伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に由来する中空キメラ性ウイルス様粒子、これらの製造および応用
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に由来する中空キメラ性ウイルス様粒子は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上述のＩＢＤＶ ｐＶＰ２の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）を含む領域Ａ、ならびに予防、治療または診断の目的に有用なポリペプチドのような所望のポリペプチドを備える異種ポリペプチドを含む領域Ｂを包含する融合タンパク質の集合体によって形成されている。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に由来する中空キメラ性ウイルス様粒子の製造およびその応用に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
ウイルス様粒子は、核酸およびタンパク質の収納および輸送に特化した構造物である。ウイルス様粒子の通常の特性は、宿主の免疫反応を刺激する優秀な能力である。これらの性質によって、ウイルス様粒子が細胞内輸送系およびサブユニットワクチンに用いる非常に興味深い作用物質になる。異なる遺伝子発現系の利用は、例えば、ロタウイルス（米国公開２００３／０１７５３０１号）、レトロウイルス（米国特許６，６０２，７０５号）パルボウイルス（米国特許６，４５８，３６２号）など、種々のウイルスに由来する空のウイルスカプシドまたはウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の製造に役立っている。これらの発現系の遺伝的な手法は、天然のウイルスカプシドを形成している、これらとは異なるタンパク質に由来する異種のアミノ酸配列を含んでいる、ＶＬＰｓの製造を可能にする。これらのＶＬＰｓは、通常、異形の、組み換えのまたはキメラのＶＬＰｓ（ＣＶＬＰｓ）と呼ばれ、それらは、主に以下の２つの目的：（ｉ）免疫学的に該当する異種のペプチドを用いた多価のワクチンを産生すること、および（ｉｉ）受容体−リガンドの相互作用に関与するアミノ酸配列の挿入による親和性の改変に使用される。
【０００３】
Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科に属する伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）は、種々のトリ類の種に感染し、かつ世界的にトリ類の産業において相当な経済的な損失を引き起こす重篤な免疫抑制疾患である、感染性の滑液包炎の直接的な原因である。
【０００４】
ＩＢＤＶ粒子は、Ｔ＝１３の対称性を有する正２０面体であり、エンベロープを欠き、かつ単一のタンパク質層によって形成されている。これまでのところ、ＩＢＤＶ粒子の原子モデルの取得を目指した試みは、失敗している。このため、ＩＢＤＶ粒子の構造に関する情報は、精製されたウイルス、およびＶＬＰｓの極低温電子顕微鏡法によって得られた画像から生成された３次元モデルに基づいている。これらの研究に基づいて、ＩＢＤＶ粒子の外部表面が５つの異なる高次構造に配置されたタンパク質ＶＰ２（３７ｋＤａ）の２６０個の３量体の連続的な格子構造によって形成されていることが観察されている。ＩＢＤＶ粒子の内側は、タンパク質ＶＰ３（２９ｋＤａ）の２００個の３量体を含んでいる。タンパク質ＶＰ３の３量体は、互いに独立して、ＶＰ２の３量体の基部領域と結合されている。ＶＰ４（２８ｋＤａ）である第３のポリペプチドもまた、正２０面体構造の角を形成する５量体の基部に位置している、ＩＢＤＶ粒子の一部であるだろうと、示唆されている。
【０００５】
ポリペプチドＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４は、１０９ｋＤａの大きさを有する前駆体ポリペプチドのタンパク分解性のプロセシングから生成される。この前駆体は、自己触媒的にプロセシングされて、結果としてポリペプチドｐＶＰ２（４８ｋＤａ）、ＶＰ３およびＶＰ４を生じる。ポリタンパク質の中央付近に位置しているＶＰ４領域は、イオン性のタンパク質分解酵素の一群に属しており、タンパク質分解性の切断を担う。ポリペプチドＶＰ２およびＶＰ３は、カプシドの集合を直接に担う。ｐＶＰ２産物は、生成された粒子に見られる形態であるタンパク質の成熟形態のＶＰ２を生じる前に、Ｃ末端において最後に切断を受ける。このｐＶＰ２のプロセシングは、カプシドを正しく形成することに必要であり、かつＶＰ３の存在を必要とするが、これを担うタンパク質分解酵素は、同定されていない。
【０００６】
形態形成は、前駆体ポリペプチドにおける修飾に関与する連続的な段階を必要とするウイルス周期（ｖｉｒａｌ ｃｙｃｌｅ）に関する生活過程である。結果として、ウイルスは、構成要素の１つ１つの間において連続的なおよび正確な相互作用を可能にする、発達した戦略を有している。正２０面体のウイルスによってしばしば用いられているこれら戦略の１つは、構造的な構成要素の基本として、単一のポリタンパク質のポリペプチドを利用することから成り立っている。これらの場合において、上記ポリタンパク質の正確なタンパク質分解性のプロセシングは、集合過程において重要な役割を果たしている。
【０００７】
ＩＢＤＶカプシド集合に関するこの原理は、以前の研究において証明されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ Ａ ｅｔ ａｌ． １９９８．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＯＲＦ Ａ１の発現がウイルス様粒子を結果として生じる”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：１０４７−１０５４）。ＩＢＤＶポリタンパク質をコードする遺伝子の真核細胞における発現は、形態学および生化学の両方の観点から、ＩＢＤＶビリオンと完全に区別できないＶＬＰｓの形成を生じさせる。また、カプシドの集合がウイルスのポリタンパク質の合成および正確なプロセシングのみを要求し、かつウイルスゲノムあるいはＶＰ５およびＶＰ１タンパク質のようなウイルスゲノムにコードされる他のタンパク質の存在とは独立している、ということが観察されている。
【０００８】
これまでにおいて、異なる組み換え系におけるＩＢＤＶ遺伝子の発現から得られた結果は、（ｉ）集合過程がウイルスの遺伝的な物質の存在と独立している、（ｉｉ）ポリタンパク質遺伝子によってコードされるそれらのポリタンパク質のみが、集合に必要である、および（ｉｉｉ）集合がポリペプチドＶＰ２とＶＰ３との間の調整された相互作用を必要とする、という推論を可能にする。
【０００９】
しかし、修飾されていないときでさえ、ｐＶＰ２／ＶＰ３の相互作用が前駆体ポリタンパク質のＶＰ２領域とＶＰ３領域との間に形成されるか否か、または逆にこの相互作用が当該前駆体のプロセシングの後に生じるか否か、がわかっていない。さらに、現在の情報は、ＶＰ４がカプシドの形態生成に関連のある役割を果たすことができるのかについては、考慮されていない。実際には、ＩＢＤＶのＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質の集合によって形成されるＩＢＤＶのＶＬＰｓが開示されている（米国特許６，５２８，０６３号、米国特許５，７８８，９７０号および特開平５−１９４５９７号）。
【００１０】
本願の発明者らによって開発された成果によって、異なる真核発現ベクターを用いることによって得られるＩＢＤＶ ＶＬＰｓ用の系を確立することができる。これらのベクターは、ウイルスＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１の存在または非存在において、ＩＢＤＶポリタンパク質を発現するために使用される。精製したＶＬＰｓの生化学的な性質決定は、ウイルスポリタンパク質だけが発現されているとき、ＶＬＰｓがｐＶＰ２、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を含み、かつポリタンパク質およびウイルスＲＮＡ重合酵素が同時に発現されているとき、ＶＬＰｓがｐＶＰ２、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１タンパク質を含むことを示している（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ Ａ ｅｔ ａｌ． １９９８．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＯＲＦ Ａ１の発現がウイルス様粒子を結果として生じる”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９： １０４７−１０５４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ ＪＬ ｅｔ ａｌ． ２０００．“昆虫細胞において発現された、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのカプシドタンパク質の集合における異なる集合体”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７８：３２２−３３１、Ｍａｒａｖｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ． ２００３．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの足場タンパク質であるＶＰ３のオリゴマー形成領域はカプシド形成に重要な役割を果たす”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：６４３８−４９、Ｌｏｍｂａｒｄｏ Ｅ ｅｔ ａｌ． １９９９．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６９７３−６９８３）。
【００１１】
それから、特許文献ＷＯ０２／０８８３３９には、カルボキシル末端において１つのポリペプチドと結合したＩＢＤＶポリタンパク質を含むキメラタンパク質の集合によって形成される、ＩＢＤＶウイルス様粒子が開示されている。
【００１２】
ＩＢＤＶのｐＶＰ２タンパク質またはこれらの断片に単独に基づくＣＶＬＰｓ、所望のポリペプチドと融合したＣＶＬＰｓ、あるいはワクチンまたは所望の産物にとっての輸送物としてそれらを潜在的に利用することは、これまでに述べられていない。
【００１３】
〔発明の要約〕
本発明は、例えば、薬物、ポリペプチドタンパク質、または核酸などの生物学的な活性を有する分子のような所望の産物を、ベクター化するまたは担体に組み込む新しいツールを提供するという問題に取り組む。
【００１４】
本発明によって提供される解決法は、本明細書において、通常、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊と呼ばれる所望のポリペプチドを含む異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むために遺伝子的に改変された、自身が集合してウイルス様粒子を形成するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質、または当該タンパク質の断片を発現した結果として中空キメラ性ウイルス様粒子を取得できることを観察した発明者らに基づいている。実際に、本発明者らは、全長のＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質、またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ酸の１番目から始まっている連続する５０１のアミノ酸残基、通常、４４１〜４６６アミノ酸残基のタンパク質の断片が、異種ポリペプチドと融合されて、このようにして得られた融合（キメラ）タンパク質がともに集合して、ＣＶＰＬｓ、特にＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊を形成できることを観察している。上述のＣＶＰＬｓ、特にＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊は、細胞に対する特異性および細胞との相互作用という点について、天然のウイルスカプシドの性質と類似の性質を有し、かつ他の標的細胞に向かって導くようにさらに操作可能である。
【００１５】
上述のＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質、またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）の配列に対して相同な少なくとも１つの配列を含む当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の断片を包含する領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを包含し、かつ上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に結合された領域Ｂを包含する融合タンパク質の集合体によって形成される。１つの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、ワクチン接種（免疫化）、治療または診断などに使用するポリペプチドのような所望のポリペプチドを含む。上記ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２＊は、例えば、治療、予防医学または予防、あるいは診断の目的（例えば、ワクチンまたは遺伝子治療ベクターなどの調製）など、保健医療の目的に使用されてもよい。
【００１６】
本発明者らによって実施された研究は、驚くべきことに、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質断片（例えば、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ酸の１番目から始まっている連続する４４１〜５０１、好ましくは４４１〜４６６アミノ酸残基を有するｐＶＰ２断片）によって形成されるＣＶＬＰｓ、および（ｉｉ）上記ＣＶＬＰｓの形成の妨げにならない異種のアミノ酸配列を包含する融合タンパク質によって形成されるＣＶＬＰｓが得られることを示している。また、本発明者らは、上記ＣＶＬＰｓがＩＢＤＶによって誘導される感染に対してトリを効果的に免疫する、または（上記ＣＶＬＰｓに存在する異種のアミノ酸残基および上記配列に含まれる抗原／免疫原に依存して、）他の原因因子によって誘導される感染から動物を効果的に保護することができることを観察している。
【００１７】
詳細な実施形態において、本発明者らは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の断片（例えば、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ酸の１番目から始まっている、連続する４４１〜４６６のアミノ酸残基を有するｐＶＰ２断片）およびヒスチジンタグ（実施例１）のような異種のアミノ酸配列を包含する融合タンパク質の集合体によって形成されるＣＶＬＰｓを得ている。他の詳細な実施形態において、本発明者らはまた、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質断片、特に、タンパク質ｐＶＰ２として本明細書において同定されている、ＦＭＤＶ ＢおよびＴ細胞エピトープを含むＢＴと呼ばれる口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のキメラタンパク質と融合された断片（実施例３）（Ｚｈａｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ ４６（１）： １−９）の発現を用いたＣＶＬＰ形成を観察している。
【００１８】
単一のタンパク質（ｐＶＰ２＊）に基づくＣＶＬＰｓ産物は、２つのタンパク質（例えば、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質およびＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に基づく融合タンパク質）によって形成された他のＣＶＬＰｓの産物と比較して、使用された発現ベクターを操作する水準および産物産生の水準の両方において、多くの利点を有している。
【００１９】
従って、本発明の１つの局面において、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１までの整数である）と相同な少なくとも１つの配列を含むＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の断片を含むまたはからなる領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂを包含する融合タンパク質に関する。１つの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、所望のポリペプチドを含んでいる。上記融合タンパク質を取得する方法は、本発明の付加的な局面を構成する。
【００２０】
他の局面において、本発明は、通常、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２＊（単一の）またはＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊（複数の）と呼ばれる、上記融合タンパク質の集合によって形成されるという点において特徴づけられる、後ほど定義されているような、中空キメラ性ウイルス様粒子に関する。
【００２１】
本発明の付加的な局面において、上記融合タンパク質の遺伝子発現に基づく、後ほど定義されているような、本発明による上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を製造する方法に関する。
【００２２】
上記融合タンパク質の遺伝子発現に基づく、上記融合タンパク質または上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓを製造する方法の実施に関して生み出される上記核酸、発現カセット、組み換えベクターおよび宿主細胞は、上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓの製造への利用だけでなく、本発明の付加的な局面を構成する。
【００２３】
上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、例えば、薬物、ポリペプチド、タンパク質、抗体または核酸などの生物学的な活性を有する所望の分子を、ベクター化するまたは担体に組み込む能力を有している。
【００２４】
従って、他の局面において、本発明は、ワクチン、遺伝子治療ベクターおよび活性物質の輸送系のような、薬学的組成物の調製における上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の利用に関する。上記ワクチン、遺伝子治療ベクターおよび活性物質の輸送系は、本発明の付加的な局面を構成する。
【００２５】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、Ｎ末端にＨｉｓタグを有している、および有していないｐＶＰ２のＣ末端欠損変異体の発現を示している。Ｈｉｓタグを有している（図１Ａ）および有していない（図１Ｂおよび図９Ｃ）ｐＶＰ２／ＶＰ２発現変異体の回収は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＶＰ２ポリクロナル抗体（図１Ａおよび１Ｂ）および抗Ｈｉｓポリクロナル抗体（図１Ｃ）を用いたウエスタンブロッティングによって解析された。同量の細胞抽出物が、ｐＶＰ２／ＶＰ２変異体の相対的な発現水準を比較するために、各変異体について載せられた。ＩＢＤＶカプシドは、陽性対照として使用され、ｐＶＰ２およびＶＰ２に対応する位置が示されている。単純化のために、ｐＶＰ２／ＶＰ２変異体は、最後のアミノ酸の位置に従って記載されている。ＶＰ３タンパク質が存在していないことを確かめて、混入の可能性を切り捨てるために、ウエスタンブロッティングが抗ＶＰ３抗体を用いて対照化された（図示せず）。
【００２６】
図２は、ｐＶＰ２のＣ末端におけるαらせんの解析を示している。図２Ａは、３０％のトリフルオロエタノール（ＴＥＥ）の存在下（破線）または非存在下（実線）のＰＥＳ緩衝液における、１文字表記においてＦＧＦＫＤＩＩＲＡＩＲＲＩ（配列番号１）と表される、ポリペプチドの円偏光２色性（ＣＤ）スペクトルを示している。２０８ｎｍおよび２２０ｎｍにおける最小値ならびに１９５ｎｍにおける増加した楕円形の形状が、この図面において観察された。図２Ｂにおいて、ＬｍＴＩＭの２４１〜２５０残基の２次構造が示されている。αらせんの両親媒性が見られる。
【００２７】
図３は、クーマシーブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるｐＶＰ２タンパク質、およびＨＴ−ｐＶＰ２変異体の解析を示している。図３Ａは、ｐＶＰ２のＣ末端領域の図を示しており、変異体において欠損として選択された位置および配列が表されている。また、Ｈｉｓタグ変異体の異形が生成された。タグ付きの変異体（図３Ｃ）およびタグなしの変異体（図３Ｂ）の両方が高い水準において発現され、以下の２段階：１２の画分が取られて２０倍に濃縮され、それから画分のそれぞれ１〜１０μｌ（ＨＴ−ｐＶＰ２変異体ごとに０．１μｌ）が載せられたことにおいて遠心分離された。それらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、かつクーマシーブルー染色によって現像された。星印は、ゲルが抗ＶＰ２抗体（ＶＰ２−５１２）を用いてウエスタンブロッティングによって分析されたことを示している。ＶＰ２−４８７およびＶＰ２−４９４変異体は、精製条件に耐える十分に安定な構造を形成しなかったので、これらは第１のショ糖勾配（図示せず）から沈降物を得られなかった。図３Ｄには、ＩＢＤＶに感染した細胞におけるＩＢＤＶタンパク質の通常の性質が示されている。遠心沈降方向は、右から左であり、画分１２は、各勾配の上部部分を表している。
【００２８】
図４は、Ｃ末端領域欠損変異体であるｐＶＰ２の集合体の電子顕微鏡写真を示している。図４Ａおよび図４Ｂは、いくつかの残基が１２面体の粒子１２個によって形成されたより大きな不安定な構造（図４Ａにおける矢印）に関与しているという事実にもかかわらず、ＶＰ２−４４１およびＶＰ２−４５６変異体がＴ＝１の対称性のカプシドを有する粒子を形成することを示している。図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、異なるＶＰ２−４６６集合体の写真を示している。図４Ｃには、下部の画分におけるフーリエ変換（挿入）から推論される六角形の配列を有する管状の構造が示されている。図４Ｄは、主な構造として、Ｔ＝１のカプシドを有する粒子、断続的な細い管および解離した物質を示しており、かつ培養液画分におけるＴ＝１３のカプシドを有する粒子がまた得られる。図４Ｅは、上部の画分においてＴ＝１を有する粒子を示している。
【００２９】
図５は、電子顕微鏡によって得られた、Ｃ末端領域に欠損を有する変異タンパク質Ｈｉｓ−ｐＶＰ２に対応する集合体の写真から構成されている。濃縮画分は、得られた集合体の観察を最適化するために希釈（１／５０）された。図５Ａは、ＨＴ−ＶＰ２−４４１の集合体（Ｔ＝１のカプシド構造およびより大きな１２面体の集合体（矢印を用いて示されている））を示している。図５Ｂは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６の集合体（中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有する粒子）を示している。図５Ｃは、中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有するＨＴ−ＶＰ２−４６６粒子の集合体を示している。図５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、ＨＴ−ＶＰ２−４７６の集合体を示している。図５Ｄは、下部の画分における種類Ｉの管状構造を示している。図５Ｅは、中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有する粒子ならびに管状の集合体を有する断片を示している。図５Ｆは、上部の画分における異常な集合体を示している。棒は、１００ｎｍの長さに一致する。
【００３０】
図６は、ＩＢＤＶカプシドの３次元構造を示している。図６Ａは、ＩＢＤＶカプシド極低温電子顕微鏡写真を示している。棒の長さは、５０ｎｍである。図６Ｂは、正２０面体の２次元軸に沿って見た、ＩＢＤＶカプシドの外表面（左）および内表面（右）の配置像（ｍａｐ）を示している。その表面配置像は、ＶＰ２−４４１の７８０分子の存在および部分的な特定のタンパク質の体積として０．７３ｃｍ３／ｇの値と仮定して表されている。エンベロープ細孔がはっきりと見えるように、配置像の前半球のみが示されている。５種類の３量体カプソマーが、文字ａ〜ｅを用いて示されている。棒の長さは、２００オングストロームである。
【００３１】
図７は、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの３次元的な構造を示している。図７Ａは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６集合体の電子顕微鏡写真（画分７）を示している。棒の長さは、５０ｎｍである。円は、Ｔ＝１３、Ｔ＝７、およびおそらくＴ＝１の対称性を有する、明確に区別ができる３つの正２０面体の集合体を囲んでいる。棒の長さは、５０ｎｍである。図７Ｂにおいて、これらの密度配置像が、７８０（Ｔ＝１３）および４２０（Ｔ＝７）分子のＨＴ−ＶＰ２−４６６の容積を含むために断面図が描かれた。ＨＴ−ＶＰ２−４６６の３量体の種類が示されている。棒の長さは、２００オングストロームである。
【００３２】
図８は、ＩＢＤＶカプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドとの構造の比較を示している。図８Ａは、３次元再構成したＩＢＤＶカプシド（実線）およびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシド（破線）の密度の特徴を示しており、どちらも１５オングストロームの解像度において分析されている。タンパク質の外皮（ｒ＝２５３〜３５０オングストローム）は、わずかな隔たり（矢印）を除いて、ほとんど完全に重なり合っている。図８Ｂは、極低温電子顕微鏡法に使用されるＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドのタンパク質を、クーマシーブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示している。ｐＶＰ２／ＶＰ２およびＶＰ３は、同じゲルから定量化された。図８Ｃおよび８Ｄは、ＩＢＤＶおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６のそれぞれを３次元再構成して得られたカプシドの断面図を示している。タンパク質およびＲＮＡは、黒である。図８Ｅは、ＩＢＤＶカプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドとの違いを算出することによる配置像を表している。生じた配置像は、２次元的な正２０面体の軸に沿って見られるＩＢＤＶカプシドの外表面を表している。図８Ｆは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドに対するＩＢＤＶカプシドの差異から算出された、異なる配置像を表している。これらの差異の差し引いて、１３２の主な突起として示される結果としての配置像は、２次元的な正２０面体の軸に沿って見られるＨＴ−ＶＰ２−４６６の内表面について示されている。部分的なタンパク質の容積として０．７３ｃｍ３／ｇを用いた、これらの密度を示す各島の１つは、約２６ｋＤａに対応している。一方において、４４２〜４６６（２．６ｋＤａ）およびＨｉｓタグ（３．４ｋＤａ）の部分の複製物５〜６個の大きさは、それぞれ３１から３７ｋＤａの範囲にある。棒の長さは、２００オングストロームである。
【００３３】
図９は、ＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの構造的な構成を示している。ＩＢＤＶ（左半分）およびＨＴ−ＶＰ２−４６６（右半分）の３次元再構成したカプシドの正２０面体断面が１５オングストロームの解像度おいて示されており、かつ２次元の軸に基づいて見られる。Ｔ＝１３を有するカプシドの中心から示されている正２０面体断面の垂直方向における距離は、３２８オングストローム（Ａ）、３１９オングストローム（Ｂ）、３１１オングストローム（Ｃ）、３０２オングストローム（Ｄ）、２９４オングストローム（Ｅ）、２８６オングストローム（Ｆ）、２７７オングストローム（Ｇ）、および２６９オングストローム（Ｈ）である。多面体の面は、ファセット（Ｆａｃｅｔｓ）プログラム（Ｒ．Ａ．クラウザー，ＭＲＣ，ケンブリッジによって提供される）から生成された。棒の長さは２００オングストロームである。
【００３４】
図１０は、ｐＶＰ２およびＨＴ−ｐＶＰ２変異タンパク質の集合体を示している。図１０Ａは、Ｃ末端配列の伸張によって決まっている、単独の（ＶＰ２）またはＨｉｓタグを有する（ＨＴ−ＶＰ２）異なるＣ末端の伸張を有するＶＰ２によって導入される集合体を示す図を示している。１文字表記において４４３−ＧＦＫＬＤＩＩＲＡＩＲ−４５３（配列番号２）と表されるポリペプチドが示されている。ＶＰ２に結合されているＣ末端配列（またはそのＨｉｓタグ型）の長さが増えているので、Ｔ＝１のカプシドを有する構造および管の間において、六角形の管状構造という形態を好む、置き換えについての平衡があることに注目する必要がある。また、ｐＶＰ２のＣ末端領域および本発明に使用されている部位の完全な配列が、示されている。図１０Ｂは、左に配列番号２のポリペプチドのここまでに説明したαらせんの説明を示している。本発明に使用される両親媒性のαらせんとＶＰ３のＣ末端領域にある５つのアミノ酸（または類似のＶＰ３ Ｈｉｓタグ（Ｈ−ｔａｇ）領域の配列構造）との間の提案される相補的な積み重なりが図の右側に示されている。ＶＰ３およびＨ−ｔａｇの配列は、Ｃ末端からＮ末端に向かう反対方向に示されている。
【００３５】
図１１は、ＩＢＤＶｐＶＰ２−４５６タンパク質の集合体によって形成されるＩＢＤＶのキメラカプシド、ならびに酵母において発現させた口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＢおよびＴエピトープのキメラＢＴペプチドを含む、異なる分画（Ｆ６〜Ｆ１１）のウエスタンブロッティング分析の結果を示している。上段のブロットは、特異的なＩＢＤＶ抗ＶＰ２抗体を用いた結果を示しており、一方において、下段のブロットは、特異的な抗ＦＭＤＶ抗体を用いて得られた結果を示している。カプシドが形成されているときに、タンパク質を産生する凝集塊が原因である異なる免疫反応のバンド（ポリペプチド）が、上段のブロットにおいて観察され、同じポリペプチドが特異的な抗ＦＭＤＶ抗体によって認識される（下段のパネル）。対照（ｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２）は、特異的なＦＭＤＶ抗体によって認識されない、特異的な抗ＶＰ２抗体に対するより小さな分子量を有する免疫反応バンドを示している。
【００３６】
図１２は、ＣＶＬＰｓを用いてマウスにワクチン接種した３週間後に、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定から得られた結果を示している。
【００３７】
〔発明の詳細な説明〕
第１の局面において、本発明は、融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、以下の、ＩＢＤＶのｐＶＰ２タンパク質もしくは上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１か５０１までの整数）を含むまたはからなる領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂを包含する融合タンパク質である。１つの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、所望のポリペプチドを包含する。領域Ｂは、領域Ａに対してアミノ（Ｎ−）末端位置またはカルボキシル（Ｃ−）末端位置に配置されてもよい。本発明において使用されているように、“ＩＢＤＶ”という用語は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスを意味し、かつあらゆる公知の抗原型（１または２）に属するＩＢＤＶの異なる株を包含する（例証の方法として、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ＴＰ ｅｔ ａｌ． ２０００． Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ． １９：５０９−４３による総説を参照のこと）。
【００３８】
“ＩＢＤＶ ｐＶＰ２ タンパク質”という用語は、通常、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列を含む、またはからなるアミノ酸配列のタンパク質と同様に、上記ＩＢＤＶタンパク質と実質的に相同なタンパク質（例えば、あるＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の配列と良好な整合を示すタンパク質）を意味し、かつＳａｎｃｈｅｚおよびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ （１９９９）によって与えられた定義に従って、ＩＢＤＶの上記あらゆる株に典型的なあらゆる異なるｐＶＰ２タンパク質（ＮＣＢＩ タンパク質バンク）を包含する（Ｓａｎｃｈｅｚ ＡＢ ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＦ．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスにおけるタンパク質分解性のプロセシング：部位特異的な突然変異生成によるポリタンパク質切断の同定”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １９９９ Ｓｅｐ １５； ２６２（１）： １９０−１９９）。上記ＩＢＤＶタンパク質と実質的に相同なタンパク質とは、例えば、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有するアミノ酸配列のタンパク質である。ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の配列と相同な配列は、配列の比較に好適なコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． １９９７． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９））の助けを借りて、当該分野における当業者によって容易に同定され得る。詳細な実施形態において、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質は、アクセス番号ＡＡＤ３０１３６としてＮＣＢＩに寄託されているアミノ酸配列の全長である、ソロア（Ｓｏｒｏａ）株のＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質である。
【００３９】
“上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１か５０１までの整数）という用語は、通常、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１番目の残基から“ｎ”番目の残基に含まれる（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１の間の整数である）、連続するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列のペプチドまたはタンパク質を意味する。従って、場合に応じて、本発明によって提供されるＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊における上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片は、あらゆるＩＢＤＶ株の典型的なあらゆるｐＶＰ２タンパク質（例えば、ソロア株のＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質（ＮＣＢＩのアクセス番号ＡＡＤ３０１３６））の、１番目のアミノ酸残基から始まっている連続する４４１から５０１のアミノ酸からなる、から必須に構成される、または、を含むアミノ酸配列を有する。
【００４０】
ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の特定の１〜ｎ断片は、以下の構成“ｐＶＰ２−ｎ”を意味している（ここで、“ｎ”は、先に定義されている）。詳細な実施形態において、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片は、以下の群：
（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４４１残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４４１；
（ｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４５２残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４５２；
（ｉｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４５６残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４５６；
（ｉｖ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４６６残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４６６；
（ｖ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４７６残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４７６；
（ｖｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４８７残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４８７；
（ｖｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４９４残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４９４；および
（ｖｉｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から５０１残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−５０１
からなる群から選択されたタンパク質である。
【００４１】
本発明の融合タンパク質は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１の整数である）を含む、またはからなる領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂを包含する。１つの実施形態において、本発明の上記融合タンパク質は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１の整数である）を含む領域Ａを包含する。他の実施形態において、本発明の上記融合タンパク質は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１の整数である）からなる領域Ａを包含する。他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、異種ポリペプチドを含む領域Ｂを包含する。他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、異種ポリペプチドを含む領域Ｂからなる。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１の整数である）を含む、またはからなり、異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂと結合された領域Ａを包含する。詳細な実施形態において、詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ末端領域に結合されており、一方、他の詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のカルボキシル末端領域に結合されている。
【００４２】
詳細な実施形態において、上記領域Ａｈａ，ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質を含むまたはからなる。この場合において、本発明の融合タンパク質を形成しているＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質は、あらゆるＩＢＤＶ株の典型的なあらゆるｐＶＰ２タンパク質（例えば、ソロア株の全長のＩＢＤＶ ｐＶＰ２（ＮＣＢＩ アクセス番号ＡＡＤ３０１３６））であってもよい。
【００４３】
他の詳細な実施形態において、上記領域Ａは、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片からなる。この場合において、本発明の融合タンパク質の領域Ａを形成しているＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片は、あらゆるＩＢＤＶ株（例えば、ソロア株）の典型的なｐＶＰ２タンパク質のあらゆる１〜ｎ断片であってもよい。詳細な実施形態において、上記領域Ａを形成しているＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片は、ｐＶＰ２−４４１タンパク質、ｐＶＰ２−４５２タンパク質、ｐＶＰ２−４５６タンパク質、ｐＶＰ２−４６６タンパク質、ｐＶＰ２−４７６タンパク質、ｐＶＰ２−４８７タンパク質、ｐＶＰ２−４９４タンパク質およびｐＶＰ２−５０１タンパク質からなる群から選択された、中でも好ましくは、ｐＶＰ２−４４１タンパク質、ｐＶＰ２−４５２タンパク質、ｐＶＰ２−４５６タンパク質およびｐＶＰ２−４６６タンパク質から選択されたタンパク質である。
【００４４】
本発明の融合タンパク質に存在する領域Ｂは、異種ポリペプチドを含む、またはからなる。本発明において用いられているように、“異種ポリペプチド”という用語は、天然のＩＢＤＶカプシドを成していないポリペプチドを意味する。
【００４５】
１つの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、所望のポリペプチドを含む、またはからなる。所望のポリペプチドの大きさは、数アミノ酸から数百アミノ酸までの広い範囲において変わってもよい。上記所望のポリペプチドは、その由来（真核生物、真核生物、またはウイルスなど）に関わりなく、動物（ヒトを含む）において免疫反応を誘導することが好ましい、ウイルス、細菌または微生物の抗原のような、組み換え的に発現された、例えば、抗原を生じやすい、ほとんど完全にあらゆるポリペプチド、生体にとって不十分である機能の補助を目的とする酵素、あるいは標的のＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な認識を可能にする核酸結合ペプチド領域を含む、本発明の融合タンパク質と上記標的の核酸配列を含む核酸配列との結合、および上記本発明の融合タンパク質（ＩＢＤＶ ＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２ｓ＊）を含むウイルス様粒子のカプシド形成を可能にするポリペプチドであり得る。詳細な実施形態において、上記所望のポリペプチドは、ウイルス、細菌、寄生生物、またはあらゆる他の微生物に起因する疾患、あるいは腫瘍性の疾患に対して、動物およびヒトにおいて免疫反応を誘導することが可能なエピトープまたは抗原決定因子のような、ワクチン接種、治療または診断に有用な、ポリペプチドである。
【００４６】
詳細な実施形態において、上記所望のポリペプチドは、ＦＭＤＶ Ｂ細胞エピトープ（Ｂエピトープ）およびＦＭＤＶ Ｔ細胞エピトープ（Ｔエピトープ）を含む、ＢＴと呼ばれる口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のキメラポリペプチドである（Ｚｈａｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ ４６（１）：１−９）。詳細な実施形態において、Ｂエピトープは、ＦＭＤＶのＶＰ１タンパク質（例えば、上記ＦＭＤＶのスペイン抗原型Ｃの単離されたＶＰ１タンパク質における１３３−１５９位または他の単離体の等価な位置）に位置しており、一方において、Ｔエピトープは、ＦＭＤＶのＶＰ１タンパク質（例えば、上記ＦＭＤＶのアジア抗原型のＶＰ４タンパク質における２０〜３４位）に位置している。
【００４７】
詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、単一の所望のポリペプチドを含んでいる。しかし、他の詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、直列の１組を形成してもよい２つ以上の同一なまたは異なる所望のポリペプチドを含んでいる。
【００４８】
詳細な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、単一の領域Ｂと結合された領域Ａを含む。この場合において、上記領域Ｂは、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のアミノ末端領域に結合されていてもよく、あるいは選択可能に、上記領域Ｂは、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域に結合されていてもよい。
【００４９】
上記のように、領域Ｂは、１つ以上の所望のポリペプチドを含んでいてもよい。詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、単一の所望のポリペプチドを含んでいるが、一方、他の詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、２つ以上の所望のポリペプチドを含んでいる。
【００５０】
他の詳細な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、１つの領域Ｂが領域Ａに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のアミノ末端領域と結合され、かつもう１つの領域Ｂが領域Ａに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域と結合されている、２つの領域Ｂと結合されている領域Ａを包含する。上記２つの領域Ｂは、同一であるまたは異なるものであってよく、かつこれらの領域Ｂのそれぞれが、互いに同一のまたは異なる２つ以上の所望のポリペプチドを含むことができる。
【００５１】
従って、１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、第１の領域Ｂが領域Ａのアミノ末端領域と結合され、かつ第２の領域Ｂが領域Ａのカルボキシル末端領域と結合されている、第１および第２の領域Ｂに結合された領域Ａを包含している。上述のように、上記第１および第２の領域Ｂは、同一のまたは異なる異種ポリペプチドを含む。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、所望の第１のポリペプチド（ＰＩ１）を含む第１の領域Ｂおよび所望の第２のポリペプチド（ＰＩ２）を含む第２の領域Ｂと結合された領域Ａを包含する。上記所望のポリペプチド（ＰＩ１およびＰＩ２）は、同一であるまたは異なるものであってもよい。特定の実施形態において、上記所望のポリペプチド（ＰＩ１およびＰＩ２）は、互いに異なっている。
【００５３】
他の詳細な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、１つの領域Ｂが領域Ａに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のアミノ末端領域と結合され、かつもう１つの領域Ｂが領域Ａに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域と結合されている、２つの領域Ｂと結合されている領域Ａを包含する。上記２つの領域Ｂは、同一であるまたは異なるものであってよく、かつこれらの領域Ｂのそれぞれが、互いに同一のまたは異なる２つ以上の所望のポリペプチドを含むことができる。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、所望の第１のポリペプチド（ＰＩ１）を含む第１の領域Ｂおよび所望の第２のポリペプチド（ＰＩ２）を含む第２の領域Ｂと結合された領域Ａを包含する。上記所望のポリペプチド（ＰＩ１およびＰＩ２）は、同一であるまたは異なるものであってもよい。特定の実施形態において、上記所望のポリペプチド（ＰＩ１およびＰＩ２）は、異なっている。
【００５４】
本発明の融合タンパク質の領域Ａは、上記領域Ｂと直接に結合されていてもよい。選択可能に、上記領域Ａは、上記領域Ｂと直接に結合されていなくてもよいが、むしろ領域Ａと領域Ｂとの間にあるリンカーポリペプチドを介して結合されている。従って、必要に応じて、本発明の融合タンパク質は、上記領域Ａと領域Ｂとの間に位置しているリンカーポリペプチドをさらに含むことができる。上記リンカーポリペプチドは、構造的な安定性を有するペプチド、好ましくは免疫反応を誘導可能なまたは不可能な非構造的な領域を生じるペプチドであれば好適である。説明を目的として、上記適応性のあるペプチドは、アミノ酸残基、特にＧｌｙおよびＳｅｒの繰り返し、あるいは他の好適なアミノ酸残基の繰り返しを含む。
【００５５】
本発明の融合タンパク質は、好適な宿主細胞において当該融合タンパク質をコードする
核酸配列の遺伝子発現という手段によって得られてもよい。上記宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞である。当該細胞は、例えば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列を有する細胞、または当該核酸によって形質転換された細胞、あるいは本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えベクターを用いて形質転換された、トランスフェクトされた、または感染された細胞である。本発明の融合タンパク質の取得に好適な核酸配列、発現カセット、組み換えベクターおよび宿主細胞は、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を産生する過程と一緒に、以下において詳細に説明されている。
【００５６】
好適な宿主において発現される本発明の融合タンパク質は、自身を集合させて、本明細書において、通常、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２＊（単一）またはＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊（複数）と呼ばれるＩＢＤＶから由来する中空キメラ性ウイルス様粒子を形成する。
【００５７】
従って、他の局面において、本発明は、上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊（例えば、本発明融合タンパク質を少なくとも包含している中空キメラ性ウイルス様粒子）に関する。当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、本発明の融合タンパクの集合によって形成される。当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、Ｔ＝１の対称性を有し、かつＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１までの整数である）を含むまたはからなる領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂを包含する本発明の融合タンパク質の集合体のみからなるという点において特徴付けられる。
【００５８】
本発明のＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、ＩＢＤＶの上記ウイルス様粒子の形成が可能な条件において、好適な宿主細胞における本発明の融合タンパク質の発現によって得られてもよい。
【００５９】
従って、他の局面において、本発明の核酸配列は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列に関する。
【００６０】
詳細な実施形態において、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）に対応するオープンリーディングフレーム、またはコード領域を含むまたはからなる核酸配列、ならびに（ｉｉ）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列を含んでいる。
【００６１】
他の詳細な実施形態において、本発明によって提供される核酸の配列は、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列、（ｉｉ）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる第１の核酸配列、ならびに（ｉｉ’）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる第２の核酸配列を包含し、当該第２の核酸配列が当該第１の核酸配列と同一であっても、異なっていてもよい。この場合において、当該第１または第２の核酸配列のいずれか一方が、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応する、オープンリーディングフレームまたはコード領域を含む核酸配列の５’末端と作動可能に結合され、かつ当該第１または第２の核酸配列の残る一方が、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応する、オープンリーディングフレームまたはコード領域を含む核酸配列の３’末端と作動可能に結合されている。
【００６２】
本明細書において使用されるように、“ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応する、オープンリーディングフレーム”または“ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応する、オープンリーディングフレーム”という用語は、上記オープンリーディングフレームの核酸配列に加えて、当該ｐＶＰ２タンパク質および１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）をコードする同じ核酸配列と類似の他のオープンリーディングフレームを包含する。
【００６３】
さらに、“１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレーム”という用語は、１つ以上の所望のポリペプチドを含む上記ポリペプチドのあらゆるコード核酸配列を含む。“類似の”という用語は、本明細書に使用されるように、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１までの整数である）のコード核酸配列に基づいて、例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、核酸分子のあらゆる末端に対する１つ以上のヌクレオチドの付加、あるいはあらゆる末端または配列内における１つ以上のヌクレオチドの欠損を含む、保存的なまたは非保存的なヌクレオチドの置換によって、単離または集合されるあらゆる核酸配列を包含することを指す。通常、他の核酸配列と類似の核酸配列は、当該核酸配列と実質的に相同なものである。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、“実質的に相同な”という表現は、該当の核酸配列がヌクレオチドのレベルにおいて、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性の度合いを有していることを意味している。
【００６５】
他の局面において、本発明は、本発明によって提供される核酸配列（例えば、転写因子、ならびに付加的に翻訳因子および制御因子と作動可能に結合されている本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸）を含む発現カセットを提供する。
【００６６】
詳細な実施形態において、本発明によって提供される発現カセットは、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）に対応する、オープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列、ならびに（ｉｉ）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列を含む、転写因子ならびに付加的に翻訳因子および制御因子と結合されている、核酸配列を包含する。
【００６７】
他の実施形態において、本発明によって提供される発現カセットは、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列、（ｉｉ）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる第１の核酸配列、ならびに（ｉｉ’）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる第２の核酸配列（ここで、当該第２の核酸配列は、当該第１の核酸配列と同一であっても、異なっていてもよい）を含む、転写因子ならびに付加的に翻訳因子および制御因子と結合されている、核酸配列を包含する。この場合において、上記第１または第２の核酸配列のいずれか一方は、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む核酸の５’末端と作動可能に結合され、かつ残る他方は、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む核酸の３’末端と作動可能に結合されている。
【００６８】
本発明によって提供される発現カセットに存在する上記転写因子ならびに付加的な翻訳因子および制御因子は、作動可能に連結されている核酸配列（ＩＢＤＶ ｐＶＰ２またはこれらの断片あるいは異種ポリペプチド）の転写を導くプロモータ、ならびに適切な時期および位置における転写および転写の好適な制御に必要な他の配列（例えば、開始シグナルおよび終止シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、転写促進因子、転写サイレンサーなど）を含む。本発明に係る上記因子だけでなく発現カセットの集合に使用されるベクターおよび組み換えベクターは、使用される予定の宿主細胞に従って選択される。
【００６９】
他の局面において、本発明は、本発明によって提供される核酸配列または本発明によって提供される発現カセットを含む組み換えベクターを提供する。実際には、本発明によって提供される組み換えベクターの生成には、あらゆるベクターを使用してもよい。一例を挙げると、上記好適な発現系またはベクターは、個々の場合における条件および必要に従って、異種複製開始点（例えば、細菌または酵母の中において増幅されるように、細菌または酵母の開始点）と同様に、所望の１つまたは複数の遺伝子とは異なる、トランスフェクションされた細胞の選択に使用され得るマーカをさらに有する上記プラスミド、バックミド、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージＰ１に基づく人工染色体（ＰＡＣｓ）、コスミドまたはウイルスから選択されればよい。これらの組み換えベクターは、従来の遺伝工学的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）を用いて、当該分野における当業者によって得られてもよく、これらは、本発明の一部である。
【００７０】
詳細な実施形態において、上記組み換えベクターは、集合してＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を形成する本発明の融合タンパク質を複製周期の間に発現する、酵母の形質転換に好適なプラスミドのようなプラスミド、あるいは組み換えバキュロウイルスのようなウイルスである。詳細な実施形態において、ｐＶＰ−４５６タンパク質におけるＣ末端位置にＦＭＤＶキメラＢＴペプチドを含むＣＶＬＰｓ、特にＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、酵母において得られる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株（実施例３）の形質転換に使用された発現プラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６−ＢＴは、この目的のために生成された。他の詳細な実施形態において、ＣＶＬＰｓは、ｒＢＶに基づく発現系（実施例１）を用いて得られている。
【００７１】
他の局面において、本発明は、本発明によって提供される核酸配列（例えば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列をコードしている核酸配列を含む核酸）を含む宿主細胞を提供する。詳細な実施形態において、上記宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む、本発明によって提供される核酸配列によって形質転換された細胞である。他の詳細な実施形態において、上記細胞は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む本発明の核酸配列を用いて形質転換された、トランスフェクションされた、または感染されている細胞である。
【００７２】
本発明によって提供される核酸配列を用いた形質転換に好適なあらゆる宿主細胞、または本発明によって提供される組み換えベクターを用いた形質転換された、トランスフェクションされた、もしくは感染に好適なあらゆる宿主細胞としては、例えば、哺乳類の細胞、トリの細胞、または酵母の細胞などを用いられてもよいが、詳細な実施形態において、上記宿主細胞は、酵母細胞および昆虫細胞から選択される。酵母は、容易さおよび生産費用に関して好適である。昆虫細胞は、発現系がｒＢＶを含むときに、好適である。ｒＢＶの使用は、バキュロウイルスの宿主範囲に関する生物学的研究における安全性の問題にとって有利である。
【００７３】
詳細な実施形態において、本発明は、本発明によって提供される組み換えベクター、または本発明の核酸配列を含むプラスミドのような本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明によって提供される発現カセットを用いて形質転換された、酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳ． ｐｏｍｂｅなどのようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属あるいはＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓなどのようなＰｉｃｈｉａ属の酵母）のような宿主細胞を提供する。
【００７４】
詳細な実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む本発明の核酸配列または本発明によって提供される発現カセットを含むｒＢＶのような、本発明によって提供される組み換えベクターを用いて感染させた、昆虫細胞のような宿主細胞を提供する。
【００７５】
他の局面において、本発明は、上記融合タンパク質の発現および必要に応じて上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の回収を可能にする条件において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含み、かつ本発明によって提供される宿主細胞を、培養することを包含する、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を生産する方法を提供する。詳細な実施形態において、当該方法は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む本発明の核酸配列によって形質転換された細胞からなる、本発明によって提供される宿主細胞を用いて実施される。他の詳細な実施形態において、当該方法は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明によって提供される組み換えベクターを用いて形質転換された、トランスフェクションされた、または感染されている細胞からなる、本発明によって提供される宿主細胞を用いて実施される。
【００７６】
上記細胞において本発明の融合タンパク質を発現した後に、発現されたタンパク質は、集合してＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を形成する。ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、必要に応じて、培地から単離または除去ならびに精製されてもよい。当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の単離および精製は、例えば、ショ糖勾配分画法のような従来の方法によって行なわれてもよい。
【００７７】
詳細な実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞であり、かつ本発明の融合タンパク質の遺伝子発現は、昆虫細胞において本発明によって提供される核酸配列から本発明の融合タンパク質を発現することができるｒＢＶを用いた方法によって行われる。従って、詳細な実施形態において、本発明は、（ｉ）組み換えタンパク質を発現して、これらの集合によるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の形成を可能にする条件において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むｒＢＶを用いて感染させた昆虫細胞を培養すること、および（ｉｉ）必要に応じて、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を単離および付加的に精製することを包含するＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の生産方法を提供する。従って、当該方法は、まず、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む、本発明の核酸配列または本発明によって提供される発現カセットを含むｒＢＶから構成される組み換えベクターを得ること、当該ｒＢＶを昆虫細胞に感染させて組み換えタンパク質を発現させること、ならびに必要に応じて、本発明の融合タンパク質の集合によって形成されるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の単離および続いて付加的に当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の実質的な精製を包含する。
【００７８】
本発明の融合タンパク質の発現を可能にする組み換えバキュロウイルスの集合は、ここに記載された事項およびこの技術に関する分野の状態（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．、Ｌｅｕｓｃｈ ＭＳ ｅｔ ａｌ． １９９５．“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける組み換えバキュロウイルス（バックミド）の直接の選択にとっての新規の宿主ベクター系”Ｇｅｎｅ １６０：９１ − ４、およびＬｕｃｋｏｗ ＶＡ ｅｔ ａｌ． １９９３．“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて増殖させたバキュロウイルスゲノムに外来遺伝子の部位特異的なトランスポゾンを媒介する挿入することによる、感染性組み換えバキュロウイルスの効率的な生成”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：４５６６−７９）に基づいて当該分野における当業者によって実施されてもよい。
【００７９】
他の詳細な実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞であり、本発明の融合タンパク質の遺伝子発現は、酵母細胞において本発明の融合タンパク質の発現を可能にする組み換えベクターを用いる方法によって行われてもよい。従って、詳細な実施形態において、本発明は、（ｉ）組み換え融合タンパク質の発現およびこれらの集合によるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の形成を可能にする条件において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターを用いて形質転換した酵母の培養、ならびに（ｉｉ）必要に応じて、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の単離および付加的な精製を包含するＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の生産方法を提供する。従って、当該方法は、まず、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む、本発明の核酸配列または本発明によって提供される発現カセットを含むプラスミドから構成される組み換えベクターを得ること、当該組み換えベクターを用いて酵母細胞を形質転換させて組み換えタンパク質を発現させること、ならびに必要に応じて、本発明の融合タンパク質の集合によって形成されるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の単離および続いて付加的に当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の実質的な精製を包含する。特定の実施形態において、酵母の形質転換に好適な発現系は、ｐＥＳＣ酵母発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づいている。本発明の融合タンパク質の発現を可能にする好適な組み換えベクターを用いて形質転換した酵母を培養することは、ここに記載された事項およびこの技術に関する分野の状態（ｐＥＳＣ エピトープタグ付きベクターの取り扱い説明書 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版 Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）に基づいて、当該分野における当業者によって行われてもよい。通常、酵母細胞において得られたＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、Ｔ＝１のカプシドである。一例を挙げると、領域ＡがｐＶＰ２−４４１タンパク質から構成されるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊、ｐＶＰ２−４５６タンパク質またはｐＶＰ２−４６６タンパク質は、酵母細胞において産生されるとき、このようにして得られたＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、Ｔ＝１のカプシドのみであった。
【００８０】
他の局面において、本発明は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を産生して得るための本発明によって提供される組み換えベクターの利用に関する。
【００８１】
当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、ベクター、または生物学的活性を有する分子（例えば、疾患を処置する治療的な能力を有する、薬物、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ホルモン、酵素、または核酸など）のような所望の産物の輸送体として使用されてもよい。このため、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、治療、診断または研究の目的に使用されてもよい。詳細な実施形態において、上記生物学的な所望の分子は、輸送された動物もしくはヒトにおける免疫反応抗原または誘導因子のような所望のポリペプチドを包含するので、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊ウイルス、細菌、寄生虫または他の種類の微生物に起因するヒトおよび動物の疾患に対するワクチンの調製に使用されてもよい。また、上記生物学的な所望の分子は、好適な細胞内において誘導されるような遺伝子治療に有用な核酸配列を含むので、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊遺伝子治療ベクターの調製に使用されてもよい。また、上記生物学的な所望の分子は、所望の衛生的な化合物（疾患を処置する能力を有する抗体、ホルモン、または酵素など）含むので、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊活性物質の輸送系として使用されてもよい。
【００８２】
従って、他の局面において、本発明は、薬学的組成物（例えば、ワクチン、または活性物質の輸送系など）の調製におけるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の利用に関する。詳細な実施形態において、当該薬学的組成物は、ウイルス、細菌、寄生虫または他の種類の微生物に起因するヒトまたは動物の疾患、あるいは腫瘍性の疾患に対する予防を与えることを目的とするワクチンである。他の詳細な実施形態において、当該薬学的組成物は、遺伝子治療ベクターである。他の詳細な実施形態において、当該薬学的組成物は、活性物質の輸送系である。上記活性物質は、例示的かつ非限定的に、疾患の治療に潜在的に関与する薬物、抗体、ホルモンまたは酵素などである。
【００８３】
さらに、他の局面において、本発明は、治療に有効な量のＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊ならびに薬学的に受容可能な補助剤または賦形剤を含む薬学的組成物に関する。詳細な実施形態において、当該薬学的組成物は、ワクチン、遺伝子治療または活性物質の輸送系である。
【００８４】
他の局面において、本発明は、薬学的に受容可能な補助剤および／または賦形剤を付加的に有する治療に有効な量のＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を含むワクチンに関する。当該ワクチンは、微生物（例えば、ウイルス、細菌または寄生虫など）に起因する疾患、または腫瘍性の疾患に対する動物およびヒトの保護（例えば、予防）に有用である。詳細な実施形態において、当該ワクチンは、１つ以上の感染性の疾患誘導因子に起因する感染に対する動物およびヒトの同時の予防にとって、特に有用である。一例を挙げると、本発明によって提供されるワクチンは、トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、ガン、キジ、ウズラおよびダチョウなど）をＩＢＤＶおよびトリの疾患の原因である１つ以上の感染性因子（トリの病原体）に対して予防することに使用されてもよい。
【００８５】
本明細書において使用される意味において、“治療に有効な量”という表現は、所望の影響を引き起こすように、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の計算された量を意味しており、この量は、他にも理由があるが、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の典型的な性質および得られる免疫効果によって、通常、決定される。
【００８６】
上記ワクチンに使用され得る薬学的に受容可能な補助剤および担体は、当該分野における当業者にとって周知であり、かつ従来のワクチンの調製に使用される補助剤および担体である。
【００８７】
詳細な実施形態において、上記ワクチンは、食塩溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）もしくはあらゆる他の薬学的に受容可能な希釈剤のような、薬学的に受容可能な希釈剤における溶液または水性の懸濁液として調製される。
【００８８】
本発明によって提供されるワクチンは、上記ワクチンが選択された投与方法に好適である薬学的な形態に調合されるために、使用された異種の配列またはエピトープに対して、結果として免疫反応を生じるあらゆる好適な投与方法によって投与されてもよい。詳細な実施形態において、本発明によって提供されるワクチンの投与は、非経口的（例えば、腹腔内的または皮下的など）に実施される。
【００８９】
他の局面において、本発明は、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を含む遺伝子治療ベクターに関する。
【００９０】
他の局面において。本発明は、少なくとも１つのＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊および１つの活性物質を含む活性物質の輸送系に関する。例示的かつ非限定的に、活性物質としては、疾患の処置に治療の能力を有する薬物、抗体、ホルモンまたは酵素が挙げられる。
【００９１】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、あらゆる意味において本発明を限定するものではない。
【００９２】
〔実施例１：昆虫細胞におけるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊採取および構造的多様性の解析〕
Ｉ．材料と方法
（ウイルスの調製）
抗体型ＩのＩＢＤＶ株であるＩＢＤＶ ソロア株は、ウズラの筋肉ＱＭ７細胞から通常の手順によって精製され（Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ． １９９９．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３， ６９７３−６９８３）、２５ｍＭ ＰＥＳ緩衝液に保存された（ピペラジン−Ｎ−Ｎ’−ビス（２−エタノスルホン酸） ［ＰＩＰＥＳ］ ｐＨ＝６．２、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＣａＣｌ２）。
【００９３】
（組み換えバキュロウイルスの集合）
組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）ＦＢ／ＶＰ２−４５６は、以前に説明されている（Ｃａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１． “伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの主要なカプシドタンパク質ＶＰ２のＣ末端は、カプシド集合体にとってのＴ数の決定に関与する”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５， １０８１５−１０８２８）。
【００９４】
プラスミドｐＶＯＴＥ．／ＰＯＬＹ（Ｏｎａ ｅｔ ａｌ， ２００４．“ｐＶＰ２のＣ末端領域は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのカプシドポリペプチドである、ＶＰ２とＶＰ３との相互作用に必須である”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２２， １３５−１４２．）は、ＦＢ／ＶＰ２−４４１、ＦＢ／ＶＰ２−４６６、ＦＢ／ＶＰ２−４４１ＦＢ／ＶＰ２−４７６、ＦＢ／ＶＰ２−４８７、ＦＢ／ＶＰ２−４９４、ＦＢ／ＶＰ２−５０１およびＦＢ／ＶＰ２−５１２として同定されているｒＢＶを生成するために、ｐＶＰ２に由来するこれらのＤＮＡ断片のＰＣＲ合成に関する鋳型ＤＮＡとして使用されている。ＰＣＲは、ベントＤＮＡ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡ）重合酵素（Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに、５’末端に対する同じプライマー（５’−ｐＶＰ２）および各変異体の３’末端に特異的なプライマー（表１）を用いて実施された。
【００９５】
【表１】
【００９６】
Ｂｇｌ ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いたＰＣＲ消化の断片は、タンパク質発現プラスミドＦａｓｔＢａｃおよびｐＨｉｓＦａｓｔＢａｃ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の多（ポリリンカー）クローン化部位にクローン化された。プラスミドｐＨｉｓＦａｓｔＢａｃ−Ｃは、ｐＶＰ２の変種を発現させるために用いられた。使用された外部のタグ配列の１文字表記は、ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＧＳ（配列番号１２）である。結果として生じるプラスミド配列は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の配列決定法によって確認された（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７．“連鎖停止阻害剤を用いたＤＮＡ配列決定”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４， ５４６３−５４６７）。
【００９７】
バックミドの選別は、Ｅ． ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂａｃ株から得て、リポフェクトアミンを用いてそれらをトランスフェクションするためのこれらの調製は、製品（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の手順に従って実施した。
【００９８】
集合体は、Ｈ５昆虫細胞において発現された（Ｍａｒａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのカプシドの内部タンパク質ＶＰ３の同定およびＲＮＡ結合モチーフの性質決定”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７， ２４５９−２４６８）（図１）。
【００９９】
（ｐＶＰ２欠損変異体構造の性質決定）
Ｈ５細胞は、好適なｒＢＶを用いて、１つの細胞につきプラーク形成単位（ＰＦＵ）１〜５の感染の多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）に感染させた。細胞は、感染後４８時間（４８ ｈｏｕｒｓ ｐｏｓｔ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（ｈ．ｐ．ｉ．）において回収され、氷上において１％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＥＳ溶解緩衝液に溶解された。粒子の材料は、２０％のショ糖の緩衝物および２５〜５０％の直線的なショ糖勾配を通して精製された。ｐＶＰ２欠損変異タンパク質を含む粒子の材料は、超遠心分離によって２０倍に濃縮され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって同定された。ＶＰ２を豊富に含む分画は、構造的な研究用に選抜され、精製の後から最初の１〜２日以内に使用された。
【０１００】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング）
感染細胞の細胞抽出物（１０〜１５μｌ）またはショ糖濃度勾配の画分（２〜５μｌ）は、１倍の最終濃度に達するまでレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液に加えられ、加熱された（１００℃において２分間）。電気泳動は、１１％のポリアクリルアミドゲル（３８．９６％（体積あたりの重さ）のアクリルアミドおよび１．０４（体積あたりの重さ）のビス−アクリルアミドメチレン）において実施された。ウエスタンブロッティングは、抗ＶＰ２血清（Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ． １９９９．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：６９７３−６９８３）を用いて実施された。ウサギ抗ＶＰ３血清は、陰性対照として使用された。抗Ｈｉｓタグ抗体は、Ｓｉｇｍａから得られた。
【０１０１】
（従来の電子顕微鏡法）
ショ糖勾配の各画分の試料２〜５μｌが用意され、２％（体積あたりの重量）の水性の酢酸ウラニルを用いて逆染色された。顕微鏡写真は、１００ｋＶにおいて動作する公称倍率４００００倍のＪＥＯＬ １２００ ＥＸＩＩ電子顕微鏡を用いて記録された。
【０１０２】
（電子顕微鏡法）
試料（５μｌの液滴）またはビリオンもしくはＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドを含む画分は、Ｃａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｃａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１． “伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの主要なカプシドタンパク質ＶＰ２のＣ末端は、カプシド集合体にとってのＴ数の決定に関与する”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５， １０８１５−１０８２８）によって本質的に開示されているように確立された方法に従って、石炭を用いて覆われた網の上に置かれ、水滴を用いて２回洗浄され、吸収によって乾燥され、かつ液体エタン槽に沈められた。顕微鏡写真は、２００ｋＶにおいて動作し、かつ視野装置を備えるＴｅｃｎａｉ Ｇ２電子顕微鏡において、公称倍率５００００倍において捕えられた試料が６−１０ｅ−／ｎｍ２の露光を受け取るように、最小の露光条件において記録された。バクテリオファージＴ４がガラス化され、尾部の鞘の軸方向に対する４０．５オングストロームの間隔が内部の倍率対照として使用された。
【０１０３】
（円偏光２色性（ＣＤ）顕微鏡法）
配列番号１のペプチドは化学的に合成され、遠紫外線円偏光２色性のスペクトルが、２５℃において０．１〜１ｍｍの大きさを有する細胞を用いてＪａｓｃｏ ２色性写真に記録された。ペプチド濃度は、１０から２００μＭの範囲を使用した。ＣＤスペクトルは、Ｊｉｍｅｎｅｚ １９９９（Ｊｉｍｅｎｅｚ ｅｔ ａｌ， １９９９．“アルファチュブリンのＣ末端（４０４−４５１）組み換えペプチドおよびベータチュブリンのＣ末端（３９４−４４５）組み換えペプチドのらせん構造”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ８， ７８８−７９９）によって以前に説明されたように分析された（図４Ａ）。
【０１０４】
（画像解析）
通常の画像処理操作が、ＰＩＣソフトウェアシステム（Ｔｒｕｓ ｅｔ ａｌ． １９９６.“電子顕微鏡のデジタル画像処理：ＰＩＣ システム−ＩＩＩ”Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１６， ６１−６７）を用いて実施された。顕微鏡写真は、フーリエ解析によって、それらの解像度および非点収差に関して評価された。選択された電子顕微鏡写真のサブフォーカル（ｓｕｂ−ｆｏｒｃａｌ）値は、電子顕微鏡のコントラスト伝達関数の第１の０以内にある解像度において構造を再構成することを可能にする。解析された選択された顕微鏡写真にとってのサブフォーカル値（ＩＢＤＶにとって８１、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドにとって８２）は、０．６から３．７μＭの範囲（それぞれ、１２〜３０オングストロームの間隔におけるＣＴＦ）にわたって、ビーソフトパッケージ（Ｂｓｏｆｔ ｐａｃｋａｇｅ）（Ｈｅｙｍａｎｎ， ２００１）を用いて測定された。顕微鏡写真は、Ｚｅｉｓｓ ＰｈｏｔｏＳｃａｎ ＴＤ ｓｃａｎｎｅｒを用いて２１μｍ／ピクセル（試料において４．２オングストローム）において得られ、かつ階級化して（ｂｉｎｎｅｄ）２１μｍピクセルを生成した。タンパク質の粒子は、抽出され、かつＣｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．の自動化された方法（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３．“ＨＳＶ−１の凍結した水和カプシドに対する放射線障害に対する影響”Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１１， ２２２−２３３）を用いて前処理された。粒子の角度方向に関する第１の評価は、開始モデルとして３次元再構成したＩＢＤＶを用い、好適な尺度および２８オングストロームの解像度において、“通常の方式の”フーリエ変換における処理（ＰＦＴ：ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｆｏｕｒｉｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ）（Ｂａｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ， １９９６．“凍結電子顕微鏡法によって結像された生物学的な巨大分子の方向を決定するモデルベース（ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ）手法”Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１６， １２０−１３０）によって測定される。新しい密度配置像が算出され、かつ振幅および面情報の両方が使用可能なように、ＰＦＴの演算手順を改良した様式を用いて、続く面方向決定のすべての補足および起点に使用された。
【０１０５】
モデルベース処理のみが、小さなＶＰ２カプシドを再構成するために使用され、大きなＶＰ２カプシドから抽出された他の小さなＶＰ２カプシドは、開始モデルとして使用された。その３次元構造は、対称性によって元のカプシドと関連する無作為に選択する等価な観察によって、加重逆投影法を用いて正２０面体の対称性を課すことなく、かつ全体の配向性間隔を通して、方向決定を分布させることなく、内部対照として算出された。結果として得られた密度配置像は、低解像度においてであるが、正２０面体の対称性に基づく方法を用いて得られた密度配置像と類似であった（図示せず）。面は、要求されたＣＴＦの小葉（ｌｏｂｕｌｅ）面の単純な転移を用いて、コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）に関して補正された。再構成は、フーリエ−ベッセル手法（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ， １９７１．“電子顕微鏡写真からのフーリエ合成による３次元再構成の手法”Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｓｅｒ Ｂ ２６１， ２２１−２３０）を用いて算出された。最終的な再構成は、ＩＢＤＶおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドに関する１０８４９および１５５７の画像を組み合わせ、かつ解像度は、それぞれ１２および１５オングストロームの外皮のフーリエ相関基準（閾値０．５）を用いて得られた。より小さいＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドについての他の再構成は、顕微鏡写真の同じ設定から算出された。１０８の粒子を含む最終的な再構成解像度は、ＦＳＣ解析（Ｃｏｎｖａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３．“ＨＳＶ−１の凍結した水和カプシドに対する放射線障害に対する影響”Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１１， ２２２−２３３）によって得られた評価に従って、約２３オングストロームと評価された。
【０１０６】
球面的に定量された半径方向の密度プロファイルは、Ｔ＝１３の配置像の両方について算出され、かつ標準化および両方のプロファイルを重ねる倍率にされた。それから、配置像は、両方の差異および２つの配置像の水準を変えることによって得られた。小さな密度の島は、タンパク質の外皮に対応する半径について、より大きな差異のみに考慮して、フィルタを通して、両方の配置像の結果（図８Ｅおよび８Ｆを参照のこと）に転換された。
【０１０７】
ＩＩ．結果
（Ｎ末端にＨｉｓ−タグを有しているｐＶＰ２タンパク質Ｃ末端欠損変異体）
組み換えバキュロウイルスにおいて発現されるとき、ＶＰ２タンパク質（４４１アミノ酸）に生じているｐＶＰ２タンパク質のＣ末端（５１２アミノ酸）のプロセシングが起こらないと仮定すると、Ｃ末端の長さについて変化しているｐＶＰ２の異なる集合体が、上述の系において発現される。４５６、４６６、４７６、４８７、４９４および５０１位（図３Ａ）は、上述の領域を均一に覆うために選択される。これらのｐＶＰ２／ＶＰ２変種のウエスタンブロッティング解析は、Ｃ末端に欠損を有するｐＶＰ２変異体のすべてが、正確に発現されて、主要なバンドを生じる（図１）。また、ＨｉｓタグとそれらのＮ末端において融合されている（ＨＴ−ＶＰ２）、ｐＶＰ２／ＶＰ２変異体の同じ組が、生成される。ｐＶＰ２／ＶＰ２の変種の分子量は、表２に示されている。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
ｐＶＰ２／ＶＰ２の変種は、高い水準に発現され、かつショ糖勾配を受けて、ショ糖の緩衝物を用いて精製された。上述の勾配から得られた画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって性質決定された。クーマシーブルーを用いて染色されたゲルは、ｐＶＰ２の変種を含む画分が非常にブロードなバンドを有していることを示した（図３Ｂおよび３Ｃ）。以下に説明されている手法に従ってＩＢＤＶを感染させた細胞から得られた融合タンパク質は、上述の結果と比較するために精製された（図３Ｄ）。Ｈｉｓタグを含んでいないｐＶＰ２変異体は、異種の指向性を示し、一方において、Ｈｉｓタグを含んでいるｐＶＰ２／ＶＰ２融合タンパク質は、Ｃ末端領域の長さの増加に合わせてその大きさが増加するように構成されている（図３Ｃ）。
【０１１０】
（ｐＶＰ２／ＶＰ２集合体の電子顕微鏡解析）
ショ糖勾配から得られ、電子顕微鏡法によって逆染色された、異なるタンパク質の画分の解析は、ｐＶＰ２のＣ末端の長さおよびＨｉｓタグの有無に依存して異なる形態を示した。
【０１１１】
ＶＰ２−４４１（図４Ａ）およびＶＰ２−４６５（図４Ｂ）は、Ｔ＝１２の対称性を有する１２面体のカプシドの直径と一致する２３ｎｍの直径を有するドーナツ型の集合体構造を生じる。従って、形成されるＶＰ２−４６６集合体の種類によって、その変種は、ショ糖勾配を通ってある位置に置かれる。約２５ｎｍの直径を有する細い管を含む（図４Ｃ）下部の画分は、らせんの形態に規則正しく整列した（図４Ｃの箱）。中間の画分は、この対称性がおそらく非常に不安定であることを示すカプシドを妨げる物質によって取り囲まれた、Ｔ＝１と類似の対称性のカプシドを有する短めの細い管を示した（図４Ｄ）。また、Ｔ＝１３と類似の対称物が、たまに観察された（図４Ｄの箱）。勾配における上部に優勢な構造は、同程度の小さい粒子であった（図４Ｅ）。ＶＰ２−４７６ＶＰ２−４６６と同じような挙動を示す。ＶＰ２−５０１のほとんどは、勾配の下半分における画分に移動し、約３５ｎｍの直径を有する部分的に整列した管に集合した（図４Ｆ）。勾配の上半分の部分において、ＶＰ２−５０２は、不規則な大きさを有する等軸のねじれた管状の構造に集合している。ＶＰ２−５１２が、曲がった短い細管および不規則な粒子として最終的に観察された。
【０１１２】
ＩＢＤＶによって感染した細胞において、生成した構造のほとんどは、勾配の中間に位置し、かつ６５〜７０ｎｍの直径を有する正２０面体の粒子と一致していた（図４Ｈ）。しかし、種類Ｉの管と呼ばれる六角形の構成を有する管状の構造は、勾配の下部の近くに観察された（図４Ｇ）。
【０１１３】
これらの結果のすべては、ＶＰ２−４６６が６量体（細い管）種のカプシドおよび５量体（Ｔ＝１のカプシド）種のカプシドを形成するという十分な情報を示し、かつＴ＝１３集合体を有するカプシドがたまに観察された。
【０１１４】
（（Ｈｉｓ−）ｐＶＰ２／ＶＰ２集合体の電子顕微鏡解析）
ＨＴ−ｐＶＰ２／ＶＰ２融合タンパク質の集合体は、同様に解析された。２３ｎｍの直径を有する粒子の存在は、ＨＴ−ＶＰ２−４４１が豊富に含まれる画分において観察された（図５Ａ）。ＨＴ−ＶＰ２−４５６変異体は、実際に感染性を有するＴ＝１３のカプシドと類似の形態を有する、勾配の中間に移動した構造の集合体を産生した（図５Ｂと図４Ｈとを比較すればよい）。Ｔ＝１のカプシドであるＨＴ−ＶＰ２−４６５のほとんどは、勾配の上部の部分に位置していた。正しいカプシドを形成する傾向は、ＨＴ−ＶＰ２−４６６において向上された（図５Ｃ）。Ｔ＝１３と類似のカプシドを有する粒子は、多量に存在することを示し、かつこれらが高い効率において得られるので、これらは、高い解像度の構造的な研究用に選抜された。５３ｎｍという中程度の大きさを有するカプシドは、Ｔ＝１３のカプシドと容易に区別され得る（図５Ｃの矢印）。
【０１１５】
ＨＴ−ＶＰ２−４７６（図５Ｄ〜Ｆ）およびＨＴ−ＶＰ２−４８７の融合タンパク質は、ウイルスと同様の構造を有するカプシドとして集合される能力を維持していたが、その効率は低かった。優勢な構造は、種々の長さを有する六角形の管であった（図５Ｄ）。最後に、ＨＴ−ＶＰ２−４９４、ＨＴ−ＶＰ２−５０１およびＨＴ−ＶＰ２−５１２の融合タンパク質は、明らかに六角形の配列を有する管状の構造のみを形成した。
【０１１６】
異なるｐＶＰ２／ＶＰ２タンパク質のＮ末端におけるＨｉｓタグは、規則正しい粒子におけるサブユニットの集合に影響を与えなかった。ＶＰ３の非存在において、カプシドの他の主要な構成要素であるＨＴ−ＶＰ２−４５６は、Ｔ＝１３のカプシド類似の対称性を有する構造の正確な集合を可能にする。
【０１１７】
（ｐＶＰ２Ｃ末端領域の４４３〜４５２アミノ酸の円偏光２色性解析）
ｐＶＰ２タンパク質Ｃ末端の４４３〜４５２アミノ酸と一致する、配列番号２のペプチドの２次構造は、アガディール（Ａｇａｄｉｒ）コンピュータプログラム（Ｍｕｎｏｚ ａｎｄ Ｓｅｒｒａｎｏ， １９９４．“実証的な要因を用いたらせん状のペプチドの折りたたみに関する課題の解明”Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １， ３９９−４０９）を用いて予測された。上述のプログラムは、両親媒性のαらせんを生じる、上記ペプチドにおいて明白ならせん状の傾向を検出した（図１０Ｂの左）。この予測を対比するために、４４２〜４５４アミノ酸である合成ペプチドが合成され、２次構造の平均が円偏光２色性によって解析された。水性の緩衝液において、上記ペプチドは、不揃いな曲がりくねった形態を取り入れたような、無意味ならせん構造を示した。らせん体を誘導する溶媒であるトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）が加えられたとき、上記ペプチド明確にらせん体の構成要素の形態を生じた。類似の周知の構造を有するペプチドが見られるか否かを調べるために、ＷＨＡＴＩＦ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｂｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／ｇｖ／ｗａｈｔｉｆ）を用いてＰＤＢ（タンパク質データベース）において検索され、上記ペプチドは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｃａｎａのトリオースリン酸イソメラーゼにおける２４１〜２５０アミノ酸（Ｌｍ ＴＩＭ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９．“ｌｅｉｓｈｍａｎｉａトリオースリン酸イソメラーゼの構造的かつ変異生成の研究：点変異が触媒能力を失うことなく、中温性の酵素を非常に安定な酵素に転換することができる”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １２， ２４３−２５０）に見られた。一文字表記においてＥＦＲＤＩＩＤＡＴＲ（配列番号１３）と表される上記ペプチドを１０個のｐＶＰ２アミノ酸と比較すると、保存的な変化（Ｋに対してＲ）、負荷された鎖の片側の維持によって極性を変えるＲを用いたＤの置換、およびＩに対してＴの変化があり、両親媒性がほとんど一致していることが観察された。
【０１１８】
（ＩＢＤＶ カプシドの構造）
ＩＢＤＶ粒子の極低温顕微鏡写真は、明確に周辺を表す領域を示している（図６Ａ）。Ｔ＝１３のカプシドの最終的な密度配置像は、１２オングストロームの解像度を用いて算出された。上記カプシドの分子集合体は、Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７．“極低温電子顕微鏡法によって決定された伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの３次元構造”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１， ３２５−３３０）によって開示されている、主要な性質として連続的な外皮から突出している２６０個のＶＰ２の３量体が存在し、かつ異なる形態における５種類に並べられている（図６Ｂのａ〜ｅ）ことと、必須に類似している。解像度の向上によって、より正確かつ厳密な方法において構造的な詳細の多く、特にカプシドの内側における５つの軸を同定することができた。このようにして、５量体ごとに５つある内側に６０個ある３量体は、２つの環状の端部によって置き換えられている。一方において、予測されていたように（図９）、最も外側の端部は、１０個の緊密に接続された球状の密集体によって形成され、内側の端部は、５つの球状体によって形成されている。他の関連する面は、カプセル状の外皮における穴の存在に関与している。これらの穴（全部をあわせて６１６個）は、約１５オングストロームの直径を有しており、外側における隣接する３量体の間にある接続腕と呼ばれる、密度接続に基づいて正確に配置されている。
【０１１９】
（Ｈｉｓ−ＶＰ２−４６６ カプシドの構造）
ウイルス様粒子が豊富に含まれる画分の遠視顕微鏡解析は、ＶＰ２−４６６カプシドが、異なっているが、類似の集合体を有するカプシドの複雑な混合物によって形成されていることを示している（図７Ａ）。これらのカプシドは、より小さい異性体の集合体を有する、６５ｎｍ（Ｔ＝１３のＩＢＤＶカプシドと類似している）から５３ｎｍまでの範囲にある大きさをほぼ有している。これらの構造物のすべては、同じ周辺を表す領域を示した。ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシド３次元再構成は、１５オングストロームの解像度を用いて測定された（図７Ｂの左および中央）。ＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの外側は、ほとんど重なり合っているが、内側は、明らかな差異を示している。より大きな構造上の差は、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドにおいてＹ字型の３量体の構造を接続しているが、ＩＢＤＶカプシドにはない付加的な密度が観察される、対照な５つの部分から成る軸および６つの部分から成る軸に関する。
【０１２０】
中間の大きさを有するＨＴ−ＶＰ−４６６カプシドの密度配置像は、３角形のカプソマーの３種類（ａ’、ｂ’およびｃ’と呼ばれる）のみを必要とすることを除いて、Ｔ＝１３のカプシドにおける３量体のカプソマーの類似物との等価性に基づいて、Ｔ＝７の対称性を示した（図７Ｂの右）。Ｔ＝１３のカプシドとＴ＝７のカプシドとは、正２０面体の格子においてＨＴ−ＶＰ−４６６の同じ必須の３量体の塊を共有している。
【０１２１】
（ＩＢＤＶ カプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６ カプシドとの構造的および生化学的な比較）
構造上の類似性は、ＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ−４６６カプシドの半径方向の密度プロファイル（図８Ａ）ならびに中央の断面（図８ＣおよびＤ）の両方において、ほとんど完全に重なっているということが、見られた。２つの軽微な差異がタンパク質の覆い（約２５３オングストローム〜３５０オングストロームの半径）に見られる（図８Ａの矢印）。付加的な密度の頂点が、主にＩＢＤＶカプシドの内側において観察され、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドにおける他の密度の頂点が、３２５オングストローム〜３４５オングストロームの半径において、位置している。異なる配置像は、より厳密に上述の差を位置付けるために、両方の構造物において、タンパク質の鞘が有する密度の数値の数学的な減算によって算出された。２つの配置像における減算の次数を変えることによって、結果として生じる配置像は、各構造の原因になっているそれらの構造上の差異のみを示す（図８ＥおよびＦ）。ＩＢＤＶ上にある構造上の差異の位置は、大きく異なっている領域が隣接するＶＰ２の３量体の間にある接続腕であるということを示している。内側における構造上の差異は、正確にはＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの内側の高密度体が配置されている、主に対称な５つの部分から成るおよび６つの部分から成る軸にある。
【０１２２】
クーマシーブルーを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル染色は、ウイルス粒子を多く含む画分が、全体のタンパク質のほぼ９０％を構成する主要な要素として、ｐＶＰ２／ＶＰ２およびＶＰ３を含んでいるということを示した（図８Ｂ）。ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドによって電子顕微鏡データを得るために使用した画分の等価な分析は、上述のカプシドが約５４ｋＤａの単一のポリペプチドから構成されていることを示した。タンパク質のさやの水準における最小の差異がＶＰ３との差異を確認したことを考慮しないので、得られた結果は、両方のカプシドがＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドのそれぞれにとって、単一のタンパク質、ＶＰ２またはそのＨｉｓタグ変種から集合され、かつＶＰ３がＩＢＤＶカプシドの必須な構成要素として組み入れられないということを意味している。
【０１２３】
（カプシドＴ＝１３における擬似等価物の解析）
このカプシドは擬似等価物を考慮する必要があるので、ＩＢＤＶカプシドにとって新しい概要が考慮される必要がある。この仮定を確かめ、かつＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−カプシドの同等な性質を評価するために、上述したカプシドの正２０面体の配置像が比較された（図９）。最も外側の断面（３２８〜３１１オングストローム）は、４両体の単位が基本的に一致していることを示した（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）。さらに、連続したカプシドが明確であり（３０２〜２９４オングストローム）、かつ最初の差異が観察された（図９Ｄおよび９Ｅ）。２８６オングストロームの半径において、Ｔ＝１３のカプシドの両方における内側の層が始まる部分に一致する断面は、内側にある３量体の単位２６０個が、対称な５つの部分から成る軸を周囲のそれらを含む、他の３量体の単位２６０個と明確に連続していることを示した（図９Ｆ）。５量体を形成する３量体は、６量体を形成する３量体よりも緊密に集合しており、かつＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの対称な６つの部分から成る軸における可視的な付加的な高密度体がある、２７７オングストロームの半径に明らかに融合されている。階数６の対称な軸における付加的な高密度体は（図９Ｈ）、２６９オングストロームの半径であることが明確である。
【０１２４】
ＩＩＩ．考察
ＩＢＤＶにおいて最も豊富なタンパク質であるＶＰ２の立体配置に関する多形性が、本発明において解析されている。ＶＰ２は、まず、成熟したＶＰ２タンパク質（４４１アミノ酸）を生じるためにＣ末端において数回のプロセシングを受ける、５１２アミノ酸の前駆体ｐＶＰ２として合成される。従って、本発明において開発したバキュロウイルスの系において発現される変異体のほとんどは、ウイルスの集合過程の間に自然に生じる中間体と一致することができる。多形性の制御を担う分子機構が、そのＣ末端に対して一時的に結合され、かつその機能を果たしたときに取り除かれる７１アミノ酸にある。ＶＰ３の非存在において、ＶＰ２タンパク質のＮ末端にＨｉｓタグが存在することは、このＨｉｓタグが集合におけるＶＰ３タンパク質の機能を再現することを示しており、正しい集合に必要である。従って、Ｔ＝１３のＩＢＤＶカプシド複合体の集合を制御することは、本発明の系において遮断されてもよい、２つのポリペプチド要素の独立した相互作用を必要とする。
【０１２５】
本発明の結果は、ＶＰ２タンパク質の変化における分子制御因子が、αらせんの形状に配列されている４４３−ＧＦＫＤＩＩＲＡＩＲ−４５３（配列番号２）断片に配置されていることを示している。本発明のＨＴ−ＶＰ２−４５６変異体は、ＶＰ２における単一の立体配置または複数の立体配置の形成における境界を表す。集合体の単位が短ければ、ＨＴ−ＶＰ２−４６１の場合のように、５量体構造のみが産生され（Ｔ＝１のカプシド）、４４３〜４５３アミノ酸が含まれていれば、Ｔ＝１３カプシドおよびＴ＝１カプシドの両方が形成される。
【０１２６】
〔実施例２：ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊免疫原性の性質決定〕
実施例１において得られたＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２−４５６の免疫原性を評価するために、免疫化試験が１日齢のニワトリにおいて実施された。簡単に説明すると、７個体のＳＰＦ（特異的抗原なし）動物の群がＰＢＳに希釈された１動物につき１０μｇのＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２−４５６を含む２００μｌの１回投与によって筋肉内に免疫化された。類似の群は、ＰＢＳを注射された。血清が両方の群における動物の１匹ずつから毎週に抽出された。群における個々の等しい容積によって代表される同質の血清（プール）を得るために、各群および日に由来する血清は、混合された。当該血清は、ＥＬＩＳＡを用いて分析された。これを受けて、ウェルが１０ｎｇのＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２−４５６を用いて覆われた。試験は、これまでに開示されている手法（Ｂｉｅｒｅｒ、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓによって編集された、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｃ＿ｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）に従って実施された。得られた結果は、補助剤の非存在において単一の免疫化がｐＶＰ２−４５６タンパク質に対する強力な反応を引き起こすことを示す。実施例１において得られた他のＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２ｓ＊が試験されたとき、同様の結果が得られた。また、スペイン特許出願Ｐ２００３００７５１、Ｐ２００４００１２０およびＰ２００４００１２１に開示されているＩＢＤＶ ＶＰ２を含む、他のキメラおよび非キメラのＶＬＰの両方が試験されたとき、同様の結果が得られた。
【０１２７】
〔実施例３：酵母におけるＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊（ｐＶＰ２-＊ＢＴ）の採取〕
発現プラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６−ＢＴは、酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の培養細胞においてＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の取得を可能にする研究用に、ｐＶＰ２−４５６のＮ末端に結合された、ＢＴと呼ばれるＦＭＤＶキメラペプチドをコードする異種の遺伝子（Ｚｈａｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ ４６（１）： １−９）を用いて生成された。当該キメラＢＴペプチドは、Ｂ細胞エピトープ（ＦＭＤＶのスペイン抗原型における単離されたＶＰ１タンパク質の１３３〜１５９位に配置されている）およびＴ細胞エピトープ（ＦＭＤＶのアジア抗原型におけるＶＰ４タンパク質の２０〜３４位に配置されている）を含んでいる。当該Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列は、一文字表記においてＳＩＩＮＮＹＹＭＱＱＹＱＮＳＭ（配列番号１４）であり、一方において、当該Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列は、一文字表記においてＭＴＴＴＹＴＡＳＡＲＧＤＬＡＨＬＴＴＴＨＡＲＨＬＰ（配列番号１５）である。
【０１２８】
発現プラスミド集合における第１の段階は、ベクターｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖにｐＶＰ２タンパク質のコード領域をクローニングすることによって実施された。プラスミドｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖは、酵素Ｐｖｕ ＩＩを用いてベクターｐＲＳ４２６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を消化し、かつ消化混合物を最連結することによって生成された。ｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖである結果物のベクターは、親ベクターｐＲＳ４２６に対して逆の位置に他クローン化領域を含んでいる。ｐＶＰ２−４５６タンパク質に対応するＤＮＡ断片は、鋳型としてプラスミドｐＶＯＴＥ．２／Ｐｏｌｙを用いて対応するオリゴヌクレオチド（表１）とともにＰＣＲ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｒｉｓｃｏ， Ｃ．， Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｓ．， Ａｌｂａｉ， Ｊ． Ｐ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ．（１９９８）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＯＲＦ Ａ１の発現がウイルス様粒子を結果として生じる”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：１０４７−１０５４）することによって得られた。断片は、精製され、酵素Ｂｇｌ ＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化が実施され、かつＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを用いてあらかじめ消化した上述のベクターｐＥＳＣＵＲＡ．ｉｎｖにクローン化された。結果物のプラスミドは、ｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６と呼ばれた。
【０１２９】
上述のＦＭＤＶキメラＢＴペプチドのオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片は、あらかじめ好適な制限酵素を用いて消化された上述のプラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６にクローン化された。
【０１３０】
上述のプラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６−ＢＴは、続いて、これまでに開示された手法（Ｇｉｅｔｚ， Ｒ．Ｄ． ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｗｏｏｄｓ． （２００２）“Ｌｉａｃ／ＳＳ担体ＤＮＡ／ＰＥＧ法による酵母の形質転換”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０： ８７−９６）に従って、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母の１倍体株である４９９の培養細胞の形質転換に使用された。上述のプラスミドを用いて形質転換した酵母は、アミノ酸であるトリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを補い、かつウラシルを欠いている（−Ｕｒａ）ＳＣ培地（ＣＳＭ＋ＹＮＢ、２％グルコースおよびバクトアガー）を用いた培養皿における増殖によって選抜された。３０℃において４８時間に渡ってインキュベーションした後に、タンパク質発現の以降の解析およびＣＶＬＰｓ−ＶＰ２−４５６−ＢＴの形成の実施に使用される、コロニーが選抜された。
【０１３１】
ｐＶＰ２−４５６およびＢＴタンパク質発現ならびにＣＶＬＰ形成の解析は、他の発現系においてＩＢＤＶ ＶＬＰの性質決定するこれまでに開示された手法（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｒｉｓｃｏ， Ｃ．， Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｓ．， Ａｌｂａｒ， Ｊ． Ｐ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ．（１９９８）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＯＲＦ Ａ１の発現がウイルス様粒子を結果として生じる”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：１０４７−１０５４、およびＬｏｍｂａｒｄｏ， Ｅ．， Ｍａｒａｖｅｒ， Ａ．， Ｃａｓｔｏｎ， Ｊ． Ｒ．， Ｒｉｖｅｒａ， Ｊ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｓｅｒｒａｎｏ， Ａ．， Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ． （１９９９）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６９７３−６９８）に従って実施された。選抜されたコロニーは、２％ラフィノースを補ったＣＳＭ（−Ｕｒａ）＋ＹＮＢ液体培地において培養された。培養細胞は、３０℃において２４時間に渡ってインキュベートされた。この培養細胞は、光学密度（ＯＤ）０．２を有する、２％のガラクトース誘導因子を補ったＣＭＳ（Ｕｒａ）＋ＹＮＢ培地を入れた２００ｍｌのフラスコにおいて、接種に使用された。培養細胞は、１８時間に渡って（ＯＤが１．０から２．０になるまで）３０℃に維持された。酵母は、４℃において５分間に渡って３０００ｐｒｍによって遠心分離され、蒸留水を用いて１回の洗浄を行ったあと、ペレットは溶解緩衝液（ＴＥＮ：ｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ）＋２倍のタンパク質分解酵素阻害剤（Ｃｏｍｐｌ Ｒｏｃｈｅ）に懸濁された。および４２５〜６００ミクロンの大きさを有するガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）の１体積が溶解物に加えられた。この混合物は、常に４℃において、２０秒の休憩を挟んで、３０秒間に渡って４回の激しいボルテックスを実施した。それから、可溶性画分は、４℃において１５分間に渡って１３０００ｒｐｍによって溶解混合物を遠心分離によって回収された。この試料は、これまでに開示されている手法（Ｌｏｍｂａｒｄｏ， Ｅ．， Ｍａｒａｖｅｒ， Ａ．， Ｃａｓｔｏｎ， Ｊ． Ｒ．， Ｒｉｖｅｒａ， Ｊ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｓｅｒｒａｎｏ， Ａ．， Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ．（１９９９）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６９７３−６９８３）に従ってショ糖勾配における画分に供された。分画後の試料および開始材料の試料は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（分子生物学における現在の手法）ならびに抗ｐＶＰ２−４５６および抗ＢＴ血清を用いたウエスタンブロッティング（分子生物学における現在の手法）によって解析された。ウエスタンブロットは、ｐＶＰ２と一致する予想される分子量（４８ｋＤａ）およびＢＴタンパク質と一致する予想される分子量を有する、バンドの存在を示した（図１１）。これらの結果は、プラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６−ＢＴを用いて形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ培養細胞において両方のタンパク質の正しい発現を示している。異なる勾配の画分は、前述したようなＴＥＭ（Ｌｏｍｂａｒｄｏ， Ｅ．， Ｍａｒａｖｅｒ， Ａ．， Ｃａｓｔｏｎ， Ｊ． Ｒ．， Ｒｉｖｅｒａ， Ｊ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｓｅｒｒａｎｏ， Ａ．， Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ．（１９９９）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６９７３−６９８３）によって解析された。勾配画分のＴＥＭ解析は、ＣＶＬＰｓ−ＶＰ２−４５６−ＢＴの存在を示した（図示せず）。
【０１３２】
〔実施例４：抗ＦＭＤＶ免疫反応を誘導するＣＶＬＰｓの能力〕
ＣＶＬＰｓが（すなわち、ＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊（ｐＶＰ２−ＢＴ）（実施例３））マウスにおけるＦＭＤＶに対する免疫反応を誘導する能力を評価するために、１４日齢のバルブク（Ｂａｌｂｃ）マウスの４つの群（１群につき１０匹の動物）が、筋肉内的に免疫化された。処置群は、以下の群：
群１、偽薬（ＰＢＳ）；
群２、５０μｇのＣＶＬＰｓ；
群３、１００μｇのＣＶＬＰｓ；および
群４、５０μｇのＣＶＬＰｓに加えて補助剤
であった。
【０１３３】
トコフェロールが補助剤として使用され、かつ免疫原（ＣＶＬＰｓ）の量は、最終量が０．２ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁された。ワクチン接種から３週間の後に、血清試料は、各動物から回収され、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）特異抗体の存在が、前述のようなウサギ 抗抗原型Ｃ ＦＭＤＶ血清（抗Ｃ１ノビル（Ｎｏｖｉｌｌｅ））（Ｅ． ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２３ （２００５） ２６４７−２６５７）を用いて捕捉した非精製のＦＭＤＶ株Ｃ−Ｓ８ｃｌウイルスに対する、捕捉ＥＬＩＳＡ（ｔｒａｐｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ）によって検出された。
【０１３４】
簡単に説明すると、９６穴プレートが炭酸塩緩衝液における抗Ｃ１ノビル血清を用いて覆われ、室温において１昼夜に渡って乾燥させた。プレートは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．００５％）（洗浄緩衝液）を用いて３回洗浄され、ＦＭＤＶ株Ｃ−Ｓ８ｃｌに感染させた胎児のハムスターの腎（ＢＨＫ）細胞からの上清と一致する抗原がウェルに加えられた。インキュベーション（３７℃において１時間）の後に、ウェルは、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄され、５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液（ブロッキング緩衝液）を用いて１時間ブロッキングされた。
【０１３５】
ブロッキングの後に、プレートは、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を加えたブロッキング緩衝液を用いた、上述したマウス（例えば、偽薬マウスおよびＣＶＬＰｓ免疫化マウス）の４つの群に由来する血清の希釈物に用いて２時間インキュベートされた。洗浄（洗浄緩衝液を用いて２回）の後に、ウェルは、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を加えたブロッキング緩衝液に懸濁させたホースラディッシュ ペルオキシダーゼと結合されたヤギ抗マウス血清を用いて１時間インキュベートされた。多数回の洗浄の後に、基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）がウェルに加えられ、反応は、１０分間現像され、２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて停止された。抗原抗体反応は、２９２ｎｍにおける分光光度計において決定された。
【０１３６】
図１２に示されているように、群３および４に由来する動物のいくらかが、ＦＭＤＶに対する特異的な抗体を主張する資格を示した。これらの結果は、ＣＶＬＰｓ（ＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊（ｐＶＰ２＊−ＢＴ）（実施例３））を用いた免疫化がＦＭＤＶに対する免疫反応を誘導し、かつこの免疫反応が補助剤の付加によって増加されたことを明瞭に指し示している。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、Ｎ末端にＨｉｓタグを有している、および有していないｐＶＰ２のＣ末端欠損変異体の発現を示しており、Ｈｉｓタグを有している（図１Ａ）および有していない（図１Ｂおよび図９Ｃ）ｐＶＰ２／ＶＰ２発現変異体の回収は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＶＰ２ポリクロナル抗体（図１Ａおよび１Ｂ）および抗Ｈｉｓポリクロナル抗体（図１Ｃ）を用いたウエスタンブロッティングによって解析された。
【図２】図２は、ｐＶＰ２のＣ末端におけるαらせんの解析を示しており、図２Ａは、３０％のトリフルオロエタノール（ＴＥＥ）の存在下（破線）または非存在下（実線）のＰＥＳ緩衝液における、１文字表記においてＦＧＦＫＤＩＩＲＡＩＲＲＩ（配列番号１）と表される、ポリペプチドの円偏光２色性（ＣＤ）スペクトルを示し、図２Ｂにおいて、ＬｍＴＩＭの２４１〜２５０残基の２次構造が示されている。
【図３】図３は、クーマシーブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるｐＶＰ２タンパク質およびＨＴ−ｐＶＰ２変異体の解析を示している。図３Ａは、ｐＶＰ２のＣ末端領域の図を示しており、変異体において欠損として選択された位置および配列が表されている。タグ付きの変異体（図３Ｃ）およびタグなしの変異体（図３Ｂ）の両方が高い水準において発現され、以下の２段階：１２の画分が取られて２０倍に濃縮され、それから画分のそれぞれ１〜１０μｌ（ＨＴ−ｐＶＰ２変異体ごとに０．１μｌ）が載せられたことにおいて遠心分離された。それらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、かつクーマシーブルー染色によって現像された。星印は、ゲルが抗ＶＰ２抗体（ＶＰ２−５１２）を用いてウエスタンブロッティングによって分析されたことを示している。図３Ｄには、ＩＢＤＶに感染した細胞におけるＩＢＤＶタンパク質の通常の性質が示されている。
【図４】図４は、Ｃ末端領域欠損変異体であるｐＶＰ２の集合の電子顕微鏡写真を示している。図４Ａおよび図４Ｂは、いくつかの残基が１２面体の粒子１２個によって形成されたより大きな不安定な構造（図４Ａにおける矢印）に関与しているという事実にもかかわらず、ＶＰ２−４４１およびＶＰ２−４５６変異体が対称性Ｔ＝１のカプシドを有する粒子を形成することを示している。図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、異なるＶＰ２−４６６集合体の写真を示している。図４Ｃには、下部の画分におけるフーリエ変換（挿入）から推論される六角形の配列を有する管状の構造が示されている。図４Ｄは、主な構造として、Ｔ＝１のカプシドを有する粒子、断続的な細い管および解離した物質を示しており、かつ培養液画分におけるＴ＝１３のカプシドを有する粒子がまた得られる。図４Ｅは、上部の画分においてＴ＝１を有する粒子を示している。
【図５】図５は、電子顕微鏡によって得られた、Ｃ末端領域に欠損を有する変異タンパク質Ｈｉｓ−ｐＶＰ２に対応する集合体の写真から構成されている。図５Ａは、ＨＴ−ＶＰ２−４４１の集合体（Ｔ＝１のカプシド構造およびより大きな１２面体の集合体（矢印を用いて示されている））を示している。図５Ｂは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６の集合体（中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有する粒子）を示している。図５Ｃは、中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有するＨＴ−ＶＰ２−４６６粒子の集合体を示している。図５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、ＨＴ−ＶＰ２−４７６の集合体を示している。図５Ｄは、下部の画分におけるタイプＩの管状構造を示している。図５Ｅは、中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有する粒子ならびに管状の集合体を有する断片を示している。図５Ｆは、上部の画分における異常な集合体を示している。
【図６】図６は、ＩＢＤＶカプシドの３次元構造を示している。図６Ａは、ＩＢＤＶカプシド極低温電子顕微鏡写真を示している。図６Ｂは、正２０面体の２次元軸に沿って見た、ＩＢＤＶカプシドの外表面（左）および内表面（右）の配置像（ｍａｐ）を示している。
【図７】図７は、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの３次元的な構造を示している。図７Ａは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６集合体の電子顕微鏡写真（画分７）を示している。図７Ｂは、これらの密度配置像は、７８０（Ｔ＝１３）および４２０（Ｔ＝７）分子のＨＴ−ＶＰ２−４６６の容積を含むために断面図が描かれた。
【図８】図８は、ＩＢＤＶカプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドとの構造の比較を示している。図８Ａは、３次元再構成したＩＢＤＶカプシド（実線）およびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシド（破線）の密度の特徴を示しており、どちらも１５オングストロームの解像度において分析されている。図８Ｂは、極低温電子顕微鏡法に使用されるＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドのタンパク質を、クーマシーブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示している。図８Ｃおよび８Ｄは、ＩＢＤＶおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６のそれぞれを３次元再構成して得られたカプシドの断面図を示している。図８Ｅは、ＩＢＤＶカプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドとの違いを演算することによる配置像を表している。図８Ｆは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドに対するＩＢＤＶカプシドの差異から算出された、異なる配置像を表している。
【図９】図９は、ＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの構造的な構成を示している。Ｔ＝１３を有するカプシドの中心から示されている正２０面体断面の垂直方向における距離は、３２８オングストローム（Ａ）、３１９オングストローム（Ｂ）、３１１オングストローム（Ｃ）、３０２オングストローム（Ｄ）、２９４オングストローム（Ｅ）、２８６オングストローム（Ｆ）、２７７オングストローム（Ｇ）、および２６９オングストローム（Ｈ）である。
【図１０】図１０は、ｐＶＰ２およびＨＴ−ｐＶＰ２変異タンパク質の集合体を示している。図１０Ａは、Ｃ末端配列の伸張によって決まっている、単独の（ＶＰ２）またはＨｉｓタグを有する（ＨＴ−ＶＰ２）異なるＣ末端の伸張を有するＶＰ２によって導入される集合体を示す図を示している。ｐＶＰ２のＣ末端領域および本発明に使用されている部位の完全な配列がまた、示されている。図１０Ｂは、左に配列番号２のポリペプチドのここまでに説明したαらせんの説明を示している。
【図１１】図１１は、ＩＢＤＶｐＶＰ２−４５６タンパク質の集合体によって形成されるＩＢＤＶのキメラカプシド、ならびに酵母において発現させた口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＢおよびＴエピトープキメラＢＴペプチドを含む、異なる分画（Ｆ６〜Ｆ１１）ウエスタンブロッティング分析の結果を示している。上段のブロットは、特異的なＩＢＤＶ抗ＶＰ２抗体を用いた結果を示しており、下段のブロットは、特異的な抗ＦＭＤＶ抗体を用いて得られた結果を示している。
【図１２】図１２は、ＣＶＬＰｓを用いてマウスにワクチン接種した３週間後に、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定から得られた結果を示している。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に由来する中空キメラ性ウイルス様粒子の製造およびその応用に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
ウイルス様粒子は、核酸およびタンパク質の収納および輸送に特化した構造物である。ウイルス様粒子の通常の特性は、宿主の免疫反応を刺激する優秀な能力である。これらの性質によって、ウイルス様粒子が細胞内輸送系およびサブユニットワクチンに用いる非常に興味深い作用物質になる。異なる遺伝子発現系の利用は、例えば、ロタウイルス（米国公開２００３／０１７５３０１号）、レトロウイルス（米国特許６，６０２，７０５号）パルボウイルス（米国特許６，４５８，３６２号）など、種々のウイルスに由来する空のウイルスカプシドまたはウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の製造に役立っている。これらの発現系の遺伝的な手法は、天然のウイルスカプシドを形成している、これらとは異なるタンパク質に由来する異種のアミノ酸配列を含んでいる、ＶＬＰｓの製造を可能にする。これらのＶＬＰｓは、通常、異形の、組み換えのまたはキメラのＶＬＰｓ（ＣＶＬＰｓ）と呼ばれ、それらは、主に以下の２つの目的：（ｉ）免疫学的に該当する異種のペプチドを用いた多価のワクチンを産生すること、および（ｉｉ）受容体−リガンドの相互作用に関与するアミノ酸配列の挿入による親和性の改変に使用される。
【０００３】
Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科に属する伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）は、種々のトリ類の種に感染し、かつ世界的にトリ類の産業において相当な経済的な損失を引き起こす重篤な免疫抑制疾患である、感染性の滑液包炎の直接的な原因である。
【０００４】
ＩＢＤＶ粒子は、Ｔ＝１３の対称性を有する正２０面体であり、エンベロープを欠き、かつ単一のタンパク質層によって形成されている。これまでのところ、ＩＢＤＶ粒子の原子モデルの取得を目指した試みは、失敗している。このため、ＩＢＤＶ粒子の構造に関する情報は、精製されたウイルス、およびＶＬＰｓの極低温電子顕微鏡法によって得られた画像から生成された３次元モデルに基づいている。これらの研究に基づいて、ＩＢＤＶ粒子の外部表面が５つの異なる高次構造に配置されたタンパク質ＶＰ２（３７ｋＤａ）の２６０個の３量体の連続的な格子構造によって形成されていることが観察されている。ＩＢＤＶ粒子の内側は、タンパク質ＶＰ３（２９ｋＤａ）の２００個の３量体を含んでいる。タンパク質ＶＰ３の３量体は、互いに独立して、ＶＰ２の３量体の基部領域と結合されている。ＶＰ４（２８ｋＤａ）である第３のポリペプチドもまた、正２０面体構造の角を形成する５量体の基部に位置している、ＩＢＤＶ粒子の一部であるだろうと、示唆されている。
【０００５】
ポリペプチドＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４は、１０９ｋＤａの大きさを有する前駆体ポリペプチドのタンパク分解性のプロセシングから生成される。この前駆体は、自己触媒的にプロセシングされて、結果としてポリペプチドｐＶＰ２（４８ｋＤａ）、ＶＰ３およびＶＰ４を生じる。ポリタンパク質の中央付近に位置しているＶＰ４領域は、イオン性のタンパク質分解酵素の一群に属しており、タンパク質分解性の切断を担う。ポリペプチドＶＰ２およびＶＰ３は、カプシドの集合を直接に担う。ｐＶＰ２産物は、生成された粒子に見られる形態であるタンパク質の成熟形態のＶＰ２を生じる前に、Ｃ末端において最後に切断を受ける。このｐＶＰ２のプロセシングは、カプシドを正しく形成することに必要であり、かつＶＰ３の存在を必要とするが、これを担うタンパク質分解酵素は、同定されていない。
【０００６】
形態形成は、前駆体ポリペプチドにおける修飾に関与する連続的な段階を必要とするウイルス周期（ｖｉｒａｌ ｃｙｃｌｅ）に関する生活過程である。結果として、ウイルスは、構成要素の１つ１つの間において連続的なおよび正確な相互作用を可能にする、発達した戦略を有している。正２０面体のウイルスによってしばしば用いられているこれら戦略の１つは、構造的な構成要素の基本として、単一のポリタンパク質のポリペプチドを利用することから成り立っている。これらの場合において、上記ポリタンパク質の正確なタンパク質分解性のプロセシングは、集合過程において重要な役割を果たしている。
【０００７】
ＩＢＤＶカプシド集合に関するこの原理は、以前の研究において証明されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ Ａ ｅｔ ａｌ． １９９８．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＯＲＦ Ａ１の発現がウイルス様粒子を結果として生じる”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：１０４７−１０５４）。ＩＢＤＶポリタンパク質をコードする遺伝子の真核細胞における発現は、形態学および生化学の両方の観点から、ＩＢＤＶビリオンと完全に区別できないＶＬＰｓの形成を生じさせる。また、カプシドの集合がウイルスのポリタンパク質の合成および正確なプロセシングのみを要求し、かつウイルスゲノムあるいはＶＰ５およびＶＰ１タンパク質のようなウイルスゲノムにコードされる他のタンパク質の存在とは独立している、ということが観察されている。
【０００８】
これまでにおいて、異なる組み換え系におけるＩＢＤＶ遺伝子の発現から得られた結果は、（ｉ）集合過程がウイルスの遺伝的な物質の存在と独立している、（ｉｉ）ポリタンパク質遺伝子によってコードされるそれらのポリタンパク質のみが、集合に必要である、および（ｉｉｉ）集合がポリペプチドＶＰ２とＶＰ３との間の調整された相互作用を必要とする、という推論を可能にする。
【０００９】
しかし、修飾されていないときでさえ、ｐＶＰ２／ＶＰ３の相互作用が前駆体ポリタンパク質のＶＰ２領域とＶＰ３領域との間に形成されるか否か、または逆にこの相互作用が当該前駆体のプロセシングの後に生じるか否か、がわかっていない。さらに、現在の情報は、ＶＰ４がカプシドの形態生成に関連のある役割を果たすことができるのかについては、考慮されていない。実際には、ＩＢＤＶのＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質の集合によって形成されるＩＢＤＶのＶＬＰｓが開示されている（米国特許６，５２８，０６３号、米国特許５，７８８，９７０号および特開平５−１９４５９７号）。
【００１０】
本願の発明者らによって開発された成果によって、異なる真核発現ベクターを用いることによって得られるＩＢＤＶ ＶＬＰｓ用の系を確立することができる。これらのベクターは、ウイルスＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１の存在または非存在において、ＩＢＤＶポリタンパク質を発現するために使用される。精製したＶＬＰｓの生化学的な性質決定は、ウイルスポリタンパク質だけが発現されているとき、ＶＬＰｓがｐＶＰ２、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を含み、かつポリタンパク質およびウイルスＲＮＡ重合酵素が同時に発現されているとき、ＶＬＰｓがｐＶＰ２、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１タンパク質を含むことを示している（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ Ａ ｅｔ ａｌ． １９９８．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＯＲＦ Ａ１の発現がウイルス様粒子を結果として生じる”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９： １０４７−１０５４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ ＪＬ ｅｔ ａｌ． ２０００．“昆虫細胞において発現された、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのカプシドタンパク質の集合における異なる集合体”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７８：３２２−３３１、Ｍａｒａｖｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ． ２００３．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの足場タンパク質であるＶＰ３のオリゴマー形成領域はカプシド形成に重要な役割を果たす”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：６４３８−４９、Ｌｏｍｂａｒｄｏ Ｅ ｅｔ ａｌ． １９９９．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６９７３−６９８３）。
【００１１】
それから、特許文献ＷＯ０２／０８８３３９には、カルボキシル末端において１つのポリペプチドと結合したＩＢＤＶポリタンパク質を含むキメラタンパク質の集合によって形成される、ＩＢＤＶウイルス様粒子が開示されている。
【００１２】
ＩＢＤＶのｐＶＰ２タンパク質またはこれらの断片に単独に基づくＣＶＬＰｓ、所望のポリペプチドと融合したＣＶＬＰｓ、あるいはワクチンまたは所望の産物にとっての輸送物としてそれらを潜在的に利用することは、これまでに述べられていない。
【００１３】
〔発明の要約〕
本発明は、例えば、薬物、ポリペプチドタンパク質、または核酸などの生物学的な活性を有する分子のような所望の産物を、ベクター化するまたは担体に組み込む新しいツールを提供するという問題に取り組む。
【００１４】
本発明によって提供される解決法は、本明細書において、通常、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊と呼ばれる所望のポリペプチドを含む異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むために遺伝子的に改変された、自身が集合してウイルス様粒子を形成するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質、または当該タンパク質の断片を発現した結果として中空キメラ性ウイルス様粒子を取得できることを観察した発明者らに基づいている。実際に、本発明者らは、全長のＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質、またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ酸の１番目から始まっている連続する５０１のアミノ酸残基、通常、４４１〜４６６アミノ酸残基のタンパク質の断片が、異種ポリペプチドと融合されて、このようにして得られた融合（キメラ）タンパク質がともに集合して、ＣＶＰＬｓ、特にＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊を形成できることを観察している。上述のＣＶＰＬｓ、特にＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊は、細胞に対する特異性および細胞との相互作用という点について、天然のウイルスカプシドの性質と類似の性質を有し、かつ他の標的細胞に向かって導くようにさらに操作可能である。
【００１５】
上述のＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質、またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）の配列に対して相同な少なくとも１つの配列を含む当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の断片を包含する領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを包含し、かつ上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に結合された領域Ｂを包含する融合タンパク質の集合体によって形成される。１つの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、ワクチン接種（免疫化）、治療または診断などに使用するポリペプチドのような所望のポリペプチドを含む。上記ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２＊は、例えば、治療、予防医学または予防、あるいは診断の目的（例えば、ワクチンまたは遺伝子治療ベクターなどの調製）など、保健医療の目的に使用されてもよい。
【００１６】
本発明者らによって実施された研究は、驚くべきことに、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質断片（例えば、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ酸の１番目から始まっている連続する４４１〜５０１、好ましくは４４１〜４６６アミノ酸残基を有するｐＶＰ２断片）によって形成されるＣＶＬＰｓ、および（ｉｉ）上記ＣＶＬＰｓの形成の妨げにならない異種のアミノ酸配列を包含する融合タンパク質によって形成されるＣＶＬＰｓが得られることを示している。また、本発明者らは、上記ＣＶＬＰｓがＩＢＤＶによって誘導される感染に対してトリを効果的に免疫する、または（上記ＣＶＬＰｓに存在する異種のアミノ酸残基および上記配列に含まれる抗原／免疫原に依存して、）他の原因因子によって誘導される感染から動物を効果的に保護することができることを観察している。
【００１７】
詳細な実施形態において、本発明者らは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の断片（例えば、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ酸の１番目から始まっている、連続する４４１〜４６６のアミノ酸残基を有するｐＶＰ２断片）およびヒスチジンタグ（実施例１）のような異種のアミノ酸配列を包含する融合タンパク質の集合体によって形成されるＣＶＬＰｓを得ている。他の詳細な実施形態において、本発明者らはまた、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質断片、特に、タンパク質ｐＶＰ２として本明細書において同定されている、ＦＭＤＶ ＢおよびＴ細胞エピトープを含むＢＴと呼ばれる口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のキメラタンパク質と融合された断片（実施例３）（Ｚｈａｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ ４６（１）： １−９）の発現を用いたＣＶＬＰ形成を観察している。
【００１８】
単一のタンパク質（ｐＶＰ２＊）に基づくＣＶＬＰｓ産物は、２つのタンパク質（例えば、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質およびＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に基づく融合タンパク質）によって形成された他のＣＶＬＰｓの産物と比較して、使用された発現ベクターを操作する水準および産物産生の水準の両方において、多くの利点を有している。
【００１９】
従って、本発明の１つの局面において、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１までの整数である）と相同な少なくとも１つの配列を含むＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の断片を含むまたはからなる領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂを包含する融合タンパク質に関する。１つの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、所望のポリペプチドを含んでいる。上記融合タンパク質を取得する方法は、本発明の付加的な局面を構成する。
【００２０】
他の局面において、本発明は、通常、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２＊（単一の）またはＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊（複数の）と呼ばれる、上記融合タンパク質の集合によって形成されるという点において特徴づけられる、後ほど定義されているような、中空キメラ性ウイルス様粒子に関する。
【００２１】
本発明の付加的な局面において、上記融合タンパク質の遺伝子発現に基づく、後ほど定義されているような、本発明による上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を製造する方法に関する。
【００２２】
上記融合タンパク質の遺伝子発現に基づく、上記融合タンパク質または上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓを製造する方法の実施に関して生み出される上記核酸、発現カセット、組み換えベクターおよび宿主細胞は、上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓの製造への利用だけでなく、本発明の付加的な局面を構成する。
【００２３】
上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、例えば、薬物、ポリペプチド、タンパク質、抗体または核酸などの生物学的な活性を有する所望の分子を、ベクター化するまたは担体に組み込む能力を有している。
【００２４】
従って、他の局面において、本発明は、ワクチン、遺伝子治療ベクターおよび活性物質の輸送系のような、薬学的組成物の調製における上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の利用に関する。上記ワクチン、遺伝子治療ベクターおよび活性物質の輸送系は、本発明の付加的な局面を構成する。
【００２５】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、Ｎ末端にＨｉｓタグを有している、および有していないｐＶＰ２のＣ末端欠損変異体の発現を示している。Ｈｉｓタグを有している（図１Ａ）および有していない（図１Ｂおよび図９Ｃ）ｐＶＰ２／ＶＰ２発現変異体の回収は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＶＰ２ポリクロナル抗体（図１Ａおよび１Ｂ）および抗Ｈｉｓポリクロナル抗体（図１Ｃ）を用いたウエスタンブロッティングによって解析された。同量の細胞抽出物が、ｐＶＰ２／ＶＰ２変異体の相対的な発現水準を比較するために、各変異体について載せられた。ＩＢＤＶカプシドは、陽性対照として使用され、ｐＶＰ２およびＶＰ２に対応する位置が示されている。単純化のために、ｐＶＰ２／ＶＰ２変異体は、最後のアミノ酸の位置に従って記載されている。ＶＰ３タンパク質が存在していないことを確かめて、混入の可能性を切り捨てるために、ウエスタンブロッティングが抗ＶＰ３抗体を用いて対照化された（図示せず）。
【００２６】
図２は、ｐＶＰ２のＣ末端におけるαらせんの解析を示している。図２Ａは、３０％のトリフルオロエタノール（ＴＥＥ）の存在下（破線）または非存在下（実線）のＰＥＳ緩衝液における、１文字表記においてＦＧＦＫＤＩＩＲＡＩＲＲＩ（配列番号１）と表される、ポリペプチドの円偏光２色性（ＣＤ）スペクトルを示している。２０８ｎｍおよび２２０ｎｍにおける最小値ならびに１９５ｎｍにおける増加した楕円形の形状が、この図面において観察された。図２Ｂにおいて、ＬｍＴＩＭの２４１〜２５０残基の２次構造が示されている。αらせんの両親媒性が見られる。
【００２７】
図３は、クーマシーブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるｐＶＰ２タンパク質、およびＨＴ−ｐＶＰ２変異体の解析を示している。図３Ａは、ｐＶＰ２のＣ末端領域の図を示しており、変異体において欠損として選択された位置および配列が表されている。また、Ｈｉｓタグ変異体の異形が生成された。タグ付きの変異体（図３Ｃ）およびタグなしの変異体（図３Ｂ）の両方が高い水準において発現され、以下の２段階：１２の画分が取られて２０倍に濃縮され、それから画分のそれぞれ１〜１０μｌ（ＨＴ−ｐＶＰ２変異体ごとに０．１μｌ）が載せられたことにおいて遠心分離された。それらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、かつクーマシーブルー染色によって現像された。星印は、ゲルが抗ＶＰ２抗体（ＶＰ２−５１２）を用いてウエスタンブロッティングによって分析されたことを示している。ＶＰ２−４８７およびＶＰ２−４９４変異体は、精製条件に耐える十分に安定な構造を形成しなかったので、これらは第１のショ糖勾配（図示せず）から沈降物を得られなかった。図３Ｄには、ＩＢＤＶに感染した細胞におけるＩＢＤＶタンパク質の通常の性質が示されている。遠心沈降方向は、右から左であり、画分１２は、各勾配の上部部分を表している。
【００２８】
図４は、Ｃ末端領域欠損変異体であるｐＶＰ２の集合体の電子顕微鏡写真を示している。図４Ａおよび図４Ｂは、いくつかの残基が１２面体の粒子１２個によって形成されたより大きな不安定な構造（図４Ａにおける矢印）に関与しているという事実にもかかわらず、ＶＰ２−４４１およびＶＰ２−４５６変異体がＴ＝１の対称性のカプシドを有する粒子を形成することを示している。図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、異なるＶＰ２−４６６集合体の写真を示している。図４Ｃには、下部の画分におけるフーリエ変換（挿入）から推論される六角形の配列を有する管状の構造が示されている。図４Ｄは、主な構造として、Ｔ＝１のカプシドを有する粒子、断続的な細い管および解離した物質を示しており、かつ培養液画分におけるＴ＝１３のカプシドを有する粒子がまた得られる。図４Ｅは、上部の画分においてＴ＝１を有する粒子を示している。
【００２９】
図５は、電子顕微鏡によって得られた、Ｃ末端領域に欠損を有する変異タンパク質Ｈｉｓ−ｐＶＰ２に対応する集合体の写真から構成されている。濃縮画分は、得られた集合体の観察を最適化するために希釈（１／５０）された。図５Ａは、ＨＴ−ＶＰ２−４４１の集合体（Ｔ＝１のカプシド構造およびより大きな１２面体の集合体（矢印を用いて示されている））を示している。図５Ｂは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６の集合体（中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有する粒子）を示している。図５Ｃは、中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有するＨＴ−ＶＰ２−４６６粒子の集合体を示している。図５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、ＨＴ−ＶＰ２−４７６の集合体を示している。図５Ｄは、下部の画分における種類Ｉの管状構造を示している。図５Ｅは、中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有する粒子ならびに管状の集合体を有する断片を示している。図５Ｆは、上部の画分における異常な集合体を示している。棒は、１００ｎｍの長さに一致する。
【００３０】
図６は、ＩＢＤＶカプシドの３次元構造を示している。図６Ａは、ＩＢＤＶカプシド極低温電子顕微鏡写真を示している。棒の長さは、５０ｎｍである。図６Ｂは、正２０面体の２次元軸に沿って見た、ＩＢＤＶカプシドの外表面（左）および内表面（右）の配置像（ｍａｐ）を示している。その表面配置像は、ＶＰ２−４４１の７８０分子の存在および部分的な特定のタンパク質の体積として０．７３ｃｍ３／ｇの値と仮定して表されている。エンベロープ細孔がはっきりと見えるように、配置像の前半球のみが示されている。５種類の３量体カプソマーが、文字ａ〜ｅを用いて示されている。棒の長さは、２００オングストロームである。
【００３１】
図７は、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの３次元的な構造を示している。図７Ａは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６集合体の電子顕微鏡写真（画分７）を示している。棒の長さは、５０ｎｍである。円は、Ｔ＝１３、Ｔ＝７、およびおそらくＴ＝１の対称性を有する、明確に区別ができる３つの正２０面体の集合体を囲んでいる。棒の長さは、５０ｎｍである。図７Ｂにおいて、これらの密度配置像が、７８０（Ｔ＝１３）および４２０（Ｔ＝７）分子のＨＴ−ＶＰ２−４６６の容積を含むために断面図が描かれた。ＨＴ−ＶＰ２−４６６の３量体の種類が示されている。棒の長さは、２００オングストロームである。
【００３２】
図８は、ＩＢＤＶカプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドとの構造の比較を示している。図８Ａは、３次元再構成したＩＢＤＶカプシド（実線）およびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシド（破線）の密度の特徴を示しており、どちらも１５オングストロームの解像度において分析されている。タンパク質の外皮（ｒ＝２５３〜３５０オングストローム）は、わずかな隔たり（矢印）を除いて、ほとんど完全に重なり合っている。図８Ｂは、極低温電子顕微鏡法に使用されるＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドのタンパク質を、クーマシーブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示している。ｐＶＰ２／ＶＰ２およびＶＰ３は、同じゲルから定量化された。図８Ｃおよび８Ｄは、ＩＢＤＶおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６のそれぞれを３次元再構成して得られたカプシドの断面図を示している。タンパク質およびＲＮＡは、黒である。図８Ｅは、ＩＢＤＶカプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドとの違いを算出することによる配置像を表している。生じた配置像は、２次元的な正２０面体の軸に沿って見られるＩＢＤＶカプシドの外表面を表している。図８Ｆは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドに対するＩＢＤＶカプシドの差異から算出された、異なる配置像を表している。これらの差異の差し引いて、１３２の主な突起として示される結果としての配置像は、２次元的な正２０面体の軸に沿って見られるＨＴ−ＶＰ２−４６６の内表面について示されている。部分的なタンパク質の容積として０．７３ｃｍ３／ｇを用いた、これらの密度を示す各島の１つは、約２６ｋＤａに対応している。一方において、４４２〜４６６（２．６ｋＤａ）およびＨｉｓタグ（３．４ｋＤａ）の部分の複製物５〜６個の大きさは、それぞれ３１から３７ｋＤａの範囲にある。棒の長さは、２００オングストロームである。
【００３３】
図９は、ＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの構造的な構成を示している。ＩＢＤＶ（左半分）およびＨＴ−ＶＰ２−４６６（右半分）の３次元再構成したカプシドの正２０面体断面が１５オングストロームの解像度おいて示されており、かつ２次元の軸に基づいて見られる。Ｔ＝１３を有するカプシドの中心から示されている正２０面体断面の垂直方向における距離は、３２８オングストローム（Ａ）、３１９オングストローム（Ｂ）、３１１オングストローム（Ｃ）、３０２オングストローム（Ｄ）、２９４オングストローム（Ｅ）、２８６オングストローム（Ｆ）、２７７オングストローム（Ｇ）、および２６９オングストローム（Ｈ）である。多面体の面は、ファセット（Ｆａｃｅｔｓ）プログラム（Ｒ．Ａ．クラウザー，ＭＲＣ，ケンブリッジによって提供される）から生成された。棒の長さは２００オングストロームである。
【００３４】
図１０は、ｐＶＰ２およびＨＴ−ｐＶＰ２変異タンパク質の集合体を示している。図１０Ａは、Ｃ末端配列の伸張によって決まっている、単独の（ＶＰ２）またはＨｉｓタグを有する（ＨＴ−ＶＰ２）異なるＣ末端の伸張を有するＶＰ２によって導入される集合体を示す図を示している。１文字表記において４４３−ＧＦＫＬＤＩＩＲＡＩＲ−４５３（配列番号２）と表されるポリペプチドが示されている。ＶＰ２に結合されているＣ末端配列（またはそのＨｉｓタグ型）の長さが増えているので、Ｔ＝１のカプシドを有する構造および管の間において、六角形の管状構造という形態を好む、置き換えについての平衡があることに注目する必要がある。また、ｐＶＰ２のＣ末端領域および本発明に使用されている部位の完全な配列が、示されている。図１０Ｂは、左に配列番号２のポリペプチドのここまでに説明したαらせんの説明を示している。本発明に使用される両親媒性のαらせんとＶＰ３のＣ末端領域にある５つのアミノ酸（または類似のＶＰ３ Ｈｉｓタグ（Ｈ−ｔａｇ）領域の配列構造）との間の提案される相補的な積み重なりが図の右側に示されている。ＶＰ３およびＨ−ｔａｇの配列は、Ｃ末端からＮ末端に向かう反対方向に示されている。
【００３５】
図１１は、ＩＢＤＶｐＶＰ２−４５６タンパク質の集合体によって形成されるＩＢＤＶのキメラカプシド、ならびに酵母において発現させた口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＢおよびＴエピトープのキメラＢＴペプチドを含む、異なる分画（Ｆ６〜Ｆ１１）のウエスタンブロッティング分析の結果を示している。上段のブロットは、特異的なＩＢＤＶ抗ＶＰ２抗体を用いた結果を示しており、一方において、下段のブロットは、特異的な抗ＦＭＤＶ抗体を用いて得られた結果を示している。カプシドが形成されているときに、タンパク質を産生する凝集塊が原因である異なる免疫反応のバンド（ポリペプチド）が、上段のブロットにおいて観察され、同じポリペプチドが特異的な抗ＦＭＤＶ抗体によって認識される（下段のパネル）。対照（ｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２）は、特異的なＦＭＤＶ抗体によって認識されない、特異的な抗ＶＰ２抗体に対するより小さな分子量を有する免疫反応バンドを示している。
【００３６】
図１２は、ＣＶＬＰｓを用いてマウスにワクチン接種した３週間後に、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定から得られた結果を示している。
【００３７】
〔発明の詳細な説明〕
第１の局面において、本発明は、融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、以下の、ＩＢＤＶのｐＶＰ２タンパク質もしくは上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１か５０１までの整数）を含むまたはからなる領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂを包含する融合タンパク質である。１つの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、所望のポリペプチドを包含する。領域Ｂは、領域Ａに対してアミノ（Ｎ−）末端位置またはカルボキシル（Ｃ−）末端位置に配置されてもよい。本発明において使用されているように、“ＩＢＤＶ”という用語は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスを意味し、かつあらゆる公知の抗原型（１または２）に属するＩＢＤＶの異なる株を包含する（例証の方法として、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ＴＰ ｅｔ ａｌ． ２０００． Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ． １９：５０９−４３による総説を参照のこと）。
【００３８】
“ＩＢＤＶ ｐＶＰ２ タンパク質”という用語は、通常、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列を含む、またはからなるアミノ酸配列のタンパク質と同様に、上記ＩＢＤＶタンパク質と実質的に相同なタンパク質（例えば、あるＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の配列と良好な整合を示すタンパク質）を意味し、かつＳａｎｃｈｅｚおよびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ （１９９９）によって与えられた定義に従って、ＩＢＤＶの上記あらゆる株に典型的なあらゆる異なるｐＶＰ２タンパク質（ＮＣＢＩ タンパク質バンク）を包含する（Ｓａｎｃｈｅｚ ＡＢ ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＦ．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスにおけるタンパク質分解性のプロセシング：部位特異的な突然変異生成によるポリタンパク質切断の同定”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １９９９ Ｓｅｐ １５； ２６２（１）： １９０−１９９）。上記ＩＢＤＶタンパク質と実質的に相同なタンパク質とは、例えば、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有するアミノ酸配列のタンパク質である。ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の配列と相同な配列は、配列の比較に好適なコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． １９９７． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９））の助けを借りて、当該分野における当業者によって容易に同定され得る。詳細な実施形態において、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質は、アクセス番号ＡＡＤ３０１３６としてＮＣＢＩに寄託されているアミノ酸配列の全長である、ソロア（Ｓｏｒｏａ）株のＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質である。
【００３９】
“上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１か５０１までの整数）という用語は、通常、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１番目の残基から“ｎ”番目の残基に含まれる（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１の間の整数である）、連続するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列のペプチドまたはタンパク質を意味する。従って、場合に応じて、本発明によって提供されるＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊における上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片は、あらゆるＩＢＤＶ株の典型的なあらゆるｐＶＰ２タンパク質（例えば、ソロア株のＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質（ＮＣＢＩのアクセス番号ＡＡＤ３０１３６））の、１番目のアミノ酸残基から始まっている連続する４４１から５０１のアミノ酸からなる、から必須に構成される、または、を含むアミノ酸配列を有する。
【００４０】
ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の特定の１〜ｎ断片は、以下の構成“ｐＶＰ２−ｎ”を意味している（ここで、“ｎ”は、先に定義されている）。詳細な実施形態において、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片は、以下の群：
（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４４１残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４４１；
（ｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４５２残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４５２；
（ｉｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４５６残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４５６；
（ｉｖ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４６６残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４６６；
（ｖ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４７６残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４７６；
（ｖｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４８７残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４８７；
（ｖｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から４９４残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−４９４；および
（ｖｉｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１から５０１残基を含む連続するアミノ酸の配列からなるアミノ酸配列のｐＶＰ２−５０１
からなる群から選択されたタンパク質である。
【００４１】
本発明の融合タンパク質は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１の整数である）を含む、またはからなる領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂを包含する。１つの実施形態において、本発明の上記融合タンパク質は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１の整数である）を含む領域Ａを包含する。他の実施形態において、本発明の上記融合タンパク質は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１の整数である）からなる領域Ａを包含する。他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、異種ポリペプチドを含む領域Ｂを包含する。他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、異種ポリペプチドを含む領域Ｂからなる。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１の整数である）を含む、またはからなり、異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂと結合された領域Ａを包含する。詳細な実施形態において、詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のアミノ末端領域に結合されており、一方、他の詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のカルボキシル末端領域に結合されている。
【００４２】
詳細な実施形態において、上記領域Ａｈａ，ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質を含むまたはからなる。この場合において、本発明の融合タンパク質を形成しているＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質は、あらゆるＩＢＤＶ株の典型的なあらゆるｐＶＰ２タンパク質（例えば、ソロア株の全長のＩＢＤＶ ｐＶＰ２（ＮＣＢＩ アクセス番号ＡＡＤ３０１３６））であってもよい。
【００４３】
他の詳細な実施形態において、上記領域Ａは、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片からなる。この場合において、本発明の融合タンパク質の領域Ａを形成しているＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片は、あらゆるＩＢＤＶ株（例えば、ソロア株）の典型的なｐＶＰ２タンパク質のあらゆる１〜ｎ断片であってもよい。詳細な実施形態において、上記領域Ａを形成しているＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片は、ｐＶＰ２−４４１タンパク質、ｐＶＰ２−４５２タンパク質、ｐＶＰ２−４５６タンパク質、ｐＶＰ２−４６６タンパク質、ｐＶＰ２−４７６タンパク質、ｐＶＰ２−４８７タンパク質、ｐＶＰ２−４９４タンパク質およびｐＶＰ２−５０１タンパク質からなる群から選択された、中でも好ましくは、ｐＶＰ２−４４１タンパク質、ｐＶＰ２−４５２タンパク質、ｐＶＰ２−４５６タンパク質およびｐＶＰ２−４６６タンパク質から選択されたタンパク質である。
【００４４】
本発明の融合タンパク質に存在する領域Ｂは、異種ポリペプチドを含む、またはからなる。本発明において用いられているように、“異種ポリペプチド”という用語は、天然のＩＢＤＶカプシドを成していないポリペプチドを意味する。
【００４５】
１つの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、所望のポリペプチドを含む、またはからなる。所望のポリペプチドの大きさは、数アミノ酸から数百アミノ酸までの広い範囲において変わってもよい。上記所望のポリペプチドは、その由来（真核生物、真核生物、またはウイルスなど）に関わりなく、動物（ヒトを含む）において免疫反応を誘導することが好ましい、ウイルス、細菌または微生物の抗原のような、組み換え的に発現された、例えば、抗原を生じやすい、ほとんど完全にあらゆるポリペプチド、生体にとって不十分である機能の補助を目的とする酵素、あるいは標的のＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な認識を可能にする核酸結合ペプチド領域を含む、本発明の融合タンパク質と上記標的の核酸配列を含む核酸配列との結合、および上記本発明の融合タンパク質（ＩＢＤＶ ＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２ｓ＊）を含むウイルス様粒子のカプシド形成を可能にするポリペプチドであり得る。詳細な実施形態において、上記所望のポリペプチドは、ウイルス、細菌、寄生生物、またはあらゆる他の微生物に起因する疾患、あるいは腫瘍性の疾患に対して、動物およびヒトにおいて免疫反応を誘導することが可能なエピトープまたは抗原決定因子のような、ワクチン接種、治療または診断に有用な、ポリペプチドである。
【００４６】
詳細な実施形態において、上記所望のポリペプチドは、ＦＭＤＶ Ｂ細胞エピトープ（Ｂエピトープ）およびＦＭＤＶ Ｔ細胞エピトープ（Ｔエピトープ）を含む、ＢＴと呼ばれる口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のキメラポリペプチドである（Ｚｈａｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ ４６（１）：１−９）。詳細な実施形態において、Ｂエピトープは、ＦＭＤＶのＶＰ１タンパク質（例えば、上記ＦＭＤＶのスペイン抗原型Ｃの単離されたＶＰ１タンパク質における１３３−１５９位または他の単離体の等価な位置）に位置しており、一方において、Ｔエピトープは、ＦＭＤＶのＶＰ１タンパク質（例えば、上記ＦＭＤＶのアジア抗原型のＶＰ４タンパク質における２０〜３４位）に位置している。
【００４７】
詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、単一の所望のポリペプチドを含んでいる。しかし、他の詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、直列の１組を形成してもよい２つ以上の同一なまたは異なる所望のポリペプチドを含んでいる。
【００４８】
詳細な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、単一の領域Ｂと結合された領域Ａを含む。この場合において、上記領域Ｂは、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のアミノ末端領域に結合されていてもよく、あるいは選択可能に、上記領域Ｂは、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域に結合されていてもよい。
【００４９】
上記のように、領域Ｂは、１つ以上の所望のポリペプチドを含んでいてもよい。詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、単一の所望のポリペプチドを含んでいるが、一方、他の詳細な実施形態において、上記領域Ｂは、２つ以上の所望のポリペプチドを含んでいる。
【００５０】
他の詳細な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、１つの領域Ｂが領域Ａに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のアミノ末端領域と結合され、かつもう１つの領域Ｂが領域Ａに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域と結合されている、２つの領域Ｂと結合されている領域Ａを包含する。上記２つの領域Ｂは、同一であるまたは異なるものであってよく、かつこれらの領域Ｂのそれぞれが、互いに同一のまたは異なる２つ以上の所望のポリペプチドを含むことができる。
【００５１】
従って、１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、第１の領域Ｂが領域Ａのアミノ末端領域と結合され、かつ第２の領域Ｂが領域Ａのカルボキシル末端領域と結合されている、第１および第２の領域Ｂに結合された領域Ａを包含している。上述のように、上記第１および第２の領域Ｂは、同一のまたは異なる異種ポリペプチドを含む。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、所望の第１のポリペプチド（ＰＩ１）を含む第１の領域Ｂおよび所望の第２のポリペプチド（ＰＩ２）を含む第２の領域Ｂと結合された領域Ａを包含する。上記所望のポリペプチド（ＰＩ１およびＰＩ２）は、同一であるまたは異なるものであってもよい。特定の実施形態において、上記所望のポリペプチド（ＰＩ１およびＰＩ２）は、互いに異なっている。
【００５３】
他の詳細な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、１つの領域Ｂが領域Ａに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のアミノ末端領域と結合され、かつもう１つの領域Ｂが領域Ａに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域と結合されている、２つの領域Ｂと結合されている領域Ａを包含する。上記２つの領域Ｂは、同一であるまたは異なるものであってよく、かつこれらの領域Ｂのそれぞれが、互いに同一のまたは異なる２つ以上の所望のポリペプチドを含むことができる。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、所望の第１のポリペプチド（ＰＩ１）を含む第１の領域Ｂおよび所望の第２のポリペプチド（ＰＩ２）を含む第２の領域Ｂと結合された領域Ａを包含する。上記所望のポリペプチド（ＰＩ１およびＰＩ２）は、同一であるまたは異なるものであってもよい。特定の実施形態において、上記所望のポリペプチド（ＰＩ１およびＰＩ２）は、異なっている。
【００５４】
本発明の融合タンパク質の領域Ａは、上記領域Ｂと直接に結合されていてもよい。選択可能に、上記領域Ａは、上記領域Ｂと直接に結合されていなくてもよいが、むしろ領域Ａと領域Ｂとの間にあるリンカーポリペプチドを介して結合されている。従って、必要に応じて、本発明の融合タンパク質は、上記領域Ａと領域Ｂとの間に位置しているリンカーポリペプチドをさらに含むことができる。上記リンカーポリペプチドは、構造的な安定性を有するペプチド、好ましくは免疫反応を誘導可能なまたは不可能な非構造的な領域を生じるペプチドであれば好適である。説明を目的として、上記適応性のあるペプチドは、アミノ酸残基、特にＧｌｙおよびＳｅｒの繰り返し、あるいは他の好適なアミノ酸残基の繰り返しを含む。
【００５５】
本発明の融合タンパク質は、好適な宿主細胞において当該融合タンパク質をコードする
核酸配列の遺伝子発現という手段によって得られてもよい。上記宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞である。当該細胞は、例えば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列を有する細胞、または当該核酸によって形質転換された細胞、あるいは本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えベクターを用いて形質転換された、トランスフェクトされた、または感染された細胞である。本発明の融合タンパク質の取得に好適な核酸配列、発現カセット、組み換えベクターおよび宿主細胞は、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を産生する過程と一緒に、以下において詳細に説明されている。
【００５６】
好適な宿主において発現される本発明の融合タンパク質は、自身を集合させて、本明細書において、通常、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２＊（単一）またはＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊（複数）と呼ばれるＩＢＤＶから由来する中空キメラ性ウイルス様粒子を形成する。
【００５７】
従って、他の局面において、本発明は、上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊（例えば、本発明融合タンパク質を少なくとも包含している中空キメラ性ウイルス様粒子）に関する。当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、本発明の融合タンパクの集合によって形成される。当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、Ｔ＝１の対称性を有し、かつＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１までの整数である）を含むまたはからなる領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む、またはからなる領域Ｂを包含する本発明の融合タンパク質の集合体のみからなるという点において特徴付けられる。
【００５８】
本発明のＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、ＩＢＤＶの上記ウイルス様粒子の形成が可能な条件において、好適な宿主細胞における本発明の融合タンパク質の発現によって得られてもよい。
【００５９】
従って、他の局面において、本発明の核酸配列は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列に関する。
【００６０】
詳細な実施形態において、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）に対応するオープンリーディングフレーム、またはコード領域を含むまたはからなる核酸配列、ならびに（ｉｉ）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列を含んでいる。
【００６１】
他の詳細な実施形態において、本発明によって提供される核酸の配列は、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列、（ｉｉ）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる第１の核酸配列、ならびに（ｉｉ’）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる第２の核酸配列を包含し、当該第２の核酸配列が当該第１の核酸配列と同一であっても、異なっていてもよい。この場合において、当該第１または第２の核酸配列のいずれか一方が、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応する、オープンリーディングフレームまたはコード領域を含む核酸配列の５’末端と作動可能に結合され、かつ当該第１または第２の核酸配列の残る一方が、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応する、オープンリーディングフレームまたはコード領域を含む核酸配列の３’末端と作動可能に結合されている。
【００６２】
本明細書において使用されるように、“ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応する、オープンリーディングフレーム”または“ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応する、オープンリーディングフレーム”という用語は、上記オープンリーディングフレームの核酸配列に加えて、当該ｐＶＰ２タンパク質および１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）をコードする同じ核酸配列と類似の他のオープンリーディングフレームを包含する。
【００６３】
さらに、“１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレーム”という用語は、１つ以上の所望のポリペプチドを含む上記ポリペプチドのあらゆるコード核酸配列を含む。“類似の”という用語は、本明細書に使用されるように、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は４４１から５０１までの整数である）のコード核酸配列に基づいて、例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、核酸分子のあらゆる末端に対する１つ以上のヌクレオチドの付加、あるいはあらゆる末端または配列内における１つ以上のヌクレオチドの欠損を含む、保存的なまたは非保存的なヌクレオチドの置換によって、単離または集合されるあらゆる核酸配列を包含することを指す。通常、他の核酸配列と類似の核酸配列は、当該核酸配列と実質的に相同なものである。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、“実質的に相同な”という表現は、該当の核酸配列がヌクレオチドのレベルにおいて、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性の度合いを有していることを意味している。
【００６５】
他の局面において、本発明は、本発明によって提供される核酸配列（例えば、転写因子、ならびに付加的に翻訳因子および制御因子と作動可能に結合されている本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸）を含む発現カセットを提供する。
【００６６】
詳細な実施形態において、本発明によって提供される発現カセットは、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）に対応する、オープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列、ならびに（ｉｉ）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列を含む、転写因子ならびに付加的に翻訳因子および制御因子と結合されている、核酸配列を包含する。
【００６７】
他の実施形態において、本発明によって提供される発現カセットは、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる核酸配列、（ｉｉ）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる第１の核酸配列、ならびに（ｉｉ’）１つ以上の所望のポリペプチドを含む１つ以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む、またはからなる第２の核酸配列（ここで、当該第２の核酸配列は、当該第１の核酸配列と同一であっても、異なっていてもよい）を含む、転写因子ならびに付加的に翻訳因子および制御因子と結合されている、核酸配列を包含する。この場合において、上記第１または第２の核酸配列のいずれか一方は、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む核酸の５’末端と作動可能に結合され、かつ残る他方は、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む核酸の３’末端と作動可能に結合されている。
【００６８】
本発明によって提供される発現カセットに存在する上記転写因子ならびに付加的な翻訳因子および制御因子は、作動可能に連結されている核酸配列（ＩＢＤＶ ｐＶＰ２またはこれらの断片あるいは異種ポリペプチド）の転写を導くプロモータ、ならびに適切な時期および位置における転写および転写の好適な制御に必要な他の配列（例えば、開始シグナルおよび終止シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、転写促進因子、転写サイレンサーなど）を含む。本発明に係る上記因子だけでなく発現カセットの集合に使用されるベクターおよび組み換えベクターは、使用される予定の宿主細胞に従って選択される。
【００６９】
他の局面において、本発明は、本発明によって提供される核酸配列または本発明によって提供される発現カセットを含む組み換えベクターを提供する。実際には、本発明によって提供される組み換えベクターの生成には、あらゆるベクターを使用してもよい。一例を挙げると、上記好適な発現系またはベクターは、個々の場合における条件および必要に従って、異種複製開始点（例えば、細菌または酵母の中において増幅されるように、細菌または酵母の開始点）と同様に、所望の１つまたは複数の遺伝子とは異なる、トランスフェクションされた細胞の選択に使用され得るマーカをさらに有する上記プラスミド、バックミド、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージＰ１に基づく人工染色体（ＰＡＣｓ）、コスミドまたはウイルスから選択されればよい。これらの組み換えベクターは、従来の遺伝工学的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）を用いて、当該分野における当業者によって得られてもよく、これらは、本発明の一部である。
【００７０】
詳細な実施形態において、上記組み換えベクターは、集合してＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を形成する本発明の融合タンパク質を複製周期の間に発現する、酵母の形質転換に好適なプラスミドのようなプラスミド、あるいは組み換えバキュロウイルスのようなウイルスである。詳細な実施形態において、ｐＶＰ−４５６タンパク質におけるＣ末端位置にＦＭＤＶキメラＢＴペプチドを含むＣＶＬＰｓ、特にＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、酵母において得られる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株（実施例３）の形質転換に使用された発現プラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６−ＢＴは、この目的のために生成された。他の詳細な実施形態において、ＣＶＬＰｓは、ｒＢＶに基づく発現系（実施例１）を用いて得られている。
【００７１】
他の局面において、本発明は、本発明によって提供される核酸配列（例えば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列をコードしている核酸配列を含む核酸）を含む宿主細胞を提供する。詳細な実施形態において、上記宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む、本発明によって提供される核酸配列によって形質転換された細胞である。他の詳細な実施形態において、上記細胞は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む本発明の核酸配列を用いて形質転換された、トランスフェクションされた、または感染されている細胞である。
【００７２】
本発明によって提供される核酸配列を用いた形質転換に好適なあらゆる宿主細胞、または本発明によって提供される組み換えベクターを用いた形質転換された、トランスフェクションされた、もしくは感染に好適なあらゆる宿主細胞としては、例えば、哺乳類の細胞、トリの細胞、または酵母の細胞などを用いられてもよいが、詳細な実施形態において、上記宿主細胞は、酵母細胞および昆虫細胞から選択される。酵母は、容易さおよび生産費用に関して好適である。昆虫細胞は、発現系がｒＢＶを含むときに、好適である。ｒＢＶの使用は、バキュロウイルスの宿主範囲に関する生物学的研究における安全性の問題にとって有利である。
【００７３】
詳細な実施形態において、本発明は、本発明によって提供される組み換えベクター、または本発明の核酸配列を含むプラスミドのような本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明によって提供される発現カセットを用いて形質転換された、酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳ． ｐｏｍｂｅなどのようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属あるいはＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓなどのようなＰｉｃｈｉａ属の酵母）のような宿主細胞を提供する。
【００７４】
詳細な実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む本発明の核酸配列または本発明によって提供される発現カセットを含むｒＢＶのような、本発明によって提供される組み換えベクターを用いて感染させた、昆虫細胞のような宿主細胞を提供する。
【００７５】
他の局面において、本発明は、上記融合タンパク質の発現および必要に応じて上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の回収を可能にする条件において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含み、かつ本発明によって提供される宿主細胞を、培養することを包含する、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を生産する方法を提供する。詳細な実施形態において、当該方法は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む本発明の核酸配列によって形質転換された細胞からなる、本発明によって提供される宿主細胞を用いて実施される。他の詳細な実施形態において、当該方法は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明によって提供される組み換えベクターを用いて形質転換された、トランスフェクションされた、または感染されている細胞からなる、本発明によって提供される宿主細胞を用いて実施される。
【００７６】
上記細胞において本発明の融合タンパク質を発現した後に、発現されたタンパク質は、集合してＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を形成する。ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、必要に応じて、培地から単離または除去ならびに精製されてもよい。当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の単離および精製は、例えば、ショ糖勾配分画法のような従来の方法によって行なわれてもよい。
【００７７】
詳細な実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞であり、かつ本発明の融合タンパク質の遺伝子発現は、昆虫細胞において本発明によって提供される核酸配列から本発明の融合タンパク質を発現することができるｒＢＶを用いた方法によって行われる。従って、詳細な実施形態において、本発明は、（ｉ）組み換えタンパク質を発現して、これらの集合によるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の形成を可能にする条件において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むｒＢＶを用いて感染させた昆虫細胞を培養すること、および（ｉｉ）必要に応じて、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を単離および付加的に精製することを包含するＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の生産方法を提供する。従って、当該方法は、まず、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む、本発明の核酸配列または本発明によって提供される発現カセットを含むｒＢＶから構成される組み換えベクターを得ること、当該ｒＢＶを昆虫細胞に感染させて組み換えタンパク質を発現させること、ならびに必要に応じて、本発明の融合タンパク質の集合によって形成されるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の単離および続いて付加的に当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の実質的な精製を包含する。
【００７８】
本発明の融合タンパク質の発現を可能にする組み換えバキュロウイルスの集合は、ここに記載された事項およびこの技術に関する分野の状態（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．、Ｌｅｕｓｃｈ ＭＳ ｅｔ ａｌ． １９９５．“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける組み換えバキュロウイルス（バックミド）の直接の選択にとっての新規の宿主ベクター系”Ｇｅｎｅ １６０：９１ − ４、およびＬｕｃｋｏｗ ＶＡ ｅｔ ａｌ． １９９３．“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて増殖させたバキュロウイルスゲノムに外来遺伝子の部位特異的なトランスポゾンを媒介する挿入することによる、感染性組み換えバキュロウイルスの効率的な生成”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：４５６６−７９）に基づいて当該分野における当業者によって実施されてもよい。
【００７９】
他の詳細な実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞であり、本発明の融合タンパク質の遺伝子発現は、酵母細胞において本発明の融合タンパク質の発現を可能にする組み換えベクターを用いる方法によって行われてもよい。従って、詳細な実施形態において、本発明は、（ｉ）組み換え融合タンパク質の発現およびこれらの集合によるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の形成を可能にする条件において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターを用いて形質転換した酵母の培養、ならびに（ｉｉ）必要に応じて、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の単離および付加的な精製を包含するＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の生産方法を提供する。従って、当該方法は、まず、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む、本発明の核酸配列または本発明によって提供される発現カセットを含むプラスミドから構成される組み換えベクターを得ること、当該組み換えベクターを用いて酵母細胞を形質転換させて組み換えタンパク質を発現させること、ならびに必要に応じて、本発明の融合タンパク質の集合によって形成されるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の単離および続いて付加的に当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の実質的な精製を包含する。特定の実施形態において、酵母の形質転換に好適な発現系は、ｐＥＳＣ酵母発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づいている。本発明の融合タンパク質の発現を可能にする好適な組み換えベクターを用いて形質転換した酵母を培養することは、ここに記載された事項およびこの技術に関する分野の状態（ｐＥＳＣ エピトープタグ付きベクターの取り扱い説明書 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版 Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）に基づいて、当該分野における当業者によって行われてもよい。通常、酵母細胞において得られたＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、Ｔ＝１のカプシドである。一例を挙げると、領域ＡがｐＶＰ２−４４１タンパク質から構成されるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊、ｐＶＰ２−４５６タンパク質またはｐＶＰ２−４６６タンパク質は、酵母細胞において産生されるとき、このようにして得られたＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、Ｔ＝１のカプシドのみであった。
【００８０】
他の局面において、本発明は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を産生して得るための本発明によって提供される組み換えベクターの利用に関する。
【００８１】
当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、ベクター、または生物学的活性を有する分子（例えば、疾患を処置する治療的な能力を有する、薬物、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ホルモン、酵素、または核酸など）のような所望の産物の輸送体として使用されてもよい。このため、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊は、治療、診断または研究の目的に使用されてもよい。詳細な実施形態において、上記生物学的な所望の分子は、輸送された動物もしくはヒトにおける免疫反応抗原または誘導因子のような所望のポリペプチドを包含するので、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊ウイルス、細菌、寄生虫または他の種類の微生物に起因するヒトおよび動物の疾患に対するワクチンの調製に使用されてもよい。また、上記生物学的な所望の分子は、好適な細胞内において誘導されるような遺伝子治療に有用な核酸配列を含むので、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊遺伝子治療ベクターの調製に使用されてもよい。また、上記生物学的な所望の分子は、所望の衛生的な化合物（疾患を処置する能力を有する抗体、ホルモン、または酵素など）含むので、当該ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊活性物質の輸送系として使用されてもよい。
【００８２】
従って、他の局面において、本発明は、薬学的組成物（例えば、ワクチン、または活性物質の輸送系など）の調製におけるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の利用に関する。詳細な実施形態において、当該薬学的組成物は、ウイルス、細菌、寄生虫または他の種類の微生物に起因するヒトまたは動物の疾患、あるいは腫瘍性の疾患に対する予防を与えることを目的とするワクチンである。他の詳細な実施形態において、当該薬学的組成物は、遺伝子治療ベクターである。他の詳細な実施形態において、当該薬学的組成物は、活性物質の輸送系である。上記活性物質は、例示的かつ非限定的に、疾患の治療に潜在的に関与する薬物、抗体、ホルモンまたは酵素などである。
【００８３】
さらに、他の局面において、本発明は、治療に有効な量のＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊ならびに薬学的に受容可能な補助剤または賦形剤を含む薬学的組成物に関する。詳細な実施形態において、当該薬学的組成物は、ワクチン、遺伝子治療または活性物質の輸送系である。
【００８４】
他の局面において、本発明は、薬学的に受容可能な補助剤および／または賦形剤を付加的に有する治療に有効な量のＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を含むワクチンに関する。当該ワクチンは、微生物（例えば、ウイルス、細菌または寄生虫など）に起因する疾患、または腫瘍性の疾患に対する動物およびヒトの保護（例えば、予防）に有用である。詳細な実施形態において、当該ワクチンは、１つ以上の感染性の疾患誘導因子に起因する感染に対する動物およびヒトの同時の予防にとって、特に有用である。一例を挙げると、本発明によって提供されるワクチンは、トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、ガン、キジ、ウズラおよびダチョウなど）をＩＢＤＶおよびトリの疾患の原因である１つ以上の感染性因子（トリの病原体）に対して予防することに使用されてもよい。
【００８５】
本明細書において使用される意味において、“治療に有効な量”という表現は、所望の影響を引き起こすように、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の計算された量を意味しており、この量は、他にも理由があるが、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の典型的な性質および得られる免疫効果によって、通常、決定される。
【００８６】
上記ワクチンに使用され得る薬学的に受容可能な補助剤および担体は、当該分野における当業者にとって周知であり、かつ従来のワクチンの調製に使用される補助剤および担体である。
【００８７】
詳細な実施形態において、上記ワクチンは、食塩溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）もしくはあらゆる他の薬学的に受容可能な希釈剤のような、薬学的に受容可能な希釈剤における溶液または水性の懸濁液として調製される。
【００８８】
本発明によって提供されるワクチンは、上記ワクチンが選択された投与方法に好適である薬学的な形態に調合されるために、使用された異種の配列またはエピトープに対して、結果として免疫反応を生じるあらゆる好適な投与方法によって投与されてもよい。詳細な実施形態において、本発明によって提供されるワクチンの投与は、非経口的（例えば、腹腔内的または皮下的など）に実施される。
【００８９】
他の局面において、本発明は、ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を含む遺伝子治療ベクターに関する。
【００９０】
他の局面において。本発明は、少なくとも１つのＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊および１つの活性物質を含む活性物質の輸送系に関する。例示的かつ非限定的に、活性物質としては、疾患の処置に治療の能力を有する薬物、抗体、ホルモンまたは酵素が挙げられる。
【００９１】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、あらゆる意味において本発明を限定するものではない。
【００９２】
〔実施例１：昆虫細胞におけるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊採取および構造的多様性の解析〕
Ｉ．材料と方法
（ウイルスの調製）
抗体型ＩのＩＢＤＶ株であるＩＢＤＶ ソロア株は、ウズラの筋肉ＱＭ７細胞から通常の手順によって精製され（Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ． １９９９．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３， ６９７３−６９８３）、２５ｍＭ ＰＥＳ緩衝液に保存された（ピペラジン−Ｎ−Ｎ’−ビス（２−エタノスルホン酸） ［ＰＩＰＥＳ］ ｐＨ＝６．２、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＣａＣｌ２）。
【００９３】
（組み換えバキュロウイルスの集合）
組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）ＦＢ／ＶＰ２−４５６は、以前に説明されている（Ｃａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１． “伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの主要なカプシドタンパク質ＶＰ２のＣ末端は、カプシド集合体にとってのＴ数の決定に関与する”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５， １０８１５−１０８２８）。
【００９４】
プラスミドｐＶＯＴＥ．／ＰＯＬＹ（Ｏｎａ ｅｔ ａｌ， ２００４．“ｐＶＰ２のＣ末端領域は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのカプシドポリペプチドである、ＶＰ２とＶＰ３との相互作用に必須である”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２２， １３５−１４２．）は、ＦＢ／ＶＰ２−４４１、ＦＢ／ＶＰ２−４６６、ＦＢ／ＶＰ２−４４１ＦＢ／ＶＰ２−４７６、ＦＢ／ＶＰ２−４８７、ＦＢ／ＶＰ２−４９４、ＦＢ／ＶＰ２−５０１およびＦＢ／ＶＰ２−５１２として同定されているｒＢＶを生成するために、ｐＶＰ２に由来するこれらのＤＮＡ断片のＰＣＲ合成に関する鋳型ＤＮＡとして使用されている。ＰＣＲは、ベントＤＮＡ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡ）重合酵素（Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに、５’末端に対する同じプライマー（５’−ｐＶＰ２）および各変異体の３’末端に特異的なプライマー（表１）を用いて実施された。
【００９５】
【表１】
【００９６】
Ｂｇｌ ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いたＰＣＲ消化の断片は、タンパク質発現プラスミドＦａｓｔＢａｃおよびｐＨｉｓＦａｓｔＢａｃ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の多（ポリリンカー）クローン化部位にクローン化された。プラスミドｐＨｉｓＦａｓｔＢａｃ−Ｃは、ｐＶＰ２の変種を発現させるために用いられた。使用された外部のタグ配列の１文字表記は、ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＧＳ（配列番号１２）である。結果として生じるプラスミド配列は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の配列決定法によって確認された（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７．“連鎖停止阻害剤を用いたＤＮＡ配列決定”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４， ５４６３−５４６７）。
【００９７】
バックミドの選別は、Ｅ． ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂａｃ株から得て、リポフェクトアミンを用いてそれらをトランスフェクションするためのこれらの調製は、製品（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の手順に従って実施した。
【００９８】
集合体は、Ｈ５昆虫細胞において発現された（Ｍａｒａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのカプシドの内部タンパク質ＶＰ３の同定およびＲＮＡ結合モチーフの性質決定”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７， ２４５９−２４６８）（図１）。
【００９９】
（ｐＶＰ２欠損変異体構造の性質決定）
Ｈ５細胞は、好適なｒＢＶを用いて、１つの細胞につきプラーク形成単位（ＰＦＵ）１〜５の感染の多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）に感染させた。細胞は、感染後４８時間（４８ ｈｏｕｒｓ ｐｏｓｔ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（ｈ．ｐ．ｉ．）において回収され、氷上において１％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＥＳ溶解緩衝液に溶解された。粒子の材料は、２０％のショ糖の緩衝物および２５〜５０％の直線的なショ糖勾配を通して精製された。ｐＶＰ２欠損変異タンパク質を含む粒子の材料は、超遠心分離によって２０倍に濃縮され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって同定された。ＶＰ２を豊富に含む分画は、構造的な研究用に選抜され、精製の後から最初の１〜２日以内に使用された。
【０１００】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング）
感染細胞の細胞抽出物（１０〜１５μｌ）またはショ糖濃度勾配の画分（２〜５μｌ）は、１倍の最終濃度に達するまでレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液に加えられ、加熱された（１００℃において２分間）。電気泳動は、１１％のポリアクリルアミドゲル（３８．９６％（体積あたりの重さ）のアクリルアミドおよび１．０４（体積あたりの重さ）のビス−アクリルアミドメチレン）において実施された。ウエスタンブロッティングは、抗ＶＰ２血清（Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ． １９９９．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：６９７３−６９８３）を用いて実施された。ウサギ抗ＶＰ３血清は、陰性対照として使用された。抗Ｈｉｓタグ抗体は、Ｓｉｇｍａから得られた。
【０１０１】
（従来の電子顕微鏡法）
ショ糖勾配の各画分の試料２〜５μｌが用意され、２％（体積あたりの重量）の水性の酢酸ウラニルを用いて逆染色された。顕微鏡写真は、１００ｋＶにおいて動作する公称倍率４００００倍のＪＥＯＬ １２００ ＥＸＩＩ電子顕微鏡を用いて記録された。
【０１０２】
（電子顕微鏡法）
試料（５μｌの液滴）またはビリオンもしくはＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドを含む画分は、Ｃａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｃａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１． “伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの主要なカプシドタンパク質ＶＰ２のＣ末端は、カプシド集合体にとってのＴ数の決定に関与する”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５， １０８１５−１０８２８）によって本質的に開示されているように確立された方法に従って、石炭を用いて覆われた網の上に置かれ、水滴を用いて２回洗浄され、吸収によって乾燥され、かつ液体エタン槽に沈められた。顕微鏡写真は、２００ｋＶにおいて動作し、かつ視野装置を備えるＴｅｃｎａｉ Ｇ２電子顕微鏡において、公称倍率５００００倍において捕えられた試料が６−１０ｅ−／ｎｍ２の露光を受け取るように、最小の露光条件において記録された。バクテリオファージＴ４がガラス化され、尾部の鞘の軸方向に対する４０．５オングストロームの間隔が内部の倍率対照として使用された。
【０１０３】
（円偏光２色性（ＣＤ）顕微鏡法）
配列番号１のペプチドは化学的に合成され、遠紫外線円偏光２色性のスペクトルが、２５℃において０．１〜１ｍｍの大きさを有する細胞を用いてＪａｓｃｏ ２色性写真に記録された。ペプチド濃度は、１０から２００μＭの範囲を使用した。ＣＤスペクトルは、Ｊｉｍｅｎｅｚ １９９９（Ｊｉｍｅｎｅｚ ｅｔ ａｌ， １９９９．“アルファチュブリンのＣ末端（４０４−４５１）組み換えペプチドおよびベータチュブリンのＣ末端（３９４−４４５）組み換えペプチドのらせん構造”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ８， ７８８−７９９）によって以前に説明されたように分析された（図４Ａ）。
【０１０４】
（画像解析）
通常の画像処理操作が、ＰＩＣソフトウェアシステム（Ｔｒｕｓ ｅｔ ａｌ． １９９６.“電子顕微鏡のデジタル画像処理：ＰＩＣ システム−ＩＩＩ”Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１６， ６１−６７）を用いて実施された。顕微鏡写真は、フーリエ解析によって、それらの解像度および非点収差に関して評価された。選択された電子顕微鏡写真のサブフォーカル（ｓｕｂ−ｆｏｒｃａｌ）値は、電子顕微鏡のコントラスト伝達関数の第１の０以内にある解像度において構造を再構成することを可能にする。解析された選択された顕微鏡写真にとってのサブフォーカル値（ＩＢＤＶにとって８１、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドにとって８２）は、０．６から３．７μＭの範囲（それぞれ、１２〜３０オングストロームの間隔におけるＣＴＦ）にわたって、ビーソフトパッケージ（Ｂｓｏｆｔ ｐａｃｋａｇｅ）（Ｈｅｙｍａｎｎ， ２００１）を用いて測定された。顕微鏡写真は、Ｚｅｉｓｓ ＰｈｏｔｏＳｃａｎ ＴＤ ｓｃａｎｎｅｒを用いて２１μｍ／ピクセル（試料において４．２オングストローム）において得られ、かつ階級化して（ｂｉｎｎｅｄ）２１μｍピクセルを生成した。タンパク質の粒子は、抽出され、かつＣｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．の自動化された方法（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３．“ＨＳＶ−１の凍結した水和カプシドに対する放射線障害に対する影響”Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１１， ２２２−２３３）を用いて前処理された。粒子の角度方向に関する第１の評価は、開始モデルとして３次元再構成したＩＢＤＶを用い、好適な尺度および２８オングストロームの解像度において、“通常の方式の”フーリエ変換における処理（ＰＦＴ：ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｆｏｕｒｉｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ）（Ｂａｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ， １９９６．“凍結電子顕微鏡法によって結像された生物学的な巨大分子の方向を決定するモデルベース（ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ）手法”Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１６， １２０−１３０）によって測定される。新しい密度配置像が算出され、かつ振幅および面情報の両方が使用可能なように、ＰＦＴの演算手順を改良した様式を用いて、続く面方向決定のすべての補足および起点に使用された。
【０１０５】
モデルベース処理のみが、小さなＶＰ２カプシドを再構成するために使用され、大きなＶＰ２カプシドから抽出された他の小さなＶＰ２カプシドは、開始モデルとして使用された。その３次元構造は、対称性によって元のカプシドと関連する無作為に選択する等価な観察によって、加重逆投影法を用いて正２０面体の対称性を課すことなく、かつ全体の配向性間隔を通して、方向決定を分布させることなく、内部対照として算出された。結果として得られた密度配置像は、低解像度においてであるが、正２０面体の対称性に基づく方法を用いて得られた密度配置像と類似であった（図示せず）。面は、要求されたＣＴＦの小葉（ｌｏｂｕｌｅ）面の単純な転移を用いて、コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）に関して補正された。再構成は、フーリエ−ベッセル手法（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ， １９７１．“電子顕微鏡写真からのフーリエ合成による３次元再構成の手法”Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｓｅｒ Ｂ ２６１， ２２１−２３０）を用いて算出された。最終的な再構成は、ＩＢＤＶおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドに関する１０８４９および１５５７の画像を組み合わせ、かつ解像度は、それぞれ１２および１５オングストロームの外皮のフーリエ相関基準（閾値０．５）を用いて得られた。より小さいＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドについての他の再構成は、顕微鏡写真の同じ設定から算出された。１０８の粒子を含む最終的な再構成解像度は、ＦＳＣ解析（Ｃｏｎｖａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３．“ＨＳＶ−１の凍結した水和カプシドに対する放射線障害に対する影響”Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１１， ２２２−２３３）によって得られた評価に従って、約２３オングストロームと評価された。
【０１０６】
球面的に定量された半径方向の密度プロファイルは、Ｔ＝１３の配置像の両方について算出され、かつ標準化および両方のプロファイルを重ねる倍率にされた。それから、配置像は、両方の差異および２つの配置像の水準を変えることによって得られた。小さな密度の島は、タンパク質の外皮に対応する半径について、より大きな差異のみに考慮して、フィルタを通して、両方の配置像の結果（図８Ｅおよび８Ｆを参照のこと）に転換された。
【０１０７】
ＩＩ．結果
（Ｎ末端にＨｉｓ−タグを有しているｐＶＰ２タンパク質Ｃ末端欠損変異体）
組み換えバキュロウイルスにおいて発現されるとき、ＶＰ２タンパク質（４４１アミノ酸）に生じているｐＶＰ２タンパク質のＣ末端（５１２アミノ酸）のプロセシングが起こらないと仮定すると、Ｃ末端の長さについて変化しているｐＶＰ２の異なる集合体が、上述の系において発現される。４５６、４６６、４７６、４８７、４９４および５０１位（図３Ａ）は、上述の領域を均一に覆うために選択される。これらのｐＶＰ２／ＶＰ２変種のウエスタンブロッティング解析は、Ｃ末端に欠損を有するｐＶＰ２変異体のすべてが、正確に発現されて、主要なバンドを生じる（図１）。また、ＨｉｓタグとそれらのＮ末端において融合されている（ＨＴ−ＶＰ２）、ｐＶＰ２／ＶＰ２変異体の同じ組が、生成される。ｐＶＰ２／ＶＰ２の変種の分子量は、表２に示されている。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
ｐＶＰ２／ＶＰ２の変種は、高い水準に発現され、かつショ糖勾配を受けて、ショ糖の緩衝物を用いて精製された。上述の勾配から得られた画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって性質決定された。クーマシーブルーを用いて染色されたゲルは、ｐＶＰ２の変種を含む画分が非常にブロードなバンドを有していることを示した（図３Ｂおよび３Ｃ）。以下に説明されている手法に従ってＩＢＤＶを感染させた細胞から得られた融合タンパク質は、上述の結果と比較するために精製された（図３Ｄ）。Ｈｉｓタグを含んでいないｐＶＰ２変異体は、異種の指向性を示し、一方において、Ｈｉｓタグを含んでいるｐＶＰ２／ＶＰ２融合タンパク質は、Ｃ末端領域の長さの増加に合わせてその大きさが増加するように構成されている（図３Ｃ）。
【０１１０】
（ｐＶＰ２／ＶＰ２集合体の電子顕微鏡解析）
ショ糖勾配から得られ、電子顕微鏡法によって逆染色された、異なるタンパク質の画分の解析は、ｐＶＰ２のＣ末端の長さおよびＨｉｓタグの有無に依存して異なる形態を示した。
【０１１１】
ＶＰ２−４４１（図４Ａ）およびＶＰ２−４６５（図４Ｂ）は、Ｔ＝１２の対称性を有する１２面体のカプシドの直径と一致する２３ｎｍの直径を有するドーナツ型の集合体構造を生じる。従って、形成されるＶＰ２−４６６集合体の種類によって、その変種は、ショ糖勾配を通ってある位置に置かれる。約２５ｎｍの直径を有する細い管を含む（図４Ｃ）下部の画分は、らせんの形態に規則正しく整列した（図４Ｃの箱）。中間の画分は、この対称性がおそらく非常に不安定であることを示すカプシドを妨げる物質によって取り囲まれた、Ｔ＝１と類似の対称性のカプシドを有する短めの細い管を示した（図４Ｄ）。また、Ｔ＝１３と類似の対称物が、たまに観察された（図４Ｄの箱）。勾配における上部に優勢な構造は、同程度の小さい粒子であった（図４Ｅ）。ＶＰ２−４７６ＶＰ２−４６６と同じような挙動を示す。ＶＰ２−５０１のほとんどは、勾配の下半分における画分に移動し、約３５ｎｍの直径を有する部分的に整列した管に集合した（図４Ｆ）。勾配の上半分の部分において、ＶＰ２−５０２は、不規則な大きさを有する等軸のねじれた管状の構造に集合している。ＶＰ２−５１２が、曲がった短い細管および不規則な粒子として最終的に観察された。
【０１１２】
ＩＢＤＶによって感染した細胞において、生成した構造のほとんどは、勾配の中間に位置し、かつ６５〜７０ｎｍの直径を有する正２０面体の粒子と一致していた（図４Ｈ）。しかし、種類Ｉの管と呼ばれる六角形の構成を有する管状の構造は、勾配の下部の近くに観察された（図４Ｇ）。
【０１１３】
これらの結果のすべては、ＶＰ２−４６６が６量体（細い管）種のカプシドおよび５量体（Ｔ＝１のカプシド）種のカプシドを形成するという十分な情報を示し、かつＴ＝１３集合体を有するカプシドがたまに観察された。
【０１１４】
（（Ｈｉｓ−）ｐＶＰ２／ＶＰ２集合体の電子顕微鏡解析）
ＨＴ−ｐＶＰ２／ＶＰ２融合タンパク質の集合体は、同様に解析された。２３ｎｍの直径を有する粒子の存在は、ＨＴ−ＶＰ２−４４１が豊富に含まれる画分において観察された（図５Ａ）。ＨＴ−ＶＰ２−４５６変異体は、実際に感染性を有するＴ＝１３のカプシドと類似の形態を有する、勾配の中間に移動した構造の集合体を産生した（図５Ｂと図４Ｈとを比較すればよい）。Ｔ＝１のカプシドであるＨＴ−ＶＰ２−４６５のほとんどは、勾配の上部の部分に位置していた。正しいカプシドを形成する傾向は、ＨＴ−ＶＰ２−４６６において向上された（図５Ｃ）。Ｔ＝１３と類似のカプシドを有する粒子は、多量に存在することを示し、かつこれらが高い効率において得られるので、これらは、高い解像度の構造的な研究用に選抜された。５３ｎｍという中程度の大きさを有するカプシドは、Ｔ＝１３のカプシドと容易に区別され得る（図５Ｃの矢印）。
【０１１５】
ＨＴ−ＶＰ２−４７６（図５Ｄ〜Ｆ）およびＨＴ−ＶＰ２−４８７の融合タンパク質は、ウイルスと同様の構造を有するカプシドとして集合される能力を維持していたが、その効率は低かった。優勢な構造は、種々の長さを有する六角形の管であった（図５Ｄ）。最後に、ＨＴ−ＶＰ２−４９４、ＨＴ−ＶＰ２−５０１およびＨＴ−ＶＰ２−５１２の融合タンパク質は、明らかに六角形の配列を有する管状の構造のみを形成した。
【０１１６】
異なるｐＶＰ２／ＶＰ２タンパク質のＮ末端におけるＨｉｓタグは、規則正しい粒子におけるサブユニットの集合に影響を与えなかった。ＶＰ３の非存在において、カプシドの他の主要な構成要素であるＨＴ−ＶＰ２−４５６は、Ｔ＝１３のカプシド類似の対称性を有する構造の正確な集合を可能にする。
【０１１７】
（ｐＶＰ２Ｃ末端領域の４４３〜４５２アミノ酸の円偏光２色性解析）
ｐＶＰ２タンパク質Ｃ末端の４４３〜４５２アミノ酸と一致する、配列番号２のペプチドの２次構造は、アガディール（Ａｇａｄｉｒ）コンピュータプログラム（Ｍｕｎｏｚ ａｎｄ Ｓｅｒｒａｎｏ， １９９４．“実証的な要因を用いたらせん状のペプチドの折りたたみに関する課題の解明”Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １， ３９９−４０９）を用いて予測された。上述のプログラムは、両親媒性のαらせんを生じる、上記ペプチドにおいて明白ならせん状の傾向を検出した（図１０Ｂの左）。この予測を対比するために、４４２〜４５４アミノ酸である合成ペプチドが合成され、２次構造の平均が円偏光２色性によって解析された。水性の緩衝液において、上記ペプチドは、不揃いな曲がりくねった形態を取り入れたような、無意味ならせん構造を示した。らせん体を誘導する溶媒であるトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）が加えられたとき、上記ペプチド明確にらせん体の構成要素の形態を生じた。類似の周知の構造を有するペプチドが見られるか否かを調べるために、ＷＨＡＴＩＦ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｂｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／ｇｖ／ｗａｈｔｉｆ）を用いてＰＤＢ（タンパク質データベース）において検索され、上記ペプチドは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｃａｎａのトリオースリン酸イソメラーゼにおける２４１〜２５０アミノ酸（Ｌｍ ＴＩＭ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９．“ｌｅｉｓｈｍａｎｉａトリオースリン酸イソメラーゼの構造的かつ変異生成の研究：点変異が触媒能力を失うことなく、中温性の酵素を非常に安定な酵素に転換することができる”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １２， ２４３−２５０）に見られた。一文字表記においてＥＦＲＤＩＩＤＡＴＲ（配列番号１３）と表される上記ペプチドを１０個のｐＶＰ２アミノ酸と比較すると、保存的な変化（Ｋに対してＲ）、負荷された鎖の片側の維持によって極性を変えるＲを用いたＤの置換、およびＩに対してＴの変化があり、両親媒性がほとんど一致していることが観察された。
【０１１８】
（ＩＢＤＶ カプシドの構造）
ＩＢＤＶ粒子の極低温顕微鏡写真は、明確に周辺を表す領域を示している（図６Ａ）。Ｔ＝１３のカプシドの最終的な密度配置像は、１２オングストロームの解像度を用いて算出された。上記カプシドの分子集合体は、Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７．“極低温電子顕微鏡法によって決定された伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの３次元構造”Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１， ３２５−３３０）によって開示されている、主要な性質として連続的な外皮から突出している２６０個のＶＰ２の３量体が存在し、かつ異なる形態における５種類に並べられている（図６Ｂのａ〜ｅ）ことと、必須に類似している。解像度の向上によって、より正確かつ厳密な方法において構造的な詳細の多く、特にカプシドの内側における５つの軸を同定することができた。このようにして、５量体ごとに５つある内側に６０個ある３量体は、２つの環状の端部によって置き換えられている。一方において、予測されていたように（図９）、最も外側の端部は、１０個の緊密に接続された球状の密集体によって形成され、内側の端部は、５つの球状体によって形成されている。他の関連する面は、カプセル状の外皮における穴の存在に関与している。これらの穴（全部をあわせて６１６個）は、約１５オングストロームの直径を有しており、外側における隣接する３量体の間にある接続腕と呼ばれる、密度接続に基づいて正確に配置されている。
【０１１９】
（Ｈｉｓ−ＶＰ２−４６６ カプシドの構造）
ウイルス様粒子が豊富に含まれる画分の遠視顕微鏡解析は、ＶＰ２−４６６カプシドが、異なっているが、類似の集合体を有するカプシドの複雑な混合物によって形成されていることを示している（図７Ａ）。これらのカプシドは、より小さい異性体の集合体を有する、６５ｎｍ（Ｔ＝１３のＩＢＤＶカプシドと類似している）から５３ｎｍまでの範囲にある大きさをほぼ有している。これらの構造物のすべては、同じ周辺を表す領域を示した。ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシド３次元再構成は、１５オングストロームの解像度を用いて測定された（図７Ｂの左および中央）。ＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの外側は、ほとんど重なり合っているが、内側は、明らかな差異を示している。より大きな構造上の差は、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドにおいてＹ字型の３量体の構造を接続しているが、ＩＢＤＶカプシドにはない付加的な密度が観察される、対照な５つの部分から成る軸および６つの部分から成る軸に関する。
【０１２０】
中間の大きさを有するＨＴ−ＶＰ−４６６カプシドの密度配置像は、３角形のカプソマーの３種類（ａ’、ｂ’およびｃ’と呼ばれる）のみを必要とすることを除いて、Ｔ＝１３のカプシドにおける３量体のカプソマーの類似物との等価性に基づいて、Ｔ＝７の対称性を示した（図７Ｂの右）。Ｔ＝１３のカプシドとＴ＝７のカプシドとは、正２０面体の格子においてＨＴ−ＶＰ−４６６の同じ必須の３量体の塊を共有している。
【０１２１】
（ＩＢＤＶ カプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６ カプシドとの構造的および生化学的な比較）
構造上の類似性は、ＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ−４６６カプシドの半径方向の密度プロファイル（図８Ａ）ならびに中央の断面（図８ＣおよびＤ）の両方において、ほとんど完全に重なっているということが、見られた。２つの軽微な差異がタンパク質の覆い（約２５３オングストローム〜３５０オングストロームの半径）に見られる（図８Ａの矢印）。付加的な密度の頂点が、主にＩＢＤＶカプシドの内側において観察され、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドにおける他の密度の頂点が、３２５オングストローム〜３４５オングストロームの半径において、位置している。異なる配置像は、より厳密に上述の差を位置付けるために、両方の構造物において、タンパク質の鞘が有する密度の数値の数学的な減算によって算出された。２つの配置像における減算の次数を変えることによって、結果として生じる配置像は、各構造の原因になっているそれらの構造上の差異のみを示す（図８ＥおよびＦ）。ＩＢＤＶ上にある構造上の差異の位置は、大きく異なっている領域が隣接するＶＰ２の３量体の間にある接続腕であるということを示している。内側における構造上の差異は、正確にはＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの内側の高密度体が配置されている、主に対称な５つの部分から成るおよび６つの部分から成る軸にある。
【０１２２】
クーマシーブルーを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル染色は、ウイルス粒子を多く含む画分が、全体のタンパク質のほぼ９０％を構成する主要な要素として、ｐＶＰ２／ＶＰ２およびＶＰ３を含んでいるということを示した（図８Ｂ）。ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドによって電子顕微鏡データを得るために使用した画分の等価な分析は、上述のカプシドが約５４ｋＤａの単一のポリペプチドから構成されていることを示した。タンパク質のさやの水準における最小の差異がＶＰ３との差異を確認したことを考慮しないので、得られた結果は、両方のカプシドがＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドのそれぞれにとって、単一のタンパク質、ＶＰ２またはそのＨｉｓタグ変種から集合され、かつＶＰ３がＩＢＤＶカプシドの必須な構成要素として組み入れられないということを意味している。
【０１２３】
（カプシドＴ＝１３における擬似等価物の解析）
このカプシドは擬似等価物を考慮する必要があるので、ＩＢＤＶカプシドにとって新しい概要が考慮される必要がある。この仮定を確かめ、かつＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−カプシドの同等な性質を評価するために、上述したカプシドの正２０面体の配置像が比較された（図９）。最も外側の断面（３２８〜３１１オングストローム）は、４両体の単位が基本的に一致していることを示した（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）。さらに、連続したカプシドが明確であり（３０２〜２９４オングストローム）、かつ最初の差異が観察された（図９Ｄおよび９Ｅ）。２８６オングストロームの半径において、Ｔ＝１３のカプシドの両方における内側の層が始まる部分に一致する断面は、内側にある３量体の単位２６０個が、対称な５つの部分から成る軸を周囲のそれらを含む、他の３量体の単位２６０個と明確に連続していることを示した（図９Ｆ）。５量体を形成する３量体は、６量体を形成する３量体よりも緊密に集合しており、かつＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの対称な６つの部分から成る軸における可視的な付加的な高密度体がある、２７７オングストロームの半径に明らかに融合されている。階数６の対称な軸における付加的な高密度体は（図９Ｈ）、２６９オングストロームの半径であることが明確である。
【０１２４】
ＩＩＩ．考察
ＩＢＤＶにおいて最も豊富なタンパク質であるＶＰ２の立体配置に関する多形性が、本発明において解析されている。ＶＰ２は、まず、成熟したＶＰ２タンパク質（４４１アミノ酸）を生じるためにＣ末端において数回のプロセシングを受ける、５１２アミノ酸の前駆体ｐＶＰ２として合成される。従って、本発明において開発したバキュロウイルスの系において発現される変異体のほとんどは、ウイルスの集合過程の間に自然に生じる中間体と一致することができる。多形性の制御を担う分子機構が、そのＣ末端に対して一時的に結合され、かつその機能を果たしたときに取り除かれる７１アミノ酸にある。ＶＰ３の非存在において、ＶＰ２タンパク質のＮ末端にＨｉｓタグが存在することは、このＨｉｓタグが集合におけるＶＰ３タンパク質の機能を再現することを示しており、正しい集合に必要である。従って、Ｔ＝１３のＩＢＤＶカプシド複合体の集合を制御することは、本発明の系において遮断されてもよい、２つのポリペプチド要素の独立した相互作用を必要とする。
【０１２５】
本発明の結果は、ＶＰ２タンパク質の変化における分子制御因子が、αらせんの形状に配列されている４４３−ＧＦＫＤＩＩＲＡＩＲ−４５３（配列番号２）断片に配置されていることを示している。本発明のＨＴ−ＶＰ２−４５６変異体は、ＶＰ２における単一の立体配置または複数の立体配置の形成における境界を表す。集合体の単位が短ければ、ＨＴ−ＶＰ２−４６１の場合のように、５量体構造のみが産生され（Ｔ＝１のカプシド）、４４３〜４５３アミノ酸が含まれていれば、Ｔ＝１３カプシドおよびＴ＝１カプシドの両方が形成される。
【０１２６】
〔実施例２：ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊免疫原性の性質決定〕
実施例１において得られたＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２−４５６の免疫原性を評価するために、免疫化試験が１日齢のニワトリにおいて実施された。簡単に説明すると、７個体のＳＰＦ（特異的抗原なし）動物の群がＰＢＳに希釈された１動物につき１０μｇのＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２−４５６を含む２００μｌの１回投与によって筋肉内に免疫化された。類似の群は、ＰＢＳを注射された。血清が両方の群における動物の１匹ずつから毎週に抽出された。群における個々の等しい容積によって代表される同質の血清（プール）を得るために、各群および日に由来する血清は、混合された。当該血清は、ＥＬＩＳＡを用いて分析された。これを受けて、ウェルが１０ｎｇのＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２−４５６を用いて覆われた。試験は、これまでに開示されている手法（Ｂｉｅｒｅｒ、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓによって編集された、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｃ＿ｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）に従って実施された。得られた結果は、補助剤の非存在において単一の免疫化がｐＶＰ２−４５６タンパク質に対する強力な反応を引き起こすことを示す。実施例１において得られた他のＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２ｓ＊が試験されたとき、同様の結果が得られた。また、スペイン特許出願Ｐ２００３００７５１、Ｐ２００４００１２０およびＰ２００４００１２１に開示されているＩＢＤＶ ＶＰ２を含む、他のキメラおよび非キメラのＶＬＰの両方が試験されたとき、同様の結果が得られた。
【０１２７】
〔実施例３：酵母におけるＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊（ｐＶＰ２-＊ＢＴ）の採取〕
発現プラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６−ＢＴは、酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の培養細胞においてＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊の取得を可能にする研究用に、ｐＶＰ２−４５６のＮ末端に結合された、ＢＴと呼ばれるＦＭＤＶキメラペプチドをコードする異種の遺伝子（Ｚｈａｎｇ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ ４６（１）： １−９）を用いて生成された。当該キメラＢＴペプチドは、Ｂ細胞エピトープ（ＦＭＤＶのスペイン抗原型における単離されたＶＰ１タンパク質の１３３〜１５９位に配置されている）およびＴ細胞エピトープ（ＦＭＤＶのアジア抗原型におけるＶＰ４タンパク質の２０〜３４位に配置されている）を含んでいる。当該Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列は、一文字表記においてＳＩＩＮＮＹＹＭＱＱＹＱＮＳＭ（配列番号１４）であり、一方において、当該Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列は、一文字表記においてＭＴＴＴＹＴＡＳＡＲＧＤＬＡＨＬＴＴＴＨＡＲＨＬＰ（配列番号１５）である。
【０１２８】
発現プラスミド集合における第１の段階は、ベクターｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖにｐＶＰ２タンパク質のコード領域をクローニングすることによって実施された。プラスミドｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖは、酵素Ｐｖｕ ＩＩを用いてベクターｐＲＳ４２６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を消化し、かつ消化混合物を最連結することによって生成された。ｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖである結果物のベクターは、親ベクターｐＲＳ４２６に対して逆の位置に他クローン化領域を含んでいる。ｐＶＰ２−４５６タンパク質に対応するＤＮＡ断片は、鋳型としてプラスミドｐＶＯＴＥ．２／Ｐｏｌｙを用いて対応するオリゴヌクレオチド（表１）とともにＰＣＲ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｒｉｓｃｏ， Ｃ．， Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｓ．， Ａｌｂａｉ， Ｊ． Ｐ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ．（１９９８）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＯＲＦ Ａ１の発現がウイルス様粒子を結果として生じる”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：１０４７−１０５４）することによって得られた。断片は、精製され、酵素Ｂｇｌ ＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化が実施され、かつＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを用いてあらかじめ消化した上述のベクターｐＥＳＣＵＲＡ．ｉｎｖにクローン化された。結果物のプラスミドは、ｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６と呼ばれた。
【０１２９】
上述のＦＭＤＶキメラＢＴペプチドのオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片は、あらかじめ好適な制限酵素を用いて消化された上述のプラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６にクローン化された。
【０１３０】
上述のプラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６−ＢＴは、続いて、これまでに開示された手法（Ｇｉｅｔｚ， Ｒ．Ｄ． ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｗｏｏｄｓ． （２００２）“Ｌｉａｃ／ＳＳ担体ＤＮＡ／ＰＥＧ法による酵母の形質転換”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０： ８７−９６）に従って、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母の１倍体株である４９９の培養細胞の形質転換に使用された。上述のプラスミドを用いて形質転換した酵母は、アミノ酸であるトリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを補い、かつウラシルを欠いている（−Ｕｒａ）ＳＣ培地（ＣＳＭ＋ＹＮＢ、２％グルコースおよびバクトアガー）を用いた培養皿における増殖によって選抜された。３０℃において４８時間に渡ってインキュベーションした後に、タンパク質発現の以降の解析およびＣＶＬＰｓ−ＶＰ２−４５６−ＢＴの形成の実施に使用される、コロニーが選抜された。
【０１３１】
ｐＶＰ２−４５６およびＢＴタンパク質発現ならびにＣＶＬＰ形成の解析は、他の発現系においてＩＢＤＶ ＶＬＰの性質決定するこれまでに開示された手法（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｒｉｓｃｏ， Ｃ．， Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｓ．， Ａｌｂａｒ， Ｊ． Ｐ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ．（１９９８）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＯＲＦ Ａ１の発現がウイルス様粒子を結果として生じる”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：１０４７−１０５４、およびＬｏｍｂａｒｄｏ， Ｅ．， Ｍａｒａｖｅｒ， Ａ．， Ｃａｓｔｏｎ， Ｊ． Ｒ．， Ｒｉｖｅｒａ， Ｊ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｓｅｒｒａｎｏ， Ａ．， Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ． （１９９９）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６９７３−６９８）に従って実施された。選抜されたコロニーは、２％ラフィノースを補ったＣＳＭ（−Ｕｒａ）＋ＹＮＢ液体培地において培養された。培養細胞は、３０℃において２４時間に渡ってインキュベートされた。この培養細胞は、光学密度（ＯＤ）０．２を有する、２％のガラクトース誘導因子を補ったＣＭＳ（Ｕｒａ）＋ＹＮＢ培地を入れた２００ｍｌのフラスコにおいて、接種に使用された。培養細胞は、１８時間に渡って（ＯＤが１．０から２．０になるまで）３０℃に維持された。酵母は、４℃において５分間に渡って３０００ｐｒｍによって遠心分離され、蒸留水を用いて１回の洗浄を行ったあと、ペレットは溶解緩衝液（ＴＥＮ：ｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ）＋２倍のタンパク質分解酵素阻害剤（Ｃｏｍｐｌ Ｒｏｃｈｅ）に懸濁された。および４２５〜６００ミクロンの大きさを有するガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）の１体積が溶解物に加えられた。この混合物は、常に４℃において、２０秒の休憩を挟んで、３０秒間に渡って４回の激しいボルテックスを実施した。それから、可溶性画分は、４℃において１５分間に渡って１３０００ｒｐｍによって溶解混合物を遠心分離によって回収された。この試料は、これまでに開示されている手法（Ｌｏｍｂａｒｄｏ， Ｅ．， Ｍａｒａｖｅｒ， Ａ．， Ｃａｓｔｏｎ， Ｊ． Ｒ．， Ｒｉｖｅｒａ， Ｊ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｓｅｒｒａｎｏ， Ａ．， Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ．（１９９９）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６９７３−６９８３）に従ってショ糖勾配における画分に供された。分画後の試料および開始材料の試料は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（分子生物学における現在の手法）ならびに抗ｐＶＰ２−４５６および抗ＢＴ血清を用いたウエスタンブロッティング（分子生物学における現在の手法）によって解析された。ウエスタンブロットは、ｐＶＰ２と一致する予想される分子量（４８ｋＤａ）およびＢＴタンパク質と一致する予想される分子量を有する、バンドの存在を示した（図１１）。これらの結果は、プラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−４５６−ＢＴを用いて形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ培養細胞において両方のタンパク質の正しい発現を示している。異なる勾配の画分は、前述したようなＴＥＭ（Ｌｏｍｂａｒｄｏ， Ｅ．， Ｍａｒａｖｅｒ， Ａ．， Ｃａｓｔｏｎ， Ｊ． Ｒ．， Ｒｉｖｅｒａ， Ｊ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ， Ａ．， Ｓｅｒｒａｎｏ， Ａ．， Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｆ．（１９９９）．“伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの推定されるＲＮＡ依存的なＲＮＡ重合酵素であるＶＰ１はカプシドタンパク質ＶＰ３と複合体を形成して、ウイルス様粒子への効率的なカプシド形成を導く”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６９７３−６９８３）によって解析された。勾配画分のＴＥＭ解析は、ＣＶＬＰｓ−ＶＰ２−４５６−ＢＴの存在を示した（図示せず）。
【０１３２】
〔実施例４：抗ＦＭＤＶ免疫反応を誘導するＣＶＬＰｓの能力〕
ＣＶＬＰｓが（すなわち、ＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊（ｐＶＰ２−ＢＴ）（実施例３））マウスにおけるＦＭＤＶに対する免疫反応を誘導する能力を評価するために、１４日齢のバルブク（Ｂａｌｂｃ）マウスの４つの群（１群につき１０匹の動物）が、筋肉内的に免疫化された。処置群は、以下の群：
群１、偽薬（ＰＢＳ）；
群２、５０μｇのＣＶＬＰｓ；
群３、１００μｇのＣＶＬＰｓ；および
群４、５０μｇのＣＶＬＰｓに加えて補助剤
であった。
【０１３３】
トコフェロールが補助剤として使用され、かつ免疫原（ＣＶＬＰｓ）の量は、最終量が０．２ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁された。ワクチン接種から３週間の後に、血清試料は、各動物から回収され、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）特異抗体の存在が、前述のようなウサギ 抗抗原型Ｃ ＦＭＤＶ血清（抗Ｃ１ノビル（Ｎｏｖｉｌｌｅ））（Ｅ． ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２３ （２００５） ２６４７−２６５７）を用いて捕捉した非精製のＦＭＤＶ株Ｃ−Ｓ８ｃｌウイルスに対する、捕捉ＥＬＩＳＡ（ｔｒａｐｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ）によって検出された。
【０１３４】
簡単に説明すると、９６穴プレートが炭酸塩緩衝液における抗Ｃ１ノビル血清を用いて覆われ、室温において１昼夜に渡って乾燥させた。プレートは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．００５％）（洗浄緩衝液）を用いて３回洗浄され、ＦＭＤＶ株Ｃ−Ｓ８ｃｌに感染させた胎児のハムスターの腎（ＢＨＫ）細胞からの上清と一致する抗原がウェルに加えられた。インキュベーション（３７℃において１時間）の後に、ウェルは、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄され、５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液（ブロッキング緩衝液）を用いて１時間ブロッキングされた。
【０１３５】
ブロッキングの後に、プレートは、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を加えたブロッキング緩衝液を用いた、上述したマウス（例えば、偽薬マウスおよびＣＶＬＰｓ免疫化マウス）の４つの群に由来する血清の希釈物に用いて２時間インキュベートされた。洗浄（洗浄緩衝液を用いて２回）の後に、ウェルは、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を加えたブロッキング緩衝液に懸濁させたホースラディッシュ ペルオキシダーゼと結合されたヤギ抗マウス血清を用いて１時間インキュベートされた。多数回の洗浄の後に、基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）がウェルに加えられ、反応は、１０分間現像され、２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて停止された。抗原抗体反応は、２９２ｎｍにおける分光光度計において決定された。
【０１３６】
図１２に示されているように、群３および４に由来する動物のいくらかが、ＦＭＤＶに対する特異的な抗体を主張する資格を示した。これらの結果は、ＣＶＬＰｓ（ＣＶＬＰｓ−ｐＶＰ２＊（ｐＶＰ２＊−ＢＴ）（実施例３））を用いた免疫化がＦＭＤＶに対する免疫反応を誘導し、かつこの免疫反応が補助剤の付加によって増加されたことを明瞭に指し示している。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、Ｎ末端にＨｉｓタグを有している、および有していないｐＶＰ２のＣ末端欠損変異体の発現を示しており、Ｈｉｓタグを有している（図１Ａ）および有していない（図１Ｂおよび図９Ｃ）ｐＶＰ２／ＶＰ２発現変異体の回収は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＶＰ２ポリクロナル抗体（図１Ａおよび１Ｂ）および抗Ｈｉｓポリクロナル抗体（図１Ｃ）を用いたウエスタンブロッティングによって解析された。
【図２】図２は、ｐＶＰ２のＣ末端におけるαらせんの解析を示しており、図２Ａは、３０％のトリフルオロエタノール（ＴＥＥ）の存在下（破線）または非存在下（実線）のＰＥＳ緩衝液における、１文字表記においてＦＧＦＫＤＩＩＲＡＩＲＲＩ（配列番号１）と表される、ポリペプチドの円偏光２色性（ＣＤ）スペクトルを示し、図２Ｂにおいて、ＬｍＴＩＭの２４１〜２５０残基の２次構造が示されている。
【図３】図３は、クーマシーブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるｐＶＰ２タンパク質およびＨＴ−ｐＶＰ２変異体の解析を示している。図３Ａは、ｐＶＰ２のＣ末端領域の図を示しており、変異体において欠損として選択された位置および配列が表されている。タグ付きの変異体（図３Ｃ）およびタグなしの変異体（図３Ｂ）の両方が高い水準において発現され、以下の２段階：１２の画分が取られて２０倍に濃縮され、それから画分のそれぞれ１〜１０μｌ（ＨＴ−ｐＶＰ２変異体ごとに０．１μｌ）が載せられたことにおいて遠心分離された。それらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、かつクーマシーブルー染色によって現像された。星印は、ゲルが抗ＶＰ２抗体（ＶＰ２−５１２）を用いてウエスタンブロッティングによって分析されたことを示している。図３Ｄには、ＩＢＤＶに感染した細胞におけるＩＢＤＶタンパク質の通常の性質が示されている。
【図４】図４は、Ｃ末端領域欠損変異体であるｐＶＰ２の集合の電子顕微鏡写真を示している。図４Ａおよび図４Ｂは、いくつかの残基が１２面体の粒子１２個によって形成されたより大きな不安定な構造（図４Ａにおける矢印）に関与しているという事実にもかかわらず、ＶＰ２−４４１およびＶＰ２−４５６変異体が対称性Ｔ＝１のカプシドを有する粒子を形成することを示している。図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、異なるＶＰ２−４６６集合体の写真を示している。図４Ｃには、下部の画分におけるフーリエ変換（挿入）から推論される六角形の配列を有する管状の構造が示されている。図４Ｄは、主な構造として、Ｔ＝１のカプシドを有する粒子、断続的な細い管および解離した物質を示しており、かつ培養液画分におけるＴ＝１３のカプシドを有する粒子がまた得られる。図４Ｅは、上部の画分においてＴ＝１を有する粒子を示している。
【図５】図５は、電子顕微鏡によって得られた、Ｃ末端領域に欠損を有する変異タンパク質Ｈｉｓ−ｐＶＰ２に対応する集合体の写真から構成されている。図５Ａは、ＨＴ−ＶＰ２−４４１の集合体（Ｔ＝１のカプシド構造およびより大きな１２面体の集合体（矢印を用いて示されている））を示している。図５Ｂは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６の集合体（中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有する粒子）を示している。図５Ｃは、中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有するＨＴ−ＶＰ２−４６６粒子の集合体を示している。図５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、ＨＴ−ＶＰ２−４７６の集合体を示している。図５Ｄは、下部の画分におけるタイプＩの管状構造を示している。図５Ｅは、中間の画分におけるＴ＝１３およびＴ＝７のカプシドを有する粒子ならびに管状の集合体を有する断片を示している。図５Ｆは、上部の画分における異常な集合体を示している。
【図６】図６は、ＩＢＤＶカプシドの３次元構造を示している。図６Ａは、ＩＢＤＶカプシド極低温電子顕微鏡写真を示している。図６Ｂは、正２０面体の２次元軸に沿って見た、ＩＢＤＶカプシドの外表面（左）および内表面（右）の配置像（ｍａｐ）を示している。
【図７】図７は、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの３次元的な構造を示している。図７Ａは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６集合体の電子顕微鏡写真（画分７）を示している。図７Ｂは、これらの密度配置像は、７８０（Ｔ＝１３）および４２０（Ｔ＝７）分子のＨＴ−ＶＰ２−４６６の容積を含むために断面図が描かれた。
【図８】図８は、ＩＢＤＶカプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドとの構造の比較を示している。図８Ａは、３次元再構成したＩＢＤＶカプシド（実線）およびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシド（破線）の密度の特徴を示しており、どちらも１５オングストロームの解像度において分析されている。図８Ｂは、極低温電子顕微鏡法に使用されるＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドのタンパク質を、クーマシーブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示している。図８Ｃおよび８Ｄは、ＩＢＤＶおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６のそれぞれを３次元再構成して得られたカプシドの断面図を示している。図８Ｅは、ＩＢＤＶカプシドとＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドとの違いを演算することによる配置像を表している。図８Ｆは、ＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドに対するＩＢＤＶカプシドの差異から算出された、異なる配置像を表している。
【図９】図９は、ＩＢＤＶカプシドおよびＨＴ−ＶＰ２−４６６カプシドの構造的な構成を示している。Ｔ＝１３を有するカプシドの中心から示されている正２０面体断面の垂直方向における距離は、３２８オングストローム（Ａ）、３１９オングストローム（Ｂ）、３１１オングストローム（Ｃ）、３０２オングストローム（Ｄ）、２９４オングストローム（Ｅ）、２８６オングストローム（Ｆ）、２７７オングストローム（Ｇ）、および２６９オングストローム（Ｈ）である。
【図１０】図１０は、ｐＶＰ２およびＨＴ−ｐＶＰ２変異タンパク質の集合体を示している。図１０Ａは、Ｃ末端配列の伸張によって決まっている、単独の（ＶＰ２）またはＨｉｓタグを有する（ＨＴ−ＶＰ２）異なるＣ末端の伸張を有するＶＰ２によって導入される集合体を示す図を示している。ｐＶＰ２のＣ末端領域および本発明に使用されている部位の完全な配列がまた、示されている。図１０Ｂは、左に配列番号２のポリペプチドのここまでに説明したαらせんの説明を示している。
【図１１】図１１は、ＩＢＤＶｐＶＰ２−４５６タンパク質の集合体によって形成されるＩＢＤＶのキメラカプシド、ならびに酵母において発現させた口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＢおよびＴエピトープキメラＢＴペプチドを含む、異なる分画（Ｆ６〜Ｆ１１）ウエスタンブロッティング分析の結果を示している。上段のブロットは、特異的なＩＢＤＶ抗ＶＰ２抗体を用いた結果を示しており、下段のブロットは、特異的な抗ＦＭＤＶ抗体を用いて得られた結果を示している。
【図１２】図１２は、ＣＶＬＰｓを用いてマウスにワクチン接種した３週間後に、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定から得られた結果を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）を含む領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む領域Ｂを包含する融合タンパク質。
【請求項２】
上記領域Ａが、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質からなる請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
上記領域Ａが、以下の群：
（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４４１残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４４１；
（ｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４５２残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４５２；
（ｉｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４５６残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４５６；
（ｉｖ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４６６残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４６６；
（ｖ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４７６残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４７６；
（ｖｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４８７残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４８７；
（ｖｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４９４残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４９４；ならびに
（ｖｉｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から５０１残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−５０１
から選択された上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片からなる請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
上記領域Ｂが、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の上記１〜ｎ断片のアミノ末端領域に結合されている請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
上記領域Ｂが、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の上記１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域に結合されている請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
上記異種ポリペプチドが所望のポリペプチドを含み、当該所望のポリペプチドがワクチン接種、治療または診断に使用するポリペプチドである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
上記領域Ｂが上記異種ポリペプチドを含み、当該異種ポリペプチドが単一の所望のポリペプチドを含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
上記領域Ｂが上記異種ポリペプチドを含み、当該異種ポリペプチドが２つ以上の所望のポリペプチドを含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
領域Ａおよび１つの領域Ｂを包含する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
領域Ａならびに２つの同一なまたは異なる領域Ｂを包含し、
上記領域Ｂの一方が、上記領域Ａに存在する、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の上記１〜ｎ断片のアミノ末端領域に結合されており、
上記領域Ｂの他方が、上位領域Ａに存在する、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の上記１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域に結合されている
請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
領域Ｂのそれぞれが異種ポリペプチドを含み、当該異種ポリペプチドが同一のまたは異なる１つ以上の所望のポリペプチドを含む請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
上記領域Ａと上記領域Ｂとの間に置かれたリンカーポリペプチドをさらに包含する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質を少なくとも１つ包含する中空キメラ性ウイルス様粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する核酸。
【請求項１５】
転写因子と、付加的に翻訳因子および制御因子と、作動可能に結合された請求項１４に記載の核酸を包含する発現カセット。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸を包含する組み換えベクター。
【請求項１７】
付加的に異種複製開始点を有している、プラスミド、バックミド、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージＰ１に基づく人工染色体（ＰＡＣｓ）、コスミドまたはウイルスから選択される請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１４に記載の核酸、または請求項１５に記載の発現カセット、または請求項１６もしくは１７に記載の組み換えベクターを包含する宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１４に記載の核酸配列によって形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１６または１７に記載の組み換えベクターを用いて形質転換された、トランスフェクションされた、または感染された宿主細胞。
【請求項２１】
上記細胞が、哺乳類細胞、トリ細胞、昆虫細胞または酵母細胞である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含み、さらに必要に応じて上記中空キメラ性ウイルス様粒子を回収することを包含する請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子の製造方法。
【請求項２３】
上記宿主細胞が昆虫細胞であり、（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組み換えバキュロウイルスを用いて感染させた昆虫細胞を、上記融合タンパク質を発現することおよびその集合体が請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子であるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を形成することを可能にする条件において、培養すること、ならびに必要に応じて、（ｉｉ）上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を単離および付加的に精製することを包含する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記宿主細胞が酵母細胞であり、（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターを用いて形質転換された酵母細胞を、上記融合タンパク質を発現することおよびその集合体が請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子であるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を形成することを可能にする条件において、培養すること、ならびに必要に応じて、（ｉｉ）上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を単離および付加的に精製することを包含する請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子を産生かつ取得するための請求項１６または１７に記載の組み換えベクターの使用。
【請求項２６】
薬学的組成物の調製における請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子の使用。
【請求項２７】
上記薬学的組成物がワクチン、遺伝子治療ベクターまたは活性物質の輸送系である請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
付加的な薬学的に受容可能な補助剤および／または賦形剤とともに、治療に有効な量の請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子を包含する薬学的組成物。
【請求項２９】
ワクチン、遺伝子治療ベクターまたは活性物質の輸送系である請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
付加的な薬学的に受容可能な補助剤および／または賦形剤とともに、治療に有効な量の請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子を包含するワクチン。
【請求項３１】
２つ以上の疾患を誘導する感染性因子によって引き起こされるウイルス感染から動物およびヒトを保護する請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子を包含する遺伝子治療ベクター。
【請求項３３】
請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子および活性物質を包含する活性物質の輸送系。
【請求項１】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片（ここで、“ｎ”は、４４１から５０１までの整数である）を含む領域Ａ、ならびに異種ポリペプチドを含む領域Ｂを包含する融合タンパク質。
【請求項２】
上記領域Ａが、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質からなる請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
上記領域Ａが、以下の群：
（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４４１残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４４１；
（ｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４５２残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４５２；
（ｉｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４５６残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４５６；
（ｉｖ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４６６残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４６６；
（ｖ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４７６残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４７６；
（ｖｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４８７残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４８７；
（ｖｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から４９４残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−４９４；ならびに
（ｖｉｉｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１残基目から５０１残基目までを含むアミノ酸配列から構成されるアミノ酸配列であるｐＶＰ２−５０１
から選択された上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の１〜ｎ断片からなる請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
上記領域Ｂが、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の上記１〜ｎ断片のアミノ末端領域に結合されている請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
上記領域Ｂが、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の上記１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域に結合されている請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
上記異種ポリペプチドが所望のポリペプチドを含み、当該所望のポリペプチドがワクチン接種、治療または診断に使用するポリペプチドである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
上記領域Ｂが上記異種ポリペプチドを含み、当該異種ポリペプチドが単一の所望のポリペプチドを含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
上記領域Ｂが上記異種ポリペプチドを含み、当該異種ポリペプチドが２つ以上の所望のポリペプチドを含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
領域Ａおよび１つの領域Ｂを包含する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
領域Ａならびに２つの同一なまたは異なる領域Ｂを包含し、
上記領域Ｂの一方が、上記領域Ａに存在する、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の上記１〜ｎ断片のアミノ末端領域に結合されており、
上記領域Ｂの他方が、上位領域Ａに存在する、上記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質または当該ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質の上記１〜ｎ断片のカルボキシル末端領域に結合されている
請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
領域Ｂのそれぞれが異種ポリペプチドを含み、当該異種ポリペプチドが同一のまたは異なる１つ以上の所望のポリペプチドを含む請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
上記領域Ａと上記領域Ｂとの間に置かれたリンカーポリペプチドをさらに包含する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質を少なくとも１つ包含する中空キメラ性ウイルス様粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する核酸。
【請求項１５】
転写因子と、付加的に翻訳因子および制御因子と、作動可能に結合された請求項１４に記載の核酸を包含する発現カセット。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸を包含する組み換えベクター。
【請求項１７】
付加的に異種複製開始点を有している、プラスミド、バックミド、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージＰ１に基づく人工染色体（ＰＡＣｓ）、コスミドまたはウイルスから選択される請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１４に記載の核酸、または請求項１５に記載の発現カセット、または請求項１６もしくは１７に記載の組み換えベクターを包含する宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１４に記載の核酸配列によって形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１６または１７に記載の組み換えベクターを用いて形質転換された、トランスフェクションされた、または感染された宿主細胞。
【請求項２１】
上記細胞が、哺乳類細胞、トリ細胞、昆虫細胞または酵母細胞である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含み、さらに必要に応じて上記中空キメラ性ウイルス様粒子を回収することを包含する請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子の製造方法。
【請求項２３】
上記宿主細胞が昆虫細胞であり、（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組み換えバキュロウイルスを用いて感染させた昆虫細胞を、上記融合タンパク質を発現することおよびその集合体が請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子であるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を形成することを可能にする条件において、培養すること、ならびに必要に応じて、（ｉｉ）上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を単離および付加的に精製することを包含する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記宿主細胞が酵母細胞であり、（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターを用いて形質転換された酵母細胞を、上記融合タンパク質を発現することおよびその集合体が請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子であるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を形成することを可能にする条件において、培養すること、ならびに必要に応じて、（ｉｉ）上記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰ−ｐＶＰ２ｓ＊を単離および付加的に精製することを包含する請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子を産生かつ取得するための請求項１６または１７に記載の組み換えベクターの使用。
【請求項２６】
薬学的組成物の調製における請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子の使用。
【請求項２７】
上記薬学的組成物がワクチン、遺伝子治療ベクターまたは活性物質の輸送系である請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
付加的な薬学的に受容可能な補助剤および／または賦形剤とともに、治療に有効な量の請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子を包含する薬学的組成物。
【請求項２９】
ワクチン、遺伝子治療ベクターまたは活性物質の輸送系である請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
付加的な薬学的に受容可能な補助剤および／または賦形剤とともに、治療に有効な量の請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子を包含するワクチン。
【請求項３１】
２つ以上の疾患を誘導する感染性因子によって引き起こされるウイルス感染から動物およびヒトを保護する請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子を包含する遺伝子治療ベクター。
【請求項３３】
請求項１３に記載の中空キメラ性ウイルス様粒子および活性物質を包含する活性物質の輸送系。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５０１０１２（Ｐ２００９−５０１０１２Ａ）
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２０８０８（Ｐ２００８−５２０８０８）
【出願日】平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６９１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００９６７３
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０８０１４３２７）
【出願人】（５０８０１４３５０）ビオノストラ，ソシエダッド リミターダ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６９１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００９６７３
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０８０１４３２７）
【出願人】（５０８０１４３５０）ビオノストラ，ソシエダッド リミターダ (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]