レーザ走査顕微鏡および分光データ取得プログラム
【課題】 標本に塗布された１つ又は複数の蛍光プローブからの蛍光を、任意の波長単位で測光し、それを連続データ（λスタックデータ）として取得する場合に、その標本に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的または略自動的に設定することが可能なレーザ走査顕微鏡を提供する。
【解決手段】 複数の蛍光プローブに対応した励起波長のレーザ光を発生するレーザ光源７〜９と、発生されたレーザ光を標本面上でスキャンさせる偏向部２と、前記標本面からの蛍光を任意の波長幅で取得して分光する分光部１５と、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、分光部１５が分光データを取得する際の条件を設定する分光データ取得条件設定部１６と、設定された分光データ取得条件に基づいて、分光部１５を制御する分光制御部１８と、分光された蛍光を受光して電気信号に変換する光電変換部１４と、を備える。
【解決手段】 複数の蛍光プローブに対応した励起波長のレーザ光を発生するレーザ光源７〜９と、発生されたレーザ光を標本面上でスキャンさせる偏向部２と、前記標本面からの蛍光を任意の波長幅で取得して分光する分光部１５と、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、分光部１５が分光データを取得する際の条件を設定する分光データ取得条件設定部１６と、設定された分光データ取得条件に基づいて、分光部１５を制御する分光制御部１８と、分光された蛍光を受光して電気信号に変換する光電変換部１４と、を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光を複数の蛍光プローブが塗布された標本面に照射して、その標本面を２次元走査し、標本面からの蛍光を受光して、標本を観察するレーザ走査顕微鏡に関し、特に、そのようなレーザ走査顕微鏡における分光データの取得技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザを蛍光プローブが塗布された標本面に照射し、標本からの蛍光を受光して対応する電気信号を生成し、その電気信号に基づいて、標本からの蛍光に対応する画像データを生成して、例えばモニタ等に表示させて観察するレーザ走査顕微鏡がある。
【０００３】
このようなレーザ走査顕微鏡を用いて、蛍光プローブが導入された標本からの蛍光を観察するには、その蛍光プローブの励起波長、蛍光ピーク波長に合った励起レーザ、測光ダイクロイックミラー、吸収フィルタを使用する必要がある。
【０００４】
図２０は、このような従来のレーザ走査顕微鏡の構成を示すブロック図である。
図２０に示すように、標本に塗布される蛍光プローブの種別等に応じて、励起レーザを射出するレーザ光源８７〜８９、測光ダイクロイックミラー９１、吸収フィルタ９２、が複数設置される。
【０００５】
以下、図に示すレーザ走査顕微鏡の動作について説明する。
まず、レーザ光源８７〜８９から励起レーザが射出される。それらレーザは、集光装置８５、合成ミラー８６、を介することで、集光され合成される。そして、全反射ミラー８４、励起ダイクロイックミラー８３、偏向部８２、対物レンズ８１を通過して、標本（面）に照射される。
【０００６】
その励起レーザの照射に対応する標本からの蛍光は、再び、対物レンズ８１、偏向部８２、を通過し、励起ダイクロイックミラー８３に向かう。
標本からの蛍光は、励起ダイクロイックミラー８３によって分光され、蛍光プローブからの蛍光のみを選択・分光する測光ダイクロイックミラー９１、吸収フィルタ９２を通過して光電変換部９３で電気信号に変換される。そして、この電気信号に基づいて、不図示のモニタに観察対象の標本（例えば、細胞）に対応する画像が表示される。
【０００７】
そして、上記測光ダイクロイックミラー９１、吸収フィルタ９２の組み合わせを適宜切り替えることで、複数の蛍光プローブからの蛍光を観察している。
また、下記特許文献１には、顕微鏡システムに搭載される励起レーザ、各種フィルタのスペクトルデータと、試料（標本）に導入されている蛍光プローブの励起波長データ、及び、蛍光波長データに基づいて、最適な励起レーザ、測光ダイクロイックミラー、吸収フィルタの組み合わせを自動設定する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２０００−３９５６３号公報 「共焦点顕微鏡の機器配置調整のための方法およびシステム構成」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、最近では、標本に塗布された１つ又は複数の蛍光プローブからの蛍光を、任意の波長単位で測光し、それを連続データ（λスタックデータ）として取得するというものがある。
【０００９】
このようなものに対しては、上記した図１に示されるシステム構成では、観察者が希望する透過スペクトルを持つ複数種類のフィルタを順次切り替えながら画像を取得する必要があり、システムが煩雑になるばかりか、場合によっては、観察者の希望に沿うフィルタが入手できない場合も考えられる。
【００１０】
本発明の課題は、標本に塗布された１つ又は複数の蛍光プローブからの蛍光を、任意の波長単位で測光し、それを連続データ（λスタックデータ）として取得する場合に、その標本に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的または略自動的に設定することが可能なレーザ走査顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１態様のレーザ走査顕微鏡は、複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、該標本を観察するレーザ走査顕微鏡において、前記複数の蛍光プローブに対応した励起波長のレーザ光を発生するレーザ光源と、前記発生されたレーザ光を標本面上でスキャンさせる偏向手段と、前記標本面からの蛍光を任意の波長幅で取得して分光する分光手段と、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定する分光データ取得条件設定手段と、前記設定された分光データ取得条件に基づいて、前記分光手段を制御する分光制御手段と、分光された蛍光を受光して電気信号に変換する光電変換手段と、を備えることを特徴とするレーザ走査顕微鏡である。
【００１２】
ここで、分光制御手段によって分光手段を制御して任意の蛍光波長を任意の波長幅で取得することが可能となり、λスタックデータを容易に取得することができる。また、分光データ取得条件設定手段は、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定するので、複数の蛍光プローブが導入された試料（標本）に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的にまたは略自動的に設定できる。
【００１３】
本発明の第２態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第１態様に対して、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性を格納する分光特性データ格納手段をさらに備える。そして、前記分光データ取得条件設定手段は、格納された分光特性データに基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定する。
【００１４】
本発明の第３態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第１態様において、前記分光手段は、標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラーと、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリットと、を備え、前記分光データ取得条件設定手段は、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、該標本に対して波長走査を行なう際の、前記回折ミラーの回転角に対応する波長送り量、前記スリットの幅に対応する分光分解能を前記分光データ取得条件として設定する。
【００１５】
本発明の第４態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第３態様において、前記分光データ取得条件設定手段は、前記複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出する最近接ピーク間距離算出手段と、前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記波長送り量に設定する送り量設定手段と、前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記分光分解能を設定する分光分解能設定手段と、を備え、前記分光制御手段は、前記分光分解能、前記送り量に基づいて、前記分光手段を制御する。
【００１６】
このようにすれば、前記送り量設定手段によって、波長送り量は例えば、最近接ピーク間距離に一致するように設定されるので、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含まれるのを回避することが可能となると共に、例えば、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含ませないために、分光データの取得範囲内で不必要に分光データの取得回数を増やすことが回避できる。
【００１７】
本発明の第５態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第４態様において、前記分光データ取得条件設定手段は、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定する区間判定手段、を備え、前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、前記分光制御手段は、前記設定された区間に基づいて、前記分光手段を制御する。
【００１８】
本発明の第６態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第５態様において、前記分光データ取得条件設定手段は、前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定された場合に、前記設定された区間をさらに所定数に分割する区間分割手段と、を備え、前記区間判定手段は、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを、前記区間分割手段によって分割された区間に対しても判定する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、分光制御部によって分光部を制御して任意の蛍光波長を任意の波長幅で取得することが可能となり、λスタックデータを容易に取得することができる。また、分光データ取得条件設定部によって、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、分光部が分光データを取得する際の条件を設定するので、複数の蛍光プローブが導入された試料（標本）に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的にまたは略自動的に設定できる。よって、レーザ走査顕微鏡を用いて標本の観察を行なう観察者の負担を軽減することが可能となる。
【００２０】
また、本発明によれば、送り量設定部によって、波長送り量が例えば、最近接ピーク間距離に一致するように設定されるので、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含まれるのを回避することが可能となると共に、例えば、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含ませないために、分光データの取得範囲内で不必要に分光データの取得回数を増やすことが回避できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
図１は、本発明の第１実施形態のレーザ走査顕微鏡の構成を示すブロック図である。
図１において、レーザ走査顕微鏡は、複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、その標本を観察する。そして、図に示されるように、レーザ走査顕微鏡は、複数の蛍光プローブに対応した励起波長のレーザ光を発生するレーザ光源７〜９を含むレーザユニット１０と、発生されたレーザ光を標本面上で例えば２次元にスキャンさせる偏向部２と、その標本面からの蛍光を任意の波長幅で取得して分光する分光部１５と、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、分光部１５が分光データを取得する際の条件を設定する分光データ取得条件設定部１６と、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性、例えば、各蛍光プローブが発する蛍光のピーク波長、を格納する分光特性データ格納部１７と、設定された分光データ取得条件に基づいて、分光部１５を制御する分光制御部１８と、分光された蛍光を受光して電気信号に変換する光電変換部１４と、を備える。
【００２２】
分光データ取得条件設定部１６、分光特性データ格納部１７、分光制御部１８は、例えば、分光部１５に接続されたコンピュータ１９内のソフトウェアまたはハードウェアとして構成できる。
【００２３】
図１に示されるように、分光部１５は、標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラー１３と、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリット１１と、を備える。これにより、回折ミラー１３、スリット１１を制御して任意の蛍光波長を任意の波長幅で取得することが可能となり、λスタックデータを容易に取得することができる。
【００２４】
分光データ取得条件設定部１６は、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、その標本に対して波長走査を行なう際の、回折ミラー１３の回転角に対応する波長送り量、スリット１１の幅に対応する分光分解能を分光データ取得条件として設定する。
【００２５】
図２は、第１実施形態の分光データ取得条件設定部１６の構成を示すブロック図である。
図２において、分光データ取得条件設定部１６は、例えば、分光特性データ格納部１７に格納された、標本に塗布された複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出する最近接ピーク間距離算出部２１と、算出された最近接ピーク間距離に基づいて上記した波長送り量に設定する送り量設定部２２と、算出された最近接ピーク間距離に基づいて上記した分光分解能を設定する分光分解能設定部２３と、分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを指定することが可能なユーザインターフェイスとしての取得開始・終了位置指定部２４と、を備える。
【００２６】
分光制御部１８は、送り量設定部２２によって設定された波長送り量と、例えば、隣接する区間（１回の取得範囲）の境界が互いに接するように分光分解能設定部２３によって設定された分光分解能と、取得開始・終了位置指定部２４を用いてユーザが指定した分光データの取得開始波長と取得終了波長と、に基づいて、分光部１５を制御して、分光データを取得する。
【００２７】
再び、図１の説明に戻り、その動作について説明する。
まず、レーザ光源７〜９から励起レーザが射出される。それらレーザは、集光装置４、合成ミラー５、を介することで、集光され合成される。そして、全反射ミラー６、励起ダイクロイックミラー３、偏向部２、対物レンズ１を通過して、標本（面）に照射される。
【００２８】
その励起レーザの照射に対応する標本からの蛍光は、再び、対物レンズ１、偏向部２、を通過し、励起ダイクロイックミラー３に向かう。
ここで、励起ダイクロイックミラー３は、複数の、例えば３つの励起レーザに対して、それら励起レーザを透過させると共に、それら励起レーザの標本への照射に対応する、標本からの蛍光を反射させるように予め設計されている。
【００２９】
このため、標本からの蛍光は、励起ダイクロイックミラー３によって分光され、全反射ミラー１２に向かい、そこで、さらに転向されて、分光制御部１８によって所定の角度に設定されている回折ミラー１３に入射する。
【００３０】
そして、その回折ミラー１３によって、蛍光はスペクトル分解され、波長選択される。この回折ミラー１３を介した蛍光から、さらに、分光制御部１８によって所定の幅に設定されたスリット１１によって受光波長範囲外の蛍光が除外される。スリット１１を通過した受光波長範囲の蛍光は、光電変換部１４において電気信号に変換される。そして、この電気信号に基づいて、不図示のモニタに観察対象の標本（例えば、細胞）に対応する画像が表示される。
【００３１】
ここで、回折ミラー１３は分光制御部１８によって角度が設定可能であり、また、スリット１１はその幅を分光制御部１８によって設定可能である。例えば、分光制御部１８によって、回折ミラー１３が所定の角度ずつ変更されて、その都度、スリット１１の幅に対応する１回分の分光データを取得することを繰り返して、必要な範囲の分光データを取得することができる。
【００３２】
なお、本実施形態においては、標本に複数の蛍光プローブを塗布することで、対応する標本、例えば細胞中の複数の観察部位を観察するものであるが、以下にデータ例を挙げて、本実施形態におけるレーザ走査顕微鏡の動作について説明する。
【００３３】
なお、本実施形態においては、３つの蛍光プローブに対応して励起レーザを射出する３つのレーザ光源７、８、９を設ける装置構成が採用されているが、通常そうであるように、使用される蛍光プローブの数と、対応するレーザ光源の数とが常に一致している訳ではなく、使用される蛍光プローブの数や、それが作用する標本（例えば、細胞）の部位等によって、その対応関係も変わることは言うまでもない。例えば、１つのレーザ光源が標本に塗布された複数の蛍光プローブに対応していてもよい。
【００３４】
図３は、３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザを同時に照射した場合の各蛍光プローブからの蛍光の波長特性の一例を示す図である。
図３において、標本（例えば、細胞）には３つの蛍光プローブが塗布されていて、それら蛍光プローブは、その種別に応じて、細胞中の異なる部位に作用し、その細胞への励起レーザの照射によって、その作用した部位が蛍光を発することによって、観察対象となる。各蛍光プローブは、通常は、互いに異なるピーク波長の蛍光を発することになるが、図では、ピーク波長がそれぞれλ１、λ２、λ３で与えられる３つの蛍光プローブに対する波長特性が描かれている。
【００３５】
図４Ａ〜図４Ｃは、 ３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザのいずれか１つを必要なタイミングで照射した場合の、その励起レーザに対応する蛍光プローブからの蛍光の波長特性の一例を示す図である。
【００３６】
すなわち、図４Ａは、ピーク波長がλ１の蛍光プローブに対応する波長特性を、図４Ｂは、ピーク波長がλ２の蛍光プローブに対応する波長特性を、図４Ｃは、ピーク波長がλ３の蛍光プローブに対応する波長特性を、それぞれ示している。
【００３７】
なお、本実施形態においては、例えば、レーザ光源７は、ピーク波長がλ１の蛍光プローブに対応する励起レーザを射出し、また、レーザ光源８は、ピーク波長がλ２の蛍光プローブに対応する励起レーザを射出し、また、レーザ光源９は、ピーク波長がλ３の蛍光プローブに対応する励起レーザを射出するものとする。
【００３８】
図５は、波長送り量を分光制御部に設定する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図２の最近接ピーク間距離算出部２１、送り量設定部２２によって行なわれる。
【００３９】
図５において、まず、ステップＳ１０１で、最近接ピーク間距離算出部２１によって、分光データ取得条件格納部１７から標本に塗布された複数の蛍光プローブが発する蛍光ピーク波長が取得される。ここでは、例えば以下のような値が各蛍光プローブの発する蛍光ピーク波長として分光データ取得条件格納部１７に格納されているものとする。
λ１＝５１０ｎｍ
λ２＝５６０ｎｍ
λ３＝５８０ｎｍ
続く、ステップＳ１０２で、取得したピーク波長λ１、λ２、λ３から、最近接ピーク間距離算出部２１によって、最も近接したピーク波長の差分が求められ、変数λGapMinに格納される。この場合、λ２とλ３との差が最小となるので、λGapMinは、次のように算出される。
λGapMin＝｜λ２−λ３｜＝｜５６０ｎｍ−５８０ｎｍ｜＝２０ｎｍ
そして、ステップＳ１０３で、送り量設定部２２によって、変数λGapMinの値が回折ミラーの回転角（波長送り量）として、分光制御部１８に設定される。例えば、１度が４０ｎｍ分の送り量に相当する場合、２０ｎｍの波長送り量に対して０．５度に回転角が設定される。
【００４０】
このようにすれば、送り量設定部２２によって、波長送り量は、最近接ピーク間距離に一致するように設定されるので、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含まれるのを回避することが可能となると共に、例えば、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含ませないために、分光データの取得範囲内で不必要に分光データの取得回数を増やすことが回避できる。
【００４１】
図６は、第１実施形態における分光部を制御して分光データを取得する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図２の分光分解能設定部２２、分光制御部１８、等によって行なわれる。
【００４２】
図６において、まず、ステップＳ２０１で、ユーザは、図２の取得開始・終了位置指定部２３を用いて、分光データの取得開始波長λStartを指定する。また、ステップＳ２０２で、ユーザは、同様に、取得開始・終了位置指定部２３を用いて、分光データの取得終了波長λEndを指定する。
【００４３】
続いて、ステップＳ２０３で、分光制御部１８によって、取得開始波長と取得終了波長とに基づいて定まる取得範囲を、既に設定済みの波長送り量で割ることで、その取得範囲に対する分光データを取得するのに必要な、１回分の分光データの取得を行なう回数（繰り返し数）Ｎが以下の式によって算出される。
Ｎ＝（λEnd−λStart）／λGapMin
ステップＳ２０４では、上記算出されたλGapMinに基づいて、図２の分光分解能設定部２２によって、スリット幅（分光分解能）λResolutionが設定される。このステップにおいて、例えば、λGapMinに一致するように、すなわち、隣接する１回の取得範囲同士が互いに境界を接するように、スリット幅λResolutionが設定される（λResolution＝λGapMin）。
【００４４】
そして、以下のステップＳ２０５〜Ｓ２０８のループ処理を繰り返すことで、１回分の分光データが順次取得される。
まず、ループ処理に先立って、カウンタＩを“０”に初期化する。そして、ステップＳ２０５において、既に算出してある繰り返し数ＮがカウンタＩより大きいか（Ｎ＞Ｉ）が判定される。
【００４５】
ステップＳ２０５で、ＮがＩ以下であれば、一連の処理を終了する。
ステップＳ２０５で、ＮがＩより大きければ、ステップＳ２０６に進み、そこで、分光制御部１８によって、回折ミラーを下記位置に送られるように回転させる。
λStart＋（Ｉ×λGapMin）
続いて、ステップＳ２０７で、１回分の分光データの取得処理が行なわれる。すなわち、上記したように、レーザ光源７〜９から射出、集光、合成された励起レーザは、標本（面）上で２次元走査（照射）され、その照射に対応する標本からの蛍光が、再び、対物レンズ１、偏向部２、励起ダイクロイックミラー３を通過して、全反射ミラー１２に向かい、そこで、さらに転向されて、分光制御部１８によってステップＳ２０６で角度（位置）が設定された回折ミラー１３に入射する。そして、その回折ミラー１３によって、蛍光はスペクトル分解され、波長選択される。この回折ミラー１３を介した蛍光から、さらに、分光制御部１８によってステップＳ２０４においてその幅が設定されたスリット１１により受光波長範囲外の蛍光が除外される。スリット１１を通過した受光波長範囲の蛍光は、光電変換部１４において電気信号に変換される。このようにして、１回分の分光データが取得される。
【００４６】
そして、ステップＳ２０８において、カウンタ変数ＩをインクリメントしてステップＳ２０５に戻る。ステップＳ２０５では、インクリメントされたカウンタＩについて繰り返し数Ｎとの比較を行なう。
【００４７】
図７は、図３の３つの蛍光プローブからの蛍光の波長特性に対応して設定された分光データの取得範囲の一例を示す図（その１）である。
図７において、ユーザは、取得開始・終了位置指定部を用いて、分光データの取得開始波長λStart、取得終了波長λEndを以下のように設定する。
λStart＝５００ｎｍ
λEnd＝６００ｎｍ
最近接ピーク間距離λGapMinは、上記したように、２０ｎｍで与えられるので、この例では、５００−５２０ｎｍ、５２０−５４０ｎｍ、５４０−５６０ｎｍ、５６０−５８０ｎｍ、５８０−６００ｎｍ、の５回に分けて分光データの取得が行なわれることになる。
【００４８】
なお、取得した分光データが蛍光ピーク波長とそのピーク波長に対応する励起レーザのピーク波長とを含む場合には、実際には、その取得した分光データ中のピーク波長に対応する標本（細胞）中の部位を観察することが困難となるが、実際の使用においては、そのような取得範囲を採用せずに捨てれば済むため、上述の第１実施形態のような励起レーザの波長位置を考慮しない取得範囲の設定方法も有用である。以下に説明する第２実施形態においては、このような励起レーザの波長位置も考慮して取得範囲を設定している。
【００４９】
第２実施形態においても、図１に示されるレーザ走査顕微鏡の構成が基本的には採用される。
図８は、第２実施形態の分光データ取得条件設定部１６の構成を示すブロック図である。
【００５０】
図８において、分光データ取得条件設定部１６は、図２と比較して、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光のピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定する区間判定部３１、を備える。そして、この区間判定部３１によって、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、分光制御部１８は、その設定された区間に基づいて、分光部を制御して分光データを取得する。
【００５１】
なお、区間判定部３１による条件が満たされない場合に、区間をさらに分割する区間分割部があってもよい。
図９は、第２実施形態の分光データ取得条件設定部１６の変形例を示すブロック図である。
【００５２】
図９において、分光データ取得条件設定部１６は、図８と比較して、区間判定部３１によって、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザピーク波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたと判定された場合に、その設定された区間をさらに所定数に分割する区間分割部３２、をさらに備える。そして、区間判定部３１は、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光のピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを、区間分割部３２によって分割された区間に対しても判定する。
【００５３】
このようにすれば、区間分割部３２を用いて分割を繰り返すことにより、区間判定部３１による条件が満たされる区間が設定され易くなる。
また、本第２実施形態においては、分光特性データ格納部２７は、各蛍光プローブのピーク波長と、それぞれのピーク波長に対応する励起レーザ波長とを関連付けて格納する。
【００５４】
例えば、３つの蛍光プローブが標本に塗布される場合に、各蛍光プローブの蛍光ピーク波長が、λ１（＝５１０ｎｍ）、λ２（＝５６０ｎｍ）、λ３（＝５８０ｎｍ）で、それぞれのピーク波長に対応する励起レーザ波長が、Exλ１（＝４９２ｎｍ）、Exλ２（＝５４２ｎｍ）、Exλ３（＝５７５ｎｍ）である場合に、以下のようなデータが分光特性データ格納部２７には格納されている。
λ１＝５１０ｎｍ Exλ１＝４９２ｎｍ
λ２＝５６０ｎｍ Exλ２＝５４２ｎｍ
λ３＝５８０ｎｍ Exλ３＝５７５ｎｍ
以下、第２実施形態におけるレーザ走査顕微鏡の動作について説明する。まず、第１実施形態の図５のフローチャートと同様の処理が行なわれることによって、最近接ピーク間距離算出部２１によって変数λGapMinに設定された最も近接するピーク波長間の距離が、送り量設定部２２によって波長送り量として分光制御部に設定される。
【００５５】
図１０は、第２実施形態における分光部を制御して分光データを取得する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図２の分光分解能設定部２３、分光制御部１８、等によって行なわれる。
【００５６】
この図１０のフローチャートは、第１実施形態の図６のフローチャートにステップＳ３０１とステップＳ３０２との処理を追加したものとなっている。
この追加されたステップＳ３０１では、設定されたλGapMinおよび分光特性データ格納部２７に格納された励起レーザ波長Exλ１、Exλ１、Exλ１とを取得する。また、ステップＳ３０２では、ステップＳ３０１で取得されたλGapMin、各励起レーザを参照して、一旦設定された波長送り量を再設定する処理、例えば、所定数に分割する処理、が行なわれる。
【００５７】
図１１は、図１０のステップＳ３０２の処理（波長送り量の再設定処理）をより詳細に示すフローチャートである。
図１１において、まず、ステップＳ４０１で、カウンタの値を“０”に初期化する。続いて、ステップＳ４０２で、既に設定されている取得開始波長λStartとλGapMinとから現在の（Ｉ番目の）区間の分光データ取得開始波長λSectionStart（＝λStart＋Ｉ×λGapMin）を算出すると共に、その現区間の分光データ取得開始波長λSectionStartが既に設定されている取得終了波長λEndより小さいかが判定される。
【００５８】
ステップＳ４０２で、現区間の分光データ取得開始波長λSectionStartが取得終了波長λEnd以上であると判定された場合は、一連の処理を終了する。
一方、ステップＳ４０２で、現区間の分光データ取得開始波長λSectionStartが取得終了波長λEndより小さいと判定された場合は、ステップＳ４０３に進み、そこで、現区間の分光データ取得終了波長λSectionEnd（＝λStart＋（Ｉ＋１）×λGapMin）を算出する。通常そうであるように、現区間の分光データ取得終了波長は、次区間の分光データ取得開始波長に一致する。
【００５９】
そして、ステップＳ４０４において、現区間、すなわち、λSectionStartとλSectionEndとの間に、分光特性データ格納部１７に格納されている、標本に照射される各励起レーザピーク波長Exλ１、Exλ２、Exλ３、及び、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長λ１、λ２、λ３の内の２つが入っているかどうかにつき判定する。
【００６０】
ステップＳ４０４において、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の２つが、λSectionStartとλSectionEndとの間に含まれると判定された場合には、ステップＳ４０５に進み、そこで、λGapMinの値を半分（λGapMin＝λGapMin／２）に再設定（分割）し、ステップＳ４０１に戻り、上記処理を繰り返す。
【００６１】
一方、ステップＳ４０４において、λSectionStartとλSectionEndとの間に、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合には、ステップＳ４０６でカウンタＩをインクリメント（Ｉ＝Ｉ＋１）してステップＳ４０２に戻り、ステップＳ４０２以降の処理が次区間に対して行なわれる。
【００６２】
このようにして再設定された区間に基づいて、図１０のステップＳ２０３以降の処理が行なわれる。
図１２は、図３の３つの蛍光プローブからの蛍光の波長特性に対応して設定された分光データの取得範囲の一例を示す図（その２）である。
【００６３】
図１２において、ユーザは、取得開始・終了位置指定部を用いて、分光データの取得開始波長λStart、取得終了波長λEndを以下のように設定する。
λStart＝５００ｎｍ
λEnd＝６００ｎｍ
最近接ピーク間距離λGapMinは、上記したように、２０ｎｍで与えられるので、この例では、当初は、５００−５２０ｎｍ、５２０−５４０ｎｍ、５４０−５６０ｎｍ、５６０−５８０ｎｍ、５８０−６００ｎｍ、の５回に分けて分光データの取得が行なわれる予定であった。
【００６４】
しかし、当初の各区間の幅（２０ｎｍ）では、例えば、区間５６０−５８０ｎｍに、励起レーザピーク波長Exλ３（＝５７５ｎｍ）と蛍光ピーク波長λ３（＝５８０ｎｍ）とが含まれてしまうため、現区間が５６０−５８０ｎｍの区間である場合に図１１のステップＳ４０４において、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の２つが、λSectionStart（＝５６０ｎｍ）とλSectionEnd（＝５８０ｎｍ）との間に含まれると判定され、続くステップＳ４０５において、λGapMinの値が、２０ｎｍから半分の１０ｎｍに再設定（分割）される。
【００６５】
しかし、この再設定によって、５００−５１０ｎｍ、・・・、５９０−６００ｎｍの１０区間に分割されたとしても、例えば、区間５７０−５８０ｎｍに、励起レーザピーク波長Exλ３（＝５７５ｎｍ）と蛍光ピーク波長λ３（＝５８０ｎｍ）とが含まれてしまうため、現区間が５７０−５８０ｎｍの区間である場合に図１１のステップＳ４０４において、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の２つが、λSectionStart（＝５７０ｎｍ）とλSectionEnd（＝５８０ｎｍ）との間に含まれると判定され、続くステップＳ４０５において、λGapMinの値が、１０ｎｍから半分の５ｎｍに再設定（分割）される。
【００６６】
そして、この結果、５００−５０５ｎｍ、・・・、５９５−６００ｎｍの２０区間に分割され、かつ、各区間はいずれも、図１１のステップＳ４０４において、λSectionStartとλSectionEndとの間に、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定されるので、分光制御部はこの区間に基づいて分光部を制御して分光データの取得を行なうことになる。
【００６７】
以上の説明では、分光データの取得開始波長、取得終了波長は、いずれも図２の取得開始・終了位置指定部２４を用いてユーザが指定していたが、この取得開始波長、取得終了波長、すなわち、取得範囲を自動的に設定することも可能である。以下に述べる第３実施形態では、取得範囲を自動的に設定している。
【００６８】
第３実施形態においても、図１に示されるレーザ走査顕微鏡の構成が基本的には採用される。
図１３は、第３実施形態の分光データ取得条件設定部１６の構成を示すブロック図である。
【００６９】
図１３の分光データ取得条件設定部１６は、図２と比較して、取得開始・終了位置指定部２４の替わりに取得範囲設定部３４を備えている。この取得範囲設定部３４は、分光特性データ格納部３７に格納されている、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを設定する。
【００７０】
取得範囲設定部３４は、標本に塗布された全ての蛍光プローブに対応するピーク波長を含むように、分光データの取得範囲を設定する。その際、例えば、右端または左端のピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合だけ減少した端部寄りの波長位置を分光データの取得開始位置、および、取得終了位置に設定する。
【００７１】
また、本第３実施形態においては、分光特性データ格納部３７は、各蛍光プローブのピーク波長と、それぞれのピーク波長に対応するピーク値の半値幅（分布曲線の値がそのピーク値から半分に減少した波長位置までのピーク波長からのずれ量）とを関連付けて格納する。
【００７２】
例えば、３つの蛍光プローブが標本に塗布される場合に、各蛍光プローブのピーク波長が、λ１（＝５１０ｎｍ）、λ２（＝５６０ｎｍ）、λ３（＝５８０ｎｍ）で、それぞれのピーク波長に対応するピーク値の半値幅が、Δλ１（＝±２０ｎｍ）、Δλ２（＝±１５ｎｍ）、Δλ３（＝±１０ｎｍ）である場合に、以下のようなデータが分光特性データ格納部３７には格納されている。
λ１＝５１０ｎｍ Δλ１＝±２０ｎｍ
λ２＝５６０ｎｍ Δλ２＝±１５ｎｍ
λ３＝５８０ｎｍ Δλ３＝±１０ｎｍ
以下、第３実施形態におけるレーザ走査顕微鏡の動作について図１４および図１５のフローチャートを参照して説明する。
【００７３】
図１４は、分光データの取得開始波長を設定する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図１３の取得範囲設定部３４によって行なわれる。
図１４において、まず、ステップＳ５０１で、取得範囲設定部３４によって、分光特性データ格納部３７から最も短波長側（左端）の蛍光からのピーク波長（この場合、λ１）が取得され、変数λMinに設定される。また、同様に、その半値幅（ピーク波長からのずれ量、この場合、Δλ１）が取得され、変数λH1に設定される。
【００７４】
続く、ステップＳ５０２で、取得範囲設定部３４によって、下記式に基づいて、分光データの取得開始位置λStartが求められる。
λStart＝λMin−λH1
ここで、ステップＳ５０２において、ピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合（この場合、１／２）だけ減少した端部寄りの波長位置を求めることから、ずれ量λH1を左端ピーク波長λMinから減算している。
【００７５】
図１５は、分光データの取得終了波長を設定する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図１３の取得範囲設定部３４によって行なわれる。
図１５において、まず、ステップＳ６０１で、取得範囲設定部３４によって、分光特性データ格納部３７から最も長波長側（右端）の蛍光からのピーク波長（この場合、λ３）が取得され、変数λMaxに設定される。また、同様に、その半値幅（ピーク波長からのずれ量、この場合、Δλ１）が取得され、変数λH2に設定される。
【００７６】
続く、ステップＳ６０２で、取得範囲設定部３４によって、下記式に基づいて、分光データの取得終了位置λEndが求められる。
λEnd＝λMax＋λH2
ここで、ステップＳ６０２において、ピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合（この場合、１／２）だけ減少した端部寄りの波長位置を求めることから、ずれ量λH2を右端ピーク波長λMaxに加算している。
【００７７】
なお、分光特性データ格納部３７に格納される上記の分光特性データについて、図１４及び図１５の処理を行なえば、以下に示すような値が取得開始位置λStart、取得終了位置λEndにそれぞれ設定される。
λStart＝λMin−λH1＝５１０ｎｍ−２０ｎｍ＝４９０ｎｍ
λEnd＝λMax＋λH2＝５８０ｎｍ＋１０ｎｍ＝５９０ｎｍ
このように本第３実施形態においては、複数の蛍光プローブが導入された試料（標本）に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的に設定できるので、レーザ走査顕微鏡を用いて標本の観察を行なう観察者の負担を軽減することが可能となる。
【００７８】
以下、本発明の第４実施形態について説明する。第４実施形態では、分光分解能の設定方法について説明するが、この分光分解能の設定処理は、例えば、第１実施形態の図６のフローチャート中のステップＳ２０４にて行なわれる処理である。
【００７９】
この図６のステップＳ２０４では、分光分解能設定部２２によって、スリット幅（分光分解能）λResolutionが、最近接のピーク波長間距離λGapMinに基づいて、下記式に示すように設定される。
λResolution＝λGapMin ・・・ （Ａ１）
本第４実施形態においては、上記式に対して、下記（Ａ２）または（Ａ３）式によって、隣接する区間の境界が互いに所定区間だけ重なるように分光分解能を算出（設定）する。
【００８０】
まず、（Ａ２）式においては、変数λGapMinに対して、１より大きい定数β（β＞１）を乗算することで、分光分解能λResolutionを算出している。
λResolution＝β×λGapMin ・・・ （Ａ２）
また、（Ａ３）式においては、上記（Ａ２）の右辺に対して、蛍光強度Ｉに関する減少関数ｆ（Ｉ）（Ｉ1＜Ｉ2ならば、ｆ（Ｉ1）＞ｆ（Ｉ2））をさらに乗算して分光分解能λResolutionを算出している。
λResolution＝β×ｆ（Ｉ）×λGapMin ・・・ （Ａ３）
ここで、ｆ（Ｉ）は蛍光強度Ｉに関する減少関数であるので、蛍光強度が弱い蛍光プローブほど大きい値をとることになり、結果として、蛍光強度が弱い蛍光プローブほどλResolutionが大きな値となり（分光分解能が下がり）、明るさをかせぐことができる。
【００８１】
本第４実施形態においては、特に、蛍光強度が弱い蛍光プローブからの分光データも取得できるようになる、という利点を有する。
以上の説明では、分光データの１回の取得区間について制約を設けない構成であったが、例えば、１回の取得区間が小さくなり過ぎると、蛍光ピークを検出することが困難になるという問題がある。このような事態を回避するには、図２、図８、図９、図１３において、ピークを検出することが可能な目安となる分光分解能の下限を格納する分解能下限値格納部と、設定された又は分割された区間の区間幅が上記下限値以下であるか否かを判定する区間幅判定部と、をさらに備えるようにしてもよい。
【００８２】
そして、設定された又は分割された区間の区間幅が上記下限値より大きい場合に、分光制御部は、その設定された又は分割された区間に基づいて、分光部を制御して分光データを取得する。
【００８３】
図１６は、第１実施形態の図２のブロック図に対して、分解能下限値格納部４２と、区間幅判定部４１とが追加されたブロック図である。
なお、第３実施形態の図１３のブロック図に対しても、図１６に対して行なったのと同様にして、分解能下限値格納部４２と、区間幅判定部４１とを追加することができる。
【００８４】
また、第２実施形態の図８および図９のブロック図に対しては、区間判定部３１に区間幅判定部４１の機能を兼用させてもよい。この場合、区間判定部３１は、分解能下限値格納部４２に格納された分解能下限値を参照して、区間幅の下限値との比較を行なう。
【００８５】
図１７は、第１実施形態の図５のフローチャートに、区間幅の下限値との比較処理を追加したフローチャートである。
図１７では、図５と比較し、ステップＳ１０３の後にステップＳ１０４が設けられ、このステップＳ１０４において、ステップＳ１０２で設定された変数λGapMinと設定可能最小値を示す分光分解能下限値とが比較される。そして、このステップＳ１０４の判定ステップにおいて、設定されたλGapMinが分光分解能下限値より大きいと判定された場合に例えば図６や図１０のフローチャートに示される以降の処理を継続し、設定された区間に基づいて、分光データの取得が行なわれる。
【００８６】
図１８は、第２実施形態の図１０のフローチャートに、区間幅の下限値との比較処理を追加したフローチャートである。
図１８では、図１０と比較し、ステップＳ３０２とステップＳ２０３との間にステップＳ３０３が設けられ、このステップＳ３０３において、ステップＳ３０２で再設定された変数λGapMinと設定可能最小値を示す分光分解能下限値とが比較される。そして、このステップＳ３０３の判定ステップにおいて、再設定されたλGapMinが分光分解能下限値より大きいと判定された場合に以降の処理を継続し、設定された区間に基づいて、分光データの取得が行なわれる。
【００８７】
図１９は、本実施形態における各処理をコンピュータに実行させるプログラムが格納される記憶媒体例を示す図である。
図１９に示すように、上記記憶媒体には、ＣＤ−ＲＯＭ、フレキシブルディスク（ＭＯ、ＤＶＤ、リムーバブルハードディスク等であってもよい）等の媒体駆動装置６７に脱着可能な可搬記憶媒体６６、ネットワーク回線６３経由でプログラムが送信される外部の装置（サーバ等）内の記憶手段（データベース等）６２、情報処理装置６１の本体６４内のメモリ（ＲＡＭまたはハードディスク等）６５、が含まれる。本実施形態の各処理を行うプログラムは、上記記憶媒体から本体６４内のメモリ６５にロードされ実行される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の第１実施形態のレーザ走査顕微鏡の構成を示すブロック図である。
【図２】第１実施形態の分光データ取得条件設定部の構成を示すブロック図である。
【図３】３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザを同時に照射した場合の各蛍光プローブからの蛍光の波長特性の一例を示す図である。
【図４Ａ】３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザのいずれか１つを必要なタイミングで照射した場合の、その励起レーザに対応する蛍光プローブからの蛍光（ピーク波長λ１）の波長特性の一例を示す図である。
【図４Ｂ】３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザのいずれか１つを必要なタイミングで照射した場合の、その励起レーザに対応する蛍光プローブからの蛍光（ピーク波長λ２）の波長特性の一例を示す図である。
【図４Ｃ】３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザのいずれか１つを必要なタイミングで照射した場合の、その励起レーザに対応する蛍光プローブからの蛍光（ピーク波長λ３）の波長特性の一例を示す図である。
【図５】波長送り量を分光制御部に設定する処理のフローチャートである。
【図６】第１実施形態における分光部を制御して分光データを取得する処理のフローチャートである。
【図７】図３の３つの蛍光プローブからの蛍光の波長特性に対応して設定された分光データの取得範囲の一例を示す図（その１）である。
【図８】第２実施形態の分光データ取得条件設定部の構成を示すブロック図である。
【図９】第２実施形態の分光データ取得条件設定部の変形例を示すブロック図である。
【図１０】第２実施形態における分光部を制御して分光データを取得する処理のフローチャートである。
【図１１】図１０の波長送り量の再設定処理をより詳細に示すフローチャートである。
【図１２】図３の３つの蛍光プローブからの蛍光の波長特性に対応して設定された分光データの取得範囲の一例を示す図（その２）である。
【図１３】第３実施形態の分光データ取得条件設定部の構成を示すブロック図である。
【図１４】分光データの取得開始波長を設定する処理のフローチャートである。
【図１５】分光データの取得終了波長を設定する処理のフローチャートである。
【図１６】第１実施形態の図２のブロック図に対して、分解能下限値格納部と、区間幅判定部とが追加されたブロック図である。
【図１７】第１実施形態の図５のフローチャートに、区間幅の下限値との比較処理を追加したフローチャートである。
【図１８】第２実施形態の図１０のフローチャートに、区間幅の下限値との比較処理を追加したフローチャートである。
【図１９】記憶媒体例を示す図である。
【図２０】従来のレーザ走査顕微鏡の構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００８９】
１ 対物レンズ
２ 偏向部
３ 励起ダイクロイックミラー
４ 集光装置
５ 合成ミラー
６，１２ 全反射ミラー
７〜９ レーザ光源
１０ レーザユニット
１１ スリット
１３ 回折ミラー
１４ 光電変換部
１５ 分光部
１６ 分光データ取得条件設定部
１７，２７，３７ 分光特性データ格納部
１８ 分光制御部
２１ 最近接ピーク間距離算出部
２２ 送り量設定部
２３ 分光分解能設定部
２４ 取得開始・終了位置指定部
３１ 区間判定部
３２ 区間分割部
３４ 取得範囲設定部
４１ 区間幅判定部
４２ 分解能下限値格納部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光を複数の蛍光プローブが塗布された標本面に照射して、その標本面を２次元走査し、標本面からの蛍光を受光して、標本を観察するレーザ走査顕微鏡に関し、特に、そのようなレーザ走査顕微鏡における分光データの取得技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザを蛍光プローブが塗布された標本面に照射し、標本からの蛍光を受光して対応する電気信号を生成し、その電気信号に基づいて、標本からの蛍光に対応する画像データを生成して、例えばモニタ等に表示させて観察するレーザ走査顕微鏡がある。
【０００３】
このようなレーザ走査顕微鏡を用いて、蛍光プローブが導入された標本からの蛍光を観察するには、その蛍光プローブの励起波長、蛍光ピーク波長に合った励起レーザ、測光ダイクロイックミラー、吸収フィルタを使用する必要がある。
【０００４】
図２０は、このような従来のレーザ走査顕微鏡の構成を示すブロック図である。
図２０に示すように、標本に塗布される蛍光プローブの種別等に応じて、励起レーザを射出するレーザ光源８７〜８９、測光ダイクロイックミラー９１、吸収フィルタ９２、が複数設置される。
【０００５】
以下、図に示すレーザ走査顕微鏡の動作について説明する。
まず、レーザ光源８７〜８９から励起レーザが射出される。それらレーザは、集光装置８５、合成ミラー８６、を介することで、集光され合成される。そして、全反射ミラー８４、励起ダイクロイックミラー８３、偏向部８２、対物レンズ８１を通過して、標本（面）に照射される。
【０００６】
その励起レーザの照射に対応する標本からの蛍光は、再び、対物レンズ８１、偏向部８２、を通過し、励起ダイクロイックミラー８３に向かう。
標本からの蛍光は、励起ダイクロイックミラー８３によって分光され、蛍光プローブからの蛍光のみを選択・分光する測光ダイクロイックミラー９１、吸収フィルタ９２を通過して光電変換部９３で電気信号に変換される。そして、この電気信号に基づいて、不図示のモニタに観察対象の標本（例えば、細胞）に対応する画像が表示される。
【０００７】
そして、上記測光ダイクロイックミラー９１、吸収フィルタ９２の組み合わせを適宜切り替えることで、複数の蛍光プローブからの蛍光を観察している。
また、下記特許文献１には、顕微鏡システムに搭載される励起レーザ、各種フィルタのスペクトルデータと、試料（標本）に導入されている蛍光プローブの励起波長データ、及び、蛍光波長データに基づいて、最適な励起レーザ、測光ダイクロイックミラー、吸収フィルタの組み合わせを自動設定する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２０００−３９５６３号公報 「共焦点顕微鏡の機器配置調整のための方法およびシステム構成」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、最近では、標本に塗布された１つ又は複数の蛍光プローブからの蛍光を、任意の波長単位で測光し、それを連続データ（λスタックデータ）として取得するというものがある。
【０００９】
このようなものに対しては、上記した図１に示されるシステム構成では、観察者が希望する透過スペクトルを持つ複数種類のフィルタを順次切り替えながら画像を取得する必要があり、システムが煩雑になるばかりか、場合によっては、観察者の希望に沿うフィルタが入手できない場合も考えられる。
【００１０】
本発明の課題は、標本に塗布された１つ又は複数の蛍光プローブからの蛍光を、任意の波長単位で測光し、それを連続データ（λスタックデータ）として取得する場合に、その標本に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的または略自動的に設定することが可能なレーザ走査顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１態様のレーザ走査顕微鏡は、複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、該標本を観察するレーザ走査顕微鏡において、前記複数の蛍光プローブに対応した励起波長のレーザ光を発生するレーザ光源と、前記発生されたレーザ光を標本面上でスキャンさせる偏向手段と、前記標本面からの蛍光を任意の波長幅で取得して分光する分光手段と、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定する分光データ取得条件設定手段と、前記設定された分光データ取得条件に基づいて、前記分光手段を制御する分光制御手段と、分光された蛍光を受光して電気信号に変換する光電変換手段と、を備えることを特徴とするレーザ走査顕微鏡である。
【００１２】
ここで、分光制御手段によって分光手段を制御して任意の蛍光波長を任意の波長幅で取得することが可能となり、λスタックデータを容易に取得することができる。また、分光データ取得条件設定手段は、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定するので、複数の蛍光プローブが導入された試料（標本）に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的にまたは略自動的に設定できる。
【００１３】
本発明の第２態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第１態様に対して、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性を格納する分光特性データ格納手段をさらに備える。そして、前記分光データ取得条件設定手段は、格納された分光特性データに基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定する。
【００１４】
本発明の第３態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第１態様において、前記分光手段は、標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラーと、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリットと、を備え、前記分光データ取得条件設定手段は、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、該標本に対して波長走査を行なう際の、前記回折ミラーの回転角に対応する波長送り量、前記スリットの幅に対応する分光分解能を前記分光データ取得条件として設定する。
【００１５】
本発明の第４態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第３態様において、前記分光データ取得条件設定手段は、前記複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出する最近接ピーク間距離算出手段と、前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記波長送り量に設定する送り量設定手段と、前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記分光分解能を設定する分光分解能設定手段と、を備え、前記分光制御手段は、前記分光分解能、前記送り量に基づいて、前記分光手段を制御する。
【００１６】
このようにすれば、前記送り量設定手段によって、波長送り量は例えば、最近接ピーク間距離に一致するように設定されるので、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含まれるのを回避することが可能となると共に、例えば、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含ませないために、分光データの取得範囲内で不必要に分光データの取得回数を増やすことが回避できる。
【００１７】
本発明の第５態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第４態様において、前記分光データ取得条件設定手段は、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定する区間判定手段、を備え、前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、前記分光制御手段は、前記設定された区間に基づいて、前記分光手段を制御する。
【００１８】
本発明の第６態様のレーザ走査顕微鏡は、上記第５態様において、前記分光データ取得条件設定手段は、前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定された場合に、前記設定された区間をさらに所定数に分割する区間分割手段と、を備え、前記区間判定手段は、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを、前記区間分割手段によって分割された区間に対しても判定する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、分光制御部によって分光部を制御して任意の蛍光波長を任意の波長幅で取得することが可能となり、λスタックデータを容易に取得することができる。また、分光データ取得条件設定部によって、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、分光部が分光データを取得する際の条件を設定するので、複数の蛍光プローブが導入された試料（標本）に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的にまたは略自動的に設定できる。よって、レーザ走査顕微鏡を用いて標本の観察を行なう観察者の負担を軽減することが可能となる。
【００２０】
また、本発明によれば、送り量設定部によって、波長送り量が例えば、最近接ピーク間距離に一致するように設定されるので、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含まれるのを回避することが可能となると共に、例えば、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含ませないために、分光データの取得範囲内で不必要に分光データの取得回数を増やすことが回避できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
図１は、本発明の第１実施形態のレーザ走査顕微鏡の構成を示すブロック図である。
図１において、レーザ走査顕微鏡は、複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、その標本を観察する。そして、図に示されるように、レーザ走査顕微鏡は、複数の蛍光プローブに対応した励起波長のレーザ光を発生するレーザ光源７〜９を含むレーザユニット１０と、発生されたレーザ光を標本面上で例えば２次元にスキャンさせる偏向部２と、その標本面からの蛍光を任意の波長幅で取得して分光する分光部１５と、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、分光部１５が分光データを取得する際の条件を設定する分光データ取得条件設定部１６と、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性、例えば、各蛍光プローブが発する蛍光のピーク波長、を格納する分光特性データ格納部１７と、設定された分光データ取得条件に基づいて、分光部１５を制御する分光制御部１８と、分光された蛍光を受光して電気信号に変換する光電変換部１４と、を備える。
【００２２】
分光データ取得条件設定部１６、分光特性データ格納部１７、分光制御部１８は、例えば、分光部１５に接続されたコンピュータ１９内のソフトウェアまたはハードウェアとして構成できる。
【００２３】
図１に示されるように、分光部１５は、標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラー１３と、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリット１１と、を備える。これにより、回折ミラー１３、スリット１１を制御して任意の蛍光波長を任意の波長幅で取得することが可能となり、λスタックデータを容易に取得することができる。
【００２４】
分光データ取得条件設定部１６は、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、その標本に対して波長走査を行なう際の、回折ミラー１３の回転角に対応する波長送り量、スリット１１の幅に対応する分光分解能を分光データ取得条件として設定する。
【００２５】
図２は、第１実施形態の分光データ取得条件設定部１６の構成を示すブロック図である。
図２において、分光データ取得条件設定部１６は、例えば、分光特性データ格納部１７に格納された、標本に塗布された複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出する最近接ピーク間距離算出部２１と、算出された最近接ピーク間距離に基づいて上記した波長送り量に設定する送り量設定部２２と、算出された最近接ピーク間距離に基づいて上記した分光分解能を設定する分光分解能設定部２３と、分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを指定することが可能なユーザインターフェイスとしての取得開始・終了位置指定部２４と、を備える。
【００２６】
分光制御部１８は、送り量設定部２２によって設定された波長送り量と、例えば、隣接する区間（１回の取得範囲）の境界が互いに接するように分光分解能設定部２３によって設定された分光分解能と、取得開始・終了位置指定部２４を用いてユーザが指定した分光データの取得開始波長と取得終了波長と、に基づいて、分光部１５を制御して、分光データを取得する。
【００２７】
再び、図１の説明に戻り、その動作について説明する。
まず、レーザ光源７〜９から励起レーザが射出される。それらレーザは、集光装置４、合成ミラー５、を介することで、集光され合成される。そして、全反射ミラー６、励起ダイクロイックミラー３、偏向部２、対物レンズ１を通過して、標本（面）に照射される。
【００２８】
その励起レーザの照射に対応する標本からの蛍光は、再び、対物レンズ１、偏向部２、を通過し、励起ダイクロイックミラー３に向かう。
ここで、励起ダイクロイックミラー３は、複数の、例えば３つの励起レーザに対して、それら励起レーザを透過させると共に、それら励起レーザの標本への照射に対応する、標本からの蛍光を反射させるように予め設計されている。
【００２９】
このため、標本からの蛍光は、励起ダイクロイックミラー３によって分光され、全反射ミラー１２に向かい、そこで、さらに転向されて、分光制御部１８によって所定の角度に設定されている回折ミラー１３に入射する。
【００３０】
そして、その回折ミラー１３によって、蛍光はスペクトル分解され、波長選択される。この回折ミラー１３を介した蛍光から、さらに、分光制御部１８によって所定の幅に設定されたスリット１１によって受光波長範囲外の蛍光が除外される。スリット１１を通過した受光波長範囲の蛍光は、光電変換部１４において電気信号に変換される。そして、この電気信号に基づいて、不図示のモニタに観察対象の標本（例えば、細胞）に対応する画像が表示される。
【００３１】
ここで、回折ミラー１３は分光制御部１８によって角度が設定可能であり、また、スリット１１はその幅を分光制御部１８によって設定可能である。例えば、分光制御部１８によって、回折ミラー１３が所定の角度ずつ変更されて、その都度、スリット１１の幅に対応する１回分の分光データを取得することを繰り返して、必要な範囲の分光データを取得することができる。
【００３２】
なお、本実施形態においては、標本に複数の蛍光プローブを塗布することで、対応する標本、例えば細胞中の複数の観察部位を観察するものであるが、以下にデータ例を挙げて、本実施形態におけるレーザ走査顕微鏡の動作について説明する。
【００３３】
なお、本実施形態においては、３つの蛍光プローブに対応して励起レーザを射出する３つのレーザ光源７、８、９を設ける装置構成が採用されているが、通常そうであるように、使用される蛍光プローブの数と、対応するレーザ光源の数とが常に一致している訳ではなく、使用される蛍光プローブの数や、それが作用する標本（例えば、細胞）の部位等によって、その対応関係も変わることは言うまでもない。例えば、１つのレーザ光源が標本に塗布された複数の蛍光プローブに対応していてもよい。
【００３４】
図３は、３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザを同時に照射した場合の各蛍光プローブからの蛍光の波長特性の一例を示す図である。
図３において、標本（例えば、細胞）には３つの蛍光プローブが塗布されていて、それら蛍光プローブは、その種別に応じて、細胞中の異なる部位に作用し、その細胞への励起レーザの照射によって、その作用した部位が蛍光を発することによって、観察対象となる。各蛍光プローブは、通常は、互いに異なるピーク波長の蛍光を発することになるが、図では、ピーク波長がそれぞれλ１、λ２、λ３で与えられる３つの蛍光プローブに対する波長特性が描かれている。
【００３５】
図４Ａ〜図４Ｃは、 ３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザのいずれか１つを必要なタイミングで照射した場合の、その励起レーザに対応する蛍光プローブからの蛍光の波長特性の一例を示す図である。
【００３６】
すなわち、図４Ａは、ピーク波長がλ１の蛍光プローブに対応する波長特性を、図４Ｂは、ピーク波長がλ２の蛍光プローブに対応する波長特性を、図４Ｃは、ピーク波長がλ３の蛍光プローブに対応する波長特性を、それぞれ示している。
【００３７】
なお、本実施形態においては、例えば、レーザ光源７は、ピーク波長がλ１の蛍光プローブに対応する励起レーザを射出し、また、レーザ光源８は、ピーク波長がλ２の蛍光プローブに対応する励起レーザを射出し、また、レーザ光源９は、ピーク波長がλ３の蛍光プローブに対応する励起レーザを射出するものとする。
【００３８】
図５は、波長送り量を分光制御部に設定する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図２の最近接ピーク間距離算出部２１、送り量設定部２２によって行なわれる。
【００３９】
図５において、まず、ステップＳ１０１で、最近接ピーク間距離算出部２１によって、分光データ取得条件格納部１７から標本に塗布された複数の蛍光プローブが発する蛍光ピーク波長が取得される。ここでは、例えば以下のような値が各蛍光プローブの発する蛍光ピーク波長として分光データ取得条件格納部１７に格納されているものとする。
λ１＝５１０ｎｍ
λ２＝５６０ｎｍ
λ３＝５８０ｎｍ
続く、ステップＳ１０２で、取得したピーク波長λ１、λ２、λ３から、最近接ピーク間距離算出部２１によって、最も近接したピーク波長の差分が求められ、変数λGapMinに格納される。この場合、λ２とλ３との差が最小となるので、λGapMinは、次のように算出される。
λGapMin＝｜λ２−λ３｜＝｜５６０ｎｍ−５８０ｎｍ｜＝２０ｎｍ
そして、ステップＳ１０３で、送り量設定部２２によって、変数λGapMinの値が回折ミラーの回転角（波長送り量）として、分光制御部１８に設定される。例えば、１度が４０ｎｍ分の送り量に相当する場合、２０ｎｍの波長送り量に対して０．５度に回転角が設定される。
【００４０】
このようにすれば、送り量設定部２２によって、波長送り量は、最近接ピーク間距離に一致するように設定されるので、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含まれるのを回避することが可能となると共に、例えば、１回の分光データの取得区間内に複数の蛍光ピークが含ませないために、分光データの取得範囲内で不必要に分光データの取得回数を増やすことが回避できる。
【００４１】
図６は、第１実施形態における分光部を制御して分光データを取得する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図２の分光分解能設定部２２、分光制御部１８、等によって行なわれる。
【００４２】
図６において、まず、ステップＳ２０１で、ユーザは、図２の取得開始・終了位置指定部２３を用いて、分光データの取得開始波長λStartを指定する。また、ステップＳ２０２で、ユーザは、同様に、取得開始・終了位置指定部２３を用いて、分光データの取得終了波長λEndを指定する。
【００４３】
続いて、ステップＳ２０３で、分光制御部１８によって、取得開始波長と取得終了波長とに基づいて定まる取得範囲を、既に設定済みの波長送り量で割ることで、その取得範囲に対する分光データを取得するのに必要な、１回分の分光データの取得を行なう回数（繰り返し数）Ｎが以下の式によって算出される。
Ｎ＝（λEnd−λStart）／λGapMin
ステップＳ２０４では、上記算出されたλGapMinに基づいて、図２の分光分解能設定部２２によって、スリット幅（分光分解能）λResolutionが設定される。このステップにおいて、例えば、λGapMinに一致するように、すなわち、隣接する１回の取得範囲同士が互いに境界を接するように、スリット幅λResolutionが設定される（λResolution＝λGapMin）。
【００４４】
そして、以下のステップＳ２０５〜Ｓ２０８のループ処理を繰り返すことで、１回分の分光データが順次取得される。
まず、ループ処理に先立って、カウンタＩを“０”に初期化する。そして、ステップＳ２０５において、既に算出してある繰り返し数ＮがカウンタＩより大きいか（Ｎ＞Ｉ）が判定される。
【００４５】
ステップＳ２０５で、ＮがＩ以下であれば、一連の処理を終了する。
ステップＳ２０５で、ＮがＩより大きければ、ステップＳ２０６に進み、そこで、分光制御部１８によって、回折ミラーを下記位置に送られるように回転させる。
λStart＋（Ｉ×λGapMin）
続いて、ステップＳ２０７で、１回分の分光データの取得処理が行なわれる。すなわち、上記したように、レーザ光源７〜９から射出、集光、合成された励起レーザは、標本（面）上で２次元走査（照射）され、その照射に対応する標本からの蛍光が、再び、対物レンズ１、偏向部２、励起ダイクロイックミラー３を通過して、全反射ミラー１２に向かい、そこで、さらに転向されて、分光制御部１８によってステップＳ２０６で角度（位置）が設定された回折ミラー１３に入射する。そして、その回折ミラー１３によって、蛍光はスペクトル分解され、波長選択される。この回折ミラー１３を介した蛍光から、さらに、分光制御部１８によってステップＳ２０４においてその幅が設定されたスリット１１により受光波長範囲外の蛍光が除外される。スリット１１を通過した受光波長範囲の蛍光は、光電変換部１４において電気信号に変換される。このようにして、１回分の分光データが取得される。
【００４６】
そして、ステップＳ２０８において、カウンタ変数ＩをインクリメントしてステップＳ２０５に戻る。ステップＳ２０５では、インクリメントされたカウンタＩについて繰り返し数Ｎとの比較を行なう。
【００４７】
図７は、図３の３つの蛍光プローブからの蛍光の波長特性に対応して設定された分光データの取得範囲の一例を示す図（その１）である。
図７において、ユーザは、取得開始・終了位置指定部を用いて、分光データの取得開始波長λStart、取得終了波長λEndを以下のように設定する。
λStart＝５００ｎｍ
λEnd＝６００ｎｍ
最近接ピーク間距離λGapMinは、上記したように、２０ｎｍで与えられるので、この例では、５００−５２０ｎｍ、５２０−５４０ｎｍ、５４０−５６０ｎｍ、５６０−５８０ｎｍ、５８０−６００ｎｍ、の５回に分けて分光データの取得が行なわれることになる。
【００４８】
なお、取得した分光データが蛍光ピーク波長とそのピーク波長に対応する励起レーザのピーク波長とを含む場合には、実際には、その取得した分光データ中のピーク波長に対応する標本（細胞）中の部位を観察することが困難となるが、実際の使用においては、そのような取得範囲を採用せずに捨てれば済むため、上述の第１実施形態のような励起レーザの波長位置を考慮しない取得範囲の設定方法も有用である。以下に説明する第２実施形態においては、このような励起レーザの波長位置も考慮して取得範囲を設定している。
【００４９】
第２実施形態においても、図１に示されるレーザ走査顕微鏡の構成が基本的には採用される。
図８は、第２実施形態の分光データ取得条件設定部１６の構成を示すブロック図である。
【００５０】
図８において、分光データ取得条件設定部１６は、図２と比較して、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光のピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定する区間判定部３１、を備える。そして、この区間判定部３１によって、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、分光制御部１８は、その設定された区間に基づいて、分光部を制御して分光データを取得する。
【００５１】
なお、区間判定部３１による条件が満たされない場合に、区間をさらに分割する区間分割部があってもよい。
図９は、第２実施形態の分光データ取得条件設定部１６の変形例を示すブロック図である。
【００５２】
図９において、分光データ取得条件設定部１６は、図８と比較して、区間判定部３１によって、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザピーク波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたと判定された場合に、その設定された区間をさらに所定数に分割する区間分割部３２、をさらに備える。そして、区間判定部３１は、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光のピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを、区間分割部３２によって分割された区間に対しても判定する。
【００５３】
このようにすれば、区間分割部３２を用いて分割を繰り返すことにより、区間判定部３１による条件が満たされる区間が設定され易くなる。
また、本第２実施形態においては、分光特性データ格納部２７は、各蛍光プローブのピーク波長と、それぞれのピーク波長に対応する励起レーザ波長とを関連付けて格納する。
【００５４】
例えば、３つの蛍光プローブが標本に塗布される場合に、各蛍光プローブの蛍光ピーク波長が、λ１（＝５１０ｎｍ）、λ２（＝５６０ｎｍ）、λ３（＝５８０ｎｍ）で、それぞれのピーク波長に対応する励起レーザ波長が、Exλ１（＝４９２ｎｍ）、Exλ２（＝５４２ｎｍ）、Exλ３（＝５７５ｎｍ）である場合に、以下のようなデータが分光特性データ格納部２７には格納されている。
λ１＝５１０ｎｍ Exλ１＝４９２ｎｍ
λ２＝５６０ｎｍ Exλ２＝５４２ｎｍ
λ３＝５８０ｎｍ Exλ３＝５７５ｎｍ
以下、第２実施形態におけるレーザ走査顕微鏡の動作について説明する。まず、第１実施形態の図５のフローチャートと同様の処理が行なわれることによって、最近接ピーク間距離算出部２１によって変数λGapMinに設定された最も近接するピーク波長間の距離が、送り量設定部２２によって波長送り量として分光制御部に設定される。
【００５５】
図１０は、第２実施形態における分光部を制御して分光データを取得する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図２の分光分解能設定部２３、分光制御部１８、等によって行なわれる。
【００５６】
この図１０のフローチャートは、第１実施形態の図６のフローチャートにステップＳ３０１とステップＳ３０２との処理を追加したものとなっている。
この追加されたステップＳ３０１では、設定されたλGapMinおよび分光特性データ格納部２７に格納された励起レーザ波長Exλ１、Exλ１、Exλ１とを取得する。また、ステップＳ３０２では、ステップＳ３０１で取得されたλGapMin、各励起レーザを参照して、一旦設定された波長送り量を再設定する処理、例えば、所定数に分割する処理、が行なわれる。
【００５７】
図１１は、図１０のステップＳ３０２の処理（波長送り量の再設定処理）をより詳細に示すフローチャートである。
図１１において、まず、ステップＳ４０１で、カウンタの値を“０”に初期化する。続いて、ステップＳ４０２で、既に設定されている取得開始波長λStartとλGapMinとから現在の（Ｉ番目の）区間の分光データ取得開始波長λSectionStart（＝λStart＋Ｉ×λGapMin）を算出すると共に、その現区間の分光データ取得開始波長λSectionStartが既に設定されている取得終了波長λEndより小さいかが判定される。
【００５８】
ステップＳ４０２で、現区間の分光データ取得開始波長λSectionStartが取得終了波長λEnd以上であると判定された場合は、一連の処理を終了する。
一方、ステップＳ４０２で、現区間の分光データ取得開始波長λSectionStartが取得終了波長λEndより小さいと判定された場合は、ステップＳ４０３に進み、そこで、現区間の分光データ取得終了波長λSectionEnd（＝λStart＋（Ｉ＋１）×λGapMin）を算出する。通常そうであるように、現区間の分光データ取得終了波長は、次区間の分光データ取得開始波長に一致する。
【００５９】
そして、ステップＳ４０４において、現区間、すなわち、λSectionStartとλSectionEndとの間に、分光特性データ格納部１７に格納されている、標本に照射される各励起レーザピーク波長Exλ１、Exλ２、Exλ３、及び、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長λ１、λ２、λ３の内の２つが入っているかどうかにつき判定する。
【００６０】
ステップＳ４０４において、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の２つが、λSectionStartとλSectionEndとの間に含まれると判定された場合には、ステップＳ４０５に進み、そこで、λGapMinの値を半分（λGapMin＝λGapMin／２）に再設定（分割）し、ステップＳ４０１に戻り、上記処理を繰り返す。
【００６１】
一方、ステップＳ４０４において、λSectionStartとλSectionEndとの間に、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合には、ステップＳ４０６でカウンタＩをインクリメント（Ｉ＝Ｉ＋１）してステップＳ４０２に戻り、ステップＳ４０２以降の処理が次区間に対して行なわれる。
【００６２】
このようにして再設定された区間に基づいて、図１０のステップＳ２０３以降の処理が行なわれる。
図１２は、図３の３つの蛍光プローブからの蛍光の波長特性に対応して設定された分光データの取得範囲の一例を示す図（その２）である。
【００６３】
図１２において、ユーザは、取得開始・終了位置指定部を用いて、分光データの取得開始波長λStart、取得終了波長λEndを以下のように設定する。
λStart＝５００ｎｍ
λEnd＝６００ｎｍ
最近接ピーク間距離λGapMinは、上記したように、２０ｎｍで与えられるので、この例では、当初は、５００−５２０ｎｍ、５２０−５４０ｎｍ、５４０−５６０ｎｍ、５６０−５８０ｎｍ、５８０−６００ｎｍ、の５回に分けて分光データの取得が行なわれる予定であった。
【００６４】
しかし、当初の各区間の幅（２０ｎｍ）では、例えば、区間５６０−５８０ｎｍに、励起レーザピーク波長Exλ３（＝５７５ｎｍ）と蛍光ピーク波長λ３（＝５８０ｎｍ）とが含まれてしまうため、現区間が５６０−５８０ｎｍの区間である場合に図１１のステップＳ４０４において、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の２つが、λSectionStart（＝５６０ｎｍ）とλSectionEnd（＝５８０ｎｍ）との間に含まれると判定され、続くステップＳ４０５において、λGapMinの値が、２０ｎｍから半分の１０ｎｍに再設定（分割）される。
【００６５】
しかし、この再設定によって、５００−５１０ｎｍ、・・・、５９０−６００ｎｍの１０区間に分割されたとしても、例えば、区間５７０−５８０ｎｍに、励起レーザピーク波長Exλ３（＝５７５ｎｍ）と蛍光ピーク波長λ３（＝５８０ｎｍ）とが含まれてしまうため、現区間が５７０−５８０ｎｍの区間である場合に図１１のステップＳ４０４において、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の２つが、λSectionStart（＝５７０ｎｍ）とλSectionEnd（＝５８０ｎｍ）との間に含まれると判定され、続くステップＳ４０５において、λGapMinの値が、１０ｎｍから半分の５ｎｍに再設定（分割）される。
【００６６】
そして、この結果、５００−５０５ｎｍ、・・・、５９５−６００ｎｍの２０区間に分割され、かつ、各区間はいずれも、図１１のステップＳ４０４において、λSectionStartとλSectionEndとの間に、Exλ１、Exλ２、Exλ３、λ１、λ２、λ３の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定されるので、分光制御部はこの区間に基づいて分光部を制御して分光データの取得を行なうことになる。
【００６７】
以上の説明では、分光データの取得開始波長、取得終了波長は、いずれも図２の取得開始・終了位置指定部２４を用いてユーザが指定していたが、この取得開始波長、取得終了波長、すなわち、取得範囲を自動的に設定することも可能である。以下に述べる第３実施形態では、取得範囲を自動的に設定している。
【００６８】
第３実施形態においても、図１に示されるレーザ走査顕微鏡の構成が基本的には採用される。
図１３は、第３実施形態の分光データ取得条件設定部１６の構成を示すブロック図である。
【００６９】
図１３の分光データ取得条件設定部１６は、図２と比較して、取得開始・終了位置指定部２４の替わりに取得範囲設定部３４を備えている。この取得範囲設定部３４は、分光特性データ格納部３７に格納されている、標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを設定する。
【００７０】
取得範囲設定部３４は、標本に塗布された全ての蛍光プローブに対応するピーク波長を含むように、分光データの取得範囲を設定する。その際、例えば、右端または左端のピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合だけ減少した端部寄りの波長位置を分光データの取得開始位置、および、取得終了位置に設定する。
【００７１】
また、本第３実施形態においては、分光特性データ格納部３７は、各蛍光プローブのピーク波長と、それぞれのピーク波長に対応するピーク値の半値幅（分布曲線の値がそのピーク値から半分に減少した波長位置までのピーク波長からのずれ量）とを関連付けて格納する。
【００７２】
例えば、３つの蛍光プローブが標本に塗布される場合に、各蛍光プローブのピーク波長が、λ１（＝５１０ｎｍ）、λ２（＝５６０ｎｍ）、λ３（＝５８０ｎｍ）で、それぞれのピーク波長に対応するピーク値の半値幅が、Δλ１（＝±２０ｎｍ）、Δλ２（＝±１５ｎｍ）、Δλ３（＝±１０ｎｍ）である場合に、以下のようなデータが分光特性データ格納部３７には格納されている。
λ１＝５１０ｎｍ Δλ１＝±２０ｎｍ
λ２＝５６０ｎｍ Δλ２＝±１５ｎｍ
λ３＝５８０ｎｍ Δλ３＝±１０ｎｍ
以下、第３実施形態におけるレーザ走査顕微鏡の動作について図１４および図１５のフローチャートを参照して説明する。
【００７３】
図１４は、分光データの取得開始波長を設定する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図１３の取得範囲設定部３４によって行なわれる。
図１４において、まず、ステップＳ５０１で、取得範囲設定部３４によって、分光特性データ格納部３７から最も短波長側（左端）の蛍光からのピーク波長（この場合、λ１）が取得され、変数λMinに設定される。また、同様に、その半値幅（ピーク波長からのずれ量、この場合、Δλ１）が取得され、変数λH1に設定される。
【００７４】
続く、ステップＳ５０２で、取得範囲設定部３４によって、下記式に基づいて、分光データの取得開始位置λStartが求められる。
λStart＝λMin−λH1
ここで、ステップＳ５０２において、ピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合（この場合、１／２）だけ減少した端部寄りの波長位置を求めることから、ずれ量λH1を左端ピーク波長λMinから減算している。
【００７５】
図１５は、分光データの取得終了波長を設定する処理のフローチャートである。このフローチャートの処理は、図１３の取得範囲設定部３４によって行なわれる。
図１５において、まず、ステップＳ６０１で、取得範囲設定部３４によって、分光特性データ格納部３７から最も長波長側（右端）の蛍光からのピーク波長（この場合、λ３）が取得され、変数λMaxに設定される。また、同様に、その半値幅（ピーク波長からのずれ量、この場合、Δλ１）が取得され、変数λH2に設定される。
【００７６】
続く、ステップＳ６０２で、取得範囲設定部３４によって、下記式に基づいて、分光データの取得終了位置λEndが求められる。
λEnd＝λMax＋λH2
ここで、ステップＳ６０２において、ピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合（この場合、１／２）だけ減少した端部寄りの波長位置を求めることから、ずれ量λH2を右端ピーク波長λMaxに加算している。
【００７７】
なお、分光特性データ格納部３７に格納される上記の分光特性データについて、図１４及び図１５の処理を行なえば、以下に示すような値が取得開始位置λStart、取得終了位置λEndにそれぞれ設定される。
λStart＝λMin−λH1＝５１０ｎｍ−２０ｎｍ＝４９０ｎｍ
λEnd＝λMax＋λH2＝５８０ｎｍ＋１０ｎｍ＝５９０ｎｍ
このように本第３実施形態においては、複数の蛍光プローブが導入された試料（標本）に対して、有効な分光データを取得できる範囲が自動的に設定できるので、レーザ走査顕微鏡を用いて標本の観察を行なう観察者の負担を軽減することが可能となる。
【００７８】
以下、本発明の第４実施形態について説明する。第４実施形態では、分光分解能の設定方法について説明するが、この分光分解能の設定処理は、例えば、第１実施形態の図６のフローチャート中のステップＳ２０４にて行なわれる処理である。
【００７９】
この図６のステップＳ２０４では、分光分解能設定部２２によって、スリット幅（分光分解能）λResolutionが、最近接のピーク波長間距離λGapMinに基づいて、下記式に示すように設定される。
λResolution＝λGapMin ・・・ （Ａ１）
本第４実施形態においては、上記式に対して、下記（Ａ２）または（Ａ３）式によって、隣接する区間の境界が互いに所定区間だけ重なるように分光分解能を算出（設定）する。
【００８０】
まず、（Ａ２）式においては、変数λGapMinに対して、１より大きい定数β（β＞１）を乗算することで、分光分解能λResolutionを算出している。
λResolution＝β×λGapMin ・・・ （Ａ２）
また、（Ａ３）式においては、上記（Ａ２）の右辺に対して、蛍光強度Ｉに関する減少関数ｆ（Ｉ）（Ｉ1＜Ｉ2ならば、ｆ（Ｉ1）＞ｆ（Ｉ2））をさらに乗算して分光分解能λResolutionを算出している。
λResolution＝β×ｆ（Ｉ）×λGapMin ・・・ （Ａ３）
ここで、ｆ（Ｉ）は蛍光強度Ｉに関する減少関数であるので、蛍光強度が弱い蛍光プローブほど大きい値をとることになり、結果として、蛍光強度が弱い蛍光プローブほどλResolutionが大きな値となり（分光分解能が下がり）、明るさをかせぐことができる。
【００８１】
本第４実施形態においては、特に、蛍光強度が弱い蛍光プローブからの分光データも取得できるようになる、という利点を有する。
以上の説明では、分光データの１回の取得区間について制約を設けない構成であったが、例えば、１回の取得区間が小さくなり過ぎると、蛍光ピークを検出することが困難になるという問題がある。このような事態を回避するには、図２、図８、図９、図１３において、ピークを検出することが可能な目安となる分光分解能の下限を格納する分解能下限値格納部と、設定された又は分割された区間の区間幅が上記下限値以下であるか否かを判定する区間幅判定部と、をさらに備えるようにしてもよい。
【００８２】
そして、設定された又は分割された区間の区間幅が上記下限値より大きい場合に、分光制御部は、その設定された又は分割された区間に基づいて、分光部を制御して分光データを取得する。
【００８３】
図１６は、第１実施形態の図２のブロック図に対して、分解能下限値格納部４２と、区間幅判定部４１とが追加されたブロック図である。
なお、第３実施形態の図１３のブロック図に対しても、図１６に対して行なったのと同様にして、分解能下限値格納部４２と、区間幅判定部４１とを追加することができる。
【００８４】
また、第２実施形態の図８および図９のブロック図に対しては、区間判定部３１に区間幅判定部４１の機能を兼用させてもよい。この場合、区間判定部３１は、分解能下限値格納部４２に格納された分解能下限値を参照して、区間幅の下限値との比較を行なう。
【００８５】
図１７は、第１実施形態の図５のフローチャートに、区間幅の下限値との比較処理を追加したフローチャートである。
図１７では、図５と比較し、ステップＳ１０３の後にステップＳ１０４が設けられ、このステップＳ１０４において、ステップＳ１０２で設定された変数λGapMinと設定可能最小値を示す分光分解能下限値とが比較される。そして、このステップＳ１０４の判定ステップにおいて、設定されたλGapMinが分光分解能下限値より大きいと判定された場合に例えば図６や図１０のフローチャートに示される以降の処理を継続し、設定された区間に基づいて、分光データの取得が行なわれる。
【００８６】
図１８は、第２実施形態の図１０のフローチャートに、区間幅の下限値との比較処理を追加したフローチャートである。
図１８では、図１０と比較し、ステップＳ３０２とステップＳ２０３との間にステップＳ３０３が設けられ、このステップＳ３０３において、ステップＳ３０２で再設定された変数λGapMinと設定可能最小値を示す分光分解能下限値とが比較される。そして、このステップＳ３０３の判定ステップにおいて、再設定されたλGapMinが分光分解能下限値より大きいと判定された場合に以降の処理を継続し、設定された区間に基づいて、分光データの取得が行なわれる。
【００８７】
図１９は、本実施形態における各処理をコンピュータに実行させるプログラムが格納される記憶媒体例を示す図である。
図１９に示すように、上記記憶媒体には、ＣＤ−ＲＯＭ、フレキシブルディスク（ＭＯ、ＤＶＤ、リムーバブルハードディスク等であってもよい）等の媒体駆動装置６７に脱着可能な可搬記憶媒体６６、ネットワーク回線６３経由でプログラムが送信される外部の装置（サーバ等）内の記憶手段（データベース等）６２、情報処理装置６１の本体６４内のメモリ（ＲＡＭまたはハードディスク等）６５、が含まれる。本実施形態の各処理を行うプログラムは、上記記憶媒体から本体６４内のメモリ６５にロードされ実行される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の第１実施形態のレーザ走査顕微鏡の構成を示すブロック図である。
【図２】第１実施形態の分光データ取得条件設定部の構成を示すブロック図である。
【図３】３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザを同時に照射した場合の各蛍光プローブからの蛍光の波長特性の一例を示す図である。
【図４Ａ】３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザのいずれか１つを必要なタイミングで照射した場合の、その励起レーザに対応する蛍光プローブからの蛍光（ピーク波長λ１）の波長特性の一例を示す図である。
【図４Ｂ】３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザのいずれか１つを必要なタイミングで照射した場合の、その励起レーザに対応する蛍光プローブからの蛍光（ピーク波長λ２）の波長特性の一例を示す図である。
【図４Ｃ】３つの蛍光プローブが塗布された標本に、３つの励起レーザのいずれか１つを必要なタイミングで照射した場合の、その励起レーザに対応する蛍光プローブからの蛍光（ピーク波長λ３）の波長特性の一例を示す図である。
【図５】波長送り量を分光制御部に設定する処理のフローチャートである。
【図６】第１実施形態における分光部を制御して分光データを取得する処理のフローチャートである。
【図７】図３の３つの蛍光プローブからの蛍光の波長特性に対応して設定された分光データの取得範囲の一例を示す図（その１）である。
【図８】第２実施形態の分光データ取得条件設定部の構成を示すブロック図である。
【図９】第２実施形態の分光データ取得条件設定部の変形例を示すブロック図である。
【図１０】第２実施形態における分光部を制御して分光データを取得する処理のフローチャートである。
【図１１】図１０の波長送り量の再設定処理をより詳細に示すフローチャートである。
【図１２】図３の３つの蛍光プローブからの蛍光の波長特性に対応して設定された分光データの取得範囲の一例を示す図（その２）である。
【図１３】第３実施形態の分光データ取得条件設定部の構成を示すブロック図である。
【図１４】分光データの取得開始波長を設定する処理のフローチャートである。
【図１５】分光データの取得終了波長を設定する処理のフローチャートである。
【図１６】第１実施形態の図２のブロック図に対して、分解能下限値格納部と、区間幅判定部とが追加されたブロック図である。
【図１７】第１実施形態の図５のフローチャートに、区間幅の下限値との比較処理を追加したフローチャートである。
【図１８】第２実施形態の図１０のフローチャートに、区間幅の下限値との比較処理を追加したフローチャートである。
【図１９】記憶媒体例を示す図である。
【図２０】従来のレーザ走査顕微鏡の構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００８９】
１ 対物レンズ
２ 偏向部
３ 励起ダイクロイックミラー
４ 集光装置
５ 合成ミラー
６，１２ 全反射ミラー
７〜９ レーザ光源
１０ レーザユニット
１１ スリット
１３ 回折ミラー
１４ 光電変換部
１５ 分光部
１６ 分光データ取得条件設定部
１７，２７，３７ 分光特性データ格納部
１８ 分光制御部
２１ 最近接ピーク間距離算出部
２２ 送り量設定部
２３ 分光分解能設定部
２４ 取得開始・終了位置指定部
３１ 区間判定部
３２ 区間分割部
３４ 取得範囲設定部
４１ 区間幅判定部
４２ 分解能下限値格納部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、該標本を観察するレーザ走査顕微鏡において、
前記複数の蛍光プローブに対応した励起波長のレーザ光を発生するレーザ光源と、
前記発生されたレーザ光を標本面上でスキャンさせる偏向手段と、
前記標本面からの蛍光を任意の波長幅で取得して分光する分光手段と、
前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定する分光データ取得条件設定手段と、
前記設定された分光データ取得条件に基づいて、前記分光手段を制御する分光制御手段と、
分光された蛍光を受光して電気信号に変換する光電変換手段と、を備えることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
【請求項２】
前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性を格納する分光特性データ格納手段をさらに備え、
前記分光データ取得条件設定手段は、格納された分光特性データに基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項３】
前記分光手段は、標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラーと、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリットと、を備え、
前記分光データ取得条件設定手段は、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、該標本に対して波長走査を行なう際の、前記回折ミラーの回転角に対応する波長送り量、前記スリットの幅に対応する分光分解能を前記分光データ取得条件として設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項４】
前記分光データ取得条件設定手段は、
前記複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出する最近接ピーク間距離算出手段と、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記波長送り量に設定する送り量設定手段と、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記分光分解能を設定する分光分解能設定手段と、を備え、
前記分光制御手段は、前記分光分解能、前記送り量に基づいて、前記分光手段を制御することを特徴とする請求項３記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項５】
前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを指定することが可能な取得開始・終了位置指定手段、をさらに備えることを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項６】
前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを設定する取得範囲設定手段、をさらに備えることを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項７】
前記取得範囲設定手段は、前記標本に塗布された全ての蛍光プローブの蛍光ピーク波長を含むように、分光データの取得範囲を設定することを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項８】
前記分光データ取得条件設定手段は、
標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定する区間判定手段、を備え、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、前記分光制御手段は、前記設定された区間に基づいて、前記分光手段を制御することを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項９】
前記分光データ取得条件設定手段は、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定された場合に、前記設定された区間をさらに所定数に分割する区間分割手段と、を備え、
前記区間判定手段は、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを、前記区間分割手段によって分割された区間に対しても判定することを特徴とする請求項８記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１０】
ピークを検出することが可能な目安となる分光分解能の下限を格納する分解能下限値格納手段と、
設定された又は分割された区間の区間幅が前記下限値以下であるか否かを判定する区間幅判定手段と、をさらに備え、
設定された又は分割された区間の区間幅が前記下限値より大きい場合に、前記分光制御手段は、前記設定された又は分割された区間に基づいて、前記分光手段を制御することを特徴とする請求項４、または、９記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１１】
前記分光分解能設定手段は、隣接する区間の境界が互いに接するように前記分光分解能を設定することを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１２】
前記分光分解能設定手段は、隣接する区間の境界が互いに所定区間だけ重なるように前記分光分解能を設定することを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１３】
前記取得範囲設定手段は、右端または左端のピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合だけ減少した端部寄りの波長位置を分光データの取得開始位置、および、取得終了位置に設定することを特徴とする請求項６記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１４】
複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、該標本を観察するレーザ走査顕微鏡における分光データの取得条件を設定する処理をコンピュータに実現させるプログラムにおいて、
前記複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出する処理と、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラーの回転角に対応する波長送り量に設定する処理と、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリットの幅に対応する分光分解能を設定する処理と、
前記設定された波長送り量、分光分解能に基づいて、前記分光データを取得する処理と、
を前記コンピュータに実行させることを特徴とする分光データ取得プログラム。
【請求項１５】
前記分光データを取得する処理は、指定された前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを加味して行なうことを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項１６】
前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを設定する処理、を備え、
前記分光データを取得する処理は、設定された前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを加味して行なうことを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項１７】
標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定する処理、を備え、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、その設定された区間に基づいて、前記分光データを取得する処理を前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項１８】
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定された場合に、前記設定された区間をさらに所定数に分割する処理、を備え、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかの判定を、前記分割された区間に対しても行なうことを特徴とする請求項１７記載の分光データ取得プログラム。
【請求項１９】
隣接する区間の境界が互いに接するように前記分光分解能を設定する処理、を備えることを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項２０】
隣接する区間の境界が互いに所定区間だけ重なるように前記分光分解能を設定する処理、を備えることを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項２１】
右端または左端のピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合だけ減少した端部寄りの波長位置を分光データの取得開始位置、および、取得終了位置に設定する処理、を備えることを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項２２】
複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、該標本を観察するレーザ走査顕微鏡に接続されたコンピュータが行なう分光データの取得条件を設定する方法において、
前記複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出し、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラーの回転角に対応する波長送り量に設定し、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリットの幅に対応する分光分解能を設定し、
前記設定された波長送り量、分光分解能に基づいて、前記分光データを取得する、
ことを特徴とする分光データ取得方法。
【請求項２３】
前記分光データを取得するに際して、指定された前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを加味して行なうことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２４】
さらに、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを設定し、
前記分光データを取得するに際して、設定された前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを加味して行なうことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２５】
標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定し、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザピーク波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、その設定された区間に基づいて、前記分光データを取得する、
ことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２６】
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定された場合に、前記設定された区間をさらに所定数に分割し、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかの判定を、前記分割された区間に対しても行なう、
ことを特徴とする請求項２５記載の分光データ取得方法。
【請求項２７】
さらに、隣接する区間の境界が互いに接するように前記分光分解能を設定する、ことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２８】
さらに、隣接する区間の境界が互いに所定区間だけ重なるように前記分光分解能を設定する、ことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２９】
さらに、右端または左端のピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合だけ減少した端部寄りの波長位置を分光データの取得開始位置、および、取得終了位置に設定する、ことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項１】
複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、該標本を観察するレーザ走査顕微鏡において、
前記複数の蛍光プローブに対応した励起波長のレーザ光を発生するレーザ光源と、
前記発生されたレーザ光を標本面上でスキャンさせる偏向手段と、
前記標本面からの蛍光を任意の波長幅で取得して分光する分光手段と、
前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定する分光データ取得条件設定手段と、
前記設定された分光データ取得条件に基づいて、前記分光手段を制御する分光制御手段と、
分光された蛍光を受光して電気信号に変換する光電変換手段と、を備えることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
【請求項２】
前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性を格納する分光特性データ格納手段をさらに備え、
前記分光データ取得条件設定手段は、格納された分光特性データに基づいて、前記分光手段が分光データを取得する際の条件を設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項３】
前記分光手段は、標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラーと、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリットと、を備え、
前記分光データ取得条件設定手段は、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、該標本に対して波長走査を行なう際の、前記回折ミラーの回転角に対応する波長送り量、前記スリットの幅に対応する分光分解能を前記分光データ取得条件として設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項４】
前記分光データ取得条件設定手段は、
前記複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出する最近接ピーク間距離算出手段と、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記波長送り量に設定する送り量設定手段と、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記分光分解能を設定する分光分解能設定手段と、を備え、
前記分光制御手段は、前記分光分解能、前記送り量に基づいて、前記分光手段を制御することを特徴とする請求項３記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項５】
前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを指定することが可能な取得開始・終了位置指定手段、をさらに備えることを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項６】
前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを設定する取得範囲設定手段、をさらに備えることを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項７】
前記取得範囲設定手段は、前記標本に塗布された全ての蛍光プローブの蛍光ピーク波長を含むように、分光データの取得範囲を設定することを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項８】
前記分光データ取得条件設定手段は、
標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定する区間判定手段、を備え、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、前記分光制御手段は、前記設定された区間に基づいて、前記分光手段を制御することを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項９】
前記分光データ取得条件設定手段は、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定された場合に、前記設定された区間をさらに所定数に分割する区間分割手段と、を備え、
前記区間判定手段は、標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを、前記区間分割手段によって分割された区間に対しても判定することを特徴とする請求項８記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１０】
ピークを検出することが可能な目安となる分光分解能の下限を格納する分解能下限値格納手段と、
設定された又は分割された区間の区間幅が前記下限値以下であるか否かを判定する区間幅判定手段と、をさらに備え、
設定された又は分割された区間の区間幅が前記下限値より大きい場合に、前記分光制御手段は、前記設定された又は分割された区間に基づいて、前記分光手段を制御することを特徴とする請求項４、または、９記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１１】
前記分光分解能設定手段は、隣接する区間の境界が互いに接するように前記分光分解能を設定することを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１２】
前記分光分解能設定手段は、隣接する区間の境界が互いに所定区間だけ重なるように前記分光分解能を設定することを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１３】
前記取得範囲設定手段は、右端または左端のピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合だけ減少した端部寄りの波長位置を分光データの取得開始位置、および、取得終了位置に設定することを特徴とする請求項６記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項１４】
複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、該標本を観察するレーザ走査顕微鏡における分光データの取得条件を設定する処理をコンピュータに実現させるプログラムにおいて、
前記複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出する処理と、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラーの回転角に対応する波長送り量に設定する処理と、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリットの幅に対応する分光分解能を設定する処理と、
前記設定された波長送り量、分光分解能に基づいて、前記分光データを取得する処理と、
を前記コンピュータに実行させることを特徴とする分光データ取得プログラム。
【請求項１５】
前記分光データを取得する処理は、指定された前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを加味して行なうことを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項１６】
前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを設定する処理、を備え、
前記分光データを取得する処理は、設定された前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを加味して行なうことを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項１７】
標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定する処理、を備え、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、その設定された区間に基づいて、前記分光データを取得する処理を前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項１８】
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定された場合に、前記設定された区間をさらに所定数に分割する処理、を備え、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかの判定を、前記分割された区間に対しても行なうことを特徴とする請求項１７記載の分光データ取得プログラム。
【請求項１９】
隣接する区間の境界が互いに接するように前記分光分解能を設定する処理、を備えることを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項２０】
隣接する区間の境界が互いに所定区間だけ重なるように前記分光分解能を設定する処理、を備えることを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項２１】
右端または左端のピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合だけ減少した端部寄りの波長位置を分光データの取得開始位置、および、取得終了位置に設定する処理、を備えることを特徴とする請求項１４記載の分光データ取得プログラム。
【請求項２２】
複数の蛍光プローブが塗布された標本にレーザ光を照射して、その照射に対応する標本からの蛍光を受光することで、該標本を観察するレーザ走査顕微鏡に接続されたコンピュータが行なう分光データの取得条件を設定する方法において、
前記複数の蛍光プローブからの蛍光ピーク波長に基づいて、それら複数のピーク波長のうちの最も近接するピーク波長間の距離を算出し、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、前記標本からの蛍光をスペクトル分解し、かつ、波長選択する回折ミラーの回転角に対応する波長送り量に設定し、
前記算出された最近接ピーク間距離に基づいて、受光する蛍光の波長範囲を選択するスリットの幅に対応する分光分解能を設定し、
前記設定された波長送り量、分光分解能に基づいて、前記分光データを取得する、
ことを特徴とする分光データ取得方法。
【請求項２３】
前記分光データを取得するに際して、指定された前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを加味して行なうことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２４】
さらに、前記標本に塗布された複数の蛍光プローブの既知の分光特性に基づいて、前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを設定し、
前記分光データを取得するに際して、設定された前記分光データの取得開始波長と、取得終了波長とを加味して行なうことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２５】
標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかを判定し、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザピーク波長の内の１つが含まれるか、または、いずれも含まれないと判定された場合に、その設定された区間に基づいて、前記分光データを取得する、
ことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２６】
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定された場合に、前記設定された区間をさらに所定数に分割し、
前記標本に塗布された各蛍光プローブからの蛍光ピーク波長、及び、前記標本に照射される各励起レーザ波長の内の２つが含まれるように区間が設定されたかの判定を、前記分割された区間に対しても行なう、
ことを特徴とする請求項２５記載の分光データ取得方法。
【請求項２７】
さらに、隣接する区間の境界が互いに接するように前記分光分解能を設定する、ことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２８】
さらに、隣接する区間の境界が互いに所定区間だけ重なるように前記分光分解能を設定する、ことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【請求項２９】
さらに、右端または左端のピーク波長に対応する分布曲線の値がそのピーク値から所定の割合だけ減少した端部寄りの波長位置を分光データの取得開始位置、および、取得終了位置に設定する、ことを特徴とする請求項２２記載の分光データ取得方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００６−３９１１６（Ｐ２００６−３９１１６Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２１７３９７（Ｐ２００４−２１７３９７）
【出願日】平成１６年７月２６日（２００４．７．２６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２６日（２００４．７．２６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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