ルイスＹ抗原に関連した疾患の予防または治療用の医薬組成物、ならびにルイスＹ抗原検出用のキット
【課題】ルイスＹ抗原過剰発現から生じる疾患の予防または治療用の医薬組成物、ならびに被検者からの試料においてルイスＹ抗原を過剰発現する、癌細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳを検出する方法の提供。
【解決手段】トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体を含む医薬組物。トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメインまたはこの標識された類似体を含むキット。
【解決手段】トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体を含む医薬組物。トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメインまたはこの標識された類似体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン、ならびにルイスＹ抗原に関連した疾患または障害の予防および／または治療のためのこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性生物体によって誘発される過剰な宿主免疫応答から生じる敗血性ショック症候群は、入院患者の主要な死因である。敗血症における病態生理学的変化は、免疫細胞、特に単球およびマクロファージからの、一酸化窒素、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびインターロイキン（ＩＬｓ）を含む前炎症性メディエイタの、病原体に誘発された制御不能な放出に関係がある。グラム陰性バクテリアの感染は、グラム陰性バクテリア外膜のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）成分による、全身性のバクテリア性敗血症の主要な要因の１つである。ＬＰＳは、前炎症性メディエイタの急速な増加を誘発し、致死性の全身性の組織損傷および多臓器不全をもたらし、これは敗血性症候群の炎症性応答によく似ている。
【０００３】
哺乳動物において、膜結合ＣＤ１４およびＴｏｌｌ様レセプタ４（ＴＬＲ４）−ＭＤ−２は、ＬＰＳの細胞認識に関与する。ＴＬＲ４レセプタへのＬＰＳの結合は、ｐ３８、ｐ４２／ｐ４４細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）およびｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を含むミトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の要素の、活性化を誘発する。休止において、刺激されていない細胞、核因子（ＮＦ）−кＢ、５０−および６５−ｋＤａ（ｐ５０／ｐ６５）タンパク質サブユニットから成るヘテロ二量化複合体は、細胞質中で抑制性кＢα（ＩкＢα）に結合された不活性複合体として維持される。細胞がＬＰＳによる前炎症性の刺激下にある間に、ＩкＢαのリン酸化および分解は、ＮＦ−кＢα核転座を可能にし、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、ＴＮＦ−αおよびその他を含む炎症性遺伝子の発現を促進する。
【０００４】
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、６個の表皮成長因子（ＥＧＦ）様構造（Ｄ２）、Ｏ−グリコシル化部位に富むドメイン（Ｄ３）、膜内外ドメイン（Ｄ４）、および細胞質尾ドメイン（Ｄ５）が付随するＮＨ２末端レクチン様ドメイン（Ｄ１）を含む、５５７アミノ酸Ｉタイプグリコシル化膜内外タンパク質である。（Ｗｅｉｌｅｒ，Ｈ．等、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ２００３Ｊｕｌ．；１（７）：１５１５−２４）。Ｄ２ ＥＧＦ様構造は、トロンビンの基質特異性の変化を介して、ＴＭの抗血液凝固活性を担っている。ＴＭドメイン２（ＴＭＤ２）−トロンビン複合体は、抗血液凝固タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）を活性化し、これはまた前血液凝固（プロコアギュラント）補助因子ＶａおよびＶＩＩＩａを不活性化する。一方、ＴＭ発現は、ケラチノサイト、多形核好中球（ＰＭＮｓ）、単球および内皮細胞を含む細胞タイプにおいて生じ、ＴＭは、抗凝固に加えて、生物学的機能を有する可能性があることを示唆している。また、ＴＭの異なる生物学的機能も存在し得る。ＴＭドメインは、タンパク質Ｃに依存した機構および自律的な機構によって、脈管形成因子および抗炎症薬剤として機能する。最近、ＴＭドメイン１（ＴＭＤ１）の抗炎症活性が示唆された。というのは欠失ＴＭレクチン様ドメインを有する複数マウスは、ＮＦкＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路を介した癒着分子発現の抑止によって、ＬＰＳを伴う攻撃を受け易くなるからである（Ｃｏｎｗａｙ，Ｅ．Ｍ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２ Ｓｅｐ．２；１９６（５）：５６７−７７；米国特許第７３４１９９１２号）。さらに、ＴＭＤ１は、進行したグリケーション最終生成物（ＲＡＧＥ）に対するレセプタへの、ＨＭＧＢ１の結合を妨害することによって、高可動性群Ｂ１（ＨＭＧＢ１）タンパク質、致死性内毒症および致死性敗血症の後発生サイトカインメディエイタを封鎖することが示された（Ａｂｅｙａｍａ，等、Ｊ．Ｃｌｉ．Ｉｖｅｓｔ．２００５Ｍａｙ；１１５（５）１２６７−７４．Ｅｐｕｂ．２００５Ａｐｒ．１４）。また、ＴＭＤ１は補体活性化を妨げ、関節炎を防ぐ。
【０００５】
ＴＭＤ１は、Ｃａ２＋依存炭水化物レセプタドメインから一般に構成される、哺乳動物のＣタイプレクチンに対して、構造的に相同性である。異なるＣタイプレクチンは、細胞癒着、エンドサイトーシスおよび病原体中和を含む種々の生物学的機能に寄与し、先天性免疫系において重要な役割を果たす。
【０００６】
上皮由来の腫瘍の７０％に過剰発現されるルイスＹ抗原は、血液タイプに関連したジフコシル化オリゴサッカライドのファミリーの一員である（Ｋｕｅｍｍｅｌ，Ａ．等、Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２００７；２８：３４０−３４９）。上皮由来に由来した腫瘍には、乳房、膵臓、卵巣、結腸、胃または肺の癌が含まれる。ルイスＹ発現腫瘍の高い頻度、腫瘍細胞表面のこの高い密度および変性された発現、ならびに原発性および転移性病変におけるこの比較的相同な発現は、乳癌を含んだ上皮腫瘍の範囲に対する抗原的標的としての、腫瘍の選別につながっている。（Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｊ．Ａ．等、ＰＡＮＡＳ，２００５；１０２（５２）：１９０５１−１９０５６；
Ｓｃｈｌｉｍｏｋ，Ｇ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：１７９９−１８０３，１９９５；Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７：４７８−４８４，１９９９）。ルイスＹ抗原を認識する抗体は、Ｌｅｙを発現する癌腫を除去すると予想される（Ｋｅｒｒｉｅ Ｃｌａｒｋｅ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６，３６２１−３６２８，２０００；Ｅｒｗｉｎ Ｒ．Ｂｏｇｈａｅｒｔ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０，４５３８−４５４９，２００４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７３４１９９１２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｏｎｗａｙ，Ｅ．Ｍ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２ Ｓｅｐ．２；１９６（５）：５６７−７７．
【非特許文献２】Ａｂｅｙａｍａ，等、Ｊ．Ｃｌｉ．Ｉｖｅｓｔ．２００５Ｍａｙ；１１５（５）１２６７−７４．Ｅｐｕｂ．２００５Ａｐｒ．１４．
【非特許文献３】Ｋｕｅｍｍｅｌ，Ａ．等、Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２００７；２８：３４０−３４９．
【非特許文献４】Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｊ．Ａ．等、ＰＡＮＡＳ，２００５；１０２（５２）：１９０５１−１９０５６．
【非特許文献５】Ｓｃｈｌｉｍｏｋ，Ｇ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：１７９９−１８０３，１９９５．
【非特許文献６】Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７：４７８−４８４，１９９９．
【非特許文献７】Ｋｅｒｒｉｅ Ｃｌａｒｋｅ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６，３６２１−３６２８，２０００．
【非特許文献８】Ｅｒｗｉｎ Ｒ．Ｂｏｇｈａｅｒｔ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０，４５３８−４５４９，２００４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体を含む、ルイスＹ抗原過剰発現から生じる疾患の予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳおいて過剰発現されたルイスＹ抗原を検出するための、トロンボモジュリンの標識されたＮ末端レクチン様ドメインまたはこの標識された類似体を含むキットを提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、被検者からの試料において、ルイスＹ抗原を過剰発現する腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳを検出する方法も提供し、前記方法は、試料を、標識されたトロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの標識された類似体を含む組成物と接触させるステップを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体を含む、ルイスＹ抗原過剰発現から生じる疾患の治療用の医薬組成物を提供する。提示されたルイスＹ抗原は、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳにおいて発現される。この実施形態において、腫瘍細胞は、乳房、膵臓、卵巣、結腸、胃および肺癌から選択された、上皮由来の腫瘍である。また、この組成物は、ルイスＹ抗原を過剰発現する腫瘍を予防および治療する。
【００１３】
本発明において、ＴＭＤ１はＬＰＳに結合し、凝固作用を誘発し、ならびにマクロファージによるバクテリア食菌作用を増強することが発見されている。ＴＭＤ１は、グラム陰性バクテリアによって誘発される敗血症の全身性炎症の早期における抗炎症性因子として機能することが実証される。さらに、ＴＭＤ１は、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などのスムースタイプ（ｓｍｏｏｔｈ−ｔｙｐｅ）ＬＰＳを運搬するバクテリア、重要なグラム陰性病原体と特異的に相互作用すること、および、ＬＰＳへの結合、下流シグナル形質導入を遮断することによって、ＬＰＳおよび肺炎桿菌誘発炎症性応答および死亡率を減衰させることが示される。したがって、ＴＭＤ１は、ＬＰＳの中和における重要な保護機能を有することができ、敗血性ショック症候群および他の炎症性疾患状態の治療において治療的に有用である。また、マクロファージにおけるＴＭの生物学的機能も提示される。
【００１４】
本発明は、ＴＭがグラム陰性バクテリア媒介敗血症を保護することを示す。トロンボモジュリンＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）は、ルイスＹ抗原およびＬＰＳに結合し、ＬＰＳ誘発炎症性応答を抑制する。さらに、ＴＭＤ１は、大腸菌および肺炎桿菌を凝固させ、これらのグラム陰性バクテリアの食菌作用を増強する。ＴＭＤ１の投与は、ＬＰＳおよびグラム陰性バクテリアによって誘発された敗血症における、炎症性応答を抑制することにより宿主を保護する。それ故、組換えタイプＴＭＤ１は、敗血症の過激な炎症の治療において、とりわけグラム陰性バクテリアによって生じる感染において有用であり得る。
【００１５】
好ましい実施形態において、炎症性応答は、ＬＰＳまたはグラム陰性バクテリアによって誘発された敗血症である。さらに好ましい実施形態において、グラム陰性バクテリアは、大腸菌または肺炎桿菌である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｂ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｃ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｄ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｅ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｆ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｇ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図２Ａ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｂ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｃ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｄ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｅ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｆ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｇ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｈ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｉ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｊ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図３Ａ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｂ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｃ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｄ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｅ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｆ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図４Ａ】ｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。
【図４Ｂ】ｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。
【図４Ｃ】ｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。
【図４Ｄ】ｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。
【図５Ａ】ＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを凝固する作用およびバクテリアを食菌する作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示す図である。
【図５Ｂ】ＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを凝固する作用およびバクテリアを食菌する作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示す図である。
【図５Ｃ】ＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを凝固する作用およびバクテリアを食菌する作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示す図である。
【図６Ａ】アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。
【図６Ｂ】アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。
【図６Ｃ】アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。
【図６Ｄ】アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。
【００１７】
図１はＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図である。（ＡおよびＢ）ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)からのｒＴＭＤタンパク質および哺乳動物のタンパク質を、ＲＡＷ２６４．７細胞に添加する前に前培養させた。６時間培養の後に、培地を（Ａ）ＴＮＦ−αおよび（Ｂ）ＮＯの測定のために収集した。ｍＴＭＤ１は、哺乳動物タンパク質発現系からのｒＴＭＤ１を表す。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。ＬＰＳ処理培養と比較して、ＡおよびＢ、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＰＢＳ群と比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＬＰＳの種々の量を、ＲＡＷ２６４．７細胞においてＴＮＦ−α産生を誘発させるために使用し、ｒＴＭＤ１の効果を測定した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）である。ＬＰＳ処理群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＩкＢα（Ｄ）、核分画における、ＬＰＳで誘発されたＩкＢαのリン酸化および分解（Ｄ）、ＮＦ−кＢｐ５０およびｐ６５の核転座（Ｅ）、ＥＲＫ１／２およびｐ３８リン酸化（Ｆ）、およびｉＮＯＳ発現（Ｇ）をアッセイするためにウエスタンブロッティングを使用した。全ての結果は、少なくとも３つの独立した実験で得られた結果をよく表している。
【００１８】
図２は、ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。（ＡおよびＢ）ｒＴＭＤ１は，ＬＰＳのｉ．ｐ．注射（２０ｍｇ／ｋｇ）の前にｉ．ｖ．投与された。（Ａ）ＴＮＦ−αおよび（Ｂ）ＮＯ産生のアッセイのために、ＬＰＳ投与の６時間後に血清を集めた。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝１０）である。ＬＰＳ処理群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＰＢＳ処理群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された肺の切開面の代表的な顕微鏡像を示す。（Ｄ）それぞれの肺胞において、浸潤したＰＭＮの数を光学顕微鏡によって観察した（倍率６３０×）。それぞれの実験マウスについて、スライドガラス１枚当り４つの任意の区域からＰＭＮの数を数え、ＰＭＮの数をそれぞれのスライドガラス上の肺胞数の区域に基準化した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝１０）である。ＬＰＳ処理群と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＰＢＳ処理群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１。これらのグラフは、３つの独立した実験からの結果を表す。（Ｅ，Ｆ，およびＧ）複数マウス中へのＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）ｉ．ｐ．注射の前に、ｒＴＭＤ１（５および２５ｍｇ／ｋｇ）を、ｉ．ｖ．投与した。１２時間後に、複数マウスを犠牲にし、腎臓組織を取り出した。腎臓切開面を、組織学的ヘマトキシレンおよびエオシン染色によって観察した。代表的な顕微鏡像を示す。（Ｅ）腎性障害のｒＴＭＤ１抑制。矢印先端は、糸球体の部位を示す（スケールバーは５０μｍ）。ｒＴＭＤ１は、複数マウス血清中の腎性障害マーカＢＵＮ（Ｆ）およびクレアチニン（Ｇ）のレベルを低下させた。それぞれの実験群に対して、ｎ＝４；ＬＰＳで処理されていない対照複数マウスと比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１。ＬＰＳ処理対照複数マウスと比較して＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。これらのグラフは、３つの独立した実験からの結果を示す。（Ｈ）複数マウスは、ＬＰＳ（４０ｍｇ／ｋｇ）およびｒＴＭＤ１（ＬＰＳ注射の、０、６、１２および２４時間後に２ｍｇ／ｋｇの４回の投与量）を受けた。生存数を求めた。それぞれの実験群に対して、ｎ＝２０。ＬＰＳ処理群と比較して、＊＊＊Ｐ（Ｉ）＜０．００１。（Ｉ）循環におけるｒＴＭＤ１のクリアランス。それぞれ、循環におけるｒＴＭＤ１の半減期はｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の注射によって求め、また血清中のｒＴＭＤ１のレベルは、捕捉および検出抗体として抗−ｃ−ＭｙｅおよびＴＭ−Ｈ３００を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝５）。（Ｊ）ｒＴＭＤ１処理を伴わないか、または伴った循環におけるＬＰＳのクリアランス。ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）を、雄ＦＶＢ複数マウスに、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を伴わないか、または伴ってｉ．ｐ．投与し、血清試料を、種々の時間間隔において収集し、ＬＰＳの量をリムルス(Ｌｉｍｕｌｕｓ)アメーバ様細胞溶解産物試験によって求めた。数値は、平均値±ＳＤ。それぞれの時間間隔群に対して、ｎ＝５；ＬＰＳ処理複数マウスと比較して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００１９】
図３はｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。（ＡおよびＢ）ｒＴＭＤ１を、複数マウスへの肺炎桿菌（５х１０２ＣＦＵ／マウス）の注射の前に投与した。血清を、（Ａ）ＴＮＦ−αおよび（Ｂ）ＮＯ産生のアッセイのために肺炎桿菌の投与１２時間後に収集した。肺炎桿菌処理群と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＰＢＳ処理群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を、複数マウスへの肺炎桿菌（５×１０３ＣＦＵ／マウス）の注射の前に投与した。生存率を求めた。それぞれの実験群に対して、ｎ＝２０。肺炎桿菌処理群と比較した＊＊＊Ｐ＜０．００１。これらのグラフは、３つの独立した実験からの結果を表す。（Ｄ）循環においてｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌クリアランスを増強した。ＦＶＢ複数マウスに、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を伴わないか、または伴って肺炎桿菌（５×１０２ＣＦＵ／マウス）をｉ．ｐ．注射した。それぞれの群からの血液試料を種々の時間間隔において収集し、生存可能なバクテリアをＣＦＵ計数するためにアッセイした。数値は、平均値±ＳＤ。それぞれの時間間隔群に対して、ｎ＝５；肺炎桿菌処理複数マウスと比較して、＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）（Ｆ）ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を、複数マウスに肺炎桿菌（５х１０２ＦＵ／マウス）を注射した３０または６０分後に、直ちに投与した。ＴＮＦ−αの血清レベルおよび肺炎桿菌クリアランス（Ｆ）を求めた。数値は、平均値±ＳＤ。それぞれの時間間隔群に対して、ｎ＝８−１０；それぞれの時間間隔群の肺炎桿菌処理複数と比較して、＊Ｐ＜０．００５および＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＰＢＳ処理群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１。同様の結果が２つの独立した実験において得られた。
【００２０】
図４はｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。（Ａ）肺炎桿菌またはＢＳＡ。
（Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳまたはＢＳＡ。（ＡおよびＢ）肺炎桿菌、ＬＰＳまたはＢＳＡをウエル上にコートした。ｒＴＭＤタンパク質の等モル量をそれぞれのウエルに添加した。ｒＴＭＤタンパク質の結合を検出した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝６）。ｒＴＭＤ２３添加群およびＢＳＡコート群と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＬＰＳをウエル上にコートし、０．２Ｍマンノースまたは５ｍＭ ＥＤＴＡの、不存在下および存在下において、ＣａＣｌ２を含む結合バッファー中でｒＴＭＤ（５０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。結果は、結合バッファー群（１００％）で基準化した相対吸光度の百分率として表す。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝６）。この結合バッファー群と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１。示された結果は、少なくとも３つの独立した実験において得られた結果の典型的なものである。（Ｄ）ＬＰＳに対するＣＤ１４の結合のｒＴＭＤ１封鎖。ＬＰＳをウエル上にコートし、ｒＴＭＤ１およびＣＤ１４の指示された濃度でインキュベートした。ＬＰＳに対するＣＤ１４の結合を、ＣＤ１４抗体（Ｍ−３０５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して検出した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）、ＣＤ１４だけを受けた群と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。同様の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【００２１】
図５はＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを凝固する作用およびバクテリアを食菌する作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示す図である。（Ａ）ＦＩＴＣ標識肺炎桿菌およびＦＩＴＣ標識ＦＩＴＣ標識大腸菌ＤＨ５αを、５ｍＭＣａＣｌ２を含む結合バッファー中で、ならびに０．２Ｍマンノースおよび５ｍＭＥＤＴＡを含まないか、または含んで、ｒＴＭＤ１の不存在下または存在下でインキュベートした。蛍光的に標識されたバクテリアを、蛍光顕微鏡を使用して観察して、バクテリアの凝集作用を評価した。非標識ｒＴＭＤ１をエンテロキナーゼによるｒＴＭＤ１のインキュベーションによって調製し、Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｓ１に記載されている通りに精製した。また、哺乳動物発現ｒＴＭＤ１および標識ｒＴＭＤ２３を有する内部対照も包含されていた。顕微鏡写真は、これらの３つの独立した実験の代表的なものである。（Ｂ）代表的顕微鏡写真は、バクテリアの食菌作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示している。分化したＴＨＰ−１細胞を、ｒＴＭＤ１前処理されたＦＩＴＣ標識肺炎桿菌によりインキュベートした。左のパネルは明るいドメイン像を示し、右のパネルは蛍光顕微鏡写真（スケールバーは２００μｍを表す）を示す。（Ｃ）（Ｂ）からの試料のＦＡＣＳ分析。このグラフは、ＦＩＴＣ蛍光（ｘ軸）のレベルに対して相対的細胞数（ｙ軸）を描いたものである。これらのグラフは、３つの独立した実験からの結果を表す。
【００２２】
図６はアルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。（Ａ）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ結果。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）。哺乳動物発現ｒＴＭＤ１の糖結合特異性は、相対強度によって示される（最高の吸光度に関連して）。糖識別は、表に挙げた番号によって示される。ブランクに比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、４つの独立したアッセイの平均から得られた。同様の結果が、ピキア発現ｒＴＭＤ１を使用して得られた。（Ｂ）ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の効果。ＬＰＳをウエル上にコートし、種々の濃度のＬｅｙおよびｒＴＭＤ１をそれぞれのウエルに添加した。ｒＴＭＤ１の結合は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）として発現され、ｒＴＭＤ１単独群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１。同様の結果が、２つの独立した実験において得られた。（Ｃ）大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析。ＬＰＳ（５μｇ／ウエル）を高結合マイクロタイタープレートのウエルの上にコートした。Ｌｅａ、Ｌｅｂ、Ｌｅｘ、およびＬｅｙ抗体（５μｇ／ｍＬ）を結合バッファー中のそれぞれのウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートしてから、ペルオキシダーゼ標識した第二の抗体によって２時間培養した。ＬＰＳへのルイス抗体の結合は、４５０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって検出された。平均値±ＳＤ（ｎ＝４）。同様の結果が２つの独立した実験において得られた。（Ｄ）ＬＰＳ誘発シグナル伝達経路についての、ｒＴＭＤ１の抑制効果に関するＬｅｙの効果。ｒＴＭＤ１（２０μｇ／ｍＬ）および種々の濃度のＬｅｙを、細胞に添加する前にＬＰＳ（１００ｍｇ／ｍＬ）と共にプレインキュベートした。３０分間の培養の後に、ウエスターン ブロットを使用して、ＬＰＳ誘発ＥＲＫ１／２リン酸化、細胞質の区画におけるＩкＢαの分解、および、ＮＦ−кＢｐ５０およびＮＦ−кＢｐ６５の核転座を、アッセイした。同様の結果が２つの独立した実験において得られた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書では、「炎症」は、生存している組織の損傷に対する局所反応、とりわけ細い血管、これらの内容物、およびこれらの随伴する構造に対する局所反応を意味する。組織への、脈管壁を通した血液成分（血管外遊出）の通過が炎症の特徴である。一般に、炎症は、内皮壁への増強された白血球の癒着で始まり、組織または器官中への白血球の血管外遊出をもたらす。
【００２４】
実際に、バクテリア、過剰な熱、低温、粉砕などの機械的損傷、酸、アルカリ、照射により生存している組織に損傷を与えるいずれかの有害なプロセスまたはウイルスによる感染は、関与する器官または組織に関係なく炎症を起こし得る。動物およびヒトの疾患は、関節炎、皮膚炎、腹膜炎、虚血／再潅流障害（例えば、心臓、肝臓、腎臓、脳）を随伴する障害、炎症性肺障害（例えば、喘息、気管支炎、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）を含む）、脈管炎、アテローム性動脈硬化症、腎炎、皮膚創傷治癒、敗血症、および、局所および全身性感染症を含む「炎症性疾患」として分類されることは、明らかなはずである。
【００２５】
本明細書では、用語「グラム陰性バクテリア」は、グラム染色プロトコルにおいてクリスタルバイオレット染料を保持しないものである。グラム陽性菌は、アルコール洗浄の後に前記暗青色染料を保持する。グラム染色試験において、クリスタルバイオレットの後に、対比染料が添加され、この対比染料は全てのグラム陰性バクテリアを赤色またはピンク色に染める。この試験自体、バクテリア細胞壁の構造差に基づいて、バクテリアの２つの明確に異なるタイプを分類する際に有用である。グラム陰性バクテリアの多くの種は、病原性であり、グラム陰性バクテリアは宿主有機体の疾患を起こすことが可能であることを意味している。この病原性の能力は、通常、グラム陰性細胞壁のある種の成分、特にリポ多糖類（ＬＰＳまたはエンドトキシンとしても知られている)層に随伴している。
【００２６】
本明細書では、用語「凝固」は、粒子の凝集である。これは、生物学の場合に３つの主な例において生じる。１．抗体の存在下でバクテリアまたは赤血球などの細胞の凝集。抗体または他の分子は、多発性粒子と結合し、多発性粒子を接合する。２．溶液に懸濁されている小さい粒子の凝集。これらの大きい物質は、次いで（通常は）沈殿する。３．アレルギー性反応タイプ発生。この場合、細胞は異物が細胞に入るのを防止するために、より堅く締まる。これは、通常その細胞の周辺にある抗原の結果である。本発明のバクテリアの凝固は、マクロファージによるバクテリアを食菌する作用を促進する。
【００２７】
好ましい実施形態において、当該の疾患は、ＬＰＳまたはグラム陰性バクテリアにより誘発される敗血症である。この疾患または障害は、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）をＬＰＳまたはグラム陰性バクテリアに結合して、バクテリアの凝固またはオプソニン作用を誘発することによって予防または治療される。したがって、この疾患または障害は、マクロファージにおける、炎症性のメディエイタＴＮＦ−αまたはＮＯの、ＬＰＳで誘発された産生を減少させることによって、ならびにＬＰＳで誘発された炎症性の応答に関与したシグナル経路を抑制することによって予防または治療される。
【００２８】
さらに好ましい実施形態において、当該の疾患または障害は、相互作用ＴＭＤ１によって予防または治療される。ＴＭＤ１は、グラム陰性バクテリアに対する先天性の免疫性にとって、自然のオプソニン的機能基として機能する。オプソニン作用の誘発は、ＬＰＳまたは細胞膜中のルイスＹ抗原へＴＭＤ１を結合させることによってなされ、バクテリアの凝固の誘発は、マクロファージによるバクテリアを食菌する作用を促進する。これらの応答は、肺におけるＰＭＮ浸潤を軽減するか、または腎臓機能を維持する。ＬＰＳで誘発された炎症性応答に関与したシグナル経路は、ＥＲＫおよびＰ３８のリン酸化、ＩкＢの分解、およびＮＦ―кＢの転座、および、誘導性の一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびＴＮＦ−αの増大する発現を含む。さらに、この疾患または障害は、高移動性基Ｂ１（ＨＭＧＢ１）との相互作用ＴＭＤ１によって予防される。
【００２９】
また、本発明は、被験者からの試料においてルイスＹ抗原を過剰発現する、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳを検出する方法を提供し、前記方法は、次のステップを含む：試料を、標識されたトロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）、またはこの標識された類似体と接触させるステップ。好ましい実施形態において、ルイスＹ抗原を発現する腫瘍細胞は、乳房、膵臓、卵巣、結腸、胃および肺癌である。提示された試料は、被験者からの、血液、組織、体液、細胞または排出物から得られる。本発明の実施形態において、被験者は、哺乳動物である。本発明の好ましい実施形態において、被験者はヒトである。ＴＭＤ１における標識されたマーカまたはこの類似体は、蛍光分子、放射性分子、色素の分子、ビオチン、アクリジニウムエステルおよびアクリジニウム−９−カルボキサミドなどの検出可能なマーカである。
【００３０】
本明細書では、用語「被験者」は、医療の注目を受けるなんらかの動物である。特に、動物はヒトである。ヒトは、往々にして病気になったり、傷害を受けたりして、医師またの医療専門家による治療を必要とする。
【００３１】
本明細書では、用語「類似体」は、１つまたは２つ以上の個々の原子が、異なる原子で、または異なる官能基で置換された化合物である。生化学におけるこの用語のその他の使用は、別の物質に構造が類似している物質のことをいう。本明細書において使用される、ＴＭＤ１の類似体には、限定はしないがネズミを含む異なる動物からのＴＭのレクチンドメイン、ならびに突然変異など、および、ポリエチレングリコール化およびグリコシレーションなどの化学的変性などの、この分野の知識を有する技術者に知られている変性が含まれる。
【００３２】
本明細書では、用語「先天性免疫」は、宿主を他の有機体による感染から非特異的な方法で防御する、細胞およびメカニズムを含む。これは、先天性の細胞は包括的な方法で病原体を認識および応答し、しかし順応免疫系とは異なって、これは、宿主に対して長期にわたる、または保護的免疫を与えないことを意味する。先天性免疫系は、感染に対して即時の防御をもたらし、植物および動物の生命現象の全ての綱において見出される。
【００３３】
本明細書では、用語「オプソニン作用」は、例えば、膜上のマイナスに電荷された分子を被覆することにより、食菌作用のプロセスに対する結合エンハンサーとして作用するいずれかの分子作用である。食菌作用を実行する細胞の膜ならびにこの標的は、共にマイナス電荷（ゼータ電位）を有し、この２つの細胞の接近を困難にする。オプソニン作用のプロセスの間に、抗原は、抗体および／または補体分子によって結合される。食作用の細胞は、オプソニン分子を結合するレセプタを発現する。これらの分子により被覆された抗原により、食細胞への抗原の結合は、大きく増強する。ほとんどの食作用の結合は、抗原のオプソニン作用なしには生じ得ない。さらに、抗原のオプソニン作用、および引き続く活性化された食細胞への結合は、近傍の食細胞上の補体レセプタの発現を増大させる。オプソニン分子の例には、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体、および、補体系のＣ３ｂ、Ｃ４ｂおよびｉＣ３ｂ成分が挙げられる。
【００３４】
さらに、本発明は、標識されたトロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）、またはこの標識された類似体を含む、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳにおいて過剰発現されたルイスＹ抗原を検出するキットを提供する。
【実施例】
【００３５】
材料および方法
【００３６】
１． ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)および哺乳動物タンパク質の両方の発現系を使用した組換えタイプＴＭＤ（ｒＴＭＤ）の調製。
ｐＰＩＣＺαＡおよびｐＣＲ３−ＥＫベクターを、ヒトｒＴＭＤタンパク質の発現および分泌のために使用した。このヒトｒＴＭＤタンパク質は、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｔｏｒｉｓ）およびヒト胎芽腎臓 ２９３（ＨＥＫ２９３）哺乳動物タンパク質発現系において、精製のために、および、タンパク質検出のために６ＸＨｉｓ標識およびｃ−Ｍｙｃエピトープを含んでいる。簡潔に言うと、ＴＭＤ１（残余物Ａｌａ１−Ａｌａ１５５）、ＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３（残余Ａｌａ２２４−Ｇｌｕ３４６）、およびＴＭＤ２３（残余Ａｌａ２２４−Ｓｅｒ４９７）に対してコード化するｃＤＮＡ断片を、特異性プライマーを使用してヒト臍帯静脈内皮細胞のＰＣＲによって得た。構築物に対して使用したプライマーシーケンスは、以下の通りであった：ＴＭＤ（ＴＭＤ１−センス：配列番号２およびＴＭＤ−アンチセンス：配列番号２およびｒＴＭＤ１−アンチセンス：配列番号３）、ＴＭＤ２３（ＴＭＤ２−センス：配列番号４およびＴＭＤ３−アンチセンス：配列番号５）、およびＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３（ＴＭＤ２−センスおよびＴＭＤ２／ＥＧＦ３−アンチセンス：配列番号６）。ｒＴＭＤシーケンスとＨｉｓ／ｃ−Ｍｙｃ標識の間のエントロキナーゼ切断部位は、引き続いて起こる標識シーケンスの除去を可能とする。発現されたｒＴＭＤタンパク質を含む、酵母発酵媒体またはＨＥＫ２９３細胞条件付け媒体は、ニッケルキレート化セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用し、ｒＴＭＤ含有分画をイミダゾール傾斜方法で溶離した。精製されたｒＴＭＤタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスターンブロッティングによって検査し、質量分光分析によるタンパク質同定によって確認した。また、ｒＴＭＤタンパク質のＮ末端アミノ酸シーケンスもモデル４７７Ａシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によるＥｄｍａｎ分解によって決定した。融合ペプチドを含むｒＴＭＤの分子量は、タンパク質濃度計算用のＥｘＰＡｓｙ ウエブサイトを使用して予測した（ｒＴＭＤ１：２２，９０２ダルトン、ｒＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３：１６，４７３。ダルトンおよびｒＴＭＤ２３：３２，８２３ダルトン）。非標識ｒＴＭＤを、５ｎｇエンテロキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，ＭＡ）含有１ｍｇｒＴＭＤを、４℃において１６時間培養することによって調製した。培養の後に、試料をニッケルキレート化セファロースカラムに適用し、この非標識ｒＴＭＤ含有非結合分画を収集した。この試料を固定された大豆トリプシン抑制因子セファロースゲルでさらに処理して、残余のエンテロキナーゼを吸収した。それぞれの試料を、エンテロキナーゼ処理の前後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスターンブロットによって分析し、元の標識ｒＴＭＤ１より２０００ダルトン小さい分子量を有する非標識ｒＴＭＤ１を得た。
【００３７】
細胞および細胞培養。
ヒト白血病単球ＴＨＰ−１細胞およびネズミマクロファージ細胞をアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション（Ａｍｅｒｉｋａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得た。ＴＨＰ−１細胞を、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１％β−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％致死胎児血清（ＦＢＳ）で捕足された、ＲＰＭＩ−１６４０の懸濁液中で増殖させた。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１．５ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウムおよび４．５ｇ／ｌグルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳを含むように調整された、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ変性Ｅａｇｌｅ’ｓ媒体中で、給湿された５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃において、付着層として増殖させた。差別化のために、ＴＨＰ−１細胞を、１０ｎＭ ＰＭＡを含む媒体中でプレートとし、１８時間接着させた。
【００３８】
３． 炎症性のメディエイタアッセイ。
条件付けされた媒体またはマウス血清における、ＴＮＦ−αを酵素関連免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって測定した。媒体またはマウス血清定における亜硝酸塩の蓄積は、Ｇｒｉｅｓｓ 試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して比色分析によって求めた。血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニンを、Ｒｏｃｈｅ Ｄ＆Ｐモジュラー（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ）により測定した。
【００３９】
４． ウエスターン ブロッティング。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＬＰＳ（ＬＰＳ Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含まないか、または含んで、ルイスＹ（Ｌｅｙ；ＤｅｘｔｒａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）の不存在下または存在下で３０分間プレインキュベートされた、ｒＴＭＤ（０−５０μｇ／ｍＬ、０−２．１８ｎモル／ｍＬに等しい）を使用してＴＨＰ−１またはＲＡＷ２６４．７細胞を刺激した。インキュベーション期間は、ｐＩкＢおよびＩкＢ（他に指示がなければ、Ｂ−９およびＣ−２１，ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ，ＣＡ，）、ｐ３８（Ｃ−２０）およびｐｐ３８（Ｄ−８）に対して２０分間、ＥＲＫ１／２（Ｋ−２３）、ｐＥＲＫ１／２
（Ｅ−４）、ラミン（ｌａｍｉｎ）Ｂ２（Ｅ−３、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、ＣＡ)、ＮＦ−кＢｐ５０（Ｃ−１９）およびＮＦ−кＢｐ６５核転座（Ｃ−２０）に対して３０分間、および特異性抗体（Ｎ−２０）を使用したｉＮＯＳ発現に対して２４時間であった。
【００４０】
５． 動物および全身性敗血症モデル。
雄ＦＶＢ複数マウス（生後８−１０週間）を使用して、インビボで敗血症をモデルした。Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｎｇ Ｋｕｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙが方法を承認した。慢性の内毒血症モデルにおいて、等モル量で、種々の濃度のｒＴＭＤ１またはｒＴＭＤタンパク質を尾部静脈（ｉ．ｖ．）注射によって投与し、ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）または肺炎桿菌（５×１０２ＣＦＵ／マウス、ＢＣＲＣ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与した。６または１２時間後に、複数マウスをペントバルビタール麻酔（５０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）によって犠牲にした。血清を収集し、ＴＮＦ−α、ＮＯ、ＢＵＮおよびクレアチニンに対してアッセイし、ならびに肺および腎臓組織を取り出し、ホルマリンで固定し、組織化学的検査のためにパラフィン中に包埋した。致命的な敗血症モデルにおいて、ｒＴＭＤ１（２ｍｇ／ｋｇ、８７．３ｎモル／ｋｇに等しい）をＬＰＳ（４０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与０、６、１２、および２４時間後に、ｉ．ｖ．投与した。循環におけるｒＴＭＤ１の半減期を、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ、４３６．６４ｎモル／ｋｇに等しい）のｉ．ｖ．注射によって求め、血清試料を種々の時間間隔で収集した。収集された血清中のｒＴＭＤ１のレベルを、捕捉および検出抗体（両者とも、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）として、アンチ−ｃ−Ｍｙｃモノクロナール抗体およびＴＭ−Ｈ３００をそれぞれ使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって求めた。致死性の菌血症に対してｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を、肺炎桿菌（５×１０３ＣＦＵ／マウス）の注射の前に投与した。死亡率率を、どの実験群においても全てのマウスが死亡するまで、６−１２時間毎に監視した。ＬＰＳ半減期を求める実験的方法は、以下の通りである。ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）を、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を含まないか、または含んで雄ＦＶＢｓ１０２にｉ．ｐ．投与した。血清試料を種々の時間間隔で収集し、ＬＰＳの量をリムルス(Ｌｉｍｕｌｕｓ)アメーバ様細胞溶解産物試験（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｅ．Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）によって求めた。さらに実験を実施して、ｒＴＭＤ１がバクテリア クリアランスに影響を与えるかどうかを確認した。肺炎桿菌（５×１０２ＣＦＵ／マウス）を、ＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を含まないか、または含んで雄複数マウスにｉ．ｐ．投与し、血清試料を種々の時間間隔で収集した。血液試料の順次希釈溶液を血液寒天板上で平板インキュベートとし、３７℃において終夜インキュベーションした後に、コロニーを数えることによって肺炎桿菌の外殖を定量した。
【００４１】
６．肺炎桿菌およびＬＰＳ結合アッセイ
重炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）の１００μＬ中の、肺炎桿菌（３×１０５ＣＦＵ／ウエル）、大腸菌Ｏ１１１スムースタイプＬＰＳ（５μｇ／ウエル）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、５μｇ／ウエル）を、高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のウエル上にコートした。非特異性結合を、５０ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む結合バッファー（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２）で遮断した。１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む結合バッファー中の、ＣＤ１４（１０μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含まないか、または含んだ種々の濃度のｒＴＭＤタンパク質をウエルに添加し、２時間インキュベートした。いくつかの実験において、ＬＰＳ結合およびｒＴＭＤ１結合と競合するために、０．２Ｍマンノース、５ｍＭ ＥＤＴＡ、またはＬｅｙを結合バッファー中に含ませた。抗体ｒＴＭＤタンパク質のｃ−Ｍｙｃエピトープに対する抗体をウエルに添加し、２時間インキュベーとし、ペルオキシダーゼ標識化した二番目の抗体を続いて添加した。ｒＴＭＤタンパク質の結合を４５０ｎｍを測定することによって検出した。
【００４２】
７．バクテリアの凝固に関するｒＴＭＤ１の効果
肺炎桿菌および大腸菌ＤＨ５α（ＢＣＲＣ）を、０．１Ｍ 重炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）０．１ｍｇ／ｍＬで２回洗浄し、暗所で３７℃において、０．ｍｇ／ｍＬフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）によりインキュベートした。ｒＴＭＤ１の２０μｇ／ｍＬのそれぞれを、非標識ｒＴＭＤ１、哺乳動物のｒＴＭＤ１、および組換えＴＭドメイン２および３（ｒＴＭＤ２３）を、バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中で、０．２Ｍマンノースまたは５ｍＭＥＤＴＡを含んで、または含まずに、ＦＩＴＣ標識バクテリア（１×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）によって共−インキュベートした。試料をガラススライド上に置き、蛍光的に標識されたバクテリアを顕微鏡的に観察して、凝固を評価した。
【００４３】
８．ＴＨＰ−１食菌作用アッセイ
ＦＩＴＣ標識肺炎桿菌（１×１０５ＣＦＵ／ウエル）を、分化したＴＨＰ−１細胞に添加する前に、３７℃で、３０分間プレインキュベートした。２時間インキュベーションした後に、ＴＨＰ−１細胞を蛍光顕微鏡検査の前に、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、またはさらにトリプシン化し、ＰＢＳ中に再懸濁させて、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析して、ＴＨＰ−１細胞内の蛍光を測定した。ログ（ｌｏｇ）スケールで５３０ｎｍにおいて収集された、条件当り１０，０００件（細胞）の緑色蛍光データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）により分析した。
【００４４】
９．ｒＴＭＤ１リガンド分析。
ビオチン−ポリアクリルアミド（ビオチン−ＰＡＡ）−糖（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ）、ｒＴＭＤ１、ウサギアンチマウス ＩｇＧ 抗体（Ｚｙｍｅｄ）、マウス、アンチ−６×Ｈｉｓ標識抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ならびに接合ストレプトアビジンをコートしたドナーおよびタンパク質Ａ接合アクセプタビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、２５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭＣａＣｌ２および１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むアッセイバッファーで、適切な濃度に希釈した。このアンチ−６×Ｈｉｓ標識抗体、ウサギアンチマウス ＩｇＧ 抗体、およびアクセプタビーズ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ならびにアクセプタビーズを使用（アクセプタ混合物として）前に、２５℃で１時間アッセイバッファーでインキュベートした。ビオチン−ＰＡＡ−糖 、ｒＴＭＤ１、およびドナービーズを、ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ−３８４アッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）のウエルに別々に添加し、２５℃で１時間インキュベートした。アクセプタの混合物のアリコートを次いでウエルに添加し、２５℃でさらに２時間インキュベートした。この結果をＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプログラムを使用して、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎの機器によって読み取った。全ての手法およびインキュベーションを暗所で実施した。
【００４５】
１０．大腸菌ＬＰＳ Ｏ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析。
大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ＬＰＳ（５μｇ／ウエル）を高結合マイクロタイタープレートのウエル上にコートした。５０ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む結合バッファーにより特異性結が遮断された後に、ルイスａ(Ｌｅａ)、ルイスｂ(Ｌｅｂ)、ルイスＸ(Ｌｅｘ)、およびＬｅｙに対する種々の抗体（Ａｂｃａｍ）の５μｇ／ｍＬを、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む結合バッファーと共にウエルに添加し、および、ヤギアンチマウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役ＩｇＧまたはＩｇＭにより３７℃で２時間インキュベートする前に、２７℃で２時間インキュベートした。このペルオキシダーゼ反応を、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用して実施し、２ＮＨ２ＳＯ４によって停止した。この産物を４５０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって検出した。
【００４６】
１１．統計的分析
生存データをログ−ランクによって分析した。データを平均値±標準偏差（ＳＤ）として表した。統計的有意性を非対性スチューデント ｔ 検定によって分析した。２つを超える群の間の差異を分散の一方向分析または分散の二方向分析、および以下の多重比較検定によって比較した。この場合、Ｐ＜０．０５は統計的に有意と考えられる。
【実施例１】
【００４７】
ｒＴＭＤ１処理は、マクロファージにおけるＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生を減少させる。
【００４８】
ＴＭＤ１が抗炎症性特性を有するかどうかを試験するために、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）および哺乳動物のタンパク質発現系の両方を使用することによってｒＴＭＤタンパク質を調製した。両方の系から得られたこのｒＴＭＤタンパク質は、糖鎖形成変性の状態で同様な分子量を有した。この分子量は、約３５キロダルトン（ｋＤａ）であり、銀染色およびウエスターン ブロッテイングによってアッセイされる通りであった。ＬＰＳにより刺激されたＲＡＷ２６４．７およびＴＨＰ−１細胞におけるｒＴＭＤタンパク質の抗炎症性効果を最初に試験した。ＥＧＦ様ドメイン１、２，３を含む組換えＴＭＤ２（ｒＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３）ではなく、ピキア発現ｒＴＭＤ１は、投与量に依存して、ＬＰＳにより刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞中のＴＮＦ−α産生を抑制した（図１Ａ）；同様な結果が、ＴＨＰ−１細胞において得られた（データは示されていない）。同様に、ｒＴＭＤ１だけが、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯ産生を効果的に抑制し得る（図１Ｂ）。；同様な結果は、哺乳動物発現ｒＴＭＤ１を使用して得られた（図１Ａ−Ｂ）。ｒＴＭＤ１による、ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタの減少がＬＰＳ−ｒＴＭＤ１結合から生じるのかどうかを試験するために、ＬＰＳおよびｒＴＭＤ１の種々の濃度を使用して、相互作用を試験した。ｒＴＭＤ１の不在の場合に、ＬＰＳは投与量に依存してＴＮＦ−α産生を増大させ（図１Ｃ）、ｒＴＭＤ１は投与量に依存してＬＰＳ誘発ＴＮＦ−α産生を
抑制した（図１Ｃ）。このことは、細胞による炎症性メディエイタ産生に関してｒＴＭＤ１が有する低減効果を、ＬＰＳ−ｒＴＭＤ１結合がもたらすという仮説と一致する。
【実施例２】
【００４９】
ｒＴＭＤ１はＬＰＳ誘発シグナル伝達経路を遮断する。
ＩкＢαのリン酸化および分解は、ＬＰＳ（１００ｍｇ／ｍＬ）で刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞において起こる。この効果は、ｒＴＭＤ１（５０μｇ／ｍＬ、２．１８ｎモル／ｍＬ）によって完全に逆になった（図１Ｄ）。また、ＮＦ−кＢのＬＰＳ誘発核転座もｒＴＭＤ１によって投与量依存のやりかたで抑制された（図１Ｅ）。また、ＥＲＫ１／２およびｐ３８のＬＰＳ誘発リン酸化もｒＴＭＤ１によって抑制された（図１Ｆ）。シグナル形質導入経路の活性化に関するｒＴＭＤ１の同様な効果が、ＴＨＰ−１細胞において観察された（データは示されていない）。また、ＬＰＳによるＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳ誘導もｒＴＭＤ１によって抑制された（図１Ｇ）。
【実施例３】
【００５０】
ｒＴＭＤ１はサイトカイン放出を減少させ、肺および腎臓の障害を減衰させ、実験敗血症における生存率を改善させ、ならびにバクテリアＬＰＳクリアランスを増強する。
ｒＴＭＤ１はＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびシグナル伝達経路を抑制することが予想できるので、多分、ｒＴＭＤ１は、インビボでＬＰＳによって誘発される炎症性応答および死亡率を減少させるための治療薬として機能するであろう。ＴＮＦ−αおよびＮＯレベルは、対照複数マウスに対する、２０ｍｇ／ｋｇＬＰＳのｉ．ｐ．投与の６時間後に、複数マウスにおいて増大した。ｒＴＭＤ１（１−５ｍｇ／ｋｇ、４３．６６−２１８．３ｎモル／ｋｇに等しい）のｉ．ｖ．注射を受けた複数マウスは、ＴＮＦ−αおよびＮＯのレベルが著しく低下した（図２Ａ−Ｂ）。ＰＭＮｓ浸潤は、ＬＰＳ処理複数マウスの肺切開面において、ＬＰＳの投与６時間後に明らかであった（図２Ｃ−Ｄ）。ｒＴＭＤ１注射はＬＰＳ投与の６時間後にＰＭＮｓの肺性蓄積を著しく抑制した（図２Ｃ−Ｄ）。しかしながら、ｒＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３は、ＬＰＳ誘発炎症性応答に関して著しい効果はなく、酵母組換えタンパク質のネガティブ対照として使えると予想される（図２Ｃ−Ｄ）。同様に、ＬＰＳは、腎臓の重篤な糸球体障害を起こす。糸球体腎炎の程度は、ｒＴＭＤ１処理複数マウスにおいて著しく低下した（図２Ｅ）。ＬＰＳの投与の１２時間後に、ＢＵＮおよび血清クレアチニンの増大は、腎臓の機能不全と一致した。ｒＴＭＤ１により処理され、次いでＬＰＳで攻撃された複数マウスは、ＬＰＳ処理複数マウスと比較して、ＢＵＮおよびクレアチニンレベルを明らかに減少させた（図２Ｆ−Ｇ）。この効果が、死亡率を下げる効果をもつかどうかを検討するために、複数マウスを、ｒＴＭＤ１（２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで４回、ｉ．ｖ．投与された投与量により処理し、どちらの実験群においても、全ての複数マウスが死亡するまで複数マウスを観察した。ｒＴＭＤ１処理は、死亡率を著しく下げ、内毒血症の間にわたり生存を増進させる（ＬＰＳ攻撃１日後に、ｒＴＭＤ１処理群生存、１００％、ＰＢＳ処理群生存、１０％；およびＬＰＳ攻撃４日後に、ｒＴＭＤ１処理群生存、６０％、ＰＢＳ処理群生存、０％）（図２Ｈ）。このことは、ｒＴＭＤ１が治療効果の可能性を有し得ることを示唆している。注射されたｒＴＭＤ１は、それぞれのｉ．ｖ．注射後１２時間以内に、検出可能であり、この場合、ＥＬＩＳＡによりアッセイして、３−４時間の半減期である（図２Ｉ）。注射されたＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）は、ｉ．ｐ．投与２時間後に、最高レベルに到達し、約６−８時間の半減期を有して、循環から取り除かれる（図２Ｊ）。ｒＴＭＤ１投与はＬＰＳクリアランスを増強した（図２Ｊ）。さらに、ｒＴＭＤ１（ＴＭＤ１Ａｂ）に対するウサギ多クローン性抗体を調製し、特徴付けをした。ＴＭＤ１ ＡｂによるｒＴＭＤ１の前処理は、ＬＰＳ誘発ＴＮＦ−α放出の抑制についての効果を逆転させる。このことは、炎症性メディエイタ産生についてのｒＴＭＤ１の抗炎症性効果は、ｒＴＭＤ１に特異性があることを示している。
【実施例４】
【００５１】
ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌誘発炎症性応答および死亡率を減少させ、およびバクテリアクリアランスを増強させる。
【００５２】
ＴＭＤ１がグラム陰性バクテリアによって発現された死亡を防御するかどうかを試験するために、肺炎桿菌をｉ．ｐ．注射することおよびｒＴＭＤ１で処置することによって全身性の敗血症を複数マウスに誘発した（図３Ａ−Ｃ）。ＴＮＦ−αおよびＮＯレベルは、肺炎桿菌（５×１０２ ＣＦＵ）を受けた複数マウスにおいて１２時間以内に増大した。ｒＴＭＤ１処理（５−２５ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）は、効果的にＴＮＦ−αおよびＮＯ産生を減少させる（図３Ａ−Ｂ）。生存実験のために、肺炎桿菌（５×１０３ＣＦＵ）を受けた全ての複数マウスが、１８時間以内に死亡したが、一方ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の単一ｉ．ｖ．投与量を受けた複数マウスの５０％は、２４時間を超えて生存した（図３Ｃ）。肺炎桿菌に誘発された死亡率の影響が、バクテリアクリアランスを促進させたｒＴＭＤ１に起因するかどうかを探索するために、血液中の生存可能なバクテリアの量を求めた。ＦＶＢ複数マウスに肺炎桿菌（５×１０２ＣＦＵ）を、ｒＴＭＤ１処理（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を含まないか、または含んでそれぞれｉ．ｐ．注射した。ｒＴＭＤ１は、注射１２、２４、３６時間後に、循環における肺炎桿菌クリアランスを著しく増強した（図３Ｄ）。ｒＴＭＤ１が治療能力を有することを示すために、ｒＴＭＤ１をバクテリア感染の後に注入した。時系列の実験において、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を肺炎桿菌のｉ．ｐ．投与３０分後または６０分後に直ちに（１分間以内）ｉ．ｖ．投与した。この結果は、ｒＴＭＤ１が肺炎桿菌誘起ＴＮＦ−α放出を効果的に抑制し得ること（図３Ｅ）、およびｒＴＭＤ１の３０分後または６０分後処置においてさえも、感染１２、２４および３６時間後において、循環における肺炎桿菌クリアランスを増強させることを示した（図３Ｆ）。ｒＴＭＤ１の不存在下で肺炎桿菌に感染した複数マウスは、４２時間後に死亡し始めた。しかしながら、全てのｒＴＭＤ１処置群において生存率は改善された。
【実施例５】
【００５３】
ｒＴＭＤ１のグラム陰性バクテリアおよびＬＰＳとの直接結合、および膜結合ＴＭのＬＰＳとの直接結合。
【００５４】
ＴＭＤ１が、グラム陰性バクテリアおよびＬＰＳに特異的に結合する能力があるかどうかを試験するために、ｒＴＭＤ１およびｒＴＭＤ２３を、肺炎桿菌、ＬＰＳまたはＢＳＡと結合させるために使用した。ｒＴＭＤ２３ではなくて、ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌に特異的に結合すると予想される（図４Ａ）。ｒＴＭＤ１はグラム陰性バクテリアに結合すると予想されるので、グラム陰性バクテリアのＬＰＳは、可能性のある候補リガンドと考えられる。適切に、ＬＰＳまたはＢＳＡへのｒＴＭＤ１およびｒＴＭＤ２３を測定した。ｒＴＭＤ２３ではなくてｒＴＭＤ１がＬＰＳに特異的に結合（図４Ｂ）し、結合はマンノースおよびＥＤＴＡによって抑制される。このことは、ＴＭＤ１炭水化物認識ドメインが、Ｃａ２＋に依存したやりかたでＬＰＳ炭水化物と相互作用したことを示している（図４Ｃ）。図４Ｂから、ＬＰＳのｒＴＭＤ１との結合の５０％飽和から概算された見掛けのＫｄは、約１．６×１０−６モル／Ｌであった。また、ＬＰＳは、ｒＴＭＤ１を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用した８．２４×１０−６モル／Ｌから９．０１×１０−８モル／Ｌの範囲の濃度に依存したやりかたでＫｄに結合する。ＬＰＳへのｒＴＭＤ１の結合は、おそらく、ＬＰＳのＬＰＳ結合分子との相互作用を遮断するであろうと考えられ、このＬＰＳへのｒＴＭＤ１の結合がＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびシグナル伝達経路を遮断する。図４Ｄに示す通り、ＬＰＳへのＣＤ１４の結合は、投与量に依存したやりかたでｒＴＭＤ１によって抑制されるが、ＬＰＳへのＬＰＳ結合タンパク質の結合は、ｒＴＭＤ１によって抑制されなかった（データは示されていない）。ｒＴＭＤ１が相互作用するように、内因性のＴＭＤ１がＬＰＳと特異的に相互作用し得るかどうかを探索するために、内因性の膜結合ＴＭ１４、および過剰発現されたフルレングスまたはレクチン様ドメイン欠失膜結合ＴＭ１７，２９を設計して、ＬＰＳ結合能力を試験した。この結果は、ＴＨＰ−１細胞上に発現された膜結合ＴＭは、ビオチニル化されたＬＰＳを結合すると予想されることを示した。さらに、レクチン様ドメイン欠失膜結合ＴＭではなく、フルレングスＴＭは、ビオチニル化されたＬＰＳを結合すると予想される。これらの結果は、膜固定ＴＭは、ＴＭのＮ末端レクチン様ドメインを介してＬＰＳを結合すると予想されることを示す。
【実施例６】
【００５５】
ｒＴＭＤ１は、グラム陰性バクテリアの凝固を誘発し、ＴＨＰ−１細胞におけるバクテリアの食菌作用を増強する。
【００５６】
ＴＭＤ１は、炭水化物リガンド１７に結合することによって細胞−細胞間の癒着を媒介し、ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳおよび肺炎桿菌（それぞれ、図２Ｊおよび３Ｄ）のクリアランスにおいて機能するので、もしバクテリアの表面上の炭水化物機能基がＴＭのリガンドから構成されとすれば、ｒＴＭＤ１が、バクテリアの結合およびバクテリアを食菌する作用に関与し得ることは自明のことと思われた。ｒＴＭＤ１結合特異性を、ＦＩＴＣ標識グラム陰性（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎桿菌）およびＥ．Ｃｏｌｉ（大腸菌））バクテリアとの凝固反応によってアッセイした。ｒＴＭＤ１（２０μｇ・ｍＬ）は、肺炎桿菌および大腸菌ＤＨ５αの著しい凝固を誘発した（図５Ａ）。さらに、凝固活性は、Ｃａ２＋依存性であり、マンノースおよびＥＤＴＡ（図５Ａ）によって減衰される。ｒＴＭＤ１タンパク質における、Ｈｉｓ／ｃ−Ｍｙｃ標識の可能性のある干渉効果を除外するために、非標識ｒＴＭＤ１を調製して、試験を実施した。非標識ｒＴＭＤ１は、ｒＴＭＤ１と同様な効果を示し、一方標識ｒＴＭＤ２３は、凝固を産生できなかった。同様な結果が、哺乳動物発現ｒＴＭＤ１を使用することによって得られた（図５Ａ）。活性化されたＴＨＰ−１細胞による、ＦＩＴＣ−標識肺炎桿菌の食菌作用に関するｒＴＭＤ１の効果をアッセイした。ｒＴＭＤ１は、ＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを食菌する作用の量を著しく増大した。それ故、ｒＴＭＤ１は、バクテリア誘発炎症性反応と干渉するだけでなく、またバクテリアの凝固を誘発しマクロファージによる食菌作用を促進する。
【実施例７】
【００５７】
ｒＴＭＤ１のリガンド特異性の確認およびＨＭＧＢ１−ｒＴＭＤ１結合に関するＬｅｙの非競合効果。
【００５８】
ｒＴＭＤ１のリガンド特異性を確認するために、炭水化物リガンド（図６Ａ）のパネルを、アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、ｒＴＭＤ１親和性に対して試験した。この結果は、Ｌｅｙ抗原は、哺乳動物発現ｒＴＭＤ１またはピキア発現ｒＴＭＤ１に対する特異性リガンドであることを示した（図６Ａ）。Ｌｅｙは、ｒＴＭＤ１のＬＰＳとの結合を、投与量に依存するやりかたで特異的に抑制した（図６Ｂ）。このことは、ｒＴＭＤ１の炭水化物結合部位は、ＬＰＳとの相互作用に関与していたことを示す。ＥＬＩＳＡは、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ＬＰＳが、ｒＴＭＤ１の結合特異性と一致して、ＬｅａおよびＬｅｂ抗原よりもＬｅｘおよびＬｅｙ抗原を含むことを示した（図６Ｃ）。さらに、Ｌｅｙは、投与量に依存して、ＬＰＳ誘発ＥＲＫ１／２リン酸化、ＩкＢα分解、および、ＮＦ−кＢ ｐ５０およびｐ６５核転座に関する、ｒＴＭＤ１の遮断効果を中和することが予想できる（図６Ｄ）。ＨＭＧＢ１のｒＴＭＤ１との結合に関するＬｅｙの効果を観察するための実験を、ＬＰＳ／Ｌｅｙ−ｒＴＭＤ１相互作用がＨＭＧＢ１−ｒＴＭＤ１相互作用と干渉し、したがって、ＬＰＳ／ＬｅｙおよびＨＭＧＢ１がＴＭＤ１上でオーバーラップするかどうかを検証するために実施した。この結果は、Ｌｅｙは、ＨＭＧＢ１およびｒＴＭＤ１相互作用を阻害しないと予想されることを示し、このことは、ＨＭＧＢ１相互作用を媒介する、ＴＭＤ１の構造ドメインは、ＬＰＳ／Ｌｅｙとオーバーラップしないことを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン、ならびにルイスＹ抗原に関連した疾患または障害の予防および／または治療のためのこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性生物体によって誘発される過剰な宿主免疫応答から生じる敗血性ショック症候群は、入院患者の主要な死因である。敗血症における病態生理学的変化は、免疫細胞、特に単球およびマクロファージからの、一酸化窒素、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびインターロイキン（ＩＬｓ）を含む前炎症性メディエイタの、病原体に誘発された制御不能な放出に関係がある。グラム陰性バクテリアの感染は、グラム陰性バクテリア外膜のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）成分による、全身性のバクテリア性敗血症の主要な要因の１つである。ＬＰＳは、前炎症性メディエイタの急速な増加を誘発し、致死性の全身性の組織損傷および多臓器不全をもたらし、これは敗血性症候群の炎症性応答によく似ている。
【０００３】
哺乳動物において、膜結合ＣＤ１４およびＴｏｌｌ様レセプタ４（ＴＬＲ４）−ＭＤ−２は、ＬＰＳの細胞認識に関与する。ＴＬＲ４レセプタへのＬＰＳの結合は、ｐ３８、ｐ４２／ｐ４４細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）およびｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を含むミトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の要素の、活性化を誘発する。休止において、刺激されていない細胞、核因子（ＮＦ）−кＢ、５０−および６５−ｋＤａ（ｐ５０／ｐ６５）タンパク質サブユニットから成るヘテロ二量化複合体は、細胞質中で抑制性кＢα（ＩкＢα）に結合された不活性複合体として維持される。細胞がＬＰＳによる前炎症性の刺激下にある間に、ＩкＢαのリン酸化および分解は、ＮＦ−кＢα核転座を可能にし、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、ＴＮＦ−αおよびその他を含む炎症性遺伝子の発現を促進する。
【０００４】
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、６個の表皮成長因子（ＥＧＦ）様構造（Ｄ２）、Ｏ−グリコシル化部位に富むドメイン（Ｄ３）、膜内外ドメイン（Ｄ４）、および細胞質尾ドメイン（Ｄ５）が付随するＮＨ２末端レクチン様ドメイン（Ｄ１）を含む、５５７アミノ酸Ｉタイプグリコシル化膜内外タンパク質である。（Ｗｅｉｌｅｒ，Ｈ．等、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ２００３Ｊｕｌ．；１（７）：１５１５−２４）。Ｄ２ ＥＧＦ様構造は、トロンビンの基質特異性の変化を介して、ＴＭの抗血液凝固活性を担っている。ＴＭドメイン２（ＴＭＤ２）−トロンビン複合体は、抗血液凝固タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）を活性化し、これはまた前血液凝固（プロコアギュラント）補助因子ＶａおよびＶＩＩＩａを不活性化する。一方、ＴＭ発現は、ケラチノサイト、多形核好中球（ＰＭＮｓ）、単球および内皮細胞を含む細胞タイプにおいて生じ、ＴＭは、抗凝固に加えて、生物学的機能を有する可能性があることを示唆している。また、ＴＭの異なる生物学的機能も存在し得る。ＴＭドメインは、タンパク質Ｃに依存した機構および自律的な機構によって、脈管形成因子および抗炎症薬剤として機能する。最近、ＴＭドメイン１（ＴＭＤ１）の抗炎症活性が示唆された。というのは欠失ＴＭレクチン様ドメインを有する複数マウスは、ＮＦкＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路を介した癒着分子発現の抑止によって、ＬＰＳを伴う攻撃を受け易くなるからである（Ｃｏｎｗａｙ，Ｅ．Ｍ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２ Ｓｅｐ．２；１９６（５）：５６７−７７；米国特許第７３４１９９１２号）。さらに、ＴＭＤ１は、進行したグリケーション最終生成物（ＲＡＧＥ）に対するレセプタへの、ＨＭＧＢ１の結合を妨害することによって、高可動性群Ｂ１（ＨＭＧＢ１）タンパク質、致死性内毒症および致死性敗血症の後発生サイトカインメディエイタを封鎖することが示された（Ａｂｅｙａｍａ，等、Ｊ．Ｃｌｉ．Ｉｖｅｓｔ．２００５Ｍａｙ；１１５（５）１２６７−７４．Ｅｐｕｂ．２００５Ａｐｒ．１４）。また、ＴＭＤ１は補体活性化を妨げ、関節炎を防ぐ。
【０００５】
ＴＭＤ１は、Ｃａ２＋依存炭水化物レセプタドメインから一般に構成される、哺乳動物のＣタイプレクチンに対して、構造的に相同性である。異なるＣタイプレクチンは、細胞癒着、エンドサイトーシスおよび病原体中和を含む種々の生物学的機能に寄与し、先天性免疫系において重要な役割を果たす。
【０００６】
上皮由来の腫瘍の７０％に過剰発現されるルイスＹ抗原は、血液タイプに関連したジフコシル化オリゴサッカライドのファミリーの一員である（Ｋｕｅｍｍｅｌ，Ａ．等、Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２００７；２８：３４０−３４９）。上皮由来に由来した腫瘍には、乳房、膵臓、卵巣、結腸、胃または肺の癌が含まれる。ルイスＹ発現腫瘍の高い頻度、腫瘍細胞表面のこの高い密度および変性された発現、ならびに原発性および転移性病変におけるこの比較的相同な発現は、乳癌を含んだ上皮腫瘍の範囲に対する抗原的標的としての、腫瘍の選別につながっている。（Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｊ．Ａ．等、ＰＡＮＡＳ，２００５；１０２（５２）：１９０５１−１９０５６；
Ｓｃｈｌｉｍｏｋ，Ｇ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：１７９９−１８０３，１９９５；Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７：４７８−４８４，１９９９）。ルイスＹ抗原を認識する抗体は、Ｌｅｙを発現する癌腫を除去すると予想される（Ｋｅｒｒｉｅ Ｃｌａｒｋｅ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６，３６２１−３６２８，２０００；Ｅｒｗｉｎ Ｒ．Ｂｏｇｈａｅｒｔ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０，４５３８−４５４９，２００４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７３４１９９１２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｏｎｗａｙ，Ｅ．Ｍ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２ Ｓｅｐ．２；１９６（５）：５６７−７７．
【非特許文献２】Ａｂｅｙａｍａ，等、Ｊ．Ｃｌｉ．Ｉｖｅｓｔ．２００５Ｍａｙ；１１５（５）１２６７−７４．Ｅｐｕｂ．２００５Ａｐｒ．１４．
【非特許文献３】Ｋｕｅｍｍｅｌ，Ａ．等、Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．２００７；２８：３４０−３４９．
【非特許文献４】Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｊ．Ａ．等、ＰＡＮＡＳ，２００５；１０２（５２）：１９０５１−１９０５６．
【非特許文献５】Ｓｃｈｌｉｍｏｋ，Ｇ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：１７９９−１８０３，１９９５．
【非特許文献６】Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７：４７８−４８４，１９９９．
【非特許文献７】Ｋｅｒｒｉｅ Ｃｌａｒｋｅ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６，３６２１−３６２８，２０００．
【非特許文献８】Ｅｒｗｉｎ Ｒ．Ｂｏｇｈａｅｒｔ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０，４５３８−４５４９，２００４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体を含む、ルイスＹ抗原過剰発現から生じる疾患の予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳおいて過剰発現されたルイスＹ抗原を検出するための、トロンボモジュリンの標識されたＮ末端レクチン様ドメインまたはこの標識された類似体を含むキットを提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、被検者からの試料において、ルイスＹ抗原を過剰発現する腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳを検出する方法も提供し、前記方法は、試料を、標識されたトロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの標識された類似体を含む組成物と接触させるステップを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体を含む、ルイスＹ抗原過剰発現から生じる疾患の治療用の医薬組成物を提供する。提示されたルイスＹ抗原は、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳにおいて発現される。この実施形態において、腫瘍細胞は、乳房、膵臓、卵巣、結腸、胃および肺癌から選択された、上皮由来の腫瘍である。また、この組成物は、ルイスＹ抗原を過剰発現する腫瘍を予防および治療する。
【００１３】
本発明において、ＴＭＤ１はＬＰＳに結合し、凝固作用を誘発し、ならびにマクロファージによるバクテリア食菌作用を増強することが発見されている。ＴＭＤ１は、グラム陰性バクテリアによって誘発される敗血症の全身性炎症の早期における抗炎症性因子として機能することが実証される。さらに、ＴＭＤ１は、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などのスムースタイプ（ｓｍｏｏｔｈ−ｔｙｐｅ）ＬＰＳを運搬するバクテリア、重要なグラム陰性病原体と特異的に相互作用すること、および、ＬＰＳへの結合、下流シグナル形質導入を遮断することによって、ＬＰＳおよび肺炎桿菌誘発炎症性応答および死亡率を減衰させることが示される。したがって、ＴＭＤ１は、ＬＰＳの中和における重要な保護機能を有することができ、敗血性ショック症候群および他の炎症性疾患状態の治療において治療的に有用である。また、マクロファージにおけるＴＭの生物学的機能も提示される。
【００１４】
本発明は、ＴＭがグラム陰性バクテリア媒介敗血症を保護することを示す。トロンボモジュリンＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）は、ルイスＹ抗原およびＬＰＳに結合し、ＬＰＳ誘発炎症性応答を抑制する。さらに、ＴＭＤ１は、大腸菌および肺炎桿菌を凝固させ、これらのグラム陰性バクテリアの食菌作用を増強する。ＴＭＤ１の投与は、ＬＰＳおよびグラム陰性バクテリアによって誘発された敗血症における、炎症性応答を抑制することにより宿主を保護する。それ故、組換えタイプＴＭＤ１は、敗血症の過激な炎症の治療において、とりわけグラム陰性バクテリアによって生じる感染において有用であり得る。
【００１５】
好ましい実施形態において、炎症性応答は、ＬＰＳまたはグラム陰性バクテリアによって誘発された敗血症である。さらに好ましい実施形態において、グラム陰性バクテリアは、大腸菌または肺炎桿菌である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｂ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｃ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｄ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｅ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｆ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図１Ｇ】ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図。
【図２Ａ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｂ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｃ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｄ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｅ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｆ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｇ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｈ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｉ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図２Ｊ】ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。
【図３Ａ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｂ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｃ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｄ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｅ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図３Ｆ】ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。
【図４Ａ】ｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。
【図４Ｂ】ｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。
【図４Ｃ】ｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。
【図４Ｄ】ｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。
【図５Ａ】ＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを凝固する作用およびバクテリアを食菌する作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示す図である。
【図５Ｂ】ＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを凝固する作用およびバクテリアを食菌する作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示す図である。
【図５Ｃ】ＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを凝固する作用およびバクテリアを食菌する作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示す図である。
【図６Ａ】アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。
【図６Ｂ】アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。
【図６Ｃ】アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。
【図６Ｄ】アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。
【００１７】
図１はＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびＬＰＳ誘発シグナル伝達に関する組換えタイプＭＴＤ（ｒＴＭＤ）タンパク質の効果を示す図である。（ＡおよびＢ）ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)からのｒＴＭＤタンパク質および哺乳動物のタンパク質を、ＲＡＷ２６４．７細胞に添加する前に前培養させた。６時間培養の後に、培地を（Ａ）ＴＮＦ−αおよび（Ｂ）ＮＯの測定のために収集した。ｍＴＭＤ１は、哺乳動物タンパク質発現系からのｒＴＭＤ１を表す。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。ＬＰＳ処理培養と比較して、ＡおよびＢ、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＰＢＳ群と比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＬＰＳの種々の量を、ＲＡＷ２６４．７細胞においてＴＮＦ−α産生を誘発させるために使用し、ｒＴＭＤ１の効果を測定した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）である。ＬＰＳ処理群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＩкＢα（Ｄ）、核分画における、ＬＰＳで誘発されたＩкＢαのリン酸化および分解（Ｄ）、ＮＦ−кＢｐ５０およびｐ６５の核転座（Ｅ）、ＥＲＫ１／２およびｐ３８リン酸化（Ｆ）、およびｉＮＯＳ発現（Ｇ）をアッセイするためにウエスタンブロッティングを使用した。全ての結果は、少なくとも３つの独立した実験で得られた結果をよく表している。
【００１８】
図２は、ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳで誘発された炎症性の応答および死亡率を低下させること、ＬＰＳに誘発されたＰＭＮｓの肺性蓄積および腎障害を減少させること、およびインビボのＬＰＳクリアランスを増大させることを示す図である。（ＡおよびＢ）ｒＴＭＤ１は，ＬＰＳのｉ．ｐ．注射（２０ｍｇ／ｋｇ）の前にｉ．ｖ．投与された。（Ａ）ＴＮＦ−αおよび（Ｂ）ＮＯ産生のアッセイのために、ＬＰＳ投与の６時間後に血清を集めた。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝１０）である。ＬＰＳ処理群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＰＢＳ処理群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された肺の切開面の代表的な顕微鏡像を示す。（Ｄ）それぞれの肺胞において、浸潤したＰＭＮの数を光学顕微鏡によって観察した（倍率６３０×）。それぞれの実験マウスについて、スライドガラス１枚当り４つの任意の区域からＰＭＮの数を数え、ＰＭＮの数をそれぞれのスライドガラス上の肺胞数の区域に基準化した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝１０）である。ＬＰＳ処理群と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＰＢＳ処理群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１。これらのグラフは、３つの独立した実験からの結果を表す。（Ｅ，Ｆ，およびＧ）複数マウス中へのＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）ｉ．ｐ．注射の前に、ｒＴＭＤ１（５および２５ｍｇ／ｋｇ）を、ｉ．ｖ．投与した。１２時間後に、複数マウスを犠牲にし、腎臓組織を取り出した。腎臓切開面を、組織学的ヘマトキシレンおよびエオシン染色によって観察した。代表的な顕微鏡像を示す。（Ｅ）腎性障害のｒＴＭＤ１抑制。矢印先端は、糸球体の部位を示す（スケールバーは５０μｍ）。ｒＴＭＤ１は、複数マウス血清中の腎性障害マーカＢＵＮ（Ｆ）およびクレアチニン（Ｇ）のレベルを低下させた。それぞれの実験群に対して、ｎ＝４；ＬＰＳで処理されていない対照複数マウスと比較して＃＃＃Ｐ＜０．００１。ＬＰＳ処理対照複数マウスと比較して＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。これらのグラフは、３つの独立した実験からの結果を示す。（Ｈ）複数マウスは、ＬＰＳ（４０ｍｇ／ｋｇ）およびｒＴＭＤ１（ＬＰＳ注射の、０、６、１２および２４時間後に２ｍｇ／ｋｇの４回の投与量）を受けた。生存数を求めた。それぞれの実験群に対して、ｎ＝２０。ＬＰＳ処理群と比較して、＊＊＊Ｐ（Ｉ）＜０．００１。（Ｉ）循環におけるｒＴＭＤ１のクリアランス。それぞれ、循環におけるｒＴＭＤ１の半減期はｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の注射によって求め、また血清中のｒＴＭＤ１のレベルは、捕捉および検出抗体として抗−ｃ−ＭｙｅおよびＴＭ−Ｈ３００を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝５）。（Ｊ）ｒＴＭＤ１処理を伴わないか、または伴った循環におけるＬＰＳのクリアランス。ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）を、雄ＦＶＢ複数マウスに、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を伴わないか、または伴ってｉ．ｐ．投与し、血清試料を、種々の時間間隔において収集し、ＬＰＳの量をリムルス(Ｌｉｍｕｌｕｓ)アメーバ様細胞溶解産物試験によって求めた。数値は、平均値±ＳＤ。それぞれの時間間隔群に対して、ｎ＝５；ＬＰＳ処理複数マウスと比較して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００１９】
図３はｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌で誘発された炎症性応答および死亡率を低下させ、およびバクテリアのクリアランスを増強させることを示す図である。（ＡおよびＢ）ｒＴＭＤ１を、複数マウスへの肺炎桿菌（５х１０２ＣＦＵ／マウス）の注射の前に投与した。血清を、（Ａ）ＴＮＦ−αおよび（Ｂ）ＮＯ産生のアッセイのために肺炎桿菌の投与１２時間後に収集した。肺炎桿菌処理群と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＰＢＳ処理群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を、複数マウスへの肺炎桿菌（５×１０３ＣＦＵ／マウス）の注射の前に投与した。生存率を求めた。それぞれの実験群に対して、ｎ＝２０。肺炎桿菌処理群と比較した＊＊＊Ｐ＜０．００１。これらのグラフは、３つの独立した実験からの結果を表す。（Ｄ）循環においてｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌クリアランスを増強した。ＦＶＢ複数マウスに、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を伴わないか、または伴って肺炎桿菌（５×１０２ＣＦＵ／マウス）をｉ．ｐ．注射した。それぞれの群からの血液試料を種々の時間間隔において収集し、生存可能なバクテリアをＣＦＵ計数するためにアッセイした。数値は、平均値±ＳＤ。それぞれの時間間隔群に対して、ｎ＝５；肺炎桿菌処理複数マウスと比較して、＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）（Ｆ）ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を、複数マウスに肺炎桿菌（５х１０２ＦＵ／マウス）を注射した３０または６０分後に、直ちに投与した。ＴＮＦ−αの血清レベルおよび肺炎桿菌クリアランス（Ｆ）を求めた。数値は、平均値±ＳＤ。それぞれの時間間隔群に対して、ｎ＝８−１０；それぞれの時間間隔群の肺炎桿菌処理複数と比較して、＊Ｐ＜０．００５および＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＰＢＳ処理群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１。同様の結果が２つの独立した実験において得られた。
【００２０】
図４はｒＴＭＤタンパク質の肺炎桿菌およびＬＰＳとの結合、およびＬＰＳへのＣＤ１４の結合に関するｒＴＭＤ１の遮断効果を示す図である。（Ａ）肺炎桿菌またはＢＳＡ。
（Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳまたはＢＳＡ。（ＡおよびＢ）肺炎桿菌、ＬＰＳまたはＢＳＡをウエル上にコートした。ｒＴＭＤタンパク質の等モル量をそれぞれのウエルに添加した。ｒＴＭＤタンパク質の結合を検出した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝６）。ｒＴＭＤ２３添加群およびＢＳＡコート群と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＬＰＳをウエル上にコートし、０．２Ｍマンノースまたは５ｍＭ ＥＤＴＡの、不存在下および存在下において、ＣａＣｌ２を含む結合バッファー中でｒＴＭＤ（５０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。結果は、結合バッファー群（１００％）で基準化した相対吸光度の百分率として表す。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝６）。この結合バッファー群と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１。示された結果は、少なくとも３つの独立した実験において得られた結果の典型的なものである。（Ｄ）ＬＰＳに対するＣＤ１４の結合のｒＴＭＤ１封鎖。ＬＰＳをウエル上にコートし、ｒＴＭＤ１およびＣＤ１４の指示された濃度でインキュベートした。ＬＰＳに対するＣＤ１４の結合を、ＣＤ１４抗体（Ｍ−３０５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して検出した。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）、ＣＤ１４だけを受けた群と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。同様の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【００２１】
図５はＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを凝固する作用およびバクテリアを食菌する作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示す図である。（Ａ）ＦＩＴＣ標識肺炎桿菌およびＦＩＴＣ標識ＦＩＴＣ標識大腸菌ＤＨ５αを、５ｍＭＣａＣｌ２を含む結合バッファー中で、ならびに０．２Ｍマンノースおよび５ｍＭＥＤＴＡを含まないか、または含んで、ｒＴＭＤ１の不存在下または存在下でインキュベートした。蛍光的に標識されたバクテリアを、蛍光顕微鏡を使用して観察して、バクテリアの凝集作用を評価した。非標識ｒＴＭＤ１をエンテロキナーゼによるｒＴＭＤ１のインキュベーションによって調製し、Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｓ１に記載されている通りに精製した。また、哺乳動物発現ｒＴＭＤ１および標識ｒＴＭＤ２３を有する内部対照も包含されていた。顕微鏡写真は、これらの３つの独立した実験の代表的なものである。（Ｂ）代表的顕微鏡写真は、バクテリアの食菌作用に関するｒＴＭＤ１の効果を示している。分化したＴＨＰ−１細胞を、ｒＴＭＤ１前処理されたＦＩＴＣ標識肺炎桿菌によりインキュベートした。左のパネルは明るいドメイン像を示し、右のパネルは蛍光顕微鏡写真（スケールバーは２００μｍを表す）を示す。（Ｃ）（Ｂ）からの試料のＦＡＣＳ分析。このグラフは、ＦＩＴＣ蛍光（ｘ軸）のレベルに対して相対的細胞数（ｙ軸）を描いたものである。これらのグラフは、３つの独立した実験からの結果を表す。
【００２２】
図６はアルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）によるｒＴＭＤ１リガンドの分析、ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の抑制効果、および大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析を示す図である。（Ａ）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ結果。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）。哺乳動物発現ｒＴＭＤ１の糖結合特異性は、相対強度によって示される（最高の吸光度に関連して）。糖識別は、表に挙げた番号によって示される。ブランクに比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、４つの独立したアッセイの平均から得られた。同様の結果が、ピキア発現ｒＴＭＤ１を使用して得られた。（Ｂ）ＬＰＳとのｒＴＭＤ１の結合に関するＬｅｙ抗原の効果。ＬＰＳをウエル上にコートし、種々の濃度のＬｅｙおよびｒＴＭＤ１をそれぞれのウエルに添加した。ｒＴＭＤ１の結合は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）として発現され、ｒＴＭＤ１単独群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１。同様の結果が、２つの独立した実験において得られた。（Ｃ）大腸菌ＬＰＳＯ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析。ＬＰＳ（５μｇ／ウエル）を高結合マイクロタイタープレートのウエルの上にコートした。Ｌｅａ、Ｌｅｂ、Ｌｅｘ、およびＬｅｙ抗体（５μｇ／ｍＬ）を結合バッファー中のそれぞれのウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートしてから、ペルオキシダーゼ標識した第二の抗体によって２時間培養した。ＬＰＳへのルイス抗体の結合は、４５０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって検出された。平均値±ＳＤ（ｎ＝４）。同様の結果が２つの独立した実験において得られた。（Ｄ）ＬＰＳ誘発シグナル伝達経路についての、ｒＴＭＤ１の抑制効果に関するＬｅｙの効果。ｒＴＭＤ１（２０μｇ／ｍＬ）および種々の濃度のＬｅｙを、細胞に添加する前にＬＰＳ（１００ｍｇ／ｍＬ）と共にプレインキュベートした。３０分間の培養の後に、ウエスターン ブロットを使用して、ＬＰＳ誘発ＥＲＫ１／２リン酸化、細胞質の区画におけるＩкＢαの分解、および、ＮＦ−кＢｐ５０およびＮＦ−кＢｐ６５の核転座を、アッセイした。同様の結果が２つの独立した実験において得られた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書では、「炎症」は、生存している組織の損傷に対する局所反応、とりわけ細い血管、これらの内容物、およびこれらの随伴する構造に対する局所反応を意味する。組織への、脈管壁を通した血液成分（血管外遊出）の通過が炎症の特徴である。一般に、炎症は、内皮壁への増強された白血球の癒着で始まり、組織または器官中への白血球の血管外遊出をもたらす。
【００２４】
実際に、バクテリア、過剰な熱、低温、粉砕などの機械的損傷、酸、アルカリ、照射により生存している組織に損傷を与えるいずれかの有害なプロセスまたはウイルスによる感染は、関与する器官または組織に関係なく炎症を起こし得る。動物およびヒトの疾患は、関節炎、皮膚炎、腹膜炎、虚血／再潅流障害（例えば、心臓、肝臓、腎臓、脳）を随伴する障害、炎症性肺障害（例えば、喘息、気管支炎、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）を含む）、脈管炎、アテローム性動脈硬化症、腎炎、皮膚創傷治癒、敗血症、および、局所および全身性感染症を含む「炎症性疾患」として分類されることは、明らかなはずである。
【００２５】
本明細書では、用語「グラム陰性バクテリア」は、グラム染色プロトコルにおいてクリスタルバイオレット染料を保持しないものである。グラム陽性菌は、アルコール洗浄の後に前記暗青色染料を保持する。グラム染色試験において、クリスタルバイオレットの後に、対比染料が添加され、この対比染料は全てのグラム陰性バクテリアを赤色またはピンク色に染める。この試験自体、バクテリア細胞壁の構造差に基づいて、バクテリアの２つの明確に異なるタイプを分類する際に有用である。グラム陰性バクテリアの多くの種は、病原性であり、グラム陰性バクテリアは宿主有機体の疾患を起こすことが可能であることを意味している。この病原性の能力は、通常、グラム陰性細胞壁のある種の成分、特にリポ多糖類（ＬＰＳまたはエンドトキシンとしても知られている)層に随伴している。
【００２６】
本明細書では、用語「凝固」は、粒子の凝集である。これは、生物学の場合に３つの主な例において生じる。１．抗体の存在下でバクテリアまたは赤血球などの細胞の凝集。抗体または他の分子は、多発性粒子と結合し、多発性粒子を接合する。２．溶液に懸濁されている小さい粒子の凝集。これらの大きい物質は、次いで（通常は）沈殿する。３．アレルギー性反応タイプ発生。この場合、細胞は異物が細胞に入るのを防止するために、より堅く締まる。これは、通常その細胞の周辺にある抗原の結果である。本発明のバクテリアの凝固は、マクロファージによるバクテリアを食菌する作用を促進する。
【００２７】
好ましい実施形態において、当該の疾患は、ＬＰＳまたはグラム陰性バクテリアにより誘発される敗血症である。この疾患または障害は、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）をＬＰＳまたはグラム陰性バクテリアに結合して、バクテリアの凝固またはオプソニン作用を誘発することによって予防または治療される。したがって、この疾患または障害は、マクロファージにおける、炎症性のメディエイタＴＮＦ−αまたはＮＯの、ＬＰＳで誘発された産生を減少させることによって、ならびにＬＰＳで誘発された炎症性の応答に関与したシグナル経路を抑制することによって予防または治療される。
【００２８】
さらに好ましい実施形態において、当該の疾患または障害は、相互作用ＴＭＤ１によって予防または治療される。ＴＭＤ１は、グラム陰性バクテリアに対する先天性の免疫性にとって、自然のオプソニン的機能基として機能する。オプソニン作用の誘発は、ＬＰＳまたは細胞膜中のルイスＹ抗原へＴＭＤ１を結合させることによってなされ、バクテリアの凝固の誘発は、マクロファージによるバクテリアを食菌する作用を促進する。これらの応答は、肺におけるＰＭＮ浸潤を軽減するか、または腎臓機能を維持する。ＬＰＳで誘発された炎症性応答に関与したシグナル経路は、ＥＲＫおよびＰ３８のリン酸化、ＩкＢの分解、およびＮＦ―кＢの転座、および、誘導性の一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびＴＮＦ−αの増大する発現を含む。さらに、この疾患または障害は、高移動性基Ｂ１（ＨＭＧＢ１）との相互作用ＴＭＤ１によって予防される。
【００２９】
また、本発明は、被験者からの試料においてルイスＹ抗原を過剰発現する、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳを検出する方法を提供し、前記方法は、次のステップを含む：試料を、標識されたトロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）、またはこの標識された類似体と接触させるステップ。好ましい実施形態において、ルイスＹ抗原を発現する腫瘍細胞は、乳房、膵臓、卵巣、結腸、胃および肺癌である。提示された試料は、被験者からの、血液、組織、体液、細胞または排出物から得られる。本発明の実施形態において、被験者は、哺乳動物である。本発明の好ましい実施形態において、被験者はヒトである。ＴＭＤ１における標識されたマーカまたはこの類似体は、蛍光分子、放射性分子、色素の分子、ビオチン、アクリジニウムエステルおよびアクリジニウム−９−カルボキサミドなどの検出可能なマーカである。
【００３０】
本明細書では、用語「被験者」は、医療の注目を受けるなんらかの動物である。特に、動物はヒトである。ヒトは、往々にして病気になったり、傷害を受けたりして、医師またの医療専門家による治療を必要とする。
【００３１】
本明細書では、用語「類似体」は、１つまたは２つ以上の個々の原子が、異なる原子で、または異なる官能基で置換された化合物である。生化学におけるこの用語のその他の使用は、別の物質に構造が類似している物質のことをいう。本明細書において使用される、ＴＭＤ１の類似体には、限定はしないがネズミを含む異なる動物からのＴＭのレクチンドメイン、ならびに突然変異など、および、ポリエチレングリコール化およびグリコシレーションなどの化学的変性などの、この分野の知識を有する技術者に知られている変性が含まれる。
【００３２】
本明細書では、用語「先天性免疫」は、宿主を他の有機体による感染から非特異的な方法で防御する、細胞およびメカニズムを含む。これは、先天性の細胞は包括的な方法で病原体を認識および応答し、しかし順応免疫系とは異なって、これは、宿主に対して長期にわたる、または保護的免疫を与えないことを意味する。先天性免疫系は、感染に対して即時の防御をもたらし、植物および動物の生命現象の全ての綱において見出される。
【００３３】
本明細書では、用語「オプソニン作用」は、例えば、膜上のマイナスに電荷された分子を被覆することにより、食菌作用のプロセスに対する結合エンハンサーとして作用するいずれかの分子作用である。食菌作用を実行する細胞の膜ならびにこの標的は、共にマイナス電荷（ゼータ電位）を有し、この２つの細胞の接近を困難にする。オプソニン作用のプロセスの間に、抗原は、抗体および／または補体分子によって結合される。食作用の細胞は、オプソニン分子を結合するレセプタを発現する。これらの分子により被覆された抗原により、食細胞への抗原の結合は、大きく増強する。ほとんどの食作用の結合は、抗原のオプソニン作用なしには生じ得ない。さらに、抗原のオプソニン作用、および引き続く活性化された食細胞への結合は、近傍の食細胞上の補体レセプタの発現を増大させる。オプソニン分子の例には、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体、および、補体系のＣ３ｂ、Ｃ４ｂおよびｉＣ３ｂ成分が挙げられる。
【００３４】
さらに、本発明は、標識されたトロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）、またはこの標識された類似体を含む、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳにおいて過剰発現されたルイスＹ抗原を検出するキットを提供する。
【実施例】
【００３５】
材料および方法
【００３６】
１． ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)および哺乳動物タンパク質の両方の発現系を使用した組換えタイプＴＭＤ（ｒＴＭＤ）の調製。
ｐＰＩＣＺαＡおよびｐＣＲ３−ＥＫベクターを、ヒトｒＴＭＤタンパク質の発現および分泌のために使用した。このヒトｒＴＭＤタンパク質は、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｔｏｒｉｓ）およびヒト胎芽腎臓 ２９３（ＨＥＫ２９３）哺乳動物タンパク質発現系において、精製のために、および、タンパク質検出のために６ＸＨｉｓ標識およびｃ−Ｍｙｃエピトープを含んでいる。簡潔に言うと、ＴＭＤ１（残余物Ａｌａ１−Ａｌａ１５５）、ＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３（残余Ａｌａ２２４−Ｇｌｕ３４６）、およびＴＭＤ２３（残余Ａｌａ２２４−Ｓｅｒ４９７）に対してコード化するｃＤＮＡ断片を、特異性プライマーを使用してヒト臍帯静脈内皮細胞のＰＣＲによって得た。構築物に対して使用したプライマーシーケンスは、以下の通りであった：ＴＭＤ（ＴＭＤ１−センス：配列番号２およびＴＭＤ−アンチセンス：配列番号２およびｒＴＭＤ１−アンチセンス：配列番号３）、ＴＭＤ２３（ＴＭＤ２−センス：配列番号４およびＴＭＤ３−アンチセンス：配列番号５）、およびＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３（ＴＭＤ２−センスおよびＴＭＤ２／ＥＧＦ３−アンチセンス：配列番号６）。ｒＴＭＤシーケンスとＨｉｓ／ｃ−Ｍｙｃ標識の間のエントロキナーゼ切断部位は、引き続いて起こる標識シーケンスの除去を可能とする。発現されたｒＴＭＤタンパク質を含む、酵母発酵媒体またはＨＥＫ２９３細胞条件付け媒体は、ニッケルキレート化セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用し、ｒＴＭＤ含有分画をイミダゾール傾斜方法で溶離した。精製されたｒＴＭＤタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスターンブロッティングによって検査し、質量分光分析によるタンパク質同定によって確認した。また、ｒＴＭＤタンパク質のＮ末端アミノ酸シーケンスもモデル４７７Ａシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によるＥｄｍａｎ分解によって決定した。融合ペプチドを含むｒＴＭＤの分子量は、タンパク質濃度計算用のＥｘＰＡｓｙ ウエブサイトを使用して予測した（ｒＴＭＤ１：２２，９０２ダルトン、ｒＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３：１６，４７３。ダルトンおよびｒＴＭＤ２３：３２，８２３ダルトン）。非標識ｒＴＭＤを、５ｎｇエンテロキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，ＭＡ）含有１ｍｇｒＴＭＤを、４℃において１６時間培養することによって調製した。培養の後に、試料をニッケルキレート化セファロースカラムに適用し、この非標識ｒＴＭＤ含有非結合分画を収集した。この試料を固定された大豆トリプシン抑制因子セファロースゲルでさらに処理して、残余のエンテロキナーゼを吸収した。それぞれの試料を、エンテロキナーゼ処理の前後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスターンブロットによって分析し、元の標識ｒＴＭＤ１より２０００ダルトン小さい分子量を有する非標識ｒＴＭＤ１を得た。
【００３７】
細胞および細胞培養。
ヒト白血病単球ＴＨＰ−１細胞およびネズミマクロファージ細胞をアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション（Ａｍｅｒｉｋａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得た。ＴＨＰ−１細胞を、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１％β−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％致死胎児血清（ＦＢＳ）で捕足された、ＲＰＭＩ−１６４０の懸濁液中で増殖させた。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１．５ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウムおよび４．５ｇ／ｌグルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳを含むように調整された、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ変性Ｅａｇｌｅ’ｓ媒体中で、給湿された５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃において、付着層として増殖させた。差別化のために、ＴＨＰ−１細胞を、１０ｎＭ ＰＭＡを含む媒体中でプレートとし、１８時間接着させた。
【００３８】
３． 炎症性のメディエイタアッセイ。
条件付けされた媒体またはマウス血清における、ＴＮＦ−αを酵素関連免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって測定した。媒体またはマウス血清定における亜硝酸塩の蓄積は、Ｇｒｉｅｓｓ 試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して比色分析によって求めた。血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニンを、Ｒｏｃｈｅ Ｄ＆Ｐモジュラー（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ）により測定した。
【００３９】
４． ウエスターン ブロッティング。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＬＰＳ（ＬＰＳ Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含まないか、または含んで、ルイスＹ（Ｌｅｙ；ＤｅｘｔｒａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）の不存在下または存在下で３０分間プレインキュベートされた、ｒＴＭＤ（０−５０μｇ／ｍＬ、０−２．１８ｎモル／ｍＬに等しい）を使用してＴＨＰ−１またはＲＡＷ２６４．７細胞を刺激した。インキュベーション期間は、ｐＩкＢおよびＩкＢ（他に指示がなければ、Ｂ−９およびＣ−２１，ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ，ＣＡ，）、ｐ３８（Ｃ−２０）およびｐｐ３８（Ｄ−８）に対して２０分間、ＥＲＫ１／２（Ｋ−２３）、ｐＥＲＫ１／２
（Ｅ−４）、ラミン（ｌａｍｉｎ）Ｂ２（Ｅ−３、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、ＣＡ)、ＮＦ−кＢｐ５０（Ｃ−１９）およびＮＦ−кＢｐ６５核転座（Ｃ−２０）に対して３０分間、および特異性抗体（Ｎ−２０）を使用したｉＮＯＳ発現に対して２４時間であった。
【００４０】
５． 動物および全身性敗血症モデル。
雄ＦＶＢ複数マウス（生後８−１０週間）を使用して、インビボで敗血症をモデルした。Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｎｇ Ｋｕｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙが方法を承認した。慢性の内毒血症モデルにおいて、等モル量で、種々の濃度のｒＴＭＤ１またはｒＴＭＤタンパク質を尾部静脈（ｉ．ｖ．）注射によって投与し、ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）または肺炎桿菌（５×１０２ＣＦＵ／マウス、ＢＣＲＣ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与した。６または１２時間後に、複数マウスをペントバルビタール麻酔（５０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）によって犠牲にした。血清を収集し、ＴＮＦ−α、ＮＯ、ＢＵＮおよびクレアチニンに対してアッセイし、ならびに肺および腎臓組織を取り出し、ホルマリンで固定し、組織化学的検査のためにパラフィン中に包埋した。致命的な敗血症モデルにおいて、ｒＴＭＤ１（２ｍｇ／ｋｇ、８７．３ｎモル／ｋｇに等しい）をＬＰＳ（４０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与０、６、１２、および２４時間後に、ｉ．ｖ．投与した。循環におけるｒＴＭＤ１の半減期を、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ、４３６．６４ｎモル／ｋｇに等しい）のｉ．ｖ．注射によって求め、血清試料を種々の時間間隔で収集した。収集された血清中のｒＴＭＤ１のレベルを、捕捉および検出抗体（両者とも、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）として、アンチ−ｃ−Ｍｙｃモノクロナール抗体およびＴＭ−Ｈ３００をそれぞれ使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって求めた。致死性の菌血症に対してｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を、肺炎桿菌（５×１０３ＣＦＵ／マウス）の注射の前に投与した。死亡率率を、どの実験群においても全てのマウスが死亡するまで、６−１２時間毎に監視した。ＬＰＳ半減期を求める実験的方法は、以下の通りである。ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）を、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を含まないか、または含んで雄ＦＶＢｓ１０２にｉ．ｐ．投与した。血清試料を種々の時間間隔で収集し、ＬＰＳの量をリムルス(Ｌｉｍｕｌｕｓ)アメーバ様細胞溶解産物試験（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｅ．Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）によって求めた。さらに実験を実施して、ｒＴＭＤ１がバクテリア クリアランスに影響を与えるかどうかを確認した。肺炎桿菌（５×１０２ＣＦＵ／マウス）を、ＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を含まないか、または含んで雄複数マウスにｉ．ｐ．投与し、血清試料を種々の時間間隔で収集した。血液試料の順次希釈溶液を血液寒天板上で平板インキュベートとし、３７℃において終夜インキュベーションした後に、コロニーを数えることによって肺炎桿菌の外殖を定量した。
【００４１】
６．肺炎桿菌およびＬＰＳ結合アッセイ
重炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）の１００μＬ中の、肺炎桿菌（３×１０５ＣＦＵ／ウエル）、大腸菌Ｏ１１１スムースタイプＬＰＳ（５μｇ／ウエル）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、５μｇ／ウエル）を、高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のウエル上にコートした。非特異性結合を、５０ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む結合バッファー（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２）で遮断した。１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む結合バッファー中の、ＣＤ１４（１０μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含まないか、または含んだ種々の濃度のｒＴＭＤタンパク質をウエルに添加し、２時間インキュベートした。いくつかの実験において、ＬＰＳ結合およびｒＴＭＤ１結合と競合するために、０．２Ｍマンノース、５ｍＭ ＥＤＴＡ、またはＬｅｙを結合バッファー中に含ませた。抗体ｒＴＭＤタンパク質のｃ−Ｍｙｃエピトープに対する抗体をウエルに添加し、２時間インキュベーとし、ペルオキシダーゼ標識化した二番目の抗体を続いて添加した。ｒＴＭＤタンパク質の結合を４５０ｎｍを測定することによって検出した。
【００４２】
７．バクテリアの凝固に関するｒＴＭＤ１の効果
肺炎桿菌および大腸菌ＤＨ５α（ＢＣＲＣ）を、０．１Ｍ 重炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）０．１ｍｇ／ｍＬで２回洗浄し、暗所で３７℃において、０．ｍｇ／ｍＬフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）によりインキュベートした。ｒＴＭＤ１の２０μｇ／ｍＬのそれぞれを、非標識ｒＴＭＤ１、哺乳動物のｒＴＭＤ１、および組換えＴＭドメイン２および３（ｒＴＭＤ２３）を、バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中で、０．２Ｍマンノースまたは５ｍＭＥＤＴＡを含んで、または含まずに、ＦＩＴＣ標識バクテリア（１×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）によって共−インキュベートした。試料をガラススライド上に置き、蛍光的に標識されたバクテリアを顕微鏡的に観察して、凝固を評価した。
【００４３】
８．ＴＨＰ−１食菌作用アッセイ
ＦＩＴＣ標識肺炎桿菌（１×１０５ＣＦＵ／ウエル）を、分化したＴＨＰ−１細胞に添加する前に、３７℃で、３０分間プレインキュベートした。２時間インキュベーションした後に、ＴＨＰ−１細胞を蛍光顕微鏡検査の前に、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、またはさらにトリプシン化し、ＰＢＳ中に再懸濁させて、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析して、ＴＨＰ−１細胞内の蛍光を測定した。ログ（ｌｏｇ）スケールで５３０ｎｍにおいて収集された、条件当り１０，０００件（細胞）の緑色蛍光データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）により分析した。
【００４４】
９．ｒＴＭＤ１リガンド分析。
ビオチン−ポリアクリルアミド（ビオチン−ＰＡＡ）−糖（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ）、ｒＴＭＤ１、ウサギアンチマウス ＩｇＧ 抗体（Ｚｙｍｅｄ）、マウス、アンチ−６×Ｈｉｓ標識抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ならびに接合ストレプトアビジンをコートしたドナーおよびタンパク質Ａ接合アクセプタビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、２５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭＣａＣｌ２および１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むアッセイバッファーで、適切な濃度に希釈した。このアンチ−６×Ｈｉｓ標識抗体、ウサギアンチマウス ＩｇＧ 抗体、およびアクセプタビーズ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ならびにアクセプタビーズを使用（アクセプタ混合物として）前に、２５℃で１時間アッセイバッファーでインキュベートした。ビオチン−ＰＡＡ−糖 、ｒＴＭＤ１、およびドナービーズを、ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ−３８４アッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）のウエルに別々に添加し、２５℃で１時間インキュベートした。アクセプタの混合物のアリコートを次いでウエルに添加し、２５℃でさらに２時間インキュベートした。この結果をＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプログラムを使用して、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎの機器によって読み取った。全ての手法およびインキュベーションを暗所で実施した。
【００４５】
１０．大腸菌ＬＰＳ Ｏ１１１：Ｂ４におけるルイス抗原の分析。
大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ＬＰＳ（５μｇ／ウエル）を高結合マイクロタイタープレートのウエル上にコートした。５０ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む結合バッファーにより特異性結が遮断された後に、ルイスａ(Ｌｅａ)、ルイスｂ(Ｌｅｂ)、ルイスＸ(Ｌｅｘ)、およびＬｅｙに対する種々の抗体（Ａｂｃａｍ）の５μｇ／ｍＬを、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む結合バッファーと共にウエルに添加し、および、ヤギアンチマウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役ＩｇＧまたはＩｇＭにより３７℃で２時間インキュベートする前に、２７℃で２時間インキュベートした。このペルオキシダーゼ反応を、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用して実施し、２ＮＨ２ＳＯ４によって停止した。この産物を４５０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって検出した。
【００４６】
１１．統計的分析
生存データをログ−ランクによって分析した。データを平均値±標準偏差（ＳＤ）として表した。統計的有意性を非対性スチューデント ｔ 検定によって分析した。２つを超える群の間の差異を分散の一方向分析または分散の二方向分析、および以下の多重比較検定によって比較した。この場合、Ｐ＜０．０５は統計的に有意と考えられる。
【実施例１】
【００４７】
ｒＴＭＤ１処理は、マクロファージにおけるＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生を減少させる。
【００４８】
ＴＭＤ１が抗炎症性特性を有するかどうかを試験するために、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）および哺乳動物のタンパク質発現系の両方を使用することによってｒＴＭＤタンパク質を調製した。両方の系から得られたこのｒＴＭＤタンパク質は、糖鎖形成変性の状態で同様な分子量を有した。この分子量は、約３５キロダルトン（ｋＤａ）であり、銀染色およびウエスターン ブロッテイングによってアッセイされる通りであった。ＬＰＳにより刺激されたＲＡＷ２６４．７およびＴＨＰ−１細胞におけるｒＴＭＤタンパク質の抗炎症性効果を最初に試験した。ＥＧＦ様ドメイン１、２，３を含む組換えＴＭＤ２（ｒＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３）ではなく、ピキア発現ｒＴＭＤ１は、投与量に依存して、ＬＰＳにより刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞中のＴＮＦ−α産生を抑制した（図１Ａ）；同様な結果が、ＴＨＰ−１細胞において得られた（データは示されていない）。同様に、ｒＴＭＤ１だけが、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯ産生を効果的に抑制し得る（図１Ｂ）。；同様な結果は、哺乳動物発現ｒＴＭＤ１を使用して得られた（図１Ａ−Ｂ）。ｒＴＭＤ１による、ＬＰＳ誘発炎症性メディエイタの減少がＬＰＳ−ｒＴＭＤ１結合から生じるのかどうかを試験するために、ＬＰＳおよびｒＴＭＤ１の種々の濃度を使用して、相互作用を試験した。ｒＴＭＤ１の不在の場合に、ＬＰＳは投与量に依存してＴＮＦ−α産生を増大させ（図１Ｃ）、ｒＴＭＤ１は投与量に依存してＬＰＳ誘発ＴＮＦ−α産生を
抑制した（図１Ｃ）。このことは、細胞による炎症性メディエイタ産生に関してｒＴＭＤ１が有する低減効果を、ＬＰＳ−ｒＴＭＤ１結合がもたらすという仮説と一致する。
【実施例２】
【００４９】
ｒＴＭＤ１はＬＰＳ誘発シグナル伝達経路を遮断する。
ＩкＢαのリン酸化および分解は、ＬＰＳ（１００ｍｇ／ｍＬ）で刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞において起こる。この効果は、ｒＴＭＤ１（５０μｇ／ｍＬ、２．１８ｎモル／ｍＬ）によって完全に逆になった（図１Ｄ）。また、ＮＦ−кＢのＬＰＳ誘発核転座もｒＴＭＤ１によって投与量依存のやりかたで抑制された（図１Ｅ）。また、ＥＲＫ１／２およびｐ３８のＬＰＳ誘発リン酸化もｒＴＭＤ１によって抑制された（図１Ｆ）。シグナル形質導入経路の活性化に関するｒＴＭＤ１の同様な効果が、ＴＨＰ−１細胞において観察された（データは示されていない）。また、ＬＰＳによるＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳ誘導もｒＴＭＤ１によって抑制された（図１Ｇ）。
【実施例３】
【００５０】
ｒＴＭＤ１はサイトカイン放出を減少させ、肺および腎臓の障害を減衰させ、実験敗血症における生存率を改善させ、ならびにバクテリアＬＰＳクリアランスを増強する。
ｒＴＭＤ１はＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびシグナル伝達経路を抑制することが予想できるので、多分、ｒＴＭＤ１は、インビボでＬＰＳによって誘発される炎症性応答および死亡率を減少させるための治療薬として機能するであろう。ＴＮＦ−αおよびＮＯレベルは、対照複数マウスに対する、２０ｍｇ／ｋｇＬＰＳのｉ．ｐ．投与の６時間後に、複数マウスにおいて増大した。ｒＴＭＤ１（１−５ｍｇ／ｋｇ、４３．６６−２１８．３ｎモル／ｋｇに等しい）のｉ．ｖ．注射を受けた複数マウスは、ＴＮＦ−αおよびＮＯのレベルが著しく低下した（図２Ａ−Ｂ）。ＰＭＮｓ浸潤は、ＬＰＳ処理複数マウスの肺切開面において、ＬＰＳの投与６時間後に明らかであった（図２Ｃ−Ｄ）。ｒＴＭＤ１注射はＬＰＳ投与の６時間後にＰＭＮｓの肺性蓄積を著しく抑制した（図２Ｃ−Ｄ）。しかしながら、ｒＴＭＤ２／ＥＧＦ１２３は、ＬＰＳ誘発炎症性応答に関して著しい効果はなく、酵母組換えタンパク質のネガティブ対照として使えると予想される（図２Ｃ−Ｄ）。同様に、ＬＰＳは、腎臓の重篤な糸球体障害を起こす。糸球体腎炎の程度は、ｒＴＭＤ１処理複数マウスにおいて著しく低下した（図２Ｅ）。ＬＰＳの投与の１２時間後に、ＢＵＮおよび血清クレアチニンの増大は、腎臓の機能不全と一致した。ｒＴＭＤ１により処理され、次いでＬＰＳで攻撃された複数マウスは、ＬＰＳ処理複数マウスと比較して、ＢＵＮおよびクレアチニンレベルを明らかに減少させた（図２Ｆ−Ｇ）。この効果が、死亡率を下げる効果をもつかどうかを検討するために、複数マウスを、ｒＴＭＤ１（２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで４回、ｉ．ｖ．投与された投与量により処理し、どちらの実験群においても、全ての複数マウスが死亡するまで複数マウスを観察した。ｒＴＭＤ１処理は、死亡率を著しく下げ、内毒血症の間にわたり生存を増進させる（ＬＰＳ攻撃１日後に、ｒＴＭＤ１処理群生存、１００％、ＰＢＳ処理群生存、１０％；およびＬＰＳ攻撃４日後に、ｒＴＭＤ１処理群生存、６０％、ＰＢＳ処理群生存、０％）（図２Ｈ）。このことは、ｒＴＭＤ１が治療効果の可能性を有し得ることを示唆している。注射されたｒＴＭＤ１は、それぞれのｉ．ｖ．注射後１２時間以内に、検出可能であり、この場合、ＥＬＩＳＡによりアッセイして、３−４時間の半減期である（図２Ｉ）。注射されたＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）は、ｉ．ｐ．投与２時間後に、最高レベルに到達し、約６−８時間の半減期を有して、循環から取り除かれる（図２Ｊ）。ｒＴＭＤ１投与はＬＰＳクリアランスを増強した（図２Ｊ）。さらに、ｒＴＭＤ１（ＴＭＤ１Ａｂ）に対するウサギ多クローン性抗体を調製し、特徴付けをした。ＴＭＤ１ ＡｂによるｒＴＭＤ１の前処理は、ＬＰＳ誘発ＴＮＦ−α放出の抑制についての効果を逆転させる。このことは、炎症性メディエイタ産生についてのｒＴＭＤ１の抗炎症性効果は、ｒＴＭＤ１に特異性があることを示している。
【実施例４】
【００５１】
ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌誘発炎症性応答および死亡率を減少させ、およびバクテリアクリアランスを増強させる。
【００５２】
ＴＭＤ１がグラム陰性バクテリアによって発現された死亡を防御するかどうかを試験するために、肺炎桿菌をｉ．ｐ．注射することおよびｒＴＭＤ１で処置することによって全身性の敗血症を複数マウスに誘発した（図３Ａ−Ｃ）。ＴＮＦ−αおよびＮＯレベルは、肺炎桿菌（５×１０２ ＣＦＵ）を受けた複数マウスにおいて１２時間以内に増大した。ｒＴＭＤ１処理（５−２５ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）は、効果的にＴＮＦ−αおよびＮＯ産生を減少させる（図３Ａ−Ｂ）。生存実験のために、肺炎桿菌（５×１０３ＣＦＵ）を受けた全ての複数マウスが、１８時間以内に死亡したが、一方ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の単一ｉ．ｖ．投与量を受けた複数マウスの５０％は、２４時間を超えて生存した（図３Ｃ）。肺炎桿菌に誘発された死亡率の影響が、バクテリアクリアランスを促進させたｒＴＭＤ１に起因するかどうかを探索するために、血液中の生存可能なバクテリアの量を求めた。ＦＶＢ複数マウスに肺炎桿菌（５×１０２ＣＦＵ）を、ｒＴＭＤ１処理（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）を含まないか、または含んでそれぞれｉ．ｐ．注射した。ｒＴＭＤ１は、注射１２、２４、３６時間後に、循環における肺炎桿菌クリアランスを著しく増強した（図３Ｄ）。ｒＴＭＤ１が治療能力を有することを示すために、ｒＴＭＤ１をバクテリア感染の後に注入した。時系列の実験において、ｒＴＭＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を肺炎桿菌のｉ．ｐ．投与３０分後または６０分後に直ちに（１分間以内）ｉ．ｖ．投与した。この結果は、ｒＴＭＤ１が肺炎桿菌誘起ＴＮＦ−α放出を効果的に抑制し得ること（図３Ｅ）、およびｒＴＭＤ１の３０分後または６０分後処置においてさえも、感染１２、２４および３６時間後において、循環における肺炎桿菌クリアランスを増強させることを示した（図３Ｆ）。ｒＴＭＤ１の不存在下で肺炎桿菌に感染した複数マウスは、４２時間後に死亡し始めた。しかしながら、全てのｒＴＭＤ１処置群において生存率は改善された。
【実施例５】
【００５３】
ｒＴＭＤ１のグラム陰性バクテリアおよびＬＰＳとの直接結合、および膜結合ＴＭのＬＰＳとの直接結合。
【００５４】
ＴＭＤ１が、グラム陰性バクテリアおよびＬＰＳに特異的に結合する能力があるかどうかを試験するために、ｒＴＭＤ１およびｒＴＭＤ２３を、肺炎桿菌、ＬＰＳまたはＢＳＡと結合させるために使用した。ｒＴＭＤ２３ではなくて、ｒＴＭＤ１は、肺炎桿菌に特異的に結合すると予想される（図４Ａ）。ｒＴＭＤ１はグラム陰性バクテリアに結合すると予想されるので、グラム陰性バクテリアのＬＰＳは、可能性のある候補リガンドと考えられる。適切に、ＬＰＳまたはＢＳＡへのｒＴＭＤ１およびｒＴＭＤ２３を測定した。ｒＴＭＤ２３ではなくてｒＴＭＤ１がＬＰＳに特異的に結合（図４Ｂ）し、結合はマンノースおよびＥＤＴＡによって抑制される。このことは、ＴＭＤ１炭水化物認識ドメインが、Ｃａ２＋に依存したやりかたでＬＰＳ炭水化物と相互作用したことを示している（図４Ｃ）。図４Ｂから、ＬＰＳのｒＴＭＤ１との結合の５０％飽和から概算された見掛けのＫｄは、約１．６×１０−６モル／Ｌであった。また、ＬＰＳは、ｒＴＭＤ１を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用した８．２４×１０−６モル／Ｌから９．０１×１０−８モル／Ｌの範囲の濃度に依存したやりかたでＫｄに結合する。ＬＰＳへのｒＴＭＤ１の結合は、おそらく、ＬＰＳのＬＰＳ結合分子との相互作用を遮断するであろうと考えられ、このＬＰＳへのｒＴＭＤ１の結合がＬＰＳ誘発炎症性メディエイタ産生およびシグナル伝達経路を遮断する。図４Ｄに示す通り、ＬＰＳへのＣＤ１４の結合は、投与量に依存したやりかたでｒＴＭＤ１によって抑制されるが、ＬＰＳへのＬＰＳ結合タンパク質の結合は、ｒＴＭＤ１によって抑制されなかった（データは示されていない）。ｒＴＭＤ１が相互作用するように、内因性のＴＭＤ１がＬＰＳと特異的に相互作用し得るかどうかを探索するために、内因性の膜結合ＴＭ１４、および過剰発現されたフルレングスまたはレクチン様ドメイン欠失膜結合ＴＭ１７，２９を設計して、ＬＰＳ結合能力を試験した。この結果は、ＴＨＰ−１細胞上に発現された膜結合ＴＭは、ビオチニル化されたＬＰＳを結合すると予想されることを示した。さらに、レクチン様ドメイン欠失膜結合ＴＭではなく、フルレングスＴＭは、ビオチニル化されたＬＰＳを結合すると予想される。これらの結果は、膜固定ＴＭは、ＴＭのＮ末端レクチン様ドメインを介してＬＰＳを結合すると予想されることを示す。
【実施例６】
【００５５】
ｒＴＭＤ１は、グラム陰性バクテリアの凝固を誘発し、ＴＨＰ−１細胞におけるバクテリアの食菌作用を増強する。
【００５６】
ＴＭＤ１は、炭水化物リガンド１７に結合することによって細胞−細胞間の癒着を媒介し、ｒＴＭＤ１は、ＬＰＳおよび肺炎桿菌（それぞれ、図２Ｊおよび３Ｄ）のクリアランスにおいて機能するので、もしバクテリアの表面上の炭水化物機能基がＴＭのリガンドから構成されとすれば、ｒＴＭＤ１が、バクテリアの結合およびバクテリアを食菌する作用に関与し得ることは自明のことと思われた。ｒＴＭＤ１結合特異性を、ＦＩＴＣ標識グラム陰性（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎桿菌）およびＥ．Ｃｏｌｉ（大腸菌））バクテリアとの凝固反応によってアッセイした。ｒＴＭＤ１（２０μｇ・ｍＬ）は、肺炎桿菌および大腸菌ＤＨ５αの著しい凝固を誘発した（図５Ａ）。さらに、凝固活性は、Ｃａ２＋依存性であり、マンノースおよびＥＤＴＡ（図５Ａ）によって減衰される。ｒＴＭＤ１タンパク質における、Ｈｉｓ／ｃ−Ｍｙｃ標識の可能性のある干渉効果を除外するために、非標識ｒＴＭＤ１を調製して、試験を実施した。非標識ｒＴＭＤ１は、ｒＴＭＤ１と同様な効果を示し、一方標識ｒＴＭＤ２３は、凝固を産生できなかった。同様な結果が、哺乳動物発現ｒＴＭＤ１を使用することによって得られた（図５Ａ）。活性化されたＴＨＰ−１細胞による、ＦＩＴＣ−標識肺炎桿菌の食菌作用に関するｒＴＭＤ１の効果をアッセイした。ｒＴＭＤ１は、ＴＨＰ−１細胞による、バクテリアを食菌する作用の量を著しく増大した。それ故、ｒＴＭＤ１は、バクテリア誘発炎症性反応と干渉するだけでなく、またバクテリアの凝固を誘発しマクロファージによる食菌作用を促進する。
【実施例７】
【００５７】
ｒＴＭＤ１のリガンド特異性の確認およびＨＭＧＢ１−ｒＴＭＤ１結合に関するＬｅｙの非競合効果。
【００５８】
ｒＴＭＤ１のリガンド特異性を確認するために、炭水化物リガンド（図６Ａ）のパネルを、アルファスクリーン法（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、ｒＴＭＤ１親和性に対して試験した。この結果は、Ｌｅｙ抗原は、哺乳動物発現ｒＴＭＤ１またはピキア発現ｒＴＭＤ１に対する特異性リガンドであることを示した（図６Ａ）。Ｌｅｙは、ｒＴＭＤ１のＬＰＳとの結合を、投与量に依存するやりかたで特異的に抑制した（図６Ｂ）。このことは、ｒＴＭＤ１の炭水化物結合部位は、ＬＰＳとの相互作用に関与していたことを示す。ＥＬＩＳＡは、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ＬＰＳが、ｒＴＭＤ１の結合特異性と一致して、ＬｅａおよびＬｅｂ抗原よりもＬｅｘおよびＬｅｙ抗原を含むことを示した（図６Ｃ）。さらに、Ｌｅｙは、投与量に依存して、ＬＰＳ誘発ＥＲＫ１／２リン酸化、ＩкＢα分解、および、ＮＦ−кＢ ｐ５０およびｐ６５核転座に関する、ｒＴＭＤ１の遮断効果を中和することが予想できる（図６Ｄ）。ＨＭＧＢ１のｒＴＭＤ１との結合に関するＬｅｙの効果を観察するための実験を、ＬＰＳ／Ｌｅｙ−ｒＴＭＤ１相互作用がＨＭＧＢ１−ｒＴＭＤ１相互作用と干渉し、したがって、ＬＰＳ／ＬｅｙおよびＨＭＧＢ１がＴＭＤ１上でオーバーラップするかどうかを検証するために実施した。この結果は、Ｌｅｙは、ＨＭＧＢ１およびｒＴＭＤ１相互作用を阻害しないと予想されることを示し、このことは、ＨＭＧＢ１相互作用を媒介する、ＴＭＤ１の構造ドメインは、ＬＰＳ／Ｌｅｙとオーバーラップしないことを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体を含む、ルイスＹ抗原過剰発現から生じる疾患の治療用の医薬組成物。
【請求項２】
ルイスＹ抗原が、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳにおいて発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
疾患が、腫瘍または炎症性疾患であって、ここで、
（ａ）腫瘍が、乳房、膵臓、卵巣、結腸、胃または肺癌から選択された、上皮由来の腫瘍であり、
（ｂ）炎症性疾患が、ＬＰＳまたはグラム陰性バクテリアによって誘発される、
請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
炎症性疾患が、敗血症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
予防または治療が、配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体をルイスＹ抗原に結合させて、凝固反応、バクテリアのオプソニン作用またはマクロファージによる食菌作用を誘発することによってなされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
標識された、配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ−末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）、またはこの標識された類似体を含む、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳにおいて過剰発現されたルイスＹ抗原を検出するキット。
【請求項１】
配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体を含む、ルイスＹ抗原過剰発現から生じる疾患の治療用の医薬組成物。
【請求項２】
ルイスＹ抗原が、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳにおいて発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
疾患が、腫瘍または炎症性疾患であって、ここで、
（ａ）腫瘍が、乳房、膵臓、卵巣、結腸、胃または肺癌から選択された、上皮由来の腫瘍であり、
（ｂ）炎症性疾患が、ＬＰＳまたはグラム陰性バクテリアによって誘発される、
請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
炎症性疾患が、敗血症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
予防または治療が、配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）またはこの類似体をルイスＹ抗原に結合させて、凝固反応、バクテリアのオプソニン作用またはマクロファージによる食菌作用を誘発することによってなされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
標識された、配列番号１の、トロンボモジュリンのＮ−末端レクチン様ドメイン（ＴＭＤ１）、またはこの標識された類似体を含む、腫瘍細胞、グラム陰性バクテリアまたはＬＰＳにおいて過剰発現されたルイスＹ抗原を検出するキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図２Ｊ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図２Ｊ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【公開番号】特開２０１０−１５５８２２（Ｐ２０１０−１５５８２２Ａ）
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−２４６５０３（Ｐ２００９−２４６５０３）
【出願日】平成２１年１０月２７日（２００９．１０．２７）
【出願人】（５０９２９７８２０）
【出願人】（５０９２９７８３１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４６５０３（Ｐ２００９−２４６５０３）
【出願日】平成２１年１０月２７日（２００９．１０．２７）
【出願人】（５０９２９７８２０）
【出願人】（５０９２９７８３１）
【Ｆターム（参考）】
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