化粧料
【課題】ユーグレナを利用して、有利な作用効果を奏する化粧料および化粧料原料を得ること、さらには紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料成分を得て、それらを含む化粧料およびその製造方法とすることである。
【解決手段】ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）などのユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性についての有効成分として含有する化粧料とする。またはユーグレナ属に属する藻類の細胞体を１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理によってオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取することからなる紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料原料を製造する。
【解決手段】ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）などのユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性についての有効成分として含有する化粧料とする。またはユーグレナ属に属する藻類の細胞体を１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理によってオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取することからなる紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料原料を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ユーグレナ属に属する藻類の含有成分を利用した化粧料およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーグレナ属に属する藻類(以下、単にユーグレナまたはユーグレナ藻とも略称する)は、鞭毛を有し、運動性のある単細胞真核藻類であり、大部分のユーグレナは葉緑体を持っており光合成を行って独立栄養生活を営むが、捕食性のものや吸収栄養性の種もある。このようなユーグレナは、古くから家畜飼料やサプリメントとして研究されており、その他に育毛剤や化粧料の原料としても用いられている。
【０００３】
例えば、培養したユーグレナに、水、エタノール、１,３−ブチレングリコールの単独溶媒を用いて得られた抽出液には、男性型脱毛症や円形脱毛症に関与すると言われているテストステロン-５α-リダクダーゼ阻害効果があり、育毛剤として利用できることが知られている（特許文献１）。
【０００４】
また、培養したユーグレナに、水、アルコール、有機溶媒の単独又は混合溶媒を用いて得られた抽出液を、抗酸化剤として化粧料に利用できる事が知られている（特許文献２）。
【０００５】
さらに、塩ストレスおよび／または浸透圧ストレスを与えて培養したユーグレナの藻体を、適当な方法により抽出又は破砕する事で得られる藻体抽出物には、トレハロースが多く含まれており、保湿性の高い育毛・養毛剤として利用できる事が知られている（特許文献３）。
このようにユーグレナは、抗酸化作用、保湿作用等の効果を有する抽出液の製造及び、化粧品などへ利用されてきた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２-６８９４３号公報
【特許文献２】特開２００２-６９４４３号公報
【特許文献３】特開２００３-１３７７４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記した従来の技術では、ユーグレナを利用して紫外線に対する細胞の傷害防御等の効果は報告されていない。
【０００８】
また、紫外線による細胞傷害の予防を目的とする合成紫外線防御剤や天然紫外線防御剤が周知であるが、合成紫外線防御剤は、添加量によって皮膚刺激等の安全性に課題があり、また、天然紫外線防御剤は、その効果を充分に得るための添加量には実用上の制限がある。
【０００９】
そこで、この発明の課題は、上記した問題を解決し、ユーグレナを利用して、有利な作用効果を奏する化粧料および化粧料原料を得ること、さらには紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料成分を得て、それらを含む化粧料およびその製造方法とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願の発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ユーグレナをオートクレーブにより加熱加圧処理をした後、酵素処理することにより得られるエキスが、従来には見られない有利な作用効果を奏し、特に紫外線による細胞傷害を防御し、更には線維芽細胞の増殖効果も有することを見出し、この発明を完成するに至ったのである。
すなわち、上記の課題を解決するために、ユーグレナ属に属する藻類（ユーグレナ）の細胞として、好ましくはオートクレーブ処理したものを蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を有効成分として含有する化粧料としたのである。
【００１１】
この有効成分は、紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての有効成分であるか、または線維芽細胞増殖性についての有効成分であることが、化粧料の有効成分として有利である。
【００１２】
ここで、ユーグレナは、細胞膜直下にペリクルと呼ばれる構造を有するという系統分類学的な特徴があり、この構造は縦列またはらせん状に並んだ蛋白質性のペリクル板と微小管列からなるものである。
【００１３】
この発明の化粧料は、ユーグレナの細胞を蛋白質酵素分解することにより、細胞を構成する蛋白質を分解して充分に低分子量化し、特に細胞膜などを分解して細胞内の蛋白質を低分子量化して得られるペプチドとして比較的多く含んでいる水溶性抽出物を有効成分として含んでいる。
そのため、この発明の化粧料は、有利な作用効果を奏する化粧料になり、特に紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料になる。
【００１４】
この発明に用いるユーグレナは、ユーグレナ属に属する藻類の代表例として、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）を採用できる。
【００１５】
紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料の製造方法としては、ユーグレナ属に属する藻類の細胞体をオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取し、この水溶性成分を有効成分として配合することによる製造方法を採用することができる。
【００１６】
ユーグレナに直接に蛋白質分解酵素を作用させるより、予めそのような作用が及びやすくするために、加圧状態で沸点以上に加熱された水蒸気を細胞の内部まで浸透させて蛋白質その他の生体高分子の熱分解を促進し、その後に蛋白質分解酵素を効率よく作用させて水溶性抽出物を得やすくする。オートクレーブによる滅菌作用も有効であることは勿論である。
【００１７】
特に、上記のオートクレーブ処理が、１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理であることは、確実にそのような化粧料原料を得るために好ましい方法である。
【００１８】
オートクレーブ処理が、上記した所定温度範囲未満の低温では、生体高分子の熱分解を効率よく行なうことが充分にできずに好ましくなく、１５０℃を超える高温では、熱変性が進みすぎて有用なペプチドその他の物質の収率が却って減少するために好ましくない。
【００１９】
また、オートクレーブ処理が、大気圧〜０．２５５ＭＰａの範囲が好ましい理由は、大気圧未満の低圧では、水蒸気を細胞の内部まで浸透させることが充分にできずに好ましくなく、０．２５５ＭＰａを超える高圧にしても加圧に伴う生体高分子の分解が効率よく進むことがなく、却って実用的でなくなるからである。
【００２０】
また、１分〜３０分の加熱加圧処理を採用することが好ましい理由は、１分未満の短時間では、水蒸気を細胞の内部まで浸透させることは困難であるから好ましくなく、３０分を越えて長時間の処理を行なっても、生体高分子の分解が効率よく進まず、却って実用的でないからである。
【発明の効果】
【００２１】
この発明は、ユーグレナの細胞を蛋白質酵素分解し、抽出される水溶性成分を有効成分とする化粧料としたので、ユーグレナの細胞を構成する蛋白質を分解して充分に低分子量化されたペプチドを水溶性成分として多く含む抽出物を含み、有利な作用効果を奏する化粧料および化粧料原料となり、さらにはこのような抽出物により紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料成分を得て、それらを含む化粧料およびその製造方法となる利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
この発明では、ユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を有効成分として含有する化粧料とし、その化粧料は、ユーグレナ属に属する藻類の細胞体をオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取し、この水溶性成分を有効成分として配合して製造する。
【００２３】
この発明で用いるユーグレナは、ユーグレナ属に属する全ての種を用いることができる。代表的なユーグレナとしては、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)、ユーグレナ・グラシリス・バー・バシラリス（Euglena gracilis var.Bacillaris）、ユーグレナ・ビリディス(Euglena viridis)などが挙げられ、これらの変異種も用いることもできる。
【００２４】
また、この発明でユーグレナを培養する際に用いられる培地は、特に限定されるものではなく、通常ユーグレナの培養に用いられるものであれば良く、また、炭素源、窒素源、無機化合物、ビタミン類などを適宜組合せて用いても良い。
【００２５】
例えば、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地「ユーグレナ−生理と生化学−、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４２項」、Ｈｕｔｎｅｒ培地「ユーグレナ−生理と生化学、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４２項」、 Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地「ユーグレナ−生理と生化学、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４３ 項」など、従来から知られている培地を用いることができる。
【００２６】
なお、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地は、培地１リットル当たり、リン酸水素二アンモニウム１.０ｇ、リン酸二水素カリウム１.０ｇ、硫酸マグネシウム０.２ｇ、炭酸カルシウム.０２ｇ、クエン酸０.８ｇ、硫酸第一鉄３.０ｍｇ、硫酸マンガン１.８ｍｇ、硫酸コバルト１.５ｍｇ、硫酸亜鉛０.４ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム０.２ｍｇ、硫酸銅０.０２ｍｇ、ビタミンＢ１０.１ｍｇ、ビタミンＢ１２０.０００５ｍｇを含み、ｐＨは３.５〜６.８であり、好ましくは５.５である。
【００２７】
また、Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地は、培地１リットル当たり、アルギニン塩酸塩０.５ｇ、アスパラギン酸０.３ｇ、グルコース１２.０ｇ、グルタミン酸４.０ｇ、グリシン０.３ｇ、ヒスチジン塩酸塩０.０５ｇ、リンゴ酸６.５ｇ、クエン酸３Ｎａ０.５ｇ、コハク酸２Ｎａ０.１ｇ、硫酸アンモニウム０.５ｇ、炭酸水素アンモニウム０.２５ｇ、リン酸二水素カリウム０.２５ｇ、炭酸マグネシウム０.６ｇ、炭酸カルシウム０.１２ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ５０ｍｇ、硫酸第一鉄アンモニウム５０ｍｇ、硫酸マンガン１８ｍｇ、硫酸亜鉛２５ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４.０ｍｇ、硫酸銅１.２ｍｇ、バナジン酸アンモニウム０.５ｍｇ、硫酸コバルト０.５ｍｇ、ホウ酸０.６ｍｇ、硫酸ニッケル０.５ｍｇ、ビタミンＢ１２.５ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０.００５ｍｇを含み、ｐＨは３.５である。
【００２８】
ユーグレナの培養は、静置培養、攪拌培養等により行われるが、嫌気条件で培養しても良い。更に、嫌気条件で培養後は好気条件で培養することも出来る。
培養は、２０〜３０℃で行い、２８〜３０℃で最も良好な生育が見られ、光照射下及び／又は暗黒下で行う。光照射を行う場合、２０００〜８０００ Ｌｕｘの光を照射する。
培養時に、振盪を行うことも出来、その場合１分間当たり９５〜１０５回の振盪で最も良好な生育が見られる。
上記条件によりユーグレナを２〜５日間培養すれば、生育は定常期に達し、１リットル当たり最大で約３０ｇ（湿重量）の細胞を得る事ができる。
【００２９】
このようにして得られたユーグレナ細胞を遠心分離などの方法によって培養液から回収し、例えばスプレードライヤー等により乾燥粉末化する。
【００３０】
乾燥体（重量）に対し、好ましくは１００倍量（重量）の精製水を加え、加圧加熱処理を行なう。その後、蛋白質分解酵素を添加し藻体を処理する。処理終了後、例えば９０℃で失活し、遠心分離または濾過することにより、残渣と水溶性成分を分離する。
【００３１】
具体的には、加圧加熱処理条件は、オートクレーブを用いて１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理であることが好ましく、例えば、０．１〜０．１４ＭＰａ、１２１℃で１０分間の加熱加圧処理をして好ましい結果が得られる。
この発明に用いる蛋白質分解酵素としては、例えばペプシン、パンクレアチン、パパインなど一般的に用いられるプロテアーゼ活性を有する酵素を単独または併用が挙げられる。
特にポリペプチド鎖の途中のペプチド結合を加水分解し、幾つかのペプチドに分解するためにエンド型ペプチダーゼを採用することが好ましい。
市販の蛋白質分解酵素としては、ヤクルト薬品工業社製のパンチダーゼＭＰ、アロアーゼＡＰ−１０なども採用できる。
酵素の添加濃度、反応液のｐＨや反応温度、その他の条件等は、各酵素剤にとって最適な条件を選択すればよい。
【００３２】
このようにして得られた水溶性成分は、そのまま用いることもできるが、本発明の効果を失わない範囲内で分画、脱臭，脱色，濃縮等の精製操作を加えて用いることもできる。
化粧料に上記の水溶性成分を有効成分として配合するには、化粧料1ｇ当たり乾燥重量にて３０〜６０ｍｇを配合することが好ましい。例えば２％配合化粧水の場合には１００ｇ当たり６０〜１２０ｍｇ配合する。
【００３３】
化粧料を製造する場合に、上記のようにして得られる水溶性成分以外の成分としては、特に限定されず、一般的に化粧料の製造に用いられるものを併用し、各種化粧品とすることが可能である。
【実施例】
【００３４】
〔実施例１〕
ユーグレナ粉末１ｇにその１００倍量の精製水を加え、圧力０．１ＭＰａ、温度１２１℃に加熱して１０分間の加熱加圧処理をした。その後、エンド型プロテアーゼのタンパク質分解酵素（例えば ヤクルト薬品工業社製:パンチダーゼＭＰ）を全量の５％添加し、３５℃、１６時間、攪拌反応させた。反応後、濾紙を用いて濾過することで水溶性成分(以下、エキスとも称する場合がある)を分取した。
【００３５】
〔比較例１〕
実施例1において、タンパク質分解酵素を添加しなかったこと以外は全く同様にしてエキスを分取した。
【００３６】
〔比較例２〕
実施例1において、加圧しなかったこと、すなわちユーグレナ粉末１ｇにその１００倍量の精製水を加え、大気圧（常圧）にて温度９０ ℃で１０分間の加熱処理をした。その後は、全く同様にしてエキスを分取した。
【００３７】
〔比較例３〕
実施例１において、比較例２と同様に加圧せずに加熱処理し、さらにタンパク質分解酵素は添加しなかったこと以外は、実施例1と全く同様にしてエキスを分取した。
【００３８】
〔比較例４〕
実施例1において、加熱加圧処理をしなかったこと以外は全く同様にしてエキスを分取した。
【００３９】
以上の実施例１および比較例１〜４のエキスについて、以下の紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての評価試験を行ない、その結果を図１に示した。
【００４０】
＜紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての評価試験＞
試験方法としては、ＮＢ１ＲＧＢ細胞を５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地中で培養したものを使用した。なおこの培養は全て３７℃、５％ＣＯ２存在下条件で行った。詳細には、２.５×１０４ｃｅｌｌｓ ／ｍｌのＮＢ１ＲＧＢ細胞を、３５ｍｍプラスティックシャーレに２ｍｌ播種し、２４時間培養した。その後、新鮮な培地に交換し、試験サンプルを２％になるよう培地中に添加し、２４時間培養した。培地をＨＡＮＫＳ’に交換の後、ＵＶＡランプを用い紫外線照射を行う。照射後、５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に交換し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養する。培養後、ＭＴＴ染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定し、ＵＶＡ未照射での細胞生存率を１００％として、各サンプル添加における生存率を算出した。
【００４１】
図１の結果からも明らかなように、実施例１の細胞生存率（６１．４％）と対照区（４９．６％）の比較では、実施例１の方が生存率は１１．８％高く、１％の基準で有意差も認められた。また、実施例１は酵素処理を行なわなかった比較例１（５１．７％）、加圧処理を行なわなかった比較例２（５１．９％）、加圧処理、酵素処理の両方を行なわなかった比較例３（５１．７％）、加熱処理、加圧処理を行なわず、酵素処理のみを行なった比較例４（４６．３％）のいずれと比較をしても１０％程度高い細胞生存率を示した。
これにより、加熱・加圧処理後に酵素処理を併用することによって紫外線による皮膚細胞損傷防止性が顕著に得られていることがわかる。
【００４２】
次に、実施例１及び比較例１〜４により得られたユーグレナ酵素処理エキスの細胞増殖効果を調べ、得られた細胞増殖率の比較を表1および図２に示した。
【００４３】
＜線維芽細胞増殖効果試験＞
前述の実施例１及び比較例１〜４により得られたユーグレナ酵素処理エキスの線維芽細胞増殖効果を調べた。
試験方法としては、ＮＢ１ＲＧＢ細胞を５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地中で培養したものを使用した。なお、この培養は全て３７℃、５％ＣＯ２存在下条件で行った。詳細には、２.５×１０４ｃｅｌｌｓ ／ｍｌのＮＢ１ＲＧＢ細胞を調整し、９６ｗｅｌｌプレートに２００μl ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した。その後、０.５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に交換し、試験試料をそれぞれ２％ 、１％になるよう培地中に添加し、５日間培養した。５日後、ＮＲ染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定し、試験試料を添加していない細胞の増殖率を１００％（対照区：control）として、各サンプル濃度における細胞増殖率を算出した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
表１および図２の結果からも明らかなように、実施例１と対照区（１００％）の比較では、実施例１は対照区と比べて１６０％以上の細胞増殖率を示した。また、ユーグレナ酵素処理エキスによる細胞増殖効果は、サンプル添加濃度に比例して増加していた。
【００４６】
一方、比較例１および比較例３は、対照区と同程度の細胞増殖率を示し、比較例２および比較例４でも実施例１に準ずる細胞増殖率を示していたが、実施例1に比べて１７％以上劣っていた。比較例１および比較例３と比較例２および４の違いは、タンパク質分解酵素による処理の有無であった。
これらの結果から、タンパク質分解酵素処理を行なうことによって線維芽細胞増殖効果が改善され、加圧加熱処理を併用することにより改善効果が顕著であることが判明した。
【００４７】
次に、この発明のユーグレナ酵素処理エキスが用いられる化粧品の形態としては、特に限定される物ではないが、例えば、美容液、化粧水、クリーム、乳液等が適当であり、その他にも既知の化粧品形態や剤形を選択できる。それらの代表例となる処方例を以下の表２、３に挙げる。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実施例1および比較例１〜４の紫外線照射による細胞生存率を示す図表
【図２】実施例1および比較例１〜４の線維芽細胞の増殖率とエキスの添加濃度との関係を示す図表
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ユーグレナ属に属する藻類の含有成分を利用した化粧料およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーグレナ属に属する藻類(以下、単にユーグレナまたはユーグレナ藻とも略称する)は、鞭毛を有し、運動性のある単細胞真核藻類であり、大部分のユーグレナは葉緑体を持っており光合成を行って独立栄養生活を営むが、捕食性のものや吸収栄養性の種もある。このようなユーグレナは、古くから家畜飼料やサプリメントとして研究されており、その他に育毛剤や化粧料の原料としても用いられている。
【０００３】
例えば、培養したユーグレナに、水、エタノール、１,３−ブチレングリコールの単独溶媒を用いて得られた抽出液には、男性型脱毛症や円形脱毛症に関与すると言われているテストステロン-５α-リダクダーゼ阻害効果があり、育毛剤として利用できることが知られている（特許文献１）。
【０００４】
また、培養したユーグレナに、水、アルコール、有機溶媒の単独又は混合溶媒を用いて得られた抽出液を、抗酸化剤として化粧料に利用できる事が知られている（特許文献２）。
【０００５】
さらに、塩ストレスおよび／または浸透圧ストレスを与えて培養したユーグレナの藻体を、適当な方法により抽出又は破砕する事で得られる藻体抽出物には、トレハロースが多く含まれており、保湿性の高い育毛・養毛剤として利用できる事が知られている（特許文献３）。
このようにユーグレナは、抗酸化作用、保湿作用等の効果を有する抽出液の製造及び、化粧品などへ利用されてきた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２-６８９４３号公報
【特許文献２】特開２００２-６９４４３号公報
【特許文献３】特開２００３-１３７７４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記した従来の技術では、ユーグレナを利用して紫外線に対する細胞の傷害防御等の効果は報告されていない。
【０００８】
また、紫外線による細胞傷害の予防を目的とする合成紫外線防御剤や天然紫外線防御剤が周知であるが、合成紫外線防御剤は、添加量によって皮膚刺激等の安全性に課題があり、また、天然紫外線防御剤は、その効果を充分に得るための添加量には実用上の制限がある。
【０００９】
そこで、この発明の課題は、上記した問題を解決し、ユーグレナを利用して、有利な作用効果を奏する化粧料および化粧料原料を得ること、さらには紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料成分を得て、それらを含む化粧料およびその製造方法とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願の発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ユーグレナをオートクレーブにより加熱加圧処理をした後、酵素処理することにより得られるエキスが、従来には見られない有利な作用効果を奏し、特に紫外線による細胞傷害を防御し、更には線維芽細胞の増殖効果も有することを見出し、この発明を完成するに至ったのである。
すなわち、上記の課題を解決するために、ユーグレナ属に属する藻類（ユーグレナ）の細胞として、好ましくはオートクレーブ処理したものを蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を有効成分として含有する化粧料としたのである。
【００１１】
この有効成分は、紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての有効成分であるか、または線維芽細胞増殖性についての有効成分であることが、化粧料の有効成分として有利である。
【００１２】
ここで、ユーグレナは、細胞膜直下にペリクルと呼ばれる構造を有するという系統分類学的な特徴があり、この構造は縦列またはらせん状に並んだ蛋白質性のペリクル板と微小管列からなるものである。
【００１３】
この発明の化粧料は、ユーグレナの細胞を蛋白質酵素分解することにより、細胞を構成する蛋白質を分解して充分に低分子量化し、特に細胞膜などを分解して細胞内の蛋白質を低分子量化して得られるペプチドとして比較的多く含んでいる水溶性抽出物を有効成分として含んでいる。
そのため、この発明の化粧料は、有利な作用効果を奏する化粧料になり、特に紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料になる。
【００１４】
この発明に用いるユーグレナは、ユーグレナ属に属する藻類の代表例として、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）を採用できる。
【００１５】
紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料の製造方法としては、ユーグレナ属に属する藻類の細胞体をオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取し、この水溶性成分を有効成分として配合することによる製造方法を採用することができる。
【００１６】
ユーグレナに直接に蛋白質分解酵素を作用させるより、予めそのような作用が及びやすくするために、加圧状態で沸点以上に加熱された水蒸気を細胞の内部まで浸透させて蛋白質その他の生体高分子の熱分解を促進し、その後に蛋白質分解酵素を効率よく作用させて水溶性抽出物を得やすくする。オートクレーブによる滅菌作用も有効であることは勿論である。
【００１７】
特に、上記のオートクレーブ処理が、１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理であることは、確実にそのような化粧料原料を得るために好ましい方法である。
【００１８】
オートクレーブ処理が、上記した所定温度範囲未満の低温では、生体高分子の熱分解を効率よく行なうことが充分にできずに好ましくなく、１５０℃を超える高温では、熱変性が進みすぎて有用なペプチドその他の物質の収率が却って減少するために好ましくない。
【００１９】
また、オートクレーブ処理が、大気圧〜０．２５５ＭＰａの範囲が好ましい理由は、大気圧未満の低圧では、水蒸気を細胞の内部まで浸透させることが充分にできずに好ましくなく、０．２５５ＭＰａを超える高圧にしても加圧に伴う生体高分子の分解が効率よく進むことがなく、却って実用的でなくなるからである。
【００２０】
また、１分〜３０分の加熱加圧処理を採用することが好ましい理由は、１分未満の短時間では、水蒸気を細胞の内部まで浸透させることは困難であるから好ましくなく、３０分を越えて長時間の処理を行なっても、生体高分子の分解が効率よく進まず、却って実用的でないからである。
【発明の効果】
【００２１】
この発明は、ユーグレナの細胞を蛋白質酵素分解し、抽出される水溶性成分を有効成分とする化粧料としたので、ユーグレナの細胞を構成する蛋白質を分解して充分に低分子量化されたペプチドを水溶性成分として多く含む抽出物を含み、有利な作用効果を奏する化粧料および化粧料原料となり、さらにはこのような抽出物により紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性について有効な化粧料成分を得て、それらを含む化粧料およびその製造方法となる利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
この発明では、ユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を有効成分として含有する化粧料とし、その化粧料は、ユーグレナ属に属する藻類の細胞体をオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取し、この水溶性成分を有効成分として配合して製造する。
【００２３】
この発明で用いるユーグレナは、ユーグレナ属に属する全ての種を用いることができる。代表的なユーグレナとしては、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)、ユーグレナ・グラシリス・バー・バシラリス（Euglena gracilis var.Bacillaris）、ユーグレナ・ビリディス(Euglena viridis)などが挙げられ、これらの変異種も用いることもできる。
【００２４】
また、この発明でユーグレナを培養する際に用いられる培地は、特に限定されるものではなく、通常ユーグレナの培養に用いられるものであれば良く、また、炭素源、窒素源、無機化合物、ビタミン類などを適宜組合せて用いても良い。
【００２５】
例えば、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地「ユーグレナ−生理と生化学−、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４２項」、Ｈｕｔｎｅｒ培地「ユーグレナ−生理と生化学、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４２項」、 Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地「ユーグレナ−生理と生化学、北岡正三郎編、株式会社学会出版センター、第２４３ 項」など、従来から知られている培地を用いることができる。
【００２６】
なお、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地は、培地１リットル当たり、リン酸水素二アンモニウム１.０ｇ、リン酸二水素カリウム１.０ｇ、硫酸マグネシウム０.２ｇ、炭酸カルシウム.０２ｇ、クエン酸０.８ｇ、硫酸第一鉄３.０ｍｇ、硫酸マンガン１.８ｍｇ、硫酸コバルト１.５ｍｇ、硫酸亜鉛０.４ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム０.２ｍｇ、硫酸銅０.０２ｍｇ、ビタミンＢ１０.１ｍｇ、ビタミンＢ１２０.０００５ｍｇを含み、ｐＨは３.５〜６.８であり、好ましくは５.５である。
【００２７】
また、Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地は、培地１リットル当たり、アルギニン塩酸塩０.５ｇ、アスパラギン酸０.３ｇ、グルコース１２.０ｇ、グルタミン酸４.０ｇ、グリシン０.３ｇ、ヒスチジン塩酸塩０.０５ｇ、リンゴ酸６.５ｇ、クエン酸３Ｎａ０.５ｇ、コハク酸２Ｎａ０.１ｇ、硫酸アンモニウム０.５ｇ、炭酸水素アンモニウム０.２５ｇ、リン酸二水素カリウム０.２５ｇ、炭酸マグネシウム０.６ｇ、炭酸カルシウム０.１２ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ５０ｍｇ、硫酸第一鉄アンモニウム５０ｍｇ、硫酸マンガン１８ｍｇ、硫酸亜鉛２５ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４.０ｍｇ、硫酸銅１.２ｍｇ、バナジン酸アンモニウム０.５ｍｇ、硫酸コバルト０.５ｍｇ、ホウ酸０.６ｍｇ、硫酸ニッケル０.５ｍｇ、ビタミンＢ１２.５ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０.００５ｍｇを含み、ｐＨは３.５である。
【００２８】
ユーグレナの培養は、静置培養、攪拌培養等により行われるが、嫌気条件で培養しても良い。更に、嫌気条件で培養後は好気条件で培養することも出来る。
培養は、２０〜３０℃で行い、２８〜３０℃で最も良好な生育が見られ、光照射下及び／又は暗黒下で行う。光照射を行う場合、２０００〜８０００ Ｌｕｘの光を照射する。
培養時に、振盪を行うことも出来、その場合１分間当たり９５〜１０５回の振盪で最も良好な生育が見られる。
上記条件によりユーグレナを２〜５日間培養すれば、生育は定常期に達し、１リットル当たり最大で約３０ｇ（湿重量）の細胞を得る事ができる。
【００２９】
このようにして得られたユーグレナ細胞を遠心分離などの方法によって培養液から回収し、例えばスプレードライヤー等により乾燥粉末化する。
【００３０】
乾燥体（重量）に対し、好ましくは１００倍量（重量）の精製水を加え、加圧加熱処理を行なう。その後、蛋白質分解酵素を添加し藻体を処理する。処理終了後、例えば９０℃で失活し、遠心分離または濾過することにより、残渣と水溶性成分を分離する。
【００３１】
具体的には、加圧加熱処理条件は、オートクレーブを用いて１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理であることが好ましく、例えば、０．１〜０．１４ＭＰａ、１２１℃で１０分間の加熱加圧処理をして好ましい結果が得られる。
この発明に用いる蛋白質分解酵素としては、例えばペプシン、パンクレアチン、パパインなど一般的に用いられるプロテアーゼ活性を有する酵素を単独または併用が挙げられる。
特にポリペプチド鎖の途中のペプチド結合を加水分解し、幾つかのペプチドに分解するためにエンド型ペプチダーゼを採用することが好ましい。
市販の蛋白質分解酵素としては、ヤクルト薬品工業社製のパンチダーゼＭＰ、アロアーゼＡＰ−１０なども採用できる。
酵素の添加濃度、反応液のｐＨや反応温度、その他の条件等は、各酵素剤にとって最適な条件を選択すればよい。
【００３２】
このようにして得られた水溶性成分は、そのまま用いることもできるが、本発明の効果を失わない範囲内で分画、脱臭，脱色，濃縮等の精製操作を加えて用いることもできる。
化粧料に上記の水溶性成分を有効成分として配合するには、化粧料1ｇ当たり乾燥重量にて３０〜６０ｍｇを配合することが好ましい。例えば２％配合化粧水の場合には１００ｇ当たり６０〜１２０ｍｇ配合する。
【００３３】
化粧料を製造する場合に、上記のようにして得られる水溶性成分以外の成分としては、特に限定されず、一般的に化粧料の製造に用いられるものを併用し、各種化粧品とすることが可能である。
【実施例】
【００３４】
〔実施例１〕
ユーグレナ粉末１ｇにその１００倍量の精製水を加え、圧力０．１ＭＰａ、温度１２１℃に加熱して１０分間の加熱加圧処理をした。その後、エンド型プロテアーゼのタンパク質分解酵素（例えば ヤクルト薬品工業社製:パンチダーゼＭＰ）を全量の５％添加し、３５℃、１６時間、攪拌反応させた。反応後、濾紙を用いて濾過することで水溶性成分(以下、エキスとも称する場合がある)を分取した。
【００３５】
〔比較例１〕
実施例1において、タンパク質分解酵素を添加しなかったこと以外は全く同様にしてエキスを分取した。
【００３６】
〔比較例２〕
実施例1において、加圧しなかったこと、すなわちユーグレナ粉末１ｇにその１００倍量の精製水を加え、大気圧（常圧）にて温度９０ ℃で１０分間の加熱処理をした。その後は、全く同様にしてエキスを分取した。
【００３７】
〔比較例３〕
実施例１において、比較例２と同様に加圧せずに加熱処理し、さらにタンパク質分解酵素は添加しなかったこと以外は、実施例1と全く同様にしてエキスを分取した。
【００３８】
〔比較例４〕
実施例1において、加熱加圧処理をしなかったこと以外は全く同様にしてエキスを分取した。
【００３９】
以上の実施例１および比較例１〜４のエキスについて、以下の紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての評価試験を行ない、その結果を図１に示した。
【００４０】
＜紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての評価試験＞
試験方法としては、ＮＢ１ＲＧＢ細胞を５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地中で培養したものを使用した。なおこの培養は全て３７℃、５％ＣＯ２存在下条件で行った。詳細には、２.５×１０４ｃｅｌｌｓ ／ｍｌのＮＢ１ＲＧＢ細胞を、３５ｍｍプラスティックシャーレに２ｍｌ播種し、２４時間培養した。その後、新鮮な培地に交換し、試験サンプルを２％になるよう培地中に添加し、２４時間培養した。培地をＨＡＮＫＳ’に交換の後、ＵＶＡランプを用い紫外線照射を行う。照射後、５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に交換し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養する。培養後、ＭＴＴ染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定し、ＵＶＡ未照射での細胞生存率を１００％として、各サンプル添加における生存率を算出した。
【００４１】
図１の結果からも明らかなように、実施例１の細胞生存率（６１．４％）と対照区（４９．６％）の比較では、実施例１の方が生存率は１１．８％高く、１％の基準で有意差も認められた。また、実施例１は酵素処理を行なわなかった比較例１（５１．７％）、加圧処理を行なわなかった比較例２（５１．９％）、加圧処理、酵素処理の両方を行なわなかった比較例３（５１．７％）、加熱処理、加圧処理を行なわず、酵素処理のみを行なった比較例４（４６．３％）のいずれと比較をしても１０％程度高い細胞生存率を示した。
これにより、加熱・加圧処理後に酵素処理を併用することによって紫外線による皮膚細胞損傷防止性が顕著に得られていることがわかる。
【００４２】
次に、実施例１及び比較例１〜４により得られたユーグレナ酵素処理エキスの細胞増殖効果を調べ、得られた細胞増殖率の比較を表1および図２に示した。
【００４３】
＜線維芽細胞増殖効果試験＞
前述の実施例１及び比較例１〜４により得られたユーグレナ酵素処理エキスの線維芽細胞増殖効果を調べた。
試験方法としては、ＮＢ１ＲＧＢ細胞を５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地中で培養したものを使用した。なお、この培養は全て３７℃、５％ＣＯ２存在下条件で行った。詳細には、２.５×１０４ｃｅｌｌｓ ／ｍｌのＮＢ１ＲＧＢ細胞を調整し、９６ｗｅｌｌプレートに２００μl ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した。その後、０.５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に交換し、試験試料をそれぞれ２％ 、１％になるよう培地中に添加し、５日間培養した。５日後、ＮＲ染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定し、試験試料を添加していない細胞の増殖率を１００％（対照区：control）として、各サンプル濃度における細胞増殖率を算出した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
表１および図２の結果からも明らかなように、実施例１と対照区（１００％）の比較では、実施例１は対照区と比べて１６０％以上の細胞増殖率を示した。また、ユーグレナ酵素処理エキスによる細胞増殖効果は、サンプル添加濃度に比例して増加していた。
【００４６】
一方、比較例１および比較例３は、対照区と同程度の細胞増殖率を示し、比較例２および比較例４でも実施例１に準ずる細胞増殖率を示していたが、実施例1に比べて１７％以上劣っていた。比較例１および比較例３と比較例２および４の違いは、タンパク質分解酵素による処理の有無であった。
これらの結果から、タンパク質分解酵素処理を行なうことによって線維芽細胞増殖効果が改善され、加圧加熱処理を併用することにより改善効果が顕著であることが判明した。
【００４７】
次に、この発明のユーグレナ酵素処理エキスが用いられる化粧品の形態としては、特に限定される物ではないが、例えば、美容液、化粧水、クリーム、乳液等が適当であり、その他にも既知の化粧品形態や剤形を選択できる。それらの代表例となる処方例を以下の表２、３に挙げる。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実施例1および比較例１〜４の紫外線照射による細胞生存率を示す図表
【図２】実施例1および比較例１〜４の線維芽細胞の増殖率とエキスの添加濃度との関係を示す図表
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を有効成分として含有する化粧料。
【請求項２】
有効成分が、紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての有効成分である請求項１に記載の化粧料。
【請求項３】
有効成分が、線維 芽細胞増殖性についての有効成分である請求項１に記載の化粧料。
【請求項４】
ユーグレナ属に属する藻類が、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）である請求項１〜３のいずれかに記載の化粧料。
【請求項５】
ユーグレナ属に属する藻類の細胞体をオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取し、この水溶性成分を有効成分として配合することからなる紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料の製造方法。
【請求項６】
オートクレーブ処理が、１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理である請求項５に記載の紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料の製造方法。
【請求項１】
ユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分を有効成分として含有する化粧料。
【請求項２】
有効成分が、紫外線による皮膚細胞損傷防止性についての有効成分である請求項１に記載の化粧料。
【請求項３】
有効成分が、線維 芽細胞増殖性についての有効成分である請求項１に記載の化粧料。
【請求項４】
ユーグレナ属に属する藻類が、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）である請求項１〜３のいずれかに記載の化粧料。
【請求項５】
ユーグレナ属に属する藻類の細胞体をオートクレーブ処理した後、蛋白質分解酵素を作用させ、次いで水溶性成分を分取し、この水溶性成分を有効成分として配合することからなる紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料の製造方法。
【請求項６】
オートクレーブ処理が、１００〜１５０℃、大気圧〜０．２５５ＭＰａ、1分〜３０分の加熱加圧処理である請求項５に記載の紫外線による皮膚細胞損傷防止性または線維芽細胞増殖性を有する化粧料の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−９００６５（Ｐ２０１０−９００６５Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６１８４５（Ｐ２００８−２６１８４５）
【出願日】平成２０年１０月８日（２００８．１０．８）
【出願人】（５９３０８４６４９）日本コルマー株式会社 (12)
【出願人】（５０６１４１２２５）株式会社ユーグレナ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月８日（２００８．１０．８）
【出願人】（５９３０８４６４９）日本コルマー株式会社 (12)
【出願人】（５０６１４１２２５）株式会社ユーグレナ (12)
【Ｆターム（参考）】
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