ポリオール脱水素酵素組成物
【課題】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の保存安定性を向上させる手段を提供する。
【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物であって、前記酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である、ポリオール脱水素酵素組成物である。
【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物であって、前記酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である、ポリオール脱水素酵素組成物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）の保存安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の保存安定性を向上させたポリオール脱水素酵素組成物、当該組成物を含むポリオール測定試薬、および当該組成物を用いたポリオールの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在し、グルコノバクター属の細菌などから抽出、精製する方法が知られており、グリセロールやソルビトール、マンニトールなどの定量に利用されている。
【０００３】
従来から、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）もしくはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかし、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑である。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００６】
溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すようなＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた方法が知られている。
【０００７】
【化２】
【０００８】
しかし、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた場合、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼと同様、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００９】
これに対して、より安価で簡便なグリセロールの定量方法として、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を用いる方法がある。この方法は、下記式（４）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がないなどのメリットがある。
【００１０】
【化３】
【００１１】
しかし、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、膜結合型酵素であるため、保存安定性が悪いという問題点がある。このような安定性が低い酵素を用いた測定試薬では、保存中に酵素の失活が起こり測定対象物質の濃度を正確に定量することができないという問題があった。したがって、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させることが重要な課題となっている。
【００１２】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させる方法として、２価性架橋試薬により酵素を化学修飾する方法が知られている（特許文献１など）。
【００１３】
これに加えて、特許文献２には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を安定化剤として用いることにより保存安定性の向上した酵素組成物が得られることが開示されている。特許文献３には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、２価の金属イオンを有する化合物、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、界面活性剤とを安定化剤として使用することにより、安定なポリオール脱水素酵素組成物が得られることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００６−２７１２５７号公報
【特許文献２】特開２００７−２５９８１４号公報
【特許文献３】特開２００８−２４５５３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記特許文献１に記載の方法は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾することにより酵素の安定性を向上させている。しかし、かような酵素の化学修飾工程は煩雑であり、酵素の製造コストが増大するという問題がある。
【００１６】
また、特許文献２や特許文献３に記載の方法では、金属化合物や界面活性剤などの安定化剤を添加することにより酵素の安定性を向上させている。しかし、特許文献２および特許文献３に記載の方法においても化学修飾された酵素を使用しており、化学修飾した酵素を用いた場合には酵素の安定性が向上するものの、化学修飾されていない酵素を使用する場合には依然として酵素の残存活性が低下するという問題があった。
【００１７】
そこで本発明は、安価かつ簡便に酵素の保存安定性が向上したポリオール脱水素酵素組成物を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、正確にポリオールを定量できる上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を含むポリオール測定試薬、および上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を用いたポリオールの定量方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記従来の問題点に鑑み、鋭意研究を積み重ねた結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に対して、酵素組成物中に含まれる界面活性剤であるポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の量を低減することにより、ポリオール脱水素酵素の安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物であって、前記酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である、ポリオール脱水素酵素組成物である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、酵素組成物中に含まれる界面活性剤の量が低減されることにより、安価かつ簡便な方法でＰＱＱ依存性ＰＤＨの経時的な酵素活性の低下、特に凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止することができる。特に、本発明により得られる酵素組成物では、化学修飾されていない酵素を使用する場合であっても、酵素の失活を抑制し、酵素の保存安定性を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一形態によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物であって、前記酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である、ポリオール脱水素酵素組成物が提供される。
【００２２】
ポリオール脱水素酵素は細胞膜結合型酵素であり、疎水性が高いために水溶媒系では不安定である。このため、溶液中におけるポリオール脱水素酵素の凝集を防ぎ、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上させる目的で、酵素の安定化剤として界面活性剤を使用することが知られていた。そして、従来の酵素組成物においては、界面活性剤による酵素の安定化効果が十分に得られるように酵素組成物中には高濃度の界面活性剤が含まれていた。
【００２３】
本発明者らは界面活性剤とポリオール脱水素酵素の安定性との関係を詳細に検討した結果、高濃度の界面活性剤がポリオール脱水素酵素の失活を招くことを見出した。特に、高濃度の界面活性剤による酵素の失活は、化学修飾されていないポリオール脱水素酵素の場合に顕著であった。従来の酵素組成物では保存安定性を向上させた化学修飾された酵素を使用することが多く、高濃度の界面活性剤を使用することによる酵素の保存安定性の低下は重大な問題とならなかった。
【００２４】
本発明では、酵素組成物中の界面活性剤の含有量を従来のものに比べて低減することにより、酵素が化学修飾されていない場合であっても酵素の失活を有意に抑制することができる。したがって、高コストな酵素の化学修飾工程を行わなくても、保存安定性の向上した酵素組成物が提供される。
【００２５】
本発明の酵素組成物はＰＱＱ依存性ＰＤＨおよびＰＱＱ依存性ＰＤＨを安定化する安定化剤を含む。そして、本発明の酵素組成物に含まれる安定化剤は界面活性剤として、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含み、さらに、好ましくは、必要に応じて、非還元糖および／または２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を含む。
【００２６】
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）は、いずれのポリオールを基質としてもよく、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されない。例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、およびマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とし、より好ましくはグリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）を基質とする。
【００２７】
本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨとしては、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など、様々な細菌が生成することが知られている。本発明では、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができる菌（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌」とも称する）が生成するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。これらの中でも特に、グルコノバクター属に由来するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。
【００２８】
また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌であれば、これらの自然突然変異株または人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法と同様にしてもしくは当業者に周知の方法を適宜修飾してまたはこれらの方法を適宜組合せて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）が使用され、特にグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が好ましく使用される。
【００２９】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は、特に制限されず、例えば、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を栄養培地にて培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する方法が挙げられる。
【００３０】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２２〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９の範囲、好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素でも、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００３２】
次いで、得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等を用いることができる。抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。
【００３３】
なお、上述したように、本発明ではＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾しなくても、保存安定性が有意に向上した酵素組成物が得られるため、上記の方法で得られる部分精製酵素や精製酵素の溶液をそのままの形態で、すなわち、化学修飾されていないＰＱＱ依存性ＰＤＨ（非修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を使用することが好ましい。ただし、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾された形態で使用してももちろんよい。化学修飾された形態のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来のＰＱＱ依存性ＰＤＨを、例えば、特許文献１に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
【００３４】
本発明では、界面活性剤としてポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）を含有する。かかる形態によれば、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性が向上し、また、本発明の酵素組成物の保存安定性が向上する。さらに、酵素組成物を緩衝液等で再溶解する際、溶解速度が速いという効果がある。ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）としては、市販品であるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を使用することができる。
【００３５】
このポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標））の含有量は、本来であれば、質量分率（質量％）で規定することが望ましいが、下記理由により現状では規定困難である。
【００３６】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）の定量方法としては、（１）ＰＱＱ依存性ＰＤＨを加熱やトリクロロ酢酸等により変性後、遠心分離することにより沈殿させ、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含まない上清の２８０ｎｍの吸光度を測定する方法や（２）ＪＩＳ法により測定する方法などが考えられる。しかし、（１）の方法では、完全にＰＱＱ依存性ＰＤＨを沈殿させることが困難であり、測定誤差が生じる。また、（２）の方法では、ＰＱＱ依存性ＰＤＨが発色反応を妨害し、定量できないという問題が生じる。そこで本発明者らは簡易なＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）量の確認方法として、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度により規定することとした。具体的には、ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように濃度調整されたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を調製し、このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（株式会社島津製作所製）により測定した場合の吸光度の大きさにより酵素組成物中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）の含有量を評価することとした。なお、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の濃度の調整は濃縮することにより行うことができる。ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）は界面活性剤等の干渉を受けにくく、高精度な蛋白質の定量法として知られている。なお、標準液としては牛血清アルブミンを用いた。一方、酵素組成物中の蛋白質およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００は波長２８０ｎｍで吸光を示し、当該２８０ｎｍにおける吸光度の大きさは酵素組成物中に含まれる蛋白質およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００の合計量に対応する。したがって、ローリー法により蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液、すなわち同一の蛋白濃度を有する溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）量の確認することができる。
【００３７】
具体的には、酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が好ましくは６〜１６の範囲であり、より好ましくは６〜１４の範囲であり、特に好ましくは６〜１２の範囲である。６未満である場合にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００の量が少なすぎて安定化効果が得られず、１６を超える場合にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００が高濃度となり、保存安定性が低下する。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の含有量をこの吸光度の値が上記範囲とすることにより、酵素の失活を防止し、酵素組成物の保存安定性を向上させることが可能となる。なお、特許文献２または３に記載のＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度は、限外ろ過時にＴｒｉｔｏｎＸ−１００が濃縮されることを考慮していないため、実際の組成物中の濃度を正確に規定していない。
【００３８】
本発明の酵素組成物は、安定化剤として緩衝剤を含有する。緩衝剤を添加することにより、ｐＨを酵素に好適な範囲と調節することができ、酵素の保存安定性を向上させることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、酢酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸、またはイミダゾールなどが挙げられる。中でも、低濃度の安定化剤でＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる点で、グリシルグリシンを使用することが好ましい。グリシルグリシンはアミノ酸系緩衝剤の一種であるが、グリシンなどの他のアミノ酸系緩衝剤やＭＯＰＳなどの他のよく知られている緩衝剤を含む酵素組成物に比べて、酵素の残存活性を飛躍的に向上させることができる。
【００３９】
本発明の酵素組成物に含まれる緩衝剤の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に限定されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは２〜２５０質量％、より好ましくは３〜２００質量％である。さらに好ましくは５〜１５０質量％である。２質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２５０質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。
【００４０】
また、本発明の酵素組成物において、緩衝剤に加えて酸またはアルカリなどのｐＨ調整剤を含むことが好ましい。これにより、酵素組成物のｐＨを所望の範囲に調整することができる。本発明の酵素組成物のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは６．０〜１１．０、より好ましくは６．５〜１０．５、最も好ましくは７．０〜１０．０である。なお、酵素組成物のｐＨとは、酵素組成物が溶液形態や半固体形態の場合には当該酵素組成物のｐＨをいい、酵素組成物が固体形態の場合には当該酵素組成物１ｇを１００ｍｌ水溶液とした際の当該水溶液のｐＨをいう。かようなｐＨ調整剤としては、塩酸等の酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリが挙げられる。ｐＨ調整剤の含有量は特に制限されず、所望のｐＨが実現される量を用いればよい。
【００４１】
緩衝剤を添加する方法は特に制限されず、緩衝剤をそのまま添加してもよいが、緩衝剤を予め水に溶解させた緩衝液の形態で添加することが好ましい。なお、添加された緩衝液は凍結乾燥等の処理により緩衝液中の水分が除去され、かような場合には緩衝剤として酵素組成物中に存在する。
【００４２】
本発明で使用される具体的な緩衝液としては、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳもしくはＨＥＰＥＳなどのＧＯＯＤ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液やグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液などのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが用いられる。これらの中でも、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液またはグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液のようなグリシルグリシン緩衝液が好ましい。また、上記緩衝液の濃度は特に制限されないが、好ましくは０．５〜５００ｍＭ、より好ましくは０．７５〜４００ｍＭ、最も好ましくは１〜３００ｍＭである。なお、本発明において緩衝液の濃度とは、緩衝液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。０．５ｍＭ以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、５００ｍＭ以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。また、上記緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは４．０〜１１．０、より好ましくは５．０〜１０．０の範囲である。
【００４３】
本発明の酵素組成物は、安定化剤としてさらに非還元糖を含むことが好ましい。非還元糖は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の酵素組成物の保存安定性を向上しうる。
【００４４】
本発明において、「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基をもたないために還元性を有しない糖類を意味する。このような還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士の結合したトレハロース型小糖類、糖類の還元基および非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型小糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコールなどが挙げられる。中でも、トレハロース、ラフィノース、スクロースが好ましく、特にトレハロースおよびラフィノースが好ましい。また、これらのうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。これらの還元糖は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４５】
本発明の酵素組成物に含まれる非還元糖の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、酵素組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜２００質量％、より好ましくは５〜１００質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２００質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。
【００４６】
本発明の酵素組成物は、安定化剤としてさらに２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を含むことが好ましい。本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の組成物の保存安定性を向上させうる。
【００４７】
本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物としては、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上でき、かつ、２価のイオンを形成する化合物であれば特に制限されない。上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の具体的な例としては、カルシウム、マグネシウム、バリウム、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、水銀、鉛および亜鉛などの２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物が挙げられる。中でも、カルシウムを含む化合物およびマグネシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。また、上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の形態は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できるものであれば特に制限されないが、例えば、上記金属のフッ化物、塩化物、臭化物、もしくはヨウ化物などのハロゲン化物、上記金属の硫酸塩、上記金属の硝酸塩、または上記金属のリン酸塩などが挙げられる。これらの中でも、塩化物、硫酸塩、および硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なお、これら２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は単独で使用されても、また２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００４８】
本発明の酵素組成物に含まれる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、３０質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められ、また、本発明の組成物を緩衝液等で再溶解する際、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を溶解できる。
【００４９】
本発明の酵素組成物は、本発明の目的を損なわない範囲内で、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤などの付加成分を所望に応じて含有することができる。
【００５０】
本発明の酵素組成物の形態は特に制限されず、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体形態；液状、乳液状等の液体形態；またはペースト状等の半固体形態などの、任意の形態でありうる。中でも、本発明の効果が顕著に発揮されることから、固体状の形態であることが好ましい。
【００５１】
本発明の酵素組成物の製造方法は、特に制限されないが、上記の方法で得られる部分精製酵素や精製酵素の溶液は、濃縮されることが好ましい。濃縮することにより、酵素溶液中の酵素濃度が濃くなるため、酵素の失活が抑えられる場合がある。また、凍結乾燥等により粉末状の酵素組成物を調製する場合は、酵素濃度が濃い方が凍結乾燥等の処理による酵素の失活を有意に抑えることができる場合があるからである。さらに、濃縮することにより、粉末にする工程において、液量が減少するため小スケールで処理することができる。
【００５２】
本発明の酵素溶液の濃縮方法は、特に制限されないが、例えば、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに上述した安定化剤を添加し、各成分が均一に分散した酵素溶液を調製した後、この酵素溶液を濃縮してもよく、また、濃縮後に安定化剤を添加する方法などが挙げられる。酵素溶液を濃縮する方法としては、限外ろ過法、各種クロマトグラフィー法、塩析法などが挙げられるが、酵素の失活が少なく、且つ簡便であることから、限外ろ過法が好ましい。
【００５３】
酵素組成物中のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を低減する方法は、特に制限されず、限外ろ過法、各種クロマトグラフィー法、界面活性剤を吸着する樹脂等を使用することができる。
【００５４】
従来から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）を含むＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨにポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）などの安定化剤を添加して酵素溶液を調製し、これを限外ろ過により濃縮する方法で製造する方法が用いられていた。しかし、従来の方法では、この濃縮前の酵素溶液中の界面活性剤の濃度は酵素の安定化効果が十分に得られるように通常、過剰量の臨界ミセル濃度以上とされていた。このため、ミセルを形成した界面活性剤は、酵素と共に濃縮され、濃縮後に得られた酵素組成物やその凍結乾燥物中に多量の界面活性剤が含まれていた。
【００５５】
これに対して、本発明の一実施形態では、従来から知られている濃度よりも薄い濃度の界面活性剤を含有する酵素溶液を限外ろ過により濃縮する。これにより、界面活性剤が効率よく限外ろ過膜を通過することができ、濃縮後に得られた酵素組成物中の界面活性剤の含有量を低減することが可能となる。酵素組成物中の界面活性剤の含有量を従来から知られる量よりも低減させることにより、酵素組成物の安定性が向上し、ひいては、ポリオール脱水素酵素が化学修飾されていない場合であっても、酵素の失活を有意に抑制することができる。このように、本実施形態によれば、簡便かつ安価な方法により、保存安定性の向上した酵素組成物が得られる。
【００５６】
より具体的には、まず、ＰＱＱ依存性ＰＤＨおよび上述した界面活性剤などの安定化剤を含む酵素溶液を調製する。この際、安定化剤としての緩衝剤は予め水に溶解された緩衝液の形態で使用することが好ましい。また、酵素溶液の調製時においては、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを均一に分散させるために、酵素溶液１００ｍＬ中に、界面活性剤の含有量を０．０１５〜２０ｇとすることが好ましく、０．０２０〜１０ｇとすることが好ましい。なお、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）や緩衝液（緩衝剤）などの安定化剤の添加順序も特に制限されず、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、各成分を順次添加してもよく、各成分を同時に添加してもよい。
【００５７】
その後、限外ろ過前に、緩衝液を添加して酵素溶液を希釈することにより、酵素溶液中の界面活性剤としてのポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を低減させる。限外ろ過前の酵素溶液中のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度としては、この界面活性剤が効率よく限外ろ過膜を通過できるような薄い濃度であればよい。
【００５８】
すなわち、本発明の一実施形態によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝液と、を含み、前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度が０．１ｗ／ｖ％未満である酵素溶液を限外ろ過する工程を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の製造方法が提供される。限外ろ過される酵素溶液中の前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度は、より好ましくは０．０７５ｗ／ｖ％以下であり、さらに好ましくは０．０５ｗ／ｖ％以下である。かかる場合には、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）が効率よく限外ろ過膜を通過でき、組成物中のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を低減することができる。
【００５９】
より好ましい実施形態において、前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を臨界ミセル濃度未満である酵素溶液を限外ろ過する工程を有する。界面活性剤であるポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）は、臨界ミセル濃度未満にすることにより、簡便な方法で効率よくポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を減少させることが可能となる。例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標））の臨界ミセル濃度は０．０１５ｗ／ｖ％であるため、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）を使用する場合には、濃縮前の酵素組成物中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）の濃度を０．０１５ｗ／ｖ％未満とすればよい。なお、該ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）などの界面活性剤が臨界ミセル濃度未満でも失活することはない。また、「１ｗ／ｖ％」は溶液１００ｍＬ中に１ｇの界面活性剤が含まれた場合の濃度をいう。
【００６０】
なお、限外ろ過の際の酵素溶液中のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度の下限値は特に制限されないが、酵素活性を失活させないため０．００５ｗ／ｖ％以上であるのが好ましい。
【００６１】
限外ろ過に使用する限外ろ過膜の分画分子量は、酵素のロスがなく、且つポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）が効率よく減量できるとの観点から５，０００〜１００，０００であり、より好ましくはであり、７，５００〜７５，０００でありさらに好ましくは１０，０００〜５０，０００である。５，０００未満では、濃縮速度が遅すぎる場合があり、１００，０００より大きいと、ＰＱＱ依存性ＰＤＨが限外ろ過膜を通過してしまい、酵素の回収率が低下する場合があるためである。なお、本発明において、酵素溶液の限外ろ過は１回のみでもよいし、複数回行ってもよい。界面活性剤の濃度を低減させた限外ろ過工程を少なくとも１回行うことにより、界面活性剤が効率よく限外濾過膜を通過することができ、その結果濃縮物中に含まれる界面活性剤であるポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を低減させることができる。
【００６２】
安定化剤として非還元糖、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物、および／またはその他の付加成分を含む場合のこれらの成分の添加順序や添加時期は特に制限されず、酵素溶液調製の際に、上記の方法と同様に、これらの成分を順次または同時にＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して添加してもよいし、限外ろ過後に得られた酵素組成物にこれらの成分を順次または同時に添加してもよい。
【００６３】
上記手順により液体形態の酵素組成物が得られるが、本発明の酵素組成物は粉末状などの固体形態であってもよい。本発明の酵素組成物が粉末状とする場合は、限外ろ過されて得た酵素組成物を凍結乾燥すればよい。すなわち、本発明の製造方法は、前記限外ろ過されて得た酵素組成物を凍結乾燥する工程をさらに有する。この際、凍結乾燥の方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。本発明により得られた凍結乾燥された酵素組成物においては、凍結乾燥時のＰＱＱ依存性ＰＤＨの失活が抑制されるとともに、凍結乾燥後のＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性が有意に向上する。
【００６４】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、フェナジニウムメチルサルフェートおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等が挙げられる。
【００６５】
本発明の別の一形態によれば、本発明の上記形態の酵素組成物を含むポリオール測定試薬が提供される。また、本発明のさらに別の一形態によれば、本発明の上記形態の酵素組成物をポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法が提供される。本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールの定量に優れるため、ポリオール測定試薬として好適に使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは補欠分子族としてＰＱＱを有するため、あえてＰＱＱを反応系に添加することなく、ポリオールを定量することができる。
【００６６】
本発明において「ポリオール」とは、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）を意味する。本発明で用いられるポリオールとしては、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、またはラクチトールなどのニ糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、またはリビトールなどのペンチトール、マンニトール、またはソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくはグリセロールである。
【００６７】
本発明のポリオール測定試薬は、ポリオールを定量するための試薬であり、ポリオール脱水素酵素組成物中にＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む。ポリオール脱水素酵素として、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴がある。例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として、本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００６８】
本発明の定量方法に用いられるポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿または全血などが挙げられる。また、本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清、血漿、または全血などの中性脂肪測定にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、例えば、リポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解されるが、ここで生じたグリセロールを上記のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いて定量することができる。精神病治療患者および透析患者においては、中性脂肪測定時に遊離グリセロールが問題になるが、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、グリセロールを予め消去するか、またはその量を測定しておくことにより、真の中性脂肪値を求めることが可能となる。なお、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【実施例】
【００６９】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。
【００７０】
（酵素活性）
５０μＭ ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、０．２ｍＭ ＰＭＳ（５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート）、および４５０ｍＭ グリセロールを含んだ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）中に、酵素溶液を加えた。この溶液中の酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
【００７１】
［調製例１：非修飾ＰＤＨの調製］
ソルビトール ２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー ０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン １ｇ／１００ｍＬ、尿素 ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／１００ｍＬ、およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／１００ｍＬからなり、ｐＨが７．０である培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００７２】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。
【００７３】
次に、上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃の条件で２６時間培養した。
【００７４】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００７５】
この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が１ｇ／１００ｍＬとなるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００７６】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）で一晩透析することにより、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液と称する。
【００７７】
［実施例１］
（１）ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の濃縮
調製例１で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍＬに６倍量（１２０ｍＬ）の１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を添加し、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度を臨界ミセル濃度未満（０．０１４％ｗ／ｖ）にした。このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００７８】
（２）２８０ｎｍにおける吸光度の測定
上記（１）で得たＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液をローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。この酵素溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（株式会社島津製作所製）を用いて測定した。結果を表１に示す。
【００７９】
（３）粉末安定性の検討
（２）で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度：５ｍｇ／ｍＬ）に対蛋白量あたりそれぞれ６０％、５％となるようにトレハロースおよび硫酸マグネシウムを添加した。
【００８０】
添加後、ゆるく撹拌し、−８０℃で凍結させた。凍結後、凍結乾燥を２４時間行い粉末状の酵素組成物を得た。得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表１に示す。
【００８１】
［実施例２］
調製例１で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍＬに４倍量（８０ｍＬ）の１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を添加した。このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００８２】
上記で得たＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液を使用すること以外は実施例１と同様の方法により、２８０ｎｍにおける吸光度の測定および粉末安定性の検討を行った。結果を表１に示す。
【００８３】
［実施例３］
調製例１で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍＬに２倍量（４０ｍＬ）の１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を添加した。このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００８４】
上記で得たＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液を使用すること以外は実施例１と同様の方法により、２８０ｎｍにおける吸光度の測定および粉末安定性の検討を行った。結果を表１に示す。
【００８５】
［比較例１］
調製例１で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍＬをそのまま限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００８６】
上記で得たＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液を使用すること以外は実施例１と同様の方法により、２８０ｎｍにおける吸光度の測定および粉末安定性の検討を行った。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
上記表１に示される結果から、従来から知られているＴｒｉｔｏｎＸ−１００量に比べてＴｒｉｔｏｎＸ−１００量を低減することにより、粉末酵素組成物の安定性が向上していることがわかる。すなわち、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である実施例１〜３は、当該２８０ｎｍにおける吸光度が当該範囲を外れる比較例１に比べて酵素の残存活性を有意に向上させることができることが確認される。そして、実施例１〜３で得られた凍結乾燥物では３７℃で１週間インキュベートした後の酵素の残存活性（単位：％）が８０％以上であり、化学修飾を行わなくても安定性の向上した酵素組成物が得られることがわかる。
【００８９】
［調製例２：修飾ＰＤＨの調製］
調製例１と同様の方法により、培養・遠心分離・透析を行い、可溶化膜画分を得た。
【００９０】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することにより、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品（グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨとも称する）を得た。
【００９１】
次いで、該グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ）に、０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、蛋白濃度を０．６２５ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。調製したＰＤＨ（比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度０．６２５ｍｇ／ｍＬ） ４０ｍＬに、終濃度０．２ｇ／１００ｍＬになるように１ｇ／１００ｍＬ グルタルアルデヒド溶液 １０ｍＬを加え、２０℃で６０分間穏やかに撹拌した。
【００９２】
続いて、０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬ加え、２０℃で３０分間反応させることにより架橋反応を停止した。反応終了後、０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）で一晩透析することにより蛋白濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ、比活性２８Ｕ／ｍｇ蛋白の修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を得た。
【００９３】
［比較例２］
（１）修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の濃縮
調製例２で得られた修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ、比活性２８Ｕ／ｍｇ蛋白） ５０ｍＬをそのまま限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００９４】
（２）２８０ｎｍにおける吸光度の調整
上記で得た修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液をローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。この酵素溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（株式会社島津製作所製）を用いて測定した。
【００９５】
（３）粉末安定性の検討
（２）で得られた修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度：５ｍｇ／ｍＬ）に対蛋白量あたりそれぞれ６０％、５％となるようにトレハロースおよび硫酸マグネシウムを添加した。
【００９６】
添加後、ゆるく撹拌し、−８０℃で凍結させた。凍結後、凍結乾燥を２４時間行い粉末状の酵素組成物を得た。得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表２に示す。
【００９７】
【表２】
【００９８】
表２から、修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いた場合（比較例２）には酵素の残存活性は２８０ｎｍにおける吸光度が１６を超える、すなわち、酵素組成物中に高濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００が含まれる場合であっても、未修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いた場合（比較例１）に比べて酵素の残存活性の低下が小さいことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上させることが可能であるため、本発明の酵素組成物は、正確にポリオールを定量することにおいて好適に使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）の保存安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の保存安定性を向上させたポリオール脱水素酵素組成物、当該組成物を含むポリオール測定試薬、および当該組成物を用いたポリオールの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在し、グルコノバクター属の細菌などから抽出、精製する方法が知られており、グリセロールやソルビトール、マンニトールなどの定量に利用されている。
【０００３】
従来から、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）もしくはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかし、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑である。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００６】
溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すようなＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた方法が知られている。
【０００７】
【化２】
【０００８】
しかし、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた場合、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼと同様、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００９】
これに対して、より安価で簡便なグリセロールの定量方法として、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を用いる方法がある。この方法は、下記式（４）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がないなどのメリットがある。
【００１０】
【化３】
【００１１】
しかし、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、膜結合型酵素であるため、保存安定性が悪いという問題点がある。このような安定性が低い酵素を用いた測定試薬では、保存中に酵素の失活が起こり測定対象物質の濃度を正確に定量することができないという問題があった。したがって、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させることが重要な課題となっている。
【００１２】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させる方法として、２価性架橋試薬により酵素を化学修飾する方法が知られている（特許文献１など）。
【００１３】
これに加えて、特許文献２には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を安定化剤として用いることにより保存安定性の向上した酵素組成物が得られることが開示されている。特許文献３には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、２価の金属イオンを有する化合物、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、界面活性剤とを安定化剤として使用することにより、安定なポリオール脱水素酵素組成物が得られることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００６−２７１２５７号公報
【特許文献２】特開２００７−２５９８１４号公報
【特許文献３】特開２００８−２４５５３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記特許文献１に記載の方法は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾することにより酵素の安定性を向上させている。しかし、かような酵素の化学修飾工程は煩雑であり、酵素の製造コストが増大するという問題がある。
【００１６】
また、特許文献２や特許文献３に記載の方法では、金属化合物や界面活性剤などの安定化剤を添加することにより酵素の安定性を向上させている。しかし、特許文献２および特許文献３に記載の方法においても化学修飾された酵素を使用しており、化学修飾した酵素を用いた場合には酵素の安定性が向上するものの、化学修飾されていない酵素を使用する場合には依然として酵素の残存活性が低下するという問題があった。
【００１７】
そこで本発明は、安価かつ簡便に酵素の保存安定性が向上したポリオール脱水素酵素組成物を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、正確にポリオールを定量できる上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を含むポリオール測定試薬、および上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を用いたポリオールの定量方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記従来の問題点に鑑み、鋭意研究を積み重ねた結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に対して、酵素組成物中に含まれる界面活性剤であるポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の量を低減することにより、ポリオール脱水素酵素の安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物であって、前記酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である、ポリオール脱水素酵素組成物である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、酵素組成物中に含まれる界面活性剤の量が低減されることにより、安価かつ簡便な方法でＰＱＱ依存性ＰＤＨの経時的な酵素活性の低下、特に凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止することができる。特に、本発明により得られる酵素組成物では、化学修飾されていない酵素を使用する場合であっても、酵素の失活を抑制し、酵素の保存安定性を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一形態によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物であって、前記酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である、ポリオール脱水素酵素組成物が提供される。
【００２２】
ポリオール脱水素酵素は細胞膜結合型酵素であり、疎水性が高いために水溶媒系では不安定である。このため、溶液中におけるポリオール脱水素酵素の凝集を防ぎ、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上させる目的で、酵素の安定化剤として界面活性剤を使用することが知られていた。そして、従来の酵素組成物においては、界面活性剤による酵素の安定化効果が十分に得られるように酵素組成物中には高濃度の界面活性剤が含まれていた。
【００２３】
本発明者らは界面活性剤とポリオール脱水素酵素の安定性との関係を詳細に検討した結果、高濃度の界面活性剤がポリオール脱水素酵素の失活を招くことを見出した。特に、高濃度の界面活性剤による酵素の失活は、化学修飾されていないポリオール脱水素酵素の場合に顕著であった。従来の酵素組成物では保存安定性を向上させた化学修飾された酵素を使用することが多く、高濃度の界面活性剤を使用することによる酵素の保存安定性の低下は重大な問題とならなかった。
【００２４】
本発明では、酵素組成物中の界面活性剤の含有量を従来のものに比べて低減することにより、酵素が化学修飾されていない場合であっても酵素の失活を有意に抑制することができる。したがって、高コストな酵素の化学修飾工程を行わなくても、保存安定性の向上した酵素組成物が提供される。
【００２５】
本発明の酵素組成物はＰＱＱ依存性ＰＤＨおよびＰＱＱ依存性ＰＤＨを安定化する安定化剤を含む。そして、本発明の酵素組成物に含まれる安定化剤は界面活性剤として、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含み、さらに、好ましくは、必要に応じて、非還元糖および／または２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を含む。
【００２６】
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）は、いずれのポリオールを基質としてもよく、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されない。例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、およびマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とし、より好ましくはグリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）を基質とする。
【００２７】
本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨとしては、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など、様々な細菌が生成することが知られている。本発明では、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができる菌（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌」とも称する）が生成するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。これらの中でも特に、グルコノバクター属に由来するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。
【００２８】
また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌であれば、これらの自然突然変異株または人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法と同様にしてもしくは当業者に周知の方法を適宜修飾してまたはこれらの方法を適宜組合せて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）が使用され、特にグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が好ましく使用される。
【００２９】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は、特に制限されず、例えば、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を栄養培地にて培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する方法が挙げられる。
【００３０】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２２〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９の範囲、好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素でも、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００３２】
次いで、得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等を用いることができる。抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。
【００３３】
なお、上述したように、本発明ではＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾しなくても、保存安定性が有意に向上した酵素組成物が得られるため、上記の方法で得られる部分精製酵素や精製酵素の溶液をそのままの形態で、すなわち、化学修飾されていないＰＱＱ依存性ＰＤＨ（非修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を使用することが好ましい。ただし、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾された形態で使用してももちろんよい。化学修飾された形態のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来のＰＱＱ依存性ＰＤＨを、例えば、特許文献１に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
【００３４】
本発明では、界面活性剤としてポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）を含有する。かかる形態によれば、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性が向上し、また、本発明の酵素組成物の保存安定性が向上する。さらに、酵素組成物を緩衝液等で再溶解する際、溶解速度が速いという効果がある。ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）としては、市販品であるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を使用することができる。
【００３５】
このポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標））の含有量は、本来であれば、質量分率（質量％）で規定することが望ましいが、下記理由により現状では規定困難である。
【００３６】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）の定量方法としては、（１）ＰＱＱ依存性ＰＤＨを加熱やトリクロロ酢酸等により変性後、遠心分離することにより沈殿させ、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含まない上清の２８０ｎｍの吸光度を測定する方法や（２）ＪＩＳ法により測定する方法などが考えられる。しかし、（１）の方法では、完全にＰＱＱ依存性ＰＤＨを沈殿させることが困難であり、測定誤差が生じる。また、（２）の方法では、ＰＱＱ依存性ＰＤＨが発色反応を妨害し、定量できないという問題が生じる。そこで本発明者らは簡易なＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）量の確認方法として、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度により規定することとした。具体的には、ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように濃度調整されたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を調製し、このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（株式会社島津製作所製）により測定した場合の吸光度の大きさにより酵素組成物中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）の含有量を評価することとした。なお、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の濃度の調整は濃縮することにより行うことができる。ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）は界面活性剤等の干渉を受けにくく、高精度な蛋白質の定量法として知られている。なお、標準液としては牛血清アルブミンを用いた。一方、酵素組成物中の蛋白質およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００は波長２８０ｎｍで吸光を示し、当該２８０ｎｍにおける吸光度の大きさは酵素組成物中に含まれる蛋白質およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００の合計量に対応する。したがって、ローリー法により蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液、すなわち同一の蛋白濃度を有する溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）量の確認することができる。
【００３７】
具体的には、酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が好ましくは６〜１６の範囲であり、より好ましくは６〜１４の範囲であり、特に好ましくは６〜１２の範囲である。６未満である場合にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００の量が少なすぎて安定化効果が得られず、１６を超える場合にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００が高濃度となり、保存安定性が低下する。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の含有量をこの吸光度の値が上記範囲とすることにより、酵素の失活を防止し、酵素組成物の保存安定性を向上させることが可能となる。なお、特許文献２または３に記載のＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度は、限外ろ過時にＴｒｉｔｏｎＸ−１００が濃縮されることを考慮していないため、実際の組成物中の濃度を正確に規定していない。
【００３８】
本発明の酵素組成物は、安定化剤として緩衝剤を含有する。緩衝剤を添加することにより、ｐＨを酵素に好適な範囲と調節することができ、酵素の保存安定性を向上させることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、酢酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸、またはイミダゾールなどが挙げられる。中でも、低濃度の安定化剤でＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる点で、グリシルグリシンを使用することが好ましい。グリシルグリシンはアミノ酸系緩衝剤の一種であるが、グリシンなどの他のアミノ酸系緩衝剤やＭＯＰＳなどの他のよく知られている緩衝剤を含む酵素組成物に比べて、酵素の残存活性を飛躍的に向上させることができる。
【００３９】
本発明の酵素組成物に含まれる緩衝剤の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に限定されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは２〜２５０質量％、より好ましくは３〜２００質量％である。さらに好ましくは５〜１５０質量％である。２質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２５０質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。
【００４０】
また、本発明の酵素組成物において、緩衝剤に加えて酸またはアルカリなどのｐＨ調整剤を含むことが好ましい。これにより、酵素組成物のｐＨを所望の範囲に調整することができる。本発明の酵素組成物のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは６．０〜１１．０、より好ましくは６．５〜１０．５、最も好ましくは７．０〜１０．０である。なお、酵素組成物のｐＨとは、酵素組成物が溶液形態や半固体形態の場合には当該酵素組成物のｐＨをいい、酵素組成物が固体形態の場合には当該酵素組成物１ｇを１００ｍｌ水溶液とした際の当該水溶液のｐＨをいう。かようなｐＨ調整剤としては、塩酸等の酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリが挙げられる。ｐＨ調整剤の含有量は特に制限されず、所望のｐＨが実現される量を用いればよい。
【００４１】
緩衝剤を添加する方法は特に制限されず、緩衝剤をそのまま添加してもよいが、緩衝剤を予め水に溶解させた緩衝液の形態で添加することが好ましい。なお、添加された緩衝液は凍結乾燥等の処理により緩衝液中の水分が除去され、かような場合には緩衝剤として酵素組成物中に存在する。
【００４２】
本発明で使用される具体的な緩衝液としては、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳもしくはＨＥＰＥＳなどのＧＯＯＤ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液やグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液などのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが用いられる。これらの中でも、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液またはグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液のようなグリシルグリシン緩衝液が好ましい。また、上記緩衝液の濃度は特に制限されないが、好ましくは０．５〜５００ｍＭ、より好ましくは０．７５〜４００ｍＭ、最も好ましくは１〜３００ｍＭである。なお、本発明において緩衝液の濃度とは、緩衝液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。０．５ｍＭ以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、５００ｍＭ以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。また、上記緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは４．０〜１１．０、より好ましくは５．０〜１０．０の範囲である。
【００４３】
本発明の酵素組成物は、安定化剤としてさらに非還元糖を含むことが好ましい。非還元糖は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の酵素組成物の保存安定性を向上しうる。
【００４４】
本発明において、「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基をもたないために還元性を有しない糖類を意味する。このような還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士の結合したトレハロース型小糖類、糖類の還元基および非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型小糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコールなどが挙げられる。中でも、トレハロース、ラフィノース、スクロースが好ましく、特にトレハロースおよびラフィノースが好ましい。また、これらのうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。これらの還元糖は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４５】
本発明の酵素組成物に含まれる非還元糖の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、酵素組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜２００質量％、より好ましくは５〜１００質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２００質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。
【００４６】
本発明の酵素組成物は、安定化剤としてさらに２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を含むことが好ましい。本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の組成物の保存安定性を向上させうる。
【００４７】
本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物としては、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上でき、かつ、２価のイオンを形成する化合物であれば特に制限されない。上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の具体的な例としては、カルシウム、マグネシウム、バリウム、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、水銀、鉛および亜鉛などの２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物が挙げられる。中でも、カルシウムを含む化合物およびマグネシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。また、上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の形態は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できるものであれば特に制限されないが、例えば、上記金属のフッ化物、塩化物、臭化物、もしくはヨウ化物などのハロゲン化物、上記金属の硫酸塩、上記金属の硝酸塩、または上記金属のリン酸塩などが挙げられる。これらの中でも、塩化物、硫酸塩、および硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なお、これら２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は単独で使用されても、また２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００４８】
本発明の酵素組成物に含まれる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、３０質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められ、また、本発明の組成物を緩衝液等で再溶解する際、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を溶解できる。
【００４９】
本発明の酵素組成物は、本発明の目的を損なわない範囲内で、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤などの付加成分を所望に応じて含有することができる。
【００５０】
本発明の酵素組成物の形態は特に制限されず、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体形態；液状、乳液状等の液体形態；またはペースト状等の半固体形態などの、任意の形態でありうる。中でも、本発明の効果が顕著に発揮されることから、固体状の形態であることが好ましい。
【００５１】
本発明の酵素組成物の製造方法は、特に制限されないが、上記の方法で得られる部分精製酵素や精製酵素の溶液は、濃縮されることが好ましい。濃縮することにより、酵素溶液中の酵素濃度が濃くなるため、酵素の失活が抑えられる場合がある。また、凍結乾燥等により粉末状の酵素組成物を調製する場合は、酵素濃度が濃い方が凍結乾燥等の処理による酵素の失活を有意に抑えることができる場合があるからである。さらに、濃縮することにより、粉末にする工程において、液量が減少するため小スケールで処理することができる。
【００５２】
本発明の酵素溶液の濃縮方法は、特に制限されないが、例えば、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに上述した安定化剤を添加し、各成分が均一に分散した酵素溶液を調製した後、この酵素溶液を濃縮してもよく、また、濃縮後に安定化剤を添加する方法などが挙げられる。酵素溶液を濃縮する方法としては、限外ろ過法、各種クロマトグラフィー法、塩析法などが挙げられるが、酵素の失活が少なく、且つ簡便であることから、限外ろ過法が好ましい。
【００５３】
酵素組成物中のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を低減する方法は、特に制限されず、限外ろ過法、各種クロマトグラフィー法、界面活性剤を吸着する樹脂等を使用することができる。
【００５４】
従来から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）を含むＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨにポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）などの安定化剤を添加して酵素溶液を調製し、これを限外ろ過により濃縮する方法で製造する方法が用いられていた。しかし、従来の方法では、この濃縮前の酵素溶液中の界面活性剤の濃度は酵素の安定化効果が十分に得られるように通常、過剰量の臨界ミセル濃度以上とされていた。このため、ミセルを形成した界面活性剤は、酵素と共に濃縮され、濃縮後に得られた酵素組成物やその凍結乾燥物中に多量の界面活性剤が含まれていた。
【００５５】
これに対して、本発明の一実施形態では、従来から知られている濃度よりも薄い濃度の界面活性剤を含有する酵素溶液を限外ろ過により濃縮する。これにより、界面活性剤が効率よく限外ろ過膜を通過することができ、濃縮後に得られた酵素組成物中の界面活性剤の含有量を低減することが可能となる。酵素組成物中の界面活性剤の含有量を従来から知られる量よりも低減させることにより、酵素組成物の安定性が向上し、ひいては、ポリオール脱水素酵素が化学修飾されていない場合であっても、酵素の失活を有意に抑制することができる。このように、本実施形態によれば、簡便かつ安価な方法により、保存安定性の向上した酵素組成物が得られる。
【００５６】
より具体的には、まず、ＰＱＱ依存性ＰＤＨおよび上述した界面活性剤などの安定化剤を含む酵素溶液を調製する。この際、安定化剤としての緩衝剤は予め水に溶解された緩衝液の形態で使用することが好ましい。また、酵素溶液の調製時においては、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを均一に分散させるために、酵素溶液１００ｍＬ中に、界面活性剤の含有量を０．０１５〜２０ｇとすることが好ましく、０．０２０〜１０ｇとすることが好ましい。なお、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）や緩衝液（緩衝剤）などの安定化剤の添加順序も特に制限されず、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、各成分を順次添加してもよく、各成分を同時に添加してもよい。
【００５７】
その後、限外ろ過前に、緩衝液を添加して酵素溶液を希釈することにより、酵素溶液中の界面活性剤としてのポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を低減させる。限外ろ過前の酵素溶液中のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度としては、この界面活性剤が効率よく限外ろ過膜を通過できるような薄い濃度であればよい。
【００５８】
すなわち、本発明の一実施形態によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝液と、を含み、前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度が０．１ｗ／ｖ％未満である酵素溶液を限外ろ過する工程を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の製造方法が提供される。限外ろ過される酵素溶液中の前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度は、より好ましくは０．０７５ｗ／ｖ％以下であり、さらに好ましくは０．０５ｗ／ｖ％以下である。かかる場合には、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）が効率よく限外ろ過膜を通過でき、組成物中のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を低減することができる。
【００５９】
より好ましい実施形態において、前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を臨界ミセル濃度未満である酵素溶液を限外ろ過する工程を有する。界面活性剤であるポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）は、臨界ミセル濃度未満にすることにより、簡便な方法で効率よくポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を減少させることが可能となる。例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標））の臨界ミセル濃度は０．０１５ｗ／ｖ％であるため、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）を使用する場合には、濃縮前の酵素組成物中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）の濃度を０．０１５ｗ／ｖ％未満とすればよい。なお、該ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）などの界面活性剤が臨界ミセル濃度未満でも失活することはない。また、「１ｗ／ｖ％」は溶液１００ｍＬ中に１ｇの界面活性剤が含まれた場合の濃度をいう。
【００６０】
なお、限外ろ過の際の酵素溶液中のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度の下限値は特に制限されないが、酵素活性を失活させないため０．００５ｗ／ｖ％以上であるのが好ましい。
【００６１】
限外ろ過に使用する限外ろ過膜の分画分子量は、酵素のロスがなく、且つポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）が効率よく減量できるとの観点から５，０００〜１００，０００であり、より好ましくはであり、７，５００〜７５，０００でありさらに好ましくは１０，０００〜５０，０００である。５，０００未満では、濃縮速度が遅すぎる場合があり、１００，０００より大きいと、ＰＱＱ依存性ＰＤＨが限外ろ過膜を通過してしまい、酵素の回収率が低下する場合があるためである。なお、本発明において、酵素溶液の限外ろ過は１回のみでもよいし、複数回行ってもよい。界面活性剤の濃度を低減させた限外ろ過工程を少なくとも１回行うことにより、界面活性剤が効率よく限外濾過膜を通過することができ、その結果濃縮物中に含まれる界面活性剤であるポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度を低減させることができる。
【００６２】
安定化剤として非還元糖、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物、および／またはその他の付加成分を含む場合のこれらの成分の添加順序や添加時期は特に制限されず、酵素溶液調製の際に、上記の方法と同様に、これらの成分を順次または同時にＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して添加してもよいし、限外ろ過後に得られた酵素組成物にこれらの成分を順次または同時に添加してもよい。
【００６３】
上記手順により液体形態の酵素組成物が得られるが、本発明の酵素組成物は粉末状などの固体形態であってもよい。本発明の酵素組成物が粉末状とする場合は、限外ろ過されて得た酵素組成物を凍結乾燥すればよい。すなわち、本発明の製造方法は、前記限外ろ過されて得た酵素組成物を凍結乾燥する工程をさらに有する。この際、凍結乾燥の方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。本発明により得られた凍結乾燥された酵素組成物においては、凍結乾燥時のＰＱＱ依存性ＰＤＨの失活が抑制されるとともに、凍結乾燥後のＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性が有意に向上する。
【００６４】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、フェナジニウムメチルサルフェートおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等が挙げられる。
【００６５】
本発明の別の一形態によれば、本発明の上記形態の酵素組成物を含むポリオール測定試薬が提供される。また、本発明のさらに別の一形態によれば、本発明の上記形態の酵素組成物をポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法が提供される。本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールの定量に優れるため、ポリオール測定試薬として好適に使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは補欠分子族としてＰＱＱを有するため、あえてＰＱＱを反応系に添加することなく、ポリオールを定量することができる。
【００６６】
本発明において「ポリオール」とは、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）を意味する。本発明で用いられるポリオールとしては、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、またはラクチトールなどのニ糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、またはリビトールなどのペンチトール、マンニトール、またはソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくはグリセロールである。
【００６７】
本発明のポリオール測定試薬は、ポリオールを定量するための試薬であり、ポリオール脱水素酵素組成物中にＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む。ポリオール脱水素酵素として、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴がある。例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として、本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００６８】
本発明の定量方法に用いられるポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿または全血などが挙げられる。また、本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清、血漿、または全血などの中性脂肪測定にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、例えば、リポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解されるが、ここで生じたグリセロールを上記のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いて定量することができる。精神病治療患者および透析患者においては、中性脂肪測定時に遊離グリセロールが問題になるが、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、グリセロールを予め消去するか、またはその量を測定しておくことにより、真の中性脂肪値を求めることが可能となる。なお、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【実施例】
【００６９】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。
【００７０】
（酵素活性）
５０μＭ ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、０．２ｍＭ ＰＭＳ（５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート）、および４５０ｍＭ グリセロールを含んだ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）中に、酵素溶液を加えた。この溶液中の酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
【００７１】
［調製例１：非修飾ＰＤＨの調製］
ソルビトール ２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー ０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン １ｇ／１００ｍＬ、尿素 ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／１００ｍＬ、およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／１００ｍＬからなり、ｐＨが７．０である培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００７２】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。
【００７３】
次に、上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃の条件で２６時間培養した。
【００７４】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００７５】
この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が１ｇ／１００ｍＬとなるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００７６】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）で一晩透析することにより、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液と称する。
【００７７】
［実施例１］
（１）ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の濃縮
調製例１で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍＬに６倍量（１２０ｍＬ）の１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を添加し、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度を臨界ミセル濃度未満（０．０１４％ｗ／ｖ）にした。このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００７８】
（２）２８０ｎｍにおける吸光度の測定
上記（１）で得たＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液をローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。この酵素溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（株式会社島津製作所製）を用いて測定した。結果を表１に示す。
【００７９】
（３）粉末安定性の検討
（２）で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度：５ｍｇ／ｍＬ）に対蛋白量あたりそれぞれ６０％、５％となるようにトレハロースおよび硫酸マグネシウムを添加した。
【００８０】
添加後、ゆるく撹拌し、−８０℃で凍結させた。凍結後、凍結乾燥を２４時間行い粉末状の酵素組成物を得た。得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表１に示す。
【００８１】
［実施例２］
調製例１で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍＬに４倍量（８０ｍＬ）の１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を添加した。このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００８２】
上記で得たＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液を使用すること以外は実施例１と同様の方法により、２８０ｎｍにおける吸光度の測定および粉末安定性の検討を行った。結果を表１に示す。
【００８３】
［実施例３］
調製例１で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍＬに２倍量（４０ｍＬ）の１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を添加した。このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００８４】
上記で得たＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液を使用すること以外は実施例１と同様の方法により、２８０ｎｍにおける吸光度の測定および粉末安定性の検討を行った。結果を表１に示す。
【００８５】
［比較例１］
調製例１で得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍＬをそのまま限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００８６】
上記で得たＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液を使用すること以外は実施例１と同様の方法により、２８０ｎｍにおける吸光度の測定および粉末安定性の検討を行った。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
上記表１に示される結果から、従来から知られているＴｒｉｔｏｎＸ−１００量に比べてＴｒｉｔｏｎＸ−１００量を低減することにより、粉末酵素組成物の安定性が向上していることがわかる。すなわち、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である実施例１〜３は、当該２８０ｎｍにおける吸光度が当該範囲を外れる比較例１に比べて酵素の残存活性を有意に向上させることができることが確認される。そして、実施例１〜３で得られた凍結乾燥物では３７℃で１週間インキュベートした後の酵素の残存活性（単位：％）が８０％以上であり、化学修飾を行わなくても安定性の向上した酵素組成物が得られることがわかる。
【００８９】
［調製例２：修飾ＰＤＨの調製］
調製例１と同様の方法により、培養・遠心分離・透析を行い、可溶化膜画分を得た。
【００９０】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することにより、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品（グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨとも称する）を得た。
【００９１】
次いで、該グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ）に、０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、蛋白濃度を０．６２５ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。調製したＰＤＨ（比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度０．６２５ｍｇ／ｍＬ） ４０ｍＬに、終濃度０．２ｇ／１００ｍＬになるように１ｇ／１００ｍＬ グルタルアルデヒド溶液 １０ｍＬを加え、２０℃で６０分間穏やかに撹拌した。
【００９２】
続いて、０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬ加え、２０℃で３０分間反応させることにより架橋反応を停止した。反応終了後、０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）で一晩透析することにより蛋白濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ、比活性２８Ｕ／ｍｇ蛋白の修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を得た。
【００９３】
［比較例２］
（１）修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の濃縮
調製例２で得られた修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ、比活性２８Ｕ／ｍｇ蛋白） ５０ｍＬをそのまま限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。
【００９４】
（２）２８０ｎｍにおける吸光度の調整
上記で得た修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨの濃縮溶液をローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。この酵素溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（株式会社島津製作所製）を用いて測定した。
【００９５】
（３）粉末安定性の検討
（２）で得られた修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度：５ｍｇ／ｍＬ）に対蛋白量あたりそれぞれ６０％、５％となるようにトレハロースおよび硫酸マグネシウムを添加した。
【００９６】
添加後、ゆるく撹拌し、−８０℃で凍結させた。凍結後、凍結乾燥を２４時間行い粉末状の酵素組成物を得た。得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表２に示す。
【００９７】
【表２】
【００９８】
表２から、修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いた場合（比較例２）には酵素の残存活性は２８０ｎｍにおける吸光度が１６を超える、すなわち、酵素組成物中に高濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００が含まれる場合であっても、未修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いた場合（比較例１）に比べて酵素の残存活性の低下が小さいことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上させることが可能であるため、本発明の酵素組成物は、正確にポリオールを定量することにおいて好適に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物であって、
前記酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である、ポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項２】
前記緩衝剤がグリシルグリシンである、請求項１に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項３】
前記ポリオール脱水素酵素は、グリセロール脱水素酵素であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項４】
非還元糖をさらに含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項５】
２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物をさらに含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項６】
前記非還元糖は、トレハロースおよびラフィノースの少なくとも一方を含有する請求項４に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項７】
前記金属化合物は、カルシウムを含む化合物およびマグネシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項５に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項８】
固体形態である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物を含む、ポリオール測定試薬。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物をポリオールと反応させる段階を有する、ポリオールの定量方法。
【請求項１１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝液と、を含み、前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度が０．１ｗ／ｖ％未満である酵素溶液を限外ろ過する工程を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度が臨界ミセル濃度未満である酵素溶液を限外ろ過する工程を有する、請求項１１に記載のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記限外ろ過されて得た酵素組成物を凍結乾燥する工程をさらに有する、請求項１１および１２に記載のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法。
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物であって、
前記酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が６〜１６の範囲である、ポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項２】
前記緩衝剤がグリシルグリシンである、請求項１に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項３】
前記ポリオール脱水素酵素は、グリセロール脱水素酵素であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項４】
非還元糖をさらに含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項５】
２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物をさらに含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項６】
前記非還元糖は、トレハロースおよびラフィノースの少なくとも一方を含有する請求項４に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項７】
前記金属化合物は、カルシウムを含む化合物およびマグネシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項５に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項８】
固体形態である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物を含む、ポリオール測定試薬。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物をポリオールと反応させる段階を有する、ポリオールの定量方法。
【請求項１１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）と、緩衝液と、を含み、前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度が０．１ｗ／ｖ％未満である酵素溶液を限外ろ過する工程を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）の濃度が臨界ミセル濃度未満である酵素溶液を限外ろ過する工程を有する、請求項１１に記載のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記限外ろ過されて得た酵素組成物を凍結乾燥する工程をさらに有する、請求項１１および１２に記載のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法。
【公開番号】特開２０１０−２３３５３２（Ｐ２０１０−２３３５３２Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８６７６６（Ｐ２００９−８６７６６）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
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