【課題】ペプチド系医薬品の使用に於いて、その薬品の有効性を増強する為に、特にその血液中での循環半減期を延長されたペプチド系医薬品の提供。
【解決手段】腎臓から排出され、その元の形態においてＩgＧのＦc領域を含まないようなポリペプチドを、ＩgＧのＦc領域のサルベージレセプター結合エピトープを含み、それにより増加した循環半減期を有するように改変する。

【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の技術分野 本発明は、サルベージレセプター結合エピトープを含むように変異させたポリペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域由来のエピトープを有し、その結果として循環半減期が延長された、腎臓において排泄されるポリペプチドに関する。
【０００２】
関連する文献に関する記載 ある特異的レセプターが、ＩｇＧ分子を分解から保護する血管内空間との急速な平衡状態にあることが１９６４年に提唱された。ブランベルらのＮａｔｕｒｅ，２０３：１３５２〜１３５５（１９６４）。ブランベルのＴｈｅ Ｌａｎｓｅｔ．，１０８７〜１０９３（１９６５）も参照せよ。腎臓が免疫グロブリンフラグメントの異化作用の主要部位であり、その内因性異化作用のおよそ９０％に相当することがわかっている。ウォックナーらのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２６：２０７（１９６７）。レセプターの存在は、Ｉｇ分子が、このようなレセプターに結合しなければならない特異的な配列、あるいはコンホーメーション決定基をもつことを示唆するものである。タンパク質分解によって生成したＩｇＧのＦｃ領域は、無傷のＩｇＧ分子と同じ長さのインビボ半減期を有し、またＦａｂフラグメントは急速に分解するので（シュピーゲルバーグおよびウィーグルのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１：３２３〜３３８（１９６５）；ウォルドマンおよびゲティーの“免疫グロブリンの異化作用”，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１：１１８７〜１１９１，アカデミック・プレス，ニューヨーク（１９７１）；シュピーゲルバーグのＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｆ．Ｊ．ディクソンおよびＨ．Ｇ．キンケル編，アカデミック・プレス，ニューヨーク（１９７４），ｐ２５９〜２９４；およびスッキアーらのＳｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，１９：１６６〜１８６（１９８９））、マウスＩｇＧ2bの関連配列がＣＨ２またはＣＨ３ドメインに存在すること、および一つまたはその他のドメインの欠失によって急速な分解がもたらされるということが想定された。事実、Ｆｃフラグメントのトリプシン分解によって生成されたヒトＩｇＧのＣＨ２ドメインフラグメントは、ＦｃフラグメントまたはＩｇＧ分子が存続する間においてウサギの循環中に存続した；逆に、同様にＦｃフラグメントのトリプシン分解によって生成されたヒトＩｇＧのＣＨ３ドメイン（ｐＦｃ’）フラグメントは、急速に消失した。このことは、ＩｇＧの異化部位がＣＨ２ドメインにあることを示している。エラーソンらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１６：５１０（１９７６）；ヤスミーンらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１６：５１８（１９７６）。他の研究では、マウスのＩｇＧ2bおよびＩｇＧ2a抗体の異なる血管内半減期の決定においてＣＨ３ドメインの配列が重要であることが示された。ポロックらのＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２０２１〜２０２７（１９９０）。
【０００３】
高アフィニティーＦｃレセプターＦｃＲｌまたはＣｌｑを結合しないＩｇＧ変異体の異化速度は、親の野生型抗体のクリアランスの速度と区別することができず、このことは、異化部位がＦｃＲｌまたはＣｌｑ結合に含まれる部位とは異なることを示している。ウォーツインザクらのＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：２２１（１９９２）。また、ＩｇＧ分子またはＦｃフラグメント由来の糖質残基の除去は、インビボ半減期においてマイナーな役割であるかまたは影響を与えるものではなく、この効果の範囲は、ＩｇＧ分子のイソタイプに応じて変化する。ノーズおよびウィグゼルのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：６６３２（１９８３）；タオおよびモリソンのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：２５９５（１９８９）；ウォーツインザクらのＭｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：２１３（１９９９２）。
【０００４】
フドウ球菌タンパク質Ａ−ＩｇＧ複合体が、非複合のＩｇＧ分子よりも、血清から、より急速に除去されることが発見された。ディーマらのＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６０５（１９８３）。Ｆｃ−Ｓｐａ界面に近い残基がＩｇＧクリアランスに含まれるかどうかを決定するために、キムらのＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：５４２〜５４８（１９９４）では、マウス免疫グロブリンＧ１分子由来の組換えＦｃヒンジフラグメントのアミノ酸残基を変化させて、Ｆｃヒンジフラグメントの薬物動態学におけるこれらの突然変異の影響を決定するために、部位指向性突然変異誘発が行われた。著者らは、異化速度をコントロールするＩｇＧ１分子の部位（“異化部位”）が、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面に位置し、ブドウ球菌タンパク質Ａ結合部位とオーバーラップすることを示した。１９９３年１１月１１日発行のＷＯ９３／２２３３２も参照せよ。濃度異化現象もまたズイッカーらのＣａｎｃｅｒ，７３：７９４〜７９９（１９９４）において研究されている。ＩｇＧ異化は、マッソンのＪ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，６：６８３〜６８９（１９９３）においても、ＩｇＧ異化について議論されている。
【０００５】
ＷＯ９４／０４６８９には、哺乳類血清中のタンパク質の半減期を長くするという特性をもつＩｇＧ定常領域ドメインを特徴とする、細胞障害性ドメイン、リガンド結合ドメインおよびこれらの２つのドメインを結合するペプチドをもつタンパク質が記載されている。
【０００６】
ヒトＦｃフラグメントおよびスタフィロコッカス・アウレウス由来のタンパク質ＡのＢフラグメントとの複合体の立体図が、デイセンホーファーのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：２３６４（１９８１）によって提供されている。
【０００７】
有効分子サイズが、糸球体濾過のカットオフサイズである７０ｋＤａを越える場合に、クリアランスが大きく低下することが示されている。ノウらの“水溶性ポリマーで化学的に修飾された組換えインターロイキン２のラットにおける全身的クリアランスにおける有効分子サイズの関係”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６３１５０６４〜１５０７０（１９８８）。
発明の要約 したがって、ひとつの具体的な態様において、本発明は、腎臓から排泄され、かつＩｇＧのＦｃ領域を含まない対象ポリペプチドのポリペプチド変異体であって、ＩｇＧのＦｃ領域のサルベージレセプター結合エピトープを含み、かつ対象ポリペプチドよりも延長されたインビボ半減期をもつ変異体を提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、該ポリペプチド変異体をコードする核酸、該核酸を含む複製可能なベクター、該核酸を含む宿主細胞、および培養培地中で該宿主細胞を培養し、培養物から該ポリペプチド変異体を回収することを特徴とする該ポリペプチド変異体の産生方法を提供する。核酸分子は検出可能な基で標識することもできるし、標識しなくてもよい。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２）またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号３１）のうち、１種または２種以上の配列（５’から３’）を含み、さらにＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号３）を含む、Ｆｃではないポリペプチドを提供する。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、腎臓から排泄され、かつＩｇＧのＦｃ領域を含まない対象ポリペプチドを、ＩｇＧのＦｃ領域のサルベージレセプター結合エピトープを含み、かつ対象ポリペプチドよりも延長されたインビボ半減期をもつように改変することを特徴とする、ポリペプチド変異体の産生方法を提供する。
【００１１】
さらにまた別の態様において、本発明は、 （１）ＩｇＧ分子のＦｃ領域にあるサルベージレセプター結合エピトープの配列およびコンホメーションを同定し；
（２）腎臓で排泄され、かつＦｃ領域を含まない対象ポリペプチドを、配列を同定された結合エピトープの配列およびコンホメーションを含むように改変し；
（３）ステップ（２）で改変されたポリペプチドの、対象ポリペプチドよりもインビボ半減期が延長されたかどうかについて試験し；次いで、 （４）該ポリペプチドのインビボ半減期が延長されていない場合、延長された半減期が獲得されるまで、対象ポリペプチドの配列を、同定された結合エピトープの配列およびコンホメーションを含むようにさらに改変し、次いでインビボ半減期が延長されたかどうかについて試験することを特徴とする半減期が延長されたポリペプチド変異体の産生方法を提供する。
【００１２】
さらにまた別の態様において、本発明は、治療を必要とする哺乳動物、好ましくは患者に有効量の本発明ポリペプチド変異体（ここで、ポリペプチドはＦａｂ、（Ｆａｂ’）2、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメントまたはレセプターであり、ＬＦＡ−１アンタゴニストとして作動する）を投与することを特徴とするＬＦＡ−１媒介性障害の治療方法を提供する。より好ましくは、この変異体は、血清半減期が延長された抗ＬＦＡ−１のＦａｂまたは（Ｆａｂ’）2［抗ＣＤ１８Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）2など］である。
【００１３】
他の態様において、本発明は、抗ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８抗体フラグメント変異体を、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８を含むことが予想されるサンプル、特に血清サンプルと接触させ、結合が生じるかどうかを検出することを特徴とする、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８のインビトロまたはインビボにおける検出方法を提供する。Ｆｃ領域は、生物学的活性を失うように、そのコンホメーションを改変しない予定の対象ポリペプチドの領域に位置する（移植される）べきであり、生物学的活性を維持するためにポリペプチドのリガンドまたは抗原と結合する能力を妨害しないように、位置するべきである。
【００１４】
好ましい具体例の詳細な記載 定義 本明細書で用いる“対象ポリペプチド”とは、生物学的活性をもち、腎臓で排泄され、“ＩｇＧのＦｃ領域”を含まないポリペプチドを意味する。“ＩｇＧのＦｃ領域”とは、イソタイプＩｇＧの免疫グロブリンのＦｃ部分を意味し、抗体テクノロジーに携わる当業者には公知である。このようなポリペプチドは、酵母などの真核生物、鳥類、植物、昆虫または哺乳動物由来であるかまたは大腸菌などの細菌由来であるかのいずれにしても、ペプチドおよびタンパク質である。対象ポリペプチドは、天然物から単離してもよいし、あるいは合成によるかまたは組換え技術を用いて製造してもよい。好ましい具体例において、対象ポリペプチドは、抗原結合ドメインなどのＩｇドメインまたはＩｇ様ドメインを含む。
【００１５】
対象ポリペプチドの腎臓からのクリアランスは、少なくとも一部は該ポリペプチドの分子量に従属している。分子量の大きすぎるポリペプチドは哺乳動物の腎臓からは排泄されないであろう。対象ポリペプチド（または変異体）のが腎臓で排泄されるかどうかを決定する試験の一例は、対象ポリペプチドまたは変異体を検出可能なマーカーで標識し、実際の治療で用いる予定のものと同じ処方にて、治療される哺乳動物と同じタイプの動物に投与するという臨床的実験である。その後、該哺乳動物の尿の臨床サンプルを採取し、分析して標識が検出されるかどうかを測定する。標識が検出されれば、対象ポリペプチドは腎臓で排泄されたということである。
一般に、腎臓で排泄されるポリペプチドの分子量は、約５０００〜１００００ダルトンであるが、いくらか高めあるいは低めの分子量のものでも、上記腎臓排泄試験に合格すれば本発明の基準に該当する。
【００１６】
対象ポリペプチドは、インビボエフェクターまたは抗原機能、もしくはポリペプチド（天然コンホメーションあるいは変性コンホメーションのいずれにしても）
またはそのフラグメントによって直接または間接的に引き起こされるかまたは行われる活性を有するものであれば、生物学的に活性である。エフェクター機能には、レセプター結合およびいずれかのキャリアー結合活性、対象ポリペプチドのアゴニスムまたはアンタゴニスム、特に複製、ＤＮＡ調節機能、種々の増殖因子の生物学的活性の制御、レセプターの活性化、不活性化、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション、細胞増殖または分化などの増殖シグナルの変換が包含される。生物学的活性があるとは、対象ポリペプチドまたは哺乳動物におけるその等価物に対して惹起された抗体と交差反応しうるエピトープまたは抗原部位を所有することを意味する。
【００１７】
哺乳動物の対象ポリペプチドの例としては、レニン、ヒト成長ホルモン，ウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、チロイド刺激ホルモン、リポタンパク質、α１−抗インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、トロンボプトテイン、濾胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、ＶＩＩＩＣ因子，ＩＸ因子，組織因子およびフォンビルブラント因子などの血液凝固因子、プロテインＣなどの抗血液凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーンアクチベーター、ボンベジン、トロンビン、造血増殖因子、αおよびβ腫瘍壊死因子、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、ミュラー阻止物質、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖。プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、βラクタマーゼなどの微生物タンパク質、ＤＮアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンまたは増殖因子のレセプター、インテグリン、プロテインＡまたはＤ、リウマチ因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３，−４，−５または−６（ＮＴ−３，ＮＴ−４，ＮＴ−５またはＮＴ−６）またはＮＧＦ−βなどの神経増殖因子などの神経栄養因子、カルディオトロフィン−１（ＣＴ−１）などのカルディオトロフィン（心臓高栄養因子）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧ−αおよびＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む）などのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、デス（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８およびＣＤ１９などのＣＤタンパク質、エリスロポエチン、オステオインダクティブ因子、イムノトキシン、骨形態形成タンパク質（ＭＭＰ）、インターフェロンα，βおよびγなどのインターフェロン、Ｍ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０などのインターロイキン、天然のＩｇＧのＦｃ領域をもたない抗ＨＥＲ−２抗体、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞レセプター、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、エイズエンベロープのタンパク質などのウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミングレセプター、アグレッシン、調節タンパク質、天然のＩｇＧのＦｃ領域をもたない抗体、および上記列挙したポリペプチドのいずれかのフラグメントなどの分子が挙げられる。
【００１８】
好ましい対象は哺乳動物のポリペプチドである。このような哺乳動物のペプチドの例としては、Ｆｖ，Ｆａｂ、（Ｆａｂ'）2およびＩｇＧＦｃドメインをもたない抗−ＨＥＲ−２フラグメントなどの抗体フラグメント、ｔ−ＰＡ，ｇｂ１２０、ＤＮアーゼ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、脳ＩＧＦ−Ｉ、成長ホルモン、レラキシン鎖、成長ホルモン放出因子、インスリン鎖またはプロインスリン、ウロキナーゼ、イムノトキシン、ニューロトロフィンおよび抗原が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドは、Ｆａｂ、(Ｆａｂ')2、ダイアボディー、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメントまたはレセプターである。さらにより好ましいポリペプチドは、抗ＩｇＥ、抗ＨＥＲ２または抗ＣＤ１８Ｆａｂまたは（Ｆａｂ'）2であり、ヒトのポリペプチドまたはヒト化ポリペプチドが最も好ましい。
【００１９】
本明細書で用いる“ポリペプチド変異体”とは、１個または２個以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失などのアミノ酸変異を生じた対象ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を意味する。このような変異体は前述したように生物学的に活性であり、対象ポリペプチドとの配列の同一性は必然的に１００％以下である。好ましい具体例において、生物学的に活性なポリペプチド変異体においては、対象ポリペプチドとは少なくとも約７０％、好ましくは約７５％、さらに好ましくは約８０％、さらにまた好ましくは８５％、さらにさらに好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％のアミノ酸配列が同一である。
【００２０】
“インビボ半減期”とは、投与された哺乳動物の血液中を循環する対象ポリペプチドまたはポリペプチド変異体の半減期を意味する。
【００２１】
本明細書で用いる“サルベージレセプター結合エピトープ”とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期が延長される原因となる、ＩｇＧ分子（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４など）のＦｃ領域のエピトープを意味する。たとえば、図２では、下線部が代表的なエピトープを、また星印が重要な残基を示している。サルベージレセプター結合エピトープを決定するには、イソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４が好ましい。
【００２２】
“ポリメラーゼ鎖反応”または“ＰＣＲ”とは、米国特許第４６８３１９５号
（１９８７年７月２８日登録）に記載されている微量の核酸，ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の一片を増幅する操作または技術を意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計可能にするためには、対象となる領域あるいはそれを越えた領域の末端からの配列情報を入手しうる必要がある。これらのプライマーは、増幅されるべきテンプレートの相補鎖に対して同一または類似の配列である。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅される配列の末端と一致する。ＰＣＲを利用して、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などを増幅することができる［一般に、ミュリスらのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３（１９８７）；エルリッヒ編，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ストックトン・プレス，ニューヨーク，１９８９）を参照］。本明細書では、ＰＣＲは、特定の核酸片を増幅または生成するためにプライマーとして既知の核酸を利用し、ならびに核酸ポリメラーゼを利用することを特徴とする、核酸テストサンプルを増幅する核酸ポリメラーゼ反応法ひとつの具体例であるとみなす（それに限定されるものではない）。
【００２３】
“抗体（Ａｂ）”および“免疫グロブリン（Ｉｇ）”は、構造的特徴が同じ糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を呈するが、免疫グロブリンには抗体および抗原特異性のない他の抗体様分子の両方が包含される。後者のポリペプチドは、たとえば、リンパ系において低濃度で産生され、骨髄腫においては増加した濃度で産生される。
【００２４】
“天然抗体”および“天然免疫グロブリン”は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖からなる、通常、約１５００００ダルトンのヘテロ４量体の糖タンパク質である。各Ｌ鎖とＨ鎖はひとつの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、ジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのイソタイプのＨ鎖の種類によって異なる。各Ｈ鎖とＬ鎖もまた通例、ジスルフィド橋を介して結合している。各Ｈ鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶH）とそれに続く複数の定常ドメインを有する。各Ｌ鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶLおよび）を有し、他方の端に定常ドメインを有する。Ｌ鎖の定常ドメインはＨ鎖の最初の定常ドメインと並び、Ｌ鎖の可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと並んでいる。特別のアミノ酸残基が、Ｌ鎖とＨ鎖の可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている［クロシアらのＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８６：６５１〜６６３（１９８５）；ノヴォツニーおよびヘイバーのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４５９２〜４５９６（１９８５）］。
【００２５】
“可変とは、可変ドメインのある部分が、抗体間で広範囲にわたって異なり、それぞれ特定の抗体の特定の抗原に対する結合および特異性に用いられるという事実を意味する。しかし、可変性は抗体の可変ドメインに一様に分散しているわけではない。Ｌ鎖とＨ鎖の可変ドメインの両方に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうち、保存性が高い部分をフレームワーク（ＦＲ）と呼ぶ。天然のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインは、それぞれＦＲ領域を含み、多くの場合βシート配置になっており、３つのＣＤＲによって連結されてループ構造を形成しており、βシート構造が部分的であるものも存在する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によってきわめて近接して保持されており、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に関与している（カバットら、前記を参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接には関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００２６】
抗体をパパインで処理することによって、それぞれ１個の抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと残部のＦｃフラグメント（この名称は、容易に結晶化（ｃｒｙｓｔａｌｉｚｅ）するというその能力からきたものである）に分解される。ペプシン処理を行うと、２つの抗原結合部位をもち、依然として抗原に架橋することが可能なＦ（ａｂ'）フラグメントが得られる。
【００２７】
“Ｆｖ”は、完全抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、非共有会合によって緊密に結合した、ひとつのＨ鎖およびひとつのＬ鎖可変ドメインの２量体からなる。この配置においては、可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用して、ＶH−ＶL２量体の表面の抗原結合部位を決定する。すなわち、６個のＣＤＲによって抗体に、抗原結合特異性が付与される。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原特異性をもつ３個のＣＤＲのみを含む半分のＦｖ）でさえ、完全な結合部位抗原よりも親和性は低いとはいえ、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００２８】
Ｆａｂフラグメントもまた、Ｌ鎖の定常ドメインとＨ鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ'フラグメントは、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体のヒンジ領域の１個または２個以上のシステインを含む数個の残基が添加されていることによりＦａｂフラグメントとは異なっている。Ｆａｂ'−ＳＨを、本明細書ではＦａｂ'と称するが、これは定常ドメインのシステイン残基から遊離のチオール基が生じたものである。Ｆ（ａｂ'）2抗体フラグメントは、もともとはＦａｂ'フラグメントのペアとして作成されたものであり、各フラグメントの間にヒンジ部システインを有している。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた公知である。
【００２９】
“一本鎖Ｆｖ”または“ｓＦｖ”抗体フラグメントは、抗体のＶHおよびＶLドメインを含み、これらのドメインが一本鎖ポリペプチド鎖で存在するものである。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶHおよびＶLドメインの間にポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖについては、プラックタン，ＡのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ローゼンバーグおよびムーア編，スプリンガー−ベルラーグ，ニューヨーク，２６９〜３１５（１９９４）を参照。
【００３０】
いずれかの脊椎動物由来の抗体（免疫グロブリン）の“Ｌ鎖”は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２つのはっきりと異なるタイプのうちのどちらかに分類することができる。
【００３１】
Ｈ鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンをいくつかのクラスに分類することができる。これらが免疫グロブリンの主要な５クラス、すなわち、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧおよびＩｇＭであり、これらはさらに幾つかのサブクラス（イソタイプ）に分類することができる；ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１およびＩｇＡ２など。異なるクラスの免疫グロブリンに対応するＨ鎖の定常ドメインはそれぞれ、α，δ，εおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元配置は公知である。
【００３２】
“抗体”は、広義で用いられる語句であり、単一モノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ特異的抗体組成物、二特異的抗体、ダイアボディーおよび一本鎖分子ならびに抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2およびＦｖなど）は、それらが所望の生物学的活性を呈する限りは、特別に包含される。
【００３３】
本明細書で用いる“モノクローナル抗体”は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、数少なくはあるけれども天然に起こりうる突然変異以外は、集団が同一であることを特徴とする個々の抗体から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位を指向する。さらに、通常、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含む常套の（ポリクローナル）抗体調製物とは反対に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。
【００３４】
さらに、それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる汚染がないことにおいて利点がある。“モノクローナル”とは、実質的に均質な集団の抗体から得られる抗体の特徴を意味し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を要求するものとして理解されるべきではない。たとえば、本発明に用いるモノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルスタインによってＮａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法または、組換えＤＮＡ法（たとえば米国特許第４８１６５６７号（キャビリーら））によって製造することができる。
【００３５】
“モノクローナル抗体”は、たとえばクラックソンらのＮａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８（１９９１）およびマークスらのＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１〜５９７（１９９１）に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００３６】
本明細書で用いるモノクローナル抗体は、特別に“キメラ”抗体（免疫グロブリン）を包含する。キメラ抗体とは、Ｈ鎖および／またはＬ鎖の一部が、特定の種から誘導される抗体または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体において、対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、鎖の残りの部分が、他の種から誘導される抗体または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体において、対応する配列と同一であるかまたは相同である抗体、ならびにそれが所望の生物学的活性を呈する限りはこのような抗体のフラグメントを意味する［キャバリーら，前記；モリソンらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１〜６８５５（１９８４）］。
【００３７】
非ヒト（マウスなど）抗体の“ヒト化”体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ'，Ｆ（ａｂ'）2または抗体の他の抗原結合配列など）であり、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含む。ヒト化抗体は、大部分はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性，親和性およびキャパシティーを有するマウス、ラットまたはラビットなどの非ヒト種のＣＤＲの残基によって置換されている（ドナー抗体）。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、導入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも発見されない残基を含むことができる。これらの変更は、抗体の性能をさらに改良し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にすべての少なくともひとつ、代表的には２つの可変ドメインを含み、該可変ドメインにおいては、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むのが最適である。さらに詳細な情報は次の文献を参照せよ。ジョーンズらのＮａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；ライヒマンらのＮａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびプレスタのＣｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３〜５９６（１９９２）。ヒト化抗体としては、抗体の抗原結合領域が、対象抗原でマカカサルを感作することによって生産された抗体から誘導されたものであるＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体が挙げられる。
【００３８】
“ヒトにおける非免疫原性”とは、医薬的に許容しうる担体中の対象ポリペプチドまたはポリペプチド変異体を、医薬的有効量でヒトの適当な組織に接触させるに際し、対象ポリペプチドまたは変異体に対する感受性または耐性が、適当な潜伏期（たとえば８〜１４日）後に、対象ポリペプチドまたは変異体を２回目に投与する際に現れないことを意味する。
【００３９】
“ダイアボディー”は、同一のポリペプチド鎖上でＬ鎖可変ドメイン（ＶL）とＨ鎖可変ドメイン（ＶH）が結合している（ＶH−ＶL）、２つの抗原結合部位をもつ小さい抗体フラグメントを意味する。同一鎖上で２つのドメインを結合するには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは他方の鎖の相補的ドメインと強制的に結合され、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーに関しては、たとえば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびホリガーらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４〜６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。
【００４０】
“ＬＦＡ−１−媒介性障害”とは、リンパ球上のＬＦＡ−１レセプターを必要とする細胞癒着性相互作用によって引き起こされる病的状態を意味する。このような障害の例としては、乾癬などの炎症性皮膚病、炎症性腸疾患関連応答（クローン病および潰瘍性大腸炎など）、成人呼吸困難症候群、皮膚炎、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、湿疹ならびに喘息などのアレルギー状態および他のＴ細胞の浸潤ならびに慢性炎症性応答を伴う状態、皮膚過敏反応（毒性ツタおよび毒性オークなど）、アテローム性動脈硬化、白血球癒着欠損、リューマチ性関節炎，全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ），糖尿病，多発性硬化症，レイノー症候群，自己免疫性甲状腺炎，実験的自己免疫脳脊髄炎，シェーグレン症候群，若年発症型糖尿病，および結核，サルコイドーシス，多発性筋炎，肉芽腫症および脈管炎において代表的にみられるサイトカインおよびＴリンパ球媒介性遅延型過敏症関連の自己免疫応答などの自己免疫疾患、悪性貧血、白血球漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性障害、敗血症または外傷に続いて起こる多発性臓器傷害症候群、自己免疫性溶血性貧血、ミエセミア・グラヴィス（myethemia gravis）、抗原抗体複合体媒介性疾患、移植片対宿主病または宿主対移植片病を含むすべてのタイプの移植、出血性ショック、肺酸素中毒、肺線維症、傷の回復、Ｂ細胞リンパ腫などのＴ細胞炎症応答が挙げられる。
【００４１】
特に、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１１ｂに対する抗体にとって好ましい病例としては、乾癬、移植拒絶反応、喘息、傷の回復、および肺線維症が挙げられる。ＣＤ１８に対する抗体にとって好ましい病例としては、出血性ショック、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、喘息および肺酸素中毒が挙げられる。ＣＤ２０に対する抗体にとって好ましい病例としては、Ｂ細胞リンパ腫が挙げられる。
【００４２】
“治療”は、治療的処置および予防的処置の両方を意味する。治療を必要とする対象には、すでに上記のような障害を受けている対象および障害をうけやすい対象あるいは障害を予防されるべき対象が含まれる。
【００４３】
治療の対象となる“哺乳動物”とは、ヒト、イヌ，ウマ，ネコ，ヒツジ，ブタ，ウシなどの家庭および農場の家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物またはペットなどの哺乳類として分類される動物のいずれをも意味する。好ましくは、本明細書において対象とする哺乳動物は、ヒトである。
【００４４】
一般に、“ＬＦＡ−１アンタゴニスト”は、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８のいずれかあるいは両方を指向する抗体を意味するが、ＩＣＡＭ−１の可溶性体（ＩＣＡＭ−１細胞外ドメイン）、ＩＣＡＭ−１に対する抗体およびそのフラグメント、またはＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１の相互作用を阻害しうるその他の分子も包含される。
【００４５】
“抗ＬＦＡ−１抗体”または“抗ＬＦＡ−１Ｍａｂ”とは、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８のいずれかあるいは両方を指向する抗体を意味する。抗ＣＤ１１ａ抗体としては、たとえばＭＨＭ２４［ヒルドレスらのＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：２０２〜２０８（１９８３）］、Ｒ３．１［ＩｇＧ１；ロスレイン，ベーリンガー・イングルハイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド，リッジフィールド，ＣＴ］、２５−３［または２５．３；イムノテック，フランスから入手可能；オリーブらのフェルドマン編“ヒトＴ細胞クローン、免疫調節への新しいアプローチ”，クリフトン，ＮＪ，フマナ（１９８６），ｐ１７３を参照］、ＫＢＡ［ＩｇＧ２ａ；ニシムラらのＣｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７：３２（１９８７）；ニシムラらのＣｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９４：１２２（１９８５）］、Ｍ７／１５［ＩｇＧ２ｂ；スプリンガーらのＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６８：１７１（１９８２）］、ＩＯＴ１６［ヴァーモット・デスローチスらのＳｃａｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：２７７〜２８６（１９９１）］、ＳＰＶ７（ヴァーモットら，前記）およびＭ１７［ＩｇＧ２ａ；ＡＴＣＣから入手可能，これはラット抗マウスＣＤ１１ａ抗体である］が挙げられる。
【００４６】
抗ＣＤ１８抗体の例としては、ＭＨＭ２３（ヒルドレスら，前記）、Ｍ１８／２［ＩｇＧ２ａ；サンチェスマドリッドらのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：５８６（１９８３）］、Ｈ５２［フェケートらのＪ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１：１４５〜１４９（１９９０）］、Ｍａｓ１９１ｃ（ヴァーモット・デスローチスら，前記）、ＩＯＴ１８（ヴァーモット・デスローチスら，前記）、６０．３［タイラーらのＣｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７１：３２４〜３２８（１９８８）］および６０．１［キャンパナらのＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：５３７〜５４２（１９８６）］が挙げられる。
【００４７】
適当なＬＦＡ−１アンタゴニスト（抗体を含む）の他の例としては、ハッチングスらのＮａｔｕｒｅ，３４８：６３９（１９９０）、１９９１年１１月２８日発行のＷＯ９１／１８０１１、１９９１年１１月１４日発行のＷＯ９１／１６９２８、１９９１年１１月１４日発行のＷＯ９１／１６９２７、１９９１年６月１３日発行のカナダ特許出願第２００８３６８号、１９９０年１２月１３日発行のＷＯ９０／１５０７６、１９９０年９月２０日発行のＷＯ９０／１０６５２、１９９０年９月１９日発行のＥＰ３８７６６８、１９９０年８月１日発行のＥＰ３７９９０４、１９８９年１２月１３日発行のＥＰ３４６０７８、米国特許第５０７１９６４号、米国特許第５００２８６９号、１９８８年１１月１０日発行のオーストラリア特許出願第８８１５５１８号、１９８８年１１月９日発行のＥＰ２８９９４９、および１９８９年２月２２日発行のＥＰ３０３６９２号が挙げられる。
【００４８】
発明を実施するための態様 １．本発明の一般的な説明 本発明は、目的のポリペプチドの循環半減期は増大するが、生物学的な活性は損失されないよう、ＩgＧのＦc領域のサルベージレセプター（受容体）結合エピトープを目的ポリペプチドに導入する（組み込む）ことに関する。これは、Ｆc領域を模倣するために目的ポリペプチドの適当な領域で突然変異を誘発すること、又はペプチドタグにエピトープを導入し、次いでそれを目的のポリペプチドといずれかの端又は中程で融合させること、又はＤＮＡ又はペプチド合成など、任意の方法で行うことができる。
【００４９】
そのような増大したインビボ半減期を持つポリペプチドの調製の系統的な方法は、幾つかのステップ（工程）を含む。第１の工程はＩgＧ分子のＦc領域上のサルベージレセプター結合エピトープの配列及び立体配座（コンフォメーション）の同定に関する。一度、このエピトープが同定されれば、目的ポリペプチドの配列を、同定した結合エピトープの配列及びコンフォメーションを含むように修飾する。配列を突然変異させた後、そのポリペプチド変異体を、元のポリペプチド、すなわち、目的ポリペプチド、よりも長いインビボ半減期を有するかどうかについて試験する。試験の結果、そのポリペプチドがより長いインビボ半減期を持たない場合には、同定した結合エピトープの配列及びコンフォメーションを含むよう、その配列をさらに改変する。改変したポリペプチドをより長いインビボ半減期について試験する。そして、このプロセスを、より長いインビボ半減期を示す分子が得られるまで繰り返す。
【００５０】
このようにして目的のポリペプチドに導入されたサルベージレセプター結合エピトープは、上で定義した適当なエピトープの任意のものであってよく、その性質は、例えば、修飾されるポリペプチドのタイプに依存する。転移は目的ポリペプチドの生物活性が維持されるように、即ち、転移された部分が目的ポリペプチドのコンフォメーションに悪い影響を及ぼさない、又はその生物活性を付与するリガンドとの結合に影響を及ぼさないように行う。例えば、目的ポリペプチドが抗体である場合、サルベージレセプター結合エピトープは、抗体の抗原結合部位を阻害するように位置せしめない。
【００５１】
好ましくは、目的ポリペプチドはＩgドメイン又はＩg−様ドメインを含有しており、サルベージレセプター結合エピトープは、このＩgドメイン又はＩg−様ドメイン内に位置するように配される。より好ましくは、エピトープは、Ｆcドメインの１又は２個のループ由来の任意の１又はそれ以上のアミノ酸が目的ポリペプチドのＩg又はＩg−様ドメインの類似の位置に転移されている領域からなる。
【００５２】
より好ましくは、Ｆcドメインの１又は２個のループから３又はそれ以上のアミノ酸が転移されている。さらに好ましくは、エピトープはＦc領域（例えばＩgＧの）のＣＨ２ドメインから得られ、ＩgのＣＨ１、ＣＨ３又はＶH領域、又は１以上のそのような領域に転移されているか、Ｉg−様ドメインに転移されている。
【００５３】
あるいは、エピトープはＦc領域のＣＨ２ドメインから得られ、目的ポリペプチドのＩgのＣＬ領域又はＶL領域又はその両方、に転移されているか、Ｉg−様ドメインに転移されている。
【００５４】
例えば、目的ポリペプチドが抗−ＣＤ１８である変異体について議論する目的で、様々なＩg類（即ち、ヒトＩgＧ１ＣＨ１ドメイン、ヒトＩgＧ２ＣＨ１ドメイン、ヒトＩgＧ３ＣＨ１ドメイン、ヒトＩgＧ４ＣＨ１ドメイン、ヒトカッパＣＬドメイン及びヒトラムダＣＬドメイン）の適切なコンセンサス一次構造、並びに本明細書の好ましい抗−ＣＤ１８Ｆab変異体、Ｆabv1bの具体的な配列を図示した第２図を参考にする。さらに、第２図には、Ｆabv1bの、目的のそして最も重要な残基も示されている。好ましい態様では、重要な残基は、図２でアステリスクを付したものであり、即ち、Ｆab v1bの１ループ内の、ＭＩＳに対して１アミノ酸Ｃ−末端側のＴ残基を有するＭＩＳ、及びＦab v1bのもう１つのループ内の、ＨＱＮに対して２アミノ酸Ｃ−末端側のＤ残基を有するＨＱＮ及びＤ残基に対して１アミノ酸Ｃ−末端側のＫ残基である。
【００５５】
最も好ましい態様では、特に目的のポリペプチドはＦab又は(Ｆab')2であって、サルベージレセプター結合エピトープは以下の配列(５'から３'側)： ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号３）を含有し、所望によりさらに以下の配列群：ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号１１）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２）、又はＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号３１）からなる群から選択される配列を含有している。
【００５６】
他の最も好ましい態様では、サルベージレセプター結合エピトープは、配列（１又は複数）（５'から３'）ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２）、又はＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号３１）及び配列：ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号３）を含有するＦcでないポリペプチドである。このエピトープは目的ポリペプチドと適当に融合しており、好ましい態様では目的ポリペプチドと融合しているペプチド上に含有されている。この目的に適したポリペプチドの例には、その配列が突然変異した場合に、逆の結果として、改変された２次又は３次構造を示すものが含まれ、成長ホルモンや神経成長因子が挙げられる。
【００５７】
１つの態様では、変異体は組換え法で調製される。即ち、変異体をコードする核酸を調製し、複製可能なベクターに配置し、このベクターを用いて発現のための適当な宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換する。ポリペプチド変異体は、宿主細胞を培養培地で培養し、宿主細胞培養からポリペプチド変異体を回収することにより製造される。
【００５８】
ポリペプチド変異体が分泌される場合、それは培養培地から回収される。他の態様では、ポリペプチド変異体は、腎臓から浄化された、ＩgＧのＦc領域を含有していない目的ポリペプチドを、ＩgＧのＦc領域のサルベージレセプター結合エピトープを含有しインビボ半減期が増大されるよう、改変することで調製される。改変工程は、好ましくは、Kunkel，部位特異的カセット、又はＰＣＲ突然変異誘発によって行う。Kunkel突然変異誘発法は、例えば、Kunkel，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82: 488-492(1985)に記載されている。
【００５９】
２．目的ポリペプチド及びその変異体の調製 以下の議論の大部分は、目的ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された細胞を培養し、細胞培養から目的ポリペプチド又はその変異体を回収することにより、目的ポリペプチド又はその変異体を製造することに関する。また、目的ポリペプチドを、ＷＯ９１／０６６６７（１９９１年５月１６日公開）に記載されているように、相同組換えにより製造され得ることも想定されている。簡単に説明すると、この方法は、内因性ポリペプチドを含有している一次哺乳動物細胞（例えば、所望のポリペプチドがヒト由来であればヒト細胞）を、増幅可能な遺伝子（ジヒドロ葉酸レダクターゼ［ＤＨＦＲ］又は下記のその他のもの）と、目的ポリペプチドをコードする遺伝子を増幅させる、目的ポリペプチドの遺伝子のコード領域の部位のＤＮＡ配列と相同な、少なくとも約１５０ｂｐの長さのフランキング領域を最小限１つ含む構築物（即ちベクター）で形質転換することを含む。増幅可能な遺伝子は目的ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を妨げない位置になければならない。形質転換は、増幅可能な領域を決定するために、構築物が相同的に一次細胞のゲノムに組み込まれるように行う。
【００６０】
次いで、増幅可能な遺伝子又は構築物中の他のマーカーを利用して、構築物を含有する一次細胞を選択する。マーカー遺伝子が存在すると、宿主細胞ゲノム内の構築物の存在及び組み込みが達成されている。選択は２次宿主内で行われるので、それ以上、一次細胞を選別する必要はない。要望に応じて、相同組換えの発生をＰＣＲを用い、そして得られた増幅ＤＮＡ配列の配列決定、又は適正な相同組み込からのＤＮＡが存在するときにはＰＣＲフラグメントの適当な長さを決定しそのようなフラグメントを含有する細胞のみを増幅することでも行える。また、望む場合には、選択した細胞をこの時点で、適当な増幅試薬（増幅可能な遺伝子がＤＨＦＲである場合にはメトトレキセート）を用いて細胞にストレスを与えることにより増幅し、標的遺伝子の多コピーを得る。しかしながら、増幅ステップは、以下の２次形質転換の後まで行わないことが好ましい。
【００６１】
選択工程の後、増幅可能な全領域を包含するに十分な大きさのゲノムのＤＮＡ部分を、選択した一次細胞から単離する。次いで、２次哺乳動物発現宿主細胞をこれらのゲノムＤＮＡ部分で形質転換し、クローンし、増幅可能な領域を含有するクローンを選択する。次いで、１次細胞内での増幅がなされていない場合には、増幅可能な領域を、増幅試薬を用いて増幅する。最後に、この、目的ポリペプチドを含有する増幅可能な領域の多コピーを有する２次発現宿主細胞を遺伝子の発現及びポリペプチドの製造のために培養する。
【００６２】
Ａ．目的ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離 目的ポリペプチドをコードするＤＮＡは、目的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。目的ポリペプチドをコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリー又は完全なヌクレオチド又はアミノ酸配列が既知であると仮定して、インビトロオリゴヌクレオチド合成により、得ることができる。
【００６３】
ライブラリーを目的遺伝子又はそれによりコードされているタンパク質を同定するよう設計されたプローブでスクリーンする。ｃＤＮＡ発現ライブラリーのための適当なプローブには、目的ポリペプチドを認識し特異的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体；同一又は異なる種由来の目的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの既知又は予測部分をコードする長さ約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド；及び／又は同一又は類似の遺伝子をコードする相補又はホモローガスｃＤＮＡ又はそのフラグメントが含まれる。ゲノムライブラリーのスクリーニングに適したプローブには、同一又は類似の遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、又はそのフラグメント及び／又はホモローガスなゲノムｃＤＮＡ又はそのフラグメントが含まれるが、それらに限定されない。選択したプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrooket al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)の１０−１２章に記載のような標準的な手法で行うことができる。
【００６４】
目的ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する別法は、Sambrook et al．（前掲）の１４節に記載のＰＣＲを用いる方法である。この方法には、目的ポリペプチドとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブを用いる必要がある。オリゴヌクレオチドの選択における戦略は以下の通りである。
本発明を実施する好ましい方法は、様々な組織から得たｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに、注意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を用いることである。
【００６５】
プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小となるに十分なほど十分な長さを有し、明確（あいまいでない）であるべきである。実際のヌクレオチド配列（群）は、通常、保存、又は高度に相同な、ヌクレオチド配列である。オリゴヌクレオチドは１又はそれ以上の部分で縮重していてよい。同義性オリゴヌクレオチドの使用は、優先的なコドン使用率が知られていない種からのライブラリーをスクリーニングする場合に、特に重要であろう。
【００６６】
オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされているライブラリーのＤＮＡとハイブリダイズしたときに検出しうるよう、ラベルされている必要がある。好ましい標識法は、当該技術分野で周知のごとく、32Ｐ−標識ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドを放射性標識することである。しかしながら、ビオチニル化又は酵素標識など、これらに限定されないが、他の方法を用いてオリゴヌクレオチドを標識してもよい。
【００６７】
特に興味深い目的ポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチド全長をコードするものである。幾つかの好ましい態様では、核酸配列は目的ポリペプチドのシグナル配列を含む。全タンパク質コード配列を有する核酸は、選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーを、本明細書に初めて開示された推定のアミノ酸配列を用いてスクリーニングし、必要に応じて、Sambrookら（前掲）の第７.７９節に記載の、通常のプライマー伸長法を用いて前駆体と恐らくｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡのプロセッシング中間体とを検出することで得る。
【００６８】
Ｂ．様々な目的ポリペプチドの調製 目的ポリペプチドの変異体は、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡに、上記のごとくＦc領域のための適当なヌクレオチドの変更を導入するか、所望のポリペプチド変異体をインビトロ合成することにより適切に調製される。そのような変異体は、例えば、目的ポリペプチドが適当なエピトープを含み血清中でより長い半減期を有するよう、目的ポリペプチドのアミノ酸配列内における残基の欠失、挿入又は置換を含む。最終的な構築物が所望の特徴を有することを条件として、該最終構築物に到達するには欠失、挿入及び置換の任意の組合わせが可能である。
【００６９】
アミノ酸の変更はまた、グリコシル化の数又は部位の変化など、目的ポリペプチドの翻訳後の工程を変更するかもしれない。さらに、大多数の哺乳動物遺伝子のように、目的ポリペプチドは、マルチエキソン遺伝子によってコードされているかもしれない。
【００７０】
目的ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を設計するために、突然変異部位の位置決定と突然変異の性質を、修飾しようとしている具体的な目的ポリペプチドにより決定する。例えば、まず、サルベージレセプターエピトープを含有するＩgＧＣＨ２内の２つのループに類似の構造であるループを位置させることにより、イムノグロブリン又はイムノグロブリン様ドメインを修飾する。突然変異の部位は、例えば、（１）まず保存アミノ酸選択物で置換した後、達成された結果に応じてより根本的（急激）な選択物で置換する、（２）標的残基を欠失する、又は（３）位置決めした部位の隣に同一又は異なるクラスの残基を挿入する、あるいはこれらオプション１−３の組合わせにより、個別に又は連続的に突然変異させることができる。
【００７１】
突然変異誘発に好適な位置である、目的ポリペプチドの幾つかの残基又は領域の同定のための通常の方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発(alaninescanning mutagenesis)」と呼ばれており、Cunningham 及びWells，Scienece，244: 1081-1085(1989)に記載されている。ここでは、標的残基の残基又は基（例えば、arg，asp，his，lys，及びgluなどの荷電残基）を同定して、アミノ酸と細胞内又は外の、周囲の水性環境との相互作用に影響を及ぼすよう、中性又は負の電荷を有するアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置換する。次いで、置換に機能的な感受性を示すドメインにさらに、置換部位に、又は置換部位に対して、さらなる変異又は他の変異を導入することにより、該部位をさらに練り上げる。このように、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定するが、突然変異そのものの性質は、予め決定されている必要がない。例えば、特定の部位での突然変異の遂行を最適化するために、標的コドン又は領域でアラニンスキャニング又はランダム突然変異誘発を行い、製造された変異体を循環中での半減期の増大に関してスクリーニングする。
【００７２】
アミノ酸配列の欠失は、通常、約１〜３０残基の範囲、より好ましくは約１〜１０残基の範囲であり、典型的に隣接している。隣接欠失は普通、偶数個の残基で行うが、単一又は奇数個の欠失も本発明の範囲内である。例として、ポリペプチドの半減期を改変するために、目的ポリペプチドのアミノ酸配列と配列の同一性を最も多く共有しているＬＦＡ−１抗体間で相同性が低い領域に欠失を導入する。目的ポリペプチドの、他のリガンドの結合部位の１つと実質上相同な領域内における欠失は、目的ポリペプチドの生物学的活性に一層重要な改変を、より起こし易いであろう。逐次的な欠失の数は、目的ポリペプチドの影響されたドメインでの３次構造（例、ベータープリーツシート又はアルファヘリックス）が保存されるよう選択する。
【００７３】
アミノ酸配列の挿入は、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入と同様、１残基から１００又はそれ以上の長さの残基を含むポリペプチドの、アミノ−及び／又はカルボキシ−末端融合を包含する。配列内挿入（即ち、成熟ポリペプチド配列内への挿入）は、通常、約１〜１０残基、好ましくは１〜５残基、最も好ましくは１〜３残基の範囲である。挿入は、好ましくは偶数個の残基で行うが、それは要求されない。挿入の例には、目的ポリペプチドの内部部分への挿入、並びに所望のエピトープを含有するタンパク質又はペプチドであって、融合の結果、半減期を増大させるものとの、Ｎ−又はＣ−末端での融合を含む。
変異の第３のグループはアミノ酸置換変異体である。これらの変異体では、ポリペプチド分子から少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されている。置換変異誘発において最も興味深い部位は、抗体の１又は２つのループを含む。他の興味深い部位は、様々な種から得られたポリペプチドの特定の残基が、全動物種の目的ポリペプチドの間で同一であり、この保存の程度はこれらの分子に共通する生物学的活性の達成における重要性を示唆している。これらの部位、特に、少なくとも３つ他の種で全く同一に保存された部位の配列の範囲にある部位を、相対的に保存的な方法で置換する。以下の表１には、そのような保存的な置換を好適な置換の項目の下方に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらせば、さらに、表１に例示的な置換とされているもの、あるいはアミノ酸クラスに関して後述するように、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーンする。

【００７４】
当該ポリペプチドの機能における実質的な修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、たとえば、シートやらせん立体配置など、（ｂ）標的部位における該分子の荷電またはハイドロホビシティー、または（ｃ）側鎖の嵩ばり具合を維持することに対する作用が有意に異なる置換を選択することにより行う。天然に存在する残基は共通する側鎖の特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
（２）中性で親水性：システイン、セリン、トレオニン；
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン；
（５）鎖の方向性に影響を及ぼす残基：グリシン、プロリン；および （６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【００７５】
非保存的な置換は、これらクラスの一つの成員を他のクラスのものと交換することを必要とするであろう。かかる置換残基はまた、保存的な置換部位中に導入することもできるし、または一層好ましくは残りの（非保存的な）部位に導入することができる。
【００７６】
該分子中に存在する１またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を不活化するのが望ましい。これら部位は、たとえばトリプシンの場合には、アルギニン残基やリシン残基についてコードアミノ酸配列を調べることにより同定される。プロテアーゼ開裂部位が同定されたら、標的残基を他の残基、好ましくはグルタミンなどの塩基性残基またはセリンなどの親水性残基と置換するか、該残基を欠失させるか、または該残基の直後にプロリン残基を挿入することにより該開裂部位をタンパク質分解による開裂に対して不活化させる。
【００７７】
他の態様において、シグナル配列の開始メチオニン残基以外のメチオニン残基、またはこれら各メチオニン残基のＮ末端側またはＣ末端側の約３残基内に位置する残基を他の残基と置換するか（好ましくは表１に従い）または欠失させる。別のやり方として、約１〜３残基を該部位に隣接させて挿入する。
【００７８】
当該ポリペプチドの適切な立体配置を維持するのに関与していないシステイン残基はまた、一般にセリンと置換して該分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防ぐことができる。
【００７９】
第一の態様において、当該ポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で知られた種々の方法により調製される。これら方法には、オリゴヌクレオチド媒体（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および該変異体の基となるポリペプチド（「当該ポリペプチド」）の以前に調製した変異体または非変異体のカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限られるわけではない。
【００８０】
オリゴヌクレオチド媒体突然変異誘発は、本発明における置換、欠失、および挿入ポリペプチド変異体を調製する好ましい方法である。この技術は、アデルマン（Ａdelman）らのＤＮＡ、２：１８３（１９８３）に記載されているように当該技術分野でよく知られている。簡単に説明すると、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせることによって該ＤＮＡを改変するものであり、その際、該鋳型は、変化させようとするポリペプチドの変化していないまたは天然のＤＮＡ配列を含む一本鎖の形態のプラスミドまたはバクテリオファージである。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該鋳型の第二の全相補鎖を合成させると、該鎖は、かくして該オリゴヌクレオチドプライマーを含んでおり、該ＤＮＡ中に該選択された変化をコードしているであろう。一般に、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００８１】
最適のオリゴヌクレオチドは、該変異をコードするヌクレオチドのいずれかの側に該鋳型に完全に相補的な１２〜１５ヌクレオチドを有しているであろう。このことによって、該オリゴヌクレオチドが該一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切にハイブリダイズすることが確実になる。これらオリゴヌクレオチドは、クレア（Ｃrea）らのＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、７５：５７６５（１９７８）に記載されているような当該技術分野において知られた技術を用いて容易に合成される。
【００８２】
ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適している）、または一本鎖ファージの複製起点を含むベクターにより得ることができる（ビエラ（Ｖiera）ら、Ｍeth.Ｅnzymol.１５３：３（１９８７）に記載）。それゆえ、変異させようとするＤＮＡをこれらベクターの一つに挿入して一本鎖の鋳型を得ることができる。一本鎖鋳型の製造はサンブルックらの上記文献の４.２１−４.４１章に記載されている。
【００８３】
別法として、一本鎖鋳型は標準技術を用い、二本鎖プラスミド（または他の）ＤＮＡを変性させることにより得ることができる。
【００８４】
元のＤＮＡ配列を変化させて本発明のポリペプチド変異体を生成させるため、オリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイズ条件下で一本鎖鋳型にハイブリダイズさせる。ついで、ＤＮＡ重合酵素、通常はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を加え、該オリゴヌクレオチドを合成プライマーとして用いて該鋳型の相補鎖を合成する。かくして、ＤＮＡの一方の鎖が該ポリペプチドの変異形態をコードし、他方の鎖（原鋳型）が該ポリペプチドの元の変化していない配列をコードしているヘテロ二本鎖分子が生成する。ついで、このヘテロ二本鎖分子を適当な宿主細胞、通常は大腸菌ＪＭ１０１などの原核細胞中に形質転換する。細胞を増殖させた後、アガロースプレート上に蒔き、32Ｐで放射性標識したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングして該変異ＤＮＡを含む細菌コロニーを同定する。ついで、変異した領域を取り出し、タンパク質産生のための適当なベクター、一般には適当な宿主の形質転換に典型的に用いるタイプの発現ベクター中に導入する。
【００８５】
上記に記載した方法は、該プラスミドの両鎖が変異を含むホモ二本鎖分子を生成するように修飾することができる。この修飾は以下のようである：一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型に上記のようにしてアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、すなわちデオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（αＳ）と称する修飾したチオ−デオキシリボシトシン（アマーシャム・コーポレーションから入手可能）と混合する。この混合物を上記鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、変異した塩基以外は鋳型と同一のＤＮＡの鎖が生成する。さらに、この新たなＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（αＳ）を含み、制限エンドヌクレアーゼ消化から保護するように働く。
【００８６】
ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素で切れ目を入れた後、鋳型鎖を突然変異すべき部位を含む領域を過ぎてＥｘｏIIIヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼで消化することができる。ついで反応を停止して部分的にのみ一本鎖である分子とする。ついで４つのすべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて完全なＤＮＡホモ二本鎖を生成させる。ついで、このホモ二本鎖分子を上記のようにして大腸菌ＪＭ１０１などの適当な宿主細胞中に形質転換することができる。
【００８７】
置換すべき１を越えるアミノ酸を有するポリペプチド変異体をコードするＤＮＡは、幾つかの方法の一つにより生成することができる。これらアミノ酸がポリペプチド鎖中で近接して位置する場合は、所望のアミノ酸置換のすべてをコードする一つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に突然変異誘発することができる。
しかしながら、これらアミノ酸が互いに若干の距離にて位置する（約１０以上のアミノ酸により離れている）場合は、所望の変化のすべてをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生成することは一層困難である。その代わり、２つの別法の一つを用いることができる。
【００８８】
第一の方法では、置換すべき各アミノ酸に対して別々のオリゴヌクレオチドを調製する。ついで、これらオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニールし、該鋳型からＤＮＡの第二の鎖を合成すると、これは所望のアミノ酸置換のすべてをコードしているであろう。
【００８９】
別の方法は、所望の変異体を生成するための突然変異誘発を２回またはそれ以上行うことを含む。１回目は単一の変異体について記載したものと同じである。
【００９０】
野生型ＤＮＡを鋳型として用い、この鋳型に第一の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをアニールし、ついでヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。２回目の突然変異誘発には１回目の突然変異誘発で生成した変異ＤＮＡを鋳型として利用する。それゆえ、この鋳型はすでに１またはそれ以上の変異を含んでいる。ついで、この鋳型に別の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをアニールさせると、それから得られるＤＮＡ鎖は１回目および２回目の両方の突然変異誘発からの変異をコードしている。この結果得られるＤＮＡを３回目の突然変異誘発に鋳型として用いることができる、以下、同様。
【００９１】
ＰＣＲ突然変異誘発もまた、本発明のアミノ酸変異体を製造するのに適している。以下の記載ではＤＮＡを言及しているが、この技術はまたＲＮＡにも応用できることが理解される。ＰＣＲ法とは一般に以下の手順をいう（エーリッヒ、上掲、ヒグチ（Ｒ.Ｈiguchi）による章、６１〜７０頁）：少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲにおいて出発物質として用いる場合に、鋳型ＤＮＡ中の対応領域とわずかに異なるプライマーを用い、該プライマーが該鋳型と異なる位置でのみ鋳型配列とは異なる特定のＤＮＡ断片を比較的大量に生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に変異を導入するため、プライマーの一方を該変異の位置に重複するように、および該変異を含むようにデザインする：他方のプライマーは該プラスミドの反対鎖の一続きの配列と同一でなければならないが、この配列は該プラスミドＤＮＡ中のいずれの位置に位置させることもできる。しかしながら、最終的に両プライマーにより境界付けられるＤＮＡの全増幅領域を容易にシークエンシングすることができるように、第二のプライマーの配列は第一のプライマーの配列から２００ヌクレオチド内に位置するのが好ましい。このようなプライマーペアを用いたＰＣＲ増幅の結果、該プライマーにより特定される変異の位置、および鋳型コピーは若干の間違いを起こしやすいことから、おそらく他の位置において異なるＤＮＡ断片の集団が得られる。
【００９２】
生成物質に対する鋳型比が極めて低い場合には、生成ＤＮＡ断片の大部分は所望の変異を含んでいる。この生成物質を用い、ＰＣＲ鋳型として働くプラスミド中の対応領域を標準ＤＮＡ法を用いて置換する。別々の位置の変異は、第二の変異プライマーを用いるか、または異なる変異プライマーを用いた第二のＰＣＲを行って得られる２つのＰＣＲ断片をベクター断片に３部（またはそれ以上）ライゲーションとしてライゲートすることにより、同時に導入することができる。
【００９３】
ＰＣＲ突然変異誘発の具体例において、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を、該プラスミドＤＮＡ中の増幅すべき領域の外側に唯一の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化することにより線状にする。この物質のうち１００ｎｇを、ＰＣＲ緩衝液（４つのデオキシヌクレオチド三リン酸を含有し、ジーンアンプ（ＧeneＡmpR）キット（パーキン−エルマー・シータス（Ｐerkin−Ｅlmer Ｃetus）、ノーウォーク、コネチカットおよびエメリービル（Ｅmeryville）、カリフォルニアから入手）中に含まれる）および２５ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマーを最終容量５０μＬで含有するＰＣＲ混合物に加える。この反応混合物に３５μＬの鉱油を重層する。この反応混合物を１００℃にて５分間変性し、しばらく氷上に置き、ついで１μＬのサーマス・アクアティクス（Ｔhermus aquaticus）（Ｔaq）ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μＬ、パーキン−エルマー・シータスから購入）を鉱油層の下に加える。ついで、反応混合物を、下記のようにプログラムしたＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン−エルマー・シータスから購入）中に挿入する： ２分間 ５５℃
３０秒間 ７２℃、ついで下記の１９サイクル：
３０秒間 ９４℃
３０秒間 ５５℃、および
３０秒間 ７２℃。
【００９４】
プログラムの最後に反応バイアルをサーマルサイクラーから取り出し、水性相を新たなバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０容量）で抽出し、エタノール沈殿し、ＤＮＡを標準手順により回収する。この物質を、引き続きベクター中に挿入するために適当な処理に供する。
【００９５】
変異体の他の製造方法であるカセット突然変異誘発は、ウエルズ（Ｗells）ら、Ｇene、３４：３１５（１９８５）によって記載された技術に基づく。出発物質は変異すべきＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異すべきＤＮＡのコドンを同定する。該同定した変異部位の両側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在していなければならない。そのような制限部位が存在しない場合には、上記オリゴヌクレオチド媒体突然変異誘発法を用いて該ＤＮＡ中の適当な位置に導入することができる。制限部位がプラスミド中に導入された後、プラスミドをこれら部位で切断して線状にする。これら制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを標準手順を用いて合成する。これら２つの鎖を別々に合成し、ついで標準法を用いてハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセットは、プラスミド中に直接ライゲートすることができるように、線状にしたプラスミドの末端と適合する３'末端および５'末端を有するようにデザインされている。このプラスミドは今や変異したＤＮＡ配列を含んでいる。
【００９６】
Ｃ．複製しうるベクター中への核酸の挿入 ポリペプチド変異体をコードする核酸（たとえば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）をさらにクローニングするため（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製しうるベクター中に挿入する。多くのベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は、（１）ＤＮＡ増幅に用いるのかまたはＤＮＡ発現に用いるのか、（２）ベクター中に挿入すべき核酸のサイズ、および（３）ベクターで形質転換すべき宿主細胞に依存するであろう。各ベクターはその機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する宿主細胞に依存して種々の成分を含む。ベクター成分としては、これらに限られるものではないが、一般に下記の１またはそれ以上が挙げられる：シグナル配列、複製起点、１またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写停止配列。
【００９７】
（i）シグナル配列成分 本発明のポリペプチド変異体は直接製造しうるのみならず、異種ポリペプチド、好ましくはシグナル配列または成熟ポリペプチド変異体のＮ末端側に特異的な開裂部位を有する他のポリペプチドとの融合体としても製造しうる。一般にシグナル配列はベクターの成分であってよいが、またはベクター中に挿入されるＤＮＡの一部であってよい。選択する異種シグナル配列は、宿主細胞により認識されプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによる開裂）ものでなければならない。当該シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞の場合は、該シグナル配列を、たとえば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定エンテロトキシンIIリーダーよりなる群から選ばれた原核シグナル配列で置換する。酵母分泌のためには、元のまたは野生型のシグナル配列を、たとえば、酵母インベルターゼリーダー、酵母α因子リーダー（サッカロミセスおよびクルイベロミセスα因子リーダーを含む、後者は１９９１年４月２３日発行の米国特許第５,０１０,１８２号に記載）、酵母酸性ホスファターゼリーダー、マウス唾液腺アミラーゼリーダー、カルボキシペプチダーゼリーダー、酵母ＢＡＲ１リーダー、フミコラ・ラノギノーサ（Ｈumicola lanoginosa）、リパーゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（Ｃ.albicans）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２,１７９号）、または１９９０年１１月１５日発行のＷＯ９０／１３６４６号に記載されたシグナルで置換することができる。哺乳動物細胞発現においては元のシグナル配列（すなわち、通常、当該変異体が由来する当該天然ポリペプチドのヒト細胞からのインビボ分泌を指令するポリペプチドプレ配列）で十分であるが、他の動物ポリペプチドからのシグナル配列や同種または関連種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列などの他の哺乳動物シグナル配列、並びにウイルス分泌リーダー、たとえば単純ヘルペスｇＤシグナルも適している。
そのような前駆体領域のＤＮＡは、成熟ポリペプチド変異体をコードするＤＮＡに読み取り枠にてライゲートさせる。
【００９８】
（ii）複製起点成分 発現ベクターおよびクローニングベクターの両者とも、１またはそれ以上の選択された宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。一般にクローニングベクターでは、この配列はベクターが宿主染色体ＤＮＡと独立に複製することを可能にするものであり、複製起点または自律複製配列を含む。
そのような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。
プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７,０１７）からの複製起点または他の市販の細菌ベクター、たとえばｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals）、ウプサラ、スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Ｐromega Ｂiotech）、マジソン、ウイスコンシン）からの複製起点が大抵のグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点が酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）が哺乳動物細胞でベクターをクローニングするのに有用である。一般に、哺乳動物発現ベクターでは複製起点成分は必要ない（ＳＶ４０起点は、それが初期プロモーターを含有するがゆえにのみ一般に用いられる）。
【００９９】
大抵の発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、少なくとも一つのクラスの生物中で複製しうるが、発現のために他の生物中にトランスフェクションすることができる。たとえば、ベクターを大腸菌でクローニングし、ついで同じベクターを、宿主細胞の染色体と独立に複製することはできないが、発現のために酵母または哺乳動物細胞中にトランスフェクションする。
【０１００】
ＤＮＡはまた宿主ゲノム中に挿入することにより増幅できる。このことは、バシラス種を宿主として用い、たとえば、バシラスゲノムＤＮＡ中に認められる配列に相補的なＤＮＡ配列をベクター中に含めることにより容易に行われる。バシラスを該ベクターでトランスフェクションするとゲノムとの相同組換えおよび該ＤＮＡの挿入となる。しかしながら、ポリペプチド変異体をコードするゲノムＤＮＡの回収は、外来複製ベクターのものに比べて一層複雑である。なぜなら、該ＤＮＡの切り出しのために制限酵素消化が必要だからである。
【０１０１】
（iii）選択遺伝子成分 発現ベクターおよびクローニングベクターは選択遺伝子（選択マーカーとも称する）を有していなければならない。この遺伝子は、選択培地中で増殖した形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている。該選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は該培地中で生存できないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）複合培地からは利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする遺伝子であり、たとえば、バシラスに対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０１０２】
選択スキームの一つの例では宿主細胞の増殖を阻止するために薬剤を用いる。異種遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、それゆえ、この選択を生き残る。そのような優性選択の例では、薬剤のネオマイシン（サザーン（Ｓouthern）ら、Ｊ.Ｍolec.Ａppl.Ｇenet.１：３２７［１９８２］）、ミコフェノール酸（マリガン（Ｍulligan）ら、Ｓcience、２０９：１４２２［１９８０］）、またはハイグロマイシン（サグデン（Ｓugden）ら、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、５：４１０〜４１３［１９８５］）を用いる。上記３つの例では真核条件下で細菌遺伝子を用い、それぞれ適当な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性が付与される。
【０１０３】
哺乳動物細胞の適当な選択マーカーの他の例は、ＤＨＦＲやチミジンキナーゼなどの核酸を取り込む細胞成分の同定を可能にするものである。哺乳動物細胞の形質転換体を、該マーカーを取り込むことによって形質転換体のみが独自に適合して生存する選択圧下に置く。選択圧の負荷は、培地中の選択剤の濃度を順次変えていく条件下で形質転換体を培養し、それによって選択遺伝子およびポリペプチド変異体をコードするＤＮＡの両者の増幅へと導くことにより行う。増幅とは、増殖にとって重要なタンパク質の産生のために一層要求される遺伝子が、連続的に生成した組換え細胞の染色体内にタンデムに繰り返されるプロセスである。増幅されたＤＮＡからは一層増加した量のポリペプチド変異体が合成される。増幅しうる遺伝子の他の例としては、メタロチオネインＩおよびII、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどが挙げられる。
【０１０４】
たとえば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培地中ですべての形質転換体を培養することにより同定される。野生型のＤＨＦＲを用いた場合の適当な宿主細胞は、ウアラウプ（Ｕrlaub）およびチェイシン（Ｃhasin）、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０）によって記載されたようにして調製および増殖された、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。ついで、形質転換した細胞を増加レベルのメトトレキセートにさらす。これによりＤＨＦＲ遺伝子の複数のコピーが合成され、それと同時にポリペプチド変異体をコードするＤＮＡなどの発現ベクターを含む他のＤＮＡの複数のコピーも合成される。この増幅技術は、たとえばＭｔｘに対する耐性の大きな変異体ＤＨＦＲ遺伝子を用いた場合には内生のＤＨＦＲの存在にも拘わらず、他のいかなる適当な宿主、たとえばＡＴＣＣ Ｎｏ.ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１に用いることができる（ＥＰ１１７,０６０号）。
【０１０５】
別のやり方として、ポリペプチド変異体、野生型のＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの他の選択マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換したまたは同時形質転換した宿主細胞（とりわけ内生のＤＨＦＲを含む野生型宿主細胞）は、アミノグリコシド系抗生物質、たとえばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などの選択マーカーに対する選択剤を含有する培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照。
【０１０６】
酵母中で使用するのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７（スティンチコーム（Ｓtinchcomb）ら、Ｎature、２８２：３９［１９７９］；キングスマン（Ｋingsman）ら、Ｇene、７：１４１［１９７９］；またはチェンパー（Ｔschemper）ら、Ｇene、１０：１５７［１９８０］）中に存在するｔｒｐ１遺伝子である。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、たとえばＡＴＣＣ Ｎｏ.４４０７６またはＰＥＰ４−１（ジョーンズ（Ｊones）、Ｇenetics、８５：１２［１９７７］）に選択マーカーを付与する。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１欠失の存在は、トリプトファンの不在下での増殖により形質転換体を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母株（ＡＴＣＣ Ｎｏ.２０,６２２または３８,６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補足される。
【０１０７】
さらに、１.６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１からのベクターをクルイベロミセス酵母の形質転換のために用いることができる。ビアンキ（Ｂianchi）ら、Ｃurr.Ｇenet.、１２：１８５（１９８７）。もっと最近では、組換えウシキモシンの大スケール産生のための発現系がクルイベロミセス・ラクチスについて報告されている。ファン・デン・ベルク（Ｖan den Ｂerg）、Ｂio/Ｔechnology、８：１３５（１９９０）。クルイベロミセスの工業株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌に適したマルチコピー発現ベクターもまた開示されている。フレーア（Ｆleer）ら、Ｂio/Ｔechnology、９：９６８〜９７５（１９９１）。
【０１０８】
（ＩＶ）プロモーター成分
発現ベクターとクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、そして核酸と実施可能な形で結合される１個のプロモーターを持っている。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列(通常は、約１００〜１０００ｂｐ以内)で、本件のポリペプチド変異体の核酸配列のような、特定の核酸配列に、発現可能な形で結合して、その転写と翻訳を制御している。この種のプロモーターは、典型的には、２つのクラス、インデューシブルとコンスティテューテイブに分類される。インデューシブルプロモーターは、培養条件の変化、例えば温度の変化や、養分の存在、不存在などの変化に呼応して、その制御下のＤＮＡからの転写の増加したレベルを開始するプロモーターである。現時点で、種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが、よく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素で、もとのＤＮＡからプロモーターを取り出し、その取り出したプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ポリペプチド変異体をコードしているＤＮＡに発現可能な形で結合される。対象のポリペプチドのプロモーターと多くの異種プロモーターはＤＮＡの直接の増幅及び／又は発現に使用されうる。しかし、対象のポリペプチドのプロモーターに比べて、異種プロモーターは組み換体として製造されるポリペプチド変異体のより多い転写とより高い収率を一般的に可能とするので、好ましい。
【０１０９】
原核細胞宿主の使用に適当なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系(チャンら(Ｃhan et al.)Ｎature,２７５：６１５[１９７８])及びゲデルら(Goeddel et al.),Ｎature,２８１：５４４[１９７９])、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(ゲデル(Goeddel，Ｎucleic Ａcids Ｒes.,８：４０５７[１９８０],ＥＰ３６,７７６)及びtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（デボーエルら(deＢoer et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,８０：２１−２５[１９８３])を含む。しかし、他の公知の細菌プロモーターも適用できる。これらの核酸配列は公表されており、それにより、当業者はポリペプチド変異体をコードするＤＮＡに必要な制限サイトを供給するリンカーやアダプターを用いて、そのプロモーターに、発現可能な形に結合することができる(シーベンリストら(Ｓiebenlist et al.,Ｃell,２０：２６９[１９８０])。バクテリア系で使用されるプロモーターは、ポリペプチド変異体をコードしているＤＮＡに、発現可能な形で結合されるシャイン−ダルガーノ(ＳＤ)配列もまた含む。
【０１１０】
プロモーター配列は、真核細胞用も知られている。事実、真核遺伝子は転写が開始する領域からおよそ２５〜３０ベース上流に位置するＡＴ−に富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０ベース上流に見られる他の配列は、１つのＣＸＣＡＡＴ領域（但しＸはどの核酸でもよい。）である。たいていの真核遺伝子の３’末端には、コーディング配列の３’末端にポリＡテイルの付加のためのシグナルの可能性もあるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの全ての配列は、真核発現ベクターに適当に挿入される。
【０１１１】
酵母宿主の使用に適したプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター(ヒッチェマンら(Ｈitzeman et al.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,２５５：２０７３[１９８０])又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデハイドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベイトデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェイトイソメラーゼ、３−ホスホグリセレイトムターゼ、ピルベイトキナーゼ、トリオースホスフェイトイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素のためのプロモーターを含む(ヘスら(Ｈess et al.,Ｊ.Ａdv.ＥnzymeＲeg.,７：１４９[１９６８]及びホーランド(Ｈolland，Ｂiochemistry，１７：４９００[１９７８])。
【０１１２】
生長条件によって制御されている他の転写の利点を有するインデューシブルプロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデハイドロゲナーゼＺ、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に伴なう分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデハイドロゲナーゼ、及びマルトースとガラクトース利用に関係のある酵素、のためのプロモーター領域である。酵母発現に使用される適当なベクターとプロモーターは、ヒッチェンマン(Ｈitzeman et al.)のＥＰ７３６５７に、さらに詳述されている。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターと共に好都合に使用される。哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのポリペプチド変異体の転写は、例えば、ポリオーマウイールス、鶏痘ウイールス(ＵＫ２,２１１,５０４：１９８９.７.５公開)、アデノウイールス(アデノウイールス２の如き)、牛パピローマウイールス、ニワトリ肉腫ウイールス、サイトメガロウイールス、レトロウイールス、肝炎Ｂウイールスそして最も好ましくは、シミアンウイールス４０(ＳＶ４０)の如きウイールスの染色体から得られるプロモーターによって、アクチンプロモーターやイムノグロブリンプロモーターの如き異種哺乳動物プロモーターによって、熱ショックプロモーターによって、およびポリペプチド変異体配列に通常伴なうプロモーターによって、これらのプロモーターが宿主細胞系に適合する限りにおいて、制御されている。
【０１１３】
ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイールス複製起点も含んでいるＳＶ４０制限酵素フラグメントとして、簡便に得られる（フィアーズら(Ｆires et al.,Ｎature,２７３：１１３(１９７８));ミューリガンとベルグ(Ｍulligan and Ｂerg,Ｓcience,２０９：１４２２−１４２７(１９８０);パブラキスら(Ｐavlakis et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,７８：７３９８−７４０２(１９８１))。ヒトのサイトメガロウイールスの前初期プロモーターは、ＨindIII Ｅ制限酵素処理フラグメントとして簡便に得られる(グリーナウエイら(Ｇreenaway et al.,Ｇene,１８：３５５−３６０(１９８２))。ベクターとして牛パピローマウイールスを用いる哺乳動物細胞宿主におけるＤＮＡ発現の系は、ＵＳ Ｐatent ４,４１９,４４６に記述されている。この系の修飾はＵＳ Ｐatent ４,６０１,９７８に記載されている。サル細胞における免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡの発現についてのグレイらの文献(Ｇray et al.,Ｎature,２９５：５０３−５０８(１９８２))を参照。単純ヘルペスウイールスからチミジンキナーゼプロモーターの制御下、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関するレイズらの論文(Ｒeyers et al.,Ｎature,２９７：５９８−６０１(１９８２))を参照。培養マウス及びウサギ細胞におけるヒトインターフェロンβ１の発現についてのカナーニイとベルグの論文(Ｃanaanni and Ｂerg,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,７９：５１６６−５１７０(１９８２))を参照。プロモーターとしてラウス肉腫ウイルースロングターミナルリピートを用い、ＣＶ−１サル腎細胞、ニワトリ胚芽線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨeＬa細胞およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現のゴーマンらの論文(Ｇorman et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,７９：６７７７−６７８１(１９８２))参照。
【０１１４】
（Ｖ）エンハンサー因子要素 本発明のポリペプチド変異体をコードするＤＮＡの高等真核細胞での転写は、そのベクターへエンハンサー配列を挿入することによって、しばしば増加される。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性因子で、通常１０〜３００ｂｐからなり、転写を増加するようプロモーターに作用する。エンハンサーは、比較的方向及び位置に従属性がなく、コード配列それ自体の中(オースボーンら(Ｏsbone et al.,Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,４：１２９３[１９８４])のみならず、イントロン(バネルジィーら(Ｂanerji et．al.,Ｃell,３３：７２９[１９８３])の中に、転写ユニットの５'と３'側に見出された(レイミンズら(Ｌaimins et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,７８：９９３[１９８１])及びラスキィーら(Ｌusky et al.,Ｍoll.Ｃell.Ｂio.,３：１１０８[１９８３])。多くのエンハンサー配列は、今や哺乳動物の遺伝子から知られている(グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インシュリン)。しかし、代表的には、真核細胞ウイールスからのエンハンサーが使用される。複製起点(１００〜２７０ｂｐ)のレイトサイドのＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイールス初期プロモーターエンハンサー、複製起点のレイトサイドのポリオーマエンハンサー及びアデノウイールスエンハンサーが例示される。真核プロモーターの活性化のためのエンハンス因子についてのヤニフの論文(Ｙaniv，Ｎature，２９７：１７−１８(１９８２))も参照のこと。そのエンハンサーはベクター中のポリペプチド変異体をコードする配列の５'と３'の位置において、スプライスされてもよいが、好ましくはプロモーターから５'の位置に位置している。
【０１１５】
（Ｖｉ）転写停止要素 真核細胞に使用されている発現ベクター(酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒトの細胞又は他の多細胞生物からの有核細胞)は、転写の停止またはｍＲＮＡの安定化のために必要な配列もまた含んでいるだろう。このような配列は、通常、真核又はウイールスＤＮＡ或はｃＤＮＡの非翻訳領域の５'末、時には３'末から得ることができる。これらの領域は、ポリペプチド変異体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化フラグメントとして転写されている核酸配列部分を含む。
【０１１６】
（Ｖii）ベクターの構築と分析 上に挙げた要素の１つ以上を含む適当なベクターの構築は、標準的ライゲーション技術を用いる。抽出したプラスミド又はＤＮＡフラグメントを必要とするプラスミドを生成するために、開裂し、仕立て、再ライゲートさせる。
正しい配列がプラスミドにおいて構築されたかを確認するために、ライゲーション混合物が、大腸菌，Ｅ.coli Ｋ１２(２９４株)(ＡＴＣＣ ３１,４４６)に形質転換のために使用され、適切ならば、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性菌を用いて、うまくいった形質転換体を選定する。形質転換体からプラスミドを取り出し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分折し、そして／又はメッシングらの方法(Ｍessing et al.,Ｎucleic Ａcids Ｒes.,９:３０９(１９８１))又はマキサムらの方法(Ｍaxam et al.,Ｍethods in Ｅnzymology，６５：４９９(１９８０))で、配列を決定する。
【０１１７】
（Ｖiii）一時的発現ベクター 本発明の実施に、殊に有用なのは、ポリペプチド変異体をコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一時的発現を提供する発現ベクターである。一般的には、一時的発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するような、宿主細胞で効率的に、複製しうる発現ベクターを使用することを含んでいる(サムブルークら、Ｓambrook et al.,上記，pp.１６.１７−１６.２２)。適切な発現ベクターと宿主細胞からなる一時的発現系は、所望とする生物学的または生理的性質をもったポリペプチドの迅速なスクリーニングのみならず、クローン化されたＤＮＡによってコードされているポリペプチド変異体の簡便な陽性同定法になる。このように、一時的発現系は、生理活性を有するポリペプチド変異体を同定する目的のための本発明に特に有用である。
【０１１８】
（iＸ）適切な典型的な脊椎動物細胞ベクター 組み換え脊椎動物細胞培養において、ポリペプチド変異体の合成に採用される好ましい他の方法、ベクター及び宿主細胞は、ゲーシングら(Ｇething et al.,Ｎature,２９３：６２０−６２５(１９８１))の論文、マンテイら(Ｍantei et al.,Ｎature,２８１：４０−４６(１９７７))の論文、ＥＰ１１７,０６０及びＥＰ１１７,０５８に記載されている。哺乳動物細胞培養によるポリペプチド変異体生産用の特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５(ＥＰ３０７,２４７)又はｐＳＶ１６Ｂ(ＷＯ９１／０８２９１,１９９１.６.１３公開)である。ｐＲＫ５の誘導体であるｐＲＫ５Ｂ(Ｈolmes et al.,Ｓcience,２５３:１２７８−１２８０[１９９１])が本発明におけるこのような発現のために、特に好適である。
【０１１９】
Ｄ．宿主細胞の選択と形質転換 本発明でのベクターのクローニングと発現に適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、高等真核細胞である。この目的にかなった原核生物は、エシェリキア(例えばＥ．coli)、エンテロバクター、エルウイニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ(例えばサルモネラ チフィムリウム)、セラチア(例えばセラチア マルセスセンス)、シゲラ、バシラス(例えばバシラス サチリス)、バシラス リチエニホルミス(例えばバシラス リチエニホルミス４１Ｐ:１９８９.４.１２公開のＤＤ２６６,７１０)、シュードモナス(例えばシュードモナス エールギノーサ)およびストレプトマイセスのような腸内細菌の如きグラム陰性とグラム陽性の如き真性細菌を含む。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、Ｅ.coli ２９４(ＡＴＣＣ３１,４４６)である。しかしＥ.coli Ｂ、Ｅ.coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１,５３７)、Ｅ.coli ＤＨ５αおよびＥ.coli Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７,３２５)も使用できる。これらは、限定的列挙でなく、例示である。
Ｗ３１１０株は、１つの特に好ましい宿主又は親宿主である。何故ならば、それは組み換え体ＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主細胞であるからである。好ましくは、宿主細胞は最小量の蛋白分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、宿主に内因性の蛋白をコードしている遺伝子に遺伝子的に変異をおこさせる様に修飾してもよい。例えば、Ｅ．coli Ｗ３１１０株１Ａ２(これは完全な遺伝子型tonＡΔを有する)、Ｅ．coli Ｗ３１１０株９Ｅ４(これは完全な遺伝子型tonＡΔ ptr３を有する)、Ｅ．coli Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ＡＴＣＣ５５,２４４)(これは完全な遺伝子型tonＡ ptr3 phoＡΔＥ１５Δ(arg Ｆ-lac)１６９ ΔdegＰΔompＴ kanγを有する)、Ｅ．coli Ｗ３１１０株３７Ｄ６(これは完全な遺伝子型tonＡ ptr3 phoＡΔ Ｅ１５Δ(argＦ-lac)１６９Δ degＰΔ ompＴΔ rbs ７ilvＧ kanγを有する)、Ｅ．coli Ｗ３１１０株４０Ｂ４(これは非カナマイシン耐性degＰ欠失変異を有する３７Ｄ６株である)、及び変異ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ.coli株(１９９０.８.７発行のＵＳ Ｐatent ４,９４６,７８３に開示されている)が例示される。他に、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ法又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適当である。
【０１２０】
原核生物の他に、糸状菌や酵母のような真核性微生物がポリペプチド変異体コードベクターの好ましいクローニング又は発現宿主である。一般のパン酵母であるサッカロミセス セレビシエは下等真核宿主微生物の中で最もよく利用される。しかし、沢山の他の属、種、株も一般に入手でき、ここで使用しうる。例えば、シゾサッカロミセス ポンベ(Ｂeach and Ｎurse，Ｎature,２９０:１４０[１９８１]，ＥＰ１３９,３８３(１９８５.５.２公開)；クルイベロミセス ラクチス(ＭＷ９８−８Ｃ,ＣＢＳ６８３,ＣＢＳ４５７４;Ｌouvencout et al.,Ｊ.Ｂacteriol.,７３７[１９８３])、クルイベロミセス フラジリス(ＡＴＣＣ１２,４２４)、クルイベロミセス ブルガリクス(ＡＴＣＣ１６,０４５)、クルイベロミセス ビッケラミー(ＡＴＣＣ２４,１７８)、クルイベロミセス ワルティー(ＡＴＣＣ５６,５００)、クルイベロミセス ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６,９０６；Ｖan den Ｂerg et al.，上記)、クルイベロミセス サーモトレランス及びクルイベロミセス マルキシアナスのようなクルイベロミセス宿主(ＵＳＰatent ４,９４３,５２９,Ｆleer et al.,上記)；ヤロービア(ＥＰ４０２,２２６)；ピチツア パストリス(ＥＰ１８３,０７０，Ｓkeekrishna et al.,Ｊ.Ｂasic Ｍicrobiol.,２８：２６５−２７８[１９８８]；カンジダ；トリコデルマリーシア(ＥＰ２４４,２３４)；ニューロスポラ クラッサ(Ｃase et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,７６：５２５９−５２６３[１９７９])；シュバニオマイセス オクシデンタリスのようなシュバニオマイセス(ＥＰ３９４,５３８；１９９０.１０.３１公開)；ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(ＷＯ９１／００３５７：１９９１.１.１０公開)のような糸状菌；及びアスペルギルス ニジュランス(Ｂallace et al.,Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.,１１２：２８４−２８９[１９８３]；Ｔilburn et al.,Ｇene,２６：２０５−２２１[１９８３]；Ｙelton et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,８１：１４７０−１４７４[１９８４])およびアスペルギルス ニガー(Ｋelley and Ｈynes,ＥＭＢＯＪ.,４：４７５−４７９[１９８５]のようなアスペルギルス宿主である。
【０１２１】
ポリペプチド変異体産生に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。このような宿主細胞は複雑なプロセシングの能力と、グリコシル化活性がある。原理的には、脊椎動物、非脊椎動物からであれ、どのような高等真核細胞培養も実施可能である。非脊椎動物細胞の例には植物細胞と昆虫細胞も含む。沢山のバキュロウイルス株、その変異体、スポドプテラ フルジペルダ(毛虫)、アエデスエジプテイ(蚊)、アエダス アルボピクタス(蚊)、ドロソフィラ メラノガスター(ミバエ)及びボルビワクス モリのような対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている(Ｌuckow et al.,Ｂio／Ｔechnology,６：４７−５５(１９８８)；Ｍiller et al.,in Ｇenetic Ｅngineering,Ｓetlow,Ｊ.Ｋ.et al.,eds.,Ｖol.８(Ｐlenum Publishing,１９８６),pp.２７７〜２７９；Ｍaeda et al.,Ｎature,３１５：５９２−５９４(１９８５)を参照のこと)。種々のトランスフェクション用のウイールス株は、公的に入手できる。例えばオートグラファ カルフォルニカ(Ａutographa Ｃalifornica)ＮＰＶのＬ−１変異株、ボンビクス モリ(Ｂombyx mori)ＮＰＶのＢm−５株があげられ、これらのウイールスは、本発明に従うウイールスとして、特に、スポドプテラ フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
【０１２２】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペツニア、トマトの植物細胞培養も宿主として使用できる。典型的には、ＤＮＡを含むように予め処理した細菌アグロバクテウム ツメファシエンスのある株を培養することによって、植物細胞がトランスフェクトされる。植物細胞培養液をアグロバクテウム ツメファシエンスと共にインキュベートしている間に、ポリペプチド変異体をコードしているＤＮＡがトランスフェクトするように宿主植物細胞に移入され、そして適当な条件下、そのＤＮＡを発現させる。さらに、植物細胞にふさわしい制御配列及びシグナル配列が利用される。例えば、ノパリンシンターゼプロモーターやポリアデニル化シグナル配列が利用される(Ｄepicker et al.,Ｊ.Ｍol.Ａppl.Ｇen.,１：５６１(１９８２))。さらに、Ｔ−ＤＮＡ ７８０遺伝子の上流側から摘出したＤＮＡが組み換えＤＮＡを含む植物組織で、植物−発現しうる遺伝子の転写レベルの活性化と増加を可能にする(ＥＰ ３２１,１９６：１９８９.６.２１公開)。
【０１２３】
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した細胞の増殖が近年ルーチン作業となってきた(Ｔissue Ｃulture,Ａcademic Ｐress,Ｋruse and Ｐatterson,editors[１９７３])。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で生長するようにサブクローン化された２９３，Ｇraham et al.,Ｊ.Ｇen Ｖitrol.,３６：５９[１９７７])；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Ｕrlaub and Ｃhasin,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ７７：４２１６[１９８０]);マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Ｍather,Ｂiol.Ｒrprod.,２３：２４３−２５１[１９８０])；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット腎細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝細胞(Ｈep Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Ｍather et al.,Ａnnals Ｎ.Ｙ.Ａcad.Ｓci.,３８３：４４−６８[１９８２])；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞(Ｈep Ｇ２)である。
【０１２４】
宿主細胞は、上述の本発明の発現又はクローニングベクターでトランスフェクトおよび好ましくは形質転換され、プロモーターを誘発するために、形質転換体を選出するために、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。トランスフェクシヨンは、コードされた配列が現実に発現しようとしまいと、宿主細胞により発現ベクターを取り込んだことを意味する。トランスフェクシヨンの多数の方法が当業者に公知で、例えばＣaＰＯ4法、エレクトロポレーシヨン法がある。トランスフェクシヨンの成功は、一般的に、このベクターの作動を示す表示が宿主細胞内で起きたときに認識される。
【０１２５】
トランスフォーメーシヨン(形質転換)は、ＤＮＡが生物体に導入されたとき、ＤＮＡが染色体外成分としてか又は染色体中に組み込まれることによって、複製しうるようにＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に依拠するが、形質転換は当該細胞に適した標準的手法を用いて行われる。サムブルーク(Ｓambrook)らの論文(上記)の１.８２節に記述されている塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法、又はエレクトロポレーシヨンは原核細胞又は実質的な細胞壁境界を含んでいる他の細胞で一般的に用いられる。アグロバクテリウム ツメファシエンスによる感染は、シヤウら(Ｓhaw et al.,Ｇene,２３：３１５(１９８３))の論文及びＷＯ８９／０５８５９(１９８９.６.２９公開)に記述されているように、ある種の植物細胞の形質転換のために使用される。さらに、ＷＯ９１／００３５８(１９９１.１.１０公開)に記載されているように、超音波処理を用いて植物のトランスフェクトを行ってもよい。
【０１２６】
このような細胞壁を有しない哺乳動物細胞に関しては、グラハムとファン デル エブ(Ｇraham and van der Ｅb，Ｖirology,５２：４５６−４５７(１９７８))のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的側面はアクセル(Ａxel)のＵＳ Ｐatent ４,３９９,２１６(１９８３.８.１６発行)に記載されている。酵母への形質転換は、バンゾーリンゲンら(Ｖan Ｓolingenet al.,Ｊ.Ｂact.,１３０：９４６(１９７７))及びヒシアオウ(Ｈsiao et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad,Ｓci.(ＵＳＡ),７６：３８２９(１９７９))の方法に従って行われる。しかし、細胞へのＤＮＡの他の導入法、例えば核マイクロインジェクシヨン、エレクトロポレーション、インタクト細胞とのバクテリアプロトプラスト融合、ポリブレンやポリオルニチン等のポリカチオン法がまた使用されうる。哺乳動物細胞の形質転換のための種々の方法に関しては、ケオウンら(Ｋeown et al.,Ｍethods in Ｅnzymology，１８５：５２７−５３７(１９９０))の論文とマンソアら(Ｍansour et al.,Ｎature,３３６：３４８−３５２(１９８８))の論文を参照のこと。
【０１２７】
Ｅ．宿主細胞の培養 本発明のポリペプチド変異体を製造するのに用いる原核細胞を、Ｓambrook等(上記)に一般的に記載されている適当な培地中で培養する。
本発明のポリペプチド変異体を製造するのに用いる哺乳動物細胞は、様々な培地中で培養し得る。ＨamのＦ−１０(Ｓigma)、Ｆ−１２(Ｓigma)、Ｍinimal Ｅssential Ｍedium(「ＭＥＭ」、Ｓigma)、ＲＰＭＩ−１６４０(Ｓigma)、Ｄulbeccoの改変 Ｅagle Ｍedium(「Ｄ−ＭＥＭ」、Ｓigma)およびＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２(ＧibcoＢＲＬ)等の商業的に入手し得る培地は、該宿主細胞を培養するのに適している。更に、例えば、ＨamおよびＷallace，Ｍethods in Ｅnzymology，５８：４４(１９７９)；ＢarnesおよびＳato，Ａnal.Ｂiochem.，１０２：２５５(１９８０)；米国特許第４,７６７,７０４号、第４,６５７,８６６号、第４,９２７,７６２号、第５,１２２,４６９号、または４,５６０,６５５号；再発行米国特許第３０,９８５号；国際公開９０／０３４３０または同８７／００１９５号に記載されたいずれの培地も、該宿主細胞用の培地として使用し得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子(インスリン、トランスフェリン、アプロチニン、および上皮増殖因子(ＥＧＦ)等の)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩等の)、緩衝液(ＨＥＰＥＳ等の)、ヌクレオシド(アデノシンおよびチミジン等の)、抗生物質(ゲンタマイシン等の)、微量元素(最終濃度がマイクロモルの範囲で通常存在する無機化合物)、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補い得る。いずれの他の必要な添加物も、当業者に知られているであろう適当な濃度で含めてもよい。温度、pＨ等の培養条件は、発現用に選択された宿主細胞について以前に用いられた条件であり、当業者には明らかであろう。
【０１２８】
一般に、インビトロでの哺乳動物細胞培養の生産性を最大にする原理、プロトコール、および実際的な技術は、Ｍammalian Ｃell Ｂiotechnology：ＰracticalＡpproach，Ｍ.Ｂutler編（ＩＲＬ Ｐress，１９９１）中に見出すことができる。
本明細書で言う宿主細胞は、インビトロ培養における細胞、そしてまた宿主動物内部にある細胞を包含する。
【０１２９】
Ｆ．遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子増幅および／または発現は、例えば、本明細書に示した配列に基いて、適当に標識したプローブを用いて、mＲＮＡの転写を定量するための公知のサザーンブロッティング、ノーザンブロッティング(Ｔhomas，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５[１９８０])、ドットブロッティング(ＤＮＡ分析)、またはin situハイブリダイゼーションにより、試料中で直接測定し得る。様々な標識を用い得るが、最も一般的には放射性同位体、特に32Ｐである。しかしながら、ポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いる等の他の技術も用い得る。次にビオチンは、アビジンまたは抗体に結合する部位として働き、それらは放射性同位体、蛍光体、酵素等の広範な標識で標識し得る。或いは、ＤＮＡ２重鎖(duplex)、ＲＮＡ２重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質２重鎖を含む、特異的な２重鎖を認識できる抗体を用いることができる。その抗体を標識し、その２重鎖が表面に結合する場所でアッセイを行い、その表面での２重鎖の形成によって、２重鎖に結合した抗体の存在を検出できる。
【０１３０】
或いは、遺伝子発現を、組織セクションの免疫組織学的染色および細胞培養物または体液のアッセイ等の免疫学的方法により測定して、遺伝子生成物の発現を直接定量してもよい。免疫組織学的染色技術の場合、典型的には脱水および固定により細胞試料を調製し、次に、結合する遺伝子生成物に特異的な標識した抗体と反応させる。標識は、通常、酵素標識、ケイ光標識、リン光標識等の視覚的に検出可能なものである。本発明での使用に適する特に鋭敏な染色技術は、Ｈsu等、Ａm.Ｊ.Ｃlin.Ｐath.，７５：７３４−７３８(１９８０)に記載されている。
【０１３１】
免疫組織的な染色および試料液のアッセイに用いる抗体付モノクローナルまたはポリクローナルであり得、いずれかの哺乳動物中で調製し得る。便利には、抗体は、以下のセクション４に更に記載のように、ポリペプチド変異体に対して作る。
【０１３２】
Ｇ．ポリペプチドの精製 変異体が第１段階として細胞内で製造されるなら、微粒状残渣、すなわち宿主細胞または溶解したフラグメントを、遠心分離または限外濾過により除去し、場合によりタンパク質を商業的に入手できるタンパク質濃縮フィルターで濃縮し、次いで、免疫アフィニティクロマトグラフ、イオン交換カラム分別(例えば、ジエチルアミノエチル(ＤＥＡＥ)またはカルボキシメチルまたはスルホプロピル基を有するマトリックスでの)、Ｂlue−Ｓepharose、ＣＭ Ｂlue−Ｓepharose，ＭＯＮＯ−Ｑ，ＭＯＮＯ−Ｓ，レンチルレクチン−Ｓepharose，ＷＧＡ−Ｓepharose、ＣonＡ−Ｓepharoseでのクロマトグラフィー、Ｅther Ｔoyopearl、Ｂutyl Ｔoyopearl，Ｐhenyl ＴoyopearlまたはプロテインＡ Ｓepharose、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ(例えば付加した脂肪族基を有するシリカゲル)、例えばＳephadexモレキュラーシーブまたはサイズ排除クロマトグラフィーを用いるゲル濾過、該ポリペプチドを選択的に結合するカラムでのクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈澱から選択される１以上の過程により他の不純物からポリペプチド変異体を分離する。
【０１３３】
細菌培養において製造される組換えポリペプチドは、細胞ペレットからの最初の抽出、１以上の遠心分離、塩折、水性のイオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程により通常単離され得る。最後に、ＨＰＬＣを最終精製工程に用い得る。該ポリペプチド変異体をコードする核酸の発現に用いる微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、ソニケーション、機械的破壊により、または細胞溶解剤を用いることを含むいずれかの便利な方法により破壊し得る。メチルスルホニルフルオライド(ＰＭＳＦ)等のプロテアーゼ阻害剤を、前述の工程のいずれかに含めて、タンパク質分解を阻害し、抗体を加えて外来の不純物の生長を抑制してもよい。
【０１３４】
他の態様では、組換えポリペプチド変異体を培地中に分泌する系からの上清液を、商業的に入手し得るタンパク質濃縮フィルター、例えばＡmiconまたはＭillipore Ｐellicon超濾過ユニットを用いて先ず濃縮する。濃縮工程の後、その濃縮物に適当な精製マトリックスを適用する。例えば、適当なアフィニティマトリックスは、該タンパク質に対するリガンド、適当な担体に結合したレクチンまたは抗体分子を含み得る。或いは、アニオン交換樹脂、例えばペンダントなＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基材を用い得る。適当なマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般的に用いる他のタイプを含む。或いは、カチオン交換工程を用い得る。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリックスを含む。スルホプロピル基が特に好ましい。
【０１３５】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ、例えばペンダントなメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を用いて、ポリペプチド変異体組成物を更に精製し得る。上述の精製工程のいくつかまたはすべてを、様々な組合せで用いて、均一な組換ポリペプチド変異体を得ることもできる。
【０１３６】
分泌ポリペプチドとしてポリペプチド変異体を製造する酵母の培養は精製を非常に簡単にする。大規模培養から生ずる分泌した組換えポリペプチド変異体は、Ｕrdal等、Ｊ.Ｃhromatog.，２９６：１７１(１９８４)に記載されたのと類似の方法で精製し得る。この文献は、製造用ＨＰＬＣカラムでの組換えヒトＩＬ−２の精製のための２つの順次のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を記載する。或いはアフィニティクロマトグラフィ等の技術を用いて該ポリペプチド変異体を精製してもよい。
【０１３７】
組換え培養で合成される哺乳動物のポリペプチド変異体は、培養からのポリペプチド変異体を回収するのに用いた精製工程に依存する量または性質の、タンパク質を含む非ヒトの細胞成分の存在により特徴づけられる。これらの成分は通常、酵母、原核性、または非ヒトの高級哺乳動物起源であろう。そして１重量％未満のオーダーで無害な不純物量で好ましくは存在する。
【０１３８】
Ｈ．ポリペプチド変異体の共有結合修飾物 ポリペプチド変異体の共有結合修飾物は本発明の範囲内に含まれる。それらは、化学合成により、または適用可能なら変異体ポリペプチドの酵素的若しくは化学的解裂により製造し得る。他のタイプのポリペプチド変異体の共有結合修飾は、ポリペプチド変異体の標的とするアミノ酸残基を、選択した側鎖またはＮ若しくはＣ末端残基と反応できる有機の誘導体化剤と反応させることにより、分子中に導入する。
【０１３９】
システイン残基は、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド等のα−ハロアセテート(および対応するアミン)と最も一般的に反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−(５−イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジサルファイド、メチル２−ピリジルジサルファイド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０１４０】
ヒスチジン残基は、ジエチルピロカーボネートと、この試薬がヒスチジン側鎖に比較的特異的であるので、pＨ５.５−７.０で反応することにより誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロマイドも有用である。その反応は、pＨ６.０で０.１Ｍカコジル酸ナトリウム中で好ましくは行われる。
【０１４１】
リジンおよびアミノ末端残基は、コハク酸また他のカルボン酸無水物と反応する。これらの試薬による誘導体化は、リジン残基の電荷を逆転する効果を有する。α−アミノを含有する残基を誘導体化する他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデート等のイミドエステル、ピリドキサールリン酸塩、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２,４−ペンタンジオンおよびトランスアミナーゼ触媒されるグリオキシレートとの反応を含む。
【０１４２】
アルギニン残基は、１または数個の公知の試薬、なかでもフェニルグリオキサール、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpＫaのため、アルカリ条件下に行う必要がある。さらにこれらの試薬は、リジン基およびアルギニンのイプシロンアミノ基と反応し得る。
【０１４３】
チロシン残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により行われ、スペクトル標識をチロシル残基に導入するという点で特に興味がある。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成させる。チロシル残基は、125Ｉまたは131Ｉを用いてヨード化され、ラジオイムノアッセイに用るための標識したタンパク質を調製する。上述したクロラミンＴ法が適している。
【０１４４】
カルボキシル側鎖基(アスパルチルおよびグルタミル)は、１−シクロヘキシル−３−(２−モルホリニル−４−エチル)カルボジイミドまたは１−エチル−３−(４−アゾニア−４,４−ジメチルフェニル)カルボジイミド等のカルボジイミド類(Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ')(ＲおよびＲ'は別のアルキル基である)との反応により選択的に修飾される。更にアスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラジニルおよびグルタミニル残基へ変換される。
【０１４５】
グルタミニルおよびアスパラジニル残基はしばしば脱アミド化され、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基となる。これらの残基は中性または塩基性条件下に脱アミドされる。これらの残基の脱アミドされた形は本発明の範囲内である。
【０１４６】
他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンおよびスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化(Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，Ｐroteins：Ｓtructure and Ｍolecular Ｐroperties，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman ＆ Ｃo，サンフランシスコ，７９−８６頁[１９８３])、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１４７】
本発明の範囲内のポリペプチド変異体の共有結合修飾の他のタイプは、ポリペプチド変異体の元のグリコシル化のパターンを変化させることを含む。「変化させる」とは、ポリペプチド変異体中に見出される１以上の炭水化物部分を削除すること、および／またはポリペプチド変異体に存在しない１以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１４８】
ポリペプチド変異体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合である。Ｎ−結合とは炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に結合することを言う。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン(Ｘはプロリンを除くいずれかのアミノ酸である)というトリペプチド配列は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合のための認識配列である。従ってポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によってグリコシル化部位の可能性が生じる。Ｏ−結合グリコシル化とは、糖類、Ｎ−アセチルガラクトサミン，ガラクトースまたはキシロースの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニン(５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用できる)への結合を言う。
【０１４９】
ポリペプチド変異体へのグリコシル化部分の付加は、アミノ酸配列を変化させて、１以上の上記トリペプチド配列(Ｎ−結合グリコシル化部位)を含ませることにより便利に行うことができる。その改変は、元のポリペプチド変異体の配列への、１以上のセリンまたはスチオニン残基の付加、またはそれらによる置換によっても行われる(Ｏ−結合グリコシル化部位)。容易のため、ポリペプチド変異体配列をＤＮＡレベルでの変化により好ましくは変化させる。特に好ましくは、あらかじめ選択した塩基でポリペプチド変異体をコードするＤＮＡを、所望のアミノ酸に翻訳されるであろうコドンを生成させるようミューテートさせることにより行われる。ＤＮＡミューテーションは上記の方法を用いて行う。
【０１５０】
ポリペプチド変異体で炭水化物部分の数を増加させる他の方法は、ポリペプチド変異体へのグリコシドの酵素的カップリングである。この方法は、それらが、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中でのポリペプチド変異体の製造を必要としないという点で有利である。用いるカップリング様式に依存して、糖を、(a)アルギニンおよびヒスチジン、(b)遊離カルボキシル基、(c)システインのそれのような遊離のスルフヒドリル基、(d)セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのそれのような遊離ヒドロキシル基、(e)フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのそれのような芳香族残基、または(f)グルタミンのアミド基に結合させる。これらの方法は１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０号およびＡplinおよびＷriston，ＣＲＣ Ｃrit.Ｒev.Ｂiochem.，２５９−３０６頁(１９８１)に記載されている。
【０１５１】
ポリペプチド変異体に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に行い得る。化学的な脱グリコシル化には、ポリペプチド変異体を、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または均等な化合物で処理することを必要とする。この処理は、ポリペプチド変異体を無傷に残しながら、結合糖(Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン)を除く大部分またはすべての糖の解裂をもたらす。化学的な脱グリコシル化は、Ｈakimuddin等、Ａrch.Ｂiochem.Ｂiophys.，２５９：５２(１９８７)、およびＥdge等、Ａnal.Ｂiochem.，１１８：１３１(１９８１)に記載されている。ポリペプチド誘導体の炭水化物部分の酵素的解裂は、Ｔhotakura等、Ｍeth.Ｅnzymol.，１３８：３５０(１９８７)に記載されたように様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼを用いることによって行い得る。
【０１５２】
グリコシル化の可能性のある部位におけるグリコシル化は、Ｄuskin等、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，２５７：３１０５(１９８２)に記載の如く化合物ツニカマイシンを用いることによって行い得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシル結合の生成をブロックする。
【０１５３】
他のタイプのポリペプチド変異体の共有結合修飾は、ポリペプチド変異体を、様々な非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの一つに、米国特許第４,６４０,８３５号、第４,４９６,６８７号、第４,３０１,１４４号、第４,６７０,４１７号、第４,７９１,１９２号および第４,１７９,３３７号に説明された方法で結合することを含む。
【０１５４】
３．治療用組成物：変異体の投与
アンチ−ＣＤ１８変異体の用途にはアンチ−Ｍacl／アンチ−好中球およびアンチ−ＬＦＡ−１製剤を含む。ポリペプチド変異体が抗体として作用する場合は、所望により第２のポリペプチドと融合してもよく、ＣＤ１１またはＣＤ１８抗原などの原料から、抗体またはその融合物はポリペプチド変異体が結合する蛋白を分離し精製するために用い得る。他の具体例において、本発明はここに記載のアンチ−Ｃ１１aまたはＣＤ１８抗体フラグメント変異体をＣＤ１１aまたはＣＤ１８を含む疑いのあるサンプル、特に血清試料と接触させ、結合が生じたとき検出することを含む、インビトロまたはインビボＣＤ１１aまたはＣＤ１８の検出方法を提供する。ここに記載のポリペプチド変異体はまた、未知量のポリペプチド変異体を含むサンプルが調製され得る標準また対照として定量的診断方法において使用され得る。
【０１５５】
特定の指示のためのポリペプチド変異体の治療用製剤は、所望の生理学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤と所望の純度を有するポリペプチド変異体を混和して冷凍乾燥ケーキまたは水溶液の形態で貯蔵用に製造される（Remington's Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.[1980]）。許容され得る担体、賦形剤、または安定剤は採用される投与量および濃度にて被投与者に対して毒性がない、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンなどの蛋白；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどののキレート剤：マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはツイーン、プルロニックス、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非−イオン性界面活性剤である。
【０１５６】
本発明の方法で用いられるポリペプチド変異体は、典型的には室温にて適切なｐＨで所望の純度にて、生理学的に許容され得る担体、すなわち、採用される投与量および濃度にて被投与者に対して毒性がない担体と混和することによって製剤化することができる。製剤のｐＨは主として変異体の具体的な用途および濃度によって変化するが、好ましくは約３〜約８の範囲のいずれかの範囲にある。適当な具体例の１つはｐＨ５−８の緩衝液の製剤である。
【０１５７】
ここで用いられるポリペプチド変異体は好ましくは滅菌される。滅菌は（０.２ミクロン）膜を通過させる滅菌濾過によって容易に行われる。通常ポリペプチド変異体は水溶液として貯蔵されるが、解凍用冷凍乾燥製剤も用い得る。
【０１５８】
変異体組成物は良好な医療行為に合致した方法で製剤化され、投与量が決められ、投与される。これに関連して考慮されるべき要因は処置されるべき具体的な障害、処置されるべき具体的な哺乳動物、各患者の臨床的症状、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画および医療行為者に周知の他の要因を含む。
投与されるべきポリペプチド変異体の「治療的有効量」とは、このような考慮すべき事由によって支配され、ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体については、リュヘーマチ性関節炎、炎症性応答の減少、免疫刺激の寛容の誘導、移植者またはその逆の移植の拒絶をもたらす免疫応答の阻害、または移植された移植片の生存の延長などを含む、ＬＦＡ−１伝達疾患を阻害、緩解、または処置のために必要な最小量である。変異体の量は好ましくは、移植者に対して毒性を示すか、または移植者を感染にかかりやすくする量以下である。
一般的な提案として、１回投与量当たり非経口的に投与されるＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の最初の医薬的有効量は、１日当たり約０.１〜２０mg/kg体重の範囲にあり、用いられるＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の典型的な初期投与の範囲は約０.３〜１５mg/kg/日である。
【０１５９】
上記のように、しかしながら、ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体のこれらの提案される量は大量の治療指示書に従う。適切な投与量および計画の選択のてがかりは上記のようにして得られた結果である。例えば、移植機能の急激な減退を特徴とする、進行中の急性の移植拒絶の処置や、急性拒絶の処置の後期の段階において比較的多量の投与量が最初に必要である。
【０１６０】
後続投与量が最初の投与量の１００％以下である場合、１日の投与量に基づいて計算される。すなわち、例えば、投与量の残りが、１日注射量２週間２mg/kg/日、ついで、隔週投与量９９日間０.５mg/kg/日ならば、１日投与を基礎として（すなわち、２／日／１００％＝０.５／１４日／Ｘ％＝〜１.８％）、後続投与量が初期投与量の約１.８％になる。後続投与量は、好ましくは、ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の初期投与量の約５０％以下であり、より好ましくは約２５％以下であり、さらに好ましくは約１０％以下であり、さらにより好ましくは約５％以下であり、もっとも好ましくは約２％である。
【０１６１】
ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の最も効果的な結果を得るためには、疾患により変化するが、初期投与量は疾患の最初の兆候、診断、発現、発生にできるだけ近接した時期、または自己免疫疾患の緩解時に投与される。好ましくは、初期投与は移植された移植片を伴う場合は抗原に暴露される前に始める。さらに、初期投与は抗原に対する暴露の前または実質的に同時であるときは、後続投与は初期投与よりも長期にわたって行われ、特に移植の場合は、患者の生命にとって続ける必要のない連続的な断続的持続投与が好ましい。
【０１６２】
ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の好ましい投与計画は初期投与（すなわち、望ましくない免疫応答時または前に、毎日より多い頻度および点滴による連続的投与を含む投与）および後続投与が１週間に約１回より多くない周期的投与である。より好ましくは、具体的な疾患によって変化するが、特に移植の場合は初期の毎日投与は少なくとも約１週間、好ましくは、少なくとも約２週間、例えば、移植片などの抗原に暴露された後、または急性免疫の始まり（自己免疫疾患におけるとき）後投与され、後続投与は、初期投与の終了後、少なくとも５週間、好ましくは少なくとも１０週間は２週間にたった１回投与される（好ましくは２週間に１回）。
【０１６３】
他の好ましい具体例において、特に、アンタゴニスト変異体が、アンチ−ＣＤ１１aまたはアンチ−ＣＤ１８抗体のＦabまたはＦ(ab')2ならば、初期投与は移植が行われた後、約１日〜４週間、より好ましくは１〜３週間、さらにより好ましくは２週間〜３週間で終了し、移植が行われる前約１週間から移植とほぼ同時に始まる。
【０１６４】
ポリペプチド変異体は、非経口的、皮下、腹腔内、肺内、経鼻、および所望により、局所免疫抑制処置については外傷内投与（移植前に液体をふりかけるか、または移植片とアンタゴニストを接触させることを含む）を含むなんらかの適切な手段で投与される。非経口的注入は筋肉内、静脈内、気管内、腹腔内または皮下投与を含む。さらに、ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体は、特にＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の投与量を減少させながらのパルス点滴によって投与される。投与がある程度短期か長期かに依存するが、好ましくはこの変異体は注射、もっとも好ましくは静脈内または皮下注射によって投与される。
【０１６５】
ここに記載のポリペプチド変異体は、そうとは限らないが、所望により当該障害の阻害または処置に現在使用されている１種またはそれ以上の試剤とともに製剤化される。例えば、リューマチ性関節炎では、ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体は糖質コルチコステロイドとともに投与されてもよい。さらに、Ｔ細胞受容体ペプチド治療は自己免疫脳脊髄炎の臨床的徴候を阻害するための適切な補助治療である。オファーら、Science，251:430-432(1991)。移植に際して、ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体は、例えば、シクロスポリンＡなどの上記の免疫抑制剤と同時に、または別に投与することができ、免疫抑制効果を調整する。このような他の試剤の有効量は製剤中に存在するＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の量、疾患または処置の種類、および上記で検討された他の要因により変化する。これらは一般に、前記で用いられたと同じ投与量および投与経路か、または前記で採用された投与量の約１〜約９９％の投与量で用いられる。
【０１６６】
上記の種々の自己免疫疾患は疾患の結果としての発病のもとで自己抗原に対する免疫寛容を誘導するような方法でＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体で処置される。これに関して、自己免疫疾患は移植片に対する移植者に似ており、同様の方法でＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体で処置され得る。しかし、この疾患においては、移植前の移植片の場合と異なり、患者はすでに標的抗原に対して免疫応答に至っている。すなわち、このような患者における通常の方法、例えば、シクロスポリンＡまたは他の常用の免疫抑制剤の常套的使用（単独でまたはＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体とともに）により、免疫抑制の一時的な段階を最初に誘導または維持するか、または緩解（自己免疫応答の病的または機能的徴候の欠如または実質的減少）の時期が始まるまで患者を観察することが望ましい。
【０１６７】
好ましくは、一時的な免疫抑制は常套治療のＴ細胞減少によって誘導する。ついで、その後、ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体を投与し、免疫抑制誘導剤を引っ込めた時またはそうでなければ緩解が終わった時の反動を阻害する。別法として、緩解患者の症状は激発の徴候をしっかりと観察し、すぐに、激発の最初の機能的または生化学的発現の際にすぐに、最初の投与計画を開始し、激発が収まるまで継続する。この時期のＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体投与はこの明細書のいずれかに記載の初期投与である。
【０１６８】
自己免疫疾患の場合は初期投与は１週間〜１６週間にわたる。その後、ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の低投与量維持処方が実質的に移植片または移植者の拒絶の緩解についてここに記述したと実質的に同じ方法で投与されるが、ある種の場合には移植の場合よりもより長期の後続または維持投与にまで延長するのが望ましい。本発明の具体例において、抗原またはその抗原を含む組成物が自己免疫応答に対して反応することが知られているならば、そのときは、初期ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体投与の後、その抗原を患者に投与（所望により、ＩＬ−１および／またはガンマインターフェロンとともに）し、その後、アンタゴニスト変異体投与を維持し、抗原に対する自己免疫およびの再発を抑え、一方で他の抗原に対する患者の応答を最小限に免疫抑制する。
【０１６９】
ＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体の初期処置のときは、所望により患者は隔離され、現在移植治療に用いられているような無菌環境が好ましい。患者はいかなる感染もしないようにすべきである。維持投与期間中はこれらの条件を維持する必要はなく、事実、本発明の利点の１つであるが、すなわち、患者は維持投与で処置されるとき、周囲抗原（移植片または自己抗原以外）に対する実質的に正常な免疫応答に到達し得る。
【０１７０】
ここに記載の本発明は特に生存期間を延長し、移植片の免疫寛容の増強になじむ。重要な術後期間（最初の３カ月間）は、移植片は所望により、適切な方法を用いて機能的に全身観察される。このような方法の１つは、トムソンら、ActaRadiol.，29:138-140(1988)に記載の９９Ｔcm−パーテクネテートを用いる放射性核種静脈内血管造影である。さらに、ここに記載の方法は同時に多臓器注入および移植になじむ。トレドーペレイラおよびマッケンジー、Am．Surg.，46:161-164(1980)。
【０１７１】
ある種の場合には、移植片の表面を修飾し陽性または陰性負荷基を与えるように、適当なアミノ酸またはポリマーを用いるか、または負荷官能基の生理学的に許容され得る試剤を結合させることによって移植片を修飾するのが望ましい。例えば、血液凝固を減少させるために血管には陰性負荷表面が適している。またフェニルアラニン、セリンまたはリジンを表面にカップリングさせることによって、表面を親油性または親水性にするのが場合により望ましい。これらの表面修飾にとって特に有効な免疫抑制剤はグルタールアルデヒドである。
【０１７２】
上述のように、移植前にＬＦＡ−１アンタゴニスト変位体の有効量が所望により投与され、移植片の寛容を誘導する。初期移植後に用いられるのと同じ投与量および計画が採用され得る。さらに、移植前に、移植片を所望により、Ｕ.Ｓ.特許５,１３５,９１５に記載のＴＣＧ−β組成物と接触させる。この開示をここに引用して本明細書の記載とする。要約すれば、接触は移植片を組成物とインキュベートまたは灌流させるか、移植片の１またはそれ以上の表面と組成物を接触させるのが適当である。製剤中のＴＣＧ−βの濃度、処置されるべき移植片および製剤の具体的な種類などの要因により変化するが、一般に処置は少なくとも１分、好ましくは１分〜７２時間、より好ましくは２分〜２４時間かかる。また、既述のように、移植片は同時にまたは別々にＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体と灌流させる。灌流はなんらかの適切な方法によって行われる。例えば、１９８４年９月５日公開のＤＤ２１３,１３４に記載のポンプと臓器の間に位置する圧力調整器を有し灌流の定常圧およびオーバーフローをもたらす装置を介して灌流され得る。別法として、１９８４年１１月２１日公開ＥＰ１２５,８４７に記載のように、臓器は密閉式開閉部材を経て高比重小室に置かれ、灌流剤は、液体を容器から引き込むポンプによって小室に送達され、消費され、灌流液はバルブによって容器に返送される。
【０１７３】
移植片が処置された後は、移植片は長時間貯蔵され、または手術中直ぐに用いるのに適している。１９８５年４月９日公開のＪＰ６００６１５０５に記載のように、貯蔵生存期間は製剤中の血液代替物（例えば、パーフルオロ化学乳剤）を用いるか、または移植片を冷却等張剤および抗凝固を含む含むＴＧＦ−βの製剤、ついでグリセリンと灌流させ、細胞の破壊なく摘出された臓器を冷凍させることによって、上記と同様に延長し得る。さらに、Ｕ.Ｓ.特許第４,４６２,２１５号および第４,４９４,３８５号に記載のように、臓器は公知の灌流液（上記のＴＧＦ−βおよび／またはＬＦＡ−１アンタゴニスト）中で保存するこができ、一方、臓器を冷蔵温度まで冷却し、細胞壊死を伴うことなく半永久的に臓器を保存することができる。
【０１７４】
心臓移植に関して、具体的に、ペアレントら、Cryobiology，18:571-576(1981)は５℃の移植前冷心臓灌流は着床の初期の同種移植の保護を増大すると報告している。移植片の保存に必要であると見なされるならば、これらの方法または他の方法は本発明の範囲内にある。
【０１７５】
移植前に、移植片はＴＧＦ−β組成物を含まないように、生理学的食塩水に浸漬するか、またはこの目的のための他の適当な手段によって洗浄する。移植前にＬＦＡ−１アンタゴニスト変異体を除去するのは望ましくない。
【０１７６】
また、移植前に所望により、移植者は１人またはそれ以上のドナー固有の血液の輸血が移植片の生き残りを促進するために行われる。移植手術の前または後に移植者を全体的なリンパ系照射(total lymphoid irradiation)にかける。特定の被移植者に有益な他のなんらかの前処置を本発明の方法の１部として行うことができる。
【０１７７】
４．抗体製剤（変異体が抗体−由来である場合）
(i)出発材料および方法
イムノグロブリン（Ｉg）およびある種のそれらの変異体は公知であり、多くは組換細胞培養で製造されてきた。例えば、Ｕ.Ｓ.特許第４,７４５,０５５号；第ＥＰ１２０,６９４号；ＥＰ第２５５,６９４号；ＥＰ２６６,６６３号；ＷＯ８８／０３５５９；フォルクナーら、Nature，298:286(1982)；モリソンら、J.Immun.,123:793(1979)；コーラーら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:2197(1980)；ラソら、Cancer Res.，41:2073(1981)；モリソンら、Ann．Rev．Immunol.，2:239(1984)；モリソン、Science，229:1202(1985)；モリソンら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6851(1984)参照。再選別された(reassorted)イムノグロブリン鎖は公知である。例えば、Ｕ.Ｓ.特許第４,４４４,８７８号；ＷＯ８８／０３５６５；およびＥＰ第６８,７６３号およびそれらに引用された文献参照。
本発明のポリペプチド変異体中のイムノグロブリン部分は、ＩgＧ−１、ＩgＧ−２、ＩgＧ−３、またはＩgＧ−４サブタイプ類、ＩgＡ、ＩgＥ、ＩgＤ、またはＩgＭから得られるが、好ましくはＩgＧ−１またはＩgＧ−３である。
【０１７８】
(ii)ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は一般に、当該抗体およびアジュバントの多重皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物中で産生される。例えば、マレイミドベンゾイル スルホスクシンイミド エステル（システイン残基によって結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基によって）、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣl2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ1は異なるアルキル基である）などの、二官能基化または誘導体化剤を用いて、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、牡ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターなどの免疫化されるべき動物種に免疫原性のある蛋白を、当該抗体と結合させるのが有用である。
【０１７９】
動物は、ペプチドまたはコンジュゲート１mgまたは１μg（それぞれウサギまたはマウスにつき）、フロイント完全アジュバント３容を混合し、その溶液を多部位に皮内注射することによって、抗原、抗原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化される。１カ月後、多部位に皮内注射によってフロイント完全アジュバント中ペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５〜１／１０で動物に追加抗原注射する。７〜１４日後、動物から採血し、血清の抗体力価の測定を行う。力価がプラトーに達するまで動物に追加抗原注射を行う。動物は、別の蛋白と、および／または別の架橋剤によって結合されているが、抗原は同じコンジュゲートで追加抗原注射するのが好ましい。コンジュゲートはまた、組換細胞培養中で蛋白融合物として製造され得る。また、ミョウバンなどの凝集剤は免疫応答を増強させるために適切に用いる。
【０１８０】
(iii)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体、すなわち、少数量存在していることがある潜在的な天然の突然変異を除いて同じポピュレーションを構成する個々の抗体のポピュレーションから得られる。このように修飾語句「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないものとしての抗体の特徴を表す。
【０１８１】
例えば、モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein，Nature，256: 495(1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製するか、または組換えDNA法（Cabillyら、上記）により製造することができよう。
【０１８２】
該ハイブリドーマ法において、マウスまたはハムスターのような他の適切な宿主動物を上記のごとく免疫し、免疫に使用するタンパク質と特異的に結合する抗体を製造するかまたは製造することができるリンパ球を誘発する。あるいはまた、リンパ球はin vitroで免疫することができよう。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適切な融合物質を用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，59-103頁[Academic Press，1986]）。
【０１８３】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含む適切な培養液中に接種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合は、典型的には、ハイブリドーマ用の培養液は、HGPRT−欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT培地）を含むであろう。
【０１８４】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選ばれた抗体産生細胞による高レベルの抗体産生を支持し、HAT培地のような培地に対して感受性の細胞である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞系は、Salk Institute Distribution Center，San Diego，California USAから入手可能なMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍、およびAmerican Type Culture Collection，Rockville，Maryland USAから入手可能なSP-2細胞から誘導されるようなネズミミエローマ系である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒト異種ミエローマ細胞系では、ヒトモノクローナル抗体を産生することも記載されてきた(Kozbor、J．Immunol.，133: 3001[1984];Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，51-63頁[Marcel Dekker，Inc.，New York，1987])。
【０１８５】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養液において、抗原に対するモノクローナル抗体の産生がアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)のようなin vitro結合アッセイによるかまたは免疫沈降法によって測定される。
【０１８６】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、MunsonおよびPollard、Anal．Biochem.，107: 220(1980)のScatchard分析によって測定することができる。
【０１８７】
所望の特異性、親和性、および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を確認し、次いで該クローンを、限界希釈法によってサブクローンし、標準的方法により増殖させることができよう（Goding，上記）。本目的に適した培養液には、例えばD-MEMまたはPRMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物中の腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることができよう。
【０１８８】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製法によって培養液、腹水、または血清から適切に分離される。
【０１８９】
モノクローナル抗体をコードするDNAは、容易に単離され、通常の手順（例えば、ネズミ抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源として用いられる。単離されたら、DNAを発現ベクター中に入れ、次いでこれをE.coli細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または該発現ベクターをトランスファーしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスファーする。抗体をコードするDNAの細菌における組換え発現に関する総説的文献には、Skerraら、Curr．Opinion in Immunol.，5: 256-262(1993)、およびPluckthun，Immunol．Revs.，130: 151-188(1992)が含まれる。
【０１９０】
さらなる態様において、抗体または抗体フラグメントを、CD11a、CD18、IgE、またはHER-2のような適切な抗原を用い、McCaffertyら、Nature，348: 552-554(1990)に記載の技術を用いて作製される抗体ファージライブラリーから単離することにより適切な抗体または抗体フラグメントを選ぶことができる。Clacksonら、Nature，352: 624-628 (1991)およびMarksら、J．Mol．Biol.，222: 581-597(1991)は、それぞれネズミおよびヒト抗体の、ファージライブラリーを用いる単離について記載している。その後の刊行物は、チェーンシャッフリング(Chainshuffling)（Markら、Bio/Technology，10: 779-783[1992]）、および非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのin vivo組換えおよび組み合わせ感染による高親和性（nM範囲）のヒト抗体の産生について記載している。したがって、これらの技術は、「モノクローナル」抗体を単離するための伝統的モノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わって実行可能である。
【０１９１】
該DNAは、ホモローガスなネズミ配列の代わりにヒト重−および軽−鎖定常ドメインをコードする配列で置換するか(Cabillyら、上記；Morrisonら、Proc．Nat．Acad．Sci.，81: 6851[1984])、または非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列のすべてまたは一部を、免疫グロブリンコード配列と共有結合することにより修飾することもできよう。
【０１９２】
典型的にはそのような非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインを置換するか、または該ポリペプチドで抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換することにより抗原に対する特異性を有する抗原結合部位、および別の抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【０１９３】
キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を含む方法を含む合成タンパク質化学で知られた方法を用いてin vitroで製造することもできよう。例えば、イムノトキシンはジスルフィド−交換反応を用いるかまたはチオエーテル結合を形成させることにより構築することができよう。本目的に適した試薬の例にはイミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
【０１９４】
診断的応用では、典型的には、抗体から誘導された本明細書中の変異体は検出可能な部分で標識されよう。検出可能な部分は、直接にかまたは間接的に検出可能なシグナルを生じることができるあらゆるものであり得る。例えば、検出可能な部分は3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉのようなラジオアイソトープ；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光またはケミルミネッセント化合物；例えば、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃまたは3Ｈのような放射性アイソトープ標識；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であってよい。
【０１９５】
Hunterら、Nature，144: 945(1962); Davidら、Biochemistry，13: 1014(1974); Painら、J．Immunol．Meth.，40: 219(1981); およびNygren，J．Histochem．and Cytochem.，30: 407(1982)に記載の方法を含む、ポリペプチド変異体を検出可能な部分と別々に結合させるための当該分野で知られたあらゆる方法を用いることができよう。
【０１９６】
(iv)ヒト化およびヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野でよく知られている。一般的には、ヒト化抗体はヒト以外の供給源からその中に導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変ドメインから取り出される。ヒト化は、Winterおよび共同研究者らの方法(Jonesら、Nature，321: 522-525[1986]; Riechmannら、Nature，332: 323-327[1988]; Verhoeyenら、Science，239: 1534-1536[1988])に従い、齧歯類のCDRｓまたはCDR配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより実質的に行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に完全なヒト可変ドメイン以下がヒト以外の種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体（Cabillyら、上記）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基およびおそらくいくつかのFR残基が齧歯類抗体中の類似の部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【０１９７】
ヒト化抗体を作製するのに用いられるヒト可変ドメイン（軽および重両方）の選択は抗原性を減らすのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法にしたがって、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は既知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーニングされる。次に、齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められている(Simsら、J．Immunol.，151: 2296[1993]; ChothiaおよびLesk，J．Mol．Biol.，196: 901[1987])。別の方法では、軽または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体用に用いることができよう(Carterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89: 4285[1992]; Prestaら、J．Immunol.，151: 2623[1993])。
【０１９８】
さらに、抗体が抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的特徴を保持してヒト化されることが重要である。好ましい方法によればこの目的を達成するには、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いる種々の概念的ヒト化生成物、および親配列の分析方法によって製造される。三次元免疫グロブリンモデルは当業者によく知られており、普通に利用可能である。選ばれた候補免疫グロブリン配列の、有望な三次元的立体構造を図解し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に対する結合能に影響を及ぼす残基の分析を行うことができる。このように、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性の増加といった所望の抗体特性を達成するためにコンセンサスおよび輸入配列から選び、結合することができる。一般的には、CDR残基は抗原の結合に対する影響に直接および最も実質的に関与している。
【０１９９】
あるいはまた、今や免疫に関して、内因性免疫グロブリン生成物の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、キメラおよび生殖系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（JH）のホモ接合体の欠失は内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系突然変異マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原チャレンジに対するヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Jakobovitsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90: 2551−255(1993); Jakobovitsら、Nature，362: 255-258(1993); Bruggermannら、Year in Immuno.，7: 33(1993)参照）。ヒト抗体はファージ−表示ライブラリー中で製造することもできる(HoogenboomおよびWinter、J．Mol．Biol.，227: 381[1991]; Marksら、J．Mol．Biol.，222: 581[1991])。
【０２００】
(v)二特異性抗体
二特異性抗体(BsAbs)は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体である。二特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ(ab')2二特異性抗体）から誘導することができる。
二特異性抗体の製造方法は当該分野で知られている。完全長二特異性抗体の伝統的製造法は、２本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖が異なる特異性を有する該重鎖−軽鎖対の共発現に基づいている(MillsteinおよびCuello、Nature，305: 537-539[1983])。免疫グロブリン重および軽鎖が無作為に寄せ集まっているために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つだけが正しい二特異性構造を有する１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成する。通常、アフィニティクロマトグラフィー段階によって行われる正しい分子の精製はかなりやっかいであり、生成物の収量は低い。同様な手順がWO93/08829（1993年５月13日公開）およびTrauneckerら、EMBO J.，10: 3655-3659(1991)に開示されている。
【０２０１】
別のより好ましい方法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは融合は、少なくとも、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行われる。融合の少なくとも１つ中に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを別の発現ベクター中に挿入し、適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。これは、構築物において用いられる３本のポリペプチド鎖の比が等しくないときに最適の収量が得られる態様において３本のポリペプチドフラグメントの相互の割合を調整する際の大きな柔軟性をもたらす。しかしながら、等比の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収量を生じるか、または該比が特別の有意性を有しないときは、１つの発現ベクター中に２本または３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０２０２】
この方法の好ましい態様では、二特異性抗体は１つの腕に第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他の腕にハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第2の結合特異性をもたらす）からなる。この非対称構造は、二特異性分子の１方の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することで分離が容易となるので、所望しない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望する二特異性化合物の分離が促されることがわかった。この方法は、1994年３月３日公開のWO94/04690に開示されている。さらに詳細な二特異性抗体製造方法については、例えば、Sureshら、Methods in Enzymology，121: 210(1986)を参照のこと。
【０２０３】
二特異性抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の１つはアビジンと、他方はビオチンと結合させることができる。そのような抗体は、例えば、所望しない細胞に対して免疫系細胞をターゲティングしたり（米国特許第4,676,890号）HIV感染を治療するために(WO91/00360、WO92/200373およびEP03089)提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる好都合な架橋法を用いて作製することができよう。適切な架橋剤は当該分野でよく知られており、多くの架橋技術と共に米国特許第4,676,980号に開示されている。
【０２０４】
抗体フラグメントから二特異性抗体を製造する技術は、文献中にも記載されている。例えば、二特異性抗体は、化学的結合を用いて製造することができる。Brennanら、Science，229: 81(1985)は、完全抗体を蛋白分解的に開裂し、Ｆ(ab')2フラグメントを形成させる手順について記載している。これらのフラグメントを、ビシナルジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防ぐために、ジチオール錯化剤である亜砒酸ナトリウムの存在下で還元する。次に、生じたFab'フラグメントをチオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換する。次いで、Fab'-TNB誘導体の１つをメルカプトエチルアミンで還元することによりFab'-チオールに再変換し、等モル量の他のFab'-TNB誘導体と混合しBsAbを形成させる。生じたBsAbは酵素を選択的に固定化するための物質として用いることができる。
【０２０５】
最近の進歩によりE．coliからFab'-SHフラグメントを直接回収することが容易となり、これを化学的に結合させて二特異性抗体を形成させることができる。Shalabyら、J．Exp．Med.，175: 217-225(1992)は、完全ヒト化BsAbＦ(ab')2分子の産生について記載している。各Fab'フラグメントは別々にE．coliから分泌され、in vitroで導かれる化学結合を受け、BsAbが形成される。このように形成されたBsAbはHER2レセプターを過剰発現している細胞および正常ヒトＴ細胞と結合し、ヒト肺癌標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができる（Rodriguesら、Int．J．Cancers，（Suppl.）7: 45-50(1992)参照）。
【０２０６】
組換え細胞培養から直接BsAbフラグメントを作製および単離する種々の技術についても記載されている。例えば、二特異性Ｆ(ab')2ヘテロダイマーは、ロイシンジッパー(zipper)を用いて作製されてきた(Kostelnyら、J．Immunol.，148(5): 1547-1553(1992))。FosおよびJunタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により２つの異なる抗体のFab'部分と結合させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成した。Hollingerら、Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)，90: 6444-6448(1993)に記載の「ディアボディ（diabody）」技術はBsAbフラグメントを作製するための別のメカニズムを提供してきた。該フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間をペアリングさせるには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（VL）と結合させた重鎖可変ドメイン(VH)を含む。したがって、１つのフラグメントのVHおよびVLドメインは、別のフラグメントの相補性VLおよびVHドメインとペアリングせざるをえなくなり、かくして２つの抗体結合部位が形成される。一本鎖Fv（sFv）ダイマーを用いてBsAbフラグメントを作製するための別の戦略についても報告されている（Gruberら、J．Immunol.，152: 5368(1994)参照）。これら研究者らは、25アミノ酸残基リンカーにより第2抗体のVHおよびVLドメインと結合させた第1抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体を設計した。リホールディングされた分子は、フルオレセインおよびＴ細胞レセプターと結合し、表面に共有結合したフルオレセインを有するヒト腫瘍細胞の溶解を再びもたらす。
【０２０７】
５．抗体変異体の使用
変異体抗体は、問題となる抗原、例えば、特異的な細胞、組織、または血清での抗原の産生に関する診断アッセイに有用である。変異体抗体を先に記載した方法と同様の方法で標識化し、そして／または不溶性のマトリックスに固定化する。抗原結合アッセイの一態様では、抗原に結合する抗体組成物を不溶性のマトリックスに固定化し、試験試料を固定化した変異体抗体組成物と接触させて、抗原を吸着させた後、その固定化した抗原を、離散性(discrete)発蛍光団等のような独自の標識により測定する、抗原に特異的な変異体抗体と接触させる。各々の独自の標識の存在および／または量を測定することにより、抗原の相対比および量を測定することができる。
本発明の変異体抗体はまた、患者を受動的に免疫する際にも有用である。
該変異体抗体はまた、組換え細胞培養または天然源からの、問題となる抗原のアフィニティー精製にも有用である。
【０２０８】
抗原およびその変異体抗体に関する適当な診断アッセイは、実質的には周知である。候補となる変異体を試験して、その変異体が適当な生物学的活性と半減期の増大を有するかどうかを調べる、以下の実施例に記載するバイオアッセイに加えて、競合、サンドイッチ、および立体阻害イムノアッセイ技術が有用である。競合およびサンドイッチ法は、該方法の不可欠な部分として相分離段階を利用するが、立体阻害アッセイは、単一の反応混合物で行う。基本的には、同様の手順を抗原のアッセイに、また抗原に結合する物質に使用するが、アッセイする物質の分子量によって、ある方法が有利となろう。従って、抗原または変異体抗体と呼ぶのとは別に、本明細書中では、試験すべき物質を、その状態にかかわらず、被検体と呼び、またその被検体に結合するタンパク質を、それらが抗体、細胞表面受容体、または抗原であろうとなかろうと、結合パートナーと称する。
【０２０９】
抗原またはその変異体抗体に関する分析方法は全て、次の試薬を１つまたはそれ以上使用する：標識化した被検体アナログ、固定化した被検体アナログ、標識化した結合パートナー、固定化した結合パートナー、および立体コンジュゲート。標識化試薬はまた、「トレーサー」としても知られている。
【０２１０】
試薬の固定化は、あるアッセイ方法を必要とする。固定化は、溶液中で固定されないままにある、いずれかの被検体から結合パートナーを分離することを伴う。このことは、水に不溶性のマトリックスまたは表面への吸着によってのように、アッセイ手順の前に結合パートナーもしくは被検体アナログを不溶化する(Ｂennichら、米国特許番号第３,７２０,７６０号)か、または(例えば、グルタルアルデヒド架橋を使用して)共有結合させるか、または例えば、免疫沈降によって、後でパートナーまたはアナログを不溶化することにより、都合よく成し遂げられる。
【０２１１】
競合またはサンドイッチアッセイとして知られている他のアッセイ方法は、十分確立されており、また商業的な診断産業で広く使用されている。
競合アッセイは、共通の結合パートナー上にある限られた数の結合部位に関して試験試料の被検体と競合するトレーサーアナログの能力に頼っている。一般には、結合パートナーを競合の前または後に固定化した後、その結合パートナーに結合したトレーサーおよび被検体を、結合していないトレーサーおよび被検体から分離する。この分離は、デカントする(その場合、その結合パートナーを予め不溶化しておく)か、または遠心分離する(その場合、その結合パートナーを競合反応の後に沈降させる)ことにより成し遂げられる。試験試料の被検体の量は、マーカー物質の量により測定される結合トレーサーの量に反比例する。既知量の被検体での用量−応答曲線を作成し、試験結果と比較して、試験試料中に存在する被検体の量を定量的に測定する。これらのアッセイは、酵素を検出可能なマーカーとして使用する場合、ＥＬＩＳＡシステムと呼ばれる。
【０２１２】
「ホモジーニアス(homogeneous)」アッセイと呼ばれる別の種類の競合アッセイは、相分離を必要としない。ここでは、酵素の被検体とのコンジュゲートを作製して、抗被検体が被検体に結合する場合、抗被検体の存在が酵素活性を改変するよう使用する。この場合には、抗原またはその免疫学的に活性なフラグメントを、ペルオキシダーゼのような酵素への二官能性有機ブリッジとコンジュゲートさせる。抗ポリペプチドの結合が標識の酵素活性を阻害するか、または増強するよう、コンジュゲートを抗ポリペプチドとの使用に選択する。この方法は、実質的にはＥＭＩＴという名の下で広く行われている。
【０２１３】
立体コンジュゲートは、ホモジーニアスアッセイに関する立体障害方法で使用される。これらのコンジュゲートは、ハプテンに対する抗体が、実質的には、抗被検体と同時にコンジュゲートを結合することができないよう、低分子量のハプテンを小さな被検体に共有結合させることにより合成される。このアッセイ手順の下、試験試料中に存在する被検体は、抗被検体を結合し、それによって、抗ハプテンをコンジュゲートに結合させて、コンジュゲートハプテンの性質の変化、例えば、ハプテンが発蛍光団である場合、蛍光の変化を起こすであろう。
【０２１４】
サンドイッチアッセイは特に、ポリペプチド変異体またはポリペプチド変異体抗体の測定に有用である。連続サンドイッチアッセイでは、固定化した結合パートナーを使用して、試験試料の被検体を吸着し、その試験試料を洗浄することにより取り除き、その結合被検体を使用して、標識化した結合パートナーを吸着した後、結合物質を残留トレーサーから分離する。結合トレーサーの量は、試験試料の被検体に正比例する。「同時」サンドイッチアッセイでは、標識化した結合パートナーを加える前に、試験試料を分離しない。一つの抗体としてモノクローナル抗体を、またもう一つの抗体としてポリクローナル抗体を使用する連続サンドイッチアッセイは、抗原活性に関して試料を試験する際に有用である。
前述のものは、ポリペプチド変異体および変異体抗体に関する、単に例示的な診断アッセイである。先に記載したバイオアッセイを含め、これらの被検体の測定に関して現在または将来開発される他の方法が本発明の範囲に含まれる。
【０２１５】
次の実施例を、限定するものとしてではなく説明するものとして示す。本明細書中の全ての引用の開示は、明らかに本明細書の一部を構成する。
【０２１６】
実施例 １
方法プラスミド構築
この実施例で利用するＦab(以下、Ｆabと呼ぶ)を構築するために使用する鋳型プラスミド pＨ５２を、Ｃunninghamら、Ｓcience ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）により記載されているプラスミド pＢ０４７５から誘導した。Ｆ１の起点(origin)に隣接する２つのＢamＨＩ部位をpＢ０４７５から取り除き、ＥcoＲＶおよびＳphl部位を使用して、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを、抗ＣＤ１８ Ｆab Ｈ５２をコードするＤＮＡ、バージョンＯＺ(Ｅigenbrotら、Ｐroteins １８：４９−６２（１９９４）)で置き換えた。従って、pＨ５２は、抗ＣＤ−１８ Ｆab Ｈ５２をコードするＤＮＡ(バージョンＯＺ)、軽および重鎖のＳＴIIシグナルペプチド、アルカリホスファターゼのプロモーター領域、Ｍ１３ ヘ ルパーファージ領域、およびアンピシリン耐性を含む。次のオリゴヌクレオチドを使用して、Ｆab変異体をpＨ５２のＫunkelの突然変異誘発(Ｋunkel、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ. ８２：４８８−４９２（１９８５）)により構築した。

【０２１７】
アミノ酸残基数は、Ｋabatら、上記、ＮＩＨ Ｐubl.Ｎo.９１−３２４２、第Ｉ巻、６４７−６６９頁（１９９１）に記載されているナンバリングシステムに従う。
Ｆab v１は、オリゴＶ１ＡおよびＶ１Ｃを組み込み；Ｆab v１bは、オリゴＶ１ＡおよびＶ１Ｂを組み込み；Ｆab v２は、オリゴ Ｖ２を組み込んだ。Ｆab v１、Ｆab v１b、およびＦab v２をコードするプラスミドを選択し、ジデオキシヌクレオチド配列決定(ＳequenaseTMプロトコル、Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical)を使用して、そのＤＮＡ配列を調べた。ＩgＧ１ヒンジ領域をコードするＤＮＡ、続いて、Ｈ５２の重定常部ドメインのＣ末端にある「ロイシンジッパー」を挿入することにより、Ｆ(ab')2構築物を作製した。挿入したアミノ酸配列は、

であった。
【０２１８】
別の組のＦabバージョンは、Ｆab v１bをベースにしている、すなわち、次のオリゴヌクレオチドを使用して、より長い半減期を示した変異体である。

Ｆab v３は、オリゴ Ｖ１Ｄを組み込み；Ｆab v４は、オリゴ Ｖ１Ｅを組み込み；Ｆab v５は、オリゴ Ｖ１Ｆを組み込み；およびＦab v６は、オリゴ Ｖ１Ｇを組み込む。
【０２１９】
変異体をコードするＤＮＡの発現
各々の変異体に関して、プラスミドＤＮＡをＥ.coliにトランスフォームした。次いで、その形質転換細胞を、５μg／ml カルベニシリンを含むルリアブロス(Ｌuria Ｂroth)(ＬＢ)プレートに塗布して、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを５ml［ＬＢ＋５μg／ml カルベニシリン］に播種して、３７℃で６−７時間培養した。次いで、その５mlの培養物を、２Ｌのバフル(baffled)フラスコ中のＡＰ５ 最少培地５００mlに加えて、３７℃で１６時間培養した。
ＡＰ５ 最少培地は、次のようにして作製する：１リットルにつき、グルコース(ＳigmaTMＧ−７０２１)１.５ｇ、工業用カザミノ酸(ＤifcoTM０２３１−０１−０)２.２ｇ、公定された酵母エキス(ＤifcoTM０１２７−０１−７)０.３ｇ、無水ＭgＳＯ4０.１９ｇまたはＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ(ＳigmaTMＭ２７７３)０.３９４ｇ、塩化アンモニウム(ＳigmaTMＡ９４３４)１.０７ｇ、ＫＣl(ＳigmaTMＰ５４０５)０.０７５ｇ、ＮaＣl(ＳigmaTMＳ３０１４)４.０９ｇ、１Ｍ トリエタノールアミン(pＨ ７.４)１２０.０mlを加え、スーパー−ＱTM水(Ｓuper−ＱTMＷater)を１.０Ｌまで十分に加え、さらにはまた、トリエタノールアミン１３３.２１ml、液体(Ｌiquid)(ＳigmaTMＴ１３７７７)、およびスーパー−ＱTM水９５０mlからなる１Ｍ トリエタノールアミン(pＨ ７.４)を加え、pＨをＨＣl(ＭallinckrodtTM２６１２)で７.４とし、スーパー−ＱTM水を１.０Ｌまで十分に加える。
これを、０.１μmのＳealkeenTMフィルターを通して濾過し、２−８℃で保存する。期限は６カ月である。
１Ｌの遠心分離ボトル中、細胞を３０００rpmで３０分間遠心し、上清をデカントして、そのペレット化した細胞を１時間凍結させた。そのペレットを、０.１Ｍ ベンズアミジン(Ｓigma)１００μlを加えた冷ＴＥ緩衝液(１０mＭ ＴＲＩＳ、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ ７.６)１０mlに再度懸濁させた。再度懸濁させたペレットを氷上で１時間撹拌し、１８,０００rpmで１５分間遠心し、上清をデカントして、氷上に保持した。
次いで、その上清を、カラムにＴＥ緩衝液１０mlを通すことにより予め平衡化しておいた、タンパク質Ｇ−セファロースTMファーストフロー(Ｐrotein Ｇ−ＳepharoseTMＦast Ｆlow)(Ｐharmacia)カラム［カラム床体積０.５ml］に通した。次いで、そのカラムをＴＥ緩衝液１０mlで洗浄して、ＴＲＩＳ(pＨ ８.０)０.５mlを含む管に、Ｆabを１００mＭ 酢酸(pＨ ２.８)２.５mlで溶出した。その溶出液をＣentricon−３０TM(Ａmicon)遠心機で０.５mlまで濃縮し、その濃縮した溶出液に、リン酸塩緩衝化塩類溶液２mlを加えて、その結果得られた混合物を０.５mlまで再度濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを操作して、タンパク質が産生されたことを確かめた。
【０２２０】
抗−ＣＤ１１／ＣＤ１８ Ｆab 変異体およびＦ(ab')2抗体フラグメントの精製手順の間に使用する分析方法
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)、および２つの異なった高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)法を使用して、精製工程の各々の段階で得られた生成物を分析した。使用したＨＰＬＣ法には、逆相クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーが含まれ、これらは、ＷＡＴＥＲＳTMＨＰＬＣシステムで行われた。
逆相クロマトグラフィーは、５０℃に維持した、逆相ＰＬＲＰ−ＳTM４.６×５０mmのカラム、粒径８mm(Ｐolymer Ｌaboratories、Ｓhropshire、英国)で行った。３１％ Ｂから４１％ Ｂまで次第に増加するリニアグラジエントを使用して、タンパク質を溶出した。緩衝液Ａは、脱イオン水中、０.１％ トリフルオロ酢酸を含んでおり、また緩衝液Ｂは、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル中、０.１％ トリフルオロ酢酸を含んでいた。流速を２ml／分に維持して、タンパク質のプロフィルを２１４nmでモニターした。
カチオン交換クロマトグラフィーによる分析は、５５℃に維持した、Ｂakerbondのカルボキシースルホン(ＣＳＸ)TM５０×４.６mmのカラム(Ｊ.Ｔ.Ｂaker Ｐhillipsburg、ニュージャージー)で行った。検出波長２８０nmを用い、pＨ ６.０からpＨ ８.０まで次第に増加するリニアグラジエントを流速２ml／分で使用して、タンパク質を溶出した。緩衝液Ａは、各々１６mＭのＨＥＰＥＳ／ＰＩＰＥＳ／ＭＥＳ(pＨ ６.０)を含んでおり、また緩衝液Ｂは、各々１６mＭのＨＥＰＥＳ／ＰＩＰＥＳ／ＭＥＳ(pＨ ８.０)を含んでいた。異なったＦab変異体を分離するために、リニアグラジエントを２５％ Ｂから５６％ Ｂまで２２分間操作した。Ｚipper−(Ｆab')2と(Ｆab')2抗体フラグメントを分離するために、リニアグラジエントを４０％ Ｂから１００％ Ｂまで２２分間操作した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、前もって成型された(precast)ＮovexTMゲル(Ｎovex、Ｓan Ｄiego、カリフォルニア)で行った。Ｍorrisseyの銀染色法を使用して、タンパク質を染色した。Ｍorrissey、Ａnal.Ｂiochem. １１７：３０７−３１０（１９８１）。
【０２２１】
抗−ＣＤ１１／ＣＤ１８ Ｆab 抗体フラグメントおよびＦab変異体の精製
同様の抽出および精製スキームを使用して、抗−ＣＤ１１／ＣＤ１８ Ｆab 抗体フラグメントおよび異なったＦab変異体を単離した。
抽出
凍結させた細胞ペレット(１００ｇ)を、５mＭ ＥＤＴＡ(細胞ペレット１ｇにつき、緩衝液５ml)を含む１２０mＭ ＭＥＳ緩衝液(pＨ ６.０)に室温で再度懸濁させて、マイクロ流動化装置(microfluidizer)(Ｍicrofluidics Ｃorporation、Ｎewton、マサチューセッツ)に３回通すことにより、完全に破壊した。そのホモジネートを０.２５％(ｖ／ｖ)ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)に調節して、固形物質のデブリを遠心分離(７２８０×ｇ、３０分、４℃)により取り除いた。
【０２２２】
ＡＢＸクロマトグラフィー
抗体フラグメントを含む上清を、精製水を用いて伝導率２.５ミリジーメンスまで希釈し、０.２２ミクロンのフィルター(Ｓuporcap−５０TM、Ｇelman Ｓciences、Ａnn Ａrbor、ミシガン)を通して濾過した後、５０mＭ ＭＥＳ／５mＭ ＥＤＴＡナトリウム(pＨ ６.０)(緩衝液Ａ)で平衡化した、１.６×９.５cmのＢakerbond ＡＢＸカラム(Ｊ.Ｔ.Ｂaker、Ｐhillipsburg、ニュージャージー)にロードした。溶出物を２８０nmでＵＶモニターした。ロードした後、ＵＶトレースがベースラインに戻るまで、そのカラムを緩衝液Ａで洗浄した。抗体フラグメントを、緩衝液Ａ中の０から１００mＭまでの硫酸アンモニウムの、２０カラム体積のグラジエントで溶出した。画分を、先の分析方法の項に記載したようなカチオン交換カラムで分析して、適宜プールした。
【０２２３】
ＳＰセファロース高性能(ＳＰＨＰ)クロマトグラフィー
そのＡＢＸプールを、注射用水(ＷＦＩ)を用いて伝導率４mＳ未満まで希釈し、２５mＭ ＭＯＰＳ緩衝液(pＨ ６.９)で平衡化した、ＳＰＨＰ １.６×９.２cmのカラム(Ｐharmacia Ｂiotech Ｉnc.、Ｐiscataway、ニュージャージー)にロードした。２５mＭ ＭＯＰＳ緩衝液(pＨ ６.９)中の０から２００mＭまでの酢酸ナトリウムの、２０カラム体積のリニアグラジエントにより、分離を達成した。画分を、先の分析方法の項に記載したようなＣＳＸ ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、適宜プールした。
【０２２４】
フォーミュレーション(Ｆormulation)
Ａmiconのスターセル(stir cells)およびＹＭ１０ メンブランフィルター(Ａmicon,Ｉnc.、Ｂeverly、マサチューセッツ)を使用して、抗体フラグメントを含むＳＰＨＰプールを５mg／mlまで濃縮した。ＳephadexTMＧ２５(ＰharmaciaＢiotech Ｉnc.、Ｐiscataway、ニュージャージー)でのゲル透過クロマトグラフィーにより、精製して濃縮した抗体試料をリン酸塩緩衝塩類溶液(ＰＢＳ)に緩衝液交換した。
【０２２５】
エンドトキシン測定
エンドトキシン測定を、Ｌimulus アメーバ細胞ライゼート試験(Ａssociates of Ｃape Ｃod Ｉnc.、Ｗoods Ｈole、マサチューセッツ)で行った。タンパク質１ｇにつき２未満のエンドトキシン単位(Ｅu)を含む試料を、薬物動態学研究に使用した。
【０２２６】
抗−ＣＤ１１／ＣＤ１８
Ｆ(ab')2抗体フラグメントの精製 Ｆ(ab')2フラグメントを、最初、ＡＢＸクロマトグラフィーによりロイシンジッパー(Ｆab')2変異体［ジッパー−Ｆ(ab')2］として精製した。Ｈ５２の重鎖のヒンジ領域の後にロイシンジッパードメインを加えることにより、この構築物を操作した。精製後、そのロイシンジッパードメインをペプシン消化により切断した後、このＦ(ab')2を、以下に記載するようなＳＰＨＰおよびＰhenyl ＴoyopearlTMクロマトグラフィーにより精製した。
【０２２７】
ジッパー−Ｆ(ab')2抗体フラグメントの抽出およびＡＢＸクロマトグラフィー
ジッパー−Ｆ(ab')2抗体フラグメントの抽出およびＡＢＸクロマトグラフィーは、Ｆab 抗体フラグメント変異体に関して先に記載したように行った。
【０２２８】
ジッパー−Ｆ(ab')2抗体フラグメントのペプシン消化
ＡＢＸにより精製したジッパー−Ｆ(ab')2をペプシンで処理し、その分子のロイシンジッパー部分を取り除いて、Ｆ(ab')2抗体フラグメントを得た。ＡＢＸにより精製した試料をＡmicomのスターセルで５mg／mlまで濃縮した後、１００mＭクエン酸ナトリウム緩衝液(pＨ ３.５)で１：３.５に希釈した。この溶液に、１００mＭ クエン酸ナトリウム緩衝液(pＨ ３.５)に溶解したペプシン(１mg／ml）を、１：１２のペプシン：タンパク質比で加えた。室温で４時間後、その混合物のpＨを１０％ ＮａＯＨでpＨ６.４まで上げた。
【０２２９】
ペプシンで処理したジッパー−Ｆ(ab')2抗体フラグメントのＳＰＨＰクロマトグラフィー
ロイシンジッパードメインおよび所望でない抗体フラグメントからのＦ(ab')2抗体フラグメントの精製は、Ｆab 抗体フラグメント変異体に関して先に記載したようなＳＰＨＰクロマトグラフィーにより成し遂げられた。
【０２３０】
ＳＰＨＰにより精製したＦ(ab')2抗体フラグメントのＰhenyl ＴoyopearlTMクロマトグラフィー
硫酸アンモニウムを加えることにより、ＳＰＨＰにより精製したＦ(ab')2プールを硫酸アンモニウム中で１.５Ｍとした。次いで、その調整したプールを、１.５Ｍ 硫酸アンモニウム、５０mＭ 酢酸ナトリウム、pＨ ５.４(緩衝液Ａ)で平衡化した、Ｐhenyl ＴoyopearlTM６５０Ｍ(Ｔosohaas、Ｍontgomeryville、ペンシルベニア)１.６×１０cmのカラムにロードした。２０カラム体積のグラジエントを、７０％ 緩衝液Ａから１００％ ５０mＭ 酢酸ナトリウム中の０.１５Ｍ 硫酸アンモニウム、pＨ ５.４(緩衝液Ｂ)まで操作した。先の分析方法の項に記載したような逆相およびＣＳＸ ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、画分を分析した。
【０２３１】
Ｆ(ab')2抗体フラグメントのフォーミュレーションおよびエンドトキシン測定
精製したＦ(ab')2抗体フラグメントのフォーミュレーションは、Ｆab 抗体フラグメント変異体に関して先に記載したように行った。エンドトキシン測定後、タンパク質１mgにつき２未満のＥuを含む試料を、以下に示す薬物動態学研究に使用した。
【０２３２】
マウスでの静脈内投与後の抗−ＣＤ１１／１８ 構築物の薬物動態学研究
マウスでの、５つのヒト化したhuＨ５２の抗−ＣＤ１８抗体フラグメント(構築物)の、この単回用量の薬物動態学研究の目的は、抗体フラグメントの非特異的クリアランスが定常部ドメインにおけるアミノ酸の変化により影響されるかどうかを測定することであった。血清試料を雄のＣＤ１マウスから２４時間かけて集め、ヒト抗−ＣＤ１８ 血清濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
研究する抗−ＣＤ１８ 抗体フラグメントは、先に記載したような、Ｅ.coli.が産生した組換えヒト化モノクローナル Ｆab 抗体フラグメントから誘導した。
そのＦab フラグメント、および２つのＦab'サブユニットがジスルフィド結合で一緒につながった構築物を研究した。最後に、定常部ドメインにおけるアミノ酸を変えることにより、元のＦabの３つの新しいバージョンを構築した。その構築物のさらなる記述に関しては、以下の研究計画表を参照。
その構築物の抗原結合部位は、白血球の表面上にあるＣＤ１１／ＣＤ１８ 糖タンパク質複合体のＣＤ１８ サブユニットに向けられる。これらの抗体フラグメントは、チンパンジーとヒトに特異的である；従って、マウスで得られた血清薬物動態学の知識は、フラグメントの非特異的クリアランスの記述を与える。
この研究で、線形の(linear)薬物動態学が予想されたので、複数回用量レベルよりむしろ、２mg／kgの単回用量レベルを選択した。

【０２３３】
５つの抗体構築物の薬動力学を、雄性Ｃrl：ＣＤ−１（登録商標）（ＩＣＲ）ＢＲＶＡＦ／プラス（登録商標）マウス（およそ２０〜３０ｇ）において試験した。それぞれ２０匹からなる５つの群に、尾静脈より２ｍg／ｋg用量を静脈ボーラス投与した。投与後５及び３０分、１、２、４、８、１２、１６、２０及び２４時間後に血液試料を採取した。血清を得、抗体フラグメントの濃縮物を、ＭＡＣ−１捕捉ＥＬＩＳＡで以下のようにして測定した。
【０２３４】
９６穴マイクロタイタープレートを、ネズミ抗ＣＤ１８モノクローナル抗体で一晩コーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ希釈液で１時間ブロッッキングした。ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／０.０５％ポリソルベート（登録商標）２０である。この緩衝液は、１Ｌあたり、５０ｍＬの２０倍ＰＢＳ／１.０％ポリソルベート（登録商標）２０（ＮａＣl １６０ｇ、ＫＣl４.０ｇ、Ｎa2ＨＰＯ4２２.６ｇ及びＫＨ2ＰＯ4４.０ｇを、ガラス-蒸留水又は脱イオン水に溶解し、１０.０ｍＬのポリソルベート（登録商標）２０［シグマ（登録商標）Ｐ−１３７９又は同等物］を加え、１０００ｍＬとし、０.２２μｍ又はそれ以下のフィルターを用いて滅菌濾過することにより得た混合物）を調製し、蒸留又は脱イオン水で１.０Ｌに希釈し、室温で保存する。使用期限は調製の日から２週間である。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡ希釈液は、ＰＢＳ／０.５％ＢＳＡ／０.０５％ポリソルベート（登録商標）２０／０.０１％チメロサール（登録商標）／１ｍＭ ＣaＣl2／１ｍＭ ＭgＣl2であった。この希釈液は、１Ｌあたり、ウシ血清アルブミン（Armour（登録商標）Ｎ００６８又は同等物）５.０ｇ、２０倍ＰＢＳ／１.０％ポリソルベート（登録商標）２０／０.２％チメロサール（登録商標）（ＮaＣl １６０ｇ、ＫＣl ４.０ｇ、Ｎa2ＨＰＯ4２２.６ｇ及びＫＨ2ＰＯ4４.０ｇを、ガラス-蒸留又は脱イオンした水に溶解し、１０.０ｍLのポリソルベート（登録商標）２０［シグマ（登録商標）Ｐ−１３７９又は同等物］及びチメロサール（登録商標）［シグマＴ−５１２５又は同等物］を加え、１０００ｍLとして得た混合物）、０.１％（ｖ／ｖ）１Ｍ ＣaＣl2（ジェネンテク（登録商標）Ａ３１６５）、０.１％（ｖ／ｖ）１Ｍ ＭgＣl2（ジェネンテク（登録商標）Ａ３１６７）を、蒸留又は脱イオン水で１.０Ｌに希釈し、２〜８℃で保存した。使用期限は調製の日から１ヶ月である。
【０２３６】
ブロッキングした後、再度、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、可溶性ＭＡＣ１（Bermanら，J．Cell．Biochem.，52，183−195（1993）に記載されているＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を、切り取られた（truncated）ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ヘテロダイマーを発現しているＣＨＯ細胞によりならした培地の濃縮物から捕捉した。２時間インキュベーションした後、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で６回洗浄し、試験するマウス血清試料１００μL又はホモローガスな組換えヒト抗ＣＤ１８Ｆabを含む標準を加えた。マウス血清試料をＥＬＩＳＡ希釈液で最初に１／１０に希釈した後、さらに試料希釈液で１／４に希釈し、この初発１／４０希釈液から１００μLを取った。試料希釈液は、ＥＬＩＳＡ希釈液中の１０％ Swiss Webster Mouse血清である。２時間インキュベーションした後、再度、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で６回洗浄し、ヒトＦａｂに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲートＦ(ａｂ')2１００μLを加えた。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で上記のように洗浄し、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）２.２mmol／Ｌ及び過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）０.０１２％（ｖ／ｖ）含むｐＨ７.２のリン酸緩衝生理食塩水１００μLを各ウェルに加えた。色が完全に現れたら、４.５mol／Ｌ硫酸を各ウェルあたり１００μL加えて反応を止めた。SLT Labinstruments製の自動プレートリーダーを用いて、ウェル内容物の吸光度を４９２ｎｍで測定し、４０５ｎｍのバックグランド吸光度を差し引いた。データは、４−パラメーター、非線形パラメーターの最小二乗法のためのアルゴリズムに基づく曲線フィッティングプログラムを用いて換算した。
【０２３７】
血清濃度対時間のデータを、非線形曲線フィッティングプログラムを用いて分析し、次いで薬動力学パラメーターを推定した。D'Argenio Schumitzky，ADAPTII User's Guide，Biomedical Simulations Resource，University of Southern California，Los Angeles，第２版（１９９０）。
【０２３８】
２−コンパートモデルを使用して、５つの群の、血清濃度対時間のデータを特徴付けした。１次モデルパラメーター及び計算された薬動力学パラメーターについては、表２を参照されたい。２−コンパートモデルフィットを、第１Ａ図及び第１Ｂ図に示したデータ上に重ねた。データの一覧を表３に示す。すべての群について、セントラルコンパートメントの体積は血漿体積にほぼ等しかった。



【０２３９】
結果
データを第１Ａ図及び第１Ｂ図に示す。第１Ａ図は、５つの構築物全ての０〜５時間の薬動力学を示し、第１Ｂ図は、５つの構築物全ての０〜２５時間の薬動力学を示す。初期（又はα−相）の半減期は、後期（又はβ−相）の半減期が変化したように変化した。Ｆａｂｖ１Ｂ変異体はクリアランスが８０ｍＬ／ｈｒ／ｋgであり、これはダブルジスルフィド（Ｆａｂ'）2に比べて約３倍高い。Ｆａｂｖ１、Ｆａｂ、及びＦａｂｖ２は、Ｆａｂｖ１Ｂに比べておよそ３倍、ダブルジスルフィド（Ｆａｂ'）2に比べて約６倍大きなクリアランスを有していた（それぞれ１７３、１８９及び１９０ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ）。
元のＦａｂの有効分子量は、４９ｋＤであり、そのクリアランスは１８９ｍＬ／ｈｒ／／ｋｇであった。
【０２４０】
Ｆａｂバージョン１、１Ｂ及び２はすべて、元のＦａｂと同じ分子量を有していたが、バージョン１Ｂの血清からの排出は２倍遅かった。即ち、Ｆａｂ定常部領域におけるアミノ酸配列の変化は、クリアランスに影響を及ぼしている。β−相半減期においてみられた効果は、成功度の低い２つの変異体１及び２に関しては、耐久時間全体を有意に増加させるには不十分であるという効果が検出可能であったことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１ａおよび１ｂは、マウスに２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与にて１回投与した場合の５種のＦａｂまたは（Ｆａｂ'）2構築物の血清薬物動態を表す。図１ａでは、Ｆａｂｖ１Ｂ変異体を黒四角、Ｆａｂコントロールを黒菱形、Ｆａｂｖ２変異体を黒三角、Ｆａｂｖ１変異体を黒丸およびダブルジスルフィド（Ｆａｂ'）2を白丸で示す。図１ｂでは、Ｆａｂコントロールを黒三角、Ｆａｂｖ２変異体を白丸、Ｆａｂ’変異体を白四角、Ｆａｂｖ１Ｂ変異体を黒丸およびダブルジスルフィド（Ｆａｂ'）2を黒四角で示す。これらの分子については本明細書中の表により詳細に記載されている。
【図２】図２は、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１ドメイン（配列番号４）、ヒトＩｇＧ２ＣＨ１ドメイン（配列番号５）、ヒトＩｇＧ３ＣＨ１ドメイン（配列番号６）、ヒトＩｇＧ４ＣＨ１（配列番号７）、ヒトκＣＬドメイン（配列番号８）およびヒトλＣＬドメイン（配列番号９）の共通アミノ酸配列の関連部分のアラインメントならびに抗ＣＤ１８抗体由来のＦａｂｖ１ｂ変異体（配列番号１０）（実施例１に記載）とのアラインメントである。この図では、Ｆａｂｖ１ｂの配列のうち、本発明の対象であり、かつ最も重要なアミノ酸残基および／または位置（すなわち配列番号３および１）には、それぞれ下線および星印を入れている。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓から排出されＩgＧのＦc領域を含まない目的とするポリペプチドの、ポリペプチド変異体であって、ＩgＧのＦc領域のサルベージレセプター結合エピトープを含み、目的とするポリペプチドよりも長いインビボ半減期を有する変異体。
【請求項２】
目的とするポリペプチドが、ＣＨ２ドメインでないＩｇドメイン又はＩｇ様ドメインを含むものである、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
エピトープがＩｇドメイン又はＩｇ様ドメイン内に含まれている、請求項２に記載の変異体。
【請求項４】
Ｉｇドメイン又はＩｇ様ドメインがＣＨ１ドメインを含んでいる、請求項３に記載の変異体。
【請求項５】
エピトープが、Ｆｃ領域の１又は２のループに由来するものであり、Ｉｇドメイン又はＩｇ様ドメインへと移されているものである、請求項３に記載の変異体。
【請求項６】
エピトープが、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに由来するものであり、ＩｇのＣＨ１、ＣＨ３若しくはＶH領域又は１以上のそれらの領域へと、又はＩｇ様ドメインへと移されているものである、請求項５に記載の変異体。
【請求項７】
エピトープが、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに由来するものであり、ＩｇのＣL領域若しくはＶL領域又はその両方へと、又はＩｇ様ドメインへと移されているものである、請求項５に記載の変異体。
【請求項８】
目的とするポリペプチドが、Ｆａｂ、（Ｆａｂ'）2、ジアボディ、Ｆｖフラグメント、１本鎖Ｆｖフラグメント又はレセプターである、請求項３に記載の変異体。
【請求項９】
目的とするポリペプチドが、ＬＦＡ−１アンタゴニストである、請求項８に記載の変異体。
【請求項１０】
目的とするポリペプチドが、抗ＬＦＡ−１抗体のＦａｂ又は（Ｆａｂ'）2である、請求項９に記載の変異体。
【請求項１１】
目的とするポリペプチドが、抗ＣＤ１８Ｆａｂ又は抗ＣＤ１８（Ｆａｂ'）2である、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
ヒトの又はヒト化された、請求項１１に記載の変異体。
【請求項１３】
エピトープが、配列：ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号３）を含んでいる、請求項１２に記載の変異体。
【請求項１４】
配列：ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号１１）をさらに含んでいる、請求項１３に記載の変異体。
【請求項１５】
配列：ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１）をさらに含んでいる、請求項１３に記載の変異体。
【請求項１６】
配列：ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２）をさらに含んでいる、請求項１３に記載の変異体。
【請求項１７】
配列：ＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号３１）をさらに含んでいる、請求項１３に記載の変異体。
【請求項１８】
エピトープが、配列：ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２）、ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号１１）又はＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号３１）と、ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号３）とを含んでいる、請求項１に記載の変異体。
【請求項１９】
エピトープが、目的とするポリペプチドに融合している、請求項１８に記載の変異体。
【請求項２０】
目的とするポリペプチドが、成長ホルモン又は神経発育因子である、請求項１９に記載の変異体。
【請求項２１】
請求項１に記載の変異体をコードしている核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む複製可能なベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の宿主細胞を培地中で培養し、宿主細胞カルチャーから変異体を回収することを含んでなる、ポリペプチド変異体を製造する方法。
【請求項２５】
変異体が培地から回収されるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
配列：ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２）、又はＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号３１）と、ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号３）
とを含んでいる、Ｆｃではない変異体ポリペプチド。
【請求項２７】
ポリペプチド変異体を製造する方法であって、腎臓から排出されＩgＧのＦc領域を含まない目的とするポリペプチドを、ＩgＧのＦc領域のサルベージレセプター結合エピトープを含み、増加したインビボ半減期を有するように、改変することを含んでなる方法。
【請求項２８】
改変する工程を、部位特異的、カセット、又はＰＣＲ突然変異誘発により行う、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
増加したインビボ半減期を有するポリペプチド変異体を製造する方法であって、（１）ＩgＧ分子のＦc領域上のサルベージレセプター結合エピトープの配列及びコンフォメーションを同定し；
（２）腎臓から排出されＩgＧのＦc領域を含まない目的とするポリペプチドの配列を改変して、同定された結合エピトープの配列及びコンフォメーションを含有せしめ；
（３）工程（２）の改変したポリペプチドを、目的とするポリペプチドの半減期より長いインビボ半減期について試験し；
（４）変化させたポリペプチドがより長い半減期を有していない場合は、目的とするポリペプチドの配列をさらに改変して、同定された結合エピトープの配列及びコンフォメーションを含有せしめ、より長いインビボ半減期が得られるまで、より長いインビボ半減期について試験することを含んでなる方法。
【請求項３０】
処置が必要な哺乳類に、請求項９に記載の変異体の有効量を投与することを含んでなる、ＬＦＡ−１が関与する障害を処置する方法。
【請求項３１】
処置が必要な患者に、請求項１２に記載の変異体の有効量を投与することを含んでなる、ＬＦＡ−１が関与する障害を処置する方法。

【図１】

【図２】

【公開番号】特開２００７−１４３５５２（Ｐ２００７−１４３５５２Ａ）
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００６−３２４８６５（Ｐ２００６−３２４８６５）
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【分割の表示】特願平８−５３１０３７の分割
【原出願日】平成８年３月２８日（１９９６．３．２８）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】