リポソーム
【課題】細胞毒性を示すフェオフォルバイドａもしくはその誘導体化合物において、その化合物単体の特徴であるＬＯＸ−１アンタゴニスト活性には影響を与えずに、細胞毒性のみを低減させる方法は知られていなかった。
【解決手段】フェオフォルバイドａもしくはその誘導体化合物を脂質に包接しリポソームを形成させることにより、細胞毒性のみを有意に低減させ、かつ化合物単体が持つＬＯＸ−１アンタゴニスト活性には影響を与えないことを見出した。この技術を応用することにより、副作用の少ない機能的なＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤を提供することが可能である。
【解決手段】フェオフォルバイドａもしくはその誘導体化合物を脂質に包接しリポソームを形成させることにより、細胞毒性のみを有意に低減させ、かつ化合物単体が持つＬＯＸ−１アンタゴニスト活性には影響を与えないことを見出した。この技術を応用することにより、副作用の少ない機能的なＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤を提供することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェオフォルバイドａ及びその誘導体化合物が持つＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を低下させることなく、これらの化合物が有する細胞毒性のみを低減させるシステムを提供することにある。より詳細には、本発明は、ＬＯＸ−１アンタゴニストとして使用できるリポソーム、該リポソームを含むＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤及び動脈硬化抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポルフィリンはヘモグロビン、ミオグロビンのほか、我々の体内細胞におけるチトクロムの補欠分子族ヘムの基本骨格であり、生命維持に不可欠な生体物質である。一方で植物においては葉緑体にクロロフィルが存在し、その分解過程においてフェオフォルバイドａが産生される。フェオフォルバイドａは、酸化低密度リポ蛋白質（ｏｘＬＤＬ）の受容体であるレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）の拮抗剤として（例えば特許文献１）、あるいはエンドセリン拮抗剤として（例えば特許文献２〜３）有用であることが開示されている。
【０００３】
一方で、フェオフォルバイドａやその誘導体化合物群を含むポルフィリンは、光依存的なアポトーシス誘導を細胞レベルで引き起こすことが知られている（例えば非特許文献１）。この光依存的なポルフィリンによるアポトーシス誘導作用は、蛍光物質と光線を利用した癌治療の分野で注目され、副作用を引き起こしやすい多くの薬剤や放射線治療等と比較すると、その標的箇所である癌細胞への特異性は高いことが知られている（例えば非特許文献２）。そこでポルフィリン環を結合させたオリゴマー状の化合物や、ポルフィリンに糖鎖やＤＮＡ、蛋白質等を結合した化合物が提案され、細胞認識能や腫瘍親和性を高くすることが研究されている。しかし多くのポルフィリン化合物は、光照射を行わない状態においても細胞毒性が高く、標的箇所以外の細胞をも破壊してしまうという問題があった。
【０００４】
この毒性の問題に対しては、イオン性ポルフィリン等のポルフィリン誘導体化合物の開発技術が開示されている（例えば特許文献４〜６）。
【０００５】
また、特許文献７では、ポルフィリンを脂質に包接することでリポソームを形成する技術が開示されているが、この技術においてはポルフィリンとともに化学治療剤を含有させ、且つ光照射によるポルフィリン誘導型のリポソーム崩壊過程で起こる細胞毒性（抗癌作用）を期待するものである。しかし、特許文献７には、脂質によるポルフィリンの細胞毒性の低減については記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／００１８８４号パンフレット
【特許文献２】特開平５−３３１０６３号公報
【特許文献３】特開平７−３３０６０１号公報
【特許文献４】特開２００１−２０６８８６号公報
【特許文献５】特開平９−１２４６５２号公報
【特許文献６】特開平５−９７８５７号公報
【特許文献７】特開２００７−２７７２１８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ ６７：１５６−７ （２００１）
【非特許文献２】ポルフィリン・ヘムの生命科学 現代化学 増刊２７ ２０５−２０８ （１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本件出願人は、既に特許文献１において、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物がＬＯＸ−１アンタゴニスト作用を有することに着目していたが、フェオフォルバイドａについては、前記のように細胞毒性があるため、血管内等のインビボで投与した場合には、安全性の問題があり、所望の効果を発揮させにくい状況にあった。
【０００９】
そこで、本発明は、上記現状に鑑み、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が有するＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を損なうことなく、細胞毒性を低減させる手段を開発し、前記化合物を利用するうえで人体にとって極めて安全かつ有用なシステムを提供することを目的とする。
具体的には、本発明は、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を有し、優れた安全性を有するリポソーム、該リポソームを含有するＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤及び動脈硬化抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＬＯＸ−１には本来結合しない中性電荷のリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン）をベースとすることで、本来のリガンドである陰性電化を持った酸化ＬＤＬとは異なる脂質のベースを作製し、このベースにフェオフォルバイドａを包接することでＬＯＸ−１アンタゴニスト活性は保持したまま、細胞毒性のみを低減させることに成功した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）に係るものである。
（１）フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物と、中性リン脂質とを含有することを特徴とするリポソーム。
（２）中性リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びスフィンゴミエリンからなる群から選ばれる１種以上である前記（１）記載のリポソーム。
（３）コレステロールを含有する前記（１）又は（２）記載のリポソーム。
（４）脂質１μｍｏｌに対してフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が０．０１〜１ｍｇ含有されている前記（１）〜（３）いずれか記載のリポソーム。
（５）脂質過酸化阻害剤を含有する前記（１）〜（４）のいずれか記載のリポソーム。
（６）前記脂質過酸化阻害剤がビタミン又はその誘導体である前記（５）記載のリポソーム。
（７）レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する前記（１）〜（６）いずれか記載のリポソーム。
（８）レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニストとして使用するための前記（１）〜（７）いずれか記載のリポソーム。
（９）前記（１）〜（８）いずれか記載のリポソームを含むレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
（１０）前記（１）〜（８）いずれか記載のリポソームを含む動脈硬化抑制剤。
【００１２】
なお、本発明においてアンタゴニスト作用とは、後述の実施例に記載の方法で評価した場合に、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害し、かつ酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害することを意味する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が有するＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を損なうことなく、細胞毒性のみを有意に低減させることを初めて可能にしたものである。したがって本発明によれば、ヒトにとって安全で、副作用のないＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤及び動脈硬化抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は実施例１及び実施例２の方法により調製した脂質包接型フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム）とビタミンE含有脂質包接型フェオフォルバイドａ(ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．)とフェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）による、実施例３の方法によりＬＯＸ−１アンタゴニスト活性をＥＬＩＳＡで検証した結果を示すグラフである。縦軸はＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合の阻害率を示している。
【図２】図２は実施例１の方法により調製した脂質包接型フェフォルバイドａ（＋酸化ＬＤＬ＋ＰｈＡリポソーム）とフェオフォルバイドａ単体（＋酸化ＬＤＬ＋ＰｈＡ）による、実施例４の方法によりＬＯＸ−１アンタゴニスト活性をセルアッセイで検証した結果を示すグラフである。縦軸は蛍光標識を指標に、ＬＯＸ−１発現細胞に結合した酸化ＬＤＬ量を示している。
【図３】図３は実施例１の方法により調製した脂質包接型フェフォルバイドａとフェオフォルバイドａ単体による、実施例５の方法により細胞毒性を検証した結果を示すグラフである。
【図４】図４は実施例２の方法により調整した脂質包接型フェオフォルバイドａに対するビタミンＥの効果について、実施例５の方法により細胞毒性を検証した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のリポソームは、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物と、中性リン脂質とを含有することを特徴とする。かかる特徴を有することで、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を有し、光依存性の細胞毒性も抑えられた優れた安全性を有するリポソームを得ることができる。
【００１６】
本発明のように、リポソーム形成によるフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物の細胞毒性の低減作用については知られておらず、さらにこのリポソーム包接により、ネイティブなフェオフォルバイドａが有していたＬＯＸ−１アンタゴニスト作用が影響を受けるか否かについても、全く知られていなかった。事実、化合物を何らかの巨大分子に結合させた場合、その化合物が本来持っていた性質（アンタゴニスト活性等）が失われることは、生化学の実験上、非常に多いものである。
これに対して、本発明では、中性リン脂質を含む脂質二重層を形成しているリポソームの疎水性領域に、疎水性化合物であるフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物を包接させることで、フェオフォルバイドａが有する作用のうち、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を選択的に発現させ、細胞毒性作用は選択的に発現させ難くすることが可能になると考える。
【００１７】
フェオフォルバイドａとしては、天然物から精製されたもの、あるいは合成されたものであってもよい。また、フェオフォルバイドａは、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を有するものであれば、構造上の誘導体化合物であっても問題は無い。フェオフォルバイドａの誘導体化合物としては、エチルフェオフォルバイド、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、ヘム、シアノコバラミン、フェオフィチンａ、フェオフィチンｂ、ヘマチン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン等が挙げられる。
【００１８】
リポソームを構成する中性リン脂質については、天然由来であっても合成物であってもよく、その種類も特に限定はされない。天然物であればホスファチジルコリンが多く含まれる大豆レシチン等が挙げられる。また合成品であれば、中性リン脂質であるホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
【００１９】
また、前記中性リン脂質以外にも、リポソームを構成する脂質として、コレステロールを含有することが好ましい。コレステロールを含有することでリポソームの安定性が増加するという利点がある。
【００２０】
また、リポソームを構成する他の脂質として、例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のリン脂質を用いてもよい。
【００２１】
本発明のリポソームを構成する脂質中における中性リン脂質の割合としては、５０〜１００重量％が好ましい。また、本発明のリポソームを構成する脂質中におけるコレステロール及びその他の脂質の割合としては、５０重量％以下が好ましい。
【００２２】
本発明のリポソームにおいて、脂質とフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物との量比に関しては特に制限を設けないが、好ましくは脂質１μｍｏｌに対してフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が０．０１〜１ｍｇ含まれるものである。なお、ここで脂質の量は、前記リポソームを構成する脂質成分の全量をいう。
【００２３】
また、リポソームを形成する脂質は保存状態により酸化され易くなることがあるので、脂質の酸化を防ぐ意味で脂質過酸化阻害剤を混合してもよい。例えば、アスコルビン酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、あるいはこれらの誘導体等が挙げられる。これらの中でもＬＯＸ−１アンタゴニスト活性に影響を与えない、あるいは脂溶性が調整しやすいという観点からビタミンＥが好ましく、その濃度範囲は終濃度で０−０．５Ｍである。
中でも、前記脂質過酸化阻害剤がビタミンＥ又はその誘導体である場合には、脂質の酸化防止に加えて、細胞毒性を低減させる効果も向上させることができるため、好ましい。
【００２４】
前記のような構成を有する本発明のリポソームは、通常のリポソームの製造方法に準じて得ることができる。例えば、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物と、中性リン脂質と、必要であれば他の脂質とを有機溶媒に溶解・混合し、得られる混合液から溶媒を窒素ガス等を用いて除去した後、水系溶媒と混合し、超音波処理を施す方法が挙げられる。
【００２５】
有機溶媒としては、エタノール、メタノール、クロロホルム等が挙げられる。
水系溶媒としては、水、各種のバッファー等が挙げられる。
超音波処理には、リポソームの作製に使用可能な装置を用いればよく、特に限定はない。
【００２６】
本発明のリポソームは、メンブレンフィルターに通過させることで、リポソームの粒径を調整することができる。例えば、孔径０．１μｍのメンブレンフィルターを用いることが好ましい。
【００２７】
以上のようにして得られた本発明のリポソームは、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有するものであり、しかも、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が有する細胞毒性が、これらの化合物を単独で使用した場合に比べて顕著に低減された安全性に優れたものである。
したがって、本発明のリポソームは、安全性に優れたレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニストとして使用することができる。
【００２８】
また、本発明のリポソームは、医薬組成物の成分として使用することができる。
医薬組成物の用途としては、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤、動脈硬化抑制剤が挙げられる。
【００２９】
医薬組成物の態様としては、注射剤、点滴剤等の液剤等が挙げられる。これらは、水、緩衝液等の安全性の高い溶媒中で、本発明のリポソームと、増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤等とを混合して、定法に基づいて、製剤することで得られる。
【００３０】
フェオフォルバイドa又はその誘導体化合物の配合量としては医薬組成物１００ｇあたり１００ｍｇ以下が望ましい。
【００３１】
これらの医薬組成物の１日あたりの投与量は、症状、身長、体重、年齢等により異なるが、成人１人あたりの摂取量が０．１ｍｇ／ｋｇ・日以下となるように、１回ないし数回に分けて被検体に投与するのが好ましい。
【００３２】
なお、本発明の医薬組成物の標的としているＬＯＸ−１は、ヒトや非ヒトの動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモット、ニワトリ、アヒル、ガチョウ等）の血管内皮細胞のみならず、マクロファージ、平滑筋細胞にも存在しており、それぞれの細胞に酸化ＬＤＬが取り込まれることが動脈硬化症の発症に重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、本発明は、前記ヒトや非ヒトの動物における血管内皮細胞等の動脈硬化症に関与する複数の細胞群において酸化ＬＤＬの取り込みを顕著に阻害する作用を有することから、多面的でかつ顕著に動脈硬化症を抑制することが期待でき、さらに安全性に優れることから、動脈硬化の予防効果も期待することができる。
【実施例】
【００３３】
次に、本発明をその実施例によって具体的に説明する。
【００３４】
（実施例１）
リポソーム組成物の調製
５μｍｏｌのホスファチジルコリンと２．５μｍｏｌのコレステロールをベースとし、さらにフェオフォルバイドａを０．０７５−７．５ｍｇとなるように１ｍｌのメタノールに溶解した。次にこの溶液を混合しながら窒素ガスを吹きつけ、溶媒であるメタノールを除去した。溶媒除去後、脂質混合物に１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ2のバッファーを７．５ｍｌ添加し、窒素ガス充填後に４℃で１０分間の超音波処理を行った。このようにして作製したリポソームを、脂質包接フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム）として使用した。なお、フェオフォルバイドａを添加しなかったリポソームをネガティブコントロールとして使用した。
【００３５】
（実施例２）
リポソーム組成物の調製
５μｍｏｌのホスファチジルコリンと２．５μｍｏｌのコレステロールをベースとし、さらにフェオフォルバイドａを０．０７５−７．５ｍｇとなるように１ｍｌのメタノールに溶解した。上記溶液に終濃度０−０．５ＭとなるようにビタミンＥをさらに混合した。次にこの溶液を混合しながら窒素ガスを吹きつけ、溶媒であるメタノールを除去した。溶媒除去後、脂質混合物に１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ2のバッファーを７．５ｍｌ添加し、窒素ガス充填後に４℃で１０分間の超音波処理を行った。このようにして作製したリポソームを、ビタミンＥ含有脂質包接フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．）として使用した。
またコントロールとして、フェオフォルバイドａを添加しなかったものも作製し、適時使用した。
【００３６】
（実施例３）
実施例１、２により取得した脂質包接フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム、ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．）、あるいはフェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）のアンタゴニスト作用（ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合阻害）をＥＬＩＳＡにより評価した。具体的には以下のように行った。
評価にはマキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ社製）を用いて行った。大腸菌で作製したリコンビナントＬＯＸ−１蛋白質を５μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳバッファーで調製し、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×２回で洗浄し、２５％ブロックエース（大日本住友製薬社製）を含むＰＢＳバッファー３００μｌを各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×２回で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳバッファーで適当な希釈倍率となるように調製したフェオフォルバイドａ単体や包接したフェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム、ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．）等のサンプルを１００μｌずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×３回で洗浄し、５μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳバッファーで調製した酸化ＬＤＬを、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×３回で洗浄し、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗アポリポプロテインＢ抗体（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社製）をＰＢＳバッファーで１０００倍希釈し、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。室温で２時間の静置後、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×５回で洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）−ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定（ＥＩＡ）−基質−キット試薬（バイオラッド社製）を１００μｌずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を５０μｌずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、ＬＯＸ−１に対するアンタゴニスト作用を酸化ＬＤＬの結合量として定量した。結果を図１に示す。
図１に示す結果から、このようにフェオフォルバイドａをリン脂質に包接した場合（ＰｈＡリポソーム）、あるいはビタミンＥを含有した場合（ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．）においても、フェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）と比較して、同程度のアンタゴニスト活性を有することが確認された。
なお、大腸菌由来リコンビナントＬＯＸ−１蛋白質及び酸化ＬＤＬについては、国際公開第２００８／００１８８４号パンフレット（特許文献１）に記載の方法に準じて得たものを使用した。
【００３７】
（実施例４）
実施例１により取得した脂質包接フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム）、フェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）のアンタゴニスト作用（酸化ＬＤＬの細胞内への取り込み阻害）を以下のようにして評価した。
ｂＬＯＸ−１を安定的に発現しているＣＨＯ細胞は、既報の方法に従って経代培養を行った（Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３８５， ｐ７３−７７， １９９７）。細胞を用いたアッセイについては、次のように行った。９６ウェルプレート（ファルコン社製）に１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように各ウェルに１００μｌずつ１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＨａｍＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）のもとで細胞の蒔き込みを行い、３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で２日間培養した。２日間の培養後、培養上清５０μｌを除去し、ＰｈＡリポソーム又はＰｈＡを適当な希釈倍率で含む５０μｌの新しい培養液を添加した。これらの薬剤を含む新しい培養液を添加した後に、１時間の前処理を上記環境下で行うことにより、ＬＯＸ−１への抽出物の結合反応を行った。その後、カルボシアニン蛍光色素である１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン パーコレート（ＤｉＩ：インビトロジェン社製）で標識した酸化LDLを５μｇ／ｍｌとなるように各ウェルにアプライし、上記環境下で６時間のＣＨＯ細胞内への蛍光標識酸化ＬＤＬの取り込み処理を行った。これらの処理を行った後に、１ｍｌＰＢＳバッファーで３回各ウェルを洗浄し、室温で１０％ホルマリン溶液での固定を１０分間行った。固定処理を行った細胞を、２００μｌのＰＢＳバッファーで洗浄を２回行い、最後にＤＡＰＩ（４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を行った。このように処理さ
れたプレートは、Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）により、ＤｉＩ標識酸化ＬＤＬのｂＬＯＸ−ＣＨＯ細胞への取り込みを蛍光顕微鏡イメージ画像として解析した。結果を図２に示す。なお、コントロールとして、前記薬剤を含まず、酸化ＬＤＬを用いないもの（−酸化ＬＤＬ）と前記薬剤を含まず、酸化ＬＤＬを用いたもの（＋酸化ＬＤＬ）を用意した。
図２に示す結果から、図１と同様に、セルアッセイにおいても脂質に包接したフェオフォルバイドａ（＋酸化ＬＤＬ＋ＰｈＡリポソーム）は、フェオフォルバイドａ単体（＋酸化ＬＤＬ＋ＰｈＡ）と比較して、同程度のアンタゴニスト活性を有することが確認された。
【００３８】
(実施例５)
脂質に包接したフェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム）と、フェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）の細胞毒性について、処理後の生細胞数を測定して検証した。また実施例２に従い、リポソームに加えるビタミンＥを０−０．５Ｍの範囲で変化させた場合の、細胞毒性に対する濃度依存的な効果についても検証した。生細胞数を測定する方法としては、ミトコンドリア内脱水素酵素によるＭＴＴのホルマザン（難溶性の沈殿物として生成）への還元を利用したＭＴＴ法等が汎用される。よって上記方法の変法を利用している、「Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８」（商品名、同仁化学研究所製）を用いて生細胞数の測定を行った。具体的には、９６ウェルプレート（ファルコン社製）に５．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞の蒔き込みを行った。２日間の培養後、培養上清５０μLを除去し、各阻害剤を適当な希釈倍率で含む５０μｌの新しい培養液を添加した。抽出液を含む新しい培養液を添加した後に、７時間の培養を行った。７時間後に、抽出液を含まない１００μｌの培地で３回ずつ各ウェルの洗浄を行った後に、各ウェルに３μｌずつとなるようにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８溶液であるＷＳＴ―８を含む培地を添加した。１時間の培養後、４５０nmの吸光度を測定し、生細胞数として換算した。結果を図３に示す。
図３に示す結果から、フェオフォルバイドａを脂質に包接した場合（ＰｈＡリポソーム）、フェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）と比較して約３倍の細胞生存率を示す結果となった。
また、図４は実施例２の方法により調整した脂質包接型フェオフォルバイドａに対するビタミンＥの効果について、実施例５の方法により細胞毒性を検証した結果を示すグラフであり、ビタミンＥの含有量が増加するにつれてフェオフォルバイドａのみの場合（コントロール）と比べて、細胞生存率が顕著に向上していることがわかる。
【００３９】
（実施例６）
医薬組成物（液剤）の調製例
生理食塩水に実施例１又は２で得られたリポソームを含有させた液剤として医薬組成物を調製した。なお、リポソームは、フェオフォルバイドａの実質的な含有量が１０μｇ/ｍｌとなるように調整した。
前記医薬組成物中、リポソームは安定してその状態を維持していた。
【００４０】
実施例６で得られた医薬組成物は、実施例３、４の結果から、アンタゴニスト作用剤として好適に使用できる。また、実施例５の結果から、安全性についても優れているため、動脈硬化抑制剤としても好適に使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェオフォルバイドａ及びその誘導体化合物が持つＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を低下させることなく、これらの化合物が有する細胞毒性のみを低減させるシステムを提供することにある。より詳細には、本発明は、ＬＯＸ−１アンタゴニストとして使用できるリポソーム、該リポソームを含むＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤及び動脈硬化抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポルフィリンはヘモグロビン、ミオグロビンのほか、我々の体内細胞におけるチトクロムの補欠分子族ヘムの基本骨格であり、生命維持に不可欠な生体物質である。一方で植物においては葉緑体にクロロフィルが存在し、その分解過程においてフェオフォルバイドａが産生される。フェオフォルバイドａは、酸化低密度リポ蛋白質（ｏｘＬＤＬ）の受容体であるレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）の拮抗剤として（例えば特許文献１）、あるいはエンドセリン拮抗剤として（例えば特許文献２〜３）有用であることが開示されている。
【０００３】
一方で、フェオフォルバイドａやその誘導体化合物群を含むポルフィリンは、光依存的なアポトーシス誘導を細胞レベルで引き起こすことが知られている（例えば非特許文献１）。この光依存的なポルフィリンによるアポトーシス誘導作用は、蛍光物質と光線を利用した癌治療の分野で注目され、副作用を引き起こしやすい多くの薬剤や放射線治療等と比較すると、その標的箇所である癌細胞への特異性は高いことが知られている（例えば非特許文献２）。そこでポルフィリン環を結合させたオリゴマー状の化合物や、ポルフィリンに糖鎖やＤＮＡ、蛋白質等を結合した化合物が提案され、細胞認識能や腫瘍親和性を高くすることが研究されている。しかし多くのポルフィリン化合物は、光照射を行わない状態においても細胞毒性が高く、標的箇所以外の細胞をも破壊してしまうという問題があった。
【０００４】
この毒性の問題に対しては、イオン性ポルフィリン等のポルフィリン誘導体化合物の開発技術が開示されている（例えば特許文献４〜６）。
【０００５】
また、特許文献７では、ポルフィリンを脂質に包接することでリポソームを形成する技術が開示されているが、この技術においてはポルフィリンとともに化学治療剤を含有させ、且つ光照射によるポルフィリン誘導型のリポソーム崩壊過程で起こる細胞毒性（抗癌作用）を期待するものである。しかし、特許文献７には、脂質によるポルフィリンの細胞毒性の低減については記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／００１８８４号パンフレット
【特許文献２】特開平５−３３１０６３号公報
【特許文献３】特開平７−３３０６０１号公報
【特許文献４】特開２００１−２０６８８６号公報
【特許文献５】特開平９−１２４６５２号公報
【特許文献６】特開平５−９７８５７号公報
【特許文献７】特開２００７−２７７２１８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ ６７：１５６−７ （２００１）
【非特許文献２】ポルフィリン・ヘムの生命科学 現代化学 増刊２７ ２０５−２０８ （１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本件出願人は、既に特許文献１において、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物がＬＯＸ−１アンタゴニスト作用を有することに着目していたが、フェオフォルバイドａについては、前記のように細胞毒性があるため、血管内等のインビボで投与した場合には、安全性の問題があり、所望の効果を発揮させにくい状況にあった。
【０００９】
そこで、本発明は、上記現状に鑑み、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が有するＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を損なうことなく、細胞毒性を低減させる手段を開発し、前記化合物を利用するうえで人体にとって極めて安全かつ有用なシステムを提供することを目的とする。
具体的には、本発明は、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を有し、優れた安全性を有するリポソーム、該リポソームを含有するＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤及び動脈硬化抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＬＯＸ−１には本来結合しない中性電荷のリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン）をベースとすることで、本来のリガンドである陰性電化を持った酸化ＬＤＬとは異なる脂質のベースを作製し、このベースにフェオフォルバイドａを包接することでＬＯＸ−１アンタゴニスト活性は保持したまま、細胞毒性のみを低減させることに成功した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）に係るものである。
（１）フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物と、中性リン脂質とを含有することを特徴とするリポソーム。
（２）中性リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びスフィンゴミエリンからなる群から選ばれる１種以上である前記（１）記載のリポソーム。
（３）コレステロールを含有する前記（１）又は（２）記載のリポソーム。
（４）脂質１μｍｏｌに対してフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が０．０１〜１ｍｇ含有されている前記（１）〜（３）いずれか記載のリポソーム。
（５）脂質過酸化阻害剤を含有する前記（１）〜（４）のいずれか記載のリポソーム。
（６）前記脂質過酸化阻害剤がビタミン又はその誘導体である前記（５）記載のリポソーム。
（７）レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する前記（１）〜（６）いずれか記載のリポソーム。
（８）レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニストとして使用するための前記（１）〜（７）いずれか記載のリポソーム。
（９）前記（１）〜（８）いずれか記載のリポソームを含むレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
（１０）前記（１）〜（８）いずれか記載のリポソームを含む動脈硬化抑制剤。
【００１２】
なお、本発明においてアンタゴニスト作用とは、後述の実施例に記載の方法で評価した場合に、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害し、かつ酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害することを意味する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が有するＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を損なうことなく、細胞毒性のみを有意に低減させることを初めて可能にしたものである。したがって本発明によれば、ヒトにとって安全で、副作用のないＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤及び動脈硬化抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は実施例１及び実施例２の方法により調製した脂質包接型フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム）とビタミンE含有脂質包接型フェオフォルバイドａ(ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．)とフェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）による、実施例３の方法によりＬＯＸ−１アンタゴニスト活性をＥＬＩＳＡで検証した結果を示すグラフである。縦軸はＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合の阻害率を示している。
【図２】図２は実施例１の方法により調製した脂質包接型フェフォルバイドａ（＋酸化ＬＤＬ＋ＰｈＡリポソーム）とフェオフォルバイドａ単体（＋酸化ＬＤＬ＋ＰｈＡ）による、実施例４の方法によりＬＯＸ−１アンタゴニスト活性をセルアッセイで検証した結果を示すグラフである。縦軸は蛍光標識を指標に、ＬＯＸ−１発現細胞に結合した酸化ＬＤＬ量を示している。
【図３】図３は実施例１の方法により調製した脂質包接型フェフォルバイドａとフェオフォルバイドａ単体による、実施例５の方法により細胞毒性を検証した結果を示すグラフである。
【図４】図４は実施例２の方法により調整した脂質包接型フェオフォルバイドａに対するビタミンＥの効果について、実施例５の方法により細胞毒性を検証した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のリポソームは、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物と、中性リン脂質とを含有することを特徴とする。かかる特徴を有することで、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を有し、光依存性の細胞毒性も抑えられた優れた安全性を有するリポソームを得ることができる。
【００１６】
本発明のように、リポソーム形成によるフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物の細胞毒性の低減作用については知られておらず、さらにこのリポソーム包接により、ネイティブなフェオフォルバイドａが有していたＬＯＸ−１アンタゴニスト作用が影響を受けるか否かについても、全く知られていなかった。事実、化合物を何らかの巨大分子に結合させた場合、その化合物が本来持っていた性質（アンタゴニスト活性等）が失われることは、生化学の実験上、非常に多いものである。
これに対して、本発明では、中性リン脂質を含む脂質二重層を形成しているリポソームの疎水性領域に、疎水性化合物であるフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物を包接させることで、フェオフォルバイドａが有する作用のうち、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を選択的に発現させ、細胞毒性作用は選択的に発現させ難くすることが可能になると考える。
【００１７】
フェオフォルバイドａとしては、天然物から精製されたもの、あるいは合成されたものであってもよい。また、フェオフォルバイドａは、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を有するものであれば、構造上の誘導体化合物であっても問題は無い。フェオフォルバイドａの誘導体化合物としては、エチルフェオフォルバイド、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、ヘム、シアノコバラミン、フェオフィチンａ、フェオフィチンｂ、ヘマチン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン等が挙げられる。
【００１８】
リポソームを構成する中性リン脂質については、天然由来であっても合成物であってもよく、その種類も特に限定はされない。天然物であればホスファチジルコリンが多く含まれる大豆レシチン等が挙げられる。また合成品であれば、中性リン脂質であるホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
【００１９】
また、前記中性リン脂質以外にも、リポソームを構成する脂質として、コレステロールを含有することが好ましい。コレステロールを含有することでリポソームの安定性が増加するという利点がある。
【００２０】
また、リポソームを構成する他の脂質として、例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のリン脂質を用いてもよい。
【００２１】
本発明のリポソームを構成する脂質中における中性リン脂質の割合としては、５０〜１００重量％が好ましい。また、本発明のリポソームを構成する脂質中におけるコレステロール及びその他の脂質の割合としては、５０重量％以下が好ましい。
【００２２】
本発明のリポソームにおいて、脂質とフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物との量比に関しては特に制限を設けないが、好ましくは脂質１μｍｏｌに対してフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が０．０１〜１ｍｇ含まれるものである。なお、ここで脂質の量は、前記リポソームを構成する脂質成分の全量をいう。
【００２３】
また、リポソームを形成する脂質は保存状態により酸化され易くなることがあるので、脂質の酸化を防ぐ意味で脂質過酸化阻害剤を混合してもよい。例えば、アスコルビン酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、あるいはこれらの誘導体等が挙げられる。これらの中でもＬＯＸ−１アンタゴニスト活性に影響を与えない、あるいは脂溶性が調整しやすいという観点からビタミンＥが好ましく、その濃度範囲は終濃度で０−０．５Ｍである。
中でも、前記脂質過酸化阻害剤がビタミンＥ又はその誘導体である場合には、脂質の酸化防止に加えて、細胞毒性を低減させる効果も向上させることができるため、好ましい。
【００２４】
前記のような構成を有する本発明のリポソームは、通常のリポソームの製造方法に準じて得ることができる。例えば、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物と、中性リン脂質と、必要であれば他の脂質とを有機溶媒に溶解・混合し、得られる混合液から溶媒を窒素ガス等を用いて除去した後、水系溶媒と混合し、超音波処理を施す方法が挙げられる。
【００２５】
有機溶媒としては、エタノール、メタノール、クロロホルム等が挙げられる。
水系溶媒としては、水、各種のバッファー等が挙げられる。
超音波処理には、リポソームの作製に使用可能な装置を用いればよく、特に限定はない。
【００２６】
本発明のリポソームは、メンブレンフィルターに通過させることで、リポソームの粒径を調整することができる。例えば、孔径０．１μｍのメンブレンフィルターを用いることが好ましい。
【００２７】
以上のようにして得られた本発明のリポソームは、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有するものであり、しかも、フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が有する細胞毒性が、これらの化合物を単独で使用した場合に比べて顕著に低減された安全性に優れたものである。
したがって、本発明のリポソームは、安全性に優れたレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニストとして使用することができる。
【００２８】
また、本発明のリポソームは、医薬組成物の成分として使用することができる。
医薬組成物の用途としては、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤、動脈硬化抑制剤が挙げられる。
【００２９】
医薬組成物の態様としては、注射剤、点滴剤等の液剤等が挙げられる。これらは、水、緩衝液等の安全性の高い溶媒中で、本発明のリポソームと、増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤等とを混合して、定法に基づいて、製剤することで得られる。
【００３０】
フェオフォルバイドa又はその誘導体化合物の配合量としては医薬組成物１００ｇあたり１００ｍｇ以下が望ましい。
【００３１】
これらの医薬組成物の１日あたりの投与量は、症状、身長、体重、年齢等により異なるが、成人１人あたりの摂取量が０．１ｍｇ／ｋｇ・日以下となるように、１回ないし数回に分けて被検体に投与するのが好ましい。
【００３２】
なお、本発明の医薬組成物の標的としているＬＯＸ−１は、ヒトや非ヒトの動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモット、ニワトリ、アヒル、ガチョウ等）の血管内皮細胞のみならず、マクロファージ、平滑筋細胞にも存在しており、それぞれの細胞に酸化ＬＤＬが取り込まれることが動脈硬化症の発症に重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、本発明は、前記ヒトや非ヒトの動物における血管内皮細胞等の動脈硬化症に関与する複数の細胞群において酸化ＬＤＬの取り込みを顕著に阻害する作用を有することから、多面的でかつ顕著に動脈硬化症を抑制することが期待でき、さらに安全性に優れることから、動脈硬化の予防効果も期待することができる。
【実施例】
【００３３】
次に、本発明をその実施例によって具体的に説明する。
【００３４】
（実施例１）
リポソーム組成物の調製
５μｍｏｌのホスファチジルコリンと２．５μｍｏｌのコレステロールをベースとし、さらにフェオフォルバイドａを０．０７５−７．５ｍｇとなるように１ｍｌのメタノールに溶解した。次にこの溶液を混合しながら窒素ガスを吹きつけ、溶媒であるメタノールを除去した。溶媒除去後、脂質混合物に１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ2のバッファーを７．５ｍｌ添加し、窒素ガス充填後に４℃で１０分間の超音波処理を行った。このようにして作製したリポソームを、脂質包接フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム）として使用した。なお、フェオフォルバイドａを添加しなかったリポソームをネガティブコントロールとして使用した。
【００３５】
（実施例２）
リポソーム組成物の調製
５μｍｏｌのホスファチジルコリンと２．５μｍｏｌのコレステロールをベースとし、さらにフェオフォルバイドａを０．０７５−７．５ｍｇとなるように１ｍｌのメタノールに溶解した。上記溶液に終濃度０−０．５ＭとなるようにビタミンＥをさらに混合した。次にこの溶液を混合しながら窒素ガスを吹きつけ、溶媒であるメタノールを除去した。溶媒除去後、脂質混合物に１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ2のバッファーを７．５ｍｌ添加し、窒素ガス充填後に４℃で１０分間の超音波処理を行った。このようにして作製したリポソームを、ビタミンＥ含有脂質包接フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．）として使用した。
またコントロールとして、フェオフォルバイドａを添加しなかったものも作製し、適時使用した。
【００３６】
（実施例３）
実施例１、２により取得した脂質包接フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム、ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．）、あるいはフェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）のアンタゴニスト作用（ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合阻害）をＥＬＩＳＡにより評価した。具体的には以下のように行った。
評価にはマキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ社製）を用いて行った。大腸菌で作製したリコンビナントＬＯＸ−１蛋白質を５μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳバッファーで調製し、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×２回で洗浄し、２５％ブロックエース（大日本住友製薬社製）を含むＰＢＳバッファー３００μｌを各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×２回で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳバッファーで適当な希釈倍率となるように調製したフェオフォルバイドａ単体や包接したフェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム、ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．）等のサンプルを１００μｌずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×３回で洗浄し、５μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳバッファーで調製した酸化ＬＤＬを、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×３回で洗浄し、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗アポリポプロテインＢ抗体（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社製）をＰＢＳバッファーで１０００倍希釈し、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。室温で２時間の静置後、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×５回で洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）−ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定（ＥＩＡ）−基質−キット試薬（バイオラッド社製）を１００μｌずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を５０μｌずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、ＬＯＸ−１に対するアンタゴニスト作用を酸化ＬＤＬの結合量として定量した。結果を図１に示す。
図１に示す結果から、このようにフェオフォルバイドａをリン脂質に包接した場合（ＰｈＡリポソーム）、あるいはビタミンＥを含有した場合（ＰｈＡリポソーム＋Ｖ．Ｅ．）においても、フェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）と比較して、同程度のアンタゴニスト活性を有することが確認された。
なお、大腸菌由来リコンビナントＬＯＸ−１蛋白質及び酸化ＬＤＬについては、国際公開第２００８／００１８８４号パンフレット（特許文献１）に記載の方法に準じて得たものを使用した。
【００３７】
（実施例４）
実施例１により取得した脂質包接フェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム）、フェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）のアンタゴニスト作用（酸化ＬＤＬの細胞内への取り込み阻害）を以下のようにして評価した。
ｂＬＯＸ−１を安定的に発現しているＣＨＯ細胞は、既報の方法に従って経代培養を行った（Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３８５， ｐ７３−７７， １９９７）。細胞を用いたアッセイについては、次のように行った。９６ウェルプレート（ファルコン社製）に１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように各ウェルに１００μｌずつ１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＨａｍＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）のもとで細胞の蒔き込みを行い、３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で２日間培養した。２日間の培養後、培養上清５０μｌを除去し、ＰｈＡリポソーム又はＰｈＡを適当な希釈倍率で含む５０μｌの新しい培養液を添加した。これらの薬剤を含む新しい培養液を添加した後に、１時間の前処理を上記環境下で行うことにより、ＬＯＸ−１への抽出物の結合反応を行った。その後、カルボシアニン蛍光色素である１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン パーコレート（ＤｉＩ：インビトロジェン社製）で標識した酸化LDLを５μｇ／ｍｌとなるように各ウェルにアプライし、上記環境下で６時間のＣＨＯ細胞内への蛍光標識酸化ＬＤＬの取り込み処理を行った。これらの処理を行った後に、１ｍｌＰＢＳバッファーで３回各ウェルを洗浄し、室温で１０％ホルマリン溶液での固定を１０分間行った。固定処理を行った細胞を、２００μｌのＰＢＳバッファーで洗浄を２回行い、最後にＤＡＰＩ（４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を行った。このように処理さ
れたプレートは、Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）により、ＤｉＩ標識酸化ＬＤＬのｂＬＯＸ−ＣＨＯ細胞への取り込みを蛍光顕微鏡イメージ画像として解析した。結果を図２に示す。なお、コントロールとして、前記薬剤を含まず、酸化ＬＤＬを用いないもの（−酸化ＬＤＬ）と前記薬剤を含まず、酸化ＬＤＬを用いたもの（＋酸化ＬＤＬ）を用意した。
図２に示す結果から、図１と同様に、セルアッセイにおいても脂質に包接したフェオフォルバイドａ（＋酸化ＬＤＬ＋ＰｈＡリポソーム）は、フェオフォルバイドａ単体（＋酸化ＬＤＬ＋ＰｈＡ）と比較して、同程度のアンタゴニスト活性を有することが確認された。
【００３８】
(実施例５)
脂質に包接したフェオフォルバイドａ（ＰｈＡリポソーム）と、フェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）の細胞毒性について、処理後の生細胞数を測定して検証した。また実施例２に従い、リポソームに加えるビタミンＥを０−０．５Ｍの範囲で変化させた場合の、細胞毒性に対する濃度依存的な効果についても検証した。生細胞数を測定する方法としては、ミトコンドリア内脱水素酵素によるＭＴＴのホルマザン（難溶性の沈殿物として生成）への還元を利用したＭＴＴ法等が汎用される。よって上記方法の変法を利用している、「Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８」（商品名、同仁化学研究所製）を用いて生細胞数の測定を行った。具体的には、９６ウェルプレート（ファルコン社製）に５．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞の蒔き込みを行った。２日間の培養後、培養上清５０μLを除去し、各阻害剤を適当な希釈倍率で含む５０μｌの新しい培養液を添加した。抽出液を含む新しい培養液を添加した後に、７時間の培養を行った。７時間後に、抽出液を含まない１００μｌの培地で３回ずつ各ウェルの洗浄を行った後に、各ウェルに３μｌずつとなるようにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８溶液であるＷＳＴ―８を含む培地を添加した。１時間の培養後、４５０nmの吸光度を測定し、生細胞数として換算した。結果を図３に示す。
図３に示す結果から、フェオフォルバイドａを脂質に包接した場合（ＰｈＡリポソーム）、フェオフォルバイドａ単体（ＰｈＡ）と比較して約３倍の細胞生存率を示す結果となった。
また、図４は実施例２の方法により調整した脂質包接型フェオフォルバイドａに対するビタミンＥの効果について、実施例５の方法により細胞毒性を検証した結果を示すグラフであり、ビタミンＥの含有量が増加するにつれてフェオフォルバイドａのみの場合（コントロール）と比べて、細胞生存率が顕著に向上していることがわかる。
【００３９】
（実施例６）
医薬組成物（液剤）の調製例
生理食塩水に実施例１又は２で得られたリポソームを含有させた液剤として医薬組成物を調製した。なお、リポソームは、フェオフォルバイドａの実質的な含有量が１０μｇ/ｍｌとなるように調整した。
前記医薬組成物中、リポソームは安定してその状態を維持していた。
【００４０】
実施例６で得られた医薬組成物は、実施例３、４の結果から、アンタゴニスト作用剤として好適に使用できる。また、実施例５の結果から、安全性についても優れているため、動脈硬化抑制剤としても好適に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物と、中性リン脂質とを含有することを特徴とするリポソーム。
【請求項２】
中性リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びスフィンゴミエリンからなる群から選ばれる１種以上である請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
コレステロールを含有する請求項１又は２記載のリポソーム。
【請求項４】
脂質１μｍｏｌに対してフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が０．０１〜１ｍｇ含有されている請求項１〜３いずれか記載のリポソーム。
【請求項５】
脂質過酸化阻害剤を含有する請求項１〜４いずれか記載のリポソーム。
【請求項６】
前記脂質過酸化阻害剤がビタミン又はその誘導体である請求項５記載のリポソーム。
【請求項７】
レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する請求項１〜６いずれか記載のリポソーム。
【請求項８】
レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニストとして使用するための請求項１〜７いずれか記載のリポソーム。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載のリポソームを含むレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか記載のリポソームを含む動脈硬化抑制剤。
【請求項１】
フェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物と、中性リン脂質とを含有することを特徴とするリポソーム。
【請求項２】
中性リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びスフィンゴミエリンからなる群から選ばれる１種以上である請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
コレステロールを含有する請求項１又は２記載のリポソーム。
【請求項４】
脂質１μｍｏｌに対してフェオフォルバイドａ又はその誘導体化合物が０．０１〜１ｍｇ含有されている請求項１〜３いずれか記載のリポソーム。
【請求項５】
脂質過酸化阻害剤を含有する請求項１〜４いずれか記載のリポソーム。
【請求項６】
前記脂質過酸化阻害剤がビタミン又はその誘導体である請求項５記載のリポソーム。
【請求項７】
レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する請求項１〜６いずれか記載のリポソーム。
【請求項８】
レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニストとして使用するための請求項１〜７いずれか記載のリポソーム。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載のリポソームを含むレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか記載のリポソームを含む動脈硬化抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−５１９０６（Ｐ２０１１−５１９０６Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９９９１４（Ｐ２００９−１９９９１４）
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
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