二本鎖ＲＮＡを用いた害虫駆除剤
【課題】本発明は、害虫を特異的に駆除することが可能な、ＲＮＡ干渉を利用した害虫駆除剤を提供することを目的とする。
【解決手段】特定の標的遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡであり、前記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を有する二本鎖ＲＮＡを含有し、前記標的遺伝子が害虫に含まれるものである害虫駆除剤を提供する。
【解決手段】特定の標的遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡであり、前記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を有する二本鎖ＲＮＡを含有し、前記標的遺伝子が害虫に含まれるものである害虫駆除剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ＲＮＡを有効成分とする害虫駆除剤、及び前記害虫駆除剤を用いた害虫駆除方法に関する。より詳細には、本発明は、害虫に存在する特定の標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを有効成分とする害虫駆除剤に関する。さらに本発明は、前記ＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
害虫は、人体、農作物、家畜及び家屋などの財産に対し様々な被害を及ぼすことが知られている。従来、害虫の駆除ないし害虫による被害を低減するために種々の対策が取られてきた。一般的には、昆虫の神経伝達系を阻害する物質などを有効成分とした害虫駆除剤が多く利用されている。しかし、このような従来の害虫駆除剤の場合、標的の害虫以外にも非特異的に作用するため、標的としない有益な昆虫まで殺虫することになるだけでなく、有益な微生物、植物、動物及び人体にまで悪影響を及ぼす可能性があるため問題となっている。実際に、今日では食品に含まれる残留農薬が社会的にも大きな問題となっており、標的の害虫に特異的に作用する害虫駆除剤が求められている。
【０００３】
一方、ＲＮＡ干渉とは、１９９８年に初めて報告された、二本鎖ＲＮＡと相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡが破壊される現象である（非特許文献１）。Ｆｉｒｅらの報告によると、この現象は、特定遺伝子の特定領域と相同な１００塩基対程度の２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、細胞質内でＤｉｃｅｒの働きによって導入された二本鎖ＲＮＡが２０〜２５塩基対程度の２本鎖ＲＮＡへと分解され、その後複数のタンパク質とＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し（この複合体をＲＩＳＣ：ＲＮＡ‐ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体と呼ぶ）、標的遺伝子から産出されたｍＲＮＡの相同部位と結合し強力に遺伝子発現を抑制するというものである。ＲＮＡ干渉は、導入される二本鎖ＲＮＡと標的の遺伝子との相補性により特異的に起こるため、特定の遺伝子発現を特異的に抑制することができる。現在、このようなＲＮＡ干渉を利用した遺伝子医薬などの開発が盛んに行われている。
【０００４】
害虫駆除の分野においても、ＲＮＡ干渉を利用することで特定の害虫の特定の遺伝子発現を抑制し、目的とする害虫を特異的に制御することが提案されている（特許文献１、特許文献２）。しかし、実際に効果が示された害虫は限られたものであり、特にバッタ目、ゴキブリ目に属する昆虫を効果的に殺虫することができる二本鎖ＲＮＡは開示されておらず、更なる改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１２９２０４
【特許文献２】ＷＯ２００７／０８０１２７
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６‐８１１（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述するような現状の下、本発明は、害虫を特異的に駆除することが可能な、ＲＮＡ干渉を利用した害虫駆除剤を提供することを目的とする。更に、本発明は、そのような害虫駆除剤の有効成分となり得る二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記のような課題を解決すべく発明者らは鋭意研究を重ねたところ、害虫が有する特定の遺伝子を標的遺伝子とし、それと相補的な二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することによって、効果的な殺虫作用が得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき、さらに改良を重ねた結果完成したものである。即ち、本発明は以下の害虫駆除剤及びスクリーニング法を提供する。
項１． 下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡであり、前記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を起すことができる二本鎖ＲＮＡを含有し、前記標的遺伝子が害虫に含まれるものである、害虫駆除剤：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
項２． 前記害虫が昆虫である、項１に記載の害虫駆除剤。
項３． 前記害虫がバッタ目又はゴキブリ目に属する昆虫である、項１又は２に記載の害虫駆除剤。
項４． 項１〜３のいずれかに記載の害虫駆除剤を害虫に接触させることを特徴とする、害虫駆除方法。
項５． 下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを選抜する工程を含む、害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の害虫駆除剤を使用することにより、害虫、特にバッタ目、ゴキブリ目に属する昆虫を比較的短期間に特異的且つ効果的に駆除することが出来る。よって、本発明の害虫駆除剤を使用することにより、有益な昆虫、微生物、植物及び動物などに影響を及ぼすことなく、標的の害虫のみを駆除することが出来る。従って、本発明により、人体や家畜、植物に対してより安全な害虫駆除が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｉ．害虫駆除剤
本発明の害虫駆除剤は、二本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する。前記二本鎖ＲＮＡは、害虫が有する標的遺伝子を構成する塩基配列の全部又はその一部と相補的な一本のＲＮＡ鎖（即ち、センス鎖）と前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖から構成される。当該二本鎖ＲＮＡを害虫に導入すると、ＲＮＡ干渉作用によって害虫の標的遺伝子の発現が抑制され、結果として害虫を殺虫することができ、害虫駆除が達成される。
【００１１】
ここで、害虫駆除とは、害虫を殺すことだけでなく、害虫の発生、増殖及び繁殖を抑制、阻害又は低減すること、また害虫による汚染や害虫によって媒介される感染の拡大を抑制することを意味する。
【００１２】
本発明において、害虫とは、人、家畜などの動物及び農作物などの植物に対して害を与える節足動物に属する害虫であり、好ましくは昆虫に属する害虫である。農作物に対する被害や、人に対する不快感を緩和する必要性及び本発明の害虫駆除剤がより効果的に作用するという観点から、より好ましい害虫は、バッタ目又はゴキブリ目に属する昆虫であり、例えば、バッタ目では、キリギリス科、コオロギ科、カンタン科、カネタタキ科、ケラ科、オンブバッタ科、バッタ科、ヒシバッタ科、ノミバッタ科であり、ゴキブリ目では、ゴキブリ科、チャバネゴキブリ科に属する昆虫を挙げることができ、バッタ目の中ではコオロギ科が特に好ましい。
【００１３】
本発明の標的遺伝子とは、ＲＮＡ干渉作用によって遺伝子発現の抑制対象となる遺伝子であり、具体的には害虫に存在する以下（ａ）〜（ｎ）で示される遺伝子である。
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
【００１４】
Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子とは、染色体を構成するタンパク質であるヌクレオソームの結合タンパク質１に類似したタンパク質をコードしている遺伝子である。
【００１５】
ポリＡ結合タンパク質遺伝子とは、mRNAのポリAに結合するタンパク質をコードしている遺伝子である。
【００１６】
HR3遺伝子とは、脱皮ホルモンが結合し、標的遺伝子の転写調節を行う核内受容体の遺伝子である。
【００１７】
14‐3‐3 zeta遺伝子とは、細胞周期やアポトーシスに関与するタンパク質をコードしている遺伝子である。
【００１８】
アルギニンリン酸化酵素遺伝子とは、エネルギー代謝に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である。
【００１９】
膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子とは、リン酸モノエステル結合を加水分解する膜結合型酵素の遺伝子である。
【００２０】
Cathepsin L1遺伝子とは、タンパク質分解酵素をコードしている遺伝子である。
【００２１】
Sparc遺伝子とは、細胞外マトリックスタンパク質の１つをコードする遺伝子である。
【００２２】
ヒートショックプロテイン90遺伝子とは、熱ショックタンパク質の１つをコードする遺伝子である。
【００２３】
cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素R1遺伝子とは、cAMPに依存して、タンパク質をリン酸化する酵素R1をコードする遺伝子である。
【００２４】
Wnt inhibitory factor 1 遺伝子とは、Wntシグナル経路を抑制するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２５】
Warts遺伝子とは、ヒッポシグナル経路に関与するYorkieと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２６】
Yorkie遺伝子とは、ヒッポシグナル経路に関与するWartsタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２７】
Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子とは、アポトーシスを抑制するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２８】
以上の本発明における標的遺伝子は公知であり、その配列情報も知られているため、当業者であれば公知の技術に従ってあらゆる害虫に存在する標的遺伝子に相補的な二本鎖ＲＮＡを作成することが可能である。
【００２９】
上記１４種の遺伝子から任意の１つ以上の遺伝子を選択し、標的遺伝子とすることができる。中でも標的遺伝子として好ましい遺伝子は、Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子、HR3遺伝子、14‐3‐3 zeta遺伝子、アルギニンリン酸化酵素遺伝子、Sparc遺伝子、ヒートショックプロテイン90遺伝子、cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素R1遺伝子、Warts遺伝子、Yorkie遺伝子、及びInhibitor-of-apoptosis protein遺伝子であり、より好ましくは、HR3遺伝子、ヒートショックプロテイン90遺伝子、Warts遺伝子、Yorkie遺伝子である。本発明の標的遺伝子には、前記１４種の遺伝子のホモログも含まれる。
【００３０】
本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、上記害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有するものであれば特に限定されない。
【００３１】
例えば、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、上記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する限り、標的遺伝子の全部と相補的であっても良いし、標的遺伝子の一部と相補的であってもよい。また、相補性に関しても、標的遺伝子を認識することができ、それに対してＲＮＡ干渉作用を有する限り、１００％よりも低くてもよい。二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を有するために必要な相補性は、例えば、二本鎖ＲＮＡの長さや標的遺伝子のどの部分に相補的であるかによって変化するが、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、通常９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％以上の相補性を有しており、最も好ましくは１００％の相補性を有している。
【００３２】
ここにおいて本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡが標的遺伝子と相補的であるとは、二本鎖ＲＮＡを構成する一方のセンス鎖が有する塩基配列が標的遺伝子の塩基配列と相補的であることを意味する。
【００３３】
二本鎖ＲＮＡの長さについても、上記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有し、その結果害虫を致死に至らしめる効果を有する限り特に限定されない。例えば、二本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子全体と相補的な塩基配列、即ち、標的遺伝子と同じ長さの塩基配列を有していてもよく、標的遺伝子の全塩基配列の一部の塩基配列に相当する長さを有していてもよい。一実施形態においては、二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖ＲＮＡが有する塩基配列は、好ましくは、２００塩基以上の連続する塩基配列にわたって標的遺伝子の塩基配列と相補的であり、より好ましくは４００塩基以上の連続する塩基配列にわたって相補的である。このように比較的大きな二本鎖ＲＮＡを用いる場合、細胞が有する輸送系を利用して二本鎖ＲＮＡを細胞内に取り込ませることができるため、好ましい。また、２１塩基以上２３塩基以下の塩基配列から成るｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉を誘導するために有効であることも当該技術分野において知られているが、昆虫の場合は、細胞内に能動的に取り込まれないため、それを利用する場合は、その担体（ナノパーティクル、植物組織）が必要である。よって、担体を用いる一実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２１〜２３塩基や６０〜７０塩基の長さを有することが好ましい。ここでいう塩基の数とは、標的遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数を意味する。
【００３４】
二本鎖ＲＮＡが標的遺伝子の一部と相補的である場合、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖配列を標的遺伝子のどの配列に相補的であるように設計するかは、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチ等の公知の方法を用いて決定することができる。例えば、標的遺伝子の開始コドンから約５０〜１００塩基下流のエキソン領域に存在する“ＡＡ”から始まる約１９〜３０塩基の領域であって、ＧＣ含有量が５０％前後の領域を標的の配列部分としてもよい。これは、このような領域を標的配列とすることで、優れたＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡが得られることが、当業界で経験的に知られているので、担体と用いることで有効である可能性がある。
【００３５】
二本鎖ＲＮＡは、前記センス鎖及びセンス鎖が有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖から構成される。ここで、センス鎖とアンチセンス鎖は、完全に相補的であることが好ましいが、アンチセンス鎖はセンス鎖と１又は複数の塩基が非相補的であってもよい。
【００３６】
二本鎖ＲＮＡは、全体に亘って完全に二本鎖であってもよいが、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を示す限り、部分的に一本鎖であってもよい。例えば、二本鎖ＲＮＡの３’又は５’末端が数塩基分一本鎖になっていてもよい。
【００３７】
本発明において二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を有するとは、二本鎖ＲＮＡが害虫の体内に導入された結果、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の合成が阻害されることを意味する。理論によって拘束されるのではないが、二本鎖ＲＮＡが標的の害虫の体内に取り込まれると、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、二本鎖ＲＮＡは２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡに分解される。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに取り込まれ、相同な塩基配列を有する標的遺伝子に対応するｍＲＮＡと結合し、分解することで標的遺伝子の発現を阻害すると考えられる。このような一連の反応の結果、本発明の害虫駆除剤を用いることにより、害虫を死に至らしめ、駆除することができる。従って、本発明によれば、標的の害虫に含まれる標的遺伝子の塩基配列情報を基に、その標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを設計し、それを有効成分として標的の害虫に対する害虫駆除剤を作成することができ、当該標的の害虫を駆除することができる。
【００３８】
本発明の害虫駆除剤に含有される二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子のみに対してＲＮＡ干渉作用を及ぼすように設計されてもよいが、必要に応じて複数の標的遺伝子を一度にターゲットとするように設計されてもよい。即ち、二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子が有する塩基配列のみに相補的な塩基配列を有していてもよいが、複数の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な複数の塩基配列を有していてもよい。例えば、一実施形態において、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、少なくとも２つ以上の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、別の実施形態においては、少なくとも３つ以上の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する。この場合、複数の標的遺伝子は任意に組み合せることができる。二本鎖ＲＮＡにおける、別個の標的遺伝子に対して相補的である複数の領域は、リンカー配列を介して結合されていてもよく、またリンカーを介さずに直接結合されていてもよい。
【００３９】
また二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子が有する塩基配列と相補的な塩基配列を複数コピー有していても良い。一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡは、同一の標的遺伝子であるが、由来の異なる（即ち、標的とする害虫の種類が異なる）複数の遺伝子の塩基配列と相補的な複数の塩基配列を有していてもよい。このように、異なる標的遺伝子又は同一であるが標的とする害虫が異なる複数の標的遺伝子を任意に組み合せ、それに相補的な二本鎖ＲＮＡを使用することによって、複数の害虫を一度にターゲットとすることも可能である。
【００４０】
本発明の害虫駆除剤が、特定の害虫又は害虫群だけの駆除を目的として使用される場合、本発明の二本鎖ＲＮＡは特定の害虫又は害虫群以外の生物に対してＲＮＡ干渉作用を起さないことが好ましい。従って、二本鎖ＲＮＡが有する塩基配列は特定の害虫又は害虫群以外の生物が有するＤＮＡの塩基配列と低い相同性を有することが好ましい。この場合、好ましくは、特定の害虫又は害虫群以外の生物が有するＤＮＡの塩基配列と３０％以下の相同性を有し、より好ましくは２０％以下の相同性を有し、更に好ましくは１０％以下の相同性を有する。
【００４１】
本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列情報及び公知のＲＮＡ合成技術に従って調製することができる。本発明の二本鎖ＲＮＡは、２つの一本鎖ＲＮＡを別個に合成し、これらをハイブリダイズさせる方法によって合成してもよい。また、二本鎖ＲＮＡは、発現ベクターを用いて微生物等に導入し、生物学的に合成してもよい。
【００４２】
本発明の害虫駆除剤を使用して害虫を駆除するためには、有効成分である二本鎖ＲＮＡを害虫の体内に導入させることが必要である。二本鎖ＲＮＡの導入は、当該技術分野において通常使用される任意の方法を適宜選択して行うことができる。例えば、本発明の二本鎖ＲＮＡを適切な溶液に溶解し、害虫に噴霧して体内に取り込ませてもよく、二本鎖ＲＮＡを含有する溶液を毛細管などで直接害虫に導入してもよい（インジェクション）。二本鎖ＲＮＡを昆虫の餌に混ぜ、餌状の害虫駆除剤として害虫に摂取させることもできる。本発明の二本鎖ＲＮＡを遺伝子組み換え技術を用いて害虫が摂取する微生物や植物中で合成させ、これを害虫に摂取させることによって二本鎖ＲＮＡを導入することもできる。害虫に特異的に感染するウイルスに本発明の二本鎖ＲＮＡを導入し、これを害虫駆除剤として用いて害虫に二本鎖ＲＮＡを導入してもよい。
【００４３】
本発明の害虫駆除剤は、二本鎖ＲＮＡの他に賦形剤や希釈剤などの更なる成分を含有していてもよい。本発明の害虫駆除剤は、用途に応じた剤形で用いることができ、液剤、固形剤、半固形剤、粉末剤など適宜選択することができる。
【００４４】
本発明の害虫駆除剤を用いて標的の害虫を駆除する場合、害虫個体当りに少なくとも10フェムトモルの二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することで害虫を駆除することができる。好ましくは、１００フェムトモル程度の二本鎖ＲＮＡを投与することが望ましく、より好ましくは１ピコモル程度の二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することでより確実に駆除が可能となる。
ＩＩ．害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法
本発明の一実施形態は、上記（ａ）〜（ｎ）の標的遺伝子から選択される少なくとも１つの害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを選抜する工程を含む、害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法である。上述するように、害虫が有する上記標的遺伝子にＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡは、当該標的害虫を殺す効果を有するため、本発明に従って、そのような害虫駆除剤の有効成分となる二本鎖ＲＮＡをスクリーニングすることができる。
【００４５】
害虫に含まれる標的遺伝子（ａ）〜（ｎ）の塩基配列と相補的なセンス鎖と前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖とから成る二本鎖ＲＮＡは、上述するように、遺伝子データベースにある情報を基に、公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。
【００４６】
害虫に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡの選抜は、作製した二本鎖ＲＮＡを害虫に導入し、その後の致死率を二本鎖ＲＮＡを導入していないコントロール群の害虫と比較し、有意義な致死率を示す二本鎖ＲＮＡを選別することにより行うことができる。
【実施例】
【００４７】
実施例１
コオロギｍＲＮＡの精製及び二本鎖ＲＮＡの調製
フタホシコオロギ（供試昆虫１）を用い、その胚、幼虫、成虫脳をｍＲＮＡ精製用の溶液において、均一化し、フェノールクロロフォルム処理後、エタノール沈殿にて、ｍＲＮＡを沈殿させた。得られたｍＲＮＡが分解していないことを変性ゲルを用いて確認した。その後、オリゴｄＴカラムを利用して、ｍＲＮＡのみを単離した。次に、この単離されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、パイロシークエンス法により、塩基配列を決定した。決定された配列は、データベースとして収録し、現在は、ＤＤＢＪに登録して、一般に公開している。この得られた配列情報から、ＢＬＡＳＴサーチにより、昆虫の相同遺伝子を探し、アノテーションを行った。表１は、多数の候補遺伝子のうち実際に試験を行った一部を示す。表１のＮｏ．１２〜２２の遺伝子は、細胞増殖に必須の遺伝子である。
【００４８】
【表１】
【００４９】
上記表１に示される各遺伝子と相補的な二本鎖ＲＮＡは、MEGAscript（登録商標）High Yield Transcription Kit (Ambion社製)を使用し、製造者のプロトコールに従って調製した。得られたペレット状の二本鎖ＲＮＡを風乾し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解した。吸光度測定により各溶液中の二本鎖ＲＮＡの濃度を確認した後、アガロースゲル電気泳動を用いて二本鎖ＲＮＡが精製されていることを確認した。このようにして、上記表１に示される各遺伝子の全配列と相補的な二本鎖ＲＮＡを得た。表１の遺伝子Ｎｏ．１〜１４を構成する塩基配列と相補的なＲＮＡ配列を各々配列番号１〜１４に示す。
【００５０】
実施例２
コオロギに対するＲＮＡ干渉作用の確認
実施例１で得られた各遺伝子をＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解し、２０μＭの二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を調製した。一方、ＦＬＡＭＩＮＧ／ＢＲＯＷＮＭＩＣＲＯＰＩＰＥＴＴＥ ＰＵＬＬＥＲ（ＳＵＴＴＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社製)のプログラム（１ ＨＥＡＴ＝７５０，ＰＵＬＬ＝ ，ＶＥＬ＝３０，ＴＩＭＥ＝２５０）で乾熱滅菌済みのキャピラリー（１ ｖｉａｌ ３．５” ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＃３‐０００−２０３‐Ｇ／Ｘ（ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社））から針の原型を作成した。研磨器ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ ＥＧ‐４を水で濡らしながら回転させて針先を削った。このようにして先端を尖らせたキャピラリーに前記二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を吸引し、約３０分間氷上麻酔をかけたフタホシコオロギ（３齢）の腹部の第４節と第５節の間に二本鎖ＲＮＡを２００ｎｌインジェクションした。このようにして各標的遺伝子についての二本鎖ＲＮＡを導入したコオロギを３３℃、湿度３５％で飼育し、その後の生育状態を観察した。２０日間観察した結果を以下の表２に示す。なお、事前に空試験として行った対象区のフタホシコオロギ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱ ２００ｎｌのみをインジェクション）には、２０日後も死亡個体は確認されなかった。
【００５１】
【表２】
【００５２】
表２に示す通り、遺伝子Ｎｏ．１〜１４を標的遺伝子とした二本鎖ＲＮＡを導入した場合に、有意義な割合でコオロギが致死することが分かった。特に、ＨＲ３遺伝子、Ｓｐａｒｃ遺伝子、ヒートショックプロテイン９０遺伝子、ｃＡＭＰ−依存性タンパク質リン酸化酵素Ｒ１、Ｗａｒｔｓ遺伝子、Ｙｏｒｋｉｅ遺伝子及びＩｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｏｆ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子をターゲットとすることで非常に高い致死率が得られることが分かった。
【００５３】
実施例３
ゴキブリｍＲＮＡの精製及び二本鎖ＲＮＡの調製
チャバネゴキブリ（供試昆虫２）を用い、その胚、幼虫、成虫をｍＲＮＡ精製用の溶液において、均一化し、フェノールクロロフォルム処理後、エタノール沈殿にて、ｍＲＮＡを沈殿させた。次に、この単離されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した。実施例２の結果から有効性の確認された表２のＮｏ.1〜１４の遺伝子のうち、７遺伝子を任意に選択した。選択した遺伝子を表３に示す。表３の遺伝子をチャバネゴキブリ遺伝子から単離するため、コオロギや他の昆虫の配列情報から縮重プライマーを設計し、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
【００５４】
【表３】
【００５５】
表１に示されるチャバネゴキブリ由来の各遺伝子と相補的な二本鎖ＲＮＡを、実施例１と同様にMEGAscript(登録商標)High Yield Tanscription Kit (Ambion社製)を使用して調製した。得られたペレット状の二本鎖ＲＮＡを風乾し、RNase free mQに溶解した。吸光度測定により各溶液中の二本鎖ＲＮＡの濃度を確認した後、アガロースゲル電気泳動を用いて二本鎖ＲＮＡが精製されていることを確認した。このようにして、表３に示されるチャバネゴキブリ由来の各遺伝子の全配列と相補的な二本鎖ＲＮＡを得た。表３の遺伝子Ｎｏ．２３〜２９を構成する塩基配列と相補的なＲＮＡ配列を各々配列番号１５〜２１に示す。
【００５６】
実施例４
ゴキブリに対するＲＮＡ干渉作用の確認
実施例３で得られた各遺伝子をＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解し、２０μＭの二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を調製した。一方、ＦＬＡＭＩＮＧ／ＢＲＯＷＮ ＭＩＣＲＯＰＩＰＥＴＴＥ ＰＵＬＬＥＲ（ＳＵＴＴＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社製)のプログラム（１ ＨＥＡＴ＝７５０，ＰＵＬＬ＝ ，ＶＥＬ＝３０，ＴＩＭＥ＝２５０）で乾熱滅菌済みのキャピラリー（１ ｖｉａｌ ３．５” ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＃３‐０００−２０３‐Ｇ／Ｘ（ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社））から針の原型を作成した。研磨器ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ ＥＧ‐４を水で濡らしながら回転させて針先を削った。このようにして先端を尖らせたキャピラリーに、実施例３で調製した二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を吸引し、約３０分間氷上麻酔をかけたチャバネゴキブリ（３〜４齢）の後脚基節部付近の胸部に二本鎖ＲＮＡを２００ｎｌインジェクションした。このようにして各標的遺伝子についての二本鎖ＲＮＡを導入したチャバネゴキブリを２４℃、湿度３５％で飼育し、その後の生育状態を観察した。３０日間観察した結果を以下の表４に示す。なお、事前に空試験として行った対象区のチャバネゴキブリ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱ ２００ｎｌのみをインジェクション）には、３０日後も死亡個体は確認されなかった。
【００５７】
【表４】
【００５８】
表４に示す通り、遺伝子Ｎｏ．２３〜２９を標的遺伝子とした二本鎖ＲＮＡを導入した場合に、有意義な割合でゴキブリが致死することが分かった。特に、ＨＲ３遺伝子、ヒートショックプロテイン９０遺伝子、Ｗａｒｔｓ遺伝子、Ｙｏｒｋｉｅ遺伝子をターゲットとすることで非常に高い致死率が得られることが分かった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ＲＮＡを有効成分とする害虫駆除剤、及び前記害虫駆除剤を用いた害虫駆除方法に関する。より詳細には、本発明は、害虫に存在する特定の標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを有効成分とする害虫駆除剤に関する。さらに本発明は、前記ＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
害虫は、人体、農作物、家畜及び家屋などの財産に対し様々な被害を及ぼすことが知られている。従来、害虫の駆除ないし害虫による被害を低減するために種々の対策が取られてきた。一般的には、昆虫の神経伝達系を阻害する物質などを有効成分とした害虫駆除剤が多く利用されている。しかし、このような従来の害虫駆除剤の場合、標的の害虫以外にも非特異的に作用するため、標的としない有益な昆虫まで殺虫することになるだけでなく、有益な微生物、植物、動物及び人体にまで悪影響を及ぼす可能性があるため問題となっている。実際に、今日では食品に含まれる残留農薬が社会的にも大きな問題となっており、標的の害虫に特異的に作用する害虫駆除剤が求められている。
【０００３】
一方、ＲＮＡ干渉とは、１９９８年に初めて報告された、二本鎖ＲＮＡと相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡが破壊される現象である（非特許文献１）。Ｆｉｒｅらの報告によると、この現象は、特定遺伝子の特定領域と相同な１００塩基対程度の２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、細胞質内でＤｉｃｅｒの働きによって導入された二本鎖ＲＮＡが２０〜２５塩基対程度の２本鎖ＲＮＡへと分解され、その後複数のタンパク質とＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し（この複合体をＲＩＳＣ：ＲＮＡ‐ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体と呼ぶ）、標的遺伝子から産出されたｍＲＮＡの相同部位と結合し強力に遺伝子発現を抑制するというものである。ＲＮＡ干渉は、導入される二本鎖ＲＮＡと標的の遺伝子との相補性により特異的に起こるため、特定の遺伝子発現を特異的に抑制することができる。現在、このようなＲＮＡ干渉を利用した遺伝子医薬などの開発が盛んに行われている。
【０００４】
害虫駆除の分野においても、ＲＮＡ干渉を利用することで特定の害虫の特定の遺伝子発現を抑制し、目的とする害虫を特異的に制御することが提案されている（特許文献１、特許文献２）。しかし、実際に効果が示された害虫は限られたものであり、特にバッタ目、ゴキブリ目に属する昆虫を効果的に殺虫することができる二本鎖ＲＮＡは開示されておらず、更なる改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１２９２０４
【特許文献２】ＷＯ２００７／０８０１２７
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６‐８１１（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述するような現状の下、本発明は、害虫を特異的に駆除することが可能な、ＲＮＡ干渉を利用した害虫駆除剤を提供することを目的とする。更に、本発明は、そのような害虫駆除剤の有効成分となり得る二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記のような課題を解決すべく発明者らは鋭意研究を重ねたところ、害虫が有する特定の遺伝子を標的遺伝子とし、それと相補的な二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することによって、効果的な殺虫作用が得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき、さらに改良を重ねた結果完成したものである。即ち、本発明は以下の害虫駆除剤及びスクリーニング法を提供する。
項１． 下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡであり、前記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を起すことができる二本鎖ＲＮＡを含有し、前記標的遺伝子が害虫に含まれるものである、害虫駆除剤：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
項２． 前記害虫が昆虫である、項１に記載の害虫駆除剤。
項３． 前記害虫がバッタ目又はゴキブリ目に属する昆虫である、項１又は２に記載の害虫駆除剤。
項４． 項１〜３のいずれかに記載の害虫駆除剤を害虫に接触させることを特徴とする、害虫駆除方法。
項５． 下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを選抜する工程を含む、害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の害虫駆除剤を使用することにより、害虫、特にバッタ目、ゴキブリ目に属する昆虫を比較的短期間に特異的且つ効果的に駆除することが出来る。よって、本発明の害虫駆除剤を使用することにより、有益な昆虫、微生物、植物及び動物などに影響を及ぼすことなく、標的の害虫のみを駆除することが出来る。従って、本発明により、人体や家畜、植物に対してより安全な害虫駆除が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｉ．害虫駆除剤
本発明の害虫駆除剤は、二本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する。前記二本鎖ＲＮＡは、害虫が有する標的遺伝子を構成する塩基配列の全部又はその一部と相補的な一本のＲＮＡ鎖（即ち、センス鎖）と前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖から構成される。当該二本鎖ＲＮＡを害虫に導入すると、ＲＮＡ干渉作用によって害虫の標的遺伝子の発現が抑制され、結果として害虫を殺虫することができ、害虫駆除が達成される。
【００１１】
ここで、害虫駆除とは、害虫を殺すことだけでなく、害虫の発生、増殖及び繁殖を抑制、阻害又は低減すること、また害虫による汚染や害虫によって媒介される感染の拡大を抑制することを意味する。
【００１２】
本発明において、害虫とは、人、家畜などの動物及び農作物などの植物に対して害を与える節足動物に属する害虫であり、好ましくは昆虫に属する害虫である。農作物に対する被害や、人に対する不快感を緩和する必要性及び本発明の害虫駆除剤がより効果的に作用するという観点から、より好ましい害虫は、バッタ目又はゴキブリ目に属する昆虫であり、例えば、バッタ目では、キリギリス科、コオロギ科、カンタン科、カネタタキ科、ケラ科、オンブバッタ科、バッタ科、ヒシバッタ科、ノミバッタ科であり、ゴキブリ目では、ゴキブリ科、チャバネゴキブリ科に属する昆虫を挙げることができ、バッタ目の中ではコオロギ科が特に好ましい。
【００１３】
本発明の標的遺伝子とは、ＲＮＡ干渉作用によって遺伝子発現の抑制対象となる遺伝子であり、具体的には害虫に存在する以下（ａ）〜（ｎ）で示される遺伝子である。
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
【００１４】
Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子とは、染色体を構成するタンパク質であるヌクレオソームの結合タンパク質１に類似したタンパク質をコードしている遺伝子である。
【００１５】
ポリＡ結合タンパク質遺伝子とは、mRNAのポリAに結合するタンパク質をコードしている遺伝子である。
【００１６】
HR3遺伝子とは、脱皮ホルモンが結合し、標的遺伝子の転写調節を行う核内受容体の遺伝子である。
【００１７】
14‐3‐3 zeta遺伝子とは、細胞周期やアポトーシスに関与するタンパク質をコードしている遺伝子である。
【００１８】
アルギニンリン酸化酵素遺伝子とは、エネルギー代謝に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である。
【００１９】
膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子とは、リン酸モノエステル結合を加水分解する膜結合型酵素の遺伝子である。
【００２０】
Cathepsin L1遺伝子とは、タンパク質分解酵素をコードしている遺伝子である。
【００２１】
Sparc遺伝子とは、細胞外マトリックスタンパク質の１つをコードする遺伝子である。
【００２２】
ヒートショックプロテイン90遺伝子とは、熱ショックタンパク質の１つをコードする遺伝子である。
【００２３】
cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素R1遺伝子とは、cAMPに依存して、タンパク質をリン酸化する酵素R1をコードする遺伝子である。
【００２４】
Wnt inhibitory factor 1 遺伝子とは、Wntシグナル経路を抑制するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２５】
Warts遺伝子とは、ヒッポシグナル経路に関与するYorkieと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２６】
Yorkie遺伝子とは、ヒッポシグナル経路に関与するWartsタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２７】
Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子とは、アポトーシスを抑制するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２８】
以上の本発明における標的遺伝子は公知であり、その配列情報も知られているため、当業者であれば公知の技術に従ってあらゆる害虫に存在する標的遺伝子に相補的な二本鎖ＲＮＡを作成することが可能である。
【００２９】
上記１４種の遺伝子から任意の１つ以上の遺伝子を選択し、標的遺伝子とすることができる。中でも標的遺伝子として好ましい遺伝子は、Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子、HR3遺伝子、14‐3‐3 zeta遺伝子、アルギニンリン酸化酵素遺伝子、Sparc遺伝子、ヒートショックプロテイン90遺伝子、cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素R1遺伝子、Warts遺伝子、Yorkie遺伝子、及びInhibitor-of-apoptosis protein遺伝子であり、より好ましくは、HR3遺伝子、ヒートショックプロテイン90遺伝子、Warts遺伝子、Yorkie遺伝子である。本発明の標的遺伝子には、前記１４種の遺伝子のホモログも含まれる。
【００３０】
本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、上記害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有するものであれば特に限定されない。
【００３１】
例えば、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、上記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する限り、標的遺伝子の全部と相補的であっても良いし、標的遺伝子の一部と相補的であってもよい。また、相補性に関しても、標的遺伝子を認識することができ、それに対してＲＮＡ干渉作用を有する限り、１００％よりも低くてもよい。二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を有するために必要な相補性は、例えば、二本鎖ＲＮＡの長さや標的遺伝子のどの部分に相補的であるかによって変化するが、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、通常９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％以上の相補性を有しており、最も好ましくは１００％の相補性を有している。
【００３２】
ここにおいて本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡが標的遺伝子と相補的であるとは、二本鎖ＲＮＡを構成する一方のセンス鎖が有する塩基配列が標的遺伝子の塩基配列と相補的であることを意味する。
【００３３】
二本鎖ＲＮＡの長さについても、上記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有し、その結果害虫を致死に至らしめる効果を有する限り特に限定されない。例えば、二本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子全体と相補的な塩基配列、即ち、標的遺伝子と同じ長さの塩基配列を有していてもよく、標的遺伝子の全塩基配列の一部の塩基配列に相当する長さを有していてもよい。一実施形態においては、二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖ＲＮＡが有する塩基配列は、好ましくは、２００塩基以上の連続する塩基配列にわたって標的遺伝子の塩基配列と相補的であり、より好ましくは４００塩基以上の連続する塩基配列にわたって相補的である。このように比較的大きな二本鎖ＲＮＡを用いる場合、細胞が有する輸送系を利用して二本鎖ＲＮＡを細胞内に取り込ませることができるため、好ましい。また、２１塩基以上２３塩基以下の塩基配列から成るｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉を誘導するために有効であることも当該技術分野において知られているが、昆虫の場合は、細胞内に能動的に取り込まれないため、それを利用する場合は、その担体（ナノパーティクル、植物組織）が必要である。よって、担体を用いる一実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２１〜２３塩基や６０〜７０塩基の長さを有することが好ましい。ここでいう塩基の数とは、標的遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数を意味する。
【００３４】
二本鎖ＲＮＡが標的遺伝子の一部と相補的である場合、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖配列を標的遺伝子のどの配列に相補的であるように設計するかは、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチ等の公知の方法を用いて決定することができる。例えば、標的遺伝子の開始コドンから約５０〜１００塩基下流のエキソン領域に存在する“ＡＡ”から始まる約１９〜３０塩基の領域であって、ＧＣ含有量が５０％前後の領域を標的の配列部分としてもよい。これは、このような領域を標的配列とすることで、優れたＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡが得られることが、当業界で経験的に知られているので、担体と用いることで有効である可能性がある。
【００３５】
二本鎖ＲＮＡは、前記センス鎖及びセンス鎖が有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖から構成される。ここで、センス鎖とアンチセンス鎖は、完全に相補的であることが好ましいが、アンチセンス鎖はセンス鎖と１又は複数の塩基が非相補的であってもよい。
【００３６】
二本鎖ＲＮＡは、全体に亘って完全に二本鎖であってもよいが、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を示す限り、部分的に一本鎖であってもよい。例えば、二本鎖ＲＮＡの３’又は５’末端が数塩基分一本鎖になっていてもよい。
【００３７】
本発明において二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を有するとは、二本鎖ＲＮＡが害虫の体内に導入された結果、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の合成が阻害されることを意味する。理論によって拘束されるのではないが、二本鎖ＲＮＡが標的の害虫の体内に取り込まれると、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、二本鎖ＲＮＡは２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡに分解される。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに取り込まれ、相同な塩基配列を有する標的遺伝子に対応するｍＲＮＡと結合し、分解することで標的遺伝子の発現を阻害すると考えられる。このような一連の反応の結果、本発明の害虫駆除剤を用いることにより、害虫を死に至らしめ、駆除することができる。従って、本発明によれば、標的の害虫に含まれる標的遺伝子の塩基配列情報を基に、その標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを設計し、それを有効成分として標的の害虫に対する害虫駆除剤を作成することができ、当該標的の害虫を駆除することができる。
【００３８】
本発明の害虫駆除剤に含有される二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子のみに対してＲＮＡ干渉作用を及ぼすように設計されてもよいが、必要に応じて複数の標的遺伝子を一度にターゲットとするように設計されてもよい。即ち、二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子が有する塩基配列のみに相補的な塩基配列を有していてもよいが、複数の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な複数の塩基配列を有していてもよい。例えば、一実施形態において、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、少なくとも２つ以上の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、別の実施形態においては、少なくとも３つ以上の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する。この場合、複数の標的遺伝子は任意に組み合せることができる。二本鎖ＲＮＡにおける、別個の標的遺伝子に対して相補的である複数の領域は、リンカー配列を介して結合されていてもよく、またリンカーを介さずに直接結合されていてもよい。
【００３９】
また二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子が有する塩基配列と相補的な塩基配列を複数コピー有していても良い。一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡは、同一の標的遺伝子であるが、由来の異なる（即ち、標的とする害虫の種類が異なる）複数の遺伝子の塩基配列と相補的な複数の塩基配列を有していてもよい。このように、異なる標的遺伝子又は同一であるが標的とする害虫が異なる複数の標的遺伝子を任意に組み合せ、それに相補的な二本鎖ＲＮＡを使用することによって、複数の害虫を一度にターゲットとすることも可能である。
【００４０】
本発明の害虫駆除剤が、特定の害虫又は害虫群だけの駆除を目的として使用される場合、本発明の二本鎖ＲＮＡは特定の害虫又は害虫群以外の生物に対してＲＮＡ干渉作用を起さないことが好ましい。従って、二本鎖ＲＮＡが有する塩基配列は特定の害虫又は害虫群以外の生物が有するＤＮＡの塩基配列と低い相同性を有することが好ましい。この場合、好ましくは、特定の害虫又は害虫群以外の生物が有するＤＮＡの塩基配列と３０％以下の相同性を有し、より好ましくは２０％以下の相同性を有し、更に好ましくは１０％以下の相同性を有する。
【００４１】
本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列情報及び公知のＲＮＡ合成技術に従って調製することができる。本発明の二本鎖ＲＮＡは、２つの一本鎖ＲＮＡを別個に合成し、これらをハイブリダイズさせる方法によって合成してもよい。また、二本鎖ＲＮＡは、発現ベクターを用いて微生物等に導入し、生物学的に合成してもよい。
【００４２】
本発明の害虫駆除剤を使用して害虫を駆除するためには、有効成分である二本鎖ＲＮＡを害虫の体内に導入させることが必要である。二本鎖ＲＮＡの導入は、当該技術分野において通常使用される任意の方法を適宜選択して行うことができる。例えば、本発明の二本鎖ＲＮＡを適切な溶液に溶解し、害虫に噴霧して体内に取り込ませてもよく、二本鎖ＲＮＡを含有する溶液を毛細管などで直接害虫に導入してもよい（インジェクション）。二本鎖ＲＮＡを昆虫の餌に混ぜ、餌状の害虫駆除剤として害虫に摂取させることもできる。本発明の二本鎖ＲＮＡを遺伝子組み換え技術を用いて害虫が摂取する微生物や植物中で合成させ、これを害虫に摂取させることによって二本鎖ＲＮＡを導入することもできる。害虫に特異的に感染するウイルスに本発明の二本鎖ＲＮＡを導入し、これを害虫駆除剤として用いて害虫に二本鎖ＲＮＡを導入してもよい。
【００４３】
本発明の害虫駆除剤は、二本鎖ＲＮＡの他に賦形剤や希釈剤などの更なる成分を含有していてもよい。本発明の害虫駆除剤は、用途に応じた剤形で用いることができ、液剤、固形剤、半固形剤、粉末剤など適宜選択することができる。
【００４４】
本発明の害虫駆除剤を用いて標的の害虫を駆除する場合、害虫個体当りに少なくとも10フェムトモルの二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することで害虫を駆除することができる。好ましくは、１００フェムトモル程度の二本鎖ＲＮＡを投与することが望ましく、より好ましくは１ピコモル程度の二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することでより確実に駆除が可能となる。
ＩＩ．害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法
本発明の一実施形態は、上記（ａ）〜（ｎ）の標的遺伝子から選択される少なくとも１つの害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを選抜する工程を含む、害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法である。上述するように、害虫が有する上記標的遺伝子にＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡは、当該標的害虫を殺す効果を有するため、本発明に従って、そのような害虫駆除剤の有効成分となる二本鎖ＲＮＡをスクリーニングすることができる。
【００４５】
害虫に含まれる標的遺伝子（ａ）〜（ｎ）の塩基配列と相補的なセンス鎖と前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖とから成る二本鎖ＲＮＡは、上述するように、遺伝子データベースにある情報を基に、公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。
【００４６】
害虫に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡの選抜は、作製した二本鎖ＲＮＡを害虫に導入し、その後の致死率を二本鎖ＲＮＡを導入していないコントロール群の害虫と比較し、有意義な致死率を示す二本鎖ＲＮＡを選別することにより行うことができる。
【実施例】
【００４７】
実施例１
コオロギｍＲＮＡの精製及び二本鎖ＲＮＡの調製
フタホシコオロギ（供試昆虫１）を用い、その胚、幼虫、成虫脳をｍＲＮＡ精製用の溶液において、均一化し、フェノールクロロフォルム処理後、エタノール沈殿にて、ｍＲＮＡを沈殿させた。得られたｍＲＮＡが分解していないことを変性ゲルを用いて確認した。その後、オリゴｄＴカラムを利用して、ｍＲＮＡのみを単離した。次に、この単離されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、パイロシークエンス法により、塩基配列を決定した。決定された配列は、データベースとして収録し、現在は、ＤＤＢＪに登録して、一般に公開している。この得られた配列情報から、ＢＬＡＳＴサーチにより、昆虫の相同遺伝子を探し、アノテーションを行った。表１は、多数の候補遺伝子のうち実際に試験を行った一部を示す。表１のＮｏ．１２〜２２の遺伝子は、細胞増殖に必須の遺伝子である。
【００４８】
【表１】
【００４９】
上記表１に示される各遺伝子と相補的な二本鎖ＲＮＡは、MEGAscript（登録商標）High Yield Transcription Kit (Ambion社製)を使用し、製造者のプロトコールに従って調製した。得られたペレット状の二本鎖ＲＮＡを風乾し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解した。吸光度測定により各溶液中の二本鎖ＲＮＡの濃度を確認した後、アガロースゲル電気泳動を用いて二本鎖ＲＮＡが精製されていることを確認した。このようにして、上記表１に示される各遺伝子の全配列と相補的な二本鎖ＲＮＡを得た。表１の遺伝子Ｎｏ．１〜１４を構成する塩基配列と相補的なＲＮＡ配列を各々配列番号１〜１４に示す。
【００５０】
実施例２
コオロギに対するＲＮＡ干渉作用の確認
実施例１で得られた各遺伝子をＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解し、２０μＭの二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を調製した。一方、ＦＬＡＭＩＮＧ／ＢＲＯＷＮＭＩＣＲＯＰＩＰＥＴＴＥ ＰＵＬＬＥＲ（ＳＵＴＴＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社製)のプログラム（１ ＨＥＡＴ＝７５０，ＰＵＬＬ＝ ，ＶＥＬ＝３０，ＴＩＭＥ＝２５０）で乾熱滅菌済みのキャピラリー（１ ｖｉａｌ ３．５” ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＃３‐０００−２０３‐Ｇ／Ｘ（ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社））から針の原型を作成した。研磨器ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ ＥＧ‐４を水で濡らしながら回転させて針先を削った。このようにして先端を尖らせたキャピラリーに前記二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を吸引し、約３０分間氷上麻酔をかけたフタホシコオロギ（３齢）の腹部の第４節と第５節の間に二本鎖ＲＮＡを２００ｎｌインジェクションした。このようにして各標的遺伝子についての二本鎖ＲＮＡを導入したコオロギを３３℃、湿度３５％で飼育し、その後の生育状態を観察した。２０日間観察した結果を以下の表２に示す。なお、事前に空試験として行った対象区のフタホシコオロギ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱ ２００ｎｌのみをインジェクション）には、２０日後も死亡個体は確認されなかった。
【００５１】
【表２】
【００５２】
表２に示す通り、遺伝子Ｎｏ．１〜１４を標的遺伝子とした二本鎖ＲＮＡを導入した場合に、有意義な割合でコオロギが致死することが分かった。特に、ＨＲ３遺伝子、Ｓｐａｒｃ遺伝子、ヒートショックプロテイン９０遺伝子、ｃＡＭＰ−依存性タンパク質リン酸化酵素Ｒ１、Ｗａｒｔｓ遺伝子、Ｙｏｒｋｉｅ遺伝子及びＩｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｏｆ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子をターゲットとすることで非常に高い致死率が得られることが分かった。
【００５３】
実施例３
ゴキブリｍＲＮＡの精製及び二本鎖ＲＮＡの調製
チャバネゴキブリ（供試昆虫２）を用い、その胚、幼虫、成虫をｍＲＮＡ精製用の溶液において、均一化し、フェノールクロロフォルム処理後、エタノール沈殿にて、ｍＲＮＡを沈殿させた。次に、この単離されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した。実施例２の結果から有効性の確認された表２のＮｏ.1〜１４の遺伝子のうち、７遺伝子を任意に選択した。選択した遺伝子を表３に示す。表３の遺伝子をチャバネゴキブリ遺伝子から単離するため、コオロギや他の昆虫の配列情報から縮重プライマーを設計し、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
【００５４】
【表３】
【００５５】
表１に示されるチャバネゴキブリ由来の各遺伝子と相補的な二本鎖ＲＮＡを、実施例１と同様にMEGAscript(登録商標)High Yield Tanscription Kit (Ambion社製)を使用して調製した。得られたペレット状の二本鎖ＲＮＡを風乾し、RNase free mQに溶解した。吸光度測定により各溶液中の二本鎖ＲＮＡの濃度を確認した後、アガロースゲル電気泳動を用いて二本鎖ＲＮＡが精製されていることを確認した。このようにして、表３に示されるチャバネゴキブリ由来の各遺伝子の全配列と相補的な二本鎖ＲＮＡを得た。表３の遺伝子Ｎｏ．２３〜２９を構成する塩基配列と相補的なＲＮＡ配列を各々配列番号１５〜２１に示す。
【００５６】
実施例４
ゴキブリに対するＲＮＡ干渉作用の確認
実施例３で得られた各遺伝子をＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解し、２０μＭの二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を調製した。一方、ＦＬＡＭＩＮＧ／ＢＲＯＷＮ ＭＩＣＲＯＰＩＰＥＴＴＥ ＰＵＬＬＥＲ（ＳＵＴＴＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社製)のプログラム（１ ＨＥＡＴ＝７５０，ＰＵＬＬ＝ ，ＶＥＬ＝３０，ＴＩＭＥ＝２５０）で乾熱滅菌済みのキャピラリー（１ ｖｉａｌ ３．５” ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＃３‐０００−２０３‐Ｇ／Ｘ（ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社））から針の原型を作成した。研磨器ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ ＥＧ‐４を水で濡らしながら回転させて針先を削った。このようにして先端を尖らせたキャピラリーに、実施例３で調製した二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を吸引し、約３０分間氷上麻酔をかけたチャバネゴキブリ（３〜４齢）の後脚基節部付近の胸部に二本鎖ＲＮＡを２００ｎｌインジェクションした。このようにして各標的遺伝子についての二本鎖ＲＮＡを導入したチャバネゴキブリを２４℃、湿度３５％で飼育し、その後の生育状態を観察した。３０日間観察した結果を以下の表４に示す。なお、事前に空試験として行った対象区のチャバネゴキブリ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱ ２００ｎｌのみをインジェクション）には、３０日後も死亡個体は確認されなかった。
【００５７】
【表４】
【００５８】
表４に示す通り、遺伝子Ｎｏ．２３〜２９を標的遺伝子とした二本鎖ＲＮＡを導入した場合に、有意義な割合でゴキブリが致死することが分かった。特に、ＨＲ３遺伝子、ヒートショックプロテイン９０遺伝子、Ｗａｒｔｓ遺伝子、Ｙｏｒｋｉｅ遺伝子をターゲットとすることで非常に高い致死率が得られることが分かった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡであり、前記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを含有し、前記標的遺伝子が害虫に含まれるものである、害虫駆除剤：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
【請求項２】
前記害虫が昆虫である、請求項１に記載の害虫駆除剤。
【請求項３】
前記害虫がバッタ目又はゴキブリ目に属する昆虫である、請求項１又は２に記載の害虫駆除剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の害虫駆除剤を害虫に接触させることを特徴とする、害虫駆除方法。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを選抜する工程を含む、害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡであり、前記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを含有し、前記標的遺伝子が害虫に含まれるものである、害虫駆除剤：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
【請求項２】
前記害虫が昆虫である、請求項１に記載の害虫駆除剤。
【請求項３】
前記害虫がバッタ目又はゴキブリ目に属する昆虫である、請求項１又は２に記載の害虫駆除剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の害虫駆除剤を害虫に接触させることを特徴とする、害虫駆除方法。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを選抜する工程を含む、害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
【公開番号】特開２００９−２６３３６２（Ｐ２００９−２６３３６２Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９０８６２（Ｐ２００９−９０８６２）
【出願日】平成２１年４月３日（２００９．４．３）
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【出願人】（５９７０２５６７７）アース・バイオケミカル株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３日（２００９．４．３）
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【出願人】（５９７０２５６７７）アース・バイオケミカル株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
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