器官原基形成方法、及び器官原基
【課題】生体内培養を必要とすることなく、生体外培養において、器官原基を形成することができる器官原基形成方法、及び該器官原基形成方法により形成された器官原基の提供。
【解決手段】本発明の器官原基形成方法は、アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚子様構造体を形成する胚子様構造体形成工程と、
を含むことを特徴とする。
【解決手段】本発明の器官原基形成方法は、アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚子様構造体を形成する胚子様構造体形成工程と、
を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アーリーＥＳ細胞を用いた器官原基形成方法、及び器官原基に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、機能障害又は機能不全に陥った器官の機能を回復させることを目的とした、再生医療技術が注目されている。この技術分野では、機能障害等を有する器官と代替可能な、人工器官の提供が望まれている。この種の人工器官には、正常な機能を備えることと共に、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）（生体内培養）を介さない技術によって形成されていることが求められる。何故ならば、異種・同種移植を介して形成された器官には、免疫拒絶、ウイルス等の感染の危険性があるからである。
そのため、そのような感染等の問題のない、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）（生体外培養）において、器官形成することが求められている。
【０００３】
例えば、歯科領域においても、歯の再生が望まれており、人工的な歯の原基の形成方法が提案されている。非特許文献１では、生後六ヶ月齢のブタの未萌出の第三大臼歯から得られた、歯胚由来の多種類の細胞を含む細胞懸濁液を、歯の形に整形した生分解吸収ポリマーに播種して、人工歯胚を調製し、この人工歯胚を、血流が豊富であり、栄養及び酸素の供給が十分得られるラットの大網（腹腔内にある脂肪の膜）に異種移植することによって、生体内培養に基づく技術が提案され、移植から２５〜３０週間後に、エナメル質、象牙質、歯髄等の小さな歯牙様組織が移植体中で確認されている。
【０００４】
また、非特許文献２では、上皮−間葉相互作用に着目して、歯の発生のプロセスを再現する手法が提案されている。この非特許文献２では、胎齢１０日目のマウス胎仔から採取した歯胚上皮と、歯胚由来ではない３種類の幹細胞を、歯胚間葉の代わりとして組み合わせて人工歯胚を作製している。その作製に続いて、人工歯胚を成体マウスの腎臓の被膜下に同種移植して、生体内培養により１２日間成長させることによって、歯を形成している。
【０００５】
上記非特許文献１及び２に示されるように、これまでは、生体内培養を必要とする歯の原基の形成方法のみが知られていた。また、非特許文献３に示されるように、生体外培養では、完全な歯や骨の形成は不可能であるため、異種・同種移植（生体内培養）に頼らざるを得ないのが現状であった。
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｏｕｎｇ ＣＳ，Ｔｅｒａｄａ Ｓ， Ｖａｃａｎｔｉ ＪＰ， Ｈｏｎｄａ Ｍ， Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＪＤ， Ｙｅｌｉｃｋ ＰＣ， Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｏｏｔｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｎ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ；Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ，８１，６９５−７００，２００２
【非特許文献２】Ｍｏｄｉｎｏ ＳＡ，Ｓｈａｒｐｅ ＰＴ； Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｒｉｎｇ ｏｆ ｔｅｅｔｈ ｕｓｉｎｇ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； Ａｒｃｈ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ，５０，２５５−２５８，２００５
【非特許文献３】日本歯科医師会雑誌、Ｖｏｌ． ６０、Ｎｏ． ７、２００７−１０、６５７−６７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記した従来の諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、生体内培養を必要とすることなく、生体外培養において、器官原基を形成することができる器官原基形成方法、及び該器官原基形成方法により形成された器官原基を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、本発明者らは、アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成し、前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養することにより、胚子様構造体中に器官原基を形成できることを知見し、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 器官原基形成方法であって、
アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚子様構造体を形成する胚子様構造体形成工程と、
を含むことを特徴とする器官原基形成方法である。
＜２＞ 器官原基が、歯の原基である前記＜１＞に記載の器官原基形成方法である。
＜３＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法により得られることを特徴とする器官原基である。
＜４＞ 器官原基が、歯の原基である前記＜３＞に記載の器官原基である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、前記従来の諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、生体内培養を必要とすることなく、生体外培養において、器官原基を形成することができる器官原基形成方法、及び該器官原基形成方法により形成された器官原基を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（器官原基形成方法、及び器官原基）
＜器官原基形成方法＞
本発明の器官原基形成方法は、胚様体形成工程と、胚子様構造体形成工程とを少なくとも含み、必要に応じて、摘出工程などのその他の工程を含んでなる。
【００１２】
−胚様体形成工程−
前記胚様体形成工程は、アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成する工程である。
【００１３】
−−アーリーＥＳ細胞（ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）−−
前記アーリーＥＳ細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス、ラットなどの齧歯類由来の幹細胞、ブタ、サルやヒトなどの霊長類由来の幹細胞、あるいは、前記動物由来のＥＳ細胞、人工多能性幹細胞、組織由来多能性幹細胞などの幹細胞を用いることができる。
前記アーリーＥＳ細胞の取得方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｉｓｈｉｗａｔａ Ｉ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ Ｃｅｌｌ １４， ２８３−２９１， ２００１．に記載の方法により、取得することができる。
【００１４】
−−培養液−−
前記胚様体形成工程の培養液は、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分（以下、「ＥＴＦｓ（Ｅｍｂｒｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じてその他の成分を含んでいる。
前記培養液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＨＡＭ Ｆ１２、α−ＭＥＭ、などが挙げられる。
【００１５】
−−−ＥＴＦｓ−−−
前記ＥＴＦｓの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト子宮頸部の扁平上皮癌細胞株（ＳＫＧ−ＩＩ）由来の無血清増殖株（ＳＫＧ−ＩＩ−ＳＦ）を培養し、その培養液を脱塩後、凍結乾燥する方法が挙げられる。
前記ＥＴＦｓに含まれる成分としては、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＩＧＦ−ＢＰ−３、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、などが挙げられる。
前記各成分のＥＴＦｓ中の一般的な含有量としては、例えば、以下が挙げられる。
ＩＬ−１α（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α）・・・≦３．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）・・・１００ｐｇ／ｍＬ〜２００ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３）・・・≦３１ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４）・・・≦２．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−５（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）・・・５０ｐｇ／ｍＬ〜１５０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９）・・・４００ｐｇ／ｍＬ〜５００ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２）・・・≦７．８ｐｇ／ｍＬ
ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）・・・０．５ｎｇ／ｍＬ〜２．０ｎｇ／ｍＬ
ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＴＧＦ−α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−Ｉ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ｉ）・・・≦６．３ｎｇ／ｍＬ
ＧＨ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）・・・０．１ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ−ＡＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＢ）・・・４５０ｐｇ／ｍＬ〜５５０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−ＢＰ−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３）・・・≦０．２μｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２）・・・３５ｐｇ／ｍＬ〜４５ｐｇ／ｍＬ
ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）・・・１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ
ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）・・・２５ｐｇ／ｍＬ〜３５ｐｇ／ｍＬ
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）・・・０．５ｎｇ／ｍＬ〜１．５ｎｇ／ｍＬ
【００１６】
前記培養液中における前記ＥＴＦｓの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１体積％〜１２体積％が好ましく、５体積％〜１０体積％がより好ましい。前記ＥＴＦｓの含有量が、１体積％未満、又は、１２体積％より大きいとアーリーＥＳ細胞の培養が困難となることがある。一方、前記ＥＴＦｓの含有量が、前記より好ましい範囲内であると、胚様体の形成効率が良い点で有利である。
なお、前記ＥＴＦｓに代えて、前記ＥＴＦｓに含まれる各成分の市販品を培養液に添加してもよい。
【００１７】
前記培養液に含まれるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、非必須アミノ酸溶液、ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン、Ｌ−グルタミン酸、アスコルビン酸、などが挙げられる。
【００１８】
−−培養−−
前記胚様体形成工程の培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、懸濁培養法が好ましい。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３７℃が好ましい。
前記胚様体形成工程の培養の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。通常、懸濁培養法により２４時間〜４８時間で胚様体が形成される。
【００１９】
−胚子様構造体形成工程−
前記胚子様構造体形成工程は、前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚子様構造体を形成する工程である。
これにより、胚子様構造体中に器官原基を形成することができる。
【００２０】
−−培養液−−
前記胚子様構造体形成工程の培養液は、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分（以下、「ＥＴＦｓ（Ｅｍｂｒｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じてその他の成分を含んでいる。
【００２１】
前記培養液、ＥＴＦｓ、その他の成分は、上述の胚様体形成工程の培養液と同様のものを用いることができる。
【００２２】
前記培養液中における前記ＥＴＦｓの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１体積％〜１２体積％が好ましく、５体積％〜１０体積％がより好ましい。前記ＥＴＦｓの含有量が、１体積％未満、又は、１２体積％より大きいと歯の原基の形成が困難となることがある。一方、前記ＥＴＦｓの含有量が、前記より好ましい範囲内であると、歯の原基の形成効率が良い点で有利である。
なお、前記ＥＴＦｓに代えて、前記ＥＴＦｓに含まれる各成分の市販品を培養液に添加してもよい。
【００２３】
−−培養−−
前記胚子様構造体形成工程の培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、灌流培養法が好ましい。
図６に、前記灌流培養法に用いる装置の一例の模式図を示す。図６中、６１は、灌流培養における空気（５％ ＣＯ２、９５％ ａｉｒ）を示し、該空気の流れを矢印で示す。また、６２は、培養液を示し、該培養液の流れを矢印で示す。なお、６３は、ポリテトラフルオロエチレンチューブを示し、６４は、デュアルポンプを示し、６５は、ローズチャンバーを示す。
また、図７Ａ、及び図７Ｂにローズチャンバーの一例の模式図を示す。図７Ａは、ローズチャンバーの正面図（前から見た図）である。図７Ａ中、７１は、雲母を示し、７２は、カバーガラスを示し、７３は、シリコンガスケットを示す。図７Ｂは、ローズチャンバーの平面図（上から見た図）である。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３７℃が好ましい。
前記胚子様構造体形成工程の培養の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。通常、１ヶ月程で完全な胚子様構造体が形成される。
【００２４】
前記胚子様構造体内に形成される器官原基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯、脳・脊髄、心臓、肺、気管、肝臓、膵臓（ラ島を含む）、腎臓、消化管、下垂体、甲状腺、骨、軟骨、表皮、毛包、網膜、水晶体などの原基が挙げられる。中でも、歯の原基が好適に形成される。
【００２５】
＜その他の工程＞
−摘出工程−
前記摘出工程は、前記胚子様構造体から器官原基を摘出する工程である。
前記摘出の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
＜器官原基＞
本発明の器官原基形成方法によって得ることができる上記器官原基は、再生医療の原料として好適に用いることができる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
＜マウス アーリーＥＳ細胞を用いた器官原基の形成＞
−マウス アーリーＥＳ細胞の準備−
マウス アーリーＥＳ細胞は、Ｉｓｈｉｗａｔａ Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｃｅｌｌ １４， ２８３−２９１， ２００１．に記載の方法に従って準備した。
受精後、通法により過排卵処理をしたマウスの卵管から、２細胞期胚を採取した（図１）。前記２細胞期胚を、ＥＴＦｓを添加した培養液中で単層培養し、３胚葉胚（図２の２１）を誘導した。前記３胚葉胚の胚外に成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）した小型球形細胞群（図２の２２）を濾紙法にてコロニアルクローニング（ｃｏｌｏｎｉａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）し、マウス アーリーＥＳ細胞を得た。
【００２９】
−胚様体形成工程−
前記マウス アーリーＥＳ細胞を、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に下記組成のＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、３７℃で４８〜７２時間、懸濁培養（１×１０６個／ｄｒｏｐ）し、胚様体を得た。
図３、図４は、懸濁培養の説明図である。図４中、４１は、アーリーＥＳ細胞塊を示す。
【００３０】
−−ＥＴＦｓ−−
前記ＥＴＦｓは、ヒト子宮頸部の扁平上皮癌細胞株（ＳＫＧ−ＩＩ）の無血清増殖株（ＳＫＧ−ＩＩ−ＳＦ、理化学研究所バイオリソースセンター細胞銀行、登録番号ＲＣＢ０６８５）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で４日間静置培養し、その順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を凍結乾燥、限外濾過により脱塩し、調製した。
前記天然ＥＴＦｓには、次の成分が含まれていた。
ＩＬ−１α ・・・ ≦３．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１β ・・・ １６３ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−２ ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−３ ・・・ ≦３１ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−４ ・・・ ≦２．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−５ ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−６ ・・・ １０４ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−９ ・・・ ４５３ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１０ ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１２ ・・・ ≦７．８ｐｇ／ｍＬ
ＥＧＦ ・・・ １．３ｎｇ／ｍＬ
ＴＮＦ−α ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＴＧＦ−α ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−Ｉ ・・・ ≦６．３ｎｇ／ｍＬ
ＧＨ ・・・ ０．１７ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ−ＡＢ ・・・ ５１０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−ＢＰ−３ ・・・ ≦０．２μｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−２ ・・・ ３７ｐｇ／ｍＬ
ＶＥＧＦ ・・・ ≧１，０００ｐｇ／ｍＬ
ＬＩＦ ・・・ ３１ｐｇ／ｍＬ
ＨＧＦ ・・・ １．１ｎｇ／ｍＬ
【００３１】
−胚子様構造体形成工程−
前記胚様体を、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に上記組成のＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、３７℃で、灌流培養した。
図５は、本実施例で用いた灌流培養装置の説明図である。図５中、５１は培養液交換用ウィンドウを示し、５２は装置内温度維持センサーを示し、５３は培養チャンバー・チャンバーラックを示し、５４は灌流用ポンプを示し、５５は保温ヒーター付き培養液ボトルを示す。
前記培養２８日後には、胚子様構造体の形成が確認された（図８）。また、胚子様構造体内には、表皮・毛包（図９）、気管（図１０）、心臓（図１１）、網膜（図１２）、神経管（図１３）、消化管（図１４）、骨・軟骨（図１５）、歯（図１６〜図１８）の原基の形成が確認された。
なお、図９中、矢印は、毛包（毛の原基）を示す。図１０中、矢印は、気管上皮の線毛を示す。図１１中、１１１は、心筋層を示し、１１２は、弁を示す。図１２中、１２１は、網膜神経細胞層を示し、１２２は、網膜の色素上皮層（メラニン色素の沈着）を示す。図１５中、１５１は、骨を示し、１５２は、軟骨を示す。図１６中、１６１は、歯冠形成期（前期）の歯胚を示す。図１８中、１８１は、エナメル質を示し、１８２は、象牙質を示し、１８３は、エナメル芽細胞を示し、１８４は、象牙芽細胞を示す。
【００３２】
上記に示したように、マウス アーリーＥＳ細胞から、生体外培養により、器官原基を形成できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の器官原基形成方法は、生体外培養において、器官原基を形成することができる。また、本発明の器官原基は、その構成細胞を全て含んでいるため、本来の器官が有する機能を全て得ることが可能である。したがって、再生医療の原料として好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、マウスの卵管から採取した２細胞期胚の説明図である。
【図２】図２は、単層培養により誘導された３胚葉胚の説明図である。
【図３】図３は、懸濁培養法の一例の説明図である。
【図４】図４は、図３の囲みＡ部分を拡大した説明図である。
【図５】図５は、灌流培養装置の一例の説明図（写真）である。
【図６】図６は、灌流培養装置の一例の説明図（模式図）である。
【図７Ａ】図７Ａは、ローズチャンバーの一例の正面図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ローズチャンバーの一例の平面図である。
【図８】図８は、実施例１の培養２８日後の胚子様構造体の一例を示す説明図である。
【図９】図９は、実施例１の胚子様構造体中の表皮・毛包の原基を示す説明図である。
【図１０】図１０は、実施例１の胚子様構造体中の気管の原基を示す説明図である。
【図１１】図１１は、実施例１の胚子様構造体中の心臓の原基を示す説明図である。
【図１２】図１２は、実施例１の胚子様構造体中の網膜の原基を示す説明図である。
【図１３】図１３は、実施例１の胚子様構造体中の神経管の原基を示す説明図である。
【図１４】図１４は、実施例１の胚子様構造体中の消化管の原基を示す説明図である。
【図１５】図１５は、実施例１の胚子様構造体中の骨・軟骨の原基を示す説明図である。
【図１６】図１６は、実施例１の胚子様構造体中の歯の原基（歯冠形成期（前期））を示す説明図である。
【図１７】図１７は、実施例１の胚子様構造体中の歯の原基（歯冠形成期（後期））を示す説明図である。
【図１８】図１８は、図１７の囲みＢ部分を拡大した説明図である。
【符号の説明】
【００３５】
２１ ３胚葉胚
２２ 小型球形細胞群
４１ アーリーＥＳ細胞塊
５１ 培養液交換用ウィンドウ
５２ 装置内温度維持センサー
５３ 培養チャンバー・チャンバーラック
５４ 灌流用ポンプ
５５ 保温ヒーター付培養液ボトル
６１ 空気（５％ ＣＯ２、９５％ ａｉｒ）
６２ 培養液
６３ ポリテトラフルオロエチレン チューブ
６４ デュアル ポンプ
６５ ローズ チャンバー
７１ 雲母
７２ カバーガラス
７３ シリコンガスケット
１１１ 心筋層
１１２ 弁
１２１ 網膜神経細胞層
１２２ 網膜の色素上皮層（メラニン色素の沈着）
１５１ 骨
１５２ 軟骨
１６１ 歯冠形成期（前期）の歯胚
１８１ エナメル質
１８２ 象牙質
１８３ エナメル芽細胞
１８４ 象牙芽細胞
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アーリーＥＳ細胞を用いた器官原基形成方法、及び器官原基に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、機能障害又は機能不全に陥った器官の機能を回復させることを目的とした、再生医療技術が注目されている。この技術分野では、機能障害等を有する器官と代替可能な、人工器官の提供が望まれている。この種の人工器官には、正常な機能を備えることと共に、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）（生体内培養）を介さない技術によって形成されていることが求められる。何故ならば、異種・同種移植を介して形成された器官には、免疫拒絶、ウイルス等の感染の危険性があるからである。
そのため、そのような感染等の問題のない、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）（生体外培養）において、器官形成することが求められている。
【０００３】
例えば、歯科領域においても、歯の再生が望まれており、人工的な歯の原基の形成方法が提案されている。非特許文献１では、生後六ヶ月齢のブタの未萌出の第三大臼歯から得られた、歯胚由来の多種類の細胞を含む細胞懸濁液を、歯の形に整形した生分解吸収ポリマーに播種して、人工歯胚を調製し、この人工歯胚を、血流が豊富であり、栄養及び酸素の供給が十分得られるラットの大網（腹腔内にある脂肪の膜）に異種移植することによって、生体内培養に基づく技術が提案され、移植から２５〜３０週間後に、エナメル質、象牙質、歯髄等の小さな歯牙様組織が移植体中で確認されている。
【０００４】
また、非特許文献２では、上皮−間葉相互作用に着目して、歯の発生のプロセスを再現する手法が提案されている。この非特許文献２では、胎齢１０日目のマウス胎仔から採取した歯胚上皮と、歯胚由来ではない３種類の幹細胞を、歯胚間葉の代わりとして組み合わせて人工歯胚を作製している。その作製に続いて、人工歯胚を成体マウスの腎臓の被膜下に同種移植して、生体内培養により１２日間成長させることによって、歯を形成している。
【０００５】
上記非特許文献１及び２に示されるように、これまでは、生体内培養を必要とする歯の原基の形成方法のみが知られていた。また、非特許文献３に示されるように、生体外培養では、完全な歯や骨の形成は不可能であるため、異種・同種移植（生体内培養）に頼らざるを得ないのが現状であった。
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｏｕｎｇ ＣＳ，Ｔｅｒａｄａ Ｓ， Ｖａｃａｎｔｉ ＪＰ， Ｈｏｎｄａ Ｍ， Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＪＤ， Ｙｅｌｉｃｋ ＰＣ， Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｏｏｔｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｎ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ；Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ，８１，６９５−７００，２００２
【非特許文献２】Ｍｏｄｉｎｏ ＳＡ，Ｓｈａｒｐｅ ＰＴ； Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｒｉｎｇ ｏｆ ｔｅｅｔｈ ｕｓｉｎｇ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； Ａｒｃｈ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ，５０，２５５−２５８，２００５
【非特許文献３】日本歯科医師会雑誌、Ｖｏｌ． ６０、Ｎｏ． ７、２００７−１０、６５７−６７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記した従来の諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、生体内培養を必要とすることなく、生体外培養において、器官原基を形成することができる器官原基形成方法、及び該器官原基形成方法により形成された器官原基を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、本発明者らは、アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成し、前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養することにより、胚子様構造体中に器官原基を形成できることを知見し、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 器官原基形成方法であって、
アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚子様構造体を形成する胚子様構造体形成工程と、
を含むことを特徴とする器官原基形成方法である。
＜２＞ 器官原基が、歯の原基である前記＜１＞に記載の器官原基形成方法である。
＜３＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法により得られることを特徴とする器官原基である。
＜４＞ 器官原基が、歯の原基である前記＜３＞に記載の器官原基である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、前記従来の諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、生体内培養を必要とすることなく、生体外培養において、器官原基を形成することができる器官原基形成方法、及び該器官原基形成方法により形成された器官原基を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（器官原基形成方法、及び器官原基）
＜器官原基形成方法＞
本発明の器官原基形成方法は、胚様体形成工程と、胚子様構造体形成工程とを少なくとも含み、必要に応じて、摘出工程などのその他の工程を含んでなる。
【００１２】
−胚様体形成工程−
前記胚様体形成工程は、アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成する工程である。
【００１３】
−−アーリーＥＳ細胞（ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）−−
前記アーリーＥＳ細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス、ラットなどの齧歯類由来の幹細胞、ブタ、サルやヒトなどの霊長類由来の幹細胞、あるいは、前記動物由来のＥＳ細胞、人工多能性幹細胞、組織由来多能性幹細胞などの幹細胞を用いることができる。
前記アーリーＥＳ細胞の取得方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｉｓｈｉｗａｔａ Ｉ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ Ｃｅｌｌ １４， ２８３−２９１， ２００１．に記載の方法により、取得することができる。
【００１４】
−−培養液−−
前記胚様体形成工程の培養液は、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分（以下、「ＥＴＦｓ（Ｅｍｂｒｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じてその他の成分を含んでいる。
前記培養液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＨＡＭ Ｆ１２、α−ＭＥＭ、などが挙げられる。
【００１５】
−−−ＥＴＦｓ−−−
前記ＥＴＦｓの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト子宮頸部の扁平上皮癌細胞株（ＳＫＧ−ＩＩ）由来の無血清増殖株（ＳＫＧ−ＩＩ−ＳＦ）を培養し、その培養液を脱塩後、凍結乾燥する方法が挙げられる。
前記ＥＴＦｓに含まれる成分としては、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＩＧＦ−ＢＰ−３、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、などが挙げられる。
前記各成分のＥＴＦｓ中の一般的な含有量としては、例えば、以下が挙げられる。
ＩＬ−１α（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α）・・・≦３．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）・・・１００ｐｇ／ｍＬ〜２００ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３）・・・≦３１ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４）・・・≦２．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−５（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）・・・５０ｐｇ／ｍＬ〜１５０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９）・・・４００ｐｇ／ｍＬ〜５００ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２）・・・≦７．８ｐｇ／ｍＬ
ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）・・・０．５ｎｇ／ｍＬ〜２．０ｎｇ／ｍＬ
ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＴＧＦ−α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−Ｉ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ｉ）・・・≦６．３ｎｇ／ｍＬ
ＧＨ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）・・・０．１ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ−ＡＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＢ）・・・４５０ｐｇ／ｍＬ〜５５０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−ＢＰ−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３）・・・≦０．２μｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２）・・・３５ｐｇ／ｍＬ〜４５ｐｇ／ｍＬ
ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）・・・１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ
ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）・・・２５ｐｇ／ｍＬ〜３５ｐｇ／ｍＬ
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）・・・０．５ｎｇ／ｍＬ〜１．５ｎｇ／ｍＬ
【００１６】
前記培養液中における前記ＥＴＦｓの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１体積％〜１２体積％が好ましく、５体積％〜１０体積％がより好ましい。前記ＥＴＦｓの含有量が、１体積％未満、又は、１２体積％より大きいとアーリーＥＳ細胞の培養が困難となることがある。一方、前記ＥＴＦｓの含有量が、前記より好ましい範囲内であると、胚様体の形成効率が良い点で有利である。
なお、前記ＥＴＦｓに代えて、前記ＥＴＦｓに含まれる各成分の市販品を培養液に添加してもよい。
【００１７】
前記培養液に含まれるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、非必須アミノ酸溶液、ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン、Ｌ−グルタミン酸、アスコルビン酸、などが挙げられる。
【００１８】
−−培養−−
前記胚様体形成工程の培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、懸濁培養法が好ましい。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３７℃が好ましい。
前記胚様体形成工程の培養の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。通常、懸濁培養法により２４時間〜４８時間で胚様体が形成される。
【００１９】
−胚子様構造体形成工程−
前記胚子様構造体形成工程は、前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚子様構造体を形成する工程である。
これにより、胚子様構造体中に器官原基を形成することができる。
【００２０】
−−培養液−−
前記胚子様構造体形成工程の培養液は、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分（以下、「ＥＴＦｓ（Ｅｍｂｒｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じてその他の成分を含んでいる。
【００２１】
前記培養液、ＥＴＦｓ、その他の成分は、上述の胚様体形成工程の培養液と同様のものを用いることができる。
【００２２】
前記培養液中における前記ＥＴＦｓの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１体積％〜１２体積％が好ましく、５体積％〜１０体積％がより好ましい。前記ＥＴＦｓの含有量が、１体積％未満、又は、１２体積％より大きいと歯の原基の形成が困難となることがある。一方、前記ＥＴＦｓの含有量が、前記より好ましい範囲内であると、歯の原基の形成効率が良い点で有利である。
なお、前記ＥＴＦｓに代えて、前記ＥＴＦｓに含まれる各成分の市販品を培養液に添加してもよい。
【００２３】
−−培養−−
前記胚子様構造体形成工程の培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、灌流培養法が好ましい。
図６に、前記灌流培養法に用いる装置の一例の模式図を示す。図６中、６１は、灌流培養における空気（５％ ＣＯ２、９５％ ａｉｒ）を示し、該空気の流れを矢印で示す。また、６２は、培養液を示し、該培養液の流れを矢印で示す。なお、６３は、ポリテトラフルオロエチレンチューブを示し、６４は、デュアルポンプを示し、６５は、ローズチャンバーを示す。
また、図７Ａ、及び図７Ｂにローズチャンバーの一例の模式図を示す。図７Ａは、ローズチャンバーの正面図（前から見た図）である。図７Ａ中、７１は、雲母を示し、７２は、カバーガラスを示し、７３は、シリコンガスケットを示す。図７Ｂは、ローズチャンバーの平面図（上から見た図）である。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３７℃が好ましい。
前記胚子様構造体形成工程の培養の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。通常、１ヶ月程で完全な胚子様構造体が形成される。
【００２４】
前記胚子様構造体内に形成される器官原基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯、脳・脊髄、心臓、肺、気管、肝臓、膵臓（ラ島を含む）、腎臓、消化管、下垂体、甲状腺、骨、軟骨、表皮、毛包、網膜、水晶体などの原基が挙げられる。中でも、歯の原基が好適に形成される。
【００２５】
＜その他の工程＞
−摘出工程−
前記摘出工程は、前記胚子様構造体から器官原基を摘出する工程である。
前記摘出の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
＜器官原基＞
本発明の器官原基形成方法によって得ることができる上記器官原基は、再生医療の原料として好適に用いることができる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
＜マウス アーリーＥＳ細胞を用いた器官原基の形成＞
−マウス アーリーＥＳ細胞の準備−
マウス アーリーＥＳ細胞は、Ｉｓｈｉｗａｔａ Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｃｅｌｌ １４， ２８３−２９１， ２００１．に記載の方法に従って準備した。
受精後、通法により過排卵処理をしたマウスの卵管から、２細胞期胚を採取した（図１）。前記２細胞期胚を、ＥＴＦｓを添加した培養液中で単層培養し、３胚葉胚（図２の２１）を誘導した。前記３胚葉胚の胚外に成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）した小型球形細胞群（図２の２２）を濾紙法にてコロニアルクローニング（ｃｏｌｏｎｉａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）し、マウス アーリーＥＳ細胞を得た。
【００２９】
−胚様体形成工程−
前記マウス アーリーＥＳ細胞を、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に下記組成のＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、３７℃で４８〜７２時間、懸濁培養（１×１０６個／ｄｒｏｐ）し、胚様体を得た。
図３、図４は、懸濁培養の説明図である。図４中、４１は、アーリーＥＳ細胞塊を示す。
【００３０】
−−ＥＴＦｓ−−
前記ＥＴＦｓは、ヒト子宮頸部の扁平上皮癌細胞株（ＳＫＧ−ＩＩ）の無血清増殖株（ＳＫＧ−ＩＩ−ＳＦ、理化学研究所バイオリソースセンター細胞銀行、登録番号ＲＣＢ０６８５）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で４日間静置培養し、その順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を凍結乾燥、限外濾過により脱塩し、調製した。
前記天然ＥＴＦｓには、次の成分が含まれていた。
ＩＬ−１α ・・・ ≦３．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１β ・・・ １６３ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−２ ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−３ ・・・ ≦３１ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−４ ・・・ ≦２．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−５ ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−６ ・・・ １０４ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−９ ・・・ ４５３ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１０ ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１２ ・・・ ≦７．８ｐｇ／ｍＬ
ＥＧＦ ・・・ １．３ｎｇ／ｍＬ
ＴＮＦ−α ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＴＧＦ−α ・・・ ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−Ｉ ・・・ ≦６．３ｎｇ／ｍＬ
ＧＨ ・・・ ０．１７ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ−ＡＢ ・・・ ５１０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−ＢＰ−３ ・・・ ≦０．２μｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−２ ・・・ ３７ｐｇ／ｍＬ
ＶＥＧＦ ・・・ ≧１，０００ｐｇ／ｍＬ
ＬＩＦ ・・・ ３１ｐｇ／ｍＬ
ＨＧＦ ・・・ １．１ｎｇ／ｍＬ
【００３１】
−胚子様構造体形成工程−
前記胚様体を、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に上記組成のＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、３７℃で、灌流培養した。
図５は、本実施例で用いた灌流培養装置の説明図である。図５中、５１は培養液交換用ウィンドウを示し、５２は装置内温度維持センサーを示し、５３は培養チャンバー・チャンバーラックを示し、５４は灌流用ポンプを示し、５５は保温ヒーター付き培養液ボトルを示す。
前記培養２８日後には、胚子様構造体の形成が確認された（図８）。また、胚子様構造体内には、表皮・毛包（図９）、気管（図１０）、心臓（図１１）、網膜（図１２）、神経管（図１３）、消化管（図１４）、骨・軟骨（図１５）、歯（図１６〜図１８）の原基の形成が確認された。
なお、図９中、矢印は、毛包（毛の原基）を示す。図１０中、矢印は、気管上皮の線毛を示す。図１１中、１１１は、心筋層を示し、１１２は、弁を示す。図１２中、１２１は、網膜神経細胞層を示し、１２２は、網膜の色素上皮層（メラニン色素の沈着）を示す。図１５中、１５１は、骨を示し、１５２は、軟骨を示す。図１６中、１６１は、歯冠形成期（前期）の歯胚を示す。図１８中、１８１は、エナメル質を示し、１８２は、象牙質を示し、１８３は、エナメル芽細胞を示し、１８４は、象牙芽細胞を示す。
【００３２】
上記に示したように、マウス アーリーＥＳ細胞から、生体外培養により、器官原基を形成できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の器官原基形成方法は、生体外培養において、器官原基を形成することができる。また、本発明の器官原基は、その構成細胞を全て含んでいるため、本来の器官が有する機能を全て得ることが可能である。したがって、再生医療の原料として好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、マウスの卵管から採取した２細胞期胚の説明図である。
【図２】図２は、単層培養により誘導された３胚葉胚の説明図である。
【図３】図３は、懸濁培養法の一例の説明図である。
【図４】図４は、図３の囲みＡ部分を拡大した説明図である。
【図５】図５は、灌流培養装置の一例の説明図（写真）である。
【図６】図６は、灌流培養装置の一例の説明図（模式図）である。
【図７Ａ】図７Ａは、ローズチャンバーの一例の正面図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ローズチャンバーの一例の平面図である。
【図８】図８は、実施例１の培養２８日後の胚子様構造体の一例を示す説明図である。
【図９】図９は、実施例１の胚子様構造体中の表皮・毛包の原基を示す説明図である。
【図１０】図１０は、実施例１の胚子様構造体中の気管の原基を示す説明図である。
【図１１】図１１は、実施例１の胚子様構造体中の心臓の原基を示す説明図である。
【図１２】図１２は、実施例１の胚子様構造体中の網膜の原基を示す説明図である。
【図１３】図１３は、実施例１の胚子様構造体中の神経管の原基を示す説明図である。
【図１４】図１４は、実施例１の胚子様構造体中の消化管の原基を示す説明図である。
【図１５】図１５は、実施例１の胚子様構造体中の骨・軟骨の原基を示す説明図である。
【図１６】図１６は、実施例１の胚子様構造体中の歯の原基（歯冠形成期（前期））を示す説明図である。
【図１７】図１７は、実施例１の胚子様構造体中の歯の原基（歯冠形成期（後期））を示す説明図である。
【図１８】図１８は、図１７の囲みＢ部分を拡大した説明図である。
【符号の説明】
【００３５】
２１ ３胚葉胚
２２ 小型球形細胞群
４１ アーリーＥＳ細胞塊
５１ 培養液交換用ウィンドウ
５２ 装置内温度維持センサー
５３ 培養チャンバー・チャンバーラック
５４ 灌流用ポンプ
５５ 保温ヒーター付培養液ボトル
６１ 空気（５％ ＣＯ２、９５％ ａｉｒ）
６２ 培養液
６３ ポリテトラフルオロエチレン チューブ
６４ デュアル ポンプ
６５ ローズ チャンバー
７１ 雲母
７２ カバーガラス
７３ シリコンガスケット
１１１ 心筋層
１１２ 弁
１２１ 網膜神経細胞層
１２２ 網膜の色素上皮層（メラニン色素の沈着）
１５１ 骨
１５２ 軟骨
１６１ 歯冠形成期（前期）の歯胚
１８１ エナメル質
１８２ 象牙質
１８３ エナメル芽細胞
１８４ 象牙芽細胞
【特許請求の範囲】
【請求項１】
器官原基形成方法であって、
アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚子様構造体を形成する胚子様構造体形成工程と、
を含むことを特徴とする器官原基形成方法。
【請求項２】
器官原基が、歯の原基である請求項１に記載の器官原基形成方法。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載の方法により得られることを特徴とする器官原基。
【請求項４】
器官原基が、歯の原基である請求項３に記載の器官原基。
【請求項１】
器官原基形成方法であって、
アーリーＥＳ細胞を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分を含む培養液中で培養し、胚子様構造体を形成する胚子様構造体形成工程と、
を含むことを特徴とする器官原基形成方法。
【請求項２】
器官原基が、歯の原基である請求項１に記載の器官原基形成方法。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載の方法により得られることを特徴とする器官原基。
【請求項４】
器官原基が、歯の原基である請求項３に記載の器官原基。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１０−４７５１０（Ｐ２０１０−４７５１０Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１２５９３（Ｐ２００８−２１２５９３）
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年２月２２日 日本再生医療学会発行の「再生医療 第７巻／増刊号［通巻２７号］２００８ （第７回日本再生医療学会総会 プログラム・抄録）」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月２０日 株式会社羊土社発行の「実験医学 第２６巻 第５号［通巻４１３号］２００８ （再生医療へ進む最先端の幹細胞研究 注目のｉＰＳ・ＥＳ・間葉系幹細胞などの分化・誘導の基礎と、各種疾患への臨床応用）」に発表
【出願人】（５０２３９７３６９）学校法人 日本歯科大学 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年２月２２日 日本再生医療学会発行の「再生医療 第７巻／増刊号［通巻２７号］２００８ （第７回日本再生医療学会総会 プログラム・抄録）」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月２０日 株式会社羊土社発行の「実験医学 第２６巻 第５号［通巻４１３号］２００８ （再生医療へ進む最先端の幹細胞研究 注目のｉＰＳ・ＥＳ・間葉系幹細胞などの分化・誘導の基礎と、各種疾患への臨床応用）」に発表
【出願人】（５０２３９７３６９）学校法人 日本歯科大学 (20)
【Ｆターム（参考）】
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