化合物の分離方法
サンプルを、多次元クロマトグラフィーを使用して分析する方法およびシステムを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／６４５，８１０号；２００５年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６５５，８４０号；２００５年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／６８６，２６８号の利益を主張するものである。これらの全ての出願は、それらの内容全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
化学的および生物的サンプルは、しばしば化合物の混合物を含有している。混合物を分離するための様々なクロマトグラフ技術が開発され、多くのクロマトグラフ的分離および精製のためのシステムが市販されている。
【０００３】
最も知られているクロマトグラフ技術には、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）がある。ＨＰＬＣ法は、極性および無極性化合物を分離するために使用することができ、ＨＰＬＣ法に使用する溶媒（すなわち移動相）および固定相は、分離する検体の種類に基づき選択される。移動相と固定相とを注意深く選択することによって、多くの混合物を、更なる分析または使用のために分離することのできる、十分に分解したピークまたは画分に分離することができる。質量分析（ＭＳ）などの方法による特性決定によって、サンプル中に存在する検体についての情報が提供される。
【０００４】
様々なＨＰＬＣ技術が報告されている。最も広く使用されているものには、「順相」ＨＰＬＣ（一般的に比較的極性の検体に有用であり、極性の最も小さい検体が通常最初に溶出される）および「逆相」ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ、一般的に極性のより小さな検体に有用であり、極性の最も小さい検体が通常最後に溶出される）がある。「親水性相互作用クロマトグラフィー」またはＨＩＬＩＣと呼ばれる変形態は、逆相カラムには十分保持されない高度に極性の検体に有用である。
【０００５】
しかしながら、複合体混合物が含まれている場合、単一のクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）分離では、全ての化合物を十分に分離したピークまたは画分に分離することができないこともある。ピークが十分に分解されない場合は、分離の後でも不純物または汚染物が存在することもあり、収集した画分の特性決定を妨げる。この問題に取り組むために、多次元クロマトグラフ法が開発された。これらの方法において、サンプルは第１分離にかける。第１分離から得られた溶媒流は、通常は部分的に精製された化合物混合物を表す画分中に収集される。次いで個々の画分は、選択され、第２分離技法にかける。第１および第２分離の条件は、一般的に異なっており、条件を注意深く選択すれば、第２分離は、第１分離の次元では分解しなかった化合物の分離を可能とするはずである。かかる多次元クロマトグラフ法の例には、例えばＴｒａｎｃｈｉｄａ，ＰＱら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１０５４（１−２）：３−１６（２００４年）が含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かかる方法は、２つのクロマトグラフ法のそれぞれにおいて、異なるカラムおよび異なる移動相の使用をしばしば含み、これは複雑さを追加する結果をも伴う。例えば、強陽イオン交換（ＳＣＸ）分離の後ＲＰ−ＨＰＬＣを行うことがペプチド混合物を分析するのに使用されている。しかしながら、ＳＣＸ条件によってしばしば必要とされる高塩濃度および／または有機溶媒は、ＲＰ−ＨＰＬＣに必要とされる条件とは相容れないこともあり、追加のサンプル後処理がしばしば必要とされる。
【０００７】
更に、２つの分離に使用される移動相または移動相添加物が、質量分析法を含む検出器、または分析システムの他の部分と相容れないこともあり、検出またはサンプル処理に更なる困難をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここに、２つの分離に使用される移動相のｐＨを変えることによって、第１および第２の両方の次元に関し、ＨＰＣＬ分離を使用して多次元ＨＰＬＣを実施することができることが見出された。
【０００９】
一実施形態において、本発明は少なくとも１種の検体を含むサンプルを分析するための方法を提供し、この方法は、ａ）サンプルを、第１ｐＨにおいて、第１移動相を使用して第１液体クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）第１クロマトグラフ分離から少なくとも１つの画分（または部分）を収集（またはサンプリング）するステップと；ｃ）少なくとも１つの画分を第２ｐＨにおいて、第２移動相を使用して第２液体クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；（場合によっては）ｄ）サンプル中の少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップとを含み、ここで第１ｐＨと第２ｐＨが異なっている。
【００１０】
ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ分離は、互いが実質的に直交している。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第２クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、少なくとも１００ピークのピーク容量を有している。
【００１１】
ある好ましい実施形態において、第１ｐＨと第２ｐＨは、少なくとも約３ｐＨ単位異なっている。ある好ましい実施形態において、請求項１の方法は、少なくとも１種の検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。ある好ましい実施形態において、少なくとも１種の検体は、小さな有機分子である。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、この方法の全ピーク容量は、少なくとも１，０００、５，０００または１０，０００ピークである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される。
【００１２】
ある好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集またはサンプリングした少なくとも１つの画分または部分は、少なくとも１つの画分が第２クロマトグラフ分離様式にかけられる前に濃縮または希釈され、ある実施形態では、少なくとも１つの画分が蒸発によって濃縮される。他の好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集（または選別）した少なくとも１つの画分（または部分）が、第２クロマトグラフ分離様式を行う前にオンラインで希釈される。ある実施形態において、ステップｂ）で収集した少なくとも１つの画分が、オンライン希釈を使用して希釈される。
【００１３】
ある好ましい実施形態において、検出ステップは、質量分析計を使用して実施される。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ様式は同じである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、実質的に不揮発性塩を含んでいない。ある好ましい実施形態において、第２移動相は約２０ｍＭ未満の（より好ましくは、１０または５ｍＭ未満の）不揮発性塩を含んでいる。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、約２０ｍＭ未満の揮発性塩を含んでいる。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、サンプル中の複数の検体を分離するための方法を提供する。この方法は、ａ）少なくともサンプルの一部を、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）少なくとも１つの画分（または部分）を、第１クロマトグラフ分離から収集（または選択）するステップと；ｃ）サンプル中の少なくとも２個の検体が分離されるような条件下、少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップとを含む。
【００１５】
ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ分離は、互いに実質的に直交している。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第２クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、少なくとも１００ピークのピーク容量を有している。
【００１６】
ある好ましい実施形態において、第１ｐＨと第２ｐＨは、少なくとも約３のｐＨ単位異なっている。ある好ましい実施形態において、請求項１の方法は、少なくとも１種の検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。ある好ましい実施形態において、少なくとも１種の検体は、小さな有機分子である。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、この方法の全ピーク容量は、少なくとも１，０００、５，０００または１０，０００ピークである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される。
【００１７】
ある好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集またはサンプリングした少なくとも１つの画分または部分は、少なくとも１つの画分が第２クロマトグラフ分離様式にかけられる前に濃縮または希釈され、ある実施形態では、少なくとも１つの画分が蒸発によって濃縮される。他の好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集（または選別）した少なくとも１つの画分（または部分）が、第２クロマトグラフ分離様式を行う前にオンラインで希釈される。ある実施形態において、ステップｂ）で収集した少なくとも１つの画分が、オンライン希釈を使用して希釈される。
【００１８】
ある好ましい実施形態において、検出ステップは質量分析計を使用して実施される。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ様式は同じである。ある好ましい実施形態において、第２移動相は、実質的に不揮発性塩は含んでいない。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は約２０ｍＭ未満の（より好ましくは、１０または５ｍＭ未満の）不揮発性塩を含んでいる。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、約２０ｍＭ未満の揮発性塩を含んでいる。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は２次元（または多次元）の液体クロマトグラフィーシステム中の複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するための方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを、前記２次元（または多次元）の液体クロマトグラフィーシステムの第１次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；ｂ）第１移動相を使用する前記第１次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中の前記サンプルの少なくとも第２ポリペプチドから、前記サンプルの少なくとも第１ポリペプチド成分をクロマトグラフィーで分離するステップと；ｃ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の前記分離した第１および第２ポリペプチド成分を溶出するステップと；ｄ）前記溶出液の個別の容積の少なくとも１つをサンプリングするステップと；ｅ）前記個別の容積の少なくとも１つを、前記２次元（または多次元）の液体クロマトグラフィーシステムの第２次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；ｆ）注入した個別の容積を、第２移動相を使用する前記第２次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中でクロマトグラフ分離させ、ここで前記第１および第２移動相のｐＨが約３ｐＨ単位異なっているステップと；（場合により）ｇ）前記第２次元クロマトグラフィー装置の前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液を、質量分析法を使用して特性決定し、これによって複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するステップとを含む。
【００２０】
ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ分離は、互いに実質的に直交している。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第２クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、少なくとも１００ピークのピーク容量を有している。
【００２１】
ある好ましい実施形態において、第１ｐＨと第２ｐＨは、少なくとも約３のｐＨ単位異なっている。ある好ましい実施形態において、少なくとも１種の検体は、小さな有機分子である。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、この方法の全ピーク容量は、少なくとも１，０００、５，０００または１０，０００ピークである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される。
【００２２】
ある好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集またはサンプリングした少なくとも１つの画分または部分は、少なくとも１つの画分が第２クロマトグラフ分離様式にかけられる前に濃縮または希釈され、ある実施形態では、少なくとも１つの画分が蒸発によって濃縮される。他の好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集（または選別）した少なくとも１つの画分（または部分）が、第２クロマトグラフ分離様式を行う前にオンラインで希釈される。ある実施形態において、ステップｂ）で収集した少なくとも１つの画分が、オンライン希釈を使用して希釈される。
【００２３】
ある好ましい実施形態において、検出ステップは質量分析計を使用して実施される。ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ様式は同じである。ある好ましい実施形態において、第２移動相は、実質的に不揮発性塩は含んでいない。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は約２０ｍＭ未満の（より好ましくは、１０または５ｍＭ未満の）不揮発性塩を含んでいる。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、約２０ｍＭ未満の揮発性塩を含んでいる。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は化合物および少なくとも２つの不純物を含むサンプル中の化合物を精製する方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを、化合物が第１不純物から分離されるような条件下で、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）第１クロマトグラフ分離から、少なくとも１つの化合物含有画分を収集するステップと；ｃ）少なくとも１つの化合物含有画分を、化合物が第２不純物から分離されるような条件下で、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｄ）精製した化合物を収集するステップとを含む。
【００２５】
本明細書で説明するいずれかの方法のある好ましい実施形態において、方法は、サンプル中に存在する化合物および／または不純物の１つ、幾つか、または全部を同定するステップを更に含むことができる。ある好ましい実施形態において、同定は質量分析法によって実施される。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィーシステムを提供する。このシステムは、ａ）第１クロマトグラフカラムおよび第１クロマトグラフカラムを通して第１移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第１クロマトグラフ分析システムと；ｂ）第２クロマトグラフカラムおよび第２クロマトグラフカラムを通して第２移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第２クロマトグラフ分析システムと；ｃ）第１クロマトグラフカラムの溶出液流からの少なくとも１つの化合物含有画分を選択し、少なくとも１つの化合物含有画分を第２クロマトグラフカラムに導く手段、（ここで、第１移動相のｐＨと第２移動相のｐＨが異なる）とを含む。
【００２７】
ある好ましい実施形態において、システムは更に検出器、より好ましくは質量分析計を含む。ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ様式は同じである。ある好ましい実施形態において、第２移動相は、実質的に不揮発性塩を含んでいない。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は約２０ｍＭ未満の（より好ましくは、１０または５ｍＭ未満の）不揮発性塩を含んでいる。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、約２０ｍＭ未満の揮発性塩を含んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、化合物または化合物の混合物を分離、精製、および／または分析するための方法およびシステムを提供する。本発明の方法およびシステムは、分離が可能であり、これによって化合物の複合体混合物を分解し、かかる混合物の成分の迅速な同定を可能にする。
【００２９】
混合物に存在する化合物は、例えば、（薬剤または薬剤の候補などの）小さな有機分子、（例えば、タンパク質の消化物もしくはタンパク質の混合物を含む、ペプチド合成からのまたは生体サンプルからの）ペプチドもしくはポリペプチド、（例えば、生体サンプルからのまたは合成したポリヌクレオチドからの）核酸もしくはポリヌクレオチド、合成もしくは天然ポリマー、またはこれらの材料の混合物であることができる。化合物の種類は、本明細書で説明する、化合物分離のために選択されたクロマトグラフ法によってのみ制限される。好ましい実施形態において、少なくとも１つの化合物または不純物が、少なくとも部分的に、約２〜約１２の範囲のｐＨで荷電されている。少なくとも１つの化合物または不純物が、約２〜約１２の範囲の第１ｐＨにおいて第１荷電状態を有し、約２〜約１２の範囲の第２ｐＨにおいて第２荷電状態を有することがより好ましい。例えば、化合物は、より低いｐＨにおいて＋１の荷電を有することができ、より高いｐＨにおいて０（中性）の電荷を有することができ；またはより低いｐＨにおいて＋２の電荷を、より高いｐＨにおいて＋１の電荷を、および第３の一層高いｐＨにおいては０の電荷を有することができる。ある好ましい実施形態において、検出され、分析され、または精製される検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
【００３０】
従って、一態様において、本発明は少なくとも１種の検体を含むサンプルを分析するための方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを第１ｐＨにおいて第１移動相を使用して第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）少なくとも１つの画分を、第１クロマトグラフ分離から収集または選択するステップと；ｃ）少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２移動相を使用して第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；（場合によって）ｄ）サンプル中の少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップとを一般的に含み、ここで、第１ｐＨと第２ｐＨが異なっている。
【００３１】
別の態様において、本発明は、サンプル中の複数の検体を分離するための方法を提供する。この方法は、サンプル中の少なくとも２種の検体が分離される条件下で、ａ）少なくともサンプルの一部を、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）少なくとも１つの画分を、第１クロマトグラフ分離から収集するステップと、ｃ）少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップとを含む。
【００３２】
別の実施形態において、２次元液体クロマトグラフィーシステム中の複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するための方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを、前記２次元液体クロマトグラフィーシステムの第１次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；ｂ）第１移動相を使用する前記第１次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中の前記サンプルの少なくとも第２ポリペプチドからの前記サンプルの少なくとも第１ポリペプチド成分をクロマトグラフィーで分離するステップと；ｃ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の前記分離した第１および第２ポリペプチド成分を溶出するステップと；ｄ）前記溶出液の個別の容積の少なくとも１つをサンプリングするステップと；ｅ）前記個別の容積の少なくとも１つを、前記２次元の液体クロマトグラフィーシステムの第２次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；ｆ）注入した個別の容積を、第２移動相を使用する前記第２次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中でクロマトグラフ分離させ、ここで前記第１および第２移動相のｐＨが約３ｐＨ単位異なっているステップと；ｇ）前記第２次元クロマトグラフィー装置の前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液を、質量分析法を使用して特性決定し、これによって複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するステップとを含む。
【００３３】
更に別の態様において、本発明は、化合物と少なくとも２つの不純物を含むサンプル中の化合物を精製するための方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを、化合物が第１不純物から分離されるような条件下で、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）第１クロマトグラフ分離から、少なくとも１つの化合物含有画分を収集するステップと；ｃ）少なくとも１つの化合物含有画分を、化合物が第２不純物から分離されるような条件下で、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｄ）精製した化合物を収集するステップとを含む。
【００３４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式の移動相のｐＨと第２クロマトグラフ分離様式の移動相のｐＨとは、第１および第２クロマトグラフ分離のそれぞれの間、例えば、分離がｐＨに関して定組成であるなど、それぞれ実質的に一定に維持される。この結果は、例えば、分離様式に関して単一の移動相を使用する；またはカラムに適用される移動相が分離を通して実質的に同じｐＨを有するように、ポンプおよび混合弁で混合した２つの移動相成分（それぞれの移動相成分が類似のまたは同一のｐＨを有する）を使用する（例えば、本明細書の実施例を参照されたい）；または類似のｐＨを有する２つの移動相と第３の移動相成分または改質剤を一定量ポンプによって混合して、実質的に一定の移動相ｐＨをカラムに供給するなど、幾つかの方法において達成することができる。しかしながら、ある実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ様式に供給される移動相のｐＨは、第１および／または第２クロマトグラフ分離中、あるｐＨ範囲で変えることができる。かかる実施形態において、第１クロマトグラフ様式のｐＨ範囲は、第２クロマトグラフ様式のｐＨ範囲と異なることが好ましい。
【００３５】
好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式移動相のｐＨと第２クロマトグラフ分離様式移動相のｐＨとの差異は、少なくとも３ｐＨ単位である。例えば、第１クロマトグラフ分離様式移動相のｐＨが２．５の場合、第２クロマトグラフ分離様式移動相のｐＨは、少なくとも５．５とすることができる。ある実施形態において、ｐＨの差異は、少なくとも約４ｐＨ単位、５ｐＨ単位または６ｐＨ単位である。１つのクロマトグラフ分離様式移動相のｐＨは、例えば２と５の間とすることができ、一方別のクロマトグラフ分離様式移動相のｐＨは、例えば少なくとも３ｐＨ単位超：例えば５と８の間、または５と１０の間、または７と１２の間とすることができる。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式のｐＨは、約２と約６の間、より好ましくは約２と約５の間、または約２．５と約４．５の間である。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式のｐＨは、約６と約１２の間、より好ましくは約６と約１０の間、または約７と約１０の間である。
【００３６】
本発明の１つのまたは両方の次元において使用するのに適したクロマトグラフ法には、順相ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＬＩＣ、およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を含むサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などの液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣを含む）法が含まれる。他の適切な方法には、付加的なＨＰＬＣ方法および例えば、超性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、迅速性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）などを含む関連する液体クロマトグラフ技法が含まれる。
【００３７】
ある実施形態において、好ましい分離様式は、例えば、移動相が質量分析計にサンプルの清浄化または脱塩を、殆どまたは全く行うことなく注入するのに適しているなど、移動相が質量分析法などの分析技術と相容性があるものである。従って、ある好ましい実施形態において、溶出液が質量分析法によって分析される分離様式の移動相、例えば第２クロマトグラフ様式移動相は、実質的に不揮発性塩を含んでいない。例えば、ある実施形態において、第２移動相は、２０ｍＭ未満（または１０ｍＭもしくは５ｍＭ未満）の不揮発性塩を含んでいる。本明細書で使用される「不揮発性塩」という用語は、液体クロマトグラフィーシステムを質量分析計と相互作用させる場合に、移動相溶媒を取り除くために使用される条件下で、実質的に不揮発性である移動相中に存在する塩を指す。これは、塩化ナトリウムまたはリン酸カリウムは不揮発性塩であると考えられ、一方、ギ酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、または酢酸アンモニウムなど、大部分が真空下で除去される塩は、揮発性塩である。他の揮発性塩も、当業者には明らかなように、使用することができる。例えば、揮発性酸（例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、パーフルオロオクタン酸）のアンモニウム（ＮＨ４＋）塩は、一般的にＭＳ検出に使用するのに適した揮発性塩である。
【００３８】
ある実施形態において、第１または第２クロマトグラフ分離は、ＨＰＬＣ分離、より好ましくは逆相ＨＰＬＣ分離である。ある好ましい実施形態において、第１または第２クロマトグラフ分離の１つまたは両方がＨＩＬＩＣ分離である。ある好ましい実施形態において、第２クロマトグラフ分離の種類は、例えば第１および第２クロマトグラフ分離の両方がＲＰ−ＨＰＬＣである、または両方がＨＩＬＩＣであるなど、第１クロマトグラフ分離と同じである。
【００３９】
混合物中に存在する検体または化合物は、例えば（薬剤または薬剤の候補など、一般的に１０００未満の分子量を有する）小さな有機分子、（例えば、タンパク質の消化物もしくはタンパク質の混合物を含む、ペプチド合成からのまたは生体サンプルからの）ペプチドもしくはポリペプチド、（例えば、生体サンプルからのまたは合成したポリヌクレオチドからの）核酸もしくはポリヌクレオチド、合成もしくは天然ポリマー、またはこれらの物質の混合物であることができる。化合物の種類は、本明細書で説明する、化合物分離のために選択されたクロマトグラフ法によってのみ制限される。ある好ましい実施形態において、検出され、分析され、または精製される検体は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
【００４０】
ある実施形態において、分析または精製されるサンプルは、少なくとも２０、５０、１００、５００、１０００、または５０００個の検体および／または化合物および／または成分および／または不純物を含む。
【００４１】
サンプル混合物の構成物質を効率的に分離するために、高いピーク容量を有する分離様式が好ましい。例えば、ある実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式は、少なくとも１０、２０、５０または１００ピークのピーク容量を有し、あるいは第２クロマトグラフ分離様式は、少なくとも１０、２０、５０または１００ピークのピーク容量を有する。
【００４２】
第１分離における化合物のグループの保持時間が、第２分離における化合物のグループの保持時間と高度に関連づけられない２つの分離は「直交している」と言うことができる。例えば、第１分離における化合物のグループの保持時間を第２分離における化合物のグループの保持時間に対してプロットしたならば、得られたグラフの相関係数（Ｒ２）は、２つの分離が同一ならば、１．０に、２つの分離が完全に直交するのならば０．０１となる。ある実施形態において、相関係数（Ｒ２）が約０．８未満の場合、本明細書で使用される用語として、２つの分離様式は「実質的に直交」している。他の実施形態において、（参照により本明細書に援用する、Ｇｉｌａｒ、Ｍ．；Ｏｌｉｖｏｖａ、Ｐ．；Ｄａｌｙ、Ａ．Ｅ．；Ｇｅｂｌｅｒ、Ｊ．Ｃ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５年）７７版，ｐ．６４２６〜６４３４に記載された方法によって決定した）直交性％（Ｏ％）が約３０％超の場合、本明細書で使用される用語として、２つの分離様式は「実質的に直交」している。好ましい実施形態において、本発明による第１分離と第２分離の間の相関係数は、０．８未満、より好ましくは０．６未満、より好ましくは０．４未満、更により好ましくは０．２未満、特に好ましくは０．１未満である。
【００４３】
２つの好ましい直交分離において、方法の合計ピーク容量は、個々の方法のピーク容量の積である（すなわち、個別の方法のピーク容量を掛け合わせたものである）。例えば、第１分離がピーク容量５０を有し、完全に直交している第２分離がピーク容量１００を有している場合、化合物が連続的に第１および第２分離を受けるシステムの合計ピーク容量は、５０×１００＝５０００ピークである。２つの分離が完全に直交でないシステムにおいて、合計ピーク容量は、個々の方法のピーク容量の積よりも幾分小さくなる。ピーク容量は、画分収集の頻度などの要因によって減少することが可能であり、また理論的ピーク容量よりも小さいこともあることが認識される。好ましい実施形態において、方法は少なくとも１０００、２０００、５０００、または１００００ピークの合計ピーク容量を有している。
【００４４】
選択したＬＣ様式の直交性を評価するために（例えば、ペプチドの使用に関して）、前に説明したようにペプチド保持マップを構築することができる（参照により本明細書に援用する、Ｇｉｌａｒ、Ｍ．；Ｏｌｉｖｏｖａ、Ｐ．；Ｄａｌｙ、Ａ．Ｅ．；Ｇｅｂｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．（２００５年）２８巻，ｐ．１６９４−１７０３；および同じく参照により本明細書に援用する、Ｇｉｌａｒ、Ｍ．；Ｏｌｉｖｏｖａ、Ｐ．；Ｄａｌｙ、Ａ．Ｅ．；Ｇｅｂｌｅｒ、Ｊ．Ｃ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５年）７７巻、ｐ．６４２６−６４３４も参照されたい）。簡単に言えば、５つのタンパク質消化物（それぞれ２０〜１００のペプチドを含む）を逐次ＬＣ−ＵＶ−ＭＳシステムに注入し、ペプチドをそれぞれ特有の質量によって同定し、これらの保持を記録した。保持データは、単一次元ＬＣセットアップにおいて、各ＬＣ様式に関して取得し、式１に従って正規化した。
【００４５】
【数１】
【００４６】
ＲＴｍａｘおよびＲＴｍｉｎは、それぞれデータセットにおいて保持されたペプチドの最大と最小の保持時間を表す。保持時間ＲＴｉは、正規化されたＲＴｉ（ｎｏｒｍ）に変換される。ＲＴｉ（ｎｏｒｍ）の値は、０から１にわたる。正規化は、２つの目的を果たす。第１は、保持時間の絶対値に関係なく、均一２Ｄ保持空間における異なるクロマトグラフデータの比較を可能にすることである。第２は、ピークが溶出されない場合の２Ｄ分離プロットにおけるボイドスペースを除去することである。ボイドは、カラムのボイド容積、ＬＣシステムの勾配の遅れ、または有用な範囲の外側にわたる勾配の使用によって生じ得る（例えば、ＲＰ−ＬＣにおける０〜１００％アセトニトリルの勾配、実際には全てのトリプシンペプチドが０〜５０％アセトニトリル内で溶出する）。
【００４７】
２Ｄ−ＬＣ分離における直交性を特性決定するために開発されたツールは、情報的近似性、シネントロピの割合、ピーク広がり角度、および実際的ピーク強度などの幾つかの補助的記述子を使用する。これらの数学的モデルは、一部の状況の説明には適しているが、他の状況（データの集団化を含む）では記述が困難なこともある。従って、直感的な単一記述子を使用することができる。このモデルは、以下のアプローチを使用する。（ｉ）正規化した保持データ（式１）を、図４に示すように２Ｄ分離スペースにプロットする。（ｉｉ）面積を各データポイントに割り当てて、正規化されたピーク面積を表す（ピーク幅は、４σ、ピーク高さの１３．４％においてスナイダー（Ｓｎｙｄｅｒ）により測定する）。（ｉｉｉ）直交性を２Ｄ分離スペース中のピークによってカバーされる正規化された面積として規定する。カバーされる面積が大きくなれば、直交性は大きくなる。
【００４８】
問題を単純化するために、更に、以下の仮定をすることができる。（ｉ）２Ｄ分離スペースは、以前に発行された報告書と同様に、長方形ビンに区分された。この結果、各ビンはピーク面積に相当する。（ｉｉ）データセットは、データポイントの数と等しい数の長方形ビンに区分された分離スペースと重ね合わせる。つまり、正規化された２Ｄ分離スペースのピーク容量は、分離された成分の数に等しい。従って、寸法の異なるデータセットを比較することができ、（ｉｉｉ）データポイントを含む全ての正規化されたビンの面積が合計される。被覆面積の程度は、調べた２Ｄ分離システムの直交性を表現する。
【００４９】
本発明による分離を実施するのに適したカラムは、当技術分野において知られており、必要以上の実験無しで選択することができる。例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、Ｃ８、Ｃ１８、およびフェニル置換固体支持体を含んでいる。順相カラムは、シリカを固定相として使用することができる。ＨＩＬＩＣ分離は、一般的に、場合によっては例えばアミノプロピルまたはジオール改質剤によって改質されたシリカベースカラム材料を使用して実施される。事前包装されたまたは被覆されたカラムまたはキャピラリーは、市販されており、分離のために使用する特定の固定相および固体支持体は、分離する混合物の量および複雑さ、決定する検体の種類などの要因により選択することができる。
【００５０】
同様に、カラムの寸法は、分析または精製するサンプルの量などの要因により選択することができる。より大きなサンプルの量の分析に関しては、約３ｍｍ〜約２０ｍｍの直径を有するＨＰＬＣカラムを使用することもできる。非常に少量のサンプルに関しては、細口径カラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用することもできる。
【００５１】
本発明の方法において、サンプルは、第１次元におけるクロマトグラフィー（すなわち、第１クロマトグラフ様式）を受ける。サンプルは、第１クロマトグラフ分離を開始する前に、清浄化、ろ過、濃縮、または他の予備分析調製が求められることもある。次いでサンプルは、第１次元分離システムに、通常注入弁を通して導入される。次いでサンプルの成分は、第１ＨＰＬＣシステムの移動相によって、多次元液体クロマトグラフィーシステムの第１固定相に運ばれ、この中を通る。サンプルの少なくとも１つのサンプル成分が、第１次元カラムから出る移動相溶出液が、２つ以上の分離されたサンプル成分を含むように、他のサンプル成分からクロマトグラフィーで分離される。好ましい実施形態において、溶出液流のいずれかの部分に単数の成分または複数の成分が存在するかどうかを決定するのに検出器を使用することができる。例えば、ＵＶ／ＶＩＳ（紫外線／可視波長光線検出器）などの非破壊検出器を、溶出液流中に成分または検体が存在するかどうかを決定するのに使用することができる。別な方法として、少量の溶出液流部分を分割し、質量分析計または蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）などの壊式検出器で使用することもできる。かかる様々な破壊および非破壊検出器は市販されており、例えば予想されるサンプル中の検体、化合物、成分または不純物の性質および量、使用する移動相の種類などの要因に基づき、特定の用途ための適切な検出器を選択することができる。
【００５２】
第１次元溶出液流からの溶出液の画分または部分は、幾つかの方法により、第２次元における処理のために選択することができる。例えば、ある実施形態において、第１次元検出器から得た（例えば上記の様な）情報を、第１カラムからの溶出液流のどの画分または部分を第２クロマトグラフ分離に導くかを決定するために使用することができる。従って、例えば、第１次元検出器は、溶出液の特定の画分を収集するための画分収集器を始動させることができ、または第２次元クロマトグラフィーシステムへの後の注入のための特定の画分を明らかにするために、コンピュータ化したクロマトグラフィー分析システムに信号を送ることができる。別の実施形態において、画分は、第２クロマトグラフィーシステムへの注入のために、所定の間隔または所定の頻度で（例えば、画分を３０秒毎、１分毎、２分毎などにおいて収集するなど）、収集またはサンプリングすることができる。市販されている画分収集器を、必要に応じて自動または手動様式においてサンプルを収集するために使用することができる。
【００５３】
第１次元移動相溶出液の少なくとも一部をサンプリングし、（例えば、マルチポート注入弁と関連するサンプルループを使用して）多次元クロマトグラフィーシステムの第２ＨＰＬＣ次元に導く。第１クロマトグラフ分離からの溶出液の画分を第２分離様式に導くことを可能にするために、第１分離様式は第２分離様式とインターフェースをとらなければならない。このインターフェーシングは、幾つかの方法において達成することができる。例えば、第１次元溶出液の画分は、画分収集器中に収集することができ、画分の全部または一部を、第２クロマトグラフ分離様式に導くために選択することができる。所望する場合、例えば第２次元ＨＰＬＣシステムに導入する前に、容積を低減したりまたは非相容性の溶媒を除去したりするために、画分を濃縮または蒸発することができる。脱塩など他のサンプル調製ステップを、収集した画分について同様に行うことができる。別な方法として、第１溶出液流からの画分または部分を、例えばロータリーマルチポート注入弁を通す注入によって、直接第２次元分離システムへ注入することができる（例えば、米国特許第６，７３０，２２８号を参照されたい）。ある好ましい実施形態において、第１溶出液の画分は、第２クロマトグラフ分離様式を実施する前に、オンラインで希釈することができる。好ましい実施形態において、第１次元溶出液流のサンプリングした部分（複数可）は、次いで多次元液体クロマトグラフィーシステムの第２ＨＰＬＣ次元に、（例えば第２次元注入器としてマルチポート注入弁を使用して）直接注入される。
【００５４】
第１次元溶出液流の選択された部分または画分中の少なくとも１つのサンプル成分または検体は、次いで第２次元分離において、第２次元カラムから出る移動相溶出液が２つ以上の分離したサンプル成分を含むように、他のサンプル成分からクロマトグラフィーで分離される。好ましい実施形態において、第１次元溶出液流に関して上述したように、第２溶出液流のいずれかの部分に成分が存在するか否かを決定するために、検出器を使用することができる。サンプル中に存在する分離された成分または検体を検出しそして同定するためには、質量分析的検出が好ましい。
【００５５】
第１および第２クロマトグラフ分離のための移動相は、特定の検体（複数可）の分離を最適化するために、またはサンプルの未知の成分の分離を最適化するために選択することができる。本明細書の別のところで説明しているように、本発明は、移動相のｐＨの変化が、少なくとも部分的な直交分離を、第１および第２次元が同じ種類の分離（例えば、両方の次元にＲＰ−ＨＰＬＣを使用する、それぞれに同じ種類のカラムを使用するなど）を使用する場合であっても、提供するのに使用できることを見出した。ある実施形態において、第１および第２次元のために使用するクロマトグラフカラムは同じ種類であることができ（例えば、両方とも逆相）、分離の移動相は、本明細書で説明するように基本的相違がｐＨの相違である状態において、実質的に類似していることができる。移動相ｐＨは、移動相にｐＨ改質剤を加えることで変えることができる。例えばトリフルオロ酢酸またはギ酸などの酸は、より低い（より酸性の）ｐＨを提供するために加えることができ、一方水酸化アンモニウム（すなわち、アンモニア水）またはトリメチルアミンまたはトリエチルアミンなどの他の塩基は、より高い（より塩基性の）移動相ｐＨを提供するために加えることができる。
【００５６】
別の態様において、本発明は化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィーシステムを提供する。このシステムは、ａ）第１クロマトグラフカラムおよび第１移動相を、第１クロマトグラフカラムを通してポンプ輸送するためのポンプを備えている第１クロマトグラフ分析システム；ｂ）第２クロマトグラフカラムおよび第２移動相を、第２クロマトグラフカラムを通してポンプ輸送するためのポンプを備えている第２クロマトグラフ分析システム；ｃ）第１クロマトグラフカラムの溶出液流から、少なくとも１つの化合物含有画分を選択し、少なくとも１つの化合物含有画分を第２クロマトグラフカラムに導く手段とを含み、ここで第１移動相のｐＨと第２移動相のｐＨが異なっている。
【００５７】
第１および第２クロマトグラフ分析システムのそれぞれは、サンプルまたは画分をシステムに導入するための注入器を含んでいることが好ましい。在来型のマルチポートロータリー注入弁を使用することができる。液体クロマトグラフシステムのためのポンプは市販されており、ポンプは、クロマトグラフシステムを通してポンプ輸送しなければならない溶媒の量などの基準、およびシステムに存在する逆圧に従って選択することができる。ある実施形態において、勾配溶出を使用する場合、第１および第２クロマトグラフシステムの１つまたは両方に多重ポンプを使用することが好ましいこともある。
【００５８】
本発明のシステムは、第１および第２溶出液流のいずれかからかまたは両方からの溶出液画分を収集するために、画分収集器を含むことができる。従って、第１クロマトグラフカラムの溶出液流から少なくとも１つの化合物含有画分を選択するための手段は、画分収集器などを含み、一方少なくとも１つの化合物含有画分を第２クロマトグラフカラムに導入する手段は、上述のように、手動注入器またはオンライン注入システム（例えば、マルチポート注入弁を第２次元注入器として使用）を含むことができる。代替として、あるいは追加的に、このシステムは、第１溶出液流の部分あるいは画分のオンライン希釈のためのモジュールを含むことができる。
【００５９】
本発明の多次元ＨＰＬＣシステムは、好ましくは、両方のクロマトグラフ次元のハードウェア（サンプリングシステム、注入弁、移動相ポンプ、検出システム）を操作するのに有効な、そしてハードウェアからデータを追跡および取得するソフトウェアで構成された、コンピュータ化された制御およびデータ分析システムを通して操作することが好ましい。適切なソフトウェアは、例えば、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）などの液体クロマトグラフィーシステムの製造者、および／または、Ｌａｂ Ｖｉｅｗ ｂｒａｎｄ ｓｏｆｔｗａｒｅなどのソフトウェア生産者から市販されている。ソフトウェアは、ロボットによる流体取扱器の操作のための制御素子および他のデバイスを付加的に含むことができ、これらは多次元ＨＰＬＣシステムに統合することもできる。
【００６０】
上記の説明は、第１および第２クロマトグラフ分離システムを有するシステムおよび方法について言及しているが、例えば第１および第２分離によっては分解しない検体の分離を更に改善するために、付加的なクロマトグラフ次元、例えば第３クロマトグラフ分離システムを追加することができることは、当業者にとって明らかである。例えば、第３クロマトグラフ次元を追加することができる。好ましい実施形態において、追加の次元は、他の次元の１つまたは複数に対して、相互に直交的である。好ましい実施形態において、追加の次元は、他の使用された次元の１つまたは全部に対して相互に直交的である。かかる多次元アプローチは、例えば、ホスホペプチド、グリコペプチド、高度に酸性なペプチドなどの分離および分析において、特に有効なこともある。
【００６１】
(実施例)
材料および試薬
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）から購入した。ギ酸（ＦＡ）、濃縮水酸化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸、およびＨＰＬＣ級アセトニトリルは、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ニュージャージ州、米国）から購入した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、ＨＰＬＣ移動相のための脱イオン水（１８ＭΩｃｍ）調製に使用した。ＭａｓｓＰＲＥＰペプチド標準液およびＭａｓｓＰＲＥＰタンパク質消化物標準液は、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）から入手した。
【００６２】
２Ｄ−ＨＰＬＣ実験のセットアップ
ＲＰ、ＨＩＬＩＣ、およびＳＥＣなどのＬＣ−ＭＳ相容性ＨＰＬＣ様式のために、ＭａｓｓＰＲＥＰ標準液を直接ＬＣ−ＭＳシステムに注入した。ペプチド（これらの相当する分子量によって同定したもの）の保持時間を、異なる分離次元の選択性と直交性を比較するために、グラフ中にプロットした。
【００６３】
ＳＣＸおよびＨＩＣ分離様式は、移動相中に高濃度の塩を使用する。従って、溶出ペプチドに直接保持時間を割り当てるのは（ペプチドが同定されていないため）不可能であった。代わりに、画分を短い間隔（０．５〜２分）で収集し、後にキャピラリーＬＣ−ＭＳまたはＭＡＬＤＩ ＭＳを使用して分析した。
【００６４】
ＨＰＬＣの器具類
逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、および親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）の実験は、２９９６光ダイオード配列検出器および単一四重極Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ ４０００ＭＳ器具（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を備えたＭｏｄｅｌ ２７９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。ＭＳ条件は、キャピラリー電圧３．２ｋＶ、コーン電圧３０Ｖ、エキストラクタ１Ｖ、およびＲＦレンズ０．３Ｖであった。ソース温度は１００℃に、脱溶媒は３５０℃に設定した。脱溶媒ガス流は、３５０ｌ／時間、コーンガスは５０ｌ／時間に設定した。ＭＳスキャン間隔は３００〜２５００ｍ／ｚ、スキャン時間は、０．１秒インタースキャンの状態で２．２秒であった。スペクトルは、正のＥＳＩ様式で収集した．
強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーおよび親水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィーは、２９９６光ダイオード配列検出器を備えたＭｏｄｅｌ ２７９６ Ａｌｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＭＤ ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。画分は、手動で収集した。
【００６５】
ＳＣＸおよびＨＩＣ画分の分析：ＬＣ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ ＭＳ器具類
ＬＣ−ＭＳまたはＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の前に、収集した画分は、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏＥｌｕｔｉｏｎプレートを使用して脱塩した。ＳＣＸまたはＨＩＣ画分は０．２％水性ＴＦＡを使用して１：１で希釈し、（最初に２００μｌのＡＣＮその後２００μｌの０．１％ＴＦＡを使用して調整した）抽出プレート上に装荷した。装荷後、プレートを２００μｌの０．１％ＴＦＡで洗浄し、保持しているペプチドを、６０μｌの水中６０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を使用して溶出した。約１μｌの溶出液を、ＭＡＬＤＩマトリックスα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）と混合し、分析のために直接ステンレス鋼ＭＡＬＤＩターゲットに滴下した。マトリックスは、８０％ＡＣＮ中で濃度１０ｍｇ／ｍｌにおいて調製し、１００〜５００ｆｍｏｌｅの、内部標準としての目的を果たす選択したペプチド（ＡＣＴＨ）をスパイクした。質量スペクトルは、Ｎ２パルスレーザー（３３７ｎｍ）および２．３メートルの飛行経路を備え、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．０（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）によって制御される、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｍ＠ＬＤＩ ＲＴＯＦ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）により取得した。この機器は、ディレイドエクストラクションを使用して、リフレクトロン様式で操作した。
【００６６】
脱塩し、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢプレートから回収した画分は、ＬＣ−ＭＳ分析の前にＡＣＮ含有量を低下させるため、部分的に蒸発させた。各画分の最終容積は約１０μｌであった。１μｌを、分析のためキャピラリーＲＰ−ＨＰＬカラム上に注入した。光ダイオード配列検出器を備えた、キャピラリーＨＰＬＣシステム（ＣａｐＬＣ（登録商標）、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、ＭＳ様式で操作しているＥＳＩ−Ｑ−Ｔｏｆマイクロ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆ（登録商標）ｍｉｃｒｏ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）に接続した。キャピラリー電圧を３２００Ｖ、コーン電圧を３０Ｖ、エクストラクションコーン電圧を０．５Ｖ、イオンエネルギーを４Ｖ、衝突エネルギーを１０Ｖに設定した。
【００６７】
ＨＰＬＣ実験およびカラムの説明
ＲＰ−ＨＰＬＣ、ｐＨ２．６：２．１×１５０ｍｍ、３μｍのＡｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、流速２００μｌ／分で使用した。カラム温度は４０℃に設定した。移動相Ａは、水中の０．２％ギ酸（ＦＡ）であり、移動相Ｂは ＡＣＮ中の０．１３％ＦＡであった。勾配は、７０分において、０〜５６％Ｂ（０．８％ＡＣＮ／分）であった。
【００６８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ、ｐＨ８．５および１０：２．１×１５０ｍｍ、３．５μｍの×Ｔｅｒｒａ Ｐｈｅｎｙｌ（ｐＨ８．５に関して）および２．１×１５０ｍｍのＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（ｐＨ１０に関して）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、流速２００μｌ／分で使用した。カラム温度は４０℃に設定した。移動相ＡはｐＨ８．５の２０ｍＭの水性ギ酸アンモニウムバッファーまたはｐＨ１０の同じバッファーであり、移動相ＢはＡＣＮであった。勾配は、７０分において、０〜５６％Ｂ（０．８％ＡＣＮ／分）であった。
【００６９】
ＲＰ−ＨＰＬＣ、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）、５μｍ（Ｗａｔｅｒｓ、 Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）：移動相Ａは水であり、Ｂはアセトニトリル、およびＣは４００ｍＭＮＨ４ＦＡ水性バッファーであり、ｐＨ３．２５であった。流速は０．２ｍＬ／分であって、分離温度は４０℃であった。勾配は、０．８％アセトニトリル／分であり、ポンプＣを、２０％の溶媒を定組成的に送出し、それによって移動相が８０ｍＭのＮＨ４ＦＡバッファーの一定濃度を含むように使用した。バッファーは、２４．７ｇの濃縮水酸化アンモニウム（２８％水溶液）を、９００ｍＬの水および５０ｍＬのＦＡ（９９％）に加えることによって調製した。ｐＨは、水酸化アンモニウムまたはＦＡのいずれかでｐＨ３．２５に調節し、容積を１Ｌにした。
【００７０】
ＨＩＬＩＣ：２．１×１５０ｍｍ、３μｍのＡｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、流速２００μｌ／分において使用した。カラム温度は４０℃に設定した。移動相Ａは水であり、移動相ＢはＡＣＮであり、移動相Ｃは２００ｍＭのギ酸アンモニウムであり、ｐＨは４．５であった。勾配は、６２．５分において、９０〜４０％Ｂ（０．８％ＡＣＮ／分）であり、バッファーＣは５％に一定に維持した（移動相中、１０ｍＭのギ酸アンモニウムの一定濃度とする）。
【００７１】
ＳＥＣ：３個の４．６×２５０ｍｍ、５μｍのＹＭＣジオール、６０Å ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を直列に接続した。移動相は、ポンプを使用して混合した。移動相Ａは水であり、Ｂはアセトニトリル、およびＣは２００ｍＭのギ酸アンモニウム（ＮＨ４ＦＡ）水性バッファーであり、ｐＨは４．５であった。流速は０．２ ｍＬ／分であり、分離温度は４０℃であった。定組成移動相は、２０％のアセトニトリルおよび４０ｍＭのＮＨ４ＦＡバッファーを含んでおり、ｐＨは４．５であった。バッファーは、１２．６ｇのギ酸アンモニウムを、９００ｍＬの水に溶解し、ＦＡ（９９％）を使用してｐＨを４．５に調節することにより調製し、次いで容積を１Ｌにした。
【００７２】
ＳＣＸ−ＨＰＬＣ：ｐｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ（商標）ＳＣＸ、５μｍカラム（Ｐｏ１ｙＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、メリーランド州、米国）を、イオン交換ＨＰＬＣ分離に使用した。カラムは、２５℃で操作した。ある実験に関して、移動相はＡが２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で、５％のアセトニトリルを使用してｐＨ２．６であり、Ｂが２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で、１ＭのＮａＣｌを加えた５％アセトニトリルを使用してｐＨが３であった。勾配は、１００分において、０〜１５％Ｂであった。別の実験において、条件は次の通りであった。ＳＣＸ実験は、流速０．２ｍＬ／分において３０℃で実施した。移動相Ａは水で、Ｂはアセトニトリル、およびＣは４００ｍＭのＮＨ４ＦＡ水性バッファーであり、ｐＨは３．２５であった。勾配は、４０分において、１０〜７５０％Ｃであり、ポンプＢは、塩勾配の全持続時間にわたり、定組成的に２５％のアセトニトリルを送出するために使用された。ＮＨ４ＦＡバッファーは、直接ＭＳ検出と相容性があった。
【００７３】
キャピラリーＬＣ−ＭＳ：０．３×１５０ｍｍ、３．５μｍの架橋したハイブリッドＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、流速５μｌ／分で使用した。カラム温度は４０℃に設定した。移動相Ａは、水中の０．１％ＦＡであり、移動相Ｂは、８０％ＡＣＮ／２０％水における０．１％ＦＡであった。勾配は、６４分において０〜８０％Ｂ（１％ ＡＣＮ／分）であった。
【実施例１】
【００７４】
本研究において、本発明者らは様々なＬＣ様式の直交性および代替直交ＬＣ分離アプローチの開発を評価するために、５つのタンパク質（２５０のペプチド）のトリプシン消化物を使用した。試験したクロマトグラフ様式（これは個別に試験した）は、強陽イオン交換（ＳＣＸ）， サイズ排除（ＳＥＣ），逆相（ＲＰ），および親水（ＨＩＬＩＣ）クロマトグラフィーを含んでいた。各分離に関するペプチドの保持を記録し、２Ｄグラフにプロットし数学的に相関付け、分離の直交性を、調査した２Ｄプロット中の溶出ピークによってカバーされる面積の部分として評価した。
【００７５】
これら研究の結果を図１〜３に示す。図１において、一次元におけるクロマトグラフの（前述の）ＳＣＸ分離を、Ａｔｌａｎｔｉｓ（商標）Ｃ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣと比較した。図１のキーは、ペプチドの充填状態を示す。図２において、一次元のＲＰ−ＨＰＬＣ（前述のＡｔｌａｎｔｉｓカラムでｐＨ２．６）を、ｐＨ１０におけるＸｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣと比較した。図３において一次元のＨＩＬＩＣを、ｐＨ２．６におけるＡｔｌａｎｔｉｓ（商標）Ｃ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣと比較した。
【００７６】
本発明者らは、これら条件の内で、最も高い直交性がＨＩＬＩＣとＲＰ（Ｒ２＝０．００３８）の組合せまたはＲＰ−ＲＰ（Ｒ２＝０．４５）に関して得られることを見出した。後者の場合、差別的選択性（これが直交性をもたらす）は、固定相を変化させるよりはむしろ異なる移動相を使用することによって達成することができる。しかしながら、本発明者らは、ｐＨ２．６におけるＡｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣが、ｐＨ８．５（Ｒ２＝０．７８，データは示されていない）におけるＸｔｅｒｒａ Ｐｈｅｎｙｌカラム上のＲＰ−ＨＰＬＣに対して、幾分補うこともまた見出した。この場合、わずかな直交性は、異なる固定相並びにｐＨの差異が原因であることもある。他の評価したＲＰ固定相も類似の傾向を示す。最も明瞭な選択性は、ＰＦＰ吸着剤（データは示されていない）において観察された。しかしながら、直交性は未だ制限されており、２Ｄ空間の多くは分離には使用されていない。
【００７７】
ＨＩＬＩＣおよびＲＰ様式の両方とも、極めて効率的な分離様式であり、広範囲な疎水性のペプチドの分析に適している。加えて、使用したどんな添加物を含む移動相も、揮発性であるように選択することができ、従って分離次元は互換性があり、質量分析と相容性がある。
【００７８】
ＲＰと組み合わせたＳＥＣも良好な直交性を備えているが（結果は示されていない）、低いＳＥＣピーク容量のため、（少なくともペプチドに関して）この分離次元は魅力のないものとなっている。ＳＥＣの限られた有効性のため、本発明者らは３つのカラムを直列に接続してピーク容量を高め保持データを記録した。比較的疎水性のペプチドの吸着剤との残留相互作用は、ｐＨ４．５において２０％のアセトニトリルおよび４０ｍＭのＮＨ４ＦＡバッファーを移動相に加えることによって最小化された。しかしながら、一部の２次相互作用が未だ広がっており、より大きなペプチドを回収することを制限しており、分離の総体的選択性に影響を及ぼしている。ペプチドの寸法とペプチドのＳＥＣ保持の間に、緩い相関関係だけが観察された。より長いペプチド（より疎水性で、それ故ＲＰ様式でより保持される）は、予想通りＳＥＣ中で早めに溶出される。しかしながら、ＲＰ×ＳＥＣの組合せに関する直交性の程度は、予想された程度よりも大きかった（データは示されていない）。この挙動は、前述のペプチドの吸着剤との第２の相互作用によって生じたと考えられる。
【００７９】
ＨＩＬＩＣ様式も、ペプチド分離に関して同様に評価した。ＨＩＬＩＣ様式におけるペプチドの分離に関する報告はわずかしか発行されておらず、主にポリアスパラギン酸塩またはアミド吸着剤を使用している。本発明者らは、裸のシリカ吸着剤を充填したＨＩＬＩＣカラムを使用した。ペプチドピーク形状も回収も共に良好であった。注入前にペプチドサンプルを７０％アセトニトリルに溶解した際に、沈澱は観察されなかった。ペプチド充填とＨＩＬＩＣ保持にいくらかの相関関係があることは、保持メカニズムが区分化およびイオン相互作用（例えば荷電したシラノールによる）の両方を含んでいることを示唆している。従って、分離選択性は部分的にＳＣＸ様式におけるペプチド保持に似ている。高い度合いのＨＩＬＩＣ−ＲＰシステムの直交性が、２Ｄ−ＬＣのためのアプローチを有望なものとしている。
【００８０】
ＳＣＸ−ＲＰの組合せ（図１）は、上記のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ−ＨＩＬＩＣ実施例と比較して、より低い直交性を示す。ＳＣＸ様式における分離は、一次的にペプチド電荷に基づくので、二重および三重に荷電したペプチドは、クラスターにおいて溶出する傾向があり、ピークの発生が少ない一部の他の分離部分を出る。典型的なサンプル中に存在するトリプシンペプチドは殆ど、２＋に荷電しており（６０〜８０％）、従って、成分の大部分は狭い保持時間の範囲内にあり、それ故十分に分解していない。加えて、ある条件下で、本発明者らは、２５％アセトニトリルを移動相に加えたにもかかわらず、ＳＣＸ次元中の疎水性ペプチドの損失を観察した（類似の損失がＳＥＣに関しても同様に見られた）。これらの事例において、約３０〜４０％のペプチドがＳＣＸから溶出していることが検出されなかった。しかしながら、ＬＣ−ＭＳ相容性揮発性移動相を使用してＳＣＸを使用した場合、関係する全てのペプチド（疎水性ペプチドを含む）が、検出された（移動相中に２５％または５％両方のアセトニトリルを含む状態において、データは示されていない）。いかなる理論にも拘泥することを望むものではないが、ペプチドが移動相中のアセトニトリルの含有にもかかわらず、ＳＣＸカラムから不完全に溶出（ＮａＣｌ溶出剤）されること、または高濃度の不揮発性塩の存在において収集後の沈澱が生じていることのいずれかが考えられる。本発明者らは、ＬＣ−ＭＳ相容性バッファーは、ペプチドのＳＣＸ区分に利益があるものと確信している。
【００８１】
これらの結果は、多次元分離に使用することのできる補足的分離を得るために使用することのできるある分離の組合せを示している。２つの分離の間のｐＨの相違は、たとえ同じ分離様式（例えばＲＰ−ＨＰＬＣ）が、第１および第２分離次元の両方に使用されても、実質的な直交性を提供するために使用することができる。
【実施例２】
【００８２】
ＳＣＸ吸着剤をより詳細に調査した。ＳＣＸ様式における溶出は、通常ＮａＣｌの勾配を使用して達成され、これがこの様式をＭＳ検出とは相容れないものとしている。オフラインおよびオンライン両方の２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ設定は、しばしばＲＰ捕獲カラムを経由して実現されるサンプルの脱塩に通常依存する。以前に発行された報告書は、利用可能なＳＣＸ吸着剤は２次（疎水性）相互作用を示し、これが疎水性ペプチドの回収を低下させることを示している。移動相への有機溶媒の添加がピーク形状とペプチドの回収を改良することが示唆された。しかしながら、移動相中に２５％のアセトニトリルを使用しても、予想したよりもペプチドの数が少ないことを本発明者らは観測した。従って、本発明者らは代替移動相と直接ＭＳ検出を調査した。
【００８３】
移動相は、揮発性バッファー、すなわち４００ｍＭの水酸化アンモニウムを、ＦＡを使用してｐＨ３．２５に滴定したもの、から調製した。ＦＡの最終濃度は約１．３Ｍ（５％ＦＡ）であった。ＦＡのｐＫａは３．７５であるので、バッファーのｐＨ（０．５ｐＨ単位低い）は、ＦＡの２５％だけが脱プロトンし、［Ｈ＋］の濃度を３２５ｍＭにもってくることを保証する。アンモニウム陽イオンと一緒になって、このバッファーの全陽イオン強度は、７２５ｍＭになる。バッファーの１０％〜７５％勾配（７２．５〜５４３．７５ｍＭ）が、５＋荷電までの全ての所望のペプチドを成功裏に溶出した。ＭＳ信号は、劇的に抑制されず、オンラインＬＣ−ＭＳ検出が可能であった。
【００８４】
予想されたように、ＳＣＸ選択性は、ペプチド電荷によって駆動されると考えられる。プロットから現れる傾向は、ペプチドの保持は、それの長さにも依存することを示唆している。大きなペプチド（これはより疎水性でよりよくＲＰ中に保持される）は、同じ電荷の短いペプチドに比較して、ＳＣＸクロマトグラフィー中に比較的保持されにくい。この挙動は、電荷密度（これはペプチドが短くなるほど大きくなる）が、保持メカニズムにおいて第２の役割を果たすことを暗示している。特定の理論にも拘泥することを望むものではないが、電荷密度は、ペプチドの吸着剤との残留疎水性相互作用よりもむしろ、同じ電荷を有するペプチドを分解するためのＳＣＸ吸着剤の能力に関与していると考えられる。
【００８５】
ＳＣＸ−ＲＰ組合せの直交性は、良好であると考えられる。しかしながら、プロットしたデータにおいて、最も多量のペプチドのグループ（６６％のペプチドが２＋に荷電しており、２８％のペプチドが３＋に荷電している）が、堅固なクラスターを形成する。２Ｄ分離空間は、データポイントによって均一にカバーされていないので、直交性は予想された値より低い。
【実施例３】
【００８６】
ペプチドの２Ｄ−ＨＰＬＣ分離へのアプローチとして、ＲＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣを特性決定するために追加の実験を実施した。オフライン２Ｄ−ＨＰＬＣ実験を、達成可能な直交性の程度を確認するために設定した。５つの等モル比（それぞれ１０ｐｍｏｌｅ）の消化したタンパク質混合物を含むサンプルを、ｐＨ１０において、最近ＲＰ−ＨＰＬＣ用途のために開発された（Ｋ．Ｄ．Ｗｙｎｄｈａｍ他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ（２００３年），７５巻，ｐ．６７８１〜６７８８）、新規の３．５μｍＣ１８架橋−エチルハイブリッド（ＢＥＨ）シリカ吸着剤を充填した１５０×１ｍｍカラムを使用して、第１ＲＰ−ＨＬＰＣ次元中に注入した。ＢＥＨ吸着剤は、広範囲のｐＨにおいて非常に安定であり、ｐＨ２．６および１０両方における分離のための理想的な材料を提供する。
【００８７】
これら条件下で、平均ピーク幅は、基準線において典型的に０．５分である。２．５分の画分（５ピーク幅）を収集し、アセトニトリルおよび水酸化アンモニウムの含有量を減少させるために、部分的に蒸留した。画分の最終容量は１０μｌであり、１μｌを１５０×０．３ｍｍ、３．５μｍＢＥＨ Ｃ１８キャピラリーカラムを使用して第２ＬＣ−ＭＳ次元に注入した。
【００８８】
第１ＬＣ次元において早めに溶出するペプチドは、第２次元においても早めに溶出する傾向がある。同様に、遅く溶出した画分おいて収集されたペプチドは、第２分離次元においても遅れて溶出する。分離の直交性は、特に同じ種類のＣ１８吸着剤を第１および第２次元に使用したことを考慮した場合、良好であると考えられ、従って直交性は、ｐＨの効果を経由してのみ作られる。使用したキャピラリーＬＣシステムの勾配の遅れは約１３分であった。この特定の時間は、含まれるピークによるものではない。少しのトリプシンペプチド溶出が４３分を超えても、有用な分離ウィンドウは、３０分の幅しかない。ペプチドを溶出する収集した画分の殆どは、有用なＬＣ−ＭＳ時間の５０％〜７０％をカバーする。早期、中期、および後期に収集する画分の勾配の開始強度および間隔の調節によって、潜在的にペプチドを分離空間上により均一に広げることができる。
【００８９】
ＲＰ−ＲＰアプローチの直交性を、ＳＣＸ−ＲＰ−ＨＰＬＣシステムと比較した。（１ｍｍ内径カラムを用いたＲＰ−ＲＰ実験に比例した荷重を維持するために）４．４×超ペプチド質量を装荷した１５０×２．１ｍｍＳＣＸカラムを使用した。収集した画分をＳＰＥによって脱塩し、最終容積を蒸発によって４４μｌに減少させた。約１μｌを、ＬＣ−ＭＳによって分析した。装荷質量および分離条件は、以前のＰＲ−ＰＲ実験と同一であった。これらの条件下、分離直交性は、両方の２ＤＨＰＬＣシステムと同程度であることが判明した。
【実施例４】
【００９０】
分離選択性に対するｐＨの影響を、最初Ｅｎｏｌａｓｅ消化物（約３５ペプチド）を使用して評価した。ｐＨ７．９（１０ｍＭの重炭酸アンモニウム）の移動相で得られた保持時間を、ＦＡでｐＨ２．６にした移動相の以前に記録したデータに対してプロットした。分離の直交性は、本明細書で説明した他の幾つかの実験における直交性よりも顕著に大きかった。直交性における変化が、本当にｐＨの差異によるものかを明らかにするために、本発明者らは他の実験を実施した。ＨＰＬＣカラムに極性埋込みＲＰ−１８およびＰｈｅｎｙｌ吸着剤を充填し、分離を、類似のｐＨ（それぞれ７．９および８．５）を使用して実施した。上述のｐＨ２．６およびｐＨ７．９の間で観察された直交性に対比して、著しい直交性は観察されなかった。
【００９１】
ｐＨの影響を、両方の分離次元におけるより広いｐＨギャップを使用して更に調査した。ｐＨ８．５および１０において収集した実験データは、ｐＨ２．６の保持時間データに対してプロットした場合に著しい直交性の度合いを示した。ＲＰ分離次元の間のｐＨ差異が広くなるほど、より大きな直交性が達成された。従って、更なる議論は、ｐＨ２．６対ｐＨ１０の実験に焦点が当てられる。ｐＨ１０の分離は、高いｐＨにおいて安定なことが知られているＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８固定相について実施した。分離のために使用した２０ｍＭのギ酸アンモニウムバッファーがＭＳ信号をある程度抑制した。しかしながら、全てのペプチド質量は、明瞭に検出された。ｐＨ１０における保持データを、移動相中に０．２％のＦＡを使用している（ｐＨ２．６）ＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｃ１８ ＰＡ−Ａカラムからのデータに対してプロットした。２−Ｄ分離空間上にペプチドの比較的に高い広がりが観察された。データは、ペプチドｐＩ値に従って、３つのグループに細分化した。グラフから表れる空間的分離は、主要な分離要因が実際にはペプチドのｐＩ（電荷）であることを示唆している。（少なくとも部分的に放電された場合に）ｐＨ１０の条件下でより強力に保持される塩基性ペプチド（ｐＩ＞７．５）に比較して、カルボキシル部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）がイオン化されない場合の酸性ペプチド（ｐＩ＜５．５）の種類は、ｐＨ２．６においてより強力に保持される。
【００９２】
５．５〜７．５ｐＩ範囲内のペプチドのグループに関しても、ある程度の直交性が観察された。この観察は、更なる注釈に値する。ペプチドｐＩ値は、分子の正味荷電がゼロに等しい場合のｐＨを表す。ｐＩは、塩基性アルギニン（ｐＫａ１２．５）、リシン（ｐＫａ１０．２）、ヒスチジン（ｐＫａ６．４５）、端末アミノ基ＮＨ２（ｐＫａ７．６）などの多くのイオン化アミノ酸、アスパラギン酸（ｐＫａ３．９５）、グルタミン酸（ｐＫａ４．４５）、チロシン（ｐＫａ９．８）、および端末ＣＯＯＨ基（ｐＫａ３．６）などの酸性アミノ酸の寄与の合計である。ｐＩ範囲が５．５〜７．５の「中性」ペプチドでも、少なくとも一部のイオン化基が、分離条件（ｐＨ２．６または１０）において異なる電荷／放電を行うので、ｐＨによって影響を受けるはずである。
【００９３】
本明細書で引用した全ての特許および参考資料の内容は、参照により本明細書に援用する。
【００９４】
本開示に照らして、当業者によって認識されるように他の実施形態が、本発明および添付の特許請求範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】第１次元においてＳＣＸを、第２次元においてＲＰ−ＨＰＬＣを使用する多次元ＬＣ分離システムから得られた分離を示すプロット図である。
【図２】第１次元においてＲＰ−ＨＰＬＣを、第２次元においてＲＰ−ＨＰＬＣを使用する多次元ＬＣ分離システムから得られた分離を示すプロット図である。
【図３】第１次元においてＨＩＬＩＣを、第２次元においてＲＰ−ＨＰＬＣを使用する多次元ＬＣ分離システムから得られた分離を示すプロット図である。
【図４】選択した２Ｄ−ＬＣシステムに関する幾つかの正規化された保持時間のプロット図である。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／６４５，８１０号；２００５年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６５５，８４０号；２００５年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／６８６，２６８号の利益を主張するものである。これらの全ての出願は、それらの内容全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
化学的および生物的サンプルは、しばしば化合物の混合物を含有している。混合物を分離するための様々なクロマトグラフ技術が開発され、多くのクロマトグラフ的分離および精製のためのシステムが市販されている。
【０００３】
最も知られているクロマトグラフ技術には、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）がある。ＨＰＬＣ法は、極性および無極性化合物を分離するために使用することができ、ＨＰＬＣ法に使用する溶媒（すなわち移動相）および固定相は、分離する検体の種類に基づき選択される。移動相と固定相とを注意深く選択することによって、多くの混合物を、更なる分析または使用のために分離することのできる、十分に分解したピークまたは画分に分離することができる。質量分析（ＭＳ）などの方法による特性決定によって、サンプル中に存在する検体についての情報が提供される。
【０００４】
様々なＨＰＬＣ技術が報告されている。最も広く使用されているものには、「順相」ＨＰＬＣ（一般的に比較的極性の検体に有用であり、極性の最も小さい検体が通常最初に溶出される）および「逆相」ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ、一般的に極性のより小さな検体に有用であり、極性の最も小さい検体が通常最後に溶出される）がある。「親水性相互作用クロマトグラフィー」またはＨＩＬＩＣと呼ばれる変形態は、逆相カラムには十分保持されない高度に極性の検体に有用である。
【０００５】
しかしながら、複合体混合物が含まれている場合、単一のクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）分離では、全ての化合物を十分に分離したピークまたは画分に分離することができないこともある。ピークが十分に分解されない場合は、分離の後でも不純物または汚染物が存在することもあり、収集した画分の特性決定を妨げる。この問題に取り組むために、多次元クロマトグラフ法が開発された。これらの方法において、サンプルは第１分離にかける。第１分離から得られた溶媒流は、通常は部分的に精製された化合物混合物を表す画分中に収集される。次いで個々の画分は、選択され、第２分離技法にかける。第１および第２分離の条件は、一般的に異なっており、条件を注意深く選択すれば、第２分離は、第１分離の次元では分解しなかった化合物の分離を可能とするはずである。かかる多次元クロマトグラフ法の例には、例えばＴｒａｎｃｈｉｄａ，ＰＱら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１０５４（１−２）：３−１６（２００４年）が含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かかる方法は、２つのクロマトグラフ法のそれぞれにおいて、異なるカラムおよび異なる移動相の使用をしばしば含み、これは複雑さを追加する結果をも伴う。例えば、強陽イオン交換（ＳＣＸ）分離の後ＲＰ−ＨＰＬＣを行うことがペプチド混合物を分析するのに使用されている。しかしながら、ＳＣＸ条件によってしばしば必要とされる高塩濃度および／または有機溶媒は、ＲＰ−ＨＰＬＣに必要とされる条件とは相容れないこともあり、追加のサンプル後処理がしばしば必要とされる。
【０００７】
更に、２つの分離に使用される移動相または移動相添加物が、質量分析法を含む検出器、または分析システムの他の部分と相容れないこともあり、検出またはサンプル処理に更なる困難をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここに、２つの分離に使用される移動相のｐＨを変えることによって、第１および第２の両方の次元に関し、ＨＰＣＬ分離を使用して多次元ＨＰＬＣを実施することができることが見出された。
【０００９】
一実施形態において、本発明は少なくとも１種の検体を含むサンプルを分析するための方法を提供し、この方法は、ａ）サンプルを、第１ｐＨにおいて、第１移動相を使用して第１液体クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）第１クロマトグラフ分離から少なくとも１つの画分（または部分）を収集（またはサンプリング）するステップと；ｃ）少なくとも１つの画分を第２ｐＨにおいて、第２移動相を使用して第２液体クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；（場合によっては）ｄ）サンプル中の少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップとを含み、ここで第１ｐＨと第２ｐＨが異なっている。
【００１０】
ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ分離は、互いが実質的に直交している。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第２クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、少なくとも１００ピークのピーク容量を有している。
【００１１】
ある好ましい実施形態において、第１ｐＨと第２ｐＨは、少なくとも約３ｐＨ単位異なっている。ある好ましい実施形態において、請求項１の方法は、少なくとも１種の検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。ある好ましい実施形態において、少なくとも１種の検体は、小さな有機分子である。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、この方法の全ピーク容量は、少なくとも１，０００、５，０００または１０，０００ピークである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される。
【００１２】
ある好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集またはサンプリングした少なくとも１つの画分または部分は、少なくとも１つの画分が第２クロマトグラフ分離様式にかけられる前に濃縮または希釈され、ある実施形態では、少なくとも１つの画分が蒸発によって濃縮される。他の好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集（または選別）した少なくとも１つの画分（または部分）が、第２クロマトグラフ分離様式を行う前にオンラインで希釈される。ある実施形態において、ステップｂ）で収集した少なくとも１つの画分が、オンライン希釈を使用して希釈される。
【００１３】
ある好ましい実施形態において、検出ステップは、質量分析計を使用して実施される。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ様式は同じである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、実質的に不揮発性塩を含んでいない。ある好ましい実施形態において、第２移動相は約２０ｍＭ未満の（より好ましくは、１０または５ｍＭ未満の）不揮発性塩を含んでいる。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、約２０ｍＭ未満の揮発性塩を含んでいる。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、サンプル中の複数の検体を分離するための方法を提供する。この方法は、ａ）少なくともサンプルの一部を、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）少なくとも１つの画分（または部分）を、第１クロマトグラフ分離から収集（または選択）するステップと；ｃ）サンプル中の少なくとも２個の検体が分離されるような条件下、少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップとを含む。
【００１５】
ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ分離は、互いに実質的に直交している。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第２クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、少なくとも１００ピークのピーク容量を有している。
【００１６】
ある好ましい実施形態において、第１ｐＨと第２ｐＨは、少なくとも約３のｐＨ単位異なっている。ある好ましい実施形態において、請求項１の方法は、少なくとも１種の検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。ある好ましい実施形態において、少なくとも１種の検体は、小さな有機分子である。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、この方法の全ピーク容量は、少なくとも１，０００、５，０００または１０，０００ピークである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される。
【００１７】
ある好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集またはサンプリングした少なくとも１つの画分または部分は、少なくとも１つの画分が第２クロマトグラフ分離様式にかけられる前に濃縮または希釈され、ある実施形態では、少なくとも１つの画分が蒸発によって濃縮される。他の好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集（または選別）した少なくとも１つの画分（または部分）が、第２クロマトグラフ分離様式を行う前にオンラインで希釈される。ある実施形態において、ステップｂ）で収集した少なくとも１つの画分が、オンライン希釈を使用して希釈される。
【００１８】
ある好ましい実施形態において、検出ステップは質量分析計を使用して実施される。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ様式は同じである。ある好ましい実施形態において、第２移動相は、実質的に不揮発性塩は含んでいない。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は約２０ｍＭ未満の（より好ましくは、１０または５ｍＭ未満の）不揮発性塩を含んでいる。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、約２０ｍＭ未満の揮発性塩を含んでいる。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は２次元（または多次元）の液体クロマトグラフィーシステム中の複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するための方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを、前記２次元（または多次元）の液体クロマトグラフィーシステムの第１次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；ｂ）第１移動相を使用する前記第１次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中の前記サンプルの少なくとも第２ポリペプチドから、前記サンプルの少なくとも第１ポリペプチド成分をクロマトグラフィーで分離するステップと；ｃ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の前記分離した第１および第２ポリペプチド成分を溶出するステップと；ｄ）前記溶出液の個別の容積の少なくとも１つをサンプリングするステップと；ｅ）前記個別の容積の少なくとも１つを、前記２次元（または多次元）の液体クロマトグラフィーシステムの第２次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；ｆ）注入した個別の容積を、第２移動相を使用する前記第２次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中でクロマトグラフ分離させ、ここで前記第１および第２移動相のｐＨが約３ｐＨ単位異なっているステップと；（場合により）ｇ）前記第２次元クロマトグラフィー装置の前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液を、質量分析法を使用して特性決定し、これによって複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するステップとを含む。
【００２０】
ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ分離は、互いに実質的に直交している。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第２クロマトグラフ分離様式は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、好ましくはＨＩＬＩＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、少なくとも１００ピークのピーク容量を有している。
【００２１】
ある好ましい実施形態において、第１ｐＨと第２ｐＨは、少なくとも約３のｐＨ単位異なっている。ある好ましい実施形態において、少なくとも１種の検体は、小さな有機分子である。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１０００個の検体を含有している。ある好ましい実施形態において、この方法の全ピーク容量は、少なくとも１，０００、５，０００または１０，０００ピークである。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ分離は、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される。
【００２２】
ある好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集またはサンプリングした少なくとも１つの画分または部分は、少なくとも１つの画分が第２クロマトグラフ分離様式にかけられる前に濃縮または希釈され、ある実施形態では、少なくとも１つの画分が蒸発によって濃縮される。他の好ましい実施形態において、ステップｂ）で収集（または選別）した少なくとも１つの画分（または部分）が、第２クロマトグラフ分離様式を行う前にオンラインで希釈される。ある実施形態において、ステップｂ）で収集した少なくとも１つの画分が、オンライン希釈を使用して希釈される。
【００２３】
ある好ましい実施形態において、検出ステップは質量分析計を使用して実施される。ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ様式は同じである。ある好ましい実施形態において、第２移動相は、実質的に不揮発性塩は含んでいない。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は約２０ｍＭ未満の（より好ましくは、１０または５ｍＭ未満の）不揮発性塩を含んでいる。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、約２０ｍＭ未満の揮発性塩を含んでいる。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は化合物および少なくとも２つの不純物を含むサンプル中の化合物を精製する方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを、化合物が第１不純物から分離されるような条件下で、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）第１クロマトグラフ分離から、少なくとも１つの化合物含有画分を収集するステップと；ｃ）少なくとも１つの化合物含有画分を、化合物が第２不純物から分離されるような条件下で、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｄ）精製した化合物を収集するステップとを含む。
【００２５】
本明細書で説明するいずれかの方法のある好ましい実施形態において、方法は、サンプル中に存在する化合物および／または不純物の１つ、幾つか、または全部を同定するステップを更に含むことができる。ある好ましい実施形態において、同定は質量分析法によって実施される。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィーシステムを提供する。このシステムは、ａ）第１クロマトグラフカラムおよび第１クロマトグラフカラムを通して第１移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第１クロマトグラフ分析システムと；ｂ）第２クロマトグラフカラムおよび第２クロマトグラフカラムを通して第２移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第２クロマトグラフ分析システムと；ｃ）第１クロマトグラフカラムの溶出液流からの少なくとも１つの化合物含有画分を選択し、少なくとも１つの化合物含有画分を第２クロマトグラフカラムに導く手段、（ここで、第１移動相のｐＨと第２移動相のｐＨが異なる）とを含む。
【００２７】
ある好ましい実施形態において、システムは更に検出器、より好ましくは質量分析計を含む。ある好ましい実施形態において、第１および第２クロマトグラフ様式は同じである。ある好ましい実施形態において、第２移動相は、実質的に不揮発性塩を含んでいない。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は約２０ｍＭ未満の（より好ましくは、１０または５ｍＭ未満の）不揮発性塩を含んでいる。ある好ましい実施形態において、第１および／または第２移動相は、約２０ｍＭ未満の揮発性塩を含んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、化合物または化合物の混合物を分離、精製、および／または分析するための方法およびシステムを提供する。本発明の方法およびシステムは、分離が可能であり、これによって化合物の複合体混合物を分解し、かかる混合物の成分の迅速な同定を可能にする。
【００２９】
混合物に存在する化合物は、例えば、（薬剤または薬剤の候補などの）小さな有機分子、（例えば、タンパク質の消化物もしくはタンパク質の混合物を含む、ペプチド合成からのまたは生体サンプルからの）ペプチドもしくはポリペプチド、（例えば、生体サンプルからのまたは合成したポリヌクレオチドからの）核酸もしくはポリヌクレオチド、合成もしくは天然ポリマー、またはこれらの材料の混合物であることができる。化合物の種類は、本明細書で説明する、化合物分離のために選択されたクロマトグラフ法によってのみ制限される。好ましい実施形態において、少なくとも１つの化合物または不純物が、少なくとも部分的に、約２〜約１２の範囲のｐＨで荷電されている。少なくとも１つの化合物または不純物が、約２〜約１２の範囲の第１ｐＨにおいて第１荷電状態を有し、約２〜約１２の範囲の第２ｐＨにおいて第２荷電状態を有することがより好ましい。例えば、化合物は、より低いｐＨにおいて＋１の荷電を有することができ、より高いｐＨにおいて０（中性）の電荷を有することができ；またはより低いｐＨにおいて＋２の電荷を、より高いｐＨにおいて＋１の電荷を、および第３の一層高いｐＨにおいては０の電荷を有することができる。ある好ましい実施形態において、検出され、分析され、または精製される検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
【００３０】
従って、一態様において、本発明は少なくとも１種の検体を含むサンプルを分析するための方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを第１ｐＨにおいて第１移動相を使用して第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）少なくとも１つの画分を、第１クロマトグラフ分離から収集または選択するステップと；ｃ）少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２移動相を使用して第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；（場合によって）ｄ）サンプル中の少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップとを一般的に含み、ここで、第１ｐＨと第２ｐＨが異なっている。
【００３１】
別の態様において、本発明は、サンプル中の複数の検体を分離するための方法を提供する。この方法は、サンプル中の少なくとも２種の検体が分離される条件下で、ａ）少なくともサンプルの一部を、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）少なくとも１つの画分を、第１クロマトグラフ分離から収集するステップと、ｃ）少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップとを含む。
【００３２】
別の実施形態において、２次元液体クロマトグラフィーシステム中の複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するための方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを、前記２次元液体クロマトグラフィーシステムの第１次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；ｂ）第１移動相を使用する前記第１次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中の前記サンプルの少なくとも第２ポリペプチドからの前記サンプルの少なくとも第１ポリペプチド成分をクロマトグラフィーで分離するステップと；ｃ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の前記分離した第１および第２ポリペプチド成分を溶出するステップと；ｄ）前記溶出液の個別の容積の少なくとも１つをサンプリングするステップと；ｅ）前記個別の容積の少なくとも１つを、前記２次元の液体クロマトグラフィーシステムの第２次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；ｆ）注入した個別の容積を、第２移動相を使用する前記第２次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中でクロマトグラフ分離させ、ここで前記第１および第２移動相のｐＨが約３ｐＨ単位異なっているステップと；ｇ）前記第２次元クロマトグラフィー装置の前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液を、質量分析法を使用して特性決定し、これによって複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するステップとを含む。
【００３３】
更に別の態様において、本発明は、化合物と少なくとも２つの不純物を含むサンプル中の化合物を精製するための方法を提供する。この方法は、ａ）サンプルを、化合物が第１不純物から分離されるような条件下で、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｂ）第１クロマトグラフ分離から、少なくとも１つの化合物含有画分を収集するステップと；ｃ）少なくとも１つの化合物含有画分を、化合物が第２不純物から分離されるような条件下で、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；ｄ）精製した化合物を収集するステップとを含む。
【００３４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式の移動相のｐＨと第２クロマトグラフ分離様式の移動相のｐＨとは、第１および第２クロマトグラフ分離のそれぞれの間、例えば、分離がｐＨに関して定組成であるなど、それぞれ実質的に一定に維持される。この結果は、例えば、分離様式に関して単一の移動相を使用する；またはカラムに適用される移動相が分離を通して実質的に同じｐＨを有するように、ポンプおよび混合弁で混合した２つの移動相成分（それぞれの移動相成分が類似のまたは同一のｐＨを有する）を使用する（例えば、本明細書の実施例を参照されたい）；または類似のｐＨを有する２つの移動相と第３の移動相成分または改質剤を一定量ポンプによって混合して、実質的に一定の移動相ｐＨをカラムに供給するなど、幾つかの方法において達成することができる。しかしながら、ある実施形態において、第１および／または第２クロマトグラフ様式に供給される移動相のｐＨは、第１および／または第２クロマトグラフ分離中、あるｐＨ範囲で変えることができる。かかる実施形態において、第１クロマトグラフ様式のｐＨ範囲は、第２クロマトグラフ様式のｐＨ範囲と異なることが好ましい。
【００３５】
好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式移動相のｐＨと第２クロマトグラフ分離様式移動相のｐＨとの差異は、少なくとも３ｐＨ単位である。例えば、第１クロマトグラフ分離様式移動相のｐＨが２．５の場合、第２クロマトグラフ分離様式移動相のｐＨは、少なくとも５．５とすることができる。ある実施形態において、ｐＨの差異は、少なくとも約４ｐＨ単位、５ｐＨ単位または６ｐＨ単位である。１つのクロマトグラフ分離様式移動相のｐＨは、例えば２と５の間とすることができ、一方別のクロマトグラフ分離様式移動相のｐＨは、例えば少なくとも３ｐＨ単位超：例えば５と８の間、または５と１０の間、または７と１２の間とすることができる。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式のｐＨは、約２と約６の間、より好ましくは約２と約５の間、または約２．５と約４．５の間である。ある好ましい実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式のｐＨは、約６と約１２の間、より好ましくは約６と約１０の間、または約７と約１０の間である。
【００３６】
本発明の１つのまたは両方の次元において使用するのに適したクロマトグラフ法には、順相ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＬＩＣ、およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を含むサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などの液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣを含む）法が含まれる。他の適切な方法には、付加的なＨＰＬＣ方法および例えば、超性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、迅速性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）などを含む関連する液体クロマトグラフ技法が含まれる。
【００３７】
ある実施形態において、好ましい分離様式は、例えば、移動相が質量分析計にサンプルの清浄化または脱塩を、殆どまたは全く行うことなく注入するのに適しているなど、移動相が質量分析法などの分析技術と相容性があるものである。従って、ある好ましい実施形態において、溶出液が質量分析法によって分析される分離様式の移動相、例えば第２クロマトグラフ様式移動相は、実質的に不揮発性塩を含んでいない。例えば、ある実施形態において、第２移動相は、２０ｍＭ未満（または１０ｍＭもしくは５ｍＭ未満）の不揮発性塩を含んでいる。本明細書で使用される「不揮発性塩」という用語は、液体クロマトグラフィーシステムを質量分析計と相互作用させる場合に、移動相溶媒を取り除くために使用される条件下で、実質的に不揮発性である移動相中に存在する塩を指す。これは、塩化ナトリウムまたはリン酸カリウムは不揮発性塩であると考えられ、一方、ギ酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、または酢酸アンモニウムなど、大部分が真空下で除去される塩は、揮発性塩である。他の揮発性塩も、当業者には明らかなように、使用することができる。例えば、揮発性酸（例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、パーフルオロオクタン酸）のアンモニウム（ＮＨ４＋）塩は、一般的にＭＳ検出に使用するのに適した揮発性塩である。
【００３８】
ある実施形態において、第１または第２クロマトグラフ分離は、ＨＰＬＣ分離、より好ましくは逆相ＨＰＬＣ分離である。ある好ましい実施形態において、第１または第２クロマトグラフ分離の１つまたは両方がＨＩＬＩＣ分離である。ある好ましい実施形態において、第２クロマトグラフ分離の種類は、例えば第１および第２クロマトグラフ分離の両方がＲＰ−ＨＰＬＣである、または両方がＨＩＬＩＣであるなど、第１クロマトグラフ分離と同じである。
【００３９】
混合物中に存在する検体または化合物は、例えば（薬剤または薬剤の候補など、一般的に１０００未満の分子量を有する）小さな有機分子、（例えば、タンパク質の消化物もしくはタンパク質の混合物を含む、ペプチド合成からのまたは生体サンプルからの）ペプチドもしくはポリペプチド、（例えば、生体サンプルからのまたは合成したポリヌクレオチドからの）核酸もしくはポリヌクレオチド、合成もしくは天然ポリマー、またはこれらの物質の混合物であることができる。化合物の種類は、本明細書で説明する、化合物分離のために選択されたクロマトグラフ法によってのみ制限される。ある好ましい実施形態において、検出され、分析され、または精製される検体は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
【００４０】
ある実施形態において、分析または精製されるサンプルは、少なくとも２０、５０、１００、５００、１０００、または５０００個の検体および／または化合物および／または成分および／または不純物を含む。
【００４１】
サンプル混合物の構成物質を効率的に分離するために、高いピーク容量を有する分離様式が好ましい。例えば、ある実施形態において、第１クロマトグラフ分離様式は、少なくとも１０、２０、５０または１００ピークのピーク容量を有し、あるいは第２クロマトグラフ分離様式は、少なくとも１０、２０、５０または１００ピークのピーク容量を有する。
【００４２】
第１分離における化合物のグループの保持時間が、第２分離における化合物のグループの保持時間と高度に関連づけられない２つの分離は「直交している」と言うことができる。例えば、第１分離における化合物のグループの保持時間を第２分離における化合物のグループの保持時間に対してプロットしたならば、得られたグラフの相関係数（Ｒ２）は、２つの分離が同一ならば、１．０に、２つの分離が完全に直交するのならば０．０１となる。ある実施形態において、相関係数（Ｒ２）が約０．８未満の場合、本明細書で使用される用語として、２つの分離様式は「実質的に直交」している。他の実施形態において、（参照により本明細書に援用する、Ｇｉｌａｒ、Ｍ．；Ｏｌｉｖｏｖａ、Ｐ．；Ｄａｌｙ、Ａ．Ｅ．；Ｇｅｂｌｅｒ、Ｊ．Ｃ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５年）７７版，ｐ．６４２６〜６４３４に記載された方法によって決定した）直交性％（Ｏ％）が約３０％超の場合、本明細書で使用される用語として、２つの分離様式は「実質的に直交」している。好ましい実施形態において、本発明による第１分離と第２分離の間の相関係数は、０．８未満、より好ましくは０．６未満、より好ましくは０．４未満、更により好ましくは０．２未満、特に好ましくは０．１未満である。
【００４３】
２つの好ましい直交分離において、方法の合計ピーク容量は、個々の方法のピーク容量の積である（すなわち、個別の方法のピーク容量を掛け合わせたものである）。例えば、第１分離がピーク容量５０を有し、完全に直交している第２分離がピーク容量１００を有している場合、化合物が連続的に第１および第２分離を受けるシステムの合計ピーク容量は、５０×１００＝５０００ピークである。２つの分離が完全に直交でないシステムにおいて、合計ピーク容量は、個々の方法のピーク容量の積よりも幾分小さくなる。ピーク容量は、画分収集の頻度などの要因によって減少することが可能であり、また理論的ピーク容量よりも小さいこともあることが認識される。好ましい実施形態において、方法は少なくとも１０００、２０００、５０００、または１００００ピークの合計ピーク容量を有している。
【００４４】
選択したＬＣ様式の直交性を評価するために（例えば、ペプチドの使用に関して）、前に説明したようにペプチド保持マップを構築することができる（参照により本明細書に援用する、Ｇｉｌａｒ、Ｍ．；Ｏｌｉｖｏｖａ、Ｐ．；Ｄａｌｙ、Ａ．Ｅ．；Ｇｅｂｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．（２００５年）２８巻，ｐ．１６９４−１７０３；および同じく参照により本明細書に援用する、Ｇｉｌａｒ、Ｍ．；Ｏｌｉｖｏｖａ、Ｐ．；Ｄａｌｙ、Ａ．Ｅ．；Ｇｅｂｌｅｒ、Ｊ．Ｃ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５年）７７巻、ｐ．６４２６−６４３４も参照されたい）。簡単に言えば、５つのタンパク質消化物（それぞれ２０〜１００のペプチドを含む）を逐次ＬＣ−ＵＶ−ＭＳシステムに注入し、ペプチドをそれぞれ特有の質量によって同定し、これらの保持を記録した。保持データは、単一次元ＬＣセットアップにおいて、各ＬＣ様式に関して取得し、式１に従って正規化した。
【００４５】
【数１】
【００４６】
ＲＴｍａｘおよびＲＴｍｉｎは、それぞれデータセットにおいて保持されたペプチドの最大と最小の保持時間を表す。保持時間ＲＴｉは、正規化されたＲＴｉ（ｎｏｒｍ）に変換される。ＲＴｉ（ｎｏｒｍ）の値は、０から１にわたる。正規化は、２つの目的を果たす。第１は、保持時間の絶対値に関係なく、均一２Ｄ保持空間における異なるクロマトグラフデータの比較を可能にすることである。第２は、ピークが溶出されない場合の２Ｄ分離プロットにおけるボイドスペースを除去することである。ボイドは、カラムのボイド容積、ＬＣシステムの勾配の遅れ、または有用な範囲の外側にわたる勾配の使用によって生じ得る（例えば、ＲＰ−ＬＣにおける０〜１００％アセトニトリルの勾配、実際には全てのトリプシンペプチドが０〜５０％アセトニトリル内で溶出する）。
【００４７】
２Ｄ−ＬＣ分離における直交性を特性決定するために開発されたツールは、情報的近似性、シネントロピの割合、ピーク広がり角度、および実際的ピーク強度などの幾つかの補助的記述子を使用する。これらの数学的モデルは、一部の状況の説明には適しているが、他の状況（データの集団化を含む）では記述が困難なこともある。従って、直感的な単一記述子を使用することができる。このモデルは、以下のアプローチを使用する。（ｉ）正規化した保持データ（式１）を、図４に示すように２Ｄ分離スペースにプロットする。（ｉｉ）面積を各データポイントに割り当てて、正規化されたピーク面積を表す（ピーク幅は、４σ、ピーク高さの１３．４％においてスナイダー（Ｓｎｙｄｅｒ）により測定する）。（ｉｉｉ）直交性を２Ｄ分離スペース中のピークによってカバーされる正規化された面積として規定する。カバーされる面積が大きくなれば、直交性は大きくなる。
【００４８】
問題を単純化するために、更に、以下の仮定をすることができる。（ｉ）２Ｄ分離スペースは、以前に発行された報告書と同様に、長方形ビンに区分された。この結果、各ビンはピーク面積に相当する。（ｉｉ）データセットは、データポイントの数と等しい数の長方形ビンに区分された分離スペースと重ね合わせる。つまり、正規化された２Ｄ分離スペースのピーク容量は、分離された成分の数に等しい。従って、寸法の異なるデータセットを比較することができ、（ｉｉｉ）データポイントを含む全ての正規化されたビンの面積が合計される。被覆面積の程度は、調べた２Ｄ分離システムの直交性を表現する。
【００４９】
本発明による分離を実施するのに適したカラムは、当技術分野において知られており、必要以上の実験無しで選択することができる。例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、Ｃ８、Ｃ１８、およびフェニル置換固体支持体を含んでいる。順相カラムは、シリカを固定相として使用することができる。ＨＩＬＩＣ分離は、一般的に、場合によっては例えばアミノプロピルまたはジオール改質剤によって改質されたシリカベースカラム材料を使用して実施される。事前包装されたまたは被覆されたカラムまたはキャピラリーは、市販されており、分離のために使用する特定の固定相および固体支持体は、分離する混合物の量および複雑さ、決定する検体の種類などの要因により選択することができる。
【００５０】
同様に、カラムの寸法は、分析または精製するサンプルの量などの要因により選択することができる。より大きなサンプルの量の分析に関しては、約３ｍｍ〜約２０ｍｍの直径を有するＨＰＬＣカラムを使用することもできる。非常に少量のサンプルに関しては、細口径カラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用することもできる。
【００５１】
本発明の方法において、サンプルは、第１次元におけるクロマトグラフィー（すなわち、第１クロマトグラフ様式）を受ける。サンプルは、第１クロマトグラフ分離を開始する前に、清浄化、ろ過、濃縮、または他の予備分析調製が求められることもある。次いでサンプルは、第１次元分離システムに、通常注入弁を通して導入される。次いでサンプルの成分は、第１ＨＰＬＣシステムの移動相によって、多次元液体クロマトグラフィーシステムの第１固定相に運ばれ、この中を通る。サンプルの少なくとも１つのサンプル成分が、第１次元カラムから出る移動相溶出液が、２つ以上の分離されたサンプル成分を含むように、他のサンプル成分からクロマトグラフィーで分離される。好ましい実施形態において、溶出液流のいずれかの部分に単数の成分または複数の成分が存在するかどうかを決定するのに検出器を使用することができる。例えば、ＵＶ／ＶＩＳ（紫外線／可視波長光線検出器）などの非破壊検出器を、溶出液流中に成分または検体が存在するかどうかを決定するのに使用することができる。別な方法として、少量の溶出液流部分を分割し、質量分析計または蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）などの壊式検出器で使用することもできる。かかる様々な破壊および非破壊検出器は市販されており、例えば予想されるサンプル中の検体、化合物、成分または不純物の性質および量、使用する移動相の種類などの要因に基づき、特定の用途ための適切な検出器を選択することができる。
【００５２】
第１次元溶出液流からの溶出液の画分または部分は、幾つかの方法により、第２次元における処理のために選択することができる。例えば、ある実施形態において、第１次元検出器から得た（例えば上記の様な）情報を、第１カラムからの溶出液流のどの画分または部分を第２クロマトグラフ分離に導くかを決定するために使用することができる。従って、例えば、第１次元検出器は、溶出液の特定の画分を収集するための画分収集器を始動させることができ、または第２次元クロマトグラフィーシステムへの後の注入のための特定の画分を明らかにするために、コンピュータ化したクロマトグラフィー分析システムに信号を送ることができる。別の実施形態において、画分は、第２クロマトグラフィーシステムへの注入のために、所定の間隔または所定の頻度で（例えば、画分を３０秒毎、１分毎、２分毎などにおいて収集するなど）、収集またはサンプリングすることができる。市販されている画分収集器を、必要に応じて自動または手動様式においてサンプルを収集するために使用することができる。
【００５３】
第１次元移動相溶出液の少なくとも一部をサンプリングし、（例えば、マルチポート注入弁と関連するサンプルループを使用して）多次元クロマトグラフィーシステムの第２ＨＰＬＣ次元に導く。第１クロマトグラフ分離からの溶出液の画分を第２分離様式に導くことを可能にするために、第１分離様式は第２分離様式とインターフェースをとらなければならない。このインターフェーシングは、幾つかの方法において達成することができる。例えば、第１次元溶出液の画分は、画分収集器中に収集することができ、画分の全部または一部を、第２クロマトグラフ分離様式に導くために選択することができる。所望する場合、例えば第２次元ＨＰＬＣシステムに導入する前に、容積を低減したりまたは非相容性の溶媒を除去したりするために、画分を濃縮または蒸発することができる。脱塩など他のサンプル調製ステップを、収集した画分について同様に行うことができる。別な方法として、第１溶出液流からの画分または部分を、例えばロータリーマルチポート注入弁を通す注入によって、直接第２次元分離システムへ注入することができる（例えば、米国特許第６，７３０，２２８号を参照されたい）。ある好ましい実施形態において、第１溶出液の画分は、第２クロマトグラフ分離様式を実施する前に、オンラインで希釈することができる。好ましい実施形態において、第１次元溶出液流のサンプリングした部分（複数可）は、次いで多次元液体クロマトグラフィーシステムの第２ＨＰＬＣ次元に、（例えば第２次元注入器としてマルチポート注入弁を使用して）直接注入される。
【００５４】
第１次元溶出液流の選択された部分または画分中の少なくとも１つのサンプル成分または検体は、次いで第２次元分離において、第２次元カラムから出る移動相溶出液が２つ以上の分離したサンプル成分を含むように、他のサンプル成分からクロマトグラフィーで分離される。好ましい実施形態において、第１次元溶出液流に関して上述したように、第２溶出液流のいずれかの部分に成分が存在するか否かを決定するために、検出器を使用することができる。サンプル中に存在する分離された成分または検体を検出しそして同定するためには、質量分析的検出が好ましい。
【００５５】
第１および第２クロマトグラフ分離のための移動相は、特定の検体（複数可）の分離を最適化するために、またはサンプルの未知の成分の分離を最適化するために選択することができる。本明細書の別のところで説明しているように、本発明は、移動相のｐＨの変化が、少なくとも部分的な直交分離を、第１および第２次元が同じ種類の分離（例えば、両方の次元にＲＰ−ＨＰＬＣを使用する、それぞれに同じ種類のカラムを使用するなど）を使用する場合であっても、提供するのに使用できることを見出した。ある実施形態において、第１および第２次元のために使用するクロマトグラフカラムは同じ種類であることができ（例えば、両方とも逆相）、分離の移動相は、本明細書で説明するように基本的相違がｐＨの相違である状態において、実質的に類似していることができる。移動相ｐＨは、移動相にｐＨ改質剤を加えることで変えることができる。例えばトリフルオロ酢酸またはギ酸などの酸は、より低い（より酸性の）ｐＨを提供するために加えることができ、一方水酸化アンモニウム（すなわち、アンモニア水）またはトリメチルアミンまたはトリエチルアミンなどの他の塩基は、より高い（より塩基性の）移動相ｐＨを提供するために加えることができる。
【００５６】
別の態様において、本発明は化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィーシステムを提供する。このシステムは、ａ）第１クロマトグラフカラムおよび第１移動相を、第１クロマトグラフカラムを通してポンプ輸送するためのポンプを備えている第１クロマトグラフ分析システム；ｂ）第２クロマトグラフカラムおよび第２移動相を、第２クロマトグラフカラムを通してポンプ輸送するためのポンプを備えている第２クロマトグラフ分析システム；ｃ）第１クロマトグラフカラムの溶出液流から、少なくとも１つの化合物含有画分を選択し、少なくとも１つの化合物含有画分を第２クロマトグラフカラムに導く手段とを含み、ここで第１移動相のｐＨと第２移動相のｐＨが異なっている。
【００５７】
第１および第２クロマトグラフ分析システムのそれぞれは、サンプルまたは画分をシステムに導入するための注入器を含んでいることが好ましい。在来型のマルチポートロータリー注入弁を使用することができる。液体クロマトグラフシステムのためのポンプは市販されており、ポンプは、クロマトグラフシステムを通してポンプ輸送しなければならない溶媒の量などの基準、およびシステムに存在する逆圧に従って選択することができる。ある実施形態において、勾配溶出を使用する場合、第１および第２クロマトグラフシステムの１つまたは両方に多重ポンプを使用することが好ましいこともある。
【００５８】
本発明のシステムは、第１および第２溶出液流のいずれかからかまたは両方からの溶出液画分を収集するために、画分収集器を含むことができる。従って、第１クロマトグラフカラムの溶出液流から少なくとも１つの化合物含有画分を選択するための手段は、画分収集器などを含み、一方少なくとも１つの化合物含有画分を第２クロマトグラフカラムに導入する手段は、上述のように、手動注入器またはオンライン注入システム（例えば、マルチポート注入弁を第２次元注入器として使用）を含むことができる。代替として、あるいは追加的に、このシステムは、第１溶出液流の部分あるいは画分のオンライン希釈のためのモジュールを含むことができる。
【００５９】
本発明の多次元ＨＰＬＣシステムは、好ましくは、両方のクロマトグラフ次元のハードウェア（サンプリングシステム、注入弁、移動相ポンプ、検出システム）を操作するのに有効な、そしてハードウェアからデータを追跡および取得するソフトウェアで構成された、コンピュータ化された制御およびデータ分析システムを通して操作することが好ましい。適切なソフトウェアは、例えば、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）などの液体クロマトグラフィーシステムの製造者、および／または、Ｌａｂ Ｖｉｅｗ ｂｒａｎｄ ｓｏｆｔｗａｒｅなどのソフトウェア生産者から市販されている。ソフトウェアは、ロボットによる流体取扱器の操作のための制御素子および他のデバイスを付加的に含むことができ、これらは多次元ＨＰＬＣシステムに統合することもできる。
【００６０】
上記の説明は、第１および第２クロマトグラフ分離システムを有するシステムおよび方法について言及しているが、例えば第１および第２分離によっては分解しない検体の分離を更に改善するために、付加的なクロマトグラフ次元、例えば第３クロマトグラフ分離システムを追加することができることは、当業者にとって明らかである。例えば、第３クロマトグラフ次元を追加することができる。好ましい実施形態において、追加の次元は、他の次元の１つまたは複数に対して、相互に直交的である。好ましい実施形態において、追加の次元は、他の使用された次元の１つまたは全部に対して相互に直交的である。かかる多次元アプローチは、例えば、ホスホペプチド、グリコペプチド、高度に酸性なペプチドなどの分離および分析において、特に有効なこともある。
【００６１】
(実施例)
材料および試薬
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）から購入した。ギ酸（ＦＡ）、濃縮水酸化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸、およびＨＰＬＣ級アセトニトリルは、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ニュージャージ州、米国）から購入した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、ＨＰＬＣ移動相のための脱イオン水（１８ＭΩｃｍ）調製に使用した。ＭａｓｓＰＲＥＰペプチド標準液およびＭａｓｓＰＲＥＰタンパク質消化物標準液は、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）から入手した。
【００６２】
２Ｄ−ＨＰＬＣ実験のセットアップ
ＲＰ、ＨＩＬＩＣ、およびＳＥＣなどのＬＣ−ＭＳ相容性ＨＰＬＣ様式のために、ＭａｓｓＰＲＥＰ標準液を直接ＬＣ−ＭＳシステムに注入した。ペプチド（これらの相当する分子量によって同定したもの）の保持時間を、異なる分離次元の選択性と直交性を比較するために、グラフ中にプロットした。
【００６３】
ＳＣＸおよびＨＩＣ分離様式は、移動相中に高濃度の塩を使用する。従って、溶出ペプチドに直接保持時間を割り当てるのは（ペプチドが同定されていないため）不可能であった。代わりに、画分を短い間隔（０．５〜２分）で収集し、後にキャピラリーＬＣ−ＭＳまたはＭＡＬＤＩ ＭＳを使用して分析した。
【００６４】
ＨＰＬＣの器具類
逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、および親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）の実験は、２９９６光ダイオード配列検出器および単一四重極Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ ４０００ＭＳ器具（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を備えたＭｏｄｅｌ ２７９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。ＭＳ条件は、キャピラリー電圧３．２ｋＶ、コーン電圧３０Ｖ、エキストラクタ１Ｖ、およびＲＦレンズ０．３Ｖであった。ソース温度は１００℃に、脱溶媒は３５０℃に設定した。脱溶媒ガス流は、３５０ｌ／時間、コーンガスは５０ｌ／時間に設定した。ＭＳスキャン間隔は３００〜２５００ｍ／ｚ、スキャン時間は、０．１秒インタースキャンの状態で２．２秒であった。スペクトルは、正のＥＳＩ様式で収集した．
強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーおよび親水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィーは、２９９６光ダイオード配列検出器を備えたＭｏｄｅｌ ２７９６ Ａｌｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＭＤ ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。画分は、手動で収集した。
【００６５】
ＳＣＸおよびＨＩＣ画分の分析：ＬＣ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ ＭＳ器具類
ＬＣ−ＭＳまたはＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の前に、収集した画分は、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏＥｌｕｔｉｏｎプレートを使用して脱塩した。ＳＣＸまたはＨＩＣ画分は０．２％水性ＴＦＡを使用して１：１で希釈し、（最初に２００μｌのＡＣＮその後２００μｌの０．１％ＴＦＡを使用して調整した）抽出プレート上に装荷した。装荷後、プレートを２００μｌの０．１％ＴＦＡで洗浄し、保持しているペプチドを、６０μｌの水中６０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を使用して溶出した。約１μｌの溶出液を、ＭＡＬＤＩマトリックスα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）と混合し、分析のために直接ステンレス鋼ＭＡＬＤＩターゲットに滴下した。マトリックスは、８０％ＡＣＮ中で濃度１０ｍｇ／ｍｌにおいて調製し、１００〜５００ｆｍｏｌｅの、内部標準としての目的を果たす選択したペプチド（ＡＣＴＨ）をスパイクした。質量スペクトルは、Ｎ２パルスレーザー（３３７ｎｍ）および２．３メートルの飛行経路を備え、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．０（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）によって制御される、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｍ＠ＬＤＩ ＲＴＯＦ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）により取得した。この機器は、ディレイドエクストラクションを使用して、リフレクトロン様式で操作した。
【００６６】
脱塩し、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢプレートから回収した画分は、ＬＣ−ＭＳ分析の前にＡＣＮ含有量を低下させるため、部分的に蒸発させた。各画分の最終容積は約１０μｌであった。１μｌを、分析のためキャピラリーＲＰ−ＨＰＬカラム上に注入した。光ダイオード配列検出器を備えた、キャピラリーＨＰＬＣシステム（ＣａｐＬＣ（登録商標）、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、ＭＳ様式で操作しているＥＳＩ−Ｑ−Ｔｏｆマイクロ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆ（登録商標）ｍｉｃｒｏ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）に接続した。キャピラリー電圧を３２００Ｖ、コーン電圧を３０Ｖ、エクストラクションコーン電圧を０．５Ｖ、イオンエネルギーを４Ｖ、衝突エネルギーを１０Ｖに設定した。
【００６７】
ＨＰＬＣ実験およびカラムの説明
ＲＰ−ＨＰＬＣ、ｐＨ２．６：２．１×１５０ｍｍ、３μｍのＡｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、流速２００μｌ／分で使用した。カラム温度は４０℃に設定した。移動相Ａは、水中の０．２％ギ酸（ＦＡ）であり、移動相Ｂは ＡＣＮ中の０．１３％ＦＡであった。勾配は、７０分において、０〜５６％Ｂ（０．８％ＡＣＮ／分）であった。
【００６８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ、ｐＨ８．５および１０：２．１×１５０ｍｍ、３．５μｍの×Ｔｅｒｒａ Ｐｈｅｎｙｌ（ｐＨ８．５に関して）および２．１×１５０ｍｍのＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（ｐＨ１０に関して）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、流速２００μｌ／分で使用した。カラム温度は４０℃に設定した。移動相ＡはｐＨ８．５の２０ｍＭの水性ギ酸アンモニウムバッファーまたはｐＨ１０の同じバッファーであり、移動相ＢはＡＣＮであった。勾配は、７０分において、０〜５６％Ｂ（０．８％ＡＣＮ／分）であった。
【００６９】
ＲＰ−ＨＰＬＣ、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）、５μｍ（Ｗａｔｅｒｓ、 Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）：移動相Ａは水であり、Ｂはアセトニトリル、およびＣは４００ｍＭＮＨ４ＦＡ水性バッファーであり、ｐＨ３．２５であった。流速は０．２ｍＬ／分であって、分離温度は４０℃であった。勾配は、０．８％アセトニトリル／分であり、ポンプＣを、２０％の溶媒を定組成的に送出し、それによって移動相が８０ｍＭのＮＨ４ＦＡバッファーの一定濃度を含むように使用した。バッファーは、２４．７ｇの濃縮水酸化アンモニウム（２８％水溶液）を、９００ｍＬの水および５０ｍＬのＦＡ（９９％）に加えることによって調製した。ｐＨは、水酸化アンモニウムまたはＦＡのいずれかでｐＨ３．２５に調節し、容積を１Ｌにした。
【００７０】
ＨＩＬＩＣ：２．１×１５０ｍｍ、３μｍのＡｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、流速２００μｌ／分において使用した。カラム温度は４０℃に設定した。移動相Ａは水であり、移動相ＢはＡＣＮであり、移動相Ｃは２００ｍＭのギ酸アンモニウムであり、ｐＨは４．５であった。勾配は、６２．５分において、９０〜４０％Ｂ（０．８％ＡＣＮ／分）であり、バッファーＣは５％に一定に維持した（移動相中、１０ｍＭのギ酸アンモニウムの一定濃度とする）。
【００７１】
ＳＥＣ：３個の４．６×２５０ｍｍ、５μｍのＹＭＣジオール、６０Å ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を直列に接続した。移動相は、ポンプを使用して混合した。移動相Ａは水であり、Ｂはアセトニトリル、およびＣは２００ｍＭのギ酸アンモニウム（ＮＨ４ＦＡ）水性バッファーであり、ｐＨは４．５であった。流速は０．２ ｍＬ／分であり、分離温度は４０℃であった。定組成移動相は、２０％のアセトニトリルおよび４０ｍＭのＮＨ４ＦＡバッファーを含んでおり、ｐＨは４．５であった。バッファーは、１２．６ｇのギ酸アンモニウムを、９００ｍＬの水に溶解し、ＦＡ（９９％）を使用してｐＨを４．５に調節することにより調製し、次いで容積を１Ｌにした。
【００７２】
ＳＣＸ−ＨＰＬＣ：ｐｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ（商標）ＳＣＸ、５μｍカラム（Ｐｏ１ｙＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、メリーランド州、米国）を、イオン交換ＨＰＬＣ分離に使用した。カラムは、２５℃で操作した。ある実験に関して、移動相はＡが２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で、５％のアセトニトリルを使用してｐＨ２．６であり、Ｂが２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で、１ＭのＮａＣｌを加えた５％アセトニトリルを使用してｐＨが３であった。勾配は、１００分において、０〜１５％Ｂであった。別の実験において、条件は次の通りであった。ＳＣＸ実験は、流速０．２ｍＬ／分において３０℃で実施した。移動相Ａは水で、Ｂはアセトニトリル、およびＣは４００ｍＭのＮＨ４ＦＡ水性バッファーであり、ｐＨは３．２５であった。勾配は、４０分において、１０〜７５０％Ｃであり、ポンプＢは、塩勾配の全持続時間にわたり、定組成的に２５％のアセトニトリルを送出するために使用された。ＮＨ４ＦＡバッファーは、直接ＭＳ検出と相容性があった。
【００７３】
キャピラリーＬＣ−ＭＳ：０．３×１５０ｍｍ、３．５μｍの架橋したハイブリッドＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）を、流速５μｌ／分で使用した。カラム温度は４０℃に設定した。移動相Ａは、水中の０．１％ＦＡであり、移動相Ｂは、８０％ＡＣＮ／２０％水における０．１％ＦＡであった。勾配は、６４分において０〜８０％Ｂ（１％ ＡＣＮ／分）であった。
【実施例１】
【００７４】
本研究において、本発明者らは様々なＬＣ様式の直交性および代替直交ＬＣ分離アプローチの開発を評価するために、５つのタンパク質（２５０のペプチド）のトリプシン消化物を使用した。試験したクロマトグラフ様式（これは個別に試験した）は、強陽イオン交換（ＳＣＸ）， サイズ排除（ＳＥＣ），逆相（ＲＰ），および親水（ＨＩＬＩＣ）クロマトグラフィーを含んでいた。各分離に関するペプチドの保持を記録し、２Ｄグラフにプロットし数学的に相関付け、分離の直交性を、調査した２Ｄプロット中の溶出ピークによってカバーされる面積の部分として評価した。
【００７５】
これら研究の結果を図１〜３に示す。図１において、一次元におけるクロマトグラフの（前述の）ＳＣＸ分離を、Ａｔｌａｎｔｉｓ（商標）Ｃ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣと比較した。図１のキーは、ペプチドの充填状態を示す。図２において、一次元のＲＰ−ＨＰＬＣ（前述のＡｔｌａｎｔｉｓカラムでｐＨ２．６）を、ｐＨ１０におけるＸｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣと比較した。図３において一次元のＨＩＬＩＣを、ｐＨ２．６におけるＡｔｌａｎｔｉｓ（商標）Ｃ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣと比較した。
【００７６】
本発明者らは、これら条件の内で、最も高い直交性がＨＩＬＩＣとＲＰ（Ｒ２＝０．００３８）の組合せまたはＲＰ−ＲＰ（Ｒ２＝０．４５）に関して得られることを見出した。後者の場合、差別的選択性（これが直交性をもたらす）は、固定相を変化させるよりはむしろ異なる移動相を使用することによって達成することができる。しかしながら、本発明者らは、ｐＨ２．６におけるＡｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣが、ｐＨ８．５（Ｒ２＝０．７８，データは示されていない）におけるＸｔｅｒｒａ Ｐｈｅｎｙｌカラム上のＲＰ−ＨＰＬＣに対して、幾分補うこともまた見出した。この場合、わずかな直交性は、異なる固定相並びにｐＨの差異が原因であることもある。他の評価したＲＰ固定相も類似の傾向を示す。最も明瞭な選択性は、ＰＦＰ吸着剤（データは示されていない）において観察された。しかしながら、直交性は未だ制限されており、２Ｄ空間の多くは分離には使用されていない。
【００７７】
ＨＩＬＩＣおよびＲＰ様式の両方とも、極めて効率的な分離様式であり、広範囲な疎水性のペプチドの分析に適している。加えて、使用したどんな添加物を含む移動相も、揮発性であるように選択することができ、従って分離次元は互換性があり、質量分析と相容性がある。
【００７８】
ＲＰと組み合わせたＳＥＣも良好な直交性を備えているが（結果は示されていない）、低いＳＥＣピーク容量のため、（少なくともペプチドに関して）この分離次元は魅力のないものとなっている。ＳＥＣの限られた有効性のため、本発明者らは３つのカラムを直列に接続してピーク容量を高め保持データを記録した。比較的疎水性のペプチドの吸着剤との残留相互作用は、ｐＨ４．５において２０％のアセトニトリルおよび４０ｍＭのＮＨ４ＦＡバッファーを移動相に加えることによって最小化された。しかしながら、一部の２次相互作用が未だ広がっており、より大きなペプチドを回収することを制限しており、分離の総体的選択性に影響を及ぼしている。ペプチドの寸法とペプチドのＳＥＣ保持の間に、緩い相関関係だけが観察された。より長いペプチド（より疎水性で、それ故ＲＰ様式でより保持される）は、予想通りＳＥＣ中で早めに溶出される。しかしながら、ＲＰ×ＳＥＣの組合せに関する直交性の程度は、予想された程度よりも大きかった（データは示されていない）。この挙動は、前述のペプチドの吸着剤との第２の相互作用によって生じたと考えられる。
【００７９】
ＨＩＬＩＣ様式も、ペプチド分離に関して同様に評価した。ＨＩＬＩＣ様式におけるペプチドの分離に関する報告はわずかしか発行されておらず、主にポリアスパラギン酸塩またはアミド吸着剤を使用している。本発明者らは、裸のシリカ吸着剤を充填したＨＩＬＩＣカラムを使用した。ペプチドピーク形状も回収も共に良好であった。注入前にペプチドサンプルを７０％アセトニトリルに溶解した際に、沈澱は観察されなかった。ペプチド充填とＨＩＬＩＣ保持にいくらかの相関関係があることは、保持メカニズムが区分化およびイオン相互作用（例えば荷電したシラノールによる）の両方を含んでいることを示唆している。従って、分離選択性は部分的にＳＣＸ様式におけるペプチド保持に似ている。高い度合いのＨＩＬＩＣ−ＲＰシステムの直交性が、２Ｄ−ＬＣのためのアプローチを有望なものとしている。
【００８０】
ＳＣＸ−ＲＰの組合せ（図１）は、上記のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ−ＨＩＬＩＣ実施例と比較して、より低い直交性を示す。ＳＣＸ様式における分離は、一次的にペプチド電荷に基づくので、二重および三重に荷電したペプチドは、クラスターにおいて溶出する傾向があり、ピークの発生が少ない一部の他の分離部分を出る。典型的なサンプル中に存在するトリプシンペプチドは殆ど、２＋に荷電しており（６０〜８０％）、従って、成分の大部分は狭い保持時間の範囲内にあり、それ故十分に分解していない。加えて、ある条件下で、本発明者らは、２５％アセトニトリルを移動相に加えたにもかかわらず、ＳＣＸ次元中の疎水性ペプチドの損失を観察した（類似の損失がＳＥＣに関しても同様に見られた）。これらの事例において、約３０〜４０％のペプチドがＳＣＸから溶出していることが検出されなかった。しかしながら、ＬＣ−ＭＳ相容性揮発性移動相を使用してＳＣＸを使用した場合、関係する全てのペプチド（疎水性ペプチドを含む）が、検出された（移動相中に２５％または５％両方のアセトニトリルを含む状態において、データは示されていない）。いかなる理論にも拘泥することを望むものではないが、ペプチドが移動相中のアセトニトリルの含有にもかかわらず、ＳＣＸカラムから不完全に溶出（ＮａＣｌ溶出剤）されること、または高濃度の不揮発性塩の存在において収集後の沈澱が生じていることのいずれかが考えられる。本発明者らは、ＬＣ−ＭＳ相容性バッファーは、ペプチドのＳＣＸ区分に利益があるものと確信している。
【００８１】
これらの結果は、多次元分離に使用することのできる補足的分離を得るために使用することのできるある分離の組合せを示している。２つの分離の間のｐＨの相違は、たとえ同じ分離様式（例えばＲＰ−ＨＰＬＣ）が、第１および第２分離次元の両方に使用されても、実質的な直交性を提供するために使用することができる。
【実施例２】
【００８２】
ＳＣＸ吸着剤をより詳細に調査した。ＳＣＸ様式における溶出は、通常ＮａＣｌの勾配を使用して達成され、これがこの様式をＭＳ検出とは相容れないものとしている。オフラインおよびオンライン両方の２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ設定は、しばしばＲＰ捕獲カラムを経由して実現されるサンプルの脱塩に通常依存する。以前に発行された報告書は、利用可能なＳＣＸ吸着剤は２次（疎水性）相互作用を示し、これが疎水性ペプチドの回収を低下させることを示している。移動相への有機溶媒の添加がピーク形状とペプチドの回収を改良することが示唆された。しかしながら、移動相中に２５％のアセトニトリルを使用しても、予想したよりもペプチドの数が少ないことを本発明者らは観測した。従って、本発明者らは代替移動相と直接ＭＳ検出を調査した。
【００８３】
移動相は、揮発性バッファー、すなわち４００ｍＭの水酸化アンモニウムを、ＦＡを使用してｐＨ３．２５に滴定したもの、から調製した。ＦＡの最終濃度は約１．３Ｍ（５％ＦＡ）であった。ＦＡのｐＫａは３．７５であるので、バッファーのｐＨ（０．５ｐＨ単位低い）は、ＦＡの２５％だけが脱プロトンし、［Ｈ＋］の濃度を３２５ｍＭにもってくることを保証する。アンモニウム陽イオンと一緒になって、このバッファーの全陽イオン強度は、７２５ｍＭになる。バッファーの１０％〜７５％勾配（７２．５〜５４３．７５ｍＭ）が、５＋荷電までの全ての所望のペプチドを成功裏に溶出した。ＭＳ信号は、劇的に抑制されず、オンラインＬＣ−ＭＳ検出が可能であった。
【００８４】
予想されたように、ＳＣＸ選択性は、ペプチド電荷によって駆動されると考えられる。プロットから現れる傾向は、ペプチドの保持は、それの長さにも依存することを示唆している。大きなペプチド（これはより疎水性でよりよくＲＰ中に保持される）は、同じ電荷の短いペプチドに比較して、ＳＣＸクロマトグラフィー中に比較的保持されにくい。この挙動は、電荷密度（これはペプチドが短くなるほど大きくなる）が、保持メカニズムにおいて第２の役割を果たすことを暗示している。特定の理論にも拘泥することを望むものではないが、電荷密度は、ペプチドの吸着剤との残留疎水性相互作用よりもむしろ、同じ電荷を有するペプチドを分解するためのＳＣＸ吸着剤の能力に関与していると考えられる。
【００８５】
ＳＣＸ−ＲＰ組合せの直交性は、良好であると考えられる。しかしながら、プロットしたデータにおいて、最も多量のペプチドのグループ（６６％のペプチドが２＋に荷電しており、２８％のペプチドが３＋に荷電している）が、堅固なクラスターを形成する。２Ｄ分離空間は、データポイントによって均一にカバーされていないので、直交性は予想された値より低い。
【実施例３】
【００８６】
ペプチドの２Ｄ−ＨＰＬＣ分離へのアプローチとして、ＲＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣを特性決定するために追加の実験を実施した。オフライン２Ｄ−ＨＰＬＣ実験を、達成可能な直交性の程度を確認するために設定した。５つの等モル比（それぞれ１０ｐｍｏｌｅ）の消化したタンパク質混合物を含むサンプルを、ｐＨ１０において、最近ＲＰ−ＨＰＬＣ用途のために開発された（Ｋ．Ｄ．Ｗｙｎｄｈａｍ他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ（２００３年），７５巻，ｐ．６７８１〜６７８８）、新規の３．５μｍＣ１８架橋−エチルハイブリッド（ＢＥＨ）シリカ吸着剤を充填した１５０×１ｍｍカラムを使用して、第１ＲＰ−ＨＬＰＣ次元中に注入した。ＢＥＨ吸着剤は、広範囲のｐＨにおいて非常に安定であり、ｐＨ２．６および１０両方における分離のための理想的な材料を提供する。
【００８７】
これら条件下で、平均ピーク幅は、基準線において典型的に０．５分である。２．５分の画分（５ピーク幅）を収集し、アセトニトリルおよび水酸化アンモニウムの含有量を減少させるために、部分的に蒸留した。画分の最終容量は１０μｌであり、１μｌを１５０×０．３ｍｍ、３．５μｍＢＥＨ Ｃ１８キャピラリーカラムを使用して第２ＬＣ−ＭＳ次元に注入した。
【００８８】
第１ＬＣ次元において早めに溶出するペプチドは、第２次元においても早めに溶出する傾向がある。同様に、遅く溶出した画分おいて収集されたペプチドは、第２分離次元においても遅れて溶出する。分離の直交性は、特に同じ種類のＣ１８吸着剤を第１および第２次元に使用したことを考慮した場合、良好であると考えられ、従って直交性は、ｐＨの効果を経由してのみ作られる。使用したキャピラリーＬＣシステムの勾配の遅れは約１３分であった。この特定の時間は、含まれるピークによるものではない。少しのトリプシンペプチド溶出が４３分を超えても、有用な分離ウィンドウは、３０分の幅しかない。ペプチドを溶出する収集した画分の殆どは、有用なＬＣ−ＭＳ時間の５０％〜７０％をカバーする。早期、中期、および後期に収集する画分の勾配の開始強度および間隔の調節によって、潜在的にペプチドを分離空間上により均一に広げることができる。
【００８９】
ＲＰ−ＲＰアプローチの直交性を、ＳＣＸ−ＲＰ−ＨＰＬＣシステムと比較した。（１ｍｍ内径カラムを用いたＲＰ−ＲＰ実験に比例した荷重を維持するために）４．４×超ペプチド質量を装荷した１５０×２．１ｍｍＳＣＸカラムを使用した。収集した画分をＳＰＥによって脱塩し、最終容積を蒸発によって４４μｌに減少させた。約１μｌを、ＬＣ−ＭＳによって分析した。装荷質量および分離条件は、以前のＰＲ−ＰＲ実験と同一であった。これらの条件下、分離直交性は、両方の２ＤＨＰＬＣシステムと同程度であることが判明した。
【実施例４】
【００９０】
分離選択性に対するｐＨの影響を、最初Ｅｎｏｌａｓｅ消化物（約３５ペプチド）を使用して評価した。ｐＨ７．９（１０ｍＭの重炭酸アンモニウム）の移動相で得られた保持時間を、ＦＡでｐＨ２．６にした移動相の以前に記録したデータに対してプロットした。分離の直交性は、本明細書で説明した他の幾つかの実験における直交性よりも顕著に大きかった。直交性における変化が、本当にｐＨの差異によるものかを明らかにするために、本発明者らは他の実験を実施した。ＨＰＬＣカラムに極性埋込みＲＰ−１８およびＰｈｅｎｙｌ吸着剤を充填し、分離を、類似のｐＨ（それぞれ７．９および８．５）を使用して実施した。上述のｐＨ２．６およびｐＨ７．９の間で観察された直交性に対比して、著しい直交性は観察されなかった。
【００９１】
ｐＨの影響を、両方の分離次元におけるより広いｐＨギャップを使用して更に調査した。ｐＨ８．５および１０において収集した実験データは、ｐＨ２．６の保持時間データに対してプロットした場合に著しい直交性の度合いを示した。ＲＰ分離次元の間のｐＨ差異が広くなるほど、より大きな直交性が達成された。従って、更なる議論は、ｐＨ２．６対ｐＨ１０の実験に焦点が当てられる。ｐＨ１０の分離は、高いｐＨにおいて安定なことが知られているＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８固定相について実施した。分離のために使用した２０ｍＭのギ酸アンモニウムバッファーがＭＳ信号をある程度抑制した。しかしながら、全てのペプチド質量は、明瞭に検出された。ｐＨ１０における保持データを、移動相中に０．２％のＦＡを使用している（ｐＨ２．６）ＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｃ１８ ＰＡ−Ａカラムからのデータに対してプロットした。２−Ｄ分離空間上にペプチドの比較的に高い広がりが観察された。データは、ペプチドｐＩ値に従って、３つのグループに細分化した。グラフから表れる空間的分離は、主要な分離要因が実際にはペプチドのｐＩ（電荷）であることを示唆している。（少なくとも部分的に放電された場合に）ｐＨ１０の条件下でより強力に保持される塩基性ペプチド（ｐＩ＞７．５）に比較して、カルボキシル部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）がイオン化されない場合の酸性ペプチド（ｐＩ＜５．５）の種類は、ｐＨ２．６においてより強力に保持される。
【００９２】
５．５〜７．５ｐＩ範囲内のペプチドのグループに関しても、ある程度の直交性が観察された。この観察は、更なる注釈に値する。ペプチドｐＩ値は、分子の正味荷電がゼロに等しい場合のｐＨを表す。ｐＩは、塩基性アルギニン（ｐＫａ１２．５）、リシン（ｐＫａ１０．２）、ヒスチジン（ｐＫａ６．４５）、端末アミノ基ＮＨ２（ｐＫａ７．６）などの多くのイオン化アミノ酸、アスパラギン酸（ｐＫａ３．９５）、グルタミン酸（ｐＫａ４．４５）、チロシン（ｐＫａ９．８）、および端末ＣＯＯＨ基（ｐＫａ３．６）などの酸性アミノ酸の寄与の合計である。ｐＩ範囲が５．５〜７．５の「中性」ペプチドでも、少なくとも一部のイオン化基が、分離条件（ｐＨ２．６または１０）において異なる電荷／放電を行うので、ｐＨによって影響を受けるはずである。
【００９３】
本明細書で引用した全ての特許および参考資料の内容は、参照により本明細書に援用する。
【００９４】
本開示に照らして、当業者によって認識されるように他の実施形態が、本発明および添付の特許請求範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】第１次元においてＳＣＸを、第２次元においてＲＰ−ＨＰＬＣを使用する多次元ＬＣ分離システムから得られた分離を示すプロット図である。
【図２】第１次元においてＲＰ−ＨＰＬＣを、第２次元においてＲＰ−ＨＰＬＣを使用する多次元ＬＣ分離システムから得られた分離を示すプロット図である。
【図３】第１次元においてＨＩＬＩＣを、第２次元においてＲＰ−ＨＰＬＣを使用する多次元ＬＣ分離システムから得られた分離を示すプロット図である。
【図４】選択した２Ｄ−ＬＣシステムに関する幾つかの正規化された保持時間のプロット図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）サンプルを、第１ｐＨにおいて、第１移動相を使用して第１液体クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｂ）前記第１クロマトグラフ分離から少なくとも１つの画分を収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの画分を第２ｐＨにおいて、第２移動相を使用して第２液体クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｄ）前記サンプル中の少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップとを含み、ここで前記第１ｐＨと前記第２ｐＨが異なる、少なくとも１種の検体を含むサンプルを分析する方法。
【請求項２】
第１および第２クロマトグラフ分離が、互いに対して実質的に直交している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１および／または第２クロマトグラフ分離様式が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１および／または第２クロマトグラフ分離様式が、親水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＨＰＬＣ分離が逆相ＨＰＬＣ分離である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１クロマトグラフ分離様式が、少なくとも１００ピークのピーク容量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第１ｐＨと第２ｐＨが、少なくとも約３ｐＨ単位異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種の検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種の検体が、小さな有機分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが、少なくとも１０００種の検体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
方法の全ピーク容量が、少なくとも１，０００ピークである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＰＬＣ分離が、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）において収集された少なくとも１つの画分が、前記少なくとも１つの画分を第２クロマトグラフ分離様式にかける前に、濃縮または希釈される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの画分が、蒸発によって濃縮される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）において収集された少なくとも１つの画分が、第２クロマトグラフ分離様式を実施する前にオンラインで希釈される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
検出のステップが、質量分析法を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２クロマトグラフ様式が同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
第１および／または第２移動相が、実質的に不揮発性塩を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
第１および／または第２移動相が、約２０ｍＭ未満の不揮発性塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
複数の部分が収集され、第２クロマトグラフ分離にかけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）サンプルの少なくとも一部分を、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｂ）少なくとも１つの画分を、前記第１クロマトグラフ分離から収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップとを、前記サンプル中の少なくとも２個の検体が分離される条件下で含む、サンプル中の複数の検体を分離する方法。
【請求項２２】
第１および第２クロマトグラフ分離が、互いに対して実質的に直交している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第１および／または第２クロマトグラフ分離様式が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
第１および／または第２クロマトグラフ分離様式が、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＰＬＣ分離が逆相ＨＰＬＣ分離である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
第１クロマトグラフ分離様式が、少なくとも１００ピークのピーク容量を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
第１ｐＨと前記第２ｐＨが、少なくとも約３ｐＨ単位異なる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１種の検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１種の検体が、小さな有機分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
サンプルが、少なくとも１０００種の検体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
方法の全ピーク容量が、少なくとも１０，０００ピークである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
ＨＰＬＣ分離が、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップｂ）において収集された前記少なくとも１つの画分が、前記少なくとも１つの画分を第２クロマトグラフ分離様式にかける前に、濃縮または希釈される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
検出のステップが、質量分析法を使用して実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
第１および第２クロマトグラフ様式が同じである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
第１および／または第２移動相が、実質的に不揮発性塩を含まない、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
第１および／または第２移動相が、約２０ｍＭ未満の不揮発性塩を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
複数の部分が収集され、第２クロマトグラフ分離にかけられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）サンプルを、２次元液体クロマトグラフィーシステムの第１次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；
ｂ）前記サンプルの少なくとも第１ポリペプチド成分を、第１移動相を使用する前記第１次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中の前記サンプルの少なくとも第２ポリペプチドから、クロマトグラフィーで分離するステップと；
ｃ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の前記分離した第１および第２ポリペプチド成分を溶出するステップと；
ｄ）前記溶出液の少なくとも１つの個別の容積（ｖｏｌｕｍｅ）をサンプリングするステップと；
ｅ）前記少なくとも１つの個別の容積を、前記２次元液体クロマトグラフィーシステムの第２次元クロマトグラフィー装置（ｓｅｃｏｎｄ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｐｐａｒａｔｕｓ）に注入するステップと；
ｆ）注入した個別の容積を、第２移動相を使用する前記第２次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中でクロマトグラフ分離にかけ、ここで前記第１および第２移動相の前記ｐＨが約３ｐＨ単位異なっているステップと；
ｇ）前記第２次元クロマトグラフィー装置の前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液を、質量分析法を使用して特性決定し、これによって複数のポリペプチドを含む前記サンプルを特性決定するステップと
を含む、２次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定する方法。
【請求項４０】
ａ）サンプルを、化合物が第１不純物から分離される条件下で、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｂ）少なくとも１つの化合物含有画分を、前記第１クロマトグラフ分離から収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの化合物含有画分を、前記化合物が第２不純物から分離される条件下で、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｄ）精製した化合物を収集するステップと
を含む、化合物および少なくとも２つの不純物を含むサンプル中の前記化合物を精製する方法。
【請求項４１】
ａ）第１クロマトグラフカラムおよび前記第１クロマトグラフカラムを通して第１移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第１クロマトグラフ分析システムと；
ｂ）第２クロマトグラフカラムおよび前記第２クロマトグラフカラムを通して第２移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第２クロマトグラフ分析システムと；
ｃ）少なくとも１つの化合物含有画分を、前記第１クロマトグラフカラムの溶出液流から選択する手段および前記少なくとも１つの化合物含有画分を前記第２クロマトグラフカラムに導く手段と
を含み、ここで、前記第１移動相のｐＨが、前記第２移動相のｐＨと異なる、化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項４２】
ａ）サンプルを、第１ｐＨにおいて第１移動相を用いて、第１クロマトグラフ分離にかけるステップと；
ｂ）前記第１クロマトグラフ分離から少なくとも１つの画分を収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２移動相を用いて、第２クロマトグラフ分離にかけるステップと；
ｄ）前記サンプル中の前記少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップと
を含み、ここで前記第１ｐＨと前記第２ｐＨが異なる、少なくとも１種の検体を含むサンプルの分析方法。
【請求項４４】
ａ）サンプルを、第１ｐＨにおいて第１移動相を用いて、第１クロマトグラフ分離にかけるステップと；
ｂ）前記第１クロマトグラフ分離から少なくとも１つの画分を収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの部分を、第２ｐＨにおいて第２移動相を用いて、第２クロマトグラフ分離にかけるステップと；
ｄ）前記サンプル中の少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップと
を含み、ここで前記第１および第２移動相が、実質的に不揮発性塩を含まない、少なくとも１種の検体を含むサンプルの分析方法。
【請求項４５】
ａ）サンプルの少なくとも一部を、第１ｐＨにおいて第１ＨＰＬＣ分離にかけるステップと；
ｂ）前記第１ＨＰＬＣ分離から、少なくとも１つの画分を収集するステップと；
ｃ）前記サンプル中の少なくとも２種の検体が分離される条件下で、前記少なくとも１つの画分を第２ｐＨにおいて、第２ＨＰＬＣ分離にかけるステップと
を含む、サンプル中の複数の検体を分離する方法。
【請求項４６】
ａ）サンプルを、多次元液体クロマトグラフィーシステムの第１次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；
ｂ）前記サンプルの少なくとも第１ポリペプチド成分を、第１移動相を使用する前記第１次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中の前記サンプルの少なくとも第２ポリペプチドから、クロマトグラフィーで分離するステップと；
ｃ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の前記分離した第１および第２ポリペプチド成分を溶出するステップと；
ｄ）前記溶出液の少なくとも１つの個別の容積をサンプリングするステップと；
ｅ）前記少なくとも１つの個別の容積を、前記多次元液体クロマトグラフィーシステムの第２次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；
ｆ）注入した個別の容積を、第２移動相を使用する前記第２次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中でクロマトグラフ分離にかけ、ここで前記第１および第２移動相のｐＨが約３ｐＨ単位異なっているステップと；
ｇ）前記第２次元クロマトグラフィー装置の前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液を、質量分析法を使用して特性決定し、これによって複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するステップと
を含む、多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定する方法。
【請求項４７】
ａ）第１クロマトグラフカラムおよび前記第１クロマトグラフカラムを通して第１移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第１クロマトグラフ分析サブシステムと；
ｂ）第２クロマトグラフカラムおよび前記第２クロマトグラフカラムを通して第２移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第２クロマトグラフ分析サブシステムと；
ｃ）少なくとも１つの化合物含有画分を、前記第１クロマトグラフカラムの溶出液流から選択する手段および前記少なくとも１つの化合物含有画分を前記第２クロマトグラフカラムに導く手段と
を含み、ここで、前記第１移動相のｐＨが、前記第２移動相のｐＨと異なる、化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１】
ａ）サンプルを、第１ｐＨにおいて、第１移動相を使用して第１液体クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｂ）前記第１クロマトグラフ分離から少なくとも１つの画分を収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの画分を第２ｐＨにおいて、第２移動相を使用して第２液体クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｄ）前記サンプル中の少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップとを含み、ここで前記第１ｐＨと前記第２ｐＨが異なる、少なくとも１種の検体を含むサンプルを分析する方法。
【請求項２】
第１および第２クロマトグラフ分離が、互いに対して実質的に直交している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１および／または第２クロマトグラフ分離様式が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１および／または第２クロマトグラフ分離様式が、親水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＨＰＬＣ分離が逆相ＨＰＬＣ分離である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１クロマトグラフ分離様式が、少なくとも１００ピークのピーク容量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第１ｐＨと第２ｐＨが、少なくとも約３ｐＨ単位異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種の検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種の検体が、小さな有機分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが、少なくとも１０００種の検体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
方法の全ピーク容量が、少なくとも１，０００ピークである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＰＬＣ分離が、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）において収集された少なくとも１つの画分が、前記少なくとも１つの画分を第２クロマトグラフ分離様式にかける前に、濃縮または希釈される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの画分が、蒸発によって濃縮される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）において収集された少なくとも１つの画分が、第２クロマトグラフ分離様式を実施する前にオンラインで希釈される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
検出のステップが、質量分析法を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２クロマトグラフ様式が同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
第１および／または第２移動相が、実質的に不揮発性塩を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
第１および／または第２移動相が、約２０ｍＭ未満の不揮発性塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
複数の部分が収集され、第２クロマトグラフ分離にかけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）サンプルの少なくとも一部分を、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｂ）少なくとも１つの画分を、前記第１クロマトグラフ分離から収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップとを、前記サンプル中の少なくとも２個の検体が分離される条件下で含む、サンプル中の複数の検体を分離する方法。
【請求項２２】
第１および第２クロマトグラフ分離が、互いに対して実質的に直交している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第１および／または第２クロマトグラフ分離様式が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
第１および／または第２クロマトグラフ分離様式が、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＰＬＣ分離が逆相ＨＰＬＣ分離である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
第１クロマトグラフ分離様式が、少なくとも１００ピークのピーク容量を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
第１ｐＨと前記第２ｐＨが、少なくとも約３ｐＨ単位異なる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１種の検体が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１種の検体が、小さな有機分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
サンプルが、少なくとも１０００種の検体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
方法の全ピーク容量が、少なくとも１０，０００ピークである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
ＨＰＬＣ分離が、ミクロボアカラム、キャピラリーカラム、またはナノカラムを使用して実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップｂ）において収集された前記少なくとも１つの画分が、前記少なくとも１つの画分を第２クロマトグラフ分離様式にかける前に、濃縮または希釈される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
検出のステップが、質量分析法を使用して実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
第１および第２クロマトグラフ様式が同じである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
第１および／または第２移動相が、実質的に不揮発性塩を含まない、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
第１および／または第２移動相が、約２０ｍＭ未満の不揮発性塩を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
複数の部分が収集され、第２クロマトグラフ分離にかけられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）サンプルを、２次元液体クロマトグラフィーシステムの第１次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；
ｂ）前記サンプルの少なくとも第１ポリペプチド成分を、第１移動相を使用する前記第１次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中の前記サンプルの少なくとも第２ポリペプチドから、クロマトグラフィーで分離するステップと；
ｃ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の前記分離した第１および第２ポリペプチド成分を溶出するステップと；
ｄ）前記溶出液の少なくとも１つの個別の容積（ｖｏｌｕｍｅ）をサンプリングするステップと；
ｅ）前記少なくとも１つの個別の容積を、前記２次元液体クロマトグラフィーシステムの第２次元クロマトグラフィー装置（ｓｅｃｏｎｄ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｐｐａｒａｔｕｓ）に注入するステップと；
ｆ）注入した個別の容積を、第２移動相を使用する前記第２次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中でクロマトグラフ分離にかけ、ここで前記第１および第２移動相の前記ｐＨが約３ｐＨ単位異なっているステップと；
ｇ）前記第２次元クロマトグラフィー装置の前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液を、質量分析法を使用して特性決定し、これによって複数のポリペプチドを含む前記サンプルを特性決定するステップと
を含む、２次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定する方法。
【請求項４０】
ａ）サンプルを、化合物が第１不純物から分離される条件下で、第１ｐＨにおいて第１クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｂ）少なくとも１つの化合物含有画分を、前記第１クロマトグラフ分離から収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの化合物含有画分を、前記化合物が第２不純物から分離される条件下で、第２ｐＨにおいて第２クロマトグラフ分離様式にかけるステップと；
ｄ）精製した化合物を収集するステップと
を含む、化合物および少なくとも２つの不純物を含むサンプル中の前記化合物を精製する方法。
【請求項４１】
ａ）第１クロマトグラフカラムおよび前記第１クロマトグラフカラムを通して第１移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第１クロマトグラフ分析システムと；
ｂ）第２クロマトグラフカラムおよび前記第２クロマトグラフカラムを通して第２移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第２クロマトグラフ分析システムと；
ｃ）少なくとも１つの化合物含有画分を、前記第１クロマトグラフカラムの溶出液流から選択する手段および前記少なくとも１つの化合物含有画分を前記第２クロマトグラフカラムに導く手段と
を含み、ここで、前記第１移動相のｐＨが、前記第２移動相のｐＨと異なる、化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項４２】
ａ）サンプルを、第１ｐＨにおいて第１移動相を用いて、第１クロマトグラフ分離にかけるステップと；
ｂ）前記第１クロマトグラフ分離から少なくとも１つの画分を収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの画分を、第２ｐＨにおいて第２移動相を用いて、第２クロマトグラフ分離にかけるステップと；
ｄ）前記サンプル中の前記少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップと
を含み、ここで前記第１ｐＨと前記第２ｐＨが異なる、少なくとも１種の検体を含むサンプルの分析方法。
【請求項４４】
ａ）サンプルを、第１ｐＨにおいて第１移動相を用いて、第１クロマトグラフ分離にかけるステップと；
ｂ）前記第１クロマトグラフ分離から少なくとも１つの画分を収集するステップと；
ｃ）前記少なくとも１つの部分を、第２ｐＨにおいて第２移動相を用いて、第２クロマトグラフ分離にかけるステップと；
ｄ）前記サンプル中の少なくとも１種の検体の存在または不在を検出するステップと
を含み、ここで前記第１および第２移動相が、実質的に不揮発性塩を含まない、少なくとも１種の検体を含むサンプルの分析方法。
【請求項４５】
ａ）サンプルの少なくとも一部を、第１ｐＨにおいて第１ＨＰＬＣ分離にかけるステップと；
ｂ）前記第１ＨＰＬＣ分離から、少なくとも１つの画分を収集するステップと；
ｃ）前記サンプル中の少なくとも２種の検体が分離される条件下で、前記少なくとも１つの画分を第２ｐＨにおいて、第２ＨＰＬＣ分離にかけるステップと
を含む、サンプル中の複数の検体を分離する方法。
【請求項４６】
ａ）サンプルを、多次元液体クロマトグラフィーシステムの第１次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；
ｂ）前記サンプルの少なくとも第１ポリペプチド成分を、第１移動相を使用する前記第１次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中の前記サンプルの少なくとも第２ポリペプチドから、クロマトグラフィーで分離するステップと；
ｃ）前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の前記分離した第１および第２ポリペプチド成分を溶出するステップと；
ｄ）前記溶出液の少なくとも１つの個別の容積をサンプリングするステップと；
ｅ）前記少なくとも１つの個別の容積を、前記多次元液体クロマトグラフィーシステムの第２次元クロマトグラフィー装置に注入するステップと；
ｆ）注入した個別の容積を、第２移動相を使用する前記第２次元クロマトグラフィー装置のクロマトグラフィーカラム中でクロマトグラフ分離にかけ、ここで前記第１および第２移動相のｐＨが約３ｐＨ単位異なっているステップと；
ｇ）前記第２次元クロマトグラフィー装置の前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液を、質量分析法を使用して特性決定し、これによって複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定するステップと
を含む、多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて複数のポリペプチドを含むサンプルを特性決定する方法。
【請求項４７】
ａ）第１クロマトグラフカラムおよび前記第１クロマトグラフカラムを通して第１移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第１クロマトグラフ分析サブシステムと；
ｂ）第２クロマトグラフカラムおよび前記第２クロマトグラフカラムを通して第２移動相をポンプ輸送するためのポンプを含む第２クロマトグラフ分析サブシステムと；
ｃ）少なくとも１つの化合物含有画分を、前記第１クロマトグラフカラムの溶出液流から選択する手段および前記少なくとも１つの化合物含有画分を前記第２クロマトグラフカラムに導く手段と
を含み、ここで、前記第１移動相のｐＨが、前記第２移動相のｐＨと異なる、化合物の混合物を分離するための液体クロマトグラフィーシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５３７９９４（Ｐ２００８−５３７９９４Ａ）
【公表日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５２２７５（Ｐ２００７−５５２２７５）
【出願日】平成１８年１月２０日（２００６．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１９６８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７８８５９
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（５０４４３８２５５）ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド (80)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２０日（２００６．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１９６８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７８８５９
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（５０４４３８２５５）ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド (80)
【Ｆターム（参考）】
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