光力学治療用の非極性光増感剤
【課題】光力学治療（ＰＤＴ）に使用される改善された光増感剤処方物の提供。
【解決手段】燐脂質から実質的になるリポソーム二重層、並びに治療上有効な量の非極性光増感剤を含む光力学治療用の製薬リポソーム処方物。リポソーム膜中に非極性光増感剤を配合し、それにより非極性および極性の物質を同じベシクルを使用して輸送させる。凍結防止剤として単糖またはポリアルコールを添加することにより凍結乾燥中配合された非極性光増感剤を有するリポソーム構成物の構造およびサイズを保存する。
【解決手段】燐脂質から実質的になるリポソーム二重層、並びに治療上有効な量の非極性光増感剤を含む光力学治療用の製薬リポソーム処方物。リポソーム膜中に非極性光増感剤を配合し、それにより非極性および極性の物質を同じベシクルを使用して輸送させる。凍結防止剤として単糖またはポリアルコールを添加することにより凍結乾燥中配合された非極性光増感剤を有するリポソーム構成物の構造およびサイズを保存する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テモポルフィン（Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）または他の非極性光増感剤を含むリポソーム処方物の製造、および特に静脈内注入を使用する治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、水コンパートメントにより分離されている同心状の脂質二重層からなる人工のベシクルであり、そして医薬伝達ベシクルとして広く検討されてきている。それらのすべては製造方法によりうまくコントロールできる構造、化学的組成およびコロイドのサイズにより、リポソームは、種々の応用に有用であるいくつかの性質を示す。最も重要な性質は、コロイドのサイズ（すなわち、２０ｎｍ−１０μｍの範囲のやや均一な粒子のサイズ）、特殊な膜および表面の特徴である。
【０００３】
リポソームは、それらがいくつかの異なる目的を果たすことができるために、医薬および抗原用の担体として使用される（非特許文献１）。リポソームに囲まれた医薬は、代謝酵素と接触することがない。逆に、身体の構成成分（例えば赤血球または注入部位の組織）は、医薬の投与物全体に直接曝されない。医薬が作用する持続時間は、身体内の医薬の放出が遅いために、リポソームにより延長できる。ターゲティングの選択を意味する方向付けの可能性を有するリポソームは、身体全体で医薬の分布を変化させる。細胞は、エンドサイトーシスまたは食作用のメカニズムを使用してリポソームをサイトゾル中に取り入れる。その上、リポソームは、分解（例えば、代謝分解）に対して医薬を保護できる。ときには成功することがあるが、リポソームには限界がある。リポソームは、医薬を疾患のある組織に伝達するばかりか、肝臓、脾臓、腎臓および細網内皮系にも急速に入り、そして循環している間に医薬を放す（非特許文献２）。
【０００４】
ペギレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、これらの欠陥を克服する別の方法である。まず、ペギレーションは、長期間治療領域内に医薬のレベルを維持し、そして医薬は、より小さい、さらに活性なおよび／または容易に純粋になるフラグメントに次第に分解する長期にわたって循環する部分になる。第二に、それは、長期にわたって循環する医薬を含む微粒子または大きな分子が、病気に冒された脈管構造または受容体が発現する病理学的部位に徐々に蓄積するのを可能にし、そしてこれらの領域における医薬の伝達を改善または増大させる。第三に、それは、減少した血流または低濃度のターゲット抗原で病理学的領域の到達するものと思われるこれらのターゲットされた医薬および医薬担体にさらによいターゲッティング効果を達成するのを助けることができる。ペギレーションの利益は、代表的に特に、増加した安定性（温度、ｐＨ、溶媒など）、顕著に低下した免疫原性および抗原性、プロテアーゼに対する抵抗性、触媒的活性の維持、並びに溶解性における改善、そして生成物の液体安定性の増大および攪拌により誘発される凝集の減少をもたらすことである。
【０００５】
二重層と融和できる種を含むリポソーム膜例えばポリ（エチレングリコール）結合脂質（ＰＥＧ−脂質）またはガングリオシドは、ステルスリポソームを製造するのに使用されている（非特許文献３）。ステルスリポソームは、血液循環において比較的長い半減期を有し、そして生体内で別の生体内分布を示す。Ｖａａｇｅら（非特許文献４）は、ドキソルビシンのステルスリポソームを製造し、そしてそれらを使用して新しく移植されかつ十分に定着した成長する一次マウスがん腫を治療しそして乳房内腫瘍移植物からの自発性転移の発生を阻害した。かれらは、ドキソルビシン処方物のステルスリポソームの長い循環時間がその優れた治療の有効性に関係があると結論した。立体配位的に安定化したリポソームの二重層中のＭＰＥＧ誘導体化（ペギレート化）脂質の存在は、血漿蛋白および細胞表面受容体との相互反応（従来のリポソームの静脈内投与後に見られるＲＥＳクリアランスおよび急速な血管内の不安定化／破壊に関係する）に対する立体配位バリヤをもたらす。その結果、ペギレート化リポソームは、長期の循環半減期を有し、そして任意の封入剤の薬剤動力学は、捕捉された薬剤のそれらよりむしろリポソーム担体のそれらに従うように変えられる（非特許文献５）。ペギレート化リポソームの腫瘍の局在性のメカニズムは、腫瘍における漏れやすい血管を通る管外遊出によるため（非特許文献６および７）、長期に及ぶ循環は、腫瘍の脈管構造を通るペギレート化リポソームによりなされる通過の合計数を増やすことにより、腫瘍中の蓄積に有利であると思われる。
【０００６】
光力学治療（ＰＤＴ）は、種々の医学上の応用に使用するために開発された最も将来性のある技術の１つであり、そして腫瘍をなくすための十分に認められた治療として周知である（非特許文献８）。ＰＤＴの他の重要な応用は、皮膚、歯科、化膿、呼吸器、胃腸、性器および他の感染症を含む病原性微生物による感染症の治療である。
【０００７】
感染症の治療において常に生ずる問題は、疾患の治療に使用される剤が特異性を失うことであり、それによりその治療から患者は新しい群の疾病にかかることになる場合がある。
【０００８】
種々のタイプの疾患の治療に関するＰＤＴの使用は、光増感剤の固有の特徴により制限される。これらは、それらの高いコスト、宿主生物における延長された保持、皮膚のかなりの光毒性、バックグラウンド毒性、生理学的溶液における低い溶解度（それが血栓塞栓の事故を生ずるため、血管内投与へのその有用性を低下する）、そして低いターゲティング有効性を含む。これらの不利益さは、光増感剤の非常に高い投与量の投与を導き、それは損傷をうけていない組織における光増感剤の蓄積および損傷していない部位を冒す付随して生ずるリスクの可能性を劇的に増大させる。
【０００９】
光増感剤の特異性およびＰＤＴの有効性を増大させる有望なアプローチの１つは、光増感剤とリガンド−ベクターとの融合であり、それは、目標細胞の表面上の受容体に特異的に結合する。目標細胞により認識される多数の天然および合成の分子は、これらのベクターとして使用できる。このアプローチは、腫瘍の治療用の光増感剤の新しい世代のデザインに現在使用されている（非特許文献９）。
【００１０】
光増感剤を腫瘍細胞に向けることにより腫瘍の選択性を増加させる他のアプローチは、リポソーム例えばトラスフェリン共役リポソームを使用することである（非特許文献１０）。非共役リポソームが、しばしば、細網内皮系により容易に認識され排除されるため、ＰＥＧ化リポソームが使用された（非特許文献１１および１２）。
【００１１】
ガンおよび他の疾患の疾患における光力学治療の適用が急速に増大しているため、新しい光増感剤処方物への要求が増加している。これらの新しい光増感剤処方物には、さらに安定であり、製造が容易でありさらに取り扱いが容易であることが求められる。その上、特に疎水性かつ非極性の光増感剤は、能率的かつ選択的な方法で組織に向かうことができなくてはならない。
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｔｏｒｍ ａｎｄ Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１，１９−３１，１９９８
【非特許文献２】Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｍａｒｃｈ ２００３，２，２１４−２２１
【非特許文献３】Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，８８，１１４６０−４，１９９１
【非特許文献４】Ｖａａｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，５１，９４２−８，１９９２
【非特許文献５】Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６，６８３−６９１，１９９８
【非特許文献６】Ｎｏｒｔｈｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６，２４４５−２４５１，１９９８
【非特許文献７】Ｍｕｇｇｉａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５，９８７−９９３，１９９７
【非特許文献８】「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ｔｙｐｅ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ」Ｔ．Ｄ．Ｍｏｄｙ，Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ，４，３６２−３６７，２０００
【非特許文献９】「Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ｂａｓｅｄ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ」Ｅ．Ｄ．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｄ．Ｄｏｌｐｈｉｎ，Ｃ．Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，４１５１−４２０２，１９９８
【非特許文献１０】Ｄｅｒｙｃｋｅ ａｎｄ ＤｅＷｉｔｔｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０，１８１−１８７，２００２
【非特許文献１１】Ｗｏｏｄｌｅ ａｎｄ Ｌａｓｉｅ、Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１１１３，１７１−１９９，１９９２
【非特許文献１２】Ｄａｓｓ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９，９７２−９７５，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
光力学治療（ＰＤＴ）に使用される改善された光増感剤処方物を提供するのが本発明の目的である。
リポソーム膜中に非極性光増感剤を配合し、それにより非極性および極性の物質を同じベシクルを使用して輸送するのが本発明の他の目的である。
【００１４】
凍結防止剤として単糖またはポリアルコールを添加することにより凍結乾燥中配合された非極性光増感剤を有するリポソーム構成物の構造およびサイズを保存するのが本発明の他の目的である。
【００１５】
改善された薬剤動力学の性質を有する光増感剤処方物を提供するのが本発明の他の目的である。
細胞膜を通る非極性光増感剤の輸送を改善しそのためＰＤＴの能率を増大させるのが本発明の他の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、非極性ポルフィリン光増感剤および１つ以上の燐脂質を含む光力学治療用の製薬リポソーム処方物に関し、それらは凍結乾燥を要することなく安定に貯蔵できる。リポソーム処方物は、静脈内投与のための治療上有効な量の光増感剤を提供する。燐脂質は、ペギレーションにより改変でき、すなわちそれらは燐脂質の統合された部分としてポリエチレングリコールを含む。形成されたリポソームは、膜内に非極性光増感剤を含み、そして非極性光増感剤および第二の極性の物質の組み合わされたターゲティングに有用である。処方物が単糖またはポリアルコールの存在を含むとき、それは、リポソームベシクルのサイズおよび治療上有効な量の光増感剤の含量を保存しつつ、有効に凍結乾燥できる。本発明は、また水性ベシクルによる再構成で形成されるリポソーム組成物に関する。好適な水性ベシクルによる再構成での凍結乾燥された処方物は、また静脈内投与に有用なリポソームを形成する。
本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、図とともに読まれる以下の記述から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】リポソーム処方されたｍＴＨＰＣのゲル濾過曲線である。脂質成分およびｍＴＨＰＣの両者は、集めたすべてのフラクションにわたって同じ分布を示す。
【図２】注入後の時間の関数として腫瘍中の蓄積を与える、ｍＴＨＰＣ、生成物ＡおよびＢの静脈内注入（０．５ｍｇ／ｋｇ）でのＳｗｉｓｓ ｎｕ／ｎｕマウスの無処理皮膚のＣｏｌｏ２６腫瘍の光誘発蛍光（ＬＩＦ）の測定を示す。
【図３】生成物Ａ、ＢおよびｍＴＨＰＣの静脈内注入６時間後のＰＤＴ効果を示す。マウスは、ＰＤＴ処理直後Ｅｖａｎｓブルー（１％）を腹腔内に注入され（０．２５ｍＬ）、そして２４時間後殺された。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
凍結乾燥を要することなく貯蔵して安定な、非極性ポルフィリン光増感剤および１つ以上の燐脂質を含む光力学治療用の製薬リポソーム処方物は、以下に記述される。リポソーム処方物は、静脈内投与のための治療上有効な量の光増感剤を提供する。燐脂質は、ペギレーションにより改変でき、すなわちそれらは燐脂質の統合した部分としてポリエチレングリコールを含む。形成されたリポソームは、膜内に非極性光増感剤を含みそして非極性光増感剤および第二の極性物質の組み合わさったターゲティングに有用である。
【００１９】
処方物は、単糖またはポリアルコールを使用する凍結乾燥工程により保存でき、かなり安定な貯蔵期間を有する必要がない。工程のサイクルは、リポソームベシクルのサイズ並びに光増感化合物の膜含量を保存する。
【００２０】
本発明の非極性光増感剤は、周知のポルフィリンに基づく化合物を含む。本発明の実施に有利に使用される特定の光増感剤は、ポルフィリン単環光増感剤に基づくものであり、ジュウテリオポルフィリン、エチオポルフィリン、プロトポルフィン、ヘマトポルフィリン、フェオホルバイド並びにそれらの誘導体、特にジ−およびテトラ−ヒドロポルフィリン誘導体（６４０−７８０ナノメートルの範囲で最大の光吸収を有する）を含む。
【００２１】
燐脂質は、ペギレーションにより改変されても（統合する部分としてポリエチレングリコールを含む）、またはされなくてもよい。形成されたリポソームは、膜内に非極性光増感剤を含み、そして非極性光増感剤および第二の極性物質の組み合わさったターゲティングに有用である。
【００２２】
光増感剤処方物は、望ましくない細胞または組織または他の望まない材料へ非極性光増感剤分子を向かわせるのに有用であり、そして適切な光源による照射後ターゲットを損傷するのに有用である。光増感剤処方物は、また、光増感剤の制限された光化学活性化によりまたはそれなしで蛍光イメージング法を使用することによって望ましくない細胞または組織または他の望まない材料をモニターするのに有用である。
【００２３】
特に、本発明のリポソーム処方物は、非極性光増感剤を輸送するのに有用である。非極性物質は、ベシクルの膜内に一体化され、それによってより容易に開放する構造を生成して、細胞膜への直接の作用のために光増感剤を放す。このメカニズムは、作用の１つの好ましい場所である細胞膜系に直接光増感剤を伝達する。そのため、適切な外部の光源による照明により有効に活性化される光増感剤は、望ましくない細胞、組織または他の構造を不可逆的に損傷できる。
【００２４】
従来構築されたリポソーム処方物は、ベシクルのルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）部分中に捕捉されるいくつかの化合物を輸送するのに使用されている。本発明は、１つのリポソーム内の２つの異なる輸送コンパートメントの組み合わせに焦点をあてており、非極性および極性の物質の組み合わさった輸送を可能にする。この方法で、膜内に光増感剤を存在させることによって、光増感剤は、それらの作用点に有効に向けられるが、リポソーム粒子内のルミナール部分は、他の物質（治療に有益な効果を有する医薬を含む）を包含するために、自由のままである。
【００２５】
さらに、グルコースのような単糖および燐脂質へ付着した光増感剤の組み合わせは、二糖の代わりに生理学的に普通の炭水化物を使用して凍結乾燥および再水和中、リポソームのサイズを保存するのに優れた手段である。
【００２６】
この多面的な概念は、治療に有益な効果を有すると思われる物質の添加を可能にする。１つのベシクル内の膜に結合した光増感剤とともに２つ以上の物質を組み合わせることは、ターゲティング細胞治療の酸素含量に直接または間接に影響し、光力学治療の有効性に影響する。例えば、これらの効果は、哺乳動物のチオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の阻害剤のような酵素の活性の阻害剤を添加することにより達成できる。そのため、目標とした細胞の細胞質に到達した後にのみ有効なため、阻害剤は、抗酸化剤として通常作用するＴｒｘ／ＴｒｘＲ経路をブロックするだろう。
〔実施例〕
【実施例１】
【００２７】
ｍ−ＴＨＰＣを含むリポソームの製造
ｍＴＨＰＣ（Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）は、参考として本明細書に引用される米国特許４９９２２５７および５１６２５１９に記述されている通りに合成された。
リポソームは、以下の一般的な方法で製造された。
【００２８】
非極性光増感剤、アスコルビン酸パルミテートおよび燐脂質をクロロホルム／メタノールに溶解する。溶液を、次にクロロホルム／メタノール混合物がガスクロマトグラフィーにより検出できなくなるまで、回転蒸発器を使用して真空下乾燥する。注入用の水を添加して少なくとも２時間５０℃の温度で脂質フィルムを再水和する。混合物を次に最後に１００ナノメートルの穴のサイズを使用する
【００２９】
ホモゲナイザーフィルター系を通す。好ましくは、再水和の水に単糖またはポリアルコールを補給する。濾液を集め、バイアルに入れ、好ましくは凍結乾燥する。凍結乾燥した組成物を、投与前に注入用の水により再構成する。
前記の方法を使用して、リポソーム処方物のいくつかの異なる調製物を以下のように製造した。
【００３０】
実施例 １ａ
成分 量（％ｗ／ｖ）
ｍＴＨＰＣ ０．０５−０．１５
ジパルミトイルホスファチジルコリン ０．５−２．０
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール ０．０５−０．２
ペギレート化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン ０．０５−０．２
アスコルビン酸パルミテート ０．００２−０００４
注入用の水 加えて上記濃度にする
【００３１】
実施例 １ｂ
成分 量（％ｗ／ｖ）
ｍＴＨＰＣ ０．０５−０．１５
ジパルミトイルホスファチジルコリン ０．５−２．０
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール ０．０５−０．２
アスコルビン酸パルミテート ０．００２−０００４
注入用の水 加えて上記濃度にする
【００３２】
実施例 １ｃ
成分 量（％ｗ／ｖ）
ｍＴＨＰＣ ０．０５−０．１５
ジパルミトイルホスファチジルコリン ０．５−２．０
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール ０．０５−０．２
グリコース ２．０−１２．０
アスコルビン酸パルミテート ０．００２−０００４
注入用の水 加えて上記濃度にする
すべては、本発明によるそれらの使用で十分に機能することが分かった。
【実施例２】
【００３３】
リポソームｍ−ＴＨＰＣの物理的および化学的安定性
リポソーム処方物の物理的安定性は、光子相関スペクトル分析により粒子サイズの分布をモニターすることにより測定された。
【００３４】
リポソームｍＴＨＰＣの安定性
貯蔵条件 平均粒子サイズ分布（ｎｍ）
最初 １６６
２３℃−１ヶ月 １７７
２３℃−４ヶ月 １６７
【実施例３】
【００３５】
処方物のリポソーム二重層内のｍＴＨＰＣの局在化
リポソーム処方物のゲル濾過は、セファデックスＧ５０カラムで行われた。図１に示されるように、脂質およびｍＴＨＰＣは、すべてのフラクションにわたって同じ分布を示し、両者の成分の物理的な相互作用すなわち膜二重層中へのｍＴＨＰＣの一体化を示す。分布は、表１および２に示されるように、超音波処理によりリポソーム構造を破壊した後でも著しく変化しない。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【表２】
【実施例４】
【００３８】
マウスにおける製剤動力学
Ｂａｌｂ／ｃマウスに同系間の非転移マウス結腸直腸腫瘍細胞系であるＣｏｌｏ２６を使用した。
細胞を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清、１％ストレプトマイシン−ペニシリンおよび２００ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地で、９５％空気および５％ＣＯ２中で３７℃で単層培養として維持した。６週令の無胸腺雌マウス（Ｓｗｉｓｓ，ｎｕ／ｎｕ）に、２×１０６Ｃｏｌｏ２６細胞を右後ろ足の皮下に接種した。２週後、腫瘍が５−７ｍｍの直径に達したとき、ｍ−ＴＨＰＣの処方物（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に注入した。
【００３９】
非侵襲性ＬＩＦ測定を、医薬投与後異なる時間で３つの異なる部位、すなわち皮膚が重なった腫瘍、左後ろ足上の皮膚が重なった対称的な正常の組織および隆起した皮膚で行った。選択された時点で、マウスを殺し、そして腫瘍および正常の組織からの蛍光信号を直接接触して測定した。
【００４０】
図２は、４匹のマウスで測定された注入後の時間の関数として、ｍＴＨＰＣ、生成物ＡおよびＢの蓄積を示す。非侵襲性測定は、２４時間で最適な比（１．３）で正常な組織に比べて腫瘍中のｍＴＨＰＣのよりよい蓄積の傾向を立証した。注入２４時間および４８時間後の腫瘍および筋肉との直接接触で行われた侵襲性測定は、それぞれ２．７および３．０の比を示した。
【００４１】
生成物Ａに関する測定は、投与後０．５時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間および７２時間で１匹のマウスでなされた。生成物Ａは、ｍＴＨＰＣと同様な薬剤動力学の傾向を示した。ｍＴＨＰＣに比べて、腫瘍組織の最高の蛍光強度は、注入４時間後既に達した。
【００４２】
生成物Ｂに関する測定は、投与後０．５時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間および７２時間で１匹のマウスでなされた。腫瘍の最高の蛍光強度は、静脈内注入８時間後に測定された。ｍＴＨＰＣに比べて、生成物Ｂは、完全に異なる製剤動力学の性質を示している。生成物Ｂの濃度は、ｍＴＨＰＣより遙かに早く（１６時間）腫瘍中で増加した。
【実施例５】
【００４３】
リポソームｍ−ＴＨＰＣの抗腫瘍活性
Ｂａｌｂ／ｃマウスに同系間の非転移マウス結腸直腸腫瘍細胞系であるＣｏｌｏ２６を使用した。
細胞を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清、１％ストレプトマイシン−ペニシリンおよび２００ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地で、９５％空気および５％ＣＯ２中で３７℃で単層培養の無胸腺雌マウス（Ｓｗｉｓｓ，ｎｕ／ｎｕ）に、２×１０６Ｃｏｌｏ２６細胞を右後ろ足の皮下に接種した。２−３週後、腫瘍が１０−１３ｍｍの直径に達したとき、ｍ−ＴＨＰＣの処方物（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に注入した。他に示されない限り、１つの生成物あたり１群３匹のマウスを、それぞれのＰＤＴ処理後に使用した。
【００４４】
ａ．光力学治療
０．５時間、４時間、６時間、７２時間の医薬−光の間隔（ＤＬＩ）を、ｍＴＨＰＣ、生成物Ａ（リポソームおよびｍ−ＴＨＰＣ）および生成物Ｂ（ＰＥＧ化リポソームおよびｍ−ＴＨＰＣ）としての生成物に使用した。それぞれの動物は、ケタミン（１２．５ｍｇ／ｍＬ）の筋肉内注入により麻酔にかけられ、次に光ダイオードレーザーを使用して１００ｍＷ／ｃｍ２で１０Ｊ／ｃｍ２により６５２ｎｍで光照射された。
【００４５】
ｂ．ＰＤＴ効果の評価
形態学的方法
ＰＤＴ処理後の腫瘍組織壊死を評価するために、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ染色法を使用した。
マウスに、ＰＤＴ処理直後Ｅｖａｎｓブルー（１％）を腹腔内に０．２５ｍＬ注入した。
２４時間後、マウスをハロタンの過剰投与により殺し、腫瘍を取り出しそして縦に切開した。図３に例示されているように、腫瘍全体および腫瘍の切片の写真をとった。
【００４６】
染色されない壊死領域を腫瘍の損傷と考えた。
１．医薬−光の間隔（ＤＬＩ）＝０．５時間。壊死は、使用された生成物に関係なく観察されなかった。
２．医薬−光の間隔（ＤＬＩ）＝４時間。ｍＴＨＰＣ−ＰＤＴにより処理された２匹のマウスは、部分的な腫瘍の壊死を立証した。生成物Ａにより処理された２匹のマウスは、部分的な壊死を生じ、一方三番目のマウスの腫瘍は、変化がなかった。生成物Ｂ−ＰＤＴにより処理された３匹のマウスは、腫瘍の壊死を立証し、２匹のマウスでは、明確な腫瘍の壊死が観察され、一方１匹のマウスでは、腫瘍の壊死は部分的であった。
【００４７】
３．医薬−光の間隔（ＤＬＩ）＝６時間。６匹のマウスを生成物Ａについて使用した。明確な壊死が、生成物Ａにより処理された２匹のマウスの腫瘍に認められ、そして４匹の他のものは、変化がなかった。生成物Ｂでは、明確な腫瘍壊死がすべてのマウスに観察された。ｍＴＨＰＣ−ＰＤＴにより処理された２つの腫瘍は、明確な壊死を立証し、１つの腫瘍は壊死がなかった。壊死を示すｍＴＨＰＣ−ＰＤＴ腫瘍は、肉眼による観察により確認された。
【００４８】
図に関連して本発明の好ましい態様を記述したが、本発明が記述された態様に限定されず、そして種々の変化および改変が、請求の範囲に規定された本発明の範囲または趣旨から離れることなく当業者により行われうることを理解すべきである。
【００４９】
本実施形態に係るリポソーム処方物は以下のように記載してもよい。
（付記１）
燐脂質から実質的になるリポソーム二重層、並びに治療上有効な量の非極性光増感剤を含むことを特徴とする光力学治療用の製薬リポソーム処方物。
（付記２）
該燐脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）結合燐脂質およびこれら３つの物質の組み合わせからなる群から選ばれる付記１のリポソーム処方物。
（付記３）
該光増感剤がポルフィリンマクロ環光増感剤である付記１のリポソーム処方物。
（付記４）
該ポルフィリンマクロサイクル光増感剤が、ジュウテリオポルフィリン、エチオポルフィリン、プロトポルフィン、ヘマトポルフィリン、フェオホルバイド並びにそれらのジ−およびテトラ−ヒドロポルフィリン誘導体からなる群から選ばれる付記１のリポソーム処方物。
（付記５）
凍結乾燥され、１つ以上の単糖またはポリアルコールをさらに含み、好適な水性ベシクルを添加すると凍結乾燥処方物はリポソーム二重層内に治療上有効な量の非極性光増感剤を含むリポソームを形成する付記１のリポソーム処方物。
（付記６）
該単糖がグルコースおよびフラクトースからなる群から選ばれる付記５のリポソーム処方物。
（付記７）
該ポリアルコールがイノシトールおよびマンニトールからなる群から選ばれる付記５のリポソーム処方物。
（付記８）
単糖対燐脂質の濃度比が１：２−１：１２の間である付記５のリポソーム処方物。
（付記９）
ポリアルコール対燐脂質の濃度比が１：２−１：１２の間である付記５のリポソーム処方物。
（付記１０）
製薬投与のために水性流体により再構成される付記５のリポソーム処方物。
（付記１１）
光増感剤の治療上有効な濃度が、０．０００１−０．１５％ｗ／ｖである付記１又は５のリポソーム処方物。
（付記１２）
ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸パルミテートおよびこれら２つの組み合わせからなる群から選ばれる成分をさらに含む付記１又は５のリポソーム処方物。
（付記１３）
処方物が、特に極性があり予め選択された治療でいくらかの有益な効果を有するのに好適な少なくとも１つの追加の製薬上活性な物質をさらに含む付記１又は５のリポソーム処方物。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テモポルフィン（Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）または他の非極性光増感剤を含むリポソーム処方物の製造、および特に静脈内注入を使用する治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、水コンパートメントにより分離されている同心状の脂質二重層からなる人工のベシクルであり、そして医薬伝達ベシクルとして広く検討されてきている。それらのすべては製造方法によりうまくコントロールできる構造、化学的組成およびコロイドのサイズにより、リポソームは、種々の応用に有用であるいくつかの性質を示す。最も重要な性質は、コロイドのサイズ（すなわち、２０ｎｍ−１０μｍの範囲のやや均一な粒子のサイズ）、特殊な膜および表面の特徴である。
【０００３】
リポソームは、それらがいくつかの異なる目的を果たすことができるために、医薬および抗原用の担体として使用される（非特許文献１）。リポソームに囲まれた医薬は、代謝酵素と接触することがない。逆に、身体の構成成分（例えば赤血球または注入部位の組織）は、医薬の投与物全体に直接曝されない。医薬が作用する持続時間は、身体内の医薬の放出が遅いために、リポソームにより延長できる。ターゲティングの選択を意味する方向付けの可能性を有するリポソームは、身体全体で医薬の分布を変化させる。細胞は、エンドサイトーシスまたは食作用のメカニズムを使用してリポソームをサイトゾル中に取り入れる。その上、リポソームは、分解（例えば、代謝分解）に対して医薬を保護できる。ときには成功することがあるが、リポソームには限界がある。リポソームは、医薬を疾患のある組織に伝達するばかりか、肝臓、脾臓、腎臓および細網内皮系にも急速に入り、そして循環している間に医薬を放す（非特許文献２）。
【０００４】
ペギレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、これらの欠陥を克服する別の方法である。まず、ペギレーションは、長期間治療領域内に医薬のレベルを維持し、そして医薬は、より小さい、さらに活性なおよび／または容易に純粋になるフラグメントに次第に分解する長期にわたって循環する部分になる。第二に、それは、長期にわたって循環する医薬を含む微粒子または大きな分子が、病気に冒された脈管構造または受容体が発現する病理学的部位に徐々に蓄積するのを可能にし、そしてこれらの領域における医薬の伝達を改善または増大させる。第三に、それは、減少した血流または低濃度のターゲット抗原で病理学的領域の到達するものと思われるこれらのターゲットされた医薬および医薬担体にさらによいターゲッティング効果を達成するのを助けることができる。ペギレーションの利益は、代表的に特に、増加した安定性（温度、ｐＨ、溶媒など）、顕著に低下した免疫原性および抗原性、プロテアーゼに対する抵抗性、触媒的活性の維持、並びに溶解性における改善、そして生成物の液体安定性の増大および攪拌により誘発される凝集の減少をもたらすことである。
【０００５】
二重層と融和できる種を含むリポソーム膜例えばポリ（エチレングリコール）結合脂質（ＰＥＧ−脂質）またはガングリオシドは、ステルスリポソームを製造するのに使用されている（非特許文献３）。ステルスリポソームは、血液循環において比較的長い半減期を有し、そして生体内で別の生体内分布を示す。Ｖａａｇｅら（非特許文献４）は、ドキソルビシンのステルスリポソームを製造し、そしてそれらを使用して新しく移植されかつ十分に定着した成長する一次マウスがん腫を治療しそして乳房内腫瘍移植物からの自発性転移の発生を阻害した。かれらは、ドキソルビシン処方物のステルスリポソームの長い循環時間がその優れた治療の有効性に関係があると結論した。立体配位的に安定化したリポソームの二重層中のＭＰＥＧ誘導体化（ペギレート化）脂質の存在は、血漿蛋白および細胞表面受容体との相互反応（従来のリポソームの静脈内投与後に見られるＲＥＳクリアランスおよび急速な血管内の不安定化／破壊に関係する）に対する立体配位バリヤをもたらす。その結果、ペギレート化リポソームは、長期の循環半減期を有し、そして任意の封入剤の薬剤動力学は、捕捉された薬剤のそれらよりむしろリポソーム担体のそれらに従うように変えられる（非特許文献５）。ペギレート化リポソームの腫瘍の局在性のメカニズムは、腫瘍における漏れやすい血管を通る管外遊出によるため（非特許文献６および７）、長期に及ぶ循環は、腫瘍の脈管構造を通るペギレート化リポソームによりなされる通過の合計数を増やすことにより、腫瘍中の蓄積に有利であると思われる。
【０００６】
光力学治療（ＰＤＴ）は、種々の医学上の応用に使用するために開発された最も将来性のある技術の１つであり、そして腫瘍をなくすための十分に認められた治療として周知である（非特許文献８）。ＰＤＴの他の重要な応用は、皮膚、歯科、化膿、呼吸器、胃腸、性器および他の感染症を含む病原性微生物による感染症の治療である。
【０００７】
感染症の治療において常に生ずる問題は、疾患の治療に使用される剤が特異性を失うことであり、それによりその治療から患者は新しい群の疾病にかかることになる場合がある。
【０００８】
種々のタイプの疾患の治療に関するＰＤＴの使用は、光増感剤の固有の特徴により制限される。これらは、それらの高いコスト、宿主生物における延長された保持、皮膚のかなりの光毒性、バックグラウンド毒性、生理学的溶液における低い溶解度（それが血栓塞栓の事故を生ずるため、血管内投与へのその有用性を低下する）、そして低いターゲティング有効性を含む。これらの不利益さは、光増感剤の非常に高い投与量の投与を導き、それは損傷をうけていない組織における光増感剤の蓄積および損傷していない部位を冒す付随して生ずるリスクの可能性を劇的に増大させる。
【０００９】
光増感剤の特異性およびＰＤＴの有効性を増大させる有望なアプローチの１つは、光増感剤とリガンド−ベクターとの融合であり、それは、目標細胞の表面上の受容体に特異的に結合する。目標細胞により認識される多数の天然および合成の分子は、これらのベクターとして使用できる。このアプローチは、腫瘍の治療用の光増感剤の新しい世代のデザインに現在使用されている（非特許文献９）。
【００１０】
光増感剤を腫瘍細胞に向けることにより腫瘍の選択性を増加させる他のアプローチは、リポソーム例えばトラスフェリン共役リポソームを使用することである（非特許文献１０）。非共役リポソームが、しばしば、細網内皮系により容易に認識され排除されるため、ＰＥＧ化リポソームが使用された（非特許文献１１および１２）。
【００１１】
ガンおよび他の疾患の疾患における光力学治療の適用が急速に増大しているため、新しい光増感剤処方物への要求が増加している。これらの新しい光増感剤処方物には、さらに安定であり、製造が容易でありさらに取り扱いが容易であることが求められる。その上、特に疎水性かつ非極性の光増感剤は、能率的かつ選択的な方法で組織に向かうことができなくてはならない。
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｔｏｒｍ ａｎｄ Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１，１９−３１，１９９８
【非特許文献２】Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｍａｒｃｈ ２００３，２，２１４−２２１
【非特許文献３】Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，８８，１１４６０−４，１９９１
【非特許文献４】Ｖａａｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，５１，９４２−８，１９９２
【非特許文献５】Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６，６８３−６９１，１９９８
【非特許文献６】Ｎｏｒｔｈｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６，２４４５−２４５１，１９９８
【非特許文献７】Ｍｕｇｇｉａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５，９８７−９９３，１９９７
【非特許文献８】「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ｔｙｐｅ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ」Ｔ．Ｄ．Ｍｏｄｙ，Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ，４，３６２−３６７，２０００
【非特許文献９】「Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ｂａｓｅｄ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ」Ｅ．Ｄ．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｄ．Ｄｏｌｐｈｉｎ，Ｃ．Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，４１５１−４２０２，１９９８
【非特許文献１０】Ｄｅｒｙｃｋｅ ａｎｄ ＤｅＷｉｔｔｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０，１８１−１８７，２００２
【非特許文献１１】Ｗｏｏｄｌｅ ａｎｄ Ｌａｓｉｅ、Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１１１３，１７１−１９９，１９９２
【非特許文献１２】Ｄａｓｓ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９，９７２−９７５，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
光力学治療（ＰＤＴ）に使用される改善された光増感剤処方物を提供するのが本発明の目的である。
リポソーム膜中に非極性光増感剤を配合し、それにより非極性および極性の物質を同じベシクルを使用して輸送するのが本発明の他の目的である。
【００１４】
凍結防止剤として単糖またはポリアルコールを添加することにより凍結乾燥中配合された非極性光増感剤を有するリポソーム構成物の構造およびサイズを保存するのが本発明の他の目的である。
【００１５】
改善された薬剤動力学の性質を有する光増感剤処方物を提供するのが本発明の他の目的である。
細胞膜を通る非極性光増感剤の輸送を改善しそのためＰＤＴの能率を増大させるのが本発明の他の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、非極性ポルフィリン光増感剤および１つ以上の燐脂質を含む光力学治療用の製薬リポソーム処方物に関し、それらは凍結乾燥を要することなく安定に貯蔵できる。リポソーム処方物は、静脈内投与のための治療上有効な量の光増感剤を提供する。燐脂質は、ペギレーションにより改変でき、すなわちそれらは燐脂質の統合された部分としてポリエチレングリコールを含む。形成されたリポソームは、膜内に非極性光増感剤を含み、そして非極性光増感剤および第二の極性の物質の組み合わされたターゲティングに有用である。処方物が単糖またはポリアルコールの存在を含むとき、それは、リポソームベシクルのサイズおよび治療上有効な量の光増感剤の含量を保存しつつ、有効に凍結乾燥できる。本発明は、また水性ベシクルによる再構成で形成されるリポソーム組成物に関する。好適な水性ベシクルによる再構成での凍結乾燥された処方物は、また静脈内投与に有用なリポソームを形成する。
本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、図とともに読まれる以下の記述から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】リポソーム処方されたｍＴＨＰＣのゲル濾過曲線である。脂質成分およびｍＴＨＰＣの両者は、集めたすべてのフラクションにわたって同じ分布を示す。
【図２】注入後の時間の関数として腫瘍中の蓄積を与える、ｍＴＨＰＣ、生成物ＡおよびＢの静脈内注入（０．５ｍｇ／ｋｇ）でのＳｗｉｓｓ ｎｕ／ｎｕマウスの無処理皮膚のＣｏｌｏ２６腫瘍の光誘発蛍光（ＬＩＦ）の測定を示す。
【図３】生成物Ａ、ＢおよびｍＴＨＰＣの静脈内注入６時間後のＰＤＴ効果を示す。マウスは、ＰＤＴ処理直後Ｅｖａｎｓブルー（１％）を腹腔内に注入され（０．２５ｍＬ）、そして２４時間後殺された。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
凍結乾燥を要することなく貯蔵して安定な、非極性ポルフィリン光増感剤および１つ以上の燐脂質を含む光力学治療用の製薬リポソーム処方物は、以下に記述される。リポソーム処方物は、静脈内投与のための治療上有効な量の光増感剤を提供する。燐脂質は、ペギレーションにより改変でき、すなわちそれらは燐脂質の統合した部分としてポリエチレングリコールを含む。形成されたリポソームは、膜内に非極性光増感剤を含みそして非極性光増感剤および第二の極性物質の組み合わさったターゲティングに有用である。
【００１９】
処方物は、単糖またはポリアルコールを使用する凍結乾燥工程により保存でき、かなり安定な貯蔵期間を有する必要がない。工程のサイクルは、リポソームベシクルのサイズ並びに光増感化合物の膜含量を保存する。
【００２０】
本発明の非極性光増感剤は、周知のポルフィリンに基づく化合物を含む。本発明の実施に有利に使用される特定の光増感剤は、ポルフィリン単環光増感剤に基づくものであり、ジュウテリオポルフィリン、エチオポルフィリン、プロトポルフィン、ヘマトポルフィリン、フェオホルバイド並びにそれらの誘導体、特にジ−およびテトラ−ヒドロポルフィリン誘導体（６４０−７８０ナノメートルの範囲で最大の光吸収を有する）を含む。
【００２１】
燐脂質は、ペギレーションにより改変されても（統合する部分としてポリエチレングリコールを含む）、またはされなくてもよい。形成されたリポソームは、膜内に非極性光増感剤を含み、そして非極性光増感剤および第二の極性物質の組み合わさったターゲティングに有用である。
【００２２】
光増感剤処方物は、望ましくない細胞または組織または他の望まない材料へ非極性光増感剤分子を向かわせるのに有用であり、そして適切な光源による照射後ターゲットを損傷するのに有用である。光増感剤処方物は、また、光増感剤の制限された光化学活性化によりまたはそれなしで蛍光イメージング法を使用することによって望ましくない細胞または組織または他の望まない材料をモニターするのに有用である。
【００２３】
特に、本発明のリポソーム処方物は、非極性光増感剤を輸送するのに有用である。非極性物質は、ベシクルの膜内に一体化され、それによってより容易に開放する構造を生成して、細胞膜への直接の作用のために光増感剤を放す。このメカニズムは、作用の１つの好ましい場所である細胞膜系に直接光増感剤を伝達する。そのため、適切な外部の光源による照明により有効に活性化される光増感剤は、望ましくない細胞、組織または他の構造を不可逆的に損傷できる。
【００２４】
従来構築されたリポソーム処方物は、ベシクルのルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）部分中に捕捉されるいくつかの化合物を輸送するのに使用されている。本発明は、１つのリポソーム内の２つの異なる輸送コンパートメントの組み合わせに焦点をあてており、非極性および極性の物質の組み合わさった輸送を可能にする。この方法で、膜内に光増感剤を存在させることによって、光増感剤は、それらの作用点に有効に向けられるが、リポソーム粒子内のルミナール部分は、他の物質（治療に有益な効果を有する医薬を含む）を包含するために、自由のままである。
【００２５】
さらに、グルコースのような単糖および燐脂質へ付着した光増感剤の組み合わせは、二糖の代わりに生理学的に普通の炭水化物を使用して凍結乾燥および再水和中、リポソームのサイズを保存するのに優れた手段である。
【００２６】
この多面的な概念は、治療に有益な効果を有すると思われる物質の添加を可能にする。１つのベシクル内の膜に結合した光増感剤とともに２つ以上の物質を組み合わせることは、ターゲティング細胞治療の酸素含量に直接または間接に影響し、光力学治療の有効性に影響する。例えば、これらの効果は、哺乳動物のチオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の阻害剤のような酵素の活性の阻害剤を添加することにより達成できる。そのため、目標とした細胞の細胞質に到達した後にのみ有効なため、阻害剤は、抗酸化剤として通常作用するＴｒｘ／ＴｒｘＲ経路をブロックするだろう。
〔実施例〕
【実施例１】
【００２７】
ｍ−ＴＨＰＣを含むリポソームの製造
ｍＴＨＰＣ（Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）は、参考として本明細書に引用される米国特許４９９２２５７および５１６２５１９に記述されている通りに合成された。
リポソームは、以下の一般的な方法で製造された。
【００２８】
非極性光増感剤、アスコルビン酸パルミテートおよび燐脂質をクロロホルム／メタノールに溶解する。溶液を、次にクロロホルム／メタノール混合物がガスクロマトグラフィーにより検出できなくなるまで、回転蒸発器を使用して真空下乾燥する。注入用の水を添加して少なくとも２時間５０℃の温度で脂質フィルムを再水和する。混合物を次に最後に１００ナノメートルの穴のサイズを使用する
【００２９】
ホモゲナイザーフィルター系を通す。好ましくは、再水和の水に単糖またはポリアルコールを補給する。濾液を集め、バイアルに入れ、好ましくは凍結乾燥する。凍結乾燥した組成物を、投与前に注入用の水により再構成する。
前記の方法を使用して、リポソーム処方物のいくつかの異なる調製物を以下のように製造した。
【００３０】
実施例 １ａ
成分 量（％ｗ／ｖ）
ｍＴＨＰＣ ０．０５−０．１５
ジパルミトイルホスファチジルコリン ０．５−２．０
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール ０．０５−０．２
ペギレート化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン ０．０５−０．２
アスコルビン酸パルミテート ０．００２−０００４
注入用の水 加えて上記濃度にする
【００３１】
実施例 １ｂ
成分 量（％ｗ／ｖ）
ｍＴＨＰＣ ０．０５−０．１５
ジパルミトイルホスファチジルコリン ０．５−２．０
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール ０．０５−０．２
アスコルビン酸パルミテート ０．００２−０００４
注入用の水 加えて上記濃度にする
【００３２】
実施例 １ｃ
成分 量（％ｗ／ｖ）
ｍＴＨＰＣ ０．０５−０．１５
ジパルミトイルホスファチジルコリン ０．５−２．０
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール ０．０５−０．２
グリコース ２．０−１２．０
アスコルビン酸パルミテート ０．００２−０００４
注入用の水 加えて上記濃度にする
すべては、本発明によるそれらの使用で十分に機能することが分かった。
【実施例２】
【００３３】
リポソームｍ−ＴＨＰＣの物理的および化学的安定性
リポソーム処方物の物理的安定性は、光子相関スペクトル分析により粒子サイズの分布をモニターすることにより測定された。
【００３４】
リポソームｍＴＨＰＣの安定性
貯蔵条件 平均粒子サイズ分布（ｎｍ）
最初 １６６
２３℃−１ヶ月 １７７
２３℃−４ヶ月 １６７
【実施例３】
【００３５】
処方物のリポソーム二重層内のｍＴＨＰＣの局在化
リポソーム処方物のゲル濾過は、セファデックスＧ５０カラムで行われた。図１に示されるように、脂質およびｍＴＨＰＣは、すべてのフラクションにわたって同じ分布を示し、両者の成分の物理的な相互作用すなわち膜二重層中へのｍＴＨＰＣの一体化を示す。分布は、表１および２に示されるように、超音波処理によりリポソーム構造を破壊した後でも著しく変化しない。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【表２】
【実施例４】
【００３８】
マウスにおける製剤動力学
Ｂａｌｂ／ｃマウスに同系間の非転移マウス結腸直腸腫瘍細胞系であるＣｏｌｏ２６を使用した。
細胞を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清、１％ストレプトマイシン−ペニシリンおよび２００ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地で、９５％空気および５％ＣＯ２中で３７℃で単層培養として維持した。６週令の無胸腺雌マウス（Ｓｗｉｓｓ，ｎｕ／ｎｕ）に、２×１０６Ｃｏｌｏ２６細胞を右後ろ足の皮下に接種した。２週後、腫瘍が５−７ｍｍの直径に達したとき、ｍ−ＴＨＰＣの処方物（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に注入した。
【００３９】
非侵襲性ＬＩＦ測定を、医薬投与後異なる時間で３つの異なる部位、すなわち皮膚が重なった腫瘍、左後ろ足上の皮膚が重なった対称的な正常の組織および隆起した皮膚で行った。選択された時点で、マウスを殺し、そして腫瘍および正常の組織からの蛍光信号を直接接触して測定した。
【００４０】
図２は、４匹のマウスで測定された注入後の時間の関数として、ｍＴＨＰＣ、生成物ＡおよびＢの蓄積を示す。非侵襲性測定は、２４時間で最適な比（１．３）で正常な組織に比べて腫瘍中のｍＴＨＰＣのよりよい蓄積の傾向を立証した。注入２４時間および４８時間後の腫瘍および筋肉との直接接触で行われた侵襲性測定は、それぞれ２．７および３．０の比を示した。
【００４１】
生成物Ａに関する測定は、投与後０．５時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間および７２時間で１匹のマウスでなされた。生成物Ａは、ｍＴＨＰＣと同様な薬剤動力学の傾向を示した。ｍＴＨＰＣに比べて、腫瘍組織の最高の蛍光強度は、注入４時間後既に達した。
【００４２】
生成物Ｂに関する測定は、投与後０．５時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間および７２時間で１匹のマウスでなされた。腫瘍の最高の蛍光強度は、静脈内注入８時間後に測定された。ｍＴＨＰＣに比べて、生成物Ｂは、完全に異なる製剤動力学の性質を示している。生成物Ｂの濃度は、ｍＴＨＰＣより遙かに早く（１６時間）腫瘍中で増加した。
【実施例５】
【００４３】
リポソームｍ−ＴＨＰＣの抗腫瘍活性
Ｂａｌｂ／ｃマウスに同系間の非転移マウス結腸直腸腫瘍細胞系であるＣｏｌｏ２６を使用した。
細胞を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清、１％ストレプトマイシン−ペニシリンおよび２００ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地で、９５％空気および５％ＣＯ２中で３７℃で単層培養の無胸腺雌マウス（Ｓｗｉｓｓ，ｎｕ／ｎｕ）に、２×１０６Ｃｏｌｏ２６細胞を右後ろ足の皮下に接種した。２−３週後、腫瘍が１０−１３ｍｍの直径に達したとき、ｍ−ＴＨＰＣの処方物（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に注入した。他に示されない限り、１つの生成物あたり１群３匹のマウスを、それぞれのＰＤＴ処理後に使用した。
【００４４】
ａ．光力学治療
０．５時間、４時間、６時間、７２時間の医薬−光の間隔（ＤＬＩ）を、ｍＴＨＰＣ、生成物Ａ（リポソームおよびｍ−ＴＨＰＣ）および生成物Ｂ（ＰＥＧ化リポソームおよびｍ−ＴＨＰＣ）としての生成物に使用した。それぞれの動物は、ケタミン（１２．５ｍｇ／ｍＬ）の筋肉内注入により麻酔にかけられ、次に光ダイオードレーザーを使用して１００ｍＷ／ｃｍ２で１０Ｊ／ｃｍ２により６５２ｎｍで光照射された。
【００４５】
ｂ．ＰＤＴ効果の評価
形態学的方法
ＰＤＴ処理後の腫瘍組織壊死を評価するために、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ染色法を使用した。
マウスに、ＰＤＴ処理直後Ｅｖａｎｓブルー（１％）を腹腔内に０．２５ｍＬ注入した。
２４時間後、マウスをハロタンの過剰投与により殺し、腫瘍を取り出しそして縦に切開した。図３に例示されているように、腫瘍全体および腫瘍の切片の写真をとった。
【００４６】
染色されない壊死領域を腫瘍の損傷と考えた。
１．医薬−光の間隔（ＤＬＩ）＝０．５時間。壊死は、使用された生成物に関係なく観察されなかった。
２．医薬−光の間隔（ＤＬＩ）＝４時間。ｍＴＨＰＣ−ＰＤＴにより処理された２匹のマウスは、部分的な腫瘍の壊死を立証した。生成物Ａにより処理された２匹のマウスは、部分的な壊死を生じ、一方三番目のマウスの腫瘍は、変化がなかった。生成物Ｂ−ＰＤＴにより処理された３匹のマウスは、腫瘍の壊死を立証し、２匹のマウスでは、明確な腫瘍の壊死が観察され、一方１匹のマウスでは、腫瘍の壊死は部分的であった。
【００４７】
３．医薬−光の間隔（ＤＬＩ）＝６時間。６匹のマウスを生成物Ａについて使用した。明確な壊死が、生成物Ａにより処理された２匹のマウスの腫瘍に認められ、そして４匹の他のものは、変化がなかった。生成物Ｂでは、明確な腫瘍壊死がすべてのマウスに観察された。ｍＴＨＰＣ−ＰＤＴにより処理された２つの腫瘍は、明確な壊死を立証し、１つの腫瘍は壊死がなかった。壊死を示すｍＴＨＰＣ−ＰＤＴ腫瘍は、肉眼による観察により確認された。
【００４８】
図に関連して本発明の好ましい態様を記述したが、本発明が記述された態様に限定されず、そして種々の変化および改変が、請求の範囲に規定された本発明の範囲または趣旨から離れることなく当業者により行われうることを理解すべきである。
【００４９】
本実施形態に係るリポソーム処方物は以下のように記載してもよい。
（付記１）
燐脂質から実質的になるリポソーム二重層、並びに治療上有効な量の非極性光増感剤を含むことを特徴とする光力学治療用の製薬リポソーム処方物。
（付記２）
該燐脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）結合燐脂質およびこれら３つの物質の組み合わせからなる群から選ばれる付記１のリポソーム処方物。
（付記３）
該光増感剤がポルフィリンマクロ環光増感剤である付記１のリポソーム処方物。
（付記４）
該ポルフィリンマクロサイクル光増感剤が、ジュウテリオポルフィリン、エチオポルフィリン、プロトポルフィン、ヘマトポルフィリン、フェオホルバイド並びにそれらのジ−およびテトラ−ヒドロポルフィリン誘導体からなる群から選ばれる付記１のリポソーム処方物。
（付記５）
凍結乾燥され、１つ以上の単糖またはポリアルコールをさらに含み、好適な水性ベシクルを添加すると凍結乾燥処方物はリポソーム二重層内に治療上有効な量の非極性光増感剤を含むリポソームを形成する付記１のリポソーム処方物。
（付記６）
該単糖がグルコースおよびフラクトースからなる群から選ばれる付記５のリポソーム処方物。
（付記７）
該ポリアルコールがイノシトールおよびマンニトールからなる群から選ばれる付記５のリポソーム処方物。
（付記８）
単糖対燐脂質の濃度比が１：２−１：１２の間である付記５のリポソーム処方物。
（付記９）
ポリアルコール対燐脂質の濃度比が１：２−１：１２の間である付記５のリポソーム処方物。
（付記１０）
製薬投与のために水性流体により再構成される付記５のリポソーム処方物。
（付記１１）
光増感剤の治療上有効な濃度が、０．０００１−０．１５％ｗ／ｖである付記１又は５のリポソーム処方物。
（付記１２）
ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸パルミテートおよびこれら２つの組み合わせからなる群から選ばれる成分をさらに含む付記１又は５のリポソーム処方物。
（付記１３）
処方物が、特に極性があり予め選択された治療でいくらかの有益な効果を有するのに好適な少なくとも１つの追加の製薬上活性な物質をさらに含む付記１又は５のリポソーム処方物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペギレート化燐脂質を含む燐脂質からなるリポソーム二重層、並びに該リポソーム二重層内に含まれる治療上有効な量の光増感剤からなる、保存のための凍結乾燥を必要としない光力学治療用の製薬リポソーム処方物。
【請求項２】
前記燐脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）結合燐脂質およびこれら３つの物質の組み合わせからなる群から選ばれる請求項１に記載のリポソーム処方物。
【請求項３】
前記燐脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびペギレート化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの組み合わせである請求項１に記載のリポソーム処方物。
【請求項４】
前記ジパルミトイルホスファチジルコリンの濃度は０．５−２．０％ｗ／ｖであり、
前記ジパルミトイルホスファチジルグリセロールの濃度は０．０５−０．２％ｗ／ｖである請求項３に記載のリポソーム処方物。
【請求項５】
前記光増感剤がジヒドロポルフィリンおよびテトラヒドロポルフィリンからなる群から選ばれる請求項１から４のいずれか１項に記載のリポソーム処方物。
【請求項６】
前記光増感剤がテモポルフィンである請求項１から５のいずれか１項に記載のリポソーム処方物。
【請求項７】
前記ジパルミトイルホスファチジルコリンの濃度は０．５−２．０％ｗ／ｖであり、
前記ペギレート化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの濃度は０．０５−０．２％ｗ／ｖである請求項３に記載のリポソーム処方物。
【請求項８】
前記光増感剤の治療上有効な濃度が、０．０００１−０．１５％ｗ／ｖである請求項１から７のいずれか１項に記載のリポソーム処方物。
【請求項９】
製薬投与のために水性流体により再構成される請求項１から８のいずれか１項に記載のリポソーム処方物。
【請求項１】
ペギレート化燐脂質を含む燐脂質からなるリポソーム二重層、並びに該リポソーム二重層内に含まれる治療上有効な量の光増感剤からなる、保存のための凍結乾燥を必要としない光力学治療用の製薬リポソーム処方物。
【請求項２】
前記燐脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）結合燐脂質およびこれら３つの物質の組み合わせからなる群から選ばれる請求項１に記載のリポソーム処方物。
【請求項３】
前記燐脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびペギレート化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの組み合わせである請求項１に記載のリポソーム処方物。
【請求項４】
前記ジパルミトイルホスファチジルコリンの濃度は０．５−２．０％ｗ／ｖであり、
前記ジパルミトイルホスファチジルグリセロールの濃度は０．０５−０．２％ｗ／ｖである請求項３に記載のリポソーム処方物。
【請求項５】
前記光増感剤がジヒドロポルフィリンおよびテトラヒドロポルフィリンからなる群から選ばれる請求項１から４のいずれか１項に記載のリポソーム処方物。
【請求項６】
前記光増感剤がテモポルフィンである請求項１から５のいずれか１項に記載のリポソーム処方物。
【請求項７】
前記ジパルミトイルホスファチジルコリンの濃度は０．５−２．０％ｗ／ｖであり、
前記ペギレート化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの濃度は０．０５−０．２％ｗ／ｖである請求項３に記載のリポソーム処方物。
【請求項８】
前記光増感剤の治療上有効な濃度が、０．０００１−０．１５％ｗ／ｖである請求項１から７のいずれか１項に記載のリポソーム処方物。
【請求項９】
製薬投与のために水性流体により再構成される請求項１から８のいずれか１項に記載のリポソーム処方物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２１３７３１（Ｐ２０１１−２１３７３１Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４７５０３（Ｐ２０１１−１４７５０３）
【出願日】平成２３年７月１日（２０１１．７．１）
【分割の表示】特願２００６−５２４６２８（Ｐ２００６−５２４６２８）の分割
【原出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【出願人】（５０２３５９６６６）セラムオプテック インダストリーズ インコーポレーテッド (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１日（２０１１．７．１）
【分割の表示】特願２００６−５２４６２８（Ｐ２００６−５２４６２８）の分割
【原出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【出願人】（５０２３５９６６６）セラムオプテック インダストリーズ インコーポレーテッド (20)
【Ｆターム（参考）】
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