凍結しないＤＮＡリガーゼ反応組成物
【課題】本発明の目的は、添加剤を検討し、−３０℃保存で少なくとも一週間凍結しないリガーゼ組成物、および使用方法を提供することである。また、それらを含有する試薬・キットおよび製造法を提供することである。
【解決手段】−３０℃保存で少なくとも１週間凍結しない、ＤＮＡリガーゼ反応組成物であって、好ましくはベタイン及びグリセロールを含有する組成物。
【解決手段】−３０℃保存で少なくとも１週間凍結しない、ＤＮＡリガーゼ反応組成物であって、好ましくはベタイン及びグリセロールを含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その組成物が−３０℃で少なくとも一週間凍結しないという性質を有する、ＤＮＡの相補末端を連結するための新規ＤＮＡリガーゼ反応組成物に関する。さらには、本組成物を含有する試薬・キットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡリガーゼは、隣接したＤＮＡの５’側のリン酸基と３’側の水酸基をホスホジエステル結合によって連結する酵素であり、様々な生物由来のものが知られている。その中でも、分子生物学実験で頻繁に用いられているのが、Ｔ４バクテリオファージに由来する「Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｅ．Ｃ．６．５．１．１）」である。この酵素は、反応にＭｇイオンとＡＴＰを要求し、平滑末端、及び突出末端の２本鎖ＤＮＡの連結や、２本鎖ＤＮＡのニック部分の修復に働くことが知られている。この他にも大腸菌に由来するＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ リガーゼや好熱性菌由来のＤＮＡリガーゼなども頻繁に使用されている。
【０００３】
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼとＥ． Ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼが主に分子生物学実験におけるＤＮＡの連結反応に使用される一方、好熱性菌由来のＤＮＡリガーゼは、リガーゼチェインリアクション法などの診断用途に用いられることが多い。
【０００４】
近年、様々な分子生物学用試薬やキットが販売されるに至っている。その中、リガーゼ試薬も様々な工夫がなされてきている。特に、ＤＮＡ以外の反応に必要な全ての成分を含んだ組成物（ＤＮＡリガーゼ反応組成物）、すなわち１液タイプのリガーゼ試薬が世に出て久しい。１液タイプのリガーゼ試薬は、一般的には連結したいＤＮＡを含むＤＮＡ溶液と２：１〜１：０．５の比率で混合してライゲーション反応を行う。しかし、現在販売されているそれらの試薬は、保存安定性のことを考えて凍結状態（通常−２０℃〜−３０℃）で供給され、使用直前に融解して使用する煩雑さがある。また、リガーゼは凍結融解には強いが、凍結融解を繰り返すうちに、徐々に活性が低くなってしまう試薬も見られるようである。本発明において、１液タイプ、かつ−３０℃の保存でも凍結しないライゲーション試薬の検討を行った理由は、ここにある。
【０００５】
ＤＮＡリガーゼ試薬には、反応バッファーと酵素が別々に供給される場合もあり、そのときＤＮＡリガーゼは５０％グリセロールなどを含む保存液で供給され、その時のＤＮＡリガーゼ溶液は−２０℃〜−３０℃で凍結しないが、本発明はそのような現象を意図しているのではない。本発明においては、ＤＮＡ成分以外のライゲーションに必要な成分をすべて含むＤＮＡリガーゼ反応組成物が凍結しないことが重要である。
【０００６】
凍結しない状況を作り出すためには、添加剤等を工夫することが考えられるが、反応を阻害しないという条件を満たす必要がある。そこで文献調査により、添加剤開発を調査した。分子生物学実験におけるＴ４ ＤＮＡ リガーゼの使用の歴史は古く、１９７０年代まで遡ることができる。また、添加剤の検討も種々行われており、歴史は古い。以下に例を列挙する。
【０００７】
特許文献１には、ポリエチレングリコールなどの体積排除効果があり、かつＤＮＡと相互作用しないポリマーを、ライゲーション反応に添加することによる反応促進効果が記載されている。しかし、この組成を用いて調製したＤＮＡリガーゼ組成物は冷蔵庫での−３０℃〜−３０℃での保存中に容易に凍結してしまう。
【特許文献１】ＵＳ４５８２８０２
【０００８】
また、特許文献２には、（Ａ）ポリエチレングリコール、（Ｂ）ポリアミン、一価カチオン及び二価カチオンから成る群から選択した少なくとも１種のもの、が添加剤として挙げられており、（Ａ）と（Ｂ）をリガーゼと共存させることにより、反応効率を格段に向上させることができることが記載されている。しかし、この組成を用いても、−２０℃〜−３０℃での保存中に凍結してしまうことが我々の実験から分かっていた。
【特許文献２】特開昭６２−３６１８７
【０００９】
さらに、特許文献３には、ベタインを添加することによるＴＡクローニングの効率の向上の効果が記載されている。ＴＡクローニングとは、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼなどを使用したＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）での増幅ＤＮＡ断片の３’末端にアデニン（ｄＡ）が一塩基付加されることを利用するクローニング方法である。この一塩基付加は、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼなどが有する、Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）活性による。通常３’端にチミン（ｄＴ）の一塩基突出を有するベクター（通常Ｔベクターと呼ばれる）とＰＣＲプロダクトを混合し、リガーゼを反応させことによって行うことにより、ベクターとＤＮＡ断片を連結させる。本方法は、従来の制限酵素付着末端や、平滑末端を利用する方法にくらべ、迅速で簡便であるという利点があり、従来の方法に加えて頻繁に利用される方法のひとつとなっている。この方法は付着末端を用いる方法のカテゴリーに分類されるが、手法的には特許文献１及び２の時代にはなかった方法である。
この発明に用いられているベタインの高濃度溶液は、−２０℃〜−３０℃での保存で凍結しにくいことが分かっている。しかし、その凍結しにくい濃度は４Ｍ以上と、かなり飽和濃度に近く、現実的な濃度とはいえない。実際に、その濃度でＤＮＡリガーゼ反応組成物を調製した場合、ライゲーション反応が阻害されてしまうことが我々の検討で明らかになっている。
【特許文献３】特開２００６−２５６３７
【００１０】
上記をまとめると、様々な添加剤の検討を行われてきたが、ほとんどが使用時に添加するものであり、かつライゲーションの効率を向上させる目的で検討されているようである。また、それらを添加した状態でのライゲーション効率や液の形状（凍結するか否か）については、ほとんど検討されていない。また、我々の事前の調査から、上記発明を用いても−２０℃〜−３０℃保存で凍結せず、かつ実際の１液タイプのライゲーション試薬として使用できる発明は皆無であると考えられた。
【００１１】
よって、本発明においては、様々な添加剤を加えたリガーゼ組成物（ＤＮＡ成分のみ添加せず）を調製し、−３０℃保存で凍結するか否かに加え、反応効率についても検討をおこなった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、添加剤を検討し、−３０℃保存で少なくとも一週間凍結しないリガーゼ組成物、および使用方法を提供することである。また、それらを含有する試薬・キットおよび製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
今まで様々なライゲーションの効率化方法や１液試薬の検討がなされてきたが、上でも述べたように、ライゲーション組成物の保存方法や液状形状（すなわちマイナス温度で液状を保つ）についての検討は皆無であるといえる。
【００１４】
よって、本発明においては、様々な添加剤を用いて、液の形状とＤＮＡの連結効率について評価を行った。今回、主に−３０℃で凍結しない性質について調べたが、これは一般手Ｋに用いられている−２０℃のフリーザーでの長期保存を念頭においたためである。
【００１５】
様々な条件を検討した結果、ベタインとグリセロールを共存させることで、少なくとも−３０℃で一週間凍結せず、かつ効率を保つ組成を見出すことができた。
【００１６】
本発明は以下の構成からなる。
［項１］−３０℃保存で少なくとも１週間凍結しない、ＤＮＡリガーゼ反応組成物
［項２］ベタイン及びグリセロールを含有する、項１に記載のＤＮＡリガーゼ反応組成物
［項３］２Ｍ以上のベタイン及び５％（Ｖ／Ｖ）以上のグリセロールを含有する、項２に記載のＤＮＡリガーゼ反応組成物
［項４］項１に記載の組成物を用いてリガーゼ反応を行う、ライゲーション反応方法。
［項５］項１に記載の組成物を含有する試薬および／またはキット。
［項６］項１に記載の組成物を１液で供給することを特徴とする、試薬および／またはキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、リガーゼ活性を低下させない温度（すなわち−２０℃〜−３０℃保存）で凍結しない１液タイプのＤＮＡリガーゼ反応組成物を供給できるようになる。使用に当たっての煩雑性を低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、−３０℃保存で少なくとも１週間凍結しないことを特徴とする、ＤＮＡリガーゼ反応組成物である。ここでいうリガーゼ反応組成物とは、ＤＮＡ成分のみを含まない、リガーゼ反応に必要な成分を含む組成物を指す。
【００１９】
ＤＮＡリガーゼ反応組成物の保存容器としては、特に限定されないが、一般的に用いられるプラスチック製のチューブやボトル類が好ましく用いられる。更に好ましくは、ポリプロピレン製のチューブやボトル類が用いられる。実際に、本発明においては、ポリプロピレン製の１．５ｍｌマイクロチューブを用いて検討を行った。
【００２０】
本発明におけるＤＮＡリガーゼ反応組成物は、ベタイン及びグリセロールを含有する。グリセロールは、別名グリセリン。ベタインはトリメチルグリシンを指す。本発明は、好ましくは、２Ｍ以上のベタイン及び５％（Ｖ／Ｖ）以上のグリセロールをＤＮＡリガーゼ反応組成物である。さらに好ましくは、２〜２．５Ｍベタイン、５〜１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロールが用いられる。
【００２１】
ここで言うＤＮＡリガーゼ反応組成物は、連結させたいＤＮＡ溶液と任意の比率で混合して連結反応（ライゲーション反応）を起こさせる組成物を指し、その組成物は１液から校正される。その混合比率は特に限定されないが、ＤＮＡ：組成物比が、１：４〜１：０．５の間で用いられることが好ましく、さらに好ましくは、１：２〜１：０．５で用いられる。よって、実際の反応を行う溶液中でのベタインやグリセロールの濃度は混合比率によって変化する。例えば、２Ｍベタインを含む反応組成物を１：１の混合比率でＤＮＡ溶液と混合した場合、反応時のベタイン濃度は１Ｍとなる。０．５：１の場合は、０．３３Ｍとなる。
【００２２】
本発明においてＤＮＡリガーゼの種類は、特に限定されるものではないが、好ましくはＴ４ファージ由来のＴ４ ＤＮＡ リガーゼを用いる。この酵素は、ファージを感染させた大腸菌の破砕物から調製したものや、Ｔ４ファージのリガーゼ遺伝子を大腸菌に組み換えて発現させ、その破砕物から調製されたものなど様々なものを用いることができる。特に、ＤＮＡ分解酵素などの混入の少ない高純度の高度を用いることが重要である。
【００２３】
本発明における-30℃でのDNAリガーゼ反応組成物の保存方法は一般的な研究室でしようされているフリーザーを用いることができる。本発明においては、三洋電機社製のフリーザー（ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＦＲＥＥＺＥＲ ＭＤＦ−Ｕ５３７（商標））を−３０℃に設定して用いたが、同等の性能を示すフリーザーであれば特に限定されない。凍結試験時には極力温度変化を少なくするために、ドアの開閉を極力少なくする必要があり、必要に応じて温度を定期的にモニターしても良い。また、冷気の噴出し口やファンの近くは設定温度よりも温度が低下する可能性があり、正確な評価ができないので、気をつける。
【００２４】
本組成物に含まれる成分は、ライゲーション反応の必須成分、バッファー・塩成分に加えて、様々な添加剤を加えてよい。必須成分としては、ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、及びマグネシウム、バッファー・塩成分としては、バッファー、塩化ナトリウムなどの塩、及び還元剤などを挙げることができるが、限定されるものではない。
【００２５】
本発明においてＤＮＡリガーゼの種類は、特に限定されるものではないが、好ましくはＴ４ファージ由来のＴ４ ＤＮＡ リガーゼを用いる。この酵素は、ファージを感染させた大腸菌の破砕物から調製したものや、Ｔ４ファージのリガーゼ遺伝子を大腸菌に組み換えて発現させ、その破砕物から調製されたものなど様々なものを用いることができるが、高度に精製された高純度のものを用いることが重要である。特に、ＤＮＡ分解酵素などの混入の少ないものを用いることが重要である。
【００２６】
本発明に用いられるＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）は、アデノシンのリボースの５’位の水酸基にリン酸が３分子連続して結合したヌクレオチドのことを指す。ＡＴＰの濃度としては、反応時の濃度として、０．０１〜０．２ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．０２〜０．１ｍＭが好適に用いられる。
【００２７】
本発明に用いられるマグネシウムは、様々な塩を用いることができ、特に限定されない。好ましくは、塩化マグネシウムを用いる。塩化マグネシウムの濃度は、反応時の濃度として、１〜１０ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、２〜４ｍＭが好適に用いられる。
【００２８】
緩衝液成分はｐＨを至適条件に保つのに重要である。Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼの反応は、ｐＨ７．５前後が最も至適とされており、ｐＨ７．５前後のｐＨを保つことのできるバッファー成分を含むことが好ましい。バッファーとしては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液やＨＥＰＥＳ緩衝液が好適に用いられる。特に、トリス−塩酸緩衝液が最も好ましい。緩衝液の濃度は、反応時の濃度として、１０〜１００ｍＭが好適に用いられるが、２０〜５０ｍＭが用いられる。
【００２９】
塩成分としては、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの一般的なアルカリ土類金属の塩を用いることができる。特に、塩化ナトリウムが好適に用いることができる。塩化ナトリウムの濃度は、反応時の濃度として、１０〜１００ｍＭが好適に用いられ、特に、好ましくは２０〜５０ｍＭが用いられる。
【００３０】
還元剤成分としては、２−メルカプトエタノールやジチオスレイトール（ＤＴＴ）など、一般的に生化学実験で用いられている還元成分を用いることができ、特に限定されない。特に好ましくは、還元維持能力の高いＤＴＴが用いられる。ＤＴＴの濃度は、反応時の濃度として、０．５〜１０ｍＭが好適に用いられる。特に好ましくは、１〜５ｍＭが用いられる。
【００３１】
本発明における添加剤としては、ポリエチレングリコール、スペルミジン、ベタイン、及びグリセロールなどを挙げることができるが、限定されるものではない。上で述べたようにポリエチレングリコール、スペルミジン、ベタインは、ライゲーション反応の効率を向上させることのできる成分である。
【００３２】
本発明におけるポリエチレングリコールは、様々な分子量のものを使用することができるが、好ましくは分子量が２００−２０，０００、好ましくは５，０００−１０，０００、最も好ましくは６，０００を用いる。ポリエチレングリコールの濃度は、反応時の濃度として、０．５〜３％（Ｗ／Ｖ）が好ましく用いられる。最も好ましくは０．７５〜１．５％の濃度で使用するのが良い。
【００３３】
本発明におけるスペルミジンは、ポリアミンの一種であり、様々な由来のものが販売されているが起源は特に限定されない。スペルミジンの濃度は、反応時の濃度として、０．１〜１０ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．５〜２ｍＭで使用するのが良い。
【００３４】
本発明におけるベタインは、具体的にはトリメチルグリシンを指す。この分子は、グリシンのアミノ基にメチル基が３つ結合した構造を持つ。ベタインの濃度としては、反応時の濃度として、０．１〜１．５Ｍが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．５〜１．２５Ｍが好適に用いられる。さらにベタインは、ライゲーション反応組成物の凍結を妨げる成分であり、反応組成物中で２．５〜３Ｍの濃度で用いることが好ましい。
【００３５】
また本特許は、上記組成物を用いてリガーゼ反応を行うことを特徴とする、ライゲーション反応方法をも含むものである。
【００３６】
具体的には、上記組成物に連結させたいＤＮＡ断片を混合し、反応させる。ＤＮＡ断片は、基本的には２本鎖であり、末端が相補的である必要がある。様々なパターンの連結反応が予想されるが、大きく分けると、突出末端を有するＤＮＡ同士、及び平滑末端を有するＤＮＡ同士の連結が考えられる。突出末端には、５’側のＤＮＡ鎖の突出したものと、３’側のＤＮＡ鎖の突出したものの２種類が考えられる。それらの多くは、制限酵素によって作り出される末端である。一方、平滑末端を有する断片は、末端の配列に関わらず連結することが可能である。
【００３７】
また、ＤＮＡポリメラーゼの作用により作り出される、３’末端にアデニンが一塩基基突出したＤＮＡ断片を、３’側にチミンが一塩基基突出したベクター（Ｔベクター）に連結するクローニング方法（ＴＡクローニング）が近年盛んに行われるようになっている。この方法にも本発明を用いることができる。
【００３８】
上でも述べたが、リガーゼによる連結反応が生じるには、ＤＮＡの５’側の末端がリン酸化されている必要がある。２本鎖の連結が連結されるには、最低片方の鎖が連結される必要がある（片方のみが連結された場合は、もう片方は連結されないが、ＤＮＡ断片としては連結されたことになる）。少なくとも片方のＤＮＡ断片の５’末端がリン酸化されていることが、２本鎖ＤＮＡの連結反応には必要である。多くの場合、片方だけが連結されたＤＮＡは、大腸菌などへ導入すると、大腸菌の修復機構で連結されることが知られている。
【００３９】
本発明は、上記組成物を含有する試薬・キットにも関する。
【００４０】
また、本発明の実施の一態様としては、ＤＮＡ以外のライゲーション反応に必要な上述の成分を含む１液のライゲーション試薬を挙げることができる。
【実施例】
【００４１】
以下に本発明の実施例を挙げることにより、本発明による効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
【００４２】
実施例１：添加剤の効果の検討（ＴＡクローニングによる評価）
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ 塩化マグネシウム（ナカライテスク製）、０．１ｍＭ ＡＴＰ（東洋紡製）、４ｍＭ ＤＴＴ（ナカライテスク製）、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ナカライテスク製）、２．５％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ６，０００、１ｍＭ スペルミジン、０．１Ｕ／μｌ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（東洋紡製）からなる基本組成に、表１に示す様々な添加剤を添加したＤＮＡリガーゼ反応組成物を調製した。調製したＤＮＡリガーゼ組成物（200μl）を−３０℃に設定した冷凍庫（三洋電機社製ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＦＲＥＥＺＥＲ ＭＤＦ−Ｕ５３７（商標））で１ヶ月保存した後、以下の方法を用いてＴＡクローニング効率の評価を行った。ＤＮＡリガーゼ反応組成物の保存は、ポリプロピレン製の１．５ｍｌマイクロチューブ（エッペンドルフ社製）を用いた。また同時に、保存期間中の各組成物の、凍結の有無についての確認を行った。
ＴＡクローニングする挿入ＤＮＡはＰＣＲ法を用いて調製した。具体的には、２種類のプライマー（５’−ＧＡＴ−ＧＡＧ−ＴＴＣ−ＧＴＧ−ＴＣＣ−ＧＴＡ−ＣＡＡ−ＣＴ−３’、および：５’−ＧＧＴ−ＴＡＴ−ＣＧＡ−ＡＡＴ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−ＣＡＧ−ＣＧＣ−Ｃ−３’）を使用し、λファージＤＮＡ（東洋紡製）を鋳型として、ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を準備した（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅したＤＮＡ断片の３’末端には、主にアデニンが一塩基付加されている）。増幅反応は、ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの取扱い説明書に従い、増幅後、１％アガロースゲルを用いた電気泳動解析でバンドが生じていることを確認した。増幅したＤＮＡ断片は、精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ −ＰＣＲ ＆ Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−：東洋紡製）を用いて精製し、濃度測定の後、使用した。
一方、クローニングベクターは、ＴＡクローニングキット（ＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ：東洋紡製）に添付されているＴベクター（ｐＴＡ２）を用いた。
ライゲーションは、以下のように実施した。上記ＤＮＡ断片（７５ ｆｍｏｌ）とベクター（２５ ｆｍｏｌ）を溶解した７．５μｌの溶液に、上記リガーゼ反応組成物７．５μｌを添加し、１６℃で３０分間反応させ実施した。
評価は、連結産物でＤＨ５αを形質転換し、生じてくるコロニー数で評価を行った。今回用いたｐＴＡ２ベクターは、目的ＤＮＡが挿入された場合、Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で白いコロニーを形成し、目的ＤＮＡが挿入されなかった場合は青いコロニーを形成する性質を有している。
形質転換は、具体的には、以下のように実施した。すなわち、連結反応の終了したベクター溶液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡製）１００μｌと混和後、氷上に３０分間放置した後、４２℃で３０秒間ヒートショックを行い、その一部を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）、及び０．２５％Ｘ−Ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ナカライテスク製）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１６時間培養した後、生じたコロニー数をカウントした。結果を表１に示した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
結果、基本組成に加えて、３Ｍベタイン、２．５Ｍベタイン＋５％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、及び２．５Ｍベタイン＋１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロールを添加剤として添加した組成物は、−３０℃で少なくとも一週間凍結せず、かつ高効率でＴＡクローニング可能であることが明らかとなった。
３Ｍベタインは、−３０℃で１ヶ月では凍結した。
一方、酵素の保存などでよく用いられる５０％グリセロールは、凍結しないがリガーゼ反応を阻害することが分かった。
また、２．５Ｍベタイン＋５％グリセロール、及び２．５Ｍベタイン＋１０％グリセロールを添加したリガーゼ組成物は、−３０℃・１ヶ月の保存でも凍結しないことが分かり、試薬としてより有望であることが明らかとなった。
上の検討では、ＤＮＡ溶液７．５μｌに対して、リガーゼ組成物を等量の７．５μｌ添加して行ったが、半量の３．７５μｌを用いてもほぼ同等のクローニング効率が得られることも確認した。
また、本実施例では示さなかったが、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの切断によって生じる突出末端を用いたライゲーション実験、及びＨｉｎｃ ＩＩによる切断によって生じる平滑末端を用いたライゲーション実験においても実証実験を行っており、高い効率を示すことを確かめている。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
分子生物学実験に用いられるライゲーション試薬・キットに好適に用いられる。特に、１液タイプの高効率ライゲーション試薬・キットは幅広く実験に用いられているものであり、本技術を用いることにより利便性の向上は、産業上の大きな進歩であると考えられる。また、臨床用途などについても好適に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その組成物が−３０℃で少なくとも一週間凍結しないという性質を有する、ＤＮＡの相補末端を連結するための新規ＤＮＡリガーゼ反応組成物に関する。さらには、本組成物を含有する試薬・キットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡリガーゼは、隣接したＤＮＡの５’側のリン酸基と３’側の水酸基をホスホジエステル結合によって連結する酵素であり、様々な生物由来のものが知られている。その中でも、分子生物学実験で頻繁に用いられているのが、Ｔ４バクテリオファージに由来する「Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｅ．Ｃ．６．５．１．１）」である。この酵素は、反応にＭｇイオンとＡＴＰを要求し、平滑末端、及び突出末端の２本鎖ＤＮＡの連結や、２本鎖ＤＮＡのニック部分の修復に働くことが知られている。この他にも大腸菌に由来するＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ リガーゼや好熱性菌由来のＤＮＡリガーゼなども頻繁に使用されている。
【０００３】
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼとＥ． Ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼが主に分子生物学実験におけるＤＮＡの連結反応に使用される一方、好熱性菌由来のＤＮＡリガーゼは、リガーゼチェインリアクション法などの診断用途に用いられることが多い。
【０００４】
近年、様々な分子生物学用試薬やキットが販売されるに至っている。その中、リガーゼ試薬も様々な工夫がなされてきている。特に、ＤＮＡ以外の反応に必要な全ての成分を含んだ組成物（ＤＮＡリガーゼ反応組成物）、すなわち１液タイプのリガーゼ試薬が世に出て久しい。１液タイプのリガーゼ試薬は、一般的には連結したいＤＮＡを含むＤＮＡ溶液と２：１〜１：０．５の比率で混合してライゲーション反応を行う。しかし、現在販売されているそれらの試薬は、保存安定性のことを考えて凍結状態（通常−２０℃〜−３０℃）で供給され、使用直前に融解して使用する煩雑さがある。また、リガーゼは凍結融解には強いが、凍結融解を繰り返すうちに、徐々に活性が低くなってしまう試薬も見られるようである。本発明において、１液タイプ、かつ−３０℃の保存でも凍結しないライゲーション試薬の検討を行った理由は、ここにある。
【０００５】
ＤＮＡリガーゼ試薬には、反応バッファーと酵素が別々に供給される場合もあり、そのときＤＮＡリガーゼは５０％グリセロールなどを含む保存液で供給され、その時のＤＮＡリガーゼ溶液は−２０℃〜−３０℃で凍結しないが、本発明はそのような現象を意図しているのではない。本発明においては、ＤＮＡ成分以外のライゲーションに必要な成分をすべて含むＤＮＡリガーゼ反応組成物が凍結しないことが重要である。
【０００６】
凍結しない状況を作り出すためには、添加剤等を工夫することが考えられるが、反応を阻害しないという条件を満たす必要がある。そこで文献調査により、添加剤開発を調査した。分子生物学実験におけるＴ４ ＤＮＡ リガーゼの使用の歴史は古く、１９７０年代まで遡ることができる。また、添加剤の検討も種々行われており、歴史は古い。以下に例を列挙する。
【０００７】
特許文献１には、ポリエチレングリコールなどの体積排除効果があり、かつＤＮＡと相互作用しないポリマーを、ライゲーション反応に添加することによる反応促進効果が記載されている。しかし、この組成を用いて調製したＤＮＡリガーゼ組成物は冷蔵庫での−３０℃〜−３０℃での保存中に容易に凍結してしまう。
【特許文献１】ＵＳ４５８２８０２
【０００８】
また、特許文献２には、（Ａ）ポリエチレングリコール、（Ｂ）ポリアミン、一価カチオン及び二価カチオンから成る群から選択した少なくとも１種のもの、が添加剤として挙げられており、（Ａ）と（Ｂ）をリガーゼと共存させることにより、反応効率を格段に向上させることができることが記載されている。しかし、この組成を用いても、−２０℃〜−３０℃での保存中に凍結してしまうことが我々の実験から分かっていた。
【特許文献２】特開昭６２−３６１８７
【０００９】
さらに、特許文献３には、ベタインを添加することによるＴＡクローニングの効率の向上の効果が記載されている。ＴＡクローニングとは、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼなどを使用したＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）での増幅ＤＮＡ断片の３’末端にアデニン（ｄＡ）が一塩基付加されることを利用するクローニング方法である。この一塩基付加は、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼなどが有する、Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）活性による。通常３’端にチミン（ｄＴ）の一塩基突出を有するベクター（通常Ｔベクターと呼ばれる）とＰＣＲプロダクトを混合し、リガーゼを反応させことによって行うことにより、ベクターとＤＮＡ断片を連結させる。本方法は、従来の制限酵素付着末端や、平滑末端を利用する方法にくらべ、迅速で簡便であるという利点があり、従来の方法に加えて頻繁に利用される方法のひとつとなっている。この方法は付着末端を用いる方法のカテゴリーに分類されるが、手法的には特許文献１及び２の時代にはなかった方法である。
この発明に用いられているベタインの高濃度溶液は、−２０℃〜−３０℃での保存で凍結しにくいことが分かっている。しかし、その凍結しにくい濃度は４Ｍ以上と、かなり飽和濃度に近く、現実的な濃度とはいえない。実際に、その濃度でＤＮＡリガーゼ反応組成物を調製した場合、ライゲーション反応が阻害されてしまうことが我々の検討で明らかになっている。
【特許文献３】特開２００６−２５６３７
【００１０】
上記をまとめると、様々な添加剤の検討を行われてきたが、ほとんどが使用時に添加するものであり、かつライゲーションの効率を向上させる目的で検討されているようである。また、それらを添加した状態でのライゲーション効率や液の形状（凍結するか否か）については、ほとんど検討されていない。また、我々の事前の調査から、上記発明を用いても−２０℃〜−３０℃保存で凍結せず、かつ実際の１液タイプのライゲーション試薬として使用できる発明は皆無であると考えられた。
【００１１】
よって、本発明においては、様々な添加剤を加えたリガーゼ組成物（ＤＮＡ成分のみ添加せず）を調製し、−３０℃保存で凍結するか否かに加え、反応効率についても検討をおこなった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、添加剤を検討し、−３０℃保存で少なくとも一週間凍結しないリガーゼ組成物、および使用方法を提供することである。また、それらを含有する試薬・キットおよび製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
今まで様々なライゲーションの効率化方法や１液試薬の検討がなされてきたが、上でも述べたように、ライゲーション組成物の保存方法や液状形状（すなわちマイナス温度で液状を保つ）についての検討は皆無であるといえる。
【００１４】
よって、本発明においては、様々な添加剤を用いて、液の形状とＤＮＡの連結効率について評価を行った。今回、主に−３０℃で凍結しない性質について調べたが、これは一般手Ｋに用いられている−２０℃のフリーザーでの長期保存を念頭においたためである。
【００１５】
様々な条件を検討した結果、ベタインとグリセロールを共存させることで、少なくとも−３０℃で一週間凍結せず、かつ効率を保つ組成を見出すことができた。
【００１６】
本発明は以下の構成からなる。
［項１］−３０℃保存で少なくとも１週間凍結しない、ＤＮＡリガーゼ反応組成物
［項２］ベタイン及びグリセロールを含有する、項１に記載のＤＮＡリガーゼ反応組成物
［項３］２Ｍ以上のベタイン及び５％（Ｖ／Ｖ）以上のグリセロールを含有する、項２に記載のＤＮＡリガーゼ反応組成物
［項４］項１に記載の組成物を用いてリガーゼ反応を行う、ライゲーション反応方法。
［項５］項１に記載の組成物を含有する試薬および／またはキット。
［項６］項１に記載の組成物を１液で供給することを特徴とする、試薬および／またはキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、リガーゼ活性を低下させない温度（すなわち−２０℃〜−３０℃保存）で凍結しない１液タイプのＤＮＡリガーゼ反応組成物を供給できるようになる。使用に当たっての煩雑性を低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、−３０℃保存で少なくとも１週間凍結しないことを特徴とする、ＤＮＡリガーゼ反応組成物である。ここでいうリガーゼ反応組成物とは、ＤＮＡ成分のみを含まない、リガーゼ反応に必要な成分を含む組成物を指す。
【００１９】
ＤＮＡリガーゼ反応組成物の保存容器としては、特に限定されないが、一般的に用いられるプラスチック製のチューブやボトル類が好ましく用いられる。更に好ましくは、ポリプロピレン製のチューブやボトル類が用いられる。実際に、本発明においては、ポリプロピレン製の１．５ｍｌマイクロチューブを用いて検討を行った。
【００２０】
本発明におけるＤＮＡリガーゼ反応組成物は、ベタイン及びグリセロールを含有する。グリセロールは、別名グリセリン。ベタインはトリメチルグリシンを指す。本発明は、好ましくは、２Ｍ以上のベタイン及び５％（Ｖ／Ｖ）以上のグリセロールをＤＮＡリガーゼ反応組成物である。さらに好ましくは、２〜２．５Ｍベタイン、５〜１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロールが用いられる。
【００２１】
ここで言うＤＮＡリガーゼ反応組成物は、連結させたいＤＮＡ溶液と任意の比率で混合して連結反応（ライゲーション反応）を起こさせる組成物を指し、その組成物は１液から校正される。その混合比率は特に限定されないが、ＤＮＡ：組成物比が、１：４〜１：０．５の間で用いられることが好ましく、さらに好ましくは、１：２〜１：０．５で用いられる。よって、実際の反応を行う溶液中でのベタインやグリセロールの濃度は混合比率によって変化する。例えば、２Ｍベタインを含む反応組成物を１：１の混合比率でＤＮＡ溶液と混合した場合、反応時のベタイン濃度は１Ｍとなる。０．５：１の場合は、０．３３Ｍとなる。
【００２２】
本発明においてＤＮＡリガーゼの種類は、特に限定されるものではないが、好ましくはＴ４ファージ由来のＴ４ ＤＮＡ リガーゼを用いる。この酵素は、ファージを感染させた大腸菌の破砕物から調製したものや、Ｔ４ファージのリガーゼ遺伝子を大腸菌に組み換えて発現させ、その破砕物から調製されたものなど様々なものを用いることができる。特に、ＤＮＡ分解酵素などの混入の少ない高純度の高度を用いることが重要である。
【００２３】
本発明における-30℃でのDNAリガーゼ反応組成物の保存方法は一般的な研究室でしようされているフリーザーを用いることができる。本発明においては、三洋電機社製のフリーザー（ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＦＲＥＥＺＥＲ ＭＤＦ−Ｕ５３７（商標））を−３０℃に設定して用いたが、同等の性能を示すフリーザーであれば特に限定されない。凍結試験時には極力温度変化を少なくするために、ドアの開閉を極力少なくする必要があり、必要に応じて温度を定期的にモニターしても良い。また、冷気の噴出し口やファンの近くは設定温度よりも温度が低下する可能性があり、正確な評価ができないので、気をつける。
【００２４】
本組成物に含まれる成分は、ライゲーション反応の必須成分、バッファー・塩成分に加えて、様々な添加剤を加えてよい。必須成分としては、ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、及びマグネシウム、バッファー・塩成分としては、バッファー、塩化ナトリウムなどの塩、及び還元剤などを挙げることができるが、限定されるものではない。
【００２５】
本発明においてＤＮＡリガーゼの種類は、特に限定されるものではないが、好ましくはＴ４ファージ由来のＴ４ ＤＮＡ リガーゼを用いる。この酵素は、ファージを感染させた大腸菌の破砕物から調製したものや、Ｔ４ファージのリガーゼ遺伝子を大腸菌に組み換えて発現させ、その破砕物から調製されたものなど様々なものを用いることができるが、高度に精製された高純度のものを用いることが重要である。特に、ＤＮＡ分解酵素などの混入の少ないものを用いることが重要である。
【００２６】
本発明に用いられるＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）は、アデノシンのリボースの５’位の水酸基にリン酸が３分子連続して結合したヌクレオチドのことを指す。ＡＴＰの濃度としては、反応時の濃度として、０．０１〜０．２ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．０２〜０．１ｍＭが好適に用いられる。
【００２７】
本発明に用いられるマグネシウムは、様々な塩を用いることができ、特に限定されない。好ましくは、塩化マグネシウムを用いる。塩化マグネシウムの濃度は、反応時の濃度として、１〜１０ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、２〜４ｍＭが好適に用いられる。
【００２８】
緩衝液成分はｐＨを至適条件に保つのに重要である。Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼの反応は、ｐＨ７．５前後が最も至適とされており、ｐＨ７．５前後のｐＨを保つことのできるバッファー成分を含むことが好ましい。バッファーとしては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液やＨＥＰＥＳ緩衝液が好適に用いられる。特に、トリス−塩酸緩衝液が最も好ましい。緩衝液の濃度は、反応時の濃度として、１０〜１００ｍＭが好適に用いられるが、２０〜５０ｍＭが用いられる。
【００２９】
塩成分としては、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの一般的なアルカリ土類金属の塩を用いることができる。特に、塩化ナトリウムが好適に用いることができる。塩化ナトリウムの濃度は、反応時の濃度として、１０〜１００ｍＭが好適に用いられ、特に、好ましくは２０〜５０ｍＭが用いられる。
【００３０】
還元剤成分としては、２−メルカプトエタノールやジチオスレイトール（ＤＴＴ）など、一般的に生化学実験で用いられている還元成分を用いることができ、特に限定されない。特に好ましくは、還元維持能力の高いＤＴＴが用いられる。ＤＴＴの濃度は、反応時の濃度として、０．５〜１０ｍＭが好適に用いられる。特に好ましくは、１〜５ｍＭが用いられる。
【００３１】
本発明における添加剤としては、ポリエチレングリコール、スペルミジン、ベタイン、及びグリセロールなどを挙げることができるが、限定されるものではない。上で述べたようにポリエチレングリコール、スペルミジン、ベタインは、ライゲーション反応の効率を向上させることのできる成分である。
【００３２】
本発明におけるポリエチレングリコールは、様々な分子量のものを使用することができるが、好ましくは分子量が２００−２０，０００、好ましくは５，０００−１０，０００、最も好ましくは６，０００を用いる。ポリエチレングリコールの濃度は、反応時の濃度として、０．５〜３％（Ｗ／Ｖ）が好ましく用いられる。最も好ましくは０．７５〜１．５％の濃度で使用するのが良い。
【００３３】
本発明におけるスペルミジンは、ポリアミンの一種であり、様々な由来のものが販売されているが起源は特に限定されない。スペルミジンの濃度は、反応時の濃度として、０．１〜１０ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．５〜２ｍＭで使用するのが良い。
【００３４】
本発明におけるベタインは、具体的にはトリメチルグリシンを指す。この分子は、グリシンのアミノ基にメチル基が３つ結合した構造を持つ。ベタインの濃度としては、反応時の濃度として、０．１〜１．５Ｍが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．５〜１．２５Ｍが好適に用いられる。さらにベタインは、ライゲーション反応組成物の凍結を妨げる成分であり、反応組成物中で２．５〜３Ｍの濃度で用いることが好ましい。
【００３５】
また本特許は、上記組成物を用いてリガーゼ反応を行うことを特徴とする、ライゲーション反応方法をも含むものである。
【００３６】
具体的には、上記組成物に連結させたいＤＮＡ断片を混合し、反応させる。ＤＮＡ断片は、基本的には２本鎖であり、末端が相補的である必要がある。様々なパターンの連結反応が予想されるが、大きく分けると、突出末端を有するＤＮＡ同士、及び平滑末端を有するＤＮＡ同士の連結が考えられる。突出末端には、５’側のＤＮＡ鎖の突出したものと、３’側のＤＮＡ鎖の突出したものの２種類が考えられる。それらの多くは、制限酵素によって作り出される末端である。一方、平滑末端を有する断片は、末端の配列に関わらず連結することが可能である。
【００３７】
また、ＤＮＡポリメラーゼの作用により作り出される、３’末端にアデニンが一塩基基突出したＤＮＡ断片を、３’側にチミンが一塩基基突出したベクター（Ｔベクター）に連結するクローニング方法（ＴＡクローニング）が近年盛んに行われるようになっている。この方法にも本発明を用いることができる。
【００３８】
上でも述べたが、リガーゼによる連結反応が生じるには、ＤＮＡの５’側の末端がリン酸化されている必要がある。２本鎖の連結が連結されるには、最低片方の鎖が連結される必要がある（片方のみが連結された場合は、もう片方は連結されないが、ＤＮＡ断片としては連結されたことになる）。少なくとも片方のＤＮＡ断片の５’末端がリン酸化されていることが、２本鎖ＤＮＡの連結反応には必要である。多くの場合、片方だけが連結されたＤＮＡは、大腸菌などへ導入すると、大腸菌の修復機構で連結されることが知られている。
【００３９】
本発明は、上記組成物を含有する試薬・キットにも関する。
【００４０】
また、本発明の実施の一態様としては、ＤＮＡ以外のライゲーション反応に必要な上述の成分を含む１液のライゲーション試薬を挙げることができる。
【実施例】
【００４１】
以下に本発明の実施例を挙げることにより、本発明による効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
【００４２】
実施例１：添加剤の効果の検討（ＴＡクローニングによる評価）
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ 塩化マグネシウム（ナカライテスク製）、０．１ｍＭ ＡＴＰ（東洋紡製）、４ｍＭ ＤＴＴ（ナカライテスク製）、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ナカライテスク製）、２．５％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ６，０００、１ｍＭ スペルミジン、０．１Ｕ／μｌ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（東洋紡製）からなる基本組成に、表１に示す様々な添加剤を添加したＤＮＡリガーゼ反応組成物を調製した。調製したＤＮＡリガーゼ組成物（200μl）を−３０℃に設定した冷凍庫（三洋電機社製ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＦＲＥＥＺＥＲ ＭＤＦ−Ｕ５３７（商標））で１ヶ月保存した後、以下の方法を用いてＴＡクローニング効率の評価を行った。ＤＮＡリガーゼ反応組成物の保存は、ポリプロピレン製の１．５ｍｌマイクロチューブ（エッペンドルフ社製）を用いた。また同時に、保存期間中の各組成物の、凍結の有無についての確認を行った。
ＴＡクローニングする挿入ＤＮＡはＰＣＲ法を用いて調製した。具体的には、２種類のプライマー（５’−ＧＡＴ−ＧＡＧ−ＴＴＣ−ＧＴＧ−ＴＣＣ−ＧＴＡ−ＣＡＡ−ＣＴ−３’、および：５’−ＧＧＴ−ＴＡＴ−ＣＧＡ−ＡＡＴ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−ＣＡＧ−ＣＧＣ−Ｃ−３’）を使用し、λファージＤＮＡ（東洋紡製）を鋳型として、ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を準備した（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅したＤＮＡ断片の３’末端には、主にアデニンが一塩基付加されている）。増幅反応は、ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの取扱い説明書に従い、増幅後、１％アガロースゲルを用いた電気泳動解析でバンドが生じていることを確認した。増幅したＤＮＡ断片は、精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ −ＰＣＲ ＆ Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−：東洋紡製）を用いて精製し、濃度測定の後、使用した。
一方、クローニングベクターは、ＴＡクローニングキット（ＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ：東洋紡製）に添付されているＴベクター（ｐＴＡ２）を用いた。
ライゲーションは、以下のように実施した。上記ＤＮＡ断片（７５ ｆｍｏｌ）とベクター（２５ ｆｍｏｌ）を溶解した７．５μｌの溶液に、上記リガーゼ反応組成物７．５μｌを添加し、１６℃で３０分間反応させ実施した。
評価は、連結産物でＤＨ５αを形質転換し、生じてくるコロニー数で評価を行った。今回用いたｐＴＡ２ベクターは、目的ＤＮＡが挿入された場合、Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で白いコロニーを形成し、目的ＤＮＡが挿入されなかった場合は青いコロニーを形成する性質を有している。
形質転換は、具体的には、以下のように実施した。すなわち、連結反応の終了したベクター溶液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡製）１００μｌと混和後、氷上に３０分間放置した後、４２℃で３０秒間ヒートショックを行い、その一部を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）、及び０．２５％Ｘ−Ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ナカライテスク製）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１６時間培養した後、生じたコロニー数をカウントした。結果を表１に示した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
結果、基本組成に加えて、３Ｍベタイン、２．５Ｍベタイン＋５％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、及び２．５Ｍベタイン＋１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロールを添加剤として添加した組成物は、−３０℃で少なくとも一週間凍結せず、かつ高効率でＴＡクローニング可能であることが明らかとなった。
３Ｍベタインは、−３０℃で１ヶ月では凍結した。
一方、酵素の保存などでよく用いられる５０％グリセロールは、凍結しないがリガーゼ反応を阻害することが分かった。
また、２．５Ｍベタイン＋５％グリセロール、及び２．５Ｍベタイン＋１０％グリセロールを添加したリガーゼ組成物は、−３０℃・１ヶ月の保存でも凍結しないことが分かり、試薬としてより有望であることが明らかとなった。
上の検討では、ＤＮＡ溶液７．５μｌに対して、リガーゼ組成物を等量の７．５μｌ添加して行ったが、半量の３．７５μｌを用いてもほぼ同等のクローニング効率が得られることも確認した。
また、本実施例では示さなかったが、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの切断によって生じる突出末端を用いたライゲーション実験、及びＨｉｎｃ ＩＩによる切断によって生じる平滑末端を用いたライゲーション実験においても実証実験を行っており、高い効率を示すことを確かめている。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
分子生物学実験に用いられるライゲーション試薬・キットに好適に用いられる。特に、１液タイプの高効率ライゲーション試薬・キットは幅広く実験に用いられているものであり、本技術を用いることにより利便性の向上は、産業上の大きな進歩であると考えられる。また、臨床用途などについても好適に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−３０℃保存で少なくとも１週間凍結しない、ＤＮＡリガーゼ反応組成物
【請求項２】
ベタイン及びグリセロールを含有する、請求項１に記載のＤＮＡリガーゼ反応組成物
【請求項３】
２Ｍ以上のベタイン及び５％（Ｖ／Ｖ）以上のグリセロールを含有する、請求項２に記載のＤＮＡリガーゼ反応組成物
【請求項４】
請求項１に記載の組成物を用いてリガーゼ反応を行う、ライゲーション反応方法。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を含有する試薬および／またはキット。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物を１液で供給することを特徴とする、試薬および／またはキット。
【請求項１】
−３０℃保存で少なくとも１週間凍結しない、ＤＮＡリガーゼ反応組成物
【請求項２】
ベタイン及びグリセロールを含有する、請求項１に記載のＤＮＡリガーゼ反応組成物
【請求項３】
２Ｍ以上のベタイン及び５％（Ｖ／Ｖ）以上のグリセロールを含有する、請求項２に記載のＤＮＡリガーゼ反応組成物
【請求項４】
請求項１に記載の組成物を用いてリガーゼ反応を行う、ライゲーション反応方法。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を含有する試薬および／またはキット。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物を１液で供給することを特徴とする、試薬および／またはキット。
【公開番号】特開２００８−２７１８３４（Ｐ２００８−２７１８３４Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１８４２６（Ｐ２００７−１１８４２６）
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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