喘息治療剤
ＨＧＦ又はその塩を有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は喘息治療剤に関する。更に詳細には、気管支喘息における炎症反応を極めて有効に抑制し、しかも副作用のない安全な喘息の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
現在社会においては、自動車や工場等からの排気ガス、化学物質、粉塵等による大気汚染が顕著となり、それに伴い気管支喘息の患者数が増えている。
気管支喘息とは、発作時に気管支平滑筋の収縮・攣縮が起こり、重積発作時は大変苦しい呼吸困難の状態から喘息死に至る重篤な疾患である。気管支喘息は、大人はもちろん子供でも入院原因の筆頭に挙げられる程であるが、現在の医療では、個々の患者の喘息に対応した予防も治療も難しい疾患とされている。
気管支喘息は、一般的には化学伝達物質やその他の因子に対する気道過敏性等の体質的素因に、抗原刺激等〔例えば、ハウスダスト（家内塵）・ダニ、ペット、花粉、上記の排気ガス、化学物質、粉塵等〕の原因因子、寄与因子が加わって発症するものと考えられている。その病態生理は複雑で、様々な要因、例えば、活性化された好酸球やＴリンパ球等の炎症細胞の気管支粘膜への浸潤、その際にＴｈ２サイトカイン、特にインターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、及びグロースファクター、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、変形増殖因子（ＴＧＦ−β）、中でも特にＴＧＦ−βが、一連の炎症反応を亢進化するのに重要な役割を果たしている等といった事実が多数の研究により示されているが、そのメカニズムの全容は未だ明らかとはなっていない。
炎症が頻発し、しかもその治療が不完全な状態で長期間続くと、例えば上皮下組織の線維化や、杯細胞、筋線維芽細胞の過増殖等が起こり、その結果、気管支は不完全修復（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ：リモデリング）の形で再生する。ひとたび不完全修復が起きてしまうと、気管支粘膜は線維質に置き換わり、その弾力性を失うために、気道の可逆性が失われ、喘息の慢性化・難治化を招くこととなる。
現在このような慢性的な気管支喘息の治療には、副腎皮質ホルモン剤、いわゆるステロイド剤が主に使用されている。しかし、この薬剤は治療には有効ではあるが、その副作用が問題となっている。例えば、効力のある抗喘息薬として知られているグルココルチコステロイドは、実際は一時的な症状鎮静効果しか有せず、その代償として周知の副作用、例えば骨粗鬆症、肥満、高血圧、糖尿病等を伴う〔例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｐ．Ｊ．，“Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｓｔｈｍａ”，ＵＳＡ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，３２１，ｐ１５１７−１５２７（１９８９）参照。〕。そのステロイドによる副作用を軽減すべく開発された吸入ステロイド療法も、合併症を発症する等の危険がある〔例えば、Ｔｏｏｇｏｏｄ，Ｊ．Ｈ．，“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｏｓｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｃｈｅｄｕｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｓｔｈｍａｔｉｃｓ ｔｏ ｔｈｅ ａｅｒｏｓｏｌ ｓｔｅｒｏｉｄ，ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ，７０，ｐ３８８−３９８（１９８２）参照。〕。特にステロイドの副作用がひどい患者向けにはステロイド代替薬として低用量メトトレキセートが提案されてきた〔例えば、Ｍｕｌｌａｒｋｅｙ，Ｍ．Ｆ．，“Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｔｈｍａ．Ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｓｔｕｄｙ”，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，ＵＳＡ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，３１８，ｐ６０３−６０７（１９８８）参照。〕が、メトトレキセートそれ自体がかなりの毒性を有している。
また、気管支を拡張させる即効性のある薬剤、例えばβ２刺激剤等もあるが、これは心臓にも作用するので、心臓疾患のある患者には用いる事ができず、しかも使用回数が制限される。
従って、既存のどの抗喘息剤又は喘息療法も、その効果及び安全面において不完全で、かつ持続的な寛解は報告されていない。よって患者に無害で、しかも持続的な抗炎症効果を奏するような気管支喘息の治療剤及び療法が必要とされている。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とは、Ｎ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインからなるα鎖と、β鎖とで構成されるヘテロダイマータンパクをいう。ＨＧＦは、種々の上皮細胞系において、上皮−間葉相互作用の仲介役を担う重要な因子であることが知られている。例えば、ＨＧＦは、腫瘍細胞の浸潤、転移等を誘発するマイトゲン活性、モートゲン活性、モルフォゲン活性及び血管新生作用を有することが知られている〔例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｂｕｎｉｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ”，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，ＵＳＡ，２２４，ｐ３１１−３１６（１９８７），Ｊｉａｎｇ．Ｗ．Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９，ｐ２０９−２４８（１９９９）参照。〕。また、ＨＧＦをヒト等に投与することにより、肝臓、腎臓、肺や心筋の線維化（例えば肝臓では肝硬変）の発症を防いだり、進行を阻止したりできることも知られている〔例えば、Ｕｅｋｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，ｐ２２６−２３０（１９９９）参照。〕。
ＨＧＦは、上述したように様々な生物活性を有するが、喘息による気道の炎症を抑制する効果をも有することはこれまでに全く知られておらず、本発明において初めて明らかとなった。
従って、本発明は、このＨＧＦの気道炎症抑制効果を発見した点において重要な発明であり、しかも本発明の喘息治療剤は、その構成成分を生体由来のＨＧＦとする点で、上記したステロイド剤等を用いるよりも生体に安全で、しかもその投与による副作用発症の危険性がないため、非常に優れた発明であると言える。
【発明の開示】
本発明は喘息治療剤、詳しくは、気管支喘息における炎症反応を極めて有効に抑制するＨＧＦを含有し、しかも投与による副作用がなく、生体に安全な喘息治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた。具体的には、本発明者らは、抗原吸入暴露した卵白アルブミン感作マウスにＨＧＦを投与すると、炎症時に見られる好酸球やリンパ球等の炎症細胞の浸潤が阻止され、しかも気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−４、ＩＬ−５並びにＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカイン及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）等のグロースファクターの濃度の上昇が顕著に抑制されるということを発見し、喘息等の気道炎症の治療・予防にＨＧＦを用いることが有効であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて更なる検討を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１） ＨＧＦ又はその塩を有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤、
（２） ＨＧＦが、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチド又はこれらの部分ペプチドであることを特徴とする前記（１）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（３） ＨＧＦをコードするＤＮＡを有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤、
（４） ＨＧＦをコードするＤＮＡが、配列番号：３又は４で表される塩基配列又は配列番号：３又は４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであることを特徴とする前記（３）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（５） ＨＧＦをコードするＤＮＡが、組換え発現ベクターに挿入されていることを特徴とする前記（３）又は（４）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（６） 組換え発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＺｅｏＳＶであることを特徴とする前記（５）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（７） 組換え発現ベクターが、更に宿主細胞に含まれていることを特徴とする前記（５）又は（６）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（８） ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＨＧＦをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターが、リポソーム又はマイクロカプセルに含まれていることを特徴とする前記（３）〜（７）のいずれかに記載の喘息の予防又は治療剤、
（９） 更に薬剤学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれかに記載の喘息の予防又は治療剤、
（１０） ＨＧＦ又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することにより気管支の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療方法、
（１１） ＨＧＦをコードするＤＮＡの有効量を、哺乳動物に投与することにより気管支の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療方法、
（１２） 気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療剤の製造のためのＨＧＦ又はその塩の使用、
（１３） 気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療剤の製造のためのＨＧＦをコードするＤＮＡの使用、
に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、気管支喘息モデルマウスにおいて、メサコリン吸入による気道過敏性亢進に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第２図は、抗原の吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、気管支肺胞洗浄液（以下、ＢＡＬ液と略す場合がある。）中炎症細胞数の増加に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第３図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、気管支周囲・血管周囲の組織内における浸潤炎症細胞数の増加に対するＨＧＦ投与の影響を、組織学的に観察した組織標本写真を示す図である。（ａ）は対照群（非感作／非暴露）、（ｂ）は生理食塩水投与群（感作／暴露＋生理食塩水）、（ｃ）はＨＧＦ投与群（感作／暴露＋ＨＧＦ）を示す。
第４図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、気管支周囲・血管周囲の組織内における（ａ）浸潤総炎症細胞数及び（ｂ）好酸球数の増加に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第５図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、気道上皮の粘液産生細胞（杯細胞）数の増加に対するＨＧＦ投与の影響を示す図である。（ａ）は対照群（非感作／非暴露）、（ｂ）は生理食塩水投与群（感作／暴露＋生理食塩水）、（ｃ）はＨＧＦ投与群（感作／暴露＋ＨＧＦ）の気道上皮を組織学的に観察した組織標本写真を示す図である。（ｄ）は前記各群における粘液産生細胞数を示し、（ｅ）は前記各群における粘液含有量５０％以上の細胞の数を示した図である。
第６図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、ＢＡＬ液中のサイトカイン〔（ａ）ＩＬ−４、（ｂ）ＩＬ−５、（ｃ）ＩＬ−１３及び（ｄ）ＩＬ−１２〕の濃度に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第７図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、ＢＡＬ液中のグロースファクター〔（ａ）ＰＤＧＦ、（ｂ）ＮＧＦ並びに（ｃ）ＴＧＦ−β〕の濃度の上昇に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第８図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、肺組織中におけるＴＧＦ−βの蓄積に対するＨＧＦ投与の影響を、組織学的に観察した組織標本写真を示す図である。（ａ）は対照群（非感作／非暴露）、（ｂ）は生理食塩水投与群（感作／暴露＋生理食塩水）、（ｃ）はＨＧＦ投与群（感作／暴露＋ＨＧＦ）を示す。
第９図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、血清中抗原特異的ＩｇＥ抗体（抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ）量の増加に対するＨＧＦの影響を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、ＨＧＦ又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする。
ＨＧＦ又はその塩は、哺乳動物、例えばヒト、モルモット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等由来のいずれであってもよい。またＨＧＦは、これらの哺乳動物の組織又は細胞、例えば成熟肝細胞や血小板等から抽出される精製タンパク質であっても、遺伝子組み換え技術等を用いて、ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを導入された形質転換細胞等を培養し、産生されるタンパク質を精製することによって得られる組換えタンパク質であっても、また化学的に合成される合成ポリペプチドであってもよい。成熟肝細胞や形質転換細胞等からのＨＧＦの抽出・精製又は合成ポリペプチドの製造は、それ自体公知の方法に従って行われて良い。
ヒト等の哺乳動物の細胞からＨＧＦを単離・精製する方法としては、例えば、比較的高濃度にＨＧＦを含むラット血小板をトロンビン処理し、血小板外へ分泌されるＨＧＦを取得後、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等を用いて精製する方法等が挙げられる。
また、遺伝子組み換え技術等を用いて、ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを導入された形質転換細胞等を培養し、分泌されるタンパク質を精製することによってＨＧＦを得る場合は、以下の方法に従って行うのがよい。
ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを、適当な組換え発現ベクター、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００（１９９１））等に挿入し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を構築する。
組換え発現ベクターを宿主へ導入する方法としては、自体公知の方法であればいずれも用いることができる。例えば、コンピテント細胞法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４（１９７０）］、ＤＥＡＥデキストラン法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，（１９８２）］、インビトロパッケージング法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７２，５８１（１９７５）］、ウイルスベクター法［Ｃｅｌｌ，３７，１０５３（１９８４）］、マイクロインジェクション法［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１５３，３４７（１９８４）］、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１（１９８３）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、プロトプラスト法［特開昭６３−２４８３９４２、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］に記載の方法等を挙げることができる。
宿主としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。例えば、細菌としては、エッシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等が挙げられる。
酵母としては、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、パン酵母等が挙げられる。糸状菌としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）等が挙げられる。
植物細胞としては、ワタ、トウモロコシ、ポテト、ソラマメ、ペチュニア、トマト、タバコ等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒト細胞ＨｅＬａ、ヒトＦＬ細胞、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞［実験医学，１２，３１６（１９９４）］等が挙げられる。
得られた形質転換体は、ＨＧＦを産生するために、その宿主に応じた適切な培地で培養される。培地には該形質転換体の生育に必要な炭素源、無機物、ビタミン、血清及び薬剤等が含有される。
形質転換体の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４３１（１９７２）］等が、宿主が酵母の場合、ＹＥＰＤ培地［Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１７（１９７９）］等が、宿主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎仔血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＰＲＭＩ１６４０培地（日水製薬）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気・攪拌が行われるが、これらに限定されるものではない。また、宿主が接着性の動物細胞等の場合は、所望によりガラスビーズ、コラーゲンビーズ、アセチルセルロースフォローファイバー等の担体が用いられる。
ＨＧＦを産生している形質転換体は、その培養液上清中にＨＧＦを分泌することから、この形質転換体の培養上清を用いてＨＧＦの抽出を行うことができる。また、形質転換体中に産生されたＨＧＦの抽出を行うこともできる。タンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するには、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム又は／及び凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過によりＨＧＦの粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭ等の界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた培養上清、あるいは細胞抽出液中に含まれるＨＧＦの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が用いられる。
配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列は、ＨＧＦのアミノ酸配列の例である。配列番号：２で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失しているものであるが、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、両者ともヒト由来の天然ＨＧＦであって、ＨＧＦとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。
配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％以上、好ましくは約８０％、更に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、例えば配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列から、１〜数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列、１〜数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含むペプチドであって、喘息時における気道炎症抑制作用を有するペプチドであることが好ましい。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。
これらのペプチドは、単独であっても、挿入や欠失、置換等を組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドであっても、またこれらの混合ペプチドであってもよい。
本発明に用いられるＨＧＦは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＨＧＦが、Ｃ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＨＧＦに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられるＨＧＦには、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質等の複合タンパク質等も含まれる。
本発明で用いるＨＧＦの部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある。）としては、上記したＨＧＦの部分ペプチドであればいずれのものであってもよい。本発明において、部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＨＧＦの構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。本発明の部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。さらに、部分ペプチドには、上記したＨＧＦと同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。
本発明に用いられるＨＧＦ又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。
本発明に用いられるＨＧＦの部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＬｕｅｂｋｅ、ザ ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５年）等に記載された方法が挙げられる。
また、反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせてＨＧＦの部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明は、ＨＧＦをコードするＤＮＡをその有効成分として含有することもできる。
本発明で用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ又はｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅し、得ることもできる。具体的には、ＨＧＦをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は（ｂ）配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦと実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。なお、配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
上記の配列番号：３又は４で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号：３又は４で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
本発明で用いられるＨＧＦの部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、上記のＨＧＦをコードするＤＮＡと同様に、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。具体的な本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦと実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は上記（ａ）或いは（ｂ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。
本発明で用いられるＨＧＦ又は部分ペプチドをコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦ又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。
本発明に用いられるＨＧＦ又はその部分ペプチド（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある。）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列を含有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、又は適当なベクターに組み込んだＤＮＡの中から、標識されたＨＧＦの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーションさせることによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
また、公知のＨＧＦの塩基配列情報から従来公知の方法を用いて化学合成によりクローニングすることもできる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法等が挙げられる。
ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造）等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、又は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ（以下、本発明のＤＮＡ等と略記する場合がある。）は、細胞内でのその安定性を高めるため、また、もし毒性があるならその毒性をより小さなものにするために修飾されていてもよい。このような修飾には、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐ２４７（１９９２）；Ｖｏｌ．８，ｐ３９５（１９９２）；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）等に記載された方法等が挙げられる。本発明のＤＮＡ等は、リポソーム又はミクロスフェア等に内包された特殊な形態で用いられてもよい。また、本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡ等は、塩基以外の他の物質が付加されたものであってもよい。前記他の物質としては、糖；酸又は塩基；リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体；又は、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロール等）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸等）などが挙げられる。前記他の物質は、核酸の３’末端あるいは５’末端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。本発明のＤＮＡ等は、その末端が化学修飾されたものであってもよい。末端の修飾基としては、核酸の３’末端あるいは５’末端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ等のヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコール等のグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
本発明に用いられるＨＧＦ或いはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、組換え発現ベクターに含有されていてもよい。
組換え発現ベクターとしては、ＨＧＦ又はその部分ペプチドを発現することができる発現ベクターが好ましい。
本発明に用いられる組換え発現ベクターは、例えば、ＨＧＦをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
前記組換え発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等のウイルス等の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。中でも、ウイルスが好ましく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、又はポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等が好ましい。更にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）若しくはアデノウイルス等を用いることがより好ましい。アデノウイルスには種々の血清型が存在するが、本発明では２型若しくは５型ヒトアデノウイルスを使用することが好ましい。
前記プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある。）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある。）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。また、所望により、宿主に合ったシグナル配列を発現ベクターに付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列等が、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等がそれぞれ利用できる。このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を製造することができる。
上記ＨＧＦ或いはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクターは、更に宿主細胞に導入されていてもよい。
上記組換え発現ベクターの宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、ビフィズス菌、乳酸菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕、Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕、ＤＨ５α〔Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｇｅｎｅ，９６，２３−２８（１９９０）〕、ＤＨ１０Ｂ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７巻，４６４５−４６４９（１９９０）〕等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕、〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。ビフィズス菌としては、例えばＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ等が挙げられる。乳酸菌としては、例えばラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等が挙げられる。酵母としては、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等が用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞又はＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ Ｖｉｖｏ，１３，ｐ２１３−２１７（１９７７））等が用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる（前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５，５９２（１９８５））。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記する。）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記する。）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，ｐ２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７，ｐ１０７（１９８２）等に記載の方法に従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，ｐ１１１（１９７９）等に記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，ｐ１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，ｐ１９２９（１９７８）等に記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞又は昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，ｐ４７−５５（１９８８）等に記載の方法に従って行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，ｐ２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，ｐ４５６（１９７３）等に記載の方法に従って行うことができる。このようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。宿主がエシェリヒア属菌又はバチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖等、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等の無機又は有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子等を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐ４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２）〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，ｐ４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐ５３３０（１９８４）〕等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，ｐ７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，ｐ５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，ｐ３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，ｐ５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，ｐ１（１９５０）〕等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外にＨＧＦを生成せしめることができ、生体に有効にＨＧＦを投与することができる。
組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換せず、裸のベクターとして生体にｉｎ ｖｉｖｏ導入し、本発明に用いることもできる。裸のベクターとして用いる場合、使用される組換え発現ベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳ［Ｇｅｎｅ，１０８，ｐ１９３−２００（１９９１）］、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）等のプラスミドを用いることができる。該ベクターにも、前記ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を含有させることができる。
また、ＨＧＦをコードするＤＮＡ等又はＨＧＦをコードするＤＮＡを有する組換え発現ベクターを、リポソーム、マイクロカプセル、サイトフェクチン、ＤＮＡ−タンパク質複合体、バイオポリマー等の人工ベクターに含有させることもできる。
リポソームとは、内部に水層を有する脂質二重膜でできた閉鎖小胞体であり、その脂質二分子膜構造が、生体膜に極めて近似していることが知られている。リポソームを製造するに際し使用されるリン脂質としては、例えば、レシチン、リゾレシチン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等の酸性リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質等が挙げられる。また、コレステロール等を添加することもできる。リポソームは、自体公知の方法に従って製造することができる。リポソームには、膜融合リポソーム、ＨＶＪ−膜融合リポソーム［Ｋａｎｅｄａ．Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６４，ｐ１２１２６−１２１２９（１９８９）、Ｋａｔｏ．Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６６，ｐ３３６１−３３６４（１９９１）、Ｔｏｍｉｔａ．Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．，１８６，ｐ１２９−１３４（１９９２）、Ｔｏｍｏｔａ．Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｃ．Ｒｅｓ．，７３，ｐ８９８−９０５（１９９３）］、陽イオン性リポソーム（特表平２０００−５１０１５１号公報、特表平２０００−５１６６３０号公報）等が知られている。センダウイルス（ＨＶＪ）と融合させたＨＶＪ−膜融合リポソームを用いることは、特に好ましい。リポソームの表面にＨＶＪの糖タンパクを組み込み、又は共有結合させてポリエチレングリコール等を添加すると、細胞への遺伝子導入効率が上昇する。
ＨＧＦをコードするＤＮＡにシグナル配列、プロモーター及びポリアデニル化配列を付加したＤＮＡをリポソーム中に含有させることにより、また、ＨＧＦをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターをリポソーム中に含有させることにより、本発明の喘息の予防・治療剤とすることができる。
マイクロカプセルはフィルムコートされた粒子であり、膜形成ポリマー誘導体、疎水性可塑剤、表面活性剤又は／及び潤滑剤窒素含有ポリマーの混合物からなるコーティング材料でコートされた粒子等で構成される。
ＨＧＦをコードするＤＮＡにシグナル配列、プロモーター及びポリアデニル化配列を付加したＤＮＡをマイクロカプセル中に含有させることにより、また、ＨＧＦをコードするＤＮＡを有する組換え発現ベクターをマイクロカプセル中に含有させることにより、本発明の喘息の予防・治療剤とすることができる。
ＨＧＦ又はその塩等を直接投与するか、又はＨＧＦをコードするＤＮＡ等を投与し、ＨＧＦを投与部位において発現させることにより、投与された生体の気管支炎の炎症等を抑制することができる。それ故、（ａ）ＨＧＦもしくはその部分ペプチド又はそれらの塩、又は（ｂ）ＨＧＦもしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、喘息の予防・治療剤として使用することができる。
前記「喘息」とは、いわゆるアレルギー性の慢性気道炎症や気道過敏性亢進（ＡＨＲ）等に関係する一連の症候群をいう。本発明の喘息の予防、治療剤は、急性・一過性又は慢性の喘息の両方において有効であり、小児喘息においてもその効果を発揮する。喘息の原因が、例えばウイルス感染（いわゆる風邪）、アレルゲン、化学物質によるもの等のいかなる場合であっても、また特に小児喘息においては、アトピー型であろうと非アトピー型であろうと、これらの予防・治療に有効に使用することができる。
本発明の喘息の予防・治療剤がＨＧＦからなる場合は、常套手段に従って製剤化することができる。一方、ＨＧＦをコードするＤＮＡ等を該予防・治療剤として使用する場合は、上述した通り、該ＤＮＡ等を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。本発明のＤＮＡ等は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
例えば、ＨＧＦ若しくはその塩又はＨＧＦをコードするＤＮＡ等は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に投与したり、患部、皮下、筋肉内等に埋め込むこともできる。また、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に投与することもできる。本発明の喘息の予防又は治療剤は、ネブライザーや吸入剤（ポケット型ネブライザー）の形で投与することができる。ネブライザーによる投与に際しては、好ましくは電動式ネブライザー（例えばジェット式ネブライザー、超音波式ネブライザー、メッシュ式のネブライザー等）が使用される。本発明の喘息の予防又は治療剤は、電動式ネブライザーの器具の中に入れられ、加圧された空気の噴出によって液体の薬剤を霧状にし人の気道に噴霧されるか、超音波振動によって薬剤を噴霧し、気道に投与される。吸入剤による投与方法としては、本発明の喘息の予防又は治療剤を例えばスプレー等で直接噴霧する方法か、吸入補助器具（スペーサー）を使用して噴霧された薬剤を吸入する方法が挙げられる。
本発明の製剤は、例えば、ＨＧＦ若しくはその塩又はＨＧＦをコードするＤＮＡ等を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤又は徐放性を付与する物質等とともに混和することによって製造することができる。
錠剤、カプセル剤等において混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤；結晶性セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等のような膨化剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤等が挙げられる。錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウ等）、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等）などで剤皮を施してもよい。カプセル剤の場合には、さらに油脂のような液状担体を含有することができる。また、カプセル剤は、通常のカプセル剤の他、腸溶性コーティングカプセル剤、胃内抵抗性カプセル剤、放出制御カプセル剤とすることもできる。腸溶性カプセル剤とする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングしたＨＧＦ又はＨＧＦに上記の適当な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填する。あるいは、腸溶性コーティング剤でコーティングしたカプセル、若しくは腸溶性高分子を基剤として成形したカプセルにＨＧＦ又はＨＧＦに上記の適当な賦形剤を添加したものを充填することができる。
注射のための無菌組成物は注射用水性液又は油性液に有効成分を溶解又は懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）等を併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。さらに、前記無菌組成物には、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等が配合されてもよい。調製された無菌組成物は通常、適当なアンプルに充填され、注射剤として供される。
また、ネブライザー用液剤や吸入剤として製造する場合、その添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、上記した賦形剤、緩衝剤、溶解補助剤、保存剤、安定剤、等張化液、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム等）、及び矯味剤（クエン酸、メントール、グリチルリチンアンモニウム塩、グリシン、香料等）などが用いられる。吸入剤においては、前記添加剤に加え噴射剤が配合される。噴射剤としては、液化ガス噴射剤、圧縮ガス等が用いられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）、不溶性ガス（窒素ガス等）などが挙げられる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）などに対して投与することができる。
本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡ等を製剤化せずに生体に投与する場合は、公知の方法に従って行ってよいが、例えば、ＤＮＡを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、又は投与されるヒト等からある種の細胞を体外に取り出して、これにＤＮＡを導入し、その形質転換細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある［日経サイエンス、４月号、２０−４５（１９９４）、月間薬事、３６、２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２、１５（１９９４）］。それぞれの方法において、ＤＮＡを細胞に導入する方法としては、上述したようにアデノ随伴ウイルス、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等の組換え発現ベクターに含有させて、該発現ベクター等を導入する遺伝子導入方法、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃で担体（金属粒子等）とともにＤＮＡを細胞内に導入する方法等、自体公知の方法により細胞に導入する方法［Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，９６３−９６７（１９９２）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１４６２１−１４６２４，（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８，２７２６−２７３０（１９９１）］が挙げられる。またリポソーム等を用いる場合には、リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、陽イオン性リポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法等が挙げられる。
中でも、導入効率の観点から、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法が望ましい。
また、上記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、該形質転換体を本発明の予防・治療剤とすることもできる。その場合は、例えば形質転換体をカプセル等に含有させてカプセル製剤として生体に投与することができる。
またＨＶＪ−リポソーム等のリポソームを用いる場合には、例えば、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
本発明にかかる喘息の予防・治療剤は、経口的に投与したり、患部、皮下、筋肉内等に埋め込んだり、静脈投与することができるが、好ましくは静脈投与又は気管支に局所的に投与することが好ましい。
また本発明の喘息の予防・治療剤の投与時期は、喘息の症状が起こった時に投与されるのが好ましい。また喘息の慢性化、重症・難治化に繋がる危険性がある場合等には、継続的に投与され、気道の不完全修復（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ：リモデリング）を予防するのが好ましい。
本発明の予防・治療剤の投与量は、投与対象、症状、投与形態、処置期間等により異なるので一概には言えないが、通常、静脈投与の場合、ＨＧＦとして、約２５０〜１０００μｇ／Ｋｇ／日、好ましくは約３００〜８００μｇ／Ｋｇ／日、特に好ましくは、約３００〜５５０μｇ／Ｋｇ／日、またＨＧＦをコードするＤＮＡ等として、約０．２〜４０，０００μｇ／Ｋｇ／日、好ましくは約２〜２，０００μｇ／Ｋｇ／日である。
本発明の製剤を投与することにより、喘息の発作時における気道の炎症を抑制及び予防することができる。気道の炎症時には、通常「気管支平滑筋の収縮」「粘膜の浮腫」「分泌物の増加」等の変化が起こっていると考えられており、具体的な症状としては呼吸停止等が見られる。病理形態的には、肺組織への炎症細胞、例えば好酸球、Ｔリンパ球やマクロファージ等の浸潤、気道上皮組織における粘液産生細胞（杯細胞）の過増殖等により確認できる。また、血清中の抗原特異的ＩｇＥ値が上昇し、更には、気管支肺胞洗浄液（以降、ＢＡＬ液と略す場合がある。）中のＴｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等やグロースファクター、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、変形増殖因子（ＴＧＦ−β）の濃度が上昇することが確認されている。
従って、本発明の製剤を投与すると、炎症時に見られる上記の現象が抑制される。
本発明の製剤の気道炎症抑制作用効果は、マウスを用いた抗原反復吸入暴露による実験的気管支喘息モデルを作成し、該マウスが気道の炎症反応を起こす環境下において本発明の製剤を該マウスに投与し、気道炎症及び気道過敏性亢進が抑制されることにより確認することができる。
気管支喘息モデルの作製は特に限定されないが、例えば、マウスに卵白アルブミン感作・吸入暴露を施して抗原特異的免疫性を付与する方法が挙げられる。この抗原誘発アレルギー性気道炎症モデルマウスに、例えばメサコリン（Ｍｅｔｈａｃｈｏｌｉｎｅ）等の気道収縮作用を有する物質を吸入させることにより、気道炎症を引き起こさせることができる。
血清中抗原特異的ＩｇＥ値の測定には、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｔｅｍａｎｎ，Ｕ．Ａ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｕｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，ｐ４７１−４７８，１９９７）等を用いることができる。
ＢＡＬ液中の炎症細胞を含む全ＢＡＬ細胞数の測定は、例えば生理食塩水で肺胞内を洗浄し、得られたＢＡＬ液中に存在する細胞の数を顕微鏡下で計測することにより行うことができる。
ＢＡＬ液上清中のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のサイトカインやＰＤＧＦ、ＮＧＦ、ＴＧＦ−β等のグロースファクターの濃度の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法により行うことができる。ＥＬＩＳＡにおける比色計測定は、それぞれ添付の使用説明書に記載の方法に従って行うのがよい。
組織学的及び免疫組織学的に気道炎症を確認する方法としては、例えば、気管支周辺の肺組織を過ヨウ素酸シッフ染色後、顕微鏡下で粘液産生細胞（杯細胞）の数を計測する方法、また気管支周辺の組織細胞をヘマトキシン−エオジン染色後、同じく顕微鏡下で好酸球、リンパ球又はマクロファージの数を計測する方法等が挙げられる。これらの計測には、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）等を用いることができる。また、気管支周辺組織細胞に、例えば抗ＴＧＦ−βウサギＩｇＧを吸着させ、その後アビジン−ビオチン処理（Ｕｅｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ，Ｍｅｄ．，５，ｐ２２６−２３０，１９９９）することにより、細胞内のＴＧＦ−βの蓄積を確認することができる。
以下に、実施例等を示して本発明を具体的に説明するが、言うまでもなく、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例
ＨＧＦを含有する製剤の製造
（１） ＨＧＦｃＤＮＡの作製
ヒトのＭＲＣ−５線維芽細胞からＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ｍＲＮＡを単離し、これを使用してＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＨＧＦｃＤＮＡを単離した。具体的には、ｍＲＮＡ溶液０．５μＬ（１５０ｎｇ）、１０×ＲＴ−ＰＣＲ溶液［５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２］５μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μＬ、プライマー：１（１０ｍＭ）２μＬ、プライマー：２（１０ｍＭ）２μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬ、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μＬ、逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬ及びＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ ３５．２μＬを混合し、４２℃ ３０分、９５℃ ５分で逆転写反応を行い、９４℃ ３０秒、５５℃ １分、７２℃ １分のサイクルを４０回繰り返し、さらに７２℃ ７分間反応させＨＧＦｃＤＮＡを得た。このようにして得られたＨＧＦｃＤＮＡをＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲＩＩＴＭベクターにクローニングし、ｐＣＲＩＩ／ＨＧＦを得た。
なお、プライマー：ａ及びプライマー：ｂの配列は、以下の通りのとおりである。
（２） 組換え発現ベクターの構築
（１）で作製したｐＣＲＩＩベクターに組み込まれたＨＧＦｃＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ Ｉ／Ｓｐｅ Ｉで切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）処理により切断末端を平滑化させた。得られたＨＧＦｃＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素Ｘｈｏ Ｉで処理した後、切断末端を平滑化しておいたＣＨＯ細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲと混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合してＨＧＦ発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＨＧＦを得た。得られたＨＧＦ発現ベクターはニワトリβ−アクチンプロモーターとウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル配列の間にＨＧＦｃＤＮＡを有する。また、形質転換された細胞の選択は、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子にサイトメガロウイルス初期プロモーターとポリ（Ａ）シグナル配列で連結したＤＨＦＲキメラ遺伝子により可能となる。
（３） チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞への形質転換とその発現
上記ＣＨＯ細胞発現用ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＨＧＦはＷｉｇｌｅｒらの方法［Ｃｅｌｌ，１１，ｐ２３３（１９７７）］によりチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損細胞に導入した。約３０μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＨＧＦプラスミドをそれぞれ２４０μＬの０．５Ｍ塩化カルシウムに溶解し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ塩化ナトリウム及び１．５ｍＭリン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）２４０μＬを攪拌しながら加えた。室温で３０分攪拌を続けプラスミドとリン酸カルシウムの共沈殿物を形成させた。続いて、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）と１％グルタミンとを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて５×１０５個のＣＨＯ細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換した後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈殿物を加え室温で２０分間放置した。さらに、３７℃で４時間インキュベートした後、培地を除去し、１５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５分間放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地交換しさらに３７℃で７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、透析した１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）、２％グルタミンを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて安定なＨＧＦ高生産株を得るために１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭとメソトレキセート濃度を順次追加させながら同培地で継代培養を繰り返した。得られたＨＧＦ産生組換え細胞をクローン選別を行い、安定なＨＧＦ生産株を得た。
（４） 形質転換ＣＨＯ細胞培養上清からのＨＧＦの精製
上記（３）で得られたＨＧＦ産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換え細胞株をリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセートを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）で培養し、その培養上清より、ＨＧＦを精製した。
イ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ＨＧＦ産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換え細胞株の培養液１２Ｌに最終濃度０．０１％になるようにＴｗｅｅｎ ８０を添加し、ステベックスＨＶフィルター（日本ミリポア）により濾過した。０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｃｉｔｒａｔｅ−ＮａＯＨ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．５）で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア製、カラム体積５０ｍＬ）に添加した。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．５Ｍから２．５Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により溶出したピーク画分を集め、ヘパリン溶出液Ａとした。
ロ）陰イオン交換クロマトグラフィー
ヘパリン溶出液Ａを１００倍容の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ８．０）で３回透析を行った後、緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア製、カラム体積４０ｍＬ）に添加した。緩衝液Ｂで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで溶出したピーク画分を集め、ＤＥＡＥ溶出液とした。
ハ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（２回目）
ＤＥＡＥ溶出液を１００倍容の緩衝液Ａで３回透析を行った後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア製、カラム体積５０ｍＬ）に添加した。０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．３Ｍから２．５Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により吸着物を溶出した。ＨＧＦのピーク画分を集め、ヘパリン溶出液Ｂとした。精製されたＨＧＦの収量は約１２ｍｇであり、培養上清液からの回収率は約５０％であった。
ニ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
ＨＧＦを２−メルカプトエタノール還元下及び非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。精製ＨＧＦは非還元条件下［２−ＭＥ（−）］では約５０ｋＤａを示し、還元条件下［２−ＭＥ（＋）］では約６７ｋＤａを示した。
（５） 凍結乾燥剤の作製
生理食塩水１００ｍＬ中に（４）で調整したＨＧＦ（１ｇ）、マンニトール（１ｇ）及びポリソルベート８０（１０ｍｇ）を含有する溶液を無菌的に調整し、１ｍＬずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の製剤を凍結乾燥剤として調整した（製剤１）。
【実施例】
ＨＧＦ投与による気道炎症抑制効果の確認
（１）気道過敏性亢進におけるＨＧＦ投与の影響
雌の８〜１０週令マウス（ＢＡＬＢ／ｃ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）に卵白アルブミン（ＯＶＡ）非含有飼料を与え、一定温度、一定光サイクル下で飼育した。
気管支喘息モデルマウスを、以下に示す方法により作製した。
生理食塩水１００μＬ中に２０μｇＯＶＡ（Ｇｒａｄｅ Ｖ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）及び２．２５ｍｇ硫酸アルミニウム（乳化剤：ＡｌｕｍＩｍｕｊｅｃｔ；Ｐｉｅａｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を懸濁し、この懸濁液をマウスの腹腔内に、飼育開始０日後及び１４日後に投与した。該マウスに、生理食塩水に１％のＯＶＡを含む液を、超音波ネブライザーを用いて、２０分間、ＯＶＡを吸入させた。吸入暴露は、飼育開始２８、２９及び３０日後に行った。
気管支喘息モデルマウス作製中に、一部のマウスに製造例で得た製剤１を投与した。１ｍｇの製剤１を１０ｍＬの生理食塩水に溶解・希釈後、該溶液０．２ｍＬを飼育開始後２７〜３１日の期間毎日、継続的に皮下投与した（ＨＧＦ投与群、ｎ＝１６：感作／暴露＋ＨＧＦ）。製剤１の投与量は、ＨＧＦとして５００μｇ／ｋｇ／日とした。
製剤１を生理食塩水に溶解して作成した溶液に代えて、生理食塩水０．２ｍＬを、飼育開始後２７〜３１日に継続的に皮下投与した群も作製した（生理食塩水投与群、ｎ＝１６：感作／暴露＋生理食塩水）。また、上記のＯＶＡによる感作・暴露を行わないマウスを、対照群（ｎ＝１６：非感作／非暴露）とした。
尚、群間比較は、二元配置分散分析を行った後、生理食塩水投与群とＨＧＦ投与群との間（＊）、又は対照群と生理食塩水投与群との間（＃）で、差を検定することにより行った（ｔ検定）。以降の試験においても、同様に群間比較を行った。
気管支喘息モデルマウスにおける気道過敏性の評価は、以下に示す方法により行った。メサコリン含有生理食塩水（３．１２５〜２５ｍｇ／ｍＬ）又は生理食塩水のみを超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ０７，ＯＭＲＯＮ社製）にて、気管支喘息モデルマウスのＨＧＦ投与群、生理食塩水投与群及び気管支喘息でない対照群にそれぞれ３分間吸入させた後、ホールボディープレチスモグラフボックス内にマウスを入れ、マウスが覚醒下かつ無拘束の状態で、バロメトリックプレチスモグラフ（Ｂａｒｏｍｅｔｒｉｃ ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙ：Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ，Ｔｒｏｙ，ＮＹ）によるコンピューター呼吸機能解析システム（Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｔｒｏｙ，ＮＹ）を用いて気道過敏性（Ｐｅｎｈ）を測定した。Ｐｅｈｎの測定は以下の式に従った。
Ｐｅｎｈ＝ＰＥＰ／ＰＩＰ ｘ Ｔｅ−Ｔｒ／Ｔｒ
ＰＥＰ；ｐｅａｋ ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓｕｒｅ（ｍＬ／ｓ），ｍａｘｉｍａｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｏｘ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｉｎ ｏｎｅ ｂｒｅａｔｈ
ＰＩＰ；ｐｅａｋ ｉｎｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓｕｒｅ（ｍＬ／ｓ），ｍａｘｉｍａｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｏｘ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｉｎ ｏｎｅ ｂｒｅａｔｈ
Ｔｅ；ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｉｍｅ（ｓ），ｔｉｍｅ ｆｒｏｍ ｅｎｄ ｏｆ ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｔａｒｔ ｏｆ ｎｅｘｔ ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ
Ｔｒ；ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ｓ），ｔｉｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｅｃａｙ ｔｏ ３６％ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｂｏｘ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎｓ
（Ｃｉｅｓｌｅｗｉｃｚ．Ｇ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ，１０４，ｐ３０１−３０８（１９９９）
その結果、各群において、生理食塩水のみを吸入した時に得られるベースラインＰｅｎｈ値には殆ど差がなかった（非感作／非暴露：０．４９±０．０４、感作／暴露＋生理食塩水：０．５３±０．１７、感作／暴露＋ＨＧＦ：０．５３±０．１３）が、メサコリンを吸入した場合、生理食塩水投与群ではメサコリン濃度に依存して急激な気道過敏性の上昇が見られた。これに対しＨＧＦ投与群では、その気道過敏性の上昇が有意に抑制された（第１図）。
（２）ＢＡＬ液中炎症細胞数の測定
（１）に記載の試験４８時間後、各群のマウスの気管支・肺胞内を、気管内チューブを介して生理食塩水（１ｍＬ、３７℃）で２回洗浄した。洗浄液を回収し、全ＢＡＬ液量及びＢＡＬ液内の全細胞数を、Ｂ▲ｕ▼ｒｋｅｒ−ｔ▲ｕ▼ｒｋ式血球計算板を用いて測定した。次いで、ＢＡＬ液からサイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ３：ＳＨＡＮＤＯＮ社製）を用いて単層標本を作製し（４，０００ｒｐｍ、５分）、これをメイ・ギムザ染色（１３分）した。該組織単層標本を顕微鏡下において観察し、ＢＡＬ液中におけるマクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球等の炎症細胞数を測定した。
その結果、対照群においては、全ＢＡＬ細胞数が少なく、またその内約９５％以上をマクロファージが占めており、他の炎症細胞は殆ど見られなかった。生理食塩水投与群においては、著しいリンパ球と好酸球の増加が見られた。これに対し、ＨＧＦ投与群では、生理食塩水投与群において見られたリンパ球と好酸球数の増加が有意に抑制されていた（第２図）。
（３）気管支周囲・血管周囲の組織内における浸潤炎症細胞数の測定
（２）の肺胞内洗浄後の右肺に２ｍＬの空気を、気管内チューブを介して送り、右肺胞を膨らませ、１０％ホルマリンで、４８時間固定した。この固定組織から主気管支周辺の肺組織ブロックを切り出し、パラフィン固定した。ブロックから４μｍ厚の組織切片を作製し、これらを顕微鏡スライド上に固定した後パラフィンを除去した。該組織検体スライドをヘマトキシン−エオジン染色し、明視化された炎症細胞の浸潤状況を顕微鏡下で観察した（最終倍率×４００、インセット×１，０００）。炎症細胞数の計測には、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）等を用いた。上記計測は、ランダムに選択した１０視野に対して行い、組織１ｍｍ２当たりの細胞数の平均値を算出した。また試験に供した各群のマウスの数はそれぞれ１６匹とした。
ヘマトキシン−エオジン染色は以下の通り行った。組織検体スライドを脱パラフィン後、ヘマトキシン液による染色を室温で５分間行い、３７℃のぬるま湯に５分間浸漬することにより余分な色素を洗い流した。次いで、検体を室温で９５％アルコールに１５秒浸し、親和させた後、水溶性エオジン液により対比染色を１０分間行った。
その結果を第３図及び第４図に示す。対照群においては、殆ど気管支周囲・血管周囲組織に炎症細胞の浸潤は見られなかった〔第３図−（ａ）〕が、生理食塩水投与群においては、炎症細胞の浸潤が見られ〔第３図−（ｂ）〕、炎症細胞数及び好酸球数が著しく増加した（第４図）。これに対し、ＨＧＦ投与群では、生理食塩水投与群に比較して、炎症細胞の浸潤の程度が低く、炎症細胞数及び好酸球数の増加が抑制されていた（第３図−（ｃ）、第４図）。
（４）気道上皮組織における粘液産生細胞（杯細胞）数の測定
（３）の右肺固定組織から気道上皮組織を含む主気管支周辺の肺組織ブロックを切り出し、組織検体スライドを作製した。該組織検体スライドを過ヨウ素酸シッフ染色し、明視化された杯細胞の数を顕微鏡下で計測した（最終倍率×１，０００）。計測には、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）等を用いた。上記計測をランダムに選択した１０視野に対して行い、気道上皮基底膜の単位長さ（１ｍｍ）当りの細胞数の平均値を算出した。
また、細胞中の粘液含有量を、過ヨウ素酸シッフ染色により着色される色の濃さ（染色率）から判定し、粘液産生細胞を染色率が５０％以上又は５０％以下の２種類に分類した。
過ヨウ素酸シッフ染色は以下の通り行った。組織検体スライドを脱パラフィン後、検体を室温で１％過ヨウ素酸水溶液に浸漬し、酸化させた。流水で水洗後、検体をシッフ試薬により室温で１０分間染色し、再び流水で十分水洗後、ヘマトキシリン液により１分間の核染色を行った。
結果を第５図に示す。生理食塩水投与群〔第５図−（ｂ）〕においては、対照群〔第５図−（ａ）〕に比べて粘液産生細胞の数が顕著に増加した〔第５図−（ｄ）〕。これに対し、ＨＧＦ投与群では、粘液産生細胞数の増加が抑制されており〔第５図−（ｃ）、（ｄ）〕、しかも粘液含有量５０％以上の細胞の数も、生理食塩水投与群に比べて顕著に低く（生理食塩水投与群：１６５±２７個／ｍｍ、ＨＧＦ投与群：５４±１６個／ｍｍ）、各細胞内における粘液の分泌量も低下していることが確認された〔第５図−（ｅ）〕。
（５）ＢＡＬ液中サイトカイン及びグロースファクターの濃度測定
ＢＡＬ液中のサイトカイン及びグロースファクターの濃度は、ＢＡＬ液を遠心（４℃、３，０００ｒｐｍ、１０分間）して得られた上清を用いて測定した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３並びにＰＤＧＦは、Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のＥＬＩＳＡキットを、またＴＧＦ−β又はＮＧＦはそれぞれＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）のＥＬＩＳＡキットを用いて、それぞれ添付の使用説明書に記載の方法に従って測定した。
結果を第６図及び第７図に示す。生理食塩水投与群においては、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のサイトカイン（第６図−（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））、並びにＰＤＧＦ、ＮＧＦ及びＴＧＦ−β（第７図−（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））のいずれも、対照群に比べて顕著に濃度が上昇した。これに対し、ＨＧＦ投与群では、これらの濃度の上昇が全て有意に抑制された。一方ＩＬ−１２濃度は、対照群に比べ、生理食塩水投与群では低下したが、ＨＧＦ投与群では有意に上昇した（第６図−（ｄ））。
（６）肺組織中におけるＴＧＦ−βの蓄積
（２）の肺胞洗浄後の左肺を７０％エタノールで１２時間脱水した。脱水した左肺をパラフィン固定後、（３）と同様に組織検体スライドを作製した。組織検体に抗ＴＧＦ−βウサギＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を吸着させ（１：２５０）、次いで、アビジン−ビオチン免疫染色を施し、組織内のＴＧＦ−βを明視化し、顕微鏡下（最終倍率×１，０００）で観察した。
抗ＴＧＦ−βウサギＩｇＧの吸着は、４℃、１２時間で行い、アビジン−ビオチン処理は、室温で６０分間行った。パーオキシダーゼ標識ポリマー試薬の反応は遮光下で、室温、１５分間行った。
その結果、生理食塩水投与群（第８図−（ｂ））においては、対照群（第８図−（ａ））に比べて気道上皮及び炎症細胞の殆どが染色され、細胞内においてＴＧＦ−βが産生されていることが確認された。これに対し、ＨＧＦ投与群（第８図−（ｃ））では、染色された細胞の数が生理食塩水投与群に比べて少なく、ＴＧＦ−βの産生が抑制されていることが確認された。
（７）血清中抗原特異的ＩｇＥ抗体（抗ＯＶＡＩｇＥ）量の測定
各群のマウスの下大静脈より、血液サンプルを採取し、４℃、１，５００ｒｐｍで２０分遠心し、血清サンプルを作製した。
９６ウェルのプレート（ＮＵＮＣ ＩＭＭＵＮＯＰＬＡＴＥ Ｉ：Ｎｕｎｃ）に、５μｇ／ｍＬのモノクローナル抗マウスＩｇＥ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を含むＰＢＳ希釈液を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃にて１晩反応させてプレートをコートした。その後、各ウエルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（−）（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない）（洗浄用バッファー）にて５回洗浄し、１％ＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）−ＰＢＳを１５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温にて１時間インキュベートした。ついで、洗浄用バッファーにて５回洗浄し、各群のマウスの血清サンプルを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、室温にて１時間インキュベートした。同時に、標準曲線作成用として、あらかじめ総ＩｇＥ抗体量測定の系で定量したモノクローナル抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体を、１％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（希釈バッファー）で各種濃度に希釈して、同一プレートの別のウエルに加えた。各ウエルを洗浄バッファーで５回洗浄した後、希釈バッファーで５０倍に希釈したビオチン標識ＯＶＡを１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、さらに室温で１時間インキュベートした。各ウエルを、洗浄バッファーで５回洗浄し、希釈バッファーで３０００倍に希釈したパーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＤＡＫＯ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、さらに室温で１時間インキュベートした。各ウエルを、洗浄バッファーで５回洗浄し、基質溶液（０．１Ｍ クエン酸、０．２Ｍ ＮａＨＰＯ４、Ｏ−フェニレンジアミン、及び３０％Ｈ２Ｏ２を含む。）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加えて、室温暗所にて約３０分間反応させた後、プレートの各ウエルの吸光度を４９２ｎｍで測定した。
結果を第９図に示す。生理食塩水投与群においては、抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度が、対照群に比べて著しく上昇した。これに対し、ＨＧＦ投与群では、抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度の上昇が抑制された。
【産業上の利用可能性】
本発明の喘息の予防・治療剤は、気道の炎症時に確認される炎症細胞の気道上皮及び上皮下への浸潤、Ｔｈ２サイトカイン及びグロースファクター等の気道組織内での濃度上昇等を抑制し、気管支喘息における炎症反応を極めて有効に抑制することができ、慢性喘息或いは重症・難治性喘息への移行を予防することができる。しかも、その有効成分を生体由来のＨＧＦ又はそのＨＧＦをコードするＤＮＡとすることから、生体に投与しても、従来のステロイド吸入において見られる様な副作用がない。従って本発明の喘息の予防・治療剤は、生体に非常に安全で有用である。
本出願は日本で出願された特願２００３−０８６２６８を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は喘息治療剤に関する。更に詳細には、気管支喘息における炎症反応を極めて有効に抑制し、しかも副作用のない安全な喘息の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
現在社会においては、自動車や工場等からの排気ガス、化学物質、粉塵等による大気汚染が顕著となり、それに伴い気管支喘息の患者数が増えている。
気管支喘息とは、発作時に気管支平滑筋の収縮・攣縮が起こり、重積発作時は大変苦しい呼吸困難の状態から喘息死に至る重篤な疾患である。気管支喘息は、大人はもちろん子供でも入院原因の筆頭に挙げられる程であるが、現在の医療では、個々の患者の喘息に対応した予防も治療も難しい疾患とされている。
気管支喘息は、一般的には化学伝達物質やその他の因子に対する気道過敏性等の体質的素因に、抗原刺激等〔例えば、ハウスダスト（家内塵）・ダニ、ペット、花粉、上記の排気ガス、化学物質、粉塵等〕の原因因子、寄与因子が加わって発症するものと考えられている。その病態生理は複雑で、様々な要因、例えば、活性化された好酸球やＴリンパ球等の炎症細胞の気管支粘膜への浸潤、その際にＴｈ２サイトカイン、特にインターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、及びグロースファクター、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、変形増殖因子（ＴＧＦ−β）、中でも特にＴＧＦ−βが、一連の炎症反応を亢進化するのに重要な役割を果たしている等といった事実が多数の研究により示されているが、そのメカニズムの全容は未だ明らかとはなっていない。
炎症が頻発し、しかもその治療が不完全な状態で長期間続くと、例えば上皮下組織の線維化や、杯細胞、筋線維芽細胞の過増殖等が起こり、その結果、気管支は不完全修復（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ：リモデリング）の形で再生する。ひとたび不完全修復が起きてしまうと、気管支粘膜は線維質に置き換わり、その弾力性を失うために、気道の可逆性が失われ、喘息の慢性化・難治化を招くこととなる。
現在このような慢性的な気管支喘息の治療には、副腎皮質ホルモン剤、いわゆるステロイド剤が主に使用されている。しかし、この薬剤は治療には有効ではあるが、その副作用が問題となっている。例えば、効力のある抗喘息薬として知られているグルココルチコステロイドは、実際は一時的な症状鎮静効果しか有せず、その代償として周知の副作用、例えば骨粗鬆症、肥満、高血圧、糖尿病等を伴う〔例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｐ．Ｊ．，“Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｓｔｈｍａ”，ＵＳＡ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，３２１，ｐ１５１７−１５２７（１９８９）参照。〕。そのステロイドによる副作用を軽減すべく開発された吸入ステロイド療法も、合併症を発症する等の危険がある〔例えば、Ｔｏｏｇｏｏｄ，Ｊ．Ｈ．，“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｏｓｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｃｈｅｄｕｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｓｔｈｍａｔｉｃｓ ｔｏ ｔｈｅ ａｅｒｏｓｏｌ ｓｔｅｒｏｉｄ，ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ，７０，ｐ３８８−３９８（１９８２）参照。〕。特にステロイドの副作用がひどい患者向けにはステロイド代替薬として低用量メトトレキセートが提案されてきた〔例えば、Ｍｕｌｌａｒｋｅｙ，Ｍ．Ｆ．，“Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｔｈｍａ．Ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｓｔｕｄｙ”，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，ＵＳＡ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，３１８，ｐ６０３−６０７（１９８８）参照。〕が、メトトレキセートそれ自体がかなりの毒性を有している。
また、気管支を拡張させる即効性のある薬剤、例えばβ２刺激剤等もあるが、これは心臓にも作用するので、心臓疾患のある患者には用いる事ができず、しかも使用回数が制限される。
従って、既存のどの抗喘息剤又は喘息療法も、その効果及び安全面において不完全で、かつ持続的な寛解は報告されていない。よって患者に無害で、しかも持続的な抗炎症効果を奏するような気管支喘息の治療剤及び療法が必要とされている。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とは、Ｎ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインからなるα鎖と、β鎖とで構成されるヘテロダイマータンパクをいう。ＨＧＦは、種々の上皮細胞系において、上皮−間葉相互作用の仲介役を担う重要な因子であることが知られている。例えば、ＨＧＦは、腫瘍細胞の浸潤、転移等を誘発するマイトゲン活性、モートゲン活性、モルフォゲン活性及び血管新生作用を有することが知られている〔例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｂｕｎｉｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ”，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，ＵＳＡ，２２４，ｐ３１１−３１６（１９８７），Ｊｉａｎｇ．Ｗ．Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９，ｐ２０９−２４８（１９９９）参照。〕。また、ＨＧＦをヒト等に投与することにより、肝臓、腎臓、肺や心筋の線維化（例えば肝臓では肝硬変）の発症を防いだり、進行を阻止したりできることも知られている〔例えば、Ｕｅｋｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，ｐ２２６−２３０（１９９９）参照。〕。
ＨＧＦは、上述したように様々な生物活性を有するが、喘息による気道の炎症を抑制する効果をも有することはこれまでに全く知られておらず、本発明において初めて明らかとなった。
従って、本発明は、このＨＧＦの気道炎症抑制効果を発見した点において重要な発明であり、しかも本発明の喘息治療剤は、その構成成分を生体由来のＨＧＦとする点で、上記したステロイド剤等を用いるよりも生体に安全で、しかもその投与による副作用発症の危険性がないため、非常に優れた発明であると言える。
【発明の開示】
本発明は喘息治療剤、詳しくは、気管支喘息における炎症反応を極めて有効に抑制するＨＧＦを含有し、しかも投与による副作用がなく、生体に安全な喘息治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた。具体的には、本発明者らは、抗原吸入暴露した卵白アルブミン感作マウスにＨＧＦを投与すると、炎症時に見られる好酸球やリンパ球等の炎症細胞の浸潤が阻止され、しかも気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−４、ＩＬ−５並びにＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカイン及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）等のグロースファクターの濃度の上昇が顕著に抑制されるということを発見し、喘息等の気道炎症の治療・予防にＨＧＦを用いることが有効であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて更なる検討を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１） ＨＧＦ又はその塩を有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤、
（２） ＨＧＦが、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチド又はこれらの部分ペプチドであることを特徴とする前記（１）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（３） ＨＧＦをコードするＤＮＡを有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤、
（４） ＨＧＦをコードするＤＮＡが、配列番号：３又は４で表される塩基配列又は配列番号：３又は４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであることを特徴とする前記（３）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（５） ＨＧＦをコードするＤＮＡが、組換え発現ベクターに挿入されていることを特徴とする前記（３）又は（４）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（６） 組換え発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＺｅｏＳＶであることを特徴とする前記（５）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（７） 組換え発現ベクターが、更に宿主細胞に含まれていることを特徴とする前記（５）又は（６）に記載の喘息の予防又は治療剤、
（８） ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＨＧＦをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターが、リポソーム又はマイクロカプセルに含まれていることを特徴とする前記（３）〜（７）のいずれかに記載の喘息の予防又は治療剤、
（９） 更に薬剤学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれかに記載の喘息の予防又は治療剤、
（１０） ＨＧＦ又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することにより気管支の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療方法、
（１１） ＨＧＦをコードするＤＮＡの有効量を、哺乳動物に投与することにより気管支の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療方法、
（１２） 気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療剤の製造のためのＨＧＦ又はその塩の使用、
（１３） 気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療剤の製造のためのＨＧＦをコードするＤＮＡの使用、
に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、気管支喘息モデルマウスにおいて、メサコリン吸入による気道過敏性亢進に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第２図は、抗原の吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、気管支肺胞洗浄液（以下、ＢＡＬ液と略す場合がある。）中炎症細胞数の増加に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第３図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、気管支周囲・血管周囲の組織内における浸潤炎症細胞数の増加に対するＨＧＦ投与の影響を、組織学的に観察した組織標本写真を示す図である。（ａ）は対照群（非感作／非暴露）、（ｂ）は生理食塩水投与群（感作／暴露＋生理食塩水）、（ｃ）はＨＧＦ投与群（感作／暴露＋ＨＧＦ）を示す。
第４図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、気管支周囲・血管周囲の組織内における（ａ）浸潤総炎症細胞数及び（ｂ）好酸球数の増加に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第５図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、気道上皮の粘液産生細胞（杯細胞）数の増加に対するＨＧＦ投与の影響を示す図である。（ａ）は対照群（非感作／非暴露）、（ｂ）は生理食塩水投与群（感作／暴露＋生理食塩水）、（ｃ）はＨＧＦ投与群（感作／暴露＋ＨＧＦ）の気道上皮を組織学的に観察した組織標本写真を示す図である。（ｄ）は前記各群における粘液産生細胞数を示し、（ｅ）は前記各群における粘液含有量５０％以上の細胞の数を示した図である。
第６図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、ＢＡＬ液中のサイトカイン〔（ａ）ＩＬ−４、（ｂ）ＩＬ−５、（ｃ）ＩＬ−１３及び（ｄ）ＩＬ−１２〕の濃度に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第７図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、ＢＡＬ液中のグロースファクター〔（ａ）ＰＤＧＦ、（ｂ）ＮＧＦ並びに（ｃ）ＴＧＦ−β〕の濃度の上昇に対するＨＧＦ投与の影響を示した図である。
第８図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、肺組織中におけるＴＧＦ−βの蓄積に対するＨＧＦ投与の影響を、組織学的に観察した組織標本写真を示す図である。（ａ）は対照群（非感作／非暴露）、（ｂ）は生理食塩水投与群（感作／暴露＋生理食塩水）、（ｃ）はＨＧＦ投与群（感作／暴露＋ＨＧＦ）を示す。
第９図は、抗原吸入暴露４８時間後の気管支喘息モデルマウスにおいて、血清中抗原特異的ＩｇＥ抗体（抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ）量の増加に対するＨＧＦの影響を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、ＨＧＦ又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする。
ＨＧＦ又はその塩は、哺乳動物、例えばヒト、モルモット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等由来のいずれであってもよい。またＨＧＦは、これらの哺乳動物の組織又は細胞、例えば成熟肝細胞や血小板等から抽出される精製タンパク質であっても、遺伝子組み換え技術等を用いて、ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを導入された形質転換細胞等を培養し、産生されるタンパク質を精製することによって得られる組換えタンパク質であっても、また化学的に合成される合成ポリペプチドであってもよい。成熟肝細胞や形質転換細胞等からのＨＧＦの抽出・精製又は合成ポリペプチドの製造は、それ自体公知の方法に従って行われて良い。
ヒト等の哺乳動物の細胞からＨＧＦを単離・精製する方法としては、例えば、比較的高濃度にＨＧＦを含むラット血小板をトロンビン処理し、血小板外へ分泌されるＨＧＦを取得後、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等を用いて精製する方法等が挙げられる。
また、遺伝子組み換え技術等を用いて、ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを導入された形質転換細胞等を培養し、分泌されるタンパク質を精製することによってＨＧＦを得る場合は、以下の方法に従って行うのがよい。
ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを、適当な組換え発現ベクター、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００（１９９１））等に挿入し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を構築する。
組換え発現ベクターを宿主へ導入する方法としては、自体公知の方法であればいずれも用いることができる。例えば、コンピテント細胞法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４（１９７０）］、ＤＥＡＥデキストラン法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，（１９８２）］、インビトロパッケージング法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７２，５８１（１９７５）］、ウイルスベクター法［Ｃｅｌｌ，３７，１０５３（１９８４）］、マイクロインジェクション法［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１５３，３４７（１９８４）］、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１（１９８３）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、プロトプラスト法［特開昭６３−２４８３９４２、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］に記載の方法等を挙げることができる。
宿主としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。例えば、細菌としては、エッシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等が挙げられる。
酵母としては、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、パン酵母等が挙げられる。糸状菌としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）等が挙げられる。
植物細胞としては、ワタ、トウモロコシ、ポテト、ソラマメ、ペチュニア、トマト、タバコ等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒト細胞ＨｅＬａ、ヒトＦＬ細胞、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞［実験医学，１２，３１６（１９９４）］等が挙げられる。
得られた形質転換体は、ＨＧＦを産生するために、その宿主に応じた適切な培地で培養される。培地には該形質転換体の生育に必要な炭素源、無機物、ビタミン、血清及び薬剤等が含有される。
形質転換体の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４３１（１９７２）］等が、宿主が酵母の場合、ＹＥＰＤ培地［Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１７（１９７９）］等が、宿主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎仔血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＰＲＭＩ１６４０培地（日水製薬）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気・攪拌が行われるが、これらに限定されるものではない。また、宿主が接着性の動物細胞等の場合は、所望によりガラスビーズ、コラーゲンビーズ、アセチルセルロースフォローファイバー等の担体が用いられる。
ＨＧＦを産生している形質転換体は、その培養液上清中にＨＧＦを分泌することから、この形質転換体の培養上清を用いてＨＧＦの抽出を行うことができる。また、形質転換体中に産生されたＨＧＦの抽出を行うこともできる。タンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するには、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム又は／及び凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過によりＨＧＦの粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭ等の界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた培養上清、あるいは細胞抽出液中に含まれるＨＧＦの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が用いられる。
配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列は、ＨＧＦのアミノ酸配列の例である。配列番号：２で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失しているものであるが、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、両者ともヒト由来の天然ＨＧＦであって、ＨＧＦとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。
配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％以上、好ましくは約８０％、更に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、例えば配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列から、１〜数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列、１〜数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含むペプチドであって、喘息時における気道炎症抑制作用を有するペプチドであることが好ましい。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。
これらのペプチドは、単独であっても、挿入や欠失、置換等を組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドであっても、またこれらの混合ペプチドであってもよい。
本発明に用いられるＨＧＦは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＨＧＦが、Ｃ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＨＧＦに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられるＨＧＦには、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質等の複合タンパク質等も含まれる。
本発明で用いるＨＧＦの部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある。）としては、上記したＨＧＦの部分ペプチドであればいずれのものであってもよい。本発明において、部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＨＧＦの構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。本発明の部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。さらに、部分ペプチドには、上記したＨＧＦと同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。
本発明に用いられるＨＧＦ又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。
本発明に用いられるＨＧＦの部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＬｕｅｂｋｅ、ザ ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５年）等に記載された方法が挙げられる。
また、反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせてＨＧＦの部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明は、ＨＧＦをコードするＤＮＡをその有効成分として含有することもできる。
本発明で用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ又はｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅し、得ることもできる。具体的には、ＨＧＦをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は（ｂ）配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦと実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。なお、配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
上記の配列番号：３又は４で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号：３又は４で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
本発明で用いられるＨＧＦの部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、上記のＨＧＦをコードするＤＮＡと同様に、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。具体的な本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦと実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は上記（ａ）或いは（ｂ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。
本発明で用いられるＨＧＦ又は部分ペプチドをコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦ又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。
本発明に用いられるＨＧＦ又はその部分ペプチド（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある。）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列を含有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、又は適当なベクターに組み込んだＤＮＡの中から、標識されたＨＧＦの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーションさせることによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
また、公知のＨＧＦの塩基配列情報から従来公知の方法を用いて化学合成によりクローニングすることもできる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法等が挙げられる。
ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造）等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、又は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ（以下、本発明のＤＮＡ等と略記する場合がある。）は、細胞内でのその安定性を高めるため、また、もし毒性があるならその毒性をより小さなものにするために修飾されていてもよい。このような修飾には、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐ２４７（１９９２）；Ｖｏｌ．８，ｐ３９５（１９９２）；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）等に記載された方法等が挙げられる。本発明のＤＮＡ等は、リポソーム又はミクロスフェア等に内包された特殊な形態で用いられてもよい。また、本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡ等は、塩基以外の他の物質が付加されたものであってもよい。前記他の物質としては、糖；酸又は塩基；リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体；又は、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロール等）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸等）などが挙げられる。前記他の物質は、核酸の３’末端あるいは５’末端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。本発明のＤＮＡ等は、その末端が化学修飾されたものであってもよい。末端の修飾基としては、核酸の３’末端あるいは５’末端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ等のヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコール等のグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
本発明に用いられるＨＧＦ或いはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、組換え発現ベクターに含有されていてもよい。
組換え発現ベクターとしては、ＨＧＦ又はその部分ペプチドを発現することができる発現ベクターが好ましい。
本発明に用いられる組換え発現ベクターは、例えば、ＨＧＦをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
前記組換え発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等のウイルス等の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。中でも、ウイルスが好ましく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、又はポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等が好ましい。更にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）若しくはアデノウイルス等を用いることがより好ましい。アデノウイルスには種々の血清型が存在するが、本発明では２型若しくは５型ヒトアデノウイルスを使用することが好ましい。
前記プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある。）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある。）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。また、所望により、宿主に合ったシグナル配列を発現ベクターに付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列等が、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等がそれぞれ利用できる。このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を製造することができる。
上記ＨＧＦ或いはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクターは、更に宿主細胞に導入されていてもよい。
上記組換え発現ベクターの宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、ビフィズス菌、乳酸菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕、Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕、ＤＨ５α〔Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｇｅｎｅ，９６，２３−２８（１９９０）〕、ＤＨ１０Ｂ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７巻，４６４５−４６４９（１９９０）〕等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕、〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。ビフィズス菌としては、例えばＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ等が挙げられる。乳酸菌としては、例えばラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等が挙げられる。酵母としては、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等が用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞又はＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ Ｖｉｖｏ，１３，ｐ２１３−２１７（１９７７））等が用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる（前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５，５９２（１９８５））。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記する。）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記する。）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，ｐ２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７，ｐ１０７（１９８２）等に記載の方法に従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，ｐ１１１（１９７９）等に記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，ｐ１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，ｐ１９２９（１９７８）等に記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞又は昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，ｐ４７−５５（１９８８）等に記載の方法に従って行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，ｐ２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，ｐ４５６（１９７３）等に記載の方法に従って行うことができる。このようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。宿主がエシェリヒア属菌又はバチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖等、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等の無機又は有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子等を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐ４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２）〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，ｐ４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐ５３３０（１９８４）〕等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，ｐ７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，ｐ５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，ｐ３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，ｐ５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，ｐ１（１９５０）〕等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外にＨＧＦを生成せしめることができ、生体に有効にＨＧＦを投与することができる。
組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換せず、裸のベクターとして生体にｉｎ ｖｉｖｏ導入し、本発明に用いることもできる。裸のベクターとして用いる場合、使用される組換え発現ベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳ［Ｇｅｎｅ，１０８，ｐ１９３−２００（１９９１）］、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）等のプラスミドを用いることができる。該ベクターにも、前記ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を含有させることができる。
また、ＨＧＦをコードするＤＮＡ等又はＨＧＦをコードするＤＮＡを有する組換え発現ベクターを、リポソーム、マイクロカプセル、サイトフェクチン、ＤＮＡ−タンパク質複合体、バイオポリマー等の人工ベクターに含有させることもできる。
リポソームとは、内部に水層を有する脂質二重膜でできた閉鎖小胞体であり、その脂質二分子膜構造が、生体膜に極めて近似していることが知られている。リポソームを製造するに際し使用されるリン脂質としては、例えば、レシチン、リゾレシチン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等の酸性リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質等が挙げられる。また、コレステロール等を添加することもできる。リポソームは、自体公知の方法に従って製造することができる。リポソームには、膜融合リポソーム、ＨＶＪ−膜融合リポソーム［Ｋａｎｅｄａ．Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６４，ｐ１２１２６−１２１２９（１９８９）、Ｋａｔｏ．Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６６，ｐ３３６１−３３６４（１９９１）、Ｔｏｍｉｔａ．Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．，１８６，ｐ１２９−１３４（１９９２）、Ｔｏｍｏｔａ．Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｃ．Ｒｅｓ．，７３，ｐ８９８−９０５（１９９３）］、陽イオン性リポソーム（特表平２０００−５１０１５１号公報、特表平２０００−５１６６３０号公報）等が知られている。センダウイルス（ＨＶＪ）と融合させたＨＶＪ−膜融合リポソームを用いることは、特に好ましい。リポソームの表面にＨＶＪの糖タンパクを組み込み、又は共有結合させてポリエチレングリコール等を添加すると、細胞への遺伝子導入効率が上昇する。
ＨＧＦをコードするＤＮＡにシグナル配列、プロモーター及びポリアデニル化配列を付加したＤＮＡをリポソーム中に含有させることにより、また、ＨＧＦをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターをリポソーム中に含有させることにより、本発明の喘息の予防・治療剤とすることができる。
マイクロカプセルはフィルムコートされた粒子であり、膜形成ポリマー誘導体、疎水性可塑剤、表面活性剤又は／及び潤滑剤窒素含有ポリマーの混合物からなるコーティング材料でコートされた粒子等で構成される。
ＨＧＦをコードするＤＮＡにシグナル配列、プロモーター及びポリアデニル化配列を付加したＤＮＡをマイクロカプセル中に含有させることにより、また、ＨＧＦをコードするＤＮＡを有する組換え発現ベクターをマイクロカプセル中に含有させることにより、本発明の喘息の予防・治療剤とすることができる。
ＨＧＦ又はその塩等を直接投与するか、又はＨＧＦをコードするＤＮＡ等を投与し、ＨＧＦを投与部位において発現させることにより、投与された生体の気管支炎の炎症等を抑制することができる。それ故、（ａ）ＨＧＦもしくはその部分ペプチド又はそれらの塩、又は（ｂ）ＨＧＦもしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、喘息の予防・治療剤として使用することができる。
前記「喘息」とは、いわゆるアレルギー性の慢性気道炎症や気道過敏性亢進（ＡＨＲ）等に関係する一連の症候群をいう。本発明の喘息の予防、治療剤は、急性・一過性又は慢性の喘息の両方において有効であり、小児喘息においてもその効果を発揮する。喘息の原因が、例えばウイルス感染（いわゆる風邪）、アレルゲン、化学物質によるもの等のいかなる場合であっても、また特に小児喘息においては、アトピー型であろうと非アトピー型であろうと、これらの予防・治療に有効に使用することができる。
本発明の喘息の予防・治療剤がＨＧＦからなる場合は、常套手段に従って製剤化することができる。一方、ＨＧＦをコードするＤＮＡ等を該予防・治療剤として使用する場合は、上述した通り、該ＤＮＡ等を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。本発明のＤＮＡ等は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
例えば、ＨＧＦ若しくはその塩又はＨＧＦをコードするＤＮＡ等は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に投与したり、患部、皮下、筋肉内等に埋め込むこともできる。また、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に投与することもできる。本発明の喘息の予防又は治療剤は、ネブライザーや吸入剤（ポケット型ネブライザー）の形で投与することができる。ネブライザーによる投与に際しては、好ましくは電動式ネブライザー（例えばジェット式ネブライザー、超音波式ネブライザー、メッシュ式のネブライザー等）が使用される。本発明の喘息の予防又は治療剤は、電動式ネブライザーの器具の中に入れられ、加圧された空気の噴出によって液体の薬剤を霧状にし人の気道に噴霧されるか、超音波振動によって薬剤を噴霧し、気道に投与される。吸入剤による投与方法としては、本発明の喘息の予防又は治療剤を例えばスプレー等で直接噴霧する方法か、吸入補助器具（スペーサー）を使用して噴霧された薬剤を吸入する方法が挙げられる。
本発明の製剤は、例えば、ＨＧＦ若しくはその塩又はＨＧＦをコードするＤＮＡ等を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤又は徐放性を付与する物質等とともに混和することによって製造することができる。
錠剤、カプセル剤等において混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤；結晶性セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等のような膨化剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤等が挙げられる。錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウ等）、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等）などで剤皮を施してもよい。カプセル剤の場合には、さらに油脂のような液状担体を含有することができる。また、カプセル剤は、通常のカプセル剤の他、腸溶性コーティングカプセル剤、胃内抵抗性カプセル剤、放出制御カプセル剤とすることもできる。腸溶性カプセル剤とする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングしたＨＧＦ又はＨＧＦに上記の適当な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填する。あるいは、腸溶性コーティング剤でコーティングしたカプセル、若しくは腸溶性高分子を基剤として成形したカプセルにＨＧＦ又はＨＧＦに上記の適当な賦形剤を添加したものを充填することができる。
注射のための無菌組成物は注射用水性液又は油性液に有効成分を溶解又は懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）等を併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。さらに、前記無菌組成物には、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等が配合されてもよい。調製された無菌組成物は通常、適当なアンプルに充填され、注射剤として供される。
また、ネブライザー用液剤や吸入剤として製造する場合、その添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、上記した賦形剤、緩衝剤、溶解補助剤、保存剤、安定剤、等張化液、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム等）、及び矯味剤（クエン酸、メントール、グリチルリチンアンモニウム塩、グリシン、香料等）などが用いられる。吸入剤においては、前記添加剤に加え噴射剤が配合される。噴射剤としては、液化ガス噴射剤、圧縮ガス等が用いられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）、不溶性ガス（窒素ガス等）などが挙げられる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）などに対して投与することができる。
本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡ等を製剤化せずに生体に投与する場合は、公知の方法に従って行ってよいが、例えば、ＤＮＡを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、又は投与されるヒト等からある種の細胞を体外に取り出して、これにＤＮＡを導入し、その形質転換細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある［日経サイエンス、４月号、２０−４５（１９９４）、月間薬事、３６、２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２、１５（１９９４）］。それぞれの方法において、ＤＮＡを細胞に導入する方法としては、上述したようにアデノ随伴ウイルス、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等の組換え発現ベクターに含有させて、該発現ベクター等を導入する遺伝子導入方法、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃で担体（金属粒子等）とともにＤＮＡを細胞内に導入する方法等、自体公知の方法により細胞に導入する方法［Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，９６３−９６７（１９９２）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１４６２１−１４６２４，（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８，２７２６−２７３０（１９９１）］が挙げられる。またリポソーム等を用いる場合には、リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、陽イオン性リポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法等が挙げられる。
中でも、導入効率の観点から、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法が望ましい。
また、上記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、該形質転換体を本発明の予防・治療剤とすることもできる。その場合は、例えば形質転換体をカプセル等に含有させてカプセル製剤として生体に投与することができる。
またＨＶＪ−リポソーム等のリポソームを用いる場合には、例えば、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
本発明にかかる喘息の予防・治療剤は、経口的に投与したり、患部、皮下、筋肉内等に埋め込んだり、静脈投与することができるが、好ましくは静脈投与又は気管支に局所的に投与することが好ましい。
また本発明の喘息の予防・治療剤の投与時期は、喘息の症状が起こった時に投与されるのが好ましい。また喘息の慢性化、重症・難治化に繋がる危険性がある場合等には、継続的に投与され、気道の不完全修復（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ：リモデリング）を予防するのが好ましい。
本発明の予防・治療剤の投与量は、投与対象、症状、投与形態、処置期間等により異なるので一概には言えないが、通常、静脈投与の場合、ＨＧＦとして、約２５０〜１０００μｇ／Ｋｇ／日、好ましくは約３００〜８００μｇ／Ｋｇ／日、特に好ましくは、約３００〜５５０μｇ／Ｋｇ／日、またＨＧＦをコードするＤＮＡ等として、約０．２〜４０，０００μｇ／Ｋｇ／日、好ましくは約２〜２，０００μｇ／Ｋｇ／日である。
本発明の製剤を投与することにより、喘息の発作時における気道の炎症を抑制及び予防することができる。気道の炎症時には、通常「気管支平滑筋の収縮」「粘膜の浮腫」「分泌物の増加」等の変化が起こっていると考えられており、具体的な症状としては呼吸停止等が見られる。病理形態的には、肺組織への炎症細胞、例えば好酸球、Ｔリンパ球やマクロファージ等の浸潤、気道上皮組織における粘液産生細胞（杯細胞）の過増殖等により確認できる。また、血清中の抗原特異的ＩｇＥ値が上昇し、更には、気管支肺胞洗浄液（以降、ＢＡＬ液と略す場合がある。）中のＴｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等やグロースファクター、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、変形増殖因子（ＴＧＦ−β）の濃度が上昇することが確認されている。
従って、本発明の製剤を投与すると、炎症時に見られる上記の現象が抑制される。
本発明の製剤の気道炎症抑制作用効果は、マウスを用いた抗原反復吸入暴露による実験的気管支喘息モデルを作成し、該マウスが気道の炎症反応を起こす環境下において本発明の製剤を該マウスに投与し、気道炎症及び気道過敏性亢進が抑制されることにより確認することができる。
気管支喘息モデルの作製は特に限定されないが、例えば、マウスに卵白アルブミン感作・吸入暴露を施して抗原特異的免疫性を付与する方法が挙げられる。この抗原誘発アレルギー性気道炎症モデルマウスに、例えばメサコリン（Ｍｅｔｈａｃｈｏｌｉｎｅ）等の気道収縮作用を有する物質を吸入させることにより、気道炎症を引き起こさせることができる。
血清中抗原特異的ＩｇＥ値の測定には、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｔｅｍａｎｎ，Ｕ．Ａ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｕｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，ｐ４７１−４７８，１９９７）等を用いることができる。
ＢＡＬ液中の炎症細胞を含む全ＢＡＬ細胞数の測定は、例えば生理食塩水で肺胞内を洗浄し、得られたＢＡＬ液中に存在する細胞の数を顕微鏡下で計測することにより行うことができる。
ＢＡＬ液上清中のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のサイトカインやＰＤＧＦ、ＮＧＦ、ＴＧＦ−β等のグロースファクターの濃度の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法により行うことができる。ＥＬＩＳＡにおける比色計測定は、それぞれ添付の使用説明書に記載の方法に従って行うのがよい。
組織学的及び免疫組織学的に気道炎症を確認する方法としては、例えば、気管支周辺の肺組織を過ヨウ素酸シッフ染色後、顕微鏡下で粘液産生細胞（杯細胞）の数を計測する方法、また気管支周辺の組織細胞をヘマトキシン−エオジン染色後、同じく顕微鏡下で好酸球、リンパ球又はマクロファージの数を計測する方法等が挙げられる。これらの計測には、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）等を用いることができる。また、気管支周辺組織細胞に、例えば抗ＴＧＦ−βウサギＩｇＧを吸着させ、その後アビジン−ビオチン処理（Ｕｅｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ，Ｍｅｄ．，５，ｐ２２６−２３０，１９９９）することにより、細胞内のＴＧＦ−βの蓄積を確認することができる。
以下に、実施例等を示して本発明を具体的に説明するが、言うまでもなく、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例
ＨＧＦを含有する製剤の製造
（１） ＨＧＦｃＤＮＡの作製
ヒトのＭＲＣ−５線維芽細胞からＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ｍＲＮＡを単離し、これを使用してＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＨＧＦｃＤＮＡを単離した。具体的には、ｍＲＮＡ溶液０．５μＬ（１５０ｎｇ）、１０×ＲＴ−ＰＣＲ溶液［５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２］５μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μＬ、プライマー：１（１０ｍＭ）２μＬ、プライマー：２（１０ｍＭ）２μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬ、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μＬ、逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬ及びＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ ３５．２μＬを混合し、４２℃ ３０分、９５℃ ５分で逆転写反応を行い、９４℃ ３０秒、５５℃ １分、７２℃ １分のサイクルを４０回繰り返し、さらに７２℃ ７分間反応させＨＧＦｃＤＮＡを得た。このようにして得られたＨＧＦｃＤＮＡをＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲＩＩＴＭベクターにクローニングし、ｐＣＲＩＩ／ＨＧＦを得た。
なお、プライマー：ａ及びプライマー：ｂの配列は、以下の通りのとおりである。
（２） 組換え発現ベクターの構築
（１）で作製したｐＣＲＩＩベクターに組み込まれたＨＧＦｃＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ Ｉ／Ｓｐｅ Ｉで切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）処理により切断末端を平滑化させた。得られたＨＧＦｃＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素Ｘｈｏ Ｉで処理した後、切断末端を平滑化しておいたＣＨＯ細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲと混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合してＨＧＦ発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＨＧＦを得た。得られたＨＧＦ発現ベクターはニワトリβ−アクチンプロモーターとウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル配列の間にＨＧＦｃＤＮＡを有する。また、形質転換された細胞の選択は、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子にサイトメガロウイルス初期プロモーターとポリ（Ａ）シグナル配列で連結したＤＨＦＲキメラ遺伝子により可能となる。
（３） チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞への形質転換とその発現
上記ＣＨＯ細胞発現用ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＨＧＦはＷｉｇｌｅｒらの方法［Ｃｅｌｌ，１１，ｐ２３３（１９７７）］によりチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損細胞に導入した。約３０μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＨＧＦプラスミドをそれぞれ２４０μＬの０．５Ｍ塩化カルシウムに溶解し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ塩化ナトリウム及び１．５ｍＭリン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）２４０μＬを攪拌しながら加えた。室温で３０分攪拌を続けプラスミドとリン酸カルシウムの共沈殿物を形成させた。続いて、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）と１％グルタミンとを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて５×１０５個のＣＨＯ細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換した後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈殿物を加え室温で２０分間放置した。さらに、３７℃で４時間インキュベートした後、培地を除去し、１５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５分間放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地交換しさらに３７℃で７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、透析した１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）、２％グルタミンを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて安定なＨＧＦ高生産株を得るために１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭとメソトレキセート濃度を順次追加させながら同培地で継代培養を繰り返した。得られたＨＧＦ産生組換え細胞をクローン選別を行い、安定なＨＧＦ生産株を得た。
（４） 形質転換ＣＨＯ細胞培養上清からのＨＧＦの精製
上記（３）で得られたＨＧＦ産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換え細胞株をリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセートを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）で培養し、その培養上清より、ＨＧＦを精製した。
イ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ＨＧＦ産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換え細胞株の培養液１２Ｌに最終濃度０．０１％になるようにＴｗｅｅｎ ８０を添加し、ステベックスＨＶフィルター（日本ミリポア）により濾過した。０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｃｉｔｒａｔｅ−ＮａＯＨ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．５）で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア製、カラム体積５０ｍＬ）に添加した。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．５Ｍから２．５Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により溶出したピーク画分を集め、ヘパリン溶出液Ａとした。
ロ）陰イオン交換クロマトグラフィー
ヘパリン溶出液Ａを１００倍容の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ８．０）で３回透析を行った後、緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア製、カラム体積４０ｍＬ）に添加した。緩衝液Ｂで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで溶出したピーク画分を集め、ＤＥＡＥ溶出液とした。
ハ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（２回目）
ＤＥＡＥ溶出液を１００倍容の緩衝液Ａで３回透析を行った後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア製、カラム体積５０ｍＬ）に添加した。０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．３Ｍから２．５Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により吸着物を溶出した。ＨＧＦのピーク画分を集め、ヘパリン溶出液Ｂとした。精製されたＨＧＦの収量は約１２ｍｇであり、培養上清液からの回収率は約５０％であった。
ニ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
ＨＧＦを２−メルカプトエタノール還元下及び非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。精製ＨＧＦは非還元条件下［２−ＭＥ（−）］では約５０ｋＤａを示し、還元条件下［２−ＭＥ（＋）］では約６７ｋＤａを示した。
（５） 凍結乾燥剤の作製
生理食塩水１００ｍＬ中に（４）で調整したＨＧＦ（１ｇ）、マンニトール（１ｇ）及びポリソルベート８０（１０ｍｇ）を含有する溶液を無菌的に調整し、１ｍＬずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の製剤を凍結乾燥剤として調整した（製剤１）。
【実施例】
ＨＧＦ投与による気道炎症抑制効果の確認
（１）気道過敏性亢進におけるＨＧＦ投与の影響
雌の８〜１０週令マウス（ＢＡＬＢ／ｃ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）に卵白アルブミン（ＯＶＡ）非含有飼料を与え、一定温度、一定光サイクル下で飼育した。
気管支喘息モデルマウスを、以下に示す方法により作製した。
生理食塩水１００μＬ中に２０μｇＯＶＡ（Ｇｒａｄｅ Ｖ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）及び２．２５ｍｇ硫酸アルミニウム（乳化剤：ＡｌｕｍＩｍｕｊｅｃｔ；Ｐｉｅａｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を懸濁し、この懸濁液をマウスの腹腔内に、飼育開始０日後及び１４日後に投与した。該マウスに、生理食塩水に１％のＯＶＡを含む液を、超音波ネブライザーを用いて、２０分間、ＯＶＡを吸入させた。吸入暴露は、飼育開始２８、２９及び３０日後に行った。
気管支喘息モデルマウス作製中に、一部のマウスに製造例で得た製剤１を投与した。１ｍｇの製剤１を１０ｍＬの生理食塩水に溶解・希釈後、該溶液０．２ｍＬを飼育開始後２７〜３１日の期間毎日、継続的に皮下投与した（ＨＧＦ投与群、ｎ＝１６：感作／暴露＋ＨＧＦ）。製剤１の投与量は、ＨＧＦとして５００μｇ／ｋｇ／日とした。
製剤１を生理食塩水に溶解して作成した溶液に代えて、生理食塩水０．２ｍＬを、飼育開始後２７〜３１日に継続的に皮下投与した群も作製した（生理食塩水投与群、ｎ＝１６：感作／暴露＋生理食塩水）。また、上記のＯＶＡによる感作・暴露を行わないマウスを、対照群（ｎ＝１６：非感作／非暴露）とした。
尚、群間比較は、二元配置分散分析を行った後、生理食塩水投与群とＨＧＦ投与群との間（＊）、又は対照群と生理食塩水投与群との間（＃）で、差を検定することにより行った（ｔ検定）。以降の試験においても、同様に群間比較を行った。
気管支喘息モデルマウスにおける気道過敏性の評価は、以下に示す方法により行った。メサコリン含有生理食塩水（３．１２５〜２５ｍｇ／ｍＬ）又は生理食塩水のみを超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ０７，ＯＭＲＯＮ社製）にて、気管支喘息モデルマウスのＨＧＦ投与群、生理食塩水投与群及び気管支喘息でない対照群にそれぞれ３分間吸入させた後、ホールボディープレチスモグラフボックス内にマウスを入れ、マウスが覚醒下かつ無拘束の状態で、バロメトリックプレチスモグラフ（Ｂａｒｏｍｅｔｒｉｃ ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙ：Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ，Ｔｒｏｙ，ＮＹ）によるコンピューター呼吸機能解析システム（Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｔｒｏｙ，ＮＹ）を用いて気道過敏性（Ｐｅｎｈ）を測定した。Ｐｅｈｎの測定は以下の式に従った。
Ｐｅｎｈ＝ＰＥＰ／ＰＩＰ ｘ Ｔｅ−Ｔｒ／Ｔｒ
ＰＥＰ；ｐｅａｋ ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓｕｒｅ（ｍＬ／ｓ），ｍａｘｉｍａｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｏｘ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｉｎ ｏｎｅ ｂｒｅａｔｈ
ＰＩＰ；ｐｅａｋ ｉｎｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓｕｒｅ（ｍＬ／ｓ），ｍａｘｉｍａｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｏｘ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｉｎ ｏｎｅ ｂｒｅａｔｈ
Ｔｅ；ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｉｍｅ（ｓ），ｔｉｍｅ ｆｒｏｍ ｅｎｄ ｏｆ ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｔａｒｔ ｏｆ ｎｅｘｔ ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ
Ｔｒ；ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ｓ），ｔｉｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｅｃａｙ ｔｏ ３６％ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｂｏｘ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎｓ
（Ｃｉｅｓｌｅｗｉｃｚ．Ｇ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ，１０４，ｐ３０１−３０８（１９９９）
その結果、各群において、生理食塩水のみを吸入した時に得られるベースラインＰｅｎｈ値には殆ど差がなかった（非感作／非暴露：０．４９±０．０４、感作／暴露＋生理食塩水：０．５３±０．１７、感作／暴露＋ＨＧＦ：０．５３±０．１３）が、メサコリンを吸入した場合、生理食塩水投与群ではメサコリン濃度に依存して急激な気道過敏性の上昇が見られた。これに対しＨＧＦ投与群では、その気道過敏性の上昇が有意に抑制された（第１図）。
（２）ＢＡＬ液中炎症細胞数の測定
（１）に記載の試験４８時間後、各群のマウスの気管支・肺胞内を、気管内チューブを介して生理食塩水（１ｍＬ、３７℃）で２回洗浄した。洗浄液を回収し、全ＢＡＬ液量及びＢＡＬ液内の全細胞数を、Ｂ▲ｕ▼ｒｋｅｒ−ｔ▲ｕ▼ｒｋ式血球計算板を用いて測定した。次いで、ＢＡＬ液からサイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ３：ＳＨＡＮＤＯＮ社製）を用いて単層標本を作製し（４，０００ｒｐｍ、５分）、これをメイ・ギムザ染色（１３分）した。該組織単層標本を顕微鏡下において観察し、ＢＡＬ液中におけるマクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球等の炎症細胞数を測定した。
その結果、対照群においては、全ＢＡＬ細胞数が少なく、またその内約９５％以上をマクロファージが占めており、他の炎症細胞は殆ど見られなかった。生理食塩水投与群においては、著しいリンパ球と好酸球の増加が見られた。これに対し、ＨＧＦ投与群では、生理食塩水投与群において見られたリンパ球と好酸球数の増加が有意に抑制されていた（第２図）。
（３）気管支周囲・血管周囲の組織内における浸潤炎症細胞数の測定
（２）の肺胞内洗浄後の右肺に２ｍＬの空気を、気管内チューブを介して送り、右肺胞を膨らませ、１０％ホルマリンで、４８時間固定した。この固定組織から主気管支周辺の肺組織ブロックを切り出し、パラフィン固定した。ブロックから４μｍ厚の組織切片を作製し、これらを顕微鏡スライド上に固定した後パラフィンを除去した。該組織検体スライドをヘマトキシン−エオジン染色し、明視化された炎症細胞の浸潤状況を顕微鏡下で観察した（最終倍率×４００、インセット×１，０００）。炎症細胞数の計測には、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）等を用いた。上記計測は、ランダムに選択した１０視野に対して行い、組織１ｍｍ２当たりの細胞数の平均値を算出した。また試験に供した各群のマウスの数はそれぞれ１６匹とした。
ヘマトキシン−エオジン染色は以下の通り行った。組織検体スライドを脱パラフィン後、ヘマトキシン液による染色を室温で５分間行い、３７℃のぬるま湯に５分間浸漬することにより余分な色素を洗い流した。次いで、検体を室温で９５％アルコールに１５秒浸し、親和させた後、水溶性エオジン液により対比染色を１０分間行った。
その結果を第３図及び第４図に示す。対照群においては、殆ど気管支周囲・血管周囲組織に炎症細胞の浸潤は見られなかった〔第３図−（ａ）〕が、生理食塩水投与群においては、炎症細胞の浸潤が見られ〔第３図−（ｂ）〕、炎症細胞数及び好酸球数が著しく増加した（第４図）。これに対し、ＨＧＦ投与群では、生理食塩水投与群に比較して、炎症細胞の浸潤の程度が低く、炎症細胞数及び好酸球数の増加が抑制されていた（第３図−（ｃ）、第４図）。
（４）気道上皮組織における粘液産生細胞（杯細胞）数の測定
（３）の右肺固定組織から気道上皮組織を含む主気管支周辺の肺組織ブロックを切り出し、組織検体スライドを作製した。該組織検体スライドを過ヨウ素酸シッフ染色し、明視化された杯細胞の数を顕微鏡下で計測した（最終倍率×１，０００）。計測には、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）等を用いた。上記計測をランダムに選択した１０視野に対して行い、気道上皮基底膜の単位長さ（１ｍｍ）当りの細胞数の平均値を算出した。
また、細胞中の粘液含有量を、過ヨウ素酸シッフ染色により着色される色の濃さ（染色率）から判定し、粘液産生細胞を染色率が５０％以上又は５０％以下の２種類に分類した。
過ヨウ素酸シッフ染色は以下の通り行った。組織検体スライドを脱パラフィン後、検体を室温で１％過ヨウ素酸水溶液に浸漬し、酸化させた。流水で水洗後、検体をシッフ試薬により室温で１０分間染色し、再び流水で十分水洗後、ヘマトキシリン液により１分間の核染色を行った。
結果を第５図に示す。生理食塩水投与群〔第５図−（ｂ）〕においては、対照群〔第５図−（ａ）〕に比べて粘液産生細胞の数が顕著に増加した〔第５図−（ｄ）〕。これに対し、ＨＧＦ投与群では、粘液産生細胞数の増加が抑制されており〔第５図−（ｃ）、（ｄ）〕、しかも粘液含有量５０％以上の細胞の数も、生理食塩水投与群に比べて顕著に低く（生理食塩水投与群：１６５±２７個／ｍｍ、ＨＧＦ投与群：５４±１６個／ｍｍ）、各細胞内における粘液の分泌量も低下していることが確認された〔第５図−（ｅ）〕。
（５）ＢＡＬ液中サイトカイン及びグロースファクターの濃度測定
ＢＡＬ液中のサイトカイン及びグロースファクターの濃度は、ＢＡＬ液を遠心（４℃、３，０００ｒｐｍ、１０分間）して得られた上清を用いて測定した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３並びにＰＤＧＦは、Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のＥＬＩＳＡキットを、またＴＧＦ−β又はＮＧＦはそれぞれＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）のＥＬＩＳＡキットを用いて、それぞれ添付の使用説明書に記載の方法に従って測定した。
結果を第６図及び第７図に示す。生理食塩水投与群においては、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のサイトカイン（第６図−（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））、並びにＰＤＧＦ、ＮＧＦ及びＴＧＦ−β（第７図−（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））のいずれも、対照群に比べて顕著に濃度が上昇した。これに対し、ＨＧＦ投与群では、これらの濃度の上昇が全て有意に抑制された。一方ＩＬ−１２濃度は、対照群に比べ、生理食塩水投与群では低下したが、ＨＧＦ投与群では有意に上昇した（第６図−（ｄ））。
（６）肺組織中におけるＴＧＦ−βの蓄積
（２）の肺胞洗浄後の左肺を７０％エタノールで１２時間脱水した。脱水した左肺をパラフィン固定後、（３）と同様に組織検体スライドを作製した。組織検体に抗ＴＧＦ−βウサギＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を吸着させ（１：２５０）、次いで、アビジン−ビオチン免疫染色を施し、組織内のＴＧＦ−βを明視化し、顕微鏡下（最終倍率×１，０００）で観察した。
抗ＴＧＦ−βウサギＩｇＧの吸着は、４℃、１２時間で行い、アビジン−ビオチン処理は、室温で６０分間行った。パーオキシダーゼ標識ポリマー試薬の反応は遮光下で、室温、１５分間行った。
その結果、生理食塩水投与群（第８図−（ｂ））においては、対照群（第８図−（ａ））に比べて気道上皮及び炎症細胞の殆どが染色され、細胞内においてＴＧＦ−βが産生されていることが確認された。これに対し、ＨＧＦ投与群（第８図−（ｃ））では、染色された細胞の数が生理食塩水投与群に比べて少なく、ＴＧＦ−βの産生が抑制されていることが確認された。
（７）血清中抗原特異的ＩｇＥ抗体（抗ＯＶＡＩｇＥ）量の測定
各群のマウスの下大静脈より、血液サンプルを採取し、４℃、１，５００ｒｐｍで２０分遠心し、血清サンプルを作製した。
９６ウェルのプレート（ＮＵＮＣ ＩＭＭＵＮＯＰＬＡＴＥ Ｉ：Ｎｕｎｃ）に、５μｇ／ｍＬのモノクローナル抗マウスＩｇＥ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を含むＰＢＳ希釈液を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃にて１晩反応させてプレートをコートした。その後、各ウエルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（−）（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない）（洗浄用バッファー）にて５回洗浄し、１％ＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）−ＰＢＳを１５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温にて１時間インキュベートした。ついで、洗浄用バッファーにて５回洗浄し、各群のマウスの血清サンプルを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、室温にて１時間インキュベートした。同時に、標準曲線作成用として、あらかじめ総ＩｇＥ抗体量測定の系で定量したモノクローナル抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体を、１％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（希釈バッファー）で各種濃度に希釈して、同一プレートの別のウエルに加えた。各ウエルを洗浄バッファーで５回洗浄した後、希釈バッファーで５０倍に希釈したビオチン標識ＯＶＡを１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、さらに室温で１時間インキュベートした。各ウエルを、洗浄バッファーで５回洗浄し、希釈バッファーで３０００倍に希釈したパーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＤＡＫＯ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、さらに室温で１時間インキュベートした。各ウエルを、洗浄バッファーで５回洗浄し、基質溶液（０．１Ｍ クエン酸、０．２Ｍ ＮａＨＰＯ４、Ｏ−フェニレンジアミン、及び３０％Ｈ２Ｏ２を含む。）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加えて、室温暗所にて約３０分間反応させた後、プレートの各ウエルの吸光度を４９２ｎｍで測定した。
結果を第９図に示す。生理食塩水投与群においては、抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度が、対照群に比べて著しく上昇した。これに対し、ＨＧＦ投与群では、抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度の上昇が抑制された。
【産業上の利用可能性】
本発明の喘息の予防・治療剤は、気道の炎症時に確認される炎症細胞の気道上皮及び上皮下への浸潤、Ｔｈ２サイトカイン及びグロースファクター等の気道組織内での濃度上昇等を抑制し、気管支喘息における炎症反応を極めて有効に抑制することができ、慢性喘息或いは重症・難治性喘息への移行を予防することができる。しかも、その有効成分を生体由来のＨＧＦ又はそのＨＧＦをコードするＤＮＡとすることから、生体に投与しても、従来のステロイド吸入において見られる様な副作用がない。従って本発明の喘息の予防・治療剤は、生体に非常に安全で有用である。
本出願は日本で出願された特願２００３−０８６２６８を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦ又はその塩を有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤。
【請求項２】
ＨＧＦが、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチド又はこれらの部分ペプチドであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項３】
ＨＧＦをコードするＤＮＡを有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤。
【請求項４】
ＨＧＦをコードするＤＮＡが、配列番号：３又は４で表される塩基配列又は配列番号：３又は４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項５】
ＨＧＦをコードするＤＮＡが、組換え発現ベクターに挿入されていることを特徴とする請求の範囲第３項又は第４項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項６】
組換え発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＺｅｏＳＶであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項７】
組換え発現ベクターが、更に宿主細胞に含まれていることを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項８】
ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＨＧＦをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターが、リポソーム又はマイクロカプセルに含まれていることを特徴とする請求の範囲第３項〜第７項のいずれかに記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項９】
更に薬剤学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の喘息の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１０】
ＨＧＦ又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することにより気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療方法。
【請求項１１】
ＨＧＦをコードするＤＮＡの有効量を、哺乳動物に投与することにより気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療方法。
【請求項１２】
気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療剤の製造のためのＨＧＦ又はその塩の使用。
【請求項１３】
気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療剤の製造のためのＨＧＦをコードするＤＮＡの使用。
【請求項１】
ＨＧＦ又はその塩を有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤。
【請求項２】
ＨＧＦが、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号：１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチド又はこれらの部分ペプチドであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項３】
ＨＧＦをコードするＤＮＡを有効成分として含有する喘息の予防又は治療剤。
【請求項４】
ＨＧＦをコードするＤＮＡが、配列番号：３又は４で表される塩基配列又は配列番号：３又は４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項５】
ＨＧＦをコードするＤＮＡが、組換え発現ベクターに挿入されていることを特徴とする請求の範囲第３項又は第４項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項６】
組換え発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＺｅｏＳＶであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項７】
組換え発現ベクターが、更に宿主細胞に含まれていることを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項８】
ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はＨＧＦをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターが、リポソーム又はマイクロカプセルに含まれていることを特徴とする請求の範囲第３項〜第７項のいずれかに記載の喘息の予防又は治療剤。
【請求項９】
更に薬剤学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の喘息の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１０】
ＨＧＦ又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することにより気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療方法。
【請求項１１】
ＨＧＦをコードするＤＮＡの有効量を、哺乳動物に投与することにより気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療方法。
【請求項１２】
気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療剤の製造のためのＨＧＦ又はその塩の使用。
【請求項１３】
気道の炎症を抑制することを特徴とする喘息の予防又は治療剤の製造のためのＨＧＦをコードするＤＮＡの使用。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８４９３４
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４０９１（Ｐ２００５−５０４０９１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４１３３
【国際出願日】平成１６年３月２４日（２００４．３．２４）
【出願人】（５０２０６８９０８）クリングルファーマ株式会社 (16)
【出願人】（５９１１１５０７３）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４１３３
【国際出願日】平成１６年３月２４日（２００４．３．２４）
【出願人】（５０２０６８９０８）クリングルファーマ株式会社 (16)
【出願人】（５９１１１５０７３）
【Ｆターム（参考）】
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