分光画像化顕微鏡法
（ａ）サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；（ｂ）対物レンズシステムから受光された集光された光の一部を入力光として通過させるよう位置決めされる第１のアパーチャ；（ｃ）第１のアパーチャから受光された入力光を透過するよう位置決めされる第１のレンズ；（ｄ）第１のレンズから受光された入力光を第１の面で空間に分散させるよう構成される分散素子；（ｅ）空間に分散した光を透過するよう位置決めされる第２のレンズ；（ｆ）第２のレンズから受光された、空間に分散した光の一部を、検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および（ｇ）検出光を受光するよう位置決めされ、サンプルの、少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含む、システムがここに開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は顕微鏡画像化に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
顕微鏡画像化は、電磁スペクトルの紫外線領域、可視領域および／または赤外線領域において光を発光または減衰するサンプル、たとえば生体サンプルなどを調査するために広く用いられる。単純なフィルタ、たとえば干渉フィルタなどは、スペクトルの特定の領域内に光を落とすよう制限するために、サンプルによって発光された光をフィルタ処理するために用いることができる。発光のフィルタ処理によって、ある対象のサンプル特徴を分離し調査することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
分光画像化顕微鏡法のためのシステムおよび方法がここに開示される。このシステムは波長調整可能であり、選択された中心波長でスペクトルバンドに基づき、選択されたスペクトルバンド幅を有する、サンプル画像を得ることができるように、サンプルによって発光された光のスペクトルのフィルタ処理を提供することができる。１つ以上の分散光学素子が、レンズおよびアパーチャとの組合せで、スペクトルのフィルタ処理能力を提供する。分散光学素子、レンズおよびアパーチャは、サンプル画像を測定するよう構成される１つ以上の検出器に光学的に結合される。このシステムは広範囲の中心波長を介して調整可能であり、アセンブリのスペクトルバンド幅はアパーチャ開口部のサイズの変更により調整することができる。比較的狭いスペクトルバンド幅を維持し、異なる中心波長で多数のサンプル画像を得ることによって、波長依存型の分光画像化を実現することができる。
【０００４】
分光画像化法には多数の用途がある。たとえば、分光技術は、異なる蛍光性および／または燐光性スペクトル標識付け部分を含む生体サンプルおよび／またはスペクトルにおいて異なる吸収体に関する研究に適用することができる。たとえば、異なる標識付け部分は、サンプル内の選択される生体構造と結合するか、またはサンプルのさまざまな部分において異なるように発現され得、分光画像化法はこれらの標識付け部分がサンプル内にどのように分布するかを識別するために用いることができる。これらの標識付け部分が具体的に特定の生体（たとえば細胞）構造に結合する場合、たとえば、ここに開示されるシステムおよび方法は、サンプルの選択される領域の構造および機能を調査するために用いることができる。別の例として、開示されるシステムが、複数のサンプル画像を異なる中心波長で得るよう構成される場合、それら複数のサンプル画像を解析し、ｉｎ ｓｉｔｕのサンプル成分の吸収スペクトル、反射スペクトル、発光スペクトル、ルミネセンススペクトルおよび散乱光スペクトルのようなサンプル特性を、判断することができる。
【０００５】
一般に、１つの局面では、この開示は、（ａ）サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；（ｂ）対物レンズシステムから受光された集光された光の一部が入力光として通過するよう位置決めされる第１のアパーチャ；（ｃ）第１のアパーチャから受光された入力光を透過するよう位置決めされる第１のレンズ；（ｄ）第１のレンズから受光された入力光を第１の面で空間に分散させるよう構成される分散素子；（ｅ）空間に分散した光を透過するよう位置決めされる第２のレンズ；（ｆ）第２のレンズから受光された、空間に分散した光の一部を、検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および（ｇ）検出光を受光するよう位置決めされ、サンプルの、少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含むシステムを特徴とする。入力光は分散素子の第１の表面に入射し、空間に分散した光は第１の表面を通って分散素子を出る。第１の面において測定される、入力光の主要な伝搬方向と第１の表面に対する法線との間の角度は、第１の角度に対応し；第１の面において測定される、空間に分散した光の主要な伝搬方向と第１の表面に対する法線との間の角度は、第２の角度に対応し；第１の角度と第２の角度との間の差は１０度未満である。
【０００６】
このシステムの実施例は、次の特徴の１つ以上を含むことができる。
動作中、空間に分散した光のうち、第２のアパーチャによって通過することを許される部分の中心波長は、分散素子の位置を変更することにより選択することができる。このシステムは、分散素子の位置の変更により、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分の中心波長を選択するよう構成される電子プロセッサを含むことができる。
【０００７】
第１のレンズは入力光を第１の表面上にフォーカスさせるよう構成することができる。第１および第２のアパーチャは、各々、円形の開口部を含むことができる。このシステムは、第２のアパーチャの寸法を調整することにより、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分の半値全幅（ＦＷＨＭ）スペクトルバンド幅を選択するよう構成される電子プロセッサを含むことができる。電子プロセッサは、ＦＷＨＭスペクトルバンド幅を２ｎｍと３０ｎｍとの間の値に調整するよう構成することができる。
【０００８】
サンプルは第２の面に位置決めされることができ、第１の表面は第３の面に位置決めされることができ、検出器は第４の面に位置決めされることができ、第２、第３、および第４の面は光学的に共役面である。第１のアパーチャは第２の面に位置決めされることができ、第２のアパーチャは第３の面に位置決めされることができ、第２および第３の面は光学的に共役面である。
【０００９】
分散素子は、回折格子、プリズムおよび格子プリズムからなる群から選択される少なくとも１つの素子を含むことができる。第１の角度は３０度未満であることができる。
【００１０】
このシステムは、検出器に結合される電子プロセッサを含むことができ、電子プロセッサは、サンプルの複数の画像を得るよう構成され、複数の画像の各画像は、空間に分散した光の、異なる中心波長に対応する。電子プロセッサは、複数の画像の少なくとも１つを表示するよう構成することができる。電子プロセッサは、複数の画像の少なくとも２つの画像からの情報を組み合わせることにより合成画像を形成するよう構成することができる。
【００１１】
第１のレンズは第１の表面上にサンプルを結像するよう構成することができる。第２のアパーチャは複数の開口部を含むことができ、空間に分散した光の、異なる部分が、開口部の各々を通過する。空間に分散した光の、異なる部分の各々は、検出器によって受光され、サンプルの、異なる画像を形成するために用いることができる。
【００１２】
第１の角度および第２の角度の各々は３０度以下であることができる。第１および第２のレンズの少なくとも１つは湾曲したミラーを含むことができる。第１のレンズは湾曲したミラーを含むことができる。第２のレンズは湾曲したミラーを含むことができる。
【００１３】
第２のアパーチャでの、空間に分散した光は、色収差が実質的にない状態であることができる。分散素子は、プリズム、およびプリズムの表面と接触するミラーを含むことができる。
【００１４】
このシステムの実施例は、さらに、適切なように、ここに開示される他の特徴のいずれでも含むことができる。
【００１５】
別の局面では、この開示は、（ａ）サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；（ｂ）対物レンズシステムから受光された集光された光の一部を透過光として通過させるよう位置決めされる第１のアパーチャ；（ｃ）透過光の一部を入力光として反射するよう位置決めされる、部分反射型ミラー；（ｄ）部分反射型ミラーから受光された入力光を、第１の面で空間に入力光を分散させるよう構成される分散素子に向けるよう位置決めされ、分散素子から受光された、空間に分散した光を、部分反射型ミラーに向けるよう位置決めされる、レンズ；（ｅ）部分反射型ミラーによって透過された、空間に分散した光の一部を、検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および（ｆ）検出光を受光するよう位置決めされ、サンプルの、少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含むシステムを特徴とする。入力光は分散素子の第１の表面に入射し、空間に分散した光は第１の表面を通って分散素子を出る。第１の面において測定される、入力光の主要な伝搬方向と第１の表面に対する法線との間の角度は、第１の角度に対応し；第１の面において測定される、空間に分散した光の主要な伝搬方向と第１の表面に対する法線との間の角度は、第２の角度に対応し；第１の角度と第２の角度との間の差は１０度未満である。
【００１６】
このシステムの実施例は、次の特徴の１つ以上を含むことができる。
動作中、空間に分散した光のうち、第２のアパーチャによって通過することを許される部分の中心波長は、分散素子の位置を変更することにより選択することができる。このシステムは、分散素子の位置の変更により、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分の中心波長を選択するよう構成される電子プロセッサを含むことができる。
【００１７】
レンズは湾曲したミラーを含むことができる。分散素子は、プリズム、およびプリズムの表面と接触するミラーを含むことができる。
【００１８】
このシステムは、第２のアパーチャの寸法を調整することにより、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分の半値全幅（ＦＷＨＭ）スペクトルバンド幅を選択するよう構成される電子プロセッサを含むことができる。
【００１９】
サンプルは第２の面に位置決めされることができ、第１の表面は第３の面に位置決めされることができ、検出器は第４の面に位置決めされることができ、第２、第３、および第４の面は光学的に共役面である。第１のアパーチャは第２の面に位置決めされることができ、第２のアパーチャは第３の面に位置決めされることができ、第２および第３の面は光学的に共役面である。
【００２０】
このシステムの実施例は、さらに、適切なように、ここに開示される他の特徴のうちのいずれでも含むことができる。
【００２１】
さらなる局面では、この開示は、（ａ）サンプルから分散光学素子に光を向け、入射光を第１の面で分散させて、分散光学素子から発光された、空間に分散した光を形成するステップ；（ｂ）空間に分散した光を、アパーチャ上に入射するよう向けるステップ；（ｃ）空間に分散した光のうち、アパーチャを通過する部分を検出するステップ；および（ｄ）検出された光に基づいてサンプルの画像を形成するステップを含む方法を特徴とする。サンプルからの光は、分散光学素子の表面に、第１の面で測定された、表面法線に関して第１の角度で入射し；空間に分散した光は、分散光学素子の表面を、第１の面で測定された、表面法線に関して第２の角度で出；第１の角度と第２の角度との間の差は１０度以下である。
【００２２】
この方法の実施例は、次の特徴の１つ以上を含むことができる。
この方法は、空間に分散した光のうち、アパーチャを通過する部分の中心波長を選択するよう、分散光学素子の位置を調整するステップを含むことができる。この方法は、空間に分散した光のうち、アパーチャを通過する部分のスペクトルバンド幅を選択するよう、アパーチャの寸法を調整するステップを含むことができる。
【００２３】
この方法は、各画像が異なる中心波長に対応する、サンプルの複数の画像を形成するステップを含むことができる。この方法は、複数の画像から導出される情報に基づいて、サンプル中の成分のスペクトルの少なくとも一部を判断するステップを含むことができ、そのスペクトルは、成分の吸収スペクトル、反射スペクトル、発光スペクトル、ルミネセンススペクトルおよび散乱光スペクトルの少なくとも１つを含む。
【００２４】
この方法の実施例は、さらに、適切なように、ここに開示される他の特徴または方法ステップのうちのいずれでも含むことができる。
【００２５】
この開示の目的のために、レンズは、レンズに入射する光線をフォーカスまたはデフォーカスさせるあらゆる光学素子を含むことができる。例示的なレンズは、透過型凹レンズ、透過型凸レンズ、複数の光学部品から形成される透過型複合レンズ、たとえば凹面の湾曲したミラーなどの反射型凹レンズ、たとえば凸面の湾曲したミラーなどの反射型凸レンズ、および入射する光線をフォーカスまたはデフォーカスするようともに機能する複数の構成要素を含むレンズシステムを含む。
【発明の効果】
【００２６】
実施例は、次の利点の１つ以上を含むことができる。
ここに開示されるシステムは、たとえば顕微鏡画像化などの高倍率でのサンプル画像化を可能にし、サンプル画像が得られる波長、および画像を形成するために用いられる検出される光の帯域のスペクトル幅は、迅速かつ単純な態様で選択可能である。たとえば、このシステムは、分散素子、たとえば回折格子またはプリズムなどを含み、分散素子の位置を変更することによって（たとえば分散素子を回転させることによって）、検出器によって検出される光のスペクトルバンドの中心波長を、高い信頼性で選択することができる。別の例として、このシステムは調整可能なアパーチャを含み、アパーチャの開口部のサイズ（たとえば最大寸法のような寸法）の変更によって、光のスペクトルバンドの帯域幅を高い信頼性で選択することができる。光の検出される帯域幅の中心波長およびスペクトル幅の選択は、システムオペレータによって手動で、または自動的に（たとえば電子プロセッサによって）行なうことができる。
【００２７】
ここに開示されるシステムは、色収差および他の画像化アーティファクトがないサンプル画像を得るよう構成することができる。たとえば、いくつかの実施例では、このシステムは、システムの入口アパーチャがシステムの出口アパーチャ上に結像されるように、構成される。そのような構成は、そうでなければ（たとえば口径食のため）光のアパーチャの通過から生ずるかもしれない画像誤差を低減または除去するのを支援する。ある実施例では、このシステムは、分散素子上の光の入射角と空間に分散した光が分散素子から出る角度とが等しい（またはほとんど等しい）ように構成される。角度間のこの関係の維持により、測定された画像中の色収差を低減または除去することができる。
【００２８】
このシステムは、サンプルの測定された画像におけるすべての点で同様の空間分解能を提供するよう構成することができる。たとえば、このシステムは、円形の入口アパーチャおよび出口アパーチャを含むことができ、それらは、全体のシステムの開口数−およびしたがって空間分解能−が像平面中の各点で同じであることを保証する。
【００２９】
ここに用いられる技術用語および科学用語は、他の態様で定義されない限り、すべて、この開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載されるものに類似または等価である方法および材料をこの開示の実施または試験で用いることができるが、好適な方法および材料を以下に述べる。ここに言及されたすべての出版物、特許出願、特許、および他の参照は、その全体をここに引用により援用する。対立の場合には、明細書が、定義を含んで、参照されることになる。さらに、材料、方法および例は、例示的であるのみであり、限定的であるようには意図されない。
【００３０】
１つ以上の実施例の詳細を、添付の図面および記載において述べる。他の特徴および利点は、記載、図面および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】分光画像化顕微鏡システムの概略図である。
【図２】分光画像化顕微鏡の実施例の側面図の概略図である。
【図３】図２の顕微鏡の上面図を示す概略図である。
【図４】顕微鏡アパーチャの直径の関数としての、検出器によって検出される光のスペクトルバンド幅のグラフである。
【図５】顕微鏡の空間分解能を評価するために用いられるテストパターンの画像である。
【図６】異なる開口径に対応する図３のテストパターンを介する一連のライン走査を示すグラフである。
【図７】分光画像化顕微鏡の別の実施例の概略図である。
【図８】分光画像化顕微鏡のさらなる実施例の概略図である。
【図９】分光画像化顕微鏡のさらに別の実施例の概略図である。
【図１０Ａ】異なる中心波長で測定されたテストサンプルの画像である。
【図１０Ｂ】異なる中心波長で測定されたテストサンプルの画像である。
【図１０Ｃ】異なる中心波長で測定されたテストサンプルの画像である。
【図１０Ｄ】異なる中心波長で測定されたテストサンプルの画像である。
【図１１Ａ】多数の異なる中心波長で得られたサンプルの画像から判断された、図１０Ａ〜図１０Ｄのサンプルにおける３つの異なるインクの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１１Ｂ】ＵＶ可視分光光度計で測定された図１０Ａの３つのインクの吸収スペクトルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
さまざまな図面中の同様の参照記号は、同様の要素を示す。
【００３３】
ここに開示される分光画像化顕微鏡システムは、サンプルによって発光された光を集光するための素子、発光の波長成分を空間に分散させ選択するための素子、および選択された波長成分を測定するための１つ以上の検出器を含む。これらの素子は、スペクトルでフィルタ処理されたサンプルの画像についての観察および画像化を可能にする。空間に波長成分を分散させ選択する素子は、選択される中心波長および選択される半値全幅（ＦＷＨＭ）帯域幅を有する光波長の特定の帯域幅を１つ以上の検出器に入射させて、サンプル観察および／または画像化を可能にするよう、調整することができる。光波長の適切な帯域の選択によって、サンプル中の特定の検体を、サンプル中の他のスペクトルの寄与物からの干渉なしで調査することができる。顕微鏡の空間分解能および／または視野も、システムの特定の光学素子の変更により調整することができる。
【００３４】
図１は、分光画像化顕微鏡システムの一般的な概略図を示す。システム１０００は、顕微鏡アセンブリ１０１０、対物レンズシステム１０２０、第１のアパーチャ１０３０、第１のレンズアセンブリ１０４０、分散素子１０５０、第２のレンズアセンブリ１０６０、第２のアパーチャ１０７０、検出器システム１０８０、ならびに電子プロセッサ１０９２、制御ユニット１０９４および表示ユニット１０９６を含む、電子処理モジュール１０９０を含む。
【００３５】
顕微鏡アセンブリ１０１０は、レンズ、フィルタ、光源、および顕微鏡システムに典型的な他の素子のようなさまざまな要素を含むことができる。顕微鏡アセンブリ１０１０は、さらに、典型的には、サンプルを支持するよう構成される（１つ以上の方向に並進させることができるステージのような）支持部材を含む。
【００３６】
対物レンズシステム１０２０は、１つ以上の対物レンズ、ならびに窓、フィルタ、ビームスプリッタおよびミラーのような他の光学素子を含むことができる。たとえば、いくつかの実施例では、対物レンズシステム１０２０は単一の対物レンズを含む。一般に、対物レンズシステム１０２０は、サンプルが顕微鏡アセンブリ１０１０に支持される場合に、サンプルから発光される光１１００を集光するよう位置決めされる。
【００３７】
集光された光１１１０は、対物レンズシステム１０２０によって、第１のアパーチャ１０３０を通過するように向けられる。第１のアパーチャ１０３０は、一般的に、空間フィルタとして作用する１つ以上の素子を含むことができ、集光された光１１１０の一部を通過をさせ、集光された光１１１０の一部を遮光することができる。第１のアパーチャ１０３０の開口部のサイズは、典型的には調整可能であり；調整は、システムオペレータによって手動で、または自動的に（たとえば電子プロセッサ１０９２によって）行なうことができる。一般に、第１のアパーチャ１０３０の開口部の形状は、任意の数のサイズの円形、正方形、長方形、正多角形、および不規則な形状の開口部を含む、さまざまな異なる形状のいずれかであることができる。
【００３８】
第１のアパーチャ１０３０を通過する光１１２０は第１のレンズアセンブリ１０４０に入射する。第１のレンズアセンブリ１０４０は、光１１２０を光１１３０として分散素子１０５０上に向ける１つ以上のレンズを含む。第１のレンズアセンブリ１０４０の１つ以上のレンズは、たとえば単一のレンズまたは複数のレンズを含むことができる。１つ以上のレンズは透過型レンズおよび／または反射型レンズ（たとえば湾曲したミラー）であることができる。第１のレンズアセンブリ１０４０は、さらに、一般的に、窓、平面ミラー、ビームスプリッタおよびフィルタのような他の光学素子を含むことができる。いくつかの実施例では、第１のレンズアセンブリ４０は分散素子１０５０の表面上にサンプルを結像するよう構成される。ある実施例では、サンプルは分散素子１０５０の表面上には結像されない。
【００３９】
分散素子１０５０は、光１１３０の波長成分を空間に分散させるよう構成され、透過型および／または反射型回折格子、位相マスク、ホログラフィック光学素子、回折光学素子、プリズム、格子プリズム、光学楔ならびに光学窓のような１つ以上の分散光学部品を含むことができる。分散素子１０５０は、１つ以上の軸のまわりでの分散素子１０５０の回転を可能にする回転マウントに取付けることができる。回転マウントは、たとえば、分散素子１０５０の位置の自動制御および変更を可能にするよう、電動回転アセンブリに結合することができる。
【００４０】
第２のレンズアセンブリ１０６０は、第１のレンズアセンブリ１０４０に関して上で論じられた要素のうちのいずれでも含むことができ；第２のレンズアセンブリ１０６０の素子の数およびタイプは、第１のレンズアセンブリ１０４０と同じであり得、または異なり得る。いくつかの実施例では、単一のレンズアセンブリが、第１および第２のレンズアセンブリ１０４０および１０６０の両方の機能を実行する。たとえば、システム１０００は、ビームスプリッタのような部分反射型素子を含む単一のレンズアセンブリを備えた折り畳まれた構成を有することができる。部分反射型素子は、光１１１０を分散素子１０５０に向けて反射し、空間に分散した光１１４０を透過することができる。
【００４１】
空間に分散した光１１５０は、第２のレンズアセンブリ１０６０によって、第２のアパーチャ１０７０上に入射するよう向けられる。一般に、第２のアパーチャ１０７０は、第１のアパーチャ１０３０に関して上に論じられた、構成要素のいずれでも、および特徴のいずれでも含むことができる。第２のアパーチャ１０７０は１つ以上の開口部を含むことができ、それらの各々は、手動または自動的に調整可能であることができる。典型的には、第２のアパーチャ１０７０は、第１のアパーチャ１０３０が位置決めされる面に光学的に共役である面に位置決めされる。
【００４２】
光１１６０（空間に分散した光１１５０のうち、第２のアパーチャ１０７０を通過する部分）は、検出器１０８０によって検出される。検出器１０８０は、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤアレイ、フィルム記録装置およびデジタルフレーム捕捉装置のようなさまざまな検出器の任意の１つ以上を含むことができ、光１１６０の検出に基づいてサンプルの画像を形成するよう構成される。いくつかの実施例では、検出器１０８０は、光１１６０の直接観測（たとえば目による）用の接眼レンズを含むことができる。検出器１０８０は、さらに、光１１６０の一部を接眼レンズに向けるために、付加的なレンズ、ビームスプリッタ、窓、ミラーおよびフィルタのようなさまざまな光学素子を含むことができる。
【００４３】
ある実施例では、光１１６０は複数の部分に分割することができ、それら複数の部分のうちのいくつか（またはすべて）を、異なる検出器によって検出することができる。たとえば、検出器１０８０は、光１１６０を２つ以上の部分に分割する、１つ以上のビームスプリッタを含むことができる。１つの部分は、たとえば、接眼レンズに向けることができ、その結果、システムオペレータはサンプルを直接観察することができる。光１１６０の１つ以上のさらなる部分は、検出された光に基づいてサンプルの画像を形成することができる、１つ以上の検出器（たとえば、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤアレイ、フィルム記録装置およびデジタルフレーム捕捉装置）に向けることができる。
【００４４】
図１に示されるように、いくつかの実施例では、システム１０００は、電子通信線１１７０ａ〜１１７０ｈによってシステム１０００の構成要素のうちのいくつかまたはすべてに接続される電子プロセッサ１０９２によって制御することができる。電子プロセッサ１０９２は、さらに、制御ユニット１０９４に接続されて、ユーザーがプロセッサ１０９２へ命令を送ることを可能し、表示ユニット１０９６に接続されて、電子プロセッサ１０９２が１つ以上の得られた画像を表示することができるようにする。電子プロセッサ１０９２は、いくつかの実施例では、合成情報（たとえば画像）を形成するために複数のサンプル画像からの情報を組み合わせる（たとえば異なる中心波長で得られた異なる画像からの情報を組み合わせる）よう構成されることができる。たとえば、合成画像はプロセッサ１０９２によって表示ユニット１０９６を介して表示することができる。
【００４５】
図ｌは、上に論じられるような、分光画像化顕微鏡システムの一般的な概略図である。この後の議論では、顕微鏡システムの例示的な実施例が示され論じられるが、より一般的には、広範なさまざまな異なる実施例が、図１のシステム１０００の一般的構造にしたがって可能である。
【００４６】
図２は、分光画像化顕微鏡の実施例の側面図の概略図を示す。顕微鏡１０は、サンプル支持体３０（たとえば顕微鏡ステージ）、対物レンズシステム４０、第１のアパーチャ５０、ミラー６０、第１のレンズ７０、ここでは反射型回折格子８０として実施される分散素子、第２のレンズ９０、第２のアパーチャ１００、ならびに検出光学素子１１０および検出器１２０を含む検出器システムを含む。
【００４７】
動作の際、サンプル２０はサンプル支持体３０に位置決めされ、サンプル２０から発光された光１３０は、対物レンズシステム４０によって集光される。発光１３０は、たとえば、サンプル２０によって透過される入射光、サンプル２０中の１つ以上の蛍光性および／または燐光性の標識によって発光された光、サンプル２０によって散乱した光（たとえば光散乱および／またはラマン散乱による）、ならびにサンプル２０の内部および／または外部の他の光源からの光を含むことができる。対物レンズシステム４０は、発光１３０を集光して入力光１４０を形成する。入力光１４０は、サンプル２０の像を搬送するが、それは、入力光１４０がアパーチャ５０を通過するにつれてデフォーカスされ（たとえば部分的または完全にデフォーカスされ）、アパーチャ５０における口径食による画像アーティファクトを確実に低減および／または除去する。この実施例では、アパーチャ５０は調整可能な円形のアパーチャであり、入力光１４０がアパーチャを通過するなか、入力光１４０の一部を遮光するよう調整することができる。たとえば、アパーチャ５０は入力光１４０の縁部からの光を遮光するよう調整することができ、遮光された光は画像アーティファクトおよび／または他の迷光に対応する。より一般的には、アパーチャ５０は、たとえば、所望されるように、円形、楕円形、三角形、正方形、長方形、多角形、不規則な形状、または任意の他の形状の開口部を備えた調整可能な（たとえば手動および／または自動的に）絞りを含むことができる。
【００４８】
入力光１４０はミラー６０によって反射され、第１のレンズ７０に入射する。第１のレンズ７０は焦点距離ｆ１を有し、図２に示される実施例の入力光１４０の光路に沿ってアパーチャ５０から距離ｆ１のところに位置決めされる。第１のレンズ７０は、入力光１４０を、回折格子８０の表面８２上においてフォーカスさせる。回折格子８０は、入力光１４０の波長成分を空間に分散させて、表面８２から反射される、空間に分散した光１５０を形成する。
【００４９】
格子８０は空間に分散した光１５０を第２のレンズ９０上に入射するように向けるよう配向され、第２のレンズ９０は光１５０を検出光学素子１１０上にフォーカスさせる。第２のレンズ９０は焦点距離ｆ２を有し、第２のアパーチャ１００から距離ｆ２のところに位置決めされる。第２のアパーチャ１００は、調整可能な円形のアパーチャであり、典型的には、空間に分散した光の一部だけがアパーチャを通過して検出光学素子１１０に入るよう構成される。空間に分散した光１５０のさまざまな波長成分は、格子８０により、光１５０の横方向プロファイルにおける特定の空間位置上に写像されるので、第２のアパーチャ１００は、光波長の選択された帯域だけが検出光学素子１１０を入ることを許す。一旦、検出光学素子１１０に入ると、第２のアパーチャ１００によって受入れられた光は、検出器１２０によって測定され、それは、スペクトルの波長の受入れられた帯域に対応するサンプル２０の画像を形成する。
【００５０】
第２のアパーチャ１００を通過するスペクトルの波長の帯域を選択するために（たとえば帯域の中心波長を選択するために）、回折格子８０は図２の軸８６のまわりを回転する。軸８６は、表面８２の面と平行で、さらに、図２の面と平行である。図２に示される座標軸に関して、軸８６は、格子８０の配向によって、ｙ−ｚ面中のｚ軸に対して、平行であるか、またはある角度で傾いている。
【００５１】
回折格子８０の軸８６のまわりの回転は表面８２の回転を引き起こし、空間に分散した光１５０は、ｘ−ｙ面（たとえば図２の面に垂直な面）において第２のアパーチャ１００の開口部を横切って掃引される。検出器１２０によって画像化される、空間に分散した光１５０の波長の帯域のために特定の中心波長を選択するために、格子８０を、その帯域の中心波長が第２のアパーチャ１００の開口部の上において空間に位置決めされるように、軸８６のまわりで回転させる。いくつかの実施例では、選択された帯域の中心波長が第２のアパーチャ１００の中間点に位置決めされるように、格子８０を軸８６のまわりで回転させる。一般には、しかしながら、中心波長は、空間に分散した光１５０における光のスペクトル分布によって、第２のアパーチャ１００の中間点に位置決めされても、されなくてもよい。
【００５２】
空間に分散した光１５０によって搬送されるサンプル２０の像は、それが図２の第２のアパーチャ１００を通過するにつれ、ちょうど入力光１４０が第１のアパーチャ５０を通過するにつれ、入力光１４０によって搬送されるサンプル２０の像がデフォーカスされるように、デフォーカスされる。その結果、そうでなければ第２のアパーチャ１００における口径食および他の光学的作用により発生するかもしれない画像化アーティファクトを低減および／または除去することができる。
【００５３】
図２では、第１のアパーチャ５０の開口部が第２のアパーチャ１００の開口部の上に結像されるように、第１のレンズ７０および第２のレンズ９０が位置決めされる。言いかえれば、第１のアパーチャ５０および第２のアパーチャ１００は、顕微鏡１０の共役な光学面に位置決めされる。共役な光学面にアパーチャ５０および１００を位置決めすることは、さらに、入力光１４０および空間に分散した光１５０のアパーチャの通過から発生する可能性がある画像化アーティファクトの低減および／または除去を保証するのを支援する。
【００５４】
図２のアパーチャ５０および１００は円形の開口部を有する。円形の開口部の使用は、入力光１４０および／または空間に分散した光１５０によって搬送されるサンプル２０の画像の空間分解能が同様であることを保証するのを支援する。円形の開口部を備えたアパーチャの使用により、顕微鏡１０の開口数は、すべての画像方向（たとえば、像平面を形成する光の伝搬方向に直交する２つの方向）において同じである。その結果、各方向における画像の空間分解能は同じである。
【００５５】
より一般的には、しかしながら、アパーチャ５０および／または１００は、任意の形状の開口部を有することができる。いくつかの実施例では、たとえば、アパーチャ５０および１００のいずれか、または両方は、形状において長方形の開口部、または正多角形の形状を有する開口部を有することができる。開口部は、特定用途に対して望まれるように、同じサイズまたは異なるサイズであることができ、同じ形状または異なる形状を有することができる。
【００５６】
ある実施例では、アパーチャ５０および／または１００は複数の開口部を含むことができる。たとえば、アパーチャ１００は２つ以上の開口部を含むことができ、それらの各々は、異なる中心波長に対応するスペクトルバンドが検出器１２０によって検出されることを可能にする。検出器１２０は、各画像が光の異なる中心波長に対応する、サンプル２０の複数の画像を同時に得るために、多重構成で用いることができる。複数のアパーチャのうちのいくつかまたはすべては調整可能であることができ、その結果、検出器１２０によって検出される異なるスペクトルバンドのいくつかまたはすべてのＦＷＨＭは、特定のサンプルおよび／または実験条件に対して調整することができる。
【００５７】
図２に示される実施例では、サンプル２０の像は、第１のレンズ７０によって格子８０の表面８２上にフォーカスされる。すなわち、サンプル２０は格子８０の上に結像され、その結果、サンプル２０、格子８０および検出器１２０は、顕微鏡１０の共役な光学面にある。より一般的には、いくつかの実施例では、サンプル２０は、第１のレンズ７０によって格子８０の上に結像されない。すなわち、格子８０の表面８２は、サンプル２０および検出器１２０の面に光学的に共役な面に位置決めされない。典型的には、しかしながら、第１および第２のレンズ７０および９０の位置決めは、入力光１４０の光路に沿った第１のレンズ７０と表面８２との間の距離と、空間に分散した光１５０の光路に沿った表面８２と第２のレンズ９０との間の距離との和が、レンズ焦点距離の和ｆ１＋ｆ２に対応するように、行われる。
【００５８】
一般に、レンズ７０および９０の焦点距離ｆ１およびｆ２は、顕微鏡１０の幾何学的および他の制約に従って、所望のように選択することができる。いくつかの実施例では、ｆ１およびｆ２は同じ値を有し、一方、他の実施例では、それらは異なる値を有する。図２に示される実施例では、ｆ１およびｆ２の各々は同じであり、たとえば、３００ｍｍである。一般には、しかしながら、レンズ７０および９０は、広範囲の異なる焦点距離を備えたレンズの中から選択することができる。ｆ１およびｆ２を選択するための主な基準は、顕微鏡１０の幾何学的制約、顕微鏡１０の所望の空間分解能およびスペクトル分解能、ならびに顕微鏡１０の他の要素（たとえば対物レンズシステム４０、回折格子９０、ならびに第１および第２のアパーチャ５０および１００）の光学的特性である。一般に、より長い焦点距離のレンズについては、アパーチャ１００を通過するスペクトルバンドの帯域幅はより小さい。しかしながら、より長い焦点距離が用いられる場合、より大きな径のレンズおよびより大きな分散素子が典型的には必要である。したがって、焦点距離ｆ１およびｆ２の選択は、大部分は、特定の物理的設計嗜好（たとえばあるサイズの装置に対する嗜好）を満たすかどうかの問題である。
【００５９】
図２では、入力光１４０の伝搬方向は入力光１４０の主線（principal ray）と平行である。同様に、空間に分散した光１５０の伝搬方向は空間に分散した光１５０の主線と平行である。さらに、格子の表面８２に対する法線は、図２の表面８２および軸８６の両方に垂直に配向される。ミラー６０、格子８０、ならびにレンズ７０および９０の配向は、入力光１４０が、一般に、図２のｘ、ｙおよびｚ方向のうちのどれとも平行でない方向において表面８２に入射することができるように行われる。一般に、空間に分散した光は、ｘ、ｙおよびｚ方向のうちのどれとも平行でない方向に沿って、表面８２を出ることができる。しかしながら、関与する角度の議論を単純化するために、空間に散乱する光１５０は、図２のｘ−ｙ面において表面８２を出る。
【００６０】
図２では、ｙ−ｚ面上への入力光１４０の主線の投影は、光線１４２として示される。同様に、空間に散乱する光１５０の主線のｙ−ｚ面上への投影は、光線１５２として示される。図２における表面８２の法線のｙ−ｚ面上への投影は、法線投影８４として示される。光線１４２は、ｙ−ｚ面において法線投影８４と角度θ１を形成する。光線１５２は、ｙ−ｚ面において法線投影８４と角度θ２を形成する。つまり、入力光１４０は、表面８２に対する法線に関して、ｙ−ｚ面で測定された角度θ１で格子８０の表面８２に入射する。空間に分散した光は、表面８２に対する法線に関して、ｙ−ｚ面で測定された角度θ２で、格子８０の表面８２を出る。顕微鏡１０は、一般的に、θ１＝θ２であるように構成される。
【００６１】
図２に示される実施例では、角度θ１およびθ２は、各々、約６．２５度である。一般的には、しかしながら、角度θ１およびθ２は、たとえば、顕微鏡１０の形状上の幾何学的制約に基づいて選択することができる。いくつかの実施例では、たとえば、各々の角度θ１およびθ２は、１度以上（たとえば３度以上、５度以上、１０度以上、２０度以上、３０度以上、４０度以上、５０度以上）および／または８９度以下（たとえば８５度以下、８０度以下、７５度以下、７０度以下、６５度以下、６０度以下、５５度以下）であることができる。
【００６２】
格子８０の配向は、空間に分散した光１５０の波長成分が図２のｘ−ｙ面において分散するように行われる。格子８０を軸８６のまわりで回転させることによって、分散したスペクトル成分の特定の帯域を、アパーチャ１００を通過するように向けることができる。図３は、回折格子８０の上面図を示す。図３では、ｘ−ｙ面上への入力光１４０の主線の投影は、光線１４３として示される。同様に、空間に散乱する光１５０の主線のｘ−ｙ面上への投影は、光線１５３として示される。図３において表面８２に対する法線のｘ−ｙ面上への投影は、法線投影８５として示される。光線１４３は、ｘ−ｙ面において法線投影８５と角度θ３を形成する。光線１５３は、ｘ−ｙ面において法線投影８５と角度θ４を形成する。言いかえれば、入力光１４０は、表面８２に対する法線に関して、ｘ−ｙ面で測定された角度θ３で格子８０の表面８２に入射する。空間に分散した光は、表面８２に対する法線に関して、ｘ−ｙ面で測定された角度θ４で格子８０の表面８２を出る。
【００６３】
いくつかの実施例では、顕微鏡１０は、θ３＝θ４であるように構成される。そのような構成は検出器１２０によって得られるサンプル２０の画像中の色収差を低減および／または除去し、なぜなら、入力光１４０および空間に分散した光１５０のさまざまな波長成分の光路は等しいからである。色収差が存在する場合、たとえば、異なる中心波長のサンプル２０の画像は、顕微鏡１０におけるさまざまな波長成分の、異なる光路長により、互いに対して伸張または圧縮され得る。θ３＝θ４の保証によって、異なる中心波長で得られたサンプル２０の画像は、色収差の低減または欠如のため、各々、同じアスペクト比および焦点特性を有することができる。たとえば、θ３＝θ４の時、第２のアパーチャ１００の位置での、空間に分散した光１５０は、色収差が実質的にない状態であることができる。
【００６４】
一般に、角度θ３およびθ４は、同じか、または異なることができる。角度θ３およびθ４の各々は、８９度以下（たとえば８０度以下、７０度以下、６０度以下、５０度以下、４０度以下、３０度以下、２０度以下、１５度以下、１０度以下、５度以下、４度以下、３度以下、２度以下、１度以下、０．５度以下、０．２５度以下、０．１度以下、またはそれ未満）であることができる。いくつかの実施例では、角度θ３とθ４との間の差は、８９度以下（たとえば、８０度以下、７０度以下、６０度以下、５０度以下、４０度以下、３０度以下、２０度以下、１８度以下、１６度以下、１４度以下、１２度以下、１０度以下、８度以下、６度以下、５度以下、４度以下、、３度以下、２度以下、１度以下、０．５度以下、０．２５度以下、０．１度以下、またはそれよりさらに少ない、または０でさえ）あることができる。角度θ３およびθ４が異なる場合、顕微鏡１０は、いくつかの実施例では、空間に分散した光１５０の色収差を低減するために、レンズ、プリズム、窓および他の素子のような追加の光学部品を含むことができる。
【００６５】
ある実施例では、顕微鏡１０は、角度θ３およびθ４が０またはほぼ０である、０次モードで動作させることができる。たとえば、θ３およびθ４の各々は、１０度以下（たとえば８度以下、６度以下、５度以下、４度以下、３度以下、２度以下、１度以下、０．５度以下、０．２５度、０．１度以下、またはそれよりさらに少ない、または０でさえ）あることができる。この動作モードでは、第２のアパーチャ１００を通過する波長のスペクトルバンドは非常に広くなることができ、空間に分散した光１５０のＦＷＨＭスペクトルバンド幅の７０％以上（たとえば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上）に相当し得る。その結果、検出器１２０によって得られるサンプル２０の画像は、入力光１４０のフィルタ処理がない状態で得られる画像にほぼ相当し得る。
【００６６】
一般には、空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅は、第２のアパーチャ１００の開口部のサイズ、回折格子８０の表面８２上の溝の空間密度、ならびに焦点距離ｆ１およびｆ２を含む、複数の要因に依存する。いくつかの実施例では、第２のアパーチャ１００のサイズは、空間に分散した光１５０のうちアパーチャを通過する部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅を変更するよう調整することができる。ある実施例では、たとえば、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅は、１００ｎｍ以下（たとえば７５ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、３５ｎｍ以下、２５ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、４ｎｍ以下、３ｎｍ以下、２ｎｍ以下）であることができる。ある実施例では、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅は、アパーチャの調整により、２ｎｍから５０ｎｍまで（たとえば２ｎｍから４０ｎｍまで、２ｎｍから３０ｎｍまで、２ｎｍから２０ｎｍまで、２ｎｍから１０ｎｍまで）変更することができる。
【００６７】
上で論じられるように、空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分の中心波長は、回折格子８０の配向および特性（たとえば１ミリメートル当たりの溝の数）に依存する。一般に、中心波長は、空間に分散した光１５０のスペクトルバンド幅にある波長のうちの任意の波長から格子８０を回転させることにより選択することができる。顕微鏡１０は、一般的に、電磁スペクトルの紫外線領域、可視領域、赤外線領域を含む（がそれらに限定はされない）広範囲のスペクトルの波長においてサンプル２０から光を集光するよう構成することができる。したがって、格子８０の配向の調整によって、空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分の中心波長を、スペクトルの紫外線領域、可視領域、赤外線領域の波長の中から選択することができる。
【００６８】
検出光学素子１１０は、一般的に、レンズ、ミラー、分散素子（たとえば格子、プリズム）、窓、および空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分を受光し、その光の部分を検出器１２０上に入射するように向けるよう構成される他の素子のような、さまざまな光学素子を含むことができる。検出器１２０は、検出器１２０がサンプル２０の画像を得ることができるように構成される、さまざまな異なるタイプの検出素子の１つ以上を含むことができる。典型的には、たとえば、検出器１２０は、ＣＣＤアレイ、フォトダイオードアレイ、カメラ（たとえばビデオカメラおよび／またはフィルムカメラ）、および感光記録媒体を含む検出器のような１つ以上の画像化検出器を含む。
【００６９】
回折格子８０は、一般的に、さまざまな異なる材料のうちのいずれからでも形成することができる。いくつかの実施例では、たとえば、回折格子８０は、ガラスのような材料から形成され、その上にコーティングが施された基部を含むことができる。コーティングは、入力光１４０の波長成分を効率的に反射する金属（たとえば金、銀またはアルミニウム）のような材料から形成することができる。入力光１４０の波長成分の空間分散を可能にするために、溝がコーティング材に形成される。たとえば、図２では、格子８０には１ｍｍ当たり１２００の溝がある。一般に、格子８０における１ｍｍ当たりの溝の数は、入力光１４０の波長成分の所望の空間分散、所望の反射効率および他の基準によって選択することができる。例示的な格子は、１ｍｍ当たり、３００、６００、９００、１２００、１５００、１８００、２４００または３６００の溝を含むことができるが、１ｍｍ当たりそれより多いおよび／または少ない数の溝が可能である。
【００７０】
顕微鏡１０のさまざまな構成要素は、システムオペレータによって手動で、または自動的に顕微鏡によって調整することができる。たとえば、いくつかの実施例では、顕微鏡１０は、第１および第２のアパーチャ５０および１００、第１および第２のレンズ７０および９０、ならびに回折格子８０を含む顕微鏡１０の構成要素のうちの任意の構成要素に、電子コントローラおよび／または駆動機構を介して結合される電子プロセッサ１６０を含む。電子プロセッサ１６０は、アパーチャ５０および／または１００のどちらかまたは両方の最大寸法を自動的に調整し、入力光１４０および空間に分散した光１５０の光路に沿ってレンズ７０および／または９０の位置を調整し、軸８６に関する回折格子８０の配向を調整するよう（たとえば空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分の特定の中心波長を選択するよう）構成することができる。電子プロセッサ１６０は、さらに、検出器１２０に電気的に結合されることができ、検出器１２０によるサンプル２０の画像の獲得を制御するよう構成することができる。図２に示される実施例では、電子プロセッサは、電気通信線１６２、１６４および１６６を介して、回折格子８０、第２のアパーチャ１００および検出器１２０にそれぞれ結合される。一般に、顕微鏡１０は、電子プロセッサ１６０と顕微鏡のさまざまな構成要素との間に任意の数の接続を含むことができる。
【００７１】
電子プロセッサ１６０は、さらに、得られるサンプル２０の１つ以上の画像を表示するよう構成することができる。たとえば、電子プロセッサ１６０は、顕微鏡１０に含まれる表示ユニットに電気的に接続することができる。代替的に、電子プロセッサ１６０は遠隔表示ユニットに（たとえば無線ネットワーク、有線ネットワークおよび／またはインターネットのようなネットワークによって）接続することができ、たとえば、電子プロセッサ１６０はシステムオペレータへの表示のために遠隔ユニットに画像データを送信することができる。
【００７２】
いくつかの実施例では、電子プロセッサ１６０は、サンプル２０の画像から１つ以上の合成画像を形成するよう構成することができる。たとえば、電子プロセッサ１６０は、異なる中心波長に各々が対応する２つ以上の画像を組み合わせて、サンプル２０における複数のスペクトルの寄与物からの寄与を含む合成画像を形成するよう構成することができる。
【００７３】
顕微鏡１０の性能テストを、第２のアパーチャ１００の最大寸法を変えて、空間に分散した光１５０のうちアパーチャ１００を通過した部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅を測定することにより行った。図４は、第２のアパーチャ１００の開口部の直径（「開口径」）の関数としてのＦＷＨＭスペクトルバンド幅（「バンドパス」）のグラフを示す。図４に示されるように、スペクトルバンド幅はアパーチャ開口部のサイズとほぼ線形に比例し、その結果、ある特定のスペクトルバンド幅を、第２のアパーチャ１００の適切な調整によって、高い信頼性で選択することができる。スペクトルバンド幅は、さらに、表面８２に１ｍｍ当たり異なる数の溝を有する回折格子８０の使用により、および／または異なる焦点距離ｆ２を備えた第２のレンズ９０の使用により、変更することができる。
【００７４】
顕微鏡１０は、さらに、その空間分解能を判断しようと、テストされた。米国空軍（ＵＳＡＦ）１９５１ターゲットを用いて、顕微鏡１０が狭い間隔のテストパターンを解像する能力をテストした。対物レンズシステム４０は、０．５ＮＡの６０ｘ対物レンズを含んだ。ターゲットは、狭い間隔の３本の棒からなり、棒と等しい幅の間隙によって棒が分離されている、棒の組を含んだ。図５は、顕微鏡１０で得られたターゲットの画像を示す。図４において２μｍ間隔の２μｍ幅の棒が容易に解像され、顕微鏡１０の分解能は２μｍよりよいことが示された。顕微鏡１０の空間分解能は、異なる対物レンズシステム４０でさらに改善されてもよい。
【００７５】
顕微鏡１０の空間分解能は、対物レンズシステム４０および第１のアパーチャ５０の組合せの開口数（ＮＡ）に依存する。第２のアパーチャ１００が比較的大きな開口部を有する場合、顕微鏡１０の分解能は対物レンズシステム４０のＮＡによって決められる。第２のアパーチャ１００がより小さな開口部を有する場合、顕微鏡１０の全体的なＮＡおよび分解能は低減され得る。図６は、ＵＳＡＦ１９５１ターゲットにおける３本の棒の群によるライン走査のグラフを示す。ターゲットは、対物レンズシステム４０において０．５ＮＡの５０ｘ対物レンズを用いて結像された。図６の３つのライン走査の各々は、累進的に幅が減じられる一連の棒を介して進み；左から右に、棒幅は３．４７μｍ、３．１１μｍ、２．７６μｍ、２．４６μｍおよび２．１９μｍである。上部のライン走査は、５ｍｍのアパーチャ開口部に対応する。中央のライン走査は、３ｍｍのアパーチャ開口部に対応し、下部のライン走査は、１ｍｍのアパーチャ開口部に対応する。図６が示すように、５ｍｍおよび３ｍｍのアパーチャ開口部では、最も小さな幅の棒さえも基線解像される。しかしながら、１ｍｍのアパーチャ開口部については、棒の間の谷領域の強度は、棒のピーク強度の約６０％であり、低減された空間分解能を反映している。
【００７６】
顕微鏡１０はさまざまな異なる態様で構成することができる。たとえば、図７は、レンズ７０および９０が単一のレンズ７５と取り替えられる顕微鏡１０の別の実施例を示す。ビームスプリッタ６５は入力光１４０をレンズ７５に向け、レンズ７５は、さらに、入力光１４０を回折格子８０上に入射するように向ける。格子８０から反射する、空間に分散した光１５０は、レンズ７５およびビームスプリッタ６５を通過して戻り、第２のアパーチャ１００に入射する。一般に、図７に示されるように、顕微鏡１０のあるレンズは、折り畳まれた構成の採用により除去することができる。
【００７７】
ある実施例では、反射型回折格子以外の分散素子を用いて、入力光１４０の波長成分を分散させることができる。プリズム、ホログラフィック光学素子、格子プリズム、位相マスクおよび透過型回折格子のような分散素子を、回折格子８０に加えて、またはその代替物として用いることができる。図８は、回折格子８０がプリズム８５およびミラー９５の組合せと取り替えられた顕微鏡１０の実施例を示す。顕微鏡１０の他の構成要素は図７と同様である。図８では、プリズム８５は、入力光１４０の波長成分を分散させ、ミラー９５は、プリズム８５を通って２つの経路を形成するよう光を向ける。
【００７８】
いくつかの実施例では、１つ以上のレンズを、同様の機能を実行する湾曲したミラーと取り替えることができる。図９は、レンズ７５が湾曲したミラー７７と取り替えられる以外は、図７に示される実施例と同様である顕微鏡１０の実施例を示す。ミラー７７は、ビームスプリッタ６５によって反射される入力光１４０を受光するよう位置決めされ、入力光１４０を格子８０に入射するように向けるよう構成される。ミラー７７は、さらに、空間に分散した光１５０を格子８０から受光するよう位置決めされ、空間に分散した光１５０を第２のアパーチャ１００上に入射するように向けるよう構成される。図９の顕微鏡１０の他の構成要素は、図７の対応する構成要素と同様である。
【００７９】
顕微鏡１０は、調整可能な空間分解能および／またはスペクトル分解能を備えたサンプル２０の画像化を可能にする。いくつかの実施例では、サンプル２０は、空間に分散した光１５０の異なる中心波長に各々対応する複数の画像を得ることにより画像化することができる。中心波長の適切な選択により、画像を用いて、異なるスペクトルバンドにおいてスペクトル応答を有する他の成分からの干渉なしで、サンプル２０中のある成分（たとえば特定の十分に定義されたスペクトル応答を生じさせる成分）を調査することができる。ある実施例では、異なる中心波長に対応する一連のサンプル画像を用いて、サンプル２０の成分のために、異なるタイプのスペクトル−吸収スペクトル、反射スペクトル、発光スペクトル、ルミネセンススペクトルおよび散乱光スペクトルを含む−を判断することができる。これは、吸収スペクトルが成分の局所的環境によって影響を受ける場合、特に有用であり得る。たとえば、いくつかの実施例では、吸収スペクトルは、異なる中心波長で得られる、サンプルの画像のある領域のみの検査により構築することができる。
【００８０】
顕微鏡１０がサンプル成分の吸収スペクトルを測定する能力を評価するために、合成サンプルを構成した。このサンプルは、赤、緑および青インクの部分が上に引かれたカバーグラスを含んだ。サンプルの画像を得るために、顕微鏡１０を０次モードを動作させ、ついで、異なる中心波長を選択するよう調整した。各選択される中心波長で、サンプルの画像を得た。得られた各画像ごとに、アパーチャ５０および１００を、７．３ｎｍのスペクトル分解能に対応して、３ｍｍに設定した。
【００８１】
合計４６の異なる中心波長が選択され、各中心波長の画像が、３つの異なるインクの各々に対して吸収スペクトルを得るために、異なる空間位置で解析された。図１０Ａ〜図１０Ｄは、さまざまな異なる中心波長でのサンプルの画像を示す。図１０Ａは、０次構成で得られたサンプルの画像であり、サンプルの白色光画像に本質的に対応する。図ｌ０Ｂ〜図ｌ０Ｄは、それぞれ青色インク、緑色インクおよび赤色インクに大まかに対応する、５０５ｎｍ、５７５ｎｍおよび６５０ｎｍの中心波長で得られた画像である。
【００８２】
図１１Ａは、顕微鏡１０を用いて得られた４６の画像から判断された３つのインクの各々の吸収スペクトルを示す。図１１Ｂは、ＵＶ−可視分光光度計で測定された同じ３つのインクの吸収スペクトルを示す。各インクごとに異なる技術で測定されたスペクトル間には、近い対応関係があり、顕微鏡１０は、研究中のサンプルのｉｎ ｓｉｔｕ成分に対して吸収スペクトルを判断するために高い信頼性で用いることができることを示唆している。この能力は特に重要であり、なぜなら、サンプル成分のｉｎ ｓｉｔｕスペクトルの判断は、従来の分光法で対処するのが難しい問題であるからである。同時に、ｉｎ ｓｉｔｕスペクトルの判断は、（たとえば吸収スペクトルは局所的な溶媒環境のような要因により変化し得るため）サンプル成分の化学的環境および／または生体環境に関する情報を提供することができ、サンプルの異なる部分に関する構造的な情報および機能的な情報の両方を判断するのを支援することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
ハードウェアおよびソフトウェア実現例
ここに記載される方法ステップおよび手順は、ハードウェアもしくはソフトウェア、またはそれら両方の組合せで実現することができる。特に、電子プロセッサ（たとえばプロセッサ１０９２および／または１６０）は、上に論じられる方法のうちのいずれかを実行するソフトウェアおよび／またはハードウェア命令を含むことができる。この方法は、ここに開示される方法ステップおよび図に従う標準的なプログラミング技術を用いて、コンピュータプログラムにおいて実現することができる。プログラムコードは、ここに記載される機能を実行するよう入力データに適用される。出力情報は、たとえば遠隔監視のために、プリンタ、表示装置、またはウェブサイトへのアクセスを備えたコンピュータモニタ上のウェブページのような、１つ以上の出力装置に適用される。
【００８４】
各プログラムは、好ましくは、プロセッサと通信するために、ハイレベルプロシージャ言語またはオブジェクト指向型プログラミング言語で実現される。しかしながら、所望であれば、プログラムはアセンブリ言語または機械語で実現することができる。いずれにしても、言語は、コンパイルされた言語か、または解釈された言語であることができる。各コンピュータプログラムは、ここに記載される手順を実行するためにプロセッサを構成し動作させるために、プロセッサによって読取可能な記憶媒体または装置（たとえば電子メモリ）上に格納することができる。
【００８５】
他の実施例
数多くの実施例をここに記載した。しかしながら、さまざまな修正物が開示の精神および範囲から逸脱することなくなされてもよいことが理解されるだろう。したがって、他の実施例は、特許請求の範囲内にある。
【技術分野】
【０００１】
この発明は顕微鏡画像化に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
顕微鏡画像化は、電磁スペクトルの紫外線領域、可視領域および／または赤外線領域において光を発光または減衰するサンプル、たとえば生体サンプルなどを調査するために広く用いられる。単純なフィルタ、たとえば干渉フィルタなどは、スペクトルの特定の領域内に光を落とすよう制限するために、サンプルによって発光された光をフィルタ処理するために用いることができる。発光のフィルタ処理によって、ある対象のサンプル特徴を分離し調査することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
分光画像化顕微鏡法のためのシステムおよび方法がここに開示される。このシステムは波長調整可能であり、選択された中心波長でスペクトルバンドに基づき、選択されたスペクトルバンド幅を有する、サンプル画像を得ることができるように、サンプルによって発光された光のスペクトルのフィルタ処理を提供することができる。１つ以上の分散光学素子が、レンズおよびアパーチャとの組合せで、スペクトルのフィルタ処理能力を提供する。分散光学素子、レンズおよびアパーチャは、サンプル画像を測定するよう構成される１つ以上の検出器に光学的に結合される。このシステムは広範囲の中心波長を介して調整可能であり、アセンブリのスペクトルバンド幅はアパーチャ開口部のサイズの変更により調整することができる。比較的狭いスペクトルバンド幅を維持し、異なる中心波長で多数のサンプル画像を得ることによって、波長依存型の分光画像化を実現することができる。
【０００４】
分光画像化法には多数の用途がある。たとえば、分光技術は、異なる蛍光性および／または燐光性スペクトル標識付け部分を含む生体サンプルおよび／またはスペクトルにおいて異なる吸収体に関する研究に適用することができる。たとえば、異なる標識付け部分は、サンプル内の選択される生体構造と結合するか、またはサンプルのさまざまな部分において異なるように発現され得、分光画像化法はこれらの標識付け部分がサンプル内にどのように分布するかを識別するために用いることができる。これらの標識付け部分が具体的に特定の生体（たとえば細胞）構造に結合する場合、たとえば、ここに開示されるシステムおよび方法は、サンプルの選択される領域の構造および機能を調査するために用いることができる。別の例として、開示されるシステムが、複数のサンプル画像を異なる中心波長で得るよう構成される場合、それら複数のサンプル画像を解析し、ｉｎ ｓｉｔｕのサンプル成分の吸収スペクトル、反射スペクトル、発光スペクトル、ルミネセンススペクトルおよび散乱光スペクトルのようなサンプル特性を、判断することができる。
【０００５】
一般に、１つの局面では、この開示は、（ａ）サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；（ｂ）対物レンズシステムから受光された集光された光の一部が入力光として通過するよう位置決めされる第１のアパーチャ；（ｃ）第１のアパーチャから受光された入力光を透過するよう位置決めされる第１のレンズ；（ｄ）第１のレンズから受光された入力光を第１の面で空間に分散させるよう構成される分散素子；（ｅ）空間に分散した光を透過するよう位置決めされる第２のレンズ；（ｆ）第２のレンズから受光された、空間に分散した光の一部を、検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および（ｇ）検出光を受光するよう位置決めされ、サンプルの、少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含むシステムを特徴とする。入力光は分散素子の第１の表面に入射し、空間に分散した光は第１の表面を通って分散素子を出る。第１の面において測定される、入力光の主要な伝搬方向と第１の表面に対する法線との間の角度は、第１の角度に対応し；第１の面において測定される、空間に分散した光の主要な伝搬方向と第１の表面に対する法線との間の角度は、第２の角度に対応し；第１の角度と第２の角度との間の差は１０度未満である。
【０００６】
このシステムの実施例は、次の特徴の１つ以上を含むことができる。
動作中、空間に分散した光のうち、第２のアパーチャによって通過することを許される部分の中心波長は、分散素子の位置を変更することにより選択することができる。このシステムは、分散素子の位置の変更により、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分の中心波長を選択するよう構成される電子プロセッサを含むことができる。
【０００７】
第１のレンズは入力光を第１の表面上にフォーカスさせるよう構成することができる。第１および第２のアパーチャは、各々、円形の開口部を含むことができる。このシステムは、第２のアパーチャの寸法を調整することにより、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分の半値全幅（ＦＷＨＭ）スペクトルバンド幅を選択するよう構成される電子プロセッサを含むことができる。電子プロセッサは、ＦＷＨＭスペクトルバンド幅を２ｎｍと３０ｎｍとの間の値に調整するよう構成することができる。
【０００８】
サンプルは第２の面に位置決めされることができ、第１の表面は第３の面に位置決めされることができ、検出器は第４の面に位置決めされることができ、第２、第３、および第４の面は光学的に共役面である。第１のアパーチャは第２の面に位置決めされることができ、第２のアパーチャは第３の面に位置決めされることができ、第２および第３の面は光学的に共役面である。
【０００９】
分散素子は、回折格子、プリズムおよび格子プリズムからなる群から選択される少なくとも１つの素子を含むことができる。第１の角度は３０度未満であることができる。
【００１０】
このシステムは、検出器に結合される電子プロセッサを含むことができ、電子プロセッサは、サンプルの複数の画像を得るよう構成され、複数の画像の各画像は、空間に分散した光の、異なる中心波長に対応する。電子プロセッサは、複数の画像の少なくとも１つを表示するよう構成することができる。電子プロセッサは、複数の画像の少なくとも２つの画像からの情報を組み合わせることにより合成画像を形成するよう構成することができる。
【００１１】
第１のレンズは第１の表面上にサンプルを結像するよう構成することができる。第２のアパーチャは複数の開口部を含むことができ、空間に分散した光の、異なる部分が、開口部の各々を通過する。空間に分散した光の、異なる部分の各々は、検出器によって受光され、サンプルの、異なる画像を形成するために用いることができる。
【００１２】
第１の角度および第２の角度の各々は３０度以下であることができる。第１および第２のレンズの少なくとも１つは湾曲したミラーを含むことができる。第１のレンズは湾曲したミラーを含むことができる。第２のレンズは湾曲したミラーを含むことができる。
【００１３】
第２のアパーチャでの、空間に分散した光は、色収差が実質的にない状態であることができる。分散素子は、プリズム、およびプリズムの表面と接触するミラーを含むことができる。
【００１４】
このシステムの実施例は、さらに、適切なように、ここに開示される他の特徴のいずれでも含むことができる。
【００１５】
別の局面では、この開示は、（ａ）サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；（ｂ）対物レンズシステムから受光された集光された光の一部を透過光として通過させるよう位置決めされる第１のアパーチャ；（ｃ）透過光の一部を入力光として反射するよう位置決めされる、部分反射型ミラー；（ｄ）部分反射型ミラーから受光された入力光を、第１の面で空間に入力光を分散させるよう構成される分散素子に向けるよう位置決めされ、分散素子から受光された、空間に分散した光を、部分反射型ミラーに向けるよう位置決めされる、レンズ；（ｅ）部分反射型ミラーによって透過された、空間に分散した光の一部を、検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および（ｆ）検出光を受光するよう位置決めされ、サンプルの、少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含むシステムを特徴とする。入力光は分散素子の第１の表面に入射し、空間に分散した光は第１の表面を通って分散素子を出る。第１の面において測定される、入力光の主要な伝搬方向と第１の表面に対する法線との間の角度は、第１の角度に対応し；第１の面において測定される、空間に分散した光の主要な伝搬方向と第１の表面に対する法線との間の角度は、第２の角度に対応し；第１の角度と第２の角度との間の差は１０度未満である。
【００１６】
このシステムの実施例は、次の特徴の１つ以上を含むことができる。
動作中、空間に分散した光のうち、第２のアパーチャによって通過することを許される部分の中心波長は、分散素子の位置を変更することにより選択することができる。このシステムは、分散素子の位置の変更により、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分の中心波長を選択するよう構成される電子プロセッサを含むことができる。
【００１７】
レンズは湾曲したミラーを含むことができる。分散素子は、プリズム、およびプリズムの表面と接触するミラーを含むことができる。
【００１８】
このシステムは、第２のアパーチャの寸法を調整することにより、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分の半値全幅（ＦＷＨＭ）スペクトルバンド幅を選択するよう構成される電子プロセッサを含むことができる。
【００１９】
サンプルは第２の面に位置決めされることができ、第１の表面は第３の面に位置決めされることができ、検出器は第４の面に位置決めされることができ、第２、第３、および第４の面は光学的に共役面である。第１のアパーチャは第２の面に位置決めされることができ、第２のアパーチャは第３の面に位置決めされることができ、第２および第３の面は光学的に共役面である。
【００２０】
このシステムの実施例は、さらに、適切なように、ここに開示される他の特徴のうちのいずれでも含むことができる。
【００２１】
さらなる局面では、この開示は、（ａ）サンプルから分散光学素子に光を向け、入射光を第１の面で分散させて、分散光学素子から発光された、空間に分散した光を形成するステップ；（ｂ）空間に分散した光を、アパーチャ上に入射するよう向けるステップ；（ｃ）空間に分散した光のうち、アパーチャを通過する部分を検出するステップ；および（ｄ）検出された光に基づいてサンプルの画像を形成するステップを含む方法を特徴とする。サンプルからの光は、分散光学素子の表面に、第１の面で測定された、表面法線に関して第１の角度で入射し；空間に分散した光は、分散光学素子の表面を、第１の面で測定された、表面法線に関して第２の角度で出；第１の角度と第２の角度との間の差は１０度以下である。
【００２２】
この方法の実施例は、次の特徴の１つ以上を含むことができる。
この方法は、空間に分散した光のうち、アパーチャを通過する部分の中心波長を選択するよう、分散光学素子の位置を調整するステップを含むことができる。この方法は、空間に分散した光のうち、アパーチャを通過する部分のスペクトルバンド幅を選択するよう、アパーチャの寸法を調整するステップを含むことができる。
【００２３】
この方法は、各画像が異なる中心波長に対応する、サンプルの複数の画像を形成するステップを含むことができる。この方法は、複数の画像から導出される情報に基づいて、サンプル中の成分のスペクトルの少なくとも一部を判断するステップを含むことができ、そのスペクトルは、成分の吸収スペクトル、反射スペクトル、発光スペクトル、ルミネセンススペクトルおよび散乱光スペクトルの少なくとも１つを含む。
【００２４】
この方法の実施例は、さらに、適切なように、ここに開示される他の特徴または方法ステップのうちのいずれでも含むことができる。
【００２５】
この開示の目的のために、レンズは、レンズに入射する光線をフォーカスまたはデフォーカスさせるあらゆる光学素子を含むことができる。例示的なレンズは、透過型凹レンズ、透過型凸レンズ、複数の光学部品から形成される透過型複合レンズ、たとえば凹面の湾曲したミラーなどの反射型凹レンズ、たとえば凸面の湾曲したミラーなどの反射型凸レンズ、および入射する光線をフォーカスまたはデフォーカスするようともに機能する複数の構成要素を含むレンズシステムを含む。
【発明の効果】
【００２６】
実施例は、次の利点の１つ以上を含むことができる。
ここに開示されるシステムは、たとえば顕微鏡画像化などの高倍率でのサンプル画像化を可能にし、サンプル画像が得られる波長、および画像を形成するために用いられる検出される光の帯域のスペクトル幅は、迅速かつ単純な態様で選択可能である。たとえば、このシステムは、分散素子、たとえば回折格子またはプリズムなどを含み、分散素子の位置を変更することによって（たとえば分散素子を回転させることによって）、検出器によって検出される光のスペクトルバンドの中心波長を、高い信頼性で選択することができる。別の例として、このシステムは調整可能なアパーチャを含み、アパーチャの開口部のサイズ（たとえば最大寸法のような寸法）の変更によって、光のスペクトルバンドの帯域幅を高い信頼性で選択することができる。光の検出される帯域幅の中心波長およびスペクトル幅の選択は、システムオペレータによって手動で、または自動的に（たとえば電子プロセッサによって）行なうことができる。
【００２７】
ここに開示されるシステムは、色収差および他の画像化アーティファクトがないサンプル画像を得るよう構成することができる。たとえば、いくつかの実施例では、このシステムは、システムの入口アパーチャがシステムの出口アパーチャ上に結像されるように、構成される。そのような構成は、そうでなければ（たとえば口径食のため）光のアパーチャの通過から生ずるかもしれない画像誤差を低減または除去するのを支援する。ある実施例では、このシステムは、分散素子上の光の入射角と空間に分散した光が分散素子から出る角度とが等しい（またはほとんど等しい）ように構成される。角度間のこの関係の維持により、測定された画像中の色収差を低減または除去することができる。
【００２８】
このシステムは、サンプルの測定された画像におけるすべての点で同様の空間分解能を提供するよう構成することができる。たとえば、このシステムは、円形の入口アパーチャおよび出口アパーチャを含むことができ、それらは、全体のシステムの開口数−およびしたがって空間分解能−が像平面中の各点で同じであることを保証する。
【００２９】
ここに用いられる技術用語および科学用語は、他の態様で定義されない限り、すべて、この開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載されるものに類似または等価である方法および材料をこの開示の実施または試験で用いることができるが、好適な方法および材料を以下に述べる。ここに言及されたすべての出版物、特許出願、特許、および他の参照は、その全体をここに引用により援用する。対立の場合には、明細書が、定義を含んで、参照されることになる。さらに、材料、方法および例は、例示的であるのみであり、限定的であるようには意図されない。
【００３０】
１つ以上の実施例の詳細を、添付の図面および記載において述べる。他の特徴および利点は、記載、図面および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】分光画像化顕微鏡システムの概略図である。
【図２】分光画像化顕微鏡の実施例の側面図の概略図である。
【図３】図２の顕微鏡の上面図を示す概略図である。
【図４】顕微鏡アパーチャの直径の関数としての、検出器によって検出される光のスペクトルバンド幅のグラフである。
【図５】顕微鏡の空間分解能を評価するために用いられるテストパターンの画像である。
【図６】異なる開口径に対応する図３のテストパターンを介する一連のライン走査を示すグラフである。
【図７】分光画像化顕微鏡の別の実施例の概略図である。
【図８】分光画像化顕微鏡のさらなる実施例の概略図である。
【図９】分光画像化顕微鏡のさらに別の実施例の概略図である。
【図１０Ａ】異なる中心波長で測定されたテストサンプルの画像である。
【図１０Ｂ】異なる中心波長で測定されたテストサンプルの画像である。
【図１０Ｃ】異なる中心波長で測定されたテストサンプルの画像である。
【図１０Ｄ】異なる中心波長で測定されたテストサンプルの画像である。
【図１１Ａ】多数の異なる中心波長で得られたサンプルの画像から判断された、図１０Ａ〜図１０Ｄのサンプルにおける３つの異なるインクの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１１Ｂ】ＵＶ可視分光光度計で測定された図１０Ａの３つのインクの吸収スペクトルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
さまざまな図面中の同様の参照記号は、同様の要素を示す。
【００３３】
ここに開示される分光画像化顕微鏡システムは、サンプルによって発光された光を集光するための素子、発光の波長成分を空間に分散させ選択するための素子、および選択された波長成分を測定するための１つ以上の検出器を含む。これらの素子は、スペクトルでフィルタ処理されたサンプルの画像についての観察および画像化を可能にする。空間に波長成分を分散させ選択する素子は、選択される中心波長および選択される半値全幅（ＦＷＨＭ）帯域幅を有する光波長の特定の帯域幅を１つ以上の検出器に入射させて、サンプル観察および／または画像化を可能にするよう、調整することができる。光波長の適切な帯域の選択によって、サンプル中の特定の検体を、サンプル中の他のスペクトルの寄与物からの干渉なしで調査することができる。顕微鏡の空間分解能および／または視野も、システムの特定の光学素子の変更により調整することができる。
【００３４】
図１は、分光画像化顕微鏡システムの一般的な概略図を示す。システム１０００は、顕微鏡アセンブリ１０１０、対物レンズシステム１０２０、第１のアパーチャ１０３０、第１のレンズアセンブリ１０４０、分散素子１０５０、第２のレンズアセンブリ１０６０、第２のアパーチャ１０７０、検出器システム１０８０、ならびに電子プロセッサ１０９２、制御ユニット１０９４および表示ユニット１０９６を含む、電子処理モジュール１０９０を含む。
【００３５】
顕微鏡アセンブリ１０１０は、レンズ、フィルタ、光源、および顕微鏡システムに典型的な他の素子のようなさまざまな要素を含むことができる。顕微鏡アセンブリ１０１０は、さらに、典型的には、サンプルを支持するよう構成される（１つ以上の方向に並進させることができるステージのような）支持部材を含む。
【００３６】
対物レンズシステム１０２０は、１つ以上の対物レンズ、ならびに窓、フィルタ、ビームスプリッタおよびミラーのような他の光学素子を含むことができる。たとえば、いくつかの実施例では、対物レンズシステム１０２０は単一の対物レンズを含む。一般に、対物レンズシステム１０２０は、サンプルが顕微鏡アセンブリ１０１０に支持される場合に、サンプルから発光される光１１００を集光するよう位置決めされる。
【００３７】
集光された光１１１０は、対物レンズシステム１０２０によって、第１のアパーチャ１０３０を通過するように向けられる。第１のアパーチャ１０３０は、一般的に、空間フィルタとして作用する１つ以上の素子を含むことができ、集光された光１１１０の一部を通過をさせ、集光された光１１１０の一部を遮光することができる。第１のアパーチャ１０３０の開口部のサイズは、典型的には調整可能であり；調整は、システムオペレータによって手動で、または自動的に（たとえば電子プロセッサ１０９２によって）行なうことができる。一般に、第１のアパーチャ１０３０の開口部の形状は、任意の数のサイズの円形、正方形、長方形、正多角形、および不規則な形状の開口部を含む、さまざまな異なる形状のいずれかであることができる。
【００３８】
第１のアパーチャ１０３０を通過する光１１２０は第１のレンズアセンブリ１０４０に入射する。第１のレンズアセンブリ１０４０は、光１１２０を光１１３０として分散素子１０５０上に向ける１つ以上のレンズを含む。第１のレンズアセンブリ１０４０の１つ以上のレンズは、たとえば単一のレンズまたは複数のレンズを含むことができる。１つ以上のレンズは透過型レンズおよび／または反射型レンズ（たとえば湾曲したミラー）であることができる。第１のレンズアセンブリ１０４０は、さらに、一般的に、窓、平面ミラー、ビームスプリッタおよびフィルタのような他の光学素子を含むことができる。いくつかの実施例では、第１のレンズアセンブリ４０は分散素子１０５０の表面上にサンプルを結像するよう構成される。ある実施例では、サンプルは分散素子１０５０の表面上には結像されない。
【００３９】
分散素子１０５０は、光１１３０の波長成分を空間に分散させるよう構成され、透過型および／または反射型回折格子、位相マスク、ホログラフィック光学素子、回折光学素子、プリズム、格子プリズム、光学楔ならびに光学窓のような１つ以上の分散光学部品を含むことができる。分散素子１０５０は、１つ以上の軸のまわりでの分散素子１０５０の回転を可能にする回転マウントに取付けることができる。回転マウントは、たとえば、分散素子１０５０の位置の自動制御および変更を可能にするよう、電動回転アセンブリに結合することができる。
【００４０】
第２のレンズアセンブリ１０６０は、第１のレンズアセンブリ１０４０に関して上で論じられた要素のうちのいずれでも含むことができ；第２のレンズアセンブリ１０６０の素子の数およびタイプは、第１のレンズアセンブリ１０４０と同じであり得、または異なり得る。いくつかの実施例では、単一のレンズアセンブリが、第１および第２のレンズアセンブリ１０４０および１０６０の両方の機能を実行する。たとえば、システム１０００は、ビームスプリッタのような部分反射型素子を含む単一のレンズアセンブリを備えた折り畳まれた構成を有することができる。部分反射型素子は、光１１１０を分散素子１０５０に向けて反射し、空間に分散した光１１４０を透過することができる。
【００４１】
空間に分散した光１１５０は、第２のレンズアセンブリ１０６０によって、第２のアパーチャ１０７０上に入射するよう向けられる。一般に、第２のアパーチャ１０７０は、第１のアパーチャ１０３０に関して上に論じられた、構成要素のいずれでも、および特徴のいずれでも含むことができる。第２のアパーチャ１０７０は１つ以上の開口部を含むことができ、それらの各々は、手動または自動的に調整可能であることができる。典型的には、第２のアパーチャ１０７０は、第１のアパーチャ１０３０が位置決めされる面に光学的に共役である面に位置決めされる。
【００４２】
光１１６０（空間に分散した光１１５０のうち、第２のアパーチャ１０７０を通過する部分）は、検出器１０８０によって検出される。検出器１０８０は、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤアレイ、フィルム記録装置およびデジタルフレーム捕捉装置のようなさまざまな検出器の任意の１つ以上を含むことができ、光１１６０の検出に基づいてサンプルの画像を形成するよう構成される。いくつかの実施例では、検出器１０８０は、光１１６０の直接観測（たとえば目による）用の接眼レンズを含むことができる。検出器１０８０は、さらに、光１１６０の一部を接眼レンズに向けるために、付加的なレンズ、ビームスプリッタ、窓、ミラーおよびフィルタのようなさまざまな光学素子を含むことができる。
【００４３】
ある実施例では、光１１６０は複数の部分に分割することができ、それら複数の部分のうちのいくつか（またはすべて）を、異なる検出器によって検出することができる。たとえば、検出器１０８０は、光１１６０を２つ以上の部分に分割する、１つ以上のビームスプリッタを含むことができる。１つの部分は、たとえば、接眼レンズに向けることができ、その結果、システムオペレータはサンプルを直接観察することができる。光１１６０の１つ以上のさらなる部分は、検出された光に基づいてサンプルの画像を形成することができる、１つ以上の検出器（たとえば、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤアレイ、フィルム記録装置およびデジタルフレーム捕捉装置）に向けることができる。
【００４４】
図１に示されるように、いくつかの実施例では、システム１０００は、電子通信線１１７０ａ〜１１７０ｈによってシステム１０００の構成要素のうちのいくつかまたはすべてに接続される電子プロセッサ１０９２によって制御することができる。電子プロセッサ１０９２は、さらに、制御ユニット１０９４に接続されて、ユーザーがプロセッサ１０９２へ命令を送ることを可能し、表示ユニット１０９６に接続されて、電子プロセッサ１０９２が１つ以上の得られた画像を表示することができるようにする。電子プロセッサ１０９２は、いくつかの実施例では、合成情報（たとえば画像）を形成するために複数のサンプル画像からの情報を組み合わせる（たとえば異なる中心波長で得られた異なる画像からの情報を組み合わせる）よう構成されることができる。たとえば、合成画像はプロセッサ１０９２によって表示ユニット１０９６を介して表示することができる。
【００４５】
図ｌは、上に論じられるような、分光画像化顕微鏡システムの一般的な概略図である。この後の議論では、顕微鏡システムの例示的な実施例が示され論じられるが、より一般的には、広範なさまざまな異なる実施例が、図１のシステム１０００の一般的構造にしたがって可能である。
【００４６】
図２は、分光画像化顕微鏡の実施例の側面図の概略図を示す。顕微鏡１０は、サンプル支持体３０（たとえば顕微鏡ステージ）、対物レンズシステム４０、第１のアパーチャ５０、ミラー６０、第１のレンズ７０、ここでは反射型回折格子８０として実施される分散素子、第２のレンズ９０、第２のアパーチャ１００、ならびに検出光学素子１１０および検出器１２０を含む検出器システムを含む。
【００４７】
動作の際、サンプル２０はサンプル支持体３０に位置決めされ、サンプル２０から発光された光１３０は、対物レンズシステム４０によって集光される。発光１３０は、たとえば、サンプル２０によって透過される入射光、サンプル２０中の１つ以上の蛍光性および／または燐光性の標識によって発光された光、サンプル２０によって散乱した光（たとえば光散乱および／またはラマン散乱による）、ならびにサンプル２０の内部および／または外部の他の光源からの光を含むことができる。対物レンズシステム４０は、発光１３０を集光して入力光１４０を形成する。入力光１４０は、サンプル２０の像を搬送するが、それは、入力光１４０がアパーチャ５０を通過するにつれてデフォーカスされ（たとえば部分的または完全にデフォーカスされ）、アパーチャ５０における口径食による画像アーティファクトを確実に低減および／または除去する。この実施例では、アパーチャ５０は調整可能な円形のアパーチャであり、入力光１４０がアパーチャを通過するなか、入力光１４０の一部を遮光するよう調整することができる。たとえば、アパーチャ５０は入力光１４０の縁部からの光を遮光するよう調整することができ、遮光された光は画像アーティファクトおよび／または他の迷光に対応する。より一般的には、アパーチャ５０は、たとえば、所望されるように、円形、楕円形、三角形、正方形、長方形、多角形、不規則な形状、または任意の他の形状の開口部を備えた調整可能な（たとえば手動および／または自動的に）絞りを含むことができる。
【００４８】
入力光１４０はミラー６０によって反射され、第１のレンズ７０に入射する。第１のレンズ７０は焦点距離ｆ１を有し、図２に示される実施例の入力光１４０の光路に沿ってアパーチャ５０から距離ｆ１のところに位置決めされる。第１のレンズ７０は、入力光１４０を、回折格子８０の表面８２上においてフォーカスさせる。回折格子８０は、入力光１４０の波長成分を空間に分散させて、表面８２から反射される、空間に分散した光１５０を形成する。
【００４９】
格子８０は空間に分散した光１５０を第２のレンズ９０上に入射するように向けるよう配向され、第２のレンズ９０は光１５０を検出光学素子１１０上にフォーカスさせる。第２のレンズ９０は焦点距離ｆ２を有し、第２のアパーチャ１００から距離ｆ２のところに位置決めされる。第２のアパーチャ１００は、調整可能な円形のアパーチャであり、典型的には、空間に分散した光の一部だけがアパーチャを通過して検出光学素子１１０に入るよう構成される。空間に分散した光１５０のさまざまな波長成分は、格子８０により、光１５０の横方向プロファイルにおける特定の空間位置上に写像されるので、第２のアパーチャ１００は、光波長の選択された帯域だけが検出光学素子１１０を入ることを許す。一旦、検出光学素子１１０に入ると、第２のアパーチャ１００によって受入れられた光は、検出器１２０によって測定され、それは、スペクトルの波長の受入れられた帯域に対応するサンプル２０の画像を形成する。
【００５０】
第２のアパーチャ１００を通過するスペクトルの波長の帯域を選択するために（たとえば帯域の中心波長を選択するために）、回折格子８０は図２の軸８６のまわりを回転する。軸８６は、表面８２の面と平行で、さらに、図２の面と平行である。図２に示される座標軸に関して、軸８６は、格子８０の配向によって、ｙ−ｚ面中のｚ軸に対して、平行であるか、またはある角度で傾いている。
【００５１】
回折格子８０の軸８６のまわりの回転は表面８２の回転を引き起こし、空間に分散した光１５０は、ｘ−ｙ面（たとえば図２の面に垂直な面）において第２のアパーチャ１００の開口部を横切って掃引される。検出器１２０によって画像化される、空間に分散した光１５０の波長の帯域のために特定の中心波長を選択するために、格子８０を、その帯域の中心波長が第２のアパーチャ１００の開口部の上において空間に位置決めされるように、軸８６のまわりで回転させる。いくつかの実施例では、選択された帯域の中心波長が第２のアパーチャ１００の中間点に位置決めされるように、格子８０を軸８６のまわりで回転させる。一般には、しかしながら、中心波長は、空間に分散した光１５０における光のスペクトル分布によって、第２のアパーチャ１００の中間点に位置決めされても、されなくてもよい。
【００５２】
空間に分散した光１５０によって搬送されるサンプル２０の像は、それが図２の第２のアパーチャ１００を通過するにつれ、ちょうど入力光１４０が第１のアパーチャ５０を通過するにつれ、入力光１４０によって搬送されるサンプル２０の像がデフォーカスされるように、デフォーカスされる。その結果、そうでなければ第２のアパーチャ１００における口径食および他の光学的作用により発生するかもしれない画像化アーティファクトを低減および／または除去することができる。
【００５３】
図２では、第１のアパーチャ５０の開口部が第２のアパーチャ１００の開口部の上に結像されるように、第１のレンズ７０および第２のレンズ９０が位置決めされる。言いかえれば、第１のアパーチャ５０および第２のアパーチャ１００は、顕微鏡１０の共役な光学面に位置決めされる。共役な光学面にアパーチャ５０および１００を位置決めすることは、さらに、入力光１４０および空間に分散した光１５０のアパーチャの通過から発生する可能性がある画像化アーティファクトの低減および／または除去を保証するのを支援する。
【００５４】
図２のアパーチャ５０および１００は円形の開口部を有する。円形の開口部の使用は、入力光１４０および／または空間に分散した光１５０によって搬送されるサンプル２０の画像の空間分解能が同様であることを保証するのを支援する。円形の開口部を備えたアパーチャの使用により、顕微鏡１０の開口数は、すべての画像方向（たとえば、像平面を形成する光の伝搬方向に直交する２つの方向）において同じである。その結果、各方向における画像の空間分解能は同じである。
【００５５】
より一般的には、しかしながら、アパーチャ５０および／または１００は、任意の形状の開口部を有することができる。いくつかの実施例では、たとえば、アパーチャ５０および１００のいずれか、または両方は、形状において長方形の開口部、または正多角形の形状を有する開口部を有することができる。開口部は、特定用途に対して望まれるように、同じサイズまたは異なるサイズであることができ、同じ形状または異なる形状を有することができる。
【００５６】
ある実施例では、アパーチャ５０および／または１００は複数の開口部を含むことができる。たとえば、アパーチャ１００は２つ以上の開口部を含むことができ、それらの各々は、異なる中心波長に対応するスペクトルバンドが検出器１２０によって検出されることを可能にする。検出器１２０は、各画像が光の異なる中心波長に対応する、サンプル２０の複数の画像を同時に得るために、多重構成で用いることができる。複数のアパーチャのうちのいくつかまたはすべては調整可能であることができ、その結果、検出器１２０によって検出される異なるスペクトルバンドのいくつかまたはすべてのＦＷＨＭは、特定のサンプルおよび／または実験条件に対して調整することができる。
【００５７】
図２に示される実施例では、サンプル２０の像は、第１のレンズ７０によって格子８０の表面８２上にフォーカスされる。すなわち、サンプル２０は格子８０の上に結像され、その結果、サンプル２０、格子８０および検出器１２０は、顕微鏡１０の共役な光学面にある。より一般的には、いくつかの実施例では、サンプル２０は、第１のレンズ７０によって格子８０の上に結像されない。すなわち、格子８０の表面８２は、サンプル２０および検出器１２０の面に光学的に共役な面に位置決めされない。典型的には、しかしながら、第１および第２のレンズ７０および９０の位置決めは、入力光１４０の光路に沿った第１のレンズ７０と表面８２との間の距離と、空間に分散した光１５０の光路に沿った表面８２と第２のレンズ９０との間の距離との和が、レンズ焦点距離の和ｆ１＋ｆ２に対応するように、行われる。
【００５８】
一般に、レンズ７０および９０の焦点距離ｆ１およびｆ２は、顕微鏡１０の幾何学的および他の制約に従って、所望のように選択することができる。いくつかの実施例では、ｆ１およびｆ２は同じ値を有し、一方、他の実施例では、それらは異なる値を有する。図２に示される実施例では、ｆ１およびｆ２の各々は同じであり、たとえば、３００ｍｍである。一般には、しかしながら、レンズ７０および９０は、広範囲の異なる焦点距離を備えたレンズの中から選択することができる。ｆ１およびｆ２を選択するための主な基準は、顕微鏡１０の幾何学的制約、顕微鏡１０の所望の空間分解能およびスペクトル分解能、ならびに顕微鏡１０の他の要素（たとえば対物レンズシステム４０、回折格子９０、ならびに第１および第２のアパーチャ５０および１００）の光学的特性である。一般に、より長い焦点距離のレンズについては、アパーチャ１００を通過するスペクトルバンドの帯域幅はより小さい。しかしながら、より長い焦点距離が用いられる場合、より大きな径のレンズおよびより大きな分散素子が典型的には必要である。したがって、焦点距離ｆ１およびｆ２の選択は、大部分は、特定の物理的設計嗜好（たとえばあるサイズの装置に対する嗜好）を満たすかどうかの問題である。
【００５９】
図２では、入力光１４０の伝搬方向は入力光１４０の主線（principal ray）と平行である。同様に、空間に分散した光１５０の伝搬方向は空間に分散した光１５０の主線と平行である。さらに、格子の表面８２に対する法線は、図２の表面８２および軸８６の両方に垂直に配向される。ミラー６０、格子８０、ならびにレンズ７０および９０の配向は、入力光１４０が、一般に、図２のｘ、ｙおよびｚ方向のうちのどれとも平行でない方向において表面８２に入射することができるように行われる。一般に、空間に分散した光は、ｘ、ｙおよびｚ方向のうちのどれとも平行でない方向に沿って、表面８２を出ることができる。しかしながら、関与する角度の議論を単純化するために、空間に散乱する光１５０は、図２のｘ−ｙ面において表面８２を出る。
【００６０】
図２では、ｙ−ｚ面上への入力光１４０の主線の投影は、光線１４２として示される。同様に、空間に散乱する光１５０の主線のｙ−ｚ面上への投影は、光線１５２として示される。図２における表面８２の法線のｙ−ｚ面上への投影は、法線投影８４として示される。光線１４２は、ｙ−ｚ面において法線投影８４と角度θ１を形成する。光線１５２は、ｙ−ｚ面において法線投影８４と角度θ２を形成する。つまり、入力光１４０は、表面８２に対する法線に関して、ｙ−ｚ面で測定された角度θ１で格子８０の表面８２に入射する。空間に分散した光は、表面８２に対する法線に関して、ｙ−ｚ面で測定された角度θ２で、格子８０の表面８２を出る。顕微鏡１０は、一般的に、θ１＝θ２であるように構成される。
【００６１】
図２に示される実施例では、角度θ１およびθ２は、各々、約６．２５度である。一般的には、しかしながら、角度θ１およびθ２は、たとえば、顕微鏡１０の形状上の幾何学的制約に基づいて選択することができる。いくつかの実施例では、たとえば、各々の角度θ１およびθ２は、１度以上（たとえば３度以上、５度以上、１０度以上、２０度以上、３０度以上、４０度以上、５０度以上）および／または８９度以下（たとえば８５度以下、８０度以下、７５度以下、７０度以下、６５度以下、６０度以下、５５度以下）であることができる。
【００６２】
格子８０の配向は、空間に分散した光１５０の波長成分が図２のｘ−ｙ面において分散するように行われる。格子８０を軸８６のまわりで回転させることによって、分散したスペクトル成分の特定の帯域を、アパーチャ１００を通過するように向けることができる。図３は、回折格子８０の上面図を示す。図３では、ｘ−ｙ面上への入力光１４０の主線の投影は、光線１４３として示される。同様に、空間に散乱する光１５０の主線のｘ−ｙ面上への投影は、光線１５３として示される。図３において表面８２に対する法線のｘ−ｙ面上への投影は、法線投影８５として示される。光線１４３は、ｘ−ｙ面において法線投影８５と角度θ３を形成する。光線１５３は、ｘ−ｙ面において法線投影８５と角度θ４を形成する。言いかえれば、入力光１４０は、表面８２に対する法線に関して、ｘ−ｙ面で測定された角度θ３で格子８０の表面８２に入射する。空間に分散した光は、表面８２に対する法線に関して、ｘ−ｙ面で測定された角度θ４で格子８０の表面８２を出る。
【００６３】
いくつかの実施例では、顕微鏡１０は、θ３＝θ４であるように構成される。そのような構成は検出器１２０によって得られるサンプル２０の画像中の色収差を低減および／または除去し、なぜなら、入力光１４０および空間に分散した光１５０のさまざまな波長成分の光路は等しいからである。色収差が存在する場合、たとえば、異なる中心波長のサンプル２０の画像は、顕微鏡１０におけるさまざまな波長成分の、異なる光路長により、互いに対して伸張または圧縮され得る。θ３＝θ４の保証によって、異なる中心波長で得られたサンプル２０の画像は、色収差の低減または欠如のため、各々、同じアスペクト比および焦点特性を有することができる。たとえば、θ３＝θ４の時、第２のアパーチャ１００の位置での、空間に分散した光１５０は、色収差が実質的にない状態であることができる。
【００６４】
一般に、角度θ３およびθ４は、同じか、または異なることができる。角度θ３およびθ４の各々は、８９度以下（たとえば８０度以下、７０度以下、６０度以下、５０度以下、４０度以下、３０度以下、２０度以下、１５度以下、１０度以下、５度以下、４度以下、３度以下、２度以下、１度以下、０．５度以下、０．２５度以下、０．１度以下、またはそれ未満）であることができる。いくつかの実施例では、角度θ３とθ４との間の差は、８９度以下（たとえば、８０度以下、７０度以下、６０度以下、５０度以下、４０度以下、３０度以下、２０度以下、１８度以下、１６度以下、１４度以下、１２度以下、１０度以下、８度以下、６度以下、５度以下、４度以下、、３度以下、２度以下、１度以下、０．５度以下、０．２５度以下、０．１度以下、またはそれよりさらに少ない、または０でさえ）あることができる。角度θ３およびθ４が異なる場合、顕微鏡１０は、いくつかの実施例では、空間に分散した光１５０の色収差を低減するために、レンズ、プリズム、窓および他の素子のような追加の光学部品を含むことができる。
【００６５】
ある実施例では、顕微鏡１０は、角度θ３およびθ４が０またはほぼ０である、０次モードで動作させることができる。たとえば、θ３およびθ４の各々は、１０度以下（たとえば８度以下、６度以下、５度以下、４度以下、３度以下、２度以下、１度以下、０．５度以下、０．２５度、０．１度以下、またはそれよりさらに少ない、または０でさえ）あることができる。この動作モードでは、第２のアパーチャ１００を通過する波長のスペクトルバンドは非常に広くなることができ、空間に分散した光１５０のＦＷＨＭスペクトルバンド幅の７０％以上（たとえば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上）に相当し得る。その結果、検出器１２０によって得られるサンプル２０の画像は、入力光１４０のフィルタ処理がない状態で得られる画像にほぼ相当し得る。
【００６６】
一般には、空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅は、第２のアパーチャ１００の開口部のサイズ、回折格子８０の表面８２上の溝の空間密度、ならびに焦点距離ｆ１およびｆ２を含む、複数の要因に依存する。いくつかの実施例では、第２のアパーチャ１００のサイズは、空間に分散した光１５０のうちアパーチャを通過する部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅を変更するよう調整することができる。ある実施例では、たとえば、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅は、１００ｎｍ以下（たとえば７５ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、３５ｎｍ以下、２５ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、４ｎｍ以下、３ｎｍ以下、２ｎｍ以下）であることができる。ある実施例では、空間に分散した光のうち第２のアパーチャを通過する部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅は、アパーチャの調整により、２ｎｍから５０ｎｍまで（たとえば２ｎｍから４０ｎｍまで、２ｎｍから３０ｎｍまで、２ｎｍから２０ｎｍまで、２ｎｍから１０ｎｍまで）変更することができる。
【００６７】
上で論じられるように、空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分の中心波長は、回折格子８０の配向および特性（たとえば１ミリメートル当たりの溝の数）に依存する。一般に、中心波長は、空間に分散した光１５０のスペクトルバンド幅にある波長のうちの任意の波長から格子８０を回転させることにより選択することができる。顕微鏡１０は、一般的に、電磁スペクトルの紫外線領域、可視領域、赤外線領域を含む（がそれらに限定はされない）広範囲のスペクトルの波長においてサンプル２０から光を集光するよう構成することができる。したがって、格子８０の配向の調整によって、空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分の中心波長を、スペクトルの紫外線領域、可視領域、赤外線領域の波長の中から選択することができる。
【００６８】
検出光学素子１１０は、一般的に、レンズ、ミラー、分散素子（たとえば格子、プリズム）、窓、および空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分を受光し、その光の部分を検出器１２０上に入射するように向けるよう構成される他の素子のような、さまざまな光学素子を含むことができる。検出器１２０は、検出器１２０がサンプル２０の画像を得ることができるように構成される、さまざまな異なるタイプの検出素子の１つ以上を含むことができる。典型的には、たとえば、検出器１２０は、ＣＣＤアレイ、フォトダイオードアレイ、カメラ（たとえばビデオカメラおよび／またはフィルムカメラ）、および感光記録媒体を含む検出器のような１つ以上の画像化検出器を含む。
【００６９】
回折格子８０は、一般的に、さまざまな異なる材料のうちのいずれからでも形成することができる。いくつかの実施例では、たとえば、回折格子８０は、ガラスのような材料から形成され、その上にコーティングが施された基部を含むことができる。コーティングは、入力光１４０の波長成分を効率的に反射する金属（たとえば金、銀またはアルミニウム）のような材料から形成することができる。入力光１４０の波長成分の空間分散を可能にするために、溝がコーティング材に形成される。たとえば、図２では、格子８０には１ｍｍ当たり１２００の溝がある。一般に、格子８０における１ｍｍ当たりの溝の数は、入力光１４０の波長成分の所望の空間分散、所望の反射効率および他の基準によって選択することができる。例示的な格子は、１ｍｍ当たり、３００、６００、９００、１２００、１５００、１８００、２４００または３６００の溝を含むことができるが、１ｍｍ当たりそれより多いおよび／または少ない数の溝が可能である。
【００７０】
顕微鏡１０のさまざまな構成要素は、システムオペレータによって手動で、または自動的に顕微鏡によって調整することができる。たとえば、いくつかの実施例では、顕微鏡１０は、第１および第２のアパーチャ５０および１００、第１および第２のレンズ７０および９０、ならびに回折格子８０を含む顕微鏡１０の構成要素のうちの任意の構成要素に、電子コントローラおよび／または駆動機構を介して結合される電子プロセッサ１６０を含む。電子プロセッサ１６０は、アパーチャ５０および／または１００のどちらかまたは両方の最大寸法を自動的に調整し、入力光１４０および空間に分散した光１５０の光路に沿ってレンズ７０および／または９０の位置を調整し、軸８６に関する回折格子８０の配向を調整するよう（たとえば空間に分散した光１５０のうち第２のアパーチャ１００を通過する部分の特定の中心波長を選択するよう）構成することができる。電子プロセッサ１６０は、さらに、検出器１２０に電気的に結合されることができ、検出器１２０によるサンプル２０の画像の獲得を制御するよう構成することができる。図２に示される実施例では、電子プロセッサは、電気通信線１６２、１６４および１６６を介して、回折格子８０、第２のアパーチャ１００および検出器１２０にそれぞれ結合される。一般に、顕微鏡１０は、電子プロセッサ１６０と顕微鏡のさまざまな構成要素との間に任意の数の接続を含むことができる。
【００７１】
電子プロセッサ１６０は、さらに、得られるサンプル２０の１つ以上の画像を表示するよう構成することができる。たとえば、電子プロセッサ１６０は、顕微鏡１０に含まれる表示ユニットに電気的に接続することができる。代替的に、電子プロセッサ１６０は遠隔表示ユニットに（たとえば無線ネットワーク、有線ネットワークおよび／またはインターネットのようなネットワークによって）接続することができ、たとえば、電子プロセッサ１６０はシステムオペレータへの表示のために遠隔ユニットに画像データを送信することができる。
【００７２】
いくつかの実施例では、電子プロセッサ１６０は、サンプル２０の画像から１つ以上の合成画像を形成するよう構成することができる。たとえば、電子プロセッサ１６０は、異なる中心波長に各々が対応する２つ以上の画像を組み合わせて、サンプル２０における複数のスペクトルの寄与物からの寄与を含む合成画像を形成するよう構成することができる。
【００７３】
顕微鏡１０の性能テストを、第２のアパーチャ１００の最大寸法を変えて、空間に分散した光１５０のうちアパーチャ１００を通過した部分のＦＷＨＭスペクトルバンド幅を測定することにより行った。図４は、第２のアパーチャ１００の開口部の直径（「開口径」）の関数としてのＦＷＨＭスペクトルバンド幅（「バンドパス」）のグラフを示す。図４に示されるように、スペクトルバンド幅はアパーチャ開口部のサイズとほぼ線形に比例し、その結果、ある特定のスペクトルバンド幅を、第２のアパーチャ１００の適切な調整によって、高い信頼性で選択することができる。スペクトルバンド幅は、さらに、表面８２に１ｍｍ当たり異なる数の溝を有する回折格子８０の使用により、および／または異なる焦点距離ｆ２を備えた第２のレンズ９０の使用により、変更することができる。
【００７４】
顕微鏡１０は、さらに、その空間分解能を判断しようと、テストされた。米国空軍（ＵＳＡＦ）１９５１ターゲットを用いて、顕微鏡１０が狭い間隔のテストパターンを解像する能力をテストした。対物レンズシステム４０は、０．５ＮＡの６０ｘ対物レンズを含んだ。ターゲットは、狭い間隔の３本の棒からなり、棒と等しい幅の間隙によって棒が分離されている、棒の組を含んだ。図５は、顕微鏡１０で得られたターゲットの画像を示す。図４において２μｍ間隔の２μｍ幅の棒が容易に解像され、顕微鏡１０の分解能は２μｍよりよいことが示された。顕微鏡１０の空間分解能は、異なる対物レンズシステム４０でさらに改善されてもよい。
【００７５】
顕微鏡１０の空間分解能は、対物レンズシステム４０および第１のアパーチャ５０の組合せの開口数（ＮＡ）に依存する。第２のアパーチャ１００が比較的大きな開口部を有する場合、顕微鏡１０の分解能は対物レンズシステム４０のＮＡによって決められる。第２のアパーチャ１００がより小さな開口部を有する場合、顕微鏡１０の全体的なＮＡおよび分解能は低減され得る。図６は、ＵＳＡＦ１９５１ターゲットにおける３本の棒の群によるライン走査のグラフを示す。ターゲットは、対物レンズシステム４０において０．５ＮＡの５０ｘ対物レンズを用いて結像された。図６の３つのライン走査の各々は、累進的に幅が減じられる一連の棒を介して進み；左から右に、棒幅は３．４７μｍ、３．１１μｍ、２．７６μｍ、２．４６μｍおよび２．１９μｍである。上部のライン走査は、５ｍｍのアパーチャ開口部に対応する。中央のライン走査は、３ｍｍのアパーチャ開口部に対応し、下部のライン走査は、１ｍｍのアパーチャ開口部に対応する。図６が示すように、５ｍｍおよび３ｍｍのアパーチャ開口部では、最も小さな幅の棒さえも基線解像される。しかしながら、１ｍｍのアパーチャ開口部については、棒の間の谷領域の強度は、棒のピーク強度の約６０％であり、低減された空間分解能を反映している。
【００７６】
顕微鏡１０はさまざまな異なる態様で構成することができる。たとえば、図７は、レンズ７０および９０が単一のレンズ７５と取り替えられる顕微鏡１０の別の実施例を示す。ビームスプリッタ６５は入力光１４０をレンズ７５に向け、レンズ７５は、さらに、入力光１４０を回折格子８０上に入射するように向ける。格子８０から反射する、空間に分散した光１５０は、レンズ７５およびビームスプリッタ６５を通過して戻り、第２のアパーチャ１００に入射する。一般に、図７に示されるように、顕微鏡１０のあるレンズは、折り畳まれた構成の採用により除去することができる。
【００７７】
ある実施例では、反射型回折格子以外の分散素子を用いて、入力光１４０の波長成分を分散させることができる。プリズム、ホログラフィック光学素子、格子プリズム、位相マスクおよび透過型回折格子のような分散素子を、回折格子８０に加えて、またはその代替物として用いることができる。図８は、回折格子８０がプリズム８５およびミラー９５の組合せと取り替えられた顕微鏡１０の実施例を示す。顕微鏡１０の他の構成要素は図７と同様である。図８では、プリズム８５は、入力光１４０の波長成分を分散させ、ミラー９５は、プリズム８５を通って２つの経路を形成するよう光を向ける。
【００７８】
いくつかの実施例では、１つ以上のレンズを、同様の機能を実行する湾曲したミラーと取り替えることができる。図９は、レンズ７５が湾曲したミラー７７と取り替えられる以外は、図７に示される実施例と同様である顕微鏡１０の実施例を示す。ミラー７７は、ビームスプリッタ６５によって反射される入力光１４０を受光するよう位置決めされ、入力光１４０を格子８０に入射するように向けるよう構成される。ミラー７７は、さらに、空間に分散した光１５０を格子８０から受光するよう位置決めされ、空間に分散した光１５０を第２のアパーチャ１００上に入射するように向けるよう構成される。図９の顕微鏡１０の他の構成要素は、図７の対応する構成要素と同様である。
【００７９】
顕微鏡１０は、調整可能な空間分解能および／またはスペクトル分解能を備えたサンプル２０の画像化を可能にする。いくつかの実施例では、サンプル２０は、空間に分散した光１５０の異なる中心波長に各々対応する複数の画像を得ることにより画像化することができる。中心波長の適切な選択により、画像を用いて、異なるスペクトルバンドにおいてスペクトル応答を有する他の成分からの干渉なしで、サンプル２０中のある成分（たとえば特定の十分に定義されたスペクトル応答を生じさせる成分）を調査することができる。ある実施例では、異なる中心波長に対応する一連のサンプル画像を用いて、サンプル２０の成分のために、異なるタイプのスペクトル−吸収スペクトル、反射スペクトル、発光スペクトル、ルミネセンススペクトルおよび散乱光スペクトルを含む−を判断することができる。これは、吸収スペクトルが成分の局所的環境によって影響を受ける場合、特に有用であり得る。たとえば、いくつかの実施例では、吸収スペクトルは、異なる中心波長で得られる、サンプルの画像のある領域のみの検査により構築することができる。
【００８０】
顕微鏡１０がサンプル成分の吸収スペクトルを測定する能力を評価するために、合成サンプルを構成した。このサンプルは、赤、緑および青インクの部分が上に引かれたカバーグラスを含んだ。サンプルの画像を得るために、顕微鏡１０を０次モードを動作させ、ついで、異なる中心波長を選択するよう調整した。各選択される中心波長で、サンプルの画像を得た。得られた各画像ごとに、アパーチャ５０および１００を、７．３ｎｍのスペクトル分解能に対応して、３ｍｍに設定した。
【００８１】
合計４６の異なる中心波長が選択され、各中心波長の画像が、３つの異なるインクの各々に対して吸収スペクトルを得るために、異なる空間位置で解析された。図１０Ａ〜図１０Ｄは、さまざまな異なる中心波長でのサンプルの画像を示す。図１０Ａは、０次構成で得られたサンプルの画像であり、サンプルの白色光画像に本質的に対応する。図ｌ０Ｂ〜図ｌ０Ｄは、それぞれ青色インク、緑色インクおよび赤色インクに大まかに対応する、５０５ｎｍ、５７５ｎｍおよび６５０ｎｍの中心波長で得られた画像である。
【００８２】
図１１Ａは、顕微鏡１０を用いて得られた４６の画像から判断された３つのインクの各々の吸収スペクトルを示す。図１１Ｂは、ＵＶ−可視分光光度計で測定された同じ３つのインクの吸収スペクトルを示す。各インクごとに異なる技術で測定されたスペクトル間には、近い対応関係があり、顕微鏡１０は、研究中のサンプルのｉｎ ｓｉｔｕ成分に対して吸収スペクトルを判断するために高い信頼性で用いることができることを示唆している。この能力は特に重要であり、なぜなら、サンプル成分のｉｎ ｓｉｔｕスペクトルの判断は、従来の分光法で対処するのが難しい問題であるからである。同時に、ｉｎ ｓｉｔｕスペクトルの判断は、（たとえば吸収スペクトルは局所的な溶媒環境のような要因により変化し得るため）サンプル成分の化学的環境および／または生体環境に関する情報を提供することができ、サンプルの異なる部分に関する構造的な情報および機能的な情報の両方を判断するのを支援することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
ハードウェアおよびソフトウェア実現例
ここに記載される方法ステップおよび手順は、ハードウェアもしくはソフトウェア、またはそれら両方の組合せで実現することができる。特に、電子プロセッサ（たとえばプロセッサ１０９２および／または１６０）は、上に論じられる方法のうちのいずれかを実行するソフトウェアおよび／またはハードウェア命令を含むことができる。この方法は、ここに開示される方法ステップおよび図に従う標準的なプログラミング技術を用いて、コンピュータプログラムにおいて実現することができる。プログラムコードは、ここに記載される機能を実行するよう入力データに適用される。出力情報は、たとえば遠隔監視のために、プリンタ、表示装置、またはウェブサイトへのアクセスを備えたコンピュータモニタ上のウェブページのような、１つ以上の出力装置に適用される。
【００８４】
各プログラムは、好ましくは、プロセッサと通信するために、ハイレベルプロシージャ言語またはオブジェクト指向型プログラミング言語で実現される。しかしながら、所望であれば、プログラムはアセンブリ言語または機械語で実現することができる。いずれにしても、言語は、コンパイルされた言語か、または解釈された言語であることができる。各コンピュータプログラムは、ここに記載される手順を実行するためにプロセッサを構成し動作させるために、プロセッサによって読取可能な記憶媒体または装置（たとえば電子メモリ）上に格納することができる。
【００８５】
他の実施例
数多くの実施例をここに記載した。しかしながら、さまざまな修正物が開示の精神および範囲から逸脱することなくなされてもよいことが理解されるだろう。したがって、他の実施例は、特許請求の範囲内にある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；
前記対物レンズシステムから受光された集光された光の一部を入力光として通過させるよう位置決めされる第１のアパーチャ；
前記第１のアパーチャから受光された前記入力光を透過するよう位置決めされる第１のレンズ；
前記第１のレンズから受光された前記入力光を第１の面で空間に分散させるよう構成される分散素子；
空間に分散した光を透過するよう位置決めされる第２のレンズ；
前記第２のレンズから受光された、前記空間に分散した光の一部を検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および
前記検出光を受光するよう位置決めされ、前記サンプルの少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含み、
前記入力光は前記分散素子の第１の表面に入射し、前記空間に分散した光は前記第１の表面を通って前記分散素子を出、
前記第１の面において測定される、前記入力光の主要な伝搬方向と前記第１の表面に対する法線との間の角度は、第１の角度に対応し、前記第１の面において測定される、前記空間に分散した光の主要な伝搬方向と前記第１の表面に対する前記法線との間の角度は、第２の角度に対応し、前記第１の角度と前記第２の角度との間の差は１０度未満である、システム。
【請求項２】
動作中、前記空間に分散した光のうち、前記第２のアパーチャによって通過することを許される部分の中心波長は、前記分散素子の位置を変更することにより選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記分散素子の位置の変更により、前記空間に分散した光のうち前記第２のアパーチャを通過する部分の前記中心波長を選択するよう構成される電子プロセッサをさらに含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記第２のアパーチャの寸法を調整することにより、前記空間に分散した光のうち前記第２のアパーチャを通過する部分の半値全幅（ＦＷＨＭ）スペクトルバンド幅を選択するよう構成される電子プロセッサをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記サンプルは第２の面に位置決めされ、前記第１の表面は第３の面に位置決めされ、前記検出器は第４の面に位置決めされ、前記第２、第３、および第４の面は光学的に共役面である、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記第１のアパーチャは第２の面に位置決めされ、前記第２のアパーチャは第３の面に位置決めされ、前記第２および第３の面は光学的に共役面である、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記検出器に結合される電子プロセッサをさらに含み、前記電子プロセッサは、前記サンプルの複数の画像を得るよう構成され、前記複数の画像の各画像は、前記空間に分散した光の、異なる中心波長に対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記電子プロセッサは、前記複数の画像の少なくとも２つの画像からの情報を組み合わせることにより合成画像を形成するよう構成される、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記第１の角度および前記第２の角度の各々は３０度以下である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第２のアパーチャでの、前記空間に分散した光は、色収差が実質的にない、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記分散素子は、プリズム、および前記プリズムの表面と接触するミラーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；
前記対物レンズシステムから受光された集光された光の一部を透過光として通過させるよう位置決めされる第１のアパーチャ；
前記透過光の一部を入力光として反射するよう位置決めされる部分反射型ミラー；
前記部分反射型ミラーから受光された前記入力光を、第１の面で空間に前記入力光を分散させるよう構成される分散素子に向けるよう位置決めされ、前記分散素子から受光された、空間に分散した光を、前記部分反射型ミラーに向けるよう位置決めされる、レンズ；
前記部分反射型ミラーによって透過された、前記空間に分散した光の一部を、検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および
前記検出光を受光するよう位置決めされ、前記サンプルの、少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含み、
前記入力光は前記分散素子の第１の表面に入射し、前記空間に分散した光は前記第１の表面を通って前記分散素子を出、
前記第１の面において測定される、前記入力光の主要な伝搬方向と前記第１の表面に対する法線との間の角度は、第１の角度に対応し、前記第１の面において測定される、前記空間に分散した光の主要な伝搬方向と前記第１の表面に対する前記法線との間の角度は、第２の角度に対応し、前記第１の角度と前記第２の角度との間の差は１０度未満である、システム。
【請求項１３】
動作中、前記空間に分散した光のうち、前記第２のアパーチャによって通過することを許される部分の中心波長は、前記分散素子の位置を変更することにより選択される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記分散素子の位置の変更により、前記空間に分散した光のうち前記第２のアパーチャを通過する部分の前記中心波長を選択するよう構成される電子プロセッサをさらに含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第２のアパーチャの寸法を調整することにより、前記空間に分散した光のうち前記第２のアパーチャを通過する部分の半値全幅（ＦＷＨＭ）スペクトルバンド幅を選択するよう構成される電子プロセッサをさらに含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
サンプル画像を測定する方法であって、
サンプルから分散光学素子に光を向け、入射光を第１の面で分散させて、前記分散光学素子から発光された、空間に分散した光を形成するステップ；
前記空間に分散した光を、アパーチャ上に入射するよう向けるステップ；
前記空間に分散した光のうち、前記アパーチャを通過する部分を検出するステップ；および
検出された光に基づいて前記サンプルの画像を形成するステップを含み、
前記サンプルからの光は、前記分散光学素子の表面に、表面法線に関して、前記第１の面で測定された第１の角度で入射し、前記空間に分散した光は、前記分散光学素子の表面を、前記表面法線に関して、前記第１の面で測定された第２の角度で出、前記第１の角度と前記第２の角度との間の差は１０度以下である、方法。
【請求項１７】
前記空間に分散した光のうち、前記アパーチャを通過する部分の中心波長を選択するよう、前記分散光学素子の位置を調整するステップをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記空間に分散した光のうち、前記アパーチャを通過する部分のスペクトルバンド幅を選択するよう、前記アパーチャの寸法を調整するステップをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１９】
各画像が異なる中心波長に対応する、前記サンプルの複数の画像を形成するステップをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記複数の画像から導出される情報に基づいて、前記サンプル中の成分のスペクトルの少なくとも一部を判断するステップをさらに含み、前記スペクトルは、前記成分の吸収スペクトル、反射スペクトル、発光スペクトル、ルミネセンススペクトルおよび散乱光スペクトルの少なくとも１つを含む、請求項１９の方法。
【請求項１】
サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；
前記対物レンズシステムから受光された集光された光の一部を入力光として通過させるよう位置決めされる第１のアパーチャ；
前記第１のアパーチャから受光された前記入力光を透過するよう位置決めされる第１のレンズ；
前記第１のレンズから受光された前記入力光を第１の面で空間に分散させるよう構成される分散素子；
空間に分散した光を透過するよう位置決めされる第２のレンズ；
前記第２のレンズから受光された、前記空間に分散した光の一部を検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および
前記検出光を受光するよう位置決めされ、前記サンプルの少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含み、
前記入力光は前記分散素子の第１の表面に入射し、前記空間に分散した光は前記第１の表面を通って前記分散素子を出、
前記第１の面において測定される、前記入力光の主要な伝搬方向と前記第１の表面に対する法線との間の角度は、第１の角度に対応し、前記第１の面において測定される、前記空間に分散した光の主要な伝搬方向と前記第１の表面に対する前記法線との間の角度は、第２の角度に対応し、前記第１の角度と前記第２の角度との間の差は１０度未満である、システム。
【請求項２】
動作中、前記空間に分散した光のうち、前記第２のアパーチャによって通過することを許される部分の中心波長は、前記分散素子の位置を変更することにより選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記分散素子の位置の変更により、前記空間に分散した光のうち前記第２のアパーチャを通過する部分の前記中心波長を選択するよう構成される電子プロセッサをさらに含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記第２のアパーチャの寸法を調整することにより、前記空間に分散した光のうち前記第２のアパーチャを通過する部分の半値全幅（ＦＷＨＭ）スペクトルバンド幅を選択するよう構成される電子プロセッサをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記サンプルは第２の面に位置決めされ、前記第１の表面は第３の面に位置決めされ、前記検出器は第４の面に位置決めされ、前記第２、第３、および第４の面は光学的に共役面である、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記第１のアパーチャは第２の面に位置決めされ、前記第２のアパーチャは第３の面に位置決めされ、前記第２および第３の面は光学的に共役面である、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記検出器に結合される電子プロセッサをさらに含み、前記電子プロセッサは、前記サンプルの複数の画像を得るよう構成され、前記複数の画像の各画像は、前記空間に分散した光の、異なる中心波長に対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記電子プロセッサは、前記複数の画像の少なくとも２つの画像からの情報を組み合わせることにより合成画像を形成するよう構成される、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記第１の角度および前記第２の角度の各々は３０度以下である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第２のアパーチャでの、前記空間に分散した光は、色収差が実質的にない、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記分散素子は、プリズム、および前記プリズムの表面と接触するミラーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
サンプルから光を集光するよう構成される対物レンズシステム；
前記対物レンズシステムから受光された集光された光の一部を透過光として通過させるよう位置決めされる第１のアパーチャ；
前記透過光の一部を入力光として反射するよう位置決めされる部分反射型ミラー；
前記部分反射型ミラーから受光された前記入力光を、第１の面で空間に前記入力光を分散させるよう構成される分散素子に向けるよう位置決めされ、前記分散素子から受光された、空間に分散した光を、前記部分反射型ミラーに向けるよう位置決めされる、レンズ；
前記部分反射型ミラーによって透過された、前記空間に分散した光の一部を、検出光として通過させるよう位置決めされる第２のアパーチャ；および
前記検出光を受光するよう位置決めされ、前記サンプルの、少なくとも１つの画像を形成するよう構成される検出器を含み、
前記入力光は前記分散素子の第１の表面に入射し、前記空間に分散した光は前記第１の表面を通って前記分散素子を出、
前記第１の面において測定される、前記入力光の主要な伝搬方向と前記第１の表面に対する法線との間の角度は、第１の角度に対応し、前記第１の面において測定される、前記空間に分散した光の主要な伝搬方向と前記第１の表面に対する前記法線との間の角度は、第２の角度に対応し、前記第１の角度と前記第２の角度との間の差は１０度未満である、システム。
【請求項１３】
動作中、前記空間に分散した光のうち、前記第２のアパーチャによって通過することを許される部分の中心波長は、前記分散素子の位置を変更することにより選択される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記分散素子の位置の変更により、前記空間に分散した光のうち前記第２のアパーチャを通過する部分の前記中心波長を選択するよう構成される電子プロセッサをさらに含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第２のアパーチャの寸法を調整することにより、前記空間に分散した光のうち前記第２のアパーチャを通過する部分の半値全幅（ＦＷＨＭ）スペクトルバンド幅を選択するよう構成される電子プロセッサをさらに含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
サンプル画像を測定する方法であって、
サンプルから分散光学素子に光を向け、入射光を第１の面で分散させて、前記分散光学素子から発光された、空間に分散した光を形成するステップ；
前記空間に分散した光を、アパーチャ上に入射するよう向けるステップ；
前記空間に分散した光のうち、前記アパーチャを通過する部分を検出するステップ；および
検出された光に基づいて前記サンプルの画像を形成するステップを含み、
前記サンプルからの光は、前記分散光学素子の表面に、表面法線に関して、前記第１の面で測定された第１の角度で入射し、前記空間に分散した光は、前記分散光学素子の表面を、前記表面法線に関して、前記第１の面で測定された第２の角度で出、前記第１の角度と前記第２の角度との間の差は１０度以下である、方法。
【請求項１７】
前記空間に分散した光のうち、前記アパーチャを通過する部分の中心波長を選択するよう、前記分散光学素子の位置を調整するステップをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記空間に分散した光のうち、前記アパーチャを通過する部分のスペクトルバンド幅を選択するよう、前記アパーチャの寸法を調整するステップをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１９】
各画像が異なる中心波長に対応する、前記サンプルの複数の画像を形成するステップをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記複数の画像から導出される情報に基づいて、前記サンプル中の成分のスペクトルの少なくとも一部を判断するステップをさらに含み、前記スペクトルは、前記成分の吸収スペクトル、反射スペクトル、発光スペクトル、ルミネセンススペクトルおよび散乱光スペクトルの少なくとも１つを含む、請求項１９の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ−１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ−１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５０４２４２（Ｐ２０１２−５０４２４２Ａ）
【公表日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２９２６８（Ｐ２０１１−５２９２６８）
【出願日】平成２１年９月２５日（２００９．９．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５８４０４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３６９０９
【国際公開日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【出願人】（５０８０５３７９５）タフツ ユニバーシティ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２５日（２００９．９．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５８４０４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３６９０９
【国際公開日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【出願人】（５０８０５３７９５）タフツ ユニバーシティ (3)
【Ｆターム（参考）】
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