上皮増殖因子受容体モデュレーターに対する感受性を決定するためのバイオマーカーおよび方法
ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測する方法であって、（ａ）エピレグリンおよびアンフィレグリンから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し、ついで（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の増大を示すものである方法において有用なＥＧＦＲバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にファーマコゲノミクスの分野に関し、さらに詳細には、個性化された遺伝子プロファイルの同定を可能にすべく患者の薬物感受性を決定する方法および手順に関し、このような個性化された遺伝子プロファイルは疾患および障害を治療するうえで役立つものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は組織臨床的な異質さの大きな疾患である。従来の組織学的および臨床的な特徴が予後と関連付けられているけれども、同じみかけの予後タイプの腫瘍が治療に対する応答性および患者のその後の生存において大きく異なっている。
【０００３】
各患者について治療の個性化を容易にする新たな予後および予測マーカーが、臨床において小分子や生物学的分子医薬などの治療に対する患者の応答を正確に予測するために必要である。この問題は、治療に対する患者の感受性をより良く予測できる新たなパラメーターの同定により解決される。患者試料の分類は癌の診断および治療の重要な側面である。治療に対する患者の応答と分子および遺伝マーカーとの関連付けは、非応答患者における治療の開発の新たな機会を開くことができ、あるいは有効性における一層高い確実さの故に他の治療選択のうちで治療の適応症を識別することができる。さらに、医薬、薬物、または組合せ療法に良く応答する傾向のある患者を前もって選択することは、臨床研究において必要な患者の数を減らし、臨床開発プログラムを完成するのに必要な時間を短縮することができる（Cockettら、Current Opinion in Biotechnology, 11:602-609 (2000)）。
【０００４】
患者において薬物感受性を予測することができることは特に興味深いことである、なぜなら、薬物応答性は標的細胞にとって内生の特性のみならず、宿主の代謝特性をも反映するものだからである。遺伝情報を用いて薬物感受性を予測しようとする努力は、多剤耐性遺伝子mdr1およびmrp1などの広い作用を有する個々の遺伝子に主として向けられてきた（Sonneveld, J. Intern. Med., 247:521-534 (2000)）。
【０００５】
遺伝子ｍＲＮＡ発現パターンの大スケールの特徴付けのためのマイクロアレイ法の開発は、分子マーカーを体系的に探索すること、および伝統的な組織病理学的方法では明らかではなかった別個のサブグループに癌を分類することを可能にした（Khanら、Cancer Res., 58:5009-5013 (1998); Alizadehら、Nature, 403:503-511 (2000); Bittnerら、Nature, 406:536-540 (2000); Khanら、Nature Medicine, 7(6):673-679 (2001);およびGolubら、Science, 286:531-537 (1999); Alonら、P. N. A. S. USA, 96:6745-6750 (1999)）。そのような技術および分子ツールは、分子集団内での多数の転写物の発現レベルをいかなる所定の時点においてもモニターすることを可能にした（たとえば、Schenaら、Science, 270:467-470 (1995); Lockhartら、Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Blanchardら、Nature Biotechnology, 14:1649 (1996)；Ashbyらの米国特許第5,569,588号を参照）。
【０００６】
最近の研究は、ヒト腫瘍のマイクロアレイ分析によって生成した遺伝子発現情報が臨床結果を予測し得ることを示している（van't Veerら、Nature, 415:530-536 (2002); Sorlieら、P. N. A. S. USA, 98:10869-10874 (2001); M. Shippら、Nature Medicine, 8(1):68-74 (2002): Glinskyら、The Journal of Clin. Invest., 113(6):913-923 (2004)）。これら知見は、治療に対する個々の腫瘍の応答をより良く予測することにより癌の治療が大きく改善されるであろうとの希望をもたらす。
【０００７】
上皮増殖因子受容体（EGFR）およびその下流のシグナル伝達エフェクター、特にRas/Raf/MAPキナーゼ経路の成員は、正常および異常な両上皮細胞生物学において重要な役割を果たしており（Normannoら、Gene 366, 2-16 (2006)）、それゆえ治療開発の確立された標的となってきている。抗EGFR抗体であるcetuximabおよびEGFR小分子チロシンキナーゼインヒビター（TKI）であるgefitinibおよびerlotinibは患者のサブセットで活性を示したが（BaselgaおよびArteaga, J. Clin. Oncol. 23, 2445-2459 (2005)）、その初期の臨床開発は、最も利益を受けやすい患者の集団を同定する付随する戦略の利益を受けなかった。比較的少数の腫瘍のみが「EGFR経路依存的」であり、それゆえEGFRインヒビターに応答しやすいとの仮説が、このクラスの治療法で観察される限定された臨床活性を説明するかもしれない。例えば、難治性の転移性結腸直腸癌を罹患する患者では、cetuximabでの臨床応答率は、一貫して単独療法での１１％から化学療法との併合療法での２３％までの範囲である（Cunninghamら、N. Engl. J. Med 351, 337-345 (2004)）。今日、EGFR抑制に対する感受性または耐性のメカニズムを解明することに焦点を当てた相当の努力が、とりわけEGFRタンパク質発現、キナーゼドメイン突然変異、および遺伝子コピー数の評価によりなされてきている。
【０００８】
免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定してＥＧＦＲの相対的なタンパク質発現が多くの固形腫瘍で示されているが（CiardielloおよびTortora, Eur. J. Cancer 39, 1348-1354 (2003)）、ＥＧＦＲ発現とＥＧＦＲインヒビターに対する応答との一貫した関連性は確立されていない。ｍＣＲＣを罹患した患者での単独療法およびirinotecanとの併合療法でのcetuximabの臨床研究は、ＩＨＣによる測定でＸ線撮影した応答とＥＧＦＲタンパク質発現との間の関連性を明らかにすることができなかった（Cunninghamら、N. Engl. J. Med 351, 337-345 (2004); Saltzら、J. Clin. Oncol. 22, 1201-1208 (2004)）。さらに、臨床応答はＥＧＦＲタンパク質発現が検出できない患者で示されている（Chungら、J. Clin. Oncol., 23, 1803-1810 (2005); Lenzら、Activity of cetuximab in patients with colorectal cancer refractory to both irinotecan and oxaliplatin. 2004 ASCO Annual Meeting Proceedingsで提出された論文; Saltz, Clin Colorectal Cancer, 5 Suppl. 2, S98-100 (2005)）。これと比較して、NSCLC患者におけるerlotinibおよび卵巣癌におけるgefitinibの臨床研究は、ＥＧＦＲ発現、応答、および生存の間の関連性を示した（Schilderら、Clin. Cancer Res., 11, 5539-5548 (2005); Tsaoら、N. Engl. J. Med., 353, 133-144 (2005)）。特にNSCLCにおけるチロシンキナーゼドメイン中の体細胞突然変異の存在は、多数記載されている（Janneら、J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)）。前臨床および臨床の両状況において、これら突然変異はgefitinibおよびerlotinibに対する感受性とは相関関係を有するがcetuximabに対する感受性とは相関関係を有しないことがわかっている（Janneら、J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005); Tsuchihashiら、N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)）。加えて、ＣＲＣ患者におけるＥＧＦＲキナーゼドメイン突然変異の欠如は、そのような突然変異がcetuximabに対する応答の基礎となっていない（underlie）ことを示唆している。ＥＧＦＲ遺伝子コピー数もまた、ＥＧＦＲインヒビターに対する応答の潜在的なプレディクターとして評価されている。gefitinibの臨床研究は、増大したＥＧＦＲコピー数、突然変異の状態、および臨床応答の間の関連性を示した（Cappuzzoら、J. Natl. Cancer Inst., 97, 643-655 (2005)）。同様の関連性は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるcetuximabおよびpanitumumabで処置した少数の患者でも認められた（Moroniら、Lancet Oncol., 6, 279-286 (2005)）。さらなる潜在的な予測用バイオマーカーも評価されている。例えば、神経膠芽細胞腫の患者において、ＥＧＦＲｖIIIおよびＰＴＥＮの同時発現とＥＧＦＲ小分子インヒビターに対する応答との間の有意の関連性が見出された（Mellinghoffら、N. Engl. J. Med., 353, 2012-2024 (2005)）。
【０００９】
cetuximabの抗腫瘍活性は、ＥＧＦＲリガンド結合およびリガンド依存性のＥＧＦＲ活性化を阻止できることによるとされている。cetuximabの臨床活性は複数の上皮腫瘍タイプで示されているが（Bonnerら、N. Engl. J. Med., 354, 567-578 (2006); Cunninghamら、N. Engl. J. Med., 351, 337-345 (2004)）、応答が認められ続けるのは患者のほんの少しにすぎない。上記の感受性または耐性のプレディクターを同定するためのこれまでの試みは、ゲノム発見アプローチ（genomic discovery approaches）を用いるよりも特定のバイオマーカーに焦点を当てられていた。加えて、ＲＮＡ、ＤＣｔおよびタンパク質ベースのマーカーは単独の研究での同じ患者集団で調べられたことは殆どなく、比較を困難にしていた。
【００１０】
ＥＧＦＲモデュレーターに対する感受性を決定するのに有用なバイオマーカーは、公開されたＰＣＴ出願、WO2004/063709, WO2005/067667, およびWO2005/094332に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
個性化された遺伝子プロファイルの開発を可能にすべく患者の薬物感受性を決定する新たな別の方法および手順が必要とされており、このような個性化された遺伝子プロファイルは患者の分子レベルでの応答に基づいて疾患および障害を治療するのに必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、１またはそれ以上の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）モデュレーターに対する患者の感受性を決定するための方法および手順を提供する。本発明はまた、癌などの疾患状態の治療を必要とする個体が、治療を投与する前に該治療に応答するか否かを決定または予測する方法であって、該治療が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターの投与を含むものである方法をも提供する。１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターは、例えば、１またはそれ以上のＥＧＦＲ特異的リガンド、１またはそれ以上の小分子ＥＧＦＲインヒビター、または１またはそれ以上のＥＧＦＲ結合性モノクローナル抗体から選ばれる化合物である。
【００１３】
一つの側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性（likelihood）を予測する方法であって、（ａ）エピレグリン（epiregulin）およびアンフィレグリン（amphiregulin）から選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の増大を示すものである方法を提供する。一つの側面において、少なくとも一つのバイオマーカーは、エピレグリンおよびアンフィレグリンを含む。さらに他の側面において、少なくとも一つのバイオマーカーは、表１から選択される少なくとも一つのさらなるバイオマーカーをさらに含む。他の側面において、生物学的試料は癌細胞を含む組織試料であり、本方法はさらに、癌細胞が突然変異Ｋ−ＲＡＳの存在を有するか否かを決定する工程を含み、ここで突然変異Ｋ−ＲＡＳの検出は癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示す。
【００１４】
生物学的試料は、例えば、癌細胞を含む組織試料であってよく、該組織は固定され、パラフィン埋設され、新鮮なもので（fresh）、または凍結乾燥される。
【００１５】
他の側面において、ＥＧＦＲモデュレーターはcetuximabであり、癌は結腸直腸癌である。
【００１６】
他の側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測する方法であって、（ａ）ＣＤ７３を含む少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示すものである方法を提供する。他の側面において、少なくとも一つのバイオマーカーは、表１から選択される少なくとも一つのさらなるバイオマーカーをさらに含む。他の側面において、本方法はさらに、癌細胞が突然変異Ｋ−ＲＡＳの存在を有するか否かを決定する工程を含み、ここで突然変異Ｋ−ＲＡＳの検出は癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示す。
【００１７】
癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するあるいは応答しないであろう蓋然性を予測するのに十分なバイオマーカーのレベルの差違は、既知の方法を用いて当業者により容易に決定することができる。バイオマーカーのレベルの増大または低下を相互に関連させて、該差違が、哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測するのに十分であるか否かを決定することができる。十分であるバイオマーカーのレベルの差違は、一つの側面において、哺乳動物が処置に対して治療的に応答するであろう蓋然性を予測するに先立って決定することができる。一つの側面において、バイオマーカーのレベルの差異は、ｍＲＮＡレベル（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイにより測定）の差違、例えば、発現のレベルの少なくとも２倍の差違、少なくとも３倍の差違、または少なくとも４倍の差違である。他の側面において、バイオマーカーのレベルの差異はＩＨＣによって決定される。他の側面において、バイオマーカーのレベルの差異は、Anova（ｔ検定）分析のｐ値が＜０.０５であることをいう。さらに他の側面において、差違はＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。
【００１８】
本明細書において、治療的な応答とは、癌の緩和または廃棄をいう。このことは、癌を罹患した個体の平均余命が増すこと、または癌の１またはそれ以上の徴候が低減または改善されることを意味する。この語は、癌様の細胞増殖または腫瘍容積の低減を包含する。哺乳動物が治療的に応答するか否かは、ＰＥＴ造影などの当該技術分野でよく知られた多くの方法によって測定することができる。
【００１９】
哺乳動物は、例えば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコ、霊長類、またはサルであってよい。
【００２０】
本発明の方法は、たとえば、インビトロの方法であってよく、その際、哺乳動物において少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定する工程は、哺乳動物から生物学的試料を採取し、ついで該生物学的試料中のバイオマーカーのレベルを測定することを含む。生物学的試料は、例えば、血清、新鮮な全血、末梢血単核細胞、凍結した全血、新鮮な血漿、凍結した血漿、尿、唾液、皮膚、毛包、骨髄または腫瘍組織のうちの少なくとも一つを含む。
【００２１】
少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、例えば、バイオマーカーのタンパク質および／またはｍＲＮＡ転写物のレベルであってよい。バイオマーカーのレベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲその他のＰＣＴに基づく方法、免疫組織化学、プロテオミクス法、または当該技術分野で知られた他の方法、またはこれらの組合せによって決定できる。
【００２２】
他の側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して治療的に応答するであろう哺乳動物を同定する方法であって、（ａ）表１から選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである方法を提供する。
【００２３】
他の側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して治療的に応答するであろう哺乳動物を同定する方法であって、（ａ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１から選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、ＥＧＦＲモデュレーターに暴露された哺乳動物で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである方法を提供する。
【００２４】
さらに他の側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを試験または予測する方法であって、（ａ）表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；（ｂ）該哺乳動物をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである方法を提供する。
【００２５】
他の側面において、本発明は、ある化合物が哺乳動物においてＥＧＦＲ活性を抑制するか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該化合物に暴露し；ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、該化合物に暴露していない哺乳動物における該バイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該バイオマーカーのレベルの差違が、該化合物が該哺乳動物においてＥＧＦＲ活性を抑制することを示すものである方法を提供する。
【００２６】
さらに他の側面において、本発明は、哺乳動物がＥＧＦＲ活性を抑制する化合物に暴露されたか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該化合物に暴露し；ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、該化合物に暴露していない哺乳動物における該バイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該バイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物がＥＧＦＲ活性を抑制する化合物に暴露されたことを示すものである方法を提供する。
【００２７】
他の側面において、本発明は、哺乳動物がＥＧＦＲ活性を抑制する化合物に応答するか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該化合物に暴露し；ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、該化合物に暴露していない哺乳動物における該バイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該バイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物がＥＧＦＲ活性を抑制する化合物に応答することを示すものである方法を提供する。
【００２８】
本明細書において「応答する」とは、哺乳動物において生物学的および細胞応答並びに臨床的応答（改善された徴候、治療効果、または有害な事象など）により応答することを包含する。
【００２９】
本発明はまた、表１のバイオマーカーから選択される単離されたバイオマーカーをも提供する。本発明のバイオマーカーは、表１および配列表にて提供されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列から選択される配列、並びにその断片および変異体を含む。
【００３０】
本発明はまた、表１のバイオマーカーから選択される２またはそれ以上のバイオマーカーを含むバイオマーカーセットをも提供する。
【００３１】
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターを含む治療に対してある患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するキットをも提供する。患者は、例えば、結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ、または頭部および首の癌などの癌または腫瘍を罹患していてよい。
【００３２】
一つの側面において、本発明のキットは、本発明の１またはそれ以上の特別のマイクロアレイを入れた適当な容器、患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに用いる１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーター、および使用の指示書を含む。キットはさらに、バイオマーカーセットの発現をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでモニターするための試薬または材料を含んでいてよい。
【００３３】
他の側面において、本発明は、表１のバイオマーカーから選択される２またはそれ以上のバイオマーカーを含むキットを提供する。
【００３４】
さらに他の側面において、本発明は、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための抗体および核酸の少なくとも一つを含むキットを提供する。一つの側面において、該キットはさらに、ＥＧＦＲ活性を抑制する化合物の投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを決定するための指示を含む。他の側面において、該指示は、（ａ）表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、（ｂ）該哺乳動物を該化合物に暴露し、（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定する工程を含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである。
【００３５】
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターによる治療に対して患者が感受性または耐性であるか否かを決定するためのスクリーニングアッセイをも提供する。
【００３６】
本発明はまた、疾患を罹患した患者の治療をモニターする方法であって、該疾患が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む方法によって治療されるものである方法をも提供する。
【００３７】
本発明はまた、分子レベルでの患者の応答に基づいて疾患および障害を治療するのに必要な個性化された遺伝子プロファイルをも提供する。
【００３８】
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに対する感受性かまたは耐性のいずれかと相関関係のある発現プロファイルを有する１またはそれ以上のバイオマーカーを含む、特別なマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイをも提供する。
【００３９】
本発明はまた、本発明の１またはそれ以上のバイオマーカーに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体をも提供する。
【００４０】
本発明は、添付の図面と関連して考察しながら発明の詳細な説明を読むとより理解されるであろう。
【００４１】
効能、薬物暴露、または臨床応答の迅速かつ利用可能な読み出し情報（readouts）を提供するバイオマーカーの同定は、薬物候補の臨床開発においてますます重要になっている。本発明の態様は、分泌タンパク質、または血漿バイオマーカー（バイオマーカーの一つのカテゴリーを表す）のレベルの変化を測定することを含む。一つの側面において、血漿試料（容易に利用可能な材料の代表である）はバイオマーカー分析のための代理組織として利用される。
【００４２】
本発明は、特定のシグナル伝達経路のモデュレーションに応答し、ＥＧＦＲモデュレーター感受性または耐性と相関関係をも有するバイオマーカーを提供する。これらバイオマーカーは、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに対する応答を予測するのに用いることができる。一つの側面において、本発明のバイオマーカーは、表１および配列表にて提供するバイオマーカーであり、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両配列を含む。本発明はまた、表１にて提供するポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列をも包含する。
【００４３】
表１：バイオマーカー
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
【表６】
【００４９】
【表７】
【００５０】
【表８】
【００５１】
【表９】
【００５２】
【表１０】
【００５３】
【表１１】
【００５４】
【表１２】
【００５５】
【表１３】
【００５６】
【表１４】
【００５７】
【表１５】
【００５８】
【表１６】
【００５９】
【表１７】
【００６０】
【表１８】
【００６１】
【表１９】
【００６２】
【表２０】
【００６３】
【表２１】
【００６４】
【表２２】
【００６５】
【表２３】
【００６６】
【表２４】
【００６７】
【表２５】
【００６８】
【表２６】
【００６９】
【表２７】
【００７０】
表１にて提供するバイオマーカーは、配列番号１〜１２８のヌクレオチド配列および配列番号１２９〜２５６のアミノ酸配列を含み、本明細書において単遺伝子表記（Unigene Title）に関して合計１２８のバイオマーカーとして言及される。
【００７１】
これらバイオマーカーは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性に依存し且つ細胞によって示されるＥＧＦＲモデュレーター感受性と高度の相関関係をも有する細胞での発現レベルを有する。バイオマーカーは、ＥＧＦＲモデュレーター、好ましくはＥＧＦＲキナーゼ機能または活性の直接的または間接的な抑制または拮抗作用によりＥＧＦＲキナーゼ活性に影響を及ぼす生物学的分子、小分子などに対する応答の蓋然性を予測するための有用な分子ツールとして働く。
【００７２】
野生型Ｋ−ＲＡＳおよび突然変異Ｋ−ＲＡＳ
本明細書において、野生型Ｋ−ＲａｓはＫ−Ｒａｓ変異体ａおよび変異体ｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列から選択することができる。野生型Ｋ−Ｒａｓ変異体ａは５４３６ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有し（ジーンバンクアクセッション番号NM_033360.2）、１８９アミノ酸であるタンパク質をコードする（ジーンバンクアクセッション番号NP_203524.1）。野生型Ｋ−Ｒａｓ変異体ｂは５３１２ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有し（ジーンバンクアクセッション番号NM_004985.3）、１８８アミノ酸であるタンパク質をコードする（ジーンバンクアクセッション番号NP_004976.2）。
【００７３】
Ｋ−Ｒａｓの変異形は、少なくとも１の部位、好ましくは野生型Ｋ−Ｒａｓとは異なるアミノ酸をコードする少なくとも１のヌクレオチド部位にて、野生型Ｋ−Ｒａｓとは異なるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。一つの側面において、Ｋ−Ｒａｓの変異形はエクソン２に少なくとも１の突然変異を含む。他の側面において、Ｋ−ＲＡＳの変異形はエクソン２中の以下の突然変異（塩基の変化（アミノ酸の変化））の少なくとも１を含む：200G>A (V7M); 216G>C (G12A); 215G>T (G12C); 216G>A (G12D); 215G>C (G12R); 215G>A (G12S); 216G>T (G12V); 218G>T (G13C); 219G>A (G13D)。
【００７４】
Ｋ−Ｒａｓ突然変異を検出する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、ＰＣＴ公開公報WO2005/118876に記載されている方法が挙げられる。
【００７５】
ＥＧＦＲモデュレーター
本明細書において「ＥＧＦＲモデュレーター」とは、ＥＧＦＲ活性またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を直接的または間接的にモデュレートする生物学的分子または小分子である化合物または薬物を意味するものである。それゆえ、本明細書において化合物または薬物は、小分子および生物学的分子の両者を包含するものである。直接的または間接的なモデュレーションとしては、ＥＧＦＲ活性またはＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化または抑制が挙げられる。一つの側面において、抑制とは、ＥＧＦＲのＥＧＦＲリガンド、たとえばＥＧＦへの結合の抑制をいう。他の側面において、抑制とは、ＥＧＦＲのキナーゼ活性の抑制をいう。
【００７６】
ＥＧＦＲモデュレーターとしては、たとえば、ＥＧＦＲ特異的リガンド、小分子ＥＧＦＲインヒビター、およびＥＧＦＲモノクローナル抗体が挙げられる。一つの側面において、ＥＧＦＲモデュレーターは、ＥＧＦＲ活性を抑制し、および／またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を抑制する。他の側面において、ＥＧＦＲモデュレーターは、ＥＧＦＲ活性を抑制し、および／またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を抑制するＥＧＦＲ抗体である。
【００７７】
ＥＧＦＲモデュレーターは、生物学的分子または小分子を含む。生物学的分子としては、全ての脂質および単糖のポリマー、アミノ酸、および分子量が４５０を超えるヌクレオチドが挙げられる。それゆえ、生物学的分子としては、たとえば、オリゴ糖および多糖；オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質；およびオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとしては、たとえば、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。
【００７８】
生物学的分子はさらに、上記分子のいずれかの誘導体を含む。たとえば、生物学的分子の誘導体としては、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質の脂質およびグリコシル化誘導体が挙げられる。
【００７９】
生物学的分子の誘導体はさらに、オリゴ糖および多糖の脂質誘導体、たとえば、リポ多糖を含む。最も典型的には、生物学的分子は抗体、または抗体の機能的等価物である。抗体の機能的等価物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有し、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を抑制する。そのような機能的等価物としては、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、および一本鎖抗体、並びにそのフラグメントが挙げられる。
【００８０】
抗体の機能的等価物はまた、該抗体の可変領域または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをも含む。他の配列と実質的に同じであるが、１またはそれ以上の置換、付加、および／または欠失により他の配列と異なっているアミノ酸配列は等価な配列であると考えられる。好ましくは、ある配列中のアミノ酸残基の数の５０％未満、さらに好ましくは２５％未満、さらに一層好ましくは１０％未満がタンパク質から置換、タンパク質に付加、またはタンパク質から欠失している。
【００８１】
抗体の機能的等価物は、好ましくはキメラ抗体またはヒト化抗体である。キメラ抗体は、非ヒト抗体の可変領域およびヒト抗体の定常領域を含む。ヒト化抗体は、非ヒト抗体の超可変領域（ＣＤＲ）を含む。ヒト化抗体の超可変領域以外の可変領域、たとえばフレームワーク可変領域、および定常領域は、ヒト抗体からのものである。
【００８２】
非ヒト抗体の適当な可変領域および超可変領域は、モノクローナル抗体の作成されたいずれかの非ヒト哺乳動物によって産生された抗体からのものであってよい。ヒト以外の哺乳動物の適当な例としては、たとえば、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、または霊長類が挙げられる。
【００８３】
機能的等価物はさらに、全抗体の結合特性と同じかまたは匹敵する結合特性を有する抗体のフラグメントを含む。抗体の適当なフラグメントとしては、ＥＧＦＲチロシンキナーゼに特異的且つ充分な親和性でもって結合してそのような受容体を発現する細胞の増殖を抑制する超可変（すなわち、相補性決定）領域の充分な部分を含むあらゆるフラグメントが挙げられる。
【００８４】
そのようなフラグメントは、たとえば、ＦａｂフラグメントまたはＦ(ａｂ')２フラグメントの一方または両者を含んでいてよい。抗体フラグメントは全抗体の６つの全ての相補性決定領域を含んでいるのが好ましいが、そのような領域を全てよりも少なく、たとえば３つ、４つ、または５つのＣＤＲを含む機能的フラグメントも包含される。
【００８５】
一つの側面において、フラグメントは一本鎖抗体、またはＦｖフラグメントである。一本鎖抗体は、相互連結リンカーによりまたは該リンカーなしで、抗体の軽鎖の可変領域に連結した重鎖の可変領域を少なくとも含むポリペプチドである。それゆえ、Ｆｖフラグメントは全抗体結合部位を含む。これら鎖は細菌または真核細胞で産生できる。
【００８６】
抗体および機能的等価物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどの免疫グロブリンのいずれのクラス、およびそのサブクラスの成員であってもよい。一つの側面において、抗体はＩｇＧ１サブクラスの成員である。機能的等価物はまた、これらクラスおよびサブクラスのいずれかの組合せの等価物であってもよい。
【００８７】
一つの側面において、ＥＧＦＲ抗体は、米国特許第4,943,533号に記載されたマウス抗体２２５に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および一本鎖抗体から選択することができる。
【００８８】
他の側面において、ＥＧＦＲ抗体はcetuximab（IMC-C225）であり、これはキメラ（ヒト／マウス）ＩｇＧモノクローナル抗体であってERBITUXの商標名でも知られているものである。cetuximabのＦａｂはcetuximabのＦａｂフラグメント、すなわち、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１重鎖およびカッパ軽鎖定常ドメインとともにマウス抗体Ｍ２２５（米国出願第2004/0006212号；参照のため本明細書に引用する）の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。cetuximabは、３つのすべてのＩｇＧ１重鎖定常ドメインを含む。
【００８９】
他の側面において、ＥＧＦＲ抗体は、米国特許第6,235,883号、米国特許第5,558,864号、および米国特許第5,891,996号に記載の抗体から選択することができる。ＥＧＦＲ抗体はまた、例えば、AGX-EGF（Amgen Inc.）（panitumumabとしても知られる）であってよく、これは完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。ABX-EGF（クローンE7.6.3としても知られる）の配列および特徴付けは米国特許第6,235,883号の第28欄62行〜第29欄36行および図29-34（参照のため本明細書に引用する）に記載されている。ＥＧＦＲ抗体はまた、例えば、EMD72000（Merck KGaA）であってよく、これはマウスＥＧＦＲ抗体EMD 55900のヒト化抗体である。ＥＧＦＲ抗体はまた、例えば、h-R3（TheraCIM）（ヒト化ＥＧＦＲモノクローナル抗体である）；Y10（ヒトEGFRvIII変異体のマウスホモログに対して産生されたマウスモノクローナル抗体）；またはMDX-447（Medarex Inc.）であってよい。
【００９０】
上記で検討した生物学的分子に加え、本発明において有用なＥＧＦＲモデュレーターはまた小分子であってよい。生物学的分子ではないあらゆる分子は、本明細書において小分子とされる。小分子の若干の例としては、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩、糖、アミノ酸、およびヌクレオチドが挙げられる。小分子はさらに、分子量が４５０を超えていないこと以外では生物学的分子であると考えられる分子を含む。それゆえ、小分子は、分子量が４５０またはそれ以下である脂質、オリゴ糖、オリゴペプチド、およびオリゴヌクレオチドおよびその誘導体であってよい。
【００９１】
小分子はいかなる分子量を有していてもよいことが強調される。小分子は典型的に４５０未満の分子量を有するが故に小分子と呼ばれるにすぎない。小分子は天然に見出される化合物並びに合成の化合物を含む。一つの態様において、ＥＧＦＲモデュレーターはＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制する小分子である。他の態様において、ＥＧＦＲモデュレーターはＥＧＦＲを発現する難治性腫瘍細胞の増殖を抑制する小分子である。
【００９２】
多数の小分子がＥＧＦＲを抑制するのに有用であると記載されている。
【００９３】
小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの一つの例はIRESSA（ZD1939）であり、これはＥＧＦＲを抑制するＡＴＰミメチックとして機能するキノザリン誘導体である。米国特許第5,616,582号；WO96/33980、第４頁を参照。小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの他の例はTARCEVA（OSI-774）であり、これは4-(置換フェニルアミノ)キノザリン誘導体［6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)-キノザリン-4-イル]-(3-エチニル-l-フェニル)アミン塩酸塩］ＥＧＦＲインヒビターである。WO96/30347（Pfizer Inc.）の例えば第２頁１２行〜第４頁３４行および第１９頁１４〜１７行を参照。TARCEVAは、ＥＧＦＲのリン酸化およびその下流のPI3/AktおよびMAP（マイトジェン活性化プロテイン）キナーゼシグナル伝達経路を抑制してｐ２７媒体された細胞周期の停止（arrest）という結果となることによって機能する。ASCOの第３７回年次会（サンフランシスコ、カリフォルニア、２００１年５月１２〜１５日）に提出されたHidalgoら、要約281を参照。
【００９４】
他の小分子もまたＥＧＦＲを抑制することが報告されており、その多くはＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインに特異的であると考えられている。そのような小分子の幾つかの例が、WO91/116051, WO96/30347, WO96/33980, WO97/27199, WO97/30034, WO97/42187, WO97/49688, WO98/33798, WO00/18761, およびWO00/31048に記載されている。具体的な小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、C1-1033（Pfizer Inc.）（これは、チロシンキナーゼ、とりわけＥＧＦＲのキノザリン（N-[4-(3-クロロ-4-フルオロ-フェニルアミノ)-7-(3-モルホリン-4-イル-プロポキシ)-キナゾリン-6-イル]-アクリルアミド）インヒビターであり、WO00/31048の第8頁22-6行に記載されている）；PKI166（Novartis）（これは、ＥＧＦＲのピロロピリミジンインヒビターであり、WO97/27199の第10-12頁に記載されている）；GW2016（GlaxoSmitbKline）（これは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のインヒビターである）；EKB569（Wyeth）（これは、インビトロおよびインビボでＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍の増殖を抑制することが報告されている）；AG-1478（Tryphostin）（これは、ＥＧＦＲおよびerbB-2の両者からのシグナル伝達を抑制するキナゾリン小分子である）；AG-1478（Sugen）（これは、プロテインキナーゼＣＫ２をも抑制する２基質（bisubstrate）インヒビターである）；PD153035（Parke-Davis）（これは、ＥＧＦＲキナーゼ活性および腫瘍増殖を抑制し、培養細胞においてアポトーシスを誘導し、細胞障害性化学療法剤の細胞障害性を促進することが報告されている）；SPM-924（Schwarz Pharma）（これは、前立腺癌の治療を標的とするチロシンキナーゼインヒビターである）；CP-546,989（OSI Pharmaceuticals）（これは、報告によれば、固形癌の治療のための脈管形成のインヒビターである）；ADL-681（これは、癌治療を標的とするＥＧＦＲキナーゼインヒビターである）；PD158780（これは、マウスでA4431異種移植の腫瘍増殖率を抑制することが報告されているピリドピリミジンである）；CP-358,774（これは、マウスにおいてHN5異種移植の自己リン酸化を抑制することが報告されているキナゾリンである）；ZD1839（これは、外陰部、NSCLC、前立腺、卵巣、および直腸結腸の癌を含むマウス異種移植モデルにおける抗腫瘍作用を有することが報告されているキナゾリンである）；CGP59326A（これは、マウスにおいてＥＧＦＲ陽性の異種移植の増殖を抑制することが報告されているピロロピリミジンである）；PD165557（Pfizer）；CGP54211およびCGP53353（Novartis）（これは、ジアニロフタルイミド（dianilnophthalimides）である）が挙げられる。天然由来のＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターとしては、genistein、herbimycin A、quercetin,およびerbstatinが挙げられる。
【００９５】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、米国特許第5,646,153号に記載されている化合物などの三環化合物；米国特許第5,616,582号に記載されている誘導体などのキナゾリン誘導体；および米国特許第5,196,446号に記載されている化合物などのインドール化合物である。
【００９６】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、米国特許第5,656,655号に記載されている化合物のようなスチリル置換へテロアリール化合物である。このへテロアリール基は１または２のへテロ原子を有する単環であるかまたは１ないし約４のへテロ原子を有する二環であり、該化合物は任意に置換またはポリ置換されている。
【００９７】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、米国特許第5,646,153号に記載されているビスモノおよび／または二環アリールへテロアリール、炭素環、およびへテロ炭素環化合物である。
【００９８】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、Fryら（Science 265, 1093-1095 (1994)）の図１に示されている、ＥＧＦＲを抑制する化合物である。
【００９９】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、Osherovら、J. Biol. Chem., 25;268(15):11134-42 (1993)の特に表Ｉ、II、IIIおよびIVに記載された、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１およびＨＥＲ２を抑制するtyrphostinsである。
【０１００】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、受容体のＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、およびＦＧＦＲファミリーを抑制するPD166285として同定された化合物である。PD166285は、Panekら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 283, 1433-1444 (1997)の１４３６頁の図１に示す構造を有する6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-(4-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニルアミノ)-8-メチル-8H-ピリド(2,3-d)ピリミジン-7-オンとして同定されている。
【０１０１】
本発明において用いる有用な小分子はＥＧＦＲのインヒビターであるが、ＥＧＦＲに対して完全に特異的である必要はないことが認識されなければならない。
【０１０２】
バイオマーカーおよびバイオマーカーセット
本発明は、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ経路によるシグナル伝達が重要である疾患領域において、たとえば、癌または腫瘍において、免疫学的障害、状態または不全において、または細胞のシグナル伝達および／または細胞増殖の制御が異常または異所性である疾患状態において診断および予後の両者で価値を有する個々のバイオマーカーおよびバイオマーカーセットを含む。バイオマーカーセットは、複数のバイオマーカー、たとえば、以下の表１に示す、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに対する感受性または耐性と高度の相関関係を有する複数のバイオマーカーを含む。
【０１０３】
本発明のバイオマーカーセットは、種々の生物学的系においてまたは細胞応答について１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターの起こりそうな効果を予測または妥当に予告することを可能にする。バイオマーカーセットは、被験細胞によるＥＧＦＲモデュレーター応答のインビトロアッセイに用いてインビボでの結果を予測することができる。本発明によれば、本明細書に記載する種々のバイオマーカーおよびバイオマーカーセット、またはこれらバイオマーカーセットと他のバイオマーカーまたはマーカーとの組合せを、たとえば、癌患者が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターによる治療的介入に対してどのように応答するかを予測するのに用いることができる。
【０１０４】
細胞が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに暴露された後の細胞の感受性または耐性と相関関係を有する細胞の遺伝子発現パターンのバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、該ＥＧＦＲモデュレーターで治療する前に１またはそれ以上の腫瘍試料をスクリーニングするための有用なツールを提供する。このスクリーニングは、バイオマーカーおよびバイオマーカーセットの発現結果に基づき、腫瘍、それゆえ腫瘍を罹患した患者がＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療に応答するか否かについて、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに暴露された腫瘍試料の細胞の予測を可能にする。
【０１０５】
バイオマーカーまたはバイオマーカーセットはまた、本明細書に記載するように、ＥＧＦＲモデュレーターが関与する疾患の治療を受けている患者において疾患の治療または療法の進行をモニターするのに用いることができる。
【０１０６】
バイオマーカーはまた、疾患の治療のための療法の開発のための標的とすることができる。そのような標的は、直腸結腸癌の治療に特に応用することができる。実際、これらバイオマーカーは感受性細胞および耐性細胞において異なって発現されるので、その発現パターンはＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療に対する細胞の相対的な内生の感受性と相関関係がある。従って、耐性の細胞において高度に発現されるバイオマーカーは、ＥＧＦＲモデュレーター、とりわけＥＧＦＲインヒビターに対して耐性の腫瘍の新たな療法の開発のための標的となり得る。
【０１０７】
バイオマーカーのタンパク質および／またはｍＲＮＡは、当業者によく知られた方法を用いて決定することができる。例えば、タンパク質の定量は、ＥＬＩＳＡ、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、またはフローサイトメトリーなどの方法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、ＰＣＲ、アレイハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、インシトゥハイブリダイゼーション、ドットブロット、Taqman、またはＲＮアーゼ保護アッセイなどの方法を用いて行うことができる。
【０１０８】
マイクロアレイ
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに対する感受性かまたは耐性のいずれかと相関関係のある発現パターンを示す１またはそれ以上のバイオマーカーを含む、特別のマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイをも包含する。そのようなマイクロアレイは、腫瘍生検からの被験細胞においてバイオマーカーの発現レベルを評価し、これら被験細胞がＥＧＦＲモデュレーターに対して耐性または感受性でありそうか否かを決定するためのインビトロアッセイに用いることができる。たとえば、特別のマイクロアレイは、本明細書に記載し表１に示すバイオマーカーの全てまたはそのサブセットを用いて調製することができる。組織または器官生検からの細胞を単離し、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに暴露することができる。未処理細胞および処理細胞の両者から単離した核酸を１またはそれ以上の特別のマイクロアレイに適用した後、被験細胞の遺伝子発現パターンを決定し、マイクロアレイ上でバイオマーカーセットを作成するのに用いた細胞のコントロールパネルからのバイオマーカーパターンのものと比較することができる。試験に供した細胞からの遺伝子発現パターンの結果に基づき、該細胞が遺伝子発現の耐性または感受性プロファイルのいずれを示すかを決定することができる。ついで、組織または器官生検からの被験細胞が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに応答するか否か、および治療または療法の方針を、特別のマイクロアレイ分析の結果から収集した情報に基づいて決定または評価することができる。
【０１０９】
抗体
本発明はまた、１またはそれ以上のポリペプチドバイオマーカーに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体をも包含する。そのような抗体は様々な仕方で用いることができ、たとえばインビトロおよびインビボ両者での診断、検出、スクリーニング、および／または治療法を含めて、本発明のバイオマーカーを精製、検出、およびターゲティングするのに用いることができる。
【０１１０】
キット
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターを含む治療に対して患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するためのキットをも包含する。患者は、癌または腫瘍、たとえば直腸結腸癌を罹患していてよい。そのようなキットは、患者の生検腫瘍もしくは他の癌試料を試験するのに使用するため、たとえば患者の腫瘍または癌がＥＧＦＲモデュレーターを用いた所定の治療または療法に対して耐性であるかまたは感受性であるかを決定または予測するために臨床場面において有用であろう。該キットは、以下のものを入れた適当な容器を含む：ＥＧＦＲモデュレーター、とりわけＥＧＦＲインヒビターに対する耐性および感受性と相関関係のあるバイオマーカーを含む１またはそれ以上のマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ；患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに使用する１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーター；および使用の指示書。さらに、本発明によって包含されるキットは、本明細書においてさらに記載するように、当該技術分野で実施されている他の技術および系、たとえば、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（本明細書に記載する１またはそれ以上のバイオマーカーに基づいてデザインしたプライマーを使用する）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイ、イムノブロッティング、たとえば、ウエスタンブロッティング、またはインシトゥハイブリダイゼーションなどを用い、たとえば、本発明のバイオマーカーの発現をｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでモニターするための試薬または材料をさらに含んでいてよい。
【０１１１】
バイオマーカーおよびバイオマーカーセットの応用
バイオマーカーおよびバイオマーカーセットは種々の応用に用いることができる。バイオマーカーセットは、種々の生物学的系においていかなるＥＧＦＲモデュレーターの起こりそうな効果についての予測をも可能とすべく、表１に列記したバイオマーカーのいかなる組合せからも構築することができる。本明細書に記載する様々なバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、たとえば、疾患管理における診断または予後の指標として、ＥＧＦＲをモデュレートする化合物を用いた治療的介入に対して癌患者がどのように応答するかを予測するため、および全ＥＧＦＲ制御経路によるシグナル伝達をモデュレートする治療的介入に対して患者がどのように応答するかを予測するために用いることができる。
【０１１２】
本発明のバイオマーカーはＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ経路によるシグナル伝達が重要である疾患領域において、たとえば、免疫学において、または細胞のシグナル伝達および／または増殖の制御がきかなくなった癌または腫瘍においても診断および予後の両者において価値を有する。
【０１１３】
一つの態様において、患者の組織試料からの細胞、たとえば腫瘍または癌生検をアッセイして、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターで治療する前に１またはそれ以上のバイオマーカーの発現パターンを決定することができる。一つの態様において、腫瘍または癌は直腸結腸のものである。治療の成功または失敗は、被験組織からの細胞（被験細胞）、たとえば腫瘍または癌生検のバイオマーカーの発現パターンに基づき、１またはそれ以上のバイオマーカーのコントロールセットの発現パターンと比べて同じであるか異なるかで決定することができる。それゆえ、もしも被験細胞が、ＥＧＦＲモデュレーターに対して感受性の細胞のコントロールパネルでのバイオマーカーのものに対応するバイオマーカー発現プロファイルを示すなら、該患者の癌または腫瘍は該ＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療に良好に応答するであろうことの蓋然性が非常に高いあるいは予測される。対照的に、もしも被験細胞が、ＥＧＦＲモデュレーターに対して耐性の細胞のコントロールパネルのバイオマーカーのものに対応するバイオマーカー発現パターンを示すなら、該患者の癌または腫瘍は該ＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療には応答しないであろうことの蓋然性が非常に高いあるいは予測される。
【０１１４】
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターによって治療できる疾患を罹患した患者の治療をモニターする方法をも提供する。患者の組織試料、たとえば、腫瘍生検または腫瘍試料からの単離被験細胞をＥＧＦＲモデュレーターに暴露する前および暴露後に１またはそれ以上のバイオマーカーの発現パターンを決定することができ、その際、ＥＧＦＲモデュレーターは好ましくはＥＧＦＲインヒビターである。その結果得られた治療の前および治療後の被験細胞のバイオマーカー発現プロファイルを、ＥＧＦＲモデュレーターに対して耐性または感受性のいずれかである細胞のコントロールパネルで高度に発現されるべき本明細書に記載し示した１またはそれ以上のバイオマーカーのものと比較する。それゆえ、もしも患者の応答が１またはそれ以上のバイオマーカーの発現プロファイルの相関関係に基づいてＥＧＦＲモデュレーターによる治療に対して感受性であるなら、該患者の治療予後は良好であると認定され、治療を続行することができる。また、もしもＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療の後に被験細胞が該ＥＧＦＲモデュレーターに感受性の細胞のコントロールパネルに対応するバイオマーカー発現プロファイルに変化を示さないなら、このことは現在行っている治療を修正、変更、あるいは中止さえすべきであるとの指標となり得る。このモニタリングプロセスはＥＧＦＲモデュレーターを用いた患者の治療の成功または失敗を指摘することができ、必要に応じてまたは所望により、そのようなモニタリングプロセスを繰り返すことができる。
【０１１５】
実施例
実施例１：バイオマーカーの暫定的（Interim）分析同定
CA225-045薬動力学的試験は、難治性の転移性直腸結腸癌（mCRC）を罹患した患者でのERBITUX（cetuximab）単独療法のフェーズII無作為化予備研究（phase II randomized exploratory study）である。この試験で得られた試料からのデータの暫定的分析は、臨床試料中の前臨床的に発見されたマーカーを調べ、応答予測マーカーをデノボで同定するために行った。
【０１１６】
臨床試料
転移部位の処置前腫瘍生検から単離した４９のＲＮＡ患者試料を５つのブロックに無作為化し、U133A v2.0チップ（Affymetrix, サンタクララ、カリフォルニア）でプロファイリングした。３０／４９患者からのプロファイリングデータが、以下の基準に適合する分析に含まれていた：少なくとも２サイクルの療法の完了；応答を評価するに十分な臨床データを利用できること；生検試料中の腫瘍細胞の存在；およびチップからの良品質プロファイリングデータ。
【０１１７】
３０の患者発現プロファイルは、２４の肝臓転移および６の他の組織タイプからなっていた。３０人の患者からのBest Clinical Response情報は、４人の部分的リスポンダー（ＰＲ）、５人の安定な疾患（ＳＤ）患者および２１人の進行性疾患（ＰＤ）患者を同定した。応答の評価は、世界保健機構（ＷＨＯ）基準の修正版（Millerら、Cancer, 47: 207-214 (1981)）に従って行った。全体の応答は、標的、非標的、および新たな病変の評価に基づいて行った。部分的応答（ＰＲ）は、ベースラインのＳＰＤを基準として、標的病変の直径の積の合計（ＳＰＤ）における少なくとも５０％の低減として定義された。進行性の疾患（ＰＤ）は、治療開始または新たな病変の出現以来に記録された最小のＳＰＤを基準として、標的病変のＳＰＤにおける２５％またはそれ以上の増大として定義された。安定な疾患（ＳＤ）は、ＰＲとして認めるには十分な萎縮もなく、ＰＤとして認めるには十分な増大もないものとして定義された。
【０１１８】
遺伝子発現プロファイリング
処置前生検をＲＮＡ単離のために転移部位から得た。処置前生検からのＲＮＡの単離は、RNeasyミニキット（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア）を用いて行った。ＲＮＡの品質をAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies、ロックビル、メリーランド）を用いて28S:18SリボソームＲＮＡ比を測定することによりチェックした。全ＲＮＡの濃度を分光測光的に決定した。1μgの全ＲＮＡを用い、Affymetrix Genechip Expression Analysis Technical Manualに従ってビオチン化プローブを調製した。標的をヒトHG-U133A v2.0遺伝子チップに製造業者の指示に従ってハイブリダイズさせた。データを、MAS5.0ソフトウエアを用いて前処理した。
【０１１９】
データ分析
U133A v2.0チップ上に存在する22,215のプローブセットのうち、少なくとも２の肝臓転移組織に存在信号（present calls）を有していた17,261のプローブセットをデータ分析に含めた。データの分析は、PartekPro Pattern Recognitionソフトウエア（Partek、セントチャールズ、ミズーリ）を用いたMicrosoft ExcelまたはAnova解析で両側非均等分散（unequal variance）ｔ検定を行うことによって行った。統計解析は、17,261のプローブセットについてのシグナル強度のMAS5.0分位正規化値（quantile normalized values）を用いて行った。
【０１２０】
ｔ検定およびANOVA分析を用いたバイオマーカーの分析
第一のステップは、３０の転移腫瘍の転写プロファイルで前臨床的に同定された（図１）４２のプローブセットを調べることであった。これは、前臨床的マーカーが、ERBITUX処置の臨床的利益を受けた患者（ＰＲおよびＳＤ）と受けなかった患者（ＰＤ）とで差異的に発現されるか否かを調べるために行った。
【０１２１】
臨床的利益を受けた９人の患者と進行性の疾患を有していた２１人の患者とで両側非均等分散ｔ検定を行った。４２のうち３つのプローブセットが、９人（ＰＲ＋ＳＤ）の患者と２１人（ＰＤ）の患者とで差異的に発現される（p<0.05）。これら３つのプローブセットは、アネキシンA1（ANXA1 201012_at）、セリンプロテイナーゼインヒビタークレードB成員5（SERPINB5 204855_at）、および繊維芽細胞増殖因子受容体3（FGFR3 204379_s_at）のｍＲＮＡ発現を表している。
【０１２２】
つぎに、６４０の遺伝子の一層広範なリスト（これから４２のプローブセットを得た；図１）を調べた。６４０のプローブセットのうち６３５が17,261のプローブセット中に存在し、これらを分析に含める。これら６３５のプローブセットは、１６４の原発性未処置ＣＲＣ癌の転写プロファイルで非常に様々に発現されることが認められた。これらは結腸癌において中くらいから高レベルで発現され（アレイについての平均値の２倍、すなわち３０００発現ユニットの少なくとも１の値（at least one expression value of two times the mean value for the array, i.e., 3000 expression units））、母集団分散値（population variance value）は>0.1であった。
【０１２３】
６３５のプローブセットをCA225-045試験からの３０の転移腫瘍の転写プロファイルで調べた。６３５のプローブセットのうち３９が、９（ＰＲ＋ＳＤ）と２１（ＰＤ）とで差異的に発現される（p<0.05）ことが認められ、これらを表２に記載してある。これら３９のプローブセットのうち１９はERBITUXに対する耐性マーカーであり、これらのうち２０はERBITUXに対する感受性マーカーである（図２）。
【０１２４】
表２：ERBITUXに対する応答予測のための３９のマーカー
【表２８】
【０１２５】
【表２９】
【０１２６】
最低のｐ値に基づく上位３つのマーカーは、エピレグリン（EREG, 205767_at）、アネキシンA1（ANXA1 201012_at）、およびアンフィレグリン（AREG, 205239_at）であった。興味深いことに、エピレグリンおよびアンフィレグリンはＥＧＦＲのリガンドである。これらの個々のｍＲＮＡ発現プロファイルを調べると、これらはERBITUX処置の臨床的利益を受けた患者において一層高度に発現されているようであることが示された（図３Ａおよび図３Ｂ）。このことは、高レベルのエピレグリンおよびアンフィレグリンを有する患者は、これら２つのリガンドによって駆動されるＥＧＦＲシグナル伝達経路を特に好む（addicted）腫瘍を有することを示唆している。
【０１２７】
ＥＧＦＲの他の知られたリガンドである上皮増殖因子（EGF, 206254_at）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（TGFα, 205016_at）、betacellulin（BTC, 207326_at）、およびヘパリン結合性EGF（HB-EGF, 203821_at）の発現レベルもまた調べた。これらの発現レベルはERBITUXに対する応答との相関関係を示さなかった。
【０１２８】
３９のバイオマーカーの間の生物学的関係の決定
Ingenuity Pathway Analysisウエブベースのアプリケーション（Ingenuity Systems Inc.、マウンテンビュー、カリフォルニア）を用いて表２の３９のバイオマーカー間の生物学的関係を試験した。このアプリケーションは、タンパク質、遺伝子、複合体、細胞、組織、医薬、および疾患の間で個々にモデル化した何百万もの関係からなるキュレーテッド（curated）データベースであるIngenuity Knowledge Baseを使用する。３９の遺伝子をPathway Analysisアプリケーションにインプットした。Ingenuity Knowledge Baseは３９の遺伝子のうち２５についての情報を有していた。注目すべきことには、２５の「ネットワークに好適の（network eligible）」遺伝子のうち、１７の遺伝子がＥＧＦＲネットワークにマッピングされ（図４；１７の遺伝子に陰影を付してある）、腫瘍におけるＥＧＦＲシグナル伝達状態とERBITUXに対する応答との間に強い関連性のあることを示していた。これら３９の遺伝子の分析からは他のネットワークは浮上しなかった。これら１７の遺伝子のうち、DUSP6はERK/MAPKシグナル伝達経路の成員であり、SFNはPI3K/AKTシグナル伝達経路の成員であり、両者はＥＧＦＲシグナル伝達の下流にある２つの重要な経路である。
【０１２９】
多変量解析：
ｔ検定およびANOVA解析を用いて個々のバイオマーカーがＰＲ／ＳＤ患者をＰＤ患者から分離する能力を評価した。多変量判別分析を用い、患者応答に対する３９のマーカーの予測検出力（prediction power）を評価し、ERBITUX治療に対する応答の最良のプレディクターである変量／バイオマーカーのセットを同定した。
【０１３０】
SAS判別関数分析（SAS Scientific Discovery Solutions、リリース（release）8.02, SAS Institute Inc.、ケアリー、ノースカロライナ）を３９のマーカーのデータセットに適用した。判別関数分析を、２ステッププロセスに分けた：（１）判別関数のセットの有意さを試験する；および（２）これら関数を用いて試料対象物を対応応答グループに分類する。第一のステップは、順変数選択法（forward variable selection method）を用いたSAS「段階的（stepwise）」手順により行った。導かれた判別関数を、所定の試料の分類のため、「判別（discrim）」手順と呼ばれる第二のSAS手順に進めた。
【０１３１】
試料サイズが３０人の患者と小さい場合は、試料を別個の練習および試験データセット（training and test data sets）に区分けはしなかった。その代わり、単一のデータセットを用い、同定したバイオマーカープレディクターの予測検出力をleave-one-out cross-validation法を適用して試験した。SAS cross-validationプロトコール（これはleave-one-out cross-validation法をSASプログラムで実行するものであった）を開発し、このデータセットで行って判別関数モデルを構築するのに用いることのできるプレディクターの数を定めた。この方法は、単一バイオマーカーモデルと複バイオマーカーモデル（１５までのバイオマーカー）との比較を可能にした（図５）。単一遺伝子プレディクターモデルは、ＡＵＣ適用範囲（Receiver Operating Characteristic（ＲＯＣ）曲線下の面積：感受性と特異性との間の兼ね合い（tradeoff）を示す）により測定して0.7037の予測検出力を有することがわかった。１の面積は完全に正確な予測を表す。モデルに含まれるプレディクターの数が３つのバイオマーカーまで増えると、予測検出力は0.9まで増大する。モデルに含まれるプレディクターの数が３を超えると、予測検出力が低減する傾向がある。これら結果は、最良の予測検出力が３９のバイオマーカーからの３のバイオマーカーを用いた判別関数モデルにより達成されることを示している。
【０１３２】
３９のバイオマーカーの相関：
Ingenuity Pathway Analysisは、同定した３９のバイオマーカーのうち少なくとも１７が単一の相互作用ネットワークに属することを示唆した。SAS「corr」手順を用いた相関分析を適用して、判別分析から同定した遺伝子の相関関係を調べた。表３は、SAS手順によって選択した上位プレディクターの幾つかの相関関係マトリックスの例を示す。遺伝子の幾つかは、非常に高い相関係数を示し、これら遺伝子が高い相関関係にあることを示唆した。例えば、205767_at（ＥＲＥＧ）と205239_at（ＡＲＥＧ）、または205767_at（ＥＲＥＧ）と218807_at（ＶＡＶ３）、または206754_s_at（ＣＹＰ２Ｂ６）と209260_at（ＳＦＮ）は、高い相関関係にあることがわかった。これら相関関係の高い遺伝子は、臨床的利益を受けた患者のグループと受けなかった患者のグループとの間の変動の一定の比率を説明するのに相互に交換することができた。これら結果は、Ingenuity Pathway Analysisおよび文献によって解明された可能な生物学的メカニズムとSAS手順によって決定された統計的な予測とが優れて一致することを示している。
【０１３３】
表３：判別分析の上位変数として同定された７つの最も高頻度のプローブセットに対するピアソン相関係数
【表３０】
【０１３４】
最良の予測モデル：
最良の予測モデルを、SAS段階手順を用いて決定した。205767_at（ＥＲＥＧ）が常に最初に選び出された。このことは、ＥＧＦＲリガンドであるエピレグリンの発現がＰＲ／ＳＤ患者のグループとＰＤ患者のグループとの間の変動の殆どを説明することができることを示唆している。第二のプレディクターは、第一の変量関数（プレディクター）からは説明されない変数の最大の集団を選び出すのに役立つ、等等。最良のSAS選択モデルの誤分類率（misclassification rates）は以下のとおりである：
【０１３５】
【０１３６】
バイオマーカーをまたその生物学的情報、機能的情報および同時制御（co-regulation）情報に基づいても選択し、得られた予測関数を用い、SAS「discrim」手順を使用して３０の試料のデータセットを分類した。このアプローチを用い、バイオマーカー変数の幾つかの最適の組合せおよび対応する誤分類率を同定した。例えば、以下のようである：
【０１３７】
【０１３８】
実施例２：暫定的分析後のバイオマーカーの同定
上記のように、CA225-045薬動力学的試験は、難治性の転移性直腸結腸癌（mCRC）を罹患した患者でのERBITUX（cetuximab）単独療法のフェーズII無作為化予備研究である。この試験には１１１人の患者が登録された。治療の最初の３週について標準cetuximab投与処方を続け、その後、患者は＞グレード２の皮膚発疹のないのを条件として各３週毎に400mg/m2の最大投与量まで投与量を段階的に拡大していく資格があった。処置前フェーズの間、全ての患者は１８ゲージの針で単一の転移病変を３回通過させることを含む腫瘍生検手順を受けた。２つの前処置コア（core）針生検をRNALaterの単一チューブに室温にて貯蔵し、一つのコア針生検をその後の分析のためホルマリン固定し、パラフィン埋設した。全ての患者はまた前処置採血をも受けた。全ての試料は、適当なインフォームドコンセントおよびＩＲＢ承認を受けた患者から得た。
【０１３９】
腫瘍応答は、改変世界保健機構基準（Millerら、Cancer, 47, 207-214 (1981)）に従い、９週毎（治療の１サイクル）に評価した。全体の応答は、標的、非標的、および新たな病変の評価に基づいて行った。この分析のため、完全な応答（ＣＲ）または部分的応答（ＰＲ）または安定な疾患（ＳＤ）を経験した患者は疾患対照群として分類し；進行性の疾患（ＰＤ）および選択決定不能（ＵＴＤ）患者は非リスポンダーとして分類した。分析の非リスポンダー群に含まれていたＵＴＤ患者は、応答の評価の前に死亡した患者であった。他の全てのＵＴＤ患者は分析から除外された。
【０１４０】
ＲＮＡおよびＤＮＡ抽出：
各患者の腫瘍試料のため、ＲＮＡおよびＤＮＡを、生検手順の日から７日以内にRNALaterの単一のチューブで室温にて得た２つの前処置コア針生検から単離した。ＲＮＡの単離は、RNeasyミニキット（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア）を用いて行った。ＲＮＡの品質をAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies、ロックビル、メリーランド）を用いて28S:18SリボソームＲＮＡ比を測定することによりチェックした。ＤＮＡの単離は、DNeasyミニキット（Qiagen）を用い、ＲＮＡ単離手順の際に回収したフロースルーから行った。ＲＮＡおよびＤＮＡの濃度を分光測光的に決定した。
【０１４１】
遺伝子発現プロファイリングおよび統計的解析：
十分なＲＮＡが利用できる各試料について、1μgの全ＲＮＡを用い、Affymetrix GeneChip Expression Analysis Technical Manualに従ってビオチン化プローブを調製した。標的をヒトHG-U133A v2.0遺伝子チップに製造業者の指示に従ってハイブリダイズさせた。データを、MAS5.0ソフトウエア（Affymetrix, サンタクララ、カリフォルニア）を用いて前処理し、統計解析をシグナル強度の分位正規化値を用いて行った。単変量解析を両側非均等分散ｔ検定を用いて行った。多変量解析のため、試料を練習セットと試験セットとに50-50に無作為に区分けした。上位候補プレディクターをｔ検定を用いて練習セットから選択した。このつぎに段階的判別分析（v8.2, SAS、ケアリー、ノースカロライナ）を用いたモデル構築を行った。１０倍cross validationを用いてクラス予測を評価した。練習セットから開発したモデルを試験セットを用いて評価した。
【０１４２】
臨床研究からのＲＮＡのプロファイリングに加えて、１６４の原発性結腸直腸癌の発現データベース（Banerjeaら、Mol. Cancer, 3, 21 (2004)）を調べて潜在的な予測マーカーを同定した。ついで、上記結果に記載したフィルタリングステップを経た６４０のプローブセットからのデータを、クラスターを用いた教師なし平均連結階層的クラスタリングに供し、その結果をTREEVIEWを用いて示した。
【０１４３】
遺伝子発現分析のためのＲＴ−ｑＰＣＲ：
ＲＮＡが利用できる各試料について、約100ngのＲＮＡをMultiScribe Reverse Transcriptase（TaqMan Reverse Transcription Reagents、Applied Biosystems Inc. (ABI)、フォスターシティー、カリフォルニア）を用いたランダムプライミング法により、製造業者の指示に従ってｃＤＮＡに変換した。得られたｃＤＮＡを、アンフィレグリン遺伝子（Hs00155832_m1）およびエピレグリン遺伝子（Hs00154995_m1）に対して向けられたABI Assay-on-Demandプライマー／プローブセットを用い、ABI 7900HT Sequence Detection Systemで測定した。相対的な発現レベルをΔＣｔ法（２回の反応の平均値を、内部標準として用いたGAPDH（Hs001266705_g1）と比較した）を用いて計算した。この実験デザインでは、低ΔＣｔは高発現レベルに対応する。
【０１４４】
ヌクレオチド配列分析：
ＥＧＦＲ、Ｋ−ＲＡＳ、およびＢＲＡＦの突然変異分析を、腫瘍試料から単離した利用できるゲノムＤＮＡを用いて行った。ＥＧＦＲエクソン１８−２１（ＴＫドメインをコードする）に使用したプライマーは以前に公開されている（Lynchら、N. Engl. J. Med., 350, 2129-2139 (2004)）。Ｋ−ＲＡＳのエクソン２およびＢＲＡＦのエクソン１５の評価に用いたプライマーは以下のとおりであった：
Ｋ−ＲＡＳ F 5'-TAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3'（配列番号257）および
Ｋ−ＲＡＳ R 5'-TGGTCCTGCACCAGTAA TATGC-3'（配列番号258）；
ＢＲＡＦ F 5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3'（配列番号259）および
ＢＲＡＦ R 5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'（配列番号260）。
ＰＣＲを以前に記載された条件を用いて行った（Chenら、Hum. Mutat., 27, 427-435 (2006)）。ＰＣＲ断片をQIAquick PCR Purification Kit（Qiagen）で清浄にし、ABI 3100A Capillary Genetic Analyzer（Applied Biosystems Inc.）でシークエンシングし、ついでへテロ接合性突然変異の存否についてセンスおよびアンチセンスの両方向で分析した。ＤＮＡ配列の分析を、SEQUENCHER v4.2（Gene Codes、アンアーバー、ミシガン）を用い、ついで２人の独立した観察者による各電気泳動図の視覚分析により行った。評価した各エクソンには適当な正の対照および負の対照が含まれていた。突然変異分析は、腫瘍応答を含む臨床結果の知見なしに行った。
【０１４５】
結果
患者の特徴および臨床結果：
本研究の主たる目的は、ＣＲＣにおけるcetuximab療法に対する応答予測マーカーを同定することであった。評価可能なＲＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／または血漿試料は１１１人の患者からの１０３人の患者について利用できた。これら１０３人の患者についての目的とする応答決定は以下のとおりであった：１人の完全な応答（ＣＲ）、６人の部分的な応答（ＰＲ）、２８人の安定な疾患（ＳＤ）、５６人の進行性の疾患（ＰＤ）、および最初のＸ線撮影の前に死去し、それゆえ決定できなかった１２人の患者（ＵＴＤ）。患者の３４％は応答するかまたは疾患が安定していたのに対し、残りの６６％は非リスポンダーとして分類された。
【０１４６】
腫瘍由来ＲＮＡのゲノム分析：
疾患制御グループと非リスポンダーグループとの間で差異的に発現される遺伝子を同定するため、９５の前処置生検から単離したＲＮＡについて遺伝子発現プロファイリングを行った。生検の７０％は肝臓の転移組織から採取したものであり、生検の３０％は非肝臓組織部位から採取したものであった。９５の試料のうち９１から＞500ngのＲＮＡが得られ、１０のブロックに無作為化し、U133A v2.0チップ（Affymetrix）でプロファイリングした。８７人の患者から高品質転写プロファイリングデータが得られた。７人の患者は、最初の評価の前に本研究を辞退したか、過敏症となったか、または同意を取り下げたかのいずれかの理由によりさらなる分析から排除した。残りの８０人の患者について最良の臨床応答評価を用いて最終データ分析を行い、これら患者からの発現プロファイルを統計解析に含めた。これら患者は、１人のＣＲ、５人のＰＲ、１９人のＳＤ、４３人のＰＤ、および１２人のＵＴＤを含んでいた。
【０１４７】
全部で22,215のプローブセットから転写データをフィルタリングすることにより、１６４の原発性結腸直腸癌の独立のセットにおいて様々に発現した遺伝子の最初の候補セットを同定した。このフィルタリングから、結腸癌において中くらいから高レベルで発現され（アレイについての平均値の２倍すなわち３０００発現ユニットの少なくとも１の発現値）、母集団分散値は＞0.1であった。これら６４０のプローブセットはＣＲＣ腫瘍の母集団にわたって非常に動的な範囲の発現を有し、患者選択に有用なマーカーを与えそうなことが提案された。１６４の原発性結腸癌にわたる６４０のプローブセットの教師なし階層的クラスタリングは、cetuximabへの応答を予測できる生物学的に興味のもたれる遺伝子が結腸直腸癌のサブセットにおいて優先的に発現されることを示した（図６）。図６において、１６４の腫瘍を３つの主要なクラスに分けた（クラス１、２および３）。６４０のプローブセットを５つのクラスター（Ａ〜Ｅとして識別した）に分けた。クラスターＡはＣＥＡＣＡＭ６およびＣＤ２４などの癌抗原を含むが、ＥＧＦＲリガンドであるＥＲＥＧおよびＡＲＥＧをも含む。クラスターＡはクラス１ａで最も高度に発現され、１６４の結腸直腸腫瘍試料の約２５％を占めていた。
【０１４８】
22,215のプローブセットのうち、肝臓転移患者試料の少なくとも１０％で発現することの認められた17,137のプローブセットについてデータ分析を行った。以前に同定した６４０のプローブセットのうち６２９が17,137のプローブセットのリストに存在していた。その遺伝子発現プロファイルを８０人の患者からのデータで調べ、応答評価と相関させた。表４に示すように、６２９のプローブセットのうち１２１が疾患制御を有する２５人の患者と５５人の非リスポンダーとの間で差異的に発現された（p＜0.05；疾患グループ（ＣＲ、ＰＲ、ＳＤ）と非リスポンダーとのｔ検定）。
【０１４９】
表４：疾患制御を有する２５人の患者と５５人の非リスポンダーとの間で差異的に発現されたプローブセット、p＜0.05
【表３１】
【０１５０】
【表３２】
【０１５１】
【表３３】
【０１５２】
【表３４】
【０１５３】
【表３５】
【０１５４】
【表３６】
【０１５５】
【表３７】
【０１５６】
【表３８】
【０１５７】
最低のｐ値に基づく上位３つのマーカーは、５'ヌクレオチダーゼecto（CD73, 203939_at）、エピレグリン（EREG, 205767_at）およびアンフィレグリン（AREG, 205239_at）であった。ＣＤ７３は、結腸癌細胞株および膵臓癌において予後的価値のあるプリン代謝酵素である（Erogluら、Med. Oncol., 17, 319-324 (2000); Giovannettiら、Cancer Res., 66, 3928-3935 (2006)）。そのｍＲＮＡプロファイルを調べると、それが非リスポンダーグループで一層高度に発現されることが示された。エピレグリンおよびアンフィレグリンはＥＧＦＲのリガンドである（SinghおよびHarris, Cell Signal, 17, 1183-1193 (2005)）。それらの個々のｍＲＮＡ発現プロファイルを調べると、それらは疾患制御グループ中の患者において一層高度に発現されることが示された（図７Ａおよび図７Ｂ）。図７Ａおよび図７Ｂは、ＥＧＦＲリガンドであるエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡレベルを提供する。エピレグリン（EREG, 205767_at）およびアンフィレグリン（AREG, 205239_at）のAffymetrix ｍＲＮＡレベルをｙ軸にプロットしてある。疾患制御グループ（ＣＲ、ＰＲおよびＳＤ）と非リスポンダーグループとの間で遺伝子発現レベルに統計的に有意の差がある（ＥＲＥＧ p=1.474e-05、ＡＲＥＧ p=2.489e-05）。この結果は、高レベルのエピレグリンおよびアンフィレグリンを有する患者は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を特に好む腫瘍を有すること、それゆえcetuximabでの治療に対して疾患制御を最も経験しやすいことを示唆している。
【０１５８】
上記遺伝子フィルタリングアプローチに加えて、デノボ分析を同じ８０人の患者の転写プロファイルに対して行った。両側非均等分散ｔ検定を17,137の全てのプローブセットに対して行った。上位１０の遺伝子を表５に示す。
【０１５９】
表５：デノボ分析からの上位１０の遺伝子
【表３９】
【０１６０】
最低のｐ値に基づいて上記の上位１０の遺伝子を調べると、再びＥＲＥＧおよびＡＲＥＧが上位の感受性マーカーであることがわかった。ＣＤ７３、二重特異性ホスファターゼ４（DUSP4, 204015_s_atおよび204014_at）、プレクストリン相同様ドメインＡ１（PHLDA1, 217999_s_at）は、上位の耐性マーカーであることがわかった。ＥＧＦＲの他の知られたリガンドである上皮増殖因子（EGF, 206254_at）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（TGFα, 205016_at）、betacellulin（BTC, 207326_at）およびヘパリン結合性EGF（HB-EGF, 203821_at）の発現レベルもまた調べた。これらの発現レベルはcetuximabに対する応答との相関関係を示さなかった。ＥＧＦＲ（201983_s_at）ｍＲＮＡレベルとcetuximabに対する応答との間に相関関係が認められなかったことも注目するに値した。これら結果は、この臨床研究から集めた転写プロファイリングデータのみを用いたデノボ分析が候補マーカーＡＲＥＧおよびＡＲＥＧを見出し得たことを示唆している。しかしながら、複数の試験結果の比較を仮定すれば（given the issue of multiple test comparisons）、上記の独立のフィルタリングアプローチを用いたＥＲＥＧおよびＡＲＥＧの同定は、それらがcetuximab応答を予測するための候補であることのさらなる支持を付与するものである。
【０１６１】
ｔ検定解析から、個々のバイオマーカーが疾患制御グループを非リスポンダーから分離する能力を評価することができた。判別関数分析を用い、cetuximab治療で疾患制御の最良のプレディクターである変数のセットを同定するため、患者応答の上位１００の候補マーカーのセットの予測検出力を評価した。種々の多遺伝子モデルのＡＵＣ（リシーバーオペレーティングキャラクタリスチック曲線下の面積）値は、モデル中の遺伝子数が１から１５に増えてもモデルの予測検出力は向上しないことを示した。単一遺伝子モデルのＡＵＣ値は＞0.8であった。最も頻繁に同定された遺伝子であるＥＲＥＧおよびＡＲＥＧの性能を個々のプレディクターとして評価すべく独立の試験を行った。ＥＲＥＧは0.845のＡＵＣ値を有し、ＡＲＥＧは0.815のＡＵＣ値を有し、これらがともに患者選択の非常に強力な予測マーカーであることを示していた（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【０１６２】
候補マーカーエピレグリンおよびアンフィレグリンの分析：
最終的により一層容易に診断試験に移すことのできる異なる技術プラットホーム（technology platform）で遺伝子発現を独立に確認するため、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ転写レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲ TaqManアッセイを用いて測定した。これら遺伝子の発現レベルを、アッセイベースの方法およびｑＲＴ−ＰＣＲ法の両者を用いて７３人の患者からの腫瘍試料について得た（表６）。
【０１６３】
表６：定量的ＲＴ−ＰＣＲ TaqManアッセイによるアンフィレグリンおよびエピレグリンの発現レベル
【表４０】
【０１６４】
【表４１】
【０１６５】
【表４２】
【０１６６】
２つの方法の間に良好な相関関係があり（log2-変換アレイデータについて、ピアソン＞0.85、R2＞0.7）、アンフィレグリンおよびエピレグリンの両者についてAffymetrixアレイでの高発現はTaqManアッセイからの低ΔＣｔ値に対応していた（図９）。
【０１６７】
腫瘍生検および全血から単離したＤＮＡの遺伝子分析：
ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインにおける体細胞突然変異は、ＮＳＣＬＣにおいてgefitinibおよびerlotinibに対する感受性と強い相関関係を有することがわかっている（Janneら、J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)）。ＥＧＦＲ ＴＫドメインにおける体細胞突然変異は、cetuximabに対する応答に必要ではなく、cetuximabへの応答を予測するようにも思われないことが報告されている（Tsuchihashiら、N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)）。Ｋ−ＲＡＳにおける体細胞突然変異はＮＳＣＬＣにおいてgefitinibおよびerlotinibに対する感受性の欠如と相関関係を有するが、ＣＲＣでのcetuximab感受性における役割は定かではない（Moroniら、Lancet Oncol., 6, 279-286 (2005); Paoら、PLoS Med., 2, e17 (2005)）。８０の腫瘍生検からのＤＮＡを、ＥＧＦＲ、Ｋ−ＲＡＳおよびＢＲＡＦにおける突然変異について評価した。ＥＧＦＲキナーゼドメインおよびＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５のいずれにおいてもへテロ接合性突然変異は一つも検出されなかった。コドン１２および１３に影響を及ぼすＫ−ＲＡＳエクソン２の突然変異が、分析した８０の試料のうちの３０（３８％）において検出された（表６）。Ｋ−ＲＡＳ突然変異は、試験した２７人の疾患制御グループ（５人のＰＲおよび２２人のＳＤ）のうち３人（１１％）の安定疾患患者においてのみ検出された。一方、Ｋ−ＲＡＳ突然変異は５３人の非リスポンダーのうち２７人（５１％）において検出された。このデータは明らかにＫ−ＲＡＳ突然変異の存在がcetuximab療法への応答の欠如と相関関係を有することを示している。
【０１６８】
検討：
前処置生検の分析から得られる鍵となる知見は、その腫瘍がＥＧＦＲリガンドであるエピレグリンおよびアンフィレグリンを高レベルで発現する患者はcetuximab療法の利益を受ける傾向が強いということである。加えて、その腫瘍がＫ−ＲＡＳ突然変異を有しない患者はＫ−ＲＡＳ突然変異を有する患者に比べて有意に高い疾患制御を有することもわかった。
【０１６９】
ＥＧＦＲリガンドであるエピレグリンおよびアンフィレグリンの遺伝子は、染色体4q13.3上の同部位にある（co-localized）（Contiら、Mol. Endocrinol., 20, 715-723 (2006)）。エピレグリンおよびアンフィレグリンの発現は協調的に制御されている（coordinately regulated）ことが観察された（ピアソン係数＝0.85）。エピレグリンはＥＧＦリガンドに比べてＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ４に弱く結合することが知られているが、ＥＧＦよりも遙かに強力なマイトジェンであり、レセプター活性化の長期化状態に導く（Shellyら、J. Biol. Chem., 273, 10496-10505 (1998)）。エピレグリンおよび／またはアンフィレグリンの上昇した発現は、ＥＧＦＲを介した自己分泌ループ（autocrine loop）を刺激することにより腫瘍の増殖および生存において重要な役割を果たしている。このことは、「ＥＧＦＲ依存性」である腫瘍、それゆえリガンド−レセプター相互作用を阻止するcetuximabの能力に対する感受性を特徴付けているかもしれない。L2987細胞におけるエピレグリンおよびアンフィレグリンの構成的な発現がＥＧＦＲインヒビター処置により低減し、ＥＧＦ処置によって刺激されること、およびcetuximab処置がL2987細胞の増殖を阻止することの観察は、これらＥＧＦＲリガンドが活性化ＥＧＦＲ経路およびおそらく自己分泌スティミュレーターの指標であるとの仮説を支持するものである。この仮説はまた、エピレグリンおよびアンフィレグリン並びにＥＲＢＢ３の高発現がＥＧＦＲ活性化に依存しているという肺癌マウスモデルにおける結果によっても支持されている（Fujimotoら、Cancer Res., 65, 11478-11485 (2005)）。
【０１７０】
エピレグリンおよびアンフィレグリンのＲＮＡ発現がタンパク質ベースのアッセイに翻訳されないという知見は驚くべきことではない。これらｍＲＮＡ転写物は膜結合前駆体の形態をコードしており、該前駆体は最終的に開裂されて可溶性の形態を生成する。アンフィレグリンの場合、膜結合したイソ型並びに可溶性形態はいずれも生物学的に活性であり、ジュクスタ分泌（juxtacrine）、自己分泌またはパラ分泌シグナル伝達を誘導することが示されている（SinghおよびHarris, Cell Signal, 17, 1183-1193 (2005)）。これら知見とは対照的に、上昇した血清レベルのアンフィレグリンおよびＴＧＦαが、進行したＮＳＣＬＣ患者においてgefitinibに対する悪い応答を予測すると報告されていることに注目するのは興味深いことである（Ishikawaら、Cancer Res., 65, 9176-9184 (2005)）。この研究に記載された高血清レベルのアンフィレグリンおよびＴＧＦαを有する患者の腫瘍が、増殖や生存のためのＥＧＦＲシグナル伝達への依存性を迂回させることを可能とするＫ−ＲＡＳ突然変異などの他の遺伝子異常型を有するかは、未だ決定されていない。
【０１７１】
エピレグリンおよびアンフィレグリンは、cetuximabに感受性の他の腫瘍タイプを同定するのに用いることができる。エピレグリンおよびアンフィレグリン発現は、アンドロゲン非依存性の前立腺癌において、およびアンドロゲン感受性の前立腺癌異種移植における精線除去後に増大する（Torringら、Prostate, 64, 1-8 (2005); Torringら、Anticancer Res., 20, 91-95 (2000)）。エピレグリン発現は、それが細胞増殖を刺激する膵臓癌において（Zhuら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 273, 1019-1024 (2000)）、およびそれが生存と相関関係を有する膀胱癌患者において（Thogersenら、Cancer Res., 61, 6227-6233 (2001)）一層高い。アンフィレグリンの上昇した発現は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における全体的な生存と有意の相関関係を有することがわかっている（Fontaniniら、Clin. Cancer Res., 4, 241-249 (1998)）。アンフィレグリン発現はＥＲＢＢレセプターを発現する複数のミエローマ細胞において高く、その増殖を促進する（Mahtoukら、Oncogene, 24, 3512-3524 (2005)）。最近、高レベルの黄体形成ホルモンがエピレグリンおよびアンフィレグリンの刺激（これが今度はマイトジェン性のＥＧＦＲシグナル伝達を刺激し得る）により卵巣癌および乳癌のリスクを上昇させることがわかった（Freimannら、Biochem. Pharmacol., 68, 989-996 (2004)）。最後に、ＥＧＦＲおよびエストロゲンレセプター（ＥＲα）がアンフィレグリンの発現を媒体するとの観察（Brittonら、Breast Cancer Res. Treat., 96, 131-146 (2006)）は、乳癌患者のサブセット（ＥＧＦＲ＋、ＥＲ＋、アンフィレグリン＋）はcetuximab療法の利益を受けるかもしれないことを示唆している。taxotereを併用してＥＧＦＲインヒビターgefitinibによる処置を受けた転移性乳癌患者のうち、ＥＲ陽性の腫瘍の方がＥＲ陰性の腫瘍よりも有意に良好な応答率が認められたことは注目すべきである（Ciardielloら、Br. J. Cancer, 94, 1604-1609 (2006)）。
【０１７２】
これら２つのＥＧＦＲリガンドがcetuximabに対する応答を予測するとの観察に加えて、Ｋ−ＲＡＳ突然変異のない患者（４８％）はＫ−ＲＡＳ突然変異を有する患者（１０％）よりも高い疾患制御率を有することがわかった。この結果は、Ｋ−ＲＡＳ突然変異のない患者（７６％）はＫ−ＲＡＳ突然変異を有する患者（３１％）よりも高い疾患制御率を有することを示す最近報告された研究（Lievreら、Cancer Res., 66, 3992-3995 (2006)）からの知見を確認するものである。興味深いことに、以前の研究に記載された患者の殆どはcetuximabと化学療法剤との併用療法で処置されており、Ｋ−ＲＡＳ突然変異が単独療法および併合療法の両場面で疾患の進行性を予測することを示唆している。Ｋ−ＲＡＳは、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路（ＥＧＦＲおよび他の増殖因子レセプターの下流に位置する）において重要な役割を果たしており、細胞増殖に関与している。Ｋ−ＲＡＳ中の活性化突然変異の存在は、cetuximabの抑制活性を妨害することが予期される。Ｋ−ＲＡＳ突然変異はまた、ＮＳＣＬＣにおいてgefitinibおよびerlotinibに対する耐性と相関関係があることもわかっている（Paoら、PLoS Med., 2, e17 (2005)）。これらデータはcetuximabおよび／または他のＥＧＦＲインヒビターに対する応答を予測するうえでのＫ−ＲＡＳ突然変異の役割を一貫して支持しており、ＣＲＣ、ＮＳＣＬＣおよび膵臓癌などのＲＡＳ突然変異が一般的である癌において評価が継続されなければならない（Minamotoら、Cancer Detect. Prev., 24, 1-12 (2000)）。
【０１７３】
ＮＳＣＬＣ患者で観察されたこと（Janneら、J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)）とは対照的に、このＣＲＣ研究に登録された患者においてＥＧＦＲ遺伝子（エクソン１８−２１）の突然変異は検出されず、ＣＲＣ患者での突然変異の少なさ（paucity）が確認された（Tsuchihashiら、N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)）。ＢＲＡＦ（エクソン１５）に突然変異は検出されなかったが、そのような突然変異は他の研究では低頻度（＜５％）で観察された（Moroniら、Lancet Oncol., 6, 279-286 (2005)）。ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の増大が本研究で評価した患者の１０％未満で観察され、疾患制御を有する患者における一層高いコピー数への傾向があったが、結果はMoroniらのもの（患者の３１％が増幅を有していた）よりもLievreらのもの（患者の１０％が増幅を有していた）に沿っていた。Ｋ−ＲＡＳ突然変異状態とエピレグリンｍＲＮＡ発現との組合せを用いたモデルの性能の評価は、優れた予測検出力（0.89のＡＵＣ値）を示した。
【０１７４】
実施例３：バイオマーカーに対する抗体の製造
バイオマーカーに対する抗体は種々の方法により調製することができる。例えば、バイオマーカーポリペプチドを発現している細胞を動物に投与して、該発現されたポリペプチドに対して向けられたポリクローナル抗体を含む血清の産生を動物に誘発することができる。一つの側面において、当該技術分野で一般に行われている技術を用い、バイオマーカータンパク質を調製および単離し、あるいは精製して天然の混入物を含まないようにする。ついで、発現され単離されたポリペプチドに対して高い比活性を有するポリクローナル抗血清を製造するため、そのような調製物を動物に導入する。
【０１７５】
一つの側面において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはそのタンパク質結合フラグメント）である。バイオマーカーポリペプチドを発現する細胞はいずれかの適当な組織培養培地にて培養できるが、10%ウシ胎仔血清（約56℃で不活化したもの）を含むように補充し、約10g/lの非必須アミノ酸、約1,00U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプトマイシンを含むように補充したEarle改変Eagle培地で細胞を培養するのが好ましい。
【０１７６】
免疫した（およびブースター投与した）マウスの脾細胞を抽出し、適当なミエローマ細胞株と融合することができる。いずれの適当なミエローマ細胞株をも本発明に従って用いることができるが、ＡＴＣＣ（マナサス、バージニア）から入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２／０）を用いるのが好ましい。融合後、Wandsら（1981, Gastroenterology, 80:225-232）によって記載されているように、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的に維持し、ついで限界希釈によりクローニングする。ついで、そのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、ポリペプチド免疫原またはその部分に結合することのできる抗体を分泌する細胞クローンを同定する。
【０１７７】
別法として、抗イディオタイプ抗体を用いる２工程法においてバイオマーカーポリペプチドに結合することのできるさらなる抗体を製造することができる。そのような方法は、抗体自身が抗原であること、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることができるとの事実を用いるものである。この方法によれば、タンパク質特異的抗体を用いて動物、好ましくはマウスを免疫することができる。ついで、そのような免疫した動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を製造し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングしてタンパク質特異的抗体に結合する能力が該ポリペプチドによって阻止され得る抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体はタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の生成を誘発するのに用いることができる。
【０１７８】
実施例４：免疫蛍光アッセイ
以下の免疫蛍光プロトコールを、例えば、細胞上のＥＧＦＲバイオマーカータンパク質発現を確認するため、または、例えば、細胞の表面に発現されたＥＧＦＲバイオマーカーに結合する１またはそれ以上の抗体の存在についてチェックするために用いることができる。簡単に説明すると、カルシウムおよびマグネシウムを含むDPBS（DPBS++）中の10μg/mlのウシコラーゲンII型でLab-Tek IIチャンバスライドを4℃にて一夜コーティングする。ついで、スライドを冷DPBS++で２回洗浄し、全容量125μlの8000 CHO-CCR5または CHO pC4トランスフェクション細胞を播種し、95%酸素/5%二酸化炭素の存在下、37℃でインキュベートする。
【０１７９】
培地を吸引により穏やかに除去し、吸着した細胞をDPBS++で周囲温度にて２回洗浄する。スライドを0.2%BSA（ブロッキング剤）を含有するDPBS++で0-4℃にて1時間ブロッキングする。ブロッキング溶液を吸引により穏やかに除去し、125μlの抗体含有溶液（抗体含有溶液は、例えば、ハイブリドーマ培養上澄み液（通常、希釈せずに用いる）、または血清／血漿（通常、希釈する、たとえば約1/100の希釈）であってよい）を加える。スライドを0-4℃にて1時間インキュベートする。ついで、抗体溶液を吸引により穏やかに除去し、細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で５回洗浄する。つぎに、ブロッキング溶液中のローダミン標識二次抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ）（125μl、1μg/ml）を細胞に加える。再び、細胞を0-4℃にて1時間インキュベートする。
【０１８０】
ついで、二次抗体を吸引により穏やかに除去し、細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で３回、ついで冷DPBS++で５回、洗浄する。ついで、細胞をDPBS++中の3.7%ホルムアルデヒド（125μl）で周囲温度にて15分間固定化する。その後、細胞を400μlのDPBS++で周囲温度にて５回洗浄する。最後に、細胞を50%水性グリセリンに入れ、ローダミンフィルターを用いて蛍光顕微鏡で観察する。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】本明細書に記載のバイオマーカーを同定するのに用いるスキームの模式図である。
【０１８２】
【図２】本明細書に記載のバイオマーカーの発現プロファイリングを示す。
【０１８３】
【図３Ａ】３０人の患者でのエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡ発現プロファイルを示す。
【０１８４】
【図３Ｂ】３０人の患者でのエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡ発現プロファイルを示す。
【０１８５】
【図４】Ingenuity Pathway Analysisを用いた本明細書に記載のバイオマーカーの生物学的関係の模式図である。
【０１８６】
【図５】複バイオマーカーモデルと単一バイオマーカーモデルとの比較を示す。
【０１８７】
【図６】cetuximab応答についての候補マーカーのフィルタリングを示す。１６４の原発性結腸直腸腫瘍からの６４０のプローブセットでの発現データを教師なし階層的クラスタリングに供した。１６４の腫瘍を３つの主要なクラス（クラス１、２および３）に分けた。６４０のプローブセットを５つのクラスター（Ａ〜Ｅとして識別した）に分けた。クラスターＡはＣＥＡＣＡＭ６およびＣＤ２４などの癌抗原を含むが、ＥＲＥＧおよびＡＲＥＧをも含む。クラスターＡはクラス１ａで最も高度に発現され、１６４の結腸直腸腫瘍試料の約２５％を占めていた。
【０１８８】
【図７Ａ】８０人の患者でのエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡレベルを示す。エピレグリン（ＥＲＥＧ、205767_at）およびアンフィレグリン（ＡＲＥＧ、205239_at）のAffymetrixｍ ＲＮＡレベルをｙ軸上にプロットしてある。患者を最良の臨床応答により並べてある。疾患対照群（ＣＲ、ＰＲおよびＳＤ）と非リスポンダー群（ＥＲＥＧｐ＝１.４７４ｅ−０.５、ＡＲＥＧｐ＝２.４８９ｅ−０.５）との間には遺伝子発現レベルに統計学的有意差がある。
【０１８９】
【図７Ｂ】８０人の患者でのエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡレベルを示す。エピレグリン（ＥＲＥＧ、205767_at）およびアンフィレグリン（ＡＲＥＧ、205239_at）のAffymetrixｍ ＲＮＡレベルをｙ軸上にプロットしてある。患者を最良の臨床応答により並べてある。疾患対照群（ＣＲ、ＰＲおよびＳＤ）と非リスポンダー群（ＥＲＥＧｐ＝１.４７４ｅ−０.５、ＡＲＥＧｐ＝２.４８９ｅ−０.５）との間には遺伝子発現レベルに統計学的有意差がある。
【０１９０】
【図８Ａ】患者応答の予測のためのリシーバーオペレーティングキャラクタリスチック（ＲＯＣ）曲線を示す。図８Ａは、ＥＲＥＧを用いて被験試料で予測するためのＲＯＣを提供する。ＥＲＥＧは、判別機能分析を用いた最高の単一遺伝子プレディクターであり、被験セットで０.８４５のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有し、高性能の予測を示していた。
【０１９１】
【図８Ｂ】患者応答の予測のためのリシーバーオペレーティングキャラクタリスチック（ＲＯＣ）曲線を示す。図８Ｂは、ＡＲＥＧを用いて被験セットで予測するためのＲＯＣを提供する。ＡＲＥＧ遺伝子はＥＲＥＧ遺伝子と協調して制御されることがわかっており、被験セットで０.８１５のＡＵＣを有し、これもまた単一遺伝子プレディクターとして良好な予測検出力を有すること示していた。
【０１９２】
【図９】ｑＲＴ−ＰＣＲによるＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ Affymetrix発現の確認から得られた結果を示す。２つの方法の間に良好な相関関係（ピアソン＞０.８５、Ｒ２＞０.７）が認められた。Affymetrixアレイ上での高発現（ｙ軸）は、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧの両者についてTaqMan ｑＰＣＲアッセイからの低ΔＣｔ値（ｘ軸）に対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にファーマコゲノミクスの分野に関し、さらに詳細には、個性化された遺伝子プロファイルの同定を可能にすべく患者の薬物感受性を決定する方法および手順に関し、このような個性化された遺伝子プロファイルは疾患および障害を治療するうえで役立つものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は組織臨床的な異質さの大きな疾患である。従来の組織学的および臨床的な特徴が予後と関連付けられているけれども、同じみかけの予後タイプの腫瘍が治療に対する応答性および患者のその後の生存において大きく異なっている。
【０００３】
各患者について治療の個性化を容易にする新たな予後および予測マーカーが、臨床において小分子や生物学的分子医薬などの治療に対する患者の応答を正確に予測するために必要である。この問題は、治療に対する患者の感受性をより良く予測できる新たなパラメーターの同定により解決される。患者試料の分類は癌の診断および治療の重要な側面である。治療に対する患者の応答と分子および遺伝マーカーとの関連付けは、非応答患者における治療の開発の新たな機会を開くことができ、あるいは有効性における一層高い確実さの故に他の治療選択のうちで治療の適応症を識別することができる。さらに、医薬、薬物、または組合せ療法に良く応答する傾向のある患者を前もって選択することは、臨床研究において必要な患者の数を減らし、臨床開発プログラムを完成するのに必要な時間を短縮することができる（Cockettら、Current Opinion in Biotechnology, 11:602-609 (2000)）。
【０００４】
患者において薬物感受性を予測することができることは特に興味深いことである、なぜなら、薬物応答性は標的細胞にとって内生の特性のみならず、宿主の代謝特性をも反映するものだからである。遺伝情報を用いて薬物感受性を予測しようとする努力は、多剤耐性遺伝子mdr1およびmrp1などの広い作用を有する個々の遺伝子に主として向けられてきた（Sonneveld, J. Intern. Med., 247:521-534 (2000)）。
【０００５】
遺伝子ｍＲＮＡ発現パターンの大スケールの特徴付けのためのマイクロアレイ法の開発は、分子マーカーを体系的に探索すること、および伝統的な組織病理学的方法では明らかではなかった別個のサブグループに癌を分類することを可能にした（Khanら、Cancer Res., 58:5009-5013 (1998); Alizadehら、Nature, 403:503-511 (2000); Bittnerら、Nature, 406:536-540 (2000); Khanら、Nature Medicine, 7(6):673-679 (2001);およびGolubら、Science, 286:531-537 (1999); Alonら、P. N. A. S. USA, 96:6745-6750 (1999)）。そのような技術および分子ツールは、分子集団内での多数の転写物の発現レベルをいかなる所定の時点においてもモニターすることを可能にした（たとえば、Schenaら、Science, 270:467-470 (1995); Lockhartら、Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Blanchardら、Nature Biotechnology, 14:1649 (1996)；Ashbyらの米国特許第5,569,588号を参照）。
【０００６】
最近の研究は、ヒト腫瘍のマイクロアレイ分析によって生成した遺伝子発現情報が臨床結果を予測し得ることを示している（van't Veerら、Nature, 415:530-536 (2002); Sorlieら、P. N. A. S. USA, 98:10869-10874 (2001); M. Shippら、Nature Medicine, 8(1):68-74 (2002): Glinskyら、The Journal of Clin. Invest., 113(6):913-923 (2004)）。これら知見は、治療に対する個々の腫瘍の応答をより良く予測することにより癌の治療が大きく改善されるであろうとの希望をもたらす。
【０００７】
上皮増殖因子受容体（EGFR）およびその下流のシグナル伝達エフェクター、特にRas/Raf/MAPキナーゼ経路の成員は、正常および異常な両上皮細胞生物学において重要な役割を果たしており（Normannoら、Gene 366, 2-16 (2006)）、それゆえ治療開発の確立された標的となってきている。抗EGFR抗体であるcetuximabおよびEGFR小分子チロシンキナーゼインヒビター（TKI）であるgefitinibおよびerlotinibは患者のサブセットで活性を示したが（BaselgaおよびArteaga, J. Clin. Oncol. 23, 2445-2459 (2005)）、その初期の臨床開発は、最も利益を受けやすい患者の集団を同定する付随する戦略の利益を受けなかった。比較的少数の腫瘍のみが「EGFR経路依存的」であり、それゆえEGFRインヒビターに応答しやすいとの仮説が、このクラスの治療法で観察される限定された臨床活性を説明するかもしれない。例えば、難治性の転移性結腸直腸癌を罹患する患者では、cetuximabでの臨床応答率は、一貫して単独療法での１１％から化学療法との併合療法での２３％までの範囲である（Cunninghamら、N. Engl. J. Med 351, 337-345 (2004)）。今日、EGFR抑制に対する感受性または耐性のメカニズムを解明することに焦点を当てた相当の努力が、とりわけEGFRタンパク質発現、キナーゼドメイン突然変異、および遺伝子コピー数の評価によりなされてきている。
【０００８】
免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定してＥＧＦＲの相対的なタンパク質発現が多くの固形腫瘍で示されているが（CiardielloおよびTortora, Eur. J. Cancer 39, 1348-1354 (2003)）、ＥＧＦＲ発現とＥＧＦＲインヒビターに対する応答との一貫した関連性は確立されていない。ｍＣＲＣを罹患した患者での単独療法およびirinotecanとの併合療法でのcetuximabの臨床研究は、ＩＨＣによる測定でＸ線撮影した応答とＥＧＦＲタンパク質発現との間の関連性を明らかにすることができなかった（Cunninghamら、N. Engl. J. Med 351, 337-345 (2004); Saltzら、J. Clin. Oncol. 22, 1201-1208 (2004)）。さらに、臨床応答はＥＧＦＲタンパク質発現が検出できない患者で示されている（Chungら、J. Clin. Oncol., 23, 1803-1810 (2005); Lenzら、Activity of cetuximab in patients with colorectal cancer refractory to both irinotecan and oxaliplatin. 2004 ASCO Annual Meeting Proceedingsで提出された論文; Saltz, Clin Colorectal Cancer, 5 Suppl. 2, S98-100 (2005)）。これと比較して、NSCLC患者におけるerlotinibおよび卵巣癌におけるgefitinibの臨床研究は、ＥＧＦＲ発現、応答、および生存の間の関連性を示した（Schilderら、Clin. Cancer Res., 11, 5539-5548 (2005); Tsaoら、N. Engl. J. Med., 353, 133-144 (2005)）。特にNSCLCにおけるチロシンキナーゼドメイン中の体細胞突然変異の存在は、多数記載されている（Janneら、J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)）。前臨床および臨床の両状況において、これら突然変異はgefitinibおよびerlotinibに対する感受性とは相関関係を有するがcetuximabに対する感受性とは相関関係を有しないことがわかっている（Janneら、J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005); Tsuchihashiら、N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)）。加えて、ＣＲＣ患者におけるＥＧＦＲキナーゼドメイン突然変異の欠如は、そのような突然変異がcetuximabに対する応答の基礎となっていない（underlie）ことを示唆している。ＥＧＦＲ遺伝子コピー数もまた、ＥＧＦＲインヒビターに対する応答の潜在的なプレディクターとして評価されている。gefitinibの臨床研究は、増大したＥＧＦＲコピー数、突然変異の状態、および臨床応答の間の関連性を示した（Cappuzzoら、J. Natl. Cancer Inst., 97, 643-655 (2005)）。同様の関連性は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるcetuximabおよびpanitumumabで処置した少数の患者でも認められた（Moroniら、Lancet Oncol., 6, 279-286 (2005)）。さらなる潜在的な予測用バイオマーカーも評価されている。例えば、神経膠芽細胞腫の患者において、ＥＧＦＲｖIIIおよびＰＴＥＮの同時発現とＥＧＦＲ小分子インヒビターに対する応答との間の有意の関連性が見出された（Mellinghoffら、N. Engl. J. Med., 353, 2012-2024 (2005)）。
【０００９】
cetuximabの抗腫瘍活性は、ＥＧＦＲリガンド結合およびリガンド依存性のＥＧＦＲ活性化を阻止できることによるとされている。cetuximabの臨床活性は複数の上皮腫瘍タイプで示されているが（Bonnerら、N. Engl. J. Med., 354, 567-578 (2006); Cunninghamら、N. Engl. J. Med., 351, 337-345 (2004)）、応答が認められ続けるのは患者のほんの少しにすぎない。上記の感受性または耐性のプレディクターを同定するためのこれまでの試みは、ゲノム発見アプローチ（genomic discovery approaches）を用いるよりも特定のバイオマーカーに焦点を当てられていた。加えて、ＲＮＡ、ＤＣｔおよびタンパク質ベースのマーカーは単独の研究での同じ患者集団で調べられたことは殆どなく、比較を困難にしていた。
【００１０】
ＥＧＦＲモデュレーターに対する感受性を決定するのに有用なバイオマーカーは、公開されたＰＣＴ出願、WO2004/063709, WO2005/067667, およびWO2005/094332に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
個性化された遺伝子プロファイルの開発を可能にすべく患者の薬物感受性を決定する新たな別の方法および手順が必要とされており、このような個性化された遺伝子プロファイルは患者の分子レベルでの応答に基づいて疾患および障害を治療するのに必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、１またはそれ以上の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）モデュレーターに対する患者の感受性を決定するための方法および手順を提供する。本発明はまた、癌などの疾患状態の治療を必要とする個体が、治療を投与する前に該治療に応答するか否かを決定または予測する方法であって、該治療が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターの投与を含むものである方法をも提供する。１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターは、例えば、１またはそれ以上のＥＧＦＲ特異的リガンド、１またはそれ以上の小分子ＥＧＦＲインヒビター、または１またはそれ以上のＥＧＦＲ結合性モノクローナル抗体から選ばれる化合物である。
【００１３】
一つの側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性（likelihood）を予測する方法であって、（ａ）エピレグリン（epiregulin）およびアンフィレグリン（amphiregulin）から選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の増大を示すものである方法を提供する。一つの側面において、少なくとも一つのバイオマーカーは、エピレグリンおよびアンフィレグリンを含む。さらに他の側面において、少なくとも一つのバイオマーカーは、表１から選択される少なくとも一つのさらなるバイオマーカーをさらに含む。他の側面において、生物学的試料は癌細胞を含む組織試料であり、本方法はさらに、癌細胞が突然変異Ｋ−ＲＡＳの存在を有するか否かを決定する工程を含み、ここで突然変異Ｋ−ＲＡＳの検出は癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示す。
【００１４】
生物学的試料は、例えば、癌細胞を含む組織試料であってよく、該組織は固定され、パラフィン埋設され、新鮮なもので（fresh）、または凍結乾燥される。
【００１５】
他の側面において、ＥＧＦＲモデュレーターはcetuximabであり、癌は結腸直腸癌である。
【００１６】
他の側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測する方法であって、（ａ）ＣＤ７３を含む少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示すものである方法を提供する。他の側面において、少なくとも一つのバイオマーカーは、表１から選択される少なくとも一つのさらなるバイオマーカーをさらに含む。他の側面において、本方法はさらに、癌細胞が突然変異Ｋ−ＲＡＳの存在を有するか否かを決定する工程を含み、ここで突然変異Ｋ−ＲＡＳの検出は癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示す。
【００１７】
癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するあるいは応答しないであろう蓋然性を予測するのに十分なバイオマーカーのレベルの差違は、既知の方法を用いて当業者により容易に決定することができる。バイオマーカーのレベルの増大または低下を相互に関連させて、該差違が、哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測するのに十分であるか否かを決定することができる。十分であるバイオマーカーのレベルの差違は、一つの側面において、哺乳動物が処置に対して治療的に応答するであろう蓋然性を予測するに先立って決定することができる。一つの側面において、バイオマーカーのレベルの差異は、ｍＲＮＡレベル（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイにより測定）の差違、例えば、発現のレベルの少なくとも２倍の差違、少なくとも３倍の差違、または少なくとも４倍の差違である。他の側面において、バイオマーカーのレベルの差異はＩＨＣによって決定される。他の側面において、バイオマーカーのレベルの差異は、Anova（ｔ検定）分析のｐ値が＜０.０５であることをいう。さらに他の側面において、差違はＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。
【００１８】
本明細書において、治療的な応答とは、癌の緩和または廃棄をいう。このことは、癌を罹患した個体の平均余命が増すこと、または癌の１またはそれ以上の徴候が低減または改善されることを意味する。この語は、癌様の細胞増殖または腫瘍容積の低減を包含する。哺乳動物が治療的に応答するか否かは、ＰＥＴ造影などの当該技術分野でよく知られた多くの方法によって測定することができる。
【００１９】
哺乳動物は、例えば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコ、霊長類、またはサルであってよい。
【００２０】
本発明の方法は、たとえば、インビトロの方法であってよく、その際、哺乳動物において少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定する工程は、哺乳動物から生物学的試料を採取し、ついで該生物学的試料中のバイオマーカーのレベルを測定することを含む。生物学的試料は、例えば、血清、新鮮な全血、末梢血単核細胞、凍結した全血、新鮮な血漿、凍結した血漿、尿、唾液、皮膚、毛包、骨髄または腫瘍組織のうちの少なくとも一つを含む。
【００２１】
少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、例えば、バイオマーカーのタンパク質および／またはｍＲＮＡ転写物のレベルであってよい。バイオマーカーのレベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲその他のＰＣＴに基づく方法、免疫組織化学、プロテオミクス法、または当該技術分野で知られた他の方法、またはこれらの組合せによって決定できる。
【００２２】
他の側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して治療的に応答するであろう哺乳動物を同定する方法であって、（ａ）表１から選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである方法を提供する。
【００２３】
他の側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して治療的に応答するであろう哺乳動物を同定する方法であって、（ａ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１から選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、ＥＧＦＲモデュレーターに暴露された哺乳動物で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである方法を提供する。
【００２４】
さらに他の側面において、本発明は、ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを試験または予測する方法であって、（ａ）表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；（ｂ）該哺乳動物をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである方法を提供する。
【００２５】
他の側面において、本発明は、ある化合物が哺乳動物においてＥＧＦＲ活性を抑制するか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該化合物に暴露し；ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、該化合物に暴露していない哺乳動物における該バイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該バイオマーカーのレベルの差違が、該化合物が該哺乳動物においてＥＧＦＲ活性を抑制することを示すものである方法を提供する。
【００２６】
さらに他の側面において、本発明は、哺乳動物がＥＧＦＲ活性を抑制する化合物に暴露されたか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該化合物に暴露し；ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、該化合物に暴露していない哺乳動物における該バイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該バイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物がＥＧＦＲ活性を抑制する化合物に暴露されたことを示すものである方法を提供する。
【００２７】
他の側面において、本発明は、哺乳動物がＥＧＦＲ活性を抑制する化合物に応答するか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該化合物に暴露し；ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、該化合物に暴露していない哺乳動物における該バイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該バイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物がＥＧＦＲ活性を抑制する化合物に応答することを示すものである方法を提供する。
【００２８】
本明細書において「応答する」とは、哺乳動物において生物学的および細胞応答並びに臨床的応答（改善された徴候、治療効果、または有害な事象など）により応答することを包含する。
【００２９】
本発明はまた、表１のバイオマーカーから選択される単離されたバイオマーカーをも提供する。本発明のバイオマーカーは、表１および配列表にて提供されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列から選択される配列、並びにその断片および変異体を含む。
【００３０】
本発明はまた、表１のバイオマーカーから選択される２またはそれ以上のバイオマーカーを含むバイオマーカーセットをも提供する。
【００３１】
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターを含む治療に対してある患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するキットをも提供する。患者は、例えば、結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ、または頭部および首の癌などの癌または腫瘍を罹患していてよい。
【００３２】
一つの側面において、本発明のキットは、本発明の１またはそれ以上の特別のマイクロアレイを入れた適当な容器、患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに用いる１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーター、および使用の指示書を含む。キットはさらに、バイオマーカーセットの発現をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでモニターするための試薬または材料を含んでいてよい。
【００３３】
他の側面において、本発明は、表１のバイオマーカーから選択される２またはそれ以上のバイオマーカーを含むキットを提供する。
【００３４】
さらに他の側面において、本発明は、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための抗体および核酸の少なくとも一つを含むキットを提供する。一つの側面において、該キットはさらに、ＥＧＦＲ活性を抑制する化合物の投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを決定するための指示を含む。他の側面において、該指示は、（ａ）表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、（ｂ）該哺乳動物を該化合物に暴露し、（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定する工程を含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろうことを示すものである。
【００３５】
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターによる治療に対して患者が感受性または耐性であるか否かを決定するためのスクリーニングアッセイをも提供する。
【００３６】
本発明はまた、疾患を罹患した患者の治療をモニターする方法であって、該疾患が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む方法によって治療されるものである方法をも提供する。
【００３７】
本発明はまた、分子レベルでの患者の応答に基づいて疾患および障害を治療するのに必要な個性化された遺伝子プロファイルをも提供する。
【００３８】
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに対する感受性かまたは耐性のいずれかと相関関係のある発現プロファイルを有する１またはそれ以上のバイオマーカーを含む、特別なマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイをも提供する。
【００３９】
本発明はまた、本発明の１またはそれ以上のバイオマーカーに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体をも提供する。
【００４０】
本発明は、添付の図面と関連して考察しながら発明の詳細な説明を読むとより理解されるであろう。
【００４１】
効能、薬物暴露、または臨床応答の迅速かつ利用可能な読み出し情報（readouts）を提供するバイオマーカーの同定は、薬物候補の臨床開発においてますます重要になっている。本発明の態様は、分泌タンパク質、または血漿バイオマーカー（バイオマーカーの一つのカテゴリーを表す）のレベルの変化を測定することを含む。一つの側面において、血漿試料（容易に利用可能な材料の代表である）はバイオマーカー分析のための代理組織として利用される。
【００４２】
本発明は、特定のシグナル伝達経路のモデュレーションに応答し、ＥＧＦＲモデュレーター感受性または耐性と相関関係をも有するバイオマーカーを提供する。これらバイオマーカーは、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに対する応答を予測するのに用いることができる。一つの側面において、本発明のバイオマーカーは、表１および配列表にて提供するバイオマーカーであり、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両配列を含む。本発明はまた、表１にて提供するポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列をも包含する。
【００４３】
表１：バイオマーカー
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
【表６】
【００４９】
【表７】
【００５０】
【表８】
【００５１】
【表９】
【００５２】
【表１０】
【００５３】
【表１１】
【００５４】
【表１２】
【００５５】
【表１３】
【００５６】
【表１４】
【００５７】
【表１５】
【００５８】
【表１６】
【００５９】
【表１７】
【００６０】
【表１８】
【００６１】
【表１９】
【００６２】
【表２０】
【００６３】
【表２１】
【００６４】
【表２２】
【００６５】
【表２３】
【００６６】
【表２４】
【００６７】
【表２５】
【００６８】
【表２６】
【００６９】
【表２７】
【００７０】
表１にて提供するバイオマーカーは、配列番号１〜１２８のヌクレオチド配列および配列番号１２９〜２５６のアミノ酸配列を含み、本明細書において単遺伝子表記（Unigene Title）に関して合計１２８のバイオマーカーとして言及される。
【００７１】
これらバイオマーカーは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性に依存し且つ細胞によって示されるＥＧＦＲモデュレーター感受性と高度の相関関係をも有する細胞での発現レベルを有する。バイオマーカーは、ＥＧＦＲモデュレーター、好ましくはＥＧＦＲキナーゼ機能または活性の直接的または間接的な抑制または拮抗作用によりＥＧＦＲキナーゼ活性に影響を及ぼす生物学的分子、小分子などに対する応答の蓋然性を予測するための有用な分子ツールとして働く。
【００７２】
野生型Ｋ−ＲＡＳおよび突然変異Ｋ−ＲＡＳ
本明細書において、野生型Ｋ−ＲａｓはＫ−Ｒａｓ変異体ａおよび変異体ｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列から選択することができる。野生型Ｋ−Ｒａｓ変異体ａは５４３６ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有し（ジーンバンクアクセッション番号NM_033360.2）、１８９アミノ酸であるタンパク質をコードする（ジーンバンクアクセッション番号NP_203524.1）。野生型Ｋ−Ｒａｓ変異体ｂは５３１２ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有し（ジーンバンクアクセッション番号NM_004985.3）、１８８アミノ酸であるタンパク質をコードする（ジーンバンクアクセッション番号NP_004976.2）。
【００７３】
Ｋ−Ｒａｓの変異形は、少なくとも１の部位、好ましくは野生型Ｋ−Ｒａｓとは異なるアミノ酸をコードする少なくとも１のヌクレオチド部位にて、野生型Ｋ−Ｒａｓとは異なるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。一つの側面において、Ｋ−Ｒａｓの変異形はエクソン２に少なくとも１の突然変異を含む。他の側面において、Ｋ−ＲＡＳの変異形はエクソン２中の以下の突然変異（塩基の変化（アミノ酸の変化））の少なくとも１を含む：200G>A (V7M); 216G>C (G12A); 215G>T (G12C); 216G>A (G12D); 215G>C (G12R); 215G>A (G12S); 216G>T (G12V); 218G>T (G13C); 219G>A (G13D)。
【００７４】
Ｋ−Ｒａｓ突然変異を検出する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、ＰＣＴ公開公報WO2005/118876に記載されている方法が挙げられる。
【００７５】
ＥＧＦＲモデュレーター
本明細書において「ＥＧＦＲモデュレーター」とは、ＥＧＦＲ活性またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を直接的または間接的にモデュレートする生物学的分子または小分子である化合物または薬物を意味するものである。それゆえ、本明細書において化合物または薬物は、小分子および生物学的分子の両者を包含するものである。直接的または間接的なモデュレーションとしては、ＥＧＦＲ活性またはＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化または抑制が挙げられる。一つの側面において、抑制とは、ＥＧＦＲのＥＧＦＲリガンド、たとえばＥＧＦへの結合の抑制をいう。他の側面において、抑制とは、ＥＧＦＲのキナーゼ活性の抑制をいう。
【００７６】
ＥＧＦＲモデュレーターとしては、たとえば、ＥＧＦＲ特異的リガンド、小分子ＥＧＦＲインヒビター、およびＥＧＦＲモノクローナル抗体が挙げられる。一つの側面において、ＥＧＦＲモデュレーターは、ＥＧＦＲ活性を抑制し、および／またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を抑制する。他の側面において、ＥＧＦＲモデュレーターは、ＥＧＦＲ活性を抑制し、および／またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を抑制するＥＧＦＲ抗体である。
【００７７】
ＥＧＦＲモデュレーターは、生物学的分子または小分子を含む。生物学的分子としては、全ての脂質および単糖のポリマー、アミノ酸、および分子量が４５０を超えるヌクレオチドが挙げられる。それゆえ、生物学的分子としては、たとえば、オリゴ糖および多糖；オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質；およびオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとしては、たとえば、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。
【００７８】
生物学的分子はさらに、上記分子のいずれかの誘導体を含む。たとえば、生物学的分子の誘導体としては、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質の脂質およびグリコシル化誘導体が挙げられる。
【００７９】
生物学的分子の誘導体はさらに、オリゴ糖および多糖の脂質誘導体、たとえば、リポ多糖を含む。最も典型的には、生物学的分子は抗体、または抗体の機能的等価物である。抗体の機能的等価物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有し、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を抑制する。そのような機能的等価物としては、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、および一本鎖抗体、並びにそのフラグメントが挙げられる。
【００８０】
抗体の機能的等価物はまた、該抗体の可変領域または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをも含む。他の配列と実質的に同じであるが、１またはそれ以上の置換、付加、および／または欠失により他の配列と異なっているアミノ酸配列は等価な配列であると考えられる。好ましくは、ある配列中のアミノ酸残基の数の５０％未満、さらに好ましくは２５％未満、さらに一層好ましくは１０％未満がタンパク質から置換、タンパク質に付加、またはタンパク質から欠失している。
【００８１】
抗体の機能的等価物は、好ましくはキメラ抗体またはヒト化抗体である。キメラ抗体は、非ヒト抗体の可変領域およびヒト抗体の定常領域を含む。ヒト化抗体は、非ヒト抗体の超可変領域（ＣＤＲ）を含む。ヒト化抗体の超可変領域以外の可変領域、たとえばフレームワーク可変領域、および定常領域は、ヒト抗体からのものである。
【００８２】
非ヒト抗体の適当な可変領域および超可変領域は、モノクローナル抗体の作成されたいずれかの非ヒト哺乳動物によって産生された抗体からのものであってよい。ヒト以外の哺乳動物の適当な例としては、たとえば、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、または霊長類が挙げられる。
【００８３】
機能的等価物はさらに、全抗体の結合特性と同じかまたは匹敵する結合特性を有する抗体のフラグメントを含む。抗体の適当なフラグメントとしては、ＥＧＦＲチロシンキナーゼに特異的且つ充分な親和性でもって結合してそのような受容体を発現する細胞の増殖を抑制する超可変（すなわち、相補性決定）領域の充分な部分を含むあらゆるフラグメントが挙げられる。
【００８４】
そのようなフラグメントは、たとえば、ＦａｂフラグメントまたはＦ(ａｂ')２フラグメントの一方または両者を含んでいてよい。抗体フラグメントは全抗体の６つの全ての相補性決定領域を含んでいるのが好ましいが、そのような領域を全てよりも少なく、たとえば３つ、４つ、または５つのＣＤＲを含む機能的フラグメントも包含される。
【００８５】
一つの側面において、フラグメントは一本鎖抗体、またはＦｖフラグメントである。一本鎖抗体は、相互連結リンカーによりまたは該リンカーなしで、抗体の軽鎖の可変領域に連結した重鎖の可変領域を少なくとも含むポリペプチドである。それゆえ、Ｆｖフラグメントは全抗体結合部位を含む。これら鎖は細菌または真核細胞で産生できる。
【００８６】
抗体および機能的等価物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどの免疫グロブリンのいずれのクラス、およびそのサブクラスの成員であってもよい。一つの側面において、抗体はＩｇＧ１サブクラスの成員である。機能的等価物はまた、これらクラスおよびサブクラスのいずれかの組合せの等価物であってもよい。
【００８７】
一つの側面において、ＥＧＦＲ抗体は、米国特許第4,943,533号に記載されたマウス抗体２２５に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および一本鎖抗体から選択することができる。
【００８８】
他の側面において、ＥＧＦＲ抗体はcetuximab（IMC-C225）であり、これはキメラ（ヒト／マウス）ＩｇＧモノクローナル抗体であってERBITUXの商標名でも知られているものである。cetuximabのＦａｂはcetuximabのＦａｂフラグメント、すなわち、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１重鎖およびカッパ軽鎖定常ドメインとともにマウス抗体Ｍ２２５（米国出願第2004/0006212号；参照のため本明細書に引用する）の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。cetuximabは、３つのすべてのＩｇＧ１重鎖定常ドメインを含む。
【００８９】
他の側面において、ＥＧＦＲ抗体は、米国特許第6,235,883号、米国特許第5,558,864号、および米国特許第5,891,996号に記載の抗体から選択することができる。ＥＧＦＲ抗体はまた、例えば、AGX-EGF（Amgen Inc.）（panitumumabとしても知られる）であってよく、これは完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。ABX-EGF（クローンE7.6.3としても知られる）の配列および特徴付けは米国特許第6,235,883号の第28欄62行〜第29欄36行および図29-34（参照のため本明細書に引用する）に記載されている。ＥＧＦＲ抗体はまた、例えば、EMD72000（Merck KGaA）であってよく、これはマウスＥＧＦＲ抗体EMD 55900のヒト化抗体である。ＥＧＦＲ抗体はまた、例えば、h-R3（TheraCIM）（ヒト化ＥＧＦＲモノクローナル抗体である）；Y10（ヒトEGFRvIII変異体のマウスホモログに対して産生されたマウスモノクローナル抗体）；またはMDX-447（Medarex Inc.）であってよい。
【００９０】
上記で検討した生物学的分子に加え、本発明において有用なＥＧＦＲモデュレーターはまた小分子であってよい。生物学的分子ではないあらゆる分子は、本明細書において小分子とされる。小分子の若干の例としては、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩、糖、アミノ酸、およびヌクレオチドが挙げられる。小分子はさらに、分子量が４５０を超えていないこと以外では生物学的分子であると考えられる分子を含む。それゆえ、小分子は、分子量が４５０またはそれ以下である脂質、オリゴ糖、オリゴペプチド、およびオリゴヌクレオチドおよびその誘導体であってよい。
【００９１】
小分子はいかなる分子量を有していてもよいことが強調される。小分子は典型的に４５０未満の分子量を有するが故に小分子と呼ばれるにすぎない。小分子は天然に見出される化合物並びに合成の化合物を含む。一つの態様において、ＥＧＦＲモデュレーターはＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制する小分子である。他の態様において、ＥＧＦＲモデュレーターはＥＧＦＲを発現する難治性腫瘍細胞の増殖を抑制する小分子である。
【００９２】
多数の小分子がＥＧＦＲを抑制するのに有用であると記載されている。
【００９３】
小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの一つの例はIRESSA（ZD1939）であり、これはＥＧＦＲを抑制するＡＴＰミメチックとして機能するキノザリン誘導体である。米国特許第5,616,582号；WO96/33980、第４頁を参照。小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの他の例はTARCEVA（OSI-774）であり、これは4-(置換フェニルアミノ)キノザリン誘導体［6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)-キノザリン-4-イル]-(3-エチニル-l-フェニル)アミン塩酸塩］ＥＧＦＲインヒビターである。WO96/30347（Pfizer Inc.）の例えば第２頁１２行〜第４頁３４行および第１９頁１４〜１７行を参照。TARCEVAは、ＥＧＦＲのリン酸化およびその下流のPI3/AktおよびMAP（マイトジェン活性化プロテイン）キナーゼシグナル伝達経路を抑制してｐ２７媒体された細胞周期の停止（arrest）という結果となることによって機能する。ASCOの第３７回年次会（サンフランシスコ、カリフォルニア、２００１年５月１２〜１５日）に提出されたHidalgoら、要約281を参照。
【００９４】
他の小分子もまたＥＧＦＲを抑制することが報告されており、その多くはＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインに特異的であると考えられている。そのような小分子の幾つかの例が、WO91/116051, WO96/30347, WO96/33980, WO97/27199, WO97/30034, WO97/42187, WO97/49688, WO98/33798, WO00/18761, およびWO00/31048に記載されている。具体的な小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、C1-1033（Pfizer Inc.）（これは、チロシンキナーゼ、とりわけＥＧＦＲのキノザリン（N-[4-(3-クロロ-4-フルオロ-フェニルアミノ)-7-(3-モルホリン-4-イル-プロポキシ)-キナゾリン-6-イル]-アクリルアミド）インヒビターであり、WO00/31048の第8頁22-6行に記載されている）；PKI166（Novartis）（これは、ＥＧＦＲのピロロピリミジンインヒビターであり、WO97/27199の第10-12頁に記載されている）；GW2016（GlaxoSmitbKline）（これは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のインヒビターである）；EKB569（Wyeth）（これは、インビトロおよびインビボでＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍の増殖を抑制することが報告されている）；AG-1478（Tryphostin）（これは、ＥＧＦＲおよびerbB-2の両者からのシグナル伝達を抑制するキナゾリン小分子である）；AG-1478（Sugen）（これは、プロテインキナーゼＣＫ２をも抑制する２基質（bisubstrate）インヒビターである）；PD153035（Parke-Davis）（これは、ＥＧＦＲキナーゼ活性および腫瘍増殖を抑制し、培養細胞においてアポトーシスを誘導し、細胞障害性化学療法剤の細胞障害性を促進することが報告されている）；SPM-924（Schwarz Pharma）（これは、前立腺癌の治療を標的とするチロシンキナーゼインヒビターである）；CP-546,989（OSI Pharmaceuticals）（これは、報告によれば、固形癌の治療のための脈管形成のインヒビターである）；ADL-681（これは、癌治療を標的とするＥＧＦＲキナーゼインヒビターである）；PD158780（これは、マウスでA4431異種移植の腫瘍増殖率を抑制することが報告されているピリドピリミジンである）；CP-358,774（これは、マウスにおいてHN5異種移植の自己リン酸化を抑制することが報告されているキナゾリンである）；ZD1839（これは、外陰部、NSCLC、前立腺、卵巣、および直腸結腸の癌を含むマウス異種移植モデルにおける抗腫瘍作用を有することが報告されているキナゾリンである）；CGP59326A（これは、マウスにおいてＥＧＦＲ陽性の異種移植の増殖を抑制することが報告されているピロロピリミジンである）；PD165557（Pfizer）；CGP54211およびCGP53353（Novartis）（これは、ジアニロフタルイミド（dianilnophthalimides）である）が挙げられる。天然由来のＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターとしては、genistein、herbimycin A、quercetin,およびerbstatinが挙げられる。
【００９５】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、米国特許第5,646,153号に記載されている化合物などの三環化合物；米国特許第5,616,582号に記載されている誘導体などのキナゾリン誘導体；および米国特許第5,196,446号に記載されている化合物などのインドール化合物である。
【００９６】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、米国特許第5,656,655号に記載されている化合物のようなスチリル置換へテロアリール化合物である。このへテロアリール基は１または２のへテロ原子を有する単環であるかまたは１ないし約４のへテロ原子を有する二環であり、該化合物は任意に置換またはポリ置換されている。
【００９７】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、米国特許第5,646,153号に記載されているビスモノおよび／または二環アリールへテロアリール、炭素環、およびへテロ炭素環化合物である。
【００９８】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、Fryら（Science 265, 1093-1095 (1994)）の図１に示されている、ＥＧＦＲを抑制する化合物である。
【００９９】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、Osherovら、J. Biol. Chem., 25;268(15):11134-42 (1993)の特に表Ｉ、II、IIIおよびIVに記載された、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１およびＨＥＲ２を抑制するtyrphostinsである。
【０１００】
ＥＧＦＲを抑制することが報告され、それゆえ本発明の範囲に包含されるさらなる小分子は、受容体のＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、およびＦＧＦＲファミリーを抑制するPD166285として同定された化合物である。PD166285は、Panekら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 283, 1433-1444 (1997)の１４３６頁の図１に示す構造を有する6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-(4-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニルアミノ)-8-メチル-8H-ピリド(2,3-d)ピリミジン-7-オンとして同定されている。
【０１０１】
本発明において用いる有用な小分子はＥＧＦＲのインヒビターであるが、ＥＧＦＲに対して完全に特異的である必要はないことが認識されなければならない。
【０１０２】
バイオマーカーおよびバイオマーカーセット
本発明は、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ経路によるシグナル伝達が重要である疾患領域において、たとえば、癌または腫瘍において、免疫学的障害、状態または不全において、または細胞のシグナル伝達および／または細胞増殖の制御が異常または異所性である疾患状態において診断および予後の両者で価値を有する個々のバイオマーカーおよびバイオマーカーセットを含む。バイオマーカーセットは、複数のバイオマーカー、たとえば、以下の表１に示す、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに対する感受性または耐性と高度の相関関係を有する複数のバイオマーカーを含む。
【０１０３】
本発明のバイオマーカーセットは、種々の生物学的系においてまたは細胞応答について１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターの起こりそうな効果を予測または妥当に予告することを可能にする。バイオマーカーセットは、被験細胞によるＥＧＦＲモデュレーター応答のインビトロアッセイに用いてインビボでの結果を予測することができる。本発明によれば、本明細書に記載する種々のバイオマーカーおよびバイオマーカーセット、またはこれらバイオマーカーセットと他のバイオマーカーまたはマーカーとの組合せを、たとえば、癌患者が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターによる治療的介入に対してどのように応答するかを予測するのに用いることができる。
【０１０４】
細胞が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに暴露された後の細胞の感受性または耐性と相関関係を有する細胞の遺伝子発現パターンのバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、該ＥＧＦＲモデュレーターで治療する前に１またはそれ以上の腫瘍試料をスクリーニングするための有用なツールを提供する。このスクリーニングは、バイオマーカーおよびバイオマーカーセットの発現結果に基づき、腫瘍、それゆえ腫瘍を罹患した患者がＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療に応答するか否かについて、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに暴露された腫瘍試料の細胞の予測を可能にする。
【０１０５】
バイオマーカーまたはバイオマーカーセットはまた、本明細書に記載するように、ＥＧＦＲモデュレーターが関与する疾患の治療を受けている患者において疾患の治療または療法の進行をモニターするのに用いることができる。
【０１０６】
バイオマーカーはまた、疾患の治療のための療法の開発のための標的とすることができる。そのような標的は、直腸結腸癌の治療に特に応用することができる。実際、これらバイオマーカーは感受性細胞および耐性細胞において異なって発現されるので、その発現パターンはＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療に対する細胞の相対的な内生の感受性と相関関係がある。従って、耐性の細胞において高度に発現されるバイオマーカーは、ＥＧＦＲモデュレーター、とりわけＥＧＦＲインヒビターに対して耐性の腫瘍の新たな療法の開発のための標的となり得る。
【０１０７】
バイオマーカーのタンパク質および／またはｍＲＮＡは、当業者によく知られた方法を用いて決定することができる。例えば、タンパク質の定量は、ＥＬＩＳＡ、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、またはフローサイトメトリーなどの方法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、ＰＣＲ、アレイハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、インシトゥハイブリダイゼーション、ドットブロット、Taqman、またはＲＮアーゼ保護アッセイなどの方法を用いて行うことができる。
【０１０８】
マイクロアレイ
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに対する感受性かまたは耐性のいずれかと相関関係のある発現パターンを示す１またはそれ以上のバイオマーカーを含む、特別のマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイをも包含する。そのようなマイクロアレイは、腫瘍生検からの被験細胞においてバイオマーカーの発現レベルを評価し、これら被験細胞がＥＧＦＲモデュレーターに対して耐性または感受性でありそうか否かを決定するためのインビトロアッセイに用いることができる。たとえば、特別のマイクロアレイは、本明細書に記載し表１に示すバイオマーカーの全てまたはそのサブセットを用いて調製することができる。組織または器官生検からの細胞を単離し、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに暴露することができる。未処理細胞および処理細胞の両者から単離した核酸を１またはそれ以上の特別のマイクロアレイに適用した後、被験細胞の遺伝子発現パターンを決定し、マイクロアレイ上でバイオマーカーセットを作成するのに用いた細胞のコントロールパネルからのバイオマーカーパターンのものと比較することができる。試験に供した細胞からの遺伝子発現パターンの結果に基づき、該細胞が遺伝子発現の耐性または感受性プロファイルのいずれを示すかを決定することができる。ついで、組織または器官生検からの被験細胞が１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターに応答するか否か、および治療または療法の方針を、特別のマイクロアレイ分析の結果から収集した情報に基づいて決定または評価することができる。
【０１０９】
抗体
本発明はまた、１またはそれ以上のポリペプチドバイオマーカーに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体をも包含する。そのような抗体は様々な仕方で用いることができ、たとえばインビトロおよびインビボ両者での診断、検出、スクリーニング、および／または治療法を含めて、本発明のバイオマーカーを精製、検出、およびターゲティングするのに用いることができる。
【０１１０】
キット
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターを含む治療に対して患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するためのキットをも包含する。患者は、癌または腫瘍、たとえば直腸結腸癌を罹患していてよい。そのようなキットは、患者の生検腫瘍もしくは他の癌試料を試験するのに使用するため、たとえば患者の腫瘍または癌がＥＧＦＲモデュレーターを用いた所定の治療または療法に対して耐性であるかまたは感受性であるかを決定または予測するために臨床場面において有用であろう。該キットは、以下のものを入れた適当な容器を含む：ＥＧＦＲモデュレーター、とりわけＥＧＦＲインヒビターに対する耐性および感受性と相関関係のあるバイオマーカーを含む１またはそれ以上のマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ；患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに使用する１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーター；および使用の指示書。さらに、本発明によって包含されるキットは、本明細書においてさらに記載するように、当該技術分野で実施されている他の技術および系、たとえば、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（本明細書に記載する１またはそれ以上のバイオマーカーに基づいてデザインしたプライマーを使用する）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイ、イムノブロッティング、たとえば、ウエスタンブロッティング、またはインシトゥハイブリダイゼーションなどを用い、たとえば、本発明のバイオマーカーの発現をｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでモニターするための試薬または材料をさらに含んでいてよい。
【０１１１】
バイオマーカーおよびバイオマーカーセットの応用
バイオマーカーおよびバイオマーカーセットは種々の応用に用いることができる。バイオマーカーセットは、種々の生物学的系においていかなるＥＧＦＲモデュレーターの起こりそうな効果についての予測をも可能とすべく、表１に列記したバイオマーカーのいかなる組合せからも構築することができる。本明細書に記載する様々なバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、たとえば、疾患管理における診断または予後の指標として、ＥＧＦＲをモデュレートする化合物を用いた治療的介入に対して癌患者がどのように応答するかを予測するため、および全ＥＧＦＲ制御経路によるシグナル伝達をモデュレートする治療的介入に対して患者がどのように応答するかを予測するために用いることができる。
【０１１２】
本発明のバイオマーカーはＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ経路によるシグナル伝達が重要である疾患領域において、たとえば、免疫学において、または細胞のシグナル伝達および／または増殖の制御がきかなくなった癌または腫瘍においても診断および予後の両者において価値を有する。
【０１１３】
一つの態様において、患者の組織試料からの細胞、たとえば腫瘍または癌生検をアッセイして、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターで治療する前に１またはそれ以上のバイオマーカーの発現パターンを決定することができる。一つの態様において、腫瘍または癌は直腸結腸のものである。治療の成功または失敗は、被験組織からの細胞（被験細胞）、たとえば腫瘍または癌生検のバイオマーカーの発現パターンに基づき、１またはそれ以上のバイオマーカーのコントロールセットの発現パターンと比べて同じであるか異なるかで決定することができる。それゆえ、もしも被験細胞が、ＥＧＦＲモデュレーターに対して感受性の細胞のコントロールパネルでのバイオマーカーのものに対応するバイオマーカー発現プロファイルを示すなら、該患者の癌または腫瘍は該ＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療に良好に応答するであろうことの蓋然性が非常に高いあるいは予測される。対照的に、もしも被験細胞が、ＥＧＦＲモデュレーターに対して耐性の細胞のコントロールパネルのバイオマーカーのものに対応するバイオマーカー発現パターンを示すなら、該患者の癌または腫瘍は該ＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療には応答しないであろうことの蓋然性が非常に高いあるいは予測される。
【０１１４】
本発明はまた、１またはそれ以上のＥＧＦＲモデュレーターによって治療できる疾患を罹患した患者の治療をモニターする方法をも提供する。患者の組織試料、たとえば、腫瘍生検または腫瘍試料からの単離被験細胞をＥＧＦＲモデュレーターに暴露する前および暴露後に１またはそれ以上のバイオマーカーの発現パターンを決定することができ、その際、ＥＧＦＲモデュレーターは好ましくはＥＧＦＲインヒビターである。その結果得られた治療の前および治療後の被験細胞のバイオマーカー発現プロファイルを、ＥＧＦＲモデュレーターに対して耐性または感受性のいずれかである細胞のコントロールパネルで高度に発現されるべき本明細書に記載し示した１またはそれ以上のバイオマーカーのものと比較する。それゆえ、もしも患者の応答が１またはそれ以上のバイオマーカーの発現プロファイルの相関関係に基づいてＥＧＦＲモデュレーターによる治療に対して感受性であるなら、該患者の治療予後は良好であると認定され、治療を続行することができる。また、もしもＥＧＦＲモデュレーターを用いた治療の後に被験細胞が該ＥＧＦＲモデュレーターに感受性の細胞のコントロールパネルに対応するバイオマーカー発現プロファイルに変化を示さないなら、このことは現在行っている治療を修正、変更、あるいは中止さえすべきであるとの指標となり得る。このモニタリングプロセスはＥＧＦＲモデュレーターを用いた患者の治療の成功または失敗を指摘することができ、必要に応じてまたは所望により、そのようなモニタリングプロセスを繰り返すことができる。
【０１１５】
実施例
実施例１：バイオマーカーの暫定的（Interim）分析同定
CA225-045薬動力学的試験は、難治性の転移性直腸結腸癌（mCRC）を罹患した患者でのERBITUX（cetuximab）単独療法のフェーズII無作為化予備研究（phase II randomized exploratory study）である。この試験で得られた試料からのデータの暫定的分析は、臨床試料中の前臨床的に発見されたマーカーを調べ、応答予測マーカーをデノボで同定するために行った。
【０１１６】
臨床試料
転移部位の処置前腫瘍生検から単離した４９のＲＮＡ患者試料を５つのブロックに無作為化し、U133A v2.0チップ（Affymetrix, サンタクララ、カリフォルニア）でプロファイリングした。３０／４９患者からのプロファイリングデータが、以下の基準に適合する分析に含まれていた：少なくとも２サイクルの療法の完了；応答を評価するに十分な臨床データを利用できること；生検試料中の腫瘍細胞の存在；およびチップからの良品質プロファイリングデータ。
【０１１７】
３０の患者発現プロファイルは、２４の肝臓転移および６の他の組織タイプからなっていた。３０人の患者からのBest Clinical Response情報は、４人の部分的リスポンダー（ＰＲ）、５人の安定な疾患（ＳＤ）患者および２１人の進行性疾患（ＰＤ）患者を同定した。応答の評価は、世界保健機構（ＷＨＯ）基準の修正版（Millerら、Cancer, 47: 207-214 (1981)）に従って行った。全体の応答は、標的、非標的、および新たな病変の評価に基づいて行った。部分的応答（ＰＲ）は、ベースラインのＳＰＤを基準として、標的病変の直径の積の合計（ＳＰＤ）における少なくとも５０％の低減として定義された。進行性の疾患（ＰＤ）は、治療開始または新たな病変の出現以来に記録された最小のＳＰＤを基準として、標的病変のＳＰＤにおける２５％またはそれ以上の増大として定義された。安定な疾患（ＳＤ）は、ＰＲとして認めるには十分な萎縮もなく、ＰＤとして認めるには十分な増大もないものとして定義された。
【０１１８】
遺伝子発現プロファイリング
処置前生検をＲＮＡ単離のために転移部位から得た。処置前生検からのＲＮＡの単離は、RNeasyミニキット（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア）を用いて行った。ＲＮＡの品質をAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies、ロックビル、メリーランド）を用いて28S:18SリボソームＲＮＡ比を測定することによりチェックした。全ＲＮＡの濃度を分光測光的に決定した。1μgの全ＲＮＡを用い、Affymetrix Genechip Expression Analysis Technical Manualに従ってビオチン化プローブを調製した。標的をヒトHG-U133A v2.0遺伝子チップに製造業者の指示に従ってハイブリダイズさせた。データを、MAS5.0ソフトウエアを用いて前処理した。
【０１１９】
データ分析
U133A v2.0チップ上に存在する22,215のプローブセットのうち、少なくとも２の肝臓転移組織に存在信号（present calls）を有していた17,261のプローブセットをデータ分析に含めた。データの分析は、PartekPro Pattern Recognitionソフトウエア（Partek、セントチャールズ、ミズーリ）を用いたMicrosoft ExcelまたはAnova解析で両側非均等分散（unequal variance）ｔ検定を行うことによって行った。統計解析は、17,261のプローブセットについてのシグナル強度のMAS5.0分位正規化値（quantile normalized values）を用いて行った。
【０１２０】
ｔ検定およびANOVA分析を用いたバイオマーカーの分析
第一のステップは、３０の転移腫瘍の転写プロファイルで前臨床的に同定された（図１）４２のプローブセットを調べることであった。これは、前臨床的マーカーが、ERBITUX処置の臨床的利益を受けた患者（ＰＲおよびＳＤ）と受けなかった患者（ＰＤ）とで差異的に発現されるか否かを調べるために行った。
【０１２１】
臨床的利益を受けた９人の患者と進行性の疾患を有していた２１人の患者とで両側非均等分散ｔ検定を行った。４２のうち３つのプローブセットが、９人（ＰＲ＋ＳＤ）の患者と２１人（ＰＤ）の患者とで差異的に発現される（p<0.05）。これら３つのプローブセットは、アネキシンA1（ANXA1 201012_at）、セリンプロテイナーゼインヒビタークレードB成員5（SERPINB5 204855_at）、および繊維芽細胞増殖因子受容体3（FGFR3 204379_s_at）のｍＲＮＡ発現を表している。
【０１２２】
つぎに、６４０の遺伝子の一層広範なリスト（これから４２のプローブセットを得た；図１）を調べた。６４０のプローブセットのうち６３５が17,261のプローブセット中に存在し、これらを分析に含める。これら６３５のプローブセットは、１６４の原発性未処置ＣＲＣ癌の転写プロファイルで非常に様々に発現されることが認められた。これらは結腸癌において中くらいから高レベルで発現され（アレイについての平均値の２倍、すなわち３０００発現ユニットの少なくとも１の値（at least one expression value of two times the mean value for the array, i.e., 3000 expression units））、母集団分散値（population variance value）は>0.1であった。
【０１２３】
６３５のプローブセットをCA225-045試験からの３０の転移腫瘍の転写プロファイルで調べた。６３５のプローブセットのうち３９が、９（ＰＲ＋ＳＤ）と２１（ＰＤ）とで差異的に発現される（p<0.05）ことが認められ、これらを表２に記載してある。これら３９のプローブセットのうち１９はERBITUXに対する耐性マーカーであり、これらのうち２０はERBITUXに対する感受性マーカーである（図２）。
【０１２４】
表２：ERBITUXに対する応答予測のための３９のマーカー
【表２８】
【０１２５】
【表２９】
【０１２６】
最低のｐ値に基づく上位３つのマーカーは、エピレグリン（EREG, 205767_at）、アネキシンA1（ANXA1 201012_at）、およびアンフィレグリン（AREG, 205239_at）であった。興味深いことに、エピレグリンおよびアンフィレグリンはＥＧＦＲのリガンドである。これらの個々のｍＲＮＡ発現プロファイルを調べると、これらはERBITUX処置の臨床的利益を受けた患者において一層高度に発現されているようであることが示された（図３Ａおよび図３Ｂ）。このことは、高レベルのエピレグリンおよびアンフィレグリンを有する患者は、これら２つのリガンドによって駆動されるＥＧＦＲシグナル伝達経路を特に好む（addicted）腫瘍を有することを示唆している。
【０１２７】
ＥＧＦＲの他の知られたリガンドである上皮増殖因子（EGF, 206254_at）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（TGFα, 205016_at）、betacellulin（BTC, 207326_at）、およびヘパリン結合性EGF（HB-EGF, 203821_at）の発現レベルもまた調べた。これらの発現レベルはERBITUXに対する応答との相関関係を示さなかった。
【０１２８】
３９のバイオマーカーの間の生物学的関係の決定
Ingenuity Pathway Analysisウエブベースのアプリケーション（Ingenuity Systems Inc.、マウンテンビュー、カリフォルニア）を用いて表２の３９のバイオマーカー間の生物学的関係を試験した。このアプリケーションは、タンパク質、遺伝子、複合体、細胞、組織、医薬、および疾患の間で個々にモデル化した何百万もの関係からなるキュレーテッド（curated）データベースであるIngenuity Knowledge Baseを使用する。３９の遺伝子をPathway Analysisアプリケーションにインプットした。Ingenuity Knowledge Baseは３９の遺伝子のうち２５についての情報を有していた。注目すべきことには、２５の「ネットワークに好適の（network eligible）」遺伝子のうち、１７の遺伝子がＥＧＦＲネットワークにマッピングされ（図４；１７の遺伝子に陰影を付してある）、腫瘍におけるＥＧＦＲシグナル伝達状態とERBITUXに対する応答との間に強い関連性のあることを示していた。これら３９の遺伝子の分析からは他のネットワークは浮上しなかった。これら１７の遺伝子のうち、DUSP6はERK/MAPKシグナル伝達経路の成員であり、SFNはPI3K/AKTシグナル伝達経路の成員であり、両者はＥＧＦＲシグナル伝達の下流にある２つの重要な経路である。
【０１２９】
多変量解析：
ｔ検定およびANOVA解析を用いて個々のバイオマーカーがＰＲ／ＳＤ患者をＰＤ患者から分離する能力を評価した。多変量判別分析を用い、患者応答に対する３９のマーカーの予測検出力（prediction power）を評価し、ERBITUX治療に対する応答の最良のプレディクターである変量／バイオマーカーのセットを同定した。
【０１３０】
SAS判別関数分析（SAS Scientific Discovery Solutions、リリース（release）8.02, SAS Institute Inc.、ケアリー、ノースカロライナ）を３９のマーカーのデータセットに適用した。判別関数分析を、２ステッププロセスに分けた：（１）判別関数のセットの有意さを試験する；および（２）これら関数を用いて試料対象物を対応応答グループに分類する。第一のステップは、順変数選択法（forward variable selection method）を用いたSAS「段階的（stepwise）」手順により行った。導かれた判別関数を、所定の試料の分類のため、「判別（discrim）」手順と呼ばれる第二のSAS手順に進めた。
【０１３１】
試料サイズが３０人の患者と小さい場合は、試料を別個の練習および試験データセット（training and test data sets）に区分けはしなかった。その代わり、単一のデータセットを用い、同定したバイオマーカープレディクターの予測検出力をleave-one-out cross-validation法を適用して試験した。SAS cross-validationプロトコール（これはleave-one-out cross-validation法をSASプログラムで実行するものであった）を開発し、このデータセットで行って判別関数モデルを構築するのに用いることのできるプレディクターの数を定めた。この方法は、単一バイオマーカーモデルと複バイオマーカーモデル（１５までのバイオマーカー）との比較を可能にした（図５）。単一遺伝子プレディクターモデルは、ＡＵＣ適用範囲（Receiver Operating Characteristic（ＲＯＣ）曲線下の面積：感受性と特異性との間の兼ね合い（tradeoff）を示す）により測定して0.7037の予測検出力を有することがわかった。１の面積は完全に正確な予測を表す。モデルに含まれるプレディクターの数が３つのバイオマーカーまで増えると、予測検出力は0.9まで増大する。モデルに含まれるプレディクターの数が３を超えると、予測検出力が低減する傾向がある。これら結果は、最良の予測検出力が３９のバイオマーカーからの３のバイオマーカーを用いた判別関数モデルにより達成されることを示している。
【０１３２】
３９のバイオマーカーの相関：
Ingenuity Pathway Analysisは、同定した３９のバイオマーカーのうち少なくとも１７が単一の相互作用ネットワークに属することを示唆した。SAS「corr」手順を用いた相関分析を適用して、判別分析から同定した遺伝子の相関関係を調べた。表３は、SAS手順によって選択した上位プレディクターの幾つかの相関関係マトリックスの例を示す。遺伝子の幾つかは、非常に高い相関係数を示し、これら遺伝子が高い相関関係にあることを示唆した。例えば、205767_at（ＥＲＥＧ）と205239_at（ＡＲＥＧ）、または205767_at（ＥＲＥＧ）と218807_at（ＶＡＶ３）、または206754_s_at（ＣＹＰ２Ｂ６）と209260_at（ＳＦＮ）は、高い相関関係にあることがわかった。これら相関関係の高い遺伝子は、臨床的利益を受けた患者のグループと受けなかった患者のグループとの間の変動の一定の比率を説明するのに相互に交換することができた。これら結果は、Ingenuity Pathway Analysisおよび文献によって解明された可能な生物学的メカニズムとSAS手順によって決定された統計的な予測とが優れて一致することを示している。
【０１３３】
表３：判別分析の上位変数として同定された７つの最も高頻度のプローブセットに対するピアソン相関係数
【表３０】
【０１３４】
最良の予測モデル：
最良の予測モデルを、SAS段階手順を用いて決定した。205767_at（ＥＲＥＧ）が常に最初に選び出された。このことは、ＥＧＦＲリガンドであるエピレグリンの発現がＰＲ／ＳＤ患者のグループとＰＤ患者のグループとの間の変動の殆どを説明することができることを示唆している。第二のプレディクターは、第一の変量関数（プレディクター）からは説明されない変数の最大の集団を選び出すのに役立つ、等等。最良のSAS選択モデルの誤分類率（misclassification rates）は以下のとおりである：
【０１３５】
【０１３６】
バイオマーカーをまたその生物学的情報、機能的情報および同時制御（co-regulation）情報に基づいても選択し、得られた予測関数を用い、SAS「discrim」手順を使用して３０の試料のデータセットを分類した。このアプローチを用い、バイオマーカー変数の幾つかの最適の組合せおよび対応する誤分類率を同定した。例えば、以下のようである：
【０１３７】
【０１３８】
実施例２：暫定的分析後のバイオマーカーの同定
上記のように、CA225-045薬動力学的試験は、難治性の転移性直腸結腸癌（mCRC）を罹患した患者でのERBITUX（cetuximab）単独療法のフェーズII無作為化予備研究である。この試験には１１１人の患者が登録された。治療の最初の３週について標準cetuximab投与処方を続け、その後、患者は＞グレード２の皮膚発疹のないのを条件として各３週毎に400mg/m2の最大投与量まで投与量を段階的に拡大していく資格があった。処置前フェーズの間、全ての患者は１８ゲージの針で単一の転移病変を３回通過させることを含む腫瘍生検手順を受けた。２つの前処置コア（core）針生検をRNALaterの単一チューブに室温にて貯蔵し、一つのコア針生検をその後の分析のためホルマリン固定し、パラフィン埋設した。全ての患者はまた前処置採血をも受けた。全ての試料は、適当なインフォームドコンセントおよびＩＲＢ承認を受けた患者から得た。
【０１３９】
腫瘍応答は、改変世界保健機構基準（Millerら、Cancer, 47, 207-214 (1981)）に従い、９週毎（治療の１サイクル）に評価した。全体の応答は、標的、非標的、および新たな病変の評価に基づいて行った。この分析のため、完全な応答（ＣＲ）または部分的応答（ＰＲ）または安定な疾患（ＳＤ）を経験した患者は疾患対照群として分類し；進行性の疾患（ＰＤ）および選択決定不能（ＵＴＤ）患者は非リスポンダーとして分類した。分析の非リスポンダー群に含まれていたＵＴＤ患者は、応答の評価の前に死亡した患者であった。他の全てのＵＴＤ患者は分析から除外された。
【０１４０】
ＲＮＡおよびＤＮＡ抽出：
各患者の腫瘍試料のため、ＲＮＡおよびＤＮＡを、生検手順の日から７日以内にRNALaterの単一のチューブで室温にて得た２つの前処置コア針生検から単離した。ＲＮＡの単離は、RNeasyミニキット（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア）を用いて行った。ＲＮＡの品質をAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies、ロックビル、メリーランド）を用いて28S:18SリボソームＲＮＡ比を測定することによりチェックした。ＤＮＡの単離は、DNeasyミニキット（Qiagen）を用い、ＲＮＡ単離手順の際に回収したフロースルーから行った。ＲＮＡおよびＤＮＡの濃度を分光測光的に決定した。
【０１４１】
遺伝子発現プロファイリングおよび統計的解析：
十分なＲＮＡが利用できる各試料について、1μgの全ＲＮＡを用い、Affymetrix GeneChip Expression Analysis Technical Manualに従ってビオチン化プローブを調製した。標的をヒトHG-U133A v2.0遺伝子チップに製造業者の指示に従ってハイブリダイズさせた。データを、MAS5.0ソフトウエア（Affymetrix, サンタクララ、カリフォルニア）を用いて前処理し、統計解析をシグナル強度の分位正規化値を用いて行った。単変量解析を両側非均等分散ｔ検定を用いて行った。多変量解析のため、試料を練習セットと試験セットとに50-50に無作為に区分けした。上位候補プレディクターをｔ検定を用いて練習セットから選択した。このつぎに段階的判別分析（v8.2, SAS、ケアリー、ノースカロライナ）を用いたモデル構築を行った。１０倍cross validationを用いてクラス予測を評価した。練習セットから開発したモデルを試験セットを用いて評価した。
【０１４２】
臨床研究からのＲＮＡのプロファイリングに加えて、１６４の原発性結腸直腸癌の発現データベース（Banerjeaら、Mol. Cancer, 3, 21 (2004)）を調べて潜在的な予測マーカーを同定した。ついで、上記結果に記載したフィルタリングステップを経た６４０のプローブセットからのデータを、クラスターを用いた教師なし平均連結階層的クラスタリングに供し、その結果をTREEVIEWを用いて示した。
【０１４３】
遺伝子発現分析のためのＲＴ−ｑＰＣＲ：
ＲＮＡが利用できる各試料について、約100ngのＲＮＡをMultiScribe Reverse Transcriptase（TaqMan Reverse Transcription Reagents、Applied Biosystems Inc. (ABI)、フォスターシティー、カリフォルニア）を用いたランダムプライミング法により、製造業者の指示に従ってｃＤＮＡに変換した。得られたｃＤＮＡを、アンフィレグリン遺伝子（Hs00155832_m1）およびエピレグリン遺伝子（Hs00154995_m1）に対して向けられたABI Assay-on-Demandプライマー／プローブセットを用い、ABI 7900HT Sequence Detection Systemで測定した。相対的な発現レベルをΔＣｔ法（２回の反応の平均値を、内部標準として用いたGAPDH（Hs001266705_g1）と比較した）を用いて計算した。この実験デザインでは、低ΔＣｔは高発現レベルに対応する。
【０１４４】
ヌクレオチド配列分析：
ＥＧＦＲ、Ｋ−ＲＡＳ、およびＢＲＡＦの突然変異分析を、腫瘍試料から単離した利用できるゲノムＤＮＡを用いて行った。ＥＧＦＲエクソン１８−２１（ＴＫドメインをコードする）に使用したプライマーは以前に公開されている（Lynchら、N. Engl. J. Med., 350, 2129-2139 (2004)）。Ｋ−ＲＡＳのエクソン２およびＢＲＡＦのエクソン１５の評価に用いたプライマーは以下のとおりであった：
Ｋ−ＲＡＳ F 5'-TAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3'（配列番号257）および
Ｋ−ＲＡＳ R 5'-TGGTCCTGCACCAGTAA TATGC-3'（配列番号258）；
ＢＲＡＦ F 5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3'（配列番号259）および
ＢＲＡＦ R 5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'（配列番号260）。
ＰＣＲを以前に記載された条件を用いて行った（Chenら、Hum. Mutat., 27, 427-435 (2006)）。ＰＣＲ断片をQIAquick PCR Purification Kit（Qiagen）で清浄にし、ABI 3100A Capillary Genetic Analyzer（Applied Biosystems Inc.）でシークエンシングし、ついでへテロ接合性突然変異の存否についてセンスおよびアンチセンスの両方向で分析した。ＤＮＡ配列の分析を、SEQUENCHER v4.2（Gene Codes、アンアーバー、ミシガン）を用い、ついで２人の独立した観察者による各電気泳動図の視覚分析により行った。評価した各エクソンには適当な正の対照および負の対照が含まれていた。突然変異分析は、腫瘍応答を含む臨床結果の知見なしに行った。
【０１４５】
結果
患者の特徴および臨床結果：
本研究の主たる目的は、ＣＲＣにおけるcetuximab療法に対する応答予測マーカーを同定することであった。評価可能なＲＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／または血漿試料は１１１人の患者からの１０３人の患者について利用できた。これら１０３人の患者についての目的とする応答決定は以下のとおりであった：１人の完全な応答（ＣＲ）、６人の部分的な応答（ＰＲ）、２８人の安定な疾患（ＳＤ）、５６人の進行性の疾患（ＰＤ）、および最初のＸ線撮影の前に死去し、それゆえ決定できなかった１２人の患者（ＵＴＤ）。患者の３４％は応答するかまたは疾患が安定していたのに対し、残りの６６％は非リスポンダーとして分類された。
【０１４６】
腫瘍由来ＲＮＡのゲノム分析：
疾患制御グループと非リスポンダーグループとの間で差異的に発現される遺伝子を同定するため、９５の前処置生検から単離したＲＮＡについて遺伝子発現プロファイリングを行った。生検の７０％は肝臓の転移組織から採取したものであり、生検の３０％は非肝臓組織部位から採取したものであった。９５の試料のうち９１から＞500ngのＲＮＡが得られ、１０のブロックに無作為化し、U133A v2.0チップ（Affymetrix）でプロファイリングした。８７人の患者から高品質転写プロファイリングデータが得られた。７人の患者は、最初の評価の前に本研究を辞退したか、過敏症となったか、または同意を取り下げたかのいずれかの理由によりさらなる分析から排除した。残りの８０人の患者について最良の臨床応答評価を用いて最終データ分析を行い、これら患者からの発現プロファイルを統計解析に含めた。これら患者は、１人のＣＲ、５人のＰＲ、１９人のＳＤ、４３人のＰＤ、および１２人のＵＴＤを含んでいた。
【０１４７】
全部で22,215のプローブセットから転写データをフィルタリングすることにより、１６４の原発性結腸直腸癌の独立のセットにおいて様々に発現した遺伝子の最初の候補セットを同定した。このフィルタリングから、結腸癌において中くらいから高レベルで発現され（アレイについての平均値の２倍すなわち３０００発現ユニットの少なくとも１の発現値）、母集団分散値は＞0.1であった。これら６４０のプローブセットはＣＲＣ腫瘍の母集団にわたって非常に動的な範囲の発現を有し、患者選択に有用なマーカーを与えそうなことが提案された。１６４の原発性結腸癌にわたる６４０のプローブセットの教師なし階層的クラスタリングは、cetuximabへの応答を予測できる生物学的に興味のもたれる遺伝子が結腸直腸癌のサブセットにおいて優先的に発現されることを示した（図６）。図６において、１６４の腫瘍を３つの主要なクラスに分けた（クラス１、２および３）。６４０のプローブセットを５つのクラスター（Ａ〜Ｅとして識別した）に分けた。クラスターＡはＣＥＡＣＡＭ６およびＣＤ２４などの癌抗原を含むが、ＥＧＦＲリガンドであるＥＲＥＧおよびＡＲＥＧをも含む。クラスターＡはクラス１ａで最も高度に発現され、１６４の結腸直腸腫瘍試料の約２５％を占めていた。
【０１４８】
22,215のプローブセットのうち、肝臓転移患者試料の少なくとも１０％で発現することの認められた17,137のプローブセットについてデータ分析を行った。以前に同定した６４０のプローブセットのうち６２９が17,137のプローブセットのリストに存在していた。その遺伝子発現プロファイルを８０人の患者からのデータで調べ、応答評価と相関させた。表４に示すように、６２９のプローブセットのうち１２１が疾患制御を有する２５人の患者と５５人の非リスポンダーとの間で差異的に発現された（p＜0.05；疾患グループ（ＣＲ、ＰＲ、ＳＤ）と非リスポンダーとのｔ検定）。
【０１４９】
表４：疾患制御を有する２５人の患者と５５人の非リスポンダーとの間で差異的に発現されたプローブセット、p＜0.05
【表３１】
【０１５０】
【表３２】
【０１５１】
【表３３】
【０１５２】
【表３４】
【０１５３】
【表３５】
【０１５４】
【表３６】
【０１５５】
【表３７】
【０１５６】
【表３８】
【０１５７】
最低のｐ値に基づく上位３つのマーカーは、５'ヌクレオチダーゼecto（CD73, 203939_at）、エピレグリン（EREG, 205767_at）およびアンフィレグリン（AREG, 205239_at）であった。ＣＤ７３は、結腸癌細胞株および膵臓癌において予後的価値のあるプリン代謝酵素である（Erogluら、Med. Oncol., 17, 319-324 (2000); Giovannettiら、Cancer Res., 66, 3928-3935 (2006)）。そのｍＲＮＡプロファイルを調べると、それが非リスポンダーグループで一層高度に発現されることが示された。エピレグリンおよびアンフィレグリンはＥＧＦＲのリガンドである（SinghおよびHarris, Cell Signal, 17, 1183-1193 (2005)）。それらの個々のｍＲＮＡ発現プロファイルを調べると、それらは疾患制御グループ中の患者において一層高度に発現されることが示された（図７Ａおよび図７Ｂ）。図７Ａおよび図７Ｂは、ＥＧＦＲリガンドであるエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡレベルを提供する。エピレグリン（EREG, 205767_at）およびアンフィレグリン（AREG, 205239_at）のAffymetrix ｍＲＮＡレベルをｙ軸にプロットしてある。疾患制御グループ（ＣＲ、ＰＲおよびＳＤ）と非リスポンダーグループとの間で遺伝子発現レベルに統計的に有意の差がある（ＥＲＥＧ p=1.474e-05、ＡＲＥＧ p=2.489e-05）。この結果は、高レベルのエピレグリンおよびアンフィレグリンを有する患者は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を特に好む腫瘍を有すること、それゆえcetuximabでの治療に対して疾患制御を最も経験しやすいことを示唆している。
【０１５８】
上記遺伝子フィルタリングアプローチに加えて、デノボ分析を同じ８０人の患者の転写プロファイルに対して行った。両側非均等分散ｔ検定を17,137の全てのプローブセットに対して行った。上位１０の遺伝子を表５に示す。
【０１５９】
表５：デノボ分析からの上位１０の遺伝子
【表３９】
【０１６０】
最低のｐ値に基づいて上記の上位１０の遺伝子を調べると、再びＥＲＥＧおよびＡＲＥＧが上位の感受性マーカーであることがわかった。ＣＤ７３、二重特異性ホスファターゼ４（DUSP4, 204015_s_atおよび204014_at）、プレクストリン相同様ドメインＡ１（PHLDA1, 217999_s_at）は、上位の耐性マーカーであることがわかった。ＥＧＦＲの他の知られたリガンドである上皮増殖因子（EGF, 206254_at）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（TGFα, 205016_at）、betacellulin（BTC, 207326_at）およびヘパリン結合性EGF（HB-EGF, 203821_at）の発現レベルもまた調べた。これらの発現レベルはcetuximabに対する応答との相関関係を示さなかった。ＥＧＦＲ（201983_s_at）ｍＲＮＡレベルとcetuximabに対する応答との間に相関関係が認められなかったことも注目するに値した。これら結果は、この臨床研究から集めた転写プロファイリングデータのみを用いたデノボ分析が候補マーカーＡＲＥＧおよびＡＲＥＧを見出し得たことを示唆している。しかしながら、複数の試験結果の比較を仮定すれば（given the issue of multiple test comparisons）、上記の独立のフィルタリングアプローチを用いたＥＲＥＧおよびＡＲＥＧの同定は、それらがcetuximab応答を予測するための候補であることのさらなる支持を付与するものである。
【０１６１】
ｔ検定解析から、個々のバイオマーカーが疾患制御グループを非リスポンダーから分離する能力を評価することができた。判別関数分析を用い、cetuximab治療で疾患制御の最良のプレディクターである変数のセットを同定するため、患者応答の上位１００の候補マーカーのセットの予測検出力を評価した。種々の多遺伝子モデルのＡＵＣ（リシーバーオペレーティングキャラクタリスチック曲線下の面積）値は、モデル中の遺伝子数が１から１５に増えてもモデルの予測検出力は向上しないことを示した。単一遺伝子モデルのＡＵＣ値は＞0.8であった。最も頻繁に同定された遺伝子であるＥＲＥＧおよびＡＲＥＧの性能を個々のプレディクターとして評価すべく独立の試験を行った。ＥＲＥＧは0.845のＡＵＣ値を有し、ＡＲＥＧは0.815のＡＵＣ値を有し、これらがともに患者選択の非常に強力な予測マーカーであることを示していた（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【０１６２】
候補マーカーエピレグリンおよびアンフィレグリンの分析：
最終的により一層容易に診断試験に移すことのできる異なる技術プラットホーム（technology platform）で遺伝子発現を独立に確認するため、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ転写レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲ TaqManアッセイを用いて測定した。これら遺伝子の発現レベルを、アッセイベースの方法およびｑＲＴ−ＰＣＲ法の両者を用いて７３人の患者からの腫瘍試料について得た（表６）。
【０１６３】
表６：定量的ＲＴ−ＰＣＲ TaqManアッセイによるアンフィレグリンおよびエピレグリンの発現レベル
【表４０】
【０１６４】
【表４１】
【０１６５】
【表４２】
【０１６６】
２つの方法の間に良好な相関関係があり（log2-変換アレイデータについて、ピアソン＞0.85、R2＞0.7）、アンフィレグリンおよびエピレグリンの両者についてAffymetrixアレイでの高発現はTaqManアッセイからの低ΔＣｔ値に対応していた（図９）。
【０１６７】
腫瘍生検および全血から単離したＤＮＡの遺伝子分析：
ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインにおける体細胞突然変異は、ＮＳＣＬＣにおいてgefitinibおよびerlotinibに対する感受性と強い相関関係を有することがわかっている（Janneら、J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)）。ＥＧＦＲ ＴＫドメインにおける体細胞突然変異は、cetuximabに対する応答に必要ではなく、cetuximabへの応答を予測するようにも思われないことが報告されている（Tsuchihashiら、N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)）。Ｋ−ＲＡＳにおける体細胞突然変異はＮＳＣＬＣにおいてgefitinibおよびerlotinibに対する感受性の欠如と相関関係を有するが、ＣＲＣでのcetuximab感受性における役割は定かではない（Moroniら、Lancet Oncol., 6, 279-286 (2005); Paoら、PLoS Med., 2, e17 (2005)）。８０の腫瘍生検からのＤＮＡを、ＥＧＦＲ、Ｋ−ＲＡＳおよびＢＲＡＦにおける突然変異について評価した。ＥＧＦＲキナーゼドメインおよびＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５のいずれにおいてもへテロ接合性突然変異は一つも検出されなかった。コドン１２および１３に影響を及ぼすＫ−ＲＡＳエクソン２の突然変異が、分析した８０の試料のうちの３０（３８％）において検出された（表６）。Ｋ−ＲＡＳ突然変異は、試験した２７人の疾患制御グループ（５人のＰＲおよび２２人のＳＤ）のうち３人（１１％）の安定疾患患者においてのみ検出された。一方、Ｋ−ＲＡＳ突然変異は５３人の非リスポンダーのうち２７人（５１％）において検出された。このデータは明らかにＫ−ＲＡＳ突然変異の存在がcetuximab療法への応答の欠如と相関関係を有することを示している。
【０１６８】
検討：
前処置生検の分析から得られる鍵となる知見は、その腫瘍がＥＧＦＲリガンドであるエピレグリンおよびアンフィレグリンを高レベルで発現する患者はcetuximab療法の利益を受ける傾向が強いということである。加えて、その腫瘍がＫ−ＲＡＳ突然変異を有しない患者はＫ−ＲＡＳ突然変異を有する患者に比べて有意に高い疾患制御を有することもわかった。
【０１６９】
ＥＧＦＲリガンドであるエピレグリンおよびアンフィレグリンの遺伝子は、染色体4q13.3上の同部位にある（co-localized）（Contiら、Mol. Endocrinol., 20, 715-723 (2006)）。エピレグリンおよびアンフィレグリンの発現は協調的に制御されている（coordinately regulated）ことが観察された（ピアソン係数＝0.85）。エピレグリンはＥＧＦリガンドに比べてＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ４に弱く結合することが知られているが、ＥＧＦよりも遙かに強力なマイトジェンであり、レセプター活性化の長期化状態に導く（Shellyら、J. Biol. Chem., 273, 10496-10505 (1998)）。エピレグリンおよび／またはアンフィレグリンの上昇した発現は、ＥＧＦＲを介した自己分泌ループ（autocrine loop）を刺激することにより腫瘍の増殖および生存において重要な役割を果たしている。このことは、「ＥＧＦＲ依存性」である腫瘍、それゆえリガンド−レセプター相互作用を阻止するcetuximabの能力に対する感受性を特徴付けているかもしれない。L2987細胞におけるエピレグリンおよびアンフィレグリンの構成的な発現がＥＧＦＲインヒビター処置により低減し、ＥＧＦ処置によって刺激されること、およびcetuximab処置がL2987細胞の増殖を阻止することの観察は、これらＥＧＦＲリガンドが活性化ＥＧＦＲ経路およびおそらく自己分泌スティミュレーターの指標であるとの仮説を支持するものである。この仮説はまた、エピレグリンおよびアンフィレグリン並びにＥＲＢＢ３の高発現がＥＧＦＲ活性化に依存しているという肺癌マウスモデルにおける結果によっても支持されている（Fujimotoら、Cancer Res., 65, 11478-11485 (2005)）。
【０１７０】
エピレグリンおよびアンフィレグリンのＲＮＡ発現がタンパク質ベースのアッセイに翻訳されないという知見は驚くべきことではない。これらｍＲＮＡ転写物は膜結合前駆体の形態をコードしており、該前駆体は最終的に開裂されて可溶性の形態を生成する。アンフィレグリンの場合、膜結合したイソ型並びに可溶性形態はいずれも生物学的に活性であり、ジュクスタ分泌（juxtacrine）、自己分泌またはパラ分泌シグナル伝達を誘導することが示されている（SinghおよびHarris, Cell Signal, 17, 1183-1193 (2005)）。これら知見とは対照的に、上昇した血清レベルのアンフィレグリンおよびＴＧＦαが、進行したＮＳＣＬＣ患者においてgefitinibに対する悪い応答を予測すると報告されていることに注目するのは興味深いことである（Ishikawaら、Cancer Res., 65, 9176-9184 (2005)）。この研究に記載された高血清レベルのアンフィレグリンおよびＴＧＦαを有する患者の腫瘍が、増殖や生存のためのＥＧＦＲシグナル伝達への依存性を迂回させることを可能とするＫ−ＲＡＳ突然変異などの他の遺伝子異常型を有するかは、未だ決定されていない。
【０１７１】
エピレグリンおよびアンフィレグリンは、cetuximabに感受性の他の腫瘍タイプを同定するのに用いることができる。エピレグリンおよびアンフィレグリン発現は、アンドロゲン非依存性の前立腺癌において、およびアンドロゲン感受性の前立腺癌異種移植における精線除去後に増大する（Torringら、Prostate, 64, 1-8 (2005); Torringら、Anticancer Res., 20, 91-95 (2000)）。エピレグリン発現は、それが細胞増殖を刺激する膵臓癌において（Zhuら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 273, 1019-1024 (2000)）、およびそれが生存と相関関係を有する膀胱癌患者において（Thogersenら、Cancer Res., 61, 6227-6233 (2001)）一層高い。アンフィレグリンの上昇した発現は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における全体的な生存と有意の相関関係を有することがわかっている（Fontaniniら、Clin. Cancer Res., 4, 241-249 (1998)）。アンフィレグリン発現はＥＲＢＢレセプターを発現する複数のミエローマ細胞において高く、その増殖を促進する（Mahtoukら、Oncogene, 24, 3512-3524 (2005)）。最近、高レベルの黄体形成ホルモンがエピレグリンおよびアンフィレグリンの刺激（これが今度はマイトジェン性のＥＧＦＲシグナル伝達を刺激し得る）により卵巣癌および乳癌のリスクを上昇させることがわかった（Freimannら、Biochem. Pharmacol., 68, 989-996 (2004)）。最後に、ＥＧＦＲおよびエストロゲンレセプター（ＥＲα）がアンフィレグリンの発現を媒体するとの観察（Brittonら、Breast Cancer Res. Treat., 96, 131-146 (2006)）は、乳癌患者のサブセット（ＥＧＦＲ＋、ＥＲ＋、アンフィレグリン＋）はcetuximab療法の利益を受けるかもしれないことを示唆している。taxotereを併用してＥＧＦＲインヒビターgefitinibによる処置を受けた転移性乳癌患者のうち、ＥＲ陽性の腫瘍の方がＥＲ陰性の腫瘍よりも有意に良好な応答率が認められたことは注目すべきである（Ciardielloら、Br. J. Cancer, 94, 1604-1609 (2006)）。
【０１７２】
これら２つのＥＧＦＲリガンドがcetuximabに対する応答を予測するとの観察に加えて、Ｋ−ＲＡＳ突然変異のない患者（４８％）はＫ−ＲＡＳ突然変異を有する患者（１０％）よりも高い疾患制御率を有することがわかった。この結果は、Ｋ−ＲＡＳ突然変異のない患者（７６％）はＫ−ＲＡＳ突然変異を有する患者（３１％）よりも高い疾患制御率を有することを示す最近報告された研究（Lievreら、Cancer Res., 66, 3992-3995 (2006)）からの知見を確認するものである。興味深いことに、以前の研究に記載された患者の殆どはcetuximabと化学療法剤との併用療法で処置されており、Ｋ−ＲＡＳ突然変異が単独療法および併合療法の両場面で疾患の進行性を予測することを示唆している。Ｋ−ＲＡＳは、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路（ＥＧＦＲおよび他の増殖因子レセプターの下流に位置する）において重要な役割を果たしており、細胞増殖に関与している。Ｋ−ＲＡＳ中の活性化突然変異の存在は、cetuximabの抑制活性を妨害することが予期される。Ｋ−ＲＡＳ突然変異はまた、ＮＳＣＬＣにおいてgefitinibおよびerlotinibに対する耐性と相関関係があることもわかっている（Paoら、PLoS Med., 2, e17 (2005)）。これらデータはcetuximabおよび／または他のＥＧＦＲインヒビターに対する応答を予測するうえでのＫ−ＲＡＳ突然変異の役割を一貫して支持しており、ＣＲＣ、ＮＳＣＬＣおよび膵臓癌などのＲＡＳ突然変異が一般的である癌において評価が継続されなければならない（Minamotoら、Cancer Detect. Prev., 24, 1-12 (2000)）。
【０１７３】
ＮＳＣＬＣ患者で観察されたこと（Janneら、J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)）とは対照的に、このＣＲＣ研究に登録された患者においてＥＧＦＲ遺伝子（エクソン１８−２１）の突然変異は検出されず、ＣＲＣ患者での突然変異の少なさ（paucity）が確認された（Tsuchihashiら、N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)）。ＢＲＡＦ（エクソン１５）に突然変異は検出されなかったが、そのような突然変異は他の研究では低頻度（＜５％）で観察された（Moroniら、Lancet Oncol., 6, 279-286 (2005)）。ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の増大が本研究で評価した患者の１０％未満で観察され、疾患制御を有する患者における一層高いコピー数への傾向があったが、結果はMoroniらのもの（患者の３１％が増幅を有していた）よりもLievreらのもの（患者の１０％が増幅を有していた）に沿っていた。Ｋ−ＲＡＳ突然変異状態とエピレグリンｍＲＮＡ発現との組合せを用いたモデルの性能の評価は、優れた予測検出力（0.89のＡＵＣ値）を示した。
【０１７４】
実施例３：バイオマーカーに対する抗体の製造
バイオマーカーに対する抗体は種々の方法により調製することができる。例えば、バイオマーカーポリペプチドを発現している細胞を動物に投与して、該発現されたポリペプチドに対して向けられたポリクローナル抗体を含む血清の産生を動物に誘発することができる。一つの側面において、当該技術分野で一般に行われている技術を用い、バイオマーカータンパク質を調製および単離し、あるいは精製して天然の混入物を含まないようにする。ついで、発現され単離されたポリペプチドに対して高い比活性を有するポリクローナル抗血清を製造するため、そのような調製物を動物に導入する。
【０１７５】
一つの側面において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはそのタンパク質結合フラグメント）である。バイオマーカーポリペプチドを発現する細胞はいずれかの適当な組織培養培地にて培養できるが、10%ウシ胎仔血清（約56℃で不活化したもの）を含むように補充し、約10g/lの非必須アミノ酸、約1,00U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプトマイシンを含むように補充したEarle改変Eagle培地で細胞を培養するのが好ましい。
【０１７６】
免疫した（およびブースター投与した）マウスの脾細胞を抽出し、適当なミエローマ細胞株と融合することができる。いずれの適当なミエローマ細胞株をも本発明に従って用いることができるが、ＡＴＣＣ（マナサス、バージニア）から入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２／０）を用いるのが好ましい。融合後、Wandsら（1981, Gastroenterology, 80:225-232）によって記載されているように、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的に維持し、ついで限界希釈によりクローニングする。ついで、そのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、ポリペプチド免疫原またはその部分に結合することのできる抗体を分泌する細胞クローンを同定する。
【０１７７】
別法として、抗イディオタイプ抗体を用いる２工程法においてバイオマーカーポリペプチドに結合することのできるさらなる抗体を製造することができる。そのような方法は、抗体自身が抗原であること、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることができるとの事実を用いるものである。この方法によれば、タンパク質特異的抗体を用いて動物、好ましくはマウスを免疫することができる。ついで、そのような免疫した動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を製造し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングしてタンパク質特異的抗体に結合する能力が該ポリペプチドによって阻止され得る抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体はタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の生成を誘発するのに用いることができる。
【０１７８】
実施例４：免疫蛍光アッセイ
以下の免疫蛍光プロトコールを、例えば、細胞上のＥＧＦＲバイオマーカータンパク質発現を確認するため、または、例えば、細胞の表面に発現されたＥＧＦＲバイオマーカーに結合する１またはそれ以上の抗体の存在についてチェックするために用いることができる。簡単に説明すると、カルシウムおよびマグネシウムを含むDPBS（DPBS++）中の10μg/mlのウシコラーゲンII型でLab-Tek IIチャンバスライドを4℃にて一夜コーティングする。ついで、スライドを冷DPBS++で２回洗浄し、全容量125μlの8000 CHO-CCR5または CHO pC4トランスフェクション細胞を播種し、95%酸素/5%二酸化炭素の存在下、37℃でインキュベートする。
【０１７９】
培地を吸引により穏やかに除去し、吸着した細胞をDPBS++で周囲温度にて２回洗浄する。スライドを0.2%BSA（ブロッキング剤）を含有するDPBS++で0-4℃にて1時間ブロッキングする。ブロッキング溶液を吸引により穏やかに除去し、125μlの抗体含有溶液（抗体含有溶液は、例えば、ハイブリドーマ培養上澄み液（通常、希釈せずに用いる）、または血清／血漿（通常、希釈する、たとえば約1/100の希釈）であってよい）を加える。スライドを0-4℃にて1時間インキュベートする。ついで、抗体溶液を吸引により穏やかに除去し、細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で５回洗浄する。つぎに、ブロッキング溶液中のローダミン標識二次抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ）（125μl、1μg/ml）を細胞に加える。再び、細胞を0-4℃にて1時間インキュベートする。
【０１８０】
ついで、二次抗体を吸引により穏やかに除去し、細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で３回、ついで冷DPBS++で５回、洗浄する。ついで、細胞をDPBS++中の3.7%ホルムアルデヒド（125μl）で周囲温度にて15分間固定化する。その後、細胞を400μlのDPBS++で周囲温度にて５回洗浄する。最後に、細胞を50%水性グリセリンに入れ、ローダミンフィルターを用いて蛍光顕微鏡で観察する。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】本明細書に記載のバイオマーカーを同定するのに用いるスキームの模式図である。
【０１８２】
【図２】本明細書に記載のバイオマーカーの発現プロファイリングを示す。
【０１８３】
【図３Ａ】３０人の患者でのエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡ発現プロファイルを示す。
【０１８４】
【図３Ｂ】３０人の患者でのエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡ発現プロファイルを示す。
【０１８５】
【図４】Ingenuity Pathway Analysisを用いた本明細書に記載のバイオマーカーの生物学的関係の模式図である。
【０１８６】
【図５】複バイオマーカーモデルと単一バイオマーカーモデルとの比較を示す。
【０１８７】
【図６】cetuximab応答についての候補マーカーのフィルタリングを示す。１６４の原発性結腸直腸腫瘍からの６４０のプローブセットでの発現データを教師なし階層的クラスタリングに供した。１６４の腫瘍を３つの主要なクラス（クラス１、２および３）に分けた。６４０のプローブセットを５つのクラスター（Ａ〜Ｅとして識別した）に分けた。クラスターＡはＣＥＡＣＡＭ６およびＣＤ２４などの癌抗原を含むが、ＥＲＥＧおよびＡＲＥＧをも含む。クラスターＡはクラス１ａで最も高度に発現され、１６４の結腸直腸腫瘍試料の約２５％を占めていた。
【０１８８】
【図７Ａ】８０人の患者でのエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡレベルを示す。エピレグリン（ＥＲＥＧ、205767_at）およびアンフィレグリン（ＡＲＥＧ、205239_at）のAffymetrixｍ ＲＮＡレベルをｙ軸上にプロットしてある。患者を最良の臨床応答により並べてある。疾患対照群（ＣＲ、ＰＲおよびＳＤ）と非リスポンダー群（ＥＲＥＧｐ＝１.４７４ｅ−０.５、ＡＲＥＧｐ＝２.４８９ｅ−０.５）との間には遺伝子発現レベルに統計学的有意差がある。
【０１８９】
【図７Ｂ】８０人の患者でのエピレグリンおよびアンフィレグリンのｍＲＮＡレベルを示す。エピレグリン（ＥＲＥＧ、205767_at）およびアンフィレグリン（ＡＲＥＧ、205239_at）のAffymetrixｍ ＲＮＡレベルをｙ軸上にプロットしてある。患者を最良の臨床応答により並べてある。疾患対照群（ＣＲ、ＰＲおよびＳＤ）と非リスポンダー群（ＥＲＥＧｐ＝１.４７４ｅ−０.５、ＡＲＥＧｐ＝２.４８９ｅ−０.５）との間には遺伝子発現レベルに統計学的有意差がある。
【０１９０】
【図８Ａ】患者応答の予測のためのリシーバーオペレーティングキャラクタリスチック（ＲＯＣ）曲線を示す。図８Ａは、ＥＲＥＧを用いて被験試料で予測するためのＲＯＣを提供する。ＥＲＥＧは、判別機能分析を用いた最高の単一遺伝子プレディクターであり、被験セットで０.８４５のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有し、高性能の予測を示していた。
【０１９１】
【図８Ｂ】患者応答の予測のためのリシーバーオペレーティングキャラクタリスチック（ＲＯＣ）曲線を示す。図８Ｂは、ＡＲＥＧを用いて被験セットで予測するためのＲＯＣを提供する。ＡＲＥＧ遺伝子はＥＲＥＧ遺伝子と協調して制御されることがわかっており、被験セットで０.８１５のＡＵＣを有し、これもまた単一遺伝子プレディクターとして良好な予測検出力を有すること示していた。
【０１９２】
【図９】ｑＲＴ−ＰＣＲによるＡＲＥＧおよびＥＲＥＧ Affymetrix発現の確認から得られた結果を示す。２つの方法の間に良好な相関関係（ピアソン＞０.８５、Ｒ２＞０.７）が認められた。Affymetrixアレイ上での高発現（ｙ軸）は、ＡＲＥＧおよびＥＲＥＧの両者についてTaqMan ｑＰＣＲアッセイからの低ΔＣｔ値（ｘ軸）に対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測する方法であって、
（ａ）エピレグリンおよびアンフィレグリンから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；
（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；
（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定する
ことを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の増大を示すものである方法。
【請求項２】
該少なくとも一つのバイオマーカーがエピレグリンおよびアンフィレグリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該少なくとも一つのバイオマーカーが表１から選択される少なくとも一つのさらなるバイオマーカーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該生物学的試料が癌細胞を含む組織試料であり、該組織が固定され、パラフィン埋設され、新鮮なものであり、または凍結乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、該癌細胞が突然変異Ｋ−ＲＡＳの存在を有するか否かを決定する工程を含み、その際、突然変異Ｋ−ＲＡＳの検出が該癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該ＥＧＦＲモデュレーターがcetuximabであり、該癌が結腸直腸癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測する方法であって、
（ａ）ＣＤ７３を含む少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；
（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；
（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定する
ことを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示すものである方法。
【請求項８】
該少なくとも一つのバイオマーカーが表１から選択される少なくとも一つのさらなるバイオマーカーをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該生物学的試料が癌細胞を含む組織試料であり、該組織が固定され、パラフィン埋設され、新鮮なものであり、または凍結乾燥される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、該癌細胞が突然変異Ｋ−ＲＡＳの存在を有するか否かを決定する工程を含み、その際、突然変異Ｋ−ＲＡＳの検出が該癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測する方法であって、
（ａ）エピレグリンおよびアンフィレグリンから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；
（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；
（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定する
ことを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の増大を示すものである方法。
【請求項２】
該少なくとも一つのバイオマーカーがエピレグリンおよびアンフィレグリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該少なくとも一つのバイオマーカーが表１から選択される少なくとも一つのさらなるバイオマーカーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該生物学的試料が癌細胞を含む組織試料であり、該組織が固定され、パラフィン埋設され、新鮮なものであり、または凍結乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、該癌細胞が突然変異Ｋ−ＲＡＳの存在を有するか否かを決定する工程を含み、その際、突然変異Ｋ−ＲＡＳの検出が該癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該ＥＧＦＲモデュレーターがcetuximabであり、該癌が結腸直腸癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＥＧＦＲモデュレーターの投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性を予測する方法であって、
（ａ）ＣＤ７３を含む少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し；
（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料をＥＧＦＲモデュレーターに暴露し；
（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定する
ことを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増大した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該哺乳動物が該癌の治療法に治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示すものである方法。
【請求項８】
該少なくとも一つのバイオマーカーが表１から選択される少なくとも一つのさらなるバイオマーカーをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該生物学的試料が癌細胞を含む組織試料であり、該組織が固定され、パラフィン埋設され、新鮮なものであり、または凍結乾燥される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、該癌細胞が突然変異Ｋ−ＲＡＳの存在を有するか否かを決定する工程を含み、その際、突然変異Ｋ−ＲＡＳの検出が該癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するであろう蓋然性の低下を示す、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５０５６５８（Ｐ２００９−５０５６５８Ａ）
【公表日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２８１５０（Ｐ２００８−５２８１５０）
【出願日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３３０７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２５０４４
【国際公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３３０７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２５０４４
【国際公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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