レーザ走査型顕微鏡
【課題】簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能の高い分光検出ができるレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【解決手段】レーザ光を射出する光源装置１０と、射出されたレーザ光を走査するＸＹガルバノスキャナ２２と、走査されたレーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５と、集光された標本Ａからの光を複数の波長帯域に分散する透過型の回折格子と、分散された光を検出する光検出部３６と、標本Ａからの光の回折格子への入射角を変化させるガルバノメータとを備え、ガルバノメータは、光検出部３６により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、標本Ａからの光の回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させるレーザ走査型顕微鏡１を採用する。
【解決手段】レーザ光を射出する光源装置１０と、射出されたレーザ光を走査するＸＹガルバノスキャナ２２と、走査されたレーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５と、集光された標本Ａからの光を複数の波長帯域に分散する透過型の回折格子と、分散された光を検出する光検出部３６と、標本Ａからの光の回折格子への入射角を変化させるガルバノメータとを備え、ガルバノメータは、光検出部３６により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、標本Ａからの光の回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させるレーザ走査型顕微鏡１を採用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、表面反射型の回折格子と、１次元に配列された３２個のセルよりなるマルチチャンネルＰＭＴとを備えるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、回転可能な表面反射型の回折格子と、スリット幅を可変な可変スリットと、０次元検出器とを備えるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１８５５８１号公報
【特許文献２】特開２００６−０１０９４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に開示されているレーザ走査型顕微鏡は、ピクセル毎の蛍光分光データを測定し、色素毎の参照スペクトルを用いて演算処理を行うことでクロストークの大きい複数蛍光を分離している。
【０００５】
しかしながら、波長分解能を上げると１個のセルで検出する検出光量が少なくなってＳ／Ｎが悪化してしまう。また、１個のセルで取込む波長幅を広くすると、明るくなるが波長分解能が低下してしまう。したがって、１個のセルで、１０ｎｍ幅程度の波長域を検出するようにしており、波長分解能が悪いという不都合がある。また、マルチチャンネル検出器は、電気系も含め高価で制御系が複雑化する。さらに、反射型の回折格子は、回折効率が低く、最も効率が良い波長でも７０％程度の回折効率であるため、検出する光量が低下してしまうという不都合がある。
【０００６】
特許文献２に開示されているレーザ走査型顕微鏡は、回転可能な表面反射型の回折格子と可変スリットにより、１回で取込む波長幅と、波長領域を任意に設定することが可能である。例えば、スリット幅を波長幅１０ｎｍに設定し、回折格子の回転ピッチの波長送りを２ｎｍに設定することで、明るさと波長分解能の両立を実現している。
【０００７】
しかしながら、可変スリットのスリット幅と回折格子の回転角を正確に合わせないと正しいデータを取得できないので、調整が困難であり、且つ装置が複雑化するという不都合がある。また、可変スリットと回折格子の両方を同期制御する必要があり、システムが高価となるという不都合がある。さらに、反射型の回折格子は、取込める波長領域は広いが回折効率が低く、最も効率が良い波長でも７０％程度の回折効率であるため、検出する光量が低下してしまうという不都合がある。
【０００８】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、波長幅を切り出すスリットや、高価なマルチチャンネル検出器を用いることなく、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能の高い分光検出ができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、レーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic（ＶＰＨ）回折格子と、該ＶＰＨ回折格子により分散された光を検出する光検出部と、前記標本からの光の前記ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段とを備え、前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記ＶＰＨ回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させるレーザ走査型顕微鏡を採用する。
【００１０】
本発明によれば、レーザ光源から射出されたレーザ光が走査部により標本上において走査され、標本からの光が対物レンズにより集光される。この標本からの光は、透過型のVolume Phase Holographic（ＶＰＨ）回折格子により複数の波長帯域に分散され、光検出部により検出される。この際、入射角度変更手段により、標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角が変化させられることで、標本からの光の分散状態が変化する。この場合において、光検出部により検出される複数の波長帯域の光のそれぞれについて、ブラッグの反射条件を満たすように、標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角が変化させられる。なお、ブラッグの反射条件とは、以下の式を満たす条件をいい、この条件において高い回折効率を得ることができ、強度の高い光を検出することができる。
２ｄｓｉｎΘ＝ｎλ
ここで、ｄはＶＰＨ回折格子の周期、Θは標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角、ｎは整数、λは波長である。
【００１１】
したがって、波長帯域毎にブラッグの反射条件を満たすように標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角を変化させることで、強度の高い標本からの光を波長帯域毎に検出することができる。
以上のように、本発明によれば、波長幅を切り出すスリットや、高価なマルチチャンネル検出器を用いることなく、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能が高い分光検出を行うことができる。
【００１２】
上記発明において、前記入射角度変更手段が、前記ＶＰＨ回折格子による分散方向に直交する軸線回りに前記ＶＰＨ回折格子を回転させることとしてもよい。
ＶＰＨ回折格子を分散方向に直交する軸線回りに回転させることで、標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角が変化する。この際、光検出部により検出される複数の波長帯域の光のそれぞれについて、ブラッグの反射条件を満たすように、ＶＰＨ回折格子を軸線回りに回転させることで、高い回折効率を得ることができ、強度の高い光を検出することができる。
【００１３】
上記発明において、前記光検出部により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、前記入射角度変更手段を駆動させる制御部と、前記入射角度変更手段の動作に同期して、前記レーザ光の波長を選択する波長選択手段とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、光検出部により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、ブラッグの反射条件を満たす波長の光を切り替えるとともに、この切り替えに同期してレーザ光の波長を切り替えることができる。これにより、波長選択用スリットや、マルチチャンネルＰＭＴや、反射型回折格子を用いないで、ＶＰＨ回折格子により分散された波長毎に標本からの光を検出することができ、多重染色画像を容易に取得することができる。また、検出する波長帯域の中心波長の回折効率が最大となるようにＶＰＨ回折格子への入射角を変更することで、従来の反射型回折格子を用いたものに比べて回折効率を向上させることができ、明るい画像を取得することができる。
【００１４】
上記発明において、等間隔ピッチで検出波長を時系列的に切り替えて画像を取得（λスキャン）し、各前記画像において対応するピクセルの輝度変化を用いて、ピクセル毎の分光データを取得することとしてもよい。
このようにすることで、分光データを細かく取得できるので、クロストークが大きい色素についても分離が可能である。
【００１５】
上記発明において、前記光検出部により検出される光の中心波長のピッチが、前記ＶＰＨ回折格子の回折効率が５０％における波長幅よりも狭く設定されていることとしてもよい。
このようにすることで、ＶＰＨ回折格子の回折効率を向上させることができ、明るい画像を取得することができる。
【００１６】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子の回折効率が５０％における波長幅が、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルのうち、バンド幅が最も狭い蛍光スペクトルの半値幅よりも狭く設定されていることとしてもよい。
ＶＰＨ回折格子の一つの回転角での分光特性の回折効率の半値幅は、各蛍光色素のうちバンド幅が最も狭い蛍光色素のバンドの半値幅よりも狭いほうが良く、特に、半分以下が好ましい。
【００１７】
上記発明において、λスキャンの波長ピッチが、複数の蛍光色素のうちピーク波長の中心間隔が最も狭い間隔の半分以下に設定されていることとしてもよい。
λスキャンの波長ピッチは、複数の蛍光スペクトルのうち、ピーク間隔が最も狭い間隔の半分以下が好ましい。
【００１８】
上記発明において、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを前記走査部による走査に同期して行うこととしてもよい。
このようにすることで、検出波長毎の時間差を極めて少なくでき、動きのある標本を正確に捉えることができる。
【００１９】
上記発明において、前記走査部の主走査方向のライン毎に、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを行うこととしてもよい。
このようにすることで、効果的に入射角度の切り替えと走査部による走査とを同期させることができ、動きのある標本を正確に捉えることができる。
【００２０】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子と前記ＶＰＨ回折格子に入射する前記標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、前記光検出部による検出データに波長毎に乗算することとしてもよい。
ＶＰＨ回折格子と標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、光検出部による検出データに波長毎に乗算することで、波長毎の回折効率の違いを補正することができ、正確な分光データを取得することができる。
【００２１】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子と前記光検出部との間に、前記ＶＰＨ回折格子から分散される光を前記光検出部の有効受光面に集光する集光光学系を備えることとしてもよい。
このようにすることで、ＶＰＨ回折格子から分散される光を光検出部の有効受光面に集光させることができ、標本からの光の検出効率を向上させて明るい画像を取得することができる。
【００２２】
上記発明において、前記集光光学系が、前記分散方向にのみ前記標本からの光を集光するシリンドリカルレンズであることとしてもよい。
集光光学系をシリンドリカルレンズとすることで、ＶＰＨ回折格子による分散方向にのみ標本からの光を集光することができ、効率的に光検出部の有効受光面に集光させることができる。
【００２３】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子、前記入射角度変更手段、および前記光検出部から構成される分光ユニットと、前記標本からの光のうち検出する波長を選択可能な検出系を含むメインスキャンユニットとを備え、前記分光ユニットと前記メインスキャンユニットとが着脱可能に構成されていることとしてもよい。
このようにすることで、光検出部と検出系のいずれか、あるいは両方で標本からの光を検出することができ、同時に多色の光を検出することができる。また、上記構成を有する分光ユニットをメインスキャンユニットに後付け可能な構成とすることで、明るくかつ安価な分光検出手段を容易に付加できる。すなわち、メインスキャンユニットを備えたレーザ走査型顕微鏡を、標本からの光を各蛍光波長帯域毎に対して効率よく検出することができ、波長分解能が高い多重染色標本の観察を行うようにアップグレードすることができる。
【００２４】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子を直進する光（０次光）を検出する第２の光検出部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、第２の光検出部により広帯域の光を一度に検出するモードと、ＶＰＨ回折格子による比較的狭い波長帯域（例えば１０〜２０ｎｍ）の光を検出するモードの両方を行うことができ、これらモードの切り換えを、入射角度変更手段により行うことができる。
【００２５】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子を直進する光（０次光）を、前記光検出部に再入力する再入力手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、ＶＰＨ回折格子により回折される光とＶＰＨ回折格子を直進する光の両方を１つの光検出部で検出することができ、高価な光検出部（例えばＰＭＴ）を１個削減できる。なお、再入力手段としては、例えば、ＶＰＨ回折格子を直進する光を光検出部の受光面に向けて反射するミラーを用いればよい。
【００２６】
上記発明において、前記光検出部が、ノンディスキャン検出器であり、前記入射角度変更手段により前記ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させながら、前記ノンディスキャン検出器により前記標本からの光から複数の画像を生成し、該複数の画像間のピクセルデータを結合することとしてもよい。
このようにすることで、ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させながらノンディスキャン検出器により取得した各画像における対応するピクセルのデータを結合することで、ピクセル毎の分光データを取得することができる。
【００２７】
上記発明において、前記入射角度変更手段は、前記ＶＰＨ回折格子に入射する検出光の角度を可変する反射ミラーであり、該反射ミラーと前記光検出部とが、前記ＶＰＨ回折格子を挟んで略対称の位置に配置されていることとしてもよい。
このようにすることで、ミラーを回転させることにより、ＶＰＨ回折格子を回転させる場合よりも高速な波長切換に対応することができる。また、回折効率が最大となる波長はブラッグ反射し、光検出部上の１点に集まるので、光検出部の受光面積を小さくすることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能の高い分光検出ができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の波長選択装置周辺の部分拡大図である。
【図３】図１の回折格子の断面図である。
【図４】図１の回折格子により回折される光を説明する図である。
【図５】図４の中心波長毎のＶＰＨ回折格子回転角と絶対出射角を示すグラフである。
【図６】回折効率と波長帯域との関係を示すグラフである。
【図７】ブラッグ反射条件を満たす波長における分光特性を示すグラフである。
【図８】本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図９】本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図１０】図９の波長選択装置周辺の部分拡大図である。
【図１１】図１０の変形例に係る波長選択装置周辺の部分拡大図である。
【図１２】本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図１３】本発明の第５の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図１４】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像右端の入射光（４２０ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図１５】図１４の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図１６】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像中心の入射光（４２０ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図１７】図１６の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図１８】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像左端の入射光（４２０ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図１９】図１８の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図２０】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像左端の入射光（５６０ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図２１】図２０の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図２２】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像左端の入射光（７００ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図２３】図２２の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図２４】図１３のレーザ走査型顕微鏡において各画素におけるデータ取得領域を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット２０と、結像レンズ４１およびミラー４２を有し、スキャンユニット２０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００３１】
光源装置１０は、例えば中心波長５６０ｎｍのレーザ光を発するレーザ光源１１と、例えば中心波長４８８ｎｍのレーザ光を発するレーザ光源１２と、例えば中心波長４０５ｎｍのレーザ光を発するレーザ光源１３と、これらレーザ光源からのレーザ光の光路を合成するダイクロイックミラー１４と、射出するレーザ光の波長を切り替えるＡＯＴＦ（Acousto-optic tunable filter）等の音響光学素子（波長選択手段）１５とを備えている。
【００３２】
光源装置１０とスキャンユニット２０とは、例えば可視用シングルモードファイバ１９により接続され、光源装置１０からのレーザ光がスキャンユニット２０に導光される。
スキャンユニット２０は、光源装置１０からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系２５と、標本Ａからの光を検出する検出光学系３０とを備えている。
【００３３】
照射光学系２５は、光源装置１０からのレーザ光を反射する一方、標本Ａからの光を透過するダイクロイックミラー２１と、ダイクロイックミラー２１により反射されたレーザ光を標本Ａ上で２次元走査するＸＹガルバノスキャナ（走査部）２２と、レーザ光の瞳を投影する瞳投影レンズ２３とを備えている。
【００３４】
検出光学系３０は、ダイクロイックミラー２１を透過してきた標本Ａからの光を共焦点ピンホール３２に集光する共焦点レンズ３１と、標本Ａの焦点位置からの光のみを通過させる共焦点ピンホール３２と、共焦点ピンホール３２を通過してきた標本Ａからの光を平行光にするコリメートレンズ３３と、コリメートレンズ３３により平行光にされた標本Ａからの光のうち光源装置１０からのレーザ光等の不要な成分を遮断するノッチフィルタ３４と、ノッチフィルタ３４を透過してきた標本Ａからの光を複数の波長帯域から所定の波長帯域の光を選択する波長選択装置３５と、波長選択装置３５により選択された波長帯域の光を検出する光検出部３６とを備えている。
【００３５】
波長選択装置３５は、図２に示すように、ノッチフィルタ３４を透過してきた標本Ａからの光を複数の波長帯域に分散する透過型の回折格子３７と、回折格子３７を保持し、回折格子３７を標本Ａからの光の分散方向（図２において紙面に沿う方向）に直交する軸線回りに回転させるガルバノメータ（入射角度変更手段）３８とを備えている。
【００３６】
回折格子３７は、図３に示すように、透過型のＶＰＨ（Volume Phase Holographic）回折格子である。
透過型のＶＰＨ回折格子は、媒質の屈折率を周期的に変化させたもので、ブラッグの反射条件を満たす波長において高い回折効率が得られ、その他の波長においては殆ど回折しないようにすることができる。
例えば白色光Ｗに対する回折格子３７の向きを回転調整することで、ブラッグの反射条件に合った波長の光を効率的に取り出せる。具体的には、図３に示すように、回折格子３７が符号Ｒに示す位置にある場合には赤の波長の光が矢印Ｒに示す方向に射出し、回折格子３７が符号Ｇに示す位置にある場合には緑の波長の光が矢印Ｇに示す方向に射出し、回折格子３７が符号Ｂに示す位置にある場合には青の波長の光が矢印Ｂに示す方向に射出する。
なお、１次回折光として得られる光（矢印Ｒ，Ｇ，Ｂの向きにそれぞれ射出される光）の波長幅は、回折格子３７の厚みによって変化し、厚みが厚いほど波長幅が狭くなるので、所望の波長幅となるように厚みを選択する。
【００３７】
ガルバノメータ３８は、制御ユニット５０からの指示に基づいて、回折格子３７を標本Ａからの光の分散方向に直交する軸線回りに回転させるようになっている。具体的には、ガルバノメータ３８は、光検出部３６により検出する波長帯域の中心波長に合わせて駆動され、光検出部３６により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、回折格子３７を軸線回りに回転させるようになっている。ここで、ブラッグの反射条件とは、以下の式を満たす条件をいい、この条件において高い回折効率が得られる。
２ｄｓｉｎΘ＝ｎλ
上記の式において、ｄは回折格子３７の周期、Θは標本Ａからの光の回折格子３７への入射角、ｎは整数、λは波長である。透過型のＶＰＨ回折格子では、ｎ＝１の時に高い回折効率が得られる。
【００３８】
光検出部３６は、例えばＰＭＴ（Photomultiplier Tube：光電子増倍管）である。光検出部３６として、サイドオン型ＰＭＴを用いる場合は、軸方向の感度ユニフォミティが比較的緩いので、軸方向を分散方向に合わせて配置する。
【００３９】
ここで、光検出部３６の受光面は、分散した波長を全て受光できる受光面の大きさおよび角度ユニフォミティが必要である。ただし、受光面の大きさ、角度ユニフォミティに問題があれば、シリンドリカルレンズ等の集光光学系を配置することで、受光面に対する大きさを調節することができる。
【００４０】
そこで、波長選択装置３５と光検出部３６との間には、図２に示すように、波長選択装置３５により選択された波長帯域の光を、その分散方向にのみ集光するシリンドリカルレンズ（集光光学系）３９が配置されている。このシリンドリカルレンズ３９の作用により、波長選択装置３５により分散された複数の波長帯域の光を光検出部３６に集光させることができ、光検出部３６の受光面を小さくすることができる。
【００４１】
制御ユニット５０は、ＸＹガルバノスキャナ２２、音響光学素子１５、ガルバノメータ３８、および光検出部３６を同期制御するようになっている。具体的には、制御ユニット５０は、ＸＹガルバノスキャナ２２の走査位置と光検出部３６により検出される標本Ａからの光の強度とに基づいて標本Ａの画像を生成するようになっている。また、制御ユニット５０は、光検出部３６により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、音響光学素子１５によりレーザ光の波長を切り替えるとともに、ガルバノメータ３８を駆動させて回折格子３７への入射角を変化させるようになっている。
【００４２】
上記のようにガルバノメータ３８を動作させた場合の、光検出部３６により検出される標本Ａからの光の作用について、具体例を用いて以下に説明する。
図４において、符号αは、回折格子３７の回転角（以下「ＶＰＨ回折格子回転角」という）、すなわち入射光に対する回折格子３７の法線（以下「ＶＰＨ回折格子法線」という）の角度である。符号βは、ＶＰＨ回折格子法線に対する１次回折光の出射角度である。符号γは、絶対出射角、すなわち入射光（０次光）に対する１次回折光の出射角度である。
【００４３】
図５は、中心波長毎のＶＰＨ回折格子回転角αと絶対出射角γとの関係を示している。図５において、ＶＰＨ回折格子回転角αは、ブラッグの反射条件を満たす波長毎の回転角を示している。
【００４４】
回折格子３７の厚みは、１次回折光として回折可能な波長範囲を決めるものである。すなわち、回折格子３７の屈折率分布の厚みを調節することで、角度に対する回折効率の高い波長範囲を調節することができる。ここでは、例えば、回折格子３７の格子間隔を１２００本／ｍｍ、回折格子３７の屈折率分布の厚みを１２０μｍ程度にすることで、図６に示すように、回折効率５０％で波長幅が約１０ｎｍ、回折効率ほぼ０％で波長幅が約２０ｎｍとしている。なお、サイドロープは、強度が弱いので無視できるものとする。
【００４５】
つまり、回折格子３７の回転角を、１５．７°に設定すると図６の実線に示す回折効率となり、１９．３°に設定すると図６の点線に示す回折効率となり、２３°に設定すると図６の二点鎖線に示す回折効率となる。各中心波長に対する回折効率の特性は、図６の曲線５１のように表わされる。
【００４６】
上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡１の作用について以下に説明する。
ここでは、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１を用いて、光検出部３６により標本Ａの蛍光観察を行う場合について説明する。
まず、光源装置１０を作動させ、スキャンユニット２０にレーザ光を入射させる。スキャンユニット２０に導光されたレーザ光は、ダイクロイックミラー２１により反射されてＸＹガルバノスキャナ２２に導光される。ＸＹガルバノスキャナ２２では、レーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させる。このように走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ２３および結像レンズ４１を透過してミラー４２により偏向され、対物レンズ４５により標本Ａ上に照射される。
【００４７】
標本Ａ上の対物レンズ４５の焦点面においては、標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ４５により集光され、ミラー４２、結像レンズ４１、瞳投影レンズ２３を介して、ＸＹガルバノスキャナ２２に導光される。ＸＹガルバノスキャナ２２を通過した蛍光は、ダイクロイックミラー２１を透過し、共焦点レンズ３１により集光され、標本Ａの焦点面において発生した蛍光のみが共焦点ピンホール３２を通過する。共焦点ピンホール３２を通過した蛍光は、コリメートレンズ３３により平行光にされ、ノッチフィルタ３４を透過することで不要な励起光の波長がカットされる。ノッチフィルタ３４を透過してきた蛍光は、波長選択装置３５によりブラッグの反射条件を満たす蛍光波長帯域が選択されて、光検出部３６により検出される。
【００４８】
このように光検出部３６により検出された蛍光の強度情報とＸＹガルバノスキャナ２２によるレーザ光の照射位置とを対応づけて記憶することにより、２次元的な蛍光画像を構築することが可能となる。
【００４９】
上記の画像取得方法において、光検出部３６により検出する光を切り替えて多重染色画像を取得する際の処理について説明する。
前提条件として、蛍光色素ＤＡＰＩ（４０５ｎｍ励起／４５０ｎｍ検出）、蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８（４８８ｎｍ励起／５３０ｎｍ検出）、蛍光色素Ａｌｅｘａ５６０（５６０ｎｍ励起／５８０ｎｍ検出）で３重染色された標本Ａの観察を行う。この場合において、ノッチフィルタ３４として、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６０ｎｍの波長の光をカットする特性のものを用いる。
【００５０】
まず、音響光学素子１５でレーザ波長を４０５ｎｍに設定する。
この場合には、中心波長４５０ｎｍの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角α（１５．７°）を設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する（ＤＡＰＩの画像）。
【００５１】
次に、音響光学素子１５でレーザ波長を４８８ｎｍに設定する。
この場合には、中心波長５３０ｎｍの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角α（１８．５°）を設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する（Ａｌｅｘａ４８８の画像）。
【００５２】
次に、音響光学素子１５でレーザ波長５６０ｎｍを設定する。
この場合には、中心波長５８０ｎｍの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角α（２０．４°）を設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する（Ａｌｅｘａ５６０の画像）。
そして、上記のように取得した３つのモノクロ画像に擬似カラーをつけて、多チャンネル画像として表示する。
【００５３】
以上のように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、それぞれの蛍光色素毎の検出波長帯域に合わせて、ブラッグの反射条件を満たすようにガルバノメータ３８を動作させ、回折格子３７を軸線回りに回転させることで、標本Ａからの光を各蛍光波長帯域毎に対して効率よく検出することができる。すなわち、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、波長幅を切り出すスリットや、高価なマルチチャンネル検出器を用いることなく、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能が高い多重染色標本の観察を行うことができる。
【００５４】
また、回折格子３７は、透過型のＶＰＨ回折格子であり、かつ、検出波長帯域毎にブラッグの反射条件を満たすようにしているので、反射型の回折格子３７に比べて、光検出部３６により検出する光量を増大させることができ、明るい多重染色画像を取得することができる。
【００５５】
［第１の変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第１の変形例について説明する。
本変形例における、光検出部３６により検出する光の波長を順次切り替えてλスキャンを行う際の処理について以下に説明する。
前提条件として、蛍光色素ＧＦＰと蛍光色素ＹＦＰにより２重染色された標本Ａの観察を行う。この場合において、ノッチフィルタ３４として４８８ｎｍの波長の光カットする特性のものを用い、ダイクロイックミラー２１は例えば素ガラスを使用する。
【００５６】
まず、音響光学素子１５でレーザ波長を４８８ｎｍに設定する。
この場合には、中心波長５００ｎｍの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角α（１７．５°）を設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する。
【００５７】
次に、中心波長５０２ｎｍの光が回折効率最大になるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角αを設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する。
以下、検出する光の中心波長を２ｎｍずつずらしながら、回折効率が最大となるＶＰＨ回折格子回転角αを設定して画像取得を繰返す。これらの動作を制御ユニット５０により時系列的に切り替えながら行う。
【００５８】
上記のように取得したピクセル毎の分光データを基に、例えば特開２００３−１８５５８１号公報に記載のアンミキシング処理を施すことで、蛍光色素ＧＦＰと蛍光色素ＹＦＰとを分離して、多チャンネル画像として表示する。
【００５９】
本変形例に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、前述の効果に加えて、回折格子３７を回転させて分光データを細かく取得できるので、クロストークが大きい色素についても分離が可能である。特に、本変形例においては、回折格子３７を回転させて、２ｎｍ刻みで分光データを取得できるので、クロストークが大きい色素の分離が可能である。
【００６０】
［第２の変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第２の変形例について説明する。
本変形例においては、前述の画像を取得する際の処理において、ガルバノメータ３８による回折格子３７の回転角度の切り替えを、ＸＹガルバノスキャナ２２による走査に同期させ、ＸＹガルバノスキャナ２２の主走査であるＸライン毎に行う。
このようにすることで、検出波長毎の時間差を極めて少なくでき、動きのある標本Ａを正確に捉えることができる。
【００６１】
［第３の変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第３の変形例について説明する。
前述の第１の実施形態では色素毎に１つの中心波長でのみ検出していたが、本変形例においては、色素の分光特性に合わせて複数の中心波長でデータ取得し、同じ色素のデータとして合算する。
このようにすることで、同じ色素のデータが合算されるので、各画像におけるＳ／Ｎを向上することができる。
【００６２】
［第４の変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第４の変形例について説明する。
本変形例においては、回折格子３７と回折格子３７に入射する標本Ａからの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率（図６における曲線５１）の逆数を、波長毎に検出データに乗算する。
このようにすることで、波長毎の回折効率の違いを補正することができ、正確な分光データを取得することができる。
【００６３】
［第５の変形例］
以下に、本実施形態の第１の変形例に係るレーザ走査型顕微鏡１の第５の変形例について説明する。
本変形例においては、図７に示すように、３種の蛍光（蛍光スペクトルＡ，Ｂ，Ｃ）をλスキャンして分光データを取得し、アンミキシング処理によりこれらの蛍光を分離する。
【００６４】
この場合において、回折格子３７の一つの回転角での分光特性の回折効率の半値幅は、以下に示すように、各蛍光色素の分光特性でバンド幅が最も狭い蛍光色素のバンドの半値幅よりも狭いほうが良い。
ΔλＷＳ＜ΔλＷＢ
ここで、
ΔλＷＳ：回折格子３７の分光特性の回折効率５０％地点の波長幅（半値幅）
ΔλＷＢ：最もバンド幅が狭い、蛍光スペクトルＢの分光特性の半値幅
【００６５】
また、より好ましくは、回折格子３７の一つの回転角での分光特性の回折効率の半値幅は、以下に示すように、各蛍光色素の分光特性でバンド幅が最も狭い蛍光色素のバンドの半値幅の半分以下が良い。
ΔλＷＳ＜ΔλＷＢ／２
【００６６】
また、λスキャンの波長ピッチは、以下に示すように、複数の蛍光スペクトルのピーク間隔で最も狭い間隔の半分以下が良い。
ΔλＰＳ＜ΔλＰ／２
ここで、
ΔλＰＳ：回折格子３７によるλスキャンの波長ピッチ
ΔλＰ：複数の蛍光スペクトルのうち、ピーク間隔が最も近い蛍光色素（蛍光スペクトルＡ、Ｂ間）のピーク波長間隔
【００６７】
また、λスキャンの波長ピッチは、以下に示すように、回折格子３７の一つの回転角の分光特性の回折効率の半値幅よりも狭いほうが良い。
ΔλＷＳ＞ΔλＰＳ
【００６８】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置２が第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、標本からの光を導光する光路に検出ユニットを追加した点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置２について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００６９】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２は、図８に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット（メインスキャンユニット）６０と、スキャンユニット６０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０（図示略）と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５（図示略）と、対物レンズ４５により集光された標本Ａからの光を分光する分光ユニット７０と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００７０】
スキャンユニット６０は、第１の実施形態のスキャンユニット２０と同様の構成（ダイクロイックミラー２１、ＸＹガルバノスキャナ２２、瞳投影レンズ２３、共焦点レンズ３１、共焦点ピンホール３２、およびコリメートレンズ３３）に加えて、コリメートレンズ３３により平行光にされた標本Ａからの光の一部または全部を分岐するダイクロイックミラー６１，６２と、ダイクロイックミラー６１，６２により分岐された標本Ａからの光のうちレーザ光等の不要な成分を遮断するバリアフィルタ６３，６４と、バリアフィルタ６３，６４を透過してきた標本Ａからの光をそれぞれ検出する光検出部６５，６６とを備えている。
【００７１】
分光ユニット７０は、第１の実施形態のスキャンユニット２０と同様に、コリメートレンズ３３により平行光にされた標本Ａからの光のうち光源装置１０からのレーザ光等の不要な成分を遮断するノッチフィルタ３４と、ノッチフィルタ３４を透過してきた標本Ａからの光を複数の波長帯域に分散する波長選択装置３５と、波長選択装置３５によりブラッグの反射条件を満たす波長帯域の光を検出する光検出部３６とを備えている。
【００７２】
ダイクロイックミラー６１，６２は、検出する波長帯域によって、図示しない駆動機構により標本Ａからの光の光路に挿脱されるようになっている。すなわち、光検出部６５により標本Ａからの光を検出する場合には、ダイクロイックミラー６１を標本Ａからの光の光路上に配置する。また、光検出部６５により標本Ａからの光を検出する場合には、ダイクロイックミラー６１を標本Ａからの光の光路上から外すとともに、ダイクロイックミラー６２を標本Ａからの光の光路上に配置する。また、光検出部３６により標本Ａからの光を検出する場合には、ダイクロイックミラー６１，６２を標本Ａからの光の光路上から外す。
【００７３】
あるいは、複数の光検出部により標本Ａからの光を検出する場合には、ダイクロイックミラー６１，６２の少なくとも一方を標本Ａからの光の光路上に配置する。例えば、ダイクロイックミラー６１，６２の両方を標本Ａからの光の光路上に配置した場合には、光検出部６５によりダイクロイックミラー６１で反射された光を検出し、光検出部６６によりダイクロイックミラー６２で反射された光を検出し、光検出部３６によりダイクロイックミラー６１，６２を透過した光を検出する。このようにすることで、３種類の蛍光色素を同時に検出することができる。
【００７４】
上記構成を有する本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２によれば、ダイクロイックミラー６１，６２を標本Ａからの光の光路に挿脱することで、光検出部３６，６５，６６のいずれか、あるいは光検出部３６，６５，６６の複数で標本Ａからの光を検出することができ、同時に多色の光を検出することができる。また、このような分光ユニット７０をＸＹガルバノスキャナ２２、光検出部６５，６６等を備えたスキャンユニット６０に後付け可能な構成とすることで、明るくかつ安価な分光検出手段を容易に付加できる。すなわち、スキャンユニット６０を備えたレーザ走査型顕微鏡２を、標本Ａからの光を各蛍光波長帯域毎に対して効率よく検出することができ、波長分解能が高い多重染色標本の観察を行うようにアップグレードすることができる。
【００７５】
なお、本実施形態において、標本Ａからの光の一部を分岐する手段として、光路上に挿脱されるダイクロイックミラー６１，６２を用いたが、これに代えて、例えばミラーと素ガラスとを切り替えて光路上に配置する機構としてもよい。
【００７６】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置３が第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、回折格子３７を透過してきた光（０次光）を検出する検出ユニットを追加した点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置３について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００７７】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡３は、図９に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット２０と、スキャンユニット２０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０（図示略）と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５（図示略）と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００７８】
スキャンユニット２０は、光源装置１０からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系２５と、標本Ａからの光を検出する検出光学系３０とを備えている。
照射光学系２５は、第１の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー２１と、ＸＹガルバノスキャナ２２と、瞳投影レンズ２３とを備えている。
【００７９】
検出光学系３０は、第１の実施形態と同様の構成（共焦点レンズ３１、共焦点ピンホール３２、コリメートレンズ３３、ノッチフィルタ３４、波長選択装置３５、および光検出部３６）に加えて、回折格子３７を透過してきた光（０次光）を検出する光検出部７１とを備えている。
【００８０】
図１０に示すように、回折格子３７を入射光に対して垂直に配置すると、ほとんどの波長の光が０次光として通り抜けてくる。したがって、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡３によれば、この０次光の射出方向に光検出部７１を配置することで、光検出部７１により広帯域の波長の光を一度に検出することができる。
【００８１】
これにより、広帯域の光を一度に検出するモードと、透過型のＶＰＨ回折格子３７による比較的狭い波長帯域（例えば１０〜２０ｎｍ）の光を検出するモードの両方を行うことができ、これらモードの切り換えを、回折格子３７を回転駆動させるガルバノメータ３８を用いて行うことができる。
【００８２】
また、光検出部７１により０次光を観察する場合は、ノッチフィルタ３４の代わりに、例えば５００〜６００ｎｍの透過帯域を持つ広帯域のバンドパスフィルタを設けることも有効である。
また、０次光を検出する光検出部７１を利用して、ビデオＡＦをかけても良い。
また、光検出部７１は、ＩＲ反射光でＤＩＣなどの検出を行っても良い。
【００８３】
［変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡３の変形例について説明する。
本変形例においては、図１１に示すように、光検出部７１に代えて、回折格子３７を透過する０次光を反射する反射ミラー７２と、反射ミラー７２により反射された０次光を光検出部３６に向けて反射する反射ミラー７３とを備えている。
【００８４】
本変形例に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、回折格子３７を透過する０次光を、反射ミラー（再入力手段）７２，７３により反射して光検出部３６に導光することができる。これにより、高価なＰＭＴ等の光検出部を１個削減して、製造コストを低減することができる。
【００８５】
なお、本変形例に係るレーザ走査型顕微鏡において、１次光のみを検出する場合には、０次光が光検出部３６に入らないように、回折格子３７と反射ミラー７２との間にシャッタを入れることとすれば良い。
【００８６】
〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置４が第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、回折格子３７を回転させるのではなく、回折格子３７への入射角度を変化させる点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置４について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００８７】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡４は、図１２に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット２０と、スキャンユニット２０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０（図示略）と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５（図示略）と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００８８】
スキャンユニット２０は、光源装置１０からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系２５と、標本Ａからの光を検出する検出光学系３０とを備えている。
照射光学系２５は、第１の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー２１と、ＸＹガルバノスキャナ２２と、瞳投影レンズ２３とを備えている。
【００８９】
検出光学系３０は、第１の実施形態と同様の構成（共焦点レンズ３１、共焦点ピンホール３２、コリメートレンズ３３、ノッチフィルタ３４、回折格子３７、および光検出部３６）の他、ノッチフィルタ３４を透過してきた標本Ａからの光を反射する反射ミラー７５と、反射ミラー７５を保持して反射ミラー７５を入射光に直交する軸線回りに回転させるガルバノメータ７６とを備えている。
【００９０】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡４は、検出波長の中心に対する回折効率が最大となる入射角度を合わせる方法が他の実施形態とは異なり、回折格子３７を回転させるのではなく、回折格子３７の前段に配置した反射ミラー７５をガルバノメータ７６により回転させる。
【００９１】
回折格子３７は、ブラッグ反射する波長が最も回折効率が高くなるので、反射ミラー７５と光検出部３６を回折格子３７に対して対称に配置することで、最大回折効率の光を検出することができる。
【００９２】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡４によれば、反射ミラー７５を回転させることにより、回折格子３７を回転させる場合よりも高速な波長切換に対応することができる。また、回折効率が最大となる波長はブラッグ反射して光検出部３６上の１点に集まるので、光検出部３６の受光面積を小さくすることができる。
【００９３】
〔第５の実施形態〕
次に、本発明の第５の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置５が第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、標本からの光をノンディスキャン検出するノンディスキャン検出ユニット８０を備える点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置５について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００９４】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡５は、図１３に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット２０と、スキャンユニット２０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５と、標本Ａからの光をノンディスキャン検出するノンディスキャン検出ユニット８０と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００９５】
スキャンユニット２０は、光源装置１０からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系２５と、標本Ａからの光を検出する検出光学系３０とを備えている。
照射光学系２５は、第１の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー２１と、ＸＹガルバノスキャナ２２と、瞳投影レンズ２３とを備えている。
【００９６】
検出光学系３０は、共焦点レンズ３１と、共焦点ピンホール３２と、コリメートレンズ３３と、ノッチフィルタ３４と、光検出部８６とを備えている。
接続ユニット４０は、結像レンズ４１と、光源装置１０からのレーザ光を反射する一方、標本Ａからの光を透過するダイクロイックミラー８７を備えている。
【００９７】
ノンディスキャン検出ユニット８０は、ダイクロイックミラー８７を透過した標本Ａからの光から光源装置１０からのレーザ光等をカットするＩＲカットフィルタ８１と、結像レンズ８２と、反射ミラー８３と、瞳投影レンズ８４と、回折格子３７およびガルバノメータ３８を有する波長選択装置３５と、シリンドリカルレンズ３９と、光検出部３６とを備えている。
【００９８】
ここでは、上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡５の詳細な構成について具体例を挙げて説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡５は、多光子励起により生じた蛍光を、ＸＹガルバノスキャナ２２に戻さずノンディスキャン検出し、回折格子３７を用いて、４２０〜７００ｎｍの波長帯域まで分光検出する。
【００９９】
光源装置１０から射出されるレーザ光は、標本Ａに多光子励起を生じさせるＩＲパルスレーザであり、７２０〜１０００ｎｍまでの波長のチューニングが可能である。
ＸＹガルバノスキャナ２２の光軸と対物レンズ４５の光軸との交点には、ダイクロイックミラー８７が配置されている。
【０１００】
ダイクロイックミラー８７は、光源装置１０からのＩＲパルスレーザ光を反射し、４００〜７１０ｎｍの可視光を透過する特性を有している。
ダイクロイックミラー８７の透過光路には、ＩＲカットフィルタ８１、結像レンズ８２、反射ミラー８３、瞳投影レンズ８４、波長選択装置３５、レンズ３９、および光検出部３６が配置されている。
【０１０１】
結像レンズ８２と瞳投影レンズ８４により、対物レンズ４５の瞳は回折格子３７に投影される。
回折格子３７に入射する光は、瞳投影レンズ８４により常に平行光となるが、ＸＹガルバノスキャナ２２による走査位置に応じて光軸に対する入射角度が変化する。
【０１０２】
具体的には、紙面内をＸ方向として走査による画像ピクセル数を５１２＊５１２とすると、図１４に示すように、画像左端（１ピクセル目）に対応する光線は符号９１ａ、画像中心（２５６ピクセル目）に対応する光線は符号９２ａ、画像右端（５１２ピクセル目）に対応する光線は符号９３ａのようになる。すなわち、ＸＹガルバノスキャナ２２による走査位置が、光軸中心から離れるに従って回折格子３７に入射する光の入射角が大きくなる。
【０１０３】
この場合において、Ｘ方向の画像左端と右端にそれぞれ対応する光の回折格子３７への入射角の差を、分光する波長の最短波長（本実施形態では４２０ｎｍ）と、最長波長（本実施形態では７００ｎｍ）のブラッグの反射条件を満たす角度の差に合わせる。
【０１０４】
上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡５の標本Ａの観察方法について以下に説明する。
まず、図１４に示すように、Ｘの画像右端（５１２ピクセル目）に対応する入射光９３ａが４２０ｎｍの時に、ブラッグ反射する角度にＶＰＨ回折格子回転角（α１）を合わせてＸＹスキャンを行い、画像を取得する。この時、図１５に示すように、画像右端（５１２ピクセル目）のデータを４２０ｎｍのデータとして保存し、１〜５１１ピクセルのデータは廃棄する。
【０１０５】
その後、図１６、図１８、図２０、図２２に示すように、回折格子３７の回転角を変化させながら、ＸＹ画像の取得を繰り返す。なお、各図の間に刻むＶＰＨ回折格子回転角αの可変ピッチは、必要な波長分解能に応じて決定すればよい。
【０１０６】
図１６は、画像中心（２５６ピクセル目）入射光９２ａが４２０ｎｍの時にブラッグ反射するＶＰＨ回折格子回転角（α２）である。この場合には、図１７に示すように、画像中心（２５６ピクセル目）のデータが４２０ｎｍ、画像右端（５１２ピクセル目）のデータを５６０ｎｍのデータとして保存し、１〜２５５ピクセル目までのデータは廃棄する。
【０１０７】
図１８は、画像左端（１ピクセル目）入射光９１ａが４２０ｎｍの時にブラッグ反射するＶＰＨ回折格子回転角（α３）である。この場合には、図１９に示すように、画像左端（１ピクセル目）のデータが４２０ｎｍ、画像中心（２５６ピクセル目）のデータが５６０ｎｍ、画像右端（５１２ピクセル目）のデータを７００ｎｍのデータとして保存する。この場合には、廃棄するデータはない。
【０１０８】
図２０は、画像左端（１ピクセル目）入射光が５６０ｎｍ（４２０ｎｍと７００ｎｍの中間）の時にブラッグ反射するＶＰＨ回折格子回転角（α４）である。この場合には、図２１に示すように、画像左端（１ピクセル目）のデータを５６０ｎｍのデータとして保存し、画像中心（２５６ピクセル目）のデータを７００ｎｍのデータとして保存し、２５７〜５１２ピクセルのデータは廃棄する。
【０１０９】
図２２は、画像左端（１ピクセル目）の入射光が７００ｎｍの時にブラッグ反射するＶＰＨ回折格子回転角（α５）であり、画像左端（１ピクセル目）のデータを７００ｎｍのデータとして保存する。この場合には、図２３に示すように、２〜５１２ピクセルのデータは廃棄する。
【０１１０】
上記の標本Ａの観察方法の動作をまとめた図が図２４に示されている。
図２４の矢印９５に示すように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡５によれば、各取得画像のＸ方向において同一ピクセルのデータをまとめることで、ピクセル毎の４２０ｎｍ〜７００ｎｍの分光データが取得できる。
【０１１１】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態および各変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【０１１２】
Ａ 標本
１，２，３，４，５ レーザ走査型顕微鏡
１０ 光源装置
１５ 音響光学素子（波長選択手段）
２０ スキャンユニット
２２ ＸＹガルバノスキャナ（走査部）
２５ 照射光学系
３０ 検出光学系
３５ 波長選択装置
３６ 光検出部
３７ 回折格子
３８ ガルバノメータ（入射角度変更手段）
３９ シリンドリカルレンズ（集光光学系）
４０ 接続ユニット
４５ 対物レンズ
５０ 制御ユニット
６０ スキャンユニット（メインスキャンユニット）
７０ 分光ユニット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、表面反射型の回折格子と、１次元に配列された３２個のセルよりなるマルチチャンネルＰＭＴとを備えるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、回転可能な表面反射型の回折格子と、スリット幅を可変な可変スリットと、０次元検出器とを備えるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１８５５８１号公報
【特許文献２】特開２００６−０１０９４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に開示されているレーザ走査型顕微鏡は、ピクセル毎の蛍光分光データを測定し、色素毎の参照スペクトルを用いて演算処理を行うことでクロストークの大きい複数蛍光を分離している。
【０００５】
しかしながら、波長分解能を上げると１個のセルで検出する検出光量が少なくなってＳ／Ｎが悪化してしまう。また、１個のセルで取込む波長幅を広くすると、明るくなるが波長分解能が低下してしまう。したがって、１個のセルで、１０ｎｍ幅程度の波長域を検出するようにしており、波長分解能が悪いという不都合がある。また、マルチチャンネル検出器は、電気系も含め高価で制御系が複雑化する。さらに、反射型の回折格子は、回折効率が低く、最も効率が良い波長でも７０％程度の回折効率であるため、検出する光量が低下してしまうという不都合がある。
【０００６】
特許文献２に開示されているレーザ走査型顕微鏡は、回転可能な表面反射型の回折格子と可変スリットにより、１回で取込む波長幅と、波長領域を任意に設定することが可能である。例えば、スリット幅を波長幅１０ｎｍに設定し、回折格子の回転ピッチの波長送りを２ｎｍに設定することで、明るさと波長分解能の両立を実現している。
【０００７】
しかしながら、可変スリットのスリット幅と回折格子の回転角を正確に合わせないと正しいデータを取得できないので、調整が困難であり、且つ装置が複雑化するという不都合がある。また、可変スリットと回折格子の両方を同期制御する必要があり、システムが高価となるという不都合がある。さらに、反射型の回折格子は、取込める波長領域は広いが回折効率が低く、最も効率が良い波長でも７０％程度の回折効率であるため、検出する光量が低下してしまうという不都合がある。
【０００８】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、波長幅を切り出すスリットや、高価なマルチチャンネル検出器を用いることなく、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能の高い分光検出ができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、レーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic（ＶＰＨ）回折格子と、該ＶＰＨ回折格子により分散された光を検出する光検出部と、前記標本からの光の前記ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段とを備え、前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記ＶＰＨ回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させるレーザ走査型顕微鏡を採用する。
【００１０】
本発明によれば、レーザ光源から射出されたレーザ光が走査部により標本上において走査され、標本からの光が対物レンズにより集光される。この標本からの光は、透過型のVolume Phase Holographic（ＶＰＨ）回折格子により複数の波長帯域に分散され、光検出部により検出される。この際、入射角度変更手段により、標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角が変化させられることで、標本からの光の分散状態が変化する。この場合において、光検出部により検出される複数の波長帯域の光のそれぞれについて、ブラッグの反射条件を満たすように、標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角が変化させられる。なお、ブラッグの反射条件とは、以下の式を満たす条件をいい、この条件において高い回折効率を得ることができ、強度の高い光を検出することができる。
２ｄｓｉｎΘ＝ｎλ
ここで、ｄはＶＰＨ回折格子の周期、Θは標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角、ｎは整数、λは波長である。
【００１１】
したがって、波長帯域毎にブラッグの反射条件を満たすように標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角を変化させることで、強度の高い標本からの光を波長帯域毎に検出することができる。
以上のように、本発明によれば、波長幅を切り出すスリットや、高価なマルチチャンネル検出器を用いることなく、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能が高い分光検出を行うことができる。
【００１２】
上記発明において、前記入射角度変更手段が、前記ＶＰＨ回折格子による分散方向に直交する軸線回りに前記ＶＰＨ回折格子を回転させることとしてもよい。
ＶＰＨ回折格子を分散方向に直交する軸線回りに回転させることで、標本からの光のＶＰＨ回折格子への入射角が変化する。この際、光検出部により検出される複数の波長帯域の光のそれぞれについて、ブラッグの反射条件を満たすように、ＶＰＨ回折格子を軸線回りに回転させることで、高い回折効率を得ることができ、強度の高い光を検出することができる。
【００１３】
上記発明において、前記光検出部により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、前記入射角度変更手段を駆動させる制御部と、前記入射角度変更手段の動作に同期して、前記レーザ光の波長を選択する波長選択手段とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、光検出部により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、ブラッグの反射条件を満たす波長の光を切り替えるとともに、この切り替えに同期してレーザ光の波長を切り替えることができる。これにより、波長選択用スリットや、マルチチャンネルＰＭＴや、反射型回折格子を用いないで、ＶＰＨ回折格子により分散された波長毎に標本からの光を検出することができ、多重染色画像を容易に取得することができる。また、検出する波長帯域の中心波長の回折効率が最大となるようにＶＰＨ回折格子への入射角を変更することで、従来の反射型回折格子を用いたものに比べて回折効率を向上させることができ、明るい画像を取得することができる。
【００１４】
上記発明において、等間隔ピッチで検出波長を時系列的に切り替えて画像を取得（λスキャン）し、各前記画像において対応するピクセルの輝度変化を用いて、ピクセル毎の分光データを取得することとしてもよい。
このようにすることで、分光データを細かく取得できるので、クロストークが大きい色素についても分離が可能である。
【００１５】
上記発明において、前記光検出部により検出される光の中心波長のピッチが、前記ＶＰＨ回折格子の回折効率が５０％における波長幅よりも狭く設定されていることとしてもよい。
このようにすることで、ＶＰＨ回折格子の回折効率を向上させることができ、明るい画像を取得することができる。
【００１６】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子の回折効率が５０％における波長幅が、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルのうち、バンド幅が最も狭い蛍光スペクトルの半値幅よりも狭く設定されていることとしてもよい。
ＶＰＨ回折格子の一つの回転角での分光特性の回折効率の半値幅は、各蛍光色素のうちバンド幅が最も狭い蛍光色素のバンドの半値幅よりも狭いほうが良く、特に、半分以下が好ましい。
【００１７】
上記発明において、λスキャンの波長ピッチが、複数の蛍光色素のうちピーク波長の中心間隔が最も狭い間隔の半分以下に設定されていることとしてもよい。
λスキャンの波長ピッチは、複数の蛍光スペクトルのうち、ピーク間隔が最も狭い間隔の半分以下が好ましい。
【００１８】
上記発明において、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを前記走査部による走査に同期して行うこととしてもよい。
このようにすることで、検出波長毎の時間差を極めて少なくでき、動きのある標本を正確に捉えることができる。
【００１９】
上記発明において、前記走査部の主走査方向のライン毎に、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを行うこととしてもよい。
このようにすることで、効果的に入射角度の切り替えと走査部による走査とを同期させることができ、動きのある標本を正確に捉えることができる。
【００２０】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子と前記ＶＰＨ回折格子に入射する前記標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、前記光検出部による検出データに波長毎に乗算することとしてもよい。
ＶＰＨ回折格子と標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、光検出部による検出データに波長毎に乗算することで、波長毎の回折効率の違いを補正することができ、正確な分光データを取得することができる。
【００２１】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子と前記光検出部との間に、前記ＶＰＨ回折格子から分散される光を前記光検出部の有効受光面に集光する集光光学系を備えることとしてもよい。
このようにすることで、ＶＰＨ回折格子から分散される光を光検出部の有効受光面に集光させることができ、標本からの光の検出効率を向上させて明るい画像を取得することができる。
【００２２】
上記発明において、前記集光光学系が、前記分散方向にのみ前記標本からの光を集光するシリンドリカルレンズであることとしてもよい。
集光光学系をシリンドリカルレンズとすることで、ＶＰＨ回折格子による分散方向にのみ標本からの光を集光することができ、効率的に光検出部の有効受光面に集光させることができる。
【００２３】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子、前記入射角度変更手段、および前記光検出部から構成される分光ユニットと、前記標本からの光のうち検出する波長を選択可能な検出系を含むメインスキャンユニットとを備え、前記分光ユニットと前記メインスキャンユニットとが着脱可能に構成されていることとしてもよい。
このようにすることで、光検出部と検出系のいずれか、あるいは両方で標本からの光を検出することができ、同時に多色の光を検出することができる。また、上記構成を有する分光ユニットをメインスキャンユニットに後付け可能な構成とすることで、明るくかつ安価な分光検出手段を容易に付加できる。すなわち、メインスキャンユニットを備えたレーザ走査型顕微鏡を、標本からの光を各蛍光波長帯域毎に対して効率よく検出することができ、波長分解能が高い多重染色標本の観察を行うようにアップグレードすることができる。
【００２４】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子を直進する光（０次光）を検出する第２の光検出部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、第２の光検出部により広帯域の光を一度に検出するモードと、ＶＰＨ回折格子による比較的狭い波長帯域（例えば１０〜２０ｎｍ）の光を検出するモードの両方を行うことができ、これらモードの切り換えを、入射角度変更手段により行うことができる。
【００２５】
上記発明において、前記ＶＰＨ回折格子を直進する光（０次光）を、前記光検出部に再入力する再入力手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、ＶＰＨ回折格子により回折される光とＶＰＨ回折格子を直進する光の両方を１つの光検出部で検出することができ、高価な光検出部（例えばＰＭＴ）を１個削減できる。なお、再入力手段としては、例えば、ＶＰＨ回折格子を直進する光を光検出部の受光面に向けて反射するミラーを用いればよい。
【００２６】
上記発明において、前記光検出部が、ノンディスキャン検出器であり、前記入射角度変更手段により前記ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させながら、前記ノンディスキャン検出器により前記標本からの光から複数の画像を生成し、該複数の画像間のピクセルデータを結合することとしてもよい。
このようにすることで、ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させながらノンディスキャン検出器により取得した各画像における対応するピクセルのデータを結合することで、ピクセル毎の分光データを取得することができる。
【００２７】
上記発明において、前記入射角度変更手段は、前記ＶＰＨ回折格子に入射する検出光の角度を可変する反射ミラーであり、該反射ミラーと前記光検出部とが、前記ＶＰＨ回折格子を挟んで略対称の位置に配置されていることとしてもよい。
このようにすることで、ミラーを回転させることにより、ＶＰＨ回折格子を回転させる場合よりも高速な波長切換に対応することができる。また、回折効率が最大となる波長はブラッグ反射し、光検出部上の１点に集まるので、光検出部の受光面積を小さくすることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能の高い分光検出ができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の波長選択装置周辺の部分拡大図である。
【図３】図１の回折格子の断面図である。
【図４】図１の回折格子により回折される光を説明する図である。
【図５】図４の中心波長毎のＶＰＨ回折格子回転角と絶対出射角を示すグラフである。
【図６】回折効率と波長帯域との関係を示すグラフである。
【図７】ブラッグ反射条件を満たす波長における分光特性を示すグラフである。
【図８】本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図９】本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図１０】図９の波長選択装置周辺の部分拡大図である。
【図１１】図１０の変形例に係る波長選択装置周辺の部分拡大図である。
【図１２】本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図１３】本発明の第５の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図１４】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像右端の入射光（４２０ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図１５】図１４の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図１６】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像中心の入射光（４２０ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図１７】図１６の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図１８】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像左端の入射光（４２０ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図１９】図１８の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図２０】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像左端の入射光（５６０ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図２１】図２０の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図２２】図１３のレーザ走査型顕微鏡において画像左端の入射光（７００ｎｍ）がブラッグ反射する際の状態を説明する図である。
【図２３】図２２の状態におけるデータ取得領域を説明する図である。
【図２４】図１３のレーザ走査型顕微鏡において各画素におけるデータ取得領域を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット２０と、結像レンズ４１およびミラー４２を有し、スキャンユニット２０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００３１】
光源装置１０は、例えば中心波長５６０ｎｍのレーザ光を発するレーザ光源１１と、例えば中心波長４８８ｎｍのレーザ光を発するレーザ光源１２と、例えば中心波長４０５ｎｍのレーザ光を発するレーザ光源１３と、これらレーザ光源からのレーザ光の光路を合成するダイクロイックミラー１４と、射出するレーザ光の波長を切り替えるＡＯＴＦ（Acousto-optic tunable filter）等の音響光学素子（波長選択手段）１５とを備えている。
【００３２】
光源装置１０とスキャンユニット２０とは、例えば可視用シングルモードファイバ１９により接続され、光源装置１０からのレーザ光がスキャンユニット２０に導光される。
スキャンユニット２０は、光源装置１０からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系２５と、標本Ａからの光を検出する検出光学系３０とを備えている。
【００３３】
照射光学系２５は、光源装置１０からのレーザ光を反射する一方、標本Ａからの光を透過するダイクロイックミラー２１と、ダイクロイックミラー２１により反射されたレーザ光を標本Ａ上で２次元走査するＸＹガルバノスキャナ（走査部）２２と、レーザ光の瞳を投影する瞳投影レンズ２３とを備えている。
【００３４】
検出光学系３０は、ダイクロイックミラー２１を透過してきた標本Ａからの光を共焦点ピンホール３２に集光する共焦点レンズ３１と、標本Ａの焦点位置からの光のみを通過させる共焦点ピンホール３２と、共焦点ピンホール３２を通過してきた標本Ａからの光を平行光にするコリメートレンズ３３と、コリメートレンズ３３により平行光にされた標本Ａからの光のうち光源装置１０からのレーザ光等の不要な成分を遮断するノッチフィルタ３４と、ノッチフィルタ３４を透過してきた標本Ａからの光を複数の波長帯域から所定の波長帯域の光を選択する波長選択装置３５と、波長選択装置３５により選択された波長帯域の光を検出する光検出部３６とを備えている。
【００３５】
波長選択装置３５は、図２に示すように、ノッチフィルタ３４を透過してきた標本Ａからの光を複数の波長帯域に分散する透過型の回折格子３７と、回折格子３７を保持し、回折格子３７を標本Ａからの光の分散方向（図２において紙面に沿う方向）に直交する軸線回りに回転させるガルバノメータ（入射角度変更手段）３８とを備えている。
【００３６】
回折格子３７は、図３に示すように、透過型のＶＰＨ（Volume Phase Holographic）回折格子である。
透過型のＶＰＨ回折格子は、媒質の屈折率を周期的に変化させたもので、ブラッグの反射条件を満たす波長において高い回折効率が得られ、その他の波長においては殆ど回折しないようにすることができる。
例えば白色光Ｗに対する回折格子３７の向きを回転調整することで、ブラッグの反射条件に合った波長の光を効率的に取り出せる。具体的には、図３に示すように、回折格子３７が符号Ｒに示す位置にある場合には赤の波長の光が矢印Ｒに示す方向に射出し、回折格子３７が符号Ｇに示す位置にある場合には緑の波長の光が矢印Ｇに示す方向に射出し、回折格子３７が符号Ｂに示す位置にある場合には青の波長の光が矢印Ｂに示す方向に射出する。
なお、１次回折光として得られる光（矢印Ｒ，Ｇ，Ｂの向きにそれぞれ射出される光）の波長幅は、回折格子３７の厚みによって変化し、厚みが厚いほど波長幅が狭くなるので、所望の波長幅となるように厚みを選択する。
【００３７】
ガルバノメータ３８は、制御ユニット５０からの指示に基づいて、回折格子３７を標本Ａからの光の分散方向に直交する軸線回りに回転させるようになっている。具体的には、ガルバノメータ３８は、光検出部３６により検出する波長帯域の中心波長に合わせて駆動され、光検出部３６により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、回折格子３７を軸線回りに回転させるようになっている。ここで、ブラッグの反射条件とは、以下の式を満たす条件をいい、この条件において高い回折効率が得られる。
２ｄｓｉｎΘ＝ｎλ
上記の式において、ｄは回折格子３７の周期、Θは標本Ａからの光の回折格子３７への入射角、ｎは整数、λは波長である。透過型のＶＰＨ回折格子では、ｎ＝１の時に高い回折効率が得られる。
【００３８】
光検出部３６は、例えばＰＭＴ（Photomultiplier Tube：光電子増倍管）である。光検出部３６として、サイドオン型ＰＭＴを用いる場合は、軸方向の感度ユニフォミティが比較的緩いので、軸方向を分散方向に合わせて配置する。
【００３９】
ここで、光検出部３６の受光面は、分散した波長を全て受光できる受光面の大きさおよび角度ユニフォミティが必要である。ただし、受光面の大きさ、角度ユニフォミティに問題があれば、シリンドリカルレンズ等の集光光学系を配置することで、受光面に対する大きさを調節することができる。
【００４０】
そこで、波長選択装置３５と光検出部３６との間には、図２に示すように、波長選択装置３５により選択された波長帯域の光を、その分散方向にのみ集光するシリンドリカルレンズ（集光光学系）３９が配置されている。このシリンドリカルレンズ３９の作用により、波長選択装置３５により分散された複数の波長帯域の光を光検出部３６に集光させることができ、光検出部３６の受光面を小さくすることができる。
【００４１】
制御ユニット５０は、ＸＹガルバノスキャナ２２、音響光学素子１５、ガルバノメータ３８、および光検出部３６を同期制御するようになっている。具体的には、制御ユニット５０は、ＸＹガルバノスキャナ２２の走査位置と光検出部３６により検出される標本Ａからの光の強度とに基づいて標本Ａの画像を生成するようになっている。また、制御ユニット５０は、光検出部３６により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、音響光学素子１５によりレーザ光の波長を切り替えるとともに、ガルバノメータ３８を駆動させて回折格子３７への入射角を変化させるようになっている。
【００４２】
上記のようにガルバノメータ３８を動作させた場合の、光検出部３６により検出される標本Ａからの光の作用について、具体例を用いて以下に説明する。
図４において、符号αは、回折格子３７の回転角（以下「ＶＰＨ回折格子回転角」という）、すなわち入射光に対する回折格子３７の法線（以下「ＶＰＨ回折格子法線」という）の角度である。符号βは、ＶＰＨ回折格子法線に対する１次回折光の出射角度である。符号γは、絶対出射角、すなわち入射光（０次光）に対する１次回折光の出射角度である。
【００４３】
図５は、中心波長毎のＶＰＨ回折格子回転角αと絶対出射角γとの関係を示している。図５において、ＶＰＨ回折格子回転角αは、ブラッグの反射条件を満たす波長毎の回転角を示している。
【００４４】
回折格子３７の厚みは、１次回折光として回折可能な波長範囲を決めるものである。すなわち、回折格子３７の屈折率分布の厚みを調節することで、角度に対する回折効率の高い波長範囲を調節することができる。ここでは、例えば、回折格子３７の格子間隔を１２００本／ｍｍ、回折格子３７の屈折率分布の厚みを１２０μｍ程度にすることで、図６に示すように、回折効率５０％で波長幅が約１０ｎｍ、回折効率ほぼ０％で波長幅が約２０ｎｍとしている。なお、サイドロープは、強度が弱いので無視できるものとする。
【００４５】
つまり、回折格子３７の回転角を、１５．７°に設定すると図６の実線に示す回折効率となり、１９．３°に設定すると図６の点線に示す回折効率となり、２３°に設定すると図６の二点鎖線に示す回折効率となる。各中心波長に対する回折効率の特性は、図６の曲線５１のように表わされる。
【００４６】
上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡１の作用について以下に説明する。
ここでは、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１を用いて、光検出部３６により標本Ａの蛍光観察を行う場合について説明する。
まず、光源装置１０を作動させ、スキャンユニット２０にレーザ光を入射させる。スキャンユニット２０に導光されたレーザ光は、ダイクロイックミラー２１により反射されてＸＹガルバノスキャナ２２に導光される。ＸＹガルバノスキャナ２２では、レーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させる。このように走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ２３および結像レンズ４１を透過してミラー４２により偏向され、対物レンズ４５により標本Ａ上に照射される。
【００４７】
標本Ａ上の対物レンズ４５の焦点面においては、標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ４５により集光され、ミラー４２、結像レンズ４１、瞳投影レンズ２３を介して、ＸＹガルバノスキャナ２２に導光される。ＸＹガルバノスキャナ２２を通過した蛍光は、ダイクロイックミラー２１を透過し、共焦点レンズ３１により集光され、標本Ａの焦点面において発生した蛍光のみが共焦点ピンホール３２を通過する。共焦点ピンホール３２を通過した蛍光は、コリメートレンズ３３により平行光にされ、ノッチフィルタ３４を透過することで不要な励起光の波長がカットされる。ノッチフィルタ３４を透過してきた蛍光は、波長選択装置３５によりブラッグの反射条件を満たす蛍光波長帯域が選択されて、光検出部３６により検出される。
【００４８】
このように光検出部３６により検出された蛍光の強度情報とＸＹガルバノスキャナ２２によるレーザ光の照射位置とを対応づけて記憶することにより、２次元的な蛍光画像を構築することが可能となる。
【００４９】
上記の画像取得方法において、光検出部３６により検出する光を切り替えて多重染色画像を取得する際の処理について説明する。
前提条件として、蛍光色素ＤＡＰＩ（４０５ｎｍ励起／４５０ｎｍ検出）、蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８（４８８ｎｍ励起／５３０ｎｍ検出）、蛍光色素Ａｌｅｘａ５６０（５６０ｎｍ励起／５８０ｎｍ検出）で３重染色された標本Ａの観察を行う。この場合において、ノッチフィルタ３４として、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６０ｎｍの波長の光をカットする特性のものを用いる。
【００５０】
まず、音響光学素子１５でレーザ波長を４０５ｎｍに設定する。
この場合には、中心波長４５０ｎｍの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角α（１５．７°）を設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する（ＤＡＰＩの画像）。
【００５１】
次に、音響光学素子１５でレーザ波長を４８８ｎｍに設定する。
この場合には、中心波長５３０ｎｍの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角α（１８．５°）を設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する（Ａｌｅｘａ４８８の画像）。
【００５２】
次に、音響光学素子１５でレーザ波長５６０ｎｍを設定する。
この場合には、中心波長５８０ｎｍの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角α（２０．４°）を設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する（Ａｌｅｘａ５６０の画像）。
そして、上記のように取得した３つのモノクロ画像に擬似カラーをつけて、多チャンネル画像として表示する。
【００５３】
以上のように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、それぞれの蛍光色素毎の検出波長帯域に合わせて、ブラッグの反射条件を満たすようにガルバノメータ３８を動作させ、回折格子３７を軸線回りに回転させることで、標本Ａからの光を各蛍光波長帯域毎に対して効率よく検出することができる。すなわち、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、波長幅を切り出すスリットや、高価なマルチチャンネル検出器を用いることなく、簡単かつ安価な構成で、明るく、かつ、波長分解能が高い多重染色標本の観察を行うことができる。
【００５４】
また、回折格子３７は、透過型のＶＰＨ回折格子であり、かつ、検出波長帯域毎にブラッグの反射条件を満たすようにしているので、反射型の回折格子３７に比べて、光検出部３６により検出する光量を増大させることができ、明るい多重染色画像を取得することができる。
【００５５】
［第１の変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第１の変形例について説明する。
本変形例における、光検出部３６により検出する光の波長を順次切り替えてλスキャンを行う際の処理について以下に説明する。
前提条件として、蛍光色素ＧＦＰと蛍光色素ＹＦＰにより２重染色された標本Ａの観察を行う。この場合において、ノッチフィルタ３４として４８８ｎｍの波長の光カットする特性のものを用い、ダイクロイックミラー２１は例えば素ガラスを使用する。
【００５６】
まず、音響光学素子１５でレーザ波長を４８８ｎｍに設定する。
この場合には、中心波長５００ｎｍの光が回折効率最大となるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角α（１７．５°）を設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する。
【００５７】
次に、中心波長５０２ｎｍの光が回折効率最大になるようにガルバノメータ３８を駆動することで、ＶＰＨ回折格子回転角αを設定し、ＸＹガルバノスキャナ２２を動作させて画像を取得する。
以下、検出する光の中心波長を２ｎｍずつずらしながら、回折効率が最大となるＶＰＨ回折格子回転角αを設定して画像取得を繰返す。これらの動作を制御ユニット５０により時系列的に切り替えながら行う。
【００５８】
上記のように取得したピクセル毎の分光データを基に、例えば特開２００３−１８５５８１号公報に記載のアンミキシング処理を施すことで、蛍光色素ＧＦＰと蛍光色素ＹＦＰとを分離して、多チャンネル画像として表示する。
【００５９】
本変形例に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、前述の効果に加えて、回折格子３７を回転させて分光データを細かく取得できるので、クロストークが大きい色素についても分離が可能である。特に、本変形例においては、回折格子３７を回転させて、２ｎｍ刻みで分光データを取得できるので、クロストークが大きい色素の分離が可能である。
【００６０】
［第２の変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第２の変形例について説明する。
本変形例においては、前述の画像を取得する際の処理において、ガルバノメータ３８による回折格子３７の回転角度の切り替えを、ＸＹガルバノスキャナ２２による走査に同期させ、ＸＹガルバノスキャナ２２の主走査であるＸライン毎に行う。
このようにすることで、検出波長毎の時間差を極めて少なくでき、動きのある標本Ａを正確に捉えることができる。
【００６１】
［第３の変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第３の変形例について説明する。
前述の第１の実施形態では色素毎に１つの中心波長でのみ検出していたが、本変形例においては、色素の分光特性に合わせて複数の中心波長でデータ取得し、同じ色素のデータとして合算する。
このようにすることで、同じ色素のデータが合算されるので、各画像におけるＳ／Ｎを向上することができる。
【００６２】
［第４の変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の第４の変形例について説明する。
本変形例においては、回折格子３７と回折格子３７に入射する標本Ａからの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率（図６における曲線５１）の逆数を、波長毎に検出データに乗算する。
このようにすることで、波長毎の回折効率の違いを補正することができ、正確な分光データを取得することができる。
【００６３】
［第５の変形例］
以下に、本実施形態の第１の変形例に係るレーザ走査型顕微鏡１の第５の変形例について説明する。
本変形例においては、図７に示すように、３種の蛍光（蛍光スペクトルＡ，Ｂ，Ｃ）をλスキャンして分光データを取得し、アンミキシング処理によりこれらの蛍光を分離する。
【００６４】
この場合において、回折格子３７の一つの回転角での分光特性の回折効率の半値幅は、以下に示すように、各蛍光色素の分光特性でバンド幅が最も狭い蛍光色素のバンドの半値幅よりも狭いほうが良い。
ΔλＷＳ＜ΔλＷＢ
ここで、
ΔλＷＳ：回折格子３７の分光特性の回折効率５０％地点の波長幅（半値幅）
ΔλＷＢ：最もバンド幅が狭い、蛍光スペクトルＢの分光特性の半値幅
【００６５】
また、より好ましくは、回折格子３７の一つの回転角での分光特性の回折効率の半値幅は、以下に示すように、各蛍光色素の分光特性でバンド幅が最も狭い蛍光色素のバンドの半値幅の半分以下が良い。
ΔλＷＳ＜ΔλＷＢ／２
【００６６】
また、λスキャンの波長ピッチは、以下に示すように、複数の蛍光スペクトルのピーク間隔で最も狭い間隔の半分以下が良い。
ΔλＰＳ＜ΔλＰ／２
ここで、
ΔλＰＳ：回折格子３７によるλスキャンの波長ピッチ
ΔλＰ：複数の蛍光スペクトルのうち、ピーク間隔が最も近い蛍光色素（蛍光スペクトルＡ、Ｂ間）のピーク波長間隔
【００６７】
また、λスキャンの波長ピッチは、以下に示すように、回折格子３７の一つの回転角の分光特性の回折効率の半値幅よりも狭いほうが良い。
ΔλＷＳ＞ΔλＰＳ
【００６８】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置２が第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、標本からの光を導光する光路に検出ユニットを追加した点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置２について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００６９】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２は、図８に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット（メインスキャンユニット）６０と、スキャンユニット６０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０（図示略）と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５（図示略）と、対物レンズ４５により集光された標本Ａからの光を分光する分光ユニット７０と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００７０】
スキャンユニット６０は、第１の実施形態のスキャンユニット２０と同様の構成（ダイクロイックミラー２１、ＸＹガルバノスキャナ２２、瞳投影レンズ２３、共焦点レンズ３１、共焦点ピンホール３２、およびコリメートレンズ３３）に加えて、コリメートレンズ３３により平行光にされた標本Ａからの光の一部または全部を分岐するダイクロイックミラー６１，６２と、ダイクロイックミラー６１，６２により分岐された標本Ａからの光のうちレーザ光等の不要な成分を遮断するバリアフィルタ６３，６４と、バリアフィルタ６３，６４を透過してきた標本Ａからの光をそれぞれ検出する光検出部６５，６６とを備えている。
【００７１】
分光ユニット７０は、第１の実施形態のスキャンユニット２０と同様に、コリメートレンズ３３により平行光にされた標本Ａからの光のうち光源装置１０からのレーザ光等の不要な成分を遮断するノッチフィルタ３４と、ノッチフィルタ３４を透過してきた標本Ａからの光を複数の波長帯域に分散する波長選択装置３５と、波長選択装置３５によりブラッグの反射条件を満たす波長帯域の光を検出する光検出部３６とを備えている。
【００７２】
ダイクロイックミラー６１，６２は、検出する波長帯域によって、図示しない駆動機構により標本Ａからの光の光路に挿脱されるようになっている。すなわち、光検出部６５により標本Ａからの光を検出する場合には、ダイクロイックミラー６１を標本Ａからの光の光路上に配置する。また、光検出部６５により標本Ａからの光を検出する場合には、ダイクロイックミラー６１を標本Ａからの光の光路上から外すとともに、ダイクロイックミラー６２を標本Ａからの光の光路上に配置する。また、光検出部３６により標本Ａからの光を検出する場合には、ダイクロイックミラー６１，６２を標本Ａからの光の光路上から外す。
【００７３】
あるいは、複数の光検出部により標本Ａからの光を検出する場合には、ダイクロイックミラー６１，６２の少なくとも一方を標本Ａからの光の光路上に配置する。例えば、ダイクロイックミラー６１，６２の両方を標本Ａからの光の光路上に配置した場合には、光検出部６５によりダイクロイックミラー６１で反射された光を検出し、光検出部６６によりダイクロイックミラー６２で反射された光を検出し、光検出部３６によりダイクロイックミラー６１，６２を透過した光を検出する。このようにすることで、３種類の蛍光色素を同時に検出することができる。
【００７４】
上記構成を有する本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２によれば、ダイクロイックミラー６１，６２を標本Ａからの光の光路に挿脱することで、光検出部３６，６５，６６のいずれか、あるいは光検出部３６，６５，６６の複数で標本Ａからの光を検出することができ、同時に多色の光を検出することができる。また、このような分光ユニット７０をＸＹガルバノスキャナ２２、光検出部６５，６６等を備えたスキャンユニット６０に後付け可能な構成とすることで、明るくかつ安価な分光検出手段を容易に付加できる。すなわち、スキャンユニット６０を備えたレーザ走査型顕微鏡２を、標本Ａからの光を各蛍光波長帯域毎に対して効率よく検出することができ、波長分解能が高い多重染色標本の観察を行うようにアップグレードすることができる。
【００７５】
なお、本実施形態において、標本Ａからの光の一部を分岐する手段として、光路上に挿脱されるダイクロイックミラー６１，６２を用いたが、これに代えて、例えばミラーと素ガラスとを切り替えて光路上に配置する機構としてもよい。
【００７６】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置３が第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、回折格子３７を透過してきた光（０次光）を検出する検出ユニットを追加した点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置３について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００７７】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡３は、図９に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット２０と、スキャンユニット２０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０（図示略）と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５（図示略）と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００７８】
スキャンユニット２０は、光源装置１０からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系２５と、標本Ａからの光を検出する検出光学系３０とを備えている。
照射光学系２５は、第１の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー２１と、ＸＹガルバノスキャナ２２と、瞳投影レンズ２３とを備えている。
【００７９】
検出光学系３０は、第１の実施形態と同様の構成（共焦点レンズ３１、共焦点ピンホール３２、コリメートレンズ３３、ノッチフィルタ３４、波長選択装置３５、および光検出部３６）に加えて、回折格子３７を透過してきた光（０次光）を検出する光検出部７１とを備えている。
【００８０】
図１０に示すように、回折格子３７を入射光に対して垂直に配置すると、ほとんどの波長の光が０次光として通り抜けてくる。したがって、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡３によれば、この０次光の射出方向に光検出部７１を配置することで、光検出部７１により広帯域の波長の光を一度に検出することができる。
【００８１】
これにより、広帯域の光を一度に検出するモードと、透過型のＶＰＨ回折格子３７による比較的狭い波長帯域（例えば１０〜２０ｎｍ）の光を検出するモードの両方を行うことができ、これらモードの切り換えを、回折格子３７を回転駆動させるガルバノメータ３８を用いて行うことができる。
【００８２】
また、光検出部７１により０次光を観察する場合は、ノッチフィルタ３４の代わりに、例えば５００〜６００ｎｍの透過帯域を持つ広帯域のバンドパスフィルタを設けることも有効である。
また、０次光を検出する光検出部７１を利用して、ビデオＡＦをかけても良い。
また、光検出部７１は、ＩＲ反射光でＤＩＣなどの検出を行っても良い。
【００８３】
［変形例］
以下に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡３の変形例について説明する。
本変形例においては、図１１に示すように、光検出部７１に代えて、回折格子３７を透過する０次光を反射する反射ミラー７２と、反射ミラー７２により反射された０次光を光検出部３６に向けて反射する反射ミラー７３とを備えている。
【００８４】
本変形例に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、回折格子３７を透過する０次光を、反射ミラー（再入力手段）７２，７３により反射して光検出部３６に導光することができる。これにより、高価なＰＭＴ等の光検出部を１個削減して、製造コストを低減することができる。
【００８５】
なお、本変形例に係るレーザ走査型顕微鏡において、１次光のみを検出する場合には、０次光が光検出部３６に入らないように、回折格子３７と反射ミラー７２との間にシャッタを入れることとすれば良い。
【００８６】
〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置４が第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、回折格子３７を回転させるのではなく、回折格子３７への入射角度を変化させる点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置４について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００８７】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡４は、図１２に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット２０と、スキャンユニット２０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０（図示略）と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５（図示略）と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００８８】
スキャンユニット２０は、光源装置１０からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系２５と、標本Ａからの光を検出する検出光学系３０とを備えている。
照射光学系２５は、第１の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー２１と、ＸＹガルバノスキャナ２２と、瞳投影レンズ２３とを備えている。
【００８９】
検出光学系３０は、第１の実施形態と同様の構成（共焦点レンズ３１、共焦点ピンホール３２、コリメートレンズ３３、ノッチフィルタ３４、回折格子３７、および光検出部３６）の他、ノッチフィルタ３４を透過してきた標本Ａからの光を反射する反射ミラー７５と、反射ミラー７５を保持して反射ミラー７５を入射光に直交する軸線回りに回転させるガルバノメータ７６とを備えている。
【００９０】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡４は、検出波長の中心に対する回折効率が最大となる入射角度を合わせる方法が他の実施形態とは異なり、回折格子３７を回転させるのではなく、回折格子３７の前段に配置した反射ミラー７５をガルバノメータ７６により回転させる。
【００９１】
回折格子３７は、ブラッグ反射する波長が最も回折効率が高くなるので、反射ミラー７５と光検出部３６を回折格子３７に対して対称に配置することで、最大回折効率の光を検出することができる。
【００９２】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡４によれば、反射ミラー７５を回転させることにより、回折格子３７を回転させる場合よりも高速な波長切換に対応することができる。また、回折効率が最大となる波長はブラッグ反射して光検出部３６上の１点に集まるので、光検出部３６の受光面積を小さくすることができる。
【００９３】
〔第５の実施形態〕
次に、本発明の第５の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ顕微鏡装置５が第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、標本からの光をノンディスキャン検出するノンディスキャン検出ユニット８０を備える点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置５について、第１の実施形態のレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００９４】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡５は、図１３に示されるように、レーザ光を射出する光源装置１０と、光源装置１０からのレーザ光を走査するスキャンユニット２０と、スキャンユニット２０からのレーザ光を導光する接続ユニット４０と、接続ユニット４０により導光されたレーザ光を標本Ａに照射するとともに標本Ａからの光を集光する対物レンズ４５と、標本Ａからの光をノンディスキャン検出するノンディスキャン検出ユニット８０と、これらを制御する制御ユニット５０とを備えている。
【００９５】
スキャンユニット２０は、光源装置１０からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系２５と、標本Ａからの光を検出する検出光学系３０とを備えている。
照射光学系２５は、第１の実施形態と同様に、ダイクロイックミラー２１と、ＸＹガルバノスキャナ２２と、瞳投影レンズ２３とを備えている。
【００９６】
検出光学系３０は、共焦点レンズ３１と、共焦点ピンホール３２と、コリメートレンズ３３と、ノッチフィルタ３４と、光検出部８６とを備えている。
接続ユニット４０は、結像レンズ４１と、光源装置１０からのレーザ光を反射する一方、標本Ａからの光を透過するダイクロイックミラー８７を備えている。
【００９７】
ノンディスキャン検出ユニット８０は、ダイクロイックミラー８７を透過した標本Ａからの光から光源装置１０からのレーザ光等をカットするＩＲカットフィルタ８１と、結像レンズ８２と、反射ミラー８３と、瞳投影レンズ８４と、回折格子３７およびガルバノメータ３８を有する波長選択装置３５と、シリンドリカルレンズ３９と、光検出部３６とを備えている。
【００９８】
ここでは、上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡５の詳細な構成について具体例を挙げて説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡５は、多光子励起により生じた蛍光を、ＸＹガルバノスキャナ２２に戻さずノンディスキャン検出し、回折格子３７を用いて、４２０〜７００ｎｍの波長帯域まで分光検出する。
【００９９】
光源装置１０から射出されるレーザ光は、標本Ａに多光子励起を生じさせるＩＲパルスレーザであり、７２０〜１０００ｎｍまでの波長のチューニングが可能である。
ＸＹガルバノスキャナ２２の光軸と対物レンズ４５の光軸との交点には、ダイクロイックミラー８７が配置されている。
【０１００】
ダイクロイックミラー８７は、光源装置１０からのＩＲパルスレーザ光を反射し、４００〜７１０ｎｍの可視光を透過する特性を有している。
ダイクロイックミラー８７の透過光路には、ＩＲカットフィルタ８１、結像レンズ８２、反射ミラー８３、瞳投影レンズ８４、波長選択装置３５、レンズ３９、および光検出部３６が配置されている。
【０１０１】
結像レンズ８２と瞳投影レンズ８４により、対物レンズ４５の瞳は回折格子３７に投影される。
回折格子３７に入射する光は、瞳投影レンズ８４により常に平行光となるが、ＸＹガルバノスキャナ２２による走査位置に応じて光軸に対する入射角度が変化する。
【０１０２】
具体的には、紙面内をＸ方向として走査による画像ピクセル数を５１２＊５１２とすると、図１４に示すように、画像左端（１ピクセル目）に対応する光線は符号９１ａ、画像中心（２５６ピクセル目）に対応する光線は符号９２ａ、画像右端（５１２ピクセル目）に対応する光線は符号９３ａのようになる。すなわち、ＸＹガルバノスキャナ２２による走査位置が、光軸中心から離れるに従って回折格子３７に入射する光の入射角が大きくなる。
【０１０３】
この場合において、Ｘ方向の画像左端と右端にそれぞれ対応する光の回折格子３７への入射角の差を、分光する波長の最短波長（本実施形態では４２０ｎｍ）と、最長波長（本実施形態では７００ｎｍ）のブラッグの反射条件を満たす角度の差に合わせる。
【０１０４】
上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡５の標本Ａの観察方法について以下に説明する。
まず、図１４に示すように、Ｘの画像右端（５１２ピクセル目）に対応する入射光９３ａが４２０ｎｍの時に、ブラッグ反射する角度にＶＰＨ回折格子回転角（α１）を合わせてＸＹスキャンを行い、画像を取得する。この時、図１５に示すように、画像右端（５１２ピクセル目）のデータを４２０ｎｍのデータとして保存し、１〜５１１ピクセルのデータは廃棄する。
【０１０５】
その後、図１６、図１８、図２０、図２２に示すように、回折格子３７の回転角を変化させながら、ＸＹ画像の取得を繰り返す。なお、各図の間に刻むＶＰＨ回折格子回転角αの可変ピッチは、必要な波長分解能に応じて決定すればよい。
【０１０６】
図１６は、画像中心（２５６ピクセル目）入射光９２ａが４２０ｎｍの時にブラッグ反射するＶＰＨ回折格子回転角（α２）である。この場合には、図１７に示すように、画像中心（２５６ピクセル目）のデータが４２０ｎｍ、画像右端（５１２ピクセル目）のデータを５６０ｎｍのデータとして保存し、１〜２５５ピクセル目までのデータは廃棄する。
【０１０７】
図１８は、画像左端（１ピクセル目）入射光９１ａが４２０ｎｍの時にブラッグ反射するＶＰＨ回折格子回転角（α３）である。この場合には、図１９に示すように、画像左端（１ピクセル目）のデータが４２０ｎｍ、画像中心（２５６ピクセル目）のデータが５６０ｎｍ、画像右端（５１２ピクセル目）のデータを７００ｎｍのデータとして保存する。この場合には、廃棄するデータはない。
【０１０８】
図２０は、画像左端（１ピクセル目）入射光が５６０ｎｍ（４２０ｎｍと７００ｎｍの中間）の時にブラッグ反射するＶＰＨ回折格子回転角（α４）である。この場合には、図２１に示すように、画像左端（１ピクセル目）のデータを５６０ｎｍのデータとして保存し、画像中心（２５６ピクセル目）のデータを７００ｎｍのデータとして保存し、２５７〜５１２ピクセルのデータは廃棄する。
【０１０９】
図２２は、画像左端（１ピクセル目）の入射光が７００ｎｍの時にブラッグ反射するＶＰＨ回折格子回転角（α５）であり、画像左端（１ピクセル目）のデータを７００ｎｍのデータとして保存する。この場合には、図２３に示すように、２〜５１２ピクセルのデータは廃棄する。
【０１１０】
上記の標本Ａの観察方法の動作をまとめた図が図２４に示されている。
図２４の矢印９５に示すように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡５によれば、各取得画像のＸ方向において同一ピクセルのデータをまとめることで、ピクセル毎の４２０ｎｍ〜７００ｎｍの分光データが取得できる。
【０１１１】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態および各変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【０１１２】
Ａ 標本
１，２，３，４，５ レーザ走査型顕微鏡
１０ 光源装置
１５ 音響光学素子（波長選択手段）
２０ スキャンユニット
２２ ＸＹガルバノスキャナ（走査部）
２５ 照射光学系
３０ 検出光学系
３５ 波長選択装置
３６ 光検出部
３７ 回折格子
３８ ガルバノメータ（入射角度変更手段）
３９ シリンドリカルレンズ（集光光学系）
４０ 接続ユニット
４５ 対物レンズ
５０ 制御ユニット
６０ スキャンユニット（メインスキャンユニット）
７０ 分光ユニット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic（ＶＰＨ）回折格子と、
該ＶＰＨ回折格子により分散された光を検出する光検出部と、
前記標本からの光の前記ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段とを備え、
前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記ＶＰＨ回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記入射角度変更手段が、前記ＶＰＨ回折格子による分散方向に直交する軸線回りに前記ＶＰＨ回折格子を回転させる請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記光検出部により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、前記入射角度変更手段を駆動させる制御部と、
前記入射角度変更手段の動作に同期して、前記レーザ光の波長を選択する波長選択手段とを備える請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
等間隔ピッチで検出波長を時系列的に切り替えて画像を取得（λスキャン）し、
各前記画像において対応するピクセルの輝度変化を用いて、ピクセル毎の分光データを取得する請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記光検出部により検出される光の中心波長のピッチが、前記ＶＰＨ回折格子の回折効率が５０％における波長幅よりも狭く設定されている請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記ＶＰＨ回折格子の回折効率が５０％における波長幅が、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルのうち、バンド幅が最も狭い蛍光スペクトルの半値幅よりも狭く設定されている請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
λスキャンの波長ピッチが、複数の蛍光色素のうちピーク波長の中心間隔が最も狭い間隔の半分以下に設定されている請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを前記走査部による走査に同期して行う請求項１から請求項７のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記走査部の主走査方向のライン毎に、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを行う請求項８に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記ＶＰＨ回折格子と前記ＶＰＨ回折格子に入射する前記標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、前記光検出部による検出データに波長毎に乗算する請求項１から請求項９のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記ＶＰＨ回折格子と前記光検出部との間に、前記ＶＰＨ回折格子から分散される光を前記光検出部の有効受光面に集光する集光光学系を備える請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記集光光学系が、前記分散方向にのみ前記標本からの光を集光するシリンドリカルレンズである請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記ＶＰＨ回折格子、前記入射角度変更手段、および前記光検出部から構成される分光ユニットと、
前記標本からの光のうち検出する波長を選択可能な検出系を含むメインスキャンユニットとを備え、
前記分光ユニットと前記メインスキャンユニットとが着脱可能に構成されている請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記ＶＰＨ回折格子を直進する光（０次光）を検出する第２の光検出部を備える請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１５】
前記ＶＰＨ回折格子を直進する光（０次光）を、前記光検出部に再入力する再入力手段を備える請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１６】
前記光検出部が、ノンディスキャン検出器であり、
前記入射角度変更手段により前記ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させながら、前記ノンディスキャン検出器により前記標本からの光から複数の画像を生成し、該複数の画像間のピクセルデータを結合する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１７】
前記入射角度変更手段は、前記ＶＰＨ回折格子に入射する検出光の角度を可変する反射ミラーであり、該反射ミラーと前記光検出部とが、前記ＶＰＨ回折格子を挟んで略対称の位置に配置されている請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１】
レーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたレーザ光を走査する走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、前記標本からの光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記標本からの光を複数の波長帯域に分散する透過型のVolume Phase Holographic（ＶＰＨ）回折格子と、
該ＶＰＨ回折格子により分散された光を検出する光検出部と、
前記標本からの光の前記ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させる入射角度変更手段とを備え、
前記入射角度変更手段は、前記光検出部により検出される複数の波長帯域の光がブラッグの反射条件をそれぞれ満たすように、前記標本からの光の前記ＶＰＨ回折格子への入射角を、各検出波長帯域毎に変化させるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記入射角度変更手段が、前記ＶＰＨ回折格子による分散方向に直交する軸線回りに前記ＶＰＨ回折格子を回転させる請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記光検出部により検出する波長帯域の中心波長に合わせて、前記入射角度変更手段を駆動させる制御部と、
前記入射角度変更手段の動作に同期して、前記レーザ光の波長を選択する波長選択手段とを備える請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
等間隔ピッチで検出波長を時系列的に切り替えて画像を取得（λスキャン）し、
各前記画像において対応するピクセルの輝度変化を用いて、ピクセル毎の分光データを取得する請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記光検出部により検出される光の中心波長のピッチが、前記ＶＰＨ回折格子の回折効率が５０％における波長幅よりも狭く設定されている請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記ＶＰＨ回折格子の回折効率が５０％における波長幅が、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルのうち、バンド幅が最も狭い蛍光スペクトルの半値幅よりも狭く設定されている請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
λスキャンの波長ピッチが、複数の蛍光色素のうちピーク波長の中心間隔が最も狭い間隔の半分以下に設定されている請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを前記走査部による走査に同期して行う請求項１から請求項７のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記走査部の主走査方向のライン毎に、前記入射角度変更手段による前記標本からの光の入射角度の切り替えを行う請求項８に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記ＶＰＨ回折格子と前記ＶＰＨ回折格子に入射する前記標本からの光の相対角度をブラッグの反射条件に合わせた場合における回折効率の逆数を、前記光検出部による検出データに波長毎に乗算する請求項１から請求項９のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記ＶＰＨ回折格子と前記光検出部との間に、前記ＶＰＨ回折格子から分散される光を前記光検出部の有効受光面に集光する集光光学系を備える請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記集光光学系が、前記分散方向にのみ前記標本からの光を集光するシリンドリカルレンズである請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記ＶＰＨ回折格子、前記入射角度変更手段、および前記光検出部から構成される分光ユニットと、
前記標本からの光のうち検出する波長を選択可能な検出系を含むメインスキャンユニットとを備え、
前記分光ユニットと前記メインスキャンユニットとが着脱可能に構成されている請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記ＶＰＨ回折格子を直進する光（０次光）を検出する第２の光検出部を備える請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１５】
前記ＶＰＨ回折格子を直進する光（０次光）を、前記光検出部に再入力する再入力手段を備える請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１６】
前記光検出部が、ノンディスキャン検出器であり、
前記入射角度変更手段により前記ＶＰＨ回折格子への入射角を変化させながら、前記ノンディスキャン検出器により前記標本からの光から複数の画像を生成し、該複数の画像間のピクセルデータを結合する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１７】
前記入射角度変更手段は、前記ＶＰＨ回折格子に入射する検出光の角度を可変する反射ミラーであり、該反射ミラーと前記光検出部とが、前記ＶＰＨ回折格子を挟んで略対称の位置に配置されている請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公開番号】特開２０１２−３１９６（Ｐ２０１２−３１９６Ａ）
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４０７８９（Ｐ２０１０−１４０７８９）
【出願日】平成２２年６月２１日（２０１０．６．２１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２１日（２０１０．６．２１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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