加熱された生茶葉と微生物用培地中で培養された茶細胞とを用いるテアフラビンの製造方法
【課題】安価かつ高収率で、食品に直接使用することができるようなテアフラビンの製造方法を提供する。
【解決手段】（１）茶を含む原料を加熱する工程、（２）該（１）工程で加熱した該原料を粉砕する工程、（３）微生物用培地において、茶細胞を培養し茶細胞培養物を得る工程、および（４）該（２）工程で粉砕された該原料と該（３）工程で培養された該茶細胞培養物とを反応させてテアフラビンを生成する工程を包含する、テアフラビンの製造方法を提供する。
【解決手段】（１）茶を含む原料を加熱する工程、（２）該（１）工程で加熱した該原料を粉砕する工程、（３）微生物用培地において、茶細胞を培養し茶細胞培養物を得る工程、および（４）該（２）工程で粉砕された該原料と該（３）工程で培養された該茶細胞培養物とを反応させてテアフラビンを生成する工程を包含する、テアフラビンの製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加熱された生茶葉と微生物用培地中で培養された茶細胞とを用いるテアフラビンの製造方法、その製造方法によって製造されたテアフラビン、およびそのテアフラビンを含む食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
テアフラビンは、紅茶の製造工程で茶葉中の酵素により生成される赤色色素である。テアフラビンは抗酸化作用、血糖降下作用、抗菌作用などの生理活性を有することが近年明らかになり、天然着色料としてのみならず、生理活性物質としての有用性も期待されている。
【０００３】
テアフラビンの製造方法としては紅茶葉からの抽出および生合成が知られていた。紅茶葉から抽出される場合、テアフラビンは以下のように３つのガロイルエステル体を含むテアフラビン類として抽出される。
【０００４】
【化１】
紅茶中に含まれる上記４つの化合物のおよその比率は、テアフラビン：０．０８重量％、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート：０．３重量％、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート：０．２重量％、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート：０．４重量％である。このように紅茶中のテアフラビン含有量は少ないため、従来の紅茶葉からの抽出によるテアフラビンの製造方法では、生理活性物質としてテアフラビンを使用するために十分な量および収率でテアフラビンを得ることは到底できなかった。
【０００５】
その一方、テアフラビンの生合成法としては、フェリシアン化カリウムを用いる方法、酵素試料（やぶきた若葉の水不溶画分）を用いる方法、茶葉から得られたポリフェノールオキシダーゼを用いる方法、緑茶抽出液とポリフェノール酸化酵素を含有する植物抽出液とを用いる方法、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる方法、加工緑茶葉とポリフェノールオキシダーゼとを接触させる方法、緑茶のスラリーをタンナーゼで処理し、アルゴン又は窒素雰囲気下で醗酵させる方法、生葉の搾汁を醗酵させることによる方法などが知られている。しかしながら、いずれの方法においても、紅茶からの抽出法と同様に、生理活性物質としてテアフラビンを使用するために十分な量および収率でテアフラビンを得ることは到底できなかった。
【０００６】
特許文献１および２は、培養した茶細胞から得たペルオキシダーゼ（ペルオキシダーゼ）およびタンナーゼなどの加水分解酵素をテアフラビン変換反応の酵素として利用したテアフラビン製造方法を報告している（特許文献１：「テアフラビン類の合成法」、特許文献２：「テアフラビンの選択的製造方法」）。これら製造法では、副反応が少なく従来法と比較して高収率でテアフラビンを合成することができる。これらの製造方法は、従来の方法と異なり安価にテアフラビンを選択的に高収率で製造することができる。しかしながら、特許文献１および２の方法によって製造されたテアフラビンはその製造過程で食品添加物として使用できない植物ホルモンやＢ５塩類などの成分を用いるため、得られたテアフラビンを食品組成物に添加することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１４３４６１号公報
【特許文献２】特願２００７−１８２２１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安価かつ高収率で、そして製造されたテアフラビンまたはテアフラビンを含む組成物を食品に直接使用することができるようなテアフラビン製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、植物細胞である茶細胞が微生物用培地中で培養されても、従来法である植物用培地中での培養と同様にテアフラビン変換反応に必要なペルオキシダーゼまたはタンナーゼを産生することを、全く予想外に見出した。そしてその発見に基づいて、加熱された生茶葉と微生物用培地中で培養された茶細胞とを用いる、安価かつ高収率で食品への応用が容易なテアフラビン製造方法を開発した。この製造方法は、（１）加熱により原料の茶由来の主要な不要成分であるカフェインが分解されるため、その分目的産物であるテアフラビンの純度が向上する、（２）食品添加物として使用できない植物ホルモンやＢ５塩類などの成分を用いないため、得られたテアフラビンを食品組成物に添加することが可能であり食品への応用が容易である、等の従来からは予想外の優れた効果を奏するものである。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、
（１）茶を含む原料を加熱する工程、
（２）上記（１）工程で加熱した該原料を粉砕する工程、
（３）微生物用培地において、茶細胞を培養し茶細胞培養物を得る工程、および
（４）上記（２）工程で粉砕された該原料と該（３）工程で培養された該茶細胞培養物とを反応させてテアフラビンを生成する工程
を包含するテアフラビンの製造方法を提供する。
【００１１】
一局面において、上記微生物用培地は、糖、窒素源および無機塩類を含む酵母用培地である。
【００１２】
一局面において、上記糖はスクロースおよびグルコースからなる群より選択される。
【００１３】
一局面において、本発明のテアフラビン製造方法は、上記（３）工程における反応物に含まれる酵素を失活させる工程をさらに包含する。
【００１４】
一局面において、上記失活させる工程は、上記反応物を酸性にすることおよび／または加温することにより行われる。
【００１５】
一局面において、本発明のテアフラビン製造方法は、テアフラビンを回収する工程をさらに包含する。
【００１６】
一局面において、上記回収は吸着樹脂により行われる。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、本発明のテアフラビン製造方法によって製造された実質的に純粋なテアフラビンを提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、本発明のテアフラビン製造方法によって製造されたテアフラビンを含む食品組成物を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、本発明のテアフラビン製造方法によって製造されたテアフラビンを含む肥満予防用食品組成物を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、本発明のテアフラビン製造方法によって製造されたテアフラビンを含む血糖値上昇抑制用食品組成物を提供する。
【００２１】
一局面において、上記食品組成物は高脂肪食と組み合わせて摂取されるものである。
【００２２】
一局面において、上記食品組成物はテアフラビンの安定化剤をさらに含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、安価かつ高収率であり、そして製造されたテアフラビンの食品への応用が容易であるテアフラビン製造方法が提供される。この製造方法は、（１）加熱により原料の茶由来の主要な不要成分であるカフェインが分解されるため、その分目的産物であるテアフラビンの純度が向上する、（２）製造過程において食品添加物として使用できない植物ホルモンやＢ５塩類などの成分を用いないため、得られたテアフラビンを食品組成物に添加することが可能であり食品への応用が容易である、等の優れた効果を奏するものである。
【００２４】
したがって本発明により種々の生理活性を有するテアフラビンを安価に高収率で製造し、それを容易に食品に応用して食品組成物として提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、採取時期の異なる原料茶葉の各々についての、含まれるカテキン類（ＥＣ：エピカテキン、ＥＣＧ：エピガロカテキン、ＥＣＧ：エピカテキン−３−Ｏ−ガレート、ＥＧＣＧ：エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）およびカフェインの含量、ならびにペルオキシダーゼ活性（ＰＯＤ）を示す。
【図２】図２は、採取時期の異なる原料茶葉の各々について、含まれるカテキン類およびカフェインの含有率を示す。
【図３】図３は、採取時期の異なる原料茶葉の各々を用いたテアフラビン（ＴＦ）変換試験結果を示す。
【図４】図４は、−８０℃での凍結保存の間のカテキン類含量およびペルオキシダーゼ活性の変化を示す。
【図５】図５は、異なる加熱処理条件で茶葉を処理した場合のカテキン類およびカフェインの含量を示す。
【図６】図６は、異なる量の加熱処理液量で加熱処理した場合のカテキン類およびカフェインの含量を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、種々のスクロース量の培地において茶細胞培養を行った培養物におけるペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、糖源としてそれぞれスクロースまたはグルコースを含有する培地において茶細胞培養を行った培養物におけるペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す。縦軸はペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）活性（Ｕ／ｍｌ）を示し、横軸は培養時間（日）を示す。
【図８Ａ】図８（Ａ）は、ｐＨに対するペルオキシダーゼの安定性試験結果を示す。
【図８Ｂ】図８（Ｂ）は、熱に対するペルオキシダーゼの安定性試験結果を示す。
【図９Ａ】図９（Ａ）は、ｐＨに対するタンナーゼの安定性試験結果を示す。
【図９Ｂ】図９（Ｂ）は、熱に対するタンナーゼの安定性試験結果を示す。
【図１０Ａ】図１０（Ａ）は、ｐＨに対するテアフラビンの安定性試験結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０（Ｂ）は、熱に対するテアフラビンの安定性試験結果を示す。
【図１１Ａ】図１１は、テアフラビンの安定性に対するアスコルビン酸の添加効果を示す。図１１Ａはテアフラビンの安定性に対するアスコルビン酸の添加濃度の影響を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、テアフラビンの安定性に対するアスコルビン酸の添加効果を示す。図１１Ｂは０．１％の濃度でアスコルビン酸を添加されたテアフラビン溶液の熱安定性を示す。
【図１２】図１２は、凍結乾燥または噴霧乾燥により粉末化された、本発明の製造方法によって得られたテアフラビン粉末の安定性試験結果を示す。
【図１３】図１３は、テアフラビンの精製結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先される。
【００２７】
本発明者らは、茶細胞の微生物用培地培養物を酵素源とし、茶葉抽出液を基質源として利用したテアフラビン含有粉末の製造方法を構築した。
【００２８】
本発明の製造方法は原料として生茶葉を利用する。生茶葉を加熱処理した後、粉砕し茶葉抽出液を調製する。この抽出液には、生茶葉に含まれているカテキン類が溶出されておりテアフラビン反応の基質となる。
【００２９】
茶葉抽出液へのカフェインの抽出量を軽減させて目的産物であるテアフラビンの収率を上げるために、本発明の製造方法は加熱処理工程を包含する。この加熱処理工程中にテアフラビン変換反応に必要な茶葉中の酵素が失活するため、別に酵素を供給してカテキンを酸化させるテアフラビン変換反応を行なう。この酵素の供給が、従来の植物用培地ではなく微生物用培地で培養された茶細胞培養物を添加することによって達成される点が本発明の重要な特徴である。微生物用培地は一般的に、食品組成物に用いることができない成分（例えば特定のビタミン類や植物ホルモンなど）を含まない。よって、本発明の微生物用培地で培養された茶細胞培養物を用いることにより、植物ホルモンやＢ５塩類などの食品添加物として使用できない成分を用いずにテアフラビンが製造されるので、得られたテアフラビンは食品組成物に添加することが可能である。このことにより、テアフラビンの食品組成物への応用が極めて容易になる。この茶細胞培養物はテアフラビン変換反応に必要なペルオキシダーゼおよびタンナーゼを含んでいる。この茶細胞培養物中のペルオキシダーゼおよびタンナーゼを用いてテアフラビン変換反応が行なわれる。必要に応じてテアフラビン生成後にテアフラビン変換反応を停止するために、ペルオキシダーゼおよびタンナーゼを失活させ得る。必要に応じて、遠心分離により上清を回収し、その上清を濃縮して噴霧乾燥もしくは凍結乾燥によりテアフラビンが粉末化され得る。
【００３０】
（テアフラビン）
本明細書において「テアフラビン」とは、下記の一般式：
【００３１】
【化２】
で表されるベンゾトロポロン環を有する化合物をいう。本発明における製造方法では、テアフラビンは茶に含まれるエピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）とを反応させることにより生成される。この反応は以下の式によって表される。
【００３２】
【化３】
また、エピカテキンおよびエピガロカテキンは、茶において酵素反応によりエピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）およびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）からガレートが脱離することによっても生成され得る。本明細書では、これらのエピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートをまとめて「カテキン類」と総称する。
【００３３】
（茶の加熱）
本明細書において「茶」とは、一般的な茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓまたはＣａｍｅｌｌｉａ ａｓｓａｍｉｃａ）をいう。本発明において原料として使用される茶の部位は、実生、葉、子葉、茎、果実など特に限定されないが、好ましくは葉または茎である。茶の品種としては、やぶきた、おくひかり、山の息吹、さやまかおり、かなやみどり、するがわせなどが挙げられるが、本発明においては茶の品種は特に重要ではない。以下の実施例１の結果より、７月〜９月付近に採取された茶は、テアフラビン合成の出発物質であるエピカテキンやエピガロカテキンを含むカテキン類の含量が多く、また不純物であるカフェインの含有率が少ないことから、本発明の製造方法における原料として好ましい。図１〜３も参照のこと。また同様に実施例１の結果より、採取から６０日以内の茶が本発明の製造方法における原料として好ましい。図４も参照のこと。しかしながら本発明の製造方法における原料としての茶は、特に採取時期や採取からの経過日数によっては限定されない。
【００３４】
茶由来のカフェインはテアフラビン製造に不要な成分である。よってテアフラビンの純度を上げるために、本発明の製造方法においてはまず原料の茶を加熱してカフェインを除去する。この加熱処理は約８０℃〜約９０℃で約１分間以上、約３分間以上、約３分間〜約５分間、約３分間、約４分間、または約５分間行われる。好ましくはこの加熱処理は、約８０℃で約１分間以上、約３分間以上、約３分間〜約５分間、約３分間、約４分間、または約５分間行われる。この加熱処理により、原料である茶に含まれるカフェインの約４０％以上、約５０％以上または約６０％以上が除去される。より好ましくは、この加熱処理により、原料である茶に含まれるカフェインの約５０％以上、具体的には約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％または約６０％以上が除去される。この加熱処理により、茶におけるペルオキシダーゼ活性はほぼ完全に失活する。
【００３５】
（加熱した茶の粉砕）
本発明においては、上述のようにして加熱された茶を脱水して粉砕し、後の反応に供する。粉砕は当業者に公知の方法により行われる。例えば本発明においては、加熱して脱水された茶に適当量（例えば茶１ｇにつき水１００ｍＬ）を加えてミキサーを用いて粉砕する。
【００３６】
（茶細胞の培養）
本発明で使用される「茶細胞」は、茶の生組織を含む切片を用いて、当業者に周知の一般的なカルス作成方法に基づいてカルスを誘導し、それを培地に移して培養することにより調製される。本発明の茶細胞培養物は、固体培地でこの茶細胞を培養して得られる細胞培養物および液体培地を用いて得られる培養細胞の培養懸濁物のいずれであってもよい。このようにして得られた茶細胞培養物は、茶細胞自身によって産生されたペルオキシダーゼおよびタンナーゼを含み、これらの酵素がその後のテアフラビン変換反応において作用する。
【００３７】
上記切片の培養は、代表的に、まず切片を滅菌処理しこれを寒天培地などの固体培地上で培養してカルスを誘導することにより行われる。次いで、誘導されたカルスを同様の固体培地上または液体培地上で十分に増殖させる。上記滅菌は、エタノール表面殺菌、次亜塩素酸塩による処理、滅菌した蒸留イオン交換水による洗浄などにより行われる。
【００３８】
本発明者らは、茶細胞が植物用培地ではなく微生物用培地で培養した場合にも正常に培養され、そして活性を有するペルオキシダーゼやタンナーゼを産生することを見出した。茶細胞を植物用培地ではなく微生物用培地で培養することにより、その後のテアフラビン変換反応を経て得られるテアフラビンと培地との混合物をそのまま食品に適用することが可能になる。したがって、本発明において、茶細胞は植物用培地ではなく微生物用培地において培養される。従来は植物である茶の細胞が微生物用培地で培養できるとは考えられておらず、さらに活性を有するペルオキシダーゼやタンナーゼなどの酵素を正常に産生するとは極めて予想外であった。
【００３９】
本明細書において「微生物用培地」とは、細菌や真菌を含む微生物の培養において用いられ、かつ植物ホルモンやＢ５塩類などの食品添加物として使用できない成分を含まない、任意の培地を含む。本発明において利用可能な微生物培地としては、例えばYPD培地、グルコース・酵母エキス培地 （酵母・カビ用培)、PGY培地、高浸透圧培地(酵母用培地)などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの培地は、生物工学実験書(培風館)、微生物学実験法(講談社再演ティフィク)などの実験書に記載されている。本発明における培地は、固体培地であっても液体培地であってもよい。本発明の微生物用培地は、例えば約１０ｇ／１００ｍＬ以上、より好ましくは約１５ｇ／１００ｍＬ以上の糖を含む。より具体的には、本発明の微生物用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬ、約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬまたは約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬの糖を含む。より好ましい実施形態において、本発明の微生物用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬの糖を含む。特に好ましい実施形態において、本発明の微生物用培地は、約１５ｇ／１００ｍＬの糖を含む。
【００４０】
本発明における微生物用培地の糖としては、グルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトース、フルクトースなどが挙げられるがこれらに限定されず、当該分野で公知の糖が使用され得る。本発明における微生物用培地の糖は好ましくはスクロースまたはグルコースであり、より好ましくはスクロースである。
【００４１】
本発明の微生物用培地は、糖（好ましくはスクロースまたはグルコース、より好ましくはスクロース）の他に窒素源または無機塩類を含み得る。窒素源としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液のような有機窒素源、または硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、塩化アンモニウムのような無機窒素源が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物用培地は、１または複数の窒素源を含み得る。無機塩類としては、例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物用培地は、１または複数の無機塩類を含み得る。しかしながら、本発明の微生物用培地は、食品添加物として使用できない成分（例えば植物ホルモン、ニコチン酸塩、ピリドキシン塩酸塩、Ｂ５塩類など）を含まない。
【００４２】
本発明において好ましい微生物用培地は酵母用培地である。本明細書における「酵母用培地」は、代表的に糖、窒素源および無機塩類を含み得る。本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ以上、より好ましくは約１５ｇ／１００ｍＬ以上の糖を含む。より具体的には、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬ、約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬまたは約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬの糖を含む。より好ましい実施形態において、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬの糖を含む。特に好ましい実施形態において、本発明の酵母用培地は約１５ｇ／１００ｍＬの糖を含む。
【００４３】
本発明における酵母用培地の糖としては、グルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトース、フルクトースなどが挙げられるがこれらに限定されず、当該分野で公知の糖が使用され得る。本発明における酵母用培地の糖は好ましくはスクロースまたはグルコースであり、より好ましくはスクロースである。
【００４４】
したがって、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ以上、より好ましくは約１５ｇ／１００ｍＬ以上のスクロースを含み得る。より具体的には、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬ、約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬまたは約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬのスクロースを含み得る。より好ましい実施形態において、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬのスクロースを含み得る。特に好ましい実施形態において、本発明の酵母用培地は約１５ｇ／１００ｍＬのスクロースを含み得る。
【００４５】
一つの実施形態において、本発明の酵母用培地は、１または複数の窒素源を含み得る。本発明の酵母用培地において使用される窒素源としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液のような有機窒素源、または硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、塩化アンモニウムのような無機窒素源が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態において本発明の酵母用培地は必要に応じて、酵母エキスまたはペプトンなどの有機窒素源を含む。本発明の酵母用培地は必要に応じて、例えば約０．１ｇ／１００ｍＬ〜約０．４ｇ／１００ｍＬ、好ましくは約０．４ｇ／１００ｍＬの酵母エキス、または約０．１ｇ／１００ｍＬ〜約０．２ｇ／１００ｍＬ、好ましくは約０．２ｇ／１００ｍＬのペプトン、あるいはこれらの組み合わせを含む。本発明の酵母用培地において使用される酵母エキスとしては、例えばミーストＮ（オリエンタル酵母工業(株））が挙げられ、ペプトンとしては例えばＣＥ９０Ｍ（アサヒフードアンドヘルスケア(株））が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、使用する培地に含める有機窒素源の種類および量を適切に決定することができる。ある実施形態において、本発明の酵母用培地は、約０．３ｇ／１００ｍＬの硝酸カリウムまたは約０．０５ｇ／１００ｍＬの硫酸アンモニウム、あるいはこれらの組み合わせを含む。上記に列挙した以外の窒素源は当業者に周知であり、そのような窒素源もまた本発明の酵母用培地に含まれ得る。当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、使用する培地に含める窒素源の種類および量を適切に決定することができる。
【００４６】
一つの実施形態において、本発明の酵母用培地は、１または複数のこれらの無機塩類を含み得る。本発明の酵母用培地において使用される無機塩類としては、例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態において、本発明の酵母用培地は、約０．０．３ｇ／１００ｍＬのリン酸二水素カリウム、約０．０．３ｇ／１００ｍＬの硫酸マグネシウム、約０．０．２ｇ／１００ｍＬのリン酸二水素ナトリウムまたは約０．０．２ｇ／１００ｍＬのリン酸カルシウム、あるいはこれらの組み合わせを含む。上記に列挙した以外の無機塩類は当業者に周知であり、そのような無機塩類もまた本発明の酵母用培地に含まれ得る。当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、使用する培地に含める無機塩類の種類および量を適切に決定することができる。
【００４７】
本発明の微生物用培地および／または酵母用培地は、食品添加物として使用できない成分（例えば植物ホルモン、ニコチン酸塩、ピリドキシン塩酸塩、Ｂ５塩類など）を含まない。本明細書中で「食品添加物として使用できない成分」とは、食品または食品添加物中の成分としての使用できないこれらの植物ホルモンやＢ５塩類などの任意の成分をいう。本発明の微生物用培地および／または酵母用培地は植物ホルモンを含まない点に特に注目すべきである。植物ホルモンとしては、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド、ジャスモン酸、フロリゲン、およびストリゴラクトンなどが挙げられるがこれらに限定されない。Ｂ５塩類は、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｏ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ａ．，Ｏｊｉｍａ Ｋ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，１５１−１５８（１９６８）などにおいて説明されており、当業者に周知である。
茶細胞のような植物細胞を培養するためには、培地に植物ホルモンなどの上記物質を加えることが当該分野では技術常識であった。そのため、上記物質を含まない培地で茶細胞を培養したとしても、テアフラビン変換反応を効率的に起こす量のペルオキシダーゼおよび／またはタンナーゼが茶細胞によって分泌されるとは、当業者は考えていなかった。しかしながら、本発明者らは、上記物質を含まない培地で茶細胞を培養したとしても、テアフラビン変換反応を効率的に起こす量のペルオキシダーゼおよび／またはタンナーゼが茶細胞によって十分に分泌されることを予想外に見出した。このようにして上記物質を含まない培地を使用して茶細胞を培養することにより、最終産物であるテアフラビンは、食品添加物として使用できない成分を用いずに得られるため、得られたテアフラビンを食品組成物に添加することができる。
【００４８】
（テアフラビン変換反応）
本発明のテアフラビン製造方法において、加熱してカフェインを除去してその後粉砕した茶原料と、食品添加物として使用できない成分を含まない微生物用培地（好ましくは酵母用培地）で茶細胞を培養した茶細胞培養物とを反応させることにより、テアフラビン変換反応を起こす。テアフラビンは、以下
【００４９】
【化４】
の式に従う変換反応によって生成される。竹元万壽美：テアフラビンの選択的製造方法（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６２５７９（２００８）および竹元万壽美：テアフラビンの選択的製造方法 特願２００７−１８２２１７（２００７）などを参照のこと。
【００５０】
テアフラビンの変換反応は代表的に、約２８時間から約３４時間、常温で回転振とうすることによって行われる。また、安定したテアフラビン変換反応を行うためのペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量は、１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬが最適であることが見出された（実施例４を参照のこと）。
【００５１】
（酵素の失活）
テアフラビン変換反応終了後、茶細胞培養物に含まれるペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性が残存していることにより、産物であるテアフラビンが分解される。従って、本発明の一実施形態において、テアフラビン変換反応終了後に、ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性を失活させる。ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性を失活は、テアフラビンを分解しない条件で行われなければならないことに留意すべきである。本発明の一実施形態において、ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性の失活は、ｐＨ３で１０分間７０℃に維持することにより行われる。
【００５２】
（テアフラビンの安定化剤）
本明細書において、「テアフラビンの安定化剤」とは、テアフラビンの分解を防止する任意の物質をいう。テアフラビンは酸化分解されやすい物質であるため、本発明においては、必要に応じてテアフラビンに抗酸化物質を加え、テアフラビンを安定化する。従って、本発明の一実施形態においては、テアフラビンの安定化剤は抗酸化物質である。テアフラビンの安定化剤として使用され得る抗酸化物質としては、硫酸、アスコルビン酸、クエン酸、没食子酸、トコフェロール、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明における好ましいテアフラビン安定化剤はアスコルビン酸である。本発明において製造されたテアフラビンは、約０．１％以上のアスコルビン酸を含み得る。テアフラビンに約０．１％のアスコルビン酸を含めることによって、２５℃で５日間経過後に約９８％のテアフラビンが分解されずに残存する。一方、アスコルビン酸を含まない場合には、２５℃で２日経過後には約１０％のテアフラビンしか残存せず、３日経過後にはほぼ全てのテアフラビンが酸化分解されてしまう。
【００５３】
（反応液の粉末化）
上記テアフラビン変換反応後の反応液を健康食品に適用するためには、反応で得られたテアフラビンをほとんど分解することなく高収率で粉末化することが好ましい。反応液の粉末化は、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥により行うことができる。例えば、本発明における粉末化は、約３日間またはそれ以上凍結乾燥を行うことにより達成され得る。本発明における粉末化はまた、入口温度平均１５０℃、出口温度７０℃〜７５℃で所望の量の粉末化が達成されるまで噴霧乾燥を行うことによっても達成され得る。粉末化においては、反応で得られたテアフラビンを分解することなく行うことが重要である。よって、反応液に上記テアフラビン安定化剤を含めて粉末化を行うことが好ましい。
【００５４】
（テアフラビンの精製）
本発明の製造方法では、必要に応じてテアフラビン変換反応液からテアフラビンを回収することによってテアフラビンを精製し、高純度のテアフラビンを得る。この精製によって、テアフラビン変換反応液中に含まれる茶葉由来のカフェインなどの不純物を除去することができる。カフェインの除去のためには、例えば有機溶媒による抽出除去が一般的であるが、この方法は食品製造に適合したものではないことから、本発明においては使用されない。本発明において使用される精製方法は、例えば吸着樹脂による精製が挙げられるがこれに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、ガラスカラムのようなカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによってテアフラビンの精製が行われる。樹脂としては例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（三菱化学）が使用され得、そして溶出液にはエタノールが使用され得る。目的産物であるテアフラビンは３０％エタノール画分に溶出する。しかしながら、本発明の精製はこの方法に限定されるものではない。
【００５５】
（食品組成物）
本発明の方法を使用して製造されたテアフラビンを基に、テアフラビン含有食品組成物が当業者に周知の方法によって製造され得る。
【００５６】
本発明の食品組成物は、テアフラビン粉末またはテアフラビン含有培養物をそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦型剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等とすることにより、製造され得る。これらの食品組成物におけるテアフラビン量は一律には規定しがたいが、テアフラビン１０〜１，０００ｍｇ／日、より好ましくは、５０〜４００ｍｇ／日である。本発明の食品組成物は、肥満予防または血糖値上昇抑制のために使用され得る。
【００５７】
本発明における「肥満予防」とは、例えば高脂肪食の摂取などの肥満促進要因による肥満を防ぐことをいう。単に体重を減少させるのではなく、肥満促進要因によって引き起こされる所望されない肥満のみを防ぐ点において、テアフラビンは健康的かつ安全な物質であることが理解される。実際に、本発明の製造方法によって製造されたテアフラビン含有食品組成物を普通食とともに与えたマウスにおいては、体重に変化がなかった（実施例１１を参照のこと）。
【００５８】
本発明における「血糖値上昇抑制」とは、例えば高脂肪食の摂取などの血糖値上昇要因による血糖値上昇を抑制することをいう。肥満予防と同様に、単に血糖値を下げるのではなく、血糖値上昇要因によって引き起こされる所望されない血糖値上昇のみを抑制する点において、テアフラビンは健康的かつ安全な物質であることが理解される。実際に、本発明の製造方法によって製造されたテアフラビン含有食品組成物を普通食とともに与えたマウスにおいては、血糖値に変化がなかった（実施例１１を参照のこと）。
【００５９】
ある実施形態において、本発明のテアフラビンは高脂肪食と混合して摂取され得る。別の実施形態においては、本発明のテアフラビンは高脂肪食と組み合わせて摂取され得る。本発明のテアフラビンが高脂肪食と組み合わせて摂取される場合、高脂肪食摂取の前にテアフラビンを摂取してもよいし、高脂肪食摂取と同時にテアフラビンを摂取してもよいし、高脂肪食摂取の後にテアフラビンを摂取してもよい。
【００６０】
本明細書中で「高脂肪食」とは、それを摂取した被験体において肥満および／または血糖値上昇を引き起し得る任意の食餌をいう。より具体的には、脂肪含有量が約３．４ｋｃａｌ／ｇを超え、普通食には該当しない食餌を「高脂肪食」という。本発明の実施形態においては、高脂肪食とは代表的に、約５ｋｃａｌ／ｇ以上の脂肪を含む食餌をいう。
【００６１】
本発明のテアフラビン含有食品組成物は、特に、健康食品またはサプリメントをいう。本発明の食品組成物は、テアフラビンを含有する任意の製品をいう。本発明の飲食組成物は、代表的に、以下の実施例において実証されるように肥満予防および／または血糖値上昇抑制という効果を有し、またこれらの効果を表示して販売されている。本発明のテアフラビン含有食品組成物は、肥満促進要因および／または血糖値上昇要因と組み合わせて摂取されたときに、それらの要因によって引き起こされ得る肥満および／または血糖値上昇を抑制する。一方、肥満促進要因および／または血糖値上昇要因などの所望されない要因が存在しない場合には、本発明のテアフラビン含有食品組成物は、摂取した被験体に対して有意な効果を及ぼさない。これはテアフラビンの従来全く知られていなかった機能である。健常な状態にある被験体においては体重減少や血糖値低下を引き起こすことなく、高脂肪食のような肥満促進要因および／または血糖値上昇要因を摂取した被験体においてその要因に起因する肥満および／または血糖値上昇を抑制する点において、本発明のテアフラビン含有食品組成物は予想外の驚くべき効果を奏する。
【００６２】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００６３】
以上、本発明を理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明した。以下に実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではないことが理解されるべきである。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００６４】
（実施例１ 原料としての茶の条件検討）
テアフラビンを高い効率で製造する為には、原料の茶に含まれるテアフラビンを得るための基質成分を把握することが重要である。そこで本実施例では茶葉を時季を変えて適宜採取し、その中に含まれる成分の変化を一年を通して把握した。これらの結果から、テアフラビン製造に最も適した茶の調達時期を決定した。
【００６５】
（試験方法）
磐田市内の茶葉畑から時季を変えて茶葉を採取し、その茶葉を酸化を防ぐために−８０℃で凍結し保存した。凍結した茶葉１ｇに井水１００ｍＬ（４℃）を加え、ミキサー（ＩＦＭ−７５０Ｇ；ＩＷＡＴＡＮＩ）を用いて１分間粉砕した後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により上清液を回収した。上清液に含まれるカフェイン、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、およびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）をＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて分析し、ペルオキシダーゼ活性（ＰＯＤ）を当該分野で周知の方法で測定した。
【００６６】
（結果および考察）
茶葉中カテキン含量およびペルオキシダーゼ活性の測定結果を図１に、各成分の含有率を図２に、そしてテアフラビン反応試験（プロトコールについては以下の実施例４を参照のこと）結果を図３に示す。時季を変えて採取した茶葉を分析したところ、図１および図２から分かるように、茶葉に含まれる総カテキン含量及びペルオキシダーゼ活性は８月をピークに次第に低下し、そして１月を過ぎると増加する傾向が見られた。これに対し、カフェインの含有率は、その総カテキン含量及びペルオキシダーゼ活性の傾向とは逆の傾向を示した。テアフラビン生産量は用いた茶葉に含まれるカテキン類の濃度に依存する。図３に見られるように、テアフラビン収率は６〜９月の間はほぼ一定であるが、それ以降は低下し、１月より再度上昇する傾向が見られた。
【００６７】
採取した茶葉の保存安定性の検討結果を図４に示す。尚、本実施例においては株式会社 荒畑園(静岡県 牧之原市)の茶葉を用いた。図4に示されるように、凍結茶葉においては６０日目まではほとんどそれに含まれる成分に変化は無いが、６０日以降カテキン含量が徐々に低下した。その一方、ペルオキシダーゼ活性は６０日以降急激に低下し、２００日目以降はほとんど変化しなかった。
【００６８】
以上の結果から、７〜９月頃の茶葉にはカフェイン含量率が少なく、カテキン類の含量が高いことから、テアフラビン製造に適していると考えられる。また、図４に示される茶葉の凍結保存安定性の結果から、カテキン類が分解すること無く保存できる日数は約６０日であることがわかった。
【００６９】
（実施例２ 加熱によるカフェインの除去）
テアフラビン純度を上げるには原料である茶由来のテアフラビン製造に不要な成分を除去することが重要である。そこで本実施例では、茶由来の不要成分であるカフェインの除去方法を検討した。
【００７０】
（試験方法）
茶葉１ｇに井水１００ｍＬを加え、それを７０℃、８０℃および９０℃の各温度で加熱処理した。脱水した茶葉に再度井水１００ｍＬを加えミキサー（ＩＦＭ−７５０Ｇ；ＩＷＡＴＡＮＩ）を用いて１分間粉砕した。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により得られた上清中のカフェインを含む各種成分の分析を行なった。
【００７１】
（結果）
７０℃、８０℃および９０℃の各温度で加熱後の茶葉に含まれるカテキン類（エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ））およびカフェインの含量とペルオキシダーゼ活性（ＰＯＤ）を図５に示す。図５から分かるように、７０℃処理では３０分間加熱処理してもカフェインの除去は確認できなかった。しかし、テアフラビン変換反応に必要なペルオキシダーゼ活性は完全に失活していた。８０℃で３分間加熱処理を行うとカフェインの約５８％が除去できたが、処理時間をそれより長くしてもそれ以上の除去は見られなかった。また、９０℃加熱処理は８０℃加熱処理とほぼ同じ結果であり、加熱処理によるカフェイン除去率は約６０％であった。また、テアフラビン反応の基質であるカテキン類には影響が無かったが、ペルオキシダーゼ活性はほぼ完全に失活した。したがって、カフェイン除去を行うことにより、茶葉からのテアフラビン変換反応へのペルオキシダーゼの供給は望めないことが明らかになった。
【００７２】
図６に、異なる量の加熱処理液量で加熱処理した場合のカテキン類およびカフェインの含量を示した。図６から分かるように、井水１００ｍＬに対して茶葉４ｇまではカフェイン除去率は５７％程度であったが、それ以上茶葉量を増やすとカフェイン除去率の低下が見られた。以上の結果から、茶葉からカフェインを除去するためには、多くとも茶葉約４ｇ／１００ｍＬ以下の濃度で行うのが望ましいことが分かった。
【００７３】
（実施例３ 茶細胞の培養培地の組成）
（目的）
テアフラビン変換反応を効率的に行うためには、十分な量のペルオキシダーゼを提供することが必要である。そのためには、酵素の供給源となる茶細胞の培養が重要である。茶細胞の培養に使用される従来の培地には、食品添加物として使用できない成分（例えば植物ホルモンや特定のビタミン類など）が必ず含まれていた。そこで、そのような成分を使用せずにテアフラビンを製造するための新規培地のための組成を検討した。
【００７４】
（試験方法）
用いた培地組成を以下の表１に示す。
【００７５】
（表１ 本実施例で使用した種々の培地の組成［ｇ／１００ｍＬ］）
【００７６】
【表１】
表１に示すＲＵＮ１〜ＲＵＮ５の各培地組成の培地の成分を井水１００ｍＬに溶解し、２００ｍＬ容三角フラスコに入れ、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）で殺菌した。茶細胞（本実験においては静岡県立大学 竹元講師より分譲いただいた茶細胞を使用したが、これ以外にも任意の茶細胞が使用され得る）を１０ｍＬずつ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで回転振とう培養を行なった。培養中に適宜経時的に試料を採取し、ペルオキシダーゼ活性、ｐＨ、残糖濃度を測定した。
【００７７】
（結果）
図７Ａに、表１に示した培地を用いて培養した茶細胞培養における、ペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す。図７Ａに示されるように、ビタミン類、Ｂ５塩類および植物ホルモンなどの食品添加物として使用できない成分を含まない酵母用培地で培養しても、ペルオキシダーゼが産生された。また、スクロースの量が５ｇ／１００ｍＬの酵母用培地で培養された培養物のペルオキシダーゼ活性はかなり低く、酵母用培地には１０ｇ／１００ｍＬ以上のスクロースを含めることが好ましいことが分かった。最も好ましいスクロース量は１５ｇ／１００ｍＬであることも明らかになった。
【００７８】
表１のＲＵＮ−３の培地組成を基に、ペプトンおよび酵母エキス濃度を変えた培地を用いて培養した茶細胞培養におけるペルオキシダーゼ活性の経時変化をさらに検討したところ、ペプトンを０．２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．４ｇ／１００ｍＬを含めた以下の培地組成の培地で培養した茶細胞培養物において、ペルオキシダーゼ活性が最も高いことが明らかになった（詳細なデータは示さず）。よって、以下の表２に示す培地組成を本発明における至適培地組成とした。
【００７９】
（表２ 至適培地組成［ｇ／１００ｍＬ］）
【００８０】
【表２】
また、スクロースに代えてグルコースを用いた場合のペルオキシダーゼ活性の変化についても検討した。以下の表３に示すスクロース培地およびグルコース培地の成分を井水１００ｍＬに溶解し、２００ｍＬ容三角フラスコに入れ、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）で殺菌した。茶細胞を１０ｍＬずつ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで回転振とう培養を行なった。適宜経時的に試料を採取し、ペルオキシダーゼ活性、ｐＨ、残糖濃度を測定した。
【００８１】
（表３ スクロース培地およびグルコース培地の組成）
【００８２】
【表３】
図７Ｂに、表３に示した培地を用いて培養した茶細胞培養における、培養開始直後（０日）、７日後、１５日後、２０日後、２８日後、３４日後、および４１日後のペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す。スクロース培地およびグルコース培地のいずれにおいても十分なペルオキシダーゼ活性が検出されたが、ペルオキシダーゼ活性が高い値を示す培養開始２８日〜３４日後付近では、スクロース培地で培養した培養物のペルオキシダーゼ活性がグルコース培地で培養した培養物のペルオキシダーゼ活性の約１．２倍ほどであった。このことから、本発明における微生物用培地における糖源はスクロースでもグルコースでもまたは他の糖であってもよいが、スクロースが特に好ましいと考えられる。
【００８３】
（実施例４ テアフラビン変換反応条件の検討）
（目的）
高効率のテアフラビン製造プロセスを構築する為には、原料のカテキン類を、最小量の酵素で短時間にテアフラビンに変換することが重要である。そこでカテキン量に対する酵素の至適濃度、および至適反応液量を検討した。
【００８４】
（試験方法）
乾燥茶葉１０ｇに井水を１００ｍＬ加えて５時間（２５℃）基質であるカテキン類を抽出し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間、室温）にて得られた上清を基質溶液とした。テアフラビン変換試験は２００ｍＬ容三角フラスコを用いて行い、表４に示す濃度に井水を用いて調整したカテキン類含有溶液に、茶細胞の培養上清液を加え、２５℃、１２０ｒｐｍの回転振とうにて行なった。反応液量は１００ｍＬである。なお、本明細書中の「Ｔｏｔａｌ Ｃａｔ．」とは反応の基質となるカテキン類の合計を示す。
【００８５】
（表４ ペルオキシダーゼ活性とカテキン類の組成に対するテアフラビン収量および収率）
【００８６】
【表４】
また、至適反応液量／仕込濃度の検討としてカテキン類総計（Ｔｏｔａｌ Ｃａｔ．）４４．８ｍｇ、ペルオキシダーゼ活性１．３単位とし、以下の表５に示すように反応液量を２５〜２００ｍＬと変えて同様の変換反応を行なった。
【００８７】
（表５ 反応液量の検討のための組成）
【００８８】
【表５】
（結果と考察）
表４の結果から、ペルオキシダーゼ活性に対するカテキン類濃度（Ｔｏｔａｌ Ｃａｔ．）が増加すると、テアフラビンの回収率も低下する傾向が見られた。また同時に、テアフラビン反応時間も長くなった（データ示さず）。一方、酵素活性に対して基質濃度を下げると、過反応により副産物の生成が観察された（データ示さず）。
【００８９】
表５のテアフラビン収量および収率の結果から、Ｔｏｔａｌ Ｃａｔ．／ペルオキシダーゼ＝４４．８／１．３＝３４．５で反応させた場合には反応液量として１００ｍＬ以上が至適であることがわかった。反応液量を１００ｍＬ未満にした場合、テアフラビン収率の著しい低下が観察された。この原因としては、上述のようにペルオキシダーゼ活性に対してカテキン類濃度を下げた場合と同様に過反応による副産物の生成や、または生成したテアフラビンの分解が考えられる。
【００９０】
以上の通り、効率的なテアフラビン変換反応を行うための反応組成としては、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬが好ましいことを見出した。
【００９１】
（実施例５ ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活条件の検討）
（目的）
テアフラビン変換反応終了後、ペルオキシダーゼ活性およびタンナーゼ活性が残存しているとテアフラビンが分解される。そこで、反応終了後にこれらの酵素活性を失活させることが好ましい。
【００９２】
５−１．ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活
（試験方法）
茶細胞の培養液から遠心分離（１４，０００ｒｐｍ，５分間）により回収した上清を酵素溶液とする。ｐＨ安定性を調べる為、７８％硫酸および４８％ＮａＯＨを用いてｐＨを３−９に調整し、２５℃で１時間静置後、当該分野で周知の方法によってペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性を測定した。熱安定性は、上清のｐＨを５に調整した後、３０−７０℃で１時間維持し、その後ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性を測定することによって検証した。
【００９３】
（結果）
ペルオキシダーゼ活性はｐＨ４−７では非常に安定であった。唯一ｐＨ３で約４割程度の失活が観察された（図８Ａを参照のこと）。また、熱に対しても５０℃まではほとんど失活しなかった（図８Ｂを参照のこと）。さらにｐＨを３に調整して７０℃で維持した結果、ペルオキシダーゼ活性は１０分間でほぼ失活していることが分かった（データ示さず）。
【００９４】
タンナーゼ活性は中性領域（ｐＨ４−８）では安定であるが、酸性域（＜ｐＨ４）では急激に失活する傾向が見られた（図９Ａを参照のこと）。また、熱安定性は比較的悪く、４０℃以上では急激に失活することが示された（図９Ｂを参照のこと）。ペルオキシダーゼと同様にｐＨを３に調整して７０℃で維持した結果、１０分間でほぼ失活した。
【００９５】
５−２．テアフラビンの安定性
ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活条件において、目的産物であるテアフラビンが分解されずに安定に残存するか否かを検証した。
【００９６】
（試験方法）
テアフラビン溶液のｐＨ安定性を調べる為に、７８％硫酸および４８％ＮａＯＨを用いてｐＨを３−９に調整し、２５℃で１時間静置後、テアフラビン残存率を測定した。熱安定性は、ｐＨを３に調整した後、３０−７０℃で１時間維持し、テアフラビン残存率を測定することにより検証した。
【００９７】
（結果）
テアフラビンは、酸性域（ｐＨ３−５）では比較的安定であるが中性から塩基性領域（ｐＨ６〜）においては著しく不安定であった（図１０Ａを参照のこと）。また、ｐＨを３に調整して７０℃で１時間の熱処理を行なってもほとんど分解されなかった（図１０Ｂを参照のこと）。
【００９８】
（実施例６ テアフラビン安定化剤の検討）
（目的）
テアフラビン変換反応終了から製品化までのテアフラビンの安定性を得るためには、酸化分解されやすいテアフラビンの分解を防ぐことが重要である。本発明においては、必要に応じてテアフラビンに抗酸化物質を加え、テアフラビンの酸化分解を防ぐことによりテアフラビンを安定化する。本実施例では、効果的にテアフラビンの酸化分解を防止する抗酸化物質の種類について検討した。
【００９９】
（試験方法）
テアフラビンの酸化分解を防止するために、各抗酸化物質を０．０５％濃度になるようにテアフラビン溶液に添加した後、７０℃で１時間維持し、テアフラビン残存率を測定した。
【０１００】
（結果と考察）
種々の抗酸化物質の影響を以下の表６に示す。各抗酸化物質の添加によってテアフラビンの安定性が向上することが実証された。特に硫酸およびアスコルビン酸において高い安定性効果が見られた。
【０１０１】
（表６ 種々の抗酸化物質の影響）
【０１０２】
【表６】
アスコルビン酸の添加濃度の影響を図１１に示す。アスコルビン酸添加濃度の増加に伴ってテアフラビンの安定性が向上することが分かった。特に０．１％以上の濃度では２５℃で５日間保存してもテアフラビンの分解はほとんど見られなかった（図１１Ａを参照のこと）。また、アスコルビン酸を０．１％の濃度で添加した場合、７０℃で１時間処理してもテアフラビンはほとんど分解しなかった（図１１Ｂを参照のこと）。
【０１０３】
次いで、硫酸によるｐＨ調整とアスコルビン酸添加の効果を検討した。その結果を以下の表７に示す。硫酸でｐＨを３．０に調整した場合とアスコルビン酸を０．１％の濃度で添加した場合（ｐＨ４．３）ではほぼ同等の安定性効果が得られた。
【０１０４】
（表７ 硫酸＋アスコルビン酸の効果）
【０１０５】
【表７】
以上の結果より、反応終了後に安定化剤としてアスコルビン酸を０．１（ｇ／Ｌ）％の濃度で添加して、７０℃に加温することにより、生成したテアフラビンを安定に保つことができると結論付けた。
【０１０６】
（実施例７ テアフラビン粉末化条件の検討）
（目的）
本発明のテアフラビン製造方法によってテアフラビンを量産化するにあたり、安定的にテアフラビン変換反応液を粉末化するプロセスが確立されていることが好ましい。そこでテアフラビン変換反応で得られたテアフラビン溶液を用いて粉末化プロセスについて検討した。
【０１０７】
７．１ テアフラビン変換反応液の粉末化
（試験方法）
茶葉１ｇに井水１００ｍＬを加え、それを８０℃で加熱処理した。脱水した茶葉に再度井水１００ｍＬを加えミキサー（ＩＦＭ−７５０Ｇ；ＩＷＡＴＡＮＩ）を用いて１分間粉砕したして茶葉粉砕液とした。スクロース１５ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．４ｇ／１００ｍＬ、ペプトン０．２ｇ／１００ｍＬ、ＫＮＯ３０．３ｇ／１００ｍＬ、（ＮＨ４）２ＳＯ４０．０５ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４０．０．３ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０．３ｇ／１００ｍＬ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．０．２ｇ／１００ｍＬ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０．２ｇ／１００ｍＬを含む酵母用培地（１００ｍＬ）に茶細胞を１０ｍＬ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで約３５時間回転振とう培養を行なって茶細胞培養液とした。茶葉粉砕液と茶細胞培養液とを２００ｍＬ容三角フラスコにペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬとなるように入れ、２５℃、１２０ｒｐｍの回転振とうにて約３〜５時間テアフラビン変換反応を行った。
【０１０８】
この反応液のｐＨを７８％Ｈ２ＳＯ４を用いて３に調製した後、７０℃で１０分間加熱処理を行いペルオキシダーゼおよびタンナーゼを失活させた。次に遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により粉砕茶葉を除去し、エバポレーターを用いてＢｒｉｘ（溶液中の固形分濃度）２０％を目標に濃縮液を調整した。得られた濃縮液を用いて凍結乾燥（ＦＤ）もしくは噴霧乾燥（ＳＤ）を用いてテアフラビン含有粉末を作成した。
【０１０９】
（結果）
テアフラビン変換反応により得られた変換反応液の組成を、以下の表８に示す。変換反応液のテアフラビン収率は４７％であり、Ｂｒｉｘは０．５％であった。
【０１１０】
（表８ 変換反応液の組成）
【０１１１】
【表８】
ｐＨ調整後の加熱処理によりペルオキシダーゼ、タンナーゼともに失活していることを確認し、エバポレーターを用いて濃縮を行なった。エバポレーターに変換反応液６００ｍＬを仕込、６０℃以下で運転させた場合、Ｂｒｉｘを２０％以上（４０倍濃縮）にするのに要する時間は約１時間であった。この濃縮工程でのテアフラビンを含む各成分の分解はほとんど見られず、変換反応液の組成（以下の表９を参照のこと）にほぼ変化はなかった。
【０１１２】
（表９ 濃縮後の変換反応液の組成）
【０１１３】
【表９】
次いで、濃縮液を用いて凍結乾燥および噴霧乾燥を行ない、粉末化試験を行った。ＦＤは３日間運転した。ＳＤは入口温度平均１５０℃（最大１６０℃）で運転し、出口温度は７０〜７５℃であった。試験結果を表１０に示す。ＳＤ、ＦＤともに粉末化工程中でのテアフラビンを含めた各成分の分解はほとんど見られなかった。製造した粉末中の各成分含量にも違いはほとんど見られなかった。今回試験したプロセスでテアフラビン３６重量％、カフェイン２５重量％、アスコルビン酸１７重量％、没食子酸含量６重量％の粉末を製造することが示された。
【０１１４】
（表１０ 粉末化試験の結果）
【０１１５】
【表１０】
７．２ 粉末安定性試験
（目的）
一定品質の製品を供給する為には、製品の安定性が重要である。そこで上記７．１において得られた凍結乾燥または噴霧乾燥で製造したテアフラビン含有粉末を用いて安定性試験を検討した。
【０１１６】
（試験方法）
テアフラビン含有粉末をアルミパウチにて保管後、４℃、２５℃、加速試験機（４０℃、湿度７５％）で保存した。適宜サンプリングを行い成分分析を行った
（結果）
安定性試験結果を図１２に示す。凍結乾燥で粉末化したテアフラビン粉末と噴霧乾燥で粉末化したテアフラビン粉末とは類似の挙動を示した。加速試験機では保管と同時に分解が始まることが示された。アスコルビン酸の添加により酸化を防いでいるが熱の影響が大きいと考えられる。４℃と２５℃で保存したサンプルでは、保存５０日目付近まではほぼ分解が見られないが、その後わずかながらＴＦの分解が見られ始めた。
【０１１７】
（実施例８ テアフラビン反応液の精製）
（目的）
よりテアフラビン含有率の高いテアフラビン製品を製造するためには、テアフラビン変換反応液中に含まれる茶葉由来のカフェインなどの不純物を除去することが好ましい。有機溶媒による抽出除去が一般的なカフェイン除去方法であるが、これは食品製造に適合しない方法である。そこで食品として対応可能なカフェイン除去方法を検討した。
【０１１８】
（試験方法）
茶葉１ｇに井水１００ｍＬを加え、それを８０℃で加熱処理した。脱水した茶葉に再度井水１００ｍＬを加えミキサー（ＩＦＭ−７５０Ｇ；ＩＷＡＴＡＮＩ）を用いて１分間粉砕したして茶葉粉砕液とした。スクロース１５ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．４ｇ／１００ｍＬ、ペプトン０．２ｇ／１００ｍＬ、ＫＮＯ３０．３ｇ／１００ｍＬ、（ＮＨ４）２ＳＯ４０．０５ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４０．０．３ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０．３ｇ／１００ｍＬ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．０．２ｇ／１００ｍＬ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０．２ｇ／１００ｍＬを含む酵母用培地（１００ｍＬ）に茶細胞を１０ｍＬ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで約３５時間回転振とう培養を行なって茶細胞培養液とした。茶葉粉砕液と茶細胞培養液とを２００ｍＬ容三角フラスコにペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬとなるように入れ、２５℃、１２０ｒｐｍの回転振とうにて約３〜５時間テアフラビン変換反応を行った。
【０１１９】
このテアフラビン変換反応液を用いてカラムクロマトグラフィーによる精製を検討した。カラムにはガラスカラム（３．０ｍｍＩ．Ｄ．×４０ｃｍ）に合成吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（三菱化学）を充填したものを用いた。溶出液にはエタノール溶液を用いて、エタノール濃度をステップワイズで変化させ溶出を行なった。
【０１２０】
（結果）
試験結果を図１３に示す。溶出液のエタノール濃度が１０％（溶出体積０〜４００ｍＬ）では、アスコルビン酸の溶出が確認できたが、テアフラビン、カフェイン、没食子酸、およびカテキン類の溶出はほとんど見られなかった。エタノール濃度を２０％に上げると（溶出体積４００〜１０００ｍＬ）、カフェイン、没食子酸、およびカテキン類の溶出が確認できた、テアフラビンの溶出は見られなかった。エタノール濃度を３０％に上げると（溶出体積１０００〜１７００ｍＬ）、テアフラビンの溶出が確認できた。このエタノール濃度３０％の画分には、ほぼテアフラビンしか含まれておらず、高純度のテアフラビンを得ることができた。各画分の組成を以下の表１１に示す。
【０１２１】
今回の試験によりエタノール濃度の勾配によりＴＦとカフェイン、没食子酸、およびカテキン類を分離できることが示された。しかしながら、カラムクロマトグラムによるテアフラビンの回収率は３７％であった。高純度のＴＦを調製することができたが回収率の問題が示された。今後、より詳細に条件を検討して回収率を上げる必要がある。
【０１２２】
（表１１ 各画分の含有成分）
【０１２３】
【表１１】
（実施例９ ５ｋＬ発酵槽による本発明の製造方法の実施）
以下に今回構築した製造プロセスを用いた５ｋＬ発酵槽による製品製造プロセスを示す。
【０１２４】
（１）茶葉の加熱処理によるカフェイン除去および茶葉の粉砕
原料になる生茶葉は５９．７ｋｇである。冷凍保存（−２０℃）した茶葉５９．７ｋｇを８０℃に加温した井水１，５００Ｌ中（至適比率は茶葉４ｇに対して井水１００ｍＬ）に浸透させ３分間加熱処理を行いカフェインを除去する。処理後、脱水機を用いて茶葉を回収する。
【０１２５】
加熱処理した茶葉を粉砕して基質となるカテキンを抽出する。加熱処理した茶葉１．０ｋｇに対して井水２５Ｌを加えて粉砕を行なう。マルチミルグラインダー（ＧＭ４−２５；グローエンジニアリング）を用いた場合、１８．０−２５．２ｋｇ・茶葉／時間の処理能力で茶葉を粉砕できる。得られる茶葉粉砕液は約１，５５０ｋＬである。この茶葉粉砕液に含まれるカテキン総量は約１，４００ｇである。
【０１２６】
（２）茶細胞の培養
２００Ｌ発酵槽（仕込量は１２０Ｌ）を用いて茶細胞を培養する。培養期間は約３０日間であり、培止時のペルオキシダーゼ活性は約５００ｍＵ／ｍＬである。
【０１２７】
（３）テアフラビン変換反応
安定したテアフラビン変換反応を行う為の至適な反応組成は、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬである（上記実施例４を参照のこと）。５ｋＬ発酵槽での反応液量は４ｋＬであるので、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝４０ｋ単位：１，４００ｇ：４ｋＬとする。５ｋＬ発酵槽に必要量の茶葉粉砕液、井水、茶細胞培養液を加えて反応を開始する。反応は２５℃で行なう。反応時間は３−５時間である。適宜反応液を採取し、成分分析を行なう。テアフラビン含量の増加が見られなくなった時点で反応を停止する。反応液の組成を表１２に示す。テアフラビン変換効率は約４５％付近であろう。
【０１２８】
（表１２ 反応液の組成）
【０１２９】
【表１２】
（５）ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活
上記反応液のｐＨを７８％Ｈ２ＳＯ４を用いて３に調製した後、この反応液を５ｋＬ発酵槽内で７０℃まで加熱し、７０℃で１０分間維持してペルオキシダーゼおよびタンナーゼを失活させる。次いで遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により粉砕茶葉を除去し上清液を回収する。
【０１３０】
（６）濃縮
エバポールを用いてＢｒｉｘ２０％を目標に、回収した上清液を濃縮する。エバポレーターを６０℃以下で運転させた場合、６００ｍＬをＢｒｉｘを２０％以上（約４０倍濃縮）にするのに必要な時間は約１時間である。安定化剤として濃縮液に対してアスコルビン酸を０．１重量％になるように添加する。
【０１３１】
（７）粉末化による製品の製造
噴霧乾燥により濃縮した反応液約１００Ｌを粉末化する。噴霧乾燥は入口温度を１５０℃で運転した。５ｋＬ発酵槽による製造により、テアフラビン３９．６重量％、カフェイン３０．３重量％、アスコルビン酸１４．６７重量％、没食子酸含有量７．１重量％の粉末を１．１４ｋｇ製造することができるであろう（以下の表１３を参照のこと）。本発明によるテアフラビンの製造効率は、食品添加物として使用できない成分（例えば植物ホルモンや特定のビタミン類など）を使用する従来法の効率に匹敵するものであり、十分に実用化に耐え得るものであることが明らかになった。
【０１３２】
（表１３ テアフラビン含有粉末の組成）
【０１３３】
【表１３】
（実施例１０ 高純度製品の製造）
高純度のテアフラビン製品を製造する為にはカラムクロマトグラフィーによる精製を行なう必要がある。５ｋＬ発酵槽による高純度製品を製造プロセスを以下に示す。
【０１３４】
（１）茶葉の加熱処理によるカフェイン除去および茶葉の粉砕
原料になる生茶葉は５９．７ｋｇである。冷凍保存（−２０℃）した茶葉５９．７ｋｇを８０℃に加温した井水１，５００Ｌ中（至適比率は茶葉４ｇに対して井水１００ｍＬ）に浸透させ３分間加熱処理を行いカフェインを除去する。処理後、脱水機を用いて茶葉を回収する。
【０１３５】
加熱処理した茶葉を粉砕して基質となるカテキンを抽出する。加熱処理した茶葉１．０ｋｇに対して井水２５Ｌを加えて粉砕を行なう。マルチミルグラインダー（ＧＭ４−２５；グローエンジニアリング）を用いた場合、１８．０−２５．２ｋｇ・茶葉／時間の処理能力で茶葉を粉砕できる。得られる茶葉粉砕液は約１，５５０ｋＬである。この茶葉粉砕液に含まれるカテキン総量は約１，４００ｇである。
【０１３６】
（２）茶細胞の培養
２００Ｌ発酵槽（仕込量は１２０Ｌ）を用いて茶細胞を培養した。培養期間は約３０日間であり、培止時のペルオキシダーゼ活性は約５００ｍＵ／ｍＬである。
【０１３７】
（３）テアフラビン変換反応
安定したテアフラビン変換反応を行う為の至適な反応組成は、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬである（上記実施例４を参照のこと）。５ｋＬ発酵槽での反応液量は４ｋＬであるので、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝４０ｋ単位：１，４００ｇ：４ｋＬとした。５ｋＬ発酵槽に必要量の茶葉粉砕液、井水、茶細胞培養液を加えて反応を開始する。反応は２５℃で行なう。反応時間は３−５時間である。適宜反応液を採取し、成分分析を行なう。テアフラビン含量の増加が見られなくなった時点で反応を停止する。反応液の組成は上記表１２に示したものと同一である。テアフラビン変換効率は約４５％付近である。
【０１３８】
（５）ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活
上記反応液のｐＨを７８％Ｈ２ＳＯ４を用いて３に調製した後、この反応液を５ｋＬ発酵槽内で７０℃まで加熱し、７０℃で１０分間維持してペルオキシダーゼおよびタンナーゼを失活させる。次いで遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により粉砕茶葉を除去し上清液を回収する。
【０１３９】
（６）精製
５ｋＬ発酵槽からの反応液４ｋＬを処理するのに３７．９ＬのＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（三菱化学）を充填した樹脂塔が必要である。精製操作は４℃で行う。溶出液にはエタノール（ＥｔＯＨ）溶液を用い、流速ＳＶ＝１．８で通液する。
【０１４０】
エタノール濃度を１０％〜４０％までステップワイズで変化させ各成分を溶出させる。１０％ＥｔＯＨでは各成分の溶出はほとんど見られないであろう。２０％ＥｔＯＨではカフェインとカテキン類の溶出が見られる。適宜溶出液の分析を行ないカフェインとカテキン類の溶出が終了したら、３０％ＥｔＯＨを通液する。ＴＦは３０％ＥｔＯＨ画分中に溶出される。適宜溶出液の分析を行ないテアフラビンの溶出が終了したら、４０％ＥｔＯＨを通液する。精製によるテアフラビンの収率及び組成を以下の表１４に示す。５ｋＬ発酵槽による製造から樹脂による精製工程を行なうことにより、テアフラビン９８．３重量％と高純度の製品を１９５．６ｇ製造することができるであろう。
【０１４１】
（表１４ テアフラビン精製粉末の収量）
【０１４２】
【表１４】
（実施例１１ テアフラビン混合物の機能性評価）
（１１−１ テアフラビン混合物の製造）
本実施例で使用したテアフラビンは、実施例8で作成した精製テアフラビン溶液に市販カフェイン(和光純薬工業株式会社)１０mgを添加して作成した。
【０１４３】
（１１−２ テアフラビン混合物の抗肥満効果、血糖値降下作用）
Ｃ５７ＢＬ６ の４週齢の雄のマウスを使用して、テアフラビンの抗肥満効果、血糖値降下作用について検証した。
【０１４４】
以下の表１５に示した普通食飼料（ＣＥ２、日本クレア（株）製）および高脂肪食飼料（Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２、日本クレア（株）製）を与えたマウスに対し、水またはテアフラビン混合物（水１００ｍｌあたりテアフラビン２ｍｇ、カフェイン１０ｍｇ）を含む飲料のいずれかを与え、体重、尾静脈随時及び尾静脈空腹時の血糖値推移を９ヶ月間検証した。
【０１４５】
（１）飼育実験
高脂肪食誘発肥満モデルマウスＣ５７ＢＬ６ の４週齢の雄性マウスを購入してから実験環境に慣らす為に７日間予備飼育してから健全な動物を実験に使用した。飼育室の環境は温度を２３±１℃、湿度を５５±５％の一定とし明暗は１２時間周期（明８：００-２０：００）とした。実験動物はプラスチック製のケージを用いて１つのケージあたり５匹のマウスを入れ動物飼育室内で飼育した。
【０１４６】
（表１５ 普通食餌料（ＣＥ２）、高脂肪食餌量（ＨＦＤ３２）の１００ｇ 中の成分量）
【０１４７】
【表１５】
（２）実験群及び実験条件
実験群は８群とし各群の数はｎ＝１０匹とした。各群に与えた餌料および飲料を以下の表１６に示す。なお、給餌及び給水は自由摂取とした。
【０１４８】
（表１６ 各群に与えた餌料および飲料）
【０１４９】
【表１６】
実験開始後、９ヶ月間の体重増加率変化を表１７に示す。体重増加率は飼育開始１週間後の体重を基準とし、以下の計算式に従って計算した。
体重増加率＝（測定月の体重−実験開始１週間後の体重）÷実験開始１週間後の体重×１００
（表１７ 各群の体重増加率）
【０１５０】
【表１７】
普通食−テアフラビン群（ＩＩ群）では普通食−水群（Ｉ群）と比較し、有意な体重増加率の差異は見られなかった。一方、高脂肪食−テアフラビン群（ＶＩ群）では高脂肪食−水群（ＩＩＩ群）と比較して平均６％程度体重増加率の減少が認められた。
【０１５１】
随時血糖値は午後１時に測定した。採血は尾静脈から行い、簡易血糖測定システム（テルモ社製）にて血糖値を測定した。測定結果を以下の表１８に示す。普通食−テアフラビン群（Ｉ群）では、コントロールである普通食−水群（ＩＩ群）に比べて随時血糖値は若干低下し、ほぼ１５０台で推移した。高脂肪食-テアフラビン群（ＶＩ群）では、高脂肪食−水群（ＩＩＩ群）に比べて随時血糖値が有意に低下し、ほぼ１７０から１８０台で推移した。
【０１５２】
（表１８ 各群の随時血糖値）
【０１５３】
【表１８】
さらに、プラスチックゲージに床敷も無い状態で１４時間絶食後の各群について空腹時血糖値を測定した。測定結果を以下の表１９に示す。普通食−水群（Ｉ群）と普通食−テアフラビン群（ＩＩ群）とは同程度の血糖値を示した。高脂肪食−テアフラビン群（ＶＩ群）では高脂肪食−水群（ＩＩＩ群）よりも血糖値が低下した。
【０１５４】
（表１９ 各群の空腹時血糖値）
【０１５５】
【表１９】
以上の結果から、体重に関しては、Ｉ群とＩＩ群とでは有意な差異は見られなかったが、ＩＩＩ群とＩＶ群とを比較すると、ＩＩＩ群に対してＩＶ群では体重増加度が８％低下した。したがって、本発明の製造方法によって製造されるテアフラビン混合物は、肥満予防効果を有するものであることが明らかになった。
【０１５６】
血糖値に関しては、Ｉ群とＩＩ群とでは有意な差異は見られなかったが、ＩＩＩ群とＩＶ群とを比較すると、ＩＩＩ群に対してＩＶ群では血糖値が２０％低下した。したがって、本発明の製造方法によって製造されるテアフラビン混合物は、血糖値上昇抑制効果を有するものであることが明らかになった。
【０１５７】
また、Ｉ群とＩＩ群とでは血糖値および体重について同様の測定結果が得られた事から、普通食を摂取する通常の状態では、テアフラビン混合物には血糖値を下げたり体重を下げる効果は認められず、安全性を有することが確認された。
【０１５８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加熱された生茶葉と微生物用培地中で培養された茶細胞とを用いるテアフラビンの製造方法、その製造方法によって製造されたテアフラビン、およびそのテアフラビンを含む食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
テアフラビンは、紅茶の製造工程で茶葉中の酵素により生成される赤色色素である。テアフラビンは抗酸化作用、血糖降下作用、抗菌作用などの生理活性を有することが近年明らかになり、天然着色料としてのみならず、生理活性物質としての有用性も期待されている。
【０００３】
テアフラビンの製造方法としては紅茶葉からの抽出および生合成が知られていた。紅茶葉から抽出される場合、テアフラビンは以下のように３つのガロイルエステル体を含むテアフラビン類として抽出される。
【０００４】
【化１】
紅茶中に含まれる上記４つの化合物のおよその比率は、テアフラビン：０．０８重量％、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート：０．３重量％、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート：０．２重量％、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート：０．４重量％である。このように紅茶中のテアフラビン含有量は少ないため、従来の紅茶葉からの抽出によるテアフラビンの製造方法では、生理活性物質としてテアフラビンを使用するために十分な量および収率でテアフラビンを得ることは到底できなかった。
【０００５】
その一方、テアフラビンの生合成法としては、フェリシアン化カリウムを用いる方法、酵素試料（やぶきた若葉の水不溶画分）を用いる方法、茶葉から得られたポリフェノールオキシダーゼを用いる方法、緑茶抽出液とポリフェノール酸化酵素を含有する植物抽出液とを用いる方法、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる方法、加工緑茶葉とポリフェノールオキシダーゼとを接触させる方法、緑茶のスラリーをタンナーゼで処理し、アルゴン又は窒素雰囲気下で醗酵させる方法、生葉の搾汁を醗酵させることによる方法などが知られている。しかしながら、いずれの方法においても、紅茶からの抽出法と同様に、生理活性物質としてテアフラビンを使用するために十分な量および収率でテアフラビンを得ることは到底できなかった。
【０００６】
特許文献１および２は、培養した茶細胞から得たペルオキシダーゼ（ペルオキシダーゼ）およびタンナーゼなどの加水分解酵素をテアフラビン変換反応の酵素として利用したテアフラビン製造方法を報告している（特許文献１：「テアフラビン類の合成法」、特許文献２：「テアフラビンの選択的製造方法」）。これら製造法では、副反応が少なく従来法と比較して高収率でテアフラビンを合成することができる。これらの製造方法は、従来の方法と異なり安価にテアフラビンを選択的に高収率で製造することができる。しかしながら、特許文献１および２の方法によって製造されたテアフラビンはその製造過程で食品添加物として使用できない植物ホルモンやＢ５塩類などの成分を用いるため、得られたテアフラビンを食品組成物に添加することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１４３４６１号公報
【特許文献２】特願２００７−１８２２１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安価かつ高収率で、そして製造されたテアフラビンまたはテアフラビンを含む組成物を食品に直接使用することができるようなテアフラビン製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、植物細胞である茶細胞が微生物用培地中で培養されても、従来法である植物用培地中での培養と同様にテアフラビン変換反応に必要なペルオキシダーゼまたはタンナーゼを産生することを、全く予想外に見出した。そしてその発見に基づいて、加熱された生茶葉と微生物用培地中で培養された茶細胞とを用いる、安価かつ高収率で食品への応用が容易なテアフラビン製造方法を開発した。この製造方法は、（１）加熱により原料の茶由来の主要な不要成分であるカフェインが分解されるため、その分目的産物であるテアフラビンの純度が向上する、（２）食品添加物として使用できない植物ホルモンやＢ５塩類などの成分を用いないため、得られたテアフラビンを食品組成物に添加することが可能であり食品への応用が容易である、等の従来からは予想外の優れた効果を奏するものである。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、
（１）茶を含む原料を加熱する工程、
（２）上記（１）工程で加熱した該原料を粉砕する工程、
（３）微生物用培地において、茶細胞を培養し茶細胞培養物を得る工程、および
（４）上記（２）工程で粉砕された該原料と該（３）工程で培養された該茶細胞培養物とを反応させてテアフラビンを生成する工程
を包含するテアフラビンの製造方法を提供する。
【００１１】
一局面において、上記微生物用培地は、糖、窒素源および無機塩類を含む酵母用培地である。
【００１２】
一局面において、上記糖はスクロースおよびグルコースからなる群より選択される。
【００１３】
一局面において、本発明のテアフラビン製造方法は、上記（３）工程における反応物に含まれる酵素を失活させる工程をさらに包含する。
【００１４】
一局面において、上記失活させる工程は、上記反応物を酸性にすることおよび／または加温することにより行われる。
【００１５】
一局面において、本発明のテアフラビン製造方法は、テアフラビンを回収する工程をさらに包含する。
【００１６】
一局面において、上記回収は吸着樹脂により行われる。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、本発明のテアフラビン製造方法によって製造された実質的に純粋なテアフラビンを提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、本発明のテアフラビン製造方法によって製造されたテアフラビンを含む食品組成物を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、本発明のテアフラビン製造方法によって製造されたテアフラビンを含む肥満予防用食品組成物を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、本発明のテアフラビン製造方法によって製造されたテアフラビンを含む血糖値上昇抑制用食品組成物を提供する。
【００２１】
一局面において、上記食品組成物は高脂肪食と組み合わせて摂取されるものである。
【００２２】
一局面において、上記食品組成物はテアフラビンの安定化剤をさらに含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、安価かつ高収率であり、そして製造されたテアフラビンの食品への応用が容易であるテアフラビン製造方法が提供される。この製造方法は、（１）加熱により原料の茶由来の主要な不要成分であるカフェインが分解されるため、その分目的産物であるテアフラビンの純度が向上する、（２）製造過程において食品添加物として使用できない植物ホルモンやＢ５塩類などの成分を用いないため、得られたテアフラビンを食品組成物に添加することが可能であり食品への応用が容易である、等の優れた効果を奏するものである。
【００２４】
したがって本発明により種々の生理活性を有するテアフラビンを安価に高収率で製造し、それを容易に食品に応用して食品組成物として提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、採取時期の異なる原料茶葉の各々についての、含まれるカテキン類（ＥＣ：エピカテキン、ＥＣＧ：エピガロカテキン、ＥＣＧ：エピカテキン−３−Ｏ−ガレート、ＥＧＣＧ：エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）およびカフェインの含量、ならびにペルオキシダーゼ活性（ＰＯＤ）を示す。
【図２】図２は、採取時期の異なる原料茶葉の各々について、含まれるカテキン類およびカフェインの含有率を示す。
【図３】図３は、採取時期の異なる原料茶葉の各々を用いたテアフラビン（ＴＦ）変換試験結果を示す。
【図４】図４は、−８０℃での凍結保存の間のカテキン類含量およびペルオキシダーゼ活性の変化を示す。
【図５】図５は、異なる加熱処理条件で茶葉を処理した場合のカテキン類およびカフェインの含量を示す。
【図６】図６は、異なる量の加熱処理液量で加熱処理した場合のカテキン類およびカフェインの含量を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、種々のスクロース量の培地において茶細胞培養を行った培養物におけるペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、糖源としてそれぞれスクロースまたはグルコースを含有する培地において茶細胞培養を行った培養物におけるペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す。縦軸はペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）活性（Ｕ／ｍｌ）を示し、横軸は培養時間（日）を示す。
【図８Ａ】図８（Ａ）は、ｐＨに対するペルオキシダーゼの安定性試験結果を示す。
【図８Ｂ】図８（Ｂ）は、熱に対するペルオキシダーゼの安定性試験結果を示す。
【図９Ａ】図９（Ａ）は、ｐＨに対するタンナーゼの安定性試験結果を示す。
【図９Ｂ】図９（Ｂ）は、熱に対するタンナーゼの安定性試験結果を示す。
【図１０Ａ】図１０（Ａ）は、ｐＨに対するテアフラビンの安定性試験結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０（Ｂ）は、熱に対するテアフラビンの安定性試験結果を示す。
【図１１Ａ】図１１は、テアフラビンの安定性に対するアスコルビン酸の添加効果を示す。図１１Ａはテアフラビンの安定性に対するアスコルビン酸の添加濃度の影響を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、テアフラビンの安定性に対するアスコルビン酸の添加効果を示す。図１１Ｂは０．１％の濃度でアスコルビン酸を添加されたテアフラビン溶液の熱安定性を示す。
【図１２】図１２は、凍結乾燥または噴霧乾燥により粉末化された、本発明の製造方法によって得られたテアフラビン粉末の安定性試験結果を示す。
【図１３】図１３は、テアフラビンの精製結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先される。
【００２７】
本発明者らは、茶細胞の微生物用培地培養物を酵素源とし、茶葉抽出液を基質源として利用したテアフラビン含有粉末の製造方法を構築した。
【００２８】
本発明の製造方法は原料として生茶葉を利用する。生茶葉を加熱処理した後、粉砕し茶葉抽出液を調製する。この抽出液には、生茶葉に含まれているカテキン類が溶出されておりテアフラビン反応の基質となる。
【００２９】
茶葉抽出液へのカフェインの抽出量を軽減させて目的産物であるテアフラビンの収率を上げるために、本発明の製造方法は加熱処理工程を包含する。この加熱処理工程中にテアフラビン変換反応に必要な茶葉中の酵素が失活するため、別に酵素を供給してカテキンを酸化させるテアフラビン変換反応を行なう。この酵素の供給が、従来の植物用培地ではなく微生物用培地で培養された茶細胞培養物を添加することによって達成される点が本発明の重要な特徴である。微生物用培地は一般的に、食品組成物に用いることができない成分（例えば特定のビタミン類や植物ホルモンなど）を含まない。よって、本発明の微生物用培地で培養された茶細胞培養物を用いることにより、植物ホルモンやＢ５塩類などの食品添加物として使用できない成分を用いずにテアフラビンが製造されるので、得られたテアフラビンは食品組成物に添加することが可能である。このことにより、テアフラビンの食品組成物への応用が極めて容易になる。この茶細胞培養物はテアフラビン変換反応に必要なペルオキシダーゼおよびタンナーゼを含んでいる。この茶細胞培養物中のペルオキシダーゼおよびタンナーゼを用いてテアフラビン変換反応が行なわれる。必要に応じてテアフラビン生成後にテアフラビン変換反応を停止するために、ペルオキシダーゼおよびタンナーゼを失活させ得る。必要に応じて、遠心分離により上清を回収し、その上清を濃縮して噴霧乾燥もしくは凍結乾燥によりテアフラビンが粉末化され得る。
【００３０】
（テアフラビン）
本明細書において「テアフラビン」とは、下記の一般式：
【００３１】
【化２】
で表されるベンゾトロポロン環を有する化合物をいう。本発明における製造方法では、テアフラビンは茶に含まれるエピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）とを反応させることにより生成される。この反応は以下の式によって表される。
【００３２】
【化３】
また、エピカテキンおよびエピガロカテキンは、茶において酵素反応によりエピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）およびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）からガレートが脱離することによっても生成され得る。本明細書では、これらのエピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートをまとめて「カテキン類」と総称する。
【００３３】
（茶の加熱）
本明細書において「茶」とは、一般的な茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓまたはＣａｍｅｌｌｉａ ａｓｓａｍｉｃａ）をいう。本発明において原料として使用される茶の部位は、実生、葉、子葉、茎、果実など特に限定されないが、好ましくは葉または茎である。茶の品種としては、やぶきた、おくひかり、山の息吹、さやまかおり、かなやみどり、するがわせなどが挙げられるが、本発明においては茶の品種は特に重要ではない。以下の実施例１の結果より、７月〜９月付近に採取された茶は、テアフラビン合成の出発物質であるエピカテキンやエピガロカテキンを含むカテキン類の含量が多く、また不純物であるカフェインの含有率が少ないことから、本発明の製造方法における原料として好ましい。図１〜３も参照のこと。また同様に実施例１の結果より、採取から６０日以内の茶が本発明の製造方法における原料として好ましい。図４も参照のこと。しかしながら本発明の製造方法における原料としての茶は、特に採取時期や採取からの経過日数によっては限定されない。
【００３４】
茶由来のカフェインはテアフラビン製造に不要な成分である。よってテアフラビンの純度を上げるために、本発明の製造方法においてはまず原料の茶を加熱してカフェインを除去する。この加熱処理は約８０℃〜約９０℃で約１分間以上、約３分間以上、約３分間〜約５分間、約３分間、約４分間、または約５分間行われる。好ましくはこの加熱処理は、約８０℃で約１分間以上、約３分間以上、約３分間〜約５分間、約３分間、約４分間、または約５分間行われる。この加熱処理により、原料である茶に含まれるカフェインの約４０％以上、約５０％以上または約６０％以上が除去される。より好ましくは、この加熱処理により、原料である茶に含まれるカフェインの約５０％以上、具体的には約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％または約６０％以上が除去される。この加熱処理により、茶におけるペルオキシダーゼ活性はほぼ完全に失活する。
【００３５】
（加熱した茶の粉砕）
本発明においては、上述のようにして加熱された茶を脱水して粉砕し、後の反応に供する。粉砕は当業者に公知の方法により行われる。例えば本発明においては、加熱して脱水された茶に適当量（例えば茶１ｇにつき水１００ｍＬ）を加えてミキサーを用いて粉砕する。
【００３６】
（茶細胞の培養）
本発明で使用される「茶細胞」は、茶の生組織を含む切片を用いて、当業者に周知の一般的なカルス作成方法に基づいてカルスを誘導し、それを培地に移して培養することにより調製される。本発明の茶細胞培養物は、固体培地でこの茶細胞を培養して得られる細胞培養物および液体培地を用いて得られる培養細胞の培養懸濁物のいずれであってもよい。このようにして得られた茶細胞培養物は、茶細胞自身によって産生されたペルオキシダーゼおよびタンナーゼを含み、これらの酵素がその後のテアフラビン変換反応において作用する。
【００３７】
上記切片の培養は、代表的に、まず切片を滅菌処理しこれを寒天培地などの固体培地上で培養してカルスを誘導することにより行われる。次いで、誘導されたカルスを同様の固体培地上または液体培地上で十分に増殖させる。上記滅菌は、エタノール表面殺菌、次亜塩素酸塩による処理、滅菌した蒸留イオン交換水による洗浄などにより行われる。
【００３８】
本発明者らは、茶細胞が植物用培地ではなく微生物用培地で培養した場合にも正常に培養され、そして活性を有するペルオキシダーゼやタンナーゼを産生することを見出した。茶細胞を植物用培地ではなく微生物用培地で培養することにより、その後のテアフラビン変換反応を経て得られるテアフラビンと培地との混合物をそのまま食品に適用することが可能になる。したがって、本発明において、茶細胞は植物用培地ではなく微生物用培地において培養される。従来は植物である茶の細胞が微生物用培地で培養できるとは考えられておらず、さらに活性を有するペルオキシダーゼやタンナーゼなどの酵素を正常に産生するとは極めて予想外であった。
【００３９】
本明細書において「微生物用培地」とは、細菌や真菌を含む微生物の培養において用いられ、かつ植物ホルモンやＢ５塩類などの食品添加物として使用できない成分を含まない、任意の培地を含む。本発明において利用可能な微生物培地としては、例えばYPD培地、グルコース・酵母エキス培地 （酵母・カビ用培)、PGY培地、高浸透圧培地(酵母用培地)などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの培地は、生物工学実験書(培風館)、微生物学実験法(講談社再演ティフィク)などの実験書に記載されている。本発明における培地は、固体培地であっても液体培地であってもよい。本発明の微生物用培地は、例えば約１０ｇ／１００ｍＬ以上、より好ましくは約１５ｇ／１００ｍＬ以上の糖を含む。より具体的には、本発明の微生物用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬ、約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬまたは約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬの糖を含む。より好ましい実施形態において、本発明の微生物用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬの糖を含む。特に好ましい実施形態において、本発明の微生物用培地は、約１５ｇ／１００ｍＬの糖を含む。
【００４０】
本発明における微生物用培地の糖としては、グルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトース、フルクトースなどが挙げられるがこれらに限定されず、当該分野で公知の糖が使用され得る。本発明における微生物用培地の糖は好ましくはスクロースまたはグルコースであり、より好ましくはスクロースである。
【００４１】
本発明の微生物用培地は、糖（好ましくはスクロースまたはグルコース、より好ましくはスクロース）の他に窒素源または無機塩類を含み得る。窒素源としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液のような有機窒素源、または硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、塩化アンモニウムのような無機窒素源が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物用培地は、１または複数の窒素源を含み得る。無機塩類としては、例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物用培地は、１または複数の無機塩類を含み得る。しかしながら、本発明の微生物用培地は、食品添加物として使用できない成分（例えば植物ホルモン、ニコチン酸塩、ピリドキシン塩酸塩、Ｂ５塩類など）を含まない。
【００４２】
本発明において好ましい微生物用培地は酵母用培地である。本明細書における「酵母用培地」は、代表的に糖、窒素源および無機塩類を含み得る。本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ以上、より好ましくは約１５ｇ／１００ｍＬ以上の糖を含む。より具体的には、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬ、約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬまたは約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬの糖を含む。より好ましい実施形態において、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬの糖を含む。特に好ましい実施形態において、本発明の酵母用培地は約１５ｇ／１００ｍＬの糖を含む。
【００４３】
本発明における酵母用培地の糖としては、グルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトース、フルクトースなどが挙げられるがこれらに限定されず、当該分野で公知の糖が使用され得る。本発明における酵母用培地の糖は好ましくはスクロースまたはグルコースであり、より好ましくはスクロースである。
【００４４】
したがって、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ以上、より好ましくは約１５ｇ／１００ｍＬ以上のスクロースを含み得る。より具体的には、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬ、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬ、約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２５ｇ／１００ｍＬまたは約１５ｇ／１００ｍＬ〜約２０ｇ／１００ｍＬのスクロースを含み得る。より好ましい実施形態において、本発明の酵母用培地は、約１０ｇ／１００ｍＬ〜約１５ｇ／１００ｍＬのスクロースを含み得る。特に好ましい実施形態において、本発明の酵母用培地は約１５ｇ／１００ｍＬのスクロースを含み得る。
【００４５】
一つの実施形態において、本発明の酵母用培地は、１または複数の窒素源を含み得る。本発明の酵母用培地において使用される窒素源としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液のような有機窒素源、または硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、塩化アンモニウムのような無機窒素源が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態において本発明の酵母用培地は必要に応じて、酵母エキスまたはペプトンなどの有機窒素源を含む。本発明の酵母用培地は必要に応じて、例えば約０．１ｇ／１００ｍＬ〜約０．４ｇ／１００ｍＬ、好ましくは約０．４ｇ／１００ｍＬの酵母エキス、または約０．１ｇ／１００ｍＬ〜約０．２ｇ／１００ｍＬ、好ましくは約０．２ｇ／１００ｍＬのペプトン、あるいはこれらの組み合わせを含む。本発明の酵母用培地において使用される酵母エキスとしては、例えばミーストＮ（オリエンタル酵母工業(株））が挙げられ、ペプトンとしては例えばＣＥ９０Ｍ（アサヒフードアンドヘルスケア(株））が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、使用する培地に含める有機窒素源の種類および量を適切に決定することができる。ある実施形態において、本発明の酵母用培地は、約０．３ｇ／１００ｍＬの硝酸カリウムまたは約０．０５ｇ／１００ｍＬの硫酸アンモニウム、あるいはこれらの組み合わせを含む。上記に列挙した以外の窒素源は当業者に周知であり、そのような窒素源もまた本発明の酵母用培地に含まれ得る。当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、使用する培地に含める窒素源の種類および量を適切に決定することができる。
【００４６】
一つの実施形態において、本発明の酵母用培地は、１または複数のこれらの無機塩類を含み得る。本発明の酵母用培地において使用される無機塩類としては、例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態において、本発明の酵母用培地は、約０．０．３ｇ／１００ｍＬのリン酸二水素カリウム、約０．０．３ｇ／１００ｍＬの硫酸マグネシウム、約０．０．２ｇ／１００ｍＬのリン酸二水素ナトリウムまたは約０．０．２ｇ／１００ｍＬのリン酸カルシウム、あるいはこれらの組み合わせを含む。上記に列挙した以外の無機塩類は当業者に周知であり、そのような無機塩類もまた本発明の酵母用培地に含まれ得る。当業者は、当該分野の技術常識に基づいて、使用する培地に含める無機塩類の種類および量を適切に決定することができる。
【００４７】
本発明の微生物用培地および／または酵母用培地は、食品添加物として使用できない成分（例えば植物ホルモン、ニコチン酸塩、ピリドキシン塩酸塩、Ｂ５塩類など）を含まない。本明細書中で「食品添加物として使用できない成分」とは、食品または食品添加物中の成分としての使用できないこれらの植物ホルモンやＢ５塩類などの任意の成分をいう。本発明の微生物用培地および／または酵母用培地は植物ホルモンを含まない点に特に注目すべきである。植物ホルモンとしては、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド、ジャスモン酸、フロリゲン、およびストリゴラクトンなどが挙げられるがこれらに限定されない。Ｂ５塩類は、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｏ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ａ．，Ｏｊｉｍａ Ｋ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，１５１−１５８（１９６８）などにおいて説明されており、当業者に周知である。
茶細胞のような植物細胞を培養するためには、培地に植物ホルモンなどの上記物質を加えることが当該分野では技術常識であった。そのため、上記物質を含まない培地で茶細胞を培養したとしても、テアフラビン変換反応を効率的に起こす量のペルオキシダーゼおよび／またはタンナーゼが茶細胞によって分泌されるとは、当業者は考えていなかった。しかしながら、本発明者らは、上記物質を含まない培地で茶細胞を培養したとしても、テアフラビン変換反応を効率的に起こす量のペルオキシダーゼおよび／またはタンナーゼが茶細胞によって十分に分泌されることを予想外に見出した。このようにして上記物質を含まない培地を使用して茶細胞を培養することにより、最終産物であるテアフラビンは、食品添加物として使用できない成分を用いずに得られるため、得られたテアフラビンを食品組成物に添加することができる。
【００４８】
（テアフラビン変換反応）
本発明のテアフラビン製造方法において、加熱してカフェインを除去してその後粉砕した茶原料と、食品添加物として使用できない成分を含まない微生物用培地（好ましくは酵母用培地）で茶細胞を培養した茶細胞培養物とを反応させることにより、テアフラビン変換反応を起こす。テアフラビンは、以下
【００４９】
【化４】
の式に従う変換反応によって生成される。竹元万壽美：テアフラビンの選択的製造方法（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６２５７９（２００８）および竹元万壽美：テアフラビンの選択的製造方法 特願２００７−１８２２１７（２００７）などを参照のこと。
【００５０】
テアフラビンの変換反応は代表的に、約２８時間から約３４時間、常温で回転振とうすることによって行われる。また、安定したテアフラビン変換反応を行うためのペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量は、１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬが最適であることが見出された（実施例４を参照のこと）。
【００５１】
（酵素の失活）
テアフラビン変換反応終了後、茶細胞培養物に含まれるペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性が残存していることにより、産物であるテアフラビンが分解される。従って、本発明の一実施形態において、テアフラビン変換反応終了後に、ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性を失活させる。ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性を失活は、テアフラビンを分解しない条件で行われなければならないことに留意すべきである。本発明の一実施形態において、ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性の失活は、ｐＨ３で１０分間７０℃に維持することにより行われる。
【００５２】
（テアフラビンの安定化剤）
本明細書において、「テアフラビンの安定化剤」とは、テアフラビンの分解を防止する任意の物質をいう。テアフラビンは酸化分解されやすい物質であるため、本発明においては、必要に応じてテアフラビンに抗酸化物質を加え、テアフラビンを安定化する。従って、本発明の一実施形態においては、テアフラビンの安定化剤は抗酸化物質である。テアフラビンの安定化剤として使用され得る抗酸化物質としては、硫酸、アスコルビン酸、クエン酸、没食子酸、トコフェロール、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明における好ましいテアフラビン安定化剤はアスコルビン酸である。本発明において製造されたテアフラビンは、約０．１％以上のアスコルビン酸を含み得る。テアフラビンに約０．１％のアスコルビン酸を含めることによって、２５℃で５日間経過後に約９８％のテアフラビンが分解されずに残存する。一方、アスコルビン酸を含まない場合には、２５℃で２日経過後には約１０％のテアフラビンしか残存せず、３日経過後にはほぼ全てのテアフラビンが酸化分解されてしまう。
【００５３】
（反応液の粉末化）
上記テアフラビン変換反応後の反応液を健康食品に適用するためには、反応で得られたテアフラビンをほとんど分解することなく高収率で粉末化することが好ましい。反応液の粉末化は、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥により行うことができる。例えば、本発明における粉末化は、約３日間またはそれ以上凍結乾燥を行うことにより達成され得る。本発明における粉末化はまた、入口温度平均１５０℃、出口温度７０℃〜７５℃で所望の量の粉末化が達成されるまで噴霧乾燥を行うことによっても達成され得る。粉末化においては、反応で得られたテアフラビンを分解することなく行うことが重要である。よって、反応液に上記テアフラビン安定化剤を含めて粉末化を行うことが好ましい。
【００５４】
（テアフラビンの精製）
本発明の製造方法では、必要に応じてテアフラビン変換反応液からテアフラビンを回収することによってテアフラビンを精製し、高純度のテアフラビンを得る。この精製によって、テアフラビン変換反応液中に含まれる茶葉由来のカフェインなどの不純物を除去することができる。カフェインの除去のためには、例えば有機溶媒による抽出除去が一般的であるが、この方法は食品製造に適合したものではないことから、本発明においては使用されない。本発明において使用される精製方法は、例えば吸着樹脂による精製が挙げられるがこれに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、ガラスカラムのようなカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによってテアフラビンの精製が行われる。樹脂としては例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（三菱化学）が使用され得、そして溶出液にはエタノールが使用され得る。目的産物であるテアフラビンは３０％エタノール画分に溶出する。しかしながら、本発明の精製はこの方法に限定されるものではない。
【００５５】
（食品組成物）
本発明の方法を使用して製造されたテアフラビンを基に、テアフラビン含有食品組成物が当業者に周知の方法によって製造され得る。
【００５６】
本発明の食品組成物は、テアフラビン粉末またはテアフラビン含有培養物をそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦型剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等とすることにより、製造され得る。これらの食品組成物におけるテアフラビン量は一律には規定しがたいが、テアフラビン１０〜１，０００ｍｇ／日、より好ましくは、５０〜４００ｍｇ／日である。本発明の食品組成物は、肥満予防または血糖値上昇抑制のために使用され得る。
【００５７】
本発明における「肥満予防」とは、例えば高脂肪食の摂取などの肥満促進要因による肥満を防ぐことをいう。単に体重を減少させるのではなく、肥満促進要因によって引き起こされる所望されない肥満のみを防ぐ点において、テアフラビンは健康的かつ安全な物質であることが理解される。実際に、本発明の製造方法によって製造されたテアフラビン含有食品組成物を普通食とともに与えたマウスにおいては、体重に変化がなかった（実施例１１を参照のこと）。
【００５８】
本発明における「血糖値上昇抑制」とは、例えば高脂肪食の摂取などの血糖値上昇要因による血糖値上昇を抑制することをいう。肥満予防と同様に、単に血糖値を下げるのではなく、血糖値上昇要因によって引き起こされる所望されない血糖値上昇のみを抑制する点において、テアフラビンは健康的かつ安全な物質であることが理解される。実際に、本発明の製造方法によって製造されたテアフラビン含有食品組成物を普通食とともに与えたマウスにおいては、血糖値に変化がなかった（実施例１１を参照のこと）。
【００５９】
ある実施形態において、本発明のテアフラビンは高脂肪食と混合して摂取され得る。別の実施形態においては、本発明のテアフラビンは高脂肪食と組み合わせて摂取され得る。本発明のテアフラビンが高脂肪食と組み合わせて摂取される場合、高脂肪食摂取の前にテアフラビンを摂取してもよいし、高脂肪食摂取と同時にテアフラビンを摂取してもよいし、高脂肪食摂取の後にテアフラビンを摂取してもよい。
【００６０】
本明細書中で「高脂肪食」とは、それを摂取した被験体において肥満および／または血糖値上昇を引き起し得る任意の食餌をいう。より具体的には、脂肪含有量が約３．４ｋｃａｌ／ｇを超え、普通食には該当しない食餌を「高脂肪食」という。本発明の実施形態においては、高脂肪食とは代表的に、約５ｋｃａｌ／ｇ以上の脂肪を含む食餌をいう。
【００６１】
本発明のテアフラビン含有食品組成物は、特に、健康食品またはサプリメントをいう。本発明の食品組成物は、テアフラビンを含有する任意の製品をいう。本発明の飲食組成物は、代表的に、以下の実施例において実証されるように肥満予防および／または血糖値上昇抑制という効果を有し、またこれらの効果を表示して販売されている。本発明のテアフラビン含有食品組成物は、肥満促進要因および／または血糖値上昇要因と組み合わせて摂取されたときに、それらの要因によって引き起こされ得る肥満および／または血糖値上昇を抑制する。一方、肥満促進要因および／または血糖値上昇要因などの所望されない要因が存在しない場合には、本発明のテアフラビン含有食品組成物は、摂取した被験体に対して有意な効果を及ぼさない。これはテアフラビンの従来全く知られていなかった機能である。健常な状態にある被験体においては体重減少や血糖値低下を引き起こすことなく、高脂肪食のような肥満促進要因および／または血糖値上昇要因を摂取した被験体においてその要因に起因する肥満および／または血糖値上昇を抑制する点において、本発明のテアフラビン含有食品組成物は予想外の驚くべき効果を奏する。
【００６２】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００６３】
以上、本発明を理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明した。以下に実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではないことが理解されるべきである。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００６４】
（実施例１ 原料としての茶の条件検討）
テアフラビンを高い効率で製造する為には、原料の茶に含まれるテアフラビンを得るための基質成分を把握することが重要である。そこで本実施例では茶葉を時季を変えて適宜採取し、その中に含まれる成分の変化を一年を通して把握した。これらの結果から、テアフラビン製造に最も適した茶の調達時期を決定した。
【００６５】
（試験方法）
磐田市内の茶葉畑から時季を変えて茶葉を採取し、その茶葉を酸化を防ぐために−８０℃で凍結し保存した。凍結した茶葉１ｇに井水１００ｍＬ（４℃）を加え、ミキサー（ＩＦＭ−７５０Ｇ；ＩＷＡＴＡＮＩ）を用いて１分間粉砕した後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により上清液を回収した。上清液に含まれるカフェイン、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、およびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）をＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて分析し、ペルオキシダーゼ活性（ＰＯＤ）を当該分野で周知の方法で測定した。
【００６６】
（結果および考察）
茶葉中カテキン含量およびペルオキシダーゼ活性の測定結果を図１に、各成分の含有率を図２に、そしてテアフラビン反応試験（プロトコールについては以下の実施例４を参照のこと）結果を図３に示す。時季を変えて採取した茶葉を分析したところ、図１および図２から分かるように、茶葉に含まれる総カテキン含量及びペルオキシダーゼ活性は８月をピークに次第に低下し、そして１月を過ぎると増加する傾向が見られた。これに対し、カフェインの含有率は、その総カテキン含量及びペルオキシダーゼ活性の傾向とは逆の傾向を示した。テアフラビン生産量は用いた茶葉に含まれるカテキン類の濃度に依存する。図３に見られるように、テアフラビン収率は６〜９月の間はほぼ一定であるが、それ以降は低下し、１月より再度上昇する傾向が見られた。
【００６７】
採取した茶葉の保存安定性の検討結果を図４に示す。尚、本実施例においては株式会社 荒畑園(静岡県 牧之原市)の茶葉を用いた。図4に示されるように、凍結茶葉においては６０日目まではほとんどそれに含まれる成分に変化は無いが、６０日以降カテキン含量が徐々に低下した。その一方、ペルオキシダーゼ活性は６０日以降急激に低下し、２００日目以降はほとんど変化しなかった。
【００６８】
以上の結果から、７〜９月頃の茶葉にはカフェイン含量率が少なく、カテキン類の含量が高いことから、テアフラビン製造に適していると考えられる。また、図４に示される茶葉の凍結保存安定性の結果から、カテキン類が分解すること無く保存できる日数は約６０日であることがわかった。
【００６９】
（実施例２ 加熱によるカフェインの除去）
テアフラビン純度を上げるには原料である茶由来のテアフラビン製造に不要な成分を除去することが重要である。そこで本実施例では、茶由来の不要成分であるカフェインの除去方法を検討した。
【００７０】
（試験方法）
茶葉１ｇに井水１００ｍＬを加え、それを７０℃、８０℃および９０℃の各温度で加熱処理した。脱水した茶葉に再度井水１００ｍＬを加えミキサー（ＩＦＭ−７５０Ｇ；ＩＷＡＴＡＮＩ）を用いて１分間粉砕した。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により得られた上清中のカフェインを含む各種成分の分析を行なった。
【００７１】
（結果）
７０℃、８０℃および９０℃の各温度で加熱後の茶葉に含まれるカテキン類（エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ））およびカフェインの含量とペルオキシダーゼ活性（ＰＯＤ）を図５に示す。図５から分かるように、７０℃処理では３０分間加熱処理してもカフェインの除去は確認できなかった。しかし、テアフラビン変換反応に必要なペルオキシダーゼ活性は完全に失活していた。８０℃で３分間加熱処理を行うとカフェインの約５８％が除去できたが、処理時間をそれより長くしてもそれ以上の除去は見られなかった。また、９０℃加熱処理は８０℃加熱処理とほぼ同じ結果であり、加熱処理によるカフェイン除去率は約６０％であった。また、テアフラビン反応の基質であるカテキン類には影響が無かったが、ペルオキシダーゼ活性はほぼ完全に失活した。したがって、カフェイン除去を行うことにより、茶葉からのテアフラビン変換反応へのペルオキシダーゼの供給は望めないことが明らかになった。
【００７２】
図６に、異なる量の加熱処理液量で加熱処理した場合のカテキン類およびカフェインの含量を示した。図６から分かるように、井水１００ｍＬに対して茶葉４ｇまではカフェイン除去率は５７％程度であったが、それ以上茶葉量を増やすとカフェイン除去率の低下が見られた。以上の結果から、茶葉からカフェインを除去するためには、多くとも茶葉約４ｇ／１００ｍＬ以下の濃度で行うのが望ましいことが分かった。
【００７３】
（実施例３ 茶細胞の培養培地の組成）
（目的）
テアフラビン変換反応を効率的に行うためには、十分な量のペルオキシダーゼを提供することが必要である。そのためには、酵素の供給源となる茶細胞の培養が重要である。茶細胞の培養に使用される従来の培地には、食品添加物として使用できない成分（例えば植物ホルモンや特定のビタミン類など）が必ず含まれていた。そこで、そのような成分を使用せずにテアフラビンを製造するための新規培地のための組成を検討した。
【００７４】
（試験方法）
用いた培地組成を以下の表１に示す。
【００７５】
（表１ 本実施例で使用した種々の培地の組成［ｇ／１００ｍＬ］）
【００７６】
【表１】
表１に示すＲＵＮ１〜ＲＵＮ５の各培地組成の培地の成分を井水１００ｍＬに溶解し、２００ｍＬ容三角フラスコに入れ、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）で殺菌した。茶細胞（本実験においては静岡県立大学 竹元講師より分譲いただいた茶細胞を使用したが、これ以外にも任意の茶細胞が使用され得る）を１０ｍＬずつ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで回転振とう培養を行なった。培養中に適宜経時的に試料を採取し、ペルオキシダーゼ活性、ｐＨ、残糖濃度を測定した。
【００７７】
（結果）
図７Ａに、表１に示した培地を用いて培養した茶細胞培養における、ペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す。図７Ａに示されるように、ビタミン類、Ｂ５塩類および植物ホルモンなどの食品添加物として使用できない成分を含まない酵母用培地で培養しても、ペルオキシダーゼが産生された。また、スクロースの量が５ｇ／１００ｍＬの酵母用培地で培養された培養物のペルオキシダーゼ活性はかなり低く、酵母用培地には１０ｇ／１００ｍＬ以上のスクロースを含めることが好ましいことが分かった。最も好ましいスクロース量は１５ｇ／１００ｍＬであることも明らかになった。
【００７８】
表１のＲＵＮ−３の培地組成を基に、ペプトンおよび酵母エキス濃度を変えた培地を用いて培養した茶細胞培養におけるペルオキシダーゼ活性の経時変化をさらに検討したところ、ペプトンを０．２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．４ｇ／１００ｍＬを含めた以下の培地組成の培地で培養した茶細胞培養物において、ペルオキシダーゼ活性が最も高いことが明らかになった（詳細なデータは示さず）。よって、以下の表２に示す培地組成を本発明における至適培地組成とした。
【００７９】
（表２ 至適培地組成［ｇ／１００ｍＬ］）
【００８０】
【表２】
また、スクロースに代えてグルコースを用いた場合のペルオキシダーゼ活性の変化についても検討した。以下の表３に示すスクロース培地およびグルコース培地の成分を井水１００ｍＬに溶解し、２００ｍＬ容三角フラスコに入れ、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）で殺菌した。茶細胞を１０ｍＬずつ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで回転振とう培養を行なった。適宜経時的に試料を採取し、ペルオキシダーゼ活性、ｐＨ、残糖濃度を測定した。
【００８１】
（表３ スクロース培地およびグルコース培地の組成）
【００８２】
【表３】
図７Ｂに、表３に示した培地を用いて培養した茶細胞培養における、培養開始直後（０日）、７日後、１５日後、２０日後、２８日後、３４日後、および４１日後のペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す。スクロース培地およびグルコース培地のいずれにおいても十分なペルオキシダーゼ活性が検出されたが、ペルオキシダーゼ活性が高い値を示す培養開始２８日〜３４日後付近では、スクロース培地で培養した培養物のペルオキシダーゼ活性がグルコース培地で培養した培養物のペルオキシダーゼ活性の約１．２倍ほどであった。このことから、本発明における微生物用培地における糖源はスクロースでもグルコースでもまたは他の糖であってもよいが、スクロースが特に好ましいと考えられる。
【００８３】
（実施例４ テアフラビン変換反応条件の検討）
（目的）
高効率のテアフラビン製造プロセスを構築する為には、原料のカテキン類を、最小量の酵素で短時間にテアフラビンに変換することが重要である。そこでカテキン量に対する酵素の至適濃度、および至適反応液量を検討した。
【００８４】
（試験方法）
乾燥茶葉１０ｇに井水を１００ｍＬ加えて５時間（２５℃）基質であるカテキン類を抽出し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間、室温）にて得られた上清を基質溶液とした。テアフラビン変換試験は２００ｍＬ容三角フラスコを用いて行い、表４に示す濃度に井水を用いて調整したカテキン類含有溶液に、茶細胞の培養上清液を加え、２５℃、１２０ｒｐｍの回転振とうにて行なった。反応液量は１００ｍＬである。なお、本明細書中の「Ｔｏｔａｌ Ｃａｔ．」とは反応の基質となるカテキン類の合計を示す。
【００８５】
（表４ ペルオキシダーゼ活性とカテキン類の組成に対するテアフラビン収量および収率）
【００８６】
【表４】
また、至適反応液量／仕込濃度の検討としてカテキン類総計（Ｔｏｔａｌ Ｃａｔ．）４４．８ｍｇ、ペルオキシダーゼ活性１．３単位とし、以下の表５に示すように反応液量を２５〜２００ｍＬと変えて同様の変換反応を行なった。
【００８７】
（表５ 反応液量の検討のための組成）
【００８８】
【表５】
（結果と考察）
表４の結果から、ペルオキシダーゼ活性に対するカテキン類濃度（Ｔｏｔａｌ Ｃａｔ．）が増加すると、テアフラビンの回収率も低下する傾向が見られた。また同時に、テアフラビン反応時間も長くなった（データ示さず）。一方、酵素活性に対して基質濃度を下げると、過反応により副産物の生成が観察された（データ示さず）。
【００８９】
表５のテアフラビン収量および収率の結果から、Ｔｏｔａｌ Ｃａｔ．／ペルオキシダーゼ＝４４．８／１．３＝３４．５で反応させた場合には反応液量として１００ｍＬ以上が至適であることがわかった。反応液量を１００ｍＬ未満にした場合、テアフラビン収率の著しい低下が観察された。この原因としては、上述のようにペルオキシダーゼ活性に対してカテキン類濃度を下げた場合と同様に過反応による副産物の生成や、または生成したテアフラビンの分解が考えられる。
【００９０】
以上の通り、効率的なテアフラビン変換反応を行うための反応組成としては、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬが好ましいことを見出した。
【００９１】
（実施例５ ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活条件の検討）
（目的）
テアフラビン変換反応終了後、ペルオキシダーゼ活性およびタンナーゼ活性が残存しているとテアフラビンが分解される。そこで、反応終了後にこれらの酵素活性を失活させることが好ましい。
【００９２】
５−１．ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活
（試験方法）
茶細胞の培養液から遠心分離（１４，０００ｒｐｍ，５分間）により回収した上清を酵素溶液とする。ｐＨ安定性を調べる為、７８％硫酸および４８％ＮａＯＨを用いてｐＨを３−９に調整し、２５℃で１時間静置後、当該分野で周知の方法によってペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性を測定した。熱安定性は、上清のｐＨを５に調整した後、３０−７０℃で１時間維持し、その後ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの酵素活性を測定することによって検証した。
【００９３】
（結果）
ペルオキシダーゼ活性はｐＨ４−７では非常に安定であった。唯一ｐＨ３で約４割程度の失活が観察された（図８Ａを参照のこと）。また、熱に対しても５０℃まではほとんど失活しなかった（図８Ｂを参照のこと）。さらにｐＨを３に調整して７０℃で維持した結果、ペルオキシダーゼ活性は１０分間でほぼ失活していることが分かった（データ示さず）。
【００９４】
タンナーゼ活性は中性領域（ｐＨ４−８）では安定であるが、酸性域（＜ｐＨ４）では急激に失活する傾向が見られた（図９Ａを参照のこと）。また、熱安定性は比較的悪く、４０℃以上では急激に失活することが示された（図９Ｂを参照のこと）。ペルオキシダーゼと同様にｐＨを３に調整して７０℃で維持した結果、１０分間でほぼ失活した。
【００９５】
５−２．テアフラビンの安定性
ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活条件において、目的産物であるテアフラビンが分解されずに安定に残存するか否かを検証した。
【００９６】
（試験方法）
テアフラビン溶液のｐＨ安定性を調べる為に、７８％硫酸および４８％ＮａＯＨを用いてｐＨを３−９に調整し、２５℃で１時間静置後、テアフラビン残存率を測定した。熱安定性は、ｐＨを３に調整した後、３０−７０℃で１時間維持し、テアフラビン残存率を測定することにより検証した。
【００９７】
（結果）
テアフラビンは、酸性域（ｐＨ３−５）では比較的安定であるが中性から塩基性領域（ｐＨ６〜）においては著しく不安定であった（図１０Ａを参照のこと）。また、ｐＨを３に調整して７０℃で１時間の熱処理を行なってもほとんど分解されなかった（図１０Ｂを参照のこと）。
【００９８】
（実施例６ テアフラビン安定化剤の検討）
（目的）
テアフラビン変換反応終了から製品化までのテアフラビンの安定性を得るためには、酸化分解されやすいテアフラビンの分解を防ぐことが重要である。本発明においては、必要に応じてテアフラビンに抗酸化物質を加え、テアフラビンの酸化分解を防ぐことによりテアフラビンを安定化する。本実施例では、効果的にテアフラビンの酸化分解を防止する抗酸化物質の種類について検討した。
【００９９】
（試験方法）
テアフラビンの酸化分解を防止するために、各抗酸化物質を０．０５％濃度になるようにテアフラビン溶液に添加した後、７０℃で１時間維持し、テアフラビン残存率を測定した。
【０１００】
（結果と考察）
種々の抗酸化物質の影響を以下の表６に示す。各抗酸化物質の添加によってテアフラビンの安定性が向上することが実証された。特に硫酸およびアスコルビン酸において高い安定性効果が見られた。
【０１０１】
（表６ 種々の抗酸化物質の影響）
【０１０２】
【表６】
アスコルビン酸の添加濃度の影響を図１１に示す。アスコルビン酸添加濃度の増加に伴ってテアフラビンの安定性が向上することが分かった。特に０．１％以上の濃度では２５℃で５日間保存してもテアフラビンの分解はほとんど見られなかった（図１１Ａを参照のこと）。また、アスコルビン酸を０．１％の濃度で添加した場合、７０℃で１時間処理してもテアフラビンはほとんど分解しなかった（図１１Ｂを参照のこと）。
【０１０３】
次いで、硫酸によるｐＨ調整とアスコルビン酸添加の効果を検討した。その結果を以下の表７に示す。硫酸でｐＨを３．０に調整した場合とアスコルビン酸を０．１％の濃度で添加した場合（ｐＨ４．３）ではほぼ同等の安定性効果が得られた。
【０１０４】
（表７ 硫酸＋アスコルビン酸の効果）
【０１０５】
【表７】
以上の結果より、反応終了後に安定化剤としてアスコルビン酸を０．１（ｇ／Ｌ）％の濃度で添加して、７０℃に加温することにより、生成したテアフラビンを安定に保つことができると結論付けた。
【０１０６】
（実施例７ テアフラビン粉末化条件の検討）
（目的）
本発明のテアフラビン製造方法によってテアフラビンを量産化するにあたり、安定的にテアフラビン変換反応液を粉末化するプロセスが確立されていることが好ましい。そこでテアフラビン変換反応で得られたテアフラビン溶液を用いて粉末化プロセスについて検討した。
【０１０７】
７．１ テアフラビン変換反応液の粉末化
（試験方法）
茶葉１ｇに井水１００ｍＬを加え、それを８０℃で加熱処理した。脱水した茶葉に再度井水１００ｍＬを加えミキサー（ＩＦＭ−７５０Ｇ；ＩＷＡＴＡＮＩ）を用いて１分間粉砕したして茶葉粉砕液とした。スクロース１５ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．４ｇ／１００ｍＬ、ペプトン０．２ｇ／１００ｍＬ、ＫＮＯ３０．３ｇ／１００ｍＬ、（ＮＨ４）２ＳＯ４０．０５ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４０．０．３ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０．３ｇ／１００ｍＬ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．０．２ｇ／１００ｍＬ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０．２ｇ／１００ｍＬを含む酵母用培地（１００ｍＬ）に茶細胞を１０ｍＬ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで約３５時間回転振とう培養を行なって茶細胞培養液とした。茶葉粉砕液と茶細胞培養液とを２００ｍＬ容三角フラスコにペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬとなるように入れ、２５℃、１２０ｒｐｍの回転振とうにて約３〜５時間テアフラビン変換反応を行った。
【０１０８】
この反応液のｐＨを７８％Ｈ２ＳＯ４を用いて３に調製した後、７０℃で１０分間加熱処理を行いペルオキシダーゼおよびタンナーゼを失活させた。次に遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により粉砕茶葉を除去し、エバポレーターを用いてＢｒｉｘ（溶液中の固形分濃度）２０％を目標に濃縮液を調整した。得られた濃縮液を用いて凍結乾燥（ＦＤ）もしくは噴霧乾燥（ＳＤ）を用いてテアフラビン含有粉末を作成した。
【０１０９】
（結果）
テアフラビン変換反応により得られた変換反応液の組成を、以下の表８に示す。変換反応液のテアフラビン収率は４７％であり、Ｂｒｉｘは０．５％であった。
【０１１０】
（表８ 変換反応液の組成）
【０１１１】
【表８】
ｐＨ調整後の加熱処理によりペルオキシダーゼ、タンナーゼともに失活していることを確認し、エバポレーターを用いて濃縮を行なった。エバポレーターに変換反応液６００ｍＬを仕込、６０℃以下で運転させた場合、Ｂｒｉｘを２０％以上（４０倍濃縮）にするのに要する時間は約１時間であった。この濃縮工程でのテアフラビンを含む各成分の分解はほとんど見られず、変換反応液の組成（以下の表９を参照のこと）にほぼ変化はなかった。
【０１１２】
（表９ 濃縮後の変換反応液の組成）
【０１１３】
【表９】
次いで、濃縮液を用いて凍結乾燥および噴霧乾燥を行ない、粉末化試験を行った。ＦＤは３日間運転した。ＳＤは入口温度平均１５０℃（最大１６０℃）で運転し、出口温度は７０〜７５℃であった。試験結果を表１０に示す。ＳＤ、ＦＤともに粉末化工程中でのテアフラビンを含めた各成分の分解はほとんど見られなかった。製造した粉末中の各成分含量にも違いはほとんど見られなかった。今回試験したプロセスでテアフラビン３６重量％、カフェイン２５重量％、アスコルビン酸１７重量％、没食子酸含量６重量％の粉末を製造することが示された。
【０１１４】
（表１０ 粉末化試験の結果）
【０１１５】
【表１０】
７．２ 粉末安定性試験
（目的）
一定品質の製品を供給する為には、製品の安定性が重要である。そこで上記７．１において得られた凍結乾燥または噴霧乾燥で製造したテアフラビン含有粉末を用いて安定性試験を検討した。
【０１１６】
（試験方法）
テアフラビン含有粉末をアルミパウチにて保管後、４℃、２５℃、加速試験機（４０℃、湿度７５％）で保存した。適宜サンプリングを行い成分分析を行った
（結果）
安定性試験結果を図１２に示す。凍結乾燥で粉末化したテアフラビン粉末と噴霧乾燥で粉末化したテアフラビン粉末とは類似の挙動を示した。加速試験機では保管と同時に分解が始まることが示された。アスコルビン酸の添加により酸化を防いでいるが熱の影響が大きいと考えられる。４℃と２５℃で保存したサンプルでは、保存５０日目付近まではほぼ分解が見られないが、その後わずかながらＴＦの分解が見られ始めた。
【０１１７】
（実施例８ テアフラビン反応液の精製）
（目的）
よりテアフラビン含有率の高いテアフラビン製品を製造するためには、テアフラビン変換反応液中に含まれる茶葉由来のカフェインなどの不純物を除去することが好ましい。有機溶媒による抽出除去が一般的なカフェイン除去方法であるが、これは食品製造に適合しない方法である。そこで食品として対応可能なカフェイン除去方法を検討した。
【０１１８】
（試験方法）
茶葉１ｇに井水１００ｍＬを加え、それを８０℃で加熱処理した。脱水した茶葉に再度井水１００ｍＬを加えミキサー（ＩＦＭ−７５０Ｇ；ＩＷＡＴＡＮＩ）を用いて１分間粉砕したして茶葉粉砕液とした。スクロース１５ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．４ｇ／１００ｍＬ、ペプトン０．２ｇ／１００ｍＬ、ＫＮＯ３０．３ｇ／１００ｍＬ、（ＮＨ４）２ＳＯ４０．０５ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４０．０．３ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０．３ｇ／１００ｍＬ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．０．２ｇ／１００ｍＬ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０．２ｇ／１００ｍＬを含む酵母用培地（１００ｍＬ）に茶細胞を１０ｍＬ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで約３５時間回転振とう培養を行なって茶細胞培養液とした。茶葉粉砕液と茶細胞培養液とを２００ｍＬ容三角フラスコにペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬとなるように入れ、２５℃、１２０ｒｐｍの回転振とうにて約３〜５時間テアフラビン変換反応を行った。
【０１１９】
このテアフラビン変換反応液を用いてカラムクロマトグラフィーによる精製を検討した。カラムにはガラスカラム（３．０ｍｍＩ．Ｄ．×４０ｃｍ）に合成吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（三菱化学）を充填したものを用いた。溶出液にはエタノール溶液を用いて、エタノール濃度をステップワイズで変化させ溶出を行なった。
【０１２０】
（結果）
試験結果を図１３に示す。溶出液のエタノール濃度が１０％（溶出体積０〜４００ｍＬ）では、アスコルビン酸の溶出が確認できたが、テアフラビン、カフェイン、没食子酸、およびカテキン類の溶出はほとんど見られなかった。エタノール濃度を２０％に上げると（溶出体積４００〜１０００ｍＬ）、カフェイン、没食子酸、およびカテキン類の溶出が確認できた、テアフラビンの溶出は見られなかった。エタノール濃度を３０％に上げると（溶出体積１０００〜１７００ｍＬ）、テアフラビンの溶出が確認できた。このエタノール濃度３０％の画分には、ほぼテアフラビンしか含まれておらず、高純度のテアフラビンを得ることができた。各画分の組成を以下の表１１に示す。
【０１２１】
今回の試験によりエタノール濃度の勾配によりＴＦとカフェイン、没食子酸、およびカテキン類を分離できることが示された。しかしながら、カラムクロマトグラムによるテアフラビンの回収率は３７％であった。高純度のＴＦを調製することができたが回収率の問題が示された。今後、より詳細に条件を検討して回収率を上げる必要がある。
【０１２２】
（表１１ 各画分の含有成分）
【０１２３】
【表１１】
（実施例９ ５ｋＬ発酵槽による本発明の製造方法の実施）
以下に今回構築した製造プロセスを用いた５ｋＬ発酵槽による製品製造プロセスを示す。
【０１２４】
（１）茶葉の加熱処理によるカフェイン除去および茶葉の粉砕
原料になる生茶葉は５９．７ｋｇである。冷凍保存（−２０℃）した茶葉５９．７ｋｇを８０℃に加温した井水１，５００Ｌ中（至適比率は茶葉４ｇに対して井水１００ｍＬ）に浸透させ３分間加熱処理を行いカフェインを除去する。処理後、脱水機を用いて茶葉を回収する。
【０１２５】
加熱処理した茶葉を粉砕して基質となるカテキンを抽出する。加熱処理した茶葉１．０ｋｇに対して井水２５Ｌを加えて粉砕を行なう。マルチミルグラインダー（ＧＭ４−２５；グローエンジニアリング）を用いた場合、１８．０−２５．２ｋｇ・茶葉／時間の処理能力で茶葉を粉砕できる。得られる茶葉粉砕液は約１，５５０ｋＬである。この茶葉粉砕液に含まれるカテキン総量は約１，４００ｇである。
【０１２６】
（２）茶細胞の培養
２００Ｌ発酵槽（仕込量は１２０Ｌ）を用いて茶細胞を培養する。培養期間は約３０日間であり、培止時のペルオキシダーゼ活性は約５００ｍＵ／ｍＬである。
【０１２７】
（３）テアフラビン変換反応
安定したテアフラビン変換反応を行う為の至適な反応組成は、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬである（上記実施例４を参照のこと）。５ｋＬ発酵槽での反応液量は４ｋＬであるので、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝４０ｋ単位：１，４００ｇ：４ｋＬとする。５ｋＬ発酵槽に必要量の茶葉粉砕液、井水、茶細胞培養液を加えて反応を開始する。反応は２５℃で行なう。反応時間は３−５時間である。適宜反応液を採取し、成分分析を行なう。テアフラビン含量の増加が見られなくなった時点で反応を停止する。反応液の組成を表１２に示す。テアフラビン変換効率は約４５％付近であろう。
【０１２８】
（表１２ 反応液の組成）
【０１２９】
【表１２】
（５）ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活
上記反応液のｐＨを７８％Ｈ２ＳＯ４を用いて３に調製した後、この反応液を５ｋＬ発酵槽内で７０℃まで加熱し、７０℃で１０分間維持してペルオキシダーゼおよびタンナーゼを失活させる。次いで遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により粉砕茶葉を除去し上清液を回収する。
【０１３０】
（６）濃縮
エバポールを用いてＢｒｉｘ２０％を目標に、回収した上清液を濃縮する。エバポレーターを６０℃以下で運転させた場合、６００ｍＬをＢｒｉｘを２０％以上（約４０倍濃縮）にするのに必要な時間は約１時間である。安定化剤として濃縮液に対してアスコルビン酸を０．１重量％になるように添加する。
【０１３１】
（７）粉末化による製品の製造
噴霧乾燥により濃縮した反応液約１００Ｌを粉末化する。噴霧乾燥は入口温度を１５０℃で運転した。５ｋＬ発酵槽による製造により、テアフラビン３９．６重量％、カフェイン３０．３重量％、アスコルビン酸１４．６７重量％、没食子酸含有量７．１重量％の粉末を１．１４ｋｇ製造することができるであろう（以下の表１３を参照のこと）。本発明によるテアフラビンの製造効率は、食品添加物として使用できない成分（例えば植物ホルモンや特定のビタミン類など）を使用する従来法の効率に匹敵するものであり、十分に実用化に耐え得るものであることが明らかになった。
【０１３２】
（表１３ テアフラビン含有粉末の組成）
【０１３３】
【表１３】
（実施例１０ 高純度製品の製造）
高純度のテアフラビン製品を製造する為にはカラムクロマトグラフィーによる精製を行なう必要がある。５ｋＬ発酵槽による高純度製品を製造プロセスを以下に示す。
【０１３４】
（１）茶葉の加熱処理によるカフェイン除去および茶葉の粉砕
原料になる生茶葉は５９．７ｋｇである。冷凍保存（−２０℃）した茶葉５９．７ｋｇを８０℃に加温した井水１，５００Ｌ中（至適比率は茶葉４ｇに対して井水１００ｍＬ）に浸透させ３分間加熱処理を行いカフェインを除去する。処理後、脱水機を用いて茶葉を回収する。
【０１３５】
加熱処理した茶葉を粉砕して基質となるカテキンを抽出する。加熱処理した茶葉１．０ｋｇに対して井水２５Ｌを加えて粉砕を行なう。マルチミルグラインダー（ＧＭ４−２５；グローエンジニアリング）を用いた場合、１８．０−２５．２ｋｇ・茶葉／時間の処理能力で茶葉を粉砕できる。得られる茶葉粉砕液は約１，５５０ｋＬである。この茶葉粉砕液に含まれるカテキン総量は約１，４００ｇである。
【０１３６】
（２）茶細胞の培養
２００Ｌ発酵槽（仕込量は１２０Ｌ）を用いて茶細胞を培養した。培養期間は約３０日間であり、培止時のペルオキシダーゼ活性は約５００ｍＵ／ｍＬである。
【０１３７】
（３）テアフラビン変換反応
安定したテアフラビン変換反応を行う為の至適な反応組成は、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝１単位：２０〜３５ｍｇ：１００ｍＬである（上記実施例４を参照のこと）。５ｋＬ発酵槽での反応液量は４ｋＬであるので、ペルオキシダーゼ活性：総カテキン量：反応液量＝４０ｋ単位：１，４００ｇ：４ｋＬとした。５ｋＬ発酵槽に必要量の茶葉粉砕液、井水、茶細胞培養液を加えて反応を開始する。反応は２５℃で行なう。反応時間は３−５時間である。適宜反応液を採取し、成分分析を行なう。テアフラビン含量の増加が見られなくなった時点で反応を停止する。反応液の組成は上記表１２に示したものと同一である。テアフラビン変換効率は約４５％付近である。
【０１３８】
（５）ペルオキシダーゼおよびタンナーゼの失活
上記反応液のｐＨを７８％Ｈ２ＳＯ４を用いて３に調製した後、この反応液を５ｋＬ発酵槽内で７０℃まで加熱し、７０℃で１０分間維持してペルオキシダーゼおよびタンナーゼを失活させる。次いで遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により粉砕茶葉を除去し上清液を回収する。
【０１３９】
（６）精製
５ｋＬ発酵槽からの反応液４ｋＬを処理するのに３７．９ＬのＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（三菱化学）を充填した樹脂塔が必要である。精製操作は４℃で行う。溶出液にはエタノール（ＥｔＯＨ）溶液を用い、流速ＳＶ＝１．８で通液する。
【０１４０】
エタノール濃度を１０％〜４０％までステップワイズで変化させ各成分を溶出させる。１０％ＥｔＯＨでは各成分の溶出はほとんど見られないであろう。２０％ＥｔＯＨではカフェインとカテキン類の溶出が見られる。適宜溶出液の分析を行ないカフェインとカテキン類の溶出が終了したら、３０％ＥｔＯＨを通液する。ＴＦは３０％ＥｔＯＨ画分中に溶出される。適宜溶出液の分析を行ないテアフラビンの溶出が終了したら、４０％ＥｔＯＨを通液する。精製によるテアフラビンの収率及び組成を以下の表１４に示す。５ｋＬ発酵槽による製造から樹脂による精製工程を行なうことにより、テアフラビン９８．３重量％と高純度の製品を１９５．６ｇ製造することができるであろう。
【０１４１】
（表１４ テアフラビン精製粉末の収量）
【０１４２】
【表１４】
（実施例１１ テアフラビン混合物の機能性評価）
（１１−１ テアフラビン混合物の製造）
本実施例で使用したテアフラビンは、実施例8で作成した精製テアフラビン溶液に市販カフェイン(和光純薬工業株式会社)１０mgを添加して作成した。
【０１４３】
（１１−２ テアフラビン混合物の抗肥満効果、血糖値降下作用）
Ｃ５７ＢＬ６ の４週齢の雄のマウスを使用して、テアフラビンの抗肥満効果、血糖値降下作用について検証した。
【０１４４】
以下の表１５に示した普通食飼料（ＣＥ２、日本クレア（株）製）および高脂肪食飼料（Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２、日本クレア（株）製）を与えたマウスに対し、水またはテアフラビン混合物（水１００ｍｌあたりテアフラビン２ｍｇ、カフェイン１０ｍｇ）を含む飲料のいずれかを与え、体重、尾静脈随時及び尾静脈空腹時の血糖値推移を９ヶ月間検証した。
【０１４５】
（１）飼育実験
高脂肪食誘発肥満モデルマウスＣ５７ＢＬ６ の４週齢の雄性マウスを購入してから実験環境に慣らす為に７日間予備飼育してから健全な動物を実験に使用した。飼育室の環境は温度を２３±１℃、湿度を５５±５％の一定とし明暗は１２時間周期（明８：００-２０：００）とした。実験動物はプラスチック製のケージを用いて１つのケージあたり５匹のマウスを入れ動物飼育室内で飼育した。
【０１４６】
（表１５ 普通食餌料（ＣＥ２）、高脂肪食餌量（ＨＦＤ３２）の１００ｇ 中の成分量）
【０１４７】
【表１５】
（２）実験群及び実験条件
実験群は８群とし各群の数はｎ＝１０匹とした。各群に与えた餌料および飲料を以下の表１６に示す。なお、給餌及び給水は自由摂取とした。
【０１４８】
（表１６ 各群に与えた餌料および飲料）
【０１４９】
【表１６】
実験開始後、９ヶ月間の体重増加率変化を表１７に示す。体重増加率は飼育開始１週間後の体重を基準とし、以下の計算式に従って計算した。
体重増加率＝（測定月の体重−実験開始１週間後の体重）÷実験開始１週間後の体重×１００
（表１７ 各群の体重増加率）
【０１５０】
【表１７】
普通食−テアフラビン群（ＩＩ群）では普通食−水群（Ｉ群）と比較し、有意な体重増加率の差異は見られなかった。一方、高脂肪食−テアフラビン群（ＶＩ群）では高脂肪食−水群（ＩＩＩ群）と比較して平均６％程度体重増加率の減少が認められた。
【０１５１】
随時血糖値は午後１時に測定した。採血は尾静脈から行い、簡易血糖測定システム（テルモ社製）にて血糖値を測定した。測定結果を以下の表１８に示す。普通食−テアフラビン群（Ｉ群）では、コントロールである普通食−水群（ＩＩ群）に比べて随時血糖値は若干低下し、ほぼ１５０台で推移した。高脂肪食-テアフラビン群（ＶＩ群）では、高脂肪食−水群（ＩＩＩ群）に比べて随時血糖値が有意に低下し、ほぼ１７０から１８０台で推移した。
【０１５２】
（表１８ 各群の随時血糖値）
【０１５３】
【表１８】
さらに、プラスチックゲージに床敷も無い状態で１４時間絶食後の各群について空腹時血糖値を測定した。測定結果を以下の表１９に示す。普通食−水群（Ｉ群）と普通食−テアフラビン群（ＩＩ群）とは同程度の血糖値を示した。高脂肪食−テアフラビン群（ＶＩ群）では高脂肪食−水群（ＩＩＩ群）よりも血糖値が低下した。
【０１５４】
（表１９ 各群の空腹時血糖値）
【０１５５】
【表１９】
以上の結果から、体重に関しては、Ｉ群とＩＩ群とでは有意な差異は見られなかったが、ＩＩＩ群とＩＶ群とを比較すると、ＩＩＩ群に対してＩＶ群では体重増加度が８％低下した。したがって、本発明の製造方法によって製造されるテアフラビン混合物は、肥満予防効果を有するものであることが明らかになった。
【０１５６】
血糖値に関しては、Ｉ群とＩＩ群とでは有意な差異は見られなかったが、ＩＩＩ群とＩＶ群とを比較すると、ＩＩＩ群に対してＩＶ群では血糖値が２０％低下した。したがって、本発明の製造方法によって製造されるテアフラビン混合物は、血糖値上昇抑制効果を有するものであることが明らかになった。
【０１５７】
また、Ｉ群とＩＩ群とでは血糖値および体重について同様の測定結果が得られた事から、普通食を摂取する通常の状態では、テアフラビン混合物には血糖値を下げたり体重を下げる効果は認められず、安全性を有することが確認された。
【０１５８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）茶を含む原料を加熱する工程、
（２）該（１）工程で加熱した該原料を粉砕する工程、
（３）微生物用培地において、茶細胞を培養し茶細胞培養物を得る工程、および
（４）該（２）工程で粉砕された該原料と該（３）工程で培養された該茶細胞培養物とを反応させてテアフラビンを生成する工程
を包含するテアフラビンの製造方法。
【請求項２】
前記微生物用培地が糖、窒素源および無機塩類を含む酵母用培地である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記糖がスクロースおよびグルコースからなる群から選択される請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記（３）工程における反応物に含まれる酵素を失活させる工程をさらに包含する請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記失活させる工程が、前記反応物を酸性にすることおよび／または加温することにより行われる請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記テアフラビンを回収する工程をさらに包含する請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記回収が、吸着樹脂により行われる請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法によって製造された実質的に純粋なテアフラビン。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたテアフラビンを含む食品組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたテアフラビンを含む肥満予防用食品組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたテアフラビンを含む血糖値上昇抑制用食品組成物。
【請求項１２】
高脂肪食と組み合わせて摂取されることを特徴とする請求項１０または１１のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項１３】
テアフラビンの安定化剤をさらに含む請求項９〜１２のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項１】
（１）茶を含む原料を加熱する工程、
（２）該（１）工程で加熱した該原料を粉砕する工程、
（３）微生物用培地において、茶細胞を培養し茶細胞培養物を得る工程、および
（４）該（２）工程で粉砕された該原料と該（３）工程で培養された該茶細胞培養物とを反応させてテアフラビンを生成する工程
を包含するテアフラビンの製造方法。
【請求項２】
前記微生物用培地が糖、窒素源および無機塩類を含む酵母用培地である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記糖がスクロースおよびグルコースからなる群から選択される請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記（３）工程における反応物に含まれる酵素を失活させる工程をさらに包含する請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記失活させる工程が、前記反応物を酸性にすることおよび／または加温することにより行われる請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記テアフラビンを回収する工程をさらに包含する請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記回収が、吸着樹脂により行われる請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法によって製造された実質的に純粋なテアフラビン。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたテアフラビンを含む食品組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたテアフラビンを含む肥満予防用食品組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたテアフラビンを含む血糖値上昇抑制用食品組成物。
【請求項１２】
高脂肪食と組み合わせて摂取されることを特徴とする請求項１０または１１のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項１３】
テアフラビンの安定化剤をさらに含む請求項９〜１２のいずれか１項に記載の食品組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１１−１７２５１４（Ｐ２０１１−１７２５１４Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３９４０１（Ｐ２０１０−３９４０１）
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【出願人】（５９１０６２３３１）磐田化学工業株式会社 (5)
【出願人】（５０７２１９６８６）静岡県公立大学法人 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【出願人】（５９１０６２３３１）磐田化学工業株式会社 (5)
【出願人】（５０７２１９６８６）静岡県公立大学法人 (63)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]