培養細胞の電気シグナル計測デバイスおよび該デバイスを用いる電気シグナル計測方法
【課題】培養細胞を良好な状態に保ち、その電気シグナルの計測をリアルタイムでかつ高精度に行うことができる電気シグナル計測デバイスおよび該デバイスを用いる電気シグナル計測方法を提供する。
【解決手段】半透膜３によって二つに区分けされたコンパートメントが内部に設けられた支持体２に電極が設けられた培養細胞の電気シグナル計測デバイス１であって、前記コンパートメントは、半透膜３により上部コンパートメント４と下部コンパートメント５に区分けされ、上部コンパートメント４には上部電極６１が設けられ、下部コンパートメント５には、該上部電極６１に対向して対向面６２１が半透膜３に接触して下部電極６２が設けられており、上部コンパートメント４と下部コンパートメント５に別々に流体を灌流させる上部灌流用流路および下部灌流用流路が支持体２に設けられている培養細胞の電気シグナル計測デバイス１。
【解決手段】半透膜３によって二つに区分けされたコンパートメントが内部に設けられた支持体２に電極が設けられた培養細胞の電気シグナル計測デバイス１であって、前記コンパートメントは、半透膜３により上部コンパートメント４と下部コンパートメント５に区分けされ、上部コンパートメント４には上部電極６１が設けられ、下部コンパートメント５には、該上部電極６１に対向して対向面６２１が半透膜３に接触して下部電極６２が設けられており、上部コンパートメント４と下部コンパートメント５に別々に流体を灌流させる上部灌流用流路および下部灌流用流路が支持体２に設けられている培養細胞の電気シグナル計測デバイス１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞に電界を印加した時のインピーダンス等の電流応答を、リアルタイムで高精度に計測することができる電気シグナル計測デバイスおよび該デバイスを用いる電気シグナル計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
接着性の培養細胞あるいは該培養細胞が形成する組織の状態を、非侵襲的にリアルタイムに解析することは、各種疾病の発病メカニズムの解析や、創薬研究を行う上で極めて有用な手段である。そして、より有用な情報を得るためには、ミクロレベルで高精度に解析できることが必要となる。医療、創薬に関わる分野においてはまさに、このような解析が可能であるマイクロ流体デバイスの開発が強く望まれている。
【０００３】
一般的に、培養細胞あるいは該培養細胞が形成する組織の構造や内部状態を詳細に解析するためには、解析時に培養細胞を良好な状態に保つことと、高精度な解析手法を採用することの双方が求められる。
そして従来は、解析手法として、例えば、培養細胞の電気抵抗や電気的インピーダンスをリアルタイムで計測する手法が用いられてきている。特に、インピーダンスを計測する手法は、リアルタイムにかつ非侵襲的に培養細胞に関するより多くの情報が得られるため有用である。このような培養細胞のインピーダンスを計測する手法として、例えば、微細加工技術により薄膜平面上に電極をパターニングしたデバイスを用いる方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｌｉｎｄｅｒｈｏｌｍ，Ｐ．，Ｂｒｏｕａｒｄ，Ｍ．，Ｂａｒｒａｎｄｏｎ，Ｙ．，Ｒｅｎａｕｄ，Ｐ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｒｒａｙ．ＸＩＩ ＩＣＥＢＩ ２００４ Ｇｄａｎｓｋ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、非特許文献１に記載の方法をはじめ従来の方法は、培養細胞の良好な状態での保持と、高精度な解析の双方を両立したものではなく、より詳細な情報を得るためには精度が不十分であるという問題点があった。これは、細胞の培養に用いる装置が、生体内の環境条件を反映したものではなく、生体内とは大きく異なる環境であるため培養細胞を良好な状態に保つことができないことと、インピーダンス等の計測に用いる電極の形状や配置状態が、微弱な電気信号を測定するために適したものではないことが理由であった。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、培養細胞を良好な状態に保ちつつ、その電気シグナルの計測をリアルタイムでかつ高精度に行うことができる電気シグナル計測デバイスおよび該デバイスを用いる電気シグナル計測方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意研究した結果、生体内に近い環境を再現できる細胞培養デバイスを開発し、該デバイス内に設けた半透膜上で細胞を培養し、該半透膜の上下に培養細胞を挟むようにして電極を所定の条件で配置して、培養細胞に電界を印加することで、培養細胞を良好な状態に保ちつつ電気シグナルの計測をリアルタイムにかつ高精度に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、前記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、半透膜によって二つに区分けされたコンパートメントが内部に設けられた支持体に、電極が設けられている培養細胞の電気シグナル計測デバイスであって、前記コンパートメントは、前記半透膜により上部コンパートメントおよび下部コンパートメントに区分けされ、上部コンパートメントには上部電極が設けられ、下部コンパートメントには、該上部電極に対向して、対向面が前記半透膜に接触して下部電極が設けられており、上部コンパートメントと下部コンパートメントに別々に流体を灌流させるための上部灌流用流路および下部灌流用流路が支持体に設けられていることを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項２に記載の発明は、前記上部電極の下部電極に対向する面と、前記半透膜の上部電極に対向する面との距離が１ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項３に記載の発明は、前記上部電極および下部電極の測定面の厚みが、０．５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項４に記載の発明は、前記上部電極および下部電極の材質が金メッキされた真鍮であり、これら電極の測定面の形状が、直径３ｍｍ以下の円形であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項５に記載の発明は、前記支持体の材質が、ポリジメチルシロキサンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項６に記載の発明は、インピーダンス計測用である請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項７に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスが、基板上に複数設けられていることを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測アレイである。
請求項８に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスを用いて、培養細胞の電気シグナルを計測する方法であって、上部コンパートメント側の半透膜上の、上部電極と下部電極との間の位置に細胞を導入し、上部コンパートメントに流体を、下部コンパートメントに培養液を別々に灌流させながら半透膜上で前記細胞を培養し、上部電極および下部電極より培養細胞に電界を印加して得られる培養細胞の電流応答を計測することを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、培養細胞を良好な状態に保ちつつ、その電気シグナルの計測をリアルタイムにかつ高精度に行うことができる
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を、図面を参照しながら詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施形態に何ら限定されるものではない。
図１は、本発明の培養細胞の電気シグナル計測デバイス（以下、デバイスと略記することがある）の、一実施形態を示す縦断面図である。
本発明のデバイス１は、支持体２内部に、半透膜３によって区分けされた上部コンパートメント４と下部コンパートメント５が設けられている。支持体２上部に貫通して設けられている穴を介して、上部コンパートメント４には上部電極６１が設けられ、支持体２下部に貫通して設けられている穴を介して、下部コンパートメント５には下部電極６２が設けられている。上部電極６１および下部電極６２は対向して配置され、これらが一対の電極を構成しており、これら電極間に載置された培養細胞７に電界を印加して、培養細胞の電気シグナルが計測できるようになっている。
【００１０】
上部電極６１は、その下部電極に対向する面６１１と反対側の面（すなわち、支持体上部対向面）６１２が、支持体２上部の内表面２１１と接触するように設けられている。しかし、本発明においては、必ずしもこのように接触している必要はなく、培養細胞７の電気シグナルの計測精度を損なわない範囲で、上部電極６１の支持体上部対向面６１２が内表面２１１から離間するように、上部電極６１を設けても良い。
【００１１】
上部電極６１は、培養細胞７に接触しないように設けることが好ましい。
また、上部電極６１の下部電極に対向する面６１１と、前記半透膜３の上部電極に対向する面３１との距離は１ｍｍ以下であることが好ましい。
上部電極６１をこのような好ましい配置状態とすることによって、培養細胞７の電気シグナル計測精度をより向上させることができる。
【００１２】
上部コンパートメント４の高さ、すなわち、支持体２上部の内表面２１１と、半透膜３の上部電極に対向する面３１との距離は、１ｍｍ以下であることが好ましい。
また、上部コンパートメント４の高さは、培養細胞７の大きさの１．５倍〜５倍であることが好ましく、１．５倍〜２倍であることがより好ましい。
このような距離にすることで、下部コンパートメント５内を還流する培養液から供給される栄養成分や酸素の濃度を、上部コンパートメント４内において高く維持することができ、細胞培養環境を実際の生体内に近い環境とすることができて、細胞の培養を良好に行うことができる。
【００１３】
下部コンパートメント５の高さ、すなわち、支持体２下部の内表面２２１と、半透膜３の下部電極に対向する面３２との距離は、特に限定されない。
【００１４】
下部電極６２は、上部電極６１に対向してその対向面６２１が、半透膜３の下部電極対向面３２に接触して設けられている。この時の、接触面にかかる圧力は特に限定されず、下部電極６２と半透膜３との間に培養液が灌流しなければ、半透膜３が傷つかない範囲で任意に選択することができる。このように、下部電極６２を半透膜３に接触させて設けて、下部電極６２と半透膜３との間を培養液が灌流しないようにすることで、インピーダンス等の電気シグナルの計測を高感度かつ高精度に行うことができる。
【００１５】
上部電極６１および下部電極６２の測定面の厚み、すなわち、上部電極６１であればその下部電極に対向する面６１１と支持体上部対向面６１２との間の厚さ、下部電極６２であれば、その上部電極に対向する面６２１と支持体２下部に対向する面６２２との間の厚さは、それぞれ０．５ｍｍ以下であることが好ましい。
【００１６】
上部電極６１および下部電極６２の形状は特に限定されない。
また、上部電極６１および下部電極６２の材質も、電界を印加できるものであれば特に限定されず、従来公知のものを用いれば良い。好ましい材質としては、例えば、金メッキされた真鍮、白金、チタン合金、金、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ Ｔｉｎ Ｏｘｉｄｅ：インジウム錫酸化物）等を挙げることができる。
これらの中でも、上部電極６１および下部電極６２として、材質が金メッキされた真鍮であり、これら電極の測定面の形状が、直径３ｍｍ以下の円形であるものを好ましいものとして挙げることができる。このような好ましい材質および形状のものとして、釘状のものが市販されており、入手が容易である。
なお、本発明においては、図１に示した支持体２上部の内表面２１１のうち上部電極６１が接触している面、および／または半透膜３上の下部電極６２が接触している面の上に、真空蒸着などの方法により前記材質からなる金属薄膜を形成し、これを電極として用いても良い。
【００１７】
半透膜３は、支持体２内部のコンパートメントを上部コンパートメント４と下部コンパートメント５とに区分けするように、支持体２に固定されて設けられている。また半透膜３は、品質が劣化した時に容易に交換できるよう、支持体２に対して着脱可能とされていることが好ましい。
そして、半透膜３上の上部コンパートメント４側で、細胞の培養が行われる。
【００１８】
半透膜３としては、細胞が浸潤せず、例えば、下部コンパートメント５内を灌流する培養液中の栄養成分や酸素等、あるいは上部コンパートメント４内の培養細胞７からの老廃物等の物質の交換が行われる孔径のものが用いられる。具体的には、半透膜３の孔径は、０．４μｍ以上、３μｍ未満であることが好ましく、０．４μｍ以上、１μｍ以下であることが好ましい。このように、下限を０．４μｍ以上とすることで、上部コンパートメント４と下部コンパートメント５との間の物質交換が速やかに行われる。
また、半透膜３の材質としては、培養細胞７に対して適合性を有するものであれば特に限定されず、例えば、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。
半透膜３の厚さは、培養細胞７の電気シグナル計測精度を損なわない範囲であれば特に限定されないが、物質交換を極力速やかに行うため、１０〜２０μｍの範囲内であることが好ましい。
このようなものとして、具体的には、例えば、一般的に透析膜、精密濾過等に用いられる半透膜として市販されているものを用いることができる。
【００１９】
支持体２の材質としては、培養細胞７に対して適合性を有するものであれば特に限定されない。
好ましい材質としては、外気中の酸素を透過させてデバイス１内の培養液や流体に供給することができる、酸素透過性材料が挙げられる。酸素透過性材料としては、培養細胞７に対して適合性を有するものであれば従来公知の任意の酸素透過性材料を用いることができ、例えば、酸素透過性コンタクトレンズ等に用いられている生体適合性の酸素透過性材料等を挙げることができる。特に、透明性を有するものであれば、外側からデバイス内の培養細胞７を観察できるためより好ましい。
酸素透過性材料として、具体的には、例えば、生体適合性のシリコーンゴムが挙げられる。なかでも、生体適合性および透明性を有し、さらに安価な材料であることからポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳと略記する）が好ましい。
【００２０】
支持体２には、上部コンパートメント４と下部コンパートメント５に別々に流体を灌流させるための上部灌流用流路（図示略）および下部灌流用流路（図示略）が設けられている。これら流路は、例えば、上部コンパートメント４と下部コンパートメント５の所定の場所に設けられた穴に、それぞれ配管（図示略）等を接続することで設けることができる。配管の材質は特に限定されない。
下部コンパートメント５に流体として細胞培養に必要な培養液を灌流させて、半透膜３を介して栄養成分や酸素等を培養細胞７に供給し、培養細胞７から排出された老廃物等を下部コンパートメント５から排出させるため、本発明においては、下部灌流用流路として、培養液供給用流路および培養液排出用流路を別々に下部コンパートメント５に設けることが好ましい。
また、培養液の組成は、培養する細胞の種類に応じて適宜選択すれば良い。
【００２１】
また、上部コンパートメント４においては、上部灌流用流路を介して、流体を持続的または間欠的に灌流できるようになっている。上部コンパートメント４内の流体を灌流させることにより、半透膜３上の培養細胞７に流動が付加され、これにより、細胞培養部位の環境が実際の生体内の環境に近づき、細胞の培養を良好に行うことができる。また、上部灌流用流路を介して、培養細胞７の培養環境（ｐＨ、グルコース濃度、生理活性物質濃度等）のモニタリングを行うこともできる。
上部コンパートメント４に灌流させる流体としては、培養細胞７に悪影響を与えないものであれば特に限定されないが、培養液が好ましい。
【００２２】
本発明のデバイス１を用いて電気シグナルを計測する培養細胞７の種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すれば良い。例えば、小腸由来Ｃａｃｏ−２細胞は本発明に好適である。
【００２３】
本発明のデバイス１は、上部電極６１および下部電極６２を、外部電極（図示略）に電気的に接続することで、培養細胞の電気シグナル計測に用いることができる。例えば、これら電極を直流電源に接続すれば培養細胞の電気抵抗値を計測することができ、交流電源に接続すれば培養細胞のインピーダンスを計測することができる。すなわち、目的に応じて接続する外部電極を選択すれば良い。
【００２４】
本発明のデバイス１は極めて小さく、構造も単純であるため、例えば、複数個を同一の基板上に設けて電気シグナル計測アレイとして用いることもできる。この時の基板の種類、アレイ化する方法、アレイの形態等は特に限定されず、目的に応じて選択することができる。このような電気シグナル計測アレイは、多数のサンプルのスクリーニング等に好適に用いられる。
【００２５】
本発明のデバイス１は、例えば、以下のように作製することができる。すなわち、上部電極６１挿通用の穴および上部灌流用流路接続用の穴をそれぞれ設けた所定の形状の上側支持体２１と、下部電極６２挿通用の穴および下部灌流用流路接続用の穴をそれぞれ設けた所定の形状の下側支持体２２を作製する。次いで、上側支持体２１に上部電極６１を挿通し、下側支持体２２に下部電極６２を挿通した後、上部電極６１と下部電極６２とが対向するように、上側支持体２１と下側支持体２２の端部を、半透膜３を挟んで張り合わせる。この時、下部電極６２は、その上部電極対向面６２１が半透膜３に接触してこれらの間に隙間ができないように位置決めを行う。そして、上部灌流用流路接続用の穴および下部灌流用流路接続用の穴に配管を接続して、支持体２に上部灌流用流路および下部灌流用流路を設ければ、本発明のデバイス１が得られる。
このように本発明のデバイス１は、構造が単純であり、上部電極６１および下部電極６２として、市販の釘状のものを用いることもできるため、容易に作製することができる。
【００２６】
本発明のデバイス１を用いて、培養細胞の電気シグナルは以下のように計測される。すなわち、上部コンパートメント４側の半透膜３上の、上部電極６１と下部電極６２との間の位置に細胞を導入し、上部コンパートメント４に流体を、下部コンパートメント５に培養液を別々に灌流させながら半透膜３上で前記細胞を培養し、上部電極６１および下部電極６２より培養細胞７に電界を印加して、その結果得られる培養細胞７の電流応答を計測する。本発明のデバイス１を外部の直流電源に接続して電界を印加すれば、培養細胞の電気抵抗値を計測することができ、交流電源に接続すれば、培養細胞のインピーダンスを計測することができる。インピーダンスを計測することで、培養細胞に関するより多くの情報が得られる。
【００２７】
培養細胞に電界を印加する条件は特に限定されず、計測目的、培養細胞の種類に応じて適宜選択すれば良い。
【００２８】
電気シグナルの計測を行う時は、細胞培養を停止する必要はなく、培養中の細胞をリアルタイムで計測することができる。例えば、培養細胞成長過程、培養細胞の膜構造等の組織形成過程をリアルタイムで計測することができる。また、上部コンパートメント４での流体の灌流と下部コンパートメント５での培養液の灌流とは別々に行われるため、例えば、上部コンパートメント４に薬物等を添加すれば、この薬物等に対する培養細胞の応答もリアルタイムで計測することができる。
【００２９】
本発明のデバイス１においては、上述のように上部コンパートメント４で流体を灌流させ、下部コンパートメント５で培養液を灌流させることにより、下部コンパートメント５から半透膜３を介して栄養成分や酸素等が培養細胞７に供給されると同時に、培養細胞７から排出された老廃物等が半透膜３を介して下部コンパートメント５に回収される。すなわち、半透膜３上の培養細胞７に対し、栄養成分や酸素が一定の方向から供給され、培養細胞７から排出された老廃物等も一定の方向から回収されることになり、血管等を介して栄養成分や酸素の供給と老廃物等の排出を行う、実際の生体内の環境と類似した環境を再現することができ、細胞の培養を良好に行うことができる。
【００３０】
なお、ここで言う灌流とは、単に流体が流れることを指し、流体が一定方向に流れるいわゆる還流や、流体の流れる方向が逐次変化するものも含まれる。ただし、下部コンパートメント５においては、前述のように下部灌流用流路として、培養液供給用流路および培養液排出用流路を別々に設けて、培養液を一定方向に持続的に還流させることが好ましい。
このようにすることで、培養細胞７に対する栄養成分や酸素の供給と、培養細胞７から排出された老廃物等のデバイス１外への排出を効率的に行うことができ、細胞の培養をより良好に行うことができる。
【００３１】
上部コンパートメント４内の流体の流速および下部コンパートメント５内の培養液の流速は、細胞培養を阻害せず、培養細胞の電気シグナル計測精度を損なわない範囲であれば、特に限定されない。
【００３２】
下部コンパートメント５で灌流させている培養液は、培養細胞から排出された老廃物や分泌物等を除去するために、少なくとも３〜４日毎に交換することが好ましい。
【００３３】
その他の細胞の培養条件および培養方法は、用いる細胞の種類に応じて適宜選択すれば良く、特に限定されない。
【００３４】
以上述べたように、本発明のデバイスでは、下部電極を半透膜に接触させて設けて、下部電極と半透膜との間を培養液が灌流しないようにすることで、インピーダンス等の電気シグナルの計測を高感度かつ高精度に行うことができる。
上部コンパートメントでの流体の灌流と下部コンパートメントでの培養液の灌流とは別々に行われるため、例えば、上部コンパートメントに薬物等を添加すれば、この薬物等に対する培養細胞の応答もリアルタイムで計測することができる。
上部コンパートメントの高さが低く、好ましくは１ｍｍ以下とすることで、半透膜上の細胞を良好に培養することができる。
そして、本発明のデバイスは極めて小さく構造も単純であるため、複数個を同一の基板上に設けて、容易に電気シグナル計測アレイとして用いることもでき、多数のサンプルのスクリーニング等に好適である。
このような本発明のデバイスを用いることで、抵抗値だけでなくインピーダンス計測が可能であり、半透膜上の培養細胞を非侵襲的にリアルタイムで解析することができ、より多くの情報が得られる。
【実施例】
【００３５】
以下、具体的実施例により本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
◎インピーダンス計測による培養細胞の膜状構造形成の確認
図１に示す本発明のデバイスを用いて、小腸由来Ｃａｃｏ−２細胞の培養を行いながら、該細胞のインピーダンス計測を行った。
用いたデバイスは、具体的には、以下のようなものである。すなわち、支持体はＰＤＭＳ製であり、支持体内のコンパートメントのサイズ（上部コンパートメントと下部コンパートメントを合わせたサイズ）は縦１５ｍｍ、横６ｍｍ、高さ１．６ｍｍである。これを、孔径０．４μｍ、厚さ１４μｍのポリエステル製多孔質膜（コーニング社製、コード３４５０）を半透膜として用いて、区分けして、上部コンパートメント、下部コンパートメントの高さを共に約０．８ｍｍとした。
上部電極および下部電極として、長さ１５ｍｍ、外径０．５ｍｍで、頭部が厚さ０．４ｍｍ、直径１．２ｍｍの円形状である金メッキされた真鍮製の釘状のものを、頭部の平坦面を測定面として用いた。また、上部電極は、下部電極に対抗する面と反対側の面を上側支持体内面に接触させて支持体に固定し、下部電極は、上部電極に対抗する面を半透膜に接触させて支持体に固定した。この時、上部電極の下部電極に対抗する面と半透膜との間の距離は０．４ｍｍであった。そして、これら電極を交流電源に接続した。
【００３６】
細胞の培養条件およびインピーダンスの計測条件は以下の通りである。
培養条件：培養液として、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）に１０%ウシ胎仔血清、１%ＭＥＭ可欠アミノ酸溶液、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１００規定／ｍＬペニシリン、１００μｇストレプトマイシン、１μｇアンフォテリシンを加えたものを使用し、周囲温度を３７℃、二酸化炭素濃度を５％に保った条件で培養を行った。
計測条件：計測は、市販のインピーダンスアナライザーを用いて、１Ｈｚ〜１０ＭＨｚの周波数帯について１０ｍＶ振幅の交流電場を電極間に印加して行った。
【００３７】
培養液は２日ごとに交換し、培養液交換の前後にインピーダンス計測を行った。結果を図２に示す。なお、図２中の凡例において、例えば「３日」とは、細胞培養開始から３日目の培養液交換前のことを指し、例えば、「３日交換後」とは、細胞培養開始から３日目の培養液交換後のことを指す。
図２（ａ）は、計測したインピーダンスの振幅スペクトルであり、グラフ縦軸はインピーダンスの振幅の絶対値を示す。図２（ａ）より、培養開始から７日目までは細胞成長が確認された。そして９日目以降にインピーダンス振幅の顕著な増加（１８ＫΩ）が認められ、細胞間におけるタイトジャンクションの形成および細胞の膜状構造の形成が確認された。
【００３８】
また図２（ｂ）は、計測したインピーダンスの位相スペクトルであり、グラフ縦軸は位相（θ）を示す。図２（ｂ）より、培養開始から７日目までは、低周波数側への曲線のシフトと、特徴的な１０６Ｈｚ付近のピークの出現が認められ、この間の細胞成長が確認された。そして９日目以降は、低周波数側への顕著な曲線のシフトと、１０６Ｈｚ付近のθの顕著な減少（θ＝５０°）が認められ、培養細胞の膜状構造の形成が確認された。
以上により、本発明のデバイスを用いて培養細胞のインピーダンスを高精度にリアルタイムで測定することができ、細胞成長、細胞間のタイトジャンクションの形成、および細胞の膜状構造の形成を正確に確認することができた。
【００３９】
（実施例２）
◎インピーダンス計測による培養細胞への塩化第二銅（ＣｕＣｌ２）添加の影響の確認
実施例１で用いたデバイスを用いて、塩化第二銅を添加された小腸由来Ｃａｃｏ−２細胞の培養を行いながら、インピーダンス計測を行った。
細胞の培養条件およびインピーダンスの計測条件は実施例１と同様である。
【００４０】
培養液は２日ごとに交換し、培養液交換の前後にインピーダンス計測を行った。
そして、培養開始後７日目までは通常培養を行い、インピーダンス計測後、培養液に３０μＭの濃度となるように塩化第二銅を添加して、塩化第二銅添加直後（添加後０時間）から添加後４時間までそのまま細胞培養を継続した。４時間経過後にインピーダンスを計測し、塩化第二銅を含む培養液を、塩化第二銅を含まない培養液で洗い流すことにより、培養細胞をデバイス内部に残した状態で洗浄操作を行った。この間適宜、培養細胞のインピーダンスを計測した。その結果を図３に示す。なお、図３中の凡例において、例えば「３日」とは、細胞培養開始から３日目のことを指し、例えば、「７日添加後４時間」とは、細胞培養開始から７日目の塩化第二銅添加後４時間のことを指す。
【００４１】
図３（ａ）は、計測したインピーダンスの振幅スペクトルであり、グラフ縦軸はインピーダンスの振幅の絶対値を示す。培養開始後５日目に、インピーダンスの振幅が顕著に増加し、７日目に振幅が最大となっていることが認められた。すなわち、培養開始後３日目から５日目の間に、培養細胞の膜状構造の形成が起こっていることが確認された。
そして、７日目に塩化第二銅を添加してから４時間後までは、インピーダンスの振幅変化がほとんど認められず、膜状構造が機能していることが確認された。続いて、培養細胞を洗浄後にデバイスへ戻してから塩化第二銅添加の効果が表れ、添加後２５時間で、インピーダンスの振幅が低下していることが認められ、膜状構造の崩壊が確認された。そして添加後４８時間で再びインピーダンスの振幅増加が認められ、膜状構造が再生していること確認された。すなわち、塩化第二銅による培養細胞の膜状構造への添加効果は、時間経過とともに消失することが確認された。
【００４２】
また図３（ｂ）は、計測したインピーダンスの位相スペクトルであり、グラフ縦軸は位相（θ）を示す。培養開始後３日目から７日目にかけて、曲線の低周波数側へのシフトと、特徴的な１０６Ｈｚ付近のθの減少（θ＝−６２°）が認められ、培養細胞の膜状構造の形成が確認された。
そして７日目に塩化第二銅を添加してから４時間後までは、曲線に大きな変化はなく、膜状構造がそのまま機能していることが確認された。続いて、培養細胞を洗浄後にデバイスへ戻してから塩化第二銅添加の効果が表れ、添加後２５時間で、曲線の高周波数側へのシフトと、特徴的な１０６Ｈｚ付近のθの増加（θ＝−５３°）が認められ、膜状構造の崩壊が確認された。さらに添加後４８時間で、新たに曲線の低周波数側へのシフトと、特徴的な１０６Ｈｚ付近のθの減少（θ＝−５８°）が認められ、膜状構造の再生が確認された。すなわち、塩化第二銅の添加が培養細胞の膜状構造へおよぼす効果は、時間経過とともに消失することを、本発明のデバイスを用いて培養細胞のインピーダンスを高精度にリアルタイムで測定することで確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、細胞の培養条件の最適化、培養細胞の状態の観察はもとより、医薬品の創薬プロセスで重要な薬物動態解析や医薬品候補物質のスクリーニング、さらには化学物質の環境毒性の計測等、極めて広範囲の分野での利用に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の培養細胞の電気シグナル計測デバイスの一例を示す縦断面図である。
【図２】実施例１における培養細胞のインピーダンス計測結果を示すグラフであり、図２（ａ）はインピーダンスの振幅スペクトルであり、図２（ｂ）はインピーダンスの位相スペクトルである。
【図３】実施例２における培養細胞のインピーダンス計測結果を示すグラフであり、図３（ａ）はインピーダンスの振幅スペクトルであり、図３（ｂ）はインピーダンスの位相スペクトルである。
【符号の説明】
【００４５】
１・・・電気シグナル計測デバイス、２・・・支持体、３・・・半透膜、４・・・上部コンパートメント、５・・・下部コンパートメント、６１・・・上部電極、６２・・・下部電極、６２１・・・下部電極の上部電極対向面
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞に電界を印加した時のインピーダンス等の電流応答を、リアルタイムで高精度に計測することができる電気シグナル計測デバイスおよび該デバイスを用いる電気シグナル計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
接着性の培養細胞あるいは該培養細胞が形成する組織の状態を、非侵襲的にリアルタイムに解析することは、各種疾病の発病メカニズムの解析や、創薬研究を行う上で極めて有用な手段である。そして、より有用な情報を得るためには、ミクロレベルで高精度に解析できることが必要となる。医療、創薬に関わる分野においてはまさに、このような解析が可能であるマイクロ流体デバイスの開発が強く望まれている。
【０００３】
一般的に、培養細胞あるいは該培養細胞が形成する組織の構造や内部状態を詳細に解析するためには、解析時に培養細胞を良好な状態に保つことと、高精度な解析手法を採用することの双方が求められる。
そして従来は、解析手法として、例えば、培養細胞の電気抵抗や電気的インピーダンスをリアルタイムで計測する手法が用いられてきている。特に、インピーダンスを計測する手法は、リアルタイムにかつ非侵襲的に培養細胞に関するより多くの情報が得られるため有用である。このような培養細胞のインピーダンスを計測する手法として、例えば、微細加工技術により薄膜平面上に電極をパターニングしたデバイスを用いる方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｌｉｎｄｅｒｈｏｌｍ，Ｐ．，Ｂｒｏｕａｒｄ，Ｍ．，Ｂａｒｒａｎｄｏｎ，Ｙ．，Ｒｅｎａｕｄ，Ｐ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｒｒａｙ．ＸＩＩ ＩＣＥＢＩ ２００４ Ｇｄａｎｓｋ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、非特許文献１に記載の方法をはじめ従来の方法は、培養細胞の良好な状態での保持と、高精度な解析の双方を両立したものではなく、より詳細な情報を得るためには精度が不十分であるという問題点があった。これは、細胞の培養に用いる装置が、生体内の環境条件を反映したものではなく、生体内とは大きく異なる環境であるため培養細胞を良好な状態に保つことができないことと、インピーダンス等の計測に用いる電極の形状や配置状態が、微弱な電気信号を測定するために適したものではないことが理由であった。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、培養細胞を良好な状態に保ちつつ、その電気シグナルの計測をリアルタイムでかつ高精度に行うことができる電気シグナル計測デバイスおよび該デバイスを用いる電気シグナル計測方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意研究した結果、生体内に近い環境を再現できる細胞培養デバイスを開発し、該デバイス内に設けた半透膜上で細胞を培養し、該半透膜の上下に培養細胞を挟むようにして電極を所定の条件で配置して、培養細胞に電界を印加することで、培養細胞を良好な状態に保ちつつ電気シグナルの計測をリアルタイムにかつ高精度に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、前記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、半透膜によって二つに区分けされたコンパートメントが内部に設けられた支持体に、電極が設けられている培養細胞の電気シグナル計測デバイスであって、前記コンパートメントは、前記半透膜により上部コンパートメントおよび下部コンパートメントに区分けされ、上部コンパートメントには上部電極が設けられ、下部コンパートメントには、該上部電極に対向して、対向面が前記半透膜に接触して下部電極が設けられており、上部コンパートメントと下部コンパートメントに別々に流体を灌流させるための上部灌流用流路および下部灌流用流路が支持体に設けられていることを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項２に記載の発明は、前記上部電極の下部電極に対向する面と、前記半透膜の上部電極に対向する面との距離が１ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項３に記載の発明は、前記上部電極および下部電極の測定面の厚みが、０．５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項４に記載の発明は、前記上部電極および下部電極の材質が金メッキされた真鍮であり、これら電極の測定面の形状が、直径３ｍｍ以下の円形であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項５に記載の発明は、前記支持体の材質が、ポリジメチルシロキサンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項６に記載の発明は、インピーダンス計測用である請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスである。
請求項７に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスが、基板上に複数設けられていることを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測アレイである。
請求項８に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスを用いて、培養細胞の電気シグナルを計測する方法であって、上部コンパートメント側の半透膜上の、上部電極と下部電極との間の位置に細胞を導入し、上部コンパートメントに流体を、下部コンパートメントに培養液を別々に灌流させながら半透膜上で前記細胞を培養し、上部電極および下部電極より培養細胞に電界を印加して得られる培養細胞の電流応答を計測することを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、培養細胞を良好な状態に保ちつつ、その電気シグナルの計測をリアルタイムにかつ高精度に行うことができる
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を、図面を参照しながら詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施形態に何ら限定されるものではない。
図１は、本発明の培養細胞の電気シグナル計測デバイス（以下、デバイスと略記することがある）の、一実施形態を示す縦断面図である。
本発明のデバイス１は、支持体２内部に、半透膜３によって区分けされた上部コンパートメント４と下部コンパートメント５が設けられている。支持体２上部に貫通して設けられている穴を介して、上部コンパートメント４には上部電極６１が設けられ、支持体２下部に貫通して設けられている穴を介して、下部コンパートメント５には下部電極６２が設けられている。上部電極６１および下部電極６２は対向して配置され、これらが一対の電極を構成しており、これら電極間に載置された培養細胞７に電界を印加して、培養細胞の電気シグナルが計測できるようになっている。
【００１０】
上部電極６１は、その下部電極に対向する面６１１と反対側の面（すなわち、支持体上部対向面）６１２が、支持体２上部の内表面２１１と接触するように設けられている。しかし、本発明においては、必ずしもこのように接触している必要はなく、培養細胞７の電気シグナルの計測精度を損なわない範囲で、上部電極６１の支持体上部対向面６１２が内表面２１１から離間するように、上部電極６１を設けても良い。
【００１１】
上部電極６１は、培養細胞７に接触しないように設けることが好ましい。
また、上部電極６１の下部電極に対向する面６１１と、前記半透膜３の上部電極に対向する面３１との距離は１ｍｍ以下であることが好ましい。
上部電極６１をこのような好ましい配置状態とすることによって、培養細胞７の電気シグナル計測精度をより向上させることができる。
【００１２】
上部コンパートメント４の高さ、すなわち、支持体２上部の内表面２１１と、半透膜３の上部電極に対向する面３１との距離は、１ｍｍ以下であることが好ましい。
また、上部コンパートメント４の高さは、培養細胞７の大きさの１．５倍〜５倍であることが好ましく、１．５倍〜２倍であることがより好ましい。
このような距離にすることで、下部コンパートメント５内を還流する培養液から供給される栄養成分や酸素の濃度を、上部コンパートメント４内において高く維持することができ、細胞培養環境を実際の生体内に近い環境とすることができて、細胞の培養を良好に行うことができる。
【００１３】
下部コンパートメント５の高さ、すなわち、支持体２下部の内表面２２１と、半透膜３の下部電極に対向する面３２との距離は、特に限定されない。
【００１４】
下部電極６２は、上部電極６１に対向してその対向面６２１が、半透膜３の下部電極対向面３２に接触して設けられている。この時の、接触面にかかる圧力は特に限定されず、下部電極６２と半透膜３との間に培養液が灌流しなければ、半透膜３が傷つかない範囲で任意に選択することができる。このように、下部電極６２を半透膜３に接触させて設けて、下部電極６２と半透膜３との間を培養液が灌流しないようにすることで、インピーダンス等の電気シグナルの計測を高感度かつ高精度に行うことができる。
【００１５】
上部電極６１および下部電極６２の測定面の厚み、すなわち、上部電極６１であればその下部電極に対向する面６１１と支持体上部対向面６１２との間の厚さ、下部電極６２であれば、その上部電極に対向する面６２１と支持体２下部に対向する面６２２との間の厚さは、それぞれ０．５ｍｍ以下であることが好ましい。
【００１６】
上部電極６１および下部電極６２の形状は特に限定されない。
また、上部電極６１および下部電極６２の材質も、電界を印加できるものであれば特に限定されず、従来公知のものを用いれば良い。好ましい材質としては、例えば、金メッキされた真鍮、白金、チタン合金、金、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ Ｔｉｎ Ｏｘｉｄｅ：インジウム錫酸化物）等を挙げることができる。
これらの中でも、上部電極６１および下部電極６２として、材質が金メッキされた真鍮であり、これら電極の測定面の形状が、直径３ｍｍ以下の円形であるものを好ましいものとして挙げることができる。このような好ましい材質および形状のものとして、釘状のものが市販されており、入手が容易である。
なお、本発明においては、図１に示した支持体２上部の内表面２１１のうち上部電極６１が接触している面、および／または半透膜３上の下部電極６２が接触している面の上に、真空蒸着などの方法により前記材質からなる金属薄膜を形成し、これを電極として用いても良い。
【００１７】
半透膜３は、支持体２内部のコンパートメントを上部コンパートメント４と下部コンパートメント５とに区分けするように、支持体２に固定されて設けられている。また半透膜３は、品質が劣化した時に容易に交換できるよう、支持体２に対して着脱可能とされていることが好ましい。
そして、半透膜３上の上部コンパートメント４側で、細胞の培養が行われる。
【００１８】
半透膜３としては、細胞が浸潤せず、例えば、下部コンパートメント５内を灌流する培養液中の栄養成分や酸素等、あるいは上部コンパートメント４内の培養細胞７からの老廃物等の物質の交換が行われる孔径のものが用いられる。具体的には、半透膜３の孔径は、０．４μｍ以上、３μｍ未満であることが好ましく、０．４μｍ以上、１μｍ以下であることが好ましい。このように、下限を０．４μｍ以上とすることで、上部コンパートメント４と下部コンパートメント５との間の物質交換が速やかに行われる。
また、半透膜３の材質としては、培養細胞７に対して適合性を有するものであれば特に限定されず、例えば、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。
半透膜３の厚さは、培養細胞７の電気シグナル計測精度を損なわない範囲であれば特に限定されないが、物質交換を極力速やかに行うため、１０〜２０μｍの範囲内であることが好ましい。
このようなものとして、具体的には、例えば、一般的に透析膜、精密濾過等に用いられる半透膜として市販されているものを用いることができる。
【００１９】
支持体２の材質としては、培養細胞７に対して適合性を有するものであれば特に限定されない。
好ましい材質としては、外気中の酸素を透過させてデバイス１内の培養液や流体に供給することができる、酸素透過性材料が挙げられる。酸素透過性材料としては、培養細胞７に対して適合性を有するものであれば従来公知の任意の酸素透過性材料を用いることができ、例えば、酸素透過性コンタクトレンズ等に用いられている生体適合性の酸素透過性材料等を挙げることができる。特に、透明性を有するものであれば、外側からデバイス内の培養細胞７を観察できるためより好ましい。
酸素透過性材料として、具体的には、例えば、生体適合性のシリコーンゴムが挙げられる。なかでも、生体適合性および透明性を有し、さらに安価な材料であることからポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳと略記する）が好ましい。
【００２０】
支持体２には、上部コンパートメント４と下部コンパートメント５に別々に流体を灌流させるための上部灌流用流路（図示略）および下部灌流用流路（図示略）が設けられている。これら流路は、例えば、上部コンパートメント４と下部コンパートメント５の所定の場所に設けられた穴に、それぞれ配管（図示略）等を接続することで設けることができる。配管の材質は特に限定されない。
下部コンパートメント５に流体として細胞培養に必要な培養液を灌流させて、半透膜３を介して栄養成分や酸素等を培養細胞７に供給し、培養細胞７から排出された老廃物等を下部コンパートメント５から排出させるため、本発明においては、下部灌流用流路として、培養液供給用流路および培養液排出用流路を別々に下部コンパートメント５に設けることが好ましい。
また、培養液の組成は、培養する細胞の種類に応じて適宜選択すれば良い。
【００２１】
また、上部コンパートメント４においては、上部灌流用流路を介して、流体を持続的または間欠的に灌流できるようになっている。上部コンパートメント４内の流体を灌流させることにより、半透膜３上の培養細胞７に流動が付加され、これにより、細胞培養部位の環境が実際の生体内の環境に近づき、細胞の培養を良好に行うことができる。また、上部灌流用流路を介して、培養細胞７の培養環境（ｐＨ、グルコース濃度、生理活性物質濃度等）のモニタリングを行うこともできる。
上部コンパートメント４に灌流させる流体としては、培養細胞７に悪影響を与えないものであれば特に限定されないが、培養液が好ましい。
【００２２】
本発明のデバイス１を用いて電気シグナルを計測する培養細胞７の種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すれば良い。例えば、小腸由来Ｃａｃｏ−２細胞は本発明に好適である。
【００２３】
本発明のデバイス１は、上部電極６１および下部電極６２を、外部電極（図示略）に電気的に接続することで、培養細胞の電気シグナル計測に用いることができる。例えば、これら電極を直流電源に接続すれば培養細胞の電気抵抗値を計測することができ、交流電源に接続すれば培養細胞のインピーダンスを計測することができる。すなわち、目的に応じて接続する外部電極を選択すれば良い。
【００２４】
本発明のデバイス１は極めて小さく、構造も単純であるため、例えば、複数個を同一の基板上に設けて電気シグナル計測アレイとして用いることもできる。この時の基板の種類、アレイ化する方法、アレイの形態等は特に限定されず、目的に応じて選択することができる。このような電気シグナル計測アレイは、多数のサンプルのスクリーニング等に好適に用いられる。
【００２５】
本発明のデバイス１は、例えば、以下のように作製することができる。すなわち、上部電極６１挿通用の穴および上部灌流用流路接続用の穴をそれぞれ設けた所定の形状の上側支持体２１と、下部電極６２挿通用の穴および下部灌流用流路接続用の穴をそれぞれ設けた所定の形状の下側支持体２２を作製する。次いで、上側支持体２１に上部電極６１を挿通し、下側支持体２２に下部電極６２を挿通した後、上部電極６１と下部電極６２とが対向するように、上側支持体２１と下側支持体２２の端部を、半透膜３を挟んで張り合わせる。この時、下部電極６２は、その上部電極対向面６２１が半透膜３に接触してこれらの間に隙間ができないように位置決めを行う。そして、上部灌流用流路接続用の穴および下部灌流用流路接続用の穴に配管を接続して、支持体２に上部灌流用流路および下部灌流用流路を設ければ、本発明のデバイス１が得られる。
このように本発明のデバイス１は、構造が単純であり、上部電極６１および下部電極６２として、市販の釘状のものを用いることもできるため、容易に作製することができる。
【００２６】
本発明のデバイス１を用いて、培養細胞の電気シグナルは以下のように計測される。すなわち、上部コンパートメント４側の半透膜３上の、上部電極６１と下部電極６２との間の位置に細胞を導入し、上部コンパートメント４に流体を、下部コンパートメント５に培養液を別々に灌流させながら半透膜３上で前記細胞を培養し、上部電極６１および下部電極６２より培養細胞７に電界を印加して、その結果得られる培養細胞７の電流応答を計測する。本発明のデバイス１を外部の直流電源に接続して電界を印加すれば、培養細胞の電気抵抗値を計測することができ、交流電源に接続すれば、培養細胞のインピーダンスを計測することができる。インピーダンスを計測することで、培養細胞に関するより多くの情報が得られる。
【００２７】
培養細胞に電界を印加する条件は特に限定されず、計測目的、培養細胞の種類に応じて適宜選択すれば良い。
【００２８】
電気シグナルの計測を行う時は、細胞培養を停止する必要はなく、培養中の細胞をリアルタイムで計測することができる。例えば、培養細胞成長過程、培養細胞の膜構造等の組織形成過程をリアルタイムで計測することができる。また、上部コンパートメント４での流体の灌流と下部コンパートメント５での培養液の灌流とは別々に行われるため、例えば、上部コンパートメント４に薬物等を添加すれば、この薬物等に対する培養細胞の応答もリアルタイムで計測することができる。
【００２９】
本発明のデバイス１においては、上述のように上部コンパートメント４で流体を灌流させ、下部コンパートメント５で培養液を灌流させることにより、下部コンパートメント５から半透膜３を介して栄養成分や酸素等が培養細胞７に供給されると同時に、培養細胞７から排出された老廃物等が半透膜３を介して下部コンパートメント５に回収される。すなわち、半透膜３上の培養細胞７に対し、栄養成分や酸素が一定の方向から供給され、培養細胞７から排出された老廃物等も一定の方向から回収されることになり、血管等を介して栄養成分や酸素の供給と老廃物等の排出を行う、実際の生体内の環境と類似した環境を再現することができ、細胞の培養を良好に行うことができる。
【００３０】
なお、ここで言う灌流とは、単に流体が流れることを指し、流体が一定方向に流れるいわゆる還流や、流体の流れる方向が逐次変化するものも含まれる。ただし、下部コンパートメント５においては、前述のように下部灌流用流路として、培養液供給用流路および培養液排出用流路を別々に設けて、培養液を一定方向に持続的に還流させることが好ましい。
このようにすることで、培養細胞７に対する栄養成分や酸素の供給と、培養細胞７から排出された老廃物等のデバイス１外への排出を効率的に行うことができ、細胞の培養をより良好に行うことができる。
【００３１】
上部コンパートメント４内の流体の流速および下部コンパートメント５内の培養液の流速は、細胞培養を阻害せず、培養細胞の電気シグナル計測精度を損なわない範囲であれば、特に限定されない。
【００３２】
下部コンパートメント５で灌流させている培養液は、培養細胞から排出された老廃物や分泌物等を除去するために、少なくとも３〜４日毎に交換することが好ましい。
【００３３】
その他の細胞の培養条件および培養方法は、用いる細胞の種類に応じて適宜選択すれば良く、特に限定されない。
【００３４】
以上述べたように、本発明のデバイスでは、下部電極を半透膜に接触させて設けて、下部電極と半透膜との間を培養液が灌流しないようにすることで、インピーダンス等の電気シグナルの計測を高感度かつ高精度に行うことができる。
上部コンパートメントでの流体の灌流と下部コンパートメントでの培養液の灌流とは別々に行われるため、例えば、上部コンパートメントに薬物等を添加すれば、この薬物等に対する培養細胞の応答もリアルタイムで計測することができる。
上部コンパートメントの高さが低く、好ましくは１ｍｍ以下とすることで、半透膜上の細胞を良好に培養することができる。
そして、本発明のデバイスは極めて小さく構造も単純であるため、複数個を同一の基板上に設けて、容易に電気シグナル計測アレイとして用いることもでき、多数のサンプルのスクリーニング等に好適である。
このような本発明のデバイスを用いることで、抵抗値だけでなくインピーダンス計測が可能であり、半透膜上の培養細胞を非侵襲的にリアルタイムで解析することができ、より多くの情報が得られる。
【実施例】
【００３５】
以下、具体的実施例により本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
◎インピーダンス計測による培養細胞の膜状構造形成の確認
図１に示す本発明のデバイスを用いて、小腸由来Ｃａｃｏ−２細胞の培養を行いながら、該細胞のインピーダンス計測を行った。
用いたデバイスは、具体的には、以下のようなものである。すなわち、支持体はＰＤＭＳ製であり、支持体内のコンパートメントのサイズ（上部コンパートメントと下部コンパートメントを合わせたサイズ）は縦１５ｍｍ、横６ｍｍ、高さ１．６ｍｍである。これを、孔径０．４μｍ、厚さ１４μｍのポリエステル製多孔質膜（コーニング社製、コード３４５０）を半透膜として用いて、区分けして、上部コンパートメント、下部コンパートメントの高さを共に約０．８ｍｍとした。
上部電極および下部電極として、長さ１５ｍｍ、外径０．５ｍｍで、頭部が厚さ０．４ｍｍ、直径１．２ｍｍの円形状である金メッキされた真鍮製の釘状のものを、頭部の平坦面を測定面として用いた。また、上部電極は、下部電極に対抗する面と反対側の面を上側支持体内面に接触させて支持体に固定し、下部電極は、上部電極に対抗する面を半透膜に接触させて支持体に固定した。この時、上部電極の下部電極に対抗する面と半透膜との間の距離は０．４ｍｍであった。そして、これら電極を交流電源に接続した。
【００３６】
細胞の培養条件およびインピーダンスの計測条件は以下の通りである。
培養条件：培養液として、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）に１０%ウシ胎仔血清、１%ＭＥＭ可欠アミノ酸溶液、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１００規定／ｍＬペニシリン、１００μｇストレプトマイシン、１μｇアンフォテリシンを加えたものを使用し、周囲温度を３７℃、二酸化炭素濃度を５％に保った条件で培養を行った。
計測条件：計測は、市販のインピーダンスアナライザーを用いて、１Ｈｚ〜１０ＭＨｚの周波数帯について１０ｍＶ振幅の交流電場を電極間に印加して行った。
【００３７】
培養液は２日ごとに交換し、培養液交換の前後にインピーダンス計測を行った。結果を図２に示す。なお、図２中の凡例において、例えば「３日」とは、細胞培養開始から３日目の培養液交換前のことを指し、例えば、「３日交換後」とは、細胞培養開始から３日目の培養液交換後のことを指す。
図２（ａ）は、計測したインピーダンスの振幅スペクトルであり、グラフ縦軸はインピーダンスの振幅の絶対値を示す。図２（ａ）より、培養開始から７日目までは細胞成長が確認された。そして９日目以降にインピーダンス振幅の顕著な増加（１８ＫΩ）が認められ、細胞間におけるタイトジャンクションの形成および細胞の膜状構造の形成が確認された。
【００３８】
また図２（ｂ）は、計測したインピーダンスの位相スペクトルであり、グラフ縦軸は位相（θ）を示す。図２（ｂ）より、培養開始から７日目までは、低周波数側への曲線のシフトと、特徴的な１０６Ｈｚ付近のピークの出現が認められ、この間の細胞成長が確認された。そして９日目以降は、低周波数側への顕著な曲線のシフトと、１０６Ｈｚ付近のθの顕著な減少（θ＝５０°）が認められ、培養細胞の膜状構造の形成が確認された。
以上により、本発明のデバイスを用いて培養細胞のインピーダンスを高精度にリアルタイムで測定することができ、細胞成長、細胞間のタイトジャンクションの形成、および細胞の膜状構造の形成を正確に確認することができた。
【００３９】
（実施例２）
◎インピーダンス計測による培養細胞への塩化第二銅（ＣｕＣｌ２）添加の影響の確認
実施例１で用いたデバイスを用いて、塩化第二銅を添加された小腸由来Ｃａｃｏ−２細胞の培養を行いながら、インピーダンス計測を行った。
細胞の培養条件およびインピーダンスの計測条件は実施例１と同様である。
【００４０】
培養液は２日ごとに交換し、培養液交換の前後にインピーダンス計測を行った。
そして、培養開始後７日目までは通常培養を行い、インピーダンス計測後、培養液に３０μＭの濃度となるように塩化第二銅を添加して、塩化第二銅添加直後（添加後０時間）から添加後４時間までそのまま細胞培養を継続した。４時間経過後にインピーダンスを計測し、塩化第二銅を含む培養液を、塩化第二銅を含まない培養液で洗い流すことにより、培養細胞をデバイス内部に残した状態で洗浄操作を行った。この間適宜、培養細胞のインピーダンスを計測した。その結果を図３に示す。なお、図３中の凡例において、例えば「３日」とは、細胞培養開始から３日目のことを指し、例えば、「７日添加後４時間」とは、細胞培養開始から７日目の塩化第二銅添加後４時間のことを指す。
【００４１】
図３（ａ）は、計測したインピーダンスの振幅スペクトルであり、グラフ縦軸はインピーダンスの振幅の絶対値を示す。培養開始後５日目に、インピーダンスの振幅が顕著に増加し、７日目に振幅が最大となっていることが認められた。すなわち、培養開始後３日目から５日目の間に、培養細胞の膜状構造の形成が起こっていることが確認された。
そして、７日目に塩化第二銅を添加してから４時間後までは、インピーダンスの振幅変化がほとんど認められず、膜状構造が機能していることが確認された。続いて、培養細胞を洗浄後にデバイスへ戻してから塩化第二銅添加の効果が表れ、添加後２５時間で、インピーダンスの振幅が低下していることが認められ、膜状構造の崩壊が確認された。そして添加後４８時間で再びインピーダンスの振幅増加が認められ、膜状構造が再生していること確認された。すなわち、塩化第二銅による培養細胞の膜状構造への添加効果は、時間経過とともに消失することが確認された。
【００４２】
また図３（ｂ）は、計測したインピーダンスの位相スペクトルであり、グラフ縦軸は位相（θ）を示す。培養開始後３日目から７日目にかけて、曲線の低周波数側へのシフトと、特徴的な１０６Ｈｚ付近のθの減少（θ＝−６２°）が認められ、培養細胞の膜状構造の形成が確認された。
そして７日目に塩化第二銅を添加してから４時間後までは、曲線に大きな変化はなく、膜状構造がそのまま機能していることが確認された。続いて、培養細胞を洗浄後にデバイスへ戻してから塩化第二銅添加の効果が表れ、添加後２５時間で、曲線の高周波数側へのシフトと、特徴的な１０６Ｈｚ付近のθの増加（θ＝−５３°）が認められ、膜状構造の崩壊が確認された。さらに添加後４８時間で、新たに曲線の低周波数側へのシフトと、特徴的な１０６Ｈｚ付近のθの減少（θ＝−５８°）が認められ、膜状構造の再生が確認された。すなわち、塩化第二銅の添加が培養細胞の膜状構造へおよぼす効果は、時間経過とともに消失することを、本発明のデバイスを用いて培養細胞のインピーダンスを高精度にリアルタイムで測定することで確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、細胞の培養条件の最適化、培養細胞の状態の観察はもとより、医薬品の創薬プロセスで重要な薬物動態解析や医薬品候補物質のスクリーニング、さらには化学物質の環境毒性の計測等、極めて広範囲の分野での利用に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の培養細胞の電気シグナル計測デバイスの一例を示す縦断面図である。
【図２】実施例１における培養細胞のインピーダンス計測結果を示すグラフであり、図２（ａ）はインピーダンスの振幅スペクトルであり、図２（ｂ）はインピーダンスの位相スペクトルである。
【図３】実施例２における培養細胞のインピーダンス計測結果を示すグラフであり、図３（ａ）はインピーダンスの振幅スペクトルであり、図３（ｂ）はインピーダンスの位相スペクトルである。
【符号の説明】
【００４５】
１・・・電気シグナル計測デバイス、２・・・支持体、３・・・半透膜、４・・・上部コンパートメント、５・・・下部コンパートメント、６１・・・上部電極、６２・・・下部電極、６２１・・・下部電極の上部電極対向面
【特許請求の範囲】
【請求項１】
半透膜によって二つに区分けされたコンパートメントが内部に設けられた支持体に、電極が設けられている培養細胞の電気シグナル計測デバイスであって、
前記コンパートメントは、前記半透膜により上部コンパートメントおよび下部コンパートメントに区分けされ、
上部コンパートメントには上部電極が設けられ、下部コンパートメントには、該上部電極に対向して、対向面が前記半透膜に接触して下部電極が設けられており、
上部コンパートメントと下部コンパートメントに別々に流体を灌流させるための上部灌流用流路および下部灌流用流路が支持体に設けられていることを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項２】
前記上部電極の下部電極に対向する面と、前記半透膜の上部電極に対向する面との距離が１ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項３】
前記上部電極および下部電極の測定面の厚みが、０．５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項４】
前記上部電極および下部電極の材質が金メッキされた真鍮であり、これら電極の測定面の形状が、直径３ｍｍ以下の円形であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項５】
前記支持体の材質が、ポリジメチルシロキサンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項６】
インピーダンス計測用である請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスが、基板上に複数設けられていることを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測アレイ。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスを用いて、培養細胞の電気シグナルを計測する方法であって、
上部コンパートメント側の半透膜上の、上部電極と下部電極との間の位置に細胞を導入し、上部コンパートメントに流体を、下部コンパートメントに培養液を別々に灌流させながら半透膜上で前記細胞を培養し、
上部電極および下部電極より培養細胞に電界を印加して得られる培養細胞の電流応答を計測することを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測方法。
【請求項１】
半透膜によって二つに区分けされたコンパートメントが内部に設けられた支持体に、電極が設けられている培養細胞の電気シグナル計測デバイスであって、
前記コンパートメントは、前記半透膜により上部コンパートメントおよび下部コンパートメントに区分けされ、
上部コンパートメントには上部電極が設けられ、下部コンパートメントには、該上部電極に対向して、対向面が前記半透膜に接触して下部電極が設けられており、
上部コンパートメントと下部コンパートメントに別々に流体を灌流させるための上部灌流用流路および下部灌流用流路が支持体に設けられていることを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項２】
前記上部電極の下部電極に対向する面と、前記半透膜の上部電極に対向する面との距離が１ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項３】
前記上部電極および下部電極の測定面の厚みが、０．５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項４】
前記上部電極および下部電極の材質が金メッキされた真鍮であり、これら電極の測定面の形状が、直径３ｍｍ以下の円形であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項５】
前記支持体の材質が、ポリジメチルシロキサンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項６】
インピーダンス計測用である請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスが、基板上に複数設けられていることを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測アレイ。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養細胞の電気シグナル計測デバイスを用いて、培養細胞の電気シグナルを計測する方法であって、
上部コンパートメント側の半透膜上の、上部電極と下部電極との間の位置に細胞を導入し、上部コンパートメントに流体を、下部コンパートメントに培養液を別々に灌流させながら半透膜上で前記細胞を培養し、
上部電極および下部電極より培養細胞に電界を印加して得られる培養細胞の電流応答を計測することを特徴とする培養細胞の電気シグナル計測方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−２１５４７３（Ｐ２００７−２１５４７３Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３９２３０（Ｐ２００６−３９２３０）
【出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（８０１００００４９）財団法人生産技術研究奨励会 (72)
【出願人】（００００００５２７）ペンタックス株式会社 (1,878)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（８０１００００４９）財団法人生産技術研究奨励会 (72)
【出願人】（００００００５２７）ペンタックス株式会社 (1,878)
【Ｆターム（参考）】
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