ホルミルペプチドレセプター様１レセプターに対するリガンドとして有用な組成物およびその使用法
本発明者らは、ＣＫβ８−１短縮改変体（ＣＫβ８−１（２５−１１６））が、２つの異なるＧＰＣＲ（ケモカインレセプターＣＣＲ１およびホルミルペプチドレセプター様１（ＦＰＲＬ１））についての二機能性リガンドであることを発見した。それゆえ、本発明者らは、ＣＣＲ１のその機能活性に加えて、ＣＫβ８−１（２５−１１６）はまた、単球および好中球を動員することによって、炎症反応および先天免疫に関与するＧＰＣＲレセプターＦＰＲＬ１に対する機能性リガンドであることが発見した。さらに、本発明者らは、ＣＫβ８−１（ＳＨＡＡＧｔｉｄｅと命名される）の選択的スプライシングを受けたエキソンを発見した。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、その親ケモカインＣＫβ８−１（２５−１１６）と共に、ＦＰＲＬ１を発現することが公知の単球および好中球の両方で完全に機能的である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ホルミルペプチドレセプター様１レセプターに対するリガンドとして有用な組成物およびその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ケモカイン（走化性ケモカイン）は、病原との戦場に目印を付ける、Ｔリンパ球、好中球、およびマクロファージの動員および活性化についての分子ビーコンとして作用する。感染に対する抵抗を担う白色血液細胞である白血球の動員は、ケモカインの濃度に依存する。ケモカインは、多様な生物学的プロセス（白血球の輸送およびホーミング、免疫調節、造血、ならびに新脈管形成が挙げられる）を媒介する小タンパク質（８〜１０ＫＤ）のスーパーファミリーである。今日までに、２４のケモカインレセプターが知られている。ケモカインは、生来の免疫および炎症反応において基礎的な役割を果たしている（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら（１９９４）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら（１９９７）；Ｒｏｌｌｉｎｓ（１９９７））。４つのケモカインサブファミリーが、最初の２つの保存されたシステイン残基の間の距離；Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ３Ｃに基づいて記載されている。全ての公知のケモカインは、Ｇタンパク質共役レセプターおよびＧｉファミリーの百日咳毒素感受性ヘテロトリマーＧタンパク質に属する４つの群の７回膜貫通レセプター；ＸＣＲ、ＣＣＲ、ＣＸＣＲ、およびＣＸ３ＣＲを通じてシグナルを伝達する（Ｍｕｒｐｈｙら（２０００））。細胞外結合現象は、種々の応答（例えば、走化性）を導く特定のシグナル伝達経路を活性化し得る。ケモカイン系において、複数のケモカインが、単一のケモカインレセプターを活性化し得る。例えば、レセプターＣＣＲ１は、ＲＡＮＴＥＳ（活性化されると、発現される正常Ｔ細胞を調節する）、ＭＩＰ−１α（マクロファージタンパク質）、およびＭＩＰ−１βケモカインに結合する。同様に、単一のケモカインが、いくつかのレセプターを活性化し得る（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ（１９９９））。
【０００３】
炎症の病理および抗原提示において重要な役割を果たす単球および好中球は、ケモカインに応答する（Ｌｅｅら（２０００））。単球は、ケモカインレセプターＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ２、およびＣＸＣＲ４を発現する（Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉら（１９９５）；Ｗｅｂｅｒら（２０００））。リガンドＭＩＰ−１αおよび単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ１）は、インビトロでの強力な単球アクチベーターとして報告されている（Ｆａｎｔｕｚｚｉら（１９９９））。好中球は、多くの急性炎症の間に重要であり、そして免疫をＴｈ１応答に向かわせるのにも役割を果たし得る（Ｂｏｎｅｃｃｈｉら（１９９９））。それらは主に、いくつかのＣＸＣケモカインに応答するが、ほとんどのＣＣケモカインを移動させない。ヒト好中球は、２つの高親和性ＩＬ−８レセプター、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を発現する。
【０００４】
ケモカインＣＫβ８（ＣＣＬ２３；ｈｍｒｐ−２ａ；骨髄性前駆体阻害因子１（ＭＰＩＦ−１）；ＳＣＹＡ２３としても公知（現在の命名法およびゲノムＩＤシステム））は、６つのシステムを含む９９アミノ酸のＣＣケモカインである。ＣＫβ８は、肝臓、肺、膵臓、および骨髄において構成的に発現される。ＣＫβ８は、単球、樹状細胞、および休止リンパ球に対する走化性を有し（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎら（１９９７）））、骨髄由来の低増殖能コロニー形成細胞のコロニー形成を阻害する（Ｐａｔｅｌら（１９９７））。１１６アミノ酸長のＣＫβ８−１（ＣＫβ８の選択的スプライシング形態）が報告されている。ＣＫβ８およびＣＫβ８−１の両方の成熟形態は、ＣＣＲ１レセプターに対するリガンドとされている（Ｙｏｕｎら（１９９８））。単球および好酸球の交差脱感作研究は、ＣＫβ８−１がＣＣＲ１に優先的に結合することを示す。ＣＫβ８のＮＨ２末端でのさらなるプロセシングにより、ＣＣＲ１発現細胞に対して有意により活性な７６または７５残基のタンパク質が生じる（Ｍａｃｐｈｅｅら（１９９８）、Ｂｅｒｋｈｏｕｔら（２０００））。
【０００５】
ケモカインレセプターに加えて、好中球および単球はまた、Ｇタンパク質共役Ｎ−ホルミルペプチドレセプター（ＦＰＲ）およびそのホモログであるＮ−ホルミルペプチドレセプター様１（ＦＰＲＬ１）を発現する。ＦＰＲＬ１に対するリガンドは、ＦＰＲＬ１が最初にクリーニングされた当時未知であったので、ＦＰＲＬ１は、当初、孤児レセプターとして規定された（Ｂａｏら（１９９２）；Ｍｕｒｐｈｙら（１９９２）；Ｙｅら（１９９２））。それは、リポキシンＡ４に結合するという理由で、ＬＸＡ４レセプターとされた（Ｆｉｏｒｅら（１９９４））。さらに、いくつかの異なるペプチド／タンパク質が、低親和性でＦＰＲＬ１と結合することが報告されている（図１を参照のこと）。炎症の急性フェーズの間に分泌されるタンパク質である血清アミロイドＡは、中程度の親和性の機能的リガンドであると報告されている（Ｓｕら（１９９９））。βアミロイドフラグメント（１〜４２）および神経毒プリオンペプチド１０６〜１２６もまた、低親和性リガンドであり、このことは、ＦＰＲＬ１が、神経変性疾患において役割を果たし得ることを示す（Ｌｅら（２００１））。いくつかの他の低親和性リガンドとしては、以下が挙げられる：ＨＩＶエンベロープタンパク質由来のペプチド（Ｓｕら（１９９９）、Ｄｅｎｇら（１９９９）；およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉペプチドＨｐ（２〜２０）。いくつかの合成ペプチド（例えば、Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶｍ）およびＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＭ）（「Ｗペプチド１および２」））が、このレセプターに対する強力なリガンドとして報告されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅら（２００１）；Ｂａｅｋら（１９９６））。しかし、ランダムヘキサペプチドライブラリー由来の非天然ペプチドは、生理学的に関連することが示されなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明者らは、ＣＫβ８−１の短縮改変体ＣＫβ８−１（２５−１１６）が、ホルミルペプチドレセプター様１レセプター（ＦＰＲＬ１）に対する機能的リガンドとしてのその役割を通じて、炎症反応および生来の免疫に関与することを発見した。さらに、本発明者らは、ＣＫβ８−１（２５−１１６）と共に、ＦＰＲＬ１を発現することが知られている両方の細胞において機能的なＣＫβ８−１の選択的スプライシングを受けたエキソン（ＳＨＡＡＧｔｉｄｅと呼ぶ）、ならびに短縮ＳＡＡＧｔｉｄｅおよび他のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体を発見した。機能的なＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、白血球において、レセプター−リガンド結合の際に、カルシウムフラックスを生じ、そして単球、好中球、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）および未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を誘引する。
【０００７】
１つの実施形態において、本発明は、ＳＨＡＡＧｉｄｅならびにＳＨＡＡＧｉｄｅを含むタンパク質およびペプチド（ＣＫβ８−１（２５−１１６）を除く）を包含する。さらに、本発明はまた、ＳＨＡＡＧｉｄｅを含むタンパク質およびペプチドをコードする核酸、ＳＨＡＡＧｉｄｅに特異的に結合する抗体、ならびにＳＨＡＡＧｉｄｅを含む融合タンパク質を包含する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、ＳＨＡＡＧｉｄｅまたはＳＨＡＡＧｉｄｅ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを含む組成物を包含する。このような組成物としては、ＦＰＲＬ１活性を増強するために被験体に投与するのに適した組成物が挙げられる。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明は、このような組成物を包含するキットを包含する。このようなキットは、例えば、薬学的組成物の投与を容易にするよう編集される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、ＳＨＡＡＧｉｄｅもしくはＳＨＡＡＧｉｄｅ配列を含むタンパク質またはペプチドで構成される化合物を投与することによって、ＦＰＲＬ１レセプターの活性を調節する工程を包含する、被験体の障害を処置する方法を包含する。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、アゴニストを同定するのに有用な方法およびキットを包含する。このようなアゴニストもまた本発明によって包含される。このような方法は、候補アゴニスト分子の存在下で、生物学的に活性なＳＨＡＡＧｉｄｅ、またはＳＨＡＡＧｉｄｅ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを含む組成物を、ＦＰＲＬ１レセプターと接触させる工程を包含する。ＦＰＲＬ１レセプター機能に対するアゴニストは、候補化合物の存在下で観察されるレセプター活性と比較して、活性を減少する化合物として同定され得る。
【００１２】
（詳細な説明）
本発明者らは、ＣＫβ８−１短縮改変体である、ＣＫβ８−１（２５−１１６）が、２つの異なるＧＰＣＲ（ケモカインレセプターＣＣＲ１およびホルミルペプチドレセプター様１レセプター（ＦＰＲＬ１））に対する二機能的リガンドであることを発見した。本発明者らはまた、ＣＣＲ１リガンドとしての活性に加えて、ＣＫβ８−１（２５−１１６）が、単球および好中球をＦＰＲＬ１に対する機能的リガンドとしてのその役割を介して補充することによって、炎症反応および免疫に関与することを発見した。ＣＫβ８は、細胞（単球、樹状細胞および休止リンパ球を含む）を、ＯＣＲ１を介して攻撃するが、ＣＫβ８−１（２５−１１６）（ＳＨＡＡＧチド）配列において見出される選択的にスプライシングされたエキソンを欠く。ＣＫβ８の選択的スプライシング形態（１１６アミノ酸）である、ＣＫβ８−１（１−１１６）は、ＣＫβ８と同様に、ＣＣＲ１レセプターに対する機能的リガンドである。しかし、ＣＫβ８−１（１−１１６）は、ＳＨＡＡＧチド配列を介しては、その機能を発揮しない。
【００１３】
本発明者らはまた、新規なペプチド（ＳＨＡＡＧチドペプチドおよびＳＨＡＡＧチドペプチドの改変体（以降は、まとめて「ＳＨＡＡＧチド」として知られる））のクラスである、ＣＣケモカインＣＣＬ２３のスプライスエキソン、ＣＫβ８−１（２５−１１６）の短縮変異体、（これは、驚くべきことに、ＦＰＲＬ１レセプターに対する有効で価値あるリガンドである）を発見した。これらのペプチドは、ＦＰＲＬ１を発現する白血球において、カルシウムフラックスを生じる。さらに、ＳＨＡＡＧチドは、細胞（単球、好中球、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）および未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）、ならびに他のリンパ球サブセットを含む）を効率的に引きつける。ＳＨＡＡＧチドペプチド（配列番号１）および特定のＳＨＡＡＧチド改変体は、親ケモカインＣＫβ８−１（２５−１１６）と共に、ＦＰＲＬ１を発現することが知られている単球および好中球の両方に対して機能的である。機能的ＳＨＡＡＧチドは、リンパ球においてレセプターリガンド結合の際に、カルシウムフラックスを生成し、そして、走化性アッセイにおいて、単球、好中球、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）および未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を引きつける。これらの観察を考慮すると、ＳＨＡＡＧチドは、潜在的な機能的ペプチド（従って、これは、ＦＰＲＬ１リガンドとして驚くほど有効である）を示す。
【００１４】
本発明は、ＳＨＡＡＧチド、ならびにＣＫβ８−１（２５−１１６）およびＣＫβ８−１（１−１１６）以外の、ＳＨＡＡＧチドを含むタンパク質およびペプチドを包含する。さらに、本発明はまた、ＳＨＡＡＧチドをコードする核酸、ならびにＣＫβ８−１（２５−１１６）およびＣＫβ８−１（１−１１６）をコードする核酸以外の、ＳＨＡＡＧチドを含むタンパク質およびペプチドをコードする核酸を含む。ＳＨＡＡＧチド、ならびにＣＫβ８−１（２５−１１６）を含む、ＳＨＡＡＧチドを含むタンパク質およびペプチドを含有する組成物もまた、本発明に含まれる。このような組成物は、ＦＰＲＬ１活性を増大するために被験体に投与するのに適切な組成物を包含する。このような組成物を含むキットもまた、包含される。このようなキットは、例えば、薬学的組成物の投与を容易にするように構築され得る。
【００１５】
本発明はまた、炎症反応および先天免疫の刺激を必要とする被験体を処置する方法を包含する。このような活性の刺激は、疾患（例えば、感染性疾患）に罹患している被験体に（および、同時係属中の特許出願「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」（２００２年５月７日出願、代理人参照番号１０７０９／２３）に記載されるような、ワクチン摂取においても）、役立ち得る。このような方法は、ＳＨＡＡＧチド、ＳＨＡＡＧチドを含むペプチドまたはタンパク質、または他の刺激分子を含む組成物を投与することによって、ＦＰＲＬ１レセプターを刺激する工程を包含する。
【００１６】
本発明はまた、炎症反応および先天免疫の下方制御を必要とする被験体を処置する方法を包含する。このような活性の下方制御は、疾患（神経変性障害（例えば、アルツハイマー病またはクロイツフェルト−ヤーコプ病）を含む）に罹患している被験体に役立ち得る。このような方法は、ＦＰＲＬ１レセプター機能に対するアンタゴニストを含む組成物を投与することによって、ＦＰＲＬ１レセプターを下方制御する工程を包含する。
【００１７】
このようなアンタゴニストを同定するための方法およびキットもまた、本発明に包含される。このような方法は、ＦＰＲＬ１レセプターを、生物学的に活性なＳＨＡＡＧチド配列、活性ＳＨＡＡＧチドを含むペプチドまたはタンパク質を含む組成物と、候補アンタゴニスト分子の存在下で接触させる工程を包含する。ＦＰＲＬ１レセプター機能に対するアンタゴニストは、候補化合物の非存在下で観察されるレセプター活性と比較して、レセプター活性を減少させる化合物として同定され得る。このような方法は、インビトロで実施されてもインビボで実施されてもよい。さらに、キットは、このようなインビトロ試験またはインビボ試験を容易にするように構築され得る。
【００１８】
（ＳＨＡＡＧチドおよびＳＨＡＡＧチドを含む分子）
（ＳＨＡＡＧチドを含むＳＨＡＡＧチドペプチドおよびＳＨＡＡＧチドポリペプチド）
表１は、ＳＨＡＡＧチドポリペプチド配列（配列番号１）、ならびに特定のＳＨＡＡＧチド短縮改変体および他の改変体のポリペプチド配列を示す。表２は、ＳＨＡＡＧチドポリヌクレオチド配列（配列番号１２）およびＳＨＡＡＧチド短縮改変体および他の改変体のポリヌクレオチド配列を示す。表３は、ヒトＣＫβ８−１（２５−１１６）ヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。図２は、ヒトＣＣＬ２３／ＣＫβ８改変体（ＣＫβ（１−９９）−配列番号１３；ＣＫβ（２５−９９）−配列番号１４；ＣＫβ（１−１１６）−配列番号１５；ＣＫβ（２５−１１６）−配列番号１６）の、ヒトＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１α（配列番号１９）；ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１δ（配列番号１７）およびロイコタクチン（ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ）（配列番号１８）との、アミノ酸配列アライアメントを示す。４個の保存的システイン残基が、四角で囲って示され、そして２個のさらなるシステイン（通常は、ＣＣケモカインファミリーにおいて見出されない）は、破線で囲って示される。ＣＣＬ２３／ＣＫβ８−１の選択的スプライシングエキソンが、下線を付けて示される。
【００１９】
（表１ ＳＨＡＡＧチドならびに種々の短縮改変体および他の改変体−アミノ酸配列）
【００２０】
【表１】
（表２ ＳＨＡＡＧチドならびに種々の短縮改変体および他の改変体−ポリヌクレオチド配列）
【００２１】
【表２】
（表３ ヒトＣＫβ８−１（２５−１１６）ヌクレオチド配列（配列番号１２））
【００２２】
【表３】
（ＳＨＡＡＧチド分子、誘導体およびアナログ）
本発明のＳＨＡＡＧチドペプチドは、表１に列挙される分子を含む。さらにＳＨＡＡＧチドペプチドおよびヌクレオチドの種々の他の改変体が、標準的な技術を使用して合成され得る。誘導体は、直接的に、または改変もしくは部分的置換によってのいずれかで、ネイティブの化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブの化合物と同一ではないものの類似している構造を有するが、特定の成分または側鎖においてネイティブの化合物とは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成され得るか、または異なる進化起源由来であり得る。
【００２３】
誘導体およびアナログは、誘導体またはアナログが改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長または全長以外であり得る。例えば、配列番号３は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子（配列番号１）の最初のＮ末端１５アミノ酸のみを含む。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの核酸またはペプチドの誘導体またはアナログとしては、同じサイズの核酸の配列もしくはアミノ酸の配列にわたって、または相同性アルゴリズムによって整列が行われる整列配列と比較された場合に、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性でもって、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの核酸またはペプチドに対して実質的に相同である領域を含む分子、あるいはそのコード核酸が、上記のペプチド配列をコードする相補的配列に対してストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、もしくは低ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る分子が挙げられるがこれらに限定されない（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）。相補的核酸分子は、配列に対して充分に相補的であって、その結果、ミスマッチがほとんどなく水素結合が形成されて安定な二重鎖を形成する核酸分子である。「相補的」とは、ヌクレオチド間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合をいう。
【００２４】
相補的フラグメントをハイブリダイズする１本鎖ＤＮＡの特異性は、反応条件の「ストリンジェンシー」によって決定される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ＤＮＡ二重鎖を形成する傾向が低下するにつれて、増大する。核酸ハイブリダイゼーション反応では、ストリンジェンシーは、いずれかの特異的ハイブリダイゼーション（高ストリンジェンシー）に好都合なように選択され得、特異的ハイブリダイゼーションは、例えば、全長クローンをライブラリーから同定するために用いられ得る。より特異性の低いハイブリダイゼーション（低ストリンジェンシー）は、関連しているが正確ではない（相同であるが同一ではない）ＤＮＡ分子またはセグメントを同定するために用いられ得る。
【００２５】
ＤＮＡ二重鎖は、以下によって安定化される：（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対の種類、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、および（５）特定の有機溶媒（例えば、ＤＮＡ二重鎖の安定性を低下させるホルムアミド）の存在。一般に、プローブが長くなるほど、適切なアニーリングに必要な温度は高くなる。一般的アプローチは、温度を変更することである：より高い相対温度は、よりストリンジェントな反応条件をもたらす。（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）は、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの優れた説明を提供する。
【００２６】
「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズするとは、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列がハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションプロトコルをいう。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に対して相補的であるプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時にはこのプローブの５０％が占有される。
【００２７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列のみにハイブリダイズするのを可能にする。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、そして異なる。ストリンジェントな条件としては、以下が挙げられる：（１）低いイオン強度および高い温度での洗浄（例えば、５０℃での、１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）；（２）ハイブリダイゼーションの間の変性剤（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５；４２℃での７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）；または（３）５０％ホルムアミド。洗浄はまた代表的に、４２℃での５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を含み、そして４２℃での０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での洗浄、および５５℃での５０％ホルムアミド中での洗浄、続いて、５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を含む。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が代表的に、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。これらの条件は、例として提示され、限定されることは意味しない。
【００２８】
「中程度にストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチドが配列番号７〜１２、１４の全体、フラグメント、誘導体またはアナログにハイブリダイズするように、より低いストリンジェントの、洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）を用いる。一例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて３７℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を含む。温度、イオン強度などは、実験要因（例えば、プローブ長さ）に適応するように調整され得る。他の中程度のストリンジェンシー条件は記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０）。
【００２９】
「低ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチドが配列番号７〜１２、１４の全体、フラグメント、誘導体またはアナログにハイブリダイズするように、中程度のストリンジェンシーについての洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い、洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）を使用する。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、４０℃での３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸中でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃にて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。低ストリンジェンシーの他の条件（例えば、種間交叉ハイブリダイゼーションのための低ストリンジェンシー条件）が充分に記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１）。
【００３０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、配列番号１への変異によって、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ機能を有意には変更しない、コードされるＳＨＡＡＧｔｉｄｅのアミノ酸配列の変更を受ける変化が導入され得る。例えば、Ｃ末端アミノ酸残基でのアミノ酸置換が、配列番号６の配列において行われている。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更されにくいと予想される。保存的置換が行われ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【００３１】
有用な保存的置換を、表４の「好ましい置換」に示す。１つのクラスのアミノ酸が、同じ種類の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、置換がその化合物の生物学的活性を実質的に変更しない限り、本発明の範囲内に入る。
【００３２】
【表４】
以下に影響を与える非保存的置換は、特に、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列が、より大きなポリペプチド分子の一部分を含む場合、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ機能を改変し得る：（１）ポリペプチド骨格の構造（例えば、βシートまたはαヘリックスコンホメーション）、（２）電荷、（３）疎水性、または（４）標的部位の側鎖のかさ。残基は、表５に示されるような一般的側鎖特性に基づいて分類される。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つからのメンバーの、別のクラスのメンバーでの交換を伴う。置換は、保存的置換部位に導入され得るか、より好ましくは非保存的部位に導入され得る。
【００３３】
（表５ アミノ酸分類）
【００３４】
【表５】
改変体ポリペプチドは、オリゴヌクレオチド媒介性（部位指向性）変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異誘発のような、当該分野で公知の方法を使用して生成され得る。部位指向性変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，１９８７）、カセット変異誘発、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、１９８５）または他の公知の技術は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体ＤＮＡを産生するためにクローン化されたＤＮＡ上で実施され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）。
【００３５】
本発明の「単離された」または「精製された」ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、その天然の環境の成分から分離および／または回収された、ポリペプチド、タンパク質または生物学的に活性なフラグメントを含む。単離されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、遺伝子操作された細胞において異種発現されるＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはインビトロで発現されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。
【００３６】
夾雑物成分は、代表的には、ポリペプチドについての診断用途または治療用途に干渉する物質を含む。実質的に単離されるためには、調製物は、３０乾燥重量％未満の非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ夾雑性物質（夾雑物）、より好ましくは、２０乾燥重量％未満の夾雑物、１０乾燥重量％未満の夾雑物、そして最も好ましくは、５乾燥重量％未満の夾雑物を有する。
【００３７】
目的のポリペプチドおよびフラグメントは、例えば、ベクター（例えば、細菌、ウイルスおよび真核生物細胞）を介する発現による、当該分野で周知の任意の方法によって産生され得る。さらに、インビトロ合成（例えば、ペプチド合成）もまた、使用され得る。
【００３８】
「活性ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント」は、生物学的活性および／または免疫学的活性を、表Ｉに示されるＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの活性と同様に保持するが、同一である必要はない。このポリペプチド自体であってＳＨＡＡＧｔｉｄｅがＦＰＲＬ１活性を誘発または増強することにおける実際の生物学的な役割ではない本議論の背景において、免疫学的活性は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ抗原性エピトープに対する特異的な抗体がＳＨＡＡＧｔｉｄｅを結合する場合のＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの１局面を参照する。生物学的活性は、ネイティブなＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドによって引き起こされる、阻害性機能または刺激性機能のいずれかを参照する。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの生物学的活性としては、例えば、ＦＰＲＬ１レセプターに対する結合、またはＦＰＲＬ１レセプター結合の際の走化性もしくはカルシウムフラックスの誘発が挙げられる。特定の生物学的アッセイ（実施例を参照のこと）は、用量依存性を有しても有さなくても、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ活性を決定するために使用される。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を単離すること、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのコード部分を発現すること（例えば、インビトロでの組換え発現によって）およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドのコード部分の活性を評価することによって調製され得る。
【００３９】
一般的に、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド改変体は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド様機能を保存し、配列における特定の位置の残基が他のアミノ酸に置換される任意の改変体を含み、親タンパク質の２つの残基の間にさらなる残基を挿入する可能性および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を、さらに含む。任意の、アミノ酸置換、挿入、または欠失は、本発明によって包含される。好都合な環境において、置換は、上に定義されるような保存的置換である。
【００４０】
表１は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列のＣ末端でのアミノ酸の欠失が、Ｎ末端での欠失よりＦＰＲＬ１活性の喪失を引き起こす可能性がより低いことを示す（実施例９を参照のこと）。例えば、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列の１１個のＮ末端アミノ酸からなる配列番号８は、なお中程度のＦＰＲＬ１活性を保持する。しかし、３個のＮ末端アミノ酸の欠失（配列番号２）は、低いＦＰＲＬ１活性のみを生じる。それにも関わらず、Ｎ末端での末端アミノ酸の欠失（配列番号１１）は、ＦＰＲＬ１活性の完全な消失を生じない。
【００４１】
「ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体」は、少なくとも以下を有する活性なＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを意味する：（１）全長ネイティブ配列のＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド配列と約８０％のアミノ酸配列の同一性、または（２）全長ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド配列の任意のフラグメント。例えば、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド改変体は、１つ以上のアミノ酸残基が付加されたか、または全長ネイティブアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端で欠失され、但し、ＣＫβ８およびＣＫβ８−１に同一なこれらのフラグメントを除く、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを含む。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド改変体は、全長ネイティブ配列のＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは、約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。通常は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば、少なくとも約２０アミノ酸長、よりしばしば、少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、または３００アミノ酸長以上である。
【００４２】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、２つの配列が整列される場合、候補配列中のアミノ酸残基と同一である、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。％アミノ酸同一性を決定するために、配列が整列され、必要な場合、ギャップが、導入され、最大の％配列同一性を達成し；保存的置換は、配列同一性の一部として考慮されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列整列手順は、当業者に周知である。しばしば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）は、ペプチド配列を整列するために使用される。
【００４３】
アミノ酸配列が整列される場合、所定のアミノ酸配列Ｂへの、所定のアミノ酸配列Ｂと、または所定のアミノ酸配列Ｂに対する、所定のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（これは、代替的に、所定のアミノ酸配列Ｂに、所定のアミノ酸配列Ｂと、または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、特定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所定のアミノ酸配列Ａとして表され得る）は、以下のように計算され得る：
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ １００
ここで、
Ｘは、配列アライメントプログラムまたはアルゴリズムの、ＡとＢとのアライメントによって同一の一致として評価された、アミノ酸残基の数であり、そして
Ｙは、Ｂにおける全アミノ酸残基数である。
【００４４】
アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性に等しくない。
【００４５】
融合ポリペプチドは、発現研究、細胞局在化、バイオアッセイ、およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ精製において有用である。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ「キメラタンパク質」またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ「融合タンパク質」は、非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドに融合されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドに対して実質的に相同ではない。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ融合タンパク質は、全ＳＨＡＡＧｔｉｄｅに対する任意の部分を含む、任意の数の生物学的に活性な部分を含む。例えば、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合され得る。このような融合タンパク質は、組換えＳＨＡＡＧｔｉｄｅの精製を容易にする。特定の宿主（例えば、哺乳動物）において、異種シグナル配列融合体は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ発現および／または分泌を改善し得る。
【００４６】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体の配列に特異的な抗体もまた、本発明によって包含される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（結合フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）２）および単鎖バージョンを包含する）を産生する方法は周知である。それゆえ、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、標準技術によって調製され得る。
【００４７】
本発明の走化性組成物は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を含む、１以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。１つの実施形態では、この組成物は、単離ポリヌクレオチドもしくは単離ポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドもしくは組換えポリペプチドであるＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。１つの実施形態では、このＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、この組成物中の主な（すなわち、この組成物中のこのクラスの分子のメンバーの合計の約５０重量％を超える、よりしばしば約８０重量％を超える）種（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖質）である。本発明の走化性組成物は、（天然に存在する場合）インサイチュの環境でＳＨＡＡＧｔｉｄｅｓに通常会合している物質を含まないＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。
【００４８】
単離されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅ核酸分子は、天然に見出される状況から精製され、そして少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離される。単離されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子は、特定のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子とは区別される。なぜなら、特定のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子は、細胞中に存在するからである。
【００４９】
（疾患の処置におけるＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物の使用）
本発明は、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたはＦＰＲＬ１リガンド活性に関連した障害の危険性がある（もしくは感受性である）かまたはこの障害を有する被験体を処置する、予防方法および治療方法の両方を提供する。例としては、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病）が挙げられる。
【００５０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含むタンパク質もしくはペプチド、またはＦＰＬＲ１−ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ相互作用のインヒビターもしくはアゴニストを用いて処置され得る、ヒトまたは他の種の疾患または状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：末梢の慢性炎症関連疾患（例えば：慢性炎症；血栓症；アテローム性動脈硬化症；再狭窄；慢性静脈不全；再発性細菌感染；敗血症；皮膚感染；腎臓病；糸球体腎炎；線維性肺疾患；アレルギー疾患；ＩＢＳ；慢性関節リウマチおよび急性細気管支炎）。中枢神経系−大膠細胞および小膠細胞関連疾患（例えば：神経変性疾患；アルツハイマー病；多発性硬化症；パーキンソン病；神経炎症；ＨＩＶ関連神経学的疾患；ＨＩＶ関連痴呆；ＣＮＳ細菌感染症；脳トキソプラスマ；アカントアメーバ感染症；リステリア感染症；プリオン病；亜急性海綿状脳障害および黄斑変性もまた処置され得る。
【００５１】
上昇したＦＰＲＬ１レベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。アンタゴニストは、治療様式または予防様式で投与され得る。用いられ得る治療剤としては、以下が挙げられる：（１）不活性ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログを含む分子；（２）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅアンチセンス核酸；（３）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログに対する抗体、あるいは（４）ＦＰＲＬ１レセプターの活性を拮抗するモジュレーター（すなわち、インヒビターおよびアンタゴニスト）。
【００５２】
低下したＦＰＲＬ１レベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を上昇させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的に投与され得る。用いられ得る治療剤としては、ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティを上昇させるアゴニストが挙げられる。用いられ得る治療剤としては、以下が挙げられる：（１）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログを含む分子；（２）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ核酸；あるいは（３）ＦＰＲＬ１レセプターの活性をアゴナイズするモジュレーター。
【００５３】
本発明は、ＦＰＲＬ１活性を調節する薬剤を投与することによる、被験体における、異常なＦＰＲＬ１レセプター発現または異常なＦＰＲＬ１レセプター活性に関連した疾患または状態を予防するための方法を提供する。異常なＦＰＲＬ１活性によって引き起こされるかまたはそれに起因する疾患の危険性のある被験体は、例えば、診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定され得る。予防薬剤の投与は、ＦＰＲＬ１異常に特有の症状の発現前に行われ得、その結果、疾患または症状が予防されるかあるいはその進行が遅延される。ＦＰＲＬ１異常の型に依存して、例えば、ＦＰＲＬ１アゴニストまたはＦＰＲＬ１アンタゴニストを用いて、その被験体を処置し得る。適切な薬剤は、スクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【００５４】
本発明の別の局面は、治療目的でＦＰＲＬ１活性を調節する方法に関する。調節方法は、細胞を、この細胞に関連したＦＰＲＬ１活性のうちの１以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＦＰＲＬ１活性を調節する薬剤は、核酸もしくはタンパク質、ＦＰＲＬ１の天然に存在する同属リガンド、ペプチド、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチド模倣物または他の低分子であり得る。この薬剤は、ＦＰＲＬ１活性を刺激し得る。この薬剤は、ＦＰＲＬ１活性を阻害し得る。調節方法は、インビトロで（例えば、この細胞をこの薬剤を伴って培養することによる）、あるいはインビボで（例えば、この薬剤を被験体に投与することによる）行われ得る。例えば、この方法は、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ１リガンドの低減したかまたは異常な発現または活性を補償するために、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたは核酸分子を治療として施すことを包含し得る。
【００５５】
ＦＰＲＬ１活性の刺激は、ＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ１リガンドが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ１リガンドの活性の上昇が有益な効果を有するようである状況で（例えば、感染を処置する際またはワクチン接種の際に）望ましい。逆に、低下したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ１リガンド活性は、ＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ１リガンドの活性が異常にアップレギュレートされる状態および／またはＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ１リガンドの活性の低下が、有益な効果を有するようである状態で（例えば、慢性炎症を処置する際に）望ましい。
【００５６】
適切なインビトロまたはインビボでのアッセイは、特定の治療の効果、およびその投与がその罹患組織の処置に示されるか否かを決定するために実施され得る。
【００５７】
種々の特定の実施形態では、インビトロアッセイは、患者の障害に関与する代表的細胞型について、所定の治療が、その細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定するために実施され得る。治療における使用様式は、ヒト被験体における試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、イヌなどを含むがこれらに限定されない適切な動物モデル系で試験され得る。同様に、インビボでの試験について、当該分野で公知の動物モデル系のいずれかを、ヒト被験体への投与前に用い得る。
【００５８】
炎症および感染に関連した疾患および状態は、本発明の方法を用いて処置され得る。
この疾患または状態は、免疫応答を調節するために、ＦＰＲＬ１レセプターに対するＦＰＲＬ１リガンドの作用が阻害または促進されるべき、疾患または状態である。
【００５９】
本発明の組成物は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、クモ膜下槽内での注射もしくは注入、皮下注射、または移植）、吸入スプレー、鼻腔内、腟内、直腸、舌下、または局所の投与経路によって投与され得、そして各投与経路について適切な、従来の無毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントおよびビヒクルを含む適切な投薬量単位の処方物中に単独または一緒に処方され得る。温血動物（例えば、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サルなど）の処置に加えて、本発明の組成物は、ヒトにおける使用のために有用である。
【００６０】
ＦＰＬＲ１またはＦＰＬＲ１リガンドの活性を調節し、それによって、感染性疾患または炎症性障害および炎症性疾患を予防および処置するための組み合わせ療法は、本発明の化合物およびこのような有用性が公知の他の化合物の組み合わせによって例示される。
【００６１】
例えば、炎症の処置または予防において、本発明の化合物は、以下ものと組み合わせて使用され得る：抗炎症薬剤または鎮痛薬剤（例えば、オピエートアゴニスト）、リポキシゲナーゼインヒビター（例えば、５−リポキシゲナーゼインヒビター）、シクロオキシゲナーゼインヒビター（例えば、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター）、インターロイキンインヒビター（例えば、ＴＮＦα、インターロイキン−１インヒビター）、ＮＭＤＡアンタゴニスト、一酸化窒素のインヒビターまたは一酸化窒素合成インヒビター、非ステロイド抗炎症薬剤、またはサイトカイン抑制抗炎症薬剤、例えば、化合物（例えば、アセトアミノフェン、アスピリン、コデイン、フェンタニール、イブプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、モルヒネ、ナプロキセン、フェナセチン、ピロキシカム、ステロイド鎮痛薬、サフェンタニル、スリンダク（ｓｕｎｌｉｎｄａｃ）、テニダプなど）。同様に、例示の化合物は、以下の疼痛緩和物とともに投与され得る：増強剤（例えば、カフェイン、Ｈ２アンタゴニスト、シメチコン、水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウム；充血緩和剤（例えば、フェニルエフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、またはｌｅｖｏ−デスオキシ−エフェドリン）；鎮咳薬（ａｎｔｉ−ｉｔｕｓｓｉｖｅ）（例えば、コデイン、ヒドロコドン、カラミフェン、カルベタペンタン、またはデキストロメトルファン）；ステロイド；シクロスポリンＡ；メトトレキサート；ＩＬ−１０；利尿剤；および鎮痛生抗ヒスタミンまたは非鎮痛性抗ヒスタミン）。
【００６２】
（薬学的組成物）
ＦＰＲＬ１レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、薬学的組成物へ組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、アゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など（Ｇａｎｎａｒｏ（２０００））を含む。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。通常の媒体または薬剤が、活性化合物に適合しない場合を除いて、これらの組成物の使用は、意図される。補助活性化合物もまた、組成物へと組み込まれ得る。
【００６３】
アゴニストまたはアンタゴニストの薬学的組成物は、その意図する投与経路（静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮的（すなわち、局所的）投与、経粘膜投与、および直腸投与を含む）に適合するように処方される。非経口適用、皮内適用、または皮下適用について使用される溶液または懸濁液としては、以下が挙げられ得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水）、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）、および張度の調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）により調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨て注射器または複数用量バイアルに封入され得る。
【００６４】
注入に適した薬学的組成物としては、滅菌注入可能な溶液または分散媒の即座の調製のための滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散媒および滅菌粉が挙げられる。静脈内投与について、適したキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、かつ、注射器を使用して投与されるような流体であるべきである。このような組成物は、製造および貯蔵の間、安定であるべきであり、かつ、微生物（例えば、細菌および真菌）からの汚染に対して保存されなければならない。このキャリアは、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール）、および適切な混合物。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レクチン）を使用することによって、分散物の場合では必要とされる粒子サイズを維持することによって、そして、界面活性剤を使用することによって維持され得る。種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサール）は、微生物汚染を含み得る。等張剤（例えば、糖類、ポリアルコール（マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）および、塩化ナトリウム）は、組成物中に含まれ得る。吸収を遅延させ得る組成物としては、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような薬剤が挙げられる。
【００６５】
滅菌注入可能な溶液は、必要とされる成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に、必要とされる量の活性化合物を組み込むことによって調製され得、次いで、滅菌される。一般的に、分散物は、基礎となる分散媒および他の必要とされる成分を含む滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって、調製される。滅菌注入可能な溶液の調製のための滅菌粉体、調製の方法は、滅菌溶液から、活性成分を含む粉体および任意の所望の成分を生じる減圧乾燥および凍結乾燥を含む。
【００６６】
経口組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療的投与のために、活性化合物は、賦形剤に組み込まれ得、そして、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のための流体キャリアを使用して調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口的に適用される。薬学的に適合する結合薬剤、および／またはアジュバント物質が、含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の任意の成分、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ）、またはコーンスターチ；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳＴＥＲＯＴＥＳ）；滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、ショ糖またはサッカリン）；または芳香剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料）。
【００６７】
吸入による投与について、化合物は、噴霧器、または適切な推進薬（例えば、二酸化炭素のようなガス）を含む加圧容器からのエアロゾルスプレーとして送達される。
【００６８】
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的なものであり得る。経粘膜的投与または経皮的投与について、標的障害を透過し得る浸透剤が、選択される。経粘膜的浸透剤としては、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。鼻スプレーまたは坐剤が、経粘膜的投与のために使用され得る。経皮的投与について、活性化合物は、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【００６９】
化合物はまた、坐剤（例えば、基材（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド）を有する）または直腸送達のための保持浣腸の形態で調製され得る。
【００７０】
１つの実施形態において、活性化合物は、体内からの迅速な排除に対して化合物を保護するキャリア（例えば、徐放処方物（移植片およびマイクロカプセル化送達システムを含む））と共に調製される。生分解性ポリマーまたは生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が使用され得る。ポリエチレングリコール類（例えば、ＰＥＧ）はまた、良好なキャリアである。このような物質は、ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびＮＯＶＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｅｌｓｉｎｏｒｅ、ＣＡ）からの市販品で入手され得るか、または、当業者によって調製され得る。リポソーム懸濁液はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者に対して公知の方法（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら米国特許第４，５２２，８１１号、１９８５における方法）に従って調製され得る。
【００７１】
単位投薬形態における経口処方物または非経口組成物が、生成され、投与および投薬均一性を容易にし得る。単位投薬形態とは、処置されるべき被験体に対する単回投薬として適した物理的に個別の単位をいい、これは、必要とされる薬学的キャリアと合わさった治療有効量の活性化合物を含む。本発明の単位投薬形態の仕様は、活性化合物の特性および特定の所望される治療効果、ならびに活性化合物を調剤する際の固有の制限によって規定され、そして、それらに直接依存する。
【００７２】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの核酸分子は、ベクターに挿入され得、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所的投与によって（ＮａｂｅｌおよびＮａｂｅｌ，米国特許第５，３２８，４７０号，１９９４）、または定位注射（Ｃｈｅｎら（１９９４））によって被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤を含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる遅延放出マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトな状態で生成され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、その薬学的調製物は、遺伝子送達系を生成する１つ以上の細胞を含み得る。
【００７３】
１つの局面において、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、そのポリペプチドが、インサイチュで生成されるようなＤＮＡとして送達される。１つの実施形態において、そのＤＮＡは、例えば、Ｕｌｍｅｒら（１９９３）において記載され、Ｃｏｈｅｎ（１９９３）により総説されるように「裸」である。裸のＤＮＡの取り込みは、そのＤＮＡを、細胞へと効率的に輸送されるキャリア（例えば、生分解性ビーズ）上にコーティングすることによって増大され得る。このようなワクチンにおいて、そのＤＮＡは、核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系を含む、当業者に公知の任意の種々の送達系内に存在し得る。
【００７４】
生物から生物へと遺伝物質を輸送するために使用されるベクターは、２つの一般的クラスに分けられ得る：クローニングベクターは、適切な宿主細胞における増殖に必須ではなく、外来ＤＮＡが挿入され得る領域を有する、複製するプラスミドまたはファージである；外来ＤＮＡは、ベクターの成分であるかのように複製および増殖される。発現ベクター（例えば、プラスミド、酵母、または動物ウイルスゲノム）は、外来遺伝物質を、外来ＤＮＡ（例えば、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ）を転写および翻訳するために、宿主細胞または組織に導入するために使用される。発現ベクターにおいて、その導入されるＤＮＡは、挿入されるＤＮＡを転写するように宿主細胞にシグナル伝達するプロモーターのようなエレメントに、作動可能に連結される。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導性プロモーターのようないくつかのプロモーターは、極めて有用である。誘導性プロモーターに作動可能に連結しているＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリヌクレオチドは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドまたはフラグメントの発現を制御し得る。伝統的な誘導性プロモーターの例としては、α−インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、およびステロイド（例えば、グルココルチコイド（Ｋａｕｆｍａｎ，１９９０．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：４８７−５１１．））およびテトラサイクリンに応答するプロモーターが挙げられる。他の所望される誘導性プロモーターとしては、構築物が導入される細胞に対して内因性ではないが、誘導剤が外来から供給される場合にそれらの細胞において応答性であるプロモーターが挙げられる。一般に、有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドである。しかし、他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス））が企図される。
【００７５】
ベクターの選択は、使用される生物または細胞およびベクターの所望の結末により決定される。ベクターは、標的細胞において１回複製してもよいし、「自殺」ベクターであってもよい。一般に、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列を含む。
【００７６】
薬学的組成物は、ＦＰＲＬ１関連状態の処置において通常適用される、本明細書中に記載される他の治療的に活性な化合物をさらに含み得る。
【００７７】
ＦＰＲＬ１調節を要する状態の処置または予防において、アゴニストまたはアンタゴニストの適切な投薬レベルは、一般に、１日あたり、約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、単一用量または複数用量にて投与され得る。好ましくは、この投薬レベルは、１日あたり約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇであり；より好ましくは、１日あたり約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。適切な投薬レベルは、１日あたり約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１日あたり約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、または１日あたり約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、この投薬量は、１日あたり、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜５ｍｇ／ｋｇまたは５〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。経口投与については、この組成物は、好ましくは、処置される患者に対する投薬量の症状による調節のために、１．０〜１０００ｍｇの活性成分、特に、１．０ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２０．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、７５．０ｍｇ、１００．０ｍｇ、１５０．０ｍｇ、２００．０ｍｇ、２５０．０ｍｇ、３００．０ｍｇ、４００．０ｍｇ、５００．０ｍｇ、６００．０ｍｇ、７５０．０ｍｇ、８００．０ｍｇ、９００．０ｍｇ、および１０００．０ｍｇの活性化合物を含有する錠剤の形態にて提供される。この化合物は、１日あたり１〜４回、好ましくは、１日あたり１回または２回のレジメンにて投与され得る。
【００７８】
しかし、任意の特定の患者のために、特定の用量レベルおよび投薬頻度が変動され得、使用される特定の化合物の活性、代謝安定性およびその化合物の作用する時間の長さ、年齢、体重、全身的な健康状態、性別、食事、投与様式および投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重篤度、ならびに治療を受ける宿主を含む、種々の要因に依存する。
【００７９】
（キット）
１つの局面において、本発明は、パッケージまたは容器中に以下のうちの１つ以上を含むキットを提供する：（１）本発明の生物学的に活性な組成物またはＦＰＲＬ１アンタゴニスト；（２）薬学的に受容可能なアジュバントまたは賦形剤；（３）投与のための送達手段（ｖｅｈｉｃｌｅ）（例えば、シリンジ）；（４）投与のための指示書。成分（１）〜（４）のうちの２つ以上が同じ容器中に見いだされる実施形態もまた、企図される。
【００８０】
キットが供給される場合、組成物の異なる成分が、別個の容器中にパッケージされて、使用直前に混合されてもよい。成分を別々にこのようにパッケージすることは、活性成分の機能を失うことなく、長期間の保存を可能にし得る。
【００８１】
キット中に含まれる試薬は、その異なる成分の寿命が維持され、かつその容器の材料によって吸着または変化されないように、任意の種類の容器の中に供給され得る。例えば、密封されたガラスアンプルは、凍結乾燥されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリヌクレオチド、または中性の非反応性気体（例えば、窒素）下でパッケージされた緩衝剤を含み得る。アンプルは、任意の適切な材料（例えば、ガラス）、有機ポリマー（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレンなど）；セラミック、金属または類似の試薬を保持するために代表的に使用される任意の他の材料からなり得る。適切な容器の他の例としては、アンプルとして類似の物質から製造され得る単純な瓶、およびホイル（例えば、アルミニウムまたは合金）が裏打ちされた内部を含み得る包みが挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、シリンジなどが挙げられる。容器は、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、皮下注射針によって穿刺され得るストッパーを有する瓶）。他の容器は、除去した際に成分の混合を可能にする容易に取り外し可能な膜によって分離されている、２区画を有し得る。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであり得る。
【００８２】
キットはまた、指示要素とともに供給され得る。指示は、紙または他の基材に印刷されてもよいし、そして／または電気的に読み取り可能な媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなど）として供給されてもよい。詳細な指示は、キットと物理的に関連づけられていなくてもよく；代わりに、ユーザーは、キットの製造業者または販売業者によって特定されたインターネットウェブサイトに導かれてもよいし、電子メールとして提供されてもよい。
【００８３】
（スクリーニング方法および検出方法）
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅｓ（およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅｓを発現するために使用されるＳＨＡＡＧｔｉｄｅヌクレオチド）は、ＦＰＲＬ１レセプター活性を調節する化合物についてスクリーニングするための方法において試薬として使用され得る。このような化合物は、ＦＰＲＬ１レセプターもしくはＦＰＲＬ１レセプターリガンドの不十分もしくは過剰な生成、または野生型分子と比較して異常な活性を有するＦＰＲＬ１レセプターもしくはＦＰＲＬ１レセプターリガンド形態の生成によって特徴付けられる障害を処置する際に有用であり得る。一般に、このような化合物は、ＦＰＲＬ１レセプター／ＦＰＲＬ１レセプターリガンドが関連する生物学的機能を調節するために使用され得る。
【００８４】
本発明は、ＦＰＲＬ１レセプターもしくはＦＰＲＬ１レセプターリガンドに影響を及ぼす性質（すなわち、候補化合物もしくは試験化合物もしくは薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）、食品、これらの組み合わせなど）を同定するための方法（スクリーニングアッセイ）を提供する。これは、刺激性効果であってもよいし、阻害性効果であってもよい。本発明はまた、このようなスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を包含する。
【００８５】
リガンドに応答して、またはリガンドとは無関係に、ＦＰＲＬ１レセプター活性を上昇または低下させる化合物についての試験が所望される。化合物は、ＦＰＲＬ１レセプター自体の活性を上昇または低下させる（アゴニストおよびアンタゴニスト）ことによってＦＰＲＬ１レセプター活性を調節し得る。
【００８６】
試験化合物は、コンビナトリアルライブラリー法（生物学的ライブラリー；別々にアドレス可能な並行固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む）における多くのアプローチのいずれかを使用して得られ得る。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリー（Ｌａｍ、１９９７）を包含する。
【００８７】
「低分子」とは、約５ｋＤ未満、より好ましくは、約４ｋＤ未満、そして最も好ましくは、０．６ｋＤ未満の分子量を有する構成物をいう。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖質、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的混合物および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌、または藻類の抽出物）のライブラリーが当該分野において公知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。分子ライブラリーの合成のための方法の例は記載されている（Ｃａｒｅｌｌら，１９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌら，１９９４ｂ；Ｃｈｏら，１９９３；ＤｅＷｉｔｔら，１９９３；Ｇａｌｌｏｐら，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，１９９４）。
【００８８】
化合物のライブラリーは、溶液中で（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２）またはビーズ上で（Ｌａｍら、１９９１）、チップ上で（Ｆｏｄｏｒら、１９９３）、細菌、胞子（Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第５，２２３，４０９号，１９９３）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２）またはファージで（Ｃｗｉｒｌａら，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎら，１９９０；Ｆｅｌｉｃｉら，１９９１；Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第５，２２３，４０９号，１９９３；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０）提示され得る。
【００８９】
ＦＰＲＬ１レセプターに結合するかまたはＦＰＲＬ１レセプターの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするための多くのアッセイが利用可能である。無細胞アッセイは、例えば、ＦＰＲＬ１レセプターまたは生物学的に活性なフラグメントと、ＦＰＲＬ１レセプターに結合するＳＨＡＡＧｔｉｄｅ化合物とを接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を、試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がＦＰＲＬ１レセプターと相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、試験化合物がＦＰＲＬ１レセプターと相互作用する能力を決定する工程が、ＦＰＲＬ１レセプターが優先的に試験化合物に結合するかまたは試験化合物の活性を調節する能力を決定する工程を包含する。細胞ベースのアッセイとしては、例えば、実施例において考察される、カルシウムフラックスアッセイ、結合アッセイおよび細胞移動アッセイが挙げられる。
【００９０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を含む分子、またはそのパートナー分子（例えば、ＦＰＲＬ１）のうちの１つを含む分子のいずれかを固定化することは、一方または両方のタンパク質の非複合体化形態から複合体化形態を分離することを容易にし、そして高いスループットアッセイに適合することを容易にし得る。試験化合物の、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子またはＦＰＲＬ１レセプター分子への結合、あるいは候補化合物の存在下および非存在下でのＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子とＦＰＲＬ１レセプター分子の相互作用は、反応物を含むために適切な任意の容器（例えば、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管）中で達成され得る。一方または両方のタンパク質をマトリクスに結合させ得るドメインを追加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）−ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、試験化合物と、あるいは試験化合物と非吸着ＦＰＲＬ１レセプターまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子のいずれかと結合し、そしてこの混合物は、複合体形成を導く条件（例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、いかなる非結合成分も除去し、ビーズ場合には、このマトリクスを固定し、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体は、マトリクスから解離され得、そしてＳＨＡＡＧｔｉｄｅの結合または活性のレベルが、標準的技術を使用して決定され得る。
【００９１】
タンパク質をマトリクス上に固定化するための他の技術もまた、スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、同時係属中の米国特許出願番号０９／７２１，９０２を参照のこと。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子またはＦＰＲＬ１レセプター分子のいずれかが、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンシステムを使用して固定化され得る。ビオチン化は、多くの試薬（例えば、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；ＰＩＥＲＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して達成され得、そしてストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（ＰＩＥＲＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子またはＦＰＲＬ１レセプター分子と反応性であるが、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの、ＦＰＲＬ１レセプター分子への結合を妨害しない抗体または抗体フラグメントが、プレートのウェルに誘導体化され得、そしてＦＰＲＬ１レセプター分子またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅが、抗体結合体化によってウェルに捕捉され得る。ＧＳＴ固定化複合体について記載される方法に加えて、このような複合体を検出するための方法は、ＦＰＲＬ１レセプター分子またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子と反応性の抗体、および酵素結合アッセイ（ＦＰＲＬ１レセプター分子またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子と関連する酵素活性を検出することに依存する）を使用する、複合体の免疫検出を包含する。
【００９２】
化合物がＦＰＲＬ１レセプターのアンタゴニストであることを決定するために、この化合物が、レセプターに対するＳＨＡＡＧｔｉｄｅの活性を阻害するか否かを決定し得る。好ましくは、このような化合物は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
（１）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を含む分子の、ＦＰＲＬ１レセプターへの結合を潜在的に阻害すること；
（２）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＦＰＲＬ１レセプター分子に結合するＳＨＡＡＧｔｉｄｅ含有分子のＣａ２＋応答の有意な阻害；
（３）制限された非特異的Ｃａ２＋応答；あるいは
（４）化学走化性活性の阻害。
【００９３】
標準的なインビトロ結合アッセイは、ＦＰＲＬ１レセプターに対する化合物の親和性（これによって、レセプターとの競合的相互作用により、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの活性を阻害する）を実証するために使用され得る。以下の実施例を参照のこと。好ましくは、活性化合物は、＜１０μＭ、より好ましくは、＜５μＭ、最も好ましくは、＜１μＭのＩＣ５０値を示す。
【００９４】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子の活性を阻害する化合物は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ刺激細胞における細胞内Ｃａ２＋濃度に影響する。ＦＰＲＬ１レセプターへのリガンドの結合は、ホスホリパーゼＣのＧタンパク質誘導活性化を生じ、これは、ホスファチジルイノシトールリン酸を、イノシトールリン酸およびジアシルグリセロールに変換する。次いで、イノシトールリン酸は、細胞内部位に位置するレセプターと結合して、細胞質にＣａ２＋を放出させる。細胞内保存からの放出に起因したＣａ２＋濃度の増加に加えて、イノシトールリン酸の、そのレセプターへの結合は、膜を横切る細胞内への、細胞外カルシウムの増加したフラックスをもたらす。他のＧタンパク質シグナル伝達経路が含まれ得る。
【００９５】
従って、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅによるＦＰＲＬ１レセプターの活性化、引き続く、本発明の化合物による活性化の阻害は、遊離細胞内Ｃａ２＋レベルの増加についてのアッセイによって決定され得る。代表的には、これは、カルシウム感受性蛍光プローブ（例えば、ｑｕｉｎ−２、ｆｕｒａ−２およびｉｎｄｏ−１）の使用によって達成され得る。Ｃａ２＋応答をブロックする活性化合物の効果は、存在する活性化合物およびケモカインの量に依存する。一般的に、１０ｎＭのケモカインが存在する場合、１０μＭの活性化合物は、Ｃａ２＋応答の２０〜１００％の阻害を生じるはずである。
【００９６】
活性化合物が非特異的Ｃａ２＋応答を生じるか否かを決定するために、複数のレセプター（活性化合物が標的化するレセプターを含む）を有する細胞が、化合物とともにインキュベートされる。次いで、細胞は、標的レセプターに対するリガンドで刺激され、続いて、サンプル細胞において見出される他のレセプターに対するリガンドで刺激される。化合物の存在下または非存在下での、リガンドに対する非標的レセプターに同等の応答は、活性化合物が標的レセプターに特異的であることを示す。
【００９７】
走化性を決定するために、任意の細胞移動アッセイ形式（例えば、ＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）システム（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、または任意の他の適切なデバイスもしくはシステム（Ｂａｃｏｎら，１９８８；Ｐｅｎｆｏｌｄら，１９９９））が使用され得る。簡単に述べると、これらの細胞移動アッセイは、以下のように行う。活性標的ケモカインレセプターを有する細胞を収集および調製した後、この細胞を候補アンタゴニストと混合する。この混合物を、細胞移動装置の上側チャンバに置く。下側チャンバに、刺激濃度のケモカインリガンドを添加する。次いで、移動アッセイを実行し、終了し、そして細胞移動を評価する。
【００９８】
本発明者らは、単球、好中球、未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞において発現されているＦＰＲＬ１レセプターにおけるＳＨＡＡＧｔｉｄｅ活性を示した。従って、このような細胞は、インビトロアッセイ法において使用され得る。富化されたかまたは実質的に精製された細胞集団が、インビトロ走化性アッセイにおいて使用され得る。これらの細胞集団は、所望する細胞型に依存して、当該分野において公知である種々の方法によって、調製され得る。代表的には、実質的に精製された細胞集団が、特定の条件下の培養、密度勾配における挙動のような物理的特性によってか、特性マーカーに従って分類すること（例えば、細胞表面タンパク質に対する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を使用する蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、免疫沈降）によってか、または他の方法によって、調製される。
【００９９】
細胞は、組織学（例えば、Ｌｕｎａ，１９６８を参照のこと）、免疫染色および類似の方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗら １９９８；Ｃｏｌｉｇａｎら，１９９１を参照のこと）によって同定され得る。インビトロ走化性アッセイの用途のための実質的に精製された細胞組成物を調製するための方法は、以下および実施例において、簡潔に説明されている。しかし、本発明は、所望の細胞が取得され得るかぎり、特定の精製方法が使用されることを必要としない；多くのバリーエーションおよび代替的な方法が、当業者に知られている。さらに、多くの他の精製方法および検出方法（本明細書中で具体的に列挙していない細胞に対して適切な方法も含む）は、当該分野で公知であるかまたは容易に開発され得る。さらに、免疫系組織に由来するクローンニングした細胞株は、所望される場合、本明細書中に記載の走化性アッセイにおいて使用され得る。一般的な免疫学的、精製方法および細胞培養方法は、Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９１）（１９９９までの補遺も含む）に記載されている。別段規定されない限り、培養物中の細胞は、５％ＣＯ２のもと３７℃でインキュベートされる。
【０１００】
単球精製のための適切な方法は、Ｂｅｎｄｅｒら，１９９６．（また、米国特許第５，９９４，１２６号を参照のこと）に記載されている。簡潔には、単球は、汎Ｔ細胞表面マーカーＣＤ２に対する固定した抗体を使用してＴ細胞を枯渇させることによって、ＰＢＭＣから単離される。便宜上、磁気ビーズに結合されたＣＤ２抗体の市販元（Ｄｙｎａｌ；Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を利用した。従来のＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離法によって軟膜から単離したＰＢＭＣ（代表的には、４００×１０６ＰＭＢＣを含む３５ｍｌ）は、２０×１０６細胞／ｍｌで、ＭＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）（１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を伴う））に再懸濁される。ＤＰＢＳは、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＣａＣｌ２（０．１ｇ／ｌ）、ＫＣｌ（０．２ｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．２ｇ／ｌ）、ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ（０．１ｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（８．０ｇ／ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（２．１６ｇ／ｌ））である。適切な量の固定化ＣＤ２＋磁気ビーズ（代表的には１０μｌ／１０６細胞）を細胞に添加する。この混合物を穏やかに攪拌しながら４℃で１５分間インキュベートする。磁気タグ化Ｔ細胞を、磁気セルソーター（Ｄｙｎａｌ）で、製造者のプロトコルに従って未標識細胞から除去する。未標識細胞は、主に単球およびＢ細胞を含有する。
【０１０１】
上記調製物中のＢ細胞を、差次的な接着特性を利用することにより除去する。簡潔に説明すると、Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを、Ｔ−１７５組織培養フラスコのプラスチックに、３７℃で３時間、接着させる（１００×１０６細胞／フラスコ；Ｃｏｓｔａｒ；Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）。非接着細胞（大部分にＢ細胞を含む）を吸引する。非接着細胞を完全に除去するために、フラスコをＤＰＢＳでもう３回リンスする。得られた細胞は、単球について大部分が富化されている（すなわち、＞９０％）。
【０１０２】
単球はまた、ＣＤ１４抗原のポジティブ選択によって単離され得る、簡潔に説明すると、標準的なＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離法により末梢血液から単離したＰＢＭＣ（例えば、軟膜）を、１×１０６細胞／ｍｌでＭＡＣＳ緩衝液中に懸濁する。ＣＤ１４表面抗原に対する固定化抗体（例えば、ＣＤ１４＋磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｙｎｉ））を添加し（１μｌのビーズ／１×１０６細胞）、そしてこの混合物を１５分間４℃でインキュベートする。混合物を磁気セルソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）上で製造者のプロトコルに従ってポジティブ選択カラムに通すことにより、単球を他の細胞集団から分離する。カラムをＭＡＣＳ装置から除去した後、カラム上に保持された単球をＭＡＣＳ緩衝液を用いて溶出する。次いで、細胞を遠心分離によってペレット化し、そして１０６細胞／ｍｌでＲＭＰＩ＋１０％ＦＣＳ培地中に再懸濁する。この方法により単離した単球をＣＤ２＋枯渇法により単離した細胞と本質的に同じようにして培養する。
【０１０３】
別々の成熟集団および未熟集団を含む樹状細胞の精製のための適切な方法は、当該分野において公知である。実質的に精製された樹状細胞（成熟または未熟細胞の亜集団を含む）は、インビボ培養条件における選択によって調製され得る。
【０１０４】
樹状細胞は、潜在病原と接触している全ての組織（例えば、皮膚、胃腸管および気道、ならびに二次リンパ組織のＴ細胞豊富領域）において広範に分布している。皮膚および上気道においては、それらは、高度に樹状化された細胞（皮膚においてランゲルハンス細胞と呼ばれる）の格子を形成する。抗原を捕捉した後、末梢組織（例えば、皮膚および腸）中の樹状細胞は、内部移行された抗原を提示するリンパ節のＴ細胞領域にリンパ管排液を介して移動する（ｔｒａｆｆｉｃ）。未熟樹状細胞は、抗原を取り込み、そしてプロセシングするように機能する。排液リンパ節への続く遊走の間に、ＤＣは成熟する。成熟樹状細胞は、キーとなるＡＰＣとして機能し、病原特異的細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の増殖を誘導することにより、免疫応答を開始させる。
【０１０５】
樹状細胞の実質的に純粋な集団は、インビトロ培養（下述）によって生成され得る。さらに、細胞段階を同定するために使用され得る樹状細胞成熟の間で、ケモカインレセプターの発現に顕著な変化がある（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９８；Ｃｈａｎら、１９９９；Ｄｉｅｕら、１９９８；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎら、１９９９）。例えば、未熟樹状細胞は、主にＣＣＲ１、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４を発現する。成熟の際に、これらのレセプターは、ＣＸＣＲ４を除いて、ダウンレギュレートされる。
【０１０６】
培養において、未熟形態の樹状細胞は、二次リンパ組織にまでの抗原接触の地点からの樹状細胞の遊走の間、その事象に類似すると考えられる成熟を受ける。種々の発達期のヒトまたはマカクザルの樹状細胞は、特定のサイトカインを用いてＣＤ１４＋血液前駆体から、培養中に生成され得る。樹状細胞の別の系統は、臍帯血または骨髄由来のＣＤ３４＋前駆細胞から分化され得る。本発明の１つの実施形態では、樹状細胞の亜集団が、走化性組成物の同定（すなわち、走化性能および規定のＤＣサブタイプに対する選択性を評価する）のためのインビトロアッセイのために生成される。樹状細胞の例示の亜集団は、以下の通りである：（１）未熟末梢血単球由来細胞；（２）成熟末梢血単球由来細胞、および（３）ＣＤ３４＋前駆体由来の細胞。亜集団は、当該分野で公知の種々の方法によって、単離または生成される。例えば、ＰＢＭＣ由来の未熟樹状細胞および成熟樹状細胞は、Ｂｅｎｄｅｒら、前出に従って生成される。
【０１０７】
簡潔に説明すると、ＰＢＭＣを、細胞表面マーカーＣＤ２（全てのＴ細胞上に存在する）に対する固定化抗体を用いてＴ細胞枯渇させる。市販のＣＤ２＋ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ）が、製造者のプロトコルに従って使用され得る。Ｔ細胞枯渇混合物を、３７℃で３時間、組織培養用プラスチック上に細胞をインキュベートすることによって接着画分と非接着画分とに分離する。非接着細胞を穏やかに除去し、そして接着細胞（一般にＣＤ１４＋単球）を、各々１０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を補充した培養培地（例えば、ＲＭＰＩ＋１０％ＦＣＳ）中に配置する（「１日目（Ｄａｙ １）」）。３日目〜７日目の間、細胞は、ベールをかぶったような不明瞭な形態を提示し始め、そしてサイトカインを２日目、４日目、および６日目に補充する。その時点で、細胞は、未熟樹状細胞として回収され得る。１つの実施形態では、このインビトロ期での細胞を単離し、そしてこれをアッセイにおいて使用する。代表的には、約１０×１０６の樹状細胞が、４００×１０６ＰＢＭＣから得られる。
【０１０８】
７日目の未熟樹状細胞は、代表的な樹状細胞形態を示し、これは、伸長した細胞体および多くの突起を有する。細胞の大きさは、前駆単球に比較して有意に増大する。未熟樹状細胞は、細胞表面マーカーのそれらの発現をモニタリングすることによって表現形的に特徴づけられ得る。
【０１０９】
未成熟樹状細胞（末梢血単球または骨髄由来のＣＤ３４＋前駆体から生成される）は、さらに活性化され、そして分化されて、成熟樹状細胞になり得る。以下の２つの方法が、主に使用される：ＭＣＭ（マクロファージ馴化培地）および二本鎖ＲＮＡ−ｐｌｏｙ（Ｉ：Ｃ）刺激（Ｃｅｌｌａら、１９９９；Ｖｅｒｄｉｊｋら、１９９９）。
【０１１０】
ＭＣＭ法において、６日目の未成熟樹状細胞を、遠心分離によって回収し、そして（１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩで１：１まで）希釈した熟成培地（例えば、ＭＣＭ）中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）を添加する。細胞を、さらに３日間培養し、さらにＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４を添加する。９日目の細胞を、成熟樹状細胞として使用する。
【０１１１】
ポリ（Ｉ：Ｃ）法において、６日目の未成熟樹状細胞を回収し、そして２０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ）、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＦＳおよびＩＬ−４を補充した標準培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳ）中に再懸濁する。細胞を、さらなるサイトカインなしに、さらに３日間培養する。９日目の細胞を、成熟樹状細胞として使用する。
【０１１２】
これら２つの異なる方法によって生成された成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞とも前駆体単球とも異なる表現型および機能的特性を示す。各調製由来の成熟樹状細胞を、ＦＡＣＳによって完全に特徴付けて、所望の細胞型が得られたことを確認する。
【０１１３】
特に、生成された成熟樹状細胞は、未成熟細胞よりも、その細胞表面上に顕著により高いレベルのＭＨＣクラスＩＩを発現する。ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現もまた、アップレギュレートされる。ケモカインレセプター発現もまた、成熟プロセスの間に劇的に変化する。例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５は、成熟細胞において急激にダウンレギュレートされるが、一方でＣＣＲ７は、アップレギュレートされ、そしてＭＣＭの添加の数時間以内に、細胞表面上に出現する。機能的に、成熟樹状細胞は、もはや抗原を充分に摂取することができないが、ナイーブなＴ細胞およびＢ細胞の増殖を刺激する能力を獲得する。成熟樹状細胞はまた、それらの移動挙動を変化させる；成熟樹状細胞は、もはや、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５のリガンド（例えば、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１β）に応答しない。その代わり、成熟樹状細胞は、ＣＣＲ７リガンドであるＳＬＣおよびＥＬＣに応答する。
【０１１４】
ＭＣＭは、軽微な改変を加えて、Ｒｏｍａｎｉら、１９９６に記載されるように調製する。簡潔には、ペトリ皿（１００ｍｍ、Ｆａｌｃｏｎ）を、５ｍｌのヒトＩｇ（１０ｍｇ／ｍＬ）で３７℃にて３０分間コーティングし、そして使用直前にＰＢＳで２〜３回洗浄する。８ｍｌ中５０×１０６のＰＢＭＣを、ヒトＩｇコーティングしたプレート上に、１〜２時間にわたって層状化する。非接着細胞を、洗浄して除去し、そして廃棄する。接着細胞を、新たな完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％正常ヒト血清）中で３７℃でインキュベートし、そして得られた培地（ＭＣＭ）を、２４時間後に収集する。ＭＣＭ中のＴＮＦ−α濃度を、標準的なＥＬＩＳＡ法（例えば、ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用する）によって決定する。ＭＣＭ中の最終ＴＮＦ−αレベルを、適切な量のＭＣＭをＲＰＭＩ／１０％ウシ胎仔血清と混合することによって、５０Ｕ／ｍｌに調節する。
【０１１５】
好中球精製に適切な方法は、当該分野で公知である。１つの適切な方法に従って、新鮮な全血（ＷＢ）を、５０ｍｌの遠心管中で、３％のデキストランで１：１に希釈し、そして室温で３０〜４５分間沈降させる。２５ｍｌのＷＢ＋２５ｍｌのデキストランは、３０分間の沈降後に、約３５ｍｌの上清を生じる。この上清を、１２〜１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ上に層状化し、そして１８〜２０℃にて３０〜４０分間、４００×ｇで遠心分離する。単核細胞およびＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを含む血漿／血小板層を、吸引によって除去する。好中球は、赤血球（ＲＢＣ）層上の白色層において見出される（いくつかの調製物において、好中球および赤血球の層は、混合される）。これらの場合、ＲＢＣは、低張溶解によって除去される（１２．５ｍｌの冷０．２％ ＮａＣｌを、ボルテックスしながら、好中球／ＲＢＣペレットに添加する。１２．５ｍｌの冷１．６％ ＮａＣｌを、なおボルテックスしながら、直ぐに添加する。これらの細胞を、６０〜１００×ｇで１０分間遠心分離し、そして回収する。必要な場合、この溶解工程が繰り返される）。得られた好中球は、＞９５％の純度である（主な残留細胞として、好酸球を含む）。
【０１１６】
（予後アッセイ）
本明細書中に記載される診断方法は、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたはＦＰＲＬ１リガンドの発現または活性に関連する疾患または障害を有するかまたは発症する危険性のある被験体を同定するためにさらに利用され得る。例えば、記載されるアッセイは、神経変性障害のような障害を有するかまたは発症する危険性のある被験体を同定するために使用され得る。代表的には、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＦＰＲＬ１レセプターもしくはＦＰＲＬ１リガンドが検出されるか、または活性がアッセイされる。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプルまたは組織であり得る。
【０１１７】
予後アッセイは、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたはＦＰＲＬ１リガンドの発現または活性に関連する疾患または障害を処置するために、ある様式（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、食物など）を被験体が投与され得るかどうかを決定するために使用され得る。このような方法は、被験体が、ある障害についての薬剤で効果的に処置され得るかどうかを決定するために使用され得る。本発明は、被験体が、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたは異常なＦＰＲＬ１リガンドの発現または活性に関連する障害についての薬剤で効果的に処置され得るかどうかを決定するための方法を提供する。このようなアッセイにおいて、試験サンプルが獲得され、そしてＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたは核酸が検出される（例えば、ここで、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたは核酸の存在は、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたは異常なＦＰＲＬ１リガンドの発現または活性に関連する障害を処置するための薬剤を投与され得る被験体についての診断である）。
【０１１８】
以下の実施例は、本発明を例示するために与えられ、そして限定を意図しない。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１：ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、他のＣＫβ８改変体同様に、ＣＣＲ１発現細胞における細胞内カルシウムフラックスを刺激する）
ヒト組換えケモカインであるロイコタクチン（ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ）、３つの既知のＣＫβ８改変体であるＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−１１６）、およびＣＫβ８−１の新規ＮＨ２−末端短縮型であるＣＫβ８−１（２５−１１６）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。ＣＫβ８−１（２５−１１６）を、安定なヒトＣＣＲ１トランスフェクトＨＥＫ２３９細胞における細胞内カルシウム動員を誘発する能力について、他の３つの改変体と比較した。ヒトＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎａ ６（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）を使用して調製した。ＨＥＫ−２９３細胞株を、８００μｇ／ｍｌのＧ−４１８を補充した、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。
【０１２０】
ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトケモカインレセプターＣＣＲ１の安定な発現を、以下のように得た：ＣＣＲ１をコードする全長ｃＤＮＡを、ヒト末梢血細胞から単離したゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。このＰＣＲ産物を、標準的な分子クローニング手順を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングし、そして正体を確認するために、完全に配列決定した。
【０１２１】
このＣＣＲ１／ｐｃＤＮＡ３．１構築物２μｇを使用して、以下のようにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。ＦｕＧＥＮＥ：ＤＮＡ複合体を、１００ｕｌの無血清培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＣＯ）中で、６．０μｌのＦｕＧＥＮＥ ６試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）および２μｇのＣＣＲ１／ｐｃＤＮＡ３．１を混合することによって調製した。室温で３０分間のインキュベーション後、この複合体を、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＣＯ）を補充したＤＭＥＭ培地１０ ｍｌ中に０．５〜１×１０６細胞を含む、６０ｍｍの培養プレートに添加した。混合後、これらの細胞をインキュベータに戻して、３７℃で２日間培養した。トランスフェクションの４８時間後に、ジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）を、８００ｕｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。次いで、これらの細胞を、２０，０００細胞／ウェルの濃度で、９６ウェルプレートにプレートした。Ｇ４１８選択下で２〜３週間の後に、安定なジェネテシン耐性ＣＣＲ１発現細胞を、１〜５００ｎＭの濃度のＭＩＰ−１αに応答してカルシウムを動員する能力についてアッセイした。
【０１２２】
Ｃａ２＋動員応答を、細胞内比率測定（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）蛍光色素Ｉｎｄｏ−１を使用して実施した。細胞に、培養培地中で、Ｉｎｄｏ−１／ＡＭ（３μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をロードした（４５分、２０℃、１０７細胞／ｍｌ）。色素ロード後、細胞を、１０ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、そして１％ ＦＢＳを含むＨＢＳＳ中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞質ゾルＣａ２＋放出を、Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ蛍光定量器（３５０ｎｍにて励起、４００ｎｍおよび４９０ｎｍでの比例する（ｒａｔｉｏｅｄ）二重放射）を使用して、３５０ｎｍでの励起を使用して決定した。
【０１２３】
ＨＥＫＣＣＲ１−２９３形質転換体を用いて、ＣＫβ８−１（２５−１１６）および他のＣＫβ８改変体は、１００ｎＭで迅速なカルシウムフラックスを誘導した。２つの短縮型改変体ＣＫβ８（２５−９９）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）は、高いカルシウム応答を誘導したが、一方で、改変体ＣＫβ８（２５−９９）およびＣＫβ８−１（１−１１６）によって生じるシグナルはより低かった。これらのケモカインはいずれも、トランスフェクトされていない親ＨＥＫ２９３細胞ではシグナルを誘導しなかった。このことは、この活性がＣＣＲ１に起因し、内因性レセプターに起因するものではないことを実証する。１００ｎＭのＣＫβ８（２５−９９）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）で得られた最大レセプター刺激は、同じ濃度のＣＣＲ１アゴニストであるロイコタクチンで得られたレセプター刺激と等しかった。
【０１２４】
（実施例２：ＣＣＬ２３改変体ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ヒト単球および好中球において、ＣＣＲ１関連イベントではない特有の活性プロフィールを提示する）
ヒト組換えケモカイン、ロイコタクチン、ＭＩＰ−１α、３種類の公知のＣＫβ８改変体（ＣＫβ８（１〜９９）、ＣＫβ８（２５〜９９）、ＣＫβ８−１（１〜１１６））およびＣＫβ８−１の新規ＮＨ２末端短縮形態（ＣＫβ８−１（２５〜１１６））を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。ヒト単球を、標準的なプロトコルに従い、軟膜（Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から作製した。簡単には、ＰＢＭＣを、標準的な密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ−Ｐｌｕｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により単離した。単球を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｍ、ＣＡ）磁性陽性選択を用いて精製した。ヒト好中球を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡ）での勾配遠心により、健康な個体由来の新しい末梢血から単離した。
【０１２５】
ＣＣＬ２３改変体の活性を、実施例１に記載されるカルシウムフラックス試験を用いて、新しく調製したヒト単球および好中球で試験した。全てのケモカインが単球において幾分かのカルシウム放出を刺激したが、ＣＫβ８（１−９９）およびＣＫβ８−１（１−１１６）は、２５０ｎＭでさえ乏しい活性を示した。ＣＫβ８（２５−９９）は、わずかに高いカルシウム刺激を示した。しかし、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、拡張されたカルシウム放出を伴う特有のカルシウムフラックスを示した。１００ｎＭのＣＫβ８−１（２５−１１６）で得られた最大のレセプター刺激は、同じ濃度のロイコタクチンで得られたレセプター刺激より少なくとも２倍高かった。
【０１２６】
好中球において、１００ｎＭのロイコタクチンは、カルシウム流を誘導したが、ＭＩＰ１αもＣＫβ８（１−９９）も、ＣＫβ８（２５−９９）も、ＣＫβ８（１−１１６）もカルシウム流を誘導しなかった。しかし、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、特有のカルシウム放出を誘導した。その強度は、同じ量のロイコトタクリン刺激について観察された強度より非常に高かった。
【０１２７】
（実施例３：ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１トランスフェクト体、単球および好中球で実施された交差脱感作（ｃｒｏｓｓ−ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）試験）
交差脱感作試験において、細胞を、ロイコタクチン、次いで、ケモカインＣＫβ８（１〜９９）、ＣＫβ８（２５〜９９）、ＣＫβ８−１（１〜１１６）およびＣＫβ８−１（２５〜１１６）で連続的に刺激した。ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１トランスフェクト体（実施例１におけるように調製した）において、ロイコタクチンは、全ての改変体に対して類似のレセプター脱感作パターンを誘導した。細胞を、１００ｎＭのロイコタクチンで前処理した場合、全てのリガンドに対するカルシウムフラックス応答が、完全に阻害された。
【０１２８】
類似のレセプター交差脱感作試験を、単球および好中球の両方（実施例２におけるように調製した）を用いて実施した。単球において、ロイコタクチンは、ＣＣＬ２３改変体である、ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、およびＣＫβ８−１（１−１１６）を完全に脱感作した。対照的に、ロイコタクチンでの前刺激は、単球でのＣＫβ８−１（２５−１１６）の活性を脱感作しなかった。好中球において、ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、およびＣＫβ８−１（１−１１６）は、不活性であり、かつロイコタクチンでの前刺激は、効果がなかった。しかし、ロイコタクチンでの前刺激は、ＣＫβ８−１（２５−１１６）での刺激を脱感作しなかった。
【０１２９】
（実施例４：ＣＣＬ２３改変体は、ＣＣＲ１発現細胞への結合について、１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αと競合する）
ＣＣＬ２３改変体の結合特性を、ヒトＣＣＲ１発現細胞において比較した。ＭＩＰ−１αおよびＣＣＬ２３改変体ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−１１６）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）が、１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αと競合する能力を、ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１細胞（実施例１におけるように調製した）において調査した。細胞を、非標識ケモカインの存在下で、１２５Ｉ標識したＭＩＰ−１α（最終濃度、約０．０５ｎＭ）と共にインキュベートした（４℃で３時間：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．２％ＢＳＡ、ｐＨ７．１に調整）。反応混合物を、細胞回収器（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いてＰＥＩ処理ＧＦ／Ｂガラスフィルター上に吸引した。フィルターを、２回（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．１に調整）洗浄した。シンチレーション剤（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−１０：３５μｌ）を、乾燥したフィルターに添加し、そしてフィルターを、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒにおいて計数した。データを、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて解析しおよびプロットした。
【０１３０】
漸増濃度のＭＩＰ−１αまたはＣＣＬ２３改変体で競合曲線が観察された。ＭＩＰ−１αは、０．５４ｎＭのＩＣ５０を与えた。ＣＣＬ２３改変体は、それぞれ、６４ｎＭ、１．３４ｎＭ、２０６ｎＭ、および１１２ｎＭのＩＣ５０を与えた。ＣＫβ８−１（１−１１６）は、このトランスフェクト体において、ＣＣＲ１からの結合した１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αの置換について、ＣＫβ８（１−９９）より１／３〜１／４少ない能力を示した。このことは、ＣＫβ８−１（１−１１６）のＣＣＲ１に対する比較的低い親和性と一致する。また、予想されるようにＣＫβ８（１−９９）の短縮体である、ＣＫβ８（２５〜９９）は、４０倍のＩＣ５０の増加を示した。しかし、ＣＫβ８−１（２５−１１６）（同様のＣＫβ８−１（１−１１６）のアミノ酸短縮改変体）についてのＩＣ５０は、１倍増加したのみであった。
【０１３１】
同様の結合競合試験を、単球および好中球で実施した。これらの細胞を、実施例２におけるように調製した。ＭＩＰ−１αは、好中球に結合しなかったので、好中球におけるＭＩＰ−１αの間での結合競合は、研究され得なかった。単球において、ＭＩＰ−１αは、０．２７ｎＭのＩＣ５０を有し、そしてＣＣＬ２３改変体は、それぞれ、１０ｎＭ、０．２５ｎＭ、５５ｎＭ、および５ｎＭのＩＣ５０を有する。慨して、ＣＫβ８（１−９９）およびＣＫβ８（２５−９９）は、ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１細胞において観察されたＩＣ５０と同様のＩＣ５０を示した。しかし、ＣＫβ８−１（１−１１６）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）は、単球においてより高いＭＩＰ−１α置換活性を示し、特に、ＣＫβ８−１（２５−１１６）についての活性は、１０倍高かった。１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αの結合競合データ（ＩＣ５０）を、表６に示す。各々の相互作用についてのＩＣ５０を、非線形最小二乗曲線フィッティングから誘導した。
【０１３２】
（表６、ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１トランスフェクト体および単球についての１２５Ｉ−ＭＩＰ−１α結合競合データ）
【０１３３】
【表６】
（実施例５ 改変体ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ヒト単球および好中球の新規移動特性での移動を誘導する）
移動アッセイを、単球および好中球において実施した。ヒト単球および好中球（実施例２におけるように調製した）を、回収し、そして走化性培地（ＣＭ）中に再懸濁した。このＣＭは、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）およびＭｇＳＯ４（１ｍＭ）を含むハンクス緩衝化塩溶液（Ｇｉｂｃｏ、ＭＡ）から構成されていた。これらのアッセイを、９６ウェルＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）マイクロプレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、ＭＡ）中で実施した。ロイコタクチン、ＭＩＰ−１αおよびケモカイン（実施例１におけるように調製したＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−１１６）またはＣＫβ８−１（２５−１１６））を、より下部ウェルに添加し（最終容量２９μＬ）、そして２０μＬの細胞懸濁液（単球について５×１０６細胞／ｍＬ；好中球について２．５×１０６細胞／ｍＬ）をポリカーボネートフィルター（単球について５μｍ孔径；好中球について３μｍ孔径）に添加した。９０分間のインキュベート（３７℃、１００％湿度、５％ＣＯ２）後、細胞を、フィルターの上部表面からかき出した。下部チャンバに移動した細胞を、Ｑｕａｎｔ細胞増殖アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＯＲ）を用いて定量した。
【０１３４】
単球において、ＣＫβ８−１（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−９９）、およびＣＫβ８−１（１−１１６）は、１００ｎＭまでの全ての濃度で中程度に高い活性を示した。ＣＫβ８−１（２５−１１６）の１ｎＭおよび１０ｎＭでの活性は他の改変対と非常に類似していたが、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、１００ｎＭの濃度で、他の３種類の改変体より劇的に高い活性を示した。
【０１３５】
同じ試験を、ヒト好中球で実施した。ヒト好中球は、一般的に、ＣＣＲ１リガンドに対する強力な応答を欠いた。カルシウムフラックスの結果と一致して、ロイコタクチンおよびＭＩＰ−１αを含む公知のＣＣＲ１リガンドのいずれもが、活性ではなかった。しかし、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、１００ｎＭで強力な応答を誘導した。この強度は、ＩＬ−８およびＧＲＯ−αを含む多くの他の強力なＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ１リガンドに匹敵する。
【０１３６】
（実施例６ ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ホルミルペプチドレセプター様１（ＦＰＲＬ１）発現細胞において細胞内カルシウムフラックスおよび走化性を誘導し得る）
ＣＫβ８−１（２５−１１６）の機能的活性を、ヒトＦＰＲＬ１−Ｌ１．２トランスフェクト体およびネイティブのＬ１．２細胞において調査した。Ｌ１．２細胞におけるホルミルペプチド様レセプター１（ＦＰＲＬ１）の安定した発現を、以下のように得た。ＦＰＲＬ１をコードする全長ｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、未分化ＨＬ−６０細胞から単離したゲノムＤＮＡからクローニングした。ポリメラーゼ連鎖反応産物を、標準的な分子クローニング手順を用いてｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へとクローニングし、そして完全に配列決定して同一性を確認した。２０μｇのＦＰＲＬ１／ｐｃＤＮＡ３．１構築物を、ＢｓｍＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）での消化により直線状にし、そして以下のようにマウスＢ細胞株Ｌ１．２をトランスフェクトするために用いた。２５００万の細胞を、２回洗浄し、そして０．８ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。これらの細胞を、直鎖状ＦＰＲＬ／ｐｃＤＮＡ３．１構築物ＤＮＡと共に室温で１０分間、インキュベートし、そして０．４ｃｍキュベットに移し、そして２５０Ｖ、９６０μＦでシングルエレクトロポレーションパルスを印加した。エレクトロポレートした細胞を、室温で１０分間、インキュベートし、そして１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中の３７℃の培養物中に移した。ジェネチシン（Ｇ４１８）を、トランスフェクションの４８時間後に８００μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、そしてこれらの細胞を、９６ウェルプレートに、２５，０００細胞／ウェルでプレートした。薬物選択下、２〜３週間後、安定なジェネテシン耐性ＦＰＬＲ１発現細胞を、それらが１〜１０００ｎＭの濃度のＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＣＫβ８−１に応答してＣａ＋＋を移動させる能力について評価した。
【０１３７】
カルシウムフラックス試験を、実施例１に記載される方法を用いて、これらのトランスフェクト体で実施した。ＣＣＬ２３改変体の中で、ＣＫβ８−１（２５−１１６）のみが、ＦＰＲＬ１発現細胞におけるカルシウム放出を刺激した。ＦＰＲＬ１についての非天然リガンドとして知られる合成ペプチドＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶｍ）およびＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＭ）（「Ｗペプチド１および２」）（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）から入手）は、強力なカルシウムフラックスを生成した。ＣＫβ８−１（２５−１１６）誘導されたカルシウム放出は、親（ｐａｒｉｅｎｔａｌ）細胞においても他のケモカインレセプターでトランスフェクトされた細胞においても観察されなかった。ＣＫβ８−１（２５−１１６）誘導されたカルシウムフラックス用量応答アッセイを実施した場合、１０〜２０ｎＭのＥＣ５０が、これらの細胞において観察された。ＣＫβ８−１（１−１１６）は、２００ｎＭでさえもＦＰＲＬ１発現細胞に対して活性を示さなかった。
【０１３８】
ＣＫβ８−１（２５〜１１６）が、ＦＰＲＬ１発現細胞の移動を誘発する能力を、試験した。試験条件は、実施例５におけるとおりであった。親（ｐａｒｉｅｎｔａｌ）Ｌ１．２細胞は、このアッセイにおいて移動しなかったが、ＦＰＲＬ１を発現する細胞は、１ｎＭから１μＭの範囲のＣＫβ８−１（２５−１１６）濃度に応答してベル型の用量依存性の様式で移動した。最大の半分の（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ）細胞移動は、３０ｎＭで観察された。この最大の応答の強度は、合成ペプチドＷＫＹＭＶｍおよびＷＫＹＭＶＭを用いて観察された強度より高かった。一般的に、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ＦＰＲＬ１媒介移動において、他のケモカインと比較して、より広範なベル型曲線を示した。従って、ＣＣＲ１に対する活性に加えて、ＣＫβ８−１（２５−１１６）はまた、単球および好中球上で発現したレセプターＦＰＲＬ１を介して機能する。
【０１３９】
（実施例７ ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ヒト単球およびＦＰＲＬ１発現細胞上に結合する１２５Ｉで標識されたＷＫＹＭＶｍを置換し得る）
ＦＰＲＬ１へのＣＫβ８−１（２５−１１６）の結合を、ＣＫβ８−１（２５−１１６）が、ヒトＦＰＲＬ１−Ｌ１．２トランスフェクト体およびヒト単球から１２５Ｉで標識されたＷＫＹＭＶｍ（１２５Ｉで標識されたＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））を置換する能力を測定することにより決定した。細胞を、漸増濃度の標識していないＷＫＹＭＶｍまたはＣＫβ８−１（２５−１１６）の存在下で、０．０１ｎＭの１２５Ｉ−ＷＫＹＭＶｍと共に、４℃で、３時間、インキュベートした。各々の相互作用についてのＩＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いることによる、データの非線形最小二乗曲線フィッティングから導いた。
【０１４０】
ＦＰＲＬ１−Ｌ１．２トランスフェクト体および単球について、競合曲線が、漸増濃度のＷＫＹＭＶｍまたはＣＫβ８−１（２５−１１６）で観察された（表７）。そのような曲線は、他のＣＣＬ２３改変体について観察されなかった。
【０１４１】
（表７ ＷＫＹＭＶｍおよびＣＫβ８−１（２５−１１６）で観察された、１２５Ｉ標識されたＷＫＹＭＶｍの競合曲線）
【０１４２】
【表７】
（実施例８ ケモカインまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞、単球または好中球によるカルシウム動員を誘導した）
ヒト組換えＣＫβ８−１（２５−１１６）ケモカインを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。ペプチドＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（配列番号１および配列番号６）ならびにコントロールタンパク質（配列番号１の逆配列）を合成し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９９に記載される従来技術を用いてＨＰＬＣで精製した。
【０１４３】
ヒト単球を、軟膜（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐａｌｏ Ａｌｓｏ、ＣＡ）または健康な個体の新しい血液のいずれかから、標準的なプロトコルに従い作製した。簡単には、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ−Ｐｌｕｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により単離した。単球を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）磁性陽性選択により精製した。ヒト好中球を、デキストラン沈殿および密度勾配遠心Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心法によって、新しい血液から単離した。全ての細胞を、洗浄し、そして１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地中に再懸濁した（１×１０７／ｍｌ）。
【０１４４】
未熟ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４の存在下でＣＤ１４＋単球を培養することによって、誘導した。簡単には、単球を、Ｔ−１７５フラスコ中で、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中１０６細胞／ｍｌで培養した。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４を、０日目、２日目、４日目、および６日目に、それぞれ、１０００ｕ／ｍｌおよび５００ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加した。細胞を、未熟ＤＣとして７日目に回収し、ＦＡＣＳ分析により表面タンパク質発現について特徴づけした。ＤＣ成熟を、マクロファージ馴化培地（ＭＣＭ）中で６日目の未熟ＤＣを培養することによって実施した。簡単には、６日目の未熟ＤＣを、遠心分離により回収し、そしてＭＣＭに１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。培地に、１０００ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００ｕ／ｍｌのＩＬ４を補充した。さらに３日の培養後、細胞を、成熟ＤＣとして回収し、そして表面タンパク質発現フローサイトメトリーにより特徴付けた。
【０１４５】
ＭＣＭを、以下のように調製した：軟膜から単離したＰＢＭＣを、１０ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でプレコートしたプラスチックフラスコ中、３７℃で、３０分間、インキュベートした。３０分後、非付着細胞を、除去し、そして付着細胞を、ＤＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ／１０％ヒト血清中で培養した。馴化培地を、２４時間後に回収した。ＴＮＦ−α濃度（これは、ＤＣ成熟に必須である）を、ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）を用いることによって決定した。ＭＣＭ中の最終的なＴＮＦ−αレベルを、ＲＰＭＩ／１０％ヒト血清と混合することによって５０ｕ／ｍｌまで調整し、そして−８０冷凍庫で、使用するまで貯蔵した。
【０１４６】
Ｃａ２＋移動応答を、細胞内レシオメトリック蛍光色素であるＩｎｄｏ−１を用いて実施した。培養培地中の細胞に、Ｉｎｄｏ−１／ＡＭ（３μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ））を充填した（４５分、２０℃、１０７細胞／ｍｌ）。色素充填後、細胞を、１回洗浄し（１０ｍｌ ＰＢＳ）そして１％ＦＢＳを含むＨＢＳＳ中に１０６細胞／ｍｌで懸濁した。サイトゾル［Ｃａ２＋］放出を、Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒを用い、３５０ｎｍでの励起を用いて決定した（３５０ｎｍで励起、４００ｎｍおよび４９０ｎｍでの分配された（ｒｅｔｉｏｅｄ）二重放出）。
【０１４７】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（配列番号１および配列番号６）ならびにＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ヒト単球および好中球で強力なカルシウムフラックスを生成し、そして未熟樹状細胞および成熟樹状細胞に対して部分的に活性であった。コントロールペプチドでは、有意なカルシウムフラックスが、観察されなかった。未熟樹状細胞は、高レベルのＣＣＲ１を発現し、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、これらの細胞においてＣａ２＋放出を誘導する。
【０１４８】
（実施例９ ケモカイン、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ、およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ短縮改変体は、安定に発現されたＦＰＲＬ１細胞によってカルシウム動員を誘導した）
Ｌ１．２細胞中のヒトＦＰＲＬ１の安定な発現は、実施例６のとおりに得られた。カルシウムフラックス試験を、実施例１に記載された方法を使用してトランスフェクト体で行なった。ケモカイン（ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−１１６）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）を、実施例１のとおりに調製した。Ｗペプチド１および２を、実施例６のとおりに得た。さらに、以下のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列および短縮改変体（実施例８のとおりに調製される）を試験した：
ＣＣＸＰ１ 配列番号１
ＣＣＸＰ２ 配列番号２
ＣＣＸＰ３ 配列番号３
ＣＣＸＰ４ 配列番号４
ＣＣＸＰ５ 配列番号５
ＣＣＸＰ６ 配列番号６
ＣＣＸＰ７ 配列番号７
ＣＣＸＰ８ 配列番号８
ＣＣＸＰ９ 配列番号９
ＣＣＸＰ１０ 配列番号１０。
【０１４９】
全てのリガンドを、用量応答様式および所定のピークカルシウムフラックス応答で加えた。表８は、ＣＫβ８（２５−１１６）（配列番号１６）および特定のＳＨＡＡＧｔｉｄｅが、ＦＰＲＬ１トランスフェクト体中でカルシウム動員を誘導したことを示す。しかし、ＣＫβ８（１−１１６）（これは、遊離ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ Ｎ末端を含まない）は、有意な動員を生じなかった。このデータはまた、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのＮ末端が、ＦＰＲＬ１トランスフェクト体中のその活性のために重要であることを示す。短縮Ｎ末端を有するこれらのＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、非常に減少されたカルシウム動員を生じた。短縮Ｃ末端または置換Ｃ末端を有するＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、Ｎ末端の短縮後に観察されたのと同じ活性損失を示さなかった。
【０１５０】
（表８−ＦＰＲＬ１ Ｌ１．２細胞中のカルシウムフラックスの誘導（ＩＣ５０ −は、ＩＣ５０値は列挙されず、その配列は、活性が低いかまたは有意な活性がない）
【０１５１】
【表８】
（実施例１０ ＦＰＲＬ１−Ｌ１．２細胞上のケモカイン、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ短縮改変体の走化性活性）
ＦＰＲＬ１−Ｌ１．２細胞上のケモカイン（ＣＫβ８（１−９９）およびＣＫβ８（２５−９９）、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅｓ（配列番号１および配列番号２）およびＷペプチド１および２（実施例６のとおりに得られる）の走化性活性を、移動アッセイで決定した。このケモカインを実施例１のとおりに調製した。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列（配列番号１および配列番号２）を、実施例８のとおりに調製した。ＦＰＲＬ１−Ｌ１．２細胞を、実施例６のとおりに調製した。
【０１５２】
移動アッセイを、実施例５に記載されるプロトコルを使用して、９６ウエルＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）マイクロプレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）で実施した。配列番号１およびＣＫｂ８−１（２５−１１６）の両方が、トランスフェクト体に移動し、配列番号１およびＣＫｂ８−１（２５−１１６）は、このレセプターに対して機能的であることを示している。
【０１５３】
（実施例１１ ヒト単球および好中球上ののケモカイン、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび ａｎｄ ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ短縮改変体の走化性活性）
ケモカイン：ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８ （１−１１６）およびＣＫβ８（２５−１１６）；Ｗペプチド１および２ならびにＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列（配列番号１および配列番号２）のヒト単球および好中球上の走化性活性を、移動アッセイにおいて決定した。上記のペプチドを、前出の実施例のとおりに調製した。この移動アッセイを、実施例５に記載されるプロトコルを使用して、９６ウエルのＣＨＥＭＯＴＸ（登録商標）マイクロプレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）で実施した。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（配列番号１）およびＣＫｂ８−１（２５−１１６）は、好中球および単球の両方の移動を生じた。
【０１５４】
（参考文献）
【０１５５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、報告されているＦＰＲＬ１内因性低親和性リガンドおよび非天然リガンドを示す表である。
【図２】図２は、ヒトＣＣＬ２３／ＣＫβ８改変体と、ヒトＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１αおよびＣＣＬ３／ＭＩＰ−１δのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ホルミルペプチドレセプター様１レセプターに対するリガンドとして有用な組成物およびその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ケモカイン（走化性ケモカイン）は、病原との戦場に目印を付ける、Ｔリンパ球、好中球、およびマクロファージの動員および活性化についての分子ビーコンとして作用する。感染に対する抵抗を担う白色血液細胞である白血球の動員は、ケモカインの濃度に依存する。ケモカインは、多様な生物学的プロセス（白血球の輸送およびホーミング、免疫調節、造血、ならびに新脈管形成が挙げられる）を媒介する小タンパク質（８〜１０ＫＤ）のスーパーファミリーである。今日までに、２４のケモカインレセプターが知られている。ケモカインは、生来の免疫および炎症反応において基礎的な役割を果たしている（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら（１９９４）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら（１９９７）；Ｒｏｌｌｉｎｓ（１９９７））。４つのケモカインサブファミリーが、最初の２つの保存されたシステイン残基の間の距離；Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ３Ｃに基づいて記載されている。全ての公知のケモカインは、Ｇタンパク質共役レセプターおよびＧｉファミリーの百日咳毒素感受性ヘテロトリマーＧタンパク質に属する４つの群の７回膜貫通レセプター；ＸＣＲ、ＣＣＲ、ＣＸＣＲ、およびＣＸ３ＣＲを通じてシグナルを伝達する（Ｍｕｒｐｈｙら（２０００））。細胞外結合現象は、種々の応答（例えば、走化性）を導く特定のシグナル伝達経路を活性化し得る。ケモカイン系において、複数のケモカインが、単一のケモカインレセプターを活性化し得る。例えば、レセプターＣＣＲ１は、ＲＡＮＴＥＳ（活性化されると、発現される正常Ｔ細胞を調節する）、ＭＩＰ−１α（マクロファージタンパク質）、およびＭＩＰ−１βケモカインに結合する。同様に、単一のケモカインが、いくつかのレセプターを活性化し得る（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ（１９９９））。
【０００３】
炎症の病理および抗原提示において重要な役割を果たす単球および好中球は、ケモカインに応答する（Ｌｅｅら（２０００））。単球は、ケモカインレセプターＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ２、およびＣＸＣＲ４を発現する（Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉら（１９９５）；Ｗｅｂｅｒら（２０００））。リガンドＭＩＰ−１αおよび単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ１）は、インビトロでの強力な単球アクチベーターとして報告されている（Ｆａｎｔｕｚｚｉら（１９９９））。好中球は、多くの急性炎症の間に重要であり、そして免疫をＴｈ１応答に向かわせるのにも役割を果たし得る（Ｂｏｎｅｃｃｈｉら（１９９９））。それらは主に、いくつかのＣＸＣケモカインに応答するが、ほとんどのＣＣケモカインを移動させない。ヒト好中球は、２つの高親和性ＩＬ−８レセプター、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を発現する。
【０００４】
ケモカインＣＫβ８（ＣＣＬ２３；ｈｍｒｐ−２ａ；骨髄性前駆体阻害因子１（ＭＰＩＦ−１）；ＳＣＹＡ２３としても公知（現在の命名法およびゲノムＩＤシステム））は、６つのシステムを含む９９アミノ酸のＣＣケモカインである。ＣＫβ８は、肝臓、肺、膵臓、および骨髄において構成的に発現される。ＣＫβ８は、単球、樹状細胞、および休止リンパ球に対する走化性を有し（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎら（１９９７）））、骨髄由来の低増殖能コロニー形成細胞のコロニー形成を阻害する（Ｐａｔｅｌら（１９９７））。１１６アミノ酸長のＣＫβ８−１（ＣＫβ８の選択的スプライシング形態）が報告されている。ＣＫβ８およびＣＫβ８−１の両方の成熟形態は、ＣＣＲ１レセプターに対するリガンドとされている（Ｙｏｕｎら（１９９８））。単球および好酸球の交差脱感作研究は、ＣＫβ８−１がＣＣＲ１に優先的に結合することを示す。ＣＫβ８のＮＨ２末端でのさらなるプロセシングにより、ＣＣＲ１発現細胞に対して有意により活性な７６または７５残基のタンパク質が生じる（Ｍａｃｐｈｅｅら（１９９８）、Ｂｅｒｋｈｏｕｔら（２０００））。
【０００５】
ケモカインレセプターに加えて、好中球および単球はまた、Ｇタンパク質共役Ｎ−ホルミルペプチドレセプター（ＦＰＲ）およびそのホモログであるＮ−ホルミルペプチドレセプター様１（ＦＰＲＬ１）を発現する。ＦＰＲＬ１に対するリガンドは、ＦＰＲＬ１が最初にクリーニングされた当時未知であったので、ＦＰＲＬ１は、当初、孤児レセプターとして規定された（Ｂａｏら（１９９２）；Ｍｕｒｐｈｙら（１９９２）；Ｙｅら（１９９２））。それは、リポキシンＡ４に結合するという理由で、ＬＸＡ４レセプターとされた（Ｆｉｏｒｅら（１９９４））。さらに、いくつかの異なるペプチド／タンパク質が、低親和性でＦＰＲＬ１と結合することが報告されている（図１を参照のこと）。炎症の急性フェーズの間に分泌されるタンパク質である血清アミロイドＡは、中程度の親和性の機能的リガンドであると報告されている（Ｓｕら（１９９９））。βアミロイドフラグメント（１〜４２）および神経毒プリオンペプチド１０６〜１２６もまた、低親和性リガンドであり、このことは、ＦＰＲＬ１が、神経変性疾患において役割を果たし得ることを示す（Ｌｅら（２００１））。いくつかの他の低親和性リガンドとしては、以下が挙げられる：ＨＩＶエンベロープタンパク質由来のペプチド（Ｓｕら（１９９９）、Ｄｅｎｇら（１９９９）；およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉペプチドＨｐ（２〜２０）。いくつかの合成ペプチド（例えば、Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶｍ）およびＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＭ）（「Ｗペプチド１および２」））が、このレセプターに対する強力なリガンドとして報告されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅら（２００１）；Ｂａｅｋら（１９９６））。しかし、ランダムヘキサペプチドライブラリー由来の非天然ペプチドは、生理学的に関連することが示されなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明者らは、ＣＫβ８−１の短縮改変体ＣＫβ８−１（２５−１１６）が、ホルミルペプチドレセプター様１レセプター（ＦＰＲＬ１）に対する機能的リガンドとしてのその役割を通じて、炎症反応および生来の免疫に関与することを発見した。さらに、本発明者らは、ＣＫβ８−１（２５−１１６）と共に、ＦＰＲＬ１を発現することが知られている両方の細胞において機能的なＣＫβ８−１の選択的スプライシングを受けたエキソン（ＳＨＡＡＧｔｉｄｅと呼ぶ）、ならびに短縮ＳＡＡＧｔｉｄｅおよび他のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体を発見した。機能的なＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、白血球において、レセプター−リガンド結合の際に、カルシウムフラックスを生じ、そして単球、好中球、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）および未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を誘引する。
【０００７】
１つの実施形態において、本発明は、ＳＨＡＡＧｉｄｅならびにＳＨＡＡＧｉｄｅを含むタンパク質およびペプチド（ＣＫβ８−１（２５−１１６）を除く）を包含する。さらに、本発明はまた、ＳＨＡＡＧｉｄｅを含むタンパク質およびペプチドをコードする核酸、ＳＨＡＡＧｉｄｅに特異的に結合する抗体、ならびにＳＨＡＡＧｉｄｅを含む融合タンパク質を包含する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、ＳＨＡＡＧｉｄｅまたはＳＨＡＡＧｉｄｅ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを含む組成物を包含する。このような組成物としては、ＦＰＲＬ１活性を増強するために被験体に投与するのに適した組成物が挙げられる。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明は、このような組成物を包含するキットを包含する。このようなキットは、例えば、薬学的組成物の投与を容易にするよう編集される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、ＳＨＡＡＧｉｄｅもしくはＳＨＡＡＧｉｄｅ配列を含むタンパク質またはペプチドで構成される化合物を投与することによって、ＦＰＲＬ１レセプターの活性を調節する工程を包含する、被験体の障害を処置する方法を包含する。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、アゴニストを同定するのに有用な方法およびキットを包含する。このようなアゴニストもまた本発明によって包含される。このような方法は、候補アゴニスト分子の存在下で、生物学的に活性なＳＨＡＡＧｉｄｅ、またはＳＨＡＡＧｉｄｅ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを含む組成物を、ＦＰＲＬ１レセプターと接触させる工程を包含する。ＦＰＲＬ１レセプター機能に対するアゴニストは、候補化合物の存在下で観察されるレセプター活性と比較して、活性を減少する化合物として同定され得る。
【００１２】
（詳細な説明）
本発明者らは、ＣＫβ８−１短縮改変体である、ＣＫβ８−１（２５−１１６）が、２つの異なるＧＰＣＲ（ケモカインレセプターＣＣＲ１およびホルミルペプチドレセプター様１レセプター（ＦＰＲＬ１））に対する二機能的リガンドであることを発見した。本発明者らはまた、ＣＣＲ１リガンドとしての活性に加えて、ＣＫβ８−１（２５−１１６）が、単球および好中球をＦＰＲＬ１に対する機能的リガンドとしてのその役割を介して補充することによって、炎症反応および免疫に関与することを発見した。ＣＫβ８は、細胞（単球、樹状細胞および休止リンパ球を含む）を、ＯＣＲ１を介して攻撃するが、ＣＫβ８−１（２５−１１６）（ＳＨＡＡＧチド）配列において見出される選択的にスプライシングされたエキソンを欠く。ＣＫβ８の選択的スプライシング形態（１１６アミノ酸）である、ＣＫβ８−１（１−１１６）は、ＣＫβ８と同様に、ＣＣＲ１レセプターに対する機能的リガンドである。しかし、ＣＫβ８−１（１−１１６）は、ＳＨＡＡＧチド配列を介しては、その機能を発揮しない。
【００１３】
本発明者らはまた、新規なペプチド（ＳＨＡＡＧチドペプチドおよびＳＨＡＡＧチドペプチドの改変体（以降は、まとめて「ＳＨＡＡＧチド」として知られる））のクラスである、ＣＣケモカインＣＣＬ２３のスプライスエキソン、ＣＫβ８−１（２５−１１６）の短縮変異体、（これは、驚くべきことに、ＦＰＲＬ１レセプターに対する有効で価値あるリガンドである）を発見した。これらのペプチドは、ＦＰＲＬ１を発現する白血球において、カルシウムフラックスを生じる。さらに、ＳＨＡＡＧチドは、細胞（単球、好中球、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）および未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）、ならびに他のリンパ球サブセットを含む）を効率的に引きつける。ＳＨＡＡＧチドペプチド（配列番号１）および特定のＳＨＡＡＧチド改変体は、親ケモカインＣＫβ８−１（２５−１１６）と共に、ＦＰＲＬ１を発現することが知られている単球および好中球の両方に対して機能的である。機能的ＳＨＡＡＧチドは、リンパ球においてレセプターリガンド結合の際に、カルシウムフラックスを生成し、そして、走化性アッセイにおいて、単球、好中球、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）および未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を引きつける。これらの観察を考慮すると、ＳＨＡＡＧチドは、潜在的な機能的ペプチド（従って、これは、ＦＰＲＬ１リガンドとして驚くほど有効である）を示す。
【００１４】
本発明は、ＳＨＡＡＧチド、ならびにＣＫβ８−１（２５−１１６）およびＣＫβ８−１（１−１１６）以外の、ＳＨＡＡＧチドを含むタンパク質およびペプチドを包含する。さらに、本発明はまた、ＳＨＡＡＧチドをコードする核酸、ならびにＣＫβ８−１（２５−１１６）およびＣＫβ８−１（１−１１６）をコードする核酸以外の、ＳＨＡＡＧチドを含むタンパク質およびペプチドをコードする核酸を含む。ＳＨＡＡＧチド、ならびにＣＫβ８−１（２５−１１６）を含む、ＳＨＡＡＧチドを含むタンパク質およびペプチドを含有する組成物もまた、本発明に含まれる。このような組成物は、ＦＰＲＬ１活性を増大するために被験体に投与するのに適切な組成物を包含する。このような組成物を含むキットもまた、包含される。このようなキットは、例えば、薬学的組成物の投与を容易にするように構築され得る。
【００１５】
本発明はまた、炎症反応および先天免疫の刺激を必要とする被験体を処置する方法を包含する。このような活性の刺激は、疾患（例えば、感染性疾患）に罹患している被験体に（および、同時係属中の特許出願「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」（２００２年５月７日出願、代理人参照番号１０７０９／２３）に記載されるような、ワクチン摂取においても）、役立ち得る。このような方法は、ＳＨＡＡＧチド、ＳＨＡＡＧチドを含むペプチドまたはタンパク質、または他の刺激分子を含む組成物を投与することによって、ＦＰＲＬ１レセプターを刺激する工程を包含する。
【００１６】
本発明はまた、炎症反応および先天免疫の下方制御を必要とする被験体を処置する方法を包含する。このような活性の下方制御は、疾患（神経変性障害（例えば、アルツハイマー病またはクロイツフェルト−ヤーコプ病）を含む）に罹患している被験体に役立ち得る。このような方法は、ＦＰＲＬ１レセプター機能に対するアンタゴニストを含む組成物を投与することによって、ＦＰＲＬ１レセプターを下方制御する工程を包含する。
【００１７】
このようなアンタゴニストを同定するための方法およびキットもまた、本発明に包含される。このような方法は、ＦＰＲＬ１レセプターを、生物学的に活性なＳＨＡＡＧチド配列、活性ＳＨＡＡＧチドを含むペプチドまたはタンパク質を含む組成物と、候補アンタゴニスト分子の存在下で接触させる工程を包含する。ＦＰＲＬ１レセプター機能に対するアンタゴニストは、候補化合物の非存在下で観察されるレセプター活性と比較して、レセプター活性を減少させる化合物として同定され得る。このような方法は、インビトロで実施されてもインビボで実施されてもよい。さらに、キットは、このようなインビトロ試験またはインビボ試験を容易にするように構築され得る。
【００１８】
（ＳＨＡＡＧチドおよびＳＨＡＡＧチドを含む分子）
（ＳＨＡＡＧチドを含むＳＨＡＡＧチドペプチドおよびＳＨＡＡＧチドポリペプチド）
表１は、ＳＨＡＡＧチドポリペプチド配列（配列番号１）、ならびに特定のＳＨＡＡＧチド短縮改変体および他の改変体のポリペプチド配列を示す。表２は、ＳＨＡＡＧチドポリヌクレオチド配列（配列番号１２）およびＳＨＡＡＧチド短縮改変体および他の改変体のポリヌクレオチド配列を示す。表３は、ヒトＣＫβ８−１（２５−１１６）ヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。図２は、ヒトＣＣＬ２３／ＣＫβ８改変体（ＣＫβ（１−９９）−配列番号１３；ＣＫβ（２５−９９）−配列番号１４；ＣＫβ（１−１１６）−配列番号１５；ＣＫβ（２５−１１６）−配列番号１６）の、ヒトＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１α（配列番号１９）；ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１δ（配列番号１７）およびロイコタクチン（ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ）（配列番号１８）との、アミノ酸配列アライアメントを示す。４個の保存的システイン残基が、四角で囲って示され、そして２個のさらなるシステイン（通常は、ＣＣケモカインファミリーにおいて見出されない）は、破線で囲って示される。ＣＣＬ２３／ＣＫβ８−１の選択的スプライシングエキソンが、下線を付けて示される。
【００１９】
（表１ ＳＨＡＡＧチドならびに種々の短縮改変体および他の改変体−アミノ酸配列）
【００２０】
【表１】
（表２ ＳＨＡＡＧチドならびに種々の短縮改変体および他の改変体−ポリヌクレオチド配列）
【００２１】
【表２】
（表３ ヒトＣＫβ８−１（２５−１１６）ヌクレオチド配列（配列番号１２））
【００２２】
【表３】
（ＳＨＡＡＧチド分子、誘導体およびアナログ）
本発明のＳＨＡＡＧチドペプチドは、表１に列挙される分子を含む。さらにＳＨＡＡＧチドペプチドおよびヌクレオチドの種々の他の改変体が、標準的な技術を使用して合成され得る。誘導体は、直接的に、または改変もしくは部分的置換によってのいずれかで、ネイティブの化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブの化合物と同一ではないものの類似している構造を有するが、特定の成分または側鎖においてネイティブの化合物とは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成され得るか、または異なる進化起源由来であり得る。
【００２３】
誘導体およびアナログは、誘導体またはアナログが改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長または全長以外であり得る。例えば、配列番号３は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子（配列番号１）の最初のＮ末端１５アミノ酸のみを含む。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの核酸またはペプチドの誘導体またはアナログとしては、同じサイズの核酸の配列もしくはアミノ酸の配列にわたって、または相同性アルゴリズムによって整列が行われる整列配列と比較された場合に、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性でもって、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの核酸またはペプチドに対して実質的に相同である領域を含む分子、あるいはそのコード核酸が、上記のペプチド配列をコードする相補的配列に対してストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、もしくは低ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る分子が挙げられるがこれらに限定されない（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）。相補的核酸分子は、配列に対して充分に相補的であって、その結果、ミスマッチがほとんどなく水素結合が形成されて安定な二重鎖を形成する核酸分子である。「相補的」とは、ヌクレオチド間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合をいう。
【００２４】
相補的フラグメントをハイブリダイズする１本鎖ＤＮＡの特異性は、反応条件の「ストリンジェンシー」によって決定される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ＤＮＡ二重鎖を形成する傾向が低下するにつれて、増大する。核酸ハイブリダイゼーション反応では、ストリンジェンシーは、いずれかの特異的ハイブリダイゼーション（高ストリンジェンシー）に好都合なように選択され得、特異的ハイブリダイゼーションは、例えば、全長クローンをライブラリーから同定するために用いられ得る。より特異性の低いハイブリダイゼーション（低ストリンジェンシー）は、関連しているが正確ではない（相同であるが同一ではない）ＤＮＡ分子またはセグメントを同定するために用いられ得る。
【００２５】
ＤＮＡ二重鎖は、以下によって安定化される：（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対の種類、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、および（５）特定の有機溶媒（例えば、ＤＮＡ二重鎖の安定性を低下させるホルムアミド）の存在。一般に、プローブが長くなるほど、適切なアニーリングに必要な温度は高くなる。一般的アプローチは、温度を変更することである：より高い相対温度は、よりストリンジェントな反応条件をもたらす。（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）は、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの優れた説明を提供する。
【００２６】
「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズするとは、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列がハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションプロトコルをいう。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に対して相補的であるプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時にはこのプローブの５０％が占有される。
【００２７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列のみにハイブリダイズするのを可能にする。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、そして異なる。ストリンジェントな条件としては、以下が挙げられる：（１）低いイオン強度および高い温度での洗浄（例えば、５０℃での、１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）；（２）ハイブリダイゼーションの間の変性剤（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５；４２℃での７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）；または（３）５０％ホルムアミド。洗浄はまた代表的に、４２℃での５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を含み、そして４２℃での０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での洗浄、および５５℃での５０％ホルムアミド中での洗浄、続いて、５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を含む。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が代表的に、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。これらの条件は、例として提示され、限定されることは意味しない。
【００２８】
「中程度にストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチドが配列番号７〜１２、１４の全体、フラグメント、誘導体またはアナログにハイブリダイズするように、より低いストリンジェントの、洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）を用いる。一例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて３７℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を含む。温度、イオン強度などは、実験要因（例えば、プローブ長さ）に適応するように調整され得る。他の中程度のストリンジェンシー条件は記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０）。
【００２９】
「低ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチドが配列番号７〜１２、１４の全体、フラグメント、誘導体またはアナログにハイブリダイズするように、中程度のストリンジェンシーについての洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い、洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）を使用する。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、４０℃での３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸中でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃にて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。低ストリンジェンシーの他の条件（例えば、種間交叉ハイブリダイゼーションのための低ストリンジェンシー条件）が充分に記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１）。
【００３０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、配列番号１への変異によって、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ機能を有意には変更しない、コードされるＳＨＡＡＧｔｉｄｅのアミノ酸配列の変更を受ける変化が導入され得る。例えば、Ｃ末端アミノ酸残基でのアミノ酸置換が、配列番号６の配列において行われている。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更されにくいと予想される。保存的置換が行われ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【００３１】
有用な保存的置換を、表４の「好ましい置換」に示す。１つのクラスのアミノ酸が、同じ種類の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、置換がその化合物の生物学的活性を実質的に変更しない限り、本発明の範囲内に入る。
【００３２】
【表４】
以下に影響を与える非保存的置換は、特に、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列が、より大きなポリペプチド分子の一部分を含む場合、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ機能を改変し得る：（１）ポリペプチド骨格の構造（例えば、βシートまたはαヘリックスコンホメーション）、（２）電荷、（３）疎水性、または（４）標的部位の側鎖のかさ。残基は、表５に示されるような一般的側鎖特性に基づいて分類される。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つからのメンバーの、別のクラスのメンバーでの交換を伴う。置換は、保存的置換部位に導入され得るか、より好ましくは非保存的部位に導入され得る。
【００３３】
（表５ アミノ酸分類）
【００３４】
【表５】
改変体ポリペプチドは、オリゴヌクレオチド媒介性（部位指向性）変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異誘発のような、当該分野で公知の方法を使用して生成され得る。部位指向性変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，１９８７）、カセット変異誘発、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、１９８５）または他の公知の技術は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体ＤＮＡを産生するためにクローン化されたＤＮＡ上で実施され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）。
【００３５】
本発明の「単離された」または「精製された」ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、その天然の環境の成分から分離および／または回収された、ポリペプチド、タンパク質または生物学的に活性なフラグメントを含む。単離されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、遺伝子操作された細胞において異種発現されるＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはインビトロで発現されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。
【００３６】
夾雑物成分は、代表的には、ポリペプチドについての診断用途または治療用途に干渉する物質を含む。実質的に単離されるためには、調製物は、３０乾燥重量％未満の非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ夾雑性物質（夾雑物）、より好ましくは、２０乾燥重量％未満の夾雑物、１０乾燥重量％未満の夾雑物、そして最も好ましくは、５乾燥重量％未満の夾雑物を有する。
【００３７】
目的のポリペプチドおよびフラグメントは、例えば、ベクター（例えば、細菌、ウイルスおよび真核生物細胞）を介する発現による、当該分野で周知の任意の方法によって産生され得る。さらに、インビトロ合成（例えば、ペプチド合成）もまた、使用され得る。
【００３８】
「活性ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント」は、生物学的活性および／または免疫学的活性を、表Ｉに示されるＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの活性と同様に保持するが、同一である必要はない。このポリペプチド自体であってＳＨＡＡＧｔｉｄｅがＦＰＲＬ１活性を誘発または増強することにおける実際の生物学的な役割ではない本議論の背景において、免疫学的活性は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ抗原性エピトープに対する特異的な抗体がＳＨＡＡＧｔｉｄｅを結合する場合のＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの１局面を参照する。生物学的活性は、ネイティブなＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドによって引き起こされる、阻害性機能または刺激性機能のいずれかを参照する。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの生物学的活性としては、例えば、ＦＰＲＬ１レセプターに対する結合、またはＦＰＲＬ１レセプター結合の際の走化性もしくはカルシウムフラックスの誘発が挙げられる。特定の生物学的アッセイ（実施例を参照のこと）は、用量依存性を有しても有さなくても、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ活性を決定するために使用される。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を単離すること、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのコード部分を発現すること（例えば、インビトロでの組換え発現によって）およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドのコード部分の活性を評価することによって調製され得る。
【００３９】
一般的に、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド改変体は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド様機能を保存し、配列における特定の位置の残基が他のアミノ酸に置換される任意の改変体を含み、親タンパク質の２つの残基の間にさらなる残基を挿入する可能性および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を、さらに含む。任意の、アミノ酸置換、挿入、または欠失は、本発明によって包含される。好都合な環境において、置換は、上に定義されるような保存的置換である。
【００４０】
表１は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列のＣ末端でのアミノ酸の欠失が、Ｎ末端での欠失よりＦＰＲＬ１活性の喪失を引き起こす可能性がより低いことを示す（実施例９を参照のこと）。例えば、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列の１１個のＮ末端アミノ酸からなる配列番号８は、なお中程度のＦＰＲＬ１活性を保持する。しかし、３個のＮ末端アミノ酸の欠失（配列番号２）は、低いＦＰＲＬ１活性のみを生じる。それにも関わらず、Ｎ末端での末端アミノ酸の欠失（配列番号１１）は、ＦＰＲＬ１活性の完全な消失を生じない。
【００４１】
「ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体」は、少なくとも以下を有する活性なＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを意味する：（１）全長ネイティブ配列のＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド配列と約８０％のアミノ酸配列の同一性、または（２）全長ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド配列の任意のフラグメント。例えば、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド改変体は、１つ以上のアミノ酸残基が付加されたか、または全長ネイティブアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端で欠失され、但し、ＣＫβ８およびＣＫβ８−１に同一なこれらのフラグメントを除く、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを含む。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド改変体は、全長ネイティブ配列のＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは、約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。通常は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば、少なくとも約２０アミノ酸長、よりしばしば、少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、または３００アミノ酸長以上である。
【００４２】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、２つの配列が整列される場合、候補配列中のアミノ酸残基と同一である、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。％アミノ酸同一性を決定するために、配列が整列され、必要な場合、ギャップが、導入され、最大の％配列同一性を達成し；保存的置換は、配列同一性の一部として考慮されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列整列手順は、当業者に周知である。しばしば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）は、ペプチド配列を整列するために使用される。
【００４３】
アミノ酸配列が整列される場合、所定のアミノ酸配列Ｂへの、所定のアミノ酸配列Ｂと、または所定のアミノ酸配列Ｂに対する、所定のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（これは、代替的に、所定のアミノ酸配列Ｂに、所定のアミノ酸配列Ｂと、または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、特定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所定のアミノ酸配列Ａとして表され得る）は、以下のように計算され得る：
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ １００
ここで、
Ｘは、配列アライメントプログラムまたはアルゴリズムの、ＡとＢとのアライメントによって同一の一致として評価された、アミノ酸残基の数であり、そして
Ｙは、Ｂにおける全アミノ酸残基数である。
【００４４】
アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性に等しくない。
【００４５】
融合ポリペプチドは、発現研究、細胞局在化、バイオアッセイ、およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ精製において有用である。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ「キメラタンパク質」またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ「融合タンパク質」は、非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドに融合されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドに対して実質的に相同ではない。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ融合タンパク質は、全ＳＨＡＡＧｔｉｄｅに対する任意の部分を含む、任意の数の生物学的に活性な部分を含む。例えば、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合され得る。このような融合タンパク質は、組換えＳＨＡＡＧｔｉｄｅの精製を容易にする。特定の宿主（例えば、哺乳動物）において、異種シグナル配列融合体は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ発現および／または分泌を改善し得る。
【００４６】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ改変体の配列に特異的な抗体もまた、本発明によって包含される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（結合フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）２）および単鎖バージョンを包含する）を産生する方法は周知である。それゆえ、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、標準技術によって調製され得る。
【００４７】
本発明の走化性組成物は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を含む、１以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。１つの実施形態では、この組成物は、単離ポリヌクレオチドもしくは単離ポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドもしくは組換えポリペプチドであるＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。１つの実施形態では、このＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、この組成物中の主な（すなわち、この組成物中のこのクラスの分子のメンバーの合計の約５０重量％を超える、よりしばしば約８０重量％を超える）種（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖質）である。本発明の走化性組成物は、（天然に存在する場合）インサイチュの環境でＳＨＡＡＧｔｉｄｅｓに通常会合している物質を含まないＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。
【００４８】
単離されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅ核酸分子は、天然に見出される状況から精製され、そして少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離される。単離されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子は、特定のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子とは区別される。なぜなら、特定のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子は、細胞中に存在するからである。
【００４９】
（疾患の処置におけるＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物の使用）
本発明は、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたはＦＰＲＬ１リガンド活性に関連した障害の危険性がある（もしくは感受性である）かまたはこの障害を有する被験体を処置する、予防方法および治療方法の両方を提供する。例としては、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病）が挙げられる。
【００５０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含むタンパク質もしくはペプチド、またはＦＰＬＲ１−ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ相互作用のインヒビターもしくはアゴニストを用いて処置され得る、ヒトまたは他の種の疾患または状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：末梢の慢性炎症関連疾患（例えば：慢性炎症；血栓症；アテローム性動脈硬化症；再狭窄；慢性静脈不全；再発性細菌感染；敗血症；皮膚感染；腎臓病；糸球体腎炎；線維性肺疾患；アレルギー疾患；ＩＢＳ；慢性関節リウマチおよび急性細気管支炎）。中枢神経系−大膠細胞および小膠細胞関連疾患（例えば：神経変性疾患；アルツハイマー病；多発性硬化症；パーキンソン病；神経炎症；ＨＩＶ関連神経学的疾患；ＨＩＶ関連痴呆；ＣＮＳ細菌感染症；脳トキソプラスマ；アカントアメーバ感染症；リステリア感染症；プリオン病；亜急性海綿状脳障害および黄斑変性もまた処置され得る。
【００５１】
上昇したＦＰＲＬ１レベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。アンタゴニストは、治療様式または予防様式で投与され得る。用いられ得る治療剤としては、以下が挙げられる：（１）不活性ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログを含む分子；（２）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅアンチセンス核酸；（３）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログに対する抗体、あるいは（４）ＦＰＲＬ１レセプターの活性を拮抗するモジュレーター（すなわち、インヒビターおよびアンタゴニスト）。
【００５２】
低下したＦＰＲＬ１レベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を上昇させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的に投与され得る。用いられ得る治療剤としては、ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティを上昇させるアゴニストが挙げられる。用いられ得る治療剤としては、以下が挙げられる：（１）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログを含む分子；（２）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ核酸；あるいは（３）ＦＰＲＬ１レセプターの活性をアゴナイズするモジュレーター。
【００５３】
本発明は、ＦＰＲＬ１活性を調節する薬剤を投与することによる、被験体における、異常なＦＰＲＬ１レセプター発現または異常なＦＰＲＬ１レセプター活性に関連した疾患または状態を予防するための方法を提供する。異常なＦＰＲＬ１活性によって引き起こされるかまたはそれに起因する疾患の危険性のある被験体は、例えば、診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定され得る。予防薬剤の投与は、ＦＰＲＬ１異常に特有の症状の発現前に行われ得、その結果、疾患または症状が予防されるかあるいはその進行が遅延される。ＦＰＲＬ１異常の型に依存して、例えば、ＦＰＲＬ１アゴニストまたはＦＰＲＬ１アンタゴニストを用いて、その被験体を処置し得る。適切な薬剤は、スクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【００５４】
本発明の別の局面は、治療目的でＦＰＲＬ１活性を調節する方法に関する。調節方法は、細胞を、この細胞に関連したＦＰＲＬ１活性のうちの１以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＦＰＲＬ１活性を調節する薬剤は、核酸もしくはタンパク質、ＦＰＲＬ１の天然に存在する同属リガンド、ペプチド、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチド模倣物または他の低分子であり得る。この薬剤は、ＦＰＲＬ１活性を刺激し得る。この薬剤は、ＦＰＲＬ１活性を阻害し得る。調節方法は、インビトロで（例えば、この細胞をこの薬剤を伴って培養することによる）、あるいはインビボで（例えば、この薬剤を被験体に投与することによる）行われ得る。例えば、この方法は、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ１リガンドの低減したかまたは異常な発現または活性を補償するために、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたは核酸分子を治療として施すことを包含し得る。
【００５５】
ＦＰＲＬ１活性の刺激は、ＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ１リガンドが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ１リガンドの活性の上昇が有益な効果を有するようである状況で（例えば、感染を処置する際またはワクチン接種の際に）望ましい。逆に、低下したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ１リガンド活性は、ＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ１リガンドの活性が異常にアップレギュレートされる状態および／またはＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ１リガンドの活性の低下が、有益な効果を有するようである状態で（例えば、慢性炎症を処置する際に）望ましい。
【００５６】
適切なインビトロまたはインビボでのアッセイは、特定の治療の効果、およびその投与がその罹患組織の処置に示されるか否かを決定するために実施され得る。
【００５７】
種々の特定の実施形態では、インビトロアッセイは、患者の障害に関与する代表的細胞型について、所定の治療が、その細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定するために実施され得る。治療における使用様式は、ヒト被験体における試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、イヌなどを含むがこれらに限定されない適切な動物モデル系で試験され得る。同様に、インビボでの試験について、当該分野で公知の動物モデル系のいずれかを、ヒト被験体への投与前に用い得る。
【００５８】
炎症および感染に関連した疾患および状態は、本発明の方法を用いて処置され得る。
この疾患または状態は、免疫応答を調節するために、ＦＰＲＬ１レセプターに対するＦＰＲＬ１リガンドの作用が阻害または促進されるべき、疾患または状態である。
【００５９】
本発明の組成物は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、クモ膜下槽内での注射もしくは注入、皮下注射、または移植）、吸入スプレー、鼻腔内、腟内、直腸、舌下、または局所の投与経路によって投与され得、そして各投与経路について適切な、従来の無毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントおよびビヒクルを含む適切な投薬量単位の処方物中に単独または一緒に処方され得る。温血動物（例えば、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サルなど）の処置に加えて、本発明の組成物は、ヒトにおける使用のために有用である。
【００６０】
ＦＰＬＲ１またはＦＰＬＲ１リガンドの活性を調節し、それによって、感染性疾患または炎症性障害および炎症性疾患を予防および処置するための組み合わせ療法は、本発明の化合物およびこのような有用性が公知の他の化合物の組み合わせによって例示される。
【００６１】
例えば、炎症の処置または予防において、本発明の化合物は、以下ものと組み合わせて使用され得る：抗炎症薬剤または鎮痛薬剤（例えば、オピエートアゴニスト）、リポキシゲナーゼインヒビター（例えば、５−リポキシゲナーゼインヒビター）、シクロオキシゲナーゼインヒビター（例えば、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター）、インターロイキンインヒビター（例えば、ＴＮＦα、インターロイキン−１インヒビター）、ＮＭＤＡアンタゴニスト、一酸化窒素のインヒビターまたは一酸化窒素合成インヒビター、非ステロイド抗炎症薬剤、またはサイトカイン抑制抗炎症薬剤、例えば、化合物（例えば、アセトアミノフェン、アスピリン、コデイン、フェンタニール、イブプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、モルヒネ、ナプロキセン、フェナセチン、ピロキシカム、ステロイド鎮痛薬、サフェンタニル、スリンダク（ｓｕｎｌｉｎｄａｃ）、テニダプなど）。同様に、例示の化合物は、以下の疼痛緩和物とともに投与され得る：増強剤（例えば、カフェイン、Ｈ２アンタゴニスト、シメチコン、水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウム；充血緩和剤（例えば、フェニルエフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、またはｌｅｖｏ−デスオキシ−エフェドリン）；鎮咳薬（ａｎｔｉ−ｉｔｕｓｓｉｖｅ）（例えば、コデイン、ヒドロコドン、カラミフェン、カルベタペンタン、またはデキストロメトルファン）；ステロイド；シクロスポリンＡ；メトトレキサート；ＩＬ−１０；利尿剤；および鎮痛生抗ヒスタミンまたは非鎮痛性抗ヒスタミン）。
【００６２】
（薬学的組成物）
ＦＰＲＬ１レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、薬学的組成物へ組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、アゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など（Ｇａｎｎａｒｏ（２０００））を含む。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。通常の媒体または薬剤が、活性化合物に適合しない場合を除いて、これらの組成物の使用は、意図される。補助活性化合物もまた、組成物へと組み込まれ得る。
【００６３】
アゴニストまたはアンタゴニストの薬学的組成物は、その意図する投与経路（静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮的（すなわち、局所的）投与、経粘膜投与、および直腸投与を含む）に適合するように処方される。非経口適用、皮内適用、または皮下適用について使用される溶液または懸濁液としては、以下が挙げられ得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水）、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）、および張度の調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）により調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨て注射器または複数用量バイアルに封入され得る。
【００６４】
注入に適した薬学的組成物としては、滅菌注入可能な溶液または分散媒の即座の調製のための滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散媒および滅菌粉が挙げられる。静脈内投与について、適したキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、かつ、注射器を使用して投与されるような流体であるべきである。このような組成物は、製造および貯蔵の間、安定であるべきであり、かつ、微生物（例えば、細菌および真菌）からの汚染に対して保存されなければならない。このキャリアは、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール）、および適切な混合物。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レクチン）を使用することによって、分散物の場合では必要とされる粒子サイズを維持することによって、そして、界面活性剤を使用することによって維持され得る。種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサール）は、微生物汚染を含み得る。等張剤（例えば、糖類、ポリアルコール（マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）および、塩化ナトリウム）は、組成物中に含まれ得る。吸収を遅延させ得る組成物としては、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような薬剤が挙げられる。
【００６５】
滅菌注入可能な溶液は、必要とされる成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に、必要とされる量の活性化合物を組み込むことによって調製され得、次いで、滅菌される。一般的に、分散物は、基礎となる分散媒および他の必要とされる成分を含む滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって、調製される。滅菌注入可能な溶液の調製のための滅菌粉体、調製の方法は、滅菌溶液から、活性成分を含む粉体および任意の所望の成分を生じる減圧乾燥および凍結乾燥を含む。
【００６６】
経口組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療的投与のために、活性化合物は、賦形剤に組み込まれ得、そして、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のための流体キャリアを使用して調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口的に適用される。薬学的に適合する結合薬剤、および／またはアジュバント物質が、含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の任意の成分、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ）、またはコーンスターチ；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳＴＥＲＯＴＥＳ）；滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、ショ糖またはサッカリン）；または芳香剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料）。
【００６７】
吸入による投与について、化合物は、噴霧器、または適切な推進薬（例えば、二酸化炭素のようなガス）を含む加圧容器からのエアロゾルスプレーとして送達される。
【００６８】
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的なものであり得る。経粘膜的投与または経皮的投与について、標的障害を透過し得る浸透剤が、選択される。経粘膜的浸透剤としては、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。鼻スプレーまたは坐剤が、経粘膜的投与のために使用され得る。経皮的投与について、活性化合物は、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【００６９】
化合物はまた、坐剤（例えば、基材（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド）を有する）または直腸送達のための保持浣腸の形態で調製され得る。
【００７０】
１つの実施形態において、活性化合物は、体内からの迅速な排除に対して化合物を保護するキャリア（例えば、徐放処方物（移植片およびマイクロカプセル化送達システムを含む））と共に調製される。生分解性ポリマーまたは生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が使用され得る。ポリエチレングリコール類（例えば、ＰＥＧ）はまた、良好なキャリアである。このような物質は、ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびＮＯＶＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｅｌｓｉｎｏｒｅ、ＣＡ）からの市販品で入手され得るか、または、当業者によって調製され得る。リポソーム懸濁液はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者に対して公知の方法（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら米国特許第４，５２２，８１１号、１９８５における方法）に従って調製され得る。
【００７１】
単位投薬形態における経口処方物または非経口組成物が、生成され、投与および投薬均一性を容易にし得る。単位投薬形態とは、処置されるべき被験体に対する単回投薬として適した物理的に個別の単位をいい、これは、必要とされる薬学的キャリアと合わさった治療有効量の活性化合物を含む。本発明の単位投薬形態の仕様は、活性化合物の特性および特定の所望される治療効果、ならびに活性化合物を調剤する際の固有の制限によって規定され、そして、それらに直接依存する。
【００７２】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの核酸分子は、ベクターに挿入され得、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所的投与によって（ＮａｂｅｌおよびＮａｂｅｌ，米国特許第５，３２８，４７０号，１９９４）、または定位注射（Ｃｈｅｎら（１９９４））によって被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤を含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる遅延放出マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトな状態で生成され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、その薬学的調製物は、遺伝子送達系を生成する１つ以上の細胞を含み得る。
【００７３】
１つの局面において、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、そのポリペプチドが、インサイチュで生成されるようなＤＮＡとして送達される。１つの実施形態において、そのＤＮＡは、例えば、Ｕｌｍｅｒら（１９９３）において記載され、Ｃｏｈｅｎ（１９９３）により総説されるように「裸」である。裸のＤＮＡの取り込みは、そのＤＮＡを、細胞へと効率的に輸送されるキャリア（例えば、生分解性ビーズ）上にコーティングすることによって増大され得る。このようなワクチンにおいて、そのＤＮＡは、核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系を含む、当業者に公知の任意の種々の送達系内に存在し得る。
【００７４】
生物から生物へと遺伝物質を輸送するために使用されるベクターは、２つの一般的クラスに分けられ得る：クローニングベクターは、適切な宿主細胞における増殖に必須ではなく、外来ＤＮＡが挿入され得る領域を有する、複製するプラスミドまたはファージである；外来ＤＮＡは、ベクターの成分であるかのように複製および増殖される。発現ベクター（例えば、プラスミド、酵母、または動物ウイルスゲノム）は、外来遺伝物質を、外来ＤＮＡ（例えば、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ）を転写および翻訳するために、宿主細胞または組織に導入するために使用される。発現ベクターにおいて、その導入されるＤＮＡは、挿入されるＤＮＡを転写するように宿主細胞にシグナル伝達するプロモーターのようなエレメントに、作動可能に連結される。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導性プロモーターのようないくつかのプロモーターは、極めて有用である。誘導性プロモーターに作動可能に連結しているＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリヌクレオチドは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドまたはフラグメントの発現を制御し得る。伝統的な誘導性プロモーターの例としては、α−インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、およびステロイド（例えば、グルココルチコイド（Ｋａｕｆｍａｎ，１９９０．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：４８７−５１１．））およびテトラサイクリンに応答するプロモーターが挙げられる。他の所望される誘導性プロモーターとしては、構築物が導入される細胞に対して内因性ではないが、誘導剤が外来から供給される場合にそれらの細胞において応答性であるプロモーターが挙げられる。一般に、有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドである。しかし、他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス））が企図される。
【００７５】
ベクターの選択は、使用される生物または細胞およびベクターの所望の結末により決定される。ベクターは、標的細胞において１回複製してもよいし、「自殺」ベクターであってもよい。一般に、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列を含む。
【００７６】
薬学的組成物は、ＦＰＲＬ１関連状態の処置において通常適用される、本明細書中に記載される他の治療的に活性な化合物をさらに含み得る。
【００７７】
ＦＰＲＬ１調節を要する状態の処置または予防において、アゴニストまたはアンタゴニストの適切な投薬レベルは、一般に、１日あたり、約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、単一用量または複数用量にて投与され得る。好ましくは、この投薬レベルは、１日あたり約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇであり；より好ましくは、１日あたり約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。適切な投薬レベルは、１日あたり約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１日あたり約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、または１日あたり約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、この投薬量は、１日あたり、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜５ｍｇ／ｋｇまたは５〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。経口投与については、この組成物は、好ましくは、処置される患者に対する投薬量の症状による調節のために、１．０〜１０００ｍｇの活性成分、特に、１．０ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２０．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、７５．０ｍｇ、１００．０ｍｇ、１５０．０ｍｇ、２００．０ｍｇ、２５０．０ｍｇ、３００．０ｍｇ、４００．０ｍｇ、５００．０ｍｇ、６００．０ｍｇ、７５０．０ｍｇ、８００．０ｍｇ、９００．０ｍｇ、および１０００．０ｍｇの活性化合物を含有する錠剤の形態にて提供される。この化合物は、１日あたり１〜４回、好ましくは、１日あたり１回または２回のレジメンにて投与され得る。
【００７８】
しかし、任意の特定の患者のために、特定の用量レベルおよび投薬頻度が変動され得、使用される特定の化合物の活性、代謝安定性およびその化合物の作用する時間の長さ、年齢、体重、全身的な健康状態、性別、食事、投与様式および投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重篤度、ならびに治療を受ける宿主を含む、種々の要因に依存する。
【００７９】
（キット）
１つの局面において、本発明は、パッケージまたは容器中に以下のうちの１つ以上を含むキットを提供する：（１）本発明の生物学的に活性な組成物またはＦＰＲＬ１アンタゴニスト；（２）薬学的に受容可能なアジュバントまたは賦形剤；（３）投与のための送達手段（ｖｅｈｉｃｌｅ）（例えば、シリンジ）；（４）投与のための指示書。成分（１）〜（４）のうちの２つ以上が同じ容器中に見いだされる実施形態もまた、企図される。
【００８０】
キットが供給される場合、組成物の異なる成分が、別個の容器中にパッケージされて、使用直前に混合されてもよい。成分を別々にこのようにパッケージすることは、活性成分の機能を失うことなく、長期間の保存を可能にし得る。
【００８１】
キット中に含まれる試薬は、その異なる成分の寿命が維持され、かつその容器の材料によって吸着または変化されないように、任意の種類の容器の中に供給され得る。例えば、密封されたガラスアンプルは、凍結乾燥されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリヌクレオチド、または中性の非反応性気体（例えば、窒素）下でパッケージされた緩衝剤を含み得る。アンプルは、任意の適切な材料（例えば、ガラス）、有機ポリマー（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレンなど）；セラミック、金属または類似の試薬を保持するために代表的に使用される任意の他の材料からなり得る。適切な容器の他の例としては、アンプルとして類似の物質から製造され得る単純な瓶、およびホイル（例えば、アルミニウムまたは合金）が裏打ちされた内部を含み得る包みが挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、シリンジなどが挙げられる。容器は、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、皮下注射針によって穿刺され得るストッパーを有する瓶）。他の容器は、除去した際に成分の混合を可能にする容易に取り外し可能な膜によって分離されている、２区画を有し得る。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであり得る。
【００８２】
キットはまた、指示要素とともに供給され得る。指示は、紙または他の基材に印刷されてもよいし、そして／または電気的に読み取り可能な媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなど）として供給されてもよい。詳細な指示は、キットと物理的に関連づけられていなくてもよく；代わりに、ユーザーは、キットの製造業者または販売業者によって特定されたインターネットウェブサイトに導かれてもよいし、電子メールとして提供されてもよい。
【００８３】
（スクリーニング方法および検出方法）
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅｓ（およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅｓを発現するために使用されるＳＨＡＡＧｔｉｄｅヌクレオチド）は、ＦＰＲＬ１レセプター活性を調節する化合物についてスクリーニングするための方法において試薬として使用され得る。このような化合物は、ＦＰＲＬ１レセプターもしくはＦＰＲＬ１レセプターリガンドの不十分もしくは過剰な生成、または野生型分子と比較して異常な活性を有するＦＰＲＬ１レセプターもしくはＦＰＲＬ１レセプターリガンド形態の生成によって特徴付けられる障害を処置する際に有用であり得る。一般に、このような化合物は、ＦＰＲＬ１レセプター／ＦＰＲＬ１レセプターリガンドが関連する生物学的機能を調節するために使用され得る。
【００８４】
本発明は、ＦＰＲＬ１レセプターもしくはＦＰＲＬ１レセプターリガンドに影響を及ぼす性質（すなわち、候補化合物もしくは試験化合物もしくは薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）、食品、これらの組み合わせなど）を同定するための方法（スクリーニングアッセイ）を提供する。これは、刺激性効果であってもよいし、阻害性効果であってもよい。本発明はまた、このようなスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を包含する。
【００８５】
リガンドに応答して、またはリガンドとは無関係に、ＦＰＲＬ１レセプター活性を上昇または低下させる化合物についての試験が所望される。化合物は、ＦＰＲＬ１レセプター自体の活性を上昇または低下させる（アゴニストおよびアンタゴニスト）ことによってＦＰＲＬ１レセプター活性を調節し得る。
【００８６】
試験化合物は、コンビナトリアルライブラリー法（生物学的ライブラリー；別々にアドレス可能な並行固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む）における多くのアプローチのいずれかを使用して得られ得る。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリー（Ｌａｍ、１９９７）を包含する。
【００８７】
「低分子」とは、約５ｋＤ未満、より好ましくは、約４ｋＤ未満、そして最も好ましくは、０．６ｋＤ未満の分子量を有する構成物をいう。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖質、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的混合物および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌、または藻類の抽出物）のライブラリーが当該分野において公知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。分子ライブラリーの合成のための方法の例は記載されている（Ｃａｒｅｌｌら，１９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌら，１９９４ｂ；Ｃｈｏら，１９９３；ＤｅＷｉｔｔら，１９９３；Ｇａｌｌｏｐら，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，１９９４）。
【００８８】
化合物のライブラリーは、溶液中で（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２）またはビーズ上で（Ｌａｍら、１９９１）、チップ上で（Ｆｏｄｏｒら、１９９３）、細菌、胞子（Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第５，２２３，４０９号，１９９３）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２）またはファージで（Ｃｗｉｒｌａら，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎら，１９９０；Ｆｅｌｉｃｉら，１９９１；Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第５，２２３，４０９号，１９９３；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０）提示され得る。
【００８９】
ＦＰＲＬ１レセプターに結合するかまたはＦＰＲＬ１レセプターの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするための多くのアッセイが利用可能である。無細胞アッセイは、例えば、ＦＰＲＬ１レセプターまたは生物学的に活性なフラグメントと、ＦＰＲＬ１レセプターに結合するＳＨＡＡＧｔｉｄｅ化合物とを接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を、試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がＦＰＲＬ１レセプターと相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、試験化合物がＦＰＲＬ１レセプターと相互作用する能力を決定する工程が、ＦＰＲＬ１レセプターが優先的に試験化合物に結合するかまたは試験化合物の活性を調節する能力を決定する工程を包含する。細胞ベースのアッセイとしては、例えば、実施例において考察される、カルシウムフラックスアッセイ、結合アッセイおよび細胞移動アッセイが挙げられる。
【００９０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を含む分子、またはそのパートナー分子（例えば、ＦＰＲＬ１）のうちの１つを含む分子のいずれかを固定化することは、一方または両方のタンパク質の非複合体化形態から複合体化形態を分離することを容易にし、そして高いスループットアッセイに適合することを容易にし得る。試験化合物の、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子またはＦＰＲＬ１レセプター分子への結合、あるいは候補化合物の存在下および非存在下でのＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子とＦＰＲＬ１レセプター分子の相互作用は、反応物を含むために適切な任意の容器（例えば、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管）中で達成され得る。一方または両方のタンパク質をマトリクスに結合させ得るドメインを追加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）−ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、試験化合物と、あるいは試験化合物と非吸着ＦＰＲＬ１レセプターまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子のいずれかと結合し、そしてこの混合物は、複合体形成を導く条件（例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、いかなる非結合成分も除去し、ビーズ場合には、このマトリクスを固定し、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体は、マトリクスから解離され得、そしてＳＨＡＡＧｔｉｄｅの結合または活性のレベルが、標準的技術を使用して決定され得る。
【００９１】
タンパク質をマトリクス上に固定化するための他の技術もまた、スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、同時係属中の米国特許出願番号０９／７２１，９０２を参照のこと。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子またはＦＰＲＬ１レセプター分子のいずれかが、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンシステムを使用して固定化され得る。ビオチン化は、多くの試薬（例えば、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；ＰＩＥＲＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して達成され得、そしてストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（ＰＩＥＲＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子またはＦＰＲＬ１レセプター分子と反応性であるが、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの、ＦＰＲＬ１レセプター分子への結合を妨害しない抗体または抗体フラグメントが、プレートのウェルに誘導体化され得、そしてＦＰＲＬ１レセプター分子またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅが、抗体結合体化によってウェルに捕捉され得る。ＧＳＴ固定化複合体について記載される方法に加えて、このような複合体を検出するための方法は、ＦＰＲＬ１レセプター分子またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子と反応性の抗体、および酵素結合アッセイ（ＦＰＲＬ１レセプター分子またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子と関連する酵素活性を検出することに依存する）を使用する、複合体の免疫検出を包含する。
【００９２】
化合物がＦＰＲＬ１レセプターのアンタゴニストであることを決定するために、この化合物が、レセプターに対するＳＨＡＡＧｔｉｄｅの活性を阻害するか否かを決定し得る。好ましくは、このような化合物は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
（１）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を含む分子の、ＦＰＲＬ１レセプターへの結合を潜在的に阻害すること；
（２）ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＦＰＲＬ１レセプター分子に結合するＳＨＡＡＧｔｉｄｅ含有分子のＣａ２＋応答の有意な阻害；
（３）制限された非特異的Ｃａ２＋応答；あるいは
（４）化学走化性活性の阻害。
【００９３】
標準的なインビトロ結合アッセイは、ＦＰＲＬ１レセプターに対する化合物の親和性（これによって、レセプターとの競合的相互作用により、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの活性を阻害する）を実証するために使用され得る。以下の実施例を参照のこと。好ましくは、活性化合物は、＜１０μＭ、より好ましくは、＜５μＭ、最も好ましくは、＜１μＭのＩＣ５０値を示す。
【００９４】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子の活性を阻害する化合物は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ刺激細胞における細胞内Ｃａ２＋濃度に影響する。ＦＰＲＬ１レセプターへのリガンドの結合は、ホスホリパーゼＣのＧタンパク質誘導活性化を生じ、これは、ホスファチジルイノシトールリン酸を、イノシトールリン酸およびジアシルグリセロールに変換する。次いで、イノシトールリン酸は、細胞内部位に位置するレセプターと結合して、細胞質にＣａ２＋を放出させる。細胞内保存からの放出に起因したＣａ２＋濃度の増加に加えて、イノシトールリン酸の、そのレセプターへの結合は、膜を横切る細胞内への、細胞外カルシウムの増加したフラックスをもたらす。他のＧタンパク質シグナル伝達経路が含まれ得る。
【００９５】
従って、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅによるＦＰＲＬ１レセプターの活性化、引き続く、本発明の化合物による活性化の阻害は、遊離細胞内Ｃａ２＋レベルの増加についてのアッセイによって決定され得る。代表的には、これは、カルシウム感受性蛍光プローブ（例えば、ｑｕｉｎ−２、ｆｕｒａ−２およびｉｎｄｏ−１）の使用によって達成され得る。Ｃａ２＋応答をブロックする活性化合物の効果は、存在する活性化合物およびケモカインの量に依存する。一般的に、１０ｎＭのケモカインが存在する場合、１０μＭの活性化合物は、Ｃａ２＋応答の２０〜１００％の阻害を生じるはずである。
【００９６】
活性化合物が非特異的Ｃａ２＋応答を生じるか否かを決定するために、複数のレセプター（活性化合物が標的化するレセプターを含む）を有する細胞が、化合物とともにインキュベートされる。次いで、細胞は、標的レセプターに対するリガンドで刺激され、続いて、サンプル細胞において見出される他のレセプターに対するリガンドで刺激される。化合物の存在下または非存在下での、リガンドに対する非標的レセプターに同等の応答は、活性化合物が標的レセプターに特異的であることを示す。
【００９７】
走化性を決定するために、任意の細胞移動アッセイ形式（例えば、ＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）システム（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、または任意の他の適切なデバイスもしくはシステム（Ｂａｃｏｎら，１９８８；Ｐｅｎｆｏｌｄら，１９９９））が使用され得る。簡単に述べると、これらの細胞移動アッセイは、以下のように行う。活性標的ケモカインレセプターを有する細胞を収集および調製した後、この細胞を候補アンタゴニストと混合する。この混合物を、細胞移動装置の上側チャンバに置く。下側チャンバに、刺激濃度のケモカインリガンドを添加する。次いで、移動アッセイを実行し、終了し、そして細胞移動を評価する。
【００９８】
本発明者らは、単球、好中球、未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞において発現されているＦＰＲＬ１レセプターにおけるＳＨＡＡＧｔｉｄｅ活性を示した。従って、このような細胞は、インビトロアッセイ法において使用され得る。富化されたかまたは実質的に精製された細胞集団が、インビトロ走化性アッセイにおいて使用され得る。これらの細胞集団は、所望する細胞型に依存して、当該分野において公知である種々の方法によって、調製され得る。代表的には、実質的に精製された細胞集団が、特定の条件下の培養、密度勾配における挙動のような物理的特性によってか、特性マーカーに従って分類すること（例えば、細胞表面タンパク質に対する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を使用する蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、免疫沈降）によってか、または他の方法によって、調製される。
【００９９】
細胞は、組織学（例えば、Ｌｕｎａ，１９６８を参照のこと）、免疫染色および類似の方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗら １９９８；Ｃｏｌｉｇａｎら，１９９１を参照のこと）によって同定され得る。インビトロ走化性アッセイの用途のための実質的に精製された細胞組成物を調製するための方法は、以下および実施例において、簡潔に説明されている。しかし、本発明は、所望の細胞が取得され得るかぎり、特定の精製方法が使用されることを必要としない；多くのバリーエーションおよび代替的な方法が、当業者に知られている。さらに、多くの他の精製方法および検出方法（本明細書中で具体的に列挙していない細胞に対して適切な方法も含む）は、当該分野で公知であるかまたは容易に開発され得る。さらに、免疫系組織に由来するクローンニングした細胞株は、所望される場合、本明細書中に記載の走化性アッセイにおいて使用され得る。一般的な免疫学的、精製方法および細胞培養方法は、Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９１）（１９９９までの補遺も含む）に記載されている。別段規定されない限り、培養物中の細胞は、５％ＣＯ２のもと３７℃でインキュベートされる。
【０１００】
単球精製のための適切な方法は、Ｂｅｎｄｅｒら，１９９６．（また、米国特許第５，９９４，１２６号を参照のこと）に記載されている。簡潔には、単球は、汎Ｔ細胞表面マーカーＣＤ２に対する固定した抗体を使用してＴ細胞を枯渇させることによって、ＰＢＭＣから単離される。便宜上、磁気ビーズに結合されたＣＤ２抗体の市販元（Ｄｙｎａｌ；Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を利用した。従来のＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離法によって軟膜から単離したＰＢＭＣ（代表的には、４００×１０６ＰＭＢＣを含む３５ｍｌ）は、２０×１０６細胞／ｍｌで、ＭＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）（１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を伴う））に再懸濁される。ＤＰＢＳは、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＣａＣｌ２（０．１ｇ／ｌ）、ＫＣｌ（０．２ｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．２ｇ／ｌ）、ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ（０．１ｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（８．０ｇ／ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（２．１６ｇ／ｌ））である。適切な量の固定化ＣＤ２＋磁気ビーズ（代表的には１０μｌ／１０６細胞）を細胞に添加する。この混合物を穏やかに攪拌しながら４℃で１５分間インキュベートする。磁気タグ化Ｔ細胞を、磁気セルソーター（Ｄｙｎａｌ）で、製造者のプロトコルに従って未標識細胞から除去する。未標識細胞は、主に単球およびＢ細胞を含有する。
【０１０１】
上記調製物中のＢ細胞を、差次的な接着特性を利用することにより除去する。簡潔に説明すると、Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを、Ｔ−１７５組織培養フラスコのプラスチックに、３７℃で３時間、接着させる（１００×１０６細胞／フラスコ；Ｃｏｓｔａｒ；Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）。非接着細胞（大部分にＢ細胞を含む）を吸引する。非接着細胞を完全に除去するために、フラスコをＤＰＢＳでもう３回リンスする。得られた細胞は、単球について大部分が富化されている（すなわち、＞９０％）。
【０１０２】
単球はまた、ＣＤ１４抗原のポジティブ選択によって単離され得る、簡潔に説明すると、標準的なＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離法により末梢血液から単離したＰＢＭＣ（例えば、軟膜）を、１×１０６細胞／ｍｌでＭＡＣＳ緩衝液中に懸濁する。ＣＤ１４表面抗原に対する固定化抗体（例えば、ＣＤ１４＋磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｙｎｉ））を添加し（１μｌのビーズ／１×１０６細胞）、そしてこの混合物を１５分間４℃でインキュベートする。混合物を磁気セルソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）上で製造者のプロトコルに従ってポジティブ選択カラムに通すことにより、単球を他の細胞集団から分離する。カラムをＭＡＣＳ装置から除去した後、カラム上に保持された単球をＭＡＣＳ緩衝液を用いて溶出する。次いで、細胞を遠心分離によってペレット化し、そして１０６細胞／ｍｌでＲＭＰＩ＋１０％ＦＣＳ培地中に再懸濁する。この方法により単離した単球をＣＤ２＋枯渇法により単離した細胞と本質的に同じようにして培養する。
【０１０３】
別々の成熟集団および未熟集団を含む樹状細胞の精製のための適切な方法は、当該分野において公知である。実質的に精製された樹状細胞（成熟または未熟細胞の亜集団を含む）は、インビボ培養条件における選択によって調製され得る。
【０１０４】
樹状細胞は、潜在病原と接触している全ての組織（例えば、皮膚、胃腸管および気道、ならびに二次リンパ組織のＴ細胞豊富領域）において広範に分布している。皮膚および上気道においては、それらは、高度に樹状化された細胞（皮膚においてランゲルハンス細胞と呼ばれる）の格子を形成する。抗原を捕捉した後、末梢組織（例えば、皮膚および腸）中の樹状細胞は、内部移行された抗原を提示するリンパ節のＴ細胞領域にリンパ管排液を介して移動する（ｔｒａｆｆｉｃ）。未熟樹状細胞は、抗原を取り込み、そしてプロセシングするように機能する。排液リンパ節への続く遊走の間に、ＤＣは成熟する。成熟樹状細胞は、キーとなるＡＰＣとして機能し、病原特異的細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の増殖を誘導することにより、免疫応答を開始させる。
【０１０５】
樹状細胞の実質的に純粋な集団は、インビトロ培養（下述）によって生成され得る。さらに、細胞段階を同定するために使用され得る樹状細胞成熟の間で、ケモカインレセプターの発現に顕著な変化がある（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９８；Ｃｈａｎら、１９９９；Ｄｉｅｕら、１９９８；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎら、１９９９）。例えば、未熟樹状細胞は、主にＣＣＲ１、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４を発現する。成熟の際に、これらのレセプターは、ＣＸＣＲ４を除いて、ダウンレギュレートされる。
【０１０６】
培養において、未熟形態の樹状細胞は、二次リンパ組織にまでの抗原接触の地点からの樹状細胞の遊走の間、その事象に類似すると考えられる成熟を受ける。種々の発達期のヒトまたはマカクザルの樹状細胞は、特定のサイトカインを用いてＣＤ１４＋血液前駆体から、培養中に生成され得る。樹状細胞の別の系統は、臍帯血または骨髄由来のＣＤ３４＋前駆細胞から分化され得る。本発明の１つの実施形態では、樹状細胞の亜集団が、走化性組成物の同定（すなわち、走化性能および規定のＤＣサブタイプに対する選択性を評価する）のためのインビトロアッセイのために生成される。樹状細胞の例示の亜集団は、以下の通りである：（１）未熟末梢血単球由来細胞；（２）成熟末梢血単球由来細胞、および（３）ＣＤ３４＋前駆体由来の細胞。亜集団は、当該分野で公知の種々の方法によって、単離または生成される。例えば、ＰＢＭＣ由来の未熟樹状細胞および成熟樹状細胞は、Ｂｅｎｄｅｒら、前出に従って生成される。
【０１０７】
簡潔に説明すると、ＰＢＭＣを、細胞表面マーカーＣＤ２（全てのＴ細胞上に存在する）に対する固定化抗体を用いてＴ細胞枯渇させる。市販のＣＤ２＋ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ）が、製造者のプロトコルに従って使用され得る。Ｔ細胞枯渇混合物を、３７℃で３時間、組織培養用プラスチック上に細胞をインキュベートすることによって接着画分と非接着画分とに分離する。非接着細胞を穏やかに除去し、そして接着細胞（一般にＣＤ１４＋単球）を、各々１０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を補充した培養培地（例えば、ＲＭＰＩ＋１０％ＦＣＳ）中に配置する（「１日目（Ｄａｙ １）」）。３日目〜７日目の間、細胞は、ベールをかぶったような不明瞭な形態を提示し始め、そしてサイトカインを２日目、４日目、および６日目に補充する。その時点で、細胞は、未熟樹状細胞として回収され得る。１つの実施形態では、このインビトロ期での細胞を単離し、そしてこれをアッセイにおいて使用する。代表的には、約１０×１０６の樹状細胞が、４００×１０６ＰＢＭＣから得られる。
【０１０８】
７日目の未熟樹状細胞は、代表的な樹状細胞形態を示し、これは、伸長した細胞体および多くの突起を有する。細胞の大きさは、前駆単球に比較して有意に増大する。未熟樹状細胞は、細胞表面マーカーのそれらの発現をモニタリングすることによって表現形的に特徴づけられ得る。
【０１０９】
未成熟樹状細胞（末梢血単球または骨髄由来のＣＤ３４＋前駆体から生成される）は、さらに活性化され、そして分化されて、成熟樹状細胞になり得る。以下の２つの方法が、主に使用される：ＭＣＭ（マクロファージ馴化培地）および二本鎖ＲＮＡ−ｐｌｏｙ（Ｉ：Ｃ）刺激（Ｃｅｌｌａら、１９９９；Ｖｅｒｄｉｊｋら、１９９９）。
【０１１０】
ＭＣＭ法において、６日目の未成熟樹状細胞を、遠心分離によって回収し、そして（１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩで１：１まで）希釈した熟成培地（例えば、ＭＣＭ）中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）を添加する。細胞を、さらに３日間培養し、さらにＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４を添加する。９日目の細胞を、成熟樹状細胞として使用する。
【０１１１】
ポリ（Ｉ：Ｃ）法において、６日目の未成熟樹状細胞を回収し、そして２０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ）、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＦＳおよびＩＬ−４を補充した標準培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳ）中に再懸濁する。細胞を、さらなるサイトカインなしに、さらに３日間培養する。９日目の細胞を、成熟樹状細胞として使用する。
【０１１２】
これら２つの異なる方法によって生成された成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞とも前駆体単球とも異なる表現型および機能的特性を示す。各調製由来の成熟樹状細胞を、ＦＡＣＳによって完全に特徴付けて、所望の細胞型が得られたことを確認する。
【０１１３】
特に、生成された成熟樹状細胞は、未成熟細胞よりも、その細胞表面上に顕著により高いレベルのＭＨＣクラスＩＩを発現する。ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現もまた、アップレギュレートされる。ケモカインレセプター発現もまた、成熟プロセスの間に劇的に変化する。例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５は、成熟細胞において急激にダウンレギュレートされるが、一方でＣＣＲ７は、アップレギュレートされ、そしてＭＣＭの添加の数時間以内に、細胞表面上に出現する。機能的に、成熟樹状細胞は、もはや抗原を充分に摂取することができないが、ナイーブなＴ細胞およびＢ細胞の増殖を刺激する能力を獲得する。成熟樹状細胞はまた、それらの移動挙動を変化させる；成熟樹状細胞は、もはや、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５のリガンド（例えば、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１β）に応答しない。その代わり、成熟樹状細胞は、ＣＣＲ７リガンドであるＳＬＣおよびＥＬＣに応答する。
【０１１４】
ＭＣＭは、軽微な改変を加えて、Ｒｏｍａｎｉら、１９９６に記載されるように調製する。簡潔には、ペトリ皿（１００ｍｍ、Ｆａｌｃｏｎ）を、５ｍｌのヒトＩｇ（１０ｍｇ／ｍＬ）で３７℃にて３０分間コーティングし、そして使用直前にＰＢＳで２〜３回洗浄する。８ｍｌ中５０×１０６のＰＢＭＣを、ヒトＩｇコーティングしたプレート上に、１〜２時間にわたって層状化する。非接着細胞を、洗浄して除去し、そして廃棄する。接着細胞を、新たな完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％正常ヒト血清）中で３７℃でインキュベートし、そして得られた培地（ＭＣＭ）を、２４時間後に収集する。ＭＣＭ中のＴＮＦ−α濃度を、標準的なＥＬＩＳＡ法（例えば、ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用する）によって決定する。ＭＣＭ中の最終ＴＮＦ−αレベルを、適切な量のＭＣＭをＲＰＭＩ／１０％ウシ胎仔血清と混合することによって、５０Ｕ／ｍｌに調節する。
【０１１５】
好中球精製に適切な方法は、当該分野で公知である。１つの適切な方法に従って、新鮮な全血（ＷＢ）を、５０ｍｌの遠心管中で、３％のデキストランで１：１に希釈し、そして室温で３０〜４５分間沈降させる。２５ｍｌのＷＢ＋２５ｍｌのデキストランは、３０分間の沈降後に、約３５ｍｌの上清を生じる。この上清を、１２〜１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ上に層状化し、そして１８〜２０℃にて３０〜４０分間、４００×ｇで遠心分離する。単核細胞およびＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを含む血漿／血小板層を、吸引によって除去する。好中球は、赤血球（ＲＢＣ）層上の白色層において見出される（いくつかの調製物において、好中球および赤血球の層は、混合される）。これらの場合、ＲＢＣは、低張溶解によって除去される（１２．５ｍｌの冷０．２％ ＮａＣｌを、ボルテックスしながら、好中球／ＲＢＣペレットに添加する。１２．５ｍｌの冷１．６％ ＮａＣｌを、なおボルテックスしながら、直ぐに添加する。これらの細胞を、６０〜１００×ｇで１０分間遠心分離し、そして回収する。必要な場合、この溶解工程が繰り返される）。得られた好中球は、＞９５％の純度である（主な残留細胞として、好酸球を含む）。
【０１１６】
（予後アッセイ）
本明細書中に記載される診断方法は、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたはＦＰＲＬ１リガンドの発現または活性に関連する疾患または障害を有するかまたは発症する危険性のある被験体を同定するためにさらに利用され得る。例えば、記載されるアッセイは、神経変性障害のような障害を有するかまたは発症する危険性のある被験体を同定するために使用され得る。代表的には、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＦＰＲＬ１レセプターもしくはＦＰＲＬ１リガンドが検出されるか、または活性がアッセイされる。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプルまたは組織であり得る。
【０１１７】
予後アッセイは、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたはＦＰＲＬ１リガンドの発現または活性に関連する疾患または障害を処置するために、ある様式（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、食物など）を被験体が投与され得るかどうかを決定するために使用され得る。このような方法は、被験体が、ある障害についての薬剤で効果的に処置され得るかどうかを決定するために使用され得る。本発明は、被験体が、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたは異常なＦＰＲＬ１リガンドの発現または活性に関連する障害についての薬剤で効果的に処置され得るかどうかを決定するための方法を提供する。このようなアッセイにおいて、試験サンプルが獲得され、そしてＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたは核酸が検出される（例えば、ここで、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたは核酸の存在は、異常なＦＰＲＬ１レセプターまたは異常なＦＰＲＬ１リガンドの発現または活性に関連する障害を処置するための薬剤を投与され得る被験体についての診断である）。
【０１１８】
以下の実施例は、本発明を例示するために与えられ、そして限定を意図しない。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１：ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、他のＣＫβ８改変体同様に、ＣＣＲ１発現細胞における細胞内カルシウムフラックスを刺激する）
ヒト組換えケモカインであるロイコタクチン（ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ）、３つの既知のＣＫβ８改変体であるＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−１１６）、およびＣＫβ８−１の新規ＮＨ２−末端短縮型であるＣＫβ８−１（２５−１１６）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。ＣＫβ８−１（２５−１１６）を、安定なヒトＣＣＲ１トランスフェクトＨＥＫ２３９細胞における細胞内カルシウム動員を誘発する能力について、他の３つの改変体と比較した。ヒトＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎａ ６（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）を使用して調製した。ＨＥＫ−２９３細胞株を、８００μｇ／ｍｌのＧ−４１８を補充した、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。
【０１２０】
ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトケモカインレセプターＣＣＲ１の安定な発現を、以下のように得た：ＣＣＲ１をコードする全長ｃＤＮＡを、ヒト末梢血細胞から単離したゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。このＰＣＲ産物を、標準的な分子クローニング手順を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングし、そして正体を確認するために、完全に配列決定した。
【０１２１】
このＣＣＲ１／ｐｃＤＮＡ３．１構築物２μｇを使用して、以下のようにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。ＦｕＧＥＮＥ：ＤＮＡ複合体を、１００ｕｌの無血清培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＣＯ）中で、６．０μｌのＦｕＧＥＮＥ ６試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）および２μｇのＣＣＲ１／ｐｃＤＮＡ３．１を混合することによって調製した。室温で３０分間のインキュベーション後、この複合体を、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＣＯ）を補充したＤＭＥＭ培地１０ ｍｌ中に０．５〜１×１０６細胞を含む、６０ｍｍの培養プレートに添加した。混合後、これらの細胞をインキュベータに戻して、３７℃で２日間培養した。トランスフェクションの４８時間後に、ジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）を、８００ｕｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。次いで、これらの細胞を、２０，０００細胞／ウェルの濃度で、９６ウェルプレートにプレートした。Ｇ４１８選択下で２〜３週間の後に、安定なジェネテシン耐性ＣＣＲ１発現細胞を、１〜５００ｎＭの濃度のＭＩＰ−１αに応答してカルシウムを動員する能力についてアッセイした。
【０１２２】
Ｃａ２＋動員応答を、細胞内比率測定（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）蛍光色素Ｉｎｄｏ−１を使用して実施した。細胞に、培養培地中で、Ｉｎｄｏ−１／ＡＭ（３μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をロードした（４５分、２０℃、１０７細胞／ｍｌ）。色素ロード後、細胞を、１０ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、そして１％ ＦＢＳを含むＨＢＳＳ中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞質ゾルＣａ２＋放出を、Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ蛍光定量器（３５０ｎｍにて励起、４００ｎｍおよび４９０ｎｍでの比例する（ｒａｔｉｏｅｄ）二重放射）を使用して、３５０ｎｍでの励起を使用して決定した。
【０１２３】
ＨＥＫＣＣＲ１−２９３形質転換体を用いて、ＣＫβ８−１（２５−１１６）および他のＣＫβ８改変体は、１００ｎＭで迅速なカルシウムフラックスを誘導した。２つの短縮型改変体ＣＫβ８（２５−９９）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）は、高いカルシウム応答を誘導したが、一方で、改変体ＣＫβ８（２５−９９）およびＣＫβ８−１（１−１１６）によって生じるシグナルはより低かった。これらのケモカインはいずれも、トランスフェクトされていない親ＨＥＫ２９３細胞ではシグナルを誘導しなかった。このことは、この活性がＣＣＲ１に起因し、内因性レセプターに起因するものではないことを実証する。１００ｎＭのＣＫβ８（２５−９９）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）で得られた最大レセプター刺激は、同じ濃度のＣＣＲ１アゴニストであるロイコタクチンで得られたレセプター刺激と等しかった。
【０１２４】
（実施例２：ＣＣＬ２３改変体ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ヒト単球および好中球において、ＣＣＲ１関連イベントではない特有の活性プロフィールを提示する）
ヒト組換えケモカイン、ロイコタクチン、ＭＩＰ−１α、３種類の公知のＣＫβ８改変体（ＣＫβ８（１〜９９）、ＣＫβ８（２５〜９９）、ＣＫβ８−１（１〜１１６））およびＣＫβ８−１の新規ＮＨ２末端短縮形態（ＣＫβ８−１（２５〜１１６））を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。ヒト単球を、標準的なプロトコルに従い、軟膜（Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から作製した。簡単には、ＰＢＭＣを、標準的な密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ−Ｐｌｕｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により単離した。単球を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｍ、ＣＡ）磁性陽性選択を用いて精製した。ヒト好中球を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡ）での勾配遠心により、健康な個体由来の新しい末梢血から単離した。
【０１２５】
ＣＣＬ２３改変体の活性を、実施例１に記載されるカルシウムフラックス試験を用いて、新しく調製したヒト単球および好中球で試験した。全てのケモカインが単球において幾分かのカルシウム放出を刺激したが、ＣＫβ８（１−９９）およびＣＫβ８−１（１−１１６）は、２５０ｎＭでさえ乏しい活性を示した。ＣＫβ８（２５−９９）は、わずかに高いカルシウム刺激を示した。しかし、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、拡張されたカルシウム放出を伴う特有のカルシウムフラックスを示した。１００ｎＭのＣＫβ８−１（２５−１１６）で得られた最大のレセプター刺激は、同じ濃度のロイコタクチンで得られたレセプター刺激より少なくとも２倍高かった。
【０１２６】
好中球において、１００ｎＭのロイコタクチンは、カルシウム流を誘導したが、ＭＩＰ１αもＣＫβ８（１−９９）も、ＣＫβ８（２５−９９）も、ＣＫβ８（１−１１６）もカルシウム流を誘導しなかった。しかし、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、特有のカルシウム放出を誘導した。その強度は、同じ量のロイコトタクリン刺激について観察された強度より非常に高かった。
【０１２７】
（実施例３：ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１トランスフェクト体、単球および好中球で実施された交差脱感作（ｃｒｏｓｓ−ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）試験）
交差脱感作試験において、細胞を、ロイコタクチン、次いで、ケモカインＣＫβ８（１〜９９）、ＣＫβ８（２５〜９９）、ＣＫβ８−１（１〜１１６）およびＣＫβ８−１（２５〜１１６）で連続的に刺激した。ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１トランスフェクト体（実施例１におけるように調製した）において、ロイコタクチンは、全ての改変体に対して類似のレセプター脱感作パターンを誘導した。細胞を、１００ｎＭのロイコタクチンで前処理した場合、全てのリガンドに対するカルシウムフラックス応答が、完全に阻害された。
【０１２８】
類似のレセプター交差脱感作試験を、単球および好中球の両方（実施例２におけるように調製した）を用いて実施した。単球において、ロイコタクチンは、ＣＣＬ２３改変体である、ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、およびＣＫβ８−１（１−１１６）を完全に脱感作した。対照的に、ロイコタクチンでの前刺激は、単球でのＣＫβ８−１（２５−１１６）の活性を脱感作しなかった。好中球において、ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、およびＣＫβ８−１（１−１１６）は、不活性であり、かつロイコタクチンでの前刺激は、効果がなかった。しかし、ロイコタクチンでの前刺激は、ＣＫβ８−１（２５−１１６）での刺激を脱感作しなかった。
【０１２９】
（実施例４：ＣＣＬ２３改変体は、ＣＣＲ１発現細胞への結合について、１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αと競合する）
ＣＣＬ２３改変体の結合特性を、ヒトＣＣＲ１発現細胞において比較した。ＭＩＰ−１αおよびＣＣＬ２３改変体ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−１１６）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）が、１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αと競合する能力を、ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１細胞（実施例１におけるように調製した）において調査した。細胞を、非標識ケモカインの存在下で、１２５Ｉ標識したＭＩＰ−１α（最終濃度、約０．０５ｎＭ）と共にインキュベートした（４℃で３時間：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．２％ＢＳＡ、ｐＨ７．１に調整）。反応混合物を、細胞回収器（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いてＰＥＩ処理ＧＦ／Ｂガラスフィルター上に吸引した。フィルターを、２回（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．１に調整）洗浄した。シンチレーション剤（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−１０：３５μｌ）を、乾燥したフィルターに添加し、そしてフィルターを、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒにおいて計数した。データを、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて解析しおよびプロットした。
【０１３０】
漸増濃度のＭＩＰ−１αまたはＣＣＬ２３改変体で競合曲線が観察された。ＭＩＰ−１αは、０．５４ｎＭのＩＣ５０を与えた。ＣＣＬ２３改変体は、それぞれ、６４ｎＭ、１．３４ｎＭ、２０６ｎＭ、および１１２ｎＭのＩＣ５０を与えた。ＣＫβ８−１（１−１１６）は、このトランスフェクト体において、ＣＣＲ１からの結合した１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αの置換について、ＣＫβ８（１−９９）より１／３〜１／４少ない能力を示した。このことは、ＣＫβ８−１（１−１１６）のＣＣＲ１に対する比較的低い親和性と一致する。また、予想されるようにＣＫβ８（１−９９）の短縮体である、ＣＫβ８（２５〜９９）は、４０倍のＩＣ５０の増加を示した。しかし、ＣＫβ８−１（２５−１１６）（同様のＣＫβ８−１（１−１１６）のアミノ酸短縮改変体）についてのＩＣ５０は、１倍増加したのみであった。
【０１３１】
同様の結合競合試験を、単球および好中球で実施した。これらの細胞を、実施例２におけるように調製した。ＭＩＰ−１αは、好中球に結合しなかったので、好中球におけるＭＩＰ−１αの間での結合競合は、研究され得なかった。単球において、ＭＩＰ−１αは、０．２７ｎＭのＩＣ５０を有し、そしてＣＣＬ２３改変体は、それぞれ、１０ｎＭ、０．２５ｎＭ、５５ｎＭ、および５ｎＭのＩＣ５０を有する。慨して、ＣＫβ８（１−９９）およびＣＫβ８（２５−９９）は、ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１細胞において観察されたＩＣ５０と同様のＩＣ５０を示した。しかし、ＣＫβ８−１（１−１１６）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）は、単球においてより高いＭＩＰ−１α置換活性を示し、特に、ＣＫβ８−１（２５−１１６）についての活性は、１０倍高かった。１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αの結合競合データ（ＩＣ５０）を、表６に示す。各々の相互作用についてのＩＣ５０を、非線形最小二乗曲線フィッティングから誘導した。
【０１３２】
（表６、ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１トランスフェクト体および単球についての１２５Ｉ−ＭＩＰ−１α結合競合データ）
【０１３３】
【表６】
（実施例５ 改変体ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ヒト単球および好中球の新規移動特性での移動を誘導する）
移動アッセイを、単球および好中球において実施した。ヒト単球および好中球（実施例２におけるように調製した）を、回収し、そして走化性培地（ＣＭ）中に再懸濁した。このＣＭは、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）およびＭｇＳＯ４（１ｍＭ）を含むハンクス緩衝化塩溶液（Ｇｉｂｃｏ、ＭＡ）から構成されていた。これらのアッセイを、９６ウェルＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）マイクロプレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、ＭＡ）中で実施した。ロイコタクチン、ＭＩＰ−１αおよびケモカイン（実施例１におけるように調製したＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−１１６）またはＣＫβ８−１（２５−１１６））を、より下部ウェルに添加し（最終容量２９μＬ）、そして２０μＬの細胞懸濁液（単球について５×１０６細胞／ｍＬ；好中球について２．５×１０６細胞／ｍＬ）をポリカーボネートフィルター（単球について５μｍ孔径；好中球について３μｍ孔径）に添加した。９０分間のインキュベート（３７℃、１００％湿度、５％ＣＯ２）後、細胞を、フィルターの上部表面からかき出した。下部チャンバに移動した細胞を、Ｑｕａｎｔ細胞増殖アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＯＲ）を用いて定量した。
【０１３４】
単球において、ＣＫβ８−１（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−９９）、およびＣＫβ８−１（１−１１６）は、１００ｎＭまでの全ての濃度で中程度に高い活性を示した。ＣＫβ８−１（２５−１１６）の１ｎＭおよび１０ｎＭでの活性は他の改変対と非常に類似していたが、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、１００ｎＭの濃度で、他の３種類の改変体より劇的に高い活性を示した。
【０１３５】
同じ試験を、ヒト好中球で実施した。ヒト好中球は、一般的に、ＣＣＲ１リガンドに対する強力な応答を欠いた。カルシウムフラックスの結果と一致して、ロイコタクチンおよびＭＩＰ−１αを含む公知のＣＣＲ１リガンドのいずれもが、活性ではなかった。しかし、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、１００ｎＭで強力な応答を誘導した。この強度は、ＩＬ−８およびＧＲＯ−αを含む多くの他の強力なＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ１リガンドに匹敵する。
【０１３６】
（実施例６ ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ホルミルペプチドレセプター様１（ＦＰＲＬ１）発現細胞において細胞内カルシウムフラックスおよび走化性を誘導し得る）
ＣＫβ８−１（２５−１１６）の機能的活性を、ヒトＦＰＲＬ１−Ｌ１．２トランスフェクト体およびネイティブのＬ１．２細胞において調査した。Ｌ１．２細胞におけるホルミルペプチド様レセプター１（ＦＰＲＬ１）の安定した発現を、以下のように得た。ＦＰＲＬ１をコードする全長ｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、未分化ＨＬ−６０細胞から単離したゲノムＤＮＡからクローニングした。ポリメラーゼ連鎖反応産物を、標準的な分子クローニング手順を用いてｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へとクローニングし、そして完全に配列決定して同一性を確認した。２０μｇのＦＰＲＬ１／ｐｃＤＮＡ３．１構築物を、ＢｓｍＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）での消化により直線状にし、そして以下のようにマウスＢ細胞株Ｌ１．２をトランスフェクトするために用いた。２５００万の細胞を、２回洗浄し、そして０．８ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。これらの細胞を、直鎖状ＦＰＲＬ／ｐｃＤＮＡ３．１構築物ＤＮＡと共に室温で１０分間、インキュベートし、そして０．４ｃｍキュベットに移し、そして２５０Ｖ、９６０μＦでシングルエレクトロポレーションパルスを印加した。エレクトロポレートした細胞を、室温で１０分間、インキュベートし、そして１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中の３７℃の培養物中に移した。ジェネチシン（Ｇ４１８）を、トランスフェクションの４８時間後に８００μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、そしてこれらの細胞を、９６ウェルプレートに、２５，０００細胞／ウェルでプレートした。薬物選択下、２〜３週間後、安定なジェネテシン耐性ＦＰＬＲ１発現細胞を、それらが１〜１０００ｎＭの濃度のＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＣＫβ８−１に応答してＣａ＋＋を移動させる能力について評価した。
【０１３７】
カルシウムフラックス試験を、実施例１に記載される方法を用いて、これらのトランスフェクト体で実施した。ＣＣＬ２３改変体の中で、ＣＫβ８−１（２５−１１６）のみが、ＦＰＲＬ１発現細胞におけるカルシウム放出を刺激した。ＦＰＲＬ１についての非天然リガンドとして知られる合成ペプチドＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶｍ）およびＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（ＷＫＹＭＶＭ）（「Ｗペプチド１および２」）（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）から入手）は、強力なカルシウムフラックスを生成した。ＣＫβ８−１（２５−１１６）誘導されたカルシウム放出は、親（ｐａｒｉｅｎｔａｌ）細胞においても他のケモカインレセプターでトランスフェクトされた細胞においても観察されなかった。ＣＫβ８−１（２５−１１６）誘導されたカルシウムフラックス用量応答アッセイを実施した場合、１０〜２０ｎＭのＥＣ５０が、これらの細胞において観察された。ＣＫβ８−１（１−１１６）は、２００ｎＭでさえもＦＰＲＬ１発現細胞に対して活性を示さなかった。
【０１３８】
ＣＫβ８−１（２５〜１１６）が、ＦＰＲＬ１発現細胞の移動を誘発する能力を、試験した。試験条件は、実施例５におけるとおりであった。親（ｐａｒｉｅｎｔａｌ）Ｌ１．２細胞は、このアッセイにおいて移動しなかったが、ＦＰＲＬ１を発現する細胞は、１ｎＭから１μＭの範囲のＣＫβ８−１（２５−１１６）濃度に応答してベル型の用量依存性の様式で移動した。最大の半分の（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ）細胞移動は、３０ｎＭで観察された。この最大の応答の強度は、合成ペプチドＷＫＹＭＶｍおよびＷＫＹＭＶＭを用いて観察された強度より高かった。一般的に、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ＦＰＲＬ１媒介移動において、他のケモカインと比較して、より広範なベル型曲線を示した。従って、ＣＣＲ１に対する活性に加えて、ＣＫβ８−１（２５−１１６）はまた、単球および好中球上で発現したレセプターＦＰＲＬ１を介して機能する。
【０１３９】
（実施例７ ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ヒト単球およびＦＰＲＬ１発現細胞上に結合する１２５Ｉで標識されたＷＫＹＭＶｍを置換し得る）
ＦＰＲＬ１へのＣＫβ８−１（２５−１１６）の結合を、ＣＫβ８−１（２５−１１６）が、ヒトＦＰＲＬ１−Ｌ１．２トランスフェクト体およびヒト単球から１２５Ｉで標識されたＷＫＹＭＶｍ（１２５Ｉで標識されたＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））を置換する能力を測定することにより決定した。細胞を、漸増濃度の標識していないＷＫＹＭＶｍまたはＣＫβ８−１（２５−１１６）の存在下で、０．０１ｎＭの１２５Ｉ−ＷＫＹＭＶｍと共に、４℃で、３時間、インキュベートした。各々の相互作用についてのＩＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いることによる、データの非線形最小二乗曲線フィッティングから導いた。
【０１４０】
ＦＰＲＬ１−Ｌ１．２トランスフェクト体および単球について、競合曲線が、漸増濃度のＷＫＹＭＶｍまたはＣＫβ８−１（２５−１１６）で観察された（表７）。そのような曲線は、他のＣＣＬ２３改変体について観察されなかった。
【０１４１】
（表７ ＷＫＹＭＶｍおよびＣＫβ８−１（２５−１１６）で観察された、１２５Ｉ標識されたＷＫＹＭＶｍの競合曲線）
【０１４２】
【表７】
（実施例８ ケモカインまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞、単球または好中球によるカルシウム動員を誘導した）
ヒト組換えＣＫβ８−１（２５−１１６）ケモカインを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。ペプチドＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（配列番号１および配列番号６）ならびにコントロールタンパク質（配列番号１の逆配列）を合成し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９９に記載される従来技術を用いてＨＰＬＣで精製した。
【０１４３】
ヒト単球を、軟膜（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐａｌｏ Ａｌｓｏ、ＣＡ）または健康な個体の新しい血液のいずれかから、標準的なプロトコルに従い作製した。簡単には、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ−Ｐｌｕｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により単離した。単球を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）磁性陽性選択により精製した。ヒト好中球を、デキストラン沈殿および密度勾配遠心Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心法によって、新しい血液から単離した。全ての細胞を、洗浄し、そして１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地中に再懸濁した（１×１０７／ｍｌ）。
【０１４４】
未熟ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４の存在下でＣＤ１４＋単球を培養することによって、誘導した。簡単には、単球を、Ｔ−１７５フラスコ中で、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中１０６細胞／ｍｌで培養した。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４を、０日目、２日目、４日目、および６日目に、それぞれ、１０００ｕ／ｍｌおよび５００ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加した。細胞を、未熟ＤＣとして７日目に回収し、ＦＡＣＳ分析により表面タンパク質発現について特徴づけした。ＤＣ成熟を、マクロファージ馴化培地（ＭＣＭ）中で６日目の未熟ＤＣを培養することによって実施した。簡単には、６日目の未熟ＤＣを、遠心分離により回収し、そしてＭＣＭに１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。培地に、１０００ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００ｕ／ｍｌのＩＬ４を補充した。さらに３日の培養後、細胞を、成熟ＤＣとして回収し、そして表面タンパク質発現フローサイトメトリーにより特徴付けた。
【０１４５】
ＭＣＭを、以下のように調製した：軟膜から単離したＰＢＭＣを、１０ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でプレコートしたプラスチックフラスコ中、３７℃で、３０分間、インキュベートした。３０分後、非付着細胞を、除去し、そして付着細胞を、ＤＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ／１０％ヒト血清中で培養した。馴化培地を、２４時間後に回収した。ＴＮＦ−α濃度（これは、ＤＣ成熟に必須である）を、ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）を用いることによって決定した。ＭＣＭ中の最終的なＴＮＦ−αレベルを、ＲＰＭＩ／１０％ヒト血清と混合することによって５０ｕ／ｍｌまで調整し、そして−８０冷凍庫で、使用するまで貯蔵した。
【０１４６】
Ｃａ２＋移動応答を、細胞内レシオメトリック蛍光色素であるＩｎｄｏ−１を用いて実施した。培養培地中の細胞に、Ｉｎｄｏ−１／ＡＭ（３μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ））を充填した（４５分、２０℃、１０７細胞／ｍｌ）。色素充填後、細胞を、１回洗浄し（１０ｍｌ ＰＢＳ）そして１％ＦＢＳを含むＨＢＳＳ中に１０６細胞／ｍｌで懸濁した。サイトゾル［Ｃａ２＋］放出を、Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒを用い、３５０ｎｍでの励起を用いて決定した（３５０ｎｍで励起、４００ｎｍおよび４９０ｎｍでの分配された（ｒｅｔｉｏｅｄ）二重放出）。
【０１４７】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（配列番号１および配列番号６）ならびにＣＫβ８−１（２５−１１６）は、ヒト単球および好中球で強力なカルシウムフラックスを生成し、そして未熟樹状細胞および成熟樹状細胞に対して部分的に活性であった。コントロールペプチドでは、有意なカルシウムフラックスが、観察されなかった。未熟樹状細胞は、高レベルのＣＣＲ１を発現し、ＣＫβ８−１（２５−１１６）は、これらの細胞においてＣａ２＋放出を誘導する。
【０１４８】
（実施例９ ケモカイン、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ、およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ短縮改変体は、安定に発現されたＦＰＲＬ１細胞によってカルシウム動員を誘導した）
Ｌ１．２細胞中のヒトＦＰＲＬ１の安定な発現は、実施例６のとおりに得られた。カルシウムフラックス試験を、実施例１に記載された方法を使用してトランスフェクト体で行なった。ケモカイン（ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８−１（１−１１６）およびＣＫβ８−１（２５−１１６）を、実施例１のとおりに調製した。Ｗペプチド１および２を、実施例６のとおりに得た。さらに、以下のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列および短縮改変体（実施例８のとおりに調製される）を試験した：
ＣＣＸＰ１ 配列番号１
ＣＣＸＰ２ 配列番号２
ＣＣＸＰ３ 配列番号３
ＣＣＸＰ４ 配列番号４
ＣＣＸＰ５ 配列番号５
ＣＣＸＰ６ 配列番号６
ＣＣＸＰ７ 配列番号７
ＣＣＸＰ８ 配列番号８
ＣＣＸＰ９ 配列番号９
ＣＣＸＰ１０ 配列番号１０。
【０１４９】
全てのリガンドを、用量応答様式および所定のピークカルシウムフラックス応答で加えた。表８は、ＣＫβ８（２５−１１６）（配列番号１６）および特定のＳＨＡＡＧｔｉｄｅが、ＦＰＲＬ１トランスフェクト体中でカルシウム動員を誘導したことを示す。しかし、ＣＫβ８（１−１１６）（これは、遊離ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ Ｎ末端を含まない）は、有意な動員を生じなかった。このデータはまた、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのＮ末端が、ＦＰＲＬ１トランスフェクト体中のその活性のために重要であることを示す。短縮Ｎ末端を有するこれらのＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、非常に減少されたカルシウム動員を生じた。短縮Ｃ末端または置換Ｃ末端を有するＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、Ｎ末端の短縮後に観察されたのと同じ活性損失を示さなかった。
【０１５０】
（表８−ＦＰＲＬ１ Ｌ１．２細胞中のカルシウムフラックスの誘導（ＩＣ５０ −は、ＩＣ５０値は列挙されず、その配列は、活性が低いかまたは有意な活性がない）
【０１５１】
【表８】
（実施例１０ ＦＰＲＬ１−Ｌ１．２細胞上のケモカイン、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ短縮改変体の走化性活性）
ＦＰＲＬ１−Ｌ１．２細胞上のケモカイン（ＣＫβ８（１−９９）およびＣＫβ８（２５−９９）、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅｓ（配列番号１および配列番号２）およびＷペプチド１および２（実施例６のとおりに得られる）の走化性活性を、移動アッセイで決定した。このケモカインを実施例１のとおりに調製した。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列（配列番号１および配列番号２）を、実施例８のとおりに調製した。ＦＰＲＬ１−Ｌ１．２細胞を、実施例６のとおりに調製した。
【０１５２】
移動アッセイを、実施例５に記載されるプロトコルを使用して、９６ウエルＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）マイクロプレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）で実施した。配列番号１およびＣＫｂ８−１（２５−１１６）の両方が、トランスフェクト体に移動し、配列番号１およびＣＫｂ８−１（２５−１１６）は、このレセプターに対して機能的であることを示している。
【０１５３】
（実施例１１ ヒト単球および好中球上ののケモカイン、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび ａｎｄ ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ短縮改変体の走化性活性）
ケモカイン：ＣＫβ８（１−９９）、ＣＫβ８（２５−９９）、ＣＫβ８ （１−１１６）およびＣＫβ８（２５−１１６）；Ｗペプチド１および２ならびにＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列（配列番号１および配列番号２）のヒト単球および好中球上の走化性活性を、移動アッセイにおいて決定した。上記のペプチドを、前出の実施例のとおりに調製した。この移動アッセイを、実施例５に記載されるプロトコルを使用して、９６ウエルのＣＨＥＭＯＴＸ（登録商標）マイクロプレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）で実施した。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（配列番号１）およびＣＫｂ８−１（２５−１１６）は、好中球および単球の両方の移動を生じた。
【０１５４】
（参考文献）
【０１５５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、報告されているＦＰＲＬ１内因性低親和性リガンドおよび非天然リガンドを示す表である。
【図２】図２は、ヒトＣＣＬ２３／ＣＫβ８改変体と、ヒトＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１αおよびＣＣＬ３／ＭＩＰ−１δのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６を除いて、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含む単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項２】
前記タンパク質またはポリペプチドがＦＰＲＬ１についてのリガンドである、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６である、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６の配列を有する、請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を含む核酸配列を含む単離された核酸。
【請求項１２】
配列番号２０に対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
配列番号２０に対して少なくとも９５％の同一性を含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
配列番号２０に対して少なくとも９９％の同一性を含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１１に記載の核酸に対して相補的な配列を有する単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７または配列番号３０を含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号２０を含む請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
配列番号２５を含む請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１に記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２０】
請求項１に記載のペプチドに融合した非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物および薬学的に受容可能なキャリアおよびシリンジを備えるキット。
【請求項２２】
ＦＰＲＬ１レセプターアンタゴニストを同定するための方法であって、以下：
ＦＰＲＬ１レセプターを発現する細胞と、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含むタンパク質またはポリペプチドとを接触する工程；ここで、該該レセプターは、刺激される；
該レセプターと候補アンタゴニスト化合物とを接触する工程；および
ＦＰＲＬ１レセプターについて検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記候補化合物が抗体、ペプチド、核酸または低分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が好中球、単球、Ｔリンパ球または樹状細胞である、請求項２２に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６の配列を除いて、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含む単離されたタンパク質またはポリペプチドであって、ＦＰＲＬ１レセプターについてのリガンドである、前記タンパク質またはポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項４】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項５】
Ｎ末端配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６である、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１０から９０アミノ酸からなる単離されたポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドはＦＰＲＬ１レセプターについてのリガンドである、前記単離されたポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６の配列を有する、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を有し、そして配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含むが、配列番号１６の配列を除く、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸であって、ここで、該タンパク質またはポリペプチドはＦＰＲＬ１レセプターについてのリガンドである、前記単離された核酸。
【請求項１１】
配列番号２０に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
配列番号２０に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
配列番号２０に対して少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１０に記載の核酸に対して相補的な配列を有する単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７または配列番号３０を含む、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号２０を含む、請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号２５を含む、請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
請求項１に記載のタンパク質またはポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
請求項１に記載のタンパク質またはポリペプチドに融合した非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２０】
薬学的組成物を含むキットであって、以下：
請求項１に記載のポリペプチド、
薬学的に受容可能なキャリア、および
シリンジ
を含む、前記キット。
【請求項２１】
ＦＰＲＬ１レセプターアンタゴニストを同定するための方法であって、以下：
ＦＰＲＬ１レセプターを発現する細胞と、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含むタンパク質またはポリペプチドとを接触する工程；ここで、該レセプターは刺激される；
該レセプターと候補アンタゴニスト化合物とを接触する工程；および
ＦＰＲＬ１レセプターへの該タンパク質またはポリペプチドの結合を検出する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項２２】
前記候補化合物が、抗体、ペプチド、核酸、または低分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、好中球、単球、Ｔリンパ球、または樹状細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＦＰＲＬ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＦＰＲＬ１の生物学的活性に影響を与える、前記抗体またはその結合フラグメント。
【請求項２５】
抗体またはその抗原結合フラグメントがＦＰＲＬ１活性のアゴニストである、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
抗体またはその抗原結合フラグメントがＦＰＲＬ１活性のアンタゴニストである、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含む単離されたタンパク質またはポリペプチドによるＦＰＲＬ１の生物学的活性に及ぼす効果を実質的に模倣する、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して１００％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
Ｎ末端配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号６である、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する単離されたポリペプチドによるＦＰＲＬ１の生物学的活性に及ぼす効果を実質的に模倣する、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
単離されたポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
単離されたポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３５】
単離されたポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号６の配列を有する、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
薬学的組成物を含むキットであって、該薬学的組成物は以下：
ＦＰＲＬ１に結合し、そしてＦＰＲＬ１の生物学的活性に影響を与える抗体、またはその抗原結合フラグメント；
薬学的に受容可能なキャリア；および
シリンジ
を含む、前記キット。
【請求項３７】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＦＰＲＬ１を発現する白血球においてカルシウムフラックスを引き起こす、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、単球、好中球、成熟樹状細胞または未成熟の樹状細胞から選択される細胞を誘引するまたは機能修飾する、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１】
配列番号１６を除いて、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含む単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項２】
前記タンパク質またはポリペプチドがＦＰＲＬ１についてのリガンドである、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｎ末端配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６である、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６の配列を有する、請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を含む核酸配列を含む単離された核酸。
【請求項１２】
配列番号２０に対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
配列番号２０に対して少なくとも９５％の同一性を含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
配列番号２０に対して少なくとも９９％の同一性を含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１１に記載の核酸に対して相補的な配列を有する単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７または配列番号３０を含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号２０を含む請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
配列番号２５を含む請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１に記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２０】
請求項１に記載のペプチドに融合した非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物および薬学的に受容可能なキャリアおよびシリンジを備えるキット。
【請求項２２】
ＦＰＲＬ１レセプターアンタゴニストを同定するための方法であって、以下：
ＦＰＲＬ１レセプターを発現する細胞と、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含むタンパク質またはポリペプチドとを接触する工程；ここで、該該レセプターは、刺激される；
該レセプターと候補アンタゴニスト化合物とを接触する工程；および
ＦＰＲＬ１レセプターについて検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記候補化合物が抗体、ペプチド、核酸または低分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が好中球、単球、Ｔリンパ球または樹状細胞である、請求項２２に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６の配列を除いて、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含む単離されたタンパク質またはポリペプチドであって、ＦＰＲＬ１レセプターについてのリガンドである、前記タンパク質またはポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項４】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項５】
Ｎ末端配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６である、請求項１に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１０から９０アミノ酸からなる単離されたポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドはＦＰＲＬ１レセプターについてのリガンドである、前記単離されたポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６の配列を有する、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を有し、そして配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含むが、配列番号１６の配列を除く、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸であって、ここで、該タンパク質またはポリペプチドはＦＰＲＬ１レセプターについてのリガンドである、前記単離された核酸。
【請求項１１】
配列番号２０に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
配列番号２０に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
配列番号２０に対して少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１０に記載の核酸に対して相補的な配列を有する単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７または配列番号３０を含む、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号２０を含む、請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号２５を含む、請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
請求項１に記載のタンパク質またはポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
請求項１に記載のタンパク質またはポリペプチドに融合した非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２０】
薬学的組成物を含むキットであって、以下：
請求項１に記載のポリペプチド、
薬学的に受容可能なキャリア、および
シリンジ
を含む、前記キット。
【請求項２１】
ＦＰＲＬ１レセプターアンタゴニストを同定するための方法であって、以下：
ＦＰＲＬ１レセプターを発現する細胞と、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含むタンパク質またはポリペプチドとを接触する工程；ここで、該レセプターは刺激される；
該レセプターと候補アンタゴニスト化合物とを接触する工程；および
ＦＰＲＬ１レセプターへの該タンパク質またはポリペプチドの結合を検出する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項２２】
前記候補化合物が、抗体、ペプチド、核酸、または低分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、好中球、単球、Ｔリンパ球、または樹状細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＦＰＲＬ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＦＰＲＬ１の生物学的活性に影響を与える、前記抗体またはその結合フラグメント。
【請求項２５】
抗体またはその抗原結合フラグメントがＦＰＲＬ１活性のアゴニストである、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
抗体またはその抗原結合フラグメントがＦＰＲＬ１活性のアンタゴニストである、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するＮ末端配列を含む単離されたタンパク質またはポリペプチドによるＦＰＲＬ１の生物学的活性に及ぼす効果を実質的に模倣する、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
Ｎ末端配列が、配列番号１に対して１００％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
Ｎ末端配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号６である、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する単離されたポリペプチドによるＦＰＲＬ１の生物学的活性に及ぼす効果を実質的に模倣する、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
単離されたポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
単離されたポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３５】
単離されたポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号６の配列を有する、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
薬学的組成物を含むキットであって、該薬学的組成物は以下：
ＦＰＲＬ１に結合し、そしてＦＰＲＬ１の生物学的活性に影響を与える抗体、またはその抗原結合フラグメント；
薬学的に受容可能なキャリア；および
シリンジ
を含む、前記キット。
【請求項３７】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＦＰＲＬ１を発現する白血球においてカルシウムフラックスを引き起こす、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、単球、好中球、成熟樹状細胞または未成熟の樹状細胞から選択される細胞を誘引するまたは機能修飾する、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５０７７９１（Ｐ２００６−５０７７９１Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５３４５７３（Ｐ２００３−５３４５７３）
【出願日】平成１４年８月１９日（２００２．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２６３３９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０３１６０３
【国際公開日】平成１５年４月１７日（２００３．４．１７）
【出願人】（５０２１２９６５６）ケモセントリックス， インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年８月１９日（２００２．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２６３３９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０３１６０３
【国際公開日】平成１５年４月１７日（２００３．４．１７）
【出願人】（５０２１２９６５６）ケモセントリックス， インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]