ポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型ＤＮＡを菌体から調製する方法
吸水性の担体に供試菌体を付着させて増殖させ、次いで、同担体をフェノールとＣＩＡを等量混合した混合液で処理し、さらに、遠心分離後の上清を一定量分取し、揮発し乾燥させることで、ＤＮＡ以外の夾雑物を反応に問題が無い程度に除去した鋳型ＤＮＡ試料を調製することが可能であることを見いだした。また、この方法によれば、同一条件で調製された鋳型ＤＮＡ試料を複製し保存することも可能であった。この方法で調製した鋳型ＤＮＡを利用して、ＰＣＲ反応を試みたところ、多くの糸状体の菌類や酵母において、効率的に遺伝子増幅産物が得られた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、菌体からＤＮＡを調製する方法に関する。さらに、本発明は、該方法により調製した鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ法に関する。
従来技術
生物の遺伝子ＤＮＡ配列を解析するためには、事前にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用い、解析対象の遺伝子ＤＮＡ領域を増幅することが一般的である。そのためには、鋳型ＤＮＡを調製する必要があるが、鋳型ＤＮＡを抽出する過程で、ＰＣＩ（フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール）混合液を用いる方法（非特許文献１）は、冷エタノール等で、ＤＮＡ分子の再沈殿等、ＤＮＡ分子の洗浄、純化行程が必要であった。
また、糸状体の菌類におけるＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡ試料の調製には、従来から複雑な手順と時間を要する前処理が必要であった（ＤＮＡを菌体から抽出精製する常法（非特許文献２））。また、ＤＮＡを抽出せず、少量の菌体や胞子を反応液に直接投入してＰＣＲ反応を行う、ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ（非特許文献３）やｓｐｏｒｅ ＰＣＲ法（非特許文献４）も試されているが、成功率は常法と比べると、投入する菌体の量や生育状態等の不確定要素が多く、成功率は不安定かつ低かった。後者では、反復実験やプライマー・セット等の条件を変更したＰＣＲ実験の場合にも、鋳型ＤＮＡの複製・保存ができないため、菌体を新たに培養し、試料を準備し直す必要があった。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔非特許文献１〕中山広樹（１９９６）細胞工学別冊 目で見る実験ノートシリーズ「バイオ実験イラストレイテッド」本当にふえるＰＣＲ．秀潤社刊．東京．１６２Ｐ．「５．微量ＤＮＡサンプルの調整法−−−末梢血のｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇを例に」ｐ．５２−５４．
〔非特許文献２〕Ｏ′Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｋ．，Ｃｉｇｅｌｎｉｋ，Ｅ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｎ．Ｓ．ａｎｄ Ｔｒａｐｐｅ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｔｒｕｆｆｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒｕｅ ａｎｄ ｆａｌｓｅ ｍｏｒｅｌｓ ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ １８Ｓ ａｎｄ ２８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ ８９：４８−６５．
〔非特許文献３〕中山広樹（１９９６）細胞工学別冊 目で見る実験ノートシリーズ「バイオ実験イラストレイテッド」本当にふえるＰＣＲ．秀潤社刊．東京．１６２Ｐ．「５−２ 実験例：コロニーからのダイレクトＰＣＲ」ｐ．８０−８２．
〔非特許文献４〕Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｓ．．Ｔｏｋｕｍａｓｕ，Ｓ．，Ｓｕｙａｍａ，Ｙ．ａｎｄ Ｋａｋｉｓｈｉｍａ，Ｍ．（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｉｃｔｌｙ ａｎａｍｏｒｐｈｉｃ ｇｅｎｕｓ Ｔｈｙｓａｎｏｐｈｏｒａ ｕｓｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ４３：１６９−１８０．
【発明の開示】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＤＮＡを菌体から抽出する既存の方法における、（１）時間がかかる、（２）操作手順が多く、複雑である、（３）震とう培養装置や凍結乾燥装置等の大がかりな装置類を必要とする、等の問題点、および従来のｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ法やｓｐｏｒｅ ＰＣＲ法における、（１）簡単な方法であるが、成功率が不確定である、（２）鋳型ＤＮＡの複製や保存ができない、（３）反復実験や条件変更実験の時に、同一の条件の鋳型ＤＮＡを使用できない、等の問題点を一挙に改善し、これにより簡単かつ安定してＰＣＲを実施でき、かつ調製された鋳型ＤＮＡの複製や保存が可能となるような、ＤＮＡの調製方法を提供することにある。
安定してＰＣＲを実施するためには、鋳型ＤＮＡの量や状態等、反応液内の組成を常法のように一定化することが有効である。また、大がかりな装置や多くの操作手順を要する常法の前処理の簡便化も望まれる。そこで、本発明者は、次の創意工夫を行った。
まず、栄養成分を含ませた吸水性（紙）の担体（円盤）に供試菌体を付着させて増殖させることで、必要十分量の新鮮な菌体材料を確保した。次いで、同担体をフェノールとＣＩＡを等量混合した混合液で処理し、菌体内のＤＮＡを遊離させると共に、ＰＣＲの阻害要因となるタンパク質や脂質等を変性させた。さらに、遠心分離後の上清を一定量分取し、揮発し乾燥させることで、ＤＮＡ以外の夾雑物を反応に問題が無い程度に除去した鋳型ＤＮＡ試料を調製できることを見いだした。また、この方法によれば、上清の一定量分取を複数回行い、乾燥後、冷凍保存することで、同一条件で調製された鋳型ＤＮＡ試料を複製し保存することも可能であった。本発明者は、実際に、この方法で調製した鋳型ＤＮＡを利用して、ＰＣＲ反応を試みたところ、多くの糸状体の菌類や酵母において、効率的に遺伝子増幅産物が得られることを見出した。
即ち、本発明者は、菌類（特に、糸状体の菌類）から鋳型ＤＮＡを調製する際の問題点を解決するとともに、これにより調製された鋳型ＤＮＡを利用して効率的にＰＣＲ反応を行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、より詳しくは、下記〔１〕〜〔１２〕に記載の発明を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の工程を含む、菌体からＤＮＡを調製する方法。
（ａ）担体に菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
〔２〕工程（ａ）において、担体に付着させた菌体を該担体上で培養することにより増殖させることを含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕担体が吸水性である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕担体が紙または不織布である、〔１］〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕菌体が糸状体の菌または酵母である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕菌体からポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型ＤＮＡを調製する方法である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法により菌体から調製されたＤＮＡ。
〔８〕以下の（ａ）〜（ｆ）に記載の工程を含む、ポリメラーゼ連鎖反応法。
（ａ）担体に菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
（ｆ）回収したＤＮＡとポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
〔９〕被験菌体の鑑別・同定方法であって、
（ａ）担体に被験菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された被験菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
（ｆ）回収したＤＮＡと特定の菌種に由来するＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
を含み、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物が得られた場合に、被験菌体が上記プライマーの由来菌種と同一種であると判定される方法。
〔１０〕菌体からＤＮＡを調製するために用いる菌体付着用担体。
〔１１〕担体、並びにサンプルチューブおよび／または栄養溶液を含むキット。
〔１２〕さらにフェノールおよび／またはクロロフォルムとイソアミルアルコールの混合液を含む、〔１１〕に記載のキット。
本発明は、菌体からＤＮＡを調製する新規な方法を提供する。ＤＮＡを菌体から抽出する既存の方法は、（１）時間がかかる、（２）操作手順が多く、複雑である、（３）震とう培養装置や凍結乾燥装置等の大がかりな装置類を必要とする、等の問題点があった。また、従来のｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ法やｓｐｏｒｅ ＰＣＲ法は、（１）簡単な方法であるが、成功率が不確定である、（２）鋳型ＤＮＡの複製や保存ができない、（３）反復実験や条件変更実験の時に、同一の条件の鋳型ＤＮＡを使用できない、等の問題点があった。本発明の方法により、このような問題点を一挙に改善し、菌体からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いる鋳型ＤＮＡを調製することができるようになった。本発明のＤＮＡ調製法を利用することで、簡単かつ安定してＰＣＲを実施でき、かつ調製された鋳型ＤＮＡの複製や保存が可能となった。
本発明の方法においては、まず、担体に菌体を付着させる。本発明における菌は、好ましくは糸状体の菌または酵母である。また、糸状体の菌は、糸状体であれば特に制限はなく、真菌および細菌の双方が含まれる。糸状体の真菌としては、糸状菌を例示でき、また、糸状体の細菌としては、放線菌を例示することができる。また、糸状菌としては、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｄｗａｙａｂｅｅｊａ属、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ属、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、酵母としては、特に制限はなく、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｉｍｏｒｐｈｏｍｙｃｅｓ属の酵母が挙げられる。
また、本発明における担体としては、菌体が付着可能な担体であれば制限はないが、好ましくは吸水性担体であり、より好ましくは紙または不織布であり、例えば、ろ紙、不織布ペーパー・タオル、ペーパー・タオルをろ紙等に挟んだものを適当な大きさに打ち抜くことで製造した多重紙円盤（３〜５枚重ね）、ポリプロピレン製不織布等が挙げられる。
また、本発明の担体は、後述するサンプルチューブに投入可能で、溶液と共にボルテックス・ミキサーで回転可能な大きさであることが好ましい。サンプルチューブとしてエッペンドルフサンプル・チューブを使用する場合は、約５ｍｍ直径の小円盤状担体を使用する。
また、本発明において、担体に菌体を付着させる方法としては、菌体形態に応じた種々の方法が挙げられる。例えば、以下の（１）〜（４）の方法が挙げられるが、本発明における担体に菌体を付着させる方法は、これらの方法に限定されるものではない。
（１）ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（培養初期・中・後期：菌集落の成立後）からＤＮＡを調製する場合、栄養溶液を吸収した担体を平板固化した培養基上の菌集落に接触させ、該担体に菌体を付着させる。例えば、エッペンドルフサンプル・チューブ内で栄養溶液を吸収させた担体を、ピンセット等を用いて無菌的に菌集落上に静置することで接触させることが可能である。栄養溶液としては、例えば、ＳＮ ｂｒｏｔｈ（蒸留水中、ＫＨ２ＰＯ４：０．１％，ＫＮＯ３：０．１％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５％，ＫＣｌ：０．０５％，ブドウ糖０．０２％，ショ糖０．０２％）、麦芽エキス、ＹＭ ｂｒｏｔｈ等、市販の液体培養基等を適度な濃度に希釈した物を使用することができるが、これに限定されるものではない。
（２）ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（培養開始時：培養接種直後で菌集落が未成立）からＤＮＡを調製する場合、栄養溶液を吸収した担体を平板固化した培養基上に静置し、その後増殖した菌体と接触させ、該担体に菌体を付着させる。例えば、エッペンドルフサンプル・チューブ内で栄養溶液を吸収させた担体を、平板培養基上の接種菌体（明確な菌集落はまだ無い）の隣にピンセット等で無菌的に接着して静置し、４〜７日間放置培養することで、増殖した菌体と該担体とを接触させることが可能である。増殖した菌体と該担体とが接触したか否かは、菌糸体が担体を通過生育したことを観察することで確認できる。
（３）試験管等、チューブ内の固化培養基上の菌体からＤＮＡを調製する場合、固化培養基上の菌体を栄養溶液を吸収した担体に接触させ、該担体に菌体を付着させる。例えば、固化培養基上から、滅菌柄付き針等でごく少量の菌体を取り、エッペンドルフサンプル・チューブ内の栄養溶液を吸収した担体上に接種することで接触させることが可能である。
（４）試験管やフラスコ等、容器内の液体培養基中の菌体からＤＮＡを調製する場合、液体培養基中の菌体を栄養溶液を吸収した担体に接触させ、該担体に菌体を付着させる。例えば、試験管やフラスコ等、チューブ内の液体培養基中から、滅菌ピペット等でごく少量の菌体を取り、エッペンドルフサンプル・チューブ内の栄養溶液を吸収した担体上に接種することで接触させることが可能である。
本発明においては、担体に付着させた菌体を該担体上で培養することにより増殖させて使用することもできる。
本発明の方法においては、次いで、サンプルチューブに、菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する。本発明におけるサンプルチューブとしては、例えばエッペンドルフサンプル・チューブなどの市販のチューブや、スクリュー・キャップのついたサンプルチューブ等を使用することができるが、これらに類似したサイズのサンプルチューブであれば特に制限はない。また、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液としては、例えば、ＣＩＡ混合液（クロロフォルムとイソアミルアルコールを２４：１の割合で混合）が挙げられる。サンプルチューブに、菌体が付着した担体、フェノールとＣＩＡ混合液を加える場合、フェノールとＣＩＡ混合液を等量加えることが好ましいが、この条件に限定されるものではなく、ＰＣＲ反応の障害となる菌体タンパク質の変性・失活を行え、後に遠心分離等で添加成分を除去できる条件であればよい。
また、本発明の方法においては、サンプルチューブに、菌体が付着した担体と、フェノールとＣＩＡ混合液を適量加え、ボルテックス・ミキサー等で激しく混合する（例えばフル・スピード、３０秒〜１分）。ＤＮＡは、この段階で保存することもできる。ＤＮＡを保存する場合には、そのまま冷凍保存することが好ましく、使用時は、常温解凍後、ボルテックス・ミキサー等で激しく混合し、解凍前のサンプルの状態にもどす。
本発明の方法においては、次いで、遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる。当業者であれば、周知の方法および条件で、遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降できる。
本発明の方法においては、次いで、サンプルチューブから上清を回収する。ＤＮＡ試料をＰＣＲ反応に供する場合は、上清（水層）の０．５〜５．０μｌをＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ試料として、ＰＣＲ用チューブに分注する。ＤＮＡは、この段階で保存することもできる。使用時は、常温解凍後、以下の作業に進み、水分を除去する。
本発明の方法においては、次いで、回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する。ＤＮＡ試料をＰＣＲ反応に供する場合は、上清（水層）を分注したＰＣＲ用チューブを加熱するなど、液層を完全に蒸発・乾燥させ、水層に一部移ったクロロフォルムとイソアミルアルコールを気化、除去する。ＤＮＡは、この段階で保存することもできる。すなわち、乾燥試料はそのまま冷凍保存できる。使用時は、乾燥試料をＰＣＲ反応に供する。
また、本発明は、本発明の方法によって菌体から調製されたＤＮＡ（精製されたＤＮＡも含まれる）も提供する。本発明においては、精製されたＤＮＡを得るために、当業者に周知の方法で、菌体から調製された産物の洗浄や再沈殿を行うこともできる。
本発明は、上記方法によって調製されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法もまた提供する。当業者であれば、上記方法によって調製された鋳型ＤＮＡとＰＣＲ用の反応液（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｂｕｆｆｅｒ溶液、プライマー・セット等）を混合し、周知の条件でＰＣＲ反応を行うことで、本発明のＰＣＲ法を実施できる。本発明のＰＣＲ法を使用することで、菌体（好ましくは糸状体の菌または酵母）のＤＮＡを簡便かつ再現性よく増幅できる。
本発明のＰＣＲ法を応用することにより、少量の菌体から、目的菌種の迅速な鑑別・同定が可能である。本発明は、被験菌体の迅速な鑑別・同定方法もまた提供する。本発明の鑑別・同定方法では、本発明の菌体からＤＮＡを調製する方法によって回収された被験菌体のＤＮＡと特定の菌種に由来するＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを含むＰＣＲ反応用の反応液（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｂｕｆｆｅｒ溶液等）を混合し、ＰＣＲ反応を行う。本発明の鑑別・同定方法においては、ＰＣＲ増幅産物が得られた場合に、被験菌体が供試プライマーの由来菌種と同一種であると判定される。例えば、ＰＣＲ反応後にアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色像において、ＰＣＲ増幅産物のバンドが現れた場合に、被験菌体が供試プライマーの由来菌種と同一種であると判定できる。本発明の鑑別・同定方法により、コムギ赤かび病、イネばか苗病等、多くの病害診断が可能である。
また、本発明は、本発明の方法に使用するための菌体付着用担体を提供する。本発明の菌体付着用担体としては、上述した担体を使用することができる。また、本発明の菌体付着用担体には、予め栄養溶液を吸収させた担体も含まれる。本発明の菌体付着用担体は、例えば、ろ紙に挟んだ担体素材（ろ紙、不織布、ペーパータオル）を事務用の穴空け器（パンチ）（穴のサイズ＝担体の直径）で打ち抜くことで製造できる。
さらに、本発明は、本発明の菌体付着用担体を含むキットを提供する。菌体付着用担体を含むキットは、本発明のＤＮＡ調製法に利用することができる。本発明のキットには、菌体付着用担体の他に、サンプルチューブおよび／または栄養溶液が含まれる。また、本発明のキットには、さらにフェノールやＣＩＡ混合液が含まれてもよい。フェノールとしては、例えば、平衡中性化した中性フェノールが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明のキットは、例えば、（１）菌体付着用担体が入った滅菌済みサンプルチューブとして、また、（２）ばらの菌体付着用担体、標準的な栄養溶液入りのチューブ、サンプルチューブをセットにした形態、（３）さらに（１）（２）にフェノールやＣＩＡ混合液を添付した形態等として提供できるが、これらの形態に限定されるものではない。
また、上記キットに追加してＰＣＲ用ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用Ｂｕｆｆｅｒ溶液等を含むＰＣＲ用マスターミックスを組み合わせたキットでは、さらに簡便に本発明によるＰＣＲ法を利用できる。該ＰＣＲ用ポリメラーゼとしては、当業者に周知のポリメラーゼを選択することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（実施例に記載の菌体形態１ａ＋ｂ）からのＰＣＲ増幅結果を示す写真である。レーン１−７は糸状菌類、９−１１は酵母類を示す。ＰＣＲ増幅領域は、リボソームＤＮＡのＩＴＳ（ＩＴＳ−１，ＩＴＳ−２領域），５．８Ｓ ｒＤＮＡ，２８Ｓ ｒＤＮＡ領域である。
レーン：８，１２：１００ｂｐラダー・マーカー
１：Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ（２−４−８−１）（括弧内は菌株番号を示す。以下同様。）
２：Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｓｐ．（１−６−２−１ｂ）
３：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ（１−６−２−２）
４：Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（１−４−６−３）
５：Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｍａｙｄｉｃｕｓ（１−６−４−４）
６：Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ（１−６−１０−６）
７：Ｄｗａｙａｂｅｅｊａ ｓｐ．（１−６−１０−４ａ）
９−１１：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（４７４１〜４７４３）
図２は、試験管等、チューブ内の固化培養基上の菌体（実施例に記載の菌体形態２）からのＰＣＲ増幅結果を示す写真である。同一菌株の偶数番号レーンは不織布製の担体上、奇数番号レーンはろ紙製の担体上で菌体を培養した試料を示す。ＰＣＲ増幅領域は、ペプチド鎖伸長因子１α遺伝子である。
レーン：１，１２：１００ｂｐラダー・マーカー
２，３：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（ＲＣ−６−１）
４，５：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（Ｋａｋｕ Ｒ−２）
６，７：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｆ．ｎｙｇａｍａｉ（１−５−１２−２）
８，９：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｉ（１−６−１１−５）
１０，１１：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ（２−５−７−１）
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（ａ）材料
（１）多重（３〜５枚重ね）の吸水性担体（円盤）（乾燥、滅菌済み）；吸収性担体としては、リード・ペーパー・タオル（ライオン製）やエリエール・クッキング・ペーパー（大王製紙製）等のペーパー・タオル３枚をろ紙２枚に挟んだものを、約５ｍｍ直径の小円盤状に打ち抜いた多重性の吸収性紙円盤を使用した。
（２）エッペンドルフサンプル・チューブ（１．５〜２ｍｌ、乾燥、滅菌済み）
（３）栄養溶液（例、ＳＮ ｂｒｏｔｈ：蒸留水中、ＫＨ２ＰＯ４：０．１％，ＫＮＯ３：０．１％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５％，ＫＣｌ：０．０５％，ブドウ糖０．０２％，ショ糖０．０２％、滅菌済み）
（４）フェノール（試薬グレード）
（５）クロロフォルム（試薬グレード）
（６）イソアミルアルコール（試薬グレード）
（７）イオン交換水あるいは蒸留水（ｍｉｌｌｉ−Ｑグレード）（滅菌済み）
（８）１０％グリセロール（滅菌済み）；下記（ｂ）（１）でエッペンドルフサンプル・チューブへ投入する多重の吸水性紙円盤の数を増やし、下記（ｂ）（２）の滅菌済み栄養溶液の分注量を対応させて増量することで、余分な紙円盤を準備できる。下記（ｃ）〜（ｆ）の操作手順において、これら余分な紙円盤も同様に菌体生育のために用い、菌体の生育を確認後、余分量の紙円盤を１０％グリセロールに投入、−４０℃以下で冷凍することで、供試菌体自体を生存させたまま保存できる（菌体の接種源として、数回繰り返し使用できる）。
（ｂ）事前準備
（１）多重の吸水性担体（３〜５点；基本数３点）をエッペンドルフサンプル・チューブに投入し、湿熱滅菌処理する。
（２）上記、担体入りエッペンドルフサンプル・チューブに、担体が吸収可能な量の栄養溶液を無菌的に分注する。
（３）ＣＩＡ混合液（クロロフォルムとイソアミルアルコールを２４：１の割合で混合）を調製する。
（ｃ）ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（培養初期・中・後期：菌集落の成立後）（菌体形態１ａ）からの鋳型ＤＮＡ試料調製の操作手順
（１）エッペンドルフサンプル・チューブ内で栄養溶液を吸収した担体（全量）を、ピンセット等で無菌的に菌集落上に静置し、放置培養（２、３日〜１週間程度まで）する。
（２）放置培養後、菌糸体が紙円盤を通過生育したことを確認の後、担体３点を菌体番号が書かれたエッペンドルフサンプル・チューブに回収する。
以上の操作は、菌体試料数行う。
（３）２００μｌのイオン交換水（蒸留水）をそれぞれのエッペンドルフサンプル・チューブに加える。
（４）１００μｌのフェノールと１００μｌのＣＩＡ混合液をエッペンドルフサンプル・チューブに加える（全量：約５００μｌ、水層：約２００μｌ）。
（５）ボルテックス・ミキサー等で激しく混合する（フル・スピード、３０秒〜１分）。
（６）保存する場合には、そのまま冷凍保存する。使用時は、常温解凍後、（５）の操作から行う。
（７）遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ等）で、フェノール層を沈降させる。
（８）上清（水層）の（０．５−）１．０（−５．０）μｌ（可変：標準１．０μｌ）をＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ試料として、ＰＣＲ用チューブに分注する。分注元の残試料は（６）と同様にそのまま冷凍保存する。再使用時に常温解凍後、（５）の操作から行う。
（９）それぞれ１．０μｌ等の上清（水層）を分注したＰＣＲ用チューブを加熱するなど、液層を完全に蒸発・乾燥させ、水層に一部移ったクロロフォルムとイソアミルアルコールを気化、除去する。乾燥試料はそのまま冷凍保存可能である。使用時は（１０）の操作から行う。
（１０）ＰＣＲ用の反応液（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｂｕｆｆｅｒ溶液、プライマー・セット等）を（９）の液層蒸発後のＰＣＲ用チューブに分注し、規定の条件でＰＣＲ反応を行う。
操作手順の（６）と（８）で得られた凍結保存元試料は、反復実験やプライマー・セット等の変更実験の際に、同一の菌体試料として、数十回の単位で繰り返し使用が可能である（常温解凍後、（５）の操作から再開する）。また、（８）の操作で、上清（水層）を多数のＰＣＲ用チューブに等量分注して複製を作り、（９）の操作で同時にチューブ内の液層を蒸発させ、未使用分を冷凍保存することで、同一条件のＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ試料として繰返し使用可能である。
（ｄ）ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（培養開始時：培養接種直後で菌集落が未成立）（菌体形態１ｂ）からの鋳型ＤＮＡ試料調製の操作手順
（１）エッペンドルフサンプル・チューブ内で栄養溶液を吸収した担体（全量）を、平板培養基上の接種菌体（明確な菌集落はまだ無い）の隣にピンセット等で無菌的に接着して静置し、４〜７日間放置培養する。
（２）放置培養後、菌糸体が担体を通過生育したことを確認の後、担体３点を菌体番号が書かれたエッペンドルフサンプル・チューブに回収する。以下は、上記（ｃ）の工程（３）以降と同一の手順である。
（ｅ）試験管等、チューブ内の固化培養基上の菌体（菌体形態２）からの鋳型ＤＮＡ試料調製の操作手順
（１）試験管等、チューブ内の固化培養基上から、滅菌柄付き針等でごく少量の菌体を取り、エッペンドルフサンプル・チューブ内の栄養溶液を吸収した担体上に接種する。チューブは蓋をしめ、３〜４日間放置培養する。
（２）放置培養後、菌糸体が担体上で生育したことを確認する。以下は、上記（ｃ）の工程（３）以降と同一の手順である。
（ｆ）試験管やフラスコ等、容器内の液体培養基中の菌体（菌体形態３）からの鋳型ＤＮＡ試料調製の操作手順
（１）試験管やフラスコ等、チューブ内の液体培養基中から、滅菌ピペット等でごく少量の菌体を取り、エッペンドルフサンプル・チューブ内の栄養溶液を吸収した担体上に接種する。エッペンドルフサンプル・チューブは蓋をしめ、３〜４日間放置培養する。
（２）放置培養後、菌糸体が担体上で生育したことを確認する。以下は、上記（ｃ）の工程（３）以降と同一の手順である。
［実施例１］糸状菌類および酵母への適用結果（菌体形態１ａ＋１ｂ）
７種７菌株の糸状菌を接種直後の平板上に、各約２０μｌのＳＮ ｂｒｏｔｈ溶液を吸収させた担体を菌体（菌体形態１ｂ）に隣接させて静置、また、１種３菌株の酵母の古い平板培養（菌体形態１ａ）上に担体を接着させて静置、３日間培養後に回収・処理、リボソームＤＮＡのＩＴＳ（ＩＴＳ−１，ＩＴＳ−２）領域，５．８ＳリボソームＤＮＡおよび２８ＳリボソームＤＮＡに対してＰＣＲ増幅反応を行った（プライマー・セット：ＩＴＳ５ ５′ ＧＧＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＡＧＴ ＣＧＴ ＡＡＣ ＡＡＧ Ｇ ３′（２２−ｍｅｒｓ）（配列番号：１）＋ＮＬ４ ５′ ＧＧＴ ＣＣＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＣＧ Ｇ ３′（１９−ｍｅｒｓ）（配列番号：２）、ポリメラーゼ：ＱＩＡＧＥＮ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ、ＰＣＲ反応条件：初期変性９５℃１５分後、変性９５℃３０秒、アニーリング５４℃１分のサイクルを４０回行った後、最終伸長反応を７２℃１０分行った）。ＰＣＲ増幅産物は２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、検出した（図１）。すべての菌種、菌株で当該領域のＤＮＡが増幅された。
［実施例２］Ｆｕｓａｒｉｕｍ属菌への適用結果（菌体形態２）
４種１０菌株のＦｕｓａｒｉｕｍ属菌の試験管培養からの菌体を、各約２０μｌのＳＮ ｂｒｏｔｈ溶液を吸収させた担体に少量接種、４日培養後に処理、ペプチド鎖伸長因子１α（ＴＥＦ−１α）遺伝子領域対してＰＣＲ増幅反応を行った（プライマー・セット：ＥＦ−１Ｔ ５′ ＡＴＧ ＧＧＴ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＣ ３′（２０−ｍｅｒｓ）（配列番号：３）＋ＥＦ−２Ｔ ５′ ＧＧＡ ＡＧＴ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＡＴ ＣＡＴ ＧＴＴ ５′（２１−ｍｅｒｓ）（配列番号：４）、ポリメラーゼ：ＱＩＡＧＥＮ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ、ＰＣＲ反応条件：初期変性９５℃１５分後、変性９５℃３０秒、アニーリング５２℃１分のサイクルを４０回行った後、最終伸長反応を７２℃１０分行った）。ＰＣＲ増幅産物は２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、検出した（図２）。すべての菌種、菌株で当該領域のＤＮＡが増幅された。
ＰＣＲ用のプライマー・セットとＰＣＲの温度条件が適切であれば、複数群の糸状菌類と酵母において、複数の遺伝子領域でほぼ９０％以上の成功率で強いＰＣＲ反応の結果を得た。Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｄｗａｙａｂｅｅｊａ属、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ属、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属の糸状菌類とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母に対して、また、ミトコンドリア・小サブユニット・リボソームＤＮＡ、ペプチド鎖伸長因子１α、βチューブュリン、リボソームＤＮＡ ＩＴＳ領域、５．８ＳリボソームＤＮＡ、２８ＳリボソームＤＮＡ Ｄ１ Ｄ２領域の各遺伝子領域について本法が適用可能であることが確認済みである。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、ＤＮＡを菌体から抽出する常法が持つ「時間がかかる」「操作手順が多く、複雑」「装置類が大がかり」という問題点は改善され、「時間は同程度か、より短い」「操作手順は少なく、単純である」「装置等も小規模、既存の器具類が使用可能」等、簡便となった。また、ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲやｓｐｏｒｅ ＰＣＲ法の「簡単だが、成功率が不確定である」「鋳型ＤＮＡ試料の複製・保存ができない」「反復実験や条件変更実験の際に、同一条件の鋳型ＤＮＡを使用できない」という問題点は、本発明により「時間は同程度に短い」「作業も単純で、成功率が高く、一定」「操作手順の各所に保存用の工程があり、鋳型ＤＮＡ等の複製・保存が可能」「反復実験や条件変更実験の為に、同一条件の鋳型ＤＮＡを使用可能である」等、改善されると共に再現性も高くなった。また、本発明により、ＰＣＲ反応の為の鋳型ＤＮＡ量を必要に応じて、計量の上増減することも可能となった。
また、ＰＣＩ（フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール）混合液を用いる方法では、従来、冷エタノール等で、ＤＮＡ分子の再沈殿等、ＤＮＡ分子の洗浄、純化行程が必要であったが、本法では、フェノールと水層を遠心分離し、ＰＣＲ用チューブに分注した上清を加熱、蒸発させ、クロロフォルムとイソアミルアルコールを気化、除去するため、その作業工程は不要である。また、担体上で培養・増殖した供試菌体は、冷凍保存、再利用が可能（再現性が確保される）であり、副次的な利点も大きい。
本発明により、ＰＣＲ反応結果やＰＣＲ産物を得るまでの時間が大幅に短縮され、ＰＣＲ法を基礎とした菌類遺伝子のＤＮＡ配列解析の効率化が図られることが期待される。さらに、本発明により、目的菌種の迅速な鑑別・同定や作物病害の診断が可能である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、菌体からＤＮＡを調製する方法に関する。さらに、本発明は、該方法により調製した鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ法に関する。
従来技術
生物の遺伝子ＤＮＡ配列を解析するためには、事前にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用い、解析対象の遺伝子ＤＮＡ領域を増幅することが一般的である。そのためには、鋳型ＤＮＡを調製する必要があるが、鋳型ＤＮＡを抽出する過程で、ＰＣＩ（フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール）混合液を用いる方法（非特許文献１）は、冷エタノール等で、ＤＮＡ分子の再沈殿等、ＤＮＡ分子の洗浄、純化行程が必要であった。
また、糸状体の菌類におけるＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡ試料の調製には、従来から複雑な手順と時間を要する前処理が必要であった（ＤＮＡを菌体から抽出精製する常法（非特許文献２））。また、ＤＮＡを抽出せず、少量の菌体や胞子を反応液に直接投入してＰＣＲ反応を行う、ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ（非特許文献３）やｓｐｏｒｅ ＰＣＲ法（非特許文献４）も試されているが、成功率は常法と比べると、投入する菌体の量や生育状態等の不確定要素が多く、成功率は不安定かつ低かった。後者では、反復実験やプライマー・セット等の条件を変更したＰＣＲ実験の場合にも、鋳型ＤＮＡの複製・保存ができないため、菌体を新たに培養し、試料を準備し直す必要があった。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔非特許文献１〕中山広樹（１９９６）細胞工学別冊 目で見る実験ノートシリーズ「バイオ実験イラストレイテッド」本当にふえるＰＣＲ．秀潤社刊．東京．１６２Ｐ．「５．微量ＤＮＡサンプルの調整法−−−末梢血のｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇを例に」ｐ．５２−５４．
〔非特許文献２〕Ｏ′Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｋ．，Ｃｉｇｅｌｎｉｋ，Ｅ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｎ．Ｓ．ａｎｄ Ｔｒａｐｐｅ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｔｒｕｆｆｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒｕｅ ａｎｄ ｆａｌｓｅ ｍｏｒｅｌｓ ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ １８Ｓ ａｎｄ ２８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ ８９：４８−６５．
〔非特許文献３〕中山広樹（１９９６）細胞工学別冊 目で見る実験ノートシリーズ「バイオ実験イラストレイテッド」本当にふえるＰＣＲ．秀潤社刊．東京．１６２Ｐ．「５−２ 実験例：コロニーからのダイレクトＰＣＲ」ｐ．８０−８２．
〔非特許文献４〕Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｓ．．Ｔｏｋｕｍａｓｕ，Ｓ．，Ｓｕｙａｍａ，Ｙ．ａｎｄ Ｋａｋｉｓｈｉｍａ，Ｍ．（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｉｃｔｌｙ ａｎａｍｏｒｐｈｉｃ ｇｅｎｕｓ Ｔｈｙｓａｎｏｐｈｏｒａ ｕｓｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ４３：１６９−１８０．
【発明の開示】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＤＮＡを菌体から抽出する既存の方法における、（１）時間がかかる、（２）操作手順が多く、複雑である、（３）震とう培養装置や凍結乾燥装置等の大がかりな装置類を必要とする、等の問題点、および従来のｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ法やｓｐｏｒｅ ＰＣＲ法における、（１）簡単な方法であるが、成功率が不確定である、（２）鋳型ＤＮＡの複製や保存ができない、（３）反復実験や条件変更実験の時に、同一の条件の鋳型ＤＮＡを使用できない、等の問題点を一挙に改善し、これにより簡単かつ安定してＰＣＲを実施でき、かつ調製された鋳型ＤＮＡの複製や保存が可能となるような、ＤＮＡの調製方法を提供することにある。
安定してＰＣＲを実施するためには、鋳型ＤＮＡの量や状態等、反応液内の組成を常法のように一定化することが有効である。また、大がかりな装置や多くの操作手順を要する常法の前処理の簡便化も望まれる。そこで、本発明者は、次の創意工夫を行った。
まず、栄養成分を含ませた吸水性（紙）の担体（円盤）に供試菌体を付着させて増殖させることで、必要十分量の新鮮な菌体材料を確保した。次いで、同担体をフェノールとＣＩＡを等量混合した混合液で処理し、菌体内のＤＮＡを遊離させると共に、ＰＣＲの阻害要因となるタンパク質や脂質等を変性させた。さらに、遠心分離後の上清を一定量分取し、揮発し乾燥させることで、ＤＮＡ以外の夾雑物を反応に問題が無い程度に除去した鋳型ＤＮＡ試料を調製できることを見いだした。また、この方法によれば、上清の一定量分取を複数回行い、乾燥後、冷凍保存することで、同一条件で調製された鋳型ＤＮＡ試料を複製し保存することも可能であった。本発明者は、実際に、この方法で調製した鋳型ＤＮＡを利用して、ＰＣＲ反応を試みたところ、多くの糸状体の菌類や酵母において、効率的に遺伝子増幅産物が得られることを見出した。
即ち、本発明者は、菌類（特に、糸状体の菌類）から鋳型ＤＮＡを調製する際の問題点を解決するとともに、これにより調製された鋳型ＤＮＡを利用して効率的にＰＣＲ反応を行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、より詳しくは、下記〔１〕〜〔１２〕に記載の発明を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の工程を含む、菌体からＤＮＡを調製する方法。
（ａ）担体に菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
〔２〕工程（ａ）において、担体に付着させた菌体を該担体上で培養することにより増殖させることを含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕担体が吸水性である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕担体が紙または不織布である、〔１］〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕菌体が糸状体の菌または酵母である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕菌体からポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型ＤＮＡを調製する方法である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法により菌体から調製されたＤＮＡ。
〔８〕以下の（ａ）〜（ｆ）に記載の工程を含む、ポリメラーゼ連鎖反応法。
（ａ）担体に菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
（ｆ）回収したＤＮＡとポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
〔９〕被験菌体の鑑別・同定方法であって、
（ａ）担体に被験菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された被験菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
（ｆ）回収したＤＮＡと特定の菌種に由来するＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
を含み、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物が得られた場合に、被験菌体が上記プライマーの由来菌種と同一種であると判定される方法。
〔１０〕菌体からＤＮＡを調製するために用いる菌体付着用担体。
〔１１〕担体、並びにサンプルチューブおよび／または栄養溶液を含むキット。
〔１２〕さらにフェノールおよび／またはクロロフォルムとイソアミルアルコールの混合液を含む、〔１１〕に記載のキット。
本発明は、菌体からＤＮＡを調製する新規な方法を提供する。ＤＮＡを菌体から抽出する既存の方法は、（１）時間がかかる、（２）操作手順が多く、複雑である、（３）震とう培養装置や凍結乾燥装置等の大がかりな装置類を必要とする、等の問題点があった。また、従来のｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ法やｓｐｏｒｅ ＰＣＲ法は、（１）簡単な方法であるが、成功率が不確定である、（２）鋳型ＤＮＡの複製や保存ができない、（３）反復実験や条件変更実験の時に、同一の条件の鋳型ＤＮＡを使用できない、等の問題点があった。本発明の方法により、このような問題点を一挙に改善し、菌体からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いる鋳型ＤＮＡを調製することができるようになった。本発明のＤＮＡ調製法を利用することで、簡単かつ安定してＰＣＲを実施でき、かつ調製された鋳型ＤＮＡの複製や保存が可能となった。
本発明の方法においては、まず、担体に菌体を付着させる。本発明における菌は、好ましくは糸状体の菌または酵母である。また、糸状体の菌は、糸状体であれば特に制限はなく、真菌および細菌の双方が含まれる。糸状体の真菌としては、糸状菌を例示でき、また、糸状体の細菌としては、放線菌を例示することができる。また、糸状菌としては、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｄｗａｙａｂｅｅｊａ属、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ属、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、酵母としては、特に制限はなく、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｉｍｏｒｐｈｏｍｙｃｅｓ属の酵母が挙げられる。
また、本発明における担体としては、菌体が付着可能な担体であれば制限はないが、好ましくは吸水性担体であり、より好ましくは紙または不織布であり、例えば、ろ紙、不織布ペーパー・タオル、ペーパー・タオルをろ紙等に挟んだものを適当な大きさに打ち抜くことで製造した多重紙円盤（３〜５枚重ね）、ポリプロピレン製不織布等が挙げられる。
また、本発明の担体は、後述するサンプルチューブに投入可能で、溶液と共にボルテックス・ミキサーで回転可能な大きさであることが好ましい。サンプルチューブとしてエッペンドルフサンプル・チューブを使用する場合は、約５ｍｍ直径の小円盤状担体を使用する。
また、本発明において、担体に菌体を付着させる方法としては、菌体形態に応じた種々の方法が挙げられる。例えば、以下の（１）〜（４）の方法が挙げられるが、本発明における担体に菌体を付着させる方法は、これらの方法に限定されるものではない。
（１）ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（培養初期・中・後期：菌集落の成立後）からＤＮＡを調製する場合、栄養溶液を吸収した担体を平板固化した培養基上の菌集落に接触させ、該担体に菌体を付着させる。例えば、エッペンドルフサンプル・チューブ内で栄養溶液を吸収させた担体を、ピンセット等を用いて無菌的に菌集落上に静置することで接触させることが可能である。栄養溶液としては、例えば、ＳＮ ｂｒｏｔｈ（蒸留水中、ＫＨ２ＰＯ４：０．１％，ＫＮＯ３：０．１％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５％，ＫＣｌ：０．０５％，ブドウ糖０．０２％，ショ糖０．０２％）、麦芽エキス、ＹＭ ｂｒｏｔｈ等、市販の液体培養基等を適度な濃度に希釈した物を使用することができるが、これに限定されるものではない。
（２）ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（培養開始時：培養接種直後で菌集落が未成立）からＤＮＡを調製する場合、栄養溶液を吸収した担体を平板固化した培養基上に静置し、その後増殖した菌体と接触させ、該担体に菌体を付着させる。例えば、エッペンドルフサンプル・チューブ内で栄養溶液を吸収させた担体を、平板培養基上の接種菌体（明確な菌集落はまだ無い）の隣にピンセット等で無菌的に接着して静置し、４〜７日間放置培養することで、増殖した菌体と該担体とを接触させることが可能である。増殖した菌体と該担体とが接触したか否かは、菌糸体が担体を通過生育したことを観察することで確認できる。
（３）試験管等、チューブ内の固化培養基上の菌体からＤＮＡを調製する場合、固化培養基上の菌体を栄養溶液を吸収した担体に接触させ、該担体に菌体を付着させる。例えば、固化培養基上から、滅菌柄付き針等でごく少量の菌体を取り、エッペンドルフサンプル・チューブ内の栄養溶液を吸収した担体上に接種することで接触させることが可能である。
（４）試験管やフラスコ等、容器内の液体培養基中の菌体からＤＮＡを調製する場合、液体培養基中の菌体を栄養溶液を吸収した担体に接触させ、該担体に菌体を付着させる。例えば、試験管やフラスコ等、チューブ内の液体培養基中から、滅菌ピペット等でごく少量の菌体を取り、エッペンドルフサンプル・チューブ内の栄養溶液を吸収した担体上に接種することで接触させることが可能である。
本発明においては、担体に付着させた菌体を該担体上で培養することにより増殖させて使用することもできる。
本発明の方法においては、次いで、サンプルチューブに、菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する。本発明におけるサンプルチューブとしては、例えばエッペンドルフサンプル・チューブなどの市販のチューブや、スクリュー・キャップのついたサンプルチューブ等を使用することができるが、これらに類似したサイズのサンプルチューブであれば特に制限はない。また、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液としては、例えば、ＣＩＡ混合液（クロロフォルムとイソアミルアルコールを２４：１の割合で混合）が挙げられる。サンプルチューブに、菌体が付着した担体、フェノールとＣＩＡ混合液を加える場合、フェノールとＣＩＡ混合液を等量加えることが好ましいが、この条件に限定されるものではなく、ＰＣＲ反応の障害となる菌体タンパク質の変性・失活を行え、後に遠心分離等で添加成分を除去できる条件であればよい。
また、本発明の方法においては、サンプルチューブに、菌体が付着した担体と、フェノールとＣＩＡ混合液を適量加え、ボルテックス・ミキサー等で激しく混合する（例えばフル・スピード、３０秒〜１分）。ＤＮＡは、この段階で保存することもできる。ＤＮＡを保存する場合には、そのまま冷凍保存することが好ましく、使用時は、常温解凍後、ボルテックス・ミキサー等で激しく混合し、解凍前のサンプルの状態にもどす。
本発明の方法においては、次いで、遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる。当業者であれば、周知の方法および条件で、遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降できる。
本発明の方法においては、次いで、サンプルチューブから上清を回収する。ＤＮＡ試料をＰＣＲ反応に供する場合は、上清（水層）の０．５〜５．０μｌをＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ試料として、ＰＣＲ用チューブに分注する。ＤＮＡは、この段階で保存することもできる。使用時は、常温解凍後、以下の作業に進み、水分を除去する。
本発明の方法においては、次いで、回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する。ＤＮＡ試料をＰＣＲ反応に供する場合は、上清（水層）を分注したＰＣＲ用チューブを加熱するなど、液層を完全に蒸発・乾燥させ、水層に一部移ったクロロフォルムとイソアミルアルコールを気化、除去する。ＤＮＡは、この段階で保存することもできる。すなわち、乾燥試料はそのまま冷凍保存できる。使用時は、乾燥試料をＰＣＲ反応に供する。
また、本発明は、本発明の方法によって菌体から調製されたＤＮＡ（精製されたＤＮＡも含まれる）も提供する。本発明においては、精製されたＤＮＡを得るために、当業者に周知の方法で、菌体から調製された産物の洗浄や再沈殿を行うこともできる。
本発明は、上記方法によって調製されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法もまた提供する。当業者であれば、上記方法によって調製された鋳型ＤＮＡとＰＣＲ用の反応液（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｂｕｆｆｅｒ溶液、プライマー・セット等）を混合し、周知の条件でＰＣＲ反応を行うことで、本発明のＰＣＲ法を実施できる。本発明のＰＣＲ法を使用することで、菌体（好ましくは糸状体の菌または酵母）のＤＮＡを簡便かつ再現性よく増幅できる。
本発明のＰＣＲ法を応用することにより、少量の菌体から、目的菌種の迅速な鑑別・同定が可能である。本発明は、被験菌体の迅速な鑑別・同定方法もまた提供する。本発明の鑑別・同定方法では、本発明の菌体からＤＮＡを調製する方法によって回収された被験菌体のＤＮＡと特定の菌種に由来するＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを含むＰＣＲ反応用の反応液（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｂｕｆｆｅｒ溶液等）を混合し、ＰＣＲ反応を行う。本発明の鑑別・同定方法においては、ＰＣＲ増幅産物が得られた場合に、被験菌体が供試プライマーの由来菌種と同一種であると判定される。例えば、ＰＣＲ反応後にアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色像において、ＰＣＲ増幅産物のバンドが現れた場合に、被験菌体が供試プライマーの由来菌種と同一種であると判定できる。本発明の鑑別・同定方法により、コムギ赤かび病、イネばか苗病等、多くの病害診断が可能である。
また、本発明は、本発明の方法に使用するための菌体付着用担体を提供する。本発明の菌体付着用担体としては、上述した担体を使用することができる。また、本発明の菌体付着用担体には、予め栄養溶液を吸収させた担体も含まれる。本発明の菌体付着用担体は、例えば、ろ紙に挟んだ担体素材（ろ紙、不織布、ペーパータオル）を事務用の穴空け器（パンチ）（穴のサイズ＝担体の直径）で打ち抜くことで製造できる。
さらに、本発明は、本発明の菌体付着用担体を含むキットを提供する。菌体付着用担体を含むキットは、本発明のＤＮＡ調製法に利用することができる。本発明のキットには、菌体付着用担体の他に、サンプルチューブおよび／または栄養溶液が含まれる。また、本発明のキットには、さらにフェノールやＣＩＡ混合液が含まれてもよい。フェノールとしては、例えば、平衡中性化した中性フェノールが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明のキットは、例えば、（１）菌体付着用担体が入った滅菌済みサンプルチューブとして、また、（２）ばらの菌体付着用担体、標準的な栄養溶液入りのチューブ、サンプルチューブをセットにした形態、（３）さらに（１）（２）にフェノールやＣＩＡ混合液を添付した形態等として提供できるが、これらの形態に限定されるものではない。
また、上記キットに追加してＰＣＲ用ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用Ｂｕｆｆｅｒ溶液等を含むＰＣＲ用マスターミックスを組み合わせたキットでは、さらに簡便に本発明によるＰＣＲ法を利用できる。該ＰＣＲ用ポリメラーゼとしては、当業者に周知のポリメラーゼを選択することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（実施例に記載の菌体形態１ａ＋ｂ）からのＰＣＲ増幅結果を示す写真である。レーン１−７は糸状菌類、９−１１は酵母類を示す。ＰＣＲ増幅領域は、リボソームＤＮＡのＩＴＳ（ＩＴＳ−１，ＩＴＳ−２領域），５．８Ｓ ｒＤＮＡ，２８Ｓ ｒＤＮＡ領域である。
レーン：８，１２：１００ｂｐラダー・マーカー
１：Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ（２−４−８−１）（括弧内は菌株番号を示す。以下同様。）
２：Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｓｐ．（１−６−２−１ｂ）
３：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ（１−６−２−２）
４：Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（１−４−６−３）
５：Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｍａｙｄｉｃｕｓ（１−６−４−４）
６：Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ（１−６−１０−６）
７：Ｄｗａｙａｂｅｅｊａ ｓｐ．（１−６−１０−４ａ）
９−１１：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（４７４１〜４７４３）
図２は、試験管等、チューブ内の固化培養基上の菌体（実施例に記載の菌体形態２）からのＰＣＲ増幅結果を示す写真である。同一菌株の偶数番号レーンは不織布製の担体上、奇数番号レーンはろ紙製の担体上で菌体を培養した試料を示す。ＰＣＲ増幅領域は、ペプチド鎖伸長因子１α遺伝子である。
レーン：１，１２：１００ｂｐラダー・マーカー
２，３：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（ＲＣ−６−１）
４，５：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（Ｋａｋｕ Ｒ−２）
６，７：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｆ．ｎｙｇａｍａｉ（１−５−１２−２）
８，９：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｉ（１−６−１１−５）
１０，１１：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ（２−５−７−１）
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（ａ）材料
（１）多重（３〜５枚重ね）の吸水性担体（円盤）（乾燥、滅菌済み）；吸収性担体としては、リード・ペーパー・タオル（ライオン製）やエリエール・クッキング・ペーパー（大王製紙製）等のペーパー・タオル３枚をろ紙２枚に挟んだものを、約５ｍｍ直径の小円盤状に打ち抜いた多重性の吸収性紙円盤を使用した。
（２）エッペンドルフサンプル・チューブ（１．５〜２ｍｌ、乾燥、滅菌済み）
（３）栄養溶液（例、ＳＮ ｂｒｏｔｈ：蒸留水中、ＫＨ２ＰＯ４：０．１％，ＫＮＯ３：０．１％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５％，ＫＣｌ：０．０５％，ブドウ糖０．０２％，ショ糖０．０２％、滅菌済み）
（４）フェノール（試薬グレード）
（５）クロロフォルム（試薬グレード）
（６）イソアミルアルコール（試薬グレード）
（７）イオン交換水あるいは蒸留水（ｍｉｌｌｉ−Ｑグレード）（滅菌済み）
（８）１０％グリセロール（滅菌済み）；下記（ｂ）（１）でエッペンドルフサンプル・チューブへ投入する多重の吸水性紙円盤の数を増やし、下記（ｂ）（２）の滅菌済み栄養溶液の分注量を対応させて増量することで、余分な紙円盤を準備できる。下記（ｃ）〜（ｆ）の操作手順において、これら余分な紙円盤も同様に菌体生育のために用い、菌体の生育を確認後、余分量の紙円盤を１０％グリセロールに投入、−４０℃以下で冷凍することで、供試菌体自体を生存させたまま保存できる（菌体の接種源として、数回繰り返し使用できる）。
（ｂ）事前準備
（１）多重の吸水性担体（３〜５点；基本数３点）をエッペンドルフサンプル・チューブに投入し、湿熱滅菌処理する。
（２）上記、担体入りエッペンドルフサンプル・チューブに、担体が吸収可能な量の栄養溶液を無菌的に分注する。
（３）ＣＩＡ混合液（クロロフォルムとイソアミルアルコールを２４：１の割合で混合）を調製する。
（ｃ）ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（培養初期・中・後期：菌集落の成立後）（菌体形態１ａ）からの鋳型ＤＮＡ試料調製の操作手順
（１）エッペンドルフサンプル・チューブ内で栄養溶液を吸収した担体（全量）を、ピンセット等で無菌的に菌集落上に静置し、放置培養（２、３日〜１週間程度まで）する。
（２）放置培養後、菌糸体が紙円盤を通過生育したことを確認の後、担体３点を菌体番号が書かれたエッペンドルフサンプル・チューブに回収する。
以上の操作は、菌体試料数行う。
（３）２００μｌのイオン交換水（蒸留水）をそれぞれのエッペンドルフサンプル・チューブに加える。
（４）１００μｌのフェノールと１００μｌのＣＩＡ混合液をエッペンドルフサンプル・チューブに加える（全量：約５００μｌ、水層：約２００μｌ）。
（５）ボルテックス・ミキサー等で激しく混合する（フル・スピード、３０秒〜１分）。
（６）保存する場合には、そのまま冷凍保存する。使用時は、常温解凍後、（５）の操作から行う。
（７）遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ等）で、フェノール層を沈降させる。
（８）上清（水層）の（０．５−）１．０（−５．０）μｌ（可変：標準１．０μｌ）をＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ試料として、ＰＣＲ用チューブに分注する。分注元の残試料は（６）と同様にそのまま冷凍保存する。再使用時に常温解凍後、（５）の操作から行う。
（９）それぞれ１．０μｌ等の上清（水層）を分注したＰＣＲ用チューブを加熱するなど、液層を完全に蒸発・乾燥させ、水層に一部移ったクロロフォルムとイソアミルアルコールを気化、除去する。乾燥試料はそのまま冷凍保存可能である。使用時は（１０）の操作から行う。
（１０）ＰＣＲ用の反応液（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｂｕｆｆｅｒ溶液、プライマー・セット等）を（９）の液層蒸発後のＰＣＲ用チューブに分注し、規定の条件でＰＣＲ反応を行う。
操作手順の（６）と（８）で得られた凍結保存元試料は、反復実験やプライマー・セット等の変更実験の際に、同一の菌体試料として、数十回の単位で繰り返し使用が可能である（常温解凍後、（５）の操作から再開する）。また、（８）の操作で、上清（水層）を多数のＰＣＲ用チューブに等量分注して複製を作り、（９）の操作で同時にチューブ内の液層を蒸発させ、未使用分を冷凍保存することで、同一条件のＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ試料として繰返し使用可能である。
（ｄ）ペトリ皿等、平板固化した培養基上の菌体（培養開始時：培養接種直後で菌集落が未成立）（菌体形態１ｂ）からの鋳型ＤＮＡ試料調製の操作手順
（１）エッペンドルフサンプル・チューブ内で栄養溶液を吸収した担体（全量）を、平板培養基上の接種菌体（明確な菌集落はまだ無い）の隣にピンセット等で無菌的に接着して静置し、４〜７日間放置培養する。
（２）放置培養後、菌糸体が担体を通過生育したことを確認の後、担体３点を菌体番号が書かれたエッペンドルフサンプル・チューブに回収する。以下は、上記（ｃ）の工程（３）以降と同一の手順である。
（ｅ）試験管等、チューブ内の固化培養基上の菌体（菌体形態２）からの鋳型ＤＮＡ試料調製の操作手順
（１）試験管等、チューブ内の固化培養基上から、滅菌柄付き針等でごく少量の菌体を取り、エッペンドルフサンプル・チューブ内の栄養溶液を吸収した担体上に接種する。チューブは蓋をしめ、３〜４日間放置培養する。
（２）放置培養後、菌糸体が担体上で生育したことを確認する。以下は、上記（ｃ）の工程（３）以降と同一の手順である。
（ｆ）試験管やフラスコ等、容器内の液体培養基中の菌体（菌体形態３）からの鋳型ＤＮＡ試料調製の操作手順
（１）試験管やフラスコ等、チューブ内の液体培養基中から、滅菌ピペット等でごく少量の菌体を取り、エッペンドルフサンプル・チューブ内の栄養溶液を吸収した担体上に接種する。エッペンドルフサンプル・チューブは蓋をしめ、３〜４日間放置培養する。
（２）放置培養後、菌糸体が担体上で生育したことを確認する。以下は、上記（ｃ）の工程（３）以降と同一の手順である。
［実施例１］糸状菌類および酵母への適用結果（菌体形態１ａ＋１ｂ）
７種７菌株の糸状菌を接種直後の平板上に、各約２０μｌのＳＮ ｂｒｏｔｈ溶液を吸収させた担体を菌体（菌体形態１ｂ）に隣接させて静置、また、１種３菌株の酵母の古い平板培養（菌体形態１ａ）上に担体を接着させて静置、３日間培養後に回収・処理、リボソームＤＮＡのＩＴＳ（ＩＴＳ−１，ＩＴＳ−２）領域，５．８ＳリボソームＤＮＡおよび２８ＳリボソームＤＮＡに対してＰＣＲ増幅反応を行った（プライマー・セット：ＩＴＳ５ ５′ ＧＧＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＡＧＴ ＣＧＴ ＡＡＣ ＡＡＧ Ｇ ３′（２２−ｍｅｒｓ）（配列番号：１）＋ＮＬ４ ５′ ＧＧＴ ＣＣＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＣＧ Ｇ ３′（１９−ｍｅｒｓ）（配列番号：２）、ポリメラーゼ：ＱＩＡＧＥＮ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ、ＰＣＲ反応条件：初期変性９５℃１５分後、変性９５℃３０秒、アニーリング５４℃１分のサイクルを４０回行った後、最終伸長反応を７２℃１０分行った）。ＰＣＲ増幅産物は２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、検出した（図１）。すべての菌種、菌株で当該領域のＤＮＡが増幅された。
［実施例２］Ｆｕｓａｒｉｕｍ属菌への適用結果（菌体形態２）
４種１０菌株のＦｕｓａｒｉｕｍ属菌の試験管培養からの菌体を、各約２０μｌのＳＮ ｂｒｏｔｈ溶液を吸収させた担体に少量接種、４日培養後に処理、ペプチド鎖伸長因子１α（ＴＥＦ−１α）遺伝子領域対してＰＣＲ増幅反応を行った（プライマー・セット：ＥＦ−１Ｔ ５′ ＡＴＧ ＧＧＴ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＣ ３′（２０−ｍｅｒｓ）（配列番号：３）＋ＥＦ−２Ｔ ５′ ＧＧＡ ＡＧＴ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＡＴ ＣＡＴ ＧＴＴ ５′（２１−ｍｅｒｓ）（配列番号：４）、ポリメラーゼ：ＱＩＡＧＥＮ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ、ＰＣＲ反応条件：初期変性９５℃１５分後、変性９５℃３０秒、アニーリング５２℃１分のサイクルを４０回行った後、最終伸長反応を７２℃１０分行った）。ＰＣＲ増幅産物は２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、検出した（図２）。すべての菌種、菌株で当該領域のＤＮＡが増幅された。
ＰＣＲ用のプライマー・セットとＰＣＲの温度条件が適切であれば、複数群の糸状菌類と酵母において、複数の遺伝子領域でほぼ９０％以上の成功率で強いＰＣＲ反応の結果を得た。Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｄｗａｙａｂｅｅｊａ属、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ属、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属の糸状菌類とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母に対して、また、ミトコンドリア・小サブユニット・リボソームＤＮＡ、ペプチド鎖伸長因子１α、βチューブュリン、リボソームＤＮＡ ＩＴＳ領域、５．８ＳリボソームＤＮＡ、２８ＳリボソームＤＮＡ Ｄ１ Ｄ２領域の各遺伝子領域について本法が適用可能であることが確認済みである。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、ＤＮＡを菌体から抽出する常法が持つ「時間がかかる」「操作手順が多く、複雑」「装置類が大がかり」という問題点は改善され、「時間は同程度か、より短い」「操作手順は少なく、単純である」「装置等も小規模、既存の器具類が使用可能」等、簡便となった。また、ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲやｓｐｏｒｅ ＰＣＲ法の「簡単だが、成功率が不確定である」「鋳型ＤＮＡ試料の複製・保存ができない」「反復実験や条件変更実験の際に、同一条件の鋳型ＤＮＡを使用できない」という問題点は、本発明により「時間は同程度に短い」「作業も単純で、成功率が高く、一定」「操作手順の各所に保存用の工程があり、鋳型ＤＮＡ等の複製・保存が可能」「反復実験や条件変更実験の為に、同一条件の鋳型ＤＮＡを使用可能である」等、改善されると共に再現性も高くなった。また、本発明により、ＰＣＲ反応の為の鋳型ＤＮＡ量を必要に応じて、計量の上増減することも可能となった。
また、ＰＣＩ（フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール）混合液を用いる方法では、従来、冷エタノール等で、ＤＮＡ分子の再沈殿等、ＤＮＡ分子の洗浄、純化行程が必要であったが、本法では、フェノールと水層を遠心分離し、ＰＣＲ用チューブに分注した上清を加熱、蒸発させ、クロロフォルムとイソアミルアルコールを気化、除去するため、その作業工程は不要である。また、担体上で培養・増殖した供試菌体は、冷凍保存、再利用が可能（再現性が確保される）であり、副次的な利点も大きい。
本発明により、ＰＣＲ反応結果やＰＣＲ産物を得るまでの時間が大幅に短縮され、ＰＣＲ法を基礎とした菌類遺伝子のＤＮＡ配列解析の効率化が図られることが期待される。さらに、本発明により、目的菌種の迅速な鑑別・同定や作物病害の診断が可能である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の工程を含む、菌体からＤＮＡを調製する方法。
（ａ）担体に菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
【請求項２】
工程（ａ）において、担体に付着させた菌体を該担体上で培養することにより増殖させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体が吸水性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
担体が紙または不織布である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
菌体が糸状体の菌または酵母である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
菌体からポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型ＤＮＡを調製する方法である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により菌体から調製されたＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｆ）に記載の工程を含む、ポリメラーゼ連鎖反応法。
（ａ）担体に菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
（ｆ）回収したＤＮＡとポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
【請求項９】
被験菌体の鑑別・同定方法であって、
（ａ）担体に被験菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された被験菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
（ｆ）回収したＤＮＡと特定の菌種に由来するＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
を含み、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物が得られた場合に、被験菌体が上記プライマーの由来菌種と同一種であると判定される方法。
【請求項１０】
菌体からＤＮＡを調製するために用いる菌体付着用担体。
【請求項１１】
担体、並びにサンプルチューブおよび／または栄養溶液を含むキット。
【請求項１２】
さらにフェノールおよび／またはクロロフォルムとイソアミルアルコールの混合液を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の工程を含む、菌体からＤＮＡを調製する方法。
（ａ）担体に菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
【請求項２】
工程（ａ）において、担体に付着させた菌体を該担体上で培養することにより増殖させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体が吸水性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
担体が紙または不織布である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
菌体が糸状体の菌または酵母である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
菌体からポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型ＤＮＡを調製する方法である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により菌体から調製されたＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｆ）に記載の工程を含む、ポリメラーゼ連鎖反応法。
（ａ）担体に菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
（ｆ）回収したＤＮＡとポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
【請求項９】
被験菌体の鑑別・同定方法であって、
（ａ）担体に被験菌体を付着させる工程
（ｂ）サンプルチューブに、工程（ａ）において調製された被験菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
（ｃ）遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
（ｄ）サンプルチューブから上清を回収する工程
（ｅ）回収した上清の水分を除去することによりＤＮＡを回収する工程
（ｆ）回収したＤＮＡと特定の菌種に由来するＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
を含み、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物が得られた場合に、被験菌体が上記プライマーの由来菌種と同一種であると判定される方法。
【請求項１０】
菌体からＤＮＡを調製するために用いる菌体付着用担体。
【請求項１１】
担体、並びにサンプルチューブおよび／または栄養溶液を含むキット。
【請求項１２】
さらにフェノールおよび／またはクロロフォルムとイソアミルアルコールの混合液を含む、請求項１１に記載のキット。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７００３２
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【発行日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４８０３（Ｐ２００５−５０４８０３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００９６０
【国際出願日】平成１６年１月３１日（２００４．１．３１）
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【発行日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００９６０
【国際出願日】平成１６年１月３１日（２００４．１．３１）
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
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