医薬として用いるインドール−３−プロピオン酸、並びにそれらの塩およびエステル
【課題】本発明は、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止すること、線維素生成疾患を処置すること、生物学的試料の酸化を減少させること、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、インドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）またはそれらの塩もしくはエステルを用いて、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止すること、線維素生成疾患を処置すること、生物学的試料の酸化を減少させること、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することに関する。
【解決手段】本発明は、インドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）またはそれらの塩もしくはエステルを用いて、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止すること、線維素生成疾患を処置すること、生物学的試料の酸化を減少させること、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインドール−３−プロピオン酸の使用に関するものであり、より具体的にはアミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止するために、線維素生成疾患を処置するために、生物学的試料の酸化を減少させるために、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置するために、インドール−３−プロピオン酸を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
６５歳より上のヒトの１０パーセントは軽度から重度の痴呆を有すると見積もられている。アルツハイマー病（「ＡＤ」）は慢性的な痴呆の最も一般的な原因であり、米国の２百万人のヒトがその疾患を患っている。この疾患はかっては中年の病気であると考えられてきたが、アルツハイマー病の組織病理学的病変（すなわち、神経炎アミロイドプラーク、神経原線維変性および顆粒空胞ニューロン変性）は痴呆の老人の脳にも見られることが現在分かっている。それらの病変の数は知力の低下の程度と相関関係にある。この高い羅患率は人口における年配者の割合が増加する速度と合わせて、痴呆（および特に痴呆）を最も重要な現代の社会的健康問題の一つにしている。
【０００３】
大脳アミロイド沈着はアルツハイマー病の主要な神経病理学上のマーカーである。そのアミロイドは４０〜４２個のアミノ酸ペプチドからなり、このものはアミロイドベータタンパク質（「Ａβ」）と呼ばれる（グレナー（Ｇｌｅｎｎｅｒ）およびワング（Ｗｏｎｇ）により１９８４）。ＡＤにおけるアミロイド沈着物は主に老人班の成分として見出され、そして中枢血管や髄膜血管の壁に見出される（ロバキス（Ｒｏｂａｋｉｓ）およびパンガロス（Ｐａｎｇａｌｏｓ）により１９９４）。
【０００４】
分子クローニングにより、Ａβはより大きなアミロイド前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）の小領域を含むことが示されている（ロバキスらにより１９８７；ワイドマン（Ｗｉｄｅｍａｎｎ）らにより１９８９）。要するに、このものは大きな細胞質外部分、より小さい細胞質内領域および単一の膜貫通ドメインを有するＩ型の内在性膜糖タンパク質である。ＡＰＰは、そのＮ−末端部の分泌前に（サムバムルチ（Ｓａｍｂａｍｕｒｔｉ）らにより１９９２；ロバキスおよびパンガロスにより１９９４）、広範囲な翻訳後修飾を受ける（パッポラ（Ｐａｐｐｏｌｌａ）およびロバキスにより１９９５；ロバキスおよびパンガロスにより１９９４）。ＡＰＰの生理的プロセシングは、未同定の酵素、α−セクレターゼによるＡβ配列内の切断を含む（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らにより１９９１）。より少量のＡＰＰ分子はアミロイド性分泌型ＡＰＰまたは膜結合型ＡＰＰを潜在的に産生できる他の２つの部位で切断される（ロバキスおよびパンガロスにより１９９４）。正常な細胞代謝の間に、Ａβも産生される（ハス（Ｈａａｓｓらにより１９９２；ショージ（Ｓｈｏｊｉ）らにより１９９２）。
【０００５】
アミロイドがＡＤを引き起こすかどうかについてはいくつかの論争があるが、主に３方向の証拠がそれらアミロイド仮説を強化している。第１の証拠は、ＡＰＰ遺伝子内でいくつかの点突然変異体が同定されることで示される。これらの変異体は家族性障害を患っている患者のサブグループに限られており、従ってＡＰＰ遺伝子とＡＤとの病原論上の関連が示唆されている（シャルティエ（Ｃｈａｒｔｉｅｒ）−ハーリン（Ｈａｒｌｉｎ）らにより１９９１；ケネディー（Ｋｅｎｎｅｄｙ）らにより１９９３）。第２の証拠として、アミロイドの一次的な沈着は神経原線維の変化の発生前に起こり（パッポラ（Ｐａｐｐｏｌｌａ）らにより１９９６）、この観察はアミロイドとニューロン変性の関連とも一致する。最後の証拠として、Ａβはニューロンに対して毒性であること（ヤンクナー（Ｙａｎｋｎｅｒ）らにより１９９０；ベール（Ｂｅｈｌ）らにより１９９２；ベールらにより１９９４；チャン（Ｚｈａｎｇ）らにより１９９４）、アミロイドペプチドがＡＤにおけるニューロンの病状の原因となり得るという仮説を強化するという発見がこれまでに示されている。
【０００６】
Ａβが神経毒性を有しているという発見は、アミロイド蓄積と神経変性との関連性があり得ることを示している。老化とＡＤとの密接な関連性、および両状態の神経病理学上の類似のため、酸化ストレスはＡＤ病変の病因に役割を果たしていると提案された。
【０００７】
何人かの研究者により、酸素フリーラジカル（「ＯＦＲｓ」）がＡβの細胞毒性に関連することが実証されている（ベール（Ｂｅｈｌ）により１９９２；ベールによる１９９４；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）らにより１９９５；バターフィールド（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ）らにより１９９４；グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびマトソン（Ｍａｔｔｓｏｎ）により１９９４）。酸化性傷害のマーカーはＡＤの神経病理学上の病変と局所解剖的に関連しているので、それらの発見は重要である（パッポラらにより１９９２；フルタらにより１９９５；スミスらにより１９９５；パッポラらにより１９９６）。これらの観察のため、抗酸化剤はＡＤの強力な治療剤として提案されている（マトソンにより１９９４；ヘンスリー（Ｈｅｎｓｌｅｙ）らにより１９９４；パッポラらにより１９９６）。
【０００８】
ＡＤおよび他の線維素生成疾患を処置する方法についての要求はなお続いてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【表１】
【表２】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止すること、線維素生成疾患を処置すること、生物学的試料の酸化を減少させること、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを用いて、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止すること、線維素生成疾患を処置すること、生物学的試料の酸化を減少させること、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のインドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）またはそれらの塩もしくはエステルを使用することにより、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止し、線維素生成疾患を処置し、生物学的試料の酸化を減少させ、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はＡβ(２５〜３５)のみに曝露させるか、またはＩＰＡもしくはＰＢＮと同時に曝露させたＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽腫細胞を用いた場合の、パーセントで表わす生存度を示す棒グラフである。
【図２】図２はＡβ(２５〜３５)のみに曝露させるか、またはＩＰＡもしくはＰＢＮと同時に曝露させたＰＣ１２ラットフェオクロモチトーム細胞を用いた場合の、パーセントで表わす生存度を示す棒グラフである。
【図３】図３はＡβ(１〜４２)のみに曝露させるか、またはＩＰＡもしくはＰＢＮと同時に曝露させたＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽腫細胞を用いた場合の、パーセントで表わす生存度を示す棒グラフである。
【図４】図４はアミロイドペプチドＡβ(１〜４２)もしくはＤＤＴＣのみに曝露させるか、またはそれぞれをＩＰＡと一緒に曝露させることによって誘発される脂質過酸化の程度（ＭＤＡを測定）を示す棒グラフである。
【図５】図５はＤＤＴＣによるスーパーオキシドジスムターゼの阻害によって誘発されるＰＣ１２ラット神経芽腫細胞の細胞死を防止することによる、ＩＰＡの抗酸化剤的活性を示す棒グラフである。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、２４時間（図６Ａ）および４８時間（図６Ｂ）、Ａβ(１〜４０)をインキュベーションした時のβシート形成に及ぼすＩＰＡの影響を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の要約）
本発明は細胞に及ぼすアミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止する方法に関する。その方法はその細胞を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルと接触させることを含む。
【００１５】
本発明は更に、ヒトの被験者の線維素生成疾患を処置する方法に関する。その方法はヒトの被験者に、線維素生成を抑制するかまたは後退させるのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む。
【００１６】
本発明は生物学的試料における酸化を減少させる方法にも関する。その方法はその生物学的試料を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルと接触させる方法を含む。
【００１７】
本発明はより更に、フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たす疾患または他の病気を処置する方法に関する。その方法はヒトの被験者に、それらの疾患または病気を処置するのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む。
【００１８】
（詳細な説明）
本発明は、天然の化合物であるインドール−３−プロピオン酸（「ＩＰＡ」）は細胞に及ぼすアミロイドβタンパク質の細胞毒性の影響を防止するのに特に有用であり、いずれかの線維素生成疾患を処置するのに特に有用であり、且つ細胞を酸化性損傷から保護するのに特に有用であると言う性質を合わせて有しているという発見に基づいている。従って、本発明の化合物はアルツハイマー疾患および他の線維素生成疾患（例えば、プリオン−関連の疾患が挙げられるが、これに限定しない）の強力な治療剤である。そのものは、フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている他の疾患の処置についての治療剤としても使用できる。これらの病気としてはパーキンソン病、レビー小体型痴呆、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻酔、他の種類のアミロイドーシス、発作、アテローム硬化症、気腫およびいくつかの種類の癌を含む。更に、データはＩＰＡも抗線維素生成活性をも有することを示す。
【００１９】
本発明は、細胞に及ぼすアミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止する方法を提供する。その方法は、それらの細胞を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルに曝露させることを含む。
【００２０】
本明細書で使用する「アミロイドベータタンパク質」（「Ａβ」）とは、アルツハイマー病（「ＡＤ」）の主要な神経病理学的マーカーである大脳アミロイドを構成する４０〜４２個のアミノ酸のペプチドを意味し、そして細胞に対して細胞毒性の影響を引き起こすことができるＡβのフラグメントを意味する。例えば、それらＡβフラグメントの１つはＡβの２５〜３５アミノ酸残基よりなるフラグメントである（グレナー（Ｇｌｅｎｎｅｒ）およびワング（Ｗｏｎｇ）による、Ａβの完全アミノ酸配列（ｆｕｌｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａβ）１９８４を参照、これは本明細書の一部を構成する）。
【００２１】
本明細書で使用するインドール−３−プロピオン酸とは、式
【化１】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は水素、置換アルキル基、無置換アルキル基、置換アリール基、無置換アリール基、アルコキシ基、置換または無置換アミノ基、チオール基、アルキルチオ基、アリールチオ基などからなる群から独立に選ばれる］
を有する化合物を含むことを意味する。Ｒ5およびＲ6は水素が好ましい。適当なインドール−３−プロピオン酸の一例は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6の各々が水素である上記の式を有するインドール−３−プロピオン酸である。好ましい置換基は、抗酸化性および抗線維素生成性質に有意に影響を及ぼさない基であり、これについては以下でより詳細に記載する。他の好ましい置換基は脳への浸透を増大させる基であり、例えば共有結合した親油性部分である。これらの置換基は利用可能な水素原子を有するインドール核のいずれかの原子上に存在してもよい。親油性部分の結合様式は重要ではなく、このものは炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−窒素結合または炭素−硫黄結合によって与えられる。しかしながら、得られた化合物の親油性を最大限とするには、極性が最少限となるような結合が与えられることが好ましい。従って、親油性部分は炭素−炭素結合で結合することが好ましい。それら親油性部分とは炭化水素（例えば５〜２０個の炭素原子を有するアルキル基）であってもよい。これらのアルキル基は無置換であってもよく（例えば、ヘキシルまたはドデシル）、または置換アルキル基がベンジル基またはフェニルエチル基である場合のように、例えばアリール部分等で置換されていてもよい。或いは、親油性部分は置換または無置換のホモサイクリック環（例えば、フェニル基またはトリル基）、ホモサイクリック環系、ヘテロサイクリック環、ヘテロサイクリック環系、または多環性の親油性「かご状」部分（例えば、アダマンタン）であってもよい。特に、多環「かご状」化合物を用いることは特に有利である（ツヅキ（Ｔｓｕｚｕｋｉ）により１９９１）。
【００２２】
いくつかのインドール−３−プロピオン酸は商業的に入手可能である。他のものはインドール−３−プロピオン酸の製造についての従来法の改変によって製造可能であり、その従来法としては例えばジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびクロスビー（Ｃｒｏｓｂｙ）による１９６９の文献、および米国特許第５,３００,５０６号、米国特許第５,０７７,２９３号および特開平３,１２７,７３２号（これらは本明細書の一部を構成する）が挙げられる。
【００２３】
上で示す通り、本発明は上記のインドール−３−プロピオン酸の塩を用いても行なうことができる。適当な塩としては、例えば医薬的に許容し得る塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩およびアンモニウム塩）を含む。インドール−３−プロピオン酸の塩は、その酸の水溶液または分散したものを適当な塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウム）と混合することによって、対応するインドール−３−プロピオン酸から従来の方法によって製造可能である。
【００２４】
加えて、上でも示した通り、本発明は上記のインドール−３−プロピオン酸のエステルを用いて行なうことができる。それらエステルの例としては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ベンジルエステルなどを含む。例えば、上に記載の親油性エステル部分を持つインドール−３−プロピオン酸エステルは、インドール−３−プロピオン酸エステルの脳への浸透を増大させるのに有利に使用することもできる。インドール−３−プロピオン酸エステルは、当該分野の当業者にとって知られた様々な方法によって、それらに対応する酸または塩から製造することができ、例えば、まずそれらの酸を酸クロリドに変換し、次いでその酸クロリドを適当なアルコールと反応させることによって製造することができる。エステルを製造するための他の適当な方法については、ケンプ（Ｋｅｍｐ）およびベラシオ（Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ）により１９８０に記載されている。
【００２５】
インドール−３−プロピオン酸、それらの塩またはエステルは、抗酸化性および／または抗線維素発生性質を有し、および／またはＡβの細胞毒性の影響を防止するものが好ましい。様々なインドール−３−プロピオン酸、その塩およびエステルは、Ａβの細胞毒性の影響を防止する機能が保持されていることを確認するために、本明細書に開示の方法を用いて容易にアッセイすることができ、それらのアッセイとしては例えば、細胞の生存度、脂質過酸化、細胞内Ｃａ2+および酸素フリーラジカルについてのアッセイが挙げられる。細胞に及ぼすＡβの他の細胞毒性の影響の防止としては、例えば膜の水ぶくれ、細胞収縮、染色質の異常な分布および核崩壊の防止を容易に顕微鏡観察することができる。様々なインドール−３−プロピオン酸による抗酸化性効果および抗線維素生成効果は従来の方法（例えば、本出願の実施例に記載の方法）によってアッセイすることができる。
【００２６】
上で示したように、Ａβの細胞毒性上の影響または細胞殺傷上の影響は、例えば細胞の生存度の減少（すなわち、細胞死）、脂質過酸化の増加（酸素フリーラジカルの増加の指標）、細胞内のＣａ2+レベルの増加、分散した膜の水ぶくれ、細胞収縮、核膜に対する染色質の異常分布および核崩壊を含む。
【００２７】
Ａβの細胞毒性の影響は、ニューロン細胞（中枢神経系および末梢神経系の細胞を含む）で最も容易に見られ、そして線維素生成疾患（例えば、アルツハイマー病）を患っているヒトの被験者において最も容易に起こる。
【００２８】
Ａβの細胞毒性の影響を防止するためのインドール−３−プロピオン酸（またはそれらの塩もしくはエステル）の有効量は、当該分野で知られる従来の方法（例えば、以下に記載する用量−応答曲線の決定）によって容易に決めることができる。本発明に従って投与されるべきインドール−３−プロピオン酸（またはそれらの塩もしくはエステル）の実際の好ましい量は、インドール−３−プロピオン酸の具体的な形態（すなわち、塩、エステルもしくは酸）、製剤化された具体的な組成物および投与方法によって変わることは、認められるであろう。インドール−３−プロピオン酸（またはそれらの塩もしくはエステル）の作用を改変し得る多数の因子が当業者によって考慮され、それらの因子としては例えば、体重、性別、規定食、投与時間、投与経路、排泄の割合、被験者の体調、薬物の組み合わせ、および反応感度や激烈が挙げられる。投与は、最大許容用量の範囲内で連続してまたは周期的に行なうことができる。ある病気の組に対する最適な投与の割合は、従来の用量投与試験を用いて当業者によって確かめられることができる。
【００２９】
本発明はヒトの被験者の線維素生成疾患を処置する方法を更に提供する。その方法は、線維素生成を抑制するかまたは後退させる（すなわち、線維素原の生成を抑制するかまたは後退させる）のに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む。本明細書で使用する「線維素生成疾患」とは望ましくない線維素原（フィブリル）の沈積を伴ういずれかの疾患または病気を含むことを意味する。非限定的な例として、それらの病気または疾患はアミロイドまたはアミロイド様沈積物の異常な生成から生じる障害または病気を含み、例えばプリオン関連のエンセファロパシー、アルツハイマー痴呆またはアルツハイマー病（「ＡＤ」）および他のアミロイドーシス障害を含むが、これらに限定されない。プリオン関連のエンセファロパシーの例としては、ヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病（「ＣＪＤ」）およびゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（「ＧＳＳ」）、羊やヤギのスクラピーおよび蓄牛の海綿上脳症を含む。
【００３０】
本発明はフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置する方法を更に提供する。その方法は、それらの疾患または病気を処置するのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む。フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または病気としては、パーキンソン病、レビー小体型痴呆、筋萎縮性側索痴呆、進行性核上麻痺、気腫および他の種類の癌を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
インドール−３−プロピオン酸並びにそれらの塩およびエステルは、アミロイドベータタンパク質が細胞に及ぼす細胞毒性の影響を防止するのと同様に、フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置するのに有効であるので、これらの化合物はアミロイドベータタンパク質が関与する疾患（例えば、ＡＤ）を処置するのに特に有用であると期待される。
【００３２】
インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルに関する全ての指示として、適当な用量については上述の通りであり、そして適当な投与経路については全身投与（特に、用いたインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルが血液脳関門を越える場合）を含む。全身投与としては、以下で更に詳細に述べる通り、非経口投与および経口投与を含む。
【００３３】
インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルは、単独で投与するかまたは組成物として適合し得る担体と一緒に投与することができる。適合し得る担体としては、例えば適当な医薬的担体または希釈剤を含む。それらの希釈剤成分または担体成分は、本発明で使用するインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの治療学的効果を低下させないように、選択すべきである。
【００３４】
それらの組成物は望む用途（例えば経口投与、非経口投与または局所投与）に適したいずれかの適当な形態に調剤することができる。経口用途に適当な用量形態は、錠剤、分散させた粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤および皮膚パッチ剤を含む。錠剤のための不活性な希釈剤および担体は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトースおよびタルクを含む。錠剤は顆粒化剤および崩壊剤（例えば、デンプンおよびアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンおよびアカシア）および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびタルク）を含んでもよい。錠剤はコーティングしないか、または崩壊および吸収を遅延させるために公知の技術によってコーティングしてもよい。カプセル剤で使用し得る不活性な希釈剤および担体としては、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムおよびカオリンを含む。懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤は従来の賦形剤（例えば、セルロースメチル、トラガカント、アルギン酸ナトリウム）；湿潤剤（例えば、レシチンおよびポリオキシエチレンステアレート）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル）を含んでもよい。
【００３５】
非経口投与に適当な用量形態としては、溶液剤、懸濁剤、分散剤、乳化剤などを含む。それらは減菌した固体の組成物の形態で製造して、使用する直前に減菌した注射可能な媒質中に溶解するかまたは懸濁してもよい。それらは当該分野で公知の懸濁化剤または分散化剤を含有してもよい。非経口投与の例としては、心室内投与、大脳内投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹膜内投与、直腸投与および皮下投与が挙げられる。
【００３６】
本発明は生物学的試料の酸化を減少させる方法にも関する。この方法を用いて減少させることのできる酸化の種類としては例えば、酸素フリーラジカルプロセスによって媒介される脂質過酸化および酸化を含む。生物学的試料としては、例えば細胞または細胞の群（例えば、組織）であってもよい。それら生物学的試料を上で記載したようなインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルと接触させる。接触はいずれかの適当な方法を用いて行なうことができる。例えば、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルは、生物学的試料の周辺にある細胞外環境にまで運搬され得る。或いは、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルは、例えば微量注入によって細胞へ直接に導入することができる。インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの酸化プロセスを減少させるのに有効な量は従来法によって決めることができ、それらの方法としては例えば様々な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを運搬し、そして酸化の生成物（例えば、酸素フリーラジカル）または脂質過酸化の生成物の濃度を追跡することが挙げられる。
【００３７】
（実施例）
本発明は、以下に示す非限定的な例により一層理解されるであろう。
【実施例１】
【００３８】
試験は、ＩＰＡがアルツハイマーアミロイドペプチド（「Ａβ」）に対する神経保護活性を有するか否かを調べるために行なった。この４０〜４３アミノ酸ペプチドの広範囲での大脳沈積は、アルツハイマー病におけるニューロンの広範囲な変性およびニューロンの死を引き起こす。
【００３９】
Ａβの細胞毒性の影響に対するＩＰＡの細胞保護作用を示す目的で、ヒトの神経芽細胞系ＳＫ−Ｎ−ＳＨの細胞を用いた。これらの細胞を、５０μＭのＡβ（２５〜３５）に、Ａβの活性な毒性フラグメント（ヤンクナー（Ｙａｎｋｎｅｒ）らにより１９９０）に、５０μＭのＩＰＡと共に、またはＩＰＡなしに曝露させた。コントロールとして、その実験をＡβなしで繰り返した。正のコントロールとしては、ＩＰＡの代わりに公知の抗酸化剤、フェニル−Ｎ−ｔ−ブチルニトロン（「ＰＢＮ」）を用いた。
【００４０】
その結果を図１に示すが、その図の棒グラフはパーセントで表わす生存度を示す。Ａβのみでは細胞に対して著しい細胞毒性の影響を有するが、ＩＰＡおよびＰＢＮは共に強力な保護的活性を有する。
【実施例２】
【００４１】
実施例１の実験を、ＰＣ１２ラットクロム親和性細胞腫細胞を用いて繰り返した。その結果を図２に示すが、その結果は図１に示した結果と本質的に同一である。
【実施例３】
【００４２】
実施例１の実験を、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細胞腫細胞系を用いたＡβ(１〜４２)ペプチドを用いて繰り返した。その結果を図３に示すが、その結果は実施例１について示した結果と一致する。
【実施例４】
【００４３】
ＩＰＡの細胞保護の性質は少なくとも部分的には抗酸化剤活性の結果であるという可能性を調べるために、Ａβまたは酸化ストレスに曝露させたＰＣ１２細胞中におけるマロン酸ジアルデヒド（「ＭＤＡ」）のレベル、脂質過酸化のマーカーを調べた。細胞をジエチルジチオカルボネート（「ＤＤＴＣ」）、スーパーオキシドジスムターゼ阻害剤およびある決まった酸化性損傷のモデルに曝露させることによって、酸化ストレスをかけた。ＰＣ１２細胞を、アミロイドペプチドのみに曝露させるか、またはＩＰＡと一緒にアミロイドペプチドに曝露させた。他の実験では、細胞をＤＤＴＣのみに曝露させるか、またはＩＰＡと一緒にＤＤＴＣに曝露させた。その結果を図４に示す。ＩＰＡは処置した細胞中でのマロン酸ジアルデヒドの産生を有意に減少させることが見られ、このことはＩＰＡが抗酸化剤活性を有することを示している。図４はＩＰＡについての神経保護活性および抗酸化剤活性の両方を示す。
【実施例５】
【００４４】
実施例４で見られた観察を更に確認するために、我々はＩＰＡが酸化ストレス（ＤＤＴＣ）に曝露させた細胞の死を防止するのに有効であるかどうかを調べた。ＰＣ１２神経芽細胞腫の細胞を様々な量のＤＤＴＣで、様々な量のＩＰＡと共にまたはＩＰＡなしに処理した。その結果を図５に示す。ＩＰＡの抗酸化剤活性は、ＤＤＴＣによるスーパーオキシドジスムターゼの阻害によって誘発される神経芽細胞腫細胞の細胞死を防止することによって示される。このことは、ＩＰＡがＤＤＴＣに曝露させた細胞の生存率を増加するという先に得られたデータと一致する。
【実施例６】
【００４５】
ＩＰＡがＡβ線維素生成に影響を及ぼすかどうかを決定するために、１５０μＭのＡβ（１〜４０）を超純水（すなわち、蒸留し、ろ過し且つ減菌した水）にｐＨ７で溶解させた３００μＭのＩＰＡおよび塩化ナトリウムと一緒にインキュベートした。コントロールとして、その超純水を用いて等量の塩化ナトリウムを含有するＩＰＡを溶解させ、このものを１５０μＭのＡβ（１〜４０）にｐＨ７で加えた。１つの実験においては、その溶液（すなわち、ＩＰＡ含有溶液およびコントロール溶液）を２４時間インキュベートした。第２の実験では、よれらの各溶液を４８時間インキュベートした。各インキュベーションの期間の最後に、２μＭのチオフラビンＴを含有する５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.２）を各試料（５μＬ）に加えて、最終的な量を２ｍＬとした。βシート形成の直接的な尺度である蛍光を、日立Ｆ−２０００蛍光分光計を用いて、励起波長４３５ｎｍで、発光波長４８５ｎｍで測定した。各条件につき３つの試料の平均の標準偏差を決定し、その結果を図６Ａ（インキュベーションを２４時間）および図６Ｂ（インキュベーションを４８時間）に示す（棒グラフとして）。２４時間および４８時間インキュベーションした実験の両方において、蛍光量はコントロール（標識したＡβ）と比べて、ＩＰＡ含有試料（標識したＡβ＋ＩＰＡ）の場合には有意に低い。このことは、コントロールと比べてＩＰＡ含有試料の場合にはβシート形成が起こりにくいことを示し、言いかえればＩＰＡが抗線維素生成であることを示す。
【００４６】
好ましい実施態様を本明細書で詳細に示し且つ記載してきたが、様々な改良、追加、置換などを本発明の精神から逸脱せずに行なうことができ、従ってそれらは特許請求の範囲に記載する本発明の範囲内であるとみなされることは、当該分野の当業者にとって明らかであろう。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のインドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）またはそれらの塩もしくはエステルの使用により、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止し、線維素生成疾患を処置し、生物学的試料の酸化を減少させ、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することができるため、工業的利用価値が高い。
【技術分野】
【０００１】
本発明はインドール−３−プロピオン酸の使用に関するものであり、より具体的にはアミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止するために、線維素生成疾患を処置するために、生物学的試料の酸化を減少させるために、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置するために、インドール−３−プロピオン酸を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
６５歳より上のヒトの１０パーセントは軽度から重度の痴呆を有すると見積もられている。アルツハイマー病（「ＡＤ」）は慢性的な痴呆の最も一般的な原因であり、米国の２百万人のヒトがその疾患を患っている。この疾患はかっては中年の病気であると考えられてきたが、アルツハイマー病の組織病理学的病変（すなわち、神経炎アミロイドプラーク、神経原線維変性および顆粒空胞ニューロン変性）は痴呆の老人の脳にも見られることが現在分かっている。それらの病変の数は知力の低下の程度と相関関係にある。この高い羅患率は人口における年配者の割合が増加する速度と合わせて、痴呆（および特に痴呆）を最も重要な現代の社会的健康問題の一つにしている。
【０００３】
大脳アミロイド沈着はアルツハイマー病の主要な神経病理学上のマーカーである。そのアミロイドは４０〜４２個のアミノ酸ペプチドからなり、このものはアミロイドベータタンパク質（「Ａβ」）と呼ばれる（グレナー（Ｇｌｅｎｎｅｒ）およびワング（Ｗｏｎｇ）により１９８４）。ＡＤにおけるアミロイド沈着物は主に老人班の成分として見出され、そして中枢血管や髄膜血管の壁に見出される（ロバキス（Ｒｏｂａｋｉｓ）およびパンガロス（Ｐａｎｇａｌｏｓ）により１９９４）。
【０００４】
分子クローニングにより、Ａβはより大きなアミロイド前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）の小領域を含むことが示されている（ロバキスらにより１９８７；ワイドマン（Ｗｉｄｅｍａｎｎ）らにより１９８９）。要するに、このものは大きな細胞質外部分、より小さい細胞質内領域および単一の膜貫通ドメインを有するＩ型の内在性膜糖タンパク質である。ＡＰＰは、そのＮ−末端部の分泌前に（サムバムルチ（Ｓａｍｂａｍｕｒｔｉ）らにより１９９２；ロバキスおよびパンガロスにより１９９４）、広範囲な翻訳後修飾を受ける（パッポラ（Ｐａｐｐｏｌｌａ）およびロバキスにより１９９５；ロバキスおよびパンガロスにより１９９４）。ＡＰＰの生理的プロセシングは、未同定の酵素、α−セクレターゼによるＡβ配列内の切断を含む（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らにより１９９１）。より少量のＡＰＰ分子はアミロイド性分泌型ＡＰＰまたは膜結合型ＡＰＰを潜在的に産生できる他の２つの部位で切断される（ロバキスおよびパンガロスにより１９９４）。正常な細胞代謝の間に、Ａβも産生される（ハス（Ｈａａｓｓらにより１９９２；ショージ（Ｓｈｏｊｉ）らにより１９９２）。
【０００５】
アミロイドがＡＤを引き起こすかどうかについてはいくつかの論争があるが、主に３方向の証拠がそれらアミロイド仮説を強化している。第１の証拠は、ＡＰＰ遺伝子内でいくつかの点突然変異体が同定されることで示される。これらの変異体は家族性障害を患っている患者のサブグループに限られており、従ってＡＰＰ遺伝子とＡＤとの病原論上の関連が示唆されている（シャルティエ（Ｃｈａｒｔｉｅｒ）−ハーリン（Ｈａｒｌｉｎ）らにより１９９１；ケネディー（Ｋｅｎｎｅｄｙ）らにより１９９３）。第２の証拠として、アミロイドの一次的な沈着は神経原線維の変化の発生前に起こり（パッポラ（Ｐａｐｐｏｌｌａ）らにより１９９６）、この観察はアミロイドとニューロン変性の関連とも一致する。最後の証拠として、Ａβはニューロンに対して毒性であること（ヤンクナー（Ｙａｎｋｎｅｒ）らにより１９９０；ベール（Ｂｅｈｌ）らにより１９９２；ベールらにより１９９４；チャン（Ｚｈａｎｇ）らにより１９９４）、アミロイドペプチドがＡＤにおけるニューロンの病状の原因となり得るという仮説を強化するという発見がこれまでに示されている。
【０００６】
Ａβが神経毒性を有しているという発見は、アミロイド蓄積と神経変性との関連性があり得ることを示している。老化とＡＤとの密接な関連性、および両状態の神経病理学上の類似のため、酸化ストレスはＡＤ病変の病因に役割を果たしていると提案された。
【０００７】
何人かの研究者により、酸素フリーラジカル（「ＯＦＲｓ」）がＡβの細胞毒性に関連することが実証されている（ベール（Ｂｅｈｌ）により１９９２；ベールによる１９９４；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）らにより１９９５；バターフィールド（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ）らにより１９９４；グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびマトソン（Ｍａｔｔｓｏｎ）により１９９４）。酸化性傷害のマーカーはＡＤの神経病理学上の病変と局所解剖的に関連しているので、それらの発見は重要である（パッポラらにより１９９２；フルタらにより１９９５；スミスらにより１９９５；パッポラらにより１９９６）。これらの観察のため、抗酸化剤はＡＤの強力な治療剤として提案されている（マトソンにより１９９４；ヘンスリー（Ｈｅｎｓｌｅｙ）らにより１９９４；パッポラらにより１９９６）。
【０００８】
ＡＤおよび他の線維素生成疾患を処置する方法についての要求はなお続いてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【表１】
【表２】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止すること、線維素生成疾患を処置すること、生物学的試料の酸化を減少させること、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを用いて、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止すること、線維素生成疾患を処置すること、生物学的試料の酸化を減少させること、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のインドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）またはそれらの塩もしくはエステルを使用することにより、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止し、線維素生成疾患を処置し、生物学的試料の酸化を減少させ、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はＡβ(２５〜３５)のみに曝露させるか、またはＩＰＡもしくはＰＢＮと同時に曝露させたＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽腫細胞を用いた場合の、パーセントで表わす生存度を示す棒グラフである。
【図２】図２はＡβ(２５〜３５)のみに曝露させるか、またはＩＰＡもしくはＰＢＮと同時に曝露させたＰＣ１２ラットフェオクロモチトーム細胞を用いた場合の、パーセントで表わす生存度を示す棒グラフである。
【図３】図３はＡβ(１〜４２)のみに曝露させるか、またはＩＰＡもしくはＰＢＮと同時に曝露させたＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽腫細胞を用いた場合の、パーセントで表わす生存度を示す棒グラフである。
【図４】図４はアミロイドペプチドＡβ(１〜４２)もしくはＤＤＴＣのみに曝露させるか、またはそれぞれをＩＰＡと一緒に曝露させることによって誘発される脂質過酸化の程度（ＭＤＡを測定）を示す棒グラフである。
【図５】図５はＤＤＴＣによるスーパーオキシドジスムターゼの阻害によって誘発されるＰＣ１２ラット神経芽腫細胞の細胞死を防止することによる、ＩＰＡの抗酸化剤的活性を示す棒グラフである。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、２４時間（図６Ａ）および４８時間（図６Ｂ）、Ａβ(１〜４０)をインキュベーションした時のβシート形成に及ぼすＩＰＡの影響を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の要約）
本発明は細胞に及ぼすアミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止する方法に関する。その方法はその細胞を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルと接触させることを含む。
【００１５】
本発明は更に、ヒトの被験者の線維素生成疾患を処置する方法に関する。その方法はヒトの被験者に、線維素生成を抑制するかまたは後退させるのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む。
【００１６】
本発明は生物学的試料における酸化を減少させる方法にも関する。その方法はその生物学的試料を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルと接触させる方法を含む。
【００１７】
本発明はより更に、フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たす疾患または他の病気を処置する方法に関する。その方法はヒトの被験者に、それらの疾患または病気を処置するのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む。
【００１８】
（詳細な説明）
本発明は、天然の化合物であるインドール−３−プロピオン酸（「ＩＰＡ」）は細胞に及ぼすアミロイドβタンパク質の細胞毒性の影響を防止するのに特に有用であり、いずれかの線維素生成疾患を処置するのに特に有用であり、且つ細胞を酸化性損傷から保護するのに特に有用であると言う性質を合わせて有しているという発見に基づいている。従って、本発明の化合物はアルツハイマー疾患および他の線維素生成疾患（例えば、プリオン−関連の疾患が挙げられるが、これに限定しない）の強力な治療剤である。そのものは、フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている他の疾患の処置についての治療剤としても使用できる。これらの病気としてはパーキンソン病、レビー小体型痴呆、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻酔、他の種類のアミロイドーシス、発作、アテローム硬化症、気腫およびいくつかの種類の癌を含む。更に、データはＩＰＡも抗線維素生成活性をも有することを示す。
【００１９】
本発明は、細胞に及ぼすアミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止する方法を提供する。その方法は、それらの細胞を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルに曝露させることを含む。
【００２０】
本明細書で使用する「アミロイドベータタンパク質」（「Ａβ」）とは、アルツハイマー病（「ＡＤ」）の主要な神経病理学的マーカーである大脳アミロイドを構成する４０〜４２個のアミノ酸のペプチドを意味し、そして細胞に対して細胞毒性の影響を引き起こすことができるＡβのフラグメントを意味する。例えば、それらＡβフラグメントの１つはＡβの２５〜３５アミノ酸残基よりなるフラグメントである（グレナー（Ｇｌｅｎｎｅｒ）およびワング（Ｗｏｎｇ）による、Ａβの完全アミノ酸配列（ｆｕｌｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａβ）１９８４を参照、これは本明細書の一部を構成する）。
【００２１】
本明細書で使用するインドール−３−プロピオン酸とは、式
【化１】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は水素、置換アルキル基、無置換アルキル基、置換アリール基、無置換アリール基、アルコキシ基、置換または無置換アミノ基、チオール基、アルキルチオ基、アリールチオ基などからなる群から独立に選ばれる］
を有する化合物を含むことを意味する。Ｒ5およびＲ6は水素が好ましい。適当なインドール−３−プロピオン酸の一例は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6の各々が水素である上記の式を有するインドール−３−プロピオン酸である。好ましい置換基は、抗酸化性および抗線維素生成性質に有意に影響を及ぼさない基であり、これについては以下でより詳細に記載する。他の好ましい置換基は脳への浸透を増大させる基であり、例えば共有結合した親油性部分である。これらの置換基は利用可能な水素原子を有するインドール核のいずれかの原子上に存在してもよい。親油性部分の結合様式は重要ではなく、このものは炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−窒素結合または炭素−硫黄結合によって与えられる。しかしながら、得られた化合物の親油性を最大限とするには、極性が最少限となるような結合が与えられることが好ましい。従って、親油性部分は炭素−炭素結合で結合することが好ましい。それら親油性部分とは炭化水素（例えば５〜２０個の炭素原子を有するアルキル基）であってもよい。これらのアルキル基は無置換であってもよく（例えば、ヘキシルまたはドデシル）、または置換アルキル基がベンジル基またはフェニルエチル基である場合のように、例えばアリール部分等で置換されていてもよい。或いは、親油性部分は置換または無置換のホモサイクリック環（例えば、フェニル基またはトリル基）、ホモサイクリック環系、ヘテロサイクリック環、ヘテロサイクリック環系、または多環性の親油性「かご状」部分（例えば、アダマンタン）であってもよい。特に、多環「かご状」化合物を用いることは特に有利である（ツヅキ（Ｔｓｕｚｕｋｉ）により１９９１）。
【００２２】
いくつかのインドール−３−プロピオン酸は商業的に入手可能である。他のものはインドール−３−プロピオン酸の製造についての従来法の改変によって製造可能であり、その従来法としては例えばジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびクロスビー（Ｃｒｏｓｂｙ）による１９６９の文献、および米国特許第５,３００,５０６号、米国特許第５,０７７,２９３号および特開平３,１２７,７３２号（これらは本明細書の一部を構成する）が挙げられる。
【００２３】
上で示す通り、本発明は上記のインドール−３−プロピオン酸の塩を用いても行なうことができる。適当な塩としては、例えば医薬的に許容し得る塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩およびアンモニウム塩）を含む。インドール−３−プロピオン酸の塩は、その酸の水溶液または分散したものを適当な塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウム）と混合することによって、対応するインドール−３−プロピオン酸から従来の方法によって製造可能である。
【００２４】
加えて、上でも示した通り、本発明は上記のインドール−３−プロピオン酸のエステルを用いて行なうことができる。それらエステルの例としては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ベンジルエステルなどを含む。例えば、上に記載の親油性エステル部分を持つインドール−３−プロピオン酸エステルは、インドール−３−プロピオン酸エステルの脳への浸透を増大させるのに有利に使用することもできる。インドール−３−プロピオン酸エステルは、当該分野の当業者にとって知られた様々な方法によって、それらに対応する酸または塩から製造することができ、例えば、まずそれらの酸を酸クロリドに変換し、次いでその酸クロリドを適当なアルコールと反応させることによって製造することができる。エステルを製造するための他の適当な方法については、ケンプ（Ｋｅｍｐ）およびベラシオ（Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ）により１９８０に記載されている。
【００２５】
インドール−３−プロピオン酸、それらの塩またはエステルは、抗酸化性および／または抗線維素発生性質を有し、および／またはＡβの細胞毒性の影響を防止するものが好ましい。様々なインドール−３−プロピオン酸、その塩およびエステルは、Ａβの細胞毒性の影響を防止する機能が保持されていることを確認するために、本明細書に開示の方法を用いて容易にアッセイすることができ、それらのアッセイとしては例えば、細胞の生存度、脂質過酸化、細胞内Ｃａ2+および酸素フリーラジカルについてのアッセイが挙げられる。細胞に及ぼすＡβの他の細胞毒性の影響の防止としては、例えば膜の水ぶくれ、細胞収縮、染色質の異常な分布および核崩壊の防止を容易に顕微鏡観察することができる。様々なインドール−３−プロピオン酸による抗酸化性効果および抗線維素生成効果は従来の方法（例えば、本出願の実施例に記載の方法）によってアッセイすることができる。
【００２６】
上で示したように、Ａβの細胞毒性上の影響または細胞殺傷上の影響は、例えば細胞の生存度の減少（すなわち、細胞死）、脂質過酸化の増加（酸素フリーラジカルの増加の指標）、細胞内のＣａ2+レベルの増加、分散した膜の水ぶくれ、細胞収縮、核膜に対する染色質の異常分布および核崩壊を含む。
【００２７】
Ａβの細胞毒性の影響は、ニューロン細胞（中枢神経系および末梢神経系の細胞を含む）で最も容易に見られ、そして線維素生成疾患（例えば、アルツハイマー病）を患っているヒトの被験者において最も容易に起こる。
【００２８】
Ａβの細胞毒性の影響を防止するためのインドール−３−プロピオン酸（またはそれらの塩もしくはエステル）の有効量は、当該分野で知られる従来の方法（例えば、以下に記載する用量−応答曲線の決定）によって容易に決めることができる。本発明に従って投与されるべきインドール−３−プロピオン酸（またはそれらの塩もしくはエステル）の実際の好ましい量は、インドール−３−プロピオン酸の具体的な形態（すなわち、塩、エステルもしくは酸）、製剤化された具体的な組成物および投与方法によって変わることは、認められるであろう。インドール−３−プロピオン酸（またはそれらの塩もしくはエステル）の作用を改変し得る多数の因子が当業者によって考慮され、それらの因子としては例えば、体重、性別、規定食、投与時間、投与経路、排泄の割合、被験者の体調、薬物の組み合わせ、および反応感度や激烈が挙げられる。投与は、最大許容用量の範囲内で連続してまたは周期的に行なうことができる。ある病気の組に対する最適な投与の割合は、従来の用量投与試験を用いて当業者によって確かめられることができる。
【００２９】
本発明はヒトの被験者の線維素生成疾患を処置する方法を更に提供する。その方法は、線維素生成を抑制するかまたは後退させる（すなわち、線維素原の生成を抑制するかまたは後退させる）のに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む。本明細書で使用する「線維素生成疾患」とは望ましくない線維素原（フィブリル）の沈積を伴ういずれかの疾患または病気を含むことを意味する。非限定的な例として、それらの病気または疾患はアミロイドまたはアミロイド様沈積物の異常な生成から生じる障害または病気を含み、例えばプリオン関連のエンセファロパシー、アルツハイマー痴呆またはアルツハイマー病（「ＡＤ」）および他のアミロイドーシス障害を含むが、これらに限定されない。プリオン関連のエンセファロパシーの例としては、ヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病（「ＣＪＤ」）およびゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（「ＧＳＳ」）、羊やヤギのスクラピーおよび蓄牛の海綿上脳症を含む。
【００３０】
本発明はフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置する方法を更に提供する。その方法は、それらの疾患または病気を処置するのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む。フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または病気としては、パーキンソン病、レビー小体型痴呆、筋萎縮性側索痴呆、進行性核上麻痺、気腫および他の種類の癌を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
インドール−３−プロピオン酸並びにそれらの塩およびエステルは、アミロイドベータタンパク質が細胞に及ぼす細胞毒性の影響を防止するのと同様に、フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置するのに有効であるので、これらの化合物はアミロイドベータタンパク質が関与する疾患（例えば、ＡＤ）を処置するのに特に有用であると期待される。
【００３２】
インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルに関する全ての指示として、適当な用量については上述の通りであり、そして適当な投与経路については全身投与（特に、用いたインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルが血液脳関門を越える場合）を含む。全身投与としては、以下で更に詳細に述べる通り、非経口投与および経口投与を含む。
【００３３】
インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルは、単独で投与するかまたは組成物として適合し得る担体と一緒に投与することができる。適合し得る担体としては、例えば適当な医薬的担体または希釈剤を含む。それらの希釈剤成分または担体成分は、本発明で使用するインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの治療学的効果を低下させないように、選択すべきである。
【００３４】
それらの組成物は望む用途（例えば経口投与、非経口投与または局所投与）に適したいずれかの適当な形態に調剤することができる。経口用途に適当な用量形態は、錠剤、分散させた粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤および皮膚パッチ剤を含む。錠剤のための不活性な希釈剤および担体は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトースおよびタルクを含む。錠剤は顆粒化剤および崩壊剤（例えば、デンプンおよびアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンおよびアカシア）および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびタルク）を含んでもよい。錠剤はコーティングしないか、または崩壊および吸収を遅延させるために公知の技術によってコーティングしてもよい。カプセル剤で使用し得る不活性な希釈剤および担体としては、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムおよびカオリンを含む。懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤は従来の賦形剤（例えば、セルロースメチル、トラガカント、アルギン酸ナトリウム）；湿潤剤（例えば、レシチンおよびポリオキシエチレンステアレート）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル）を含んでもよい。
【００３５】
非経口投与に適当な用量形態としては、溶液剤、懸濁剤、分散剤、乳化剤などを含む。それらは減菌した固体の組成物の形態で製造して、使用する直前に減菌した注射可能な媒質中に溶解するかまたは懸濁してもよい。それらは当該分野で公知の懸濁化剤または分散化剤を含有してもよい。非経口投与の例としては、心室内投与、大脳内投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹膜内投与、直腸投与および皮下投与が挙げられる。
【００３６】
本発明は生物学的試料の酸化を減少させる方法にも関する。この方法を用いて減少させることのできる酸化の種類としては例えば、酸素フリーラジカルプロセスによって媒介される脂質過酸化および酸化を含む。生物学的試料としては、例えば細胞または細胞の群（例えば、組織）であってもよい。それら生物学的試料を上で記載したようなインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルと接触させる。接触はいずれかの適当な方法を用いて行なうことができる。例えば、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルは、生物学的試料の周辺にある細胞外環境にまで運搬され得る。或いは、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルは、例えば微量注入によって細胞へ直接に導入することができる。インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの酸化プロセスを減少させるのに有効な量は従来法によって決めることができ、それらの方法としては例えば様々な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを運搬し、そして酸化の生成物（例えば、酸素フリーラジカル）または脂質過酸化の生成物の濃度を追跡することが挙げられる。
【００３７】
（実施例）
本発明は、以下に示す非限定的な例により一層理解されるであろう。
【実施例１】
【００３８】
試験は、ＩＰＡがアルツハイマーアミロイドペプチド（「Ａβ」）に対する神経保護活性を有するか否かを調べるために行なった。この４０〜４３アミノ酸ペプチドの広範囲での大脳沈積は、アルツハイマー病におけるニューロンの広範囲な変性およびニューロンの死を引き起こす。
【００３９】
Ａβの細胞毒性の影響に対するＩＰＡの細胞保護作用を示す目的で、ヒトの神経芽細胞系ＳＫ−Ｎ−ＳＨの細胞を用いた。これらの細胞を、５０μＭのＡβ（２５〜３５）に、Ａβの活性な毒性フラグメント（ヤンクナー（Ｙａｎｋｎｅｒ）らにより１９９０）に、５０μＭのＩＰＡと共に、またはＩＰＡなしに曝露させた。コントロールとして、その実験をＡβなしで繰り返した。正のコントロールとしては、ＩＰＡの代わりに公知の抗酸化剤、フェニル−Ｎ−ｔ−ブチルニトロン（「ＰＢＮ」）を用いた。
【００４０】
その結果を図１に示すが、その図の棒グラフはパーセントで表わす生存度を示す。Ａβのみでは細胞に対して著しい細胞毒性の影響を有するが、ＩＰＡおよびＰＢＮは共に強力な保護的活性を有する。
【実施例２】
【００４１】
実施例１の実験を、ＰＣ１２ラットクロム親和性細胞腫細胞を用いて繰り返した。その結果を図２に示すが、その結果は図１に示した結果と本質的に同一である。
【実施例３】
【００４２】
実施例１の実験を、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細胞腫細胞系を用いたＡβ(１〜４２)ペプチドを用いて繰り返した。その結果を図３に示すが、その結果は実施例１について示した結果と一致する。
【実施例４】
【００４３】
ＩＰＡの細胞保護の性質は少なくとも部分的には抗酸化剤活性の結果であるという可能性を調べるために、Ａβまたは酸化ストレスに曝露させたＰＣ１２細胞中におけるマロン酸ジアルデヒド（「ＭＤＡ」）のレベル、脂質過酸化のマーカーを調べた。細胞をジエチルジチオカルボネート（「ＤＤＴＣ」）、スーパーオキシドジスムターゼ阻害剤およびある決まった酸化性損傷のモデルに曝露させることによって、酸化ストレスをかけた。ＰＣ１２細胞を、アミロイドペプチドのみに曝露させるか、またはＩＰＡと一緒にアミロイドペプチドに曝露させた。他の実験では、細胞をＤＤＴＣのみに曝露させるか、またはＩＰＡと一緒にＤＤＴＣに曝露させた。その結果を図４に示す。ＩＰＡは処置した細胞中でのマロン酸ジアルデヒドの産生を有意に減少させることが見られ、このことはＩＰＡが抗酸化剤活性を有することを示している。図４はＩＰＡについての神経保護活性および抗酸化剤活性の両方を示す。
【実施例５】
【００４４】
実施例４で見られた観察を更に確認するために、我々はＩＰＡが酸化ストレス（ＤＤＴＣ）に曝露させた細胞の死を防止するのに有効であるかどうかを調べた。ＰＣ１２神経芽細胞腫の細胞を様々な量のＤＤＴＣで、様々な量のＩＰＡと共にまたはＩＰＡなしに処理した。その結果を図５に示す。ＩＰＡの抗酸化剤活性は、ＤＤＴＣによるスーパーオキシドジスムターゼの阻害によって誘発される神経芽細胞腫細胞の細胞死を防止することによって示される。このことは、ＩＰＡがＤＤＴＣに曝露させた細胞の生存率を増加するという先に得られたデータと一致する。
【実施例６】
【００４５】
ＩＰＡがＡβ線維素生成に影響を及ぼすかどうかを決定するために、１５０μＭのＡβ（１〜４０）を超純水（すなわち、蒸留し、ろ過し且つ減菌した水）にｐＨ７で溶解させた３００μＭのＩＰＡおよび塩化ナトリウムと一緒にインキュベートした。コントロールとして、その超純水を用いて等量の塩化ナトリウムを含有するＩＰＡを溶解させ、このものを１５０μＭのＡβ（１〜４０）にｐＨ７で加えた。１つの実験においては、その溶液（すなわち、ＩＰＡ含有溶液およびコントロール溶液）を２４時間インキュベートした。第２の実験では、よれらの各溶液を４８時間インキュベートした。各インキュベーションの期間の最後に、２μＭのチオフラビンＴを含有する５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.２）を各試料（５μＬ）に加えて、最終的な量を２ｍＬとした。βシート形成の直接的な尺度である蛍光を、日立Ｆ−２０００蛍光分光計を用いて、励起波長４３５ｎｍで、発光波長４８５ｎｍで測定した。各条件につき３つの試料の平均の標準偏差を決定し、その結果を図６Ａ（インキュベーションを２４時間）および図６Ｂ（インキュベーションを４８時間）に示す（棒グラフとして）。２４時間および４８時間インキュベーションした実験の両方において、蛍光量はコントロール（標識したＡβ）と比べて、ＩＰＡ含有試料（標識したＡβ＋ＩＰＡ）の場合には有意に低い。このことは、コントロールと比べてＩＰＡ含有試料の場合にはβシート形成が起こりにくいことを示し、言いかえればＩＰＡが抗線維素生成であることを示す。
【００４６】
好ましい実施態様を本明細書で詳細に示し且つ記載してきたが、様々な改良、追加、置換などを本発明の精神から逸脱せずに行なうことができ、従ってそれらは特許請求の範囲に記載する本発明の範囲内であるとみなされることは、当該分野の当業者にとって明らかであろう。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のインドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）またはそれらの塩もしくはエステルの使用により、アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止し、線維素生成疾患を処置し、生物学的試料の酸化を減少させ、およびフリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置することができるため、工業的利用価値が高い。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に及ぼすアミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止する方法であって、その細胞を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルに細胞を曝露させることを含む方法。
【請求項２】
細胞毒性の影響は細胞死である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞毒性の影響は脂質過酸化の増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞毒性の影響は細胞内Ｃａ2+の増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞毒性の影響は酸素フリーラジカルの増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞はニューロン細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞はヒトの被験者に存在し、そしてその曝露がインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを全身投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞が線維素生成疾患を有するヒトの被験者に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヒトの被験者の線維素生成疾患を処置する方法であって、ヒトの被験者の線維素生成を防止するかまたは後退させるのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む方法。
【請求項１０】
全身投与を行なう、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
線維素生成疾患はアルツハイマー病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
線維素生成疾患はプリオン関連のエンセファロパシーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料の酸化を減少させる方法であって、その生物学的試料を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルと接触させることを含む方法。
【請求項１４】
生物学的試料は細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酸化を減少させることで脂質過酸化を減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
酸化を減少させることで酸素フリーラジカルを減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置する方法であって、それらの処置を必要とする患者にそれらの疾患または病気を処置するのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む方法。
【請求項１８】
全身投与を行なう、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
疾患または他の病気はパーキンソン病、レビー小体型痴呆、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、発作、アテローム硬化症、気腫および癌からなる群から選ばれるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響が関与した疾患の処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項２１】
線維素生成疾患の処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項２２】
アルツハイマー病、プリオン関連のエンセファロパシーまたはそれらの組み合わせの処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項２３】
フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気の処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項２４】
パーキンソン病、レビー小体型痴呆、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、発作、アテローム硬化症、気腫、癌またはそれらの組み合わせの処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項１】
細胞に及ぼすアミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響を防止する方法であって、その細胞を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルに細胞を曝露させることを含む方法。
【請求項２】
細胞毒性の影響は細胞死である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞毒性の影響は脂質過酸化の増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞毒性の影響は細胞内Ｃａ2+の増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞毒性の影響は酸素フリーラジカルの増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞はニューロン細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞はヒトの被験者に存在し、そしてその曝露がインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを全身投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞が線維素生成疾患を有するヒトの被験者に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヒトの被験者の線維素生成疾患を処置する方法であって、ヒトの被験者の線維素生成を防止するかまたは後退させるのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む方法。
【請求項１０】
全身投与を行なう、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
線維素生成疾患はアルツハイマー病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
線維素生成疾患はプリオン関連のエンセファロパシーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料の酸化を減少させる方法であって、その生物学的試料を有効量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルと接触させることを含む方法。
【請求項１４】
生物学的試料は細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酸化を減少させることで脂質過酸化を減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
酸化を減少させることで酸素フリーラジカルを減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気を処置する方法であって、それらの処置を必要とする患者にそれらの疾患または病気を処置するのに有効な量のインドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルを投与することを含む方法。
【請求項１８】
全身投与を行なう、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
疾患または他の病気はパーキンソン病、レビー小体型痴呆、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、発作、アテローム硬化症、気腫および癌からなる群から選ばれるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
アミロイドベータタンパク質の細胞毒性の影響が関与した疾患の処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項２１】
線維素生成疾患の処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項２２】
アルツハイマー病、プリオン関連のエンセファロパシーまたはそれらの組み合わせの処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項２３】
フリーラジカルおよび／または酸化ストレスが役割を果たしている疾患または他の病気の処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【請求項２４】
パーキンソン病、レビー小体型痴呆、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、発作、アテローム硬化症、気腫、癌またはそれらの組み合わせの処置における、インドール−３−プロピオン酸またはそれらの塩もしくはエステルの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１７３４３（Ｐ２０１２−１７３４３Ａ）
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２３０６３２（Ｐ２０１１−２３０６３２）
【出願日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【分割の表示】特願２０００−５３２１１８（Ｐ２０００−５３２１１８）の分割
【原出願日】平成１１年２月２３日（１９９９．２．２３）
【出願人】（５９４０６６２１３）サウス、アラバマ、メディカル、サイエンス、ファウンデーション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＵＴＨ ＡＬＡＢＡＭＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【出願人】（５９４０３２３２２）ニューヨーク・ユニバーシティ (34)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３０６３２（Ｐ２０１１−２３０６３２）
【出願日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【分割の表示】特願２０００−５３２１１８（Ｐ２０００−５３２１１８）の分割
【原出願日】平成１１年２月２３日（１９９９．２．２３）
【出願人】（５９４０６６２１３）サウス、アラバマ、メディカル、サイエンス、ファウンデーション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＵＴＨ ＡＬＡＢＡＭＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【出願人】（５９４０３２３２２）ニューヨーク・ユニバーシティ (34)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【Ｆターム（参考）】
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