本発明は、インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２及びその変異体の可溶性断片と、ＲＮＡキャップ類似体を含むその結晶化複合体とに関する。本発明は、ＲＮＡキャップ結合ポケットと相互作用する化合物をスクリーニング及び設計するための、上記複合体の構造座標を使用する演算方法にも関する。加えて、本発明は、好ましくはハイスループット設定において、上記ＰＢ２ポリペプチド断片を使用することにより、ＲＮＡキャップ結合ポケットを含むＰＢ２ポリペプチド断片と結合し、好ましくはＲＮＡキャップ又はその類似体との相互作用を阻害する化合物を同定する方法に関する。本発明は、マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスにより引き起こされるウイルス感染による疾患状態の治療のための化合物、及びこの同定した化合物を含む薬学的組成物にも関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２又はその変異体由来であり、且つ（ｉｉ）ＲＮＡキャップ又はその類似体と結合することができる、可溶性ポリペプチド断片。
【請求項２】
結晶化に適切な程度まで精製されている、請求項１に記載のポリペプチド断片。
【請求項３】
該インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２が、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス若しくはインフルエンザＣウイルス又はその変異体由来である、請求項１又は２に記載のポリペプチド断片。
【請求項４】
（ｉ）Ｎ末端が配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５１０以下と同一であるか若しくはそれに対応する、
（ｉｉ）Ｎ末端が配列番号２によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２２以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号２によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５１１以下と同一であるか若しくはそれに対応する、又は
（ｉｉｉ）Ｎ末端が配列番号３によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２７以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号３によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５２８以下と同一であるか若しくはそれに対応するポリペプチド断片、及びＲＮＡキャップ又はその類似体と会合する能力を保持するその変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド断片。
【請求項５】
配列番号４〜配列番号１３によるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するか又はそれに対応するポリペプチド断片、及びＲＮＡキャップ又はその類似体と会合する能力を保持するその変異体である、請求項４に記載のポリペプチド断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド断片と、ＲＮＡキャップ又はその類似体とを含む、複合体。
【請求項７】
該キャップ類似体が、ｍ^７Ｇ、ｍ^７ＧＭＰ、ｍ^７ＧＴＰ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＵ及びｍ^７ＧｐｐｐＵｍから成る群から選択される、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記ポリペプチド断片が配列番号１１によるアミノ酸配列から成り、前記キャップ類似体がｍ^７ＧＴＰであり、図１８に示すような構造座標により規定される構造を有する、請求項６に記載の複合体。
【請求項９】
空間群Ｃ２２２_１と、ａ＝９．２ｎｍ、ｂ＝９．４ｎｍ、ｃ＝２２．０ｎｍ（±０．３ｎｍ）の単位格子寸法とを有する結晶形態を有する、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
該結晶が、３．０Å以上、好ましくは２．４Å以上の分解能までＸ線を回折する、請求項８及び９に記載の複合体。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド、又は請求項１２に記載の組換えベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットの全部又は一部と会合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）図１８に示すような請求項８に記載の複合体の構造座標により規定される前記結合ポケットのコンピュータモデルを構築する工程、
（ｂ）有望な結合化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させ前記化合物とすること、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択すること、及び
（ｉｉｉ）前記化合物の新規リガンド設計
から成る群から選択される方法により有望な結合化合物を選択する工程、
（ｃ）演算手段を使用する工程であって、該結合ポケットにおける前記化合物のエネルギを最小化した立体配置を提供するために、前記化合物と前記結合ポケットとのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、演算手段を使用する工程、並びに
（ｄ）前記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、前記化合物と該結合ポケットモデルとの間の会合を定量化し、それにより前記結合ポケットと会合する前記化合物の能力を評価する、結果を評価する工程、
を含む、同定する方法。
【請求項１５】
前記結合ポケットが、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４、又はそれに対応するアミノ酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合ポケットが、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３、又はそれに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合ポケットが、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合ポケットが、アミノ酸Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合ポケットが、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４の構造座標により規定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３の構造座標によりさらに規定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標によりさらに規定される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の構造座標によりさらに規定される、請求項２０又は２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標によりさらに規定される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＢ２ポリペプチド変異体の該結合ポケットが、前記結合ポケットのアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４の骨格原子からの２．５Å以下の二乗平均平方根偏差を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
（ｅ）前記化合物を合成し、任意に前記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物（複数可）及び／又は担体（複数可）と共に処方するさらなる工程を含む、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
（ｆ）前記化合物、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド断片、又は請求項１２に記載の組換え宿主細胞と、ＲＮＡキャップ又はその類似体とを接触させるさらなる工程であって、前記ＰＢ２ポリペプチド断片と前記ＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害する前記化合物の能力を確定する、接触させるさらなる工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１４〜２７に記載の方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ^７Ｇ、ｍ^７ＧＭＰ、ｍ^７ＧＴＰ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ^７Ｇｐｐｐ（Ｎ）_１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つＰＢ２又はその変異体の該ＲＮＡキャップ結合ポケットと結合することができる、化合物。
【請求項２９】
請求項１４〜２７に記載の方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ^７Ｇ、ｍ^７ＧＭＰ、ｍ^７ＧＴＰ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ^７Ｇｐｐｐ（Ｎ）_１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つ該ＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片と該ＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害することができる、化合物。
【請求項３０】
ＰＢ２の該ＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと会合する化合物を同定する方法であって、（ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド断片、又は請求項１３に記載の組換え宿主細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び（ｉｉ）ＰＢ２と結合する前記試験化合物の能力を分析する工程を含む、同定する方法。
【請求項３１】
ＲＮＡキャップ又はその類似体を添加するさらなる工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡキャップ若しくはその類似体の存在下においてＰＢ２若しくはその変異体と結合する前記試験化合物の能力、又は前記ＲＮＡキャップ若しくはその類似体とＰＢ２若しくはその変異体との結合を阻害する前記試験化合物の能力を分析する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡキャップ又はその類似体を、前記試験化合物の添加の前、同時又は後に添加する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
ハイスループット設定において行われる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試験化合物が小分子である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試験化合物がペプチド又はタンパク質である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物（複数可）及び／又は担体（複数可）と共に処方する工程をさらに含む、請求項２６、２７又は３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２７又は３７に記載の方法により製造可能な薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ^７Ｇ、ｍ^７ＧＭＰ、ｍ^７ＧＴＰ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ^７Ｇｐｐｐ（Ｎ）_１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つ該ＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片と結合することができる、化合物。
【請求項４０】
請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ^７Ｇ、ｍ^７ＧＭＰ、ｍ^７ＧＴＰ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ^７ＧｐｐｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ^７Ｇｐｐｐ（Ｎ）_１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つ該ＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片と該ＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害することができる、化合物。
【請求項４１】
ＰＢ２の該ＲＮＡキャップ結合ドメインを対象とする抗体。
【請求項４２】
配列番号１４〜配列番号２２により規定されるポリペプチドの群から選択されるポリペプチド断片を認識する、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスでのウイルス感染により引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の製造のための、請求項２８、２９、３９若しくは４０に記載の化合物、請求項３６に記載の薬学的組成物、又は請求項４１若しくは４２に記載の抗体の使用。
【請求項４４】
前記疾患状態が、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科及びラブドウイルス科を含むモノネガウイルス目のウイルス感染により引き起こされる、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記疾患状態が、オルトミクソウイルス科、アレナウイルス科又はブニヤウイルス科により引き起こされる、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
前記疾患状態が、ボルナ病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、センダイウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、ニパーウイルス、ヘンダウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、トゴトウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、ハンタンウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス及びラクロスウイルスから成る群から選択されるウイルスにより引き起こされる、請求項４３に記載の使用。
【請求項４７】
前記疾患状態が、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、トゴトウイルス及びハンタンウイルスから成る群から選択されるウイルスにより引き起こされる、請求項４３に記載の使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８−１】

【図１８−２】

【図１８−３】

【図１８−４】

【図１８−５】

【図１８−６】

【図１８−７】

【図１８−８】

【図１８−９】

【図１８−１０】

【図１８−１１】

【図１８−１２】

【図１８−１３】

【図１８−１４】

【図１８−１５】

【図１８−１６】

【図１８−１７】

【図１８−１８】

【図１８−１９】

【図１８−２０】

【図１８−２１】

【図１８−２２】

【図１８−２３】

【図１８−２４】

【図１８−２５】

【図１８−２６】

【図１８−２７】

【図１８−２８】

【図１８−２９】

【図１８−３０】

【図１８−３１】

【図１８−３２】

【図１８−３３】

【図１８−３４】

【図１８−３５】

【図１８−３６】

【図１８−３７】

【図１８−３８】

【図１８−３９】

【図１８−４０】

【図１８−４１】

【図１８−４２】

【図１８−４３】

【図１８−４４】

【図１８−４５】

【図１８−４６】

【図１８−４７】

【図１８−４８】

【図１８−４９】

【図１８−５０】

【図１８−５１】

【図１８−５２】

【図１８−５３】

【図１８−５４】

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【図１８−５６】

【図１８−５７】

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【図１８−６０】

【図１８−６１】

【図１８−６２】

【図１８−６３】

【図１８−６４】

【図１８−６５】

【図１８−６６】

【図１８−６７】

【図１８−６８】

【図１８−６９】

【図１８−７０】

【図１８−７１】

【図１８−７２】

【図１８−７３】

【図１８−７４】

【図１８−７５】

【図１８−７６】

【図１８−７７】

【図１８−７８】

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【図１８−８０】

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【図１８−８３】

【図１８−８４】

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【図１８−８６】

【図１８−８７】

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【図１８−９０】

【図１８−９１】

【図１８−９２】

【図１８−９３】

【図１８−９４】

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【図１８−９６】

【図１８−９７】

【図１８−９８】

【図１８−９９】

【図１８−１００】

【図１８−１０１】

【図１８−１０２】

【図１８−１０３】

【図１８−１０４】

【図１８−１０５】

【図１８−１０６】

【図１８−１０７】

【図１８−１０８】

【図１８−１０９】

【図１８−１１０】

【図１８−１１１】

【図１８−１１２】

【図１８−１１３】

【図１８−１１４】

【図１８−１１５】

【図１８−１１６】

【図１８−１１７】

【図１８−１１８】

【図１８−１１９】

【図１８−１２０】

【図１８−１２１】

【図１８−１２２】

【図１８−１２３】

【図１８−１２４】

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【図１８−１２６】

【図１８−１２７】

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【図１８−１２９】

【図１８−１３０】

【図１８−１３１】

【図１８−１３２】

【図１８−１３３】

【図１８−１３４】

【図１８−１３５】

【図１８−１３６】

【図１８−１３７】

【図１８−１３８】

【図１８−１３９】

【図１８−１４０】

【図１８−１４１】

【図１８−１４２】

【図１８−１４３】

【図１８−１４４】

【図１８−１４５】

【図１８−１４６】

【図１８−１４７】

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【図１８−１４９】

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【図１８−１５４】

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【図１８−１５６】

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【図１８−１５９】

【図１８−１６０】

【図１８−１６１】

【図１８−１６２】

【図１８−１６３】

【図１８−１６４】

【図１８−１６５】

【図１８−１６６】

【図１８−１６７】

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【図１８−１６９】

【図１８−１７０】

【図１８−１７１】

【図１８−１７２】

【図１８−１７３】

【図１８−１７４】

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【図１８−１７６】

【図１８−１７７】

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【図１８−１７９】

【図１８−１８０】

【図１８−１８１】

【図１８−１８２】

【図１８−１８３】

【図１８−１８４】

【図１８−１８５】

【図１８−１８６】

【図１８−１８７】

【図１８−１８８】

【図１８−１８９】

【図１８−１９０】

【図１８−１９１】

【図１８−１９２】

【図１８−１９３】

【図１８−１９４】

【図１８−１９５】

【公表番号】特表２０１１−５０１９４２（Ｐ２０１１−５０１９４２Ａ）
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２８３１７（Ｐ２０１０−５２８３１７）
【出願日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００８５４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４６９８３
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５００２６２１９７）ヨーロピアン　モレキュラー　バイオロジー　ラボラトリー (13)
【Ｆターム（参考）】