マイクロドメイン病のバイオマーカー
【課題】
本発明は、マイクロドメイン病のバイオマーカーや操作性が簡便で安価なマイクロドメイン病の検出方法等に係る技術を提供することを目的とする。
【解決手段】
（１）マイクロドメイン病のバイオマーカーとしてのＧＭ２Ａの使用、並びに（２）被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を閾値と比較する工程を含む、前記被検動物におけるマイクロドメイン病を検出する方法等。
本発明は、マイクロドメイン病のバイオマーカーや操作性が簡便で安価なマイクロドメイン病の検出方法等に係る技術を提供することを目的とする。
【解決手段】
（１）マイクロドメイン病のバイオマーカーとしてのＧＭ２Ａの使用、並びに（２）被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を閾値と比較する工程を含む、前記被検動物におけるマイクロドメイン病を検出する方法等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロドメイン病のバイオマーカー等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活慣習病の原因の１つである肥満は、脂肪細胞の数の増加と脂肪細胞自身の肥大化とが見られる状態で、一般に糖尿病、高血圧、動脈硬化、脳卒中、心筋梗塞等の病態を発症させる引き金になると考えられている。脂肪細胞が産生する生理活性物質は、総称してアディポサイトカイン（ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅ）と呼ばれる。これらの物質は、本来は脂肪細胞自身の代謝に重要な役割を果たすが、肥満等をきっかけに過剰分泌・分泌不全といった分泌制御の異常が生じると、病態の発症を引き起こす原因となる。例えば、線溶系の重要な調節因子であるプラスミノーゲンアクティベータインヒビター１（ＰＡＩ−１）は、脂肪蓄積がおこると特に内臓脂肪で著しく発現量が増加して血中濃度も増加し、血管合併症の成因の一つとなると考えられている。また、分子量約２０ｋＤａのレジスチンは、インシュリンによる糖の取り込み促進作用を抑制するので、ＴＮＦ−α等と同様にＩＩ型糖尿病の発症に関わる因子であると考えられている。その抑制機構は、ＳＯＣＳ３やＮＦ−ｋＢ等のシグナル伝達分子を活性化することによって、インシュリンのシグナル伝達を阻害する、即ち、インシュリン抵抗性を誘導するものと考えられている。
さらに、肥満患者では、摂食を抑制するレプチンが血中に高濃度で存在するにも関わらず、レプチンの作用が減弱するレプチン抵抗性が観察される。そのため、脂肪細胞から分泌されたレプチンが視床下部に作用しても、摂食行動が抑制されず、過食の状態が維持されることになる。
さらに、最近では、認知症の代表的疾患であるアルツハイマー病と、生活習慣病との関連性が注目されている。例えば、糖尿病患者では健常人に比して、アルツハイマー病への罹患率が２倍に上昇することが知られている。神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）は、神経細胞の増殖を促進し、神経細胞の細胞死を抑制するタンパク質であるが、糖尿病患者ではＮＧＦの作用が減弱しているため、アルツハイマー病に罹患しやすくなると考えられる。
肥満、糖尿病及びその合併症等の生活慣習病の病態は、スフィンゴ糖脂質の異常発現によって細胞膜のマイクロドメインの構成、構造及び機能が変化し、サイトカインやホルモンによるシグナル伝達が異常となっている疾病、即ち、マイクロドメイン病である、という仮説が提唱されている。井ノ口らは、脂肪細胞や炎症細胞が産生するＴＮＦ−αが、ＴＮＦ−α受容体を介して、細胞内に存在するガングリオシドＧＭ３合成酵素の発現を促進し、マイクロドメインの構成成分であるＧＭ３が増加することによって、マイクロドメインの構造が変化し、マイクロドメインに存在するインシュリン受容体の機能が減弱することを見出している（非特許文献１参照）。しかしながら、ＴＮＦ−αがＧＭ３を介して、レプチン抵抗性やＮＧＦの作用抑制を誘導することは、これまで報告されていない。
これまで、インシュリン抵抗性を診断する方法として、一般的にグルコース負荷試験が用いられているが、簡便性という点で問題がある。また、レプチン抵抗性やＮＧＦの作用抑制を診断しうるバイオマーカーはこれまで知られていない。そこで、マイクロドメイン病のバイオマーカーや操作性が簡便で安価なマイクロドメイン病の検出方法等に係る技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００７）、１０４、ｐ．１３６７８−１３６８３
【非特許文献２】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００８）、５５（４）、ｐ．７６７−７７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、マイクロドメイン病のバイオマーカーや操作性が簡便で安価なマイクロドメイン病の検出方法等に係る技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、かかる状況の下、脂肪細胞の肥大化に伴って細胞外へ分泌されるアディポサイトカインに注目して鋭意検討した結果、糖尿病モデル動物、糖尿病患者及び肥満のヒトにおいては、正常動物や健常人に比して、脂肪組織中のＧＭ２Ａ（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＭ２ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）の量が増加すること、並びに、ＧＭ２Ａが、サイトカイン（インシュリン、レプチン及びＮＧＦ）のシグナル伝達を抑制することを見出した。
ＧＭ２Ａは、スフィンゴ糖脂質の代謝に関与する公知の糖タンパク質である。その機能としては、ガングリオシドの分解に関与する補酵素として働き、例えば、サポシンＢと協同してＧＭ１をＧＭ２に分解し、一方、ヘキソサミニダーゼＡと協同して、ＧＭ２をＧＭ３に、ＧＡ２をラクトシルセラミドに分解する。ＧＭ２Ａ前駆体は、アミノ末端側のペプチドが除去されて、細胞外へ分泌される。例えば、ヒトＧＭ２Ａは、分子量約２５ｋＤａ、１９９アミノ酸残基の公知の糖タンパク質であり、アミノ末端側の３１残基が切断されて細胞外へ分泌される。
しかしながら、上記の知見はこれまで知られておらず、本発明者によって初めて見出されたものである。本発明は、かかる知見に基づくものである。
即ち、本発明は、ＧＭ２Ａをマイクロドメイン病のバイオマーカーとして使用することを要旨とする。
【０００６】
本発明は、
［１］ 被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を閾値と比較する工程を含むことを特徴とする前記被検動物におけるマイクロドメイン病を検出する方法；
［２］ 被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を前記被検動物について異なる時点で測定されたＧＭ２Ａの量又は活性と比較する工程を含むことを特徴とするマイクロドメイン病の疾患状態の変化をモニタリングする方法；
［３］ 前記生物学的試料が、血液、リンパ液、組織又は細胞であることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載される方法；
［４］ 前記ＧＭ２Ａの量又は活性の測定が、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光免疫測定法、エライザ法、免疫組織化学染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、ノーザンブロッティング法又はＲＴ−ＰＣＲ法により行われることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載される方法；
［５］ マイクロドメイン病のバイオマーカーとしてのＧＭ２Ａの使用；
［６］ 前記マイクロドメイン病が、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、糖尿病若しくはその合併症、癌、中枢神経障害、子宮内膜症、骨粗しょう症又は自己免疫疾患であることを特徴とする上記［５］に記載される使用；
［７］ ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬を含有することを特徴とするマイクロドメイン病の診断用キット；
［８］ 前記ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬が、抗ＧＭ２Ａ抗体、又はラジオアイソトープ若しくは蛍光色素で標識されたガングリオシドであることを特徴とする上記［７］に記載される診断用キット；
［９］ ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物；
［１０］ 脂肪細胞においてＧＭ２Ａの発現レベルを上昇させた上記[９]に記載されるトランスジェニック動物；
［１１］ ＧＭ２Ａタンパク質を投与し、血液中のＧＭ２Ａの量又は活性を人工的に上昇させた動物；
［１２］ マイクロドメイン病の症状を呈することを特徴とする上記［９］〜［１１］のいずれか一項に記載される動物；
［１３］ 抗ＧＭ２Ａ抗体を有効成分として含有することを特徴とするマイクロドメイン病の予防若しくは治療薬；
［１４］ ＧＭ２Ａ阻害活性化合物を有効成分として含有することを特徴とするマイクロドメイン病の予防若しくは治療薬；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、マイクロドメイン病のバイオマーカーや操作性が簡便で安価なマイクロドメイン病の検出方法等に係る技術が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の一態様は、マイクロドメイン病のバイオマーカーとしてのＧＭ２Ａの使用、である。より具体的には、ＧＭ２Ａはマイクロドメイン病のバイオマーカーとして、下記のように使用される。
【０００９】
〔１〕マイクロドメイン病を検出する方法
本発明のマイクロドメイン病を検出する方法は、被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を閾値と比較する工程を含む。
本明細書中、「マイクロドメイン病」なる語は、スフィンゴ糖脂質の異常発現によって細胞膜のマイクロドメイン（例、カベオラ等のラフト）の構成、構造及び機能が変化し、サイトカイン（例、インシュリン、レプチン、神経成長因子（ＮＧＦ））又はホルモンによるシグナル伝達が異常となっている疾病を意味する。
「マイクロドメイン病」の例としては、具体的には、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、糖尿病及びその合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経疾患）、癌、中枢神経障害（例、アルツハイマー病）、子宮内膜症、骨粗しょう症、並びに自己免疫疾患が挙げられる。なかでも、本発明は、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、糖尿病若しくはその合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経疾患）、又は中枢神経障害（例、アルツハイマー病）に好適に適用できる。本発明において、肥満としては、レプチン抵抗性に起因するものが好ましく、中枢神経障害（例、アルツハイマー病）としては、ＮＧＦ作用の抑制に起因するものが好ましい。
本明細書中、「マイクロドメイン病を検出する」とは、被検動物がマイクロドメイン病に罹患しているか否かを評価することを包含する事を意図して用いられる。また、本明細書中、「マイクロドメイン病に罹患している」とは、マイクロドメイン病の外見的な症状が観察されない場合も包含する事を意図して用いられる。
本発明における被検動物は、好ましくは非ヒト動物又はヒトであり、より好ましくは非ヒト哺乳動物又はヒトであり、特に好ましくはヒトである。
【００１０】
本発明における生物学的試料は、好ましくは血液、リンパ液、組織（例、脂肪組織）又は細胞（例、脂肪細胞）である。
測定の対象となるＧＭ２Ａは、天然に存在しうる形態のＧＭ２Ａであればよく、例えば、ＧＭ２Ａの完全長ＧＭ２Ａ（ＧＭ２Ａ前駆体）であってもよく、アミノ末端側のポリペプチドが除去されて細胞外へ分泌されたものであってもよい。
ＧＭ２Ａの量の測定法としては、ＧＭ２Ａの量を決定できる方法であれば限定されないが、例えば、ＧＭ２Ａタンパク質に対する特異的抗体、ＧＭ２Ａの糖鎖に対するレクチンや特異的抗体又はＧＭ２Ａ遺伝子と結合する核酸を用いた、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、エライザ法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学染色法、高速液体クロマトグラフィー定量法、マススペクトル定量法、酵素法、免疫沈降法、及びウェスタンブロッティング法等の翻訳レベルでＧＭ２Ａの発現量を測定する方法、レクチン組織化学染色法、及びレクチンブロッティング法等の糖修飾レベルでＧＭ２Ａの発現量を測定する方法並びにノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法及びｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション等の転写レベルでＧＭ２Ａの発現量を測定する方法が用いられる。
また、ＧＭ２Ａの活性の測定法としては、ＧＭ２Ａの活性を測定できる方法であれば限定されないが、例えば、ラジオアイソトープ又は蛍光色素で標識されたガングリオシドを基質として、サポシン又はヘキソサミニダーゼ等との共存又は非共存下で、生成物又は結合物を定量する方法が用いられる。
これらの方法を用いることによって、ＧＭ２Ａの量又は活性を定量的に測定することが可能である。また、自動分析装置等を使用することによって、短時間で大量の生物学的試料の測定が可能となる。
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等の免疫学的測定法に用いる抗体としては、特に限定されず、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が用いられるが、好ましくはモノクローナル抗体が用いられる。また、ＧＭ２Ａにおいて、抗体が認識するエピトープの位置は、特に限定されるものではない。抗体は完全な抗体分子でもよいし、Ｆａｂフラグメント若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメント等、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメントでもよい。
【００１１】
本発明にあっては、上記のような方法で被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定し、得られた測定値が、健常者及びマイクロドメイン病に罹患している動物の生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、前記の被検動物がマイクロドメイン病に罹患していると評価するものである。
ここで、健常者とは、マイクロドメイン病に罹患していない被検動物を意味し、他の疾患に罹患している被検動物も包含しうる。
当該閾値は、被検動物の種、性別、年齢（週齢）、生活習慣によって変動するため、これら毎に、予め設定する必要がある。
当該閾値は、例えば、健常者及びマイクロドメイン病に罹患している複数の動物の生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を上述の方法により測定し、それぞれについて得られた測定値の平均値±標準偏差を参照して設定することができる。閾値決定のための、健常者であるか、またはマイクロドメイン病に罹患している動物であるか、を判断する方法としては、マイクロドメイン病に包含される疾病の既知の診断法を利用すればよい。このような閾値の具体的な設定例としては、例えば、（マイクロドメイン病に罹患した動物の生物学的試料における、ＧＭ２Ａの量又は活性の平均値−標準偏差）等が挙げられる。
なお、「平均値」とは、同一種の動物である複数の固体から採取した生物学的試料についてそれぞれのＧＭ２Ａの量又は活性を測定し、これらの測定値の総和を個体数（試料数）で除して得られる相加平均値である。
このようにして設定した閾値と、被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性とを比較し、この測定値が、前記閾値以上であれば、前記の被検動物はマイクロドメイン病に罹患していると評価する。
特に、本発明の方法は、マイクロドメイン病を早期に（例えば、糖尿病であれば、血糖値検査によって糖尿病が検出されるより早い時期に）検出できることが期待される。
【００１２】
〔２〕マイクロドメイン病の疾患状態の変化をモニタリングする方法
本発明の、マイクロドメイン病の疾患状態の変化をモニタリングする方法は、被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を前記被検動物について異なる時点で測定されたＧＭ２Ａの量又は活性と比較する工程を含む。
当該方法は、前記の本発明の「マイクロドメイン病を検出する方法」と基本的に同様に実施することができるが、一の被検動物について異なる時点でＧＭ２Ａの量又は活性を測定し、測定されたＧＭ２Ａの量又は活性同士を比較する点で異なる。
ＧＭ２Ａの量又は活性は、一定の期間（例えば、１日間、３日間、１週間、２週間、１ヶ月）を空けて、測定される。
得られた測定値が経時的に上昇又は低下した場合、それぞれ、マイクロドメイン病が増悪又は改善したと評価することができる。このようなモニタリングを行うことによって、マイクロドメイン病に罹患している又は罹患する可能性があると評価された動物において、適当な治療薬又は予防薬の選択、及び、その効果の判定等を有効に行うことができる。
これは、適当な治療計画の決定、並びに新薬の評価に利用することができる。
【００１３】
〔３〕マイクロドメイン病の診断用キット
また、本発明は、上記で説明した本発明の方法を実施するために使用できる、マイクロドメイン病の診断キットを提供する。このキットは、ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬を含む。このような測定試薬としては、抗ＧＭ２Ａ抗体等のＧＭ２Ａを認識しうる試薬、又はラジオアイソトープ若しくは蛍光色素で標識されたガングリオシド等のＧＭ２ＡとサポシンＢ若しくはラクトヘキソサミニダーゼＡとの協同によって分解される試薬を使用することができる。
【００１４】
抗ＧＭ２Ａ抗体としては、特に限定されないが、好ましくはモノクローナル抗体である。ＧＭ２Ａの量を免疫学的手法により測定する場合、本発明によるキットはさらに、抗体の固相化、抗体の検出等に用いることのできる物質及び器具等を含んでもよい。抗体の固相化のためには、マイクロタイタープレート等の担体、炭酸緩衝液等の固相化用液体、ゼラチンやアルブミン等を含むブロッキング液を含むことができる。抗体の検出のためには、抗体を予め標識しておくことが好ましく、その場合には、本発明によるキットはその検出用試薬を含むことができる。例えば、標識物質としてビオチンを使用する場合には、検出用試薬としてストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とのコンジュゲート、並びに、ＨＲＰの作用によって発色する発色液を含むことができる。また、ＧＭ２Ａの活性測定に用いる基質としては、好ましくはラジオアイソトープ又は蛍光色素で標識されたガングリオシドである。
【００１５】
〔動物〕
本発明はまた、ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を提供する。これらトランスジェニック動物は、当該技術分野において慣用の遺伝子導入技術を用いて、当業者が容易に作製することができる。
ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子とは、ＧＭ２Ａ遺伝子に後述する所定遺伝子のエンハンサー配列部分、プロモーター配列部分及びポリＡシグナル配列部分を結合させたＤＮＡフラグメントからなる遺伝子である。
ＧＭ２Ａ遺伝子は、結合させる前記所定遺伝子に応じて発現する組織・細胞を決定することができる。
所定遺伝子として、例えば脂肪細胞のみに発現しているａＰ２遺伝子を用いた場合はＧＭ２Ａ遺伝子を脂肪細胞で高発現させることができ、神経細胞で発現している神経細胞特異的エノラーゼ遺伝子を用いた場合はＧＭ２Ａ遺伝子を神経細胞で高発現させることができる。他に所定遺伝子として、アルブミン遺伝子やインシュリン遺伝子等を挙げることができる。ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物として好ましくは、上述のようにしてＧＭ２Ａ遺伝子を脂肪細胞で高発現させたトランスジェニック動物等の、脂肪細胞においてＧＭ２Ａの発現レベルを上昇させたトランスジェニック動物である。
前記エンハンサー配列部分として、ＳＶ４０エンハンサー、ポリオーマウイルスエンハンサー等のウイルスエンハンサー、ＩｇＨエンハンサー、ＩｇＬエンハンサー、Ｔ細胞レセプターα鎖エンハンサー等の免疫系遺伝子のエンハンサー、β−アクチンエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、エラスターゼＩ遺伝子エンハンサー等の細胞エンハンサー等が挙げられる。
前記プロモーター配列部分として、ウイルス（例えば、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス）由来のプロモーター配列部分や、メタロチオネイン、メタロプロテナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１及び２、ミエリン基礎タンパク等のプロモーター配列部分等を挙げることができる。
前記ポリＡシグナル配列部分として、ＳＶ４０−ポリＡシグナル、成長ホルモン−ポリＡシグナル等が挙げられる。
ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を作製するには、前記ＤＮＡフラグメントからなる遺伝子を非ヒト哺乳動物の受精卵にマイクロインジェクション法等により導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物を分娩させることにより実施することができる。非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、ニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さ等の観点から、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい（非特許文献２参照）。
本発明はまた、ＧＭ２Ａタンパク質を投与し、血液中のＧＭ２Ａの量又は活性を人工的に上昇させた動物を提供する。
ＧＭ２Ａタンパク質を動物に投与する方法としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、エアゾル投与、脳室内投与等が挙げられる。また、更に、ＧＭ２Ａタンパク質を動物に投与する方法のうち、体内から動物に投与する方法としては、例えば、ＧＭ２Ａタンパク質をペレットにして皮下や皮内等に埋め込む方法、浸透圧ポンプにＧＭ２Ａタンパク質を封じ込めて皮下、皮内又は腹腔内等に埋め込む方法等が挙げられる。
前記動物としては、特に限定されず、好ましくは非ヒト動物であり、より好ましくは非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、 イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル）である。
このように、血液又は組織中のＧＭ２Ａ遺伝子の発現、あるいはＧＭ２Ａの量又は活性が上昇している動物は、マイクロドメイン病の症状を呈し得、マイクロドメイン病の予防若しくは治療薬等の医薬品開発のためのモデル動物として、あるいは該医薬品のスクリーニング用の動物として、非常に有用である。
【００１６】
〔形質転換細胞〕
本発明はまた、ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入された動物細胞を提供する。このような形質転換細胞は、当該技術分野において慣用の遺伝子導入技術を用いて、当業者が容易に作製することができる。
例えば、導入するＧＭ２Ａ遺伝子に、脂肪細胞にのみ発現している遺伝子のエンハンサー及びプロモーター、又はこれらの高発現用に改変したものを結合し、その遺伝子を染色体に導入することによって、ＧＭ２Ａ遺伝子がＧＭ２Ａ遺伝子の発現が上昇させられている形質転換動物細胞を作製することができる。導入するＧＭ２Ａ遺伝子は、翻訳されてＧＭ２Ａの機能を発揮するものであれば特に限定されず、修飾された遺伝子であってもよい。
宿主細胞は、特に限定されず、マウス骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ラット由来のＧＨＳ細胞等の動物細胞が用いられる。
このような形質転換動物細胞は、マイクロドメイン病の予防若しくは治療薬等の医薬品開発等に用いることができる。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明する。
【００１８】
実施例１（正常ラット脂肪細胞でのＧＭ２Ａ遺伝子の定量）
正常ラット脂肪細胞（内臓脂肪細胞、皮下脂肪細胞、精巣周囲脂肪細胞）及び液体培地（脂肪細胞分化メディウム）は、プライマリーセル社から購入した。ＧＭ２Ａプライマー（下記に、配列番号１及び２で示す。）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に合成を委託して、入手した。
各脂肪細胞（０．７５ｘ１０６細胞）に液体培地６ｍｌを加えて分散し、得られた脂肪細胞分散物を５００ｒｐｍ、５分間で遠心分離した。沈渣に液体培地３．２ｍｌを加えて再度分散した後、得られた脂肪細胞再分散物を１ウエル当たり０．５ｍｌの割合で２４ウエルプレートに加えた。これを３７℃、５％ ＣＯ２の雰囲気下で培養した。翌日（Ｄａｙ１とする）、得られた培養物に液体培地０．５ｍｌ加えて一晩培養し、以後、２日毎に液体培地を全量交換した。Ｄａｙ２、４、６、１０にそれぞれ脂肪細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、洗浄された脂肪細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて全ＲＮＡを調製した。
次に、１０ｎｇ／μｌ 全ＲＮＡ １２．５μｌ、２０μＭ オリゴｄＴ ２．５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ及び精製水 １２．５μｌ（計３０μｌ）を混合し、得られた混合物を６５℃で５分間保温した後、氷中で冷却した。冷却された混合物に、５ｘバッファー １０μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ５μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．２５μｌ（カタログ番号１８０８０−０４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ １．２５μｌ（カタログ番号１０７７７−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び精製水 ２．５μｌ（計２０μｌ）を加えて混合し、得られた混合物を４２℃で６０分間、９９℃で３分間反応させた後、これを４℃で保温することによりｃＤＮＡ溶液を調製した。
次に、１０ｘＰＣＲバッファー ５μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− １μｌ（カタログ番号ＫＯＤ−２０１、ＴＯＹＯＢＯ社）、１０μＭ ＧＭ２Ａプライマー 各１μｌ（下記に、配列番号１及び２で示す。）、ｃＤＮＡ溶液 ２μｌ及び精製水 ３３μｌ（計５０μｌ）を混合し、得られた混合物をＰＣＲ（条件は、１サイクル:９４℃ ３０秒間、２９サイクル：９４℃ １５秒間、５６℃ ３０秒間、６８℃ １分間、１サイクル：６８℃ ７分間）に供した。また、ＧＭ２Ａプライマーの代わりに、ＧＡＰＤＨプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて同様な操作（ＰＣＲ）を行った。生成したＰＣＲ産物 ５μｌを、エチジウムブロミドを含む１％ アガロースゲルを用いて電気泳動した後、電気泳動後のアガロースゲルにおける蛍光画像をＩｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ ＬＡＳ−１０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて取り込み、前記蛍光画像における蛍光強度をＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて測定した。以下の式に基づき、ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量を算出し、その結果を表１に示す。
ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量＝ＧＭ２Ａの蛍光強度／ＧＡＰＤＨの蛍光強度
［ラットＧＭ２Ａプライマー］
配列番号１：gtgctgggct tgctgttc
配列番号２：gatgctctgg atgcggtagt
【００１９】
【表１】
【００２０】
各脂肪細胞中の脂肪滴は、顕微鏡観察の結果、Ｄａｙ２において細胞質の約１０％、Ｄａｙ４において細胞質の約３０％、Ｄａｙ６で約９０％を占めていた。一方、ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量は、全ての脂肪細胞において、Ｄａｙ２に比してＤａｙ４以降で明らかに増加した。即ち、脂肪滴の量が少ない段階から、ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量は既に増加していた。
【００２１】
実施例２（糖尿病モデル動物における各組織中のＧＭ２Ａ遺伝子の定量）
代表的な糖尿病モデル動物として、１５週齢のＫＫ−Ａｙマウス（日本クレア社）及び１６週齢のｄｂ／ｄｂマウス（日本チャールズリバー社）を用いた。また、正常動物として、１６週齢Ｃ５７ＢＬマウス（日本チャールズリバー社）を用いた。まず、各マウスを失血死させた後、精巣周囲脂肪組織・大腿筋・肝臓・腎臓・脾臓・精巣をそれぞれ採取した。次に、Ｈａｎｄｙ Ｐｅｓｔｌｅ（カタログ番号ＨＭＸ−３０１、ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、各組織 約３０ｍｇをＲＮＡ ｌａｔｅｒ（カタログ番号７０２１、Ａｍｂｉｏｎ社）１ｍｌ中でホモゲナイズした後、得られた破砕物の静置後に生じる上清の一部からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて全ＲＮＡを調製した。
次に、調製された全ＲＮＡから、実施例１で用いられた方法と同様な方法によりｃＤＮＡ溶液を調製した。次いで、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｍｍ００４９４６５６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、各組織中のＧＭ２Ａ遺伝子の発現量を測定した。即ち、Ａｓｓａｙ溶液 １μｌ、２ｘＦａｓｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０μｌ（カタログ番号４３０４４３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ｃＤＮＡ溶液 ５μｌ及び精製水 ４μｌ（計２０μｌ）を混合し、得られた混合物を７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＰＣＲに供した。また、上記のＡｓｓａｙ溶液の代わりに、Ｒｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨプライマー及びＲｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて同様な操作（ＰＣＲ）を行うことにより、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。尚、標準液として、精巣から調製したｃＤＮＡ溶液を２倍ずつ希釈した溶液を調製して用いた。
ＰＣＲの条件は１サイクル：９４℃ ３０秒間、４０サイクル：９４℃ １５秒間、５６℃ ３０秒間、６８℃ １分間、１サイクル：６８℃ ７分間であり、各遺伝子量は標準直線を基にして測定した。尚、ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量は、以下の式に基づき算出した。その結果を表２に示す。
ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量＝ＧＭ２Ａの発現量／ＧＡＰＤＨの発現量
【００２２】
【表２】
【００２３】
糖尿病モデルマウスでは、Ｃ５７ＢＬマウスに比して、脂肪組織でのＧＭ２Ａ遺伝子の発現量が明らかに増加していた。一方、他の組織では、糖尿病モデルマウスと正常マウスとで明らかな差異は認められなかった。
【００２４】
実施例３（糖尿病モデル動物における脂肪組織中のＧＭ２Ａタンパク質の定量）
糖尿病モデルマウス及び正常マウスの精巣周囲脂肪組織 約３０ｍｇに、ＲＩＰＡバッファー(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ ＮａＦ、１５μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン)２００μｌを加え、得られた混合物を氷中で超音波処理した。次に、得られた破砕物を１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。得られた上清を脂肪組織抽出物とした。尚、各脂肪組織抽出物のタンパク質濃度は、牛血清アルブミンを標準タンパク質にして、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号２３２２８、Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて測定した。
脂肪組織抽出物 １００μｇを１０−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、分離された各タンパク質をＰＶＤＦ膜（カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｆ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に転写した。ＰＶＤＦ膜を５％ スキムミルク（カタログ番号１９８−１０６０５、和光純薬社）を含むＴＢＳ−Ｔ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングした後、これにＴＢＳ−Ｔ溶液で５００倍希釈したウサギ抗ＧＭ２Ａ抗体（カタログ番号１０８６４−２−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）を加え、室温に１時間放置した。次に、得られたＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、これにＴＢＳ−Ｔ溶液で１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号ｓｃ−２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を加え、室温に１時間放置した。得られたＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、これをＣｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ（カタログ番号０５０２７−２０、ナカライテスク社）に浸し、Ｉｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ ＬＡＳ−１０００により発光画像を取り込み、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅを用いてＧＭ２Ａタンパク質のバンドに相当する発光強度を測定した。次に、ＷＢ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（カタログ番号０５３６４−５５、ナカライテスク社）を得られたＰＶＤＦ膜に加えて、これを３７℃、１時間振とうさせながら保温した。その後、得られたＰＶＤＦ膜を１０００倍希釈したヤギ抗アクチン抗体（カタログ番号ｓｃ−１６１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）及びＨＲＰ標識ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（カタログ番号ｓｃ−２０２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）と反応させ、上記と同様にして、アクチンタンパク質のバンドに相当する発光強度を測定した。以下の式に基づきＧＭ２Ａタンパク質の相対発現量を算出した。その結果を表３に示す。
ＧＭ２Ａタンパク質の相対発現量＝ＧＭ２Ａタンパク質の発光量／アクチンの発光量
【００２５】
【表３】
【００２６】
糖尿病モデルマウスでは、Ｃ５７ＢＬマウスに比し、脂肪組織でのＧＭ２Ａタンパク質の発現量が増加していた。
【００２７】
実施例４（肥満患者におけるＧＭ２Ａ遺伝子の発現解析）
ヒトの組織別、疾患別の遺伝子発現データを収載している商用データベースであるＧｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ社のＡｓｃｅｎｔａを用いて、ＧＭ２Ａ遺伝子のヒト正常組織における発現分布を調べた。各種ヒト組織において、ＧＭ２Ａ遺伝子に対応するプローブである２１２７３７＿ａｔの発現を調べた結果、ほとんど全ての組織においてＧＭ２Ａ遺伝子の発現が認められた。次に、肥満患者の脂肪組織、骨格筋、肝臓におけるＧＭ２Ａ遺伝子の発現を健常人と比較した。その結果を表４に示す。
【００２８】
【表４】
【００２９】
肝臓と骨格筋とにおいては、肥満患者と非肥満患者との間で、ＧＭ２Ａ遺伝子の発現量に有意な差は認められなかった。一方、脂肪組織においては、肥満患者は非肥満患者に対し、有意に高いＧＭ２Ａ遺伝子の発現が認められた（ｐ＜０．００５）。
【００３０】
実施例５（ＧＭ２Ａタンパク質による細胞内シグナル伝達阻害作用）
マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２（ＣＲＬ−１７７２）及びラット褐色細胞腫細胞株ＰＣ１２（ＣＲＬ−１７２１）は、ＡＴＣＣ社から購入した。両細胞株の細胞を、非働化牛胎児血清を１０％含むＤ−ＭＥＭ（カタログ番号１４２４７−１５、ナカライテスク社）中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下において培養した。分化マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２の細胞は、非働化馬血清を２％含むＤ−ＭＥＭに交換し、８〜１０間培養することにより調製した。
ヒトＧＭ２Ａタンパク質は、以下の通りに調製した。まず、ヒト肺癌細胞株ＨＡＲＡ−Ｂ（カタログ番号ＪＣＲＢ１０８０．１、ヒューマンサイエンス研究資源バンク）から、オリゴｄＴを用いてｃＤＮＡを調製した。調製されたｃＤＮＡを用いて、ヒトＧＭ２Ａ遺伝子の全長を含むＰＣＲ断片を取得した。取得したＰＣＲ断片をｐＥＴ２４ａベクター（カタログ番号６９７４９−３、Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入することにより、ヒトＧＭ２Ａ／ｐＥＴ２４ａプラスミドを調製した。次に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（カタログ番号６９４５１−４、Ｎｏｖａｇｅｎ社）にヒトＧＭ２Ａ／ｐＥＴ２４ａを添加することにより、当該大腸菌を形質転換させた後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中にて、ＯＤ６００＝約０．５になるまで３７℃で振とう培養した。次いで、得られた培養物に最終濃度０．５ｍMになるように、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（カタログ番号９０３０、タカラバイオ社）を添加した後、更に１８℃、３時間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離することにより菌体を回収し、回収された菌体を超音波処理した。次いで、得られた破砕物を、１１，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離した。得られた上清に、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（カタログ番号１０１８２４４、Ｑｉａｇｅｎ社）を加えて４℃、２時間放置した後、得られた放置物を５回洗浄した。得られた洗浄物から、２５０ｍＭ イミダゾールでタンパク質を溶出させることによりタンパク質の溶出画分を得た。得られた溶出画分を陰イオン交換クロマトＨｉＴｒａｐＱ ＨＰで精製することにより、ヒトＧＭ２Ａタンパク質を調製した。
ＧＭ２Ａタンパク質によるシグナル伝達阻害試験については、以下の通りに実施した。
分化マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２の細胞にヒトＧＭ２Ａタンパク質を加えて２４時間培養した後、得られた培養物から液体培地を除去し、次いでグルコース及び血清を含まないＤ−ＭＥＭ（カタログ番号１１９６６、Ｇｉｂｃｏ社）に交換し、これを更に２時間培養した。次に、得られた培養物に１μｇ／ｍｌ インシュリン（カタログ番号Ｉ−５５００、Ｓｉｇｍａ社）を加えて１０分間培養した後、得られた細胞を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。このようにして得られた細胞から前記実施例で用いられた方法と同様な方法により、細胞抽出物を調製した。同様にして、未分化マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２の細胞にヒトＧＭ２Ａタンパク質を加えて、これを２４時間培養した後、得られた培養物から液体培地を除去し、次いで血清を含まないＤ−ＭＥＭに交換し、これを更に２時間培養した。次いで、得られた培養物に０．１μｇ／ｍｌ レプチン（カタログ番号４５０−３１、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を加えて３０分間培養した後、得られた細胞から上記と同様な方法により細胞抽出物を調製した。また、ラット褐色細胞腫細胞株ＰＣ１２の細胞にヒトＧＭ２Ａタンパク質を加えて、これを２４時間培養した後、得られた培養物から液体培地を除去し、次いで血清を含まないＤ−ＭＥＭに交換し、これを更に１時間培養した。次に、得られた培養物に０．１μｇ／ｍｌ ＮＧＦ（カタログ番号１４７−０４６４１、和光純薬社）を加えて１０分間培養した後、得られた細胞から上記と同様な方法により細胞抽出物を調製した。
実施例３に記載した方法に準じて、細胞抽出物をＰＶＤＦ膜に転写した後、インシュリンについては、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（カタログ番号９２７１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）及び抗Ａｋｔ抗体（カタログ番号９２７２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、レプチンについては、抗リン酸化ＡＭＰＫα抗体（カタログ番号２５３１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）及び抗ＡＭＰＫα抗体（カタログ番号２６０３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、ＮＧＦについては、抗リン酸化Ａｋｔ抗体及び抗Ａｋｔ抗体を用いてブロッティングした。次に、各バンドの発光強度を測定し、非リン酸化タンパクに対するリン酸化タンパクの相対量を算出した。その結果を表５に示す。
【００３１】
【表５】
【００３２】
上記試験結果から明らかなように、ＧＭ２Ａタンパク質は、インシュリン、レプチン及びＮＧＦの細胞内シグナル伝達を濃度依存的に阻害した。
【００３３】
実施例６（ＧＭ２Ａタンパク質の定量法）
（１）ウサギ抗ヒトＧＭ２Ａ抗体の作製
ウサギ抗ヒトＧＭ２Ａポリクローナル抗体は、抗原として、配列番号３又は配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをウサギに免疫し、得られた抗血清から抗原カラムを用いて、それぞれ、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体Ｉ又は抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩを得た。得られた抗ヒトＧＭ２Ａ抗体とＧＭ２Ａタンパク質との反応性を確認するため、ヒト、マウス及びラットＧＭ２Ａを電気泳動して得られたゲルを、上記の各抗体１μｇ／ｍｌでブロッティングした。その結果、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体Ｉ及び抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩは、ヒト、マウス及びラットＧＭ２Ａタンパク質とのいずれにも反応することが確認された。
【００３４】
配列番号３
CysAspGluGlyLysAspProAlaValIleArgSerLeu
配列番号４
CysProPheLysGluGlyThrTyrSerLeuProLysSerGluPheValVal
【００３５】
（２）抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩのビオチン標識
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用い、本キットのプロトコールに従って、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ ２００μｇをＨＲＰ標識した（以下、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ−ＨＲＰと記す）。
【００３６】
（３）エライザ法（検量線作成）
抗ヒトＧＭ２Ａ抗体Ｉをコーティングバッファー（２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３）で１００倍に希釈して１０μｇ／ｍｌの抗体液を調製した。得られた抗体液を１ウエル当たり１００μｌずつの割合で９６ウエルプレートに添加し、これを室温で１時間放置した。抗体液を吸引により除去した後、洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ）を１ウエル当たり２００μｌの割合で用いて洗浄し、当該洗浄操作を３回繰り返した。次に、得られた洗浄物に、１％ ＢＳＡを含む洗浄バッファー（以下、ブロッキングバッファーと記す。）を２００μｌ加え、これを室温で２時間放置した後、洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、得られた洗浄物に、種々の濃度でヒトＧＭ２Ａタンパク質を含有する検体１００μｌを添加し、これを室温で１時間放置した後、洗浄バッファーで５回洗浄した。抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ−ＨＲＰをブロッキングバッファーで１０００倍に希釈して１μｇ／ｍｌの検出用抗体液を調製した。得られた検出用抗体液を１ウエル当たり１００μｌずつの割合で添加し、これを室温で１時間放置した。得られた放置物を洗浄バッファーで５回洗浄した後、これにＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液（カタログ番号５０−７６−０１、ＫＰＬ社）を１００μｌ添加した。得られた混合物を約１５分間放置した後、これに２Ｍ 硫酸を１００μｌ添加することにより反応を停止させた。次に、得られた反応物を含む各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲で直線性が認められた。
【００３７】
実施例７（生物学的試料におけるＧＭ２Ａタンパク質の定量）
（１）正常ラット内臓脂肪細胞培養上清
実施例１で用いられた方法と同様な方法により、正常ラット内蔵脂肪細胞を培養し、Ｄａｙ３、５、７、８にそれぞれ培養上清を回収した。次に、実施例６（３）で用いられた方法と同様な方法により、培養上清中のＧＭ２Ａタンパク質の量を定量した。その結果を表６に示す。
【００３８】
【表６】
【００３９】
培養上清中のＧＭ２Ａタンパク質は、培養日数の増加（即ち、脂肪滴の蓄積）とともに従って増加した。
【００４０】
（２）ヒト血清
非肥満血清１３検体及び肥満患者血清７検体をＩＬＳｂｉｏ社から購入した。購入された各血清検体を、２０〜１００倍に希釈した後、実施例６（３）で用いられた方法と同様な方法により、ヒト血清中のＧＭ２Ａタンパク質の量を定量した。その結果を表７に示す。
【００４１】
【表７】
【００４２】
肥満患者では非肥満患者に対し、血清中のＧＭ２Ａタンパク質量が有意に高値を示した（ｐ＜０．０５）。
【００４３】
実施例８（ＧＭ２Ａタンパク質によるグルコース取り込み阻害作用）
マウス脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１は、（財）ヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入した。購入されたマウス脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１の細胞を、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ（以下、Ｄ−ＭＥＭ（１０）と記す。）中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下において培養した。培養された当該細胞を６ウエルプレートに播き、コンフルエントになって２日後に、培養液を前分化培養液（１μｇ／ｍｌ インシュリン（対照では無添加）、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１μＭ デキサメタゾンを含むＤ−ＭＥＭ（１０））へ交換して更に４日間培養した。次に、前分化培養液を後分化培養液（１μｇ／ｍｌ インシュリン（対照では無添加）を含むＤ−ＭＥＭ（１０））へ交換して３日間培養した後、マウスＧＭ２Ａタンパク質を表８に記載した濃度で含むＤ−ＭＥＭ（１０）へ交換して更に１日間培養した。翌日、得られた培養物から培養液を除去した後、マウスＧＭ２Ａタンパク質を表８に記載した濃度で含む後分化培養液又はＤ−ＭＥＭ（１０）へ交換して４時間培養した。次いで、得られた上記細胞をＨＲＰＨバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＯＨ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ 牛血清アルブミン）で２回洗浄した後、これに１ｍＭ ２−デオキシグルコースを含むＨＲＰＨバッファーを添加して３０分間培養した。次に、得られた培養物をＨＲＰＨバッファーで２回洗浄した後、スクレイパーを用いて細胞を回収した。次いで、回収物を遠心分離することにより得られた沈渣に０．１Ｍ ＮａＯＨを加えた後、これをボルテックスすることにより、前記細胞を凍結融解した。凍結融解された細胞（細胞溶液）を８５℃、３０分間保温した後、これに０．１Ｍ ＨＣｌを加えて中和することにより、検体を調製した。尚、検体のタンパク濃度は、牛血清アルブミンを標準タンパク質にして、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号２３２２８、Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて測定した。
検体中の２−デオキシグルコースの量は、以下の方法に従って定量した。蛍光測定用プレートにアッセイバッファー（５０ｍＭ トリエタノールアミン（ｐＨ８．１）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％ 牛血清アルブミン、６７０μＭ ＡＴＰ、０．１２μＭ ＮＡＤＰ＋、２５μＭ レサズリン、５．５単位／ｍｌ ヘキソキナーゼ、１６単位／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ、１単位／ｍｌ ジアホラーゼ）１００μｌ及び検体１００μｌを加えた。得られた混合物を３７℃、９０分間保温した後、得られた混合物の蛍光強度を測定した（励起波長５３０ｎｍ、検出波長５９５ｎｍ）。２−デオキシグルコース ５００μＭ、２５０μＭ、１２５μＭ、０μＭ（蒸留水）を標準物として検量線を作成し、当該検量線に基づき定量した。検体のタンパク量当たりの、細胞内へ取り込まれた２−デオキシグルコース量を相対値としてＧＭ２Ａタンパク算出した。その結果を表８に示す。
【００４４】
【表８】
【００４５】
ＧＭ２Ａタンパク質は、インシュリンによる２−デオキシグルコースの細胞内取り込み促進作用を濃度依存的に阻害した。
【００４６】
実施例９（抗ＧＭ２Ａ抗体及びリガンドによるグルコース取り込み促進作用）
ヒトＧＭ２Ａのリガンド結合ドメインに対する抗体である抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ、及び、ヒトＧＭ２ＡのリガンドであるガングリオシドＧＭ２（カタログ番号Ｇ８３９７、Ｓｉｇｍａ社）を分化マウス脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１の細胞（培養液中へＧＭ２Ａタンパク質を分泌している）に添加した後、細胞中の２−デオキシグルコース量を測定した。実施例８で用いられた方法と同様な方法により、後分化培養液中で３日間培養した後、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ又はウサギＩｇＧ（コントロール抗体）、ガングリオシドＧＭ２又はＤＭＳＯを含む後分化培養液に交換して１日間培養した。翌日、得られた培養物から培養液を除去し、次いでＨＲＰＨバッファーで２回洗浄した後、これに１ｍＭ ２−デオキシグルコースを含むＨＲＰＨバッファーを添加して３０分間培養した。検体中の２−デオキシグルコース量は、実施例８で用いられた方法と同様な方法により測定した。細胞内へ取り込まれた２−デオキシグルコースの量を相対値としてＧＭ２Ａタンパク算出した。その結果を表９に示す。
【００４７】
【表９】
【００４８】
抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ及びガングリオシドＧＭ２は、２−デオキシグルコースの細胞内取り込みを促進した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の方法は、マイクロドメイン病の早期検出及び疾患状態のモニタリング等に利用でき、本発明の動物は、マイクロドメイン病の予防若しくは治療薬等の医薬品開発等に利用できる。また、抗ＧＭ２Ａ抗体やＧＭ２Ａ阻害活性化合物は、マイクロドメイン病の予防若しくは治療薬として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：抗原ペプチド
配列番号４：抗原ペプチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロドメイン病のバイオマーカー等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活慣習病の原因の１つである肥満は、脂肪細胞の数の増加と脂肪細胞自身の肥大化とが見られる状態で、一般に糖尿病、高血圧、動脈硬化、脳卒中、心筋梗塞等の病態を発症させる引き金になると考えられている。脂肪細胞が産生する生理活性物質は、総称してアディポサイトカイン（ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅ）と呼ばれる。これらの物質は、本来は脂肪細胞自身の代謝に重要な役割を果たすが、肥満等をきっかけに過剰分泌・分泌不全といった分泌制御の異常が生じると、病態の発症を引き起こす原因となる。例えば、線溶系の重要な調節因子であるプラスミノーゲンアクティベータインヒビター１（ＰＡＩ−１）は、脂肪蓄積がおこると特に内臓脂肪で著しく発現量が増加して血中濃度も増加し、血管合併症の成因の一つとなると考えられている。また、分子量約２０ｋＤａのレジスチンは、インシュリンによる糖の取り込み促進作用を抑制するので、ＴＮＦ−α等と同様にＩＩ型糖尿病の発症に関わる因子であると考えられている。その抑制機構は、ＳＯＣＳ３やＮＦ−ｋＢ等のシグナル伝達分子を活性化することによって、インシュリンのシグナル伝達を阻害する、即ち、インシュリン抵抗性を誘導するものと考えられている。
さらに、肥満患者では、摂食を抑制するレプチンが血中に高濃度で存在するにも関わらず、レプチンの作用が減弱するレプチン抵抗性が観察される。そのため、脂肪細胞から分泌されたレプチンが視床下部に作用しても、摂食行動が抑制されず、過食の状態が維持されることになる。
さらに、最近では、認知症の代表的疾患であるアルツハイマー病と、生活習慣病との関連性が注目されている。例えば、糖尿病患者では健常人に比して、アルツハイマー病への罹患率が２倍に上昇することが知られている。神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）は、神経細胞の増殖を促進し、神経細胞の細胞死を抑制するタンパク質であるが、糖尿病患者ではＮＧＦの作用が減弱しているため、アルツハイマー病に罹患しやすくなると考えられる。
肥満、糖尿病及びその合併症等の生活慣習病の病態は、スフィンゴ糖脂質の異常発現によって細胞膜のマイクロドメインの構成、構造及び機能が変化し、サイトカインやホルモンによるシグナル伝達が異常となっている疾病、即ち、マイクロドメイン病である、という仮説が提唱されている。井ノ口らは、脂肪細胞や炎症細胞が産生するＴＮＦ−αが、ＴＮＦ−α受容体を介して、細胞内に存在するガングリオシドＧＭ３合成酵素の発現を促進し、マイクロドメインの構成成分であるＧＭ３が増加することによって、マイクロドメインの構造が変化し、マイクロドメインに存在するインシュリン受容体の機能が減弱することを見出している（非特許文献１参照）。しかしながら、ＴＮＦ−αがＧＭ３を介して、レプチン抵抗性やＮＧＦの作用抑制を誘導することは、これまで報告されていない。
これまで、インシュリン抵抗性を診断する方法として、一般的にグルコース負荷試験が用いられているが、簡便性という点で問題がある。また、レプチン抵抗性やＮＧＦの作用抑制を診断しうるバイオマーカーはこれまで知られていない。そこで、マイクロドメイン病のバイオマーカーや操作性が簡便で安価なマイクロドメイン病の検出方法等に係る技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００７）、１０４、ｐ．１３６７８−１３６８３
【非特許文献２】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００８）、５５（４）、ｐ．７６７−７７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、マイクロドメイン病のバイオマーカーや操作性が簡便で安価なマイクロドメイン病の検出方法等に係る技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、かかる状況の下、脂肪細胞の肥大化に伴って細胞外へ分泌されるアディポサイトカインに注目して鋭意検討した結果、糖尿病モデル動物、糖尿病患者及び肥満のヒトにおいては、正常動物や健常人に比して、脂肪組織中のＧＭ２Ａ（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＭ２ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）の量が増加すること、並びに、ＧＭ２Ａが、サイトカイン（インシュリン、レプチン及びＮＧＦ）のシグナル伝達を抑制することを見出した。
ＧＭ２Ａは、スフィンゴ糖脂質の代謝に関与する公知の糖タンパク質である。その機能としては、ガングリオシドの分解に関与する補酵素として働き、例えば、サポシンＢと協同してＧＭ１をＧＭ２に分解し、一方、ヘキソサミニダーゼＡと協同して、ＧＭ２をＧＭ３に、ＧＡ２をラクトシルセラミドに分解する。ＧＭ２Ａ前駆体は、アミノ末端側のペプチドが除去されて、細胞外へ分泌される。例えば、ヒトＧＭ２Ａは、分子量約２５ｋＤａ、１９９アミノ酸残基の公知の糖タンパク質であり、アミノ末端側の３１残基が切断されて細胞外へ分泌される。
しかしながら、上記の知見はこれまで知られておらず、本発明者によって初めて見出されたものである。本発明は、かかる知見に基づくものである。
即ち、本発明は、ＧＭ２Ａをマイクロドメイン病のバイオマーカーとして使用することを要旨とする。
【０００６】
本発明は、
［１］ 被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を閾値と比較する工程を含むことを特徴とする前記被検動物におけるマイクロドメイン病を検出する方法；
［２］ 被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を前記被検動物について異なる時点で測定されたＧＭ２Ａの量又は活性と比較する工程を含むことを特徴とするマイクロドメイン病の疾患状態の変化をモニタリングする方法；
［３］ 前記生物学的試料が、血液、リンパ液、組織又は細胞であることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載される方法；
［４］ 前記ＧＭ２Ａの量又は活性の測定が、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光免疫測定法、エライザ法、免疫組織化学染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、ノーザンブロッティング法又はＲＴ−ＰＣＲ法により行われることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載される方法；
［５］ マイクロドメイン病のバイオマーカーとしてのＧＭ２Ａの使用；
［６］ 前記マイクロドメイン病が、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、糖尿病若しくはその合併症、癌、中枢神経障害、子宮内膜症、骨粗しょう症又は自己免疫疾患であることを特徴とする上記［５］に記載される使用；
［７］ ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬を含有することを特徴とするマイクロドメイン病の診断用キット；
［８］ 前記ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬が、抗ＧＭ２Ａ抗体、又はラジオアイソトープ若しくは蛍光色素で標識されたガングリオシドであることを特徴とする上記［７］に記載される診断用キット；
［９］ ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物；
［１０］ 脂肪細胞においてＧＭ２Ａの発現レベルを上昇させた上記[９]に記載されるトランスジェニック動物；
［１１］ ＧＭ２Ａタンパク質を投与し、血液中のＧＭ２Ａの量又は活性を人工的に上昇させた動物；
［１２］ マイクロドメイン病の症状を呈することを特徴とする上記［９］〜［１１］のいずれか一項に記載される動物；
［１３］ 抗ＧＭ２Ａ抗体を有効成分として含有することを特徴とするマイクロドメイン病の予防若しくは治療薬；
［１４］ ＧＭ２Ａ阻害活性化合物を有効成分として含有することを特徴とするマイクロドメイン病の予防若しくは治療薬；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、マイクロドメイン病のバイオマーカーや操作性が簡便で安価なマイクロドメイン病の検出方法等に係る技術が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の一態様は、マイクロドメイン病のバイオマーカーとしてのＧＭ２Ａの使用、である。より具体的には、ＧＭ２Ａはマイクロドメイン病のバイオマーカーとして、下記のように使用される。
【０００９】
〔１〕マイクロドメイン病を検出する方法
本発明のマイクロドメイン病を検出する方法は、被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を閾値と比較する工程を含む。
本明細書中、「マイクロドメイン病」なる語は、スフィンゴ糖脂質の異常発現によって細胞膜のマイクロドメイン（例、カベオラ等のラフト）の構成、構造及び機能が変化し、サイトカイン（例、インシュリン、レプチン、神経成長因子（ＮＧＦ））又はホルモンによるシグナル伝達が異常となっている疾病を意味する。
「マイクロドメイン病」の例としては、具体的には、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、糖尿病及びその合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経疾患）、癌、中枢神経障害（例、アルツハイマー病）、子宮内膜症、骨粗しょう症、並びに自己免疫疾患が挙げられる。なかでも、本発明は、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、糖尿病若しくはその合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経疾患）、又は中枢神経障害（例、アルツハイマー病）に好適に適用できる。本発明において、肥満としては、レプチン抵抗性に起因するものが好ましく、中枢神経障害（例、アルツハイマー病）としては、ＮＧＦ作用の抑制に起因するものが好ましい。
本明細書中、「マイクロドメイン病を検出する」とは、被検動物がマイクロドメイン病に罹患しているか否かを評価することを包含する事を意図して用いられる。また、本明細書中、「マイクロドメイン病に罹患している」とは、マイクロドメイン病の外見的な症状が観察されない場合も包含する事を意図して用いられる。
本発明における被検動物は、好ましくは非ヒト動物又はヒトであり、より好ましくは非ヒト哺乳動物又はヒトであり、特に好ましくはヒトである。
【００１０】
本発明における生物学的試料は、好ましくは血液、リンパ液、組織（例、脂肪組織）又は細胞（例、脂肪細胞）である。
測定の対象となるＧＭ２Ａは、天然に存在しうる形態のＧＭ２Ａであればよく、例えば、ＧＭ２Ａの完全長ＧＭ２Ａ（ＧＭ２Ａ前駆体）であってもよく、アミノ末端側のポリペプチドが除去されて細胞外へ分泌されたものであってもよい。
ＧＭ２Ａの量の測定法としては、ＧＭ２Ａの量を決定できる方法であれば限定されないが、例えば、ＧＭ２Ａタンパク質に対する特異的抗体、ＧＭ２Ａの糖鎖に対するレクチンや特異的抗体又はＧＭ２Ａ遺伝子と結合する核酸を用いた、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、エライザ法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学染色法、高速液体クロマトグラフィー定量法、マススペクトル定量法、酵素法、免疫沈降法、及びウェスタンブロッティング法等の翻訳レベルでＧＭ２Ａの発現量を測定する方法、レクチン組織化学染色法、及びレクチンブロッティング法等の糖修飾レベルでＧＭ２Ａの発現量を測定する方法並びにノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法及びｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション等の転写レベルでＧＭ２Ａの発現量を測定する方法が用いられる。
また、ＧＭ２Ａの活性の測定法としては、ＧＭ２Ａの活性を測定できる方法であれば限定されないが、例えば、ラジオアイソトープ又は蛍光色素で標識されたガングリオシドを基質として、サポシン又はヘキソサミニダーゼ等との共存又は非共存下で、生成物又は結合物を定量する方法が用いられる。
これらの方法を用いることによって、ＧＭ２Ａの量又は活性を定量的に測定することが可能である。また、自動分析装置等を使用することによって、短時間で大量の生物学的試料の測定が可能となる。
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等の免疫学的測定法に用いる抗体としては、特に限定されず、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が用いられるが、好ましくはモノクローナル抗体が用いられる。また、ＧＭ２Ａにおいて、抗体が認識するエピトープの位置は、特に限定されるものではない。抗体は完全な抗体分子でもよいし、Ｆａｂフラグメント若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメント等、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメントでもよい。
【００１１】
本発明にあっては、上記のような方法で被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定し、得られた測定値が、健常者及びマイクロドメイン病に罹患している動物の生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、前記の被検動物がマイクロドメイン病に罹患していると評価するものである。
ここで、健常者とは、マイクロドメイン病に罹患していない被検動物を意味し、他の疾患に罹患している被検動物も包含しうる。
当該閾値は、被検動物の種、性別、年齢（週齢）、生活習慣によって変動するため、これら毎に、予め設定する必要がある。
当該閾値は、例えば、健常者及びマイクロドメイン病に罹患している複数の動物の生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を上述の方法により測定し、それぞれについて得られた測定値の平均値±標準偏差を参照して設定することができる。閾値決定のための、健常者であるか、またはマイクロドメイン病に罹患している動物であるか、を判断する方法としては、マイクロドメイン病に包含される疾病の既知の診断法を利用すればよい。このような閾値の具体的な設定例としては、例えば、（マイクロドメイン病に罹患した動物の生物学的試料における、ＧＭ２Ａの量又は活性の平均値−標準偏差）等が挙げられる。
なお、「平均値」とは、同一種の動物である複数の固体から採取した生物学的試料についてそれぞれのＧＭ２Ａの量又は活性を測定し、これらの測定値の総和を個体数（試料数）で除して得られる相加平均値である。
このようにして設定した閾値と、被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性とを比較し、この測定値が、前記閾値以上であれば、前記の被検動物はマイクロドメイン病に罹患していると評価する。
特に、本発明の方法は、マイクロドメイン病を早期に（例えば、糖尿病であれば、血糖値検査によって糖尿病が検出されるより早い時期に）検出できることが期待される。
【００１２】
〔２〕マイクロドメイン病の疾患状態の変化をモニタリングする方法
本発明の、マイクロドメイン病の疾患状態の変化をモニタリングする方法は、被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を前記被検動物について異なる時点で測定されたＧＭ２Ａの量又は活性と比較する工程を含む。
当該方法は、前記の本発明の「マイクロドメイン病を検出する方法」と基本的に同様に実施することができるが、一の被検動物について異なる時点でＧＭ２Ａの量又は活性を測定し、測定されたＧＭ２Ａの量又は活性同士を比較する点で異なる。
ＧＭ２Ａの量又は活性は、一定の期間（例えば、１日間、３日間、１週間、２週間、１ヶ月）を空けて、測定される。
得られた測定値が経時的に上昇又は低下した場合、それぞれ、マイクロドメイン病が増悪又は改善したと評価することができる。このようなモニタリングを行うことによって、マイクロドメイン病に罹患している又は罹患する可能性があると評価された動物において、適当な治療薬又は予防薬の選択、及び、その効果の判定等を有効に行うことができる。
これは、適当な治療計画の決定、並びに新薬の評価に利用することができる。
【００１３】
〔３〕マイクロドメイン病の診断用キット
また、本発明は、上記で説明した本発明の方法を実施するために使用できる、マイクロドメイン病の診断キットを提供する。このキットは、ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬を含む。このような測定試薬としては、抗ＧＭ２Ａ抗体等のＧＭ２Ａを認識しうる試薬、又はラジオアイソトープ若しくは蛍光色素で標識されたガングリオシド等のＧＭ２ＡとサポシンＢ若しくはラクトヘキソサミニダーゼＡとの協同によって分解される試薬を使用することができる。
【００１４】
抗ＧＭ２Ａ抗体としては、特に限定されないが、好ましくはモノクローナル抗体である。ＧＭ２Ａの量を免疫学的手法により測定する場合、本発明によるキットはさらに、抗体の固相化、抗体の検出等に用いることのできる物質及び器具等を含んでもよい。抗体の固相化のためには、マイクロタイタープレート等の担体、炭酸緩衝液等の固相化用液体、ゼラチンやアルブミン等を含むブロッキング液を含むことができる。抗体の検出のためには、抗体を予め標識しておくことが好ましく、その場合には、本発明によるキットはその検出用試薬を含むことができる。例えば、標識物質としてビオチンを使用する場合には、検出用試薬としてストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とのコンジュゲート、並びに、ＨＲＰの作用によって発色する発色液を含むことができる。また、ＧＭ２Ａの活性測定に用いる基質としては、好ましくはラジオアイソトープ又は蛍光色素で標識されたガングリオシドである。
【００１５】
〔動物〕
本発明はまた、ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を提供する。これらトランスジェニック動物は、当該技術分野において慣用の遺伝子導入技術を用いて、当業者が容易に作製することができる。
ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子とは、ＧＭ２Ａ遺伝子に後述する所定遺伝子のエンハンサー配列部分、プロモーター配列部分及びポリＡシグナル配列部分を結合させたＤＮＡフラグメントからなる遺伝子である。
ＧＭ２Ａ遺伝子は、結合させる前記所定遺伝子に応じて発現する組織・細胞を決定することができる。
所定遺伝子として、例えば脂肪細胞のみに発現しているａＰ２遺伝子を用いた場合はＧＭ２Ａ遺伝子を脂肪細胞で高発現させることができ、神経細胞で発現している神経細胞特異的エノラーゼ遺伝子を用いた場合はＧＭ２Ａ遺伝子を神経細胞で高発現させることができる。他に所定遺伝子として、アルブミン遺伝子やインシュリン遺伝子等を挙げることができる。ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物として好ましくは、上述のようにしてＧＭ２Ａ遺伝子を脂肪細胞で高発現させたトランスジェニック動物等の、脂肪細胞においてＧＭ２Ａの発現レベルを上昇させたトランスジェニック動物である。
前記エンハンサー配列部分として、ＳＶ４０エンハンサー、ポリオーマウイルスエンハンサー等のウイルスエンハンサー、ＩｇＨエンハンサー、ＩｇＬエンハンサー、Ｔ細胞レセプターα鎖エンハンサー等の免疫系遺伝子のエンハンサー、β−アクチンエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、エラスターゼＩ遺伝子エンハンサー等の細胞エンハンサー等が挙げられる。
前記プロモーター配列部分として、ウイルス（例えば、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス）由来のプロモーター配列部分や、メタロチオネイン、メタロプロテナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１及び２、ミエリン基礎タンパク等のプロモーター配列部分等を挙げることができる。
前記ポリＡシグナル配列部分として、ＳＶ４０−ポリＡシグナル、成長ホルモン−ポリＡシグナル等が挙げられる。
ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を作製するには、前記ＤＮＡフラグメントからなる遺伝子を非ヒト哺乳動物の受精卵にマイクロインジェクション法等により導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物を分娩させることにより実施することができる。非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、ニワトリ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さ等の観点から、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい（非特許文献２参照）。
本発明はまた、ＧＭ２Ａタンパク質を投与し、血液中のＧＭ２Ａの量又は活性を人工的に上昇させた動物を提供する。
ＧＭ２Ａタンパク質を動物に投与する方法としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、エアゾル投与、脳室内投与等が挙げられる。また、更に、ＧＭ２Ａタンパク質を動物に投与する方法のうち、体内から動物に投与する方法としては、例えば、ＧＭ２Ａタンパク質をペレットにして皮下や皮内等に埋め込む方法、浸透圧ポンプにＧＭ２Ａタンパク質を封じ込めて皮下、皮内又は腹腔内等に埋め込む方法等が挙げられる。
前記動物としては、特に限定されず、好ましくは非ヒト動物であり、より好ましくは非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、 イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル）である。
このように、血液又は組織中のＧＭ２Ａ遺伝子の発現、あるいはＧＭ２Ａの量又は活性が上昇している動物は、マイクロドメイン病の症状を呈し得、マイクロドメイン病の予防若しくは治療薬等の医薬品開発のためのモデル動物として、あるいは該医薬品のスクリーニング用の動物として、非常に有用である。
【００１６】
〔形質転換細胞〕
本発明はまた、ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入された動物細胞を提供する。このような形質転換細胞は、当該技術分野において慣用の遺伝子導入技術を用いて、当業者が容易に作製することができる。
例えば、導入するＧＭ２Ａ遺伝子に、脂肪細胞にのみ発現している遺伝子のエンハンサー及びプロモーター、又はこれらの高発現用に改変したものを結合し、その遺伝子を染色体に導入することによって、ＧＭ２Ａ遺伝子がＧＭ２Ａ遺伝子の発現が上昇させられている形質転換動物細胞を作製することができる。導入するＧＭ２Ａ遺伝子は、翻訳されてＧＭ２Ａの機能を発揮するものであれば特に限定されず、修飾された遺伝子であってもよい。
宿主細胞は、特に限定されず、マウス骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ラット由来のＧＨＳ細胞等の動物細胞が用いられる。
このような形質転換動物細胞は、マイクロドメイン病の予防若しくは治療薬等の医薬品開発等に用いることができる。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明する。
【００１８】
実施例１（正常ラット脂肪細胞でのＧＭ２Ａ遺伝子の定量）
正常ラット脂肪細胞（内臓脂肪細胞、皮下脂肪細胞、精巣周囲脂肪細胞）及び液体培地（脂肪細胞分化メディウム）は、プライマリーセル社から購入した。ＧＭ２Ａプライマー（下記に、配列番号１及び２で示す。）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に合成を委託して、入手した。
各脂肪細胞（０．７５ｘ１０６細胞）に液体培地６ｍｌを加えて分散し、得られた脂肪細胞分散物を５００ｒｐｍ、５分間で遠心分離した。沈渣に液体培地３．２ｍｌを加えて再度分散した後、得られた脂肪細胞再分散物を１ウエル当たり０．５ｍｌの割合で２４ウエルプレートに加えた。これを３７℃、５％ ＣＯ２の雰囲気下で培養した。翌日（Ｄａｙ１とする）、得られた培養物に液体培地０．５ｍｌ加えて一晩培養し、以後、２日毎に液体培地を全量交換した。Ｄａｙ２、４、６、１０にそれぞれ脂肪細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、洗浄された脂肪細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(カタログ番号７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて全ＲＮＡを調製した。
次に、１０ｎｇ／μｌ 全ＲＮＡ １２．５μｌ、２０μＭ オリゴｄＴ ２．５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ及び精製水 １２．５μｌ（計３０μｌ）を混合し、得られた混合物を６５℃で５分間保温した後、氷中で冷却した。冷却された混合物に、５ｘバッファー １０μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ５μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．２５μｌ（カタログ番号１８０８０−０４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ １．２５μｌ（カタログ番号１０７７７−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び精製水 ２．５μｌ（計２０μｌ）を加えて混合し、得られた混合物を４２℃で６０分間、９９℃で３分間反応させた後、これを４℃で保温することによりｃＤＮＡ溶液を調製した。
次に、１０ｘＰＣＲバッファー ５μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− １μｌ（カタログ番号ＫＯＤ−２０１、ＴＯＹＯＢＯ社）、１０μＭ ＧＭ２Ａプライマー 各１μｌ（下記に、配列番号１及び２で示す。）、ｃＤＮＡ溶液 ２μｌ及び精製水 ３３μｌ（計５０μｌ）を混合し、得られた混合物をＰＣＲ（条件は、１サイクル:９４℃ ３０秒間、２９サイクル：９４℃ １５秒間、５６℃ ３０秒間、６８℃ １分間、１サイクル：６８℃ ７分間）に供した。また、ＧＭ２Ａプライマーの代わりに、ＧＡＰＤＨプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて同様な操作（ＰＣＲ）を行った。生成したＰＣＲ産物 ５μｌを、エチジウムブロミドを含む１％ アガロースゲルを用いて電気泳動した後、電気泳動後のアガロースゲルにおける蛍光画像をＩｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ ＬＡＳ−１０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて取り込み、前記蛍光画像における蛍光強度をＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて測定した。以下の式に基づき、ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量を算出し、その結果を表１に示す。
ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量＝ＧＭ２Ａの蛍光強度／ＧＡＰＤＨの蛍光強度
［ラットＧＭ２Ａプライマー］
配列番号１：gtgctgggct tgctgttc
配列番号２：gatgctctgg atgcggtagt
【００１９】
【表１】
【００２０】
各脂肪細胞中の脂肪滴は、顕微鏡観察の結果、Ｄａｙ２において細胞質の約１０％、Ｄａｙ４において細胞質の約３０％、Ｄａｙ６で約９０％を占めていた。一方、ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量は、全ての脂肪細胞において、Ｄａｙ２に比してＤａｙ４以降で明らかに増加した。即ち、脂肪滴の量が少ない段階から、ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量は既に増加していた。
【００２１】
実施例２（糖尿病モデル動物における各組織中のＧＭ２Ａ遺伝子の定量）
代表的な糖尿病モデル動物として、１５週齢のＫＫ−Ａｙマウス（日本クレア社）及び１６週齢のｄｂ／ｄｂマウス（日本チャールズリバー社）を用いた。また、正常動物として、１６週齢Ｃ５７ＢＬマウス（日本チャールズリバー社）を用いた。まず、各マウスを失血死させた後、精巣周囲脂肪組織・大腿筋・肝臓・腎臓・脾臓・精巣をそれぞれ採取した。次に、Ｈａｎｄｙ Ｐｅｓｔｌｅ（カタログ番号ＨＭＸ−３０１、ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、各組織 約３０ｍｇをＲＮＡ ｌａｔｅｒ（カタログ番号７０２１、Ａｍｂｉｏｎ社）１ｍｌ中でホモゲナイズした後、得られた破砕物の静置後に生じる上清の一部からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて全ＲＮＡを調製した。
次に、調製された全ＲＮＡから、実施例１で用いられた方法と同様な方法によりｃＤＮＡ溶液を調製した。次いで、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｍｍ００４９４６５６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、各組織中のＧＭ２Ａ遺伝子の発現量を測定した。即ち、Ａｓｓａｙ溶液 １μｌ、２ｘＦａｓｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０μｌ（カタログ番号４３０４４３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ｃＤＮＡ溶液 ５μｌ及び精製水 ４μｌ（計２０μｌ）を混合し、得られた混合物を７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＰＣＲに供した。また、上記のＡｓｓａｙ溶液の代わりに、Ｒｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨプライマー及びＲｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて同様な操作（ＰＣＲ）を行うことにより、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。尚、標準液として、精巣から調製したｃＤＮＡ溶液を２倍ずつ希釈した溶液を調製して用いた。
ＰＣＲの条件は１サイクル：９４℃ ３０秒間、４０サイクル：９４℃ １５秒間、５６℃ ３０秒間、６８℃ １分間、１サイクル：６８℃ ７分間であり、各遺伝子量は標準直線を基にして測定した。尚、ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量は、以下の式に基づき算出した。その結果を表２に示す。
ＧＭ２Ａ遺伝子の相対発現量＝ＧＭ２Ａの発現量／ＧＡＰＤＨの発現量
【００２２】
【表２】
【００２３】
糖尿病モデルマウスでは、Ｃ５７ＢＬマウスに比して、脂肪組織でのＧＭ２Ａ遺伝子の発現量が明らかに増加していた。一方、他の組織では、糖尿病モデルマウスと正常マウスとで明らかな差異は認められなかった。
【００２４】
実施例３（糖尿病モデル動物における脂肪組織中のＧＭ２Ａタンパク質の定量）
糖尿病モデルマウス及び正常マウスの精巣周囲脂肪組織 約３０ｍｇに、ＲＩＰＡバッファー(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ ＮａＦ、１５μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン)２００μｌを加え、得られた混合物を氷中で超音波処理した。次に、得られた破砕物を１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。得られた上清を脂肪組織抽出物とした。尚、各脂肪組織抽出物のタンパク質濃度は、牛血清アルブミンを標準タンパク質にして、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号２３２２８、Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて測定した。
脂肪組織抽出物 １００μｇを１０−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、分離された各タンパク質をＰＶＤＦ膜（カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｆ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に転写した。ＰＶＤＦ膜を５％ スキムミルク（カタログ番号１９８−１０６０５、和光純薬社）を含むＴＢＳ−Ｔ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングした後、これにＴＢＳ−Ｔ溶液で５００倍希釈したウサギ抗ＧＭ２Ａ抗体（カタログ番号１０８６４−２−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）を加え、室温に１時間放置した。次に、得られたＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、これにＴＢＳ−Ｔ溶液で１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号ｓｃ−２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を加え、室温に１時間放置した。得られたＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、これをＣｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ（カタログ番号０５０２７−２０、ナカライテスク社）に浸し、Ｉｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ ＬＡＳ−１０００により発光画像を取り込み、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅを用いてＧＭ２Ａタンパク質のバンドに相当する発光強度を測定した。次に、ＷＢ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（カタログ番号０５３６４−５５、ナカライテスク社）を得られたＰＶＤＦ膜に加えて、これを３７℃、１時間振とうさせながら保温した。その後、得られたＰＶＤＦ膜を１０００倍希釈したヤギ抗アクチン抗体（カタログ番号ｓｃ−１６１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）及びＨＲＰ標識ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（カタログ番号ｓｃ−２０２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）と反応させ、上記と同様にして、アクチンタンパク質のバンドに相当する発光強度を測定した。以下の式に基づきＧＭ２Ａタンパク質の相対発現量を算出した。その結果を表３に示す。
ＧＭ２Ａタンパク質の相対発現量＝ＧＭ２Ａタンパク質の発光量／アクチンの発光量
【００２５】
【表３】
【００２６】
糖尿病モデルマウスでは、Ｃ５７ＢＬマウスに比し、脂肪組織でのＧＭ２Ａタンパク質の発現量が増加していた。
【００２７】
実施例４（肥満患者におけるＧＭ２Ａ遺伝子の発現解析）
ヒトの組織別、疾患別の遺伝子発現データを収載している商用データベースであるＧｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ社のＡｓｃｅｎｔａを用いて、ＧＭ２Ａ遺伝子のヒト正常組織における発現分布を調べた。各種ヒト組織において、ＧＭ２Ａ遺伝子に対応するプローブである２１２７３７＿ａｔの発現を調べた結果、ほとんど全ての組織においてＧＭ２Ａ遺伝子の発現が認められた。次に、肥満患者の脂肪組織、骨格筋、肝臓におけるＧＭ２Ａ遺伝子の発現を健常人と比較した。その結果を表４に示す。
【００２８】
【表４】
【００２９】
肝臓と骨格筋とにおいては、肥満患者と非肥満患者との間で、ＧＭ２Ａ遺伝子の発現量に有意な差は認められなかった。一方、脂肪組織においては、肥満患者は非肥満患者に対し、有意に高いＧＭ２Ａ遺伝子の発現が認められた（ｐ＜０．００５）。
【００３０】
実施例５（ＧＭ２Ａタンパク質による細胞内シグナル伝達阻害作用）
マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２（ＣＲＬ−１７７２）及びラット褐色細胞腫細胞株ＰＣ１２（ＣＲＬ−１７２１）は、ＡＴＣＣ社から購入した。両細胞株の細胞を、非働化牛胎児血清を１０％含むＤ−ＭＥＭ（カタログ番号１４２４７−１５、ナカライテスク社）中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下において培養した。分化マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２の細胞は、非働化馬血清を２％含むＤ−ＭＥＭに交換し、８〜１０間培養することにより調製した。
ヒトＧＭ２Ａタンパク質は、以下の通りに調製した。まず、ヒト肺癌細胞株ＨＡＲＡ−Ｂ（カタログ番号ＪＣＲＢ１０８０．１、ヒューマンサイエンス研究資源バンク）から、オリゴｄＴを用いてｃＤＮＡを調製した。調製されたｃＤＮＡを用いて、ヒトＧＭ２Ａ遺伝子の全長を含むＰＣＲ断片を取得した。取得したＰＣＲ断片をｐＥＴ２４ａベクター（カタログ番号６９７４９−３、Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入することにより、ヒトＧＭ２Ａ／ｐＥＴ２４ａプラスミドを調製した。次に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（カタログ番号６９４５１−４、Ｎｏｖａｇｅｎ社）にヒトＧＭ２Ａ／ｐＥＴ２４ａを添加することにより、当該大腸菌を形質転換させた後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中にて、ＯＤ６００＝約０．５になるまで３７℃で振とう培養した。次いで、得られた培養物に最終濃度０．５ｍMになるように、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（カタログ番号９０３０、タカラバイオ社）を添加した後、更に１８℃、３時間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離することにより菌体を回収し、回収された菌体を超音波処理した。次いで、得られた破砕物を、１１，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離した。得られた上清に、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（カタログ番号１０１８２４４、Ｑｉａｇｅｎ社）を加えて４℃、２時間放置した後、得られた放置物を５回洗浄した。得られた洗浄物から、２５０ｍＭ イミダゾールでタンパク質を溶出させることによりタンパク質の溶出画分を得た。得られた溶出画分を陰イオン交換クロマトＨｉＴｒａｐＱ ＨＰで精製することにより、ヒトＧＭ２Ａタンパク質を調製した。
ＧＭ２Ａタンパク質によるシグナル伝達阻害試験については、以下の通りに実施した。
分化マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２の細胞にヒトＧＭ２Ａタンパク質を加えて２４時間培養した後、得られた培養物から液体培地を除去し、次いでグルコース及び血清を含まないＤ−ＭＥＭ（カタログ番号１１９６６、Ｇｉｂｃｏ社）に交換し、これを更に２時間培養した。次に、得られた培養物に１μｇ／ｍｌ インシュリン（カタログ番号Ｉ−５５００、Ｓｉｇｍａ社）を加えて１０分間培養した後、得られた細胞を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。このようにして得られた細胞から前記実施例で用いられた方法と同様な方法により、細胞抽出物を調製した。同様にして、未分化マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２の細胞にヒトＧＭ２Ａタンパク質を加えて、これを２４時間培養した後、得られた培養物から液体培地を除去し、次いで血清を含まないＤ−ＭＥＭに交換し、これを更に２時間培養した。次いで、得られた培養物に０．１μｇ／ｍｌ レプチン（カタログ番号４５０−３１、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を加えて３０分間培養した後、得られた細胞から上記と同様な方法により細胞抽出物を調製した。また、ラット褐色細胞腫細胞株ＰＣ１２の細胞にヒトＧＭ２Ａタンパク質を加えて、これを２４時間培養した後、得られた培養物から液体培地を除去し、次いで血清を含まないＤ−ＭＥＭに交換し、これを更に１時間培養した。次に、得られた培養物に０．１μｇ／ｍｌ ＮＧＦ（カタログ番号１４７−０４６４１、和光純薬社）を加えて１０分間培養した後、得られた細胞から上記と同様な方法により細胞抽出物を調製した。
実施例３に記載した方法に準じて、細胞抽出物をＰＶＤＦ膜に転写した後、インシュリンについては、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（カタログ番号９２７１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）及び抗Ａｋｔ抗体（カタログ番号９２７２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、レプチンについては、抗リン酸化ＡＭＰＫα抗体（カタログ番号２５３１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）及び抗ＡＭＰＫα抗体（カタログ番号２６０３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、ＮＧＦについては、抗リン酸化Ａｋｔ抗体及び抗Ａｋｔ抗体を用いてブロッティングした。次に、各バンドの発光強度を測定し、非リン酸化タンパクに対するリン酸化タンパクの相対量を算出した。その結果を表５に示す。
【００３１】
【表５】
【００３２】
上記試験結果から明らかなように、ＧＭ２Ａタンパク質は、インシュリン、レプチン及びＮＧＦの細胞内シグナル伝達を濃度依存的に阻害した。
【００３３】
実施例６（ＧＭ２Ａタンパク質の定量法）
（１）ウサギ抗ヒトＧＭ２Ａ抗体の作製
ウサギ抗ヒトＧＭ２Ａポリクローナル抗体は、抗原として、配列番号３又は配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをウサギに免疫し、得られた抗血清から抗原カラムを用いて、それぞれ、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体Ｉ又は抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩを得た。得られた抗ヒトＧＭ２Ａ抗体とＧＭ２Ａタンパク質との反応性を確認するため、ヒト、マウス及びラットＧＭ２Ａを電気泳動して得られたゲルを、上記の各抗体１μｇ／ｍｌでブロッティングした。その結果、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体Ｉ及び抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩは、ヒト、マウス及びラットＧＭ２Ａタンパク質とのいずれにも反応することが確認された。
【００３４】
配列番号３
CysAspGluGlyLysAspProAlaValIleArgSerLeu
配列番号４
CysProPheLysGluGlyThrTyrSerLeuProLysSerGluPheValVal
【００３５】
（２）抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩのビオチン標識
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用い、本キットのプロトコールに従って、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ ２００μｇをＨＲＰ標識した（以下、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ−ＨＲＰと記す）。
【００３６】
（３）エライザ法（検量線作成）
抗ヒトＧＭ２Ａ抗体Ｉをコーティングバッファー（２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３）で１００倍に希釈して１０μｇ／ｍｌの抗体液を調製した。得られた抗体液を１ウエル当たり１００μｌずつの割合で９６ウエルプレートに添加し、これを室温で１時間放置した。抗体液を吸引により除去した後、洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ）を１ウエル当たり２００μｌの割合で用いて洗浄し、当該洗浄操作を３回繰り返した。次に、得られた洗浄物に、１％ ＢＳＡを含む洗浄バッファー（以下、ブロッキングバッファーと記す。）を２００μｌ加え、これを室温で２時間放置した後、洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、得られた洗浄物に、種々の濃度でヒトＧＭ２Ａタンパク質を含有する検体１００μｌを添加し、これを室温で１時間放置した後、洗浄バッファーで５回洗浄した。抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ−ＨＲＰをブロッキングバッファーで１０００倍に希釈して１μｇ／ｍｌの検出用抗体液を調製した。得られた検出用抗体液を１ウエル当たり１００μｌずつの割合で添加し、これを室温で１時間放置した。得られた放置物を洗浄バッファーで５回洗浄した後、これにＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液（カタログ番号５０−７６−０１、ＫＰＬ社）を１００μｌ添加した。得られた混合物を約１５分間放置した後、これに２Ｍ 硫酸を１００μｌ添加することにより反応を停止させた。次に、得られた反応物を含む各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲で直線性が認められた。
【００３７】
実施例７（生物学的試料におけるＧＭ２Ａタンパク質の定量）
（１）正常ラット内臓脂肪細胞培養上清
実施例１で用いられた方法と同様な方法により、正常ラット内蔵脂肪細胞を培養し、Ｄａｙ３、５、７、８にそれぞれ培養上清を回収した。次に、実施例６（３）で用いられた方法と同様な方法により、培養上清中のＧＭ２Ａタンパク質の量を定量した。その結果を表６に示す。
【００３８】
【表６】
【００３９】
培養上清中のＧＭ２Ａタンパク質は、培養日数の増加（即ち、脂肪滴の蓄積）とともに従って増加した。
【００４０】
（２）ヒト血清
非肥満血清１３検体及び肥満患者血清７検体をＩＬＳｂｉｏ社から購入した。購入された各血清検体を、２０〜１００倍に希釈した後、実施例６（３）で用いられた方法と同様な方法により、ヒト血清中のＧＭ２Ａタンパク質の量を定量した。その結果を表７に示す。
【００４１】
【表７】
【００４２】
肥満患者では非肥満患者に対し、血清中のＧＭ２Ａタンパク質量が有意に高値を示した（ｐ＜０．０５）。
【００４３】
実施例８（ＧＭ２Ａタンパク質によるグルコース取り込み阻害作用）
マウス脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１は、（財）ヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入した。購入されたマウス脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１の細胞を、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ（以下、Ｄ−ＭＥＭ（１０）と記す。）中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下において培養した。培養された当該細胞を６ウエルプレートに播き、コンフルエントになって２日後に、培養液を前分化培養液（１μｇ／ｍｌ インシュリン（対照では無添加）、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１μＭ デキサメタゾンを含むＤ−ＭＥＭ（１０））へ交換して更に４日間培養した。次に、前分化培養液を後分化培養液（１μｇ／ｍｌ インシュリン（対照では無添加）を含むＤ−ＭＥＭ（１０））へ交換して３日間培養した後、マウスＧＭ２Ａタンパク質を表８に記載した濃度で含むＤ−ＭＥＭ（１０）へ交換して更に１日間培養した。翌日、得られた培養物から培養液を除去した後、マウスＧＭ２Ａタンパク質を表８に記載した濃度で含む後分化培養液又はＤ−ＭＥＭ（１０）へ交換して４時間培養した。次いで、得られた上記細胞をＨＲＰＨバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＯＨ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ 牛血清アルブミン）で２回洗浄した後、これに１ｍＭ ２−デオキシグルコースを含むＨＲＰＨバッファーを添加して３０分間培養した。次に、得られた培養物をＨＲＰＨバッファーで２回洗浄した後、スクレイパーを用いて細胞を回収した。次いで、回収物を遠心分離することにより得られた沈渣に０．１Ｍ ＮａＯＨを加えた後、これをボルテックスすることにより、前記細胞を凍結融解した。凍結融解された細胞（細胞溶液）を８５℃、３０分間保温した後、これに０．１Ｍ ＨＣｌを加えて中和することにより、検体を調製した。尚、検体のタンパク濃度は、牛血清アルブミンを標準タンパク質にして、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号２３２２８、Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて測定した。
検体中の２−デオキシグルコースの量は、以下の方法に従って定量した。蛍光測定用プレートにアッセイバッファー（５０ｍＭ トリエタノールアミン（ｐＨ８．１）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％ 牛血清アルブミン、６７０μＭ ＡＴＰ、０．１２μＭ ＮＡＤＰ＋、２５μＭ レサズリン、５．５単位／ｍｌ ヘキソキナーゼ、１６単位／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ、１単位／ｍｌ ジアホラーゼ）１００μｌ及び検体１００μｌを加えた。得られた混合物を３７℃、９０分間保温した後、得られた混合物の蛍光強度を測定した（励起波長５３０ｎｍ、検出波長５９５ｎｍ）。２−デオキシグルコース ５００μＭ、２５０μＭ、１２５μＭ、０μＭ（蒸留水）を標準物として検量線を作成し、当該検量線に基づき定量した。検体のタンパク量当たりの、細胞内へ取り込まれた２−デオキシグルコース量を相対値としてＧＭ２Ａタンパク算出した。その結果を表８に示す。
【００４４】
【表８】
【００４５】
ＧＭ２Ａタンパク質は、インシュリンによる２−デオキシグルコースの細胞内取り込み促進作用を濃度依存的に阻害した。
【００４６】
実施例９（抗ＧＭ２Ａ抗体及びリガンドによるグルコース取り込み促進作用）
ヒトＧＭ２Ａのリガンド結合ドメインに対する抗体である抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ、及び、ヒトＧＭ２ＡのリガンドであるガングリオシドＧＭ２（カタログ番号Ｇ８３９７、Ｓｉｇｍａ社）を分化マウス脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１の細胞（培養液中へＧＭ２Ａタンパク質を分泌している）に添加した後、細胞中の２−デオキシグルコース量を測定した。実施例８で用いられた方法と同様な方法により、後分化培養液中で３日間培養した後、抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ又はウサギＩｇＧ（コントロール抗体）、ガングリオシドＧＭ２又はＤＭＳＯを含む後分化培養液に交換して１日間培養した。翌日、得られた培養物から培養液を除去し、次いでＨＲＰＨバッファーで２回洗浄した後、これに１ｍＭ ２−デオキシグルコースを含むＨＲＰＨバッファーを添加して３０分間培養した。検体中の２−デオキシグルコース量は、実施例８で用いられた方法と同様な方法により測定した。細胞内へ取り込まれた２−デオキシグルコースの量を相対値としてＧＭ２Ａタンパク算出した。その結果を表９に示す。
【００４７】
【表９】
【００４８】
抗ヒトＧＭ２Ａ抗体ＩＩ及びガングリオシドＧＭ２は、２−デオキシグルコースの細胞内取り込みを促進した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の方法は、マイクロドメイン病の早期検出及び疾患状態のモニタリング等に利用でき、本発明の動物は、マイクロドメイン病の予防若しくは治療薬等の医薬品開発等に利用できる。また、抗ＧＭ２Ａ抗体やＧＭ２Ａ阻害活性化合物は、マイクロドメイン病の予防若しくは治療薬として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：抗原ペプチド
配列番号４：抗原ペプチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を閾値と比較する工程を含むことを特徴とする前記被検動物におけるマイクロドメイン病を検出する方法。
【請求項２】
被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を前記被検動物について異なる時点で測定されたＧＭ２Ａの量又は活性と比較する工程を含むことを特徴とするマイクロドメイン病の疾患状態の変化をモニタリングする方法。
【請求項３】
前記生物学的試料が、血液、リンパ液、組織又は細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載される方法。
【請求項４】
前記ＧＭ２Ａの量又は活性の測定が、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光免疫測定法、エライザ法、免疫組織化学染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、ノーザンブロッティング法又はＲＴ−ＰＣＲ法により行われることを特徴とする請求項１又は２に記載される方法。
【請求項５】
マイクロドメイン病のバイオマーカーとしてのＧＭ２Ａの使用。
【請求項６】
前記マイクロドメイン病が、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、糖尿病若しくはその合併症、癌、中枢神経障害、子宮内膜症、骨粗しょう症又は自己免疫疾患であることを特徴とする請求項５に記載される使用。
【請求項７】
ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬を含有することを特徴とするマイクロドメイン病の診断用キット。
【請求項８】
前記ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬が、抗ＧＭ２Ａ抗体、又はラジオアイソトープ若しくは蛍光色素で標識されたガングリオシドであることを特徴とする請求項７に記載される診断用キット。
【請求項９】
ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物。
【請求項１０】
脂肪細胞においてＧＭ２Ａの発現レベルを上昇させた請求項９に記載されるトランスジェニック動物。
【請求項１１】
ＧＭ２Ａタンパク質を投与し、血液中のＧＭ２Ａの量又は活性を人工的に上昇させた動物。
【請求項１２】
マイクロドメイン病の症状を呈することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載される動物。
【請求項１３】
抗ＧＭ２Ａ抗体を有効成分として含有することを特徴とするマイクロドメイン病の予防若しくは治療薬。
【請求項１４】
ＧＭ２Ａ阻害活性化合物を有効成分として含有することを特徴とするマイクロドメイン病の予防若しくは治療薬。
【請求項１】
被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を閾値と比較する工程を含むことを特徴とする前記被検動物におけるマイクロドメイン病を検出する方法。
【請求項２】
被検動物から採取した生物学的試料におけるＧＭ２Ａの量又は活性を測定する工程、及び、前記の測定されたＧＭ２Ａの量又は活性を前記被検動物について異なる時点で測定されたＧＭ２Ａの量又は活性と比較する工程を含むことを特徴とするマイクロドメイン病の疾患状態の変化をモニタリングする方法。
【請求項３】
前記生物学的試料が、血液、リンパ液、組織又は細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載される方法。
【請求項４】
前記ＧＭ２Ａの量又は活性の測定が、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光免疫測定法、エライザ法、免疫組織化学染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、ノーザンブロッティング法又はＲＴ−ＰＣＲ法により行われることを特徴とする請求項１又は２に記載される方法。
【請求項５】
マイクロドメイン病のバイオマーカーとしてのＧＭ２Ａの使用。
【請求項６】
前記マイクロドメイン病が、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、糖尿病若しくはその合併症、癌、中枢神経障害、子宮内膜症、骨粗しょう症又は自己免疫疾患であることを特徴とする請求項５に記載される使用。
【請求項７】
ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬を含有することを特徴とするマイクロドメイン病の診断用キット。
【請求項８】
前記ＧＭ２Ａの量又は活性の測定用試薬が、抗ＧＭ２Ａ抗体、又はラジオアイソトープ若しくは蛍光色素で標識されたガングリオシドであることを特徴とする請求項７に記載される診断用キット。
【請求項９】
ＧＭ２Ａの発現レベルが上昇するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物。
【請求項１０】
脂肪細胞においてＧＭ２Ａの発現レベルを上昇させた請求項９に記載されるトランスジェニック動物。
【請求項１１】
ＧＭ２Ａタンパク質を投与し、血液中のＧＭ２Ａの量又は活性を人工的に上昇させた動物。
【請求項１２】
マイクロドメイン病の症状を呈することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載される動物。
【請求項１３】
抗ＧＭ２Ａ抗体を有効成分として含有することを特徴とするマイクロドメイン病の予防若しくは治療薬。
【請求項１４】
ＧＭ２Ａ阻害活性化合物を有効成分として含有することを特徴とするマイクロドメイン病の予防若しくは治療薬。
【公開番号】特開２０１０−１０１８８０（Ｐ２０１０−１０１８８０Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１９５２６（Ｐ２００９−２１９５２６）
【出願日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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