ペルオキシダーゼおよびニトロキシ基による炭水化物の酸化
【解決手段】 本発明は、炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する反応媒体をニトロキシ基媒介物およびペルオキシダーゼ酵素と接触させることを含む、少なくとも１つの第一アルコール基を持つ炭水化物および／または炭水化物誘導体を酸化する方法において、初期反応媒体が少なくとも１０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有しており、ペルオキシダーゼ酵素がオイルシード・ペルオキシダーゼでありそしてヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物を反応媒体に、それのｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように徐々に添加することを特徴とする、上記方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炭水化物および／または炭水化物誘導体をペルオキシダーゼ酵素およびニトロキシ基媒介物で酸化する方法に関する。特に本発明は第一アルコール基をカルボキシル基に選択的に酸化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物（および炭水化物誘導体）の第一アルコール基の酸化はアルデヒド（Ｒ’−ＣＨＯ）および／またはカルボニル（Ｒ’−ＣＯＯＨ）基の形成をもたらす。
【０００３】
アルデヒドおよびカルボニル基の形成は、得られる化合物の反応性、転用性および溶解性を高め、それ故に該化合物は非常に沢山の工業的用途（例えば食品、繊維および製紙工業）がある。結果として第一アルコール基の選択的酸化を可能とする方法を開発することに多大な興味が持たれている。かゝる方法の1つはニトロキシ基媒介物を用いるものである。
【０００４】
沢山のニトロキシ基-媒介酸化法が従来、報告されてきた。かゝる方法の例は以下の特許出願に見ることができる： 国際特許出願公開第００／５０６２１（Ａ１）号明細書、同第０１／００６８１（Ａ１）号明細書、米国特許出願公開第２００３−００２９５８８（Ａ１）号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第１０７７２２１（Ａ１）号明細書。
【０００５】
残念ながら、存在する方法の全てが沢山の欠点を有している。例えば 米国特許出願公開第２００３−００２９５８８（Ａ１）号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第１０７７２２１（Ａ１）号明細書は環境に有害なハロゲン化化合物を使用することを必要としている。しかしながら存在する方法の主な欠点はどんな時でも実際に酸化できる炭水化物基材の量に関して性能が悪いことである。例えば国際特許出願公開第００／５０６２１（Ａ１）号明細書および同第０１／００６８１（Ａ１）号明細書の両方では、記載された反応媒体に添加できる炭水化物の量は１〜２％（固形分含有量）より多くない量に制限されている（実際には固形分含有量は０．０５％を大抵、超えない）。
【０００６】
このように、得るべき酸化炭水化物のあらゆる実用量のために、非常に多量の反応薬が必要とされそして生じる排水の量は相当なものである。例えば、酸化の水準を高めるために多量の酵素を使用しなければならないことが示唆されている。これは反応の費用を予想以上に増加させるだけでなく、効力がないこともわかっている。従って既存の方法は経済的でないか、工業的規模で使用するのには適していない。
【０００７】
それ故に改善されたニトロキシ基媒介酸化法が必要とされている。
【特許文献１】国際特許出願公開第００／５０６２１（Ａ１）号明細書
【特許文献２】国際特許出願公開第０１／００６８１（Ａ１）号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３−００２９５８８（Ａ１）号明細書
【特許文献４】ヨーロッパ特許出願公開第１０７７２２１（Ａ１）号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はかゝる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの面は、炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する反応媒体をニトロキシ基媒介物およびペルオキシダーゼ酵素と接触させることを含む、少なくとも１つの第一アルコール基を持つ炭水化物および／または炭水化物誘導体を酸化する方法において、初期反応媒体が少なくとも１０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有しており、ペルオキシダーゼ酵素がオイルシード（oilseed)・ペルオキシダーゼでありそしてヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物（例えばＮａＯＨ）を反応媒体に、それのｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように徐々に添加することを特徴とする、上記方法に関する。
【００１０】
有利な一つの実施態様においては、少なくとも１０％の第一アルコール基が酸化される。更に好ましくは酸化される第一アルコール基の少なくとも５０％がカルボニル基にまで酸化される。
【００１１】
本発明の別の面は、上記方法に従ってグルコースを酸化してグルコン酸および／またはグルカル酸を製造する方法に関する。
【００１２】
本発明の更に別の面は、ａ）上記の方法に従ってトレハロースを酸化し；ｂ）場合によってはニトロキシ基媒介物を回収し；ｃ）段階ａ）の反応の酸化生成物を加水分解し；ｄ）段階ｃ）の加水分解反応の生成物をラクトン化し；そしてｅ）段階ｄ）の生成物を結晶化する
各段階を含むＤ−グルクロノラクトンの製造方法に関する。好ましくは上記トレハロースの少なくとも１５％がＤ−グルクロノラクトンに転化される。
【００１３】
本発明は、炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する反応媒体をニトロキシ基媒介物およびペルオキシダーゼ酵素と接触させることを含む、少なくとも１つの第一アルコール基を持つ炭水化物および／または炭水化物誘導体を酸化する方法において、初期反応媒体が少なくとも１０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有しており、ペルオキシダーゼ酵素がオイルシード・ペルオキシダーゼでありそしてヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物を反応媒体に、それのｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように徐々に添加することを特徴とする、上記方法に関する。
【００１４】
炭水化物および／または炭水化物誘導体：
“炭水化物”とは少なくとも１つの炭水化物サブユニットを含有するあらゆる化合物を言う。１つまたは複数の非炭水化物サブユニット（例えば脂質残余部分、蛋白質残余部分等）を含有していてもよい。
【００１５】
少なくとも１つの炭水化物サブユニット（例えばグルコースまたはフルクトース）、二糖類（例えば蔗糖、マルトース、ラクトースまたはトレハロース）またはオリゴ糖または多糖類（即ち、それぞれ３〜１０または１０以上の重合度を有する分子）でもよい。
【００１６】
オリゴ糖および多糖類はあらゆる種類でもよく、ガラクタン類、（ガラクト）マンナン類、フラノフルクタン類およびキシラン類；α−グルカン類、例えばプルラン、澱粉、澱粉成分（即ち、アミロースまたはアミロペクチン）または澱粉誘導体（例えばデキストリン類、マルトデキストリン類またはシクロデキストリン類）；β−グルカン類、例えばセルロースまたはキチン；フルクタン類、例えばイヌリン；天然または合成ゴム、例えばキサンタン、グア、アラビアゴム、寒天、カラゲナン等が含まれるが、これらに限らない。
【００１７】
本発明の方法は、上記のあらゆる炭水化物の誘導体または塩を酸化するのにも使用することができる。全くの参考までに、かゝる化合物は“炭水化物誘導体”と称する。誘導体は化学的に、酵素的におよび／または熱的に変性された炭水化物化合物を含む。本発明の方法で使用するのに適する有利な炭水化物誘導体の例には、還元された炭水化物（例えばグリセロール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、マルチトール、エリスリトールグリセロール、トレイトール、アラビニトール、リビトール、イソマルトおよびイソマルチトール）、アミノ炭水化物類、グリコナミド類、グリコシラミン類、含窒素炭水化物誘導体、デオキシ炭水化物類、チオ炭水化物類、チオ還元炭水化物類、不飽和炭水化物類、炭水化物のアンヒドロ誘導体、還元炭水化物のアンヒドロ誘導体、炭水化物グリコシド類、炭水化物エーテル類、炭水化物エーテル類および炭水化物エステル類（カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、硼酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、炭酸エステル、チオ炭酸エステルおよびカルマミン酸エステルが含まれる）がある。
【００１８】
有利には炭水化物または炭水化物誘導体は澱粉、グルコース、トレハロース、マルト−オリゴ糖類、イソマルト−オリゴ糖、グルコースシロップ類、マルトデキストリン、グリセロールおよびソルビトールまたはこれらのうちの二種以上の混合物から選択される。
【００１９】
反応媒体：
炭水化物および／または炭水化物誘導体の少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも２０重量％、更に好ましくは少なくとも３０重量％、なかでも少なくとも４０重量％（固形分含有量）を初期反応媒体に添加する。その際“初期”反応媒体とは酸化反応を開始する前の反応媒体を言う。
【００２０】
反応媒体は水性媒体、均一に混合された媒体（例えばアルコール／水またはエーテル／水−混合物）または不均一媒体（例えば水と水非混和性有機溶剤、例えば疎水性エーテル、炭化水素またはハロゲン化炭化水素との混合物）でもよい。
【００２１】
本発明の一つの有利な態様によれば、反応媒体は固体／液体−混合物でもよく、その際に本発明のニトロキシ基媒介物および／またはペルオキシダーゼ酵素は担体に固定化されている。媒介物および／または酵素は従来公知の如何なる方法（例えば化学的共役結合、ゲルでの閉じ込め、吸着、半透明な膜でのカプセル化、架橋等）を用いて固定化されていてもよい。
【００２２】
ニトロキシ基媒介物：
その形状に係わりなく、初期反応媒体はニトロキシ基媒介物と第一アルコール基とを１：４〜１：１５０、好ましくは約１：４０〜１：７０のモル比で含有しているのが有利である。ニトロキシ基媒介物は、例としてであるが、ジ第三ニトロキシル化合物、例えば２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、α−水素原子が欠けている有機系ニトロキシル化合物、例えば２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル（ＰＲＯＸＹＬ）、４−ヒドロキシ、４−メトキシ、４−アルコキシル、４−アセトキシ、４−ホスホノオキシまたは４−ベンゾイルオキシ−ＴＥＭＰＯ、それのアシル化誘導体、例えば４−アセトアミド−および４−マレイミド−ＴＥＭＰＯまたはデヒドロ−ＴＥＭＰＯ（１，２，３，６−テトラヒドロ−２，２，６，６−テトラメチルピリジン−１−オキシル）でもよい。ニトロキシ基媒介物は好ましくはＴＥＮＰＯまたは４−メトキシＴＥＭＰＯである。
【００２３】
ニトロキシ基媒介物の活性な酸化種はニトロソニウムイオン（＞Ｎ＋＝Ｏ）であり、“ニトロキシ基媒介物”とはニトロキシル化合物の活性化された状態および不活性状態の両方に関する。活性化されたニトロキシ基媒介物は反応媒体に直接的に添加してもよいが、好ましくはその場で酸化によって製造される。
【００２４】
ニトロキシ基媒介物は上述の誘導体または何らかの類似物または２種類以上の組合せでもよい。理想を言えば、使用後にニトロキシ基媒介物は回収されそして公知の何らかの方法（例えば国際特許出願公開第９６−３６６２１Ａ１に記載した方法）を用いて反応媒体に戻す。
【００２５】
ペルオキシダーゼ酵素：
ペルオキシダーゼ酵素は好ましくは１モルの第一アルコール当たり２０００〜５４０，０００単位の量で、特に好ましくは１モルの第一アルコール当たり約５０００単位の量で添加される。ペルオキシダーゼ酵素単位は、例えばChance, B. およびMaehly, A.C. (1955) Methods in Enzymology II、第 773〜775頁に説明されているような 技術分野で標準の方法を用いて測定することができる。
【００２６】
本発明の方法で使用されるペルオキシダーゼはオイルシード誘導されたペルオキシダーゼ酵素であり、好ましくは酵素分類ＥＣ１．１１．１から、更に好ましくはＥＣ１．１１．１．７から選択される。かゝる酵素の適する出所は大豆、菜種、向日葵、亜麻、綿、からし、油菜科ハマナス属植物(または他の油菜属の他の植物)、パーム油および落花生が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
ｐＨ制御:
ペルオキシダーゼ酵素を用いることは電子受容体の存在を必要とする。本発明の方法で使用される電子受容体はヒドロペルオキシドでもよい。 ヒドロペルオキシドは好ましくは過酸化水素またはそれの出所、例えば過酸化水素前駆体、例えば過硼酸塩または過炭酸塩；過酸化水素発生酵素；ペルオキシカルボン酸またはそれの塩である。１モルの第一アルコール当たり、０．５〜４ミリモルのヒドロペルオキシドを反応媒体に添加する。この添加はゆっくり行うべきでありそして反応媒体のｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように制御するべきである。
【００２８】
反応媒体の最適ｐＨはある程度、酸化すべき基体に依存している。こうして最も良好な炭水化物、特にトレハロースのためには有利なｐＨは３．５〜８．０の間にある。更に有利には４．０〜７．５の間、なかでも約７である。しかしながらある種の炭水化物誘導体（例えば還元された炭水化物および特にグリセロール）のためには有利なｐＨは５．０〜１０．０の間にある。
【００２９】
ヒドロペルオキシドに加えて、反応媒体のｐＨは更にアルカリ化合物を徐々に添加することによって維持される。こうして、１つの第一アルコール基には０．１〜１．１ミリモル／分のアルカリ化合物が反応媒体に添加される。アルカリ化合物は水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）であるのが好ましい。ヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物の添加は無電ｐＨ（ｐＨ stat.）法を用いて制御する。
【００３０】
反応媒体のｐＨの他に反応媒体の温度も理想的に制御する。こうして反応媒体は有利には１５〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃、特に好ましくは約２５℃に維持する。一つの実施態様によれば、反応時間は２０時間ほどである。別の実施態様によれば、１００時間までまたはそれ以上でもよい。しかしながら好ましくは４０〜５５時間、更に好ましくは４５〜５２時間である。
【００３１】
上述の反応条件のもとでは、驚くべきことに、高い炭水化物（および／または炭水化物誘導体）濃度（固形分含有量）が初期反応媒体中に含まれていてもよいことを見出した。初期反応媒体中に存在する第一アルコール基の１０％以上、好ましくは少なくとも２０％、更に好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは少なくとも５０％、なかでも少なくとも６０％、殊に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、更になかでも少なくとも９０％が酸化されることを見出した。有利な一つの実施態様によれば、酸化される第一アルコール基はカルボキシル基にまで酸化される。特に有利な一つの実施態様によれば、酸化される第一アルコール基の少なくとも５０％がカルボキシル基に酸化される。理想的には、酸化される第一アルコール基の少なくとも５０％がカルボニル基に酸化される。
【００３２】
グルコン酸および／またはグルカル酸の製造：
酸化反応の実際の生成物は、勿論、基材として使用される炭水化物および／または炭水化物誘導体に依存している。初期反応媒体に添加される炭水化物がグルコースである一つの可能な実施態様においては、反応生成物はグルコン酸（Ｃ１酸化）またはグルカル酸（Ｃ１およびＣ６酸化）である。こうして本発明はグルコースを酸化することによってグルコン酸またはグルカル酸を製造する方法にも関する。
【００３３】
Ｄ−グルクロノラクトンの製造：
本発明の生成物は更に例えば付加的酸化、ヒドロキシアルキル化、カルボキシメチル化、カチオン化、アミド化、エステル化、架橋または加水分解によっても変性できる。
【００３４】
このように例えば本発明は、ａ）上記の方法に従ってトレハロースを酸化し；ｂ）場合によってはニトロキシ基媒介物を回収し；ｃ）段階ａ）の反応の酸化生成物を加水分解し；ｄ）段階ｃ）の加水分解反応の生成物をラクトン化し；そしてｅ）段階ｄ）の生成物を結晶化する
各段階を含むＤ−グルクロノラクトンの製造方法に関する。好ましくは上記トレハロースの少なくとも１５％がＤ−グルクロノラクトンに転化される。
【００３５】
トレハロースは構成糖類としてＤ−グルコースを含む非還元の二糖類である。このものは植物、バクテリア、菌類、藻類または昆虫から抽出することができるしまたは例えばマルトースまたは澱粉から誘導できる。酸化されたトレハロースは酸類、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、過酸および／またはカチオン交換樹脂から選択される１種類以上の加水分解剤と反応させることによって加水分解されうる。
【００３６】
更に好ましくは、酸化トレハロースは酵素で加水分解される。適するヒドロラーゼ酵素はＯ−グリコシル化合物加水分解酵素、例えばガラクチュロナーゼ酵素を含むが、これに制限されない。加水分解酵素は好ましくはエクソ−ポリガラクチュラーゼである。この酵素は反応媒体に０．０５〜３０重量％、好ましくは２〜２０重量％の量で添加される。この酵素は溶液中に遊離していてもまたは何らかの公知の方法を用いて不活性担体に固定化されていてもよい。
【００３７】
加水分解は好ましくは液相、例えば水、溶剤、例えば直鎖状のまたは分岐した低級アルコール（例えばメタノール、エタノール、ブタノール、プロパノールおよびイソプロパノール）中でまたはそれらの二種類以上の混合物中で実施してもよい。反応時間は１〜１５０時間、好ましくは５〜８０時間、更に好ましくは５〜１０時間の間で変動してもよい。ｐＨは、加水分解グルクロナート生成物をグルクロン酸に酸化できるように好ましくは３〜６に維持し、更に好ましくは約４〜５に維持する。インキュベーション温度は３０〜５０℃、好ましくは約４０℃に調整することができる。
【００３８】
ラクトン化段階はグルクロン酸を（例えば塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸のような酸で）グルクロノラクトンに転化するために使用される。Ｄ−グルクロノラクトンは次いで以下の方法のいずれか一つ以上によって結晶化させることによって反応生成物から分離することができる：濾過、抽出、固液分離、分別沈殿、透析蒸留など。高純度のＤ−グルクロノラクトンが必要な場合には、糖類または糖類誘導体の精製に従来技術で一般に使用される技術、例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、蒸留および結晶化を使用してもよい。本発明の方法に従って製造されるＤ−グルクロノラクトンは例えば栄養補助剤、エネルギー食品または飲み物および医薬品において使用することができる。
【００３９】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４０】
実施例：
【実施例１】
【００４１】
グルコン酸およびグルカル酸の製造：
１５ｇのＤ−グルコース（ 製造元：Aldrich)を２１．５ｍＬの脱塩水に溶解する（固形分含有量３９．９％）。１．０５６ｇのＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich)をグルコース溶液に添加する。０．０２０６ｇの大豆ペルオキシダーゼ (SIGMATM)を添加しそして反応を攪拌下に２５℃で２４時間行う。過酸化水素（30 % 濃度PerhydrolTM ：製造元 Merck) を０．１３８ミリモル／分の供給速度で連続的に添加する。ｐＨは４ＭのＮａＯＨ（製造元：Merck）を添加することによって一定に維持する。
【００４２】
２４時間後に反応混合物をＨＰＬＣによって分析する。各サンプルを７５℃、１ｍＬ／分で２つの別個のカラム、即ち、水の入った Shodex K-S-801 (Na+ 型)カラムおよび０．０１モルのＨ２ＳＯ２の入ったShodex KC-811 (H+ 型)カラムで分析する。得られる２つのクロマトグラムを使用して、酸化反応によって生成されるグルクロン酸（４．４％）、グルコン酸（８６．５％）およびグルカル酸（６．８％）の濃度を測定した。
【実施例２】
【００４３】
酸化されたトラハロース中のアルデヒド含有量の測定（試験１）：
酸化操作：
２０ｇのＤ−トレハロース (ASCENDTM ；製造元：Cargill)の選択的Ｃ６−酸化を大豆ペルオキシダーゼ／過酸化水素および媒介物としてのＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich）を用いて実験室試験で行う。以下の条件を使用する：
− Ｄ−トレハロースの固形分含有量：４０％（固形分含有量）
− ＴＥＭＰＯ／第一アルコール基＊−モル比：１／４０
− 大豆ペルオキシダーゼ（OrganicTecTM）： １０，０００単位／１モルの第一ＯＨ
− 過酸化水素（３０％濃度PerhydrolTM）： ０．０１ｍＬ／分
− ｐＨ７に無電ｐＨ制御するための水酸化ナトリウム４モル溶液
− 反応温度：２５℃。
＊ 上記の第一アルコール基は化学式−ＣＨ２−ＯＨで表されるが、“第一ＯＨ”と略してもよい。
【００４４】
反応媒体をマグネットスタラーで連続的に攪拌する。サンプルを１７、４２、６０および７４モル％（ＮａＯＨ）／第一ＯＨの水酸化ナトリウム消費量に相応して反応時間（１０、２１、２８および３６時間）を増やした後に採取する。これが酸化度の目安である。
【００４５】
アルデヒド測定：
水酸化ナトリウムでのヒドロキシアミン−ヒドロクロライド滴定は、ヨーロッパ特許出願公開第１０７７２２１号（Ａ１）明細書“酸化法によって製造される多糖類アルデヒドおよび製紙における強化添加物（strength additives）としての用途”に説明された方法をベースとする。
【００４６】
１５ミリモルの第一ＯＨを含有するサンプルのｐＨを１モルＨＣｌでｐＨ３．２に調整する。即ちこのｐＨはＨＣｌの当量点にある。
【００４７】
過剰のヒドロキシアミン−ヒドロクロライドを添加する（Merckから入手の１．５モル溶液）。
【００４８】
下記の反応機構に従うオキシム誘導体化によって、ＨＣｌを生じさせそしてMetrohm pH Stat 718 Titrinoによって０．１モルＮａＯＨを添加してｐＨ値を３．２に維持する。添加するＮａＯＨのモル量は存在するアルデヒド基数の目安である。
【００４９】
反応機構：: R-CHO + NH2OH.HCl → RCHNOH + HCl
測定結果を下記の表１に示す：
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１：アルデヒド測定
Ｄ−トレハロースの第一ＯＨを、カルボン酸を生成する前にアルデヒドに酸化する。異なる酸化度でアルデヒドを測定すると、高い酸化度ではアルデヒドの値が低いことがわかる。１７、４２、６０および７４モル％のウロン酸／第一ＯＨの酸化度に相応するアルデヒド含有量はそれぞれ１３、１０、６および５モル％（アルデヒド）／第一ＯＨである。
【実施例３】
【００５２】
酸化されたトレハロース中のアルデヒド含有量の測定（試験２）
酸化操作：
２０ｇのＤ−トレハロースの選択的Ｃ６−酸化を大豆ペルオキシダーゼ／過酸化水素および媒介物としてのＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich）を用いて実験室試験で行う。以下の条件を使用する：
− Ｄ−トレハロースの固形分含有量 ：４０％（固形分含有量）
− ＴＥＭＰＯ／第一アルコール基−モル比：１／４０
− 大豆ペルオキシダーゼ（OrganicTecTM）： ５，０００単位／１モルの第一ＯＨ
− 過酸化水素（３０％濃度PerhydrolTM） ： ０．０１ｍＬ／分
− ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７およびｐＨ８に無電ｐＨ制御するための水酸化ナトリウム４モル溶液
− 反応温度：２５℃。
【００５３】
サンプルを反応時間を増加させた後に採取する。相応する水酸化ナトリウム消費量を表２に示す。
【００５４】
カルボキシル基およびアルデヒド測定：
ＮａＯＨ消費量の他に、標準Blumenkrantz法（特定ウロン酸定量化法）およびＨＰＬＣ法を酸化のレベルを測定するために使用する。ＨＰＬＣは２４℃、１ｍＬ／分で０．０１モルのＨ２ＳＯ２の入った２つの連続したShodex KC-811 (H+ 型)カラムで行う。
【００５５】
アルデヒド濃度は上記実施例２に記載の方法を用いて測定する。得られた結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２：
Ｄ−トレハロースの第一ＯＨを、カルボン酸を生成する前にアルデヒドに酸化する。異なる酸化度でアルデヒドを測定すると、高い酸化度ではアルデヒドの値が低いことがわかる。
［比較例１］
ｐＨ制御せずのトレハロースの酸化：
トレハロースの酸化を大豆ペルオキシダーゼ／過酸化水素および媒介物としてのＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich）を用いて実験室試験で行う。以下の条件を使用する：
− Ｄ−トレハロースの固形分含有量：４０％ｄ．ｓ．
− ＴＥＭＰＯ／第一アルコール基−モル比：１／７０
− 大豆ペルオキシダーゼ（OrganicTecTM）： ５，０００単位／１モルの第一ＯＨ
− 過酸化水素（３０％濃度PerhydrolTM） ：５２時間に亙って供給した２．４モル／１モルの第一ＯＨ
− 反応温度：２５℃。
【００５８】
ｐＨ制御をしないと、トレハロースの９％しか酸化されず、溶液中に８３％のトレハロースが残留することがわかった。
［比較例２］
オイルシード・ペルオキシダーゼを用いずに酸化：
４０％（固形分含有量）の２０ｇのＤ−トレハロース溶液に、ＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich）を１／４０のＴＥＭＰＯ／第一アルコール基−モル比で添加する。ペルオキシダーゼとしてわさび大根ペルオキシダーゼ（製造元：Fluka）を１モルの第一ＯＨ当たり１０，０００単位の供給量で使用する。
【００５９】
酸化は２５℃で実施する。過酸化水素（３０％濃度PerhydrolTM）を０．０１ｍＬ／分の流速で添加する。ｐＨは４モル濃度のＮａＯＨを添加することによってｐＨ７に維持する。１時間反応した後に過酸化水素濃度は２５ｐｐｍを越えた。反応は、全部で２９．３ｍＬの過酸化水素添加量および０．６ｍＬのＮａＯＨ消費量にて４９時間継続する。ＨＰＬＣ分析で０．７％の酸化がわかった。このように、わさび大根ペルオキシダーゼを使用したのでは、顕著な酸化は行われない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は炭水化物および／または炭水化物誘導体をペルオキシダーゼ酵素およびニトロキシ基媒介物で酸化する方法に関する。特に本発明は第一アルコール基をカルボキシル基に選択的に酸化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物（および炭水化物誘導体）の第一アルコール基の酸化はアルデヒド（Ｒ’−ＣＨＯ）および／またはカルボニル（Ｒ’−ＣＯＯＨ）基の形成をもたらす。
【０００３】
アルデヒドおよびカルボニル基の形成は、得られる化合物の反応性、転用性および溶解性を高め、それ故に該化合物は非常に沢山の工業的用途（例えば食品、繊維および製紙工業）がある。結果として第一アルコール基の選択的酸化を可能とする方法を開発することに多大な興味が持たれている。かゝる方法の1つはニトロキシ基媒介物を用いるものである。
【０００４】
沢山のニトロキシ基-媒介酸化法が従来、報告されてきた。かゝる方法の例は以下の特許出願に見ることができる： 国際特許出願公開第００／５０６２１（Ａ１）号明細書、同第０１／００６８１（Ａ１）号明細書、米国特許出願公開第２００３−００２９５８８（Ａ１）号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第１０７７２２１（Ａ１）号明細書。
【０００５】
残念ながら、存在する方法の全てが沢山の欠点を有している。例えば 米国特許出願公開第２００３−００２９５８８（Ａ１）号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第１０７７２２１（Ａ１）号明細書は環境に有害なハロゲン化化合物を使用することを必要としている。しかしながら存在する方法の主な欠点はどんな時でも実際に酸化できる炭水化物基材の量に関して性能が悪いことである。例えば国際特許出願公開第００／５０６２１（Ａ１）号明細書および同第０１／００６８１（Ａ１）号明細書の両方では、記載された反応媒体に添加できる炭水化物の量は１〜２％（固形分含有量）より多くない量に制限されている（実際には固形分含有量は０．０５％を大抵、超えない）。
【０００６】
このように、得るべき酸化炭水化物のあらゆる実用量のために、非常に多量の反応薬が必要とされそして生じる排水の量は相当なものである。例えば、酸化の水準を高めるために多量の酵素を使用しなければならないことが示唆されている。これは反応の費用を予想以上に増加させるだけでなく、効力がないこともわかっている。従って既存の方法は経済的でないか、工業的規模で使用するのには適していない。
【０００７】
それ故に改善されたニトロキシ基媒介酸化法が必要とされている。
【特許文献１】国際特許出願公開第００／５０６２１（Ａ１）号明細書
【特許文献２】国際特許出願公開第０１／００６８１（Ａ１）号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３−００２９５８８（Ａ１）号明細書
【特許文献４】ヨーロッパ特許出願公開第１０７７２２１（Ａ１）号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はかゝる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの面は、炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する反応媒体をニトロキシ基媒介物およびペルオキシダーゼ酵素と接触させることを含む、少なくとも１つの第一アルコール基を持つ炭水化物および／または炭水化物誘導体を酸化する方法において、初期反応媒体が少なくとも１０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有しており、ペルオキシダーゼ酵素がオイルシード（oilseed)・ペルオキシダーゼでありそしてヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物（例えばＮａＯＨ）を反応媒体に、それのｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように徐々に添加することを特徴とする、上記方法に関する。
【００１０】
有利な一つの実施態様においては、少なくとも１０％の第一アルコール基が酸化される。更に好ましくは酸化される第一アルコール基の少なくとも５０％がカルボニル基にまで酸化される。
【００１１】
本発明の別の面は、上記方法に従ってグルコースを酸化してグルコン酸および／またはグルカル酸を製造する方法に関する。
【００１２】
本発明の更に別の面は、ａ）上記の方法に従ってトレハロースを酸化し；ｂ）場合によってはニトロキシ基媒介物を回収し；ｃ）段階ａ）の反応の酸化生成物を加水分解し；ｄ）段階ｃ）の加水分解反応の生成物をラクトン化し；そしてｅ）段階ｄ）の生成物を結晶化する
各段階を含むＤ−グルクロノラクトンの製造方法に関する。好ましくは上記トレハロースの少なくとも１５％がＤ−グルクロノラクトンに転化される。
【００１３】
本発明は、炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する反応媒体をニトロキシ基媒介物およびペルオキシダーゼ酵素と接触させることを含む、少なくとも１つの第一アルコール基を持つ炭水化物および／または炭水化物誘導体を酸化する方法において、初期反応媒体が少なくとも１０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有しており、ペルオキシダーゼ酵素がオイルシード・ペルオキシダーゼでありそしてヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物を反応媒体に、それのｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように徐々に添加することを特徴とする、上記方法に関する。
【００１４】
炭水化物および／または炭水化物誘導体：
“炭水化物”とは少なくとも１つの炭水化物サブユニットを含有するあらゆる化合物を言う。１つまたは複数の非炭水化物サブユニット（例えば脂質残余部分、蛋白質残余部分等）を含有していてもよい。
【００１５】
少なくとも１つの炭水化物サブユニット（例えばグルコースまたはフルクトース）、二糖類（例えば蔗糖、マルトース、ラクトースまたはトレハロース）またはオリゴ糖または多糖類（即ち、それぞれ３〜１０または１０以上の重合度を有する分子）でもよい。
【００１６】
オリゴ糖および多糖類はあらゆる種類でもよく、ガラクタン類、（ガラクト）マンナン類、フラノフルクタン類およびキシラン類；α−グルカン類、例えばプルラン、澱粉、澱粉成分（即ち、アミロースまたはアミロペクチン）または澱粉誘導体（例えばデキストリン類、マルトデキストリン類またはシクロデキストリン類）；β−グルカン類、例えばセルロースまたはキチン；フルクタン類、例えばイヌリン；天然または合成ゴム、例えばキサンタン、グア、アラビアゴム、寒天、カラゲナン等が含まれるが、これらに限らない。
【００１７】
本発明の方法は、上記のあらゆる炭水化物の誘導体または塩を酸化するのにも使用することができる。全くの参考までに、かゝる化合物は“炭水化物誘導体”と称する。誘導体は化学的に、酵素的におよび／または熱的に変性された炭水化物化合物を含む。本発明の方法で使用するのに適する有利な炭水化物誘導体の例には、還元された炭水化物（例えばグリセロール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、マルチトール、エリスリトールグリセロール、トレイトール、アラビニトール、リビトール、イソマルトおよびイソマルチトール）、アミノ炭水化物類、グリコナミド類、グリコシラミン類、含窒素炭水化物誘導体、デオキシ炭水化物類、チオ炭水化物類、チオ還元炭水化物類、不飽和炭水化物類、炭水化物のアンヒドロ誘導体、還元炭水化物のアンヒドロ誘導体、炭水化物グリコシド類、炭水化物エーテル類、炭水化物エーテル類および炭水化物エステル類（カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、硼酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、炭酸エステル、チオ炭酸エステルおよびカルマミン酸エステルが含まれる）がある。
【００１８】
有利には炭水化物または炭水化物誘導体は澱粉、グルコース、トレハロース、マルト−オリゴ糖類、イソマルト−オリゴ糖、グルコースシロップ類、マルトデキストリン、グリセロールおよびソルビトールまたはこれらのうちの二種以上の混合物から選択される。
【００１９】
反応媒体：
炭水化物および／または炭水化物誘導体の少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも２０重量％、更に好ましくは少なくとも３０重量％、なかでも少なくとも４０重量％（固形分含有量）を初期反応媒体に添加する。その際“初期”反応媒体とは酸化反応を開始する前の反応媒体を言う。
【００２０】
反応媒体は水性媒体、均一に混合された媒体（例えばアルコール／水またはエーテル／水−混合物）または不均一媒体（例えば水と水非混和性有機溶剤、例えば疎水性エーテル、炭化水素またはハロゲン化炭化水素との混合物）でもよい。
【００２１】
本発明の一つの有利な態様によれば、反応媒体は固体／液体−混合物でもよく、その際に本発明のニトロキシ基媒介物および／またはペルオキシダーゼ酵素は担体に固定化されている。媒介物および／または酵素は従来公知の如何なる方法（例えば化学的共役結合、ゲルでの閉じ込め、吸着、半透明な膜でのカプセル化、架橋等）を用いて固定化されていてもよい。
【００２２】
ニトロキシ基媒介物：
その形状に係わりなく、初期反応媒体はニトロキシ基媒介物と第一アルコール基とを１：４〜１：１５０、好ましくは約１：４０〜１：７０のモル比で含有しているのが有利である。ニトロキシ基媒介物は、例としてであるが、ジ第三ニトロキシル化合物、例えば２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、α−水素原子が欠けている有機系ニトロキシル化合物、例えば２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル（ＰＲＯＸＹＬ）、４−ヒドロキシ、４−メトキシ、４−アルコキシル、４−アセトキシ、４−ホスホノオキシまたは４−ベンゾイルオキシ−ＴＥＭＰＯ、それのアシル化誘導体、例えば４−アセトアミド−および４−マレイミド−ＴＥＭＰＯまたはデヒドロ−ＴＥＭＰＯ（１，２，３，６−テトラヒドロ−２，２，６，６−テトラメチルピリジン−１−オキシル）でもよい。ニトロキシ基媒介物は好ましくはＴＥＮＰＯまたは４−メトキシＴＥＭＰＯである。
【００２３】
ニトロキシ基媒介物の活性な酸化種はニトロソニウムイオン（＞Ｎ＋＝Ｏ）であり、“ニトロキシ基媒介物”とはニトロキシル化合物の活性化された状態および不活性状態の両方に関する。活性化されたニトロキシ基媒介物は反応媒体に直接的に添加してもよいが、好ましくはその場で酸化によって製造される。
【００２４】
ニトロキシ基媒介物は上述の誘導体または何らかの類似物または２種類以上の組合せでもよい。理想を言えば、使用後にニトロキシ基媒介物は回収されそして公知の何らかの方法（例えば国際特許出願公開第９６−３６６２１Ａ１に記載した方法）を用いて反応媒体に戻す。
【００２５】
ペルオキシダーゼ酵素：
ペルオキシダーゼ酵素は好ましくは１モルの第一アルコール当たり２０００〜５４０，０００単位の量で、特に好ましくは１モルの第一アルコール当たり約５０００単位の量で添加される。ペルオキシダーゼ酵素単位は、例えばChance, B. およびMaehly, A.C. (1955) Methods in Enzymology II、第 773〜775頁に説明されているような 技術分野で標準の方法を用いて測定することができる。
【００２６】
本発明の方法で使用されるペルオキシダーゼはオイルシード誘導されたペルオキシダーゼ酵素であり、好ましくは酵素分類ＥＣ１．１１．１から、更に好ましくはＥＣ１．１１．１．７から選択される。かゝる酵素の適する出所は大豆、菜種、向日葵、亜麻、綿、からし、油菜科ハマナス属植物(または他の油菜属の他の植物)、パーム油および落花生が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
ｐＨ制御:
ペルオキシダーゼ酵素を用いることは電子受容体の存在を必要とする。本発明の方法で使用される電子受容体はヒドロペルオキシドでもよい。 ヒドロペルオキシドは好ましくは過酸化水素またはそれの出所、例えば過酸化水素前駆体、例えば過硼酸塩または過炭酸塩；過酸化水素発生酵素；ペルオキシカルボン酸またはそれの塩である。１モルの第一アルコール当たり、０．５〜４ミリモルのヒドロペルオキシドを反応媒体に添加する。この添加はゆっくり行うべきでありそして反応媒体のｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように制御するべきである。
【００２８】
反応媒体の最適ｐＨはある程度、酸化すべき基体に依存している。こうして最も良好な炭水化物、特にトレハロースのためには有利なｐＨは３．５〜８．０の間にある。更に有利には４．０〜７．５の間、なかでも約７である。しかしながらある種の炭水化物誘導体（例えば還元された炭水化物および特にグリセロール）のためには有利なｐＨは５．０〜１０．０の間にある。
【００２９】
ヒドロペルオキシドに加えて、反応媒体のｐＨは更にアルカリ化合物を徐々に添加することによって維持される。こうして、１つの第一アルコール基には０．１〜１．１ミリモル／分のアルカリ化合物が反応媒体に添加される。アルカリ化合物は水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）であるのが好ましい。ヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物の添加は無電ｐＨ（ｐＨ stat.）法を用いて制御する。
【００３０】
反応媒体のｐＨの他に反応媒体の温度も理想的に制御する。こうして反応媒体は有利には１５〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃、特に好ましくは約２５℃に維持する。一つの実施態様によれば、反応時間は２０時間ほどである。別の実施態様によれば、１００時間までまたはそれ以上でもよい。しかしながら好ましくは４０〜５５時間、更に好ましくは４５〜５２時間である。
【００３１】
上述の反応条件のもとでは、驚くべきことに、高い炭水化物（および／または炭水化物誘導体）濃度（固形分含有量）が初期反応媒体中に含まれていてもよいことを見出した。初期反応媒体中に存在する第一アルコール基の１０％以上、好ましくは少なくとも２０％、更に好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは少なくとも５０％、なかでも少なくとも６０％、殊に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、更になかでも少なくとも９０％が酸化されることを見出した。有利な一つの実施態様によれば、酸化される第一アルコール基はカルボキシル基にまで酸化される。特に有利な一つの実施態様によれば、酸化される第一アルコール基の少なくとも５０％がカルボキシル基に酸化される。理想的には、酸化される第一アルコール基の少なくとも５０％がカルボニル基に酸化される。
【００３２】
グルコン酸および／またはグルカル酸の製造：
酸化反応の実際の生成物は、勿論、基材として使用される炭水化物および／または炭水化物誘導体に依存している。初期反応媒体に添加される炭水化物がグルコースである一つの可能な実施態様においては、反応生成物はグルコン酸（Ｃ１酸化）またはグルカル酸（Ｃ１およびＣ６酸化）である。こうして本発明はグルコースを酸化することによってグルコン酸またはグルカル酸を製造する方法にも関する。
【００３３】
Ｄ−グルクロノラクトンの製造：
本発明の生成物は更に例えば付加的酸化、ヒドロキシアルキル化、カルボキシメチル化、カチオン化、アミド化、エステル化、架橋または加水分解によっても変性できる。
【００３４】
このように例えば本発明は、ａ）上記の方法に従ってトレハロースを酸化し；ｂ）場合によってはニトロキシ基媒介物を回収し；ｃ）段階ａ）の反応の酸化生成物を加水分解し；ｄ）段階ｃ）の加水分解反応の生成物をラクトン化し；そしてｅ）段階ｄ）の生成物を結晶化する
各段階を含むＤ−グルクロノラクトンの製造方法に関する。好ましくは上記トレハロースの少なくとも１５％がＤ−グルクロノラクトンに転化される。
【００３５】
トレハロースは構成糖類としてＤ−グルコースを含む非還元の二糖類である。このものは植物、バクテリア、菌類、藻類または昆虫から抽出することができるしまたは例えばマルトースまたは澱粉から誘導できる。酸化されたトレハロースは酸類、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、過酸および／またはカチオン交換樹脂から選択される１種類以上の加水分解剤と反応させることによって加水分解されうる。
【００３６】
更に好ましくは、酸化トレハロースは酵素で加水分解される。適するヒドロラーゼ酵素はＯ−グリコシル化合物加水分解酵素、例えばガラクチュロナーゼ酵素を含むが、これに制限されない。加水分解酵素は好ましくはエクソ−ポリガラクチュラーゼである。この酵素は反応媒体に０．０５〜３０重量％、好ましくは２〜２０重量％の量で添加される。この酵素は溶液中に遊離していてもまたは何らかの公知の方法を用いて不活性担体に固定化されていてもよい。
【００３７】
加水分解は好ましくは液相、例えば水、溶剤、例えば直鎖状のまたは分岐した低級アルコール（例えばメタノール、エタノール、ブタノール、プロパノールおよびイソプロパノール）中でまたはそれらの二種類以上の混合物中で実施してもよい。反応時間は１〜１５０時間、好ましくは５〜８０時間、更に好ましくは５〜１０時間の間で変動してもよい。ｐＨは、加水分解グルクロナート生成物をグルクロン酸に酸化できるように好ましくは３〜６に維持し、更に好ましくは約４〜５に維持する。インキュベーション温度は３０〜５０℃、好ましくは約４０℃に調整することができる。
【００３８】
ラクトン化段階はグルクロン酸を（例えば塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸のような酸で）グルクロノラクトンに転化するために使用される。Ｄ−グルクロノラクトンは次いで以下の方法のいずれか一つ以上によって結晶化させることによって反応生成物から分離することができる：濾過、抽出、固液分離、分別沈殿、透析蒸留など。高純度のＤ−グルクロノラクトンが必要な場合には、糖類または糖類誘導体の精製に従来技術で一般に使用される技術、例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、蒸留および結晶化を使用してもよい。本発明の方法に従って製造されるＤ−グルクロノラクトンは例えば栄養補助剤、エネルギー食品または飲み物および医薬品において使用することができる。
【００３９】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４０】
実施例：
【実施例１】
【００４１】
グルコン酸およびグルカル酸の製造：
１５ｇのＤ−グルコース（ 製造元：Aldrich)を２１．５ｍＬの脱塩水に溶解する（固形分含有量３９．９％）。１．０５６ｇのＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich)をグルコース溶液に添加する。０．０２０６ｇの大豆ペルオキシダーゼ (SIGMATM)を添加しそして反応を攪拌下に２５℃で２４時間行う。過酸化水素（30 % 濃度PerhydrolTM ：製造元 Merck) を０．１３８ミリモル／分の供給速度で連続的に添加する。ｐＨは４ＭのＮａＯＨ（製造元：Merck）を添加することによって一定に維持する。
【００４２】
２４時間後に反応混合物をＨＰＬＣによって分析する。各サンプルを７５℃、１ｍＬ／分で２つの別個のカラム、即ち、水の入った Shodex K-S-801 (Na+ 型)カラムおよび０．０１モルのＨ２ＳＯ２の入ったShodex KC-811 (H+ 型)カラムで分析する。得られる２つのクロマトグラムを使用して、酸化反応によって生成されるグルクロン酸（４．４％）、グルコン酸（８６．５％）およびグルカル酸（６．８％）の濃度を測定した。
【実施例２】
【００４３】
酸化されたトラハロース中のアルデヒド含有量の測定（試験１）：
酸化操作：
２０ｇのＤ−トレハロース (ASCENDTM ；製造元：Cargill)の選択的Ｃ６−酸化を大豆ペルオキシダーゼ／過酸化水素および媒介物としてのＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich）を用いて実験室試験で行う。以下の条件を使用する：
− Ｄ−トレハロースの固形分含有量：４０％（固形分含有量）
− ＴＥＭＰＯ／第一アルコール基＊−モル比：１／４０
− 大豆ペルオキシダーゼ（OrganicTecTM）： １０，０００単位／１モルの第一ＯＨ
− 過酸化水素（３０％濃度PerhydrolTM）： ０．０１ｍＬ／分
− ｐＨ７に無電ｐＨ制御するための水酸化ナトリウム４モル溶液
− 反応温度：２５℃。
＊ 上記の第一アルコール基は化学式−ＣＨ２−ＯＨで表されるが、“第一ＯＨ”と略してもよい。
【００４４】
反応媒体をマグネットスタラーで連続的に攪拌する。サンプルを１７、４２、６０および７４モル％（ＮａＯＨ）／第一ＯＨの水酸化ナトリウム消費量に相応して反応時間（１０、２１、２８および３６時間）を増やした後に採取する。これが酸化度の目安である。
【００４５】
アルデヒド測定：
水酸化ナトリウムでのヒドロキシアミン−ヒドロクロライド滴定は、ヨーロッパ特許出願公開第１０７７２２１号（Ａ１）明細書“酸化法によって製造される多糖類アルデヒドおよび製紙における強化添加物（strength additives）としての用途”に説明された方法をベースとする。
【００４６】
１５ミリモルの第一ＯＨを含有するサンプルのｐＨを１モルＨＣｌでｐＨ３．２に調整する。即ちこのｐＨはＨＣｌの当量点にある。
【００４７】
過剰のヒドロキシアミン−ヒドロクロライドを添加する（Merckから入手の１．５モル溶液）。
【００４８】
下記の反応機構に従うオキシム誘導体化によって、ＨＣｌを生じさせそしてMetrohm pH Stat 718 Titrinoによって０．１モルＮａＯＨを添加してｐＨ値を３．２に維持する。添加するＮａＯＨのモル量は存在するアルデヒド基数の目安である。
【００４９】
反応機構：: R-CHO + NH2OH.HCl → RCHNOH + HCl
測定結果を下記の表１に示す：
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１：アルデヒド測定
Ｄ−トレハロースの第一ＯＨを、カルボン酸を生成する前にアルデヒドに酸化する。異なる酸化度でアルデヒドを測定すると、高い酸化度ではアルデヒドの値が低いことがわかる。１７、４２、６０および７４モル％のウロン酸／第一ＯＨの酸化度に相応するアルデヒド含有量はそれぞれ１３、１０、６および５モル％（アルデヒド）／第一ＯＨである。
【実施例３】
【００５２】
酸化されたトレハロース中のアルデヒド含有量の測定（試験２）
酸化操作：
２０ｇのＤ−トレハロースの選択的Ｃ６−酸化を大豆ペルオキシダーゼ／過酸化水素および媒介物としてのＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich）を用いて実験室試験で行う。以下の条件を使用する：
− Ｄ−トレハロースの固形分含有量 ：４０％（固形分含有量）
− ＴＥＭＰＯ／第一アルコール基−モル比：１／４０
− 大豆ペルオキシダーゼ（OrganicTecTM）： ５，０００単位／１モルの第一ＯＨ
− 過酸化水素（３０％濃度PerhydrolTM） ： ０．０１ｍＬ／分
− ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７およびｐＨ８に無電ｐＨ制御するための水酸化ナトリウム４モル溶液
− 反応温度：２５℃。
【００５３】
サンプルを反応時間を増加させた後に採取する。相応する水酸化ナトリウム消費量を表２に示す。
【００５４】
カルボキシル基およびアルデヒド測定：
ＮａＯＨ消費量の他に、標準Blumenkrantz法（特定ウロン酸定量化法）およびＨＰＬＣ法を酸化のレベルを測定するために使用する。ＨＰＬＣは２４℃、１ｍＬ／分で０．０１モルのＨ２ＳＯ２の入った２つの連続したShodex KC-811 (H+ 型)カラムで行う。
【００５５】
アルデヒド濃度は上記実施例２に記載の方法を用いて測定する。得られた結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２：
Ｄ−トレハロースの第一ＯＨを、カルボン酸を生成する前にアルデヒドに酸化する。異なる酸化度でアルデヒドを測定すると、高い酸化度ではアルデヒドの値が低いことがわかる。
［比較例１］
ｐＨ制御せずのトレハロースの酸化：
トレハロースの酸化を大豆ペルオキシダーゼ／過酸化水素および媒介物としてのＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich）を用いて実験室試験で行う。以下の条件を使用する：
− Ｄ−トレハロースの固形分含有量：４０％ｄ．ｓ．
− ＴＥＭＰＯ／第一アルコール基−モル比：１／７０
− 大豆ペルオキシダーゼ（OrganicTecTM）： ５，０００単位／１モルの第一ＯＨ
− 過酸化水素（３０％濃度PerhydrolTM） ：５２時間に亙って供給した２．４モル／１モルの第一ＯＨ
− 反応温度：２５℃。
【００５８】
ｐＨ制御をしないと、トレハロースの９％しか酸化されず、溶液中に８３％のトレハロースが残留することがわかった。
［比較例２］
オイルシード・ペルオキシダーゼを用いずに酸化：
４０％（固形分含有量）の２０ｇのＤ−トレハロース溶液に、ＴＥＭＰＯ（製造元：Aldrich）を１／４０のＴＥＭＰＯ／第一アルコール基−モル比で添加する。ペルオキシダーゼとしてわさび大根ペルオキシダーゼ（製造元：Fluka）を１モルの第一ＯＨ当たり１０，０００単位の供給量で使用する。
【００５９】
酸化は２５℃で実施する。過酸化水素（３０％濃度PerhydrolTM）を０．０１ｍＬ／分の流速で添加する。ｐＨは４モル濃度のＮａＯＨを添加することによってｐＨ７に維持する。１時間反応した後に過酸化水素濃度は２５ｐｐｍを越えた。反応は、全部で２９．３ｍＬの過酸化水素添加量および０．６ｍＬのＮａＯＨ消費量にて４９時間継続する。ＨＰＬＣ分析で０．７％の酸化がわかった。このように、わさび大根ペルオキシダーゼを使用したのでは、顕著な酸化は行われない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する反応媒体をニトロキシ基媒介物およびペルオキシダーゼ酵素と接触させることを含む、少なくとも１つの第一アルコール基を持つ炭水化物および／または炭水化物誘導体を酸化する方法において、初期反応媒体が少なくとも１０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有しており、ペルオキシダーゼ酵素がオイルシード・ペルオキシダーゼでありそしてヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物を反応媒体に、それのｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように徐々に添加することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
炭水化物および／または炭水化物誘導体を澱粉、グルコース、トレハロース、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、グルコースシロップ、マルトデキストリン、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐＨを３．５〜８．０、好ましくは４．０〜７．５の間に維持する、請求項１に記載の炭水化物の酸化法。
【請求項４】
ｐＨを５．０〜１０．０の間に維持する、請求項１に記載の炭水化物誘導体の酸化法。
【請求項５】
初期反応媒体が少なくとも４０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
第一アルコール基の少なくとも１０％を酸化する、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
酸化された第一アルコール基の少なくとも５０％をカルボキシル基に酸化する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ニトロキシ基媒介物がジ第三ニトロキシル化合物、好ましくは２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）およびそれの誘導体またはそれらの混合物から選択される、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
初期反応媒体がニトロキシ基媒介物と第一アルコール基とを１：４〜１：１５０、好ましくは１：４０〜１：７０のモル比で含有する、請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
ペルオキシダーゼ酵素が菜種ペルオキシダーゼ、パーム油ペルオキシダーゼ、落花生ペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼおよびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
ペルオキシダーゼ酵素が大豆ペルオキシダーゼまたはパーム油ペルオキシダーゼである請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
初期反応媒体が１モルの第一アルコール当たりに２０００〜５４０，０００単位のペルオキシダーゼ酵素、好ましくは約５０００単位のペルオキシダーゼ酵素を含有する、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
ペルオキシダーゼ酵素が担体に固定化されている請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
１モルの第一アルコール当たりに０．５〜４ミリモル／分のヒドロペルオキシドを反応媒体に添加する、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロペルオキシドが過酸化水素またはそれの源物質である、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
第一アルコール基当たりに０．１〜１．１ミリモル／分のアルカリ化合物を反応媒体に添加する、請求項１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
アルカリ化合物が水酸化ナトリウムである、請求項１〜１６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
反応媒体を２０〜５０℃、好ましくは約２５℃の温度に維持する、請求項１〜１７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
反応時間が２０〜５５時間、好ましくは４５〜５２時間である、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜３または５〜１９のいずれか一つに記載の方法に従ってグルコースを酸化することを特徴とするグルコン酸および／またはグルカル酸の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜３または５〜１９のいずれか一つに記載の方法に従ってトレハロースを酸化することを特徴とする酸化トレハロースの製造方法。
【請求項２２】
ａ）請求項１〜３または５〜１９のいずれか一つに記載の方法に従ってトレハロースを酸化し；
ｂ）場合によってはニトロキシ基媒介物を回収し；
ｃ）段階ａ）の反応の酸化生成物を加水分解し；
ｄ）段階ｃ）の加水分解反応の生成物をラクトン化し；そして
ｅ）段階ｄ）の生成物を結晶化する
各段階を含むＤ−グルクロノラクトンの製造方法。
【請求項２３】
上記トレハロースの少なくとも１５％をＤ−グルクロノラクトンに転化する、請求項２２に従う方法。
【請求項２４】
段階ｃ）を硫酸、ＨＣｌおよび／またはカチオン交換樹脂の存在下に実施する、請求項２２または２３に従う方法。
【請求項２５】
段階ｃ）をO-グルコシル化合物加水分解酵素の存在下に、好ましくはエクソ−ポリガラクツロナーゼの存在下に実施する、請求項２２または２３に従う方法。
【請求項２６】
O-グルコシル化合物加水分解酵素を担体に固定化する、請求項２５に従う方法。
【請求項１】
炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する反応媒体をニトロキシ基媒介物およびペルオキシダーゼ酵素と接触させることを含む、少なくとも１つの第一アルコール基を持つ炭水化物および／または炭水化物誘導体を酸化する方法において、初期反応媒体が少なくとも１０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有しており、ペルオキシダーゼ酵素がオイルシード・ペルオキシダーゼでありそしてヒドロペルオキシドおよびアルカリ化合物を反応媒体に、それのｐＨが３．５〜１０．０の間に維持されるように徐々に添加することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
炭水化物および／または炭水化物誘導体を澱粉、グルコース、トレハロース、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、グルコースシロップ、マルトデキストリン、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐＨを３．５〜８．０、好ましくは４．０〜７．５の間に維持する、請求項１に記載の炭水化物の酸化法。
【請求項４】
ｐＨを５．０〜１０．０の間に維持する、請求項１に記載の炭水化物誘導体の酸化法。
【請求項５】
初期反応媒体が少なくとも４０重量％の炭水化物および／または炭水化物誘導体を含有する、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
第一アルコール基の少なくとも１０％を酸化する、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
酸化された第一アルコール基の少なくとも５０％をカルボキシル基に酸化する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ニトロキシ基媒介物がジ第三ニトロキシル化合物、好ましくは２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）およびそれの誘導体またはそれらの混合物から選択される、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
初期反応媒体がニトロキシ基媒介物と第一アルコール基とを１：４〜１：１５０、好ましくは１：４０〜１：７０のモル比で含有する、請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
ペルオキシダーゼ酵素が菜種ペルオキシダーゼ、パーム油ペルオキシダーゼ、落花生ペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼおよびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
ペルオキシダーゼ酵素が大豆ペルオキシダーゼまたはパーム油ペルオキシダーゼである請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
初期反応媒体が１モルの第一アルコール当たりに２０００〜５４０，０００単位のペルオキシダーゼ酵素、好ましくは約５０００単位のペルオキシダーゼ酵素を含有する、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
ペルオキシダーゼ酵素が担体に固定化されている請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
１モルの第一アルコール当たりに０．５〜４ミリモル／分のヒドロペルオキシドを反応媒体に添加する、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロペルオキシドが過酸化水素またはそれの源物質である、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
第一アルコール基当たりに０．１〜１．１ミリモル／分のアルカリ化合物を反応媒体に添加する、請求項１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
アルカリ化合物が水酸化ナトリウムである、請求項１〜１６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
反応媒体を２０〜５０℃、好ましくは約２５℃の温度に維持する、請求項１〜１７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
反応時間が２０〜５５時間、好ましくは４５〜５２時間である、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜３または５〜１９のいずれか一つに記載の方法に従ってグルコースを酸化することを特徴とするグルコン酸および／またはグルカル酸の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜３または５〜１９のいずれか一つに記載の方法に従ってトレハロースを酸化することを特徴とする酸化トレハロースの製造方法。
【請求項２２】
ａ）請求項１〜３または５〜１９のいずれか一つに記載の方法に従ってトレハロースを酸化し；
ｂ）場合によってはニトロキシ基媒介物を回収し；
ｃ）段階ａ）の反応の酸化生成物を加水分解し；
ｄ）段階ｃ）の加水分解反応の生成物をラクトン化し；そして
ｅ）段階ｄ）の生成物を結晶化する
各段階を含むＤ−グルクロノラクトンの製造方法。
【請求項２３】
上記トレハロースの少なくとも１５％をＤ−グルクロノラクトンに転化する、請求項２２に従う方法。
【請求項２４】
段階ｃ）を硫酸、ＨＣｌおよび／またはカチオン交換樹脂の存在下に実施する、請求項２２または２３に従う方法。
【請求項２５】
段階ｃ）をO-グルコシル化合物加水分解酵素の存在下に、好ましくはエクソ−ポリガラクツロナーゼの存在下に実施する、請求項２２または２３に従う方法。
【請求項２６】
O-グルコシル化合物加水分解酵素を担体に固定化する、請求項２５に従う方法。
【公表番号】特表２００７−５３４３１２（Ｐ２００７−５３４３１２Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４４３５７（Ｐ２００６−５４４３５７）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１４４０６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１５２
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５０６２０７６６８）セレスタール・ホールデイング・ベスローテン・フェンノートシャップ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１４４０６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１５２
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５０６２０７６６８）セレスタール・ホールデイング・ベスローテン・フェンノートシャップ (3)
【Ｆターム（参考）】
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