
特徴付けられた全プロペプチドのうち、ＣａｔＳＰＰは、ＣａｔＳに加えてＣａｔＬ及びＣａｔＫ双方の同様に効果的な阻害剤であることから、最も興味深い阻害動態プロファイルを有する。Ｍａｕｂａｃｈ及び共同研究者は競合的酵素結合アッセイにおいて、ＣａｔＳＰＰが、ＣａｔＳ（Ｋｉ０．２７ｎＭ）及びＣａｔＬ（Ｋｉ０．３６ｎＭ）の等効力の阻害剤であることを示した（Ｍａｕｂａｃｈら、１９９７年）のに対し、より最近の研究は、ＣａｔＳＰＰが実際はＣａｔＳ（Ｋｉ７．６ｎＭ）よりもＣａｔＬ（Ｋｉ０．４６ｎＭ）のより強力な阻害剤であり、ＣａｔＫ（Ｋｉ７．０ｎＭ）に対しほぼ同じ効果を有することを示唆している（Ｇｕａｙら、２０００年）。
【００３２】
上述の通り、通常では、天然プロペプチドであるカテプシンの活性化は、コンフォメーション変化を受け、放出される。放出後、プロペプチドは不要になると推測される。
【発明の開示】
【００３３】
本発明者らは、驚くべきことに、外因的に適用したカテプシンＳプロペプチド（ＣａｔＳＰＰ）が、浸潤癌モデルにおいてカテプシンＬ様プロテアーゼ活性に対し強力な特異的阻害作用を有することを示した。システインカテプシンプロテアーゼがインビボで活性化されると、レムナントプロペプチドフラグメントは不要となり、該プロテアーゼに対しもはや効果をもたらすことはできないと考えられることから、この結果は特に予想外であった。インビボでの同じ条件下では、外因的に付加したプロペプチドは、なんの効果も持たないと考えられている。さらに、プロペプチドは本来塩基性であることから、細胞内及び細胞上に存在するトリプシン様活性は、いずれの外因性プロペプチドも分解すると予想されよう。
【００３４】
これらの結果は、予測に反して、カテプシンプロペプチドが癌細胞の浸潤又は転移の進行を弱めるのに使用でき、故に治療の状況で使用できることを示している。
【００３５】
したがって、本発明の第１の態様では、細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼ活性の阻害方法であって、前記細胞又は組織へのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法が提供される。
【００３６】
１つの実施形態では、方法はインビトロである。別の実施形態では、方法はインビボである。
【００３７】
活性は完全に又は部分的に阻害され得る。故に方法は、正常活性に対する異常活性を減少させるのに使用され得る。
【００３８】
本発明の第２の態様では、細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現の阻害方法であって、前記細胞又は組織へのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法が提供される。
【００３９】
さらなる態様では、カテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現及び／又は異常活性に関連した状態の治療を必要とする患者におけるこの状態の治療方法であって、カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法が提供される。
【００４０】
さらに、医薬に使用するためのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸が提供される。
【００４１】
本発明はさらに、カテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現及び／又は異常活性に関連した状態の治療に使用するためのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸を提供する。
【００４２】
また、カテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現及び／又は異常活性に関連した状態を治療するための医薬品の製造におけるカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の使用も提供される。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００４４】
カテプシンＬ様プロテアーゼは、カテプシンＬプロテアーゼ、カテプシンＳプロテアーゼ、カテプシンＫプロテアーゼ及びカテプシンＶプロテアーゼから成る。
【００４５】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドは、任意の種のカテプシンプロペプチドであってもよい。１つの実施形態では、種は、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの哺乳動物種である。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、例えばアクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を有する（図３に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１３から１０９として再現された）ヒトカテプシンプロペプチドなどのヒトカテプシンプロペプチドである。
【００４６】
本発明の状況では、カテプシンプロペプチドには、野生型哺乳動物カテプシンプロペプチドのアミノ酸配列又はこのフラグメント若しくは誘導体を含むカテプシンプロペプチドが含まれる。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、野生型哺乳動物カテプシンプロペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドから成る。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド又はこの誘導体若しくはフラグメントは、例えば、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸１７から１１３から成る（図３ｂに示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１３から１０９として再現された）カテプシンＳプロペプチドである。
【００４８】
カテプシンプロペプチドは、例えばポリＨｉｓタグなどのタグを組み込み得る。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、図３ｂのアミノ酸配列１〜１１８として示されたようなポリＨｉｓタグを有するカテプシンプロペプチドである。
【００４９】
実施例に記載の通り、抗体Ｆｃ部分に融合されたカテプシンプロペプチドを用いる場合、腫瘍浸潤の特に強力な阻害は、腫瘍浸潤アッセイで立証された。カテプシンプロペプチドをＦｃ部分との融合ペプチドとして提供することで、分子の形は変化すると予測されたことから、カテプシンプロペプチドが浸潤を阻害する能力を保持しただけでなく、この阻害活性がＦｃ部分の無いカテプシンプロペプチドの活性よりも有意に高かったことは特に驚きであった。
【００５０】
したがって、本発明の１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは抗体Ｆｃ部分を含む。１つのこうした実施形態では、Ｆｃ部分は、例えばマウスＩｇＧタイプｂ Ｆｃ部分などのＩｇＧタイプｂ Ｆｃ部分である。
【００５１】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドは、カテプシンＬ様プロテアーゼの異常発現が関連した任意の状態の治療において使用され得る。例えば、本発明が使用され得る状態には、腫瘍性疾患、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、喘息、又はアテローム性動脈硬化症が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態では、状態は、カテプシンＳの過剰発現及び／又は異常活性に関連した状態である。
【００５２】
各々の他の態様に関しては、状況が特に求めない限り必要に応じて変更を加えることが、本発明の各態様の好ましい特徴である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
上述の通り、及び実施例で立証されている通り、本発明者らは、予想に反して、カテプシンプロペプチドがカテプシンＬ型プロテアーゼ活性を、特にＣａｔＳ、ＣａｔＬ、ＣａｔＶ及びＣａｔＫの活性を強力に阻害する働きがあることを腫瘍浸潤アッセイで示し、並びにカテプシンプロペプチドが、修正ボイデンチャンバー浸潤アッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）を用いた乳癌、結腸癌、前立腺癌及び星状細胞腫モデルにおいて腫瘍浸潤を強力に遮断することを示した。これらの結果は、この分子が腫瘍形成に対し、浸潤性又は転移性癌細胞の進行を減弱する効果を有することを立証するものである。
【００５４】
カテプシンプロペプチド
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドは、例えば哺乳動物種など、任意の種のカテプシンプロペプチドであってよい。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、例えばＭ９０６９６のアミノ酸残基１７から１１３の配列に相当する配列を有するアミノ酸（図３ｂに示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１３から１０９として再現された）を含むカテプシンプロペプチドなどの、ヒトカテプシンプロペプチドである。
【００５５】
本発明の状況では、カテプシンプロペプチドには、野生型哺乳動物カテプシンプロペプチドのアミノ酸配列又はこのフラグメント若しくは誘導体を含むカテプシンプロペプチドが含まれる。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドは、野生型哺乳動物カテプシンプロペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドから成る。
【００５６】
１つの実施形態では、本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド又はこの誘導体若しくはフラグメントは、カテプシンＬ型プロテアーゼプロペプチドである。例えば、本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド又はこの誘導体若しくはフラグメントは、カテプシンＳプロペプチドであってよい。
【００５７】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドのフラグメントとは、一般に少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の、例えば、野生型カテプシンプロペプチドの少なくとも５０個以上の連続するアミノ酸といった、少なくとも３０個など、典型的には少なくとも２０個の隣接するアミノ酸の、アミノ酸残基の一続きを意味する。
【００５８】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチドの「誘導体」とは、典型的には、野生型カテプシンプロペプチドと比べ、アミノ酸配列を改変することで、例えば、該タンパク質をコードする核酸の操作により、又は該タンパク質自体を変化させて修飾されるポリペプチドを意味する。こうした誘導体は、１個又は複数個のアミノ酸の挿入、付加、欠失及び／又は置換を伴い得る。１つの実施形態では、誘導体は、例えば１５個以下など２５個以下のアミノ酸の、例えば１個又は２個のアミノ酸のみなど５個以下のアミノ酸といった、典型的には１０個以下のアミノ酸の、挿入、付加、欠失及び／又は置換を含み得る。カテプシンプロペプチドペプチドの誘導体は、天然アミノ酸以外のアミノ酸又は置換アミノ酸を含有し得る。例えば、誘導体はペプチド模倣剤から得ることができる。
【００５９】
本発明の１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドはＦｃ部分を含む。
【００６０】
本発明で使用され得るカテプシンプロペプチドのフラグメント又は誘導体は、好ましくはカテプシンプロペプチド機能活性を保持する。前記活性は、例えば修正ボイデンチャンバー浸潤アッセイを用いる、例えば腫瘍モデルにおいて、腫瘍浸潤を阻害する能力である。１つの実施形態では、カテプシンプロペプチドフラグメント又は誘導体は、野生型ヒトカテプシンプロペプチドの腫瘍浸潤阻害活性の少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％を保持する。
【００６１】
本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド、フラグメント及び誘導体は、当技術分野で既知の任意の方法を用いて生成され得る。
【００６２】
しかし、本発明者らは、カテプシンプロペプチドの簡易化組換え製造のための新規な簡易化方法を開発した。実施例に示された通り、本発明者らは、組換えカテプシンプロペプチドが、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグによりうまく発現され得、リフォールド金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて精製され得ることを立証した。
【００６３】
したがって、本発明の１つの態様では、カテプシンプロペプチドは、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を含む精製ステップを伴う方法により製造される。
【００６４】
実際、本発明のさらなる独立した態様では、カテプシンプロペプチドの組換え製造方法が提供される。前記方法は、Ｎ末端ポリヒスチジンタグによるカテプシンプロペプチドの発現、及び金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いた発現プロペプチドの精製を含む。１つの実施形態では、プロペプチドは尿素含有緩衝液の存在下で精製される。
【００６５】
ＩＭＡＣの原理は、一般に当業者に理解されている。吸着は、吸着マトリックスでのキレート化により固定化された金属イオンと、結合するタンパク質表面の接近可能な電子供与アミノ酸との間の金属配位複合体の形成が前提になると考えられる。
【００６６】
同様に、組換えタンパク質へのポリヒスチジンタグの付加は、当技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第４，５６９，７９４号を参照のこと）。
【００６７】
核酸
本発明の、及び本発明で使用するための核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。核酸は、組換え的に、合成的に、又は標準的方法を用いたクローニングを含む、当業者に利用可能な任意の手段により製造され得る。
【００６８】
核酸は、任意の適切なベクターに挿入され得る。１つの実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、核酸は、宿主細胞での核酸発現を提供できる対照配列に操作可能に結合される。様々なベクターが使用され得る。例えば、適切なベクターには、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）；酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド、又はコスミドＤＮＡが含まれる。
【００６９】
ベクターは、核酸を宿主細胞に導入するのに使用され得る。様々な宿主細胞が、本発明で使用するための核酸の発現に使用され得る。本発明で使用するための適切な宿主細胞は、原核生物又は真核生物であってよい。これらには、例えば大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が含まれる。使用され得る哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、サル及びヒト細胞系及びこの誘導体並びに多くの他の細胞系が含まれる。
【００７０】
遺伝子産物の発現を調節し、修飾し、及び／又は特異的に処理する宿主細胞株が使用され得る。こうしたプロセシングは、グリコシル化、ユビキネーション、ジスルフィド結合形成及び一般的な翻訳後修飾を伴い得る。
【００７１】
例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シークエンシング、細胞へのＤＮＡ導入及び遺伝子発現などにおける核酸操作、並びにタンパク質分析のための既知の方法及びプロトコルに関する詳細は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年及び、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： 第３版 Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００年などを参照のこと。
【００７２】
治療
「治療」には、ヒト又はヒト以外の動物に利益をもたらすことができる任意のレジメンが含まれる。治療は、既存状態に関するものであり得、又は予防（予防治療）であり得る。治療には、治癒的、緩和的又は予防的効果が含まれ得る。
【００７３】
本発明の、並びに本発明で使用するためのカテプシンプロペプチド、核酸及び方法は、幾つかの病状の治療において使用され得る。これらには、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、癌、喘息及びアテローム性動脈硬化症が含まれる。特に、これらは、カテプシンプロテアーゼの過剰発現（すなわち、類似した同等の正常な健常細胞での発現よりも多い）及び／又は異常活性（例えば類似した同等の正常な健常細胞での活性よりも大きい）に関連した状態の治療において使用され得る。
【００７４】
本発明の、並びに本発明で使用するためのプロペプチド、核酸及び方法は、癌治療において使用され得る。「癌治療」には、癌性増殖が原因である状態の治療が含まれ、腫瘍性増殖又は腫瘍の治療が含まれる。本発明は、特に既存の癌の治療、及び初期治療又は手術後の癌の再発予防において有用であり得る。
【００７５】
本発明を用いて治療することができる腫瘍の例には、例えば、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む肉腫、例えば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌などの悪性腫瘍、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽腫、メラノーマ、骨髄腫、ウイルムス腫瘍、並びに急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病を含む白血病、星状細胞腫、神経膠腫並びに網膜芽細胞腫などが含まれる。
【００７６】
１つの実施形態では、癌は、乳癌、結腸癌、前立腺癌及び星状細胞腫から選択される。
【００７７】
本発明を用いて治療され得る炎症性及び／又は自己免疫障害には、多発性硬化症、グレーブス病、炎症性筋疾患及び関節リウマチが含まれる。
【００７８】
本発明の結合メンバー、核酸及び方法を用いて治療され得る神経変性障害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症及びクロイツフェルト−ヤコブ病が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明の方法を用いて治療され得る他の状態には、アテローム性動脈硬化症及び結核が含まれる。アテローム性動脈硬化症及び肥満を異常ＣａｔＳと結びつけるエビデンスが示されている。カテプシンＬは、感染においてＴＢ抗原を処理することが示されており、故に恐らくこの適正な処理を妨げる。
【００８０】
医薬組成物
本発明の、並びに本発明で使用するためのプロペプチド及び核酸は、医薬組成物として投与され得る。本発明による、及び本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて医薬的に許容な可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、安定剤又は当業者によく知られた他の物質を含み得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年を参照のこと）。こうした物質には、酢酸、トリス、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などの緩衝液；抗酸化剤；防腐剤；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；炭水化物；キレート剤；等張化剤；又は界面活性剤が含まれる。
【００８１】
組成物は、好ましくは本発明のプロペプチド、核酸又は組成物の活性に悪影響を与えない補助活性を有する、特定の治療適応のため必要に応じて選択された１つ又は複数のさらなる活性化合物を含有することもできる。例えば、癌治療では、カテプシンプロペプチドに加えて、製剤は、１つ又は複数のカテプシンＬ様プロテアーゼに結合する抗体、又は例えば特定の癌の増殖に影響を与える増殖因子など、幾つかの他の標的に対する抗体、及び／又は化学療法剤を含んでよい。
【００８２】
活性成分（例えば、プロペプチド及び／又は化学療法剤）は、マイクロスフェア、マイクロカプセルリポソーム、その他の微粒子送達システムを介して投与され得る。例えば、活性成分は、例えば、コアセルベーション技術若しくは界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレートマイクロカプセル）により調製され得るマイクロカプセル内、コロイド薬物送達システム中（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中に封入することができる。さらなる詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲら、編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年を参照のこと。
【００８３】
持続放出製剤は、活性剤の送達に使用され得る。持続放出製剤の適切な例には、マトリックスが、例えばフィルム、座薬又はマイクロカプセルなどの造形品の形態である、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれる。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００８４】
本明細書に記載のプロペプチドは、少なくとも幾つかの実施形態では、内科的治療のためヒト又は他の哺乳動物に投与されることが意図される。
【００８５】
ペプチドは、典型的には非経口的に投与され、血漿プロテアーゼにより容易に代謝され得る。恐らく最も魅力的な投与経路である経口投与は、より問題となり得る。胃では、酸がペプチドを分解し、酵素がペプチドを破壊する。残存して腸管に入るペプチドは、胃及び膵酵素、エキソ及びエンドペプチダーゼ、並びに刷子縁ペプチダーゼを含む、様々な酵素により絶えず攻撃されるため、別のタンパク質分解を受ける。この結果、腸管腔から血流へのペプチドの通過は、著しく制限され得る。しかし、治療ペプチドの非経口及び経口投与を可能にする様々なプロドラッグが開発されている。
【００８６】
ペプチドは、ポリマー部分など様々な部分に結合して、例えば、酸及び酵素分解耐性を増加し、こうした薬剤の粘膜貫通を増大するなど、ペプチド剤の生理化学特性を修飾することができる。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓは、水溶性の、非免疫原性の、インビボで安定化したプロドラッグを得るために酵素を誘導体化する様々な方法を記載している（「Ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ ａｄｄｕｃｔｓ」、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ、編Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ及びＲｏｂｅｒｔｓ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．（１９８１年））。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓは、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリコペプチド、ポリエチレングリコール及びポリアミノ酸などのポリマー材料と酵素を結合させる様々な方法を考察している。得られた結合ポリペプチドは、非経口適用のための生物活性及び水への可溶性を保持する。米国特許第４，１７９，３３７号は、生理学的に活性な非免疫原性の水溶性ポリペプチド組成物を得るため、分子量５００から２０，０００ダルトンを有するポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールにペプチドを結合することを教示する。ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールは、ポリペプチドが活性を喪失するのを防ぎ、実質的な免疫原性応答なしに組成物を哺乳動物循環系に注入することができる。
【００８７】
米国特許第５，６８１，８１１号、米国特許第５，４３８，０４０号及び米国特許第５，３５９，０３０号は、親油性及び親水性部分を含むオリゴマーに結合した治療剤を含む、安定化した、結合ポリペプチド複合体を開示する。Ｇａｒｍｅｎらは、タンパク質−ＰＥＧプロドラッグを記載する（Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．及びＫａｌｉｎｄｊｉａｎ，Ｓ．Ｂ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８７年、２２３、３６１〜３６５頁）。プロドラッグは、先ず多分散ＭＰＥＧ５０００から無水マレイン酸試薬を調製し、次いでこの試薬を本明細書に開示されたペプチドに結合して、この化学を用いて調製することができる。無水マレイン酸とのアミノ酸の反応はよく知られている。アミン含有薬剤を改良するためのマレイル−アミド結合の加水分解は、隣接した遊離カルボキシル基の存在、及び二重結合により生じた攻撃の形状により助長される。ペプチドは、生理学的条件下で（プロドラッグの加水分解により）放出され得る。
【００８８】
このような戦略は、本発明で使用するためのプロペプチドを送達するのに使用することができる。
【００８９】
ペプチドはまた、分解可能な結合、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、２００２年、５４、４５９〜４７６頁に（ペグ化インターフェロンα−２ｂに関して）示された分解可能な結合などを介して、多分散ＰＥＧなどのポリマーに結合することもできる。
【００９０】
ペプチドはまた、１，６又は１，４ベンジル脱離（ＢＥ）戦略（Ｌｅｅ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、（２００１年）、１２、１６３〜１６９頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．ら、米国特許第６，１８０，０９５号、２００１年；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、４２、３６５７〜３６６７頁を参照のこと。）；トリメチルロックラクトン化（ＴＭＬ）の使用（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、４３、４７５〜４８７頁）；水酸基末端カルボン酸リンカーへのＰＥＧカルボン酸リンカーの結合（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９８年、８７（１１）、１４４０〜１４４５頁）、並びにカルバミン酸塩及びＰＥＧアミド又はエーテル間のメタ関係を伴うプロドラッグ構造（米国特許第６，４１３，５０７号）；及び加水分解機構とは反対の還元機構を伴うプロドラッグ（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１９９９年、１０（５）、７０３〜７０７号）を含め、カルバミン酸アリルを介してアミン含有薬剤に結合したＭＰＥＧフェニルエーテル及びＭＰＥＧベンズアミドのファミリーを含むＰＥＧプロドラッグ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、２００２年、５４、４５９〜４７６頁）を用いてＰＥＧなどのポリマーに結合することもできる。
【００９１】
幾つかのアプローチは、胃腸管でのタンパク質及びペプチドの分解速度を遅くする酵素阻害剤の使用を伴い、本明細書に記載のプロペプチドに使用することができる。これらには、局所消化酵素を不活化するｐＨ操作；傍細胞輸送及び経細胞輸送の増加によるペプチド吸収を改善する透過促進剤の使用；腸上皮、特に、パイエル板によるインタクトな吸収を促進し酵素分解耐性を増加する微粒子キャリアとしてのナノ粒子の使用；腸管腔での化学及び酵素分解から薬剤を保護する乳濁液；並びに水溶化しにくい薬剤のためのミセル製剤が挙げられる。
【００９２】
幾つかのケースでは、ペプチドは、ペプチドが胃で放出されないように、腸溶コーティングされた適切なカプセル又は錠剤で提供され得る。或は、又はさらに、ペプチドは、プロドラッグとして提供され得る。１つの実施形態では、ペプチドは、プロドラッグとしてこれらの薬剤送達デバイス中に存在する。
【００９３】
ペプチドの遊離アミノ基、ヒドロキシル基、又はカルボン酸基は、ペプチドをプロドラッグに変換するのに使用することができる。プロドラッグには、１個のアミノ酸残基、又は２個以上（例えば、２、３又は４個）のアミノ酸残基のポリペプチド鎖が、様々なポリマー、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコールの遊離アミノ基、ヒドロキシ基若しくはカルボン酸基にペプチド結合を介して共有結合した化合物が含まれる。プロドラッグには、炭酸塩、カルバミン酸塩、アミド及びアルキルエステルが、Ｃ末端カルボン酸を介して上記ペプチドに共有結合した化合物も含まれる。
【００９４】
本発明のペプチド（プロペプチド）を含むプロドラッグ、又は本発明のペプチド（アナログ及びフラグメントを含む）を放出する若しくは放出可能なプロドラッグは、本発明の誘導体とみなされる。
【００９５】
ペプチド模倣剤
本発明は、さらに、治療ペプチドとして使用することができる模倣プロペプチドの使用を包含する。模倣プロペプチドは、本明細書に記載のカテプシンプロペプチドの生物活性を模倣する短いペプチドである。このような模倣ペプチドは、ファージディスプレイ又はコンビナトリアルケミストリーなど当技術分野で既知の、だがこれらに限定されない方法から得ることができる。例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、Ｓｃｉｎｃｅ ２７３：４５８〜４６３頁（１９９６年）により開示された方法は、模倣ＱＵＢ６９８．８ペプチドを生成するのに使用することができる。
【００９６】
上述の通り、カテプシンプロペプチドをコードする核酸は、治療方法に使用することもできる。こうした核酸は、当技術分野で既知の任意の適切な方法を用いて目的とする細胞に送達され得る。核酸（場合によりベクターに含有される）は、インビボ又はエクスビボ方法を用いて患者の細胞に送達され得る。インビボ方法では、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど）によるトランスフェクション、及び脂質ベース系（遺伝子の脂質媒介導入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌ）が使用され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： ８０８〜８１３頁（１９９２年）を参照のこと。国際公開９３／２５６７３号パンフレットも参照のこと）。
【００９７】
エクスビボ方法では、核酸は、患者に直接投与される又は、例えば、患者に移植される多孔質膜内に封入して投与される修飾細胞により、患者の単離細胞に導入される（例えば米国特許第４，８９２，５３８号及び５，２８３，１８７号を参照のこと）。核酸を生存細胞に導入するのに利用可能な技法には、レトロウイルスベクター、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などの使用が含まれ得る。
【００９８】
プロペプチド、核酸、薬剤、生成物若しくは組成物は、局在化した方法で腫瘍又は他の所望の部位に投与することができ、又は腫瘍若しくは他の細胞を標的にする方法で送達することができる。ターゲティング治療は、抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的系の使用により、活性薬剤を特定の細胞タイプへより特異的に送達するのに使用することができる。ターゲティングは、例えば薬剤が許容し難いほど毒性がある場合、又はそうしなければあまりに高用量を必要とすることになる場合、又はそうしなければ標的細胞に侵入できなくなる場合など、様々な理由のため望ましい場合がある。
【００９９】
用量
本発明のプロペプチド、核酸又は組成物は、好ましくは、個体に対する利益を示すのに十分な量である、「治療有効量」で個体に投与される。実際の投与レジメンは、治療する状態、この重症度、治療する患者、使用する薬剤を含む幾つかの要因に依存し、医師の裁量によるであろう。
【０１００】
最適量は、例えば、年齢、性別、体重、治療する状態の重症度、投与する活性成分及び投与経路を含む幾つかのパラメータを基に、医師により決定され得る。
【０１０１】
本発明は、これより、以下の非限定例においてさらに記載される。添付図を参照する。
【実施例】
【０１０２】
材料及び方法
ＣａｔＳＰＰのクローニング及び発現
残基１７〜１１３のヒトＣａｔＳＰＰを、それぞれＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限部位（下線）を含有するプライマーＣＡＴＳＰＰＦ（５’ ＴＴＴ ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＧＣＡＴＡＡＡＧＡＴＣＣＴＡＣ）及びＣＡＴＳＰＰＲ（５’ ＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＣＧＡＴＴＡＧＧＧＴＴＴＧＡ）を用いて、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｏｒｉｇｅｎｅ社）から増幅した。３３０ｂｐの予測バンドを、アガロース電気泳動で視覚化した。このバンドをゲル精製し、下流操作のためＮ末端ヘキサヒスチジンタグを組み込んだｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ社）にＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを用いてクローニングした。陽性クローンをコロニーＰＣＲで同定し、配列をアクセッション番号Ｍ９０６９６にアラインメントした。単一の確認したクローンを後の実験で使用した。
【０１０３】
ＣａｔＳＰＰ−Ｆｃのクローニング及び発現
ｐＲＳＥＴ−ＦｃベクターへのＣａｔＳＰＰのクローニングでは、やはりそれぞれＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限酵素部位（下線）を有する、プライマーＣＡＴＳＰＰＦＣＦ（５’ ＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＧＣＡＴＡＡＡ ＧＡＴ）及びＣＡＴＳＰＰＦＣＲ（５’ ＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＧＧＴＴ）を用いて、ＤＮＡ配列を増幅した。増幅したバンドをゲル切除し、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含有するように前もって改変したｐＲＳＥＴ細菌発現ベクターにクローニングした。陽性クローンをコロニーＰＣＲで同定し、配列をアクセッション番号Ｍ９０６９６にアラインメントした。単一の確認したクローンを全ての後の実験で使用した。
【０１０４】
ＣａｔＳＰＰ及びＣａｔＳＰＰ−Ｆｃのタンパク質発現及び精製
発現分析では、ＣａｔＳＰＰ陽性クローンをＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換し、対数増殖期中期（Ａ５５０ ０．５、３７℃）に達するまで振盪フラスコ（５００ｍｌ）で培養した。ＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ陽性クローンの発現分析を、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ株を用いて形質転換により行った。組換えタンパク質の発現はいずれも、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）を細菌培養物に添加して誘導し、回収前にさらに４時間増殖させた。細胞ペレットを再懸濁し、８Ｍ尿素含有５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールで溶解した。粗変性溶解物を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃で６０分間）により清澄にした後、Ｎｉ２＋イオンを負荷したＩＭＡＣカラム（ＨｉＴｒａｐ １ｍｌカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｃａｒｅ社）に適用した。非特異的結合物質を８Ｍ尿素含有５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭイミダゾールを用いてカラムから洗浄した後、２００カラム容量にわたって尿素を８Ｍから０Ｍに減らしてオンカラムリフォールディングした。リフォールディングしたカラム結合物質を、さらに２０カラム容量の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭイミダゾールで洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。タンパク質画分を回収し、ＰＢＳで脱塩し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより分析して純度及び完全性を判定した。精製組換えタンパク質のストックを、使用前に−２０℃で貯蔵した。
【０１０５】
ｒＣａｔＳＰＰによるシステインカテプシンの阻害
酵素アッセイを使用して、ヒトカテプシンＳ、Ｌ、Ｋ、Ｖ及びＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）のペプチド分解活性を阻害するｒＣａｔＳＰＰの能力を確認した。アッセイは、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、０．１％ Ｂｒｉｊ及び１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（ｐＨ５．５）の存在下、９６ウェルマイクロタイタープレートで３連で行った。ＣａｔＳ活性を、蛍光発生基質カルボベンジルオキシ−Ｌ−バリニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アルギニルアミド−４−メチルクマリン（Ｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、２５μＭ）を用いてモニターし、カテプシンＬ、Ｋ及びＶのアッセイは、カルボベンジルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニルアミド−４−メチルクマリン（Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、２５μＭ）を用いて行い、ＣａｔＢのアッセイは、基質としてカルボベンジルオキシ−Ｌ−アルギニルアミド−Ｌ−アルギニルアミド−４−メチルクマリン（Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、２５μＭ）を用いて行った。精製ｒＣａｔＳＰＰを、様々な濃度（０〜１０００ｎＭ）で必要に応じてアッセイに添加した。全ての実験は、３９５ｎｍの励起及び４６０ｎｍの発光を有するＣｙｔｏｆｌｕｏｒ（登録商標）４０００蛍光光度計を用いて行った。ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃもまた、ＣａｔＳの活性を阻害する能力を有することを確かめるため、蛍光分析を、ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ（０ｎＭ〜２００ｎＭ）の存在下でＣａｔＳ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、２５μＭ）を用いて行った。
【０１０６】
システインカテプシン発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
ヒト悪性細胞系パネルにおけるシステインカテプシンＳ、Ｌ、Ｋ及びＶの相対発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により判定した。Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、ＲＮＡをＵ２５１ｍｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＴ１１６及びＰＣ３細胞系から抽出し、分光光度計を用いて定量した。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて以下の条件下で行った：５０℃で３０分間、９５℃で１５分間、並びに９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１分３０秒間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間又は本文に詳述した通り。一連のシステインカテプシン増幅は、以下の表に詳述したプライマーを用いて行った。β−アクチン遺伝子増幅を、同等のローディングを立証するための内部対照として使用した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分析し、コダック１Ｄ ３．４ ＵＳＢソフトウェア及びデジタルカメラを用いてＵＶ光下で画像を撮影した。
【０１０７】
遺伝子ＲＴ−ＰＣＲプライマー配列
ＣａｔＳ（Ｆ） ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＴＣ ＡＴＧ ＴＧＡ ＣＡＡ Ｇ
ＣａｔＳ（Ｒ） ＴＡＣ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＴＣＡ ＴＧ
ＣａｔＬ（Ｆ） ＡＴＧ ＡＡＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴＴ ＧＣ
ＣａｔＬ（Ｒ） ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＧＧ ＧＴＡ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＧ
ＣａｔＫ（Ｆ） ＡＴＧ ＴＧＧ ＧＧＧ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＴＴ ＣＴＧ Ｃ
ＣａｔＫ（Ｒ） ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＧＣ Ｃ
ＣａｔＶ（Ｆ） ＡＴＧ ＡＡＴ ＣＴＴ ＴＣＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＣ
ＣａｔＶ（Ｒ） ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＴＴ ＧＧＧ ＧＴＡ ＧＣＴ ＧＧＣ
アクチン（Ｆ） ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧ
アクチン（Ｒ） ＣＧＴ ＣＡＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣ
【０１０８】
インビトロ浸潤アッセイ
インビトロ浸潤アッセイは、１２μｍ細孔膜を有する修正ボイデンチャンバー（Ｃｏｓｔａｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ社、ケンブリッジ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。膜をマトリゲル（１００μｇ／ｃｍ２）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、オックスフォード、ＵＫ）でコートし、層流フードで一晩乾燥させた。
【０１０９】
細胞を、所定濃度のｒＣａｔＳＰＰの存在下、無血清培地５００μｌの各ウェルに添加した。アッセイは全て３連で行い、浸潤プレートは、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、膜の上表面に残っている細胞を除去し、浸潤細胞をカルノワ固定液で１５分間固定した。乾燥後、浸潤細胞の核を、ヘキスト３３２５８（５０ｎｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液で３０分間室温にて染色した。チャンバーインサートをＰＢＳで２度洗浄し、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒにマウントし、浸潤細胞をニコンＥｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００蛍光顕微鏡で眺めた。３連での各膜からの代表的な視野のデジタル画像を、ニコンＤＸＭ１２００デジタルカメラを用いて倍率×２０で撮影した。結果を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍａｇｉｎｇ社によるＬｕｃｉａ ＧＦ ４．６０を用いて分析し、浸潤細胞のパーセンテージで表した。
【０１１０】
細胞生存アッセイ
ｒＣａｔＳＰＰの細胞毒性効果又は増殖効果は、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞系を用いてＭＴＴアッセイにより判定した。細胞を、２００μｌあたり１×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに添加した。２００ｎＭ ｒＣａｔＳＰＰ、同一条件下で同じベクターから生成した対照タンパク質及びビークルのみの対照を、細胞に添加し、２４、４８、及び７２時間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。この後、培地を慎重に除去し、０．５ｍｇ／ｍｌ ３−４，５−ジメチルチアゾール−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）２００μｌを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＭＴＴ試薬を除去し、不溶性ホルマザン結晶をＤＭＳＯ１００μｌで溶解した。吸光度を５７０ｎｍで測定し、結果を各ビークルのみの対照と比較した細胞生存又は増殖のパーセンテージで表した。テストは全て５連で行った。
【０１１１】
結果及び考察
これまで、ＣａｔＳＰＰの精製は、幾つかの異なるアプローチにより達成されてきた。Ｍａｕｂａｃｈ及び共同研究者らは、ＧｄｎＨＣｌ濃度勾配に対するリフォールディングにより封入体から、残基１６〜１１４に相当するペプチドを単離して、大腸菌発現系からＣａｔＳＰＰを生成した（Ｍａｕｂａｃｈら、１９９７年）。Ｇｕａｙ及び同僚らも、ＰＰ（残基１７〜１１４）を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｃ末端融合として生成する別のアプローチを用いて、大腸菌で生成した。組換えタンパク質は、封入体において再度生成した。封入体はこの後、ＧｄｎＨＣｌ濃度勾配に対してリフォールディングした後、ＧＳＴ−セファロースカラムでアフィニティー精製し、トロンビン切断ステップによりＰＰをＧＳＴ融合から除去した（Ｇｕａｙら、２０００年）。この後者の手順は、ＣａｔＫＰＰ及びＣａｔＬＰＰの生成にも使用されている。これらの従来の方法はいずれも、生物活性タンパク質を生成したが、特に封入体の単離及びリフォールディングに手間と時間を要する。ＣａｔＳＰＰ生成のためのより迅速な簡易化方法を決定するため、本発明者らは、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグでペプチド（残基１７〜１１３）を発現させ、リフォールドＩＭＡＣによりこのタンパク質を精製した。
【０１１２】
詳述した遺伝子特異的プライマーＣＡＴＳＰＰＦ及びＣＡＴＳＰＰＲを用いて、プロペプチド領域（残基１７〜１１３）をコードするオープンリーディングフレームを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により市販のｃＤＮＡライブラリーから増幅した。アガロース電気泳動により分析した場合、予測サイズのバンドを視覚化した（図１）。ゲル抽出後、バンドを市販のベクター（ｐＱＥ３０）にクローニングした。コロニーＰＣＲによる１６クローンの分析は、コロニー１０から増幅した約６５０ｂｐのバンドを明らかにする（図２ａ）。これは、コロニー１０のみが、ｐＱＥ３０細菌発現ベクターに首尾よくクローニングされたＣａｔＳＰＰ ｃＤＮＡ配列を含有している可能性を示唆するものであろう。
【０１１３】
ＤＮＡを完全な検証のため配列決定した（アクセッション番号Ｍ９０６９６にアラインメントした配列）（図２ｂを参照のこと）。選択したクローンは、さらなる試験のためｒＣａｔＳＰＰ種を単離する、さらなる増殖及び発酵の全てに使用した。
【０１１４】
次いで、先ずタンパク質の過剰発現について、並びにタンパク質がＮ末端ヒスタグを含有し予測分子量１６ｋＤａであること、及びタンパク質発現がＩＰＴＧで誘導可能な、Ｔ５プロモーターの支配下にあることを検証するため、検証したクローンからのｒＣａｔＳＰＰ発現を分析した。
【０１１５】
ｒＣａｔＳＰＰを、ｐＱＥ３０細菌発現ベクターから発現させ、オンカラムリフォールディングＩＭＡＣを用いて精製した。図３ａ）に示した通り、ｒＣａｔＳＰＰの溶出プロファイルは、幾つかのピーク、すなわち１８５分後の急激な最初のピーク、続く１９０分から１９５分の間の幅広いピークを含有する。図３ｂに矢印で示した第２の幅広いピークからの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、（Ｈｉｓ）６タグ付きｒＣａｔＳＰＰの予測分子量に相当する、分子量約１６ｋＤａを有する単一の高純度なバンドの存在を明らかにした。図３ｃ）は、抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いた精製画分の免疫ブロッティングが、約１６ｋＤａでｈｉｓタグ付き種の存在を確認することを示している。
【０１１６】
ＩＰＴＧによるｒＣａｔＳＰＰ発現の誘導性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより立証した（図４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色による細菌溶解物の分析は、レーンｂの約１６ｋＤａでｒＣａｔＳＰＰの存在を示す。これはレーンｂでは誘導されたが、非誘導レーン（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ ｌａｎｅ）ａでは誘導されなかった（図４ａ）。ニトロセルロース膜への細菌溶解物の移行、及び抗ポリヒスチジンタグ抗体によるブロッティングは、誘導レーンｂのみでこのタンパク質発現を確認する（図４ｂ）。分子量マーカーを各画像の左に示す（ｋＤａ）。
【０１１７】
ＰＢＳでの最終脱塩後、次いでプロペプチドを生物活性についてテストした。ｒＣａｔＳＰＰタンパク質の生物活性は、所定濃度のｒＣａｔＳＰＰの存在下（０ｎＭから５００ｎＭ）、ＣａｔＳ及び蛍光発生基質Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣを用いて蛍光分析により確認した。ｒＣａｔＳＰＰ存在下のＣｂｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣの加水分解に関するプログレス曲線をプロットし、ＣａｔＳ活性の用量依存阻害を観察した（図５）。同じベクターから生成し同じ方法で精製した対照（Ｈｉｓ）６タグ付きタンパク質を対照（５００ｎＭ）に用いて、ＣａｔＳ活性の摂動がｒＣａｔＳＰＰによるものであることを確認した（挿入図）。アッセイは全て３連で行った。
【０１１８】
プログレス曲線は、遅延結合性可逆的阻害剤（ｓｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の作用を示す。作成された見かけの一次反応速度曲線に、次いで、経時的な蛍光の生成［Ｐ］を以下の方程式で表すことができる非線形回帰分析を行った（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＷａｌｓｈ、１９９８年）。
［Ｐ］＝ｖｓｔ−（ｖｓ−ｖｏ）（１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓｔ））／ｋｏｂｓ＋ｄ （１）
【０１１９】
ＧｒａＦｉｔ（登録商標）ソフトウェアを用いて、図７ａに示したプログレス曲線の値を、非線形回帰分析により方程式（１）に合わせ、Ｋｉ（ｏｂｓｅｒｖｅｄ）を判定する、［Ｉ］に対するｖｓのグラフを作成した。次いでこれを、方程式（２）に示した通り、競合基質を説明するため修正した。
｛Ｋｉ＝Ｋｉ（ｏｂｓｅｒｖｅｄ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）｝ （２）
【０１２０】
この分析を用いて、ｒＣａｔＳＰＰによるＣａｔＳの阻害についてＫｉ値を算出した（図６）。
【０１２１】
さらに、図７に示した通り、所定濃度のｒＣａｔＳＰＰの存在下でカテプシンＫ、Ｖ、Ｌ及びＢ（それぞれ、ａ〜ｄ）を用いて蛍光分析を行った。蛍光は３０分間モニターし、ＲＦＵを経時的にプロットして蛍光分析プログレス曲線を作成した。ｒＣａｔＳＰＰによるカテプシン阻害により作成された見かけの一次反応速度定数に非線形回帰分析を行い（挿入図）、阻害定数（Ｋｉ）をそれぞれ、１７．６ｎＭ（±１．３）、４．８ｎＭ（±０．６）、及び０．６２ｎＭ（±０．１４）に決定することが可能となった。蛍光分析は全て、３回繰り返した。
【０１２２】
抗ペプチド分解活性の確立を確認したことで、本発明者らは、次いでＣａｔＳのエラスチン分解活性を遮断するｒＣａｔＳＰＰの能力を立証するのにｒＣａｔＳＰＰを使用した。蛍光発生基質エラスチン−ＤＱを、６０分間のインキュベーションの間、ＣａｔＳＰＰ（５０〜５００ｎＭ）の存在下でＣａｔＳのエラスチン分解代謝をモニターするのに使用し、本発明者らは、この活性の阻害を立証することができた（図８）。
【０１２３】
４つのヒト悪性細胞系におけるＣａｔＳ、Ｌ、Ｋ及びＶの発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。各々のカテプシンは４つの細胞系で発現するように思われ、アクチンの増幅は、内部対照として使用した（図９）。
【０１２４】
ｒＣａｔＳＰＰについて算出した完全なペプチド分解阻害プロファイル、及び少なくともＣａｔＳのエラスチン分解活性が示され得たエビデンスを基に、本発明者らは次に、浸潤癌モデルにおいてこれらのプロテアーゼの活性を遮断するペプチドの有効性を分析した。この実験では、本発明者らは、マトリゲルでコートした修正ボイデンチャンバーを介して腫瘍細胞浸潤を調べる試験を用いた（Ｆｌａｎｎｙら、２００３年）。この実験は、一般的なタイプの癌を代表する細胞系で行った。具体的には、これらはＰＣ３（前立腺細胞系）、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）、Ｕ２５１ＭＧ（星状細胞腫）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）及びＭＣＦ７（乳癌）であり、結果を図１０に示す。図１０ａは、インビトロ浸潤アッセイにおける４つのヒト悪性細胞系の分析を示す。ａ〜ｄ：ＨＣＴ１１６、Ｕ２５１ｍｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＰＣ３。各細胞系は、ＣａｔＳＰＰの存在下では腫瘍細胞浸潤の有意な減少を示した（＊＝ｐ：≦０．００１、＊＊＝ｐ：≦０．００１、＊＊＊＝ｐ：≦０．０００１）。全ての変数（ｖａｒｉａｂｌｅ）は、腫瘍細胞浸潤について記録し分析した１０画像により３連で行った。標準誤差は、平均±誤差としてプロットした。統計的有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて算出した。図１０ｂは、ＣａｔＳＰＰ存在下でのＭＣＦ７腫瘍細胞浸潤の有意な減少（６３％）を示すヒストグラムを示す。
【０１２５】
ｒＣａｔＳＰＰタンパク質の細胞毒性及び増殖効果を評価するため、ＭＴＴアッセイを行った。ＭＴＴアッセイは、２００ｎＭのｒＣａｔＳＰＰ、対照タンパク質及びビークルのみの対照と共にインキュベートした、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞を用いて行った。結果（図１１）は、組換えタンパク質が、細胞増殖に対し有意な効果をもたらさないことを示している。全ての変数は、５連で繰り返した。
【０１２６】
本発明者らは次に、カテプシンプロペプチドのＦｃ部分の提供が、浸潤癌モデルにおけるＬ型カテプシンプロテアーゼの阻害に与える影響を検討した。
【０１２７】
Ｃ末端Ｆｃ部分（ＣａｔＳＰＰ Ｆｃ）を含むカテプシンＳプロペプチドを、上記ＣａｔＳＰＰについて記載した通りの方法を用いてクローニングし発現させた。ＣａｔＳＰＰのｃＤＮＡ配列を、ｐＲＳＥＴ Ａ−Ｆｃベクターにクローニングした。陽性形質転換プレートからの８コロニーのセレクションに、ベクター特異的プライマーを用いてコロニーＰＣＲ分析を行った。８コロニーは全て、約１１００ｂｐのバンドの増幅により陽性であるように見える（図１２）。ｐＲＳＥＴ ＡベクターからのｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの発現を、ＩＰＴＧの添加により誘導した。結果を図１３に示す。レーンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの試料は、非誘導及び誘導試料を含有する（それぞれＢ＝０．２、Ｃ＝０．５及びＤ＝０．７ ＯＤ（Ａ５５０ｎｍ））。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いて行ったウェスタンブロッティングで分離した。ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの予測サイズに等しい、約４６ｋＤａの分子量を有するＨｉｓタグ付きタンパク質種を検出した。ＯＤが０．２の培養物での発現誘導が、タンパク質生成には最適であるように思われた。
【０１２８】
ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃは、Ｎ末端ＨｉｓタグであるためＩＭＡＣを用いて精製した。結果を図１４に示す。ａ）精製プロファイルは、２つの明白なピーク、約２００分後の急激なピーク及び２２５分から２５０分の間の第２の幅広いピークを示す。ｂ）精製から溶出した画分の分析は、第１のピークが、カラムからの非特異的結合タンパク質の溶出を表すのに対し（画分１〜５）、幅広い第２のピークは、ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの予測サイズと一致する、約４６ｋＤａの種の溶出を示す（画分６〜１５）。ｃ）抗ポリヒスチジンタグモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによる精製画分の分析は、ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃに関する予測通り約４６ｋＤａのｈｉｓタグ付き種の存在を示す。
【０１２９】
ＣａｔＳＰＰ ＦｃによるＣａｔＳペプチド分解活性の阻害を測定した。ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃを、蛍光発生基質Ｚ−ＶＶＲ−ＡＭＣを用いて蛍光分析により評価し、この種が、Ｆｃドメインの付加後、動態に何ら負の影響をもたらすことなくＣａｔＳの阻害を保持する能力を有するかどうかを判定した。結果を図１５ａ）に示す。プログレス曲線は、増加する濃度（０ｎＭから２００ｎＭ）のｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ存在下でのＣａｔＳ活性の阻害を示す。ａ、挿入図）Ｆｃ対照タンパク質（２００ｎＭ）は、ＣａｔＳ活性に対する識別可能な効果をもたらさなかった。ｂ）速度はプログレス曲線から外挿し、阻害動態は８．９ｎＭ（±２．５）として算出した。アッセイは３度繰り返した。
【０１３０】
ＣａｔＳ ＰＰの安定性対ＣａｔＳ ＰＰ−Ｆｃの安定性は、以下の通りに評価した。ｒＣａｔＳＰＰ及びｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃタンパク質を、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞と共にインキュベートし、抗体ＩｇＧ２ Ｆｃドメインの付加による組換えタンパク質の安定性を評価した。上清試料をウェスタンブロッティングにより評価し（図１６）、細胞上清内の安定性を判定した。ｒＣａｔＳＰＰは、０時間目でのみ検出できたのに対し、ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの安定性は、２４時間後に検出されたことから改善したように思われる。対照として、添加タンパク質を含有しない（−）細胞上清も評価し、上清の同等の負荷を確認するため膜をポンソーレッドで染色した。実験は３連で実施した。
【０１３１】
前立腺ＰＣ３細胞を用いたインビトロ浸潤アッセイでのカテプシンＳに対するＣａｔＳＰＰ Ｆｃの効果を、次いでテストした。結果を図１７に示す。ヒストグラムは、ＣａｔＳＰＰ Ｆｃ存在下（０〜３２ｎＭ）でのＰＣ３浸潤アッセイの定量的概要を示す。各アッセイは３連で行い、１０個の視野をアッセイ毎にカウントした。
【０１３２】
他の腫瘍細胞系を用いたインビトロ浸潤アッセイでのカテプシンＳに対するＣａｔＳＰＰ Ｆｃの効果を、次いでテストした（図１８）。ｒＣａｔＳＰＰ及びｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃタンパク質を、ＨＣＴ１１６結腸直腸細胞系を用いたインビトロ浸潤アッセイに適用した。アッセイは、増加する濃度のｒＣａｔＳＰＰ（０ｎＭから２５０ｎＭ）又はｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ（０ｎＭから５０ｎＭ）の存在下、及び最大濃度の適切な対照タンパク質の存在下でも行った。標準偏差は、誤差バーとしてプロットする。アッセイを、各々から記録した１０画像により３連で繰り返した。平均腫瘍細胞浸潤における標準偏差を、±誤差バーとしてプロットする。
【０１３３】
同様の結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて行った浸潤アッセイで見られた。図１９は、ｒＣａｔＳ ＰＰ及びｒＣａｔＳ ＰＰ−Ｆｃの相対ＥＣ５０値を示す。様々な濃度のｒＣａｔＳＰＰ又はｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの存在下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞浸潤の相対速度に、非線形回帰分析を行い、Ｓ字用量依存曲線を作成した。得られたＥＣ５０値は、（ａ）ｒＣａｔＳＰＰ及び（ｂ）ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃについてそれぞれ７８．０ｎＭ及び８．３ｎＭであることが分かった。
【０１３４】
以上の通り、ＣａｔＳＰＰ Ｆｃは、Ｆｃ部分の無いＣａｔＳＰＰで生成したものより最大阻害が有意に大きく、阻害濃度は有意に低く、浸潤アッセイにおけるカテプシンＳの強力な阻害剤として作用した。ＣａｔＳＰＰ分子の安定性が、程度は小さいながらＦｃ部分により増大することは予測し得たが、それでもなおＦｃ部分の包含が、阻害効果をこれほど大幅に高めたことは非常に驚きである。故に、結果は、カテプシンプロペプチドによるＦｃ部分の包含が、腫瘍浸潤モデルにおけるカテプシンＬ型プロテアーゼ活性の阻害を高めることを立証するものである。他の試験は、腫瘍形成モデルにおいてカテプシンの広域スペクトル小分子阻害剤を用いて行い、同様の効果を立証した。Ｊｏｙｃｅ及び同僚らは、トランスジェニックＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスでの研究において、広域スペクトルシステインカテプシン阻害剤Ｅ６４の細胞透過性アナログである、ＪＰＭ−ＯＥｔの使用を用いた（Ｊｏｙｃｅら、２００４年）。このマウスは、発癌性ＳＶ４０ Ｔ抗原の存在のため１２〜１４週で膵島腫瘍を発症する。彼らは、このマウスへのこの広域スペクトル阻害剤の投与が、この動物の組織学的分析における高浸潤癌の発生を含む、腫瘍発生の複数の段階を著しく阻害できることを立証した。別の研究では、Ｆｌａｎｎｅｒｙ及び共同研究者らは、星状細胞腫浸潤の遮断における４−モルホリンウレア−Ｌｅｕ−ｈｏｍｏＰｈｅ−ビニルスルホン（ＬＨＶＳ）の使用を調べた。本発明者らが本明細書で使用したのと同じ浸潤モデルを用いて、ＣａｔＳ及び程度は低いもののＣａｔを強力に阻害するＬＨＶＳが、５０ｎＭ濃度で最大６０％のＵ２５ＩＭＧ細胞浸潤を遮断できることを立証した（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００３年）。まとめると、これらの過去の研究は、第１に、ＣａｔＬ様プロテアーゼがこれらの細胞系の浸潤プロセスにおいて果たす役割、及び第２に、癌治療のための治療標的としての可能性を明らかに立証している。
【０１３５】
かなりの研究努力にもかかわらず、これらのプロテアーゼの各々が腫瘍形成に果たす役割の程度は、まだ十分に理解されていない。これらがひとたび発癌性細胞により分泌された場合、エラスチン、コラーゲン及び細胞外マトリックスの他の構成成分の分解におけるこれらの役割を、相当量のエビデンスが示していることは明らかである。しかし、これらの酵素がお互いの、及びメタロプロテアーゼなど、他のあまり密接に関係しないプロテアーゼの活性化及び制御に果たす役割が、現在新たに浮上している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９３年）。さらに、新たなエビデンスは、マトリックス由来抗血管新生因子の分解、及び腫瘍進行中の血管新生促進因子（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の産生におけるＣａｔＳの役割に脚光を当てるようになった（Ｗａｎｇら、２００５年）。これは、これらのプロテアーゼが、周辺ＥＣＭの単純な消化よりも、腫瘍の進行及び転移を可能にする多くの役割を有し得ることを示している。
【０１３６】
結論
本明細書で本発明者らは、例えばＣａｔＳＰＰなど、カテプシンプロペプチドを生成するための新規な発現及び精製方法を記載した。本発明者らは、例えばｒＣａｔＳＰＰなど、カテプシンプロペプチドを用いたカテプシンＬ型プロテアーゼの阻害により、腫瘍形成が減弱され得ることを立証した。本発明者らが、様々な異なる腫瘍細胞系を用いたインビトロ浸潤アッセイにおいて見た阻害プロファイルから、ＣａｔＬ様プロテアーゼの幅広い阻害が、癌の臨床治療に明らかな治療効果を有することは明らかである。特に生体における第２の部位への腫瘍の広がりを遮断することができる薬剤を開発する能力は、細胞毒性剤レジメンの併用にとって魅力的となろう。細菌培養物からｒＣａｔＳＰＰを迅速に生成し、これらの腫瘍浸潤モデルにうまく適用する能力は、これが、治療プロテアーゼ阻害剤のデザインに対する新規のアプローチを提示し得ることを示唆するものである。
【０１３７】
この本明細書で言及された文献は全て、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の記載された実施形態に対する様々な修正形態及び変形形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に理解されよう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求された本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、当業者には明らかな、本発明の記載された実施形態の様々な修正は、本発明により網羅されることが意図される。
【０１３８】
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【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＣａｔＳＰＰの増幅を示す図である。ＣａｔＳＰＰのｃＤＮＡ配列は、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーから増幅された。ＣａｔＳＰＰ ｃＤＮＡ配列の予測サイズに等しい、約３３０ｂｐの単一バンドが生成された。
【図２】ｐＱＥ−３０へのＣａｔＳ ＰＰのクローニングからのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。ｒＣａｔＳＰＰの完全リーディングフレーム用のＤＮＡ及びタンパク質配列が、ｐＱＥ−３０への挿入結果として示されることを示す図である。
【図３】ｒＣａｔＳＰＰタンパク質の精製を示す図である： ａ）ｒＣａｔＳＰＰの溶出プロファイル。ｂ）矢印で示したように、第２の幅広いピークからの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ｃ）抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いた精製画分の免疫ブロット。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングで立証された、ＩＰＴＧによるｒＣａｔＳＰＰ発現の誘導性を示す図である。ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色による細菌溶解物の分析。ｂ）抗ポリヒスチジンタグ抗体によるブロッティング。分子量マーカーを各画像の左に示す（ｋＤａ）。
【図５】ｒＣａｔＳＰＰ存在下のＣｂｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣの加水分解に関するプログレス曲線を示す図である。同じベクターから生成し同じ方法で精製した対照（Ｈｉｓ）６タグ付きタンパク質を、対照（５００ｎＭ）として用いた（挿入図）。
【図６】阻害定数（Ｋｉ）の決定を可能にする非線形回帰分析（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＷａｌｓｈ、１９９８年）のグラフを示す図である。
【図７】蛍光分析を用いたｒＣａｔＳＰＰタンパク質によるカテプシンＫ、Ｖ、Ｌ及びＢの阻害を示す図である。
【図８】ＣａｔＳエラスチン分解活性の阻害を示す図である。蛍光発生基質エラスチン−ＤＱを用いて、６０分間のインキュベーションの間、ＣａｔＳＰＰ（５０〜５００ｎＭ）の存在下でＣａｔＳのエラスチン分解代謝をモニターした。
【図９】悪性細胞系におけるＣａｔＬ様プロテアーゼの相対発現を示す図である。
【図１０】（ａ）４つのヒト悪性細胞系（ｉ〜ｉｖ）： ＨＣＴ１１６、Ｕ２５１ｍｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＰＣ３におけるインビトロ浸潤アッセイの結果を示す図である。（ｂ）ＭＣＦ−７におけるインビトロ浸潤アッセイの結果を示す図である。
【図１１】ｒＣａｔＳＰＰタンパク質の細胞毒性又は増殖効果を評価するＭＴＴアッセイの結果を示す図である。
【図１２】ｐＲＳＥＴ Ａ−ＦｃへのＣａｔＳＰＰのクローニングのコロニーＰＣＲ分析を示す図である。
【図１３】ｐＲＳＥＴ ＡベクターからのｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの発現が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いて行ったウェスタンブロッティングで解明された通り、ＩＰＴＧの添加により誘導されたことを示す図である。
【図１４】ｒＣａｔＳＰＰ−Ｆｃの精製を示す図である。ａ）は、精製プロファイルが２つの明白なピークである、約２００分後の急激なピーク及び２２５分から２５０分の間の第２の幅広いピークを示すことを示す。ｂ）は、精製から溶出した画分の分析を示す。ｃ）は、抗ポリヒスチジンタグモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによる精製画分の分析を示す。
【図１５】蛍光分析を用いたｒＣａｔＳＰＰ−ＦｃによるＣａｔＳ阻害を示す図である。
【図１６】ＣａｔＳ ＰＰの安定性対ＣａｔＳ ＰＰ−Ｆｃの安定性を立証するウェスタンブロットを示す図である。
【図１７】ＣａｔＳＰＰ Ｆｃ存在下でのＰＣ３浸潤アッセイの定量的概要を示すヒストグラムを示す図である。
【図１８】ＣａｔＳＰＰ及びＣａｔＳＰＰ−Ｆｃ組換えタンパク質の存在下でのＨＣＴ１１６浸潤アッセイの定量的概要を示すヒストグラムを示す図である。
【図１９】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞におけるｒＣａｔＳ ＰＰ及びｒＣａｔＳ ＰＰ−ＦｃのＥＣ５０値を決定するのに使用された用量依存曲線を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼ活性の阻害方法であって、前記細胞又は組織へのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法。
【請求項２】
細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現の阻害方法であって、前記細胞又は組織へのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法。
【請求項３】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態の治療を必要とする患者におけるこの状態の治療方法であって、カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法。
【請求項４】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態が、腫瘍性疾患、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、喘息、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
カテプシンプロペプチドが、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を含むヒトカテプシンプロペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
カテプシンプロペプチドが、図３のアミノ酸配列１〜１１８に相当するアミノ酸配列を有するヒトカテプシンプロペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
カテプシンプロペプチドが抗体Ｆｃ部分を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
カテプシンＬ様プロテアーゼがカテプシンＳである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
医薬に使用するためのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸。
【請求項１０】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態の治療に使用するためのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態が、腫瘍性疾患、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、喘息、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項１０に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１２】
カテプシンプロペプチドが、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を含むヒトカテプシンプロペプチドである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１３】
カテプシンプロペプチドが、図３のアミノ酸配列１〜１１８に相当するアミノ酸配列を有するヒトカテプシンプロペプチドである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１４】
カテプシンプロペプチドが抗体Ｆｃ部分を含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１５】
カテプシンＬ様プロテアーゼがカテプシンＳである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１６】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態を治療するための医薬品の製造におけるカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項１７】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態が、腫瘍性疾患、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、喘息、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
カテプシンプロペプチドが、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を含むヒトカテプシンプロペプチドである、請求項１６又は１７に記載の使用。
【請求項１９】
カテプシンプロペプチドが、図３のアミノ酸配列１〜１１８に相当するアミノ酸配列を有するヒトカテプシンプロペプチドである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
カテプシンプロペプチドが抗体Ｆｃ部分を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
カテプシンＬ様プロテアーゼがカテプシンＳである、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物。
【請求項２３】
カテプシンプロペプチドが、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を含むヒトカテプシンプロペプチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
カテプシンプロペプチドが、図３のアミノ酸配列１〜１１８に相当するアミノ酸配列を有するヒトカテプシンプロペプチドである、請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
カテプシンプロペプチドが抗体Ｆｃ部分を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
カテプシンＬ様プロテアーゼがカテプシンＳである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
カテプシンプロペプチドの組換え製造方法であって、Ｎ末端ポリヒスチジンタグを有するカテプシンプロペプチドを発現するステップと、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて発現プロペプチドを精製するステップとを含む前記方法。
【請求項１】
細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼ活性の阻害方法であって、前記細胞又は組織へのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法。
【請求項２】
細胞又は組織におけるカテプシンＬ様プロテアーゼの過剰発現の阻害方法であって、前記細胞又は組織へのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法。
【請求項３】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態の治療を必要とする患者におけるこの状態の治療方法であって、カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の投与を含む前記方法。
【請求項４】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態が、腫瘍性疾患、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、喘息、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
カテプシンプロペプチドが、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を含むヒトカテプシンプロペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
カテプシンプロペプチドが、図３のアミノ酸配列１〜１１８に相当するアミノ酸配列を有するヒトカテプシンプロペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
カテプシンプロペプチドが抗体Ｆｃ部分を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
カテプシンＬ様プロテアーゼがカテプシンＳである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
医薬に使用するためのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸。
【請求項１０】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態の治療に使用するためのカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態が、腫瘍性疾患、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、喘息、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項１０に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１２】
カテプシンプロペプチドが、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を含むヒトカテプシンプロペプチドである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１３】
カテプシンプロペプチドが、図３のアミノ酸配列１〜１１８に相当するアミノ酸配列を有するヒトカテプシンプロペプチドである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１４】
カテプシンプロペプチドが抗体Ｆｃ部分を含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１５】
カテプシンＬ様プロテアーゼがカテプシンＳである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のプロペプチド又は核酸。
【請求項１６】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態を治療するための医薬品の製造におけるカテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項１７】
カテプシンＬ様プロテアーゼの異常活性及び／又は過剰発現に関連した状態が、腫瘍性疾患、炎症性障害、神経変性障害、自己免疫障害、喘息、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
カテプシンプロペプチドが、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を含むヒトカテプシンプロペプチドである、請求項１６又は１７に記載の使用。
【請求項１９】
カテプシンプロペプチドが、図３のアミノ酸配列１〜１１８に相当するアミノ酸配列を有するヒトカテプシンプロペプチドである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
カテプシンプロペプチドが抗体Ｆｃ部分を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
カテプシンＬ様プロテアーゼがカテプシンＳである、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
カテプシンプロペプチド又はカテプシンプロペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物。
【請求項２３】
カテプシンプロペプチドが、アクセッション番号Ｍ９０６９６に開示されているカテプシンＳプロテアーゼのアミノ酸残基１７から１１３に相当するアミノ酸配列を含むヒトカテプシンプロペプチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
カテプシンプロペプチドが、図３のアミノ酸配列１〜１１８に相当するアミノ酸配列を有するヒトカテプシンプロペプチドである、請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
カテプシンプロペプチドが抗体Ｆｃ部分を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
カテプシンＬ様プロテアーゼがカテプシンＳである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
カテプシンプロペプチドの組換え製造方法であって、Ｎ末端ポリヒスチジンタグを有するカテプシンプロペプチドを発現するステップと、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて発現プロペプチドを精製するステップとを含む前記方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ−ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３ａ−ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２００９−５２８３３９（Ｐ２００９−５２８３３９Ａ）
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５６８５４（Ｐ２００８−５５６８５４）
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００７４４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９９３４８
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５０６１８００７３）フージョン アンティボディーズ リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００７４４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９９３４８
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５０６１８００７３）フージョン アンティボディーズ リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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