含窒素複素環式化合物の定量方法
【課題】検体の前処理が簡便であり、多検体を短時間で前処理することができる含窒素複素環式化合物又はその塩の定量方法を提供する。
【解決手段】一般式（Ｉ）
（式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖又は分枝状アルキル基を表す。）で表わされる含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する検体を除タンパク処理に付す工程、及び得られた除タンパク処理検体を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計による定量方法。
【解決手段】一般式（Ｉ）
（式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖又は分枝状アルキル基を表す。）で表わされる含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する検体を除タンパク処理に付す工程、及び得られた除タンパク処理検体を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計による定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿、血清又は血液等の検体中の含窒素複素環を有する化合物の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レボブピバカイン（一般名）、ブピバカイン（一般名）、並びにその類似体であるロピバカイン（一般名）、メピバカイン（一般名）等のＮ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド系誘導体は、局所麻酔剤の有効成分として使用されている有用な含窒素複素環式化合物である。
【０００３】
投与後の血液、尿等の検体中のレボブピバカイン濃度の測定方法として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法が広く用いられている。しかしながら、ＨＰＬＣによりレボブピバカインを定量する場合、検体として３００μＬ〜１０ｍＬ程度の血液等を採取する必要があり、小動物や臨床時の小児、循環血液量の低下した患者では、採血が困難な場合があった。また、前処理として、液−液抽出法又は固相抽出法により検体を処理する必要があるが、液−液抽出法では処理の作業効率が悪く、多数の検体を短時間で分析することができなかった。さらに、液−液抽出法は、有機溶媒の廃液が多いという問題点もあった。固相抽出法により前処理を行う場合には、多量の検体が必要であり、さらに、処理に時間がかかるという問題があった。ウェルプレート等を使用すれば短時間での処理は可能であるが、この場合には充填剤の乾燥から回収率にバラツキが生じる可能性があった。また、固相抽出法では、前処理にかかるコストが高いという問題点もあった。
【０００４】
また、ＨＰＬＣによる分析では、レボブピバカイン等を通常紫外線（ＵＶ）の吸収によって検出するが、ＵＶによる検出は選択性が低く、夾雑物を含む検体及び併用薬を使用した検体では、測定に用いる試料を高度に精製する必要があった。さらに、レボブピバカイン、ロピバカイン等は、吸収極大が２１０〜２３０ｎｍ付近と低波長側にあるため、夾雑物等の影響により正確な定量が困難な場合があった。また、ＨＰＬＣ−ＵＶを使用する場合は、１検体の分析に２０分程度は必要であり、分析に用いる移動相を流速１ｍＬ／分程度で送液することから、ランニングコストが高いという問題もあった。
【０００５】
さらに、ＨＰＬＣによる分析では、検量線範囲が１６〜４００倍程度であることから、検量線範囲外の検体の再測定が必要となる場合が多かった。また、定量限界下限値が高く、低濃度検体の測定は不可能な場合が多かった。
【０００６】
ＨＰＬＣ以外のレボブピバカイン等の測定方法として、質量分析計（ＭＳ）を使用する方法が行われている。非特許文献１には、ヒト血漿中のレボブピバカインの測定方法として１ｍＬの血漿を採取し、前処理として液−液抽出を行った後ＨＰＬＣ−ＭＳで分析する方法が開示されており、定量限界が０．０１μｇ／ｍＬであったとされている。非特許文献２には、ヒト血漿中のブピバカインを、ＨＰＬＣ−ＭＳで測定する方法が開示されており、検量線濃度範囲が２３．８〜２３８０．０ｎｇ／ｍＬであったとされている。
しかしながら、これらの方法においても、前処理をより簡便にしたり、分析に必要な検体量をより少量としたりする改善の余地があった。また、検量線範囲が最大４００倍であることから、検量線範囲がより広い方法が必要であった。
【０００７】
従って、より少量の検体で、より簡便に、短時間に、高感度で正確に検体中のレボブピバカイン等を測定でき、しかも検量線範囲が広く低濃度の検体及び高濃度の検体を一度で測定できる分析方法が望まれていた。また、２種以上のＮ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド系誘導体を同時に定量できる方法も望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】G.A.Chalkiadis et al., British Lournal of Anaesthesia 92 (2):218-22(2004)
【非特許文献２】Anal Chem Insights. 2008 May 28;4:11-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、検体の前処理が簡便であり、多検体を短時間で前処理することができ、レボブピバカイン等の含窒素複素環式化合物に対する選択性が高いため夾雑物等の影響を受けにくく、少量の検体で高感度な測定が可能であり、２種以上の含窒素複素環式化合物の同時定量が可能であり、かつ分析時間が短く、しかも検量線範囲が広く、さらに有機溶媒等の廃液が少ないレボブピバカイン等の含窒素複素環式化合物又はその塩の定量方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決するために研究を重ね、下記一般式（Ｉ）で表わされるレボブピバカイン等の含窒素複素環式化合物又はその塩（以下、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩ともいう）を含む検体の除タンパク処理と、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による分析とを組合わせて用いることにより、血液等の検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物及びその塩を容易に高感度で検出できること、検体中に含まれる２種以上の含窒素複素環式化合物、例えばレボブピバカイン及びロピバカインを同時に定量することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
このような方法によれば、少量の検体で高感度な測定が可能であるため、検体採取時の患者等の負担を軽減できる。具体的には、例えば検体として血漿、血清又は血液を用いる場合、わずか５０μＬ程度の採血量で検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の定量を行うことが可能である。また、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩に対する選択性が高いため、被験者が併用薬等を使用した場合、検体に夾雑物等が混合している場合等でも、検体中の併用薬等の影響を受けにくく、分析に用いる検体の前処理が容易となる。本発明においては、前処理として除タンパク処理を行うが、除タンパク処理は少量のアセトニトリル等により行えるため、処理が簡便で多検体の処理が可能であり、しかも廃液が少ないというメリットもある。
【００１２】
さらに、本発明の方法においては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣにおける流速がＬＣ単独で分析する場合と比べて遅く、かつ分析時間も短いため、分析に必要な移動相の量も少ない。このため、環境への負荷が少なく、しかも分析のランニングコストを削減することができる。また、本発明においては、ＬＣで分離及び溶出された成分を、繁雑な操作を行うことなくＭＳ／ＭＳに直接導入して分析することができるため、操作が簡便である。
【００１３】
また、このような定量方法では、定量下限濃度の４０００倍の検量線範囲が得られることから、広い濃度範囲で一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を正確に定量することができる。このため、検体中の該化合物の低濃度での濃度推移及び高濃度検体の定量のいずれも測定可能であり、検量線範囲外の検体の再測定が必要となる場合が少ない。しかも、希釈再現性にも優れており、検量線の最高濃度の５０倍の濃度まで測定可能となり、実質は０．５〜１０００００ｎｇ／ｍＬと検量線範囲２０００００倍を達成できる。
なお、検量線範囲とは、分析法が適切な精度、真度及び直線性を与える試料中の分析対象物（本発明においては一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩）の上限及び下限の濃度（量）の間隔のことである（上限値及び下限値は範囲に含まれる）。
【００１４】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記の項１〜１１を提供する。
項１． 下記一般式（Ｉ）
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖又は分枝状アルキル基を表す。）で表わされる含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する検体を除タンパク処理に付す工程、及び得られた除タンパク処理検体を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計により分析して前記化合物又はその薬学的に許容される塩を測定する工程を含むことを特徴とする検体中の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩の定量方法。
項２． 除タンパク処理が、アセトニトリルを用いて行われる処理である項１に記載の定量方法。
項３． 液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計の液体クロマトグラフィーにおける移動相が、酢酸緩衝液及びアセトニトリルの混液である項１又は２に記載の定量方法。
項４． 移動相中の酢酸緩衝液とアセトニトリルとの混合割合が、体積比で６０：４０〜６５：３５である項３に記載の定量方法。
項５． 液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計において、一般式（Ｉ）で表わされる含窒素複素環式化合物のプリカーサーイオンとしてｍ／ｚ２４０〜２９０のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとしてｍ／ｚ９７〜１４０のイオンを選択し、これらイオンをモニターする項１〜４のいずれか一項に記載の定量方法。
項６． 検体が、血漿、血清、血液、母乳、尿又は脳脊髄液である項１〜５のいずれか一項に記載の定量方法。
項７． 検体が、内標準物質として、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計の液体クロマトグラフィーにおける該内標準物質に対する一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が０．２〜０．６となる化合物を含有する項１〜６のいずれか一項に記載の定量方法。
項８． 内標準物質が、プラジクアンテルである項７に記載の定量方法。
項９． ２種以上の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を同時に定量する（ただし、レボブピバカイン又はその塩、及びブピバカイン又はその塩を同時定量する場合を除く）項１〜８のいずれか一項に記載の定量方法。
項１０． 含窒素複素環式化合物が、レボブピバカイン、ブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である項１〜９のいずれか一項に記載の定量方法。
項１１． レボブピバカイン又はその塩、及びロピバカイン又はその塩を同時に定量する項９に記載の定量方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、少量の検体で、短時間にレボブピバカイン等の含窒素複素環式化合物を簡便かつ高感度に定量することができるうえ、検体中に含まれる２種以上の含窒素複素環式化合物を同時定量することができる。また、本発明の方法は検量線範囲が極めて広いため、検量線範囲外の検体の再測定が必要となる場合が少ないうえ、測定対象化合物が低濃度であっても感度良く定量できる。さらに、本発明の方法は有機溶媒等の廃液が少ないため、環境への負荷も低減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、血漿を使用して調製した検量線試料の測定結果から作成されたレボブピバカイン（ＬＥＶ）の検量線を示す図である。
【図２】図２は、血漿を使用して調製した検量線試料の測定結果から作成されたロピバカイン（ＲＯＰ）の検量線を示す図である。
【図３】図３は、血清を使用して調製した検量線試料の測定結果から作成されたレボブピバカイン（ＬＥＶ）の検量線を示す図である。
【図４】図４は、血清を使用して調製した検量線試料の測定結果から作成されたロピバカイン（ＲＯＰ）の検量線を示す図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、ブランク血漿のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを示す図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、ブランク血清のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを示す図である。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、ロピバカイン、レボブピバカイン及びプラジクアンテルの標準溶液のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の検体中の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩の定量方法は、上記一般式（Ｉ）で表わされる含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する検体を除タンパク処理に付す工程、及び得られた除タンパク処理検体をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析して前記化合物又はその薬学的に許容される塩を測定する工程を含む。
本発明の方法は、本発明の効果を奏することになる限り、上記工程以外の工程を含んでもよい。例えば、ヒト等の動物から検体を採取する工程、検体に内標準物質を添加する工程、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析で得られた測定値から、検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の濃度を算出する工程等を行ってもよい。本発明における一般式（Ｉ）で表わされる化合物及びその塩は、検体中及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定中、通常フリー体（一般式（Ｉ）で表わされる化合物）として存在する。このため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析により得られる測定値は、通常、一般式（Ｉ）で表わされる化合物に関する測定値である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析により得られる一般式（Ｉ）で表わされる化合物に関する測定値から、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の濃度が算出される。
【００２０】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物において、カルボニル基が結合しているピペリジン環の炭素原子（下記一般式（Ｉ）中に＊で示される）は、不斉炭素原子である。
【００２１】
【化２】
【００２２】
（式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖又は分枝状アルキル基を表す。）
前記一般式（Ｉ）中のカルボニル基が結合しているピペリジン環の炭素原子（前記一般式（Ｉ）中に＊で示される不斉炭素原子）の絶対配置は、Ｒであってもよく、Ｓであってもよい。
本発明における一般式（Ｉ）で表わされる化合物が不斉炭素原子を１個有する場合、絶対配置Ｒ又はＳで表される純粋な光学活性体であってもよく、その任意な割合の混合物であってもよく、ラセミ体であってもよい。すなわち本発明における一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、下記一般式（Ｉ−１）
【００２３】
【化３】
（式中、Ｒは、前記と同義である。）で表わされる化合物、下記一般式（Ｉ−２）
【００２４】
【化４】
【００２５】
（式中、Ｒは、前記と同義である。）で表わされる化合物、又は一般式（Ｉ−１）で表わされる化合物及び一般式（Ｉ−２）で表わされる化合物の任意な割合の混合物である。
また、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、不斉炭素原子を２個有する場合には、該化合物は、光学的に純粋なジアステレオマーであってもよく、そのラセミ体であってもよく、又はその任意な割合の混合物であってもよい。
【００２６】
前記一般式（Ｉ）におけるＲとして、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。Ｒは、好ましくは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基である。より好ましくは、炭素数３〜４の直鎖状アルキル基であり、最も好ましくは、炭素数４の直鎖状アルキル基である。
【００２７】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物として、レボブピバカイン（一般名）（化学名は、（−）−（２Ｓ）−ｌ−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド）、ブピバカイン（一般名）（化学名は、（２ＲＳ）−ｌ−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド）、ロピバカイン（一般名）（化学名は、（Ｓ）−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−１−プロピルピペリジン−２−カルボキサミド）、メピバカイン（一般名）（化学名は、（２ＲＳ）−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−１−メチルピペリジン−２−カルボキサミド）等が好ましい。中でも、レボブピバカイン（化学名：（−）−（２Ｓ）−ｌ−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド）が好適である。
【００２８】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物の塩は、薬学的に許容される塩であればよく、特に限定されない。例えば、薬学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。酸付加塩として、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸塩が挙げられる。金属塩として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩として、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。有機アミン付加塩として、ピペリジン等の付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩として、リジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。中でも、酸付加塩、有機酸塩等が好ましく、塩酸塩がより好ましい。
【００２９】
本発明における検体は、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含有するものであればよい。一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含有する検体は、通常、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を投与された動物から採取される。本発明における検体として、例えば、ヒトを含む動物の血液、血漿、血清、母乳、唾液、尿及び脳脊髄液（脳髄液ともいう）等の生体試料、及び動物における各種の臓器、組織等が挙げられる。検体は、好ましくは、ヒトを含む動物から採取された生体試料である。中でも、血漿、血清、血液、母乳、尿又は脳脊髄液が、検体として好ましい。検体として血漿又は血清を使用する場合、採血された血液から血漿又は血清を分離する方法は特に限定されず、通常使用される方法により行うことができる。母乳は、初乳又は成乳等どのような状態であってもよい。
【００３０】
本発明において使用される検体の量は、例えば、血漿、血清又は血液であれば、通常、約２０μＬ以上あればよい。好ましくは、検体の量は、１０〜２００μＬ程度であり、より好ましくは、１５〜１００μＬ程度であり、最も好ましくは、２０〜３０μＬ程度である。従って、ヒトを含む動物から検体として生体試料を採取する場合には、上記量を採取すればよい。
【００３１】
本発明においては、検体が内標準物質を含有するものであることが好ましい。検体に内標準物質を添加する場合には、除タンパク処理を行う前に添加することが好ましい。内標準物質は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおいて、測定の対象である一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の検出ピークと異なる位置にピークを有する化合物であり、かつそのピークが血漿等に含まれる生体成分の検出ピークの位置とも異なるものが好ましい。また、内標準物質は、血漿等の検体中において安定で経時的変化が少なく、除タンパク処理を行っても回収率が良好な化合物が好ましい。
【００３２】
内標準物質は、例えば、後述するＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣにおける該内標準物質に対する一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が約０．１〜５となる化合物等が好ましい。内標準物質は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が、約０．２以上となる化合物であることが好ましく、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が約０．２〜０．６となる化合物がより好ましく、約０．３〜０．６となる化合物がさらに好ましく、約０．４〜０．６となる化合物が特に好ましい。なお、前記相対保持時間は、ＬＣにおける内標準物質の保持時間を１とした場合の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間である。また、内標準物質は、後述するＭＳ／ＭＳ条件１で内標準物質を含む検体を分析した際に、質量分析によるｍ／ｚが約１００〜５００である化合物等が好ましい。
【００３３】
本発明における内標準物質として、プラジクアンテル（一般名）、リドカイン（一般名）、ミダゾラム（一般名）等が好適である。中でも、内標準物質として、プラジクアンテルが好適である。検体における内標準物質の濃度は、１０〜２００ｎｇ／ｍＬ程度とすることが好ましい。
【００３４】
本発明においては、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含有する検体を、除タンパク処理に付して除タンパク検体を得る。
除タンパク処理として、除タンパク剤を用いて行われる処理、水と混和可能な有機溶媒を用いて行われる処理、加熱又は冷却による処理等が挙げられ、これらのいずれでもよい。中でも、必要な検体量が少量であり、かつ処理が簡便であることから、水と混和可能な有機溶媒を用いて行われる処理が好ましい。有機溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール等が挙げられる。中でも、アセトニトリルが好ましい。
【００３５】
水と混和可能な有機溶媒を用いて行われる除タンパク処理の方法は特に限定されず、通常の方法で行うことができる。例えば、まず、検体に、水と混和可能な有機溶媒を添加し、検体と該有機溶媒とを混合してタンパク質を沈殿させることが好ましい。また、好ましくは、検体に有機溶媒を添加混合後、超音波処理を行う。超音波処理により、検体からの一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の回収率がより安定する。超音波処理は、通常１０分程度行えばよい。検体と有機溶媒との混合割合は、検体の種類により適宜選択することができるが、体積比で検体１に対して有機溶媒約１〜１００とすることが好ましい。例えば、検体が成乳の場合には、体積比で検体１に対して有機溶媒を約１〜１００とすることがより好ましく、約４〜１００とすることがさらに好ましい。検体が成乳以外の生体試料（例えば、血漿、血清、血液、初乳、尿、脳脊髄液等）の場合には、体積比で検体１に対して有機溶媒を約１〜１０とすることがより好ましい。検体が成乳以外の生体試料の場合、さらに好ましくは、体積比で検体１に対して有機溶媒約４〜１０である。
【００３６】
検体と、水と混和可能な有機溶媒との混合液から沈殿したタンパク質を分離することにより、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩、及び所望により添加された内標準物質を含有する除タンパク処理検体が得られる。沈殿したタンパク質の除去は、公知の方法により行うことができる。例えば、遠心分離、ろ過等の方法により、上澄み（除タンパク処理検体）と沈殿したタンパク質とを簡便に分離することができる。
【００３７】
上記で得られた一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩、及び所望により添加された内標準物質を含有する除タンパク処理検体は、通常、濃縮乾固され、得られた濃縮乾固物が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおけるＬＣの移動相で溶解され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入されて分析され、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩が測定される。濃縮乾固の条件は特に限定されないが、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩、及び所望により添加された内標準物質を含有する除タンパク処理検体を、窒素気流又は減圧濃縮下、約３５〜５０℃で濃縮乾固する。
【００３８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳとしては、ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、Ａｃｃｅｌａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、Ａｌｌｉａｎｃｅ ２７９５（日本ウォーターズ株式会社製）等を使用することができる。
【００３９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムのＬＣにおける移動相としては、酢酸緩衝液及び有機溶媒の混液、ギ酸緩衝液及び有機溶媒の混液等が好適である。酢酸緩衝液としては、酢酸溶液、酢酸アンモニウム溶液、酢酸アンモニウム緩衝液等を用いることができる。前記酢酸溶液中の酢酸濃度は特に限定されないが、約１〜３μｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは約１．５〜２μｍｏｌ／Ｌである。また酢酸アンモニウム溶液中の酢酸アンモニウムの濃度は、通常約１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは約２〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約４〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。酢酸アンモニウム緩衝液は、前記酢酸アンモニウム溶液に酢酸を加えｐＨを約５〜６の範囲に調整して作製することが好ましい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール等が挙げられる。中でも、アセトニトリルが好適である。酢酸緩衝液及びアセトニトリルの混液としては、例えば、酢酸溶液及びアセトニトリルの混液、酢酸アンモニウム溶液又は酢酸アンモニウム緩衝液とアセトニトリルとの混液、酢酸溶液及びアセトニトリルの混液等が挙げられる。酢酸溶液及び酢酸アンモニウム溶液はそれぞれ酢酸水溶液及び酢酸アンモニウム水溶液であってもよい。中でも、本発明の方法においては、ＬＣにおける移動相として、酢酸アンモニウム緩衝液及びアセトニトリルの混液が好ましい。移動相中の酢酸緩衝液（酢酸溶液、酢酸アンモニウム溶液又は酢酸アンモニウム緩衝液）とアセトニトリルとの混合割合は、体積比で通常、約８０：２０〜５０：５０であり、好ましくは約７５：２５〜５５：４５、さらに好ましくは約７０：３０〜６０：４０、特に好ましくは約６０：４０〜６５：３５である。このような移動相を用いると、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩をより高感度で測定できる。また、より広い検量線範囲が得られるため好ましい。
ギ酸緩衝液及び有機溶媒の混液は、上述した酢酸緩衝液の代わりにギ酸溶液又はギ酸緩衝液を使用することにより調製することができる。
【００４０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣにおけるカラムとしては、逆相クロマトグラフィーカラムが好ましい。逆相クロマトグラフィーカラムとしては、オクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）系カラムが好ましく、例えば、エックスブリッジ（ＸＢｒｉｄｇｅ）Ｃ１８（商品名、日本ウォーターズ社製）、エックスブリッジＲＰ Ｃ１８（商品名、日本ウォーターズ社製）、カプセルパックＭＧＩＩ（商品名、資生堂社製）等が挙げられる。本発明においては、ガードカラムを使用することもできる。ガードカラムとしては、エックスブリッジＣ１８（商品名、日本ウォーターズ社製）、エックスブリッジＲＰ Ｃ１８（商品名、日本ウォーターズ社製）等が好適である。
【００４１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣにおける分析条件は特に限定されないが、移動相の流速を約０．１〜０．５ｍＬ／分とすることが好ましく、約０．２〜０．３ｍＬ／分とすることがより好ましい。この流速で、１回の分析につき約１０〜２０分通液することが好ましい。試料の注入量は、約１〜２０μＬが好ましく、カラム温度は、通常約３５〜４５℃、好ましくは約３７〜４３℃とする。
【００４２】
本発明の方法における好ましいＬＣ分析条件の一例を、下記に示す。
ＬＣ条件１
・ＨＰＬＣシステム：Ａｃｃｅｌａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・カラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ、３．５μｍ、日本ウォーターズ社製）
・ガードカラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｍｍ、３．５μｍ、日本ウォーターズ製）
・移動相： Ａ液：Ｂ液＝６２：３８
・Ａ液：５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．２）、Ｂ液：アセトニトリル
・流量：０．２ｍＬ／分
・分析時間：１０分
【００４３】
ＬＣ条件２
・ＨＰＬＣシステム：Ａｃｃｅｌａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・カラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ、３．５μｍ、日本ウォーターズ社製）
・ガードカラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｍｍ、３．５μｍ、日本ウォーターズ製）
・移動相： Ａ液：Ｂ液＝６４：３６
・Ａ液：５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）、Ｂ液：アセトニトリル
・流量：０．２ｍＬ／分
・分析時間：１０分
【００４４】
例えば、上記ＬＣ条件１によれば、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の保持時間は、通常約３〜５分である。内標準物質としてプラジクアンテル（一般名）を使用した場合、プラジクアンテルに対する一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間は、通常約０．２〜０．６である。なお、保持時間及び相対保持時間は、例え実験条件を同じくした場合においても、多少は増減するものであり、厳密に解釈されるべきものではない。
【００４５】
ＬＣで分離及び溶出された成分は、タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）のイオン化室に導入されてイオン化される。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおけるイオン化法は特に限定されず、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、サーモスプレーイオン化（ＴＳＰ）又は高速原子衝撃（ＦＡＢ）等を使用することができる。中でも、ＥＳＩが好ましい。ＭＳ／ＭＳにおいては、通常、第一段目の質量分析計でプリカーサーイオン（ここではプロトン付加分子）が選択され、次いでコリジョンセルと呼ばれる衝突室でアルゴンガス等と衝突させてプリカーサーイオンを解離させ、新しいイオン群を発生させる。この新しいイオン群のうち最大のピークを示すイオンがプロダクトイオンとして選択され、第二段目の質量分析計で分析される。
【００４６】
生成したプロダクトイオンの検出方法として、例えば、フルスキャン法、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）法、選択リアクションモニタリング（ＳＲＭ）法等が挙げられる。中でも、本発明においてはＳＲＭ法が好適に用いられる。本発明においては、一般式（Ｉ）で表わされる化合物のプリカーサーイオンとしてｍ／ｚ２４０〜２９０のイオンを選択し且つプロダクトイオンとしてｍ／ｚ９７〜１４０のイオンを選択し、これらイオンをモニターすることが好ましい。より具体的には、ＳＲＭ法において、例えば、一般式（Ｉ）で表わされる化合物のプリカーサーイオンとしてｍ／ｚ２８８．６〜２９９．０のイオンのみを選択し、次に、このイオンを窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガスに衝突させ分解させた際に生じるプロダクトイオンのうちｍ／ｚ１０〜２９０の範囲内で最大のピークを示すイオン、好ましくはｍ／ｚ１４０付近のイオンのみを選択してそのイオンの量をモニターすることにより、本発明が目的とする検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を高感度で測定することができる。このとき、例えば、内部標準物質としてプラジクアンテルを用いる場合には、プラジクアンテルのプリカーサーイオンとして、ｍ／ｚ３１３付近のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとして、ｍ／ｚ１０〜３１３の範囲内で最大のピークを示すイオン、好ましくはｍ／ｚ２０３付近のイオンを選択することが好ましい。
【００４７】
本発明の方法における好ましいＭＳ／ＭＳ分析条件の一例を、下記に示す。
ＭＳ／ＭＳ条件１
・ＭＳ／ＭＳシステム：ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・イオン化法：ＥＳＩ（＋）
・測定モード：選択リアクションモニタリング（selected reaction monitoring：ＳＲＭ）
【００４８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析で得られた測定値から、検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の濃度を算出することができる。濃度の算出方法は特に限定されず、例えば、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の標準溶液を用いて作成した検量線を用いて行う方法が好適である。具体的には、検量線は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の標準溶液に、所望により内標準物質を添加した検体を用いて、上述した除タンパク処理及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の手順を実施して得られる測定値から作成される。
【００４９】
本発明において用いられる検量線は、真度が定量下限濃度において±２０％以内であり、その他の濃度において±１５％以内であり、かつ相関係数が０．９９以上である検量線を用いることが好ましい。内標準物質を用いた場合には、例えば、検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩のピーク面積値と内標準物質のピーク面積値との比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより信頼性の高い検量線を作成することができる。また、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を、該化合物又はその塩を投与されていない動物（健常人等）の検体（例えば血漿）に溶解した標準溶液を用いることにより、例えば血漿に含まれる内因性要因の影響を除くことができる。すなわち、かかる検量線を用いることにより、患者における一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の検体中の濃度を直接算出できるので、好適である。上記定量下限濃度は、検量線作成のために用いる一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を添加した検体のうち、検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の濃度の一番低い濃度を意味する。上記真度は、一般的な式として、以下の式により算出される。
真度（％）＝１００×(測定値−理論値)／理論値
上記相関係数は、例えば、「ピアソンの積率相関係数」を用いて算出できる。
【００５０】
本発明においては、検体に含まれる一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を、回収率約９０％以上の精度で定量することができる。回収率は、通常以下の式により算出される。
回収率（％）＝１００×（回収率算出用試料のピーク面積値）／（回収率算出用対照試料のピーク面積値の平均値）
【００５１】
本発明の定量方法によれば、２種以上の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその薬学的に許容される塩を同時に定量することができる。
例えば、本発明の定量方法は、レボブピバカイン（又はその塩）、ブピバカイン（又はその塩）、ロピバカイン（又はその塩）及びメピバカイン（又はその塩）からなる群より選択される２種以上の化合物を同時定量する方法として好適である。なお、レボブピバカインは、ブピバカインの光学異性体の１つであるため、レボブピバカインとブピバカインとを分離することは、通常困難である。本発明の定量方法により、２種以上の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を同時に定量する場合には、レボブピバカイン（又はその塩）、及びブピバカイン（又はその塩）の組合わせを含まない２種以上の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を同時に定量することが好ましい。例えば、本発明の定量方法は、(i)レボブピバカイン（又はその塩）、ロピバカイン（又はその塩）及びメピバカイン（又はその塩）からなる群より選択される２種以上の化合物、又は(ii)ブピバカイン（又はその塩）、ロピバカイン（又はその塩）及びメピバカイン（又はその塩）からなる群より選択される２種以上の化合物を同時定量する方法として好適に用いられる。中でも、本発明の定量方法は、レボブピバカイン（又はその塩）及びロピバカイン（又はその塩）を同時に定量する方法としてより好適である。本発明の定量方法により、２種以上の化合物を含む検体を用いて該２種以上の化合物を同時定量する場合は、各化合物それぞれの量を同時に求めることができる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
塩酸レボブピバカインは、カイロサイエンス社製、塩酸ロピバカイン一水和物は、トロントリサーチケミカル社製、プラジクアンテルは、和光純薬工業社製のものを使用した。その他の試薬は、和光純薬工業社、関東化学社又はシグマアルドリッチ社製のものを使用した。
【００５４】
＜標準原液の調製方法＞
塩酸レボブピバカイン（分子量３２４．８９）１１．３ｍｇ（レボブピバカインとして１０ｍｇ）を秤量し、超純水を加えて正確に１０ｍＬとして、１ｍｇ／ｍＬのレボブピバカイン水溶液（標準原液）を調製した。
塩酸ロピバカイン一水和物（分子量３２８．８８）１２．０ｍｇ（ロピバカインとして１０ｍｇ）を秤量し、超純水を加えて正確に１０ｍＬとして、１ｍｇ／ｍＬのロピバカイン水溶液（標準原液）を調製した。
プラジクアンテル（分子量３１２．４１）５．０ｍｇを秤量し、アセトニトリル（ＬＣ／ＭＳ用）を加えて正確に５ｍＬとして、プラジクアンテルの１ｍｇ／ｍＬ溶液（内標準原液）を調製した。
【００５５】
＜レボブピバカイン及びロピバカインの希釈標準溶液の調製＞
前記レボブピバカイン標準原液及び前記ロピバカイン標準原液各１００μＬを採取して混合し、次いで、レボブピバカイン及びロピバカイン両成分がそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるように超純水で希釈した。この混合溶液（レボブピバカイン及びロピバカイン両成分がそれぞれ１００μｇ／ｍＬ）を用いて、前記両成分がそれぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、１６００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、及び０．５ｎｇ／ｍＬとなるように超純水で希釈し、各希釈標準溶液を調製した。
【００５６】
＜内標準溶液の調製＞
前記内標準原液を５０％アセトニトリル溶液で希釈し、プラジクアンテル濃度２０μｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬの内標準溶液を調製した。
【００５７】
＜移動相のＡ液の調製＞
酢酸アンモニウム（特級、和光純薬工業社製）３．８５ｇを超純水１０００ｍＬに溶解し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム溶液を調製した。この５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム溶液を超純水で１０倍希釈し、ｐＨメーターを用いて酢酸（ＬＣ−ＭＳ用）を加え、ｐＨ５．２に調整し、超音波照射による脱気後、Ａ液（５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．２））とした。
【００５８】
＜ニードル洗浄液の調製＞
アセトニトリル（ＬＣ／ＭＳ用）及び超純水を体積比１：１で混合後、得られた５０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液に、酢酸（ＬＣ−ＭＳ用）を０．１ｖ／ｖ％となるよう添加し、ニードル洗浄液（０．１％の酢酸を含有する５０％アセトニトリル溶液）とした。
＜再溶解液の調製＞
５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．２）及びアセトニトリルを体積比６２：３８で混合し、再溶解液とした。
【００５９】
＜ヒト血漿及び血清の検量線＞
ブランク及び０試料を含んだ、０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（各マトリクス中換算濃度）の８点検量線とした。前記濃度は、後述する血漿又は血清中換算濃度である。
＊：マトリクス中換算濃度（内標準物質（Ｉ．Ｓ．）濃度：１００ｎｇ／ｍＬ）
【００６０】
＜前処理＞
（１）血漿又は血清２０μＬにレボブピバカイン・ロピバカイン希釈標準溶液及び内部標準溶液（１００ｎｇ／ｍＬ）を各２０μＬ添加した。
（２）（１）の混合溶液にアセトニトリル２００μＬを添加後、激しく攪拌した。
（３）（２）の操作後、超音波処理（１０分、ｒｔ）し、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ）を行った。
（４）（３）の後、上清を採取して試験管に移し、窒素雰囲気又は減圧濃縮下４０℃で３０分間乾固させた。
（５）（４）で得られた残渣に再溶解液１００μＬを添加後、攪拌し再溶解させ、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＬＧ（ミリポア社製）（０．２２μｍ、４ｍｍ）にてろ過し、測定サンプルとした。
【００６１】
＜ＬＣ条件＞
・ＨＰＬＣシステム：Ａｃｃｅｌａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・カラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ、３．５μｍ、日本Ｗａｔｅｒｓ社製）
・ガードカラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｍｍ、３．５μｍ、日本Ｗａｔｅｒｓ製）
・カラム温度：４０℃
・流量：０．２ｍＬ／分
・移動相： Ａ液：Ｂ液＝６２：３８
Ａ液：５ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．２）
Ｂ液：アセトニトリル（ＬＣ／ＭＳ用）
・ニードル洗浄液：０．１％の酢酸を含有する５０％アセトニトリル溶液
・試料注入量：２μＬ
・オートサンプラー内設定温度：１０℃
・分析時間：１０分
【００６２】
＜ＭＳ／ＭＳ条件＞
・ＭＳ／ＭＳシステム：ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・イオン化法：ＥＳＩ（＋）
・スプレー電圧（Spray Voltage）：１０００Ｖ
・Heated Capillary温度：３５０℃
・測定モード：選択リアクションモニタリング（selected reaction monitoring：ＳＲＭ）
・衝突ガス圧力（Collision Pressure：ＣＰＲ）：１．５ｍＴｏｒｒ（約２００ｍＰａ）
・シースガス（Seath Gas）：４０ｐｓｉ（約２７６ｋＰａ）
・ＡＵＸ Ｇａｓ：３５ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ
モニターイオン及び測定条件を、以下に示す。表１中、ＬＥＶは、レボブピバカインを意味する。ＲＯＰは、ロピバカインを意味する。ＩＳは、内標準物質（プラジクアンテル）を意味する。
【００６３】
【表１】
【００６４】
得られた測定データを、表２〜表５に示す。表２は、検体として血漿を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表３は、検体として血漿を使用した場合のロピバカインのデータである。表４は、検体として血清を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表５は、検体として血清を使用した場合のロピバカインのデータである。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】
表２及び表３より、血漿中のレボブピバカイン及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９７７、ロピバカインについてｒ＝０．９９７５）が得られた。血漿を使用して調製した検量線試料の測定結果（表２及び表３）から作成されたレボブピバカインの検量線を図１に、ロピバカインの検量線を図２に、それぞれ示す。
【００７０】
表４及び表５より、血清中のレボブピバカイン及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９９８、ロピバカインについてｒ＝０．９９９６）が得られた。血清を使用して調製した検量線試料の測定結果（表４及び表５）から作成されたレボブピバカインの検量線を図３に、ロピバカインの検量線を図４に、それぞれ示す。
【００７１】
また、クロマトグラム上のレボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質（プラジクアンテル）の溶出位置における妨害ピークの有無を確認するために、ブランク血漿及びブランク血清それぞれを前記条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。図５Ａ〜図５Ｃに、ブランク血漿のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを、図６Ａ〜図６Ｃに、ブランク血清のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを、それぞれ示す。
【００７２】
図５Ａ及び図５Ｂはそれぞれ、ヒトから採取した血漿に、ロピバカイン及びレボブピバカインの希釈標準溶液の調製に用いた溶媒（超純水）を添加し、前記方法に従って前処理を行い、得られた測定サンプル（ブランク）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果である。図５Ａにおいて、ＲＯＰは、検体がロピバカインを含む場合に、ロピバカインのピークが検出される保持時間を示す。図５Ｂにおいて、ＬＥＶは、検体がレボブピバカインを含む場合に、レボブピバカインのピークが検出される保持時間を示す。図５Ｃは、ヒトから採取した血漿に、内標準溶液の調製においてプラジクアンテルの溶解に用いた溶媒（５０％アセトニトリル溶液）を添加し、前記方法に従って前処理を行い、得られた測定サンプル（ブランク）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果である。図５Ｃにおいて、ＩＳは、検体がプラジクアンテルを含む場合に、プラジクアンテルのピークが検出される保持時間を示す。
【００７３】
図６Ａ及び図６Ｂはそれぞれ、ヒトから採取した血清に、ロピバカイン及びレボブピバカインの希釈標準溶液の調製に用いた溶媒（超純水）を添加し、前記方法に従って前処理を行い、得られた測定サンプル（ブランク）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果である。図６Ａにおいて、ＲＯＰは、検体がロピバカインを含む場合に、ロピバカインのピークが検出される保持時間を示す。図６Ｂにおいて、ＬＥＶは、検体がレボブピバカインを含む場合に、レボブピバカインのピークが検出される保持時間を示す。図６Ｃは、ヒトから採取した血清に、内標準溶液の調製においてプラジクアンテルの溶解に用いた溶媒（５０％アセトニトリル溶液）を添加し、前記方法に従って前処理を行い、得られた測定サンプル（ブランク）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果である。図６Ｃにおいて、ＩＳは、検体がプラジクアンテルを含む場合に、プラジクアンテルのピークが検出される保持時間を示す。
【００７４】
図５Ａ〜図５Ｃ及び図６Ａ〜図６Ｃから、ブランク血漿のクロマトグラム上及びブランク血清のクロマトグラム上には定量を妨害するピークは認められなかった。
【００７５】
ロピバカイン、レボブピバカイン及び内標準物質として使用したプラジクアンテルのピーク位置及びピーク形状を確認するために、ロピバカインの希釈標準溶液、レボブピバカインの希釈標準溶液、及びプラジクアンテルの内標準溶液を前記条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
図７Ａ〜図７Ｃに、ロピバカイン（ＲＯＰ）の希釈標準溶液（図７Ａ）、レボブピバカイン（ＬＥＶ）の希釈標準溶液（図７Ｂ）、プラジクアンテル（ＩＳ）の内標準溶液（図７Ｃ）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを、それぞれ示す。図７Ａにおいて、ＲＯＰはロピバカインのピークを、図７Ｂにおいて、ＬＥＶはレボブピバカインのピークを、図７Ｃにおいて、ＩＳは内標準物質（プラジクアンテル）のピークを、それぞれ示す。ロピバカイン、レボブピバカイン及びプラジクアンテルのクロマトグラム上のピーク形状は良好であった。
【００７６】
上記測定結果から、血漿から調製したサンプル中のレボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質の回収率は、それぞれ９９．１〜１００．９％、９１．２〜９６．７％及び９９．０±３．０％であった。
また、血清から調製したサンプル中のレボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質の回収率は、それぞれ９５．０〜１０７．２％、９７．９〜１０２．３％及び９１．７±４．４％であった。
本結果より、レボブピバカイン（又はロピバカイン）の血漿濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ及び血清濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬにおいて、回収率９０％以上の精度で分析定量が可能であることが示された。
【００７７】
例えば、局所麻酔剤としてレボブピバカイン投与後、レボブピバカイン血中濃度は、持続硬膜外腔投与の場合、通常約２．９３μｇ／ｍＬ以下であり、硬膜外腔単回投与の場合、約７００〜１１００ｎｇ／ｍＬ以下であり、静脈内投与の場合、約１．２７μｇ／ｍＬ以下とされている。実施例１で得られたレボブピバカインの定量範囲０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線で直線性が得られた範囲）に基づき、希釈再現性の結果を使用して、検量線範囲を拡大することで、いずれの場合についても投与されたレボブピバカイン血中濃度を測定することが可能となり、本発明の方法が血液、血漿、血清等のレボブピバカイン濃度の定量方法として有用であることが分かった。
なお、実施例１において、血漿又は血清の代わりに検体として尿、血液等を用いても、上記と同様の結果が得られる。
【００７８】
実施例２
実施例１において、ヒト血漿又は血清の代わりにサル（Macaca fascicularis）の血液を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。
得られた測定データを、表６〜表７に示す。表６は、レボブピバカインのデータであり、表７は、ロピバカインのデータである。
【００７９】
【表６】
【００８０】
【表７】
【００８１】
表６及び表７より、サル血液中のレボブピバカイン及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９８６、ロピバカインについてｒ＝０．９９８６）が得られた。
【００８２】
上記測定結果から、サル血液から調製したサンプル中のレボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質の回収率は、それぞれ８９．１〜９６．０％、９０．７〜９５．６％及び９６．３±６．１％であった。
本結果より、レボブピバカイン及びロピバカインの血液中濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬにおいて、回収率約９０％以上の精度で分析定量が可能であることが示された。
【００８３】
実施例３
実施例１において、血漿又は血清の代わりに母乳を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。
得られた測定データを、表８〜表９に示す。表８は、検体として母乳を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表９は、検体として母乳を使用した場合のロピバカインのデータである。
【００８４】
【表８】
【００８５】
【表９】
【００８６】
表８及び表９より、母乳中のレボブピバカイン及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９９０、ロピバカインについてｒ＝０．９９８２）が得られた。
【００８７】
実施例４
メピバカインは、塩酸メピバカイン（分子量２８２．８１、シグマアルドリッチ社製）を使用した。その他の試薬等は、実施例１と同じ物を使用した。
【００８８】
＜標準原液の調製方法＞
実施例１と同様にして、１ｍｇ／ｍＬのレボブピバカイン水溶液（標準原液）、ロピバカイン水溶液（標準原液）及びプラジクアンテルの１ｍｇ／ｍＬ溶液（内標準原液）を調製した。
メピバカイン標準原液は、塩酸メピバカイン１１．５ｍｇ（メピバカインとして１０ｍｇ）を秤量し、超純水を加えて正確に１０ｍＬとして１ｍｇ／ｍＬメピバカイン水溶液（標準原液）を調製した。
【００８９】
＜レボブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインの希釈標準溶液の調製＞
前記レボブピバカイン標準原液、ロピバカイン標準原液及びメピバカイン標準原液各１００μＬ採取して混合し、次いでレボブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインの濃度がそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるよう超純水で希釈した。
【００９０】
＜移動相のＡ液の調製＞
ｐＨを６．０に調整した以外は、実施例１と同様にしてＡ液（５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０））を調製した。
＜再溶解液の調製＞
５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）及びアセトニトリルを体積比６４：３６で混合し、再溶解液とした。
内標準溶液及びニードル洗浄液の調製方法は、実施例１と同じである。
【００９１】
＜ラット脳脊髄液の検量線＞
実施例１と同様に、ブランク及び０試料を含んだ、０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（各マトリクス中換算濃度）の８点検量線とした。前記濃度は、後述するラット脳脊髄液中換算濃度である。
＊：マトリクス中換算濃度（内標準物質（Ｉ．Ｓ．）濃度：１００ｎｇ／ｍＬ）
【００９２】
＜ラット脳脊髄液の採取＞
ラット（Rattus norvegicus）（日本エスエルシー株式会社から購入、生後約２０週齢）の大槽から、カテーテルを用いて脳脊髄液を採取した。
【００９３】
＜前処理＞
血漿又は血清２０μＬの代わりに前記で採取したラット脳脊髄液２０μＬを用い、レボブピバカイン希釈標準溶液、ロピバカイン希釈標準溶液及び内部標準溶液（１００ｎｇ／ｍＬ）に加えて、前記で調製したメピバカインの希釈標準溶液２０μＬをラット脳脊髄液に添加した以外は、実施例１と同様に前処理を行ない、測定サンプルを得た。
【００９４】
＜ＬＣ条件及びＭＳ／ＭＳ条件＞
ＬＣの移動相のＡ液（酢酸アンモニウム緩衝液）として、５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、移動相の組成をＡ液：Ｂ液＝６４：３６に変更した以外は、実施例１と同様にしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析を行なった。
【００９５】
メピバカインのモニターイオン及び測定条件を、表１０に示す。表１中、ＭＥＰは、メピバカインを意味する。レボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質（プラジクアンテル）のモニターイオン及び測定条件は、実施例１と同じである。
【００９６】
【表１０】
【００９７】
得られた測定データを、表１１〜表１３に示す。表１１は、検体としてラット脳脊髄液を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表１２は、検体としてラット脳脊髄液を使用した場合のロピバカインのデータである。表１３は、検体としてラット脳脊髄液を使用した場合のメピバカインのデータである。
【００９８】
【表１１】
【００９９】
【表１２】
【０１００】
【表１３】
【０１０１】
表１１〜表１３より、脳脊髄液中のレボブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９５３、ロピバカインについてｒ＝０．９９８８、メピバカインについて０．９９７４）が得られた。
【０１０２】
実施例５
実施例１において、血漿又は血清の代わりにラット（Rattus norvegicus）尿を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。
得られた測定データを、表１４〜表１５に示す。表１４は、検体としてラット尿を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表１５は、検体としてラット尿を使用した場合のロピバカインのデータである。
【０１０３】
【表１４】
【０１０４】
【表１５】
【０１０５】
表１４〜表１５より、尿中のレボブピバカイン、及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９８５、ロピバカインについてｒ＝０．９９８５）が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、血液等の検体中のレボブピバカイン、ロピバカイン等の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩の定量に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿、血清又は血液等の検体中の含窒素複素環を有する化合物の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レボブピバカイン（一般名）、ブピバカイン（一般名）、並びにその類似体であるロピバカイン（一般名）、メピバカイン（一般名）等のＮ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド系誘導体は、局所麻酔剤の有効成分として使用されている有用な含窒素複素環式化合物である。
【０００３】
投与後の血液、尿等の検体中のレボブピバカイン濃度の測定方法として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法が広く用いられている。しかしながら、ＨＰＬＣによりレボブピバカインを定量する場合、検体として３００μＬ〜１０ｍＬ程度の血液等を採取する必要があり、小動物や臨床時の小児、循環血液量の低下した患者では、採血が困難な場合があった。また、前処理として、液−液抽出法又は固相抽出法により検体を処理する必要があるが、液−液抽出法では処理の作業効率が悪く、多数の検体を短時間で分析することができなかった。さらに、液−液抽出法は、有機溶媒の廃液が多いという問題点もあった。固相抽出法により前処理を行う場合には、多量の検体が必要であり、さらに、処理に時間がかかるという問題があった。ウェルプレート等を使用すれば短時間での処理は可能であるが、この場合には充填剤の乾燥から回収率にバラツキが生じる可能性があった。また、固相抽出法では、前処理にかかるコストが高いという問題点もあった。
【０００４】
また、ＨＰＬＣによる分析では、レボブピバカイン等を通常紫外線（ＵＶ）の吸収によって検出するが、ＵＶによる検出は選択性が低く、夾雑物を含む検体及び併用薬を使用した検体では、測定に用いる試料を高度に精製する必要があった。さらに、レボブピバカイン、ロピバカイン等は、吸収極大が２１０〜２３０ｎｍ付近と低波長側にあるため、夾雑物等の影響により正確な定量が困難な場合があった。また、ＨＰＬＣ−ＵＶを使用する場合は、１検体の分析に２０分程度は必要であり、分析に用いる移動相を流速１ｍＬ／分程度で送液することから、ランニングコストが高いという問題もあった。
【０００５】
さらに、ＨＰＬＣによる分析では、検量線範囲が１６〜４００倍程度であることから、検量線範囲外の検体の再測定が必要となる場合が多かった。また、定量限界下限値が高く、低濃度検体の測定は不可能な場合が多かった。
【０００６】
ＨＰＬＣ以外のレボブピバカイン等の測定方法として、質量分析計（ＭＳ）を使用する方法が行われている。非特許文献１には、ヒト血漿中のレボブピバカインの測定方法として１ｍＬの血漿を採取し、前処理として液−液抽出を行った後ＨＰＬＣ−ＭＳで分析する方法が開示されており、定量限界が０．０１μｇ／ｍＬであったとされている。非特許文献２には、ヒト血漿中のブピバカインを、ＨＰＬＣ−ＭＳで測定する方法が開示されており、検量線濃度範囲が２３．８〜２３８０．０ｎｇ／ｍＬであったとされている。
しかしながら、これらの方法においても、前処理をより簡便にしたり、分析に必要な検体量をより少量としたりする改善の余地があった。また、検量線範囲が最大４００倍であることから、検量線範囲がより広い方法が必要であった。
【０００７】
従って、より少量の検体で、より簡便に、短時間に、高感度で正確に検体中のレボブピバカイン等を測定でき、しかも検量線範囲が広く低濃度の検体及び高濃度の検体を一度で測定できる分析方法が望まれていた。また、２種以上のＮ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド系誘導体を同時に定量できる方法も望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】G.A.Chalkiadis et al., British Lournal of Anaesthesia 92 (2):218-22(2004)
【非特許文献２】Anal Chem Insights. 2008 May 28;4:11-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、検体の前処理が簡便であり、多検体を短時間で前処理することができ、レボブピバカイン等の含窒素複素環式化合物に対する選択性が高いため夾雑物等の影響を受けにくく、少量の検体で高感度な測定が可能であり、２種以上の含窒素複素環式化合物の同時定量が可能であり、かつ分析時間が短く、しかも検量線範囲が広く、さらに有機溶媒等の廃液が少ないレボブピバカイン等の含窒素複素環式化合物又はその塩の定量方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決するために研究を重ね、下記一般式（Ｉ）で表わされるレボブピバカイン等の含窒素複素環式化合物又はその塩（以下、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩ともいう）を含む検体の除タンパク処理と、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による分析とを組合わせて用いることにより、血液等の検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物及びその塩を容易に高感度で検出できること、検体中に含まれる２種以上の含窒素複素環式化合物、例えばレボブピバカイン及びロピバカインを同時に定量することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
このような方法によれば、少量の検体で高感度な測定が可能であるため、検体採取時の患者等の負担を軽減できる。具体的には、例えば検体として血漿、血清又は血液を用いる場合、わずか５０μＬ程度の採血量で検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の定量を行うことが可能である。また、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩に対する選択性が高いため、被験者が併用薬等を使用した場合、検体に夾雑物等が混合している場合等でも、検体中の併用薬等の影響を受けにくく、分析に用いる検体の前処理が容易となる。本発明においては、前処理として除タンパク処理を行うが、除タンパク処理は少量のアセトニトリル等により行えるため、処理が簡便で多検体の処理が可能であり、しかも廃液が少ないというメリットもある。
【００１２】
さらに、本発明の方法においては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣにおける流速がＬＣ単独で分析する場合と比べて遅く、かつ分析時間も短いため、分析に必要な移動相の量も少ない。このため、環境への負荷が少なく、しかも分析のランニングコストを削減することができる。また、本発明においては、ＬＣで分離及び溶出された成分を、繁雑な操作を行うことなくＭＳ／ＭＳに直接導入して分析することができるため、操作が簡便である。
【００１３】
また、このような定量方法では、定量下限濃度の４０００倍の検量線範囲が得られることから、広い濃度範囲で一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を正確に定量することができる。このため、検体中の該化合物の低濃度での濃度推移及び高濃度検体の定量のいずれも測定可能であり、検量線範囲外の検体の再測定が必要となる場合が少ない。しかも、希釈再現性にも優れており、検量線の最高濃度の５０倍の濃度まで測定可能となり、実質は０．５〜１０００００ｎｇ／ｍＬと検量線範囲２０００００倍を達成できる。
なお、検量線範囲とは、分析法が適切な精度、真度及び直線性を与える試料中の分析対象物（本発明においては一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩）の上限及び下限の濃度（量）の間隔のことである（上限値及び下限値は範囲に含まれる）。
【００１４】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記の項１〜１１を提供する。
項１． 下記一般式（Ｉ）
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖又は分枝状アルキル基を表す。）で表わされる含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する検体を除タンパク処理に付す工程、及び得られた除タンパク処理検体を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計により分析して前記化合物又はその薬学的に許容される塩を測定する工程を含むことを特徴とする検体中の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩の定量方法。
項２． 除タンパク処理が、アセトニトリルを用いて行われる処理である項１に記載の定量方法。
項３． 液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計の液体クロマトグラフィーにおける移動相が、酢酸緩衝液及びアセトニトリルの混液である項１又は２に記載の定量方法。
項４． 移動相中の酢酸緩衝液とアセトニトリルとの混合割合が、体積比で６０：４０〜６５：３５である項３に記載の定量方法。
項５． 液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計において、一般式（Ｉ）で表わされる含窒素複素環式化合物のプリカーサーイオンとしてｍ／ｚ２４０〜２９０のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとしてｍ／ｚ９７〜１４０のイオンを選択し、これらイオンをモニターする項１〜４のいずれか一項に記載の定量方法。
項６． 検体が、血漿、血清、血液、母乳、尿又は脳脊髄液である項１〜５のいずれか一項に記載の定量方法。
項７． 検体が、内標準物質として、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計の液体クロマトグラフィーにおける該内標準物質に対する一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が０．２〜０．６となる化合物を含有する項１〜６のいずれか一項に記載の定量方法。
項８． 内標準物質が、プラジクアンテルである項７に記載の定量方法。
項９． ２種以上の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を同時に定量する（ただし、レボブピバカイン又はその塩、及びブピバカイン又はその塩を同時定量する場合を除く）項１〜８のいずれか一項に記載の定量方法。
項１０． 含窒素複素環式化合物が、レボブピバカイン、ブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である項１〜９のいずれか一項に記載の定量方法。
項１１． レボブピバカイン又はその塩、及びロピバカイン又はその塩を同時に定量する項９に記載の定量方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、少量の検体で、短時間にレボブピバカイン等の含窒素複素環式化合物を簡便かつ高感度に定量することができるうえ、検体中に含まれる２種以上の含窒素複素環式化合物を同時定量することができる。また、本発明の方法は検量線範囲が極めて広いため、検量線範囲外の検体の再測定が必要となる場合が少ないうえ、測定対象化合物が低濃度であっても感度良く定量できる。さらに、本発明の方法は有機溶媒等の廃液が少ないため、環境への負荷も低減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、血漿を使用して調製した検量線試料の測定結果から作成されたレボブピバカイン（ＬＥＶ）の検量線を示す図である。
【図２】図２は、血漿を使用して調製した検量線試料の測定結果から作成されたロピバカイン（ＲＯＰ）の検量線を示す図である。
【図３】図３は、血清を使用して調製した検量線試料の測定結果から作成されたレボブピバカイン（ＬＥＶ）の検量線を示す図である。
【図４】図４は、血清を使用して調製した検量線試料の測定結果から作成されたロピバカイン（ＲＯＰ）の検量線を示す図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、ブランク血漿のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを示す図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、ブランク血清のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを示す図である。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、ロピバカイン、レボブピバカイン及びプラジクアンテルの標準溶液のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の検体中の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩の定量方法は、上記一般式（Ｉ）で表わされる含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する検体を除タンパク処理に付す工程、及び得られた除タンパク処理検体をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析して前記化合物又はその薬学的に許容される塩を測定する工程を含む。
本発明の方法は、本発明の効果を奏することになる限り、上記工程以外の工程を含んでもよい。例えば、ヒト等の動物から検体を採取する工程、検体に内標準物質を添加する工程、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析で得られた測定値から、検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の濃度を算出する工程等を行ってもよい。本発明における一般式（Ｉ）で表わされる化合物及びその塩は、検体中及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定中、通常フリー体（一般式（Ｉ）で表わされる化合物）として存在する。このため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析により得られる測定値は、通常、一般式（Ｉ）で表わされる化合物に関する測定値である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析により得られる一般式（Ｉ）で表わされる化合物に関する測定値から、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の濃度が算出される。
【００２０】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物において、カルボニル基が結合しているピペリジン環の炭素原子（下記一般式（Ｉ）中に＊で示される）は、不斉炭素原子である。
【００２１】
【化２】
【００２２】
（式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖又は分枝状アルキル基を表す。）
前記一般式（Ｉ）中のカルボニル基が結合しているピペリジン環の炭素原子（前記一般式（Ｉ）中に＊で示される不斉炭素原子）の絶対配置は、Ｒであってもよく、Ｓであってもよい。
本発明における一般式（Ｉ）で表わされる化合物が不斉炭素原子を１個有する場合、絶対配置Ｒ又はＳで表される純粋な光学活性体であってもよく、その任意な割合の混合物であってもよく、ラセミ体であってもよい。すなわち本発明における一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、下記一般式（Ｉ−１）
【００２３】
【化３】
（式中、Ｒは、前記と同義である。）で表わされる化合物、下記一般式（Ｉ−２）
【００２４】
【化４】
【００２５】
（式中、Ｒは、前記と同義である。）で表わされる化合物、又は一般式（Ｉ−１）で表わされる化合物及び一般式（Ｉ−２）で表わされる化合物の任意な割合の混合物である。
また、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、不斉炭素原子を２個有する場合には、該化合物は、光学的に純粋なジアステレオマーであってもよく、そのラセミ体であってもよく、又はその任意な割合の混合物であってもよい。
【００２６】
前記一般式（Ｉ）におけるＲとして、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。Ｒは、好ましくは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基である。より好ましくは、炭素数３〜４の直鎖状アルキル基であり、最も好ましくは、炭素数４の直鎖状アルキル基である。
【００２７】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物として、レボブピバカイン（一般名）（化学名は、（−）−（２Ｓ）−ｌ−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド）、ブピバカイン（一般名）（化学名は、（２ＲＳ）−ｌ−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド）、ロピバカイン（一般名）（化学名は、（Ｓ）−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−１−プロピルピペリジン−２−カルボキサミド）、メピバカイン（一般名）（化学名は、（２ＲＳ）−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−１−メチルピペリジン−２−カルボキサミド）等が好ましい。中でも、レボブピバカイン（化学名：（−）−（２Ｓ）−ｌ−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）ピペリジン−２−カルボキサミド）が好適である。
【００２８】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物の塩は、薬学的に許容される塩であればよく、特に限定されない。例えば、薬学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。酸付加塩として、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸塩が挙げられる。金属塩として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩として、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。有機アミン付加塩として、ピペリジン等の付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩として、リジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。中でも、酸付加塩、有機酸塩等が好ましく、塩酸塩がより好ましい。
【００２９】
本発明における検体は、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含有するものであればよい。一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含有する検体は、通常、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を投与された動物から採取される。本発明における検体として、例えば、ヒトを含む動物の血液、血漿、血清、母乳、唾液、尿及び脳脊髄液（脳髄液ともいう）等の生体試料、及び動物における各種の臓器、組織等が挙げられる。検体は、好ましくは、ヒトを含む動物から採取された生体試料である。中でも、血漿、血清、血液、母乳、尿又は脳脊髄液が、検体として好ましい。検体として血漿又は血清を使用する場合、採血された血液から血漿又は血清を分離する方法は特に限定されず、通常使用される方法により行うことができる。母乳は、初乳又は成乳等どのような状態であってもよい。
【００３０】
本発明において使用される検体の量は、例えば、血漿、血清又は血液であれば、通常、約２０μＬ以上あればよい。好ましくは、検体の量は、１０〜２００μＬ程度であり、より好ましくは、１５〜１００μＬ程度であり、最も好ましくは、２０〜３０μＬ程度である。従って、ヒトを含む動物から検体として生体試料を採取する場合には、上記量を採取すればよい。
【００３１】
本発明においては、検体が内標準物質を含有するものであることが好ましい。検体に内標準物質を添加する場合には、除タンパク処理を行う前に添加することが好ましい。内標準物質は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおいて、測定の対象である一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の検出ピークと異なる位置にピークを有する化合物であり、かつそのピークが血漿等に含まれる生体成分の検出ピークの位置とも異なるものが好ましい。また、内標準物質は、血漿等の検体中において安定で経時的変化が少なく、除タンパク処理を行っても回収率が良好な化合物が好ましい。
【００３２】
内標準物質は、例えば、後述するＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣにおける該内標準物質に対する一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が約０．１〜５となる化合物等が好ましい。内標準物質は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が、約０．２以上となる化合物であることが好ましく、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が約０．２〜０．６となる化合物がより好ましく、約０．３〜０．６となる化合物がさらに好ましく、約０．４〜０．６となる化合物が特に好ましい。なお、前記相対保持時間は、ＬＣにおける内標準物質の保持時間を１とした場合の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間である。また、内標準物質は、後述するＭＳ／ＭＳ条件１で内標準物質を含む検体を分析した際に、質量分析によるｍ／ｚが約１００〜５００である化合物等が好ましい。
【００３３】
本発明における内標準物質として、プラジクアンテル（一般名）、リドカイン（一般名）、ミダゾラム（一般名）等が好適である。中でも、内標準物質として、プラジクアンテルが好適である。検体における内標準物質の濃度は、１０〜２００ｎｇ／ｍＬ程度とすることが好ましい。
【００３４】
本発明においては、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含有する検体を、除タンパク処理に付して除タンパク検体を得る。
除タンパク処理として、除タンパク剤を用いて行われる処理、水と混和可能な有機溶媒を用いて行われる処理、加熱又は冷却による処理等が挙げられ、これらのいずれでもよい。中でも、必要な検体量が少量であり、かつ処理が簡便であることから、水と混和可能な有機溶媒を用いて行われる処理が好ましい。有機溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール等が挙げられる。中でも、アセトニトリルが好ましい。
【００３５】
水と混和可能な有機溶媒を用いて行われる除タンパク処理の方法は特に限定されず、通常の方法で行うことができる。例えば、まず、検体に、水と混和可能な有機溶媒を添加し、検体と該有機溶媒とを混合してタンパク質を沈殿させることが好ましい。また、好ましくは、検体に有機溶媒を添加混合後、超音波処理を行う。超音波処理により、検体からの一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の回収率がより安定する。超音波処理は、通常１０分程度行えばよい。検体と有機溶媒との混合割合は、検体の種類により適宜選択することができるが、体積比で検体１に対して有機溶媒約１〜１００とすることが好ましい。例えば、検体が成乳の場合には、体積比で検体１に対して有機溶媒を約１〜１００とすることがより好ましく、約４〜１００とすることがさらに好ましい。検体が成乳以外の生体試料（例えば、血漿、血清、血液、初乳、尿、脳脊髄液等）の場合には、体積比で検体１に対して有機溶媒を約１〜１０とすることがより好ましい。検体が成乳以外の生体試料の場合、さらに好ましくは、体積比で検体１に対して有機溶媒約４〜１０である。
【００３６】
検体と、水と混和可能な有機溶媒との混合液から沈殿したタンパク質を分離することにより、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩、及び所望により添加された内標準物質を含有する除タンパク処理検体が得られる。沈殿したタンパク質の除去は、公知の方法により行うことができる。例えば、遠心分離、ろ過等の方法により、上澄み（除タンパク処理検体）と沈殿したタンパク質とを簡便に分離することができる。
【００３７】
上記で得られた一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩、及び所望により添加された内標準物質を含有する除タンパク処理検体は、通常、濃縮乾固され、得られた濃縮乾固物が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおけるＬＣの移動相で溶解され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入されて分析され、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩が測定される。濃縮乾固の条件は特に限定されないが、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩、及び所望により添加された内標準物質を含有する除タンパク処理検体を、窒素気流又は減圧濃縮下、約３５〜５０℃で濃縮乾固する。
【００３８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳとしては、ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、Ａｃｃｅｌａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、Ａｌｌｉａｎｃｅ ２７９５（日本ウォーターズ株式会社製）等を使用することができる。
【００３９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムのＬＣにおける移動相としては、酢酸緩衝液及び有機溶媒の混液、ギ酸緩衝液及び有機溶媒の混液等が好適である。酢酸緩衝液としては、酢酸溶液、酢酸アンモニウム溶液、酢酸アンモニウム緩衝液等を用いることができる。前記酢酸溶液中の酢酸濃度は特に限定されないが、約１〜３μｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは約１．５〜２μｍｏｌ／Ｌである。また酢酸アンモニウム溶液中の酢酸アンモニウムの濃度は、通常約１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは約２〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約４〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。酢酸アンモニウム緩衝液は、前記酢酸アンモニウム溶液に酢酸を加えｐＨを約５〜６の範囲に調整して作製することが好ましい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール等が挙げられる。中でも、アセトニトリルが好適である。酢酸緩衝液及びアセトニトリルの混液としては、例えば、酢酸溶液及びアセトニトリルの混液、酢酸アンモニウム溶液又は酢酸アンモニウム緩衝液とアセトニトリルとの混液、酢酸溶液及びアセトニトリルの混液等が挙げられる。酢酸溶液及び酢酸アンモニウム溶液はそれぞれ酢酸水溶液及び酢酸アンモニウム水溶液であってもよい。中でも、本発明の方法においては、ＬＣにおける移動相として、酢酸アンモニウム緩衝液及びアセトニトリルの混液が好ましい。移動相中の酢酸緩衝液（酢酸溶液、酢酸アンモニウム溶液又は酢酸アンモニウム緩衝液）とアセトニトリルとの混合割合は、体積比で通常、約８０：２０〜５０：５０であり、好ましくは約７５：２５〜５５：４５、さらに好ましくは約７０：３０〜６０：４０、特に好ましくは約６０：４０〜６５：３５である。このような移動相を用いると、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩をより高感度で測定できる。また、より広い検量線範囲が得られるため好ましい。
ギ酸緩衝液及び有機溶媒の混液は、上述した酢酸緩衝液の代わりにギ酸溶液又はギ酸緩衝液を使用することにより調製することができる。
【００４０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣにおけるカラムとしては、逆相クロマトグラフィーカラムが好ましい。逆相クロマトグラフィーカラムとしては、オクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）系カラムが好ましく、例えば、エックスブリッジ（ＸＢｒｉｄｇｅ）Ｃ１８（商品名、日本ウォーターズ社製）、エックスブリッジＲＰ Ｃ１８（商品名、日本ウォーターズ社製）、カプセルパックＭＧＩＩ（商品名、資生堂社製）等が挙げられる。本発明においては、ガードカラムを使用することもできる。ガードカラムとしては、エックスブリッジＣ１８（商品名、日本ウォーターズ社製）、エックスブリッジＲＰ Ｃ１８（商品名、日本ウォーターズ社製）等が好適である。
【００４１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣにおける分析条件は特に限定されないが、移動相の流速を約０．１〜０．５ｍＬ／分とすることが好ましく、約０．２〜０．３ｍＬ／分とすることがより好ましい。この流速で、１回の分析につき約１０〜２０分通液することが好ましい。試料の注入量は、約１〜２０μＬが好ましく、カラム温度は、通常約３５〜４５℃、好ましくは約３７〜４３℃とする。
【００４２】
本発明の方法における好ましいＬＣ分析条件の一例を、下記に示す。
ＬＣ条件１
・ＨＰＬＣシステム：Ａｃｃｅｌａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・カラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ、３．５μｍ、日本ウォーターズ社製）
・ガードカラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｍｍ、３．５μｍ、日本ウォーターズ製）
・移動相： Ａ液：Ｂ液＝６２：３８
・Ａ液：５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．２）、Ｂ液：アセトニトリル
・流量：０．２ｍＬ／分
・分析時間：１０分
【００４３】
ＬＣ条件２
・ＨＰＬＣシステム：Ａｃｃｅｌａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・カラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ、３．５μｍ、日本ウォーターズ社製）
・ガードカラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｍｍ、３．５μｍ、日本ウォーターズ製）
・移動相： Ａ液：Ｂ液＝６４：３６
・Ａ液：５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）、Ｂ液：アセトニトリル
・流量：０．２ｍＬ／分
・分析時間：１０分
【００４４】
例えば、上記ＬＣ条件１によれば、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の保持時間は、通常約３〜５分である。内標準物質としてプラジクアンテル（一般名）を使用した場合、プラジクアンテルに対する一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間は、通常約０．２〜０．６である。なお、保持時間及び相対保持時間は、例え実験条件を同じくした場合においても、多少は増減するものであり、厳密に解釈されるべきものではない。
【００４５】
ＬＣで分離及び溶出された成分は、タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）のイオン化室に導入されてイオン化される。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおけるイオン化法は特に限定されず、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、サーモスプレーイオン化（ＴＳＰ）又は高速原子衝撃（ＦＡＢ）等を使用することができる。中でも、ＥＳＩが好ましい。ＭＳ／ＭＳにおいては、通常、第一段目の質量分析計でプリカーサーイオン（ここではプロトン付加分子）が選択され、次いでコリジョンセルと呼ばれる衝突室でアルゴンガス等と衝突させてプリカーサーイオンを解離させ、新しいイオン群を発生させる。この新しいイオン群のうち最大のピークを示すイオンがプロダクトイオンとして選択され、第二段目の質量分析計で分析される。
【００４６】
生成したプロダクトイオンの検出方法として、例えば、フルスキャン法、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）法、選択リアクションモニタリング（ＳＲＭ）法等が挙げられる。中でも、本発明においてはＳＲＭ法が好適に用いられる。本発明においては、一般式（Ｉ）で表わされる化合物のプリカーサーイオンとしてｍ／ｚ２４０〜２９０のイオンを選択し且つプロダクトイオンとしてｍ／ｚ９７〜１４０のイオンを選択し、これらイオンをモニターすることが好ましい。より具体的には、ＳＲＭ法において、例えば、一般式（Ｉ）で表わされる化合物のプリカーサーイオンとしてｍ／ｚ２８８．６〜２９９．０のイオンのみを選択し、次に、このイオンを窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガスに衝突させ分解させた際に生じるプロダクトイオンのうちｍ／ｚ１０〜２９０の範囲内で最大のピークを示すイオン、好ましくはｍ／ｚ１４０付近のイオンのみを選択してそのイオンの量をモニターすることにより、本発明が目的とする検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を高感度で測定することができる。このとき、例えば、内部標準物質としてプラジクアンテルを用いる場合には、プラジクアンテルのプリカーサーイオンとして、ｍ／ｚ３１３付近のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとして、ｍ／ｚ１０〜３１３の範囲内で最大のピークを示すイオン、好ましくはｍ／ｚ２０３付近のイオンを選択することが好ましい。
【００４７】
本発明の方法における好ましいＭＳ／ＭＳ分析条件の一例を、下記に示す。
ＭＳ／ＭＳ条件１
・ＭＳ／ＭＳシステム：ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・イオン化法：ＥＳＩ（＋）
・測定モード：選択リアクションモニタリング（selected reaction monitoring：ＳＲＭ）
【００４８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析で得られた測定値から、検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の濃度を算出することができる。濃度の算出方法は特に限定されず、例えば、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の標準溶液を用いて作成した検量線を用いて行う方法が好適である。具体的には、検量線は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の標準溶液に、所望により内標準物質を添加した検体を用いて、上述した除タンパク処理及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の手順を実施して得られる測定値から作成される。
【００４９】
本発明において用いられる検量線は、真度が定量下限濃度において±２０％以内であり、その他の濃度において±１５％以内であり、かつ相関係数が０．９９以上である検量線を用いることが好ましい。内標準物質を用いた場合には、例えば、検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩のピーク面積値と内標準物質のピーク面積値との比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより信頼性の高い検量線を作成することができる。また、一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を、該化合物又はその塩を投与されていない動物（健常人等）の検体（例えば血漿）に溶解した標準溶液を用いることにより、例えば血漿に含まれる内因性要因の影響を除くことができる。すなわち、かかる検量線を用いることにより、患者における一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の検体中の濃度を直接算出できるので、好適である。上記定量下限濃度は、検量線作成のために用いる一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を添加した検体のうち、検体中の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の濃度の一番低い濃度を意味する。上記真度は、一般的な式として、以下の式により算出される。
真度（％）＝１００×(測定値−理論値)／理論値
上記相関係数は、例えば、「ピアソンの積率相関係数」を用いて算出できる。
【００５０】
本発明においては、検体に含まれる一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を、回収率約９０％以上の精度で定量することができる。回収率は、通常以下の式により算出される。
回収率（％）＝１００×（回収率算出用試料のピーク面積値）／（回収率算出用対照試料のピーク面積値の平均値）
【００５１】
本発明の定量方法によれば、２種以上の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその薬学的に許容される塩を同時に定量することができる。
例えば、本発明の定量方法は、レボブピバカイン（又はその塩）、ブピバカイン（又はその塩）、ロピバカイン（又はその塩）及びメピバカイン（又はその塩）からなる群より選択される２種以上の化合物を同時定量する方法として好適である。なお、レボブピバカインは、ブピバカインの光学異性体の１つであるため、レボブピバカインとブピバカインとを分離することは、通常困難である。本発明の定量方法により、２種以上の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を同時に定量する場合には、レボブピバカイン（又はその塩）、及びブピバカイン（又はその塩）の組合わせを含まない２種以上の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を同時に定量することが好ましい。例えば、本発明の定量方法は、(i)レボブピバカイン（又はその塩）、ロピバカイン（又はその塩）及びメピバカイン（又はその塩）からなる群より選択される２種以上の化合物、又は(ii)ブピバカイン（又はその塩）、ロピバカイン（又はその塩）及びメピバカイン（又はその塩）からなる群より選択される２種以上の化合物を同時定量する方法として好適に用いられる。中でも、本発明の定量方法は、レボブピバカイン（又はその塩）及びロピバカイン（又はその塩）を同時に定量する方法としてより好適である。本発明の定量方法により、２種以上の化合物を含む検体を用いて該２種以上の化合物を同時定量する場合は、各化合物それぞれの量を同時に求めることができる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
塩酸レボブピバカインは、カイロサイエンス社製、塩酸ロピバカイン一水和物は、トロントリサーチケミカル社製、プラジクアンテルは、和光純薬工業社製のものを使用した。その他の試薬は、和光純薬工業社、関東化学社又はシグマアルドリッチ社製のものを使用した。
【００５４】
＜標準原液の調製方法＞
塩酸レボブピバカイン（分子量３２４．８９）１１．３ｍｇ（レボブピバカインとして１０ｍｇ）を秤量し、超純水を加えて正確に１０ｍＬとして、１ｍｇ／ｍＬのレボブピバカイン水溶液（標準原液）を調製した。
塩酸ロピバカイン一水和物（分子量３２８．８８）１２．０ｍｇ（ロピバカインとして１０ｍｇ）を秤量し、超純水を加えて正確に１０ｍＬとして、１ｍｇ／ｍＬのロピバカイン水溶液（標準原液）を調製した。
プラジクアンテル（分子量３１２．４１）５．０ｍｇを秤量し、アセトニトリル（ＬＣ／ＭＳ用）を加えて正確に５ｍＬとして、プラジクアンテルの１ｍｇ／ｍＬ溶液（内標準原液）を調製した。
【００５５】
＜レボブピバカイン及びロピバカインの希釈標準溶液の調製＞
前記レボブピバカイン標準原液及び前記ロピバカイン標準原液各１００μＬを採取して混合し、次いで、レボブピバカイン及びロピバカイン両成分がそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるように超純水で希釈した。この混合溶液（レボブピバカイン及びロピバカイン両成分がそれぞれ１００μｇ／ｍＬ）を用いて、前記両成分がそれぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、１６００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、及び０．５ｎｇ／ｍＬとなるように超純水で希釈し、各希釈標準溶液を調製した。
【００５６】
＜内標準溶液の調製＞
前記内標準原液を５０％アセトニトリル溶液で希釈し、プラジクアンテル濃度２０μｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬの内標準溶液を調製した。
【００５７】
＜移動相のＡ液の調製＞
酢酸アンモニウム（特級、和光純薬工業社製）３．８５ｇを超純水１０００ｍＬに溶解し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム溶液を調製した。この５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム溶液を超純水で１０倍希釈し、ｐＨメーターを用いて酢酸（ＬＣ−ＭＳ用）を加え、ｐＨ５．２に調整し、超音波照射による脱気後、Ａ液（５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．２））とした。
【００５８】
＜ニードル洗浄液の調製＞
アセトニトリル（ＬＣ／ＭＳ用）及び超純水を体積比１：１で混合後、得られた５０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液に、酢酸（ＬＣ−ＭＳ用）を０．１ｖ／ｖ％となるよう添加し、ニードル洗浄液（０．１％の酢酸を含有する５０％アセトニトリル溶液）とした。
＜再溶解液の調製＞
５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．２）及びアセトニトリルを体積比６２：３８で混合し、再溶解液とした。
【００５９】
＜ヒト血漿及び血清の検量線＞
ブランク及び０試料を含んだ、０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（各マトリクス中換算濃度）の８点検量線とした。前記濃度は、後述する血漿又は血清中換算濃度である。
＊：マトリクス中換算濃度（内標準物質（Ｉ．Ｓ．）濃度：１００ｎｇ／ｍＬ）
【００６０】
＜前処理＞
（１）血漿又は血清２０μＬにレボブピバカイン・ロピバカイン希釈標準溶液及び内部標準溶液（１００ｎｇ／ｍＬ）を各２０μＬ添加した。
（２）（１）の混合溶液にアセトニトリル２００μＬを添加後、激しく攪拌した。
（３）（２）の操作後、超音波処理（１０分、ｒｔ）し、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ）を行った。
（４）（３）の後、上清を採取して試験管に移し、窒素雰囲気又は減圧濃縮下４０℃で３０分間乾固させた。
（５）（４）で得られた残渣に再溶解液１００μＬを添加後、攪拌し再溶解させ、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＬＧ（ミリポア社製）（０．２２μｍ、４ｍｍ）にてろ過し、測定サンプルとした。
【００６１】
＜ＬＣ条件＞
・ＨＰＬＣシステム：Ａｃｃｅｌａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・カラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ、３．５μｍ、日本Ｗａｔｅｒｓ社製）
・ガードカラム：エックスブリッジＣ１８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｍｍ、３．５μｍ、日本Ｗａｔｅｒｓ製）
・カラム温度：４０℃
・流量：０．２ｍＬ／分
・移動相： Ａ液：Ｂ液＝６２：３８
Ａ液：５ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．２）
Ｂ液：アセトニトリル（ＬＣ／ＭＳ用）
・ニードル洗浄液：０．１％の酢酸を含有する５０％アセトニトリル溶液
・試料注入量：２μＬ
・オートサンプラー内設定温度：１０℃
・分析時間：１０分
【００６２】
＜ＭＳ／ＭＳ条件＞
・ＭＳ／ＭＳシステム：ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）
・イオン化法：ＥＳＩ（＋）
・スプレー電圧（Spray Voltage）：１０００Ｖ
・Heated Capillary温度：３５０℃
・測定モード：選択リアクションモニタリング（selected reaction monitoring：ＳＲＭ）
・衝突ガス圧力（Collision Pressure：ＣＰＲ）：１．５ｍＴｏｒｒ（約２００ｍＰａ）
・シースガス（Seath Gas）：４０ｐｓｉ（約２７６ｋＰａ）
・ＡＵＸ Ｇａｓ：３５ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ
モニターイオン及び測定条件を、以下に示す。表１中、ＬＥＶは、レボブピバカインを意味する。ＲＯＰは、ロピバカインを意味する。ＩＳは、内標準物質（プラジクアンテル）を意味する。
【００６３】
【表１】
【００６４】
得られた測定データを、表２〜表５に示す。表２は、検体として血漿を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表３は、検体として血漿を使用した場合のロピバカインのデータである。表４は、検体として血清を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表５は、検体として血清を使用した場合のロピバカインのデータである。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】
表２及び表３より、血漿中のレボブピバカイン及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９７７、ロピバカインについてｒ＝０．９９７５）が得られた。血漿を使用して調製した検量線試料の測定結果（表２及び表３）から作成されたレボブピバカインの検量線を図１に、ロピバカインの検量線を図２に、それぞれ示す。
【００７０】
表４及び表５より、血清中のレボブピバカイン及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９９８、ロピバカインについてｒ＝０．９９９６）が得られた。血清を使用して調製した検量線試料の測定結果（表４及び表５）から作成されたレボブピバカインの検量線を図３に、ロピバカインの検量線を図４に、それぞれ示す。
【００７１】
また、クロマトグラム上のレボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質（プラジクアンテル）の溶出位置における妨害ピークの有無を確認するために、ブランク血漿及びブランク血清それぞれを前記条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。図５Ａ〜図５Ｃに、ブランク血漿のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを、図６Ａ〜図６Ｃに、ブランク血清のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを、それぞれ示す。
【００７２】
図５Ａ及び図５Ｂはそれぞれ、ヒトから採取した血漿に、ロピバカイン及びレボブピバカインの希釈標準溶液の調製に用いた溶媒（超純水）を添加し、前記方法に従って前処理を行い、得られた測定サンプル（ブランク）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果である。図５Ａにおいて、ＲＯＰは、検体がロピバカインを含む場合に、ロピバカインのピークが検出される保持時間を示す。図５Ｂにおいて、ＬＥＶは、検体がレボブピバカインを含む場合に、レボブピバカインのピークが検出される保持時間を示す。図５Ｃは、ヒトから採取した血漿に、内標準溶液の調製においてプラジクアンテルの溶解に用いた溶媒（５０％アセトニトリル溶液）を添加し、前記方法に従って前処理を行い、得られた測定サンプル（ブランク）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果である。図５Ｃにおいて、ＩＳは、検体がプラジクアンテルを含む場合に、プラジクアンテルのピークが検出される保持時間を示す。
【００７３】
図６Ａ及び図６Ｂはそれぞれ、ヒトから採取した血清に、ロピバカイン及びレボブピバカインの希釈標準溶液の調製に用いた溶媒（超純水）を添加し、前記方法に従って前処理を行い、得られた測定サンプル（ブランク）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果である。図６Ａにおいて、ＲＯＰは、検体がロピバカインを含む場合に、ロピバカインのピークが検出される保持時間を示す。図６Ｂにおいて、ＬＥＶは、検体がレボブピバカインを含む場合に、レボブピバカインのピークが検出される保持時間を示す。図６Ｃは、ヒトから採取した血清に、内標準溶液の調製においてプラジクアンテルの溶解に用いた溶媒（５０％アセトニトリル溶液）を添加し、前記方法に従って前処理を行い、得られた測定サンプル（ブランク）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果である。図６Ｃにおいて、ＩＳは、検体がプラジクアンテルを含む場合に、プラジクアンテルのピークが検出される保持時間を示す。
【００７４】
図５Ａ〜図５Ｃ及び図６Ａ〜図６Ｃから、ブランク血漿のクロマトグラム上及びブランク血清のクロマトグラム上には定量を妨害するピークは認められなかった。
【００７５】
ロピバカイン、レボブピバカイン及び内標準物質として使用したプラジクアンテルのピーク位置及びピーク形状を確認するために、ロピバカインの希釈標準溶液、レボブピバカインの希釈標準溶液、及びプラジクアンテルの内標準溶液を前記条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
図７Ａ〜図７Ｃに、ロピバカイン（ＲＯＰ）の希釈標準溶液（図７Ａ）、レボブピバカイン（ＬＥＶ）の希釈標準溶液（図７Ｂ）、プラジクアンテル（ＩＳ）の内標準溶液（図７Ｃ）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるクロマトグラムを、それぞれ示す。図７Ａにおいて、ＲＯＰはロピバカインのピークを、図７Ｂにおいて、ＬＥＶはレボブピバカインのピークを、図７Ｃにおいて、ＩＳは内標準物質（プラジクアンテル）のピークを、それぞれ示す。ロピバカイン、レボブピバカイン及びプラジクアンテルのクロマトグラム上のピーク形状は良好であった。
【００７６】
上記測定結果から、血漿から調製したサンプル中のレボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質の回収率は、それぞれ９９．１〜１００．９％、９１．２〜９６．７％及び９９．０±３．０％であった。
また、血清から調製したサンプル中のレボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質の回収率は、それぞれ９５．０〜１０７．２％、９７．９〜１０２．３％及び９１．７±４．４％であった。
本結果より、レボブピバカイン（又はロピバカイン）の血漿濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ及び血清濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬにおいて、回収率９０％以上の精度で分析定量が可能であることが示された。
【００７７】
例えば、局所麻酔剤としてレボブピバカイン投与後、レボブピバカイン血中濃度は、持続硬膜外腔投与の場合、通常約２．９３μｇ／ｍＬ以下であり、硬膜外腔単回投与の場合、約７００〜１１００ｎｇ／ｍＬ以下であり、静脈内投与の場合、約１．２７μｇ／ｍＬ以下とされている。実施例１で得られたレボブピバカインの定量範囲０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線で直線性が得られた範囲）に基づき、希釈再現性の結果を使用して、検量線範囲を拡大することで、いずれの場合についても投与されたレボブピバカイン血中濃度を測定することが可能となり、本発明の方法が血液、血漿、血清等のレボブピバカイン濃度の定量方法として有用であることが分かった。
なお、実施例１において、血漿又は血清の代わりに検体として尿、血液等を用いても、上記と同様の結果が得られる。
【００７８】
実施例２
実施例１において、ヒト血漿又は血清の代わりにサル（Macaca fascicularis）の血液を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。
得られた測定データを、表６〜表７に示す。表６は、レボブピバカインのデータであり、表７は、ロピバカインのデータである。
【００７９】
【表６】
【００８０】
【表７】
【００８１】
表６及び表７より、サル血液中のレボブピバカイン及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９８６、ロピバカインについてｒ＝０．９９８６）が得られた。
【００８２】
上記測定結果から、サル血液から調製したサンプル中のレボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質の回収率は、それぞれ８９．１〜９６．０％、９０．７〜９５．６％及び９６．３±６．１％であった。
本結果より、レボブピバカイン及びロピバカインの血液中濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬにおいて、回収率約９０％以上の精度で分析定量が可能であることが示された。
【００８３】
実施例３
実施例１において、血漿又は血清の代わりに母乳を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。
得られた測定データを、表８〜表９に示す。表８は、検体として母乳を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表９は、検体として母乳を使用した場合のロピバカインのデータである。
【００８４】
【表８】
【００８５】
【表９】
【００８６】
表８及び表９より、母乳中のレボブピバカイン及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９９０、ロピバカインについてｒ＝０．９９８２）が得られた。
【００８７】
実施例４
メピバカインは、塩酸メピバカイン（分子量２８２．８１、シグマアルドリッチ社製）を使用した。その他の試薬等は、実施例１と同じ物を使用した。
【００８８】
＜標準原液の調製方法＞
実施例１と同様にして、１ｍｇ／ｍＬのレボブピバカイン水溶液（標準原液）、ロピバカイン水溶液（標準原液）及びプラジクアンテルの１ｍｇ／ｍＬ溶液（内標準原液）を調製した。
メピバカイン標準原液は、塩酸メピバカイン１１．５ｍｇ（メピバカインとして１０ｍｇ）を秤量し、超純水を加えて正確に１０ｍＬとして１ｍｇ／ｍＬメピバカイン水溶液（標準原液）を調製した。
【００８９】
＜レボブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインの希釈標準溶液の調製＞
前記レボブピバカイン標準原液、ロピバカイン標準原液及びメピバカイン標準原液各１００μＬ採取して混合し、次いでレボブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインの濃度がそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるよう超純水で希釈した。
【００９０】
＜移動相のＡ液の調製＞
ｐＨを６．０に調整した以外は、実施例１と同様にしてＡ液（５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０））を調製した。
＜再溶解液の調製＞
５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）及びアセトニトリルを体積比６４：３６で混合し、再溶解液とした。
内標準溶液及びニードル洗浄液の調製方法は、実施例１と同じである。
【００９１】
＜ラット脳脊髄液の検量線＞
実施例１と同様に、ブランク及び０試料を含んだ、０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（各マトリクス中換算濃度）の８点検量線とした。前記濃度は、後述するラット脳脊髄液中換算濃度である。
＊：マトリクス中換算濃度（内標準物質（Ｉ．Ｓ．）濃度：１００ｎｇ／ｍＬ）
【００９２】
＜ラット脳脊髄液の採取＞
ラット（Rattus norvegicus）（日本エスエルシー株式会社から購入、生後約２０週齢）の大槽から、カテーテルを用いて脳脊髄液を採取した。
【００９３】
＜前処理＞
血漿又は血清２０μＬの代わりに前記で採取したラット脳脊髄液２０μＬを用い、レボブピバカイン希釈標準溶液、ロピバカイン希釈標準溶液及び内部標準溶液（１００ｎｇ／ｍＬ）に加えて、前記で調製したメピバカインの希釈標準溶液２０μＬをラット脳脊髄液に添加した以外は、実施例１と同様に前処理を行ない、測定サンプルを得た。
【００９４】
＜ＬＣ条件及びＭＳ／ＭＳ条件＞
ＬＣの移動相のＡ液（酢酸アンモニウム緩衝液）として、５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、移動相の組成をＡ液：Ｂ液＝６４：３６に変更した以外は、実施例１と同様にしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析を行なった。
【００９５】
メピバカインのモニターイオン及び測定条件を、表１０に示す。表１中、ＭＥＰは、メピバカインを意味する。レボブピバカイン、ロピバカイン及び内標準物質（プラジクアンテル）のモニターイオン及び測定条件は、実施例１と同じである。
【００９６】
【表１０】
【００９７】
得られた測定データを、表１１〜表１３に示す。表１１は、検体としてラット脳脊髄液を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表１２は、検体としてラット脳脊髄液を使用した場合のロピバカインのデータである。表１３は、検体としてラット脳脊髄液を使用した場合のメピバカインのデータである。
【００９８】
【表１１】
【００９９】
【表１２】
【０１００】
【表１３】
【０１０１】
表１１〜表１３より、脳脊髄液中のレボブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９５３、ロピバカインについてｒ＝０．９９８８、メピバカインについて０．９９７４）が得られた。
【０１０２】
実施例５
実施例１において、血漿又は血清の代わりにラット（Rattus norvegicus）尿を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。
得られた測定データを、表１４〜表１５に示す。表１４は、検体としてラット尿を使用した場合のレボブピバカインのデータである。表１５は、検体としてラット尿を使用した場合のロピバカインのデータである。
【０１０３】
【表１４】
【０１０４】
【表１５】
【０１０５】
表１４〜表１５より、尿中のレボブピバカイン、及びロピバカインそれぞれについて、濃度０．５〜２０００ｎｇ／ｍＬ（検量線範囲４０００倍）の範囲で、相関係数の高い検量線（レボブピバカインについてｒ＝０．９９８５、ロピバカインについてｒ＝０．９９８５）が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、血液等の検体中のレボブピバカイン、ロピバカイン等の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩の定量に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖又は分枝状アルキル基を表す。）で表わされる含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する検体を除タンパク処理に付す工程、及び得られた除タンパク処理検体を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計により分析して前記化合物又はその薬学的に許容される塩を測定する工程を含むことを特徴とする検体中の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩の定量方法。
【請求項２】
除タンパク処理が、アセトニトリルを用いて行われる処理である請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計の液体クロマトグラフィーにおける移動相が、酢酸緩衝液及びアセトニトリルの混液である請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項４】
移動相中の酢酸緩衝液とアセトニトリルとの混合割合が、体積比で６０：４０〜６５：３５である請求項３に記載の定量方法。
【請求項５】
液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計において、一般式（Ｉ）で表わされる含窒素複素環式化合物のプリカーサーイオンとしてｍ／ｚ２４０〜２９０のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとしてｍ／ｚ９７〜１４０のイオンを選択し、これらイオンをモニターする請求項１〜４のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項６】
検体が、血漿、血清、血液、母乳、尿又は脳脊髄液である請求項１〜５のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項７】
検体が、内標準物質として、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計の液体クロマトグラフィーにおける該内標準物質に対する一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が０．２〜０．６となる化合物を含有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項８】
内標準物質が、プラジクアンテルである請求項７に記載の定量方法。
【請求項９】
２種以上の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を同時に定量する（ただし、レボブピバカイン又はその塩、及びブピバカイン又はその塩を同時定量する場合を除く）請求項１〜８のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１０】
含窒素複素環式化合物が、レボブピバカイン、ブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項１〜９のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１１】
レボブピバカイン又はその塩、及びロピバカイン又はその塩を同時に定量する請求項９に記載の定量方法。
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖又は分枝状アルキル基を表す。）で表わされる含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する検体を除タンパク処理に付す工程、及び得られた除タンパク処理検体を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計により分析して前記化合物又はその薬学的に許容される塩を測定する工程を含むことを特徴とする検体中の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩の定量方法。
【請求項２】
除タンパク処理が、アセトニトリルを用いて行われる処理である請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計の液体クロマトグラフィーにおける移動相が、酢酸緩衝液及びアセトニトリルの混液である請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項４】
移動相中の酢酸緩衝液とアセトニトリルとの混合割合が、体積比で６０：４０〜６５：３５である請求項３に記載の定量方法。
【請求項５】
液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計において、一般式（Ｉ）で表わされる含窒素複素環式化合物のプリカーサーイオンとしてｍ／ｚ２４０〜２９０のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとしてｍ／ｚ９７〜１４０のイオンを選択し、これらイオンをモニターする請求項１〜４のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項６】
検体が、血漿、血清、血液、母乳、尿又は脳脊髄液である請求項１〜５のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項７】
検体が、内標準物質として、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計の液体クロマトグラフィーにおける該内標準物質に対する一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の相対保持時間が０．２〜０．６となる化合物を含有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項８】
内標準物質が、プラジクアンテルである請求項７に記載の定量方法。
【請求項９】
２種以上の含窒素複素環式化合物又はその薬学的に許容される塩を同時に定量する（ただし、レボブピバカイン又はその塩、及びブピバカイン又はその塩を同時定量する場合を除く）請求項１〜８のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１０】
含窒素複素環式化合物が、レボブピバカイン、ブピバカイン、ロピバカイン及びメピバカインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項１〜９のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１１】
レボブピバカイン又はその塩、及びロピバカイン又はその塩を同時に定量する請求項９に記載の定量方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−５３０２５（Ｐ２０１２−５３０２５Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３１７５４（Ｐ２０１０−２３１７５４）
【出願日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（３９３０２８０３６）丸石製薬株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（３９３０２８０３６）丸石製薬株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
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