ホモ乳酸的好熱性バチルスの遺伝子改変
本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の工業的な適用の為の遺伝子改変に関する。本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種を遺伝子操作により改変する方法であって：ｐＳＨ７１レプリコンまたはその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化されたＤＮＡを、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中へ導入すること；選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能な温度で該細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能な温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと；選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能でない温度で該形質転換された細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能でない温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶことを含む前記方法を含む。本発明に従う方法は、Ｒ−乳酸の生産、乳酸以外の他の有機酸、アルコール、酵素、アミノ酸及びビタミンの生産の為にバチルスを改変する為に用いられうる。特に、本発明は、該バチルス種が、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物により、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を置換することにより改変される方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の産業上の利用の為の遺伝子改変に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸及び、ラクテートとして知られるその塩は、医薬、生分解性ポリマー及び食品加工を含む種々の分野において有用である、商業的に実行可能な製品である。通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種は、乳酸の工業的な製造にとって理想的な生物である。それらは、３０〜６５℃の温度で成長することができ、かつ、５０℃超の温度で嫌気的な工業的発酵を許す。この高温は、工業的スケールの際の発酵のときにいくつかの利点を有する：感染のより少ないリスク及び従ってより高い鏡像異性体純度、より速い反応等。ホモ乳酸的な性質は、ギ酸及び酢酸のような１５重量％超の副産物の形成無く、炭化水素源（六炭糖及び五炭糖を含む；国際公開第０４／０６３３８２号パンフレットを参照されたい）からの乳酸の生産を許す。バチルスの通性嫌気性の性質は、嫌気的条件下又は少なくともの酸素の低分圧下における発酵を許し、これは比較的高価でない装置及び処理を許す故に工業的スケールにとって望ましい。さらに、これらバクテリアの栄養要求は、ラクトバチルス種のような乳酸バクテリアのそれらよりも要求が厳しくなく、これも比較的高価でない工業的プロセスを許す。通性嫌気性且つホモ乳酸的である既知の中等度好熱性バチルスの１つの利点は、それらがＲ−ラクテートを生産しない又は実質的に生産しないことである。生分解性乳酸ポリマーの成功的な適用は、高価でないＳ−乳酸と高価でないＲ−乳酸の両方の利用可能性に依存するであろう故に、両方の鏡像異性体の良い費用効率の生産が要求される。現在知られているＲ−ラクテートを生産するバクテリアは、中等温度好性（例えばバチルス ラエボラクティクス）であるか又は要求の厳しい栄養要求を有し（例えばラクトバチルス デルブリッキー）、これはＲ−ラクテートの製造を、Ｓ−ラクテートの製造よりもはるかに高価にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明の１つの目的は、通性嫌気性であり且つＲ−乳酸をホモ乳酸発酵により生産する中等度好熱性バチルス株を利用することである。本発明の他の目的は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である、遺伝子操作された中等度好熱性バチルスを製造する方法を利用することである。
【０００４】
バチルス属は、２００を超える異なる種を含む（Sneath, P.H.A., 1986: Endospore-forming Gram-positive rods and cocci. in Bergey's manual of systematic bacteriology. Vol 2. Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E., Holt, J.G.(eds)Williams & Wilkins, Baltimore、を参照されたい）。これらの少しの部分だけが、遺伝子的に利用できると知られている。例えば、プロトプラスト形質転換は、多数の種々のバチルス種に機能するが、コンピテント細胞の形質転換は一般に、厳密に好気性かつ中等温度好性のバチルス ズブチリス １６８の細胞について満足に働くことが示されているだけである。工業的な株は、バチルス リケニホルミスから知られるとおり、遺伝子の改変にしばしばより耐性である。この通性嫌気性の中等度好熱性バチルス種は、酵素の工業的生産のために用いられる。しかしながら、そのヘテロ乳酸的性質の故に、乳酸の生産の為に用いられ得ない（Bulthuis, B.A., C.Rommens, G.M.Koningstein, A.H.Stouthamer, H.W.van Verseveld, 1991;Formation of fermentation products and extracellular protease during anaerobic growth of Bacillus licheniformis in chemostat and batch-culture、Antonie van Leeuwenhoek 60:355-371、を参照されたい）。一般に、高頻度のコンピテンス形質転換手順は、工業的な株について利用可能でない（Outtrup,H., and S.T. Jφrgensen, 2002: The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes in Aplications and systematics of Bacillus and relatives. R.Berkeley, M.Heyndrickx, N.Logan, and P.de Vos(eds.), pp. 206-218, Blackwell Publishing, Malden, USA、を参照されたい）。そのような株は、米国特許第６，０８３，７１８号明細書に開示されているとおりプロトプラスト形質転換により改変されうる。
【０００５】
今日までに、通性嫌気性且つ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作を明示する方法は記載されていない。プロトプラスト融合による、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓからバチルス コアギュランスへのプラスミド転移を主張する１つの報告が発行されているが（Ball, A.S., and C.Edwards, 1989:Properties of protoplasts from the thermophile Bacillus coagulans and their significance for genetic studies. Lett. Appl. Microbiol. 9:141-144、を参照されたい）、それはＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓがプラスミドを実際に宿すことの証拠を与えない。該主張は、抗生物質耐性コロニーの成長の観察に基づくだけであり、これは非常によく自然に発生する抗生物質耐性変異体であり得る。我々は、抗生物質の種々のタイプについて頻繁に、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓのそのような自然発生する抗生物質耐性変異体を観察してきた。他の刊行物：バチルス種の形質転換：An Examination of the transformation of Bacillus protoplasts by plasmids pUB110 and pHV33, Current Microbiology, Vol 13(1986), pp 191-195、において、種々のバチルスにおけるプロトプラスト形質転換が記載された。しかしながら、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓにおける形質転換は、失敗と報告された。
【０００６】
エレクトロポレーションはバクテリアについて広く用いられているが、増殖培地及びエレクトロポレーション緩衝液の種特異的な（又は株特異的さえの）最適化を要求する。バチルス種の成功的なエレクトロポレーションは、形質転換後のプラスミドＤＮＡの制限を防ぐ為にプラスミドＤＮＡのインビボ又はインビトロでのメチル化をしばしば要求する。国際公開第０２／２９０３０号パンフレットは、インビボでメチル化されたプラスミドの、エレクトロポレーションによる好熱性バチルス株ＴＮの細胞中への導入を開示する。用いられたプラスミドは、熱感受性プラスミドｐＵＢ１１０に基づく。しかしながら、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種を形質転換するために用いられたとき、このプラスミドは形質転換された細胞を産出しなかったことを、我々は発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は、遺伝子操作に基づく、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子の改変が可能であることを、今発見した。従って、本発明は最初に、形質転換による、中等度好熱性の通性嫌気性ホモ乳酸的バチルス種の遺伝子操作を示す。通性嫌気性且つＲ−乳酸生産についてホモ乳酸的である該中等度好熱性バチルスの操作に加えて、該バチルスは、乳酸以外の他の有機酸、アルコール、酵素、アミノ酸及びビタミンを含む工業的化合物の生産のためにも遺伝子操作されうる。
【０００８】
本発明に従い、中等度好熱性バチルス種がホモ乳酸的であることが重要である。何故なら、これが、新たに導入された機能が少量の副産物を伴う高い収率の生産を結果するであろうことを確保するからである。さらに、ホモ乳酸的バチルス種の使用は、産業上利用可能な微生物を得るために、僅かな改変だけが適用される必要があることを可能とする。
【０００９】
中等度好熱性バチルス種は、３０〜６５℃の温度で成長することができるバクテリアとして定義される。中等度好熱性の通性嫌気性ホモ乳酸的種の例は、バチルス コアギュランス及びバチルス スミシーである。ホモ乳酸的バチルスは天然に、ホモ乳酸発酵によりＳ−ラクテートを生産することができる。どの特定の株がホモ乳酸的発酵により乳酸を生産できるかは、当技術分野の当業者により容易に決定されうる。本発明は、該ホモ乳酸的な表現型が改変されている中等度好熱性の通性嫌気性バチルス種から派生した株も包含する。好ましくは、胞子形成欠損性である株又は派生体が選ばれる。
【００１０】
中等度好熱性の通性嫌気性ホモ乳酸的バチルスの形質転換について、文献は利用できなかったので、本発明者らは、形質転換によりこれらのバチルスを遺伝子操作することができるために、これらバチルス中で複製することができるプラスミドを発見することを必要とし、該細胞中へＤＮＡを導入する方法を最適化することを必要とし、かつ、バチルス種の定義された群についての適当な選択可能マーカーを発見することを必要とした。
【００１１】
本発明者らは、これらバチルス中で複製できるプラスミドを発見するための方法としてエレクトロポレーションを使用することを決定した。試験されたプラスミドは、ｐＩＬ２５３（Simon, D., and A.Chopin, 1988:Construction of a vector plasmid family and its use for molecular cloning in Streptococcus lactis, Biochimie 70:559-566、を参照されたい）、ｐＭＶ１５８（Burdett, V., 1980:Identification of tetracycline resistant R-plasmids in Streptococcus agalactiae (group B), Antimicrob. Agents Chemother. 18:753-766、を参照されたい）、ｐＨＰ１３（Haima,P., S.Bron, G.Venema, 1987:The effect of restriction on shotgun cloning and plasmid stability in Bacillus subtilis Marburg. Mol. gen. Genet. 209:335-342、を参照されたい）、ｐＵＢ１１０（Keggins, K.M., P.S.Lovett, E.J.Duvall, 1978:Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector plasmid pUB110, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1423-1427、を参照されたい）、ｐＡＭＳ１００（Kiewiet, R., J.Kok, J.F.M.L. Seegers, G.Venema, S.Bron, 1993:The mode of replication is a major factor in segregational plasmic instability in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 59:358-364）、ｐＷＣＦＳ１０５（Van Kranenburg, R., N. Golic, R. Bongers, R.J.Leer. W.M.de Vos, R.J.Siezen, M.Kleerebezem, 2005;Functional analysis of three plasmids from Lactobacillus plantarum, Appl. Environ. Microbiol.71:1223-1230を参照されたい）、ｐＮＺ２８０（Platteeuw, C., F.Michiels, H.Joos, J.Seurinck, and W.M.De Vos, 1995:Characterization and heterologous expression of the tetL gene and identification of iso-lSS1 elements from Enterococcus faecalis plasimie pJH1, Gene 160:89-93、を参照されたい）、ｐＮＺ１２４（Platteeuw, C., G.Simons, and W.M.de Vos. 1994:Use of the Escherichia coli β-glucuronidase (gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria, Appl. Environ. Microbiol. 60:587-593）、及びｐＮＷ３３ｎ（Zeigler,E.R. 2001:The genus Geobacillus; introduction and strain catalog, 7th ed., vol.3.Bacillus Genetic Stock Center. www.bgsc.org、を参照されたい）である。種々の試験の後、後の３つのプラスミドが複製することができ、かつ形質転換体を産出することができることが発見された。
【００１２】
これらのバチルス中で複製できるプラスミドが同定されたら、形質転換プロトコルに関する他のプロセスパラメータは、容易に最適化されうる。さらに、自然形質転換又は接合のような、ＤＮＡの導入の為の他の方法が、それらの実行可能性について試験されうる。
【００１３】
抗生物質耐性マーカーによる試験は、少なくともクロラムフェニコール耐性、テトラサイクリン耐性及びカナマイシン耐性が、用いられうることを実証した。低すぎる濃度を回避する為の措置が採られるべきである。何故なら、これらは自然発生する抗生物質耐性コロニーを生じうるからである。ｐＮＺ１２４又はｐＮＷ３３ｎ中にクローン化された、ｐＩＬ２５３からのエリスロマイシン耐性遺伝子の導入は、形質転換体を産出しなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
従って、第１の局面において、本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の、遺伝子操作による遺伝子改変の方法を開示する。該方法は、
ｐＳＨ７１レプリコンまたはその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化されたＤＮＡを、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中へ導入すること；
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能な温度で該細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能な温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと；
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能でない温度で該形質転換された細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能でない温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと；
の段階を含む。
【００１５】
許容可能な温度での選択培地上での該細胞の培養は、形質転換体、すなわち形質転換するＤＮＡを得た細胞の選抜を許す。好ましくは、形質転換するＤＮＡの完全性を確認することを許す為に、形質転換されたコロニーは、許容可能でない温度で形質転換された細胞を培養することに先立ち、単離される。次に、完全体の選抜を許す為に、１又はいくつか個々のコロニーの細胞が許容可能でない温度で培養される。
【００１６】
本発明に従い、関心のあるＤＮＡは、ｐＳＨ７１レプリコン（GenBank Accession Number A09338）又はその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化される。ｐＳＨ７１レプリコンは、熱感受性複製の機能を提供するレプリコンである。
【００１７】
熱感受性複製の機能は、許容可能な温度での該レプリコンを含有するプラスミドの複製を与え、かつ、許容可能でない温度での該プラスミドの複製の欠如を与える。ｐＳＨ７１レプリコンのこの熱感受性複製の機能は、該レプリコンによりコードされる複製起点及び複製タンパク質（ＲｅｐＡ）により与えられる。
【００１８】
本発明の文脈において、「ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体」は、熱感受性複製の機能（ＲｅｐＡタンパク質）を有し且つ配列ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列又は配列ＩＤ ＮＯ：１と８０％同一、好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡとして定義される。ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体は、上記で定義された通りのＲｅｐＡタンパク質が作用することができる複製起点を更に含む。ｐＳＨ７１レプリコンの相同体の例は、ｐＷＶ０１（GenBank Accession Number X56954）である。ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体は、調節タンパク質（ＲｅｐＣ)を更に含みうる。
【００１９】
本発明の目的に関して、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、該２つの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージをいう。同一性の程度は、BLASTアルゴリズムを用いて決定され、これはAltschul, et al., J.Mol.Biol. 215: 403-410(1990)に記載されている。BLAST分析を実施する為のソフトウェアは、米国立生物情報センターを通じて公に利用可能である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アラインメントの感度と速さを決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（W)、Blosum62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)を参照されたい)の50のアライメント（Ｂ）、10の予測（Ｅ）、M＝５、N＝−４及び両鎖の比較を用いる。
【００２０】
形質転換するＤＮＡの染色体への組み込みが意図されるとき、条件付きのレプリコンを有する組み込みプラスミドの利用可能性が望ましい。そのようなプラスミドは許容可能な条件下で導入されることができ、その後（例えば許容可能でない温度へのシフトにより）成長条件が変化されることができ、該プラスミドを非複製的にし且つ相同又は非相同組み換えにより引き起こされる染色体への組み込み現象に関する選抜を許す。条件付きのクローニングベクターとして、ｐＮＺ１２４に存在するｐＳＨ７１のような熱感受性レプリコン、又はそれと実質的に同一である（相同な）プラスミド、又はプラスミドの熱感受性特性を保有したそれらの派生体が用いられうる。通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種中におけるこのレプリコンとって許容可能な温度は好ましくは、３７〜５０℃である。許容可能でない温度は好ましくは、５０℃超である。許容可能な温度及び許容可能でない温度は、レプリコンに依存しうるだけでなく、宿主バチルス種にも依存しうる。後者は先行文献からの既知の現象であり、３７℃が、ラクトバチルス デルブリッキー中において許容可能な温度であるがラクトコッカス ラクティスについては許容可能でない温度であるｐＧ＋宿主プラスミドにより例示される（米国特許第５９１９６７８号明細書を参照されたい）。
【００２１】
条件付きのクローニングベクターは、ｐＮＷ３３ｎの熱感受性派生体又は通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種中で複製できる他のプラスミドとしても得られうる。
【００２２】
ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体を有する熱感受性プラスミド系中にクローン化された、関心のあるＤＮＡは、
A. プロトプラスト形質転換又はプロトプラスト融合、
B. エレクトロポレーション、
C. バイオリスティック（biolistic）形質転換、
D. 接合、又は、
E. 自然のコンピテント細胞の形質転換
により、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中に導入される。
【００２３】
エレクトロポレーションによるこれらバチルス種の形質転換は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種と、所望の機能及び／又は特定のバチルスのゲノム配列と相同なＤＮＡ配列を含む適当な形質転換するＤＮＡとを含有する懸濁物を通じた高電圧放電により達成されうる。
【００２４】
接合によるこれらバチルス種の形質転換は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種（の集団）と、所望の機能を有する自己伝達性又は可動性のプラスミドを含有する供与体細胞（の集団）とを、接触させることにより達成されうる。自己伝達性プラスミドは、それらが細胞間を移動するのに必要とする全ての機能をコードし、かつ、時々それらは、染色体DNA及び可動性プラスミドの転移において助けともなる。可動性プラスミドは、転移に必要とされるタンパク質の全てをコードせず、そして結果として（染色体又はプラスミドにコードされた）供与体ゲノムにより与えられるべきこれらの機能を必要とする。可動性プラスミドは少なくとも、転移のオリジン（oriT）領域を含有する。改変されるべき中等度好熱性バチルスと共培養されうる任意の供与体細胞も、原則として、供与体細胞として働くのに適当である。適当な供与体細胞の例は、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むバチルス種、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロコッカス フェカリス、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｃｏｒｉｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌ．ｄｅｌｂｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｓａｋｅｉ、Ｌ．ｓａｎｆｒｉｓｃｅｎｓｉｓを含むラクトバチルス種、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ及びＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含むストレプトコッカス種のそれらである。適当な自己伝達性プラスミドは、ｐＲＫ２４、ｐＬＳ２０、ｐＡＭβ１又はそれらと実質的に同一であるプラスミド又はプラスミドの自己伝達性能力を保有したこれらの派生体を含む。適当な可動性プラスミドは、ｐＡＴ１８、ｐＡＴ２８、ｐＪＳ２８又はそれらと実質的に同一であるプラスミド又はプラスミドの可動性能力を保有したこれらの派生体を含む。
【００２５】
本発明者らはさらに、これらバチルス種についての自然形質転換プロトコルをなんとかして開発した。これは、増殖、飢餓及び形質転換のための適切な培地組成、コンピテント細胞を展開及び回収するための適切なタイミング、並びに適切な形質転換手順を決定することを要求した。自然形質転換は、バチルス種の間では広まっていると知られていないが、本発明者らは、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルスが、自然にコンピテントにされうることを発見した。
【００２６】
エレクトロポレーション及びプロトプラスト形質転換に関して、形質転換するＤＮＡの源は、形質転換結果物に影響を与えうる。（ラクトコッカス ラクティス ＭＧ １３６３、エシェリヒア コリ ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、又はＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１１０から単離された）形質転換されるべきDNAの源は、本バチルス種における形質転換効率に影響しなかった。これはＤＮＡのメチル化状態が重要でないことを示す。これは、他のバチルス種とは対照的である（例えば国際公開第０２／２９０３０号パンフレットを参照されたい）。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様において、バチルス中への導入の為の形質転換するＤＮＡは、ラクトコッカス ラクティスから単離される。より好ましくは、該形質転換するＤＮＡを構築する為のクローニング段階も、ラクトコッカス ラクティス中で実施される。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのクローニングは、しばしばクローン化されたＤＮＡにおいて欠失及び／又は転位を結果するとみえたからである。
【００２８】
本発明により、好ましくは自然のコンピテンスの誘導による形質転換に関する方法、エレクトロコンピテント細胞の形質転換に関する方法、及び接合に関する方法が提供され、熱感受性プラスミドを使用する方法が示され、かつ、例えばＲ−ラクテートの生産の為の、通性嫌気性且つホモ乳酸的である遺伝子操作された中等度好熱性バチルス種の製造の為のこれらの要素の適用が示される。
【００２９】
形質転換するＤＮＡは、ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体とバチルス細胞に所望の機能を提供することができる、関心のあるＤＮＡとを有する。
【００３０】
染色体の改変は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の好ましい改変である。何故なら、染色体の改変は、子孫細胞にわたり、該機能の安定な分配を確保するであろうからである。染色体中の所望の機能の導入は、非相同性組み換え並びに相同組み換えによりなされうる。相同組み換えは、機能を導入し、除去し、又は導入と除去を同時にする機会を開くので、相同組み換えが好ましい。
【００３１】
本発明の文脈において、機能は、細胞により生産されるべき所望のポリペプチドをコードする遺伝子及び／又は細胞による一次又は二次代謝産物の生産に関するポリペプチドをコードする遺伝子及び／又は細胞の染色体からDNA配列の欠失を可能とするDNA配列でありうる。
【００３２】
ポリペプチドをコードする遺伝子は、細胞中で機能的な調節配列、例えばプロモーター配列を備えられる。該調節配列は、該コード配列と天然に連結された配列であってよく、又はそれと非相同であってもよい。
【００３３】
ポリペプチドをコードする遺伝子は、好みのバチルス種において機能する任意の調節配列又はプロモーター配列に結合されうる。適当なプロモーター配列は、好みのバチルス種から入手可能なプロモーター、異なる天然のバチルスプロモーターに由来するハイブリッドプロモーター及び人工のプロモーターを包含する。好ましいプロモーターは、相同組み換えにより不活性化されるべきバチルス遺伝子のプロモーターである。バチルス コアギュランスからのｌｄｈＬプロモーターが特に好ましい。又は、米国特許第５１７１６７３号明細書において開示されたとおりのアミラーゼ遺伝子のプロモーターが特に好ましい。
【００３４】
形質転換されていない細胞の大多数からの形質転換されたバチルス細胞の選択を可能とする為に、選択マーカーが形質転換するＤＮＡの一部である。該選択マーカーは、関心のある機能として同じＤＮＡ断片若しくはプラスミド上に存在してよく又は別のＤＮＡ断片又はプラスミド上に存在してもよい。好ましい選択マーカーは、ｐＭＨ３からの、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするｃａｔ遺伝子である。
【００３５】
導入されうる所望の機能は、以下に記載されるとおりのＲ−乳酸の生産であり、及び、パイルベートから代謝可能な化合物の生産を提供する他の機能である。これら化合物の例は、パイルベート、アセトラクテート、ジアセチル、アセトイン、２，３−ブタンジオール、１，２−プロパンジオール、アセテート、ホルメート、アセトアルデヒド、エタノール、Ｌ−アラニン、オキサロアセテート、Ｓ−マレート、スクシネート、フマレート、２−オキソグルタレート、オキサロスクシネート、イソシトレート、シトレート、グリオキシレートである。
【００３６】
相同組み換えが意図されるとき、形質転換するＤＮＡはさらに、操作されるべき特定のバチルスの、遺伝子のターゲット配列と相同であるＤＮＡ配列を含む。当業者は、相同組み換えを得るために、１００％の同一性が必要とされないことを理解するであろう。約９０％のパーセンテージ同一性も十分であろう。一般に、相同組み換えにより染色体に挿入されるべき、関心のあるＤＮＡ配列は、相同組み換えを可能とする十分な長さを有する相同配列の側に置かれる。そのような長さは、少なくとも約２００ｂｐ、例えば約２００〜約１５００ｂｐ、好ましくは約２００〜約１０００ｂｐである。
【００３７】
本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子の操作による改変であって、好ましくは相同組み換えにより、所望の機能が導入される上記改変に向けられる。
【００３８】
本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作による改変であって、望ましくない機能が相同組み換えにより除去される上記改変にも向けられる。
【００３９】
本発明はさらに、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作による改変であって、所望の機能が染色体中に導入され且つ同時に望ましくない機能が相同組み換えにより除去される上記改変に向けられる。
【００４０】
遺伝子操作による該改変により得られる、遺伝子操作された通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス株又はホモ乳酸的である親株の派生体は、本発明の更なる局面を成す。遺伝子操作による改変は、バクテリアの染色体における機能の導入、バイクテリアの染色体からの機能の除去、又は、同時のバクテリアの染色体における機能の導入及びバクテリアの染色体からの機能の除去を包含する。
【００４１】
好ましい実施態様において、遺伝子操作による改変は、相同組み換えにより生じる。
【００４２】
１の好ましい実施態様において、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の、遺伝子操作された派生体は、パイルベートのラクテートへの転化がブロックされ且つパイルベートが蓄積する株、又は、アセトラクテート、ジアセチル、アセトイン、２，３−ブタンジオール、１，２−プロパンジオール、アセテート、ホルメート、アセトアルデヒド、エタノール、Ｌ−アラニン、オキサロアセテート、Ｓ−マレート、スクシネート、フマレート、２−オキソグルタレート、オキサロスクシネート、イソシトレート、シトレート、グリオキシレートを含む他の産物の生産に対してパイルベートが向け直される為に追加の改変が適用される株である。
【００４３】
他の好ましい実施態様において、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作された派生体は、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＬ遺伝子が相同組み換えにより除去された株である。
【００４４】
他の好ましい実施態様において、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作された派生体は、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードするｌｄｈＬ遺伝子が、相同組み換えにより、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するＮＡＤＨ−依存性２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子により置換された株である。
【００４５】
これらの実施態様において、相同組み換えの為に用いられる構築物は、機能的であるＳ−ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素をコードしない欠陥ｌｄｈＬ遺伝子を含む。欠陥ｌｄｈＬ遺伝子は、ｌｄｈＬをコードする配列の一部又は全部が削除された構築物により提供されうる。
【００４６】
欠陥ｌｄｈＬ遺伝子は、他の遺伝子、例えば選択マーカーをコードする遺伝子又は関心のある遺伝子により、ｌｄｈＬ遺伝子の一部又は全部を置換することにより作成されうる。好ましくは、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードするｌｄｈＬ遺伝子は、ＥＣ番号ＥＣ１．１．１．２８．を有する酵素を含む、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するＮＡＤＨ−依存性２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する構築物により置換される。
【００４７】
Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードする適当な遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌｄｈＡ−変異体を相補することができる遺伝子であり、例えばBernardらにより記載されたとおりのＥ．ｃｏｌｉ ＦＭＪ１４４（Bernard, N., T.Ferrain, D.Garmyn, P.Hols, and J.Delcour, 1991:Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus by complementation in Escherichia coli. FEBS Lett. 290:61-64を参照されたい）などである。Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードする適当なｌｄｈＬ遺伝子は例えば、ラクトバチルス デルブリッキー subsp. bulgaricusからのｌｄｈＡ遺伝子（Bernardらも参照されたい）又は同じ種からのｈｄｈＤ遺伝子（Bernard, N., K.Johnsen, T.Ferain, D.Garmyn, P.Hols, J.J.Holbrook, and J.Delcour. 1994. NAD+-dependent D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Eur.J.Biochem.224:439-446）である。ｌｄｈＡ遺伝子によりコードされたＲ−ラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、配列ＩＤ ＮＯ：２に描かれている。上記のＥ．ｃｏｌｉ変異体の相補が可能である遺伝子によりコードされたポリペプチドは、アミノ酸配列において実質的に異なるようにみえる。配列ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と３０％ほどの低いパーセンテージ同一性が実施可能である。ｌｄｈＡ及びｈｄｈＤ遺伝子は、約５０％の同一性の程度を有するタンパク質をコードするようにみえる。
【００４８】
Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードする適当な遺伝子は、配列ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列をコードする遺伝子又は配列ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の同一性の程度を表すアミノ酸配列をコードし且つＥ．ｃｏｌｉ ｌｄｈＡ−変異体、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＦＭＪ１４４などを相補することができる相同な遺伝子である。そのような相同配列は、自然の対立遺伝子変異又はイントラストレイン変異（intra-strain variation）の故に、異なる集団からの細胞中又は１の集団中の細胞中に存在しうる多型を含みうる。相同体はさらに、特定されたＤＮＡ又はアミノ酸配列の起源である種以外のバチルス種から得られてよく、又は人工的に設計され且つ合成されてもよい。
【００４９】
所望の機能を導入することに加えて、工業的な発酵を最適化する為、例えばキシロース及びアラビノースを含むリグノセルロース由来の糖のような安い基質の発酵を可能にする為及び／又は望ましくない機能を除去する為に、遺伝子操作は用いられうる。
【００５０】
更なる局面において、本発明は、前記の局面の遺伝子操作された株を、関心のある化合物の生産に資する条件下で培養することを含む、該化合物の生産の方法を提供する。
【００５１】
図面の説明
【００５２】
図１は、形質転換された３つのＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１分離株から単離されたプラスミド物質により形質転換された３つのＥ．ｃｏｌｉ分離株から単離されたｐＮＷ３３Ｎの制限分析を示す。レーン１、４及び７。ＥｃｏＲＩにより消化されたｐＮＷ３３Ｎ；４２１７−ｂｐ断片。レーン２、５及び８．ＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩにより消化されたｐＮＷ３３Ｎ；３３３−ｂｐ及び３８８４−ｂｐの断片。レーン３及び６。ｋｂ ＤＮＡラダー（Stratagene）２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１．０ｋｂ、１．５ｋｂ、２．０ｋｂ、３．０ｋｂ、４．０ｋｂ、５．０ｋｂ、６．０ｋｂ、７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、９．０ｋｂ、１０．０ｋｂ及び１２．０ｋｂ。
【００５３】
図２は、ｐＪＳ２８のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＢ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）は矢印により描かれる。ＩｎｃＰプラスミドのＲＫ２の転移のオリジン（oriT）及びＥ．ｃｏｌｉの複製起点（ori）が、四角で囲まれた領域として描かれる。
【００５４】
図３は、米国特許第５１７１６７３号明細書において開示された配列に基づく、合成のＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＴＣＣ２３４９８アミラーゼプロモーター領域のヌクレオチド配列を示す。ＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、及びＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）クローニング部位が下線付加されている。ＮｃｏＩ部位はアミラーゼプロモーターへの翻訳的結合を許す。アミラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンは、ボールド体で描かれる。
【００５５】
図４は、ｐＪＳ２５のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＡ及びｒｅｐＣ）、ＮｃｏＩ部位を有さないクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍ＊）が矢印で示される。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーター領域（Ｐ）は、四角で囲まれた領域として描かれる。
【００５６】
図５は、ｐＪＳ２６のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＡ及びｒｅｐＣ）、ＮｃｏＩ部位を有さないクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍ＊）、及びＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子（ｌｄｈＡ ６９０１）が矢印で示される。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーター領域（Ｐ）は四角で囲まれる。
【００５７】
図６は、ｐＪＳ２７のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＢ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、及び、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子（ｌｄｈＡ ６９０１）が矢印により描かれる。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーター領域（Ｐ）及びＥ．ｃｏｌｉの複製起点（ｏｒｉ）は、四角で囲まれた領域として描かれる。
【００５８】
図７は、ｐＲＫ１のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＡ及びｒｅｐＣ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、及び、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｌｄｈＡ遺伝子（ｌｄｈＡ）が矢印により描かれる。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーター領域（Ｐａｍｙ ＡＴＣＣ）及びＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｄｈＬ上流及び下流領域は、四角で囲まれた領域として描かれる。
【００５９】
本発明は、以下の非限定的な実施例により、さらに説明される。
【００６０】
実施例
【００６１】
材料と方法
【００６２】
プラスミド及び菌株
【００６３】
プラスミドｐＮＺ１２４（Platteeuw, C., G.Simons, and W.M. de Vos.1994. Use of the Echerichia coli β-glucuronidase(gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 60:587-593）が、ＮＩＺＯ ｆｏｏｄ ｒｅｓｅａｒｃｈから入手された。それは、欧州特許第０２２８７２６号明細書において開示されたクローニングベクターｐＮＺ１２に基づく。
プラスミドｐＮＷ３３Ｎ（Zeigler, D.R. 2001:The genus Geobacillus; introduction and strain catalog, 7th ed., vol. 3. Bacillus Genetic Stock Center. www.bgsc.org）が、Bacillus Genetic Stock Center、オハイオ州立大学、コロンバス、オハイオ州、アメリカ合衆国、から入手され、そして、エシェリヒア コリ ＤＨ５α（Invitrogen Life Technologies）中において増殖された。ｐＮＷ３３Ｎのヌクレオチド配列は、GenBankアクセス番号ＡＹ２３７１２２下で入手可能である。
ＩｎｃＰプラスミドのＲＫ２の転移のオリジン（ｏｒｉＴ）を有するプラスミドｐＡＴΔＳ２８（Namy, O., M.Mock, A.Fouet, 1999:Co-existence of clpB and clpC in the Baciliceae. FEMS Microbiol. Lett. 173:297-302）が、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒから得られた。
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１が、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ連邦共和国、から入手された。
Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363は、Gassonにより記載された（M.J.Gasson. 1983:Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing. J.Bacteriol. 154:1-9）。
Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus LMG 6901は、ＢＣＣＭ／ＬＭＧ bacteria collection、ヘント、ベルギーから得られた。
ｐＲＫ２４を宿すＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１は、Trieu-Cuotらにより記載された（Trieu-Cuot, P., C. Carlier, P.Martin, and P.Courvalin, 1987:Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 48:289-294）。
【００６４】
培養条件
【００６５】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓは慣例的に、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／Ｌのリン酸二アンモニウム、３．５ｇ／Ｌの硫酸二アンモニウム、１０ｇ／ＬのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ビス[２−ヒドロキシメチル]イミノトリス[ヒドロキシメチル]−メタン）、３ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２、５ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ２を含有するＢＣ培地において好気的条件下で４５℃で成長させられた；必要に応じ、培地は、５０ｇ／Ｌのスクロースを補われた；ｐＨは６．６〜６．７に調整され、そして培地は使用の前にオートクレーブされた（２０分１２１℃）。プレートについては、培地は１０ｇ／ＬのGelrite及び１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２を補われた。ろ過滅菌された微量元素が別に添加された。最終濃度は：０．２ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、０．０３mg／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｍｇ／Ｌ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０５ｍｇ／Ｌ ＺｎＣｌ２であった。必要に応じ、該培地は、７ｍｇ／Ｌでろ過滅菌されたクロラムフェニコールを補われた。コンピテンス培地（Ｃ−培地）は、、０．０５ｇ／Ｌ 酵母抽出物、２ｇ／Ｌ リン酸二アンモニウム、３．５ｇ／Ｌ 硫酸二アンモニウム、１０ｇ／Ｌ グルコース、１０ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、０．５ｇ／Ｌ ＫＣｌ、２５ｍｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２を有した：ｐＨは、６．８に調整され且つ培地は使用の前にオートクレーブされた（２０分１２１℃）。フィルター滅菌された微量元素及びビタミンが別に添加された。最終濃度は：２．４ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２、３．６ｍｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３、３ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２、１．２ｍｇ／Ｌ ＺｎＣｌ２、０．０２４ｍｇ／Ｌ ビオチン、０．０１２ｍｇ／Ｌ チアミン、２０ｍｇ／Ｌ メチオニンであった。形質転換培地（Ｔ−培地）は、０．０５ｇ／Ｌの代わりに０．０２５ｇ／Ｌの酵母抽出物を有するＣ−培地であった。
【００６６】
Ｅ．ｃｏｌｉは慣例的に、ＬＢ培地（Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. J.Sambrook and D.W.Russell. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）中で、３７℃で好気的条件下で培養された。必要に応じて、クロラムフェニコール及び／又はアンピシリンが、５ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌの濃度で夫々用いられた。
【００６７】
Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓは慣例的に、ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３７℃で嫌気的条件下で培養された。
【００６８】
Ｌ．ｌａｃｔｉｓは慣例的に、０．５％ グルコースを補われたＭ１７ ｂｒｏｔｈ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、３０℃で嫌気的条件下で培養された。必要に応じて、クロラムフェニコールが５ｍｇ／Ｌの濃度で用いられた。
【００６９】
ＤＮＡ操作技術
【００７０】
標準的なＤＮＡ操作技術は、Sambrook及びRussellにより記載されたとおりに実施された（J.Sambrook and D.W.Russell.2001:Molecular cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
【００７１】
ｐＮＺ１２４及びｐＮＷ３３Ｎの派生体の構築は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ及びＥ．ｃｏｌｉ中で夫々実施された。
【００７２】
１００ｍＬ培養物からの、ラージスケールのＥ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡ単離は、Ｊｅｔｓｔａｒ ２．０ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（商標）（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いて、製造者の使用説明書に従い実施された。１ｍＬ培養物からの、スモールスケールのＥ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡ単離は、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｑｕｉｃｋ Ｐｕｒｅ（商標）（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）キットを用いて、製造者の使用説明書に従い実施された。
【００７３】
ラージスケールのＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプラスミドＤＮＡ単離は、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド勾配中で平衡遠心を用いて実施された。好気的条件下で４５℃で成長された（１７０ｒｐｍ）、３００ｍＬの二晩培養物が、遠心により回収された。該細胞ペレットは、２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、３０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭのＭｇＣｌ２及び２５％スクロースを含有する緩衝液の７ｍｌ中にプールされそして再懸濁され、そして氷上で１５分間インキュベートされた。細胞は、０．２ＭのＮａＯＨ及び１％ＳＤＳを含有する溶液の１６ｍＬの添加により溶解された。氷上での５分のインキュベーション後、該サンプルは、３ＭのＫＡｃの１２ｍＬの添加と混合により中和された。沈殿物が、遠心により除去された。上清中のＤＮＡが、２０ｍＬのイソプロパノールの添加により沈殿された。ＤＮＡは、遠心によりペレット化され、乾燥されそして、１．０ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ及び０．４ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを含有するＴＥバッファー中に溶解された。染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡが、４５０００ｒｐｍで１６時間、垂直ローター（Stepsaver 65 V13（商標）；Sorvall）を用いてセシウムクロライド密度勾配により分離された。プラスミドＤＮＡが回収され、そしてエチジウムブロマイドが他のところ（Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. J. Sambrook and D.W.Russell.2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）で記載されたとおりに除去された。
【００７４】
１０ｍＬ培養物からの、スモールスケールのＬ．ｌａｃｔｉｓ及びＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプラスミドＤＮＡ単離は、グラム陽性バクテリアについてのミニプレッププロトコルに従い実施された（Rapid mini-prep isolation of high quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. D.J.O'Sullivan and T.R.Klaenhammer. 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59:2730-2733）。
【００７５】
Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞は、Sambrook及びRussellにより記載されたとおりに、塩化カルシウムを用いて調製され、そして熱ショックにより形質転換された（Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. J. Sambrook and D.W.Russell.2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
【００７６】
Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、ＨａｌｏとＮｅｓにより記載されたとおりに、エレクトロポレーションにより形質転換された（High-frequency transformation by electroporation of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. 1989. Holo,H., and I.F.Nes. Appl. Environ. Microbiol. 55:3119-3123）。
【００７７】
クローニングの目的の為のＰＣＲ反応は、高い忠実性のＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）により製造者の使用説明書に従い実施された。
【００７８】
コロニーＰＣＲ分析が、クロラムフェニコール耐性コロニー中のｐＮＷ３３Ｎの存在を実証する為に用いられた。ＰＣＲプライマーは、配列
及び
とのｐＮＷ３３Ｎ複製遺伝子ｒｅｐＢの同一性の為に設計された。コロニーは、つまようじにより取られ、そして、少しの細胞物質が、０．５ｍＬのＰＣＲ反応チューブに移された。細胞は、電子レンジ中で１０００Ｗで１分間のインキュベーションにより破壊された。ｒＴａｑポリメラーゼ（Amersham Biosciences）を有する５０μＬ及び夫々のプライマー０．５μｇのＰＣＲ反応混合物が、製造者により推奨されたとおりに調製され、そして、破壊された細胞を有する反応チューブに添加された。
【００７９】
ＰＣＲ反応は、ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（商標）（Stratagene）中で実施された。９４℃での４分間のインキュベーションの次に、変性の為の９４℃での３０秒間、プライマーアニーリングの為の５８℃での１分間、及び伸長の為の７２℃での１分間の２５サイクルが続いた。最終のサイクルの後で、反応混合物は、さらに５分間７２℃でインキュベートされた。
【００８０】
エレクトロポレーション
【００８１】
エレクトロコンピテント細胞の調製は、適切な培養条件、回収の時間並びに洗浄バッファー及びエレクトロポレーションバッファーの組成の決定を必要とした。Ｂ．ｃｏａｇｕｒａｎｓ ＤＳＭ１は、ＬＢ培地（エレクトロポレーション効率が増加された、発展したＢＣ培地）上で成長することができる。グリシンは、細胞壁を弱める為に添加され、そして該濃度は最適化された。グリシン濃度は、０．５〜２．０％、好ましくは１．０〜１．５％であった。細胞は、最適な結果の為に、対数増殖の初期から中期で回収された。エレクトロポレーションバッファーは、４．３〜６．０、好ましくは４．３〜５．０のｐＨを有した。最適なエレクトロポレーション設定（電圧、抵抗、容量）も、決定されることを必要とした。電圧は好ましくは１．０〜２．５ｋＶ、より好ましくは１．２５〜２．０ｋＶであった。抵抗は好ましくは１００〜８００Ω、より好ましくは２００〜６００Ωであった。選択培地上でのプレーティングの前のリカバリーは、重要でありそして少なくとも２時間好ましくは３時間であった。
【００８２】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓのエレクトロコンピテント細胞が以下のとおりに調製された。一晩培養物が、１％グリシンを補われた培地５０ｍＬに植菌する（５％体積／体積）為に用いられた（６００ｎｍで約０．１３〜０．１４の濁度を結果した）。４５℃での２．５時間の好気的インキュベーションの後、遠心により細胞が回収された。細胞ペレットは、２回、氷冷エレクトロポレーションバッファー（５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．４Ｍ ソルビトール、１０％ グリセロール、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ４．５に調製された）の５０ｍＬ及び２５ｍＬ夫々により洗浄され、そして１ｍＬの氷冷エレクトロポレーションバッファー中に再懸濁された。エレクトロポレーションの為に、１００μＬの細胞懸濁物が、１μｇプラスミドＤＮＡと混合され、そして、氷上で予め冷却された０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標））に移された。サンプルは、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ及びＰｕｌｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標））を用いて、２００Ω及び２５μＦで、１．６ｋＶパルスに付された。エレクトロポレーション後すぐに、１ｍＬの培地が添加され、そして細胞は９００ｒｐｍでＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で、４５℃で３時間インキュベートされ、その後それらはクロラムフェニコールを補われたプレート上に蒔かれた。プレートは、好気的条件下で１〜２日間４５℃でインキュベートされた。
【００８３】
接合
【００８４】
フィルター接合が、Ｅ．ｃｏｌｉからＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓへの組み換えプラスミドの接合転移の為に用いられた。供与体（２ｍＬ）と受容体（２ｍＬ）の対数増殖する細胞がプールされ、そして注射器を用いてプラスチックフィルターホルダー（Ｓｃｈｌｅｉｇｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）中の滅菌された０．４５μｍセルロースアセテートフィルター上で回収された。細胞は、１０ｍＬのＢＣ−培地により洗浄され、そして、フィルターはフィルターを通じて空気を送り込むことにより乾燥された。フィルターは、抗生物質無しのＢＣ−プレートの表面上に置かれ、そして４５℃で一晩インキュベートされた。接合後、細胞は、フィルターからＢＣ−培地中に再懸濁され、そして、希釈系列が、７ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＢＣプレート上に蒔かれ、そして１〜２日間好気的に５５℃でインキュベートされた。
【００８５】
酵素分析
【００８６】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーターを用いるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓにおける酵素過剰生産は、指数関数的に成長する培養物において測定された。細胞は、遠心により回収された。無細胞系抽出物が、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０（商標）装置（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を用いて、スピード４で３０秒の２度の運転において調製された。細胞は、運転の間に１分間氷上で冷却された。タンパク質含有量が、標準としてウシ血清アルブミンを用いたＢｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の方法により測定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）が、Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ 電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、SambrookとRussellにより記載されたとおりに実施された（Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. J. Sambrook and D.W.Russell.2001. Cold Spring Harbor laboratory Press, New York）。
【００８７】
Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ特異的活性が、０．３Ｍグリシルグリシンバッファー、ｐＨ１０、０．２５％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭ ＮＡＤ，及び１％Ｒ−ラクテートを含有する、１ｍｌの分析ミックスを用いて、３４０ｎｍで分光光学的に測定され且つ５０℃で実施された。反応は、無細胞系抽出物の４０又は５０μＬの添加により開始された。特異的な活性が、ΔＡが１ｃｍ経路長についての３４０ｎｍでの吸収の増加であり且つｍｇがタンパク質の量である、ΔＡ・分-1・ｍｇ-1として表された。
【００８８】
発酵
【００８９】
バッチ発酵が、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファー無し且つ３０ｇ／Ｌグルコースを補われたＢＣ培地の４Ｌを有するバイオリアクター（７Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎ（商標））中で実施された。５０℃で増殖され且つグリセロールストックから植菌された一晩の好気的培養物（４０ｍＬ）が３６０ｍＬの新しいＢＣ培地に移されそしてさらなる４〜５時間インキュベートされた。この４００ｍＬが、バイオリアクターに植菌する為に用いられた。ｐＨ維持は、２０％（ｗ／ｖ）での石灰溶液の自動的な添加により達せられた。発酵は、５４℃、ｐＨ６．５及び２５０〜３００ｒｐｍの攪拌速度で実施された。温度調節は、水槽（Ｌａｕｄａ）により実施されながら、ｐＨ測定／調節はＡＤＩ１０２０ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ（商標））により実施された。全てのデータ（ｐＨ及び基礎消費）は、オンラインデータ取得（Ａｐｐｌｉｋｏｎ ＦＭ Ｖ５．０（商標））により処理された。サンプルは、Ｒ−及びＳ−乳酸並びにあり得る副産物の測定の為に、植菌の前及び発酵の最後で抽出された。サンプルは遠心され、そして、残ったデブリはＭｉｌｌｅｘ ＧＰ０．２２μｍｆｉｌｔｅｒ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたろ過により除去された。ろ液は、さらなる分析まで−２１℃で保存された。
【００９０】
有機酸（乳酸、酢酸、ギ酸、コハク酸）が、誘導体化及びＧＬＣを用いて測定された。Ｒ−及びＳ−ラクテートは、メチル−ラクテートへメチル化され、そしてキラルカラム上でヘッドスペース分析により測定された。
【００９１】
結果
【００９２】
実施例１．自然のコンピテント細胞を用いた、プラスミドｐＮＷ３３ＮによるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの形質転換
【００９３】
１）Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１のコンピテント細胞の調製
３つの独立した実験において、以下の手順が用いられた。バチルス コアギュランス ＤＳＭ１が、好気的条件下で５ｍｌＢＣ−培地中で４５℃で一晩培養された。この培養物が、予め温められたＣ−培地中の２５ｍｌに植菌する為に用いられて、６００ｎｍで０．１５の濁度を結果した。６００ｎｍでの０．９〜１．２の濁度が達せられるまで、新しい培養物が４５℃で好気的にインキュベートされた（表１）。
【００９４】
２）ｐＮＷ３３ＮによるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１の形質転換
コンピテント細胞の０．５ｍＬ部分がペレット化され、そして、該ペレットが、Ｔ−培地の０．１ｍＬ中に再懸濁されそしてｐＮＷ３３ＮプラスミドＤＮＡの５μｇと混合された。９００ｒｐｍでのＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中での４５℃での１．５時間のインキュベーション後、予め温められたＢＣ培地の０．３ｍＬが添加され、そしてインキュベーションが２時間継続され、その後、細胞は７ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを補われたＢＣプレート上に蒔かれた。プレートは、４５℃で好気的にインキュベートされた。インキュベーションの３日後、コロニーが現れた（表１）。
【００９５】
【００９６】
３）Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１からのプラスミド単離
コロニーは、４５℃での一晩インキュベーションのために、７ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを補われた新しいＢＣプレート上にストライプされた。コロニーＰＣＲが、プラスミドｐＮＷ３３ＮからのｒｅｐＢ遺伝子の存在を検出する為に用いられた。全てのＰＣＲ反応は、期待されたサイズの産物を産出した。夫々の実験からの１のコロニーが、Ｏ／Ｎインキュベーション及びｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミド単離の為にＢＣ培地に移された。プラスミドＤＮＡはアガロースゲル電気泳動により視認され得なかったが、このｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡによるＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの形質転換は、ｐＮＷ３３Ｎが回収されることができた形質転換体を結果した。プラスミドＤＮＡは、ｐＮＷ３３Ｎの完全性を確認する為に、ＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩにより消化された。制限パターンは、期待されたとおりであり（表１）、プラスミドｐＮＷ３３ＮがＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１に形質転換されたことを実証した。
【００９７】
実施例２．エレクトロポレーションを用いた、プラスミドｐＮＷ３３ＮによるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの形質転換
【００９８】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１は慣例的に、エレクトロポレーションによって、１μｇプラスミドｐＮＷ３３Ｎにより形質転換された。典型的には、４５℃でのインキュベーションの一日後、２０超のコロニーが、クロラムフェニコールを含有するプレート上に現れた。１の実験において、１５のコロニーが、インキュベーションの２日後で、クロラムフェニコールを含有する新しいプレートに移された。４５℃でのインキュベーションの２４時間後、形質転換は、ｒｅｐＢ特異的プライマーを用いたコロニーＰＣＲ分析により確認された。
【００９９】
期待されたサイズのＰＣＲ産物が、試験された全ての形質転換体について得られ、ｐＮＷ３３ＮのｒｅｐＢ遺伝子が存在することを実証した。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ １は、ネガティブコントロールとして用いられ、そしてＰＣＲ産物を産出しなかった。一つの形質転換体のプラスミドＤＮＡが、セシウム−クロライド勾配から単離された。プラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲＩにより及びＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩにより、ｐＮＷ３３Ｎの完全性を確認する為に、消化された。制限パターンは期待されたとおりであり（３３３ｂｐ及び３８８４ｂｐの断片）、プラスミドｐＮＷ３３ＮがＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ １に形質転換されたことを実証した。
【０１００】
実施例３．接合を用いた、プラスミドｐＮＷ３３ＮによるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの形質転換
【０１０１】
１）転移のオリジンを含有するｐＮＷ３３Ｎ派生体の構築
ＩｎｃＰプラスミドＲＫ２の転移のオリジン（ｏｒｉＴ）が、ｐＮＷ３３Ｎへクローン化された。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ供与体中に共在する任意の自己移転可能なＩｎｃＰプラスミドによる有効な共可動化を許す（Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to Gram-positive bacteria. Trieu-Cuot,P., Carlier, c., Martin, P., and Couvalin, P. 1987. FEMS Microbiol. Lett. 48:289-294）。ＲＫ２ ｏｒｉＴ領域は、ｐＡＴΔＳ２８から由来する平滑末端化された０．５−ｋｂ ＡｃｃＩ−ＡｖａＩＩ断片として、ＳｍａＩにより消化されたｐＮＷ３３Ｎ中にクローン化された。得られたプラスミドｐＪＳ２８（図２）は、ｐＲＫ２４を宿すＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１へ形質転換された。この株は、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１とのプレート接合において供与体として用いられた。
【０１０２】
２）Ｅ．ｃｏｌｉからＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓへの、ｐＪＳ２８の接合転移
アンピシリンとクロラムフェニコールとを含有するＬＢ中で３７℃で好気的に成長された、ｐＪＳ２８とｐＲＫ２４とを宿すＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物は、抗生物質を有する新しいＬＢ培地へ１／５０で移され、そして、６００ｎｍでの０．５６の濁度へ培養された。ＢＣ培地中で４５℃で好気的に成長されたＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１の一晩培養物が、新しいＢＣ培地へ１／５０で移され、そして、６００ｎｍで０．５２の濁度へ培養された。Ｅ．ｃｏｌｉとＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの等しい量（２ｍＬ）が，０．４５μｍフィルター上で回収された。細胞を有するフィルターは、抗生物質を有さないＢＣプレート上へ移され、そして、４５℃で一晩インキュベートされた。細胞がフィルターから除去され、そして、希釈系列がＢＣプレート上に蒔かれそして５５℃で好気的にインキュベートされた。１〜２日後にコロニーが現れた。ｐＪＳ２８の存在はプラスミドＤＮＡ単離により確認され、そして、その完全性がＮｃｏＩによる消化により確認されて、期待される消化パターン（１４４４−ｂｐ及び３２９９−ｂｐの断片）を産出した。接合の効率は、受容体当たり約９．３・１０−７であった。
【０１０３】
実施例４．Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ由来の発現系の構築
【０１０４】
１）Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ発現系の構築
プロモーター活性を有するＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＴＣＣ２３４９８ヌクレオチド配列断片（米国特許第５１７１６７３号明細書において開示されている）が、合成ＤＮＡ断片（図３）として製造され、そしてＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として、同じ酵素により消化されたｐＭＨ３中へクローン化された。得られたクローニングベクターｐＪＳ２５（図４）は、開始コドンとオーバーラップするＮｃｏＩ部位の使用により、このプロモーターへの翻訳的な結合を許す。このＮｃｏＩ部位の使用を可能とする為に、第１のプラスミドｐＭＨ３が、プラスミドｐＮＺ１２４から、メガプライマーを使用してｃａｔ遺伝子からＮｃｏＩ部位を除去することにより構築された。配列
及び
を有するプライマーが、メガプライマーを産生する為に用いられ、これは第２のＰＣＲ反応において、配列
を有するプライマーと組み合わせて使用された。得られたＰＣＲ産物は、完全なｃａｔ遺伝子を含み、そして、ｐＮＺ１２４ ｃａｔ遺伝子を置換するために、ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩにより消化されて、プラスミドｐＭＨ３を産生した。プラスミドｐＪＳ２５（図４）は、バチルス ズブチリス、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス プランタラム、ラクトコッカス ラクティス及びロイコノストック ラクティスを含む種々の中等温度好性のグラム陽性生物並びにグラム陰性生物エシェリヒア コリ（Use of the Escherichia coli β-glucuronidase (gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria. C. Platteeuw, G. Simons, and W.M. de Vos. 1994. Appl. Environ. Microbiol. 60:587-593）において用いられうる。
【０１０５】
２）ｌｄｈＡ過剰発現系の構築
Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードし、そしてＢｅｒｎｅｒｄらにより発行された（Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbueckii subsp. bulgaricus by complementation in Escherichia coli. 1991. Bernard, N., T. Ferrain, D. Garmyn, P. Hols, and J. Delcour. FEBS Lett. 290:61-64）、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子が、配列
及び
を有するプライマーを用いてＰＣＲにより生産された。ＰＣＲ産物は、平滑−ＸｂａＩ断片として、ＸｂａＩ−ＳｍａＩにより消化されたｐＵＣ１８中へクローン化され、そして、その完全性がヌクレオチド配列分析により確認された。次に、ｌｄｈＡ遺伝子が、ＲｃａＩ−ＸｂａＩ断片として、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩにより消化されたｐＪＳ２５中へクローン化された。得られた発現ベクターｐＪＳ２６（図５）は、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーターへと翻訳的に結合されたＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのｌｄｈＡ遺伝子を有する。次に、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーターとＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｌｄｈＡ遺伝子とを含む完全な断片が、（ＢｇｌＩＩを用いた部分消化による）ＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片として、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩにより消化された好熱性クローニングベクターｐＮＷ３３Ｎへと移されて、プラスミドｐＪＳ２７（図６）を産生した。
【０１０６】
３）Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼの過剰生産
プラスミドｐＪＳ２７が、エレクトロポレーションにより、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１へと形質転換された。特異的なＲ−ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性が、５０℃でのｍｇタンパク質当たりの分当たりの３４０ｎｍでの吸収の減少として測定された。ｐＮＷ３３Ｎを宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１の該特異的な活性は０．４５ΔＡ・分−１・ｍｇタンパク質−１であり、そしてｐＪＳ２７を宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１のそれは２．１５ΔＡ・分−１・ｍｇタンパク質−１であり、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子を含有する改変された株中のＲ−ラクテートデヒドロゲナーゼの過剰生産が、４．８倍増加した活性を結果したことを実証する。
【０１０７】
実施例５．Ｒ−ラクテート生産の為の、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１の遺伝子の改変
【０１０８】
ｐＪＳ２７を宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１（実施例４）が、工業的条件を模倣するバッチ培養において成長された。ｐＮＷ３３Ｎを宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１及びプラスミドを有さないＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１が、参照の株として用いられた。発酵後、有機酸の濃度と乳酸の光学純度が測定された（表２）。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１及びｐＮＷ３３Ｎを宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１により生産されたラクテートは、Ｓ体でエナンチオピュアであるが、ｐＪＳ２７を宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１により生産されたラクテートは、かなりの部分についてＲ体であった。副産物の形成における違いは検出されなかった。２−ヒドロキシ酪酸、酢酸、酪酸、ギ酸、ピルビン酸の濃度は、検出限界（ピルビン酸については＜０．０２％；他については＜０．０１％）より低かった。コハク酸の濃度は、０．１％（ｖ／ｖ）より低かった。これらの結果は、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓによるＲ−ラクテート生産が、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の導入により達せられうることを実証する。Ｒ−ラクテートだけを生産するＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ株の構築は、ランダム変異又は部位特異的変異により、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性に関与する遺伝子の破壊を要求するであろう。
【０１０９】
【０１１０】
実施例６．エナンチオピュアなＲ−ラクテート生産のための、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１における遺伝子置換
【０１１１】
１）組み込みプラスミドの構築
Ｒ−ラクテートを生産する改変されたＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ株が、主要なＳ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードするＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｄｈＬ遺伝子を、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｌｄｈＡ遺伝子により置換することによって構築された。置換は、条件的クローニングベクター、例えば４５℃で機能的だが５５℃で機能的でない熱感受性レプリコンを用いて、二段階の過程における相同組み換えにより達せられる。我々は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種中でのそのような熱感受性の性質を有することが発見された、ｐＮＺ１２４又はｐＭＨ３に存在するｐＳＨ７１レプリコンを用いる。組み込みベクターｐＲＫ１（図７）は、ｐＮＺ１２４レプリコン、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１染色体中のｌｄｈＬに隣接し且つ今はＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｌｄｈＡ遺伝子に結合されたＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＴＣＣ２３４９８ ａｍｙ プロモーターに隣接する２つの１−ｋｂ領域、及びクロラムフェニコール耐性をコードするｃａｔ遺伝子を含有する。組み込みベクターは、以下のカセットのライゲーションにより構築される：（i）１．８−ｋｂ ＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片、ＳａｌＩ部位は平滑末端にされ、ｐＮＺ１２４レプリコンを含有する；（ii）１．１ｋｂのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１を用いて産生されたＰＣＲ断片から切り出されたｌｄｈＬ遺伝子の上流領域を含有する；（iii）１．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてｐＭＨ３（実施例４）を用いて産生されたＰＣＲ断片から切り出されたｃａｔ遺伝子を含有する；（iv）１．３ｋｂのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片、ｐＪＳ２７（実施例５）から切り出されたＬ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＴＣＣ２３４９８ ａｍｙプロモーターに翻訳的に結合されたＢ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＬＭＧ ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子を含有する；（v）１．１−ｋｂ ＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片、平滑末端にされたＢｇｌＩＩ部位を有し、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１を用いて産生されたＰＣＲ断片から切り出されたｌｄｈＬ遺伝子の下流領域を含有する。
【０１１２】
２）Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１ ｌｄｈＬ遺伝子のＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子との交換
プラスミドｐＲＫ１が、エレクトロポレーションによりＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１へと形質転換される。形質転換体は、７ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを補われたＢＣプレート上で４５℃で成長されて得られた。プラスミド単離による形質転換の確認の後、単独のコロニーが、対数増殖中期へとＢＣ培地中で４５℃で培養され、その後温度は５５℃にシフトされそしてインキュベーションは１時間続けられる。希釈系列が、ＢＣプレート上に蒔かれ、そして５５℃で一晩インキュベートされる。コロニーはプールされ、そして第２の希釈系列においてＢＣプレート上に蒔かれる。５５℃での一晩インキュベーション後、コロニーは、一重交差現象を確認するＰＣＲ分析により、組み込みについて試験される。１のコロニーが、抗生物質を有するＢＣ培地中での５５℃での、１／１０００希釈の逐次の移行（約１０世代）による継代培養の為に選ばれる。約１００世代の後、希釈系列は、抗生物質を有するＢＣプレート上に蒔かれた。５５℃での一晩インキュベーション後、コロニーシリーズは、コロニーＰＣＲによりｌｄｈＬ遺伝子の欠如について試験される：代わりに、コロニーＰＣＲによるｌｄｈＬ遺伝子の欠如について試験することにより、第１の現象の一重交差変異体のうちの二重交差変異体が選抜されうる。これらＰＣＲ反応においてネガティブであるコロニーからの染色体ＤＮＡが単離さらそしてさらにｌｄｈＡの存在について評価され、そして正確な組み込みがサザンブロット分析により確認される。
【０１１３】
実施例７．改変されたＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１によるエナンチオピュアなＲ−ラクテート生産
【０１１４】
１）改変された株の構築
実施例６において記載された方法により、工業的Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ株からのｌｄｈＬプロモーターに結合された、工業的Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ株からのｌｄｈＡ遺伝子及びｐＭＨ３からのｃａｔ遺伝子を有するカセットにより置換されたｌｄｈＬ遺伝子を有するＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１派生体が構築された。得られた株は、ＲＤＳＭ１と呼ばれた。
【０１１５】
２）ＲＤＳＭ１による発酵
ＲＤＳＭ１株が、工業的な条件を模倣するバッチ培養において成長された。発酵後、有機酸の濃度と乳酸の光学純度とが測定された（表３）。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＲＤＳＭ１により生産されたラクテートは、９９．５％についてＲ体であった。副産物の形成における違いは、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１（実施例５）と比較して検出されなかった。２−ヒドロキシ酪酸、酢酸、酪酸、ギ酸、ピルビン酸の濃度は、検出限界（ピルビン酸については＜０．０２％；他については＜０．０１％）より低かった。コハク酸の濃度は、０．１％（ｖ／ｖ）より低かった。これらの結果は、野生型Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ遺伝子の染色体欠失、並びに（非相同）遺伝子の染色体への挿入及び機能的な発現が可能であり、そしてＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓによるエナンチオピュアなＲ−ラクテートの生産に適用されうることを実証する。
【０１１６】
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】３つの形質転換されたＢ．コアギュランス ＤＳＭ１分離株から単離されたプラスミド物質により形質転換された３つのＥ．ｃｏｌｉから単離されたｐＮＷ３３Ｎの制限分析を示す図である。
【図２】ｐＪＳ２８のプラスミド地図である。
【図３】B.コアギュランスＡＴＣＣ２３４９８アミラーゼプロモーター領域の合成の塩基配列である。
【図４】ｐＪＳ２５のプラスミド地図である。
【図５】ｐＪＳ２６のプラスミド地図である。
【図６】ｐＪＳ２７のプラスミド地図である。
【図７】ｐＲＫ１のプラスミド地図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の産業上の利用の為の遺伝子改変に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸及び、ラクテートとして知られるその塩は、医薬、生分解性ポリマー及び食品加工を含む種々の分野において有用である、商業的に実行可能な製品である。通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種は、乳酸の工業的な製造にとって理想的な生物である。それらは、３０〜６５℃の温度で成長することができ、かつ、５０℃超の温度で嫌気的な工業的発酵を許す。この高温は、工業的スケールの際の発酵のときにいくつかの利点を有する：感染のより少ないリスク及び従ってより高い鏡像異性体純度、より速い反応等。ホモ乳酸的な性質は、ギ酸及び酢酸のような１５重量％超の副産物の形成無く、炭化水素源（六炭糖及び五炭糖を含む；国際公開第０４／０６３３８２号パンフレットを参照されたい）からの乳酸の生産を許す。バチルスの通性嫌気性の性質は、嫌気的条件下又は少なくともの酸素の低分圧下における発酵を許し、これは比較的高価でない装置及び処理を許す故に工業的スケールにとって望ましい。さらに、これらバクテリアの栄養要求は、ラクトバチルス種のような乳酸バクテリアのそれらよりも要求が厳しくなく、これも比較的高価でない工業的プロセスを許す。通性嫌気性且つホモ乳酸的である既知の中等度好熱性バチルスの１つの利点は、それらがＲ−ラクテートを生産しない又は実質的に生産しないことである。生分解性乳酸ポリマーの成功的な適用は、高価でないＳ−乳酸と高価でないＲ−乳酸の両方の利用可能性に依存するであろう故に、両方の鏡像異性体の良い費用効率の生産が要求される。現在知られているＲ−ラクテートを生産するバクテリアは、中等温度好性（例えばバチルス ラエボラクティクス）であるか又は要求の厳しい栄養要求を有し（例えばラクトバチルス デルブリッキー）、これはＲ−ラクテートの製造を、Ｓ−ラクテートの製造よりもはるかに高価にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明の１つの目的は、通性嫌気性であり且つＲ−乳酸をホモ乳酸発酵により生産する中等度好熱性バチルス株を利用することである。本発明の他の目的は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である、遺伝子操作された中等度好熱性バチルスを製造する方法を利用することである。
【０００４】
バチルス属は、２００を超える異なる種を含む（Sneath, P.H.A., 1986: Endospore-forming Gram-positive rods and cocci. in Bergey's manual of systematic bacteriology. Vol 2. Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E., Holt, J.G.(eds)Williams & Wilkins, Baltimore、を参照されたい）。これらの少しの部分だけが、遺伝子的に利用できると知られている。例えば、プロトプラスト形質転換は、多数の種々のバチルス種に機能するが、コンピテント細胞の形質転換は一般に、厳密に好気性かつ中等温度好性のバチルス ズブチリス １６８の細胞について満足に働くことが示されているだけである。工業的な株は、バチルス リケニホルミスから知られるとおり、遺伝子の改変にしばしばより耐性である。この通性嫌気性の中等度好熱性バチルス種は、酵素の工業的生産のために用いられる。しかしながら、そのヘテロ乳酸的性質の故に、乳酸の生産の為に用いられ得ない（Bulthuis, B.A., C.Rommens, G.M.Koningstein, A.H.Stouthamer, H.W.van Verseveld, 1991;Formation of fermentation products and extracellular protease during anaerobic growth of Bacillus licheniformis in chemostat and batch-culture、Antonie van Leeuwenhoek 60:355-371、を参照されたい）。一般に、高頻度のコンピテンス形質転換手順は、工業的な株について利用可能でない（Outtrup,H., and S.T. Jφrgensen, 2002: The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes in Aplications and systematics of Bacillus and relatives. R.Berkeley, M.Heyndrickx, N.Logan, and P.de Vos(eds.), pp. 206-218, Blackwell Publishing, Malden, USA、を参照されたい）。そのような株は、米国特許第６，０８３，７１８号明細書に開示されているとおりプロトプラスト形質転換により改変されうる。
【０００５】
今日までに、通性嫌気性且つ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作を明示する方法は記載されていない。プロトプラスト融合による、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓからバチルス コアギュランスへのプラスミド転移を主張する１つの報告が発行されているが（Ball, A.S., and C.Edwards, 1989:Properties of protoplasts from the thermophile Bacillus coagulans and their significance for genetic studies. Lett. Appl. Microbiol. 9:141-144、を参照されたい）、それはＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓがプラスミドを実際に宿すことの証拠を与えない。該主張は、抗生物質耐性コロニーの成長の観察に基づくだけであり、これは非常によく自然に発生する抗生物質耐性変異体であり得る。我々は、抗生物質の種々のタイプについて頻繁に、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓのそのような自然発生する抗生物質耐性変異体を観察してきた。他の刊行物：バチルス種の形質転換：An Examination of the transformation of Bacillus protoplasts by plasmids pUB110 and pHV33, Current Microbiology, Vol 13(1986), pp 191-195、において、種々のバチルスにおけるプロトプラスト形質転換が記載された。しかしながら、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓにおける形質転換は、失敗と報告された。
【０００６】
エレクトロポレーションはバクテリアについて広く用いられているが、増殖培地及びエレクトロポレーション緩衝液の種特異的な（又は株特異的さえの）最適化を要求する。バチルス種の成功的なエレクトロポレーションは、形質転換後のプラスミドＤＮＡの制限を防ぐ為にプラスミドＤＮＡのインビボ又はインビトロでのメチル化をしばしば要求する。国際公開第０２／２９０３０号パンフレットは、インビボでメチル化されたプラスミドの、エレクトロポレーションによる好熱性バチルス株ＴＮの細胞中への導入を開示する。用いられたプラスミドは、熱感受性プラスミドｐＵＢ１１０に基づく。しかしながら、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種を形質転換するために用いられたとき、このプラスミドは形質転換された細胞を産出しなかったことを、我々は発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は、遺伝子操作に基づく、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子の改変が可能であることを、今発見した。従って、本発明は最初に、形質転換による、中等度好熱性の通性嫌気性ホモ乳酸的バチルス種の遺伝子操作を示す。通性嫌気性且つＲ−乳酸生産についてホモ乳酸的である該中等度好熱性バチルスの操作に加えて、該バチルスは、乳酸以外の他の有機酸、アルコール、酵素、アミノ酸及びビタミンを含む工業的化合物の生産のためにも遺伝子操作されうる。
【０００８】
本発明に従い、中等度好熱性バチルス種がホモ乳酸的であることが重要である。何故なら、これが、新たに導入された機能が少量の副産物を伴う高い収率の生産を結果するであろうことを確保するからである。さらに、ホモ乳酸的バチルス種の使用は、産業上利用可能な微生物を得るために、僅かな改変だけが適用される必要があることを可能とする。
【０００９】
中等度好熱性バチルス種は、３０〜６５℃の温度で成長することができるバクテリアとして定義される。中等度好熱性の通性嫌気性ホモ乳酸的種の例は、バチルス コアギュランス及びバチルス スミシーである。ホモ乳酸的バチルスは天然に、ホモ乳酸発酵によりＳ−ラクテートを生産することができる。どの特定の株がホモ乳酸的発酵により乳酸を生産できるかは、当技術分野の当業者により容易に決定されうる。本発明は、該ホモ乳酸的な表現型が改変されている中等度好熱性の通性嫌気性バチルス種から派生した株も包含する。好ましくは、胞子形成欠損性である株又は派生体が選ばれる。
【００１０】
中等度好熱性の通性嫌気性ホモ乳酸的バチルスの形質転換について、文献は利用できなかったので、本発明者らは、形質転換によりこれらのバチルスを遺伝子操作することができるために、これらバチルス中で複製することができるプラスミドを発見することを必要とし、該細胞中へＤＮＡを導入する方法を最適化することを必要とし、かつ、バチルス種の定義された群についての適当な選択可能マーカーを発見することを必要とした。
【００１１】
本発明者らは、これらバチルス中で複製できるプラスミドを発見するための方法としてエレクトロポレーションを使用することを決定した。試験されたプラスミドは、ｐＩＬ２５３（Simon, D., and A.Chopin, 1988:Construction of a vector plasmid family and its use for molecular cloning in Streptococcus lactis, Biochimie 70:559-566、を参照されたい）、ｐＭＶ１５８（Burdett, V., 1980:Identification of tetracycline resistant R-plasmids in Streptococcus agalactiae (group B), Antimicrob. Agents Chemother. 18:753-766、を参照されたい）、ｐＨＰ１３（Haima,P., S.Bron, G.Venema, 1987:The effect of restriction on shotgun cloning and plasmid stability in Bacillus subtilis Marburg. Mol. gen. Genet. 209:335-342、を参照されたい）、ｐＵＢ１１０（Keggins, K.M., P.S.Lovett, E.J.Duvall, 1978:Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector plasmid pUB110, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1423-1427、を参照されたい）、ｐＡＭＳ１００（Kiewiet, R., J.Kok, J.F.M.L. Seegers, G.Venema, S.Bron, 1993:The mode of replication is a major factor in segregational plasmic instability in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 59:358-364）、ｐＷＣＦＳ１０５（Van Kranenburg, R., N. Golic, R. Bongers, R.J.Leer. W.M.de Vos, R.J.Siezen, M.Kleerebezem, 2005;Functional analysis of three plasmids from Lactobacillus plantarum, Appl. Environ. Microbiol.71:1223-1230を参照されたい）、ｐＮＺ２８０（Platteeuw, C., F.Michiels, H.Joos, J.Seurinck, and W.M.De Vos, 1995:Characterization and heterologous expression of the tetL gene and identification of iso-lSS1 elements from Enterococcus faecalis plasimie pJH1, Gene 160:89-93、を参照されたい）、ｐＮＺ１２４（Platteeuw, C., G.Simons, and W.M.de Vos. 1994:Use of the Escherichia coli β-glucuronidase (gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria, Appl. Environ. Microbiol. 60:587-593）、及びｐＮＷ３３ｎ（Zeigler,E.R. 2001:The genus Geobacillus; introduction and strain catalog, 7th ed., vol.3.Bacillus Genetic Stock Center. www.bgsc.org、を参照されたい）である。種々の試験の後、後の３つのプラスミドが複製することができ、かつ形質転換体を産出することができることが発見された。
【００１２】
これらのバチルス中で複製できるプラスミドが同定されたら、形質転換プロトコルに関する他のプロセスパラメータは、容易に最適化されうる。さらに、自然形質転換又は接合のような、ＤＮＡの導入の為の他の方法が、それらの実行可能性について試験されうる。
【００１３】
抗生物質耐性マーカーによる試験は、少なくともクロラムフェニコール耐性、テトラサイクリン耐性及びカナマイシン耐性が、用いられうることを実証した。低すぎる濃度を回避する為の措置が採られるべきである。何故なら、これらは自然発生する抗生物質耐性コロニーを生じうるからである。ｐＮＺ１２４又はｐＮＷ３３ｎ中にクローン化された、ｐＩＬ２５３からのエリスロマイシン耐性遺伝子の導入は、形質転換体を産出しなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
従って、第１の局面において、本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の、遺伝子操作による遺伝子改変の方法を開示する。該方法は、
ｐＳＨ７１レプリコンまたはその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化されたＤＮＡを、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中へ導入すること；
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能な温度で該細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能な温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと；
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能でない温度で該形質転換された細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能でない温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと；
の段階を含む。
【００１５】
許容可能な温度での選択培地上での該細胞の培養は、形質転換体、すなわち形質転換するＤＮＡを得た細胞の選抜を許す。好ましくは、形質転換するＤＮＡの完全性を確認することを許す為に、形質転換されたコロニーは、許容可能でない温度で形質転換された細胞を培養することに先立ち、単離される。次に、完全体の選抜を許す為に、１又はいくつか個々のコロニーの細胞が許容可能でない温度で培養される。
【００１６】
本発明に従い、関心のあるＤＮＡは、ｐＳＨ７１レプリコン（GenBank Accession Number A09338）又はその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化される。ｐＳＨ７１レプリコンは、熱感受性複製の機能を提供するレプリコンである。
【００１７】
熱感受性複製の機能は、許容可能な温度での該レプリコンを含有するプラスミドの複製を与え、かつ、許容可能でない温度での該プラスミドの複製の欠如を与える。ｐＳＨ７１レプリコンのこの熱感受性複製の機能は、該レプリコンによりコードされる複製起点及び複製タンパク質（ＲｅｐＡ）により与えられる。
【００１８】
本発明の文脈において、「ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体」は、熱感受性複製の機能（ＲｅｐＡタンパク質）を有し且つ配列ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列又は配列ＩＤ ＮＯ：１と８０％同一、好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡとして定義される。ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体は、上記で定義された通りのＲｅｐＡタンパク質が作用することができる複製起点を更に含む。ｐＳＨ７１レプリコンの相同体の例は、ｐＷＶ０１（GenBank Accession Number X56954）である。ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体は、調節タンパク質（ＲｅｐＣ)を更に含みうる。
【００１９】
本発明の目的に関して、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、該２つの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージをいう。同一性の程度は、BLASTアルゴリズムを用いて決定され、これはAltschul, et al., J.Mol.Biol. 215: 403-410(1990)に記載されている。BLAST分析を実施する為のソフトウェアは、米国立生物情報センターを通じて公に利用可能である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アラインメントの感度と速さを決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（W)、Blosum62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)を参照されたい)の50のアライメント（Ｂ）、10の予測（Ｅ）、M＝５、N＝−４及び両鎖の比較を用いる。
【００２０】
形質転換するＤＮＡの染色体への組み込みが意図されるとき、条件付きのレプリコンを有する組み込みプラスミドの利用可能性が望ましい。そのようなプラスミドは許容可能な条件下で導入されることができ、その後（例えば許容可能でない温度へのシフトにより）成長条件が変化されることができ、該プラスミドを非複製的にし且つ相同又は非相同組み換えにより引き起こされる染色体への組み込み現象に関する選抜を許す。条件付きのクローニングベクターとして、ｐＮＺ１２４に存在するｐＳＨ７１のような熱感受性レプリコン、又はそれと実質的に同一である（相同な）プラスミド、又はプラスミドの熱感受性特性を保有したそれらの派生体が用いられうる。通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種中におけるこのレプリコンとって許容可能な温度は好ましくは、３７〜５０℃である。許容可能でない温度は好ましくは、５０℃超である。許容可能な温度及び許容可能でない温度は、レプリコンに依存しうるだけでなく、宿主バチルス種にも依存しうる。後者は先行文献からの既知の現象であり、３７℃が、ラクトバチルス デルブリッキー中において許容可能な温度であるがラクトコッカス ラクティスについては許容可能でない温度であるｐＧ＋宿主プラスミドにより例示される（米国特許第５９１９６７８号明細書を参照されたい）。
【００２１】
条件付きのクローニングベクターは、ｐＮＷ３３ｎの熱感受性派生体又は通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種中で複製できる他のプラスミドとしても得られうる。
【００２２】
ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体を有する熱感受性プラスミド系中にクローン化された、関心のあるＤＮＡは、
A. プロトプラスト形質転換又はプロトプラスト融合、
B. エレクトロポレーション、
C. バイオリスティック（biolistic）形質転換、
D. 接合、又は、
E. 自然のコンピテント細胞の形質転換
により、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中に導入される。
【００２３】
エレクトロポレーションによるこれらバチルス種の形質転換は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種と、所望の機能及び／又は特定のバチルスのゲノム配列と相同なＤＮＡ配列を含む適当な形質転換するＤＮＡとを含有する懸濁物を通じた高電圧放電により達成されうる。
【００２４】
接合によるこれらバチルス種の形質転換は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種（の集団）と、所望の機能を有する自己伝達性又は可動性のプラスミドを含有する供与体細胞（の集団）とを、接触させることにより達成されうる。自己伝達性プラスミドは、それらが細胞間を移動するのに必要とする全ての機能をコードし、かつ、時々それらは、染色体DNA及び可動性プラスミドの転移において助けともなる。可動性プラスミドは、転移に必要とされるタンパク質の全てをコードせず、そして結果として（染色体又はプラスミドにコードされた）供与体ゲノムにより与えられるべきこれらの機能を必要とする。可動性プラスミドは少なくとも、転移のオリジン（oriT）領域を含有する。改変されるべき中等度好熱性バチルスと共培養されうる任意の供与体細胞も、原則として、供与体細胞として働くのに適当である。適当な供与体細胞の例は、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むバチルス種、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロコッカス フェカリス、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｃｏｒｉｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌ．ｄｅｌｂｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｓａｋｅｉ、Ｌ．ｓａｎｆｒｉｓｃｅｎｓｉｓを含むラクトバチルス種、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ及びＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含むストレプトコッカス種のそれらである。適当な自己伝達性プラスミドは、ｐＲＫ２４、ｐＬＳ２０、ｐＡＭβ１又はそれらと実質的に同一であるプラスミド又はプラスミドの自己伝達性能力を保有したこれらの派生体を含む。適当な可動性プラスミドは、ｐＡＴ１８、ｐＡＴ２８、ｐＪＳ２８又はそれらと実質的に同一であるプラスミド又はプラスミドの可動性能力を保有したこれらの派生体を含む。
【００２５】
本発明者らはさらに、これらバチルス種についての自然形質転換プロトコルをなんとかして開発した。これは、増殖、飢餓及び形質転換のための適切な培地組成、コンピテント細胞を展開及び回収するための適切なタイミング、並びに適切な形質転換手順を決定することを要求した。自然形質転換は、バチルス種の間では広まっていると知られていないが、本発明者らは、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルスが、自然にコンピテントにされうることを発見した。
【００２６】
エレクトロポレーション及びプロトプラスト形質転換に関して、形質転換するＤＮＡの源は、形質転換結果物に影響を与えうる。（ラクトコッカス ラクティス ＭＧ １３６３、エシェリヒア コリ ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、又はＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１１０から単離された）形質転換されるべきDNAの源は、本バチルス種における形質転換効率に影響しなかった。これはＤＮＡのメチル化状態が重要でないことを示す。これは、他のバチルス種とは対照的である（例えば国際公開第０２／２９０３０号パンフレットを参照されたい）。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様において、バチルス中への導入の為の形質転換するＤＮＡは、ラクトコッカス ラクティスから単離される。より好ましくは、該形質転換するＤＮＡを構築する為のクローニング段階も、ラクトコッカス ラクティス中で実施される。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのクローニングは、しばしばクローン化されたＤＮＡにおいて欠失及び／又は転位を結果するとみえたからである。
【００２８】
本発明により、好ましくは自然のコンピテンスの誘導による形質転換に関する方法、エレクトロコンピテント細胞の形質転換に関する方法、及び接合に関する方法が提供され、熱感受性プラスミドを使用する方法が示され、かつ、例えばＲ−ラクテートの生産の為の、通性嫌気性且つホモ乳酸的である遺伝子操作された中等度好熱性バチルス種の製造の為のこれらの要素の適用が示される。
【００２９】
形質転換するＤＮＡは、ｐＳＨ７１レプリコン又はその相同体とバチルス細胞に所望の機能を提供することができる、関心のあるＤＮＡとを有する。
【００３０】
染色体の改変は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の好ましい改変である。何故なら、染色体の改変は、子孫細胞にわたり、該機能の安定な分配を確保するであろうからである。染色体中の所望の機能の導入は、非相同性組み換え並びに相同組み換えによりなされうる。相同組み換えは、機能を導入し、除去し、又は導入と除去を同時にする機会を開くので、相同組み換えが好ましい。
【００３１】
本発明の文脈において、機能は、細胞により生産されるべき所望のポリペプチドをコードする遺伝子及び／又は細胞による一次又は二次代謝産物の生産に関するポリペプチドをコードする遺伝子及び／又は細胞の染色体からDNA配列の欠失を可能とするDNA配列でありうる。
【００３２】
ポリペプチドをコードする遺伝子は、細胞中で機能的な調節配列、例えばプロモーター配列を備えられる。該調節配列は、該コード配列と天然に連結された配列であってよく、又はそれと非相同であってもよい。
【００３３】
ポリペプチドをコードする遺伝子は、好みのバチルス種において機能する任意の調節配列又はプロモーター配列に結合されうる。適当なプロモーター配列は、好みのバチルス種から入手可能なプロモーター、異なる天然のバチルスプロモーターに由来するハイブリッドプロモーター及び人工のプロモーターを包含する。好ましいプロモーターは、相同組み換えにより不活性化されるべきバチルス遺伝子のプロモーターである。バチルス コアギュランスからのｌｄｈＬプロモーターが特に好ましい。又は、米国特許第５１７１６７３号明細書において開示されたとおりのアミラーゼ遺伝子のプロモーターが特に好ましい。
【００３４】
形質転換されていない細胞の大多数からの形質転換されたバチルス細胞の選択を可能とする為に、選択マーカーが形質転換するＤＮＡの一部である。該選択マーカーは、関心のある機能として同じＤＮＡ断片若しくはプラスミド上に存在してよく又は別のＤＮＡ断片又はプラスミド上に存在してもよい。好ましい選択マーカーは、ｐＭＨ３からの、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするｃａｔ遺伝子である。
【００３５】
導入されうる所望の機能は、以下に記載されるとおりのＲ−乳酸の生産であり、及び、パイルベートから代謝可能な化合物の生産を提供する他の機能である。これら化合物の例は、パイルベート、アセトラクテート、ジアセチル、アセトイン、２，３−ブタンジオール、１，２−プロパンジオール、アセテート、ホルメート、アセトアルデヒド、エタノール、Ｌ−アラニン、オキサロアセテート、Ｓ−マレート、スクシネート、フマレート、２−オキソグルタレート、オキサロスクシネート、イソシトレート、シトレート、グリオキシレートである。
【００３６】
相同組み換えが意図されるとき、形質転換するＤＮＡはさらに、操作されるべき特定のバチルスの、遺伝子のターゲット配列と相同であるＤＮＡ配列を含む。当業者は、相同組み換えを得るために、１００％の同一性が必要とされないことを理解するであろう。約９０％のパーセンテージ同一性も十分であろう。一般に、相同組み換えにより染色体に挿入されるべき、関心のあるＤＮＡ配列は、相同組み換えを可能とする十分な長さを有する相同配列の側に置かれる。そのような長さは、少なくとも約２００ｂｐ、例えば約２００〜約１５００ｂｐ、好ましくは約２００〜約１０００ｂｐである。
【００３７】
本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子の操作による改変であって、好ましくは相同組み換えにより、所望の機能が導入される上記改変に向けられる。
【００３８】
本発明は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作による改変であって、望ましくない機能が相同組み換えにより除去される上記改変にも向けられる。
【００３９】
本発明はさらに、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作による改変であって、所望の機能が染色体中に導入され且つ同時に望ましくない機能が相同組み換えにより除去される上記改変に向けられる。
【００４０】
遺伝子操作による該改変により得られる、遺伝子操作された通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス株又はホモ乳酸的である親株の派生体は、本発明の更なる局面を成す。遺伝子操作による改変は、バクテリアの染色体における機能の導入、バイクテリアの染色体からの機能の除去、又は、同時のバクテリアの染色体における機能の導入及びバクテリアの染色体からの機能の除去を包含する。
【００４１】
好ましい実施態様において、遺伝子操作による改変は、相同組み換えにより生じる。
【００４２】
１の好ましい実施態様において、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の、遺伝子操作された派生体は、パイルベートのラクテートへの転化がブロックされ且つパイルベートが蓄積する株、又は、アセトラクテート、ジアセチル、アセトイン、２，３−ブタンジオール、１，２−プロパンジオール、アセテート、ホルメート、アセトアルデヒド、エタノール、Ｌ−アラニン、オキサロアセテート、Ｓ−マレート、スクシネート、フマレート、２−オキソグルタレート、オキサロスクシネート、イソシトレート、シトレート、グリオキシレートを含む他の産物の生産に対してパイルベートが向け直される為に追加の改変が適用される株である。
【００４３】
他の好ましい実施態様において、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作された派生体は、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＬ遺伝子が相同組み換えにより除去された株である。
【００４４】
他の好ましい実施態様において、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の遺伝子操作された派生体は、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードするｌｄｈＬ遺伝子が、相同組み換えにより、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するＮＡＤＨ−依存性２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子により置換された株である。
【００４５】
これらの実施態様において、相同組み換えの為に用いられる構築物は、機能的であるＳ−ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素をコードしない欠陥ｌｄｈＬ遺伝子を含む。欠陥ｌｄｈＬ遺伝子は、ｌｄｈＬをコードする配列の一部又は全部が削除された構築物により提供されうる。
【００４６】
欠陥ｌｄｈＬ遺伝子は、他の遺伝子、例えば選択マーカーをコードする遺伝子又は関心のある遺伝子により、ｌｄｈＬ遺伝子の一部又は全部を置換することにより作成されうる。好ましくは、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードするｌｄｈＬ遺伝子は、ＥＣ番号ＥＣ１．１．１．２８．を有する酵素を含む、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するＮＡＤＨ−依存性２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する構築物により置換される。
【００４７】
Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードする適当な遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌｄｈＡ−変異体を相補することができる遺伝子であり、例えばBernardらにより記載されたとおりのＥ．ｃｏｌｉ ＦＭＪ１４４（Bernard, N., T.Ferrain, D.Garmyn, P.Hols, and J.Delcour, 1991:Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus by complementation in Escherichia coli. FEBS Lett. 290:61-64を参照されたい）などである。Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードする適当なｌｄｈＬ遺伝子は例えば、ラクトバチルス デルブリッキー subsp. bulgaricusからのｌｄｈＡ遺伝子（Bernardらも参照されたい）又は同じ種からのｈｄｈＤ遺伝子（Bernard, N., K.Johnsen, T.Ferain, D.Garmyn, P.Hols, J.J.Holbrook, and J.Delcour. 1994. NAD+-dependent D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Eur.J.Biochem.224:439-446）である。ｌｄｈＡ遺伝子によりコードされたＲ−ラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、配列ＩＤ ＮＯ：２に描かれている。上記のＥ．ｃｏｌｉ変異体の相補が可能である遺伝子によりコードされたポリペプチドは、アミノ酸配列において実質的に異なるようにみえる。配列ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と３０％ほどの低いパーセンテージ同一性が実施可能である。ｌｄｈＡ及びｈｄｈＤ遺伝子は、約５０％の同一性の程度を有するタンパク質をコードするようにみえる。
【００４８】
Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードする適当な遺伝子は、配列ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列をコードする遺伝子又は配列ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の同一性の程度を表すアミノ酸配列をコードし且つＥ．ｃｏｌｉ ｌｄｈＡ−変異体、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＦＭＪ１４４などを相補することができる相同な遺伝子である。そのような相同配列は、自然の対立遺伝子変異又はイントラストレイン変異（intra-strain variation）の故に、異なる集団からの細胞中又は１の集団中の細胞中に存在しうる多型を含みうる。相同体はさらに、特定されたＤＮＡ又はアミノ酸配列の起源である種以外のバチルス種から得られてよく、又は人工的に設計され且つ合成されてもよい。
【００４９】
所望の機能を導入することに加えて、工業的な発酵を最適化する為、例えばキシロース及びアラビノースを含むリグノセルロース由来の糖のような安い基質の発酵を可能にする為及び／又は望ましくない機能を除去する為に、遺伝子操作は用いられうる。
【００５０】
更なる局面において、本発明は、前記の局面の遺伝子操作された株を、関心のある化合物の生産に資する条件下で培養することを含む、該化合物の生産の方法を提供する。
【００５１】
図面の説明
【００５２】
図１は、形質転換された３つのＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１分離株から単離されたプラスミド物質により形質転換された３つのＥ．ｃｏｌｉ分離株から単離されたｐＮＷ３３Ｎの制限分析を示す。レーン１、４及び７。ＥｃｏＲＩにより消化されたｐＮＷ３３Ｎ；４２１７−ｂｐ断片。レーン２、５及び８．ＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩにより消化されたｐＮＷ３３Ｎ；３３３−ｂｐ及び３８８４−ｂｐの断片。レーン３及び６。ｋｂ ＤＮＡラダー（Stratagene）２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１．０ｋｂ、１．５ｋｂ、２．０ｋｂ、３．０ｋｂ、４．０ｋｂ、５．０ｋｂ、６．０ｋｂ、７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、９．０ｋｂ、１０．０ｋｂ及び１２．０ｋｂ。
【００５３】
図２は、ｐＪＳ２８のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＢ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）は矢印により描かれる。ＩｎｃＰプラスミドのＲＫ２の転移のオリジン（oriT）及びＥ．ｃｏｌｉの複製起点（ori）が、四角で囲まれた領域として描かれる。
【００５４】
図３は、米国特許第５１７１６７３号明細書において開示された配列に基づく、合成のＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＴＣＣ２３４９８アミラーゼプロモーター領域のヌクレオチド配列を示す。ＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、及びＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）クローニング部位が下線付加されている。ＮｃｏＩ部位はアミラーゼプロモーターへの翻訳的結合を許す。アミラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンは、ボールド体で描かれる。
【００５５】
図４は、ｐＪＳ２５のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＡ及びｒｅｐＣ）、ＮｃｏＩ部位を有さないクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍ＊）が矢印で示される。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーター領域（Ｐ）は、四角で囲まれた領域として描かれる。
【００５６】
図５は、ｐＪＳ２６のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＡ及びｒｅｐＣ）、ＮｃｏＩ部位を有さないクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍ＊）、及びＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子（ｌｄｈＡ ６９０１）が矢印で示される。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーター領域（Ｐ）は四角で囲まれる。
【００５７】
図６は、ｐＪＳ２７のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＢ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、及び、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子（ｌｄｈＡ ６９０１）が矢印により描かれる。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーター領域（Ｐ）及びＥ．ｃｏｌｉの複製起点（ｏｒｉ）は、四角で囲まれた領域として描かれる。
【００５８】
図７は、ｐＲＫ１のプラスミド地図を示す。複製遺伝子（ｒｅｐＡ及びｒｅｐＣ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、及び、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｌｄｈＡ遺伝子（ｌｄｈＡ）が矢印により描かれる。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーター領域（Ｐａｍｙ ＡＴＣＣ）及びＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｄｈＬ上流及び下流領域は、四角で囲まれた領域として描かれる。
【００５９】
本発明は、以下の非限定的な実施例により、さらに説明される。
【００６０】
実施例
【００６１】
材料と方法
【００６２】
プラスミド及び菌株
【００６３】
プラスミドｐＮＺ１２４（Platteeuw, C., G.Simons, and W.M. de Vos.1994. Use of the Echerichia coli β-glucuronidase(gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 60:587-593）が、ＮＩＺＯ ｆｏｏｄ ｒｅｓｅａｒｃｈから入手された。それは、欧州特許第０２２８７２６号明細書において開示されたクローニングベクターｐＮＺ１２に基づく。
プラスミドｐＮＷ３３Ｎ（Zeigler, D.R. 2001:The genus Geobacillus; introduction and strain catalog, 7th ed., vol. 3. Bacillus Genetic Stock Center. www.bgsc.org）が、Bacillus Genetic Stock Center、オハイオ州立大学、コロンバス、オハイオ州、アメリカ合衆国、から入手され、そして、エシェリヒア コリ ＤＨ５α（Invitrogen Life Technologies）中において増殖された。ｐＮＷ３３Ｎのヌクレオチド配列は、GenBankアクセス番号ＡＹ２３７１２２下で入手可能である。
ＩｎｃＰプラスミドのＲＫ２の転移のオリジン（ｏｒｉＴ）を有するプラスミドｐＡＴΔＳ２８（Namy, O., M.Mock, A.Fouet, 1999:Co-existence of clpB and clpC in the Baciliceae. FEMS Microbiol. Lett. 173:297-302）が、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒから得られた。
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１が、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ連邦共和国、から入手された。
Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363は、Gassonにより記載された（M.J.Gasson. 1983:Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing. J.Bacteriol. 154:1-9）。
Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus LMG 6901は、ＢＣＣＭ／ＬＭＧ bacteria collection、ヘント、ベルギーから得られた。
ｐＲＫ２４を宿すＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１は、Trieu-Cuotらにより記載された（Trieu-Cuot, P., C. Carlier, P.Martin, and P.Courvalin, 1987:Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 48:289-294）。
【００６４】
培養条件
【００６５】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓは慣例的に、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／Ｌのリン酸二アンモニウム、３．５ｇ／Ｌの硫酸二アンモニウム、１０ｇ／ＬのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ビス[２−ヒドロキシメチル]イミノトリス[ヒドロキシメチル]−メタン）、３ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２、５ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ２を含有するＢＣ培地において好気的条件下で４５℃で成長させられた；必要に応じ、培地は、５０ｇ／Ｌのスクロースを補われた；ｐＨは６．６〜６．７に調整され、そして培地は使用の前にオートクレーブされた（２０分１２１℃）。プレートについては、培地は１０ｇ／ＬのGelrite及び１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２を補われた。ろ過滅菌された微量元素が別に添加された。最終濃度は：０．２ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、０．０３mg／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｍｇ／Ｌ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０５ｍｇ／Ｌ ＺｎＣｌ２であった。必要に応じ、該培地は、７ｍｇ／Ｌでろ過滅菌されたクロラムフェニコールを補われた。コンピテンス培地（Ｃ−培地）は、、０．０５ｇ／Ｌ 酵母抽出物、２ｇ／Ｌ リン酸二アンモニウム、３．５ｇ／Ｌ 硫酸二アンモニウム、１０ｇ／Ｌ グルコース、１０ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、０．５ｇ／Ｌ ＫＣｌ、２５ｍｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２を有した：ｐＨは、６．８に調整され且つ培地は使用の前にオートクレーブされた（２０分１２１℃）。フィルター滅菌された微量元素及びビタミンが別に添加された。最終濃度は：２．４ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２、３．６ｍｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３、３ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２、１．２ｍｇ／Ｌ ＺｎＣｌ２、０．０２４ｍｇ／Ｌ ビオチン、０．０１２ｍｇ／Ｌ チアミン、２０ｍｇ／Ｌ メチオニンであった。形質転換培地（Ｔ−培地）は、０．０５ｇ／Ｌの代わりに０．０２５ｇ／Ｌの酵母抽出物を有するＣ−培地であった。
【００６６】
Ｅ．ｃｏｌｉは慣例的に、ＬＢ培地（Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. J.Sambrook and D.W.Russell. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）中で、３７℃で好気的条件下で培養された。必要に応じて、クロラムフェニコール及び／又はアンピシリンが、５ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌの濃度で夫々用いられた。
【００６７】
Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓは慣例的に、ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３７℃で嫌気的条件下で培養された。
【００６８】
Ｌ．ｌａｃｔｉｓは慣例的に、０．５％ グルコースを補われたＭ１７ ｂｒｏｔｈ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、３０℃で嫌気的条件下で培養された。必要に応じて、クロラムフェニコールが５ｍｇ／Ｌの濃度で用いられた。
【００６９】
ＤＮＡ操作技術
【００７０】
標準的なＤＮＡ操作技術は、Sambrook及びRussellにより記載されたとおりに実施された（J.Sambrook and D.W.Russell.2001:Molecular cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
【００７１】
ｐＮＺ１２４及びｐＮＷ３３Ｎの派生体の構築は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ及びＥ．ｃｏｌｉ中で夫々実施された。
【００７２】
１００ｍＬ培養物からの、ラージスケールのＥ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡ単離は、Ｊｅｔｓｔａｒ ２．０ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（商標）（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いて、製造者の使用説明書に従い実施された。１ｍＬ培養物からの、スモールスケールのＥ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡ単離は、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｑｕｉｃｋ Ｐｕｒｅ（商標）（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）キットを用いて、製造者の使用説明書に従い実施された。
【００７３】
ラージスケールのＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプラスミドＤＮＡ単離は、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド勾配中で平衡遠心を用いて実施された。好気的条件下で４５℃で成長された（１７０ｒｐｍ）、３００ｍＬの二晩培養物が、遠心により回収された。該細胞ペレットは、２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、３０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭのＭｇＣｌ２及び２５％スクロースを含有する緩衝液の７ｍｌ中にプールされそして再懸濁され、そして氷上で１５分間インキュベートされた。細胞は、０．２ＭのＮａＯＨ及び１％ＳＤＳを含有する溶液の１６ｍＬの添加により溶解された。氷上での５分のインキュベーション後、該サンプルは、３ＭのＫＡｃの１２ｍＬの添加と混合により中和された。沈殿物が、遠心により除去された。上清中のＤＮＡが、２０ｍＬのイソプロパノールの添加により沈殿された。ＤＮＡは、遠心によりペレット化され、乾燥されそして、１．０ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ及び０．４ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを含有するＴＥバッファー中に溶解された。染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡが、４５０００ｒｐｍで１６時間、垂直ローター（Stepsaver 65 V13（商標）；Sorvall）を用いてセシウムクロライド密度勾配により分離された。プラスミドＤＮＡが回収され、そしてエチジウムブロマイドが他のところ（Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. J. Sambrook and D.W.Russell.2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）で記載されたとおりに除去された。
【００７４】
１０ｍＬ培養物からの、スモールスケールのＬ．ｌａｃｔｉｓ及びＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプラスミドＤＮＡ単離は、グラム陽性バクテリアについてのミニプレッププロトコルに従い実施された（Rapid mini-prep isolation of high quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. D.J.O'Sullivan and T.R.Klaenhammer. 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59:2730-2733）。
【００７５】
Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞は、Sambrook及びRussellにより記載されたとおりに、塩化カルシウムを用いて調製され、そして熱ショックにより形質転換された（Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. J. Sambrook and D.W.Russell.2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
【００７６】
Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、ＨａｌｏとＮｅｓにより記載されたとおりに、エレクトロポレーションにより形質転換された（High-frequency transformation by electroporation of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. 1989. Holo,H., and I.F.Nes. Appl. Environ. Microbiol. 55:3119-3123）。
【００７７】
クローニングの目的の為のＰＣＲ反応は、高い忠実性のＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）により製造者の使用説明書に従い実施された。
【００７８】
コロニーＰＣＲ分析が、クロラムフェニコール耐性コロニー中のｐＮＷ３３Ｎの存在を実証する為に用いられた。ＰＣＲプライマーは、配列
及び
とのｐＮＷ３３Ｎ複製遺伝子ｒｅｐＢの同一性の為に設計された。コロニーは、つまようじにより取られ、そして、少しの細胞物質が、０．５ｍＬのＰＣＲ反応チューブに移された。細胞は、電子レンジ中で１０００Ｗで１分間のインキュベーションにより破壊された。ｒＴａｑポリメラーゼ（Amersham Biosciences）を有する５０μＬ及び夫々のプライマー０．５μｇのＰＣＲ反応混合物が、製造者により推奨されたとおりに調製され、そして、破壊された細胞を有する反応チューブに添加された。
【００７９】
ＰＣＲ反応は、ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（商標）（Stratagene）中で実施された。９４℃での４分間のインキュベーションの次に、変性の為の９４℃での３０秒間、プライマーアニーリングの為の５８℃での１分間、及び伸長の為の７２℃での１分間の２５サイクルが続いた。最終のサイクルの後で、反応混合物は、さらに５分間７２℃でインキュベートされた。
【００８０】
エレクトロポレーション
【００８１】
エレクトロコンピテント細胞の調製は、適切な培養条件、回収の時間並びに洗浄バッファー及びエレクトロポレーションバッファーの組成の決定を必要とした。Ｂ．ｃｏａｇｕｒａｎｓ ＤＳＭ１は、ＬＢ培地（エレクトロポレーション効率が増加された、発展したＢＣ培地）上で成長することができる。グリシンは、細胞壁を弱める為に添加され、そして該濃度は最適化された。グリシン濃度は、０．５〜２．０％、好ましくは１．０〜１．５％であった。細胞は、最適な結果の為に、対数増殖の初期から中期で回収された。エレクトロポレーションバッファーは、４．３〜６．０、好ましくは４．３〜５．０のｐＨを有した。最適なエレクトロポレーション設定（電圧、抵抗、容量）も、決定されることを必要とした。電圧は好ましくは１．０〜２．５ｋＶ、より好ましくは１．２５〜２．０ｋＶであった。抵抗は好ましくは１００〜８００Ω、より好ましくは２００〜６００Ωであった。選択培地上でのプレーティングの前のリカバリーは、重要でありそして少なくとも２時間好ましくは３時間であった。
【００８２】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓのエレクトロコンピテント細胞が以下のとおりに調製された。一晩培養物が、１％グリシンを補われた培地５０ｍＬに植菌する（５％体積／体積）為に用いられた（６００ｎｍで約０．１３〜０．１４の濁度を結果した）。４５℃での２．５時間の好気的インキュベーションの後、遠心により細胞が回収された。細胞ペレットは、２回、氷冷エレクトロポレーションバッファー（５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．４Ｍ ソルビトール、１０％ グリセロール、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ４．５に調製された）の５０ｍＬ及び２５ｍＬ夫々により洗浄され、そして１ｍＬの氷冷エレクトロポレーションバッファー中に再懸濁された。エレクトロポレーションの為に、１００μＬの細胞懸濁物が、１μｇプラスミドＤＮＡと混合され、そして、氷上で予め冷却された０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標））に移された。サンプルは、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ及びＰｕｌｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標））を用いて、２００Ω及び２５μＦで、１．６ｋＶパルスに付された。エレクトロポレーション後すぐに、１ｍＬの培地が添加され、そして細胞は９００ｒｐｍでＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で、４５℃で３時間インキュベートされ、その後それらはクロラムフェニコールを補われたプレート上に蒔かれた。プレートは、好気的条件下で１〜２日間４５℃でインキュベートされた。
【００８３】
接合
【００８４】
フィルター接合が、Ｅ．ｃｏｌｉからＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓへの組み換えプラスミドの接合転移の為に用いられた。供与体（２ｍＬ）と受容体（２ｍＬ）の対数増殖する細胞がプールされ、そして注射器を用いてプラスチックフィルターホルダー（Ｓｃｈｌｅｉｇｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）中の滅菌された０．４５μｍセルロースアセテートフィルター上で回収された。細胞は、１０ｍＬのＢＣ−培地により洗浄され、そして、フィルターはフィルターを通じて空気を送り込むことにより乾燥された。フィルターは、抗生物質無しのＢＣ−プレートの表面上に置かれ、そして４５℃で一晩インキュベートされた。接合後、細胞は、フィルターからＢＣ−培地中に再懸濁され、そして、希釈系列が、７ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＢＣプレート上に蒔かれ、そして１〜２日間好気的に５５℃でインキュベートされた。
【００８５】
酵素分析
【００８６】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーターを用いるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓにおける酵素過剰生産は、指数関数的に成長する培養物において測定された。細胞は、遠心により回収された。無細胞系抽出物が、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０（商標）装置（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を用いて、スピード４で３０秒の２度の運転において調製された。細胞は、運転の間に１分間氷上で冷却された。タンパク質含有量が、標準としてウシ血清アルブミンを用いたＢｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の方法により測定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）が、Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ 電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、SambrookとRussellにより記載されたとおりに実施された（Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. J. Sambrook and D.W.Russell.2001. Cold Spring Harbor laboratory Press, New York）。
【００８７】
Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ特異的活性が、０．３Ｍグリシルグリシンバッファー、ｐＨ１０、０．２５％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭ ＮＡＤ，及び１％Ｒ−ラクテートを含有する、１ｍｌの分析ミックスを用いて、３４０ｎｍで分光光学的に測定され且つ５０℃で実施された。反応は、無細胞系抽出物の４０又は５０μＬの添加により開始された。特異的な活性が、ΔＡが１ｃｍ経路長についての３４０ｎｍでの吸収の増加であり且つｍｇがタンパク質の量である、ΔＡ・分-1・ｍｇ-1として表された。
【００８８】
発酵
【００８９】
バッチ発酵が、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファー無し且つ３０ｇ／Ｌグルコースを補われたＢＣ培地の４Ｌを有するバイオリアクター（７Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎ（商標））中で実施された。５０℃で増殖され且つグリセロールストックから植菌された一晩の好気的培養物（４０ｍＬ）が３６０ｍＬの新しいＢＣ培地に移されそしてさらなる４〜５時間インキュベートされた。この４００ｍＬが、バイオリアクターに植菌する為に用いられた。ｐＨ維持は、２０％（ｗ／ｖ）での石灰溶液の自動的な添加により達せられた。発酵は、５４℃、ｐＨ６．５及び２５０〜３００ｒｐｍの攪拌速度で実施された。温度調節は、水槽（Ｌａｕｄａ）により実施されながら、ｐＨ測定／調節はＡＤＩ１０２０ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ（商標））により実施された。全てのデータ（ｐＨ及び基礎消費）は、オンラインデータ取得（Ａｐｐｌｉｋｏｎ ＦＭ Ｖ５．０（商標））により処理された。サンプルは、Ｒ−及びＳ−乳酸並びにあり得る副産物の測定の為に、植菌の前及び発酵の最後で抽出された。サンプルは遠心され、そして、残ったデブリはＭｉｌｌｅｘ ＧＰ０．２２μｍｆｉｌｔｅｒ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたろ過により除去された。ろ液は、さらなる分析まで−２１℃で保存された。
【００９０】
有機酸（乳酸、酢酸、ギ酸、コハク酸）が、誘導体化及びＧＬＣを用いて測定された。Ｒ−及びＳ−ラクテートは、メチル−ラクテートへメチル化され、そしてキラルカラム上でヘッドスペース分析により測定された。
【００９１】
結果
【００９２】
実施例１．自然のコンピテント細胞を用いた、プラスミドｐＮＷ３３ＮによるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの形質転換
【００９３】
１）Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１のコンピテント細胞の調製
３つの独立した実験において、以下の手順が用いられた。バチルス コアギュランス ＤＳＭ１が、好気的条件下で５ｍｌＢＣ−培地中で４５℃で一晩培養された。この培養物が、予め温められたＣ−培地中の２５ｍｌに植菌する為に用いられて、６００ｎｍで０．１５の濁度を結果した。６００ｎｍでの０．９〜１．２の濁度が達せられるまで、新しい培養物が４５℃で好気的にインキュベートされた（表１）。
【００９４】
２）ｐＮＷ３３ＮによるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１の形質転換
コンピテント細胞の０．５ｍＬ部分がペレット化され、そして、該ペレットが、Ｔ−培地の０．１ｍＬ中に再懸濁されそしてｐＮＷ３３ＮプラスミドＤＮＡの５μｇと混合された。９００ｒｐｍでのＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中での４５℃での１．５時間のインキュベーション後、予め温められたＢＣ培地の０．３ｍＬが添加され、そしてインキュベーションが２時間継続され、その後、細胞は７ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを補われたＢＣプレート上に蒔かれた。プレートは、４５℃で好気的にインキュベートされた。インキュベーションの３日後、コロニーが現れた（表１）。
【００９５】
【００９６】
３）Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１からのプラスミド単離
コロニーは、４５℃での一晩インキュベーションのために、７ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを補われた新しいＢＣプレート上にストライプされた。コロニーＰＣＲが、プラスミドｐＮＷ３３ＮからのｒｅｐＢ遺伝子の存在を検出する為に用いられた。全てのＰＣＲ反応は、期待されたサイズの産物を産出した。夫々の実験からの１のコロニーが、Ｏ／Ｎインキュベーション及びｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミド単離の為にＢＣ培地に移された。プラスミドＤＮＡはアガロースゲル電気泳動により視認され得なかったが、このｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡによるＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの形質転換は、ｐＮＷ３３Ｎが回収されることができた形質転換体を結果した。プラスミドＤＮＡは、ｐＮＷ３３Ｎの完全性を確認する為に、ＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩにより消化された。制限パターンは、期待されたとおりであり（表１）、プラスミドｐＮＷ３３ＮがＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１に形質転換されたことを実証した。
【００９７】
実施例２．エレクトロポレーションを用いた、プラスミドｐＮＷ３３ＮによるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの形質転換
【００９８】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１は慣例的に、エレクトロポレーションによって、１μｇプラスミドｐＮＷ３３Ｎにより形質転換された。典型的には、４５℃でのインキュベーションの一日後、２０超のコロニーが、クロラムフェニコールを含有するプレート上に現れた。１の実験において、１５のコロニーが、インキュベーションの２日後で、クロラムフェニコールを含有する新しいプレートに移された。４５℃でのインキュベーションの２４時間後、形質転換は、ｒｅｐＢ特異的プライマーを用いたコロニーＰＣＲ分析により確認された。
【００９９】
期待されたサイズのＰＣＲ産物が、試験された全ての形質転換体について得られ、ｐＮＷ３３ＮのｒｅｐＢ遺伝子が存在することを実証した。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ １は、ネガティブコントロールとして用いられ、そしてＰＣＲ産物を産出しなかった。一つの形質転換体のプラスミドＤＮＡが、セシウム−クロライド勾配から単離された。プラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲＩにより及びＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩにより、ｐＮＷ３３Ｎの完全性を確認する為に、消化された。制限パターンは期待されたとおりであり（３３３ｂｐ及び３８８４ｂｐの断片）、プラスミドｐＮＷ３３ＮがＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ １に形質転換されたことを実証した。
【０１００】
実施例３．接合を用いた、プラスミドｐＮＷ３３ＮによるＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの形質転換
【０１０１】
１）転移のオリジンを含有するｐＮＷ３３Ｎ派生体の構築
ＩｎｃＰプラスミドＲＫ２の転移のオリジン（ｏｒｉＴ）が、ｐＮＷ３３Ｎへクローン化された。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ供与体中に共在する任意の自己移転可能なＩｎｃＰプラスミドによる有効な共可動化を許す（Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to Gram-positive bacteria. Trieu-Cuot,P., Carlier, c., Martin, P., and Couvalin, P. 1987. FEMS Microbiol. Lett. 48:289-294）。ＲＫ２ ｏｒｉＴ領域は、ｐＡＴΔＳ２８から由来する平滑末端化された０．５−ｋｂ ＡｃｃＩ−ＡｖａＩＩ断片として、ＳｍａＩにより消化されたｐＮＷ３３Ｎ中にクローン化された。得られたプラスミドｐＪＳ２８（図２）は、ｐＲＫ２４を宿すＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１へ形質転換された。この株は、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１とのプレート接合において供与体として用いられた。
【０１０２】
２）Ｅ．ｃｏｌｉからＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓへの、ｐＪＳ２８の接合転移
アンピシリンとクロラムフェニコールとを含有するＬＢ中で３７℃で好気的に成長された、ｐＪＳ２８とｐＲＫ２４とを宿すＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物は、抗生物質を有する新しいＬＢ培地へ１／５０で移され、そして、６００ｎｍでの０．５６の濁度へ培養された。ＢＣ培地中で４５℃で好気的に成長されたＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１の一晩培養物が、新しいＢＣ培地へ１／５０で移され、そして、６００ｎｍで０．５２の濁度へ培養された。Ｅ．ｃｏｌｉとＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの等しい量（２ｍＬ）が，０．４５μｍフィルター上で回収された。細胞を有するフィルターは、抗生物質を有さないＢＣプレート上へ移され、そして、４５℃で一晩インキュベートされた。細胞がフィルターから除去され、そして、希釈系列がＢＣプレート上に蒔かれそして５５℃で好気的にインキュベートされた。１〜２日後にコロニーが現れた。ｐＪＳ２８の存在はプラスミドＤＮＡ単離により確認され、そして、その完全性がＮｃｏＩによる消化により確認されて、期待される消化パターン（１４４４−ｂｐ及び３２９９−ｂｐの断片）を産出した。接合の効率は、受容体当たり約９．３・１０−７であった。
【０１０３】
実施例４．Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ由来の発現系の構築
【０１０４】
１）Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ発現系の構築
プロモーター活性を有するＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＴＣＣ２３４９８ヌクレオチド配列断片（米国特許第５１７１６７３号明細書において開示されている）が、合成ＤＮＡ断片（図３）として製造され、そしてＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として、同じ酵素により消化されたｐＭＨ３中へクローン化された。得られたクローニングベクターｐＪＳ２５（図４）は、開始コドンとオーバーラップするＮｃｏＩ部位の使用により、このプロモーターへの翻訳的な結合を許す。このＮｃｏＩ部位の使用を可能とする為に、第１のプラスミドｐＭＨ３が、プラスミドｐＮＺ１２４から、メガプライマーを使用してｃａｔ遺伝子からＮｃｏＩ部位を除去することにより構築された。配列
及び
を有するプライマーが、メガプライマーを産生する為に用いられ、これは第２のＰＣＲ反応において、配列
を有するプライマーと組み合わせて使用された。得られたＰＣＲ産物は、完全なｃａｔ遺伝子を含み、そして、ｐＮＺ１２４ ｃａｔ遺伝子を置換するために、ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩにより消化されて、プラスミドｐＭＨ３を産生した。プラスミドｐＪＳ２５（図４）は、バチルス ズブチリス、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス プランタラム、ラクトコッカス ラクティス及びロイコノストック ラクティスを含む種々の中等温度好性のグラム陽性生物並びにグラム陰性生物エシェリヒア コリ（Use of the Escherichia coli β-glucuronidase (gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria. C. Platteeuw, G. Simons, and W.M. de Vos. 1994. Appl. Environ. Microbiol. 60:587-593）において用いられうる。
【０１０５】
２）ｌｄｈＡ過剰発現系の構築
Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードし、そしてＢｅｒｎｅｒｄらにより発行された（Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbueckii subsp. bulgaricus by complementation in Escherichia coli. 1991. Bernard, N., T. Ferrain, D. Garmyn, P. Hols, and J. Delcour. FEBS Lett. 290:61-64）、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子が、配列
及び
を有するプライマーを用いてＰＣＲにより生産された。ＰＣＲ産物は、平滑−ＸｂａＩ断片として、ＸｂａＩ−ＳｍａＩにより消化されたｐＵＣ１８中へクローン化され、そして、その完全性がヌクレオチド配列分析により確認された。次に、ｌｄｈＡ遺伝子が、ＲｃａＩ−ＸｂａＩ断片として、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩにより消化されたｐＪＳ２５中へクローン化された。得られた発現ベクターｐＪＳ２６（図５）は、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーターへと翻訳的に結合されたＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのｌｄｈＡ遺伝子を有する。次に、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓプロモーターとＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｌｄｈＡ遺伝子とを含む完全な断片が、（ＢｇｌＩＩを用いた部分消化による）ＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片として、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩにより消化された好熱性クローニングベクターｐＮＷ３３Ｎへと移されて、プラスミドｐＪＳ２７（図６）を産生した。
【０１０６】
３）Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼの過剰生産
プラスミドｐＪＳ２７が、エレクトロポレーションにより、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１へと形質転換された。特異的なＲ−ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性が、５０℃でのｍｇタンパク質当たりの分当たりの３４０ｎｍでの吸収の減少として測定された。ｐＮＷ３３Ｎを宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１の該特異的な活性は０．４５ΔＡ・分−１・ｍｇタンパク質−１であり、そしてｐＪＳ２７を宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１のそれは２．１５ΔＡ・分−１・ｍｇタンパク質−１であり、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子を含有する改変された株中のＲ−ラクテートデヒドロゲナーゼの過剰生産が、４．８倍増加した活性を結果したことを実証する。
【０１０７】
実施例５．Ｒ−ラクテート生産の為の、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１の遺伝子の改変
【０１０８】
ｐＪＳ２７を宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１（実施例４）が、工業的条件を模倣するバッチ培養において成長された。ｐＮＷ３３Ｎを宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１及びプラスミドを有さないＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１が、参照の株として用いられた。発酵後、有機酸の濃度と乳酸の光学純度が測定された（表２）。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１及びｐＮＷ３３Ｎを宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１により生産されたラクテートは、Ｓ体でエナンチオピュアであるが、ｐＪＳ２７を宿すＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１により生産されたラクテートは、かなりの部分についてＲ体であった。副産物の形成における違いは検出されなかった。２−ヒドロキシ酪酸、酢酸、酪酸、ギ酸、ピルビン酸の濃度は、検出限界（ピルビン酸については＜０．０２％；他については＜０．０１％）より低かった。コハク酸の濃度は、０．１％（ｖ／ｖ）より低かった。これらの結果は、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓによるＲ−ラクテート生産が、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の導入により達せられうることを実証する。Ｒ−ラクテートだけを生産するＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ株の構築は、ランダム変異又は部位特異的変異により、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性に関与する遺伝子の破壊を要求するであろう。
【０１０９】
【０１１０】
実施例６．エナンチオピュアなＲ−ラクテート生産のための、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１における遺伝子置換
【０１１１】
１）組み込みプラスミドの構築
Ｒ−ラクテートを生産する改変されたＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ株が、主要なＳ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードするＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｄｈＬ遺伝子を、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｌｄｈＡ遺伝子により置換することによって構築された。置換は、条件的クローニングベクター、例えば４５℃で機能的だが５５℃で機能的でない熱感受性レプリコンを用いて、二段階の過程における相同組み換えにより達せられる。我々は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種中でのそのような熱感受性の性質を有することが発見された、ｐＮＺ１２４又はｐＭＨ３に存在するｐＳＨ７１レプリコンを用いる。組み込みベクターｐＲＫ１（図７）は、ｐＮＺ１２４レプリコン、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１染色体中のｌｄｈＬに隣接し且つ今はＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｌｄｈＡ遺伝子に結合されたＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＴＣＣ２３４９８ ａｍｙ プロモーターに隣接する２つの１−ｋｂ領域、及びクロラムフェニコール耐性をコードするｃａｔ遺伝子を含有する。組み込みベクターは、以下のカセットのライゲーションにより構築される：（i）１．８−ｋｂ ＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片、ＳａｌＩ部位は平滑末端にされ、ｐＮＺ１２４レプリコンを含有する；（ii）１．１ｋｂのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１を用いて産生されたＰＣＲ断片から切り出されたｌｄｈＬ遺伝子の上流領域を含有する；（iii）１．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてｐＭＨ３（実施例４）を用いて産生されたＰＣＲ断片から切り出されたｃａｔ遺伝子を含有する；（iv）１．３ｋｂのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片、ｐＪＳ２７（実施例５）から切り出されたＬ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＴＣＣ２３４９８ ａｍｙプロモーターに翻訳的に結合されたＢ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＬＭＧ ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子を含有する；（v）１．１−ｋｂ ＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片、平滑末端にされたＢｇｌＩＩ部位を有し、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１を用いて産生されたＰＣＲ断片から切り出されたｌｄｈＬ遺伝子の下流領域を含有する。
【０１１２】
２）Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１ ｌｄｈＬ遺伝子のＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＬＭＧ６９０１ ｌｄｈＡ遺伝子との交換
プラスミドｐＲＫ１が、エレクトロポレーションによりＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１へと形質転換される。形質転換体は、７ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを補われたＢＣプレート上で４５℃で成長されて得られた。プラスミド単離による形質転換の確認の後、単独のコロニーが、対数増殖中期へとＢＣ培地中で４５℃で培養され、その後温度は５５℃にシフトされそしてインキュベーションは１時間続けられる。希釈系列が、ＢＣプレート上に蒔かれ、そして５５℃で一晩インキュベートされる。コロニーはプールされ、そして第２の希釈系列においてＢＣプレート上に蒔かれる。５５℃での一晩インキュベーション後、コロニーは、一重交差現象を確認するＰＣＲ分析により、組み込みについて試験される。１のコロニーが、抗生物質を有するＢＣ培地中での５５℃での、１／１０００希釈の逐次の移行（約１０世代）による継代培養の為に選ばれる。約１００世代の後、希釈系列は、抗生物質を有するＢＣプレート上に蒔かれた。５５℃での一晩インキュベーション後、コロニーシリーズは、コロニーＰＣＲによりｌｄｈＬ遺伝子の欠如について試験される：代わりに、コロニーＰＣＲによるｌｄｈＬ遺伝子の欠如について試験することにより、第１の現象の一重交差変異体のうちの二重交差変異体が選抜されうる。これらＰＣＲ反応においてネガティブであるコロニーからの染色体ＤＮＡが単離さらそしてさらにｌｄｈＡの存在について評価され、そして正確な組み込みがサザンブロット分析により確認される。
【０１１３】
実施例７．改変されたＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１によるエナンチオピュアなＲ−ラクテート生産
【０１１４】
１）改変された株の構築
実施例６において記載された方法により、工業的Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ株からのｌｄｈＬプロモーターに結合された、工業的Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ株からのｌｄｈＡ遺伝子及びｐＭＨ３からのｃａｔ遺伝子を有するカセットにより置換されたｌｄｈＬ遺伝子を有するＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１派生体が構築された。得られた株は、ＲＤＳＭ１と呼ばれた。
【０１１５】
２）ＲＤＳＭ１による発酵
ＲＤＳＭ１株が、工業的な条件を模倣するバッチ培養において成長された。発酵後、有機酸の濃度と乳酸の光学純度とが測定された（表３）。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＲＤＳＭ１により生産されたラクテートは、９９．５％についてＲ体であった。副産物の形成における違いは、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＤＳＭ１（実施例５）と比較して検出されなかった。２−ヒドロキシ酪酸、酢酸、酪酸、ギ酸、ピルビン酸の濃度は、検出限界（ピルビン酸については＜０．０２％；他については＜０．０１％）より低かった。コハク酸の濃度は、０．１％（ｖ／ｖ）より低かった。これらの結果は、野生型Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ遺伝子の染色体欠失、並びに（非相同）遺伝子の染色体への挿入及び機能的な発現が可能であり、そしてＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓによるエナンチオピュアなＲ−ラクテートの生産に適用されうることを実証する。
【０１１６】
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】３つの形質転換されたＢ．コアギュランス ＤＳＭ１分離株から単離されたプラスミド物質により形質転換された３つのＥ．ｃｏｌｉから単離されたｐＮＷ３３Ｎの制限分析を示す図である。
【図２】ｐＪＳ２８のプラスミド地図である。
【図３】B.コアギュランスＡＴＣＣ２３４９８アミラーゼプロモーター領域の合成の塩基配列である。
【図４】ｐＪＳ２５のプラスミド地図である。
【図５】ｐＪＳ２６のプラスミド地図である。
【図６】ｐＪＳ２７のプラスミド地図である。
【図７】ｐＲＫ１のプラスミド地図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種を遺伝子操作により改変する方法であって：
ｐＳＨ７１レプリコンまたはその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化されたＤＮＡを、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中へ導入すること；
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能な温度で該細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能な温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと；
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能でない温度で該形質転換された細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能でない温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと
を含む前記方法。
【請求項２】
該ＤＮＡが所望の機能を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プラスミド複製にとって許容可能でない温度での該培養が、好ましくは相同組み換えにより、該ＤＮＡが該バチルス染色体中へ導入されることを許す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
望ましくない機能が、相同組み換えにより該バチルス染色体から除去される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
相同組み換えにより、所望の機能が該バチルス染色体中に導入され且つ同時に望ましくない機能が該バチルス染色体から除去される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列ＩＤ ＮＯ：１に従うアミノ酸配列又は、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するそれと実質的に相同なアミノ酸配列をコードする、該バチルス種中で機能的であるプロモーターに結合されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物により、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を置換することによって該バチルス種が改変される、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
該プロモーターが、除去された内因性Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
該バチルス種が、バチルス スミシー及び／又はバチルス コアギュランスである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該バチルス種が、胞子形成欠損性である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られうる、通性嫌気性であり且つホモ乳酸的バチルス株の派生体である、遺伝子操作された中等度好熱性バチルス株。
【請求項１１】
Ｒ−乳酸を生産する、遺伝子操作されたバチルス種。
【請求項１２】
関心のある化合物、好ましくは乳酸及び／またはラクテートの調製方法であって、請求項１１の遺伝子操作された通性嫌気性である中等度好熱性バチルス種が用いられる前記方法。
【請求項１３】
Ｒ−乳酸及び／又はＲ−ラクテートが生産される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種を遺伝子操作により改変する方法であって：
ｐＳＨ７１レプリコンまたはその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化されたＤＮＡを、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中へ導入すること；
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能な温度で該細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能な温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと；
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能でない温度で該形質転換された細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能でない温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと
を含む前記方法。
【請求項２】
該ＤＮＡが所望の機能を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プラスミド複製にとって許容可能でない温度での該培養が、好ましくは相同組み換えにより、該ＤＮＡが該バチルス染色体中へ導入されることを許す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
望ましくない機能が、相同組み換えにより該バチルス染色体から除去される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
相同組み換えにより、所望の機能が該バチルス染色体中に導入され且つ同時に望ましくない機能が該バチルス染色体から除去される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列ＩＤ ＮＯ：１に従うアミノ酸配列又は、Ｒ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するそれと実質的に相同なアミノ酸配列をコードする、該バチルス種中で機能的であるプロモーターに結合されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物により、Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を置換することによって該バチルス種が改変される、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
該プロモーターが、除去された内因性Ｓ−ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
該バチルス種が、バチルス スミシー及び／又はバチルス コアギュランスである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該バチルス種が、胞子形成欠損性である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られうる、通性嫌気性であり且つホモ乳酸的バチルス株の派生体である、遺伝子操作された中等度好熱性バチルス株。
【請求項１１】
Ｒ−乳酸を生産する、遺伝子操作されたバチルス種。
【請求項１２】
関心のある化合物、好ましくは乳酸及び／またはラクテートの調製方法であって、請求項１１の遺伝子操作された通性嫌気性である中等度好熱性バチルス種が用いられる前記方法。
【請求項１３】
Ｒ−乳酸及び／又はＲ−ラクテートが生産される、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５３６０１７（Ｐ２００９−５３６０１７Ａ）
【公表日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５１７１９（Ｐ２００８−５５１７１９）
【出願日】平成１９年１月２４日（２００７．１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０００６２３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８５４４３
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（３０６００３４１９）ピュラック バイオケム ビー．ブイ． (40)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２４日（２００７．１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０００６２３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８５４４３
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（３０６００３４１９）ピュラック バイオケム ビー．ブイ． (40)
【Ｆターム（参考）】
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