基質特異性に優れたピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
【課題】
基質特異性が改善されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）を提供する。
【解決手段】
本発明は、野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨである。
基質特異性が改善されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）を提供する。
【解決手段】
本発明は、野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基質特異性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨとも記載する。）に関し、詳しくはピロロキノリンキノン（以下、ピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）を補酵素とする改変型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）、その製造法及びグルコースセンサーに関する。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒することから、血糖の測定に用いることが可能である。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されることから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（たとえば、特許文献１を参照）。しかしながら、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素はグルコースオキシダーゼに比べてその基質特異性に問題があった。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸を置換すること、および／または、アミノ酸を挿入することによる変異により基質特異性を向上させることを可能にし、本発明を完成するに到った。
特に、これまで実質的にほとんど具体的検討がなされてこなかった「アミノ酸の挿入」に着目し詳細に検討することで、本発明を完成するに到った。
即ち本発明は、
［項１］
アミノ酸置換が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）、のうちいずれか、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸変異のうちいずれかを有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項２］
あるアミノ酸をＰへ置換、あるいは、ある部位にＰを挿入することにより安定性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨにおいて、そのＰの前後に荷電アミノ酸を位置させることにより安定性を向上させた改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項３］
Ｐの置換または挿入が４３０位周辺である請求項２に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項４］
荷電アミノ酸がＤ，Ｅである請求項２、３に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項５］
二糖類がマルトースである、請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項６］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
［項７］
請求項６に記載の遺伝子を含むベクター。
［項８］
請求項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項９］
請求項８に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
［項１０］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定用組成物。
［項１１］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
［項１２］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
［項１３］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
［項１４］
ＰＱＱＧＤＨに請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法。
［項１５］
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
［項１６］
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した酵素である。本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨをグルコースアッセイキット及びグルコースセンサに使用することにより、野生型ＰＱＱＧＤＨを使用したものよりもより高精度な分析が可能となったり、より安定性の高いグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したものである。
【０００９】
二糖類に対する作用性とは、二糖類を脱水素する作用を意味する。二糖類としては、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどが例示され、特にマルトースが例示される。本願発明では、二糖類に対する作用性が低下したことを、基質特異性の向上とも表現する。
【００１０】
二糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、野生型ＰＱＱＧＤＨを用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該二糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。次いで、改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて同様の操作を行い、その値を比較して判断する。
【００１１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下していれば、グルコースに対する作用性は上昇、不変、低下のいずれであっても本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに包含される。
【００１２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース濃度の測定において二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨを用いた場合と比較して低下したものを含む。好ましくは、マルトースに対する作用性が低下したものである。マルトースに対する作用性は、好ましくは野生型ＰＱＱＧＤＨの９０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に２０％以下である。
【００１３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であるものが好ましい。より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に２０％以下である。
【００１４】
野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列において、（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）、のうちいずれか、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸変異のうちいずれかを有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
【００１５】
ここで、例えば、「Ｔ２２４Ａ」は、２２４位のＴ（Ｔｈｒ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。また、「１７１Ａ」は、１７１位の後の位置にＡ（Ａｌａ）を挿入することを意味する。１７１位のアミノ酸の後にＡを挿入したことを意味する。多重変異体については、同様の原則によって表記したものをハイフンでつなげて表記している。
【００１６】
また、例えば、ＰＱＱＧＤＨの多重変異体「Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ」は、１６８位のＱをＡに、１６９位のＬをＰに、１７０位のＡをＬに、２４５位のＥをＤに、３４２位のＭをＩに、４２９位のＮをＤ置換し、Ａに置換された１６８位の後にＦを、Ｄに置換された４２９位の後にＰを挿入することを意味する。ここで取り扱っている数字は便宜上、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株の野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列上の位置に相当しており、前方のアミノ酸が挿入されたことによりアミノ酸の位置が後方へ１つずれたとしても、位置を表す数字の修正は行なっていない。
【００１７】
ニ糖類に対する作用性を低下させるために変異導入されたＰは、酵素の安定性を低下させる要因になることがあり、その前後に荷電アミノ酸を配置させることにより安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
【００１８】
ニ糖類に対する作用性を低下させるために変異導入されるＰの例として、本実施例では４３０Ｐが例示されているが、Ｎ４２９Ｐ変異導入により安定性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨに対しても有効である。
【００１９】
前記荷電アミノ酸の好ましい形態は、酸性アミノ酸Ｄ、Ｅであり、Ｐ測鎖を安定化するための配置をとっており、Ｐの前後いずれでも可能である。
【００２０】
次の段落に示すいずれかの置換または挿入の組合わせによる多重変異体は、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上に寄与している。
【００２１】
（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）
【００２２】
本願発明はまた、ＰＱＱＧＤＨに上記のアミノ酸挿入を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法である。
【００２３】
本願発明は、また、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法である。
【００２４】
本願発明はまた、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法である。
【００２５】
上記のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列である。中でも好ましくは配列番号１である。配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とするものであり、特開平１１−２４３９４９号公報に開示されている。なお、上記および配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【００２６】
アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
【００２７】
なお、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、好ましくは二糖類に対する作用性に対して実質的な悪影響を及ぼさない限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されていてもよい。
【００２８】
ところで、本願出願時において、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ） ＬＭＤ７９．４１株由来の酵素のＸ線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした該酵素の高次構造が明らかとなっている（非特許文献１，２，３，４を参照。）。
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９）
【非特許文献２】ＰＮＡＳ，９６（２１），１１７８７−１１７９１（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９），５１８７−５１９４（１９９９）
【非特許文献４】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９，１２６５−１２７３（２０００）
【００２９】
その高次構造に関する知見を基に、該酵素の構造と機能の相関に関する研究が進められているが、まだ完全に明らかになったとは言えない。例えば、水溶性グルコース脱水素酵素の第６番目のＷ−モチーフ、のＢストランドとＣストランドを結ぶループ領域（Ｗ６ＢＣ）中のアミノ酸残基の構造遺伝子の特定の部位に変異を導入することによりグルコースに対する選択性を改良しうることが考察されている（例えば、特許文献２を参照。）しかしながら、効果が実証されているのは実施例に開示されているものだけである。
【特許文献２】特開２００１−１９７８８８
【００３０】
ここで、本願発明の成果をもとにこれらの高次構造に関する知見を見直すと、二糖類に対する作用性の改変には、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸 の少なくとも１つ以上が関わっている可能性が考えられる。
【００３１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、および／または、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。
一方、非特許文献３および４には、ＰＱＱに結合するアミノ酸として、Ｙ３４４、Ｗ３４６、Ｒ２２８、Ｎ２２９、Ｋ３７７、Ｒ４０６、Ｒ４０８、Ｄ４２４、グルコースに結合するアミノ酸としては、Ｑ７６、Ｄ１４３、Ｈ１４４、Ｄ１６３、Ｑ１６８、Ｌ１６９、などの記載がある。
【００３２】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。
一方、非特許文献１には、活性中心のカルシウムイオンに結合するアミノ酸としては、Ｐ２４８、Ｇ２４７、Ｑ２４６、Ｄ２５２、Ｔ３４８などの記載がある。
【００３３】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造における活性中心から半径１５Å以内、好ましくは半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。
【００３４】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３５】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３６】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３７】
以上の教示にしたがって、当業者は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とする配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質および配列番号２で示されるその塩基配列を参照し、これらとの相同性が高い（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する）他の起源（天然のもの、改変されたもの、人工的に合成されたものを問わない）に由来する改変型ＰＱＱＧＤＨについても、配列番号１に対応する位置（同等の位置）を探し出し、当該領域でアミノ酸残基を置換することにより、過度に試行錯誤を行うことなく、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【００３８】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１株由来酵素のアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９２．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似しているので、配列番号１におけるある残基が、他起源の酵素のどのアミノ酸残基に該当するかを容易に認識することができる。そして、本発明にしたがって、そのような１またはそれ以上の箇所においてアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換および／または他のアミノ酸を挿入することにより、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。これらの改変型ＰＱＱＧＤＨグルコース脱水素酵素も本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、微生物など種々の起源より得られる野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を改変することにより得られる可能性がある。具体的には、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌を挙げることができる。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター属、さらに好ましくは相同性の高いアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニのいずれかの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
【００４０】
野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００４１】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００４２】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００４３】
本発明において、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
なお、アシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７は、ＮＣＩＭＢまたはＵＫＮＣＣから入手することができる。
【００４４】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００４５】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００４６】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４７】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００４８】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０ 、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１ などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９ 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ などが例示される。
【００４９】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００５０】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０ 、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１ 、エシェリヒア・コリＪＭ１０９ 、エシェリヒア・コリＤＨ５ αなどを用いることができる。
【００５１】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５２】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＰＱＱの添加によりＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００５３】
上記の方法により得られたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００５４】
上記のようにして、一度選択されたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＰＱＱ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＰＱＱ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５５】
ＰＱＱ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ）属やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ）属の酢酸菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
【００５６】
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・アエルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
【００５７】
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、ＲＳＦ１０１０ 由来のベクターもしくはその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭＢ２４等（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ら，Ｇｅｎｅ，２６，２７３（１９８３））、ｐＣＮ４０ 、ｐＣＮ６０ 等（Ｃ．Ｃ．Ｎｉｅｔｏ ら，Ｇｅｎｅ，８７，１４５（１９９０））やｐＴＳ１１３７ 等を挙げることができる。また、ｐＭＥ２９０等（Ｙ．Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅ，３６，２７（１９８５））、ｐＮＩ１１１、ｐＮＩ２０Ｃ（Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，６１４（１９９１））も利用できる。
【００５８】
アシネトバクター属細菌では、ｐＷＭ４３ 等（Ｗ．Ｍｉｎａｓ ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ，５９，２８０７（１９９３））、ｐＫＴ２３０、ｐＷＨ１２６６ 等（Ｍ．Ｈｕｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８７，４５（１９９０））がベクターとして利用可能である。
【００５９】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００６０】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００６１】
培養温度は菌が成育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなＰＱＱ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変型ＰＱＱＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００６２】
培養物中の改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、改変型ＰＱＱＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、改変型ＰＱＱＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変型ＰＱＱＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００６３】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００６４】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００６５】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＧＤＨをより安定化することができる。
【００６６】
本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００６７】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの７４位、７５位、７６位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２４５位、２５８位、３４２位、３４４位、３４５位、４１６位、４２９位及び４３０位に着目し、これらのアミノ酸部位へ上記変異導入キットを用いてランダムに変異を導入したライブラリーを作製し、基質特異性の変化を指標にスクリーニングしたところ、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。基質特異性に関しては、（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）の多重変異体が特に好ましい。
【００６８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質は、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質は、グルコース測定用組成物として用いることが出来る。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質またはグルコース測定用組成物は、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーとして用いることができる。本発明のグルコース測定用組成物は、その形態や使用方法に応じて、精製された状態であっても良いし、種々の添加物が加えられていても良い。
例えば、精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。
【００６９】
精製された改変タンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
【００７０】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００７１】
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００７２】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７３】
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７４】
組成物には、さらに他の安定化剤などをＰＱＱＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００７５】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
【００７６】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
【００７７】
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
【００７８】
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００７９】
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００８０】
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００８１】
本願発明のグルコース測定用組成物は、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分（例えばＢＳＡ等の生体由来物質）を含有しない構成とすることもできる。
【００８２】
この場合、組成物は、改変型ＰＱＱＧＤＨとカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る。また、これらを含有した上で、アミノ酸、あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
【００８３】
カルシウムの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。また、粉末組成物において、カルシウムの含有量（Ｗ／Ｗ）は、０．０５％〜５％であることが望ましい。
【００８４】
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。但し、リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成するものは好ましくない。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＰＱＱ結合を不安定とするために好ましくない。このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましい。
【００８５】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００８６】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００８７】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１ ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００８９】
実施例２：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の作製
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＰＧ５と変異導入部位のアミノ酸をコードするトリプレットを中央に含む４０ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、７４位、７５位、７６位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２４５位、２５８位、３４２位、３４４位、３４５位、４１６位、４２９位及び４３０位にランダムに変異導入した多重変異ライブラリーを作製した。そして、基質特異性の変化を指標にスクリーニングして得られた候補株の塩基配列を決定して、配列番号１記載のアミノ酸配列の２２４番目のトレオニンがアラニンに、２３６番目のアラニンがトレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）を取得した。
次ぎに、ｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔを基に、その他の変異導入されていない部位の合成オリゴヌクレオチドを利用して、上記方法と同様にしてライブラリー作製、基質特異性を指標にしたスクリーニングを実施して、基質特異性が改善された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）を取得した。
その他上記と同様に、ライブラリー作製、スクリーニングを実施し、記質特異性が改善された多重変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）を取得し、各組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換して、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００９０】
実施例３：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例２で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６ＴのＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔと命名した。
ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐの各組換えプラスミドについても上記方法と同様にして発現プラスミドを取得した。得られた発現プラスミドそれぞれｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐと命名した。
【００９１】
実施例４：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例３で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔを０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐの各発現プラスミドについても上記方法と同様にして、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００９２】
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
【００９３】
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
【００９４】
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
【００９５】
実施例５：ホロ型発現精製酵素の調製
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約３０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐによるシュードモナス・プチダＴＥ３４９３形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。
このようにして取得した精製酵素を用いて性能を評価した。
【００９６】
基質特異性
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とマルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。マルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性に際しては、０．５Ｍのマルトース溶液を調製して活性測定に用いた。結果を表１に示す。
なお、表１において、左欄「Ｔ２２４Ａ」は２２４位のＴをＡに置換したことを表す。また、左欄の「１７１Ａ」は１７１位の後ろにＡを挿入したことを表す。「Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ」は、上記と同様の原則によって表記したものを＋記号でつなげて多重変異体を表記している。
マルトース作用性は、これら多重変異体ＰＱＱＧＤＨのグルコースを基質とした活性値を１００％として、マルトースを基質とした場合の活性値と比較して、その割合（％）が低い程、マルトースに対する作用性が低下しているものと評価した。
また、これら多重変異体ＰＱＱＧＤＨの熱安定性は、菌体破砕液を４５℃、１時間処理後の残存活性（％）を測定して、野生型ＰＱＱＧＤＨと比較することにより熱安定性の優劣を評価した。
【００９７】
【表１】
【００９８】
野生型ＰＱＱＧＤＨでは、グルコースとマルトースの反応性がほぼ等しくなっているのに対し、本願発明の改変型ＰＱＱＧＤＨではマルトースの反応性が低下している。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によれば、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。この改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーに利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は基質特異性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨとも記載する。）に関し、詳しくはピロロキノリンキノン（以下、ピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）を補酵素とする改変型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）、その製造法及びグルコースセンサーに関する。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒することから、血糖の測定に用いることが可能である。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されることから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（たとえば、特許文献１を参照）。しかしながら、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素はグルコースオキシダーゼに比べてその基質特異性に問題があった。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸を置換すること、および／または、アミノ酸を挿入することによる変異により基質特異性を向上させることを可能にし、本発明を完成するに到った。
特に、これまで実質的にほとんど具体的検討がなされてこなかった「アミノ酸の挿入」に着目し詳細に検討することで、本発明を完成するに到った。
即ち本発明は、
［項１］
アミノ酸置換が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）、のうちいずれか、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸変異のうちいずれかを有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項２］
あるアミノ酸をＰへ置換、あるいは、ある部位にＰを挿入することにより安定性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨにおいて、そのＰの前後に荷電アミノ酸を位置させることにより安定性を向上させた改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項３］
Ｐの置換または挿入が４３０位周辺である請求項２に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項４］
荷電アミノ酸がＤ，Ｅである請求項２、３に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項５］
二糖類がマルトースである、請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項６］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
［項７］
請求項６に記載の遺伝子を含むベクター。
［項８］
請求項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項９］
請求項８に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
［項１０］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定用組成物。
［項１１］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
［項１２］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
［項１３］
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
［項１４］
ＰＱＱＧＤＨに請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法。
［項１５］
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
［項１６］
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した酵素である。本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨをグルコースアッセイキット及びグルコースセンサに使用することにより、野生型ＰＱＱＧＤＨを使用したものよりもより高精度な分析が可能となったり、より安定性の高いグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したものである。
【０００９】
二糖類に対する作用性とは、二糖類を脱水素する作用を意味する。二糖類としては、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどが例示され、特にマルトースが例示される。本願発明では、二糖類に対する作用性が低下したことを、基質特異性の向上とも表現する。
【００１０】
二糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、野生型ＰＱＱＧＤＨを用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該二糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。次いで、改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて同様の操作を行い、その値を比較して判断する。
【００１１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下していれば、グルコースに対する作用性は上昇、不変、低下のいずれであっても本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに包含される。
【００１２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース濃度の測定において二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨを用いた場合と比較して低下したものを含む。好ましくは、マルトースに対する作用性が低下したものである。マルトースに対する作用性は、好ましくは野生型ＰＱＱＧＤＨの９０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に２０％以下である。
【００１３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であるものが好ましい。より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に２０％以下である。
【００１４】
野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列において、（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）、のうちいずれか、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸変異のうちいずれかを有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
【００１５】
ここで、例えば、「Ｔ２２４Ａ」は、２２４位のＴ（Ｔｈｒ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。また、「１７１Ａ」は、１７１位の後の位置にＡ（Ａｌａ）を挿入することを意味する。１７１位のアミノ酸の後にＡを挿入したことを意味する。多重変異体については、同様の原則によって表記したものをハイフンでつなげて表記している。
【００１６】
また、例えば、ＰＱＱＧＤＨの多重変異体「Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ」は、１６８位のＱをＡに、１６９位のＬをＰに、１７０位のＡをＬに、２４５位のＥをＤに、３４２位のＭをＩに、４２９位のＮをＤ置換し、Ａに置換された１６８位の後にＦを、Ｄに置換された４２９位の後にＰを挿入することを意味する。ここで取り扱っている数字は便宜上、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株の野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列上の位置に相当しており、前方のアミノ酸が挿入されたことによりアミノ酸の位置が後方へ１つずれたとしても、位置を表す数字の修正は行なっていない。
【００１７】
ニ糖類に対する作用性を低下させるために変異導入されたＰは、酵素の安定性を低下させる要因になることがあり、その前後に荷電アミノ酸を配置させることにより安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
【００１８】
ニ糖類に対する作用性を低下させるために変異導入されるＰの例として、本実施例では４３０Ｐが例示されているが、Ｎ４２９Ｐ変異導入により安定性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨに対しても有効である。
【００１９】
前記荷電アミノ酸の好ましい形態は、酸性アミノ酸Ｄ、Ｅであり、Ｐ測鎖を安定化するための配置をとっており、Ｐの前後いずれでも可能である。
【００２０】
次の段落に示すいずれかの置換または挿入の組合わせによる多重変異体は、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上に寄与している。
【００２１】
（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）
【００２２】
本願発明はまた、ＰＱＱＧＤＨに上記のアミノ酸挿入を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法である。
【００２３】
本願発明は、また、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法である。
【００２４】
本願発明はまた、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法である。
【００２５】
上記のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列である。中でも好ましくは配列番号１である。配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とするものであり、特開平１１−２４３９４９号公報に開示されている。なお、上記および配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【００２６】
アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
【００２７】
なお、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、好ましくは二糖類に対する作用性に対して実質的な悪影響を及ぼさない限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されていてもよい。
【００２８】
ところで、本願出願時において、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ） ＬＭＤ７９．４１株由来の酵素のＸ線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした該酵素の高次構造が明らかとなっている（非特許文献１，２，３，４を参照。）。
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９）
【非特許文献２】ＰＮＡＳ，９６（２１），１１７８７−１１７９１（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９），５１８７−５１９４（１９９９）
【非特許文献４】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９，１２６５−１２７３（２０００）
【００２９】
その高次構造に関する知見を基に、該酵素の構造と機能の相関に関する研究が進められているが、まだ完全に明らかになったとは言えない。例えば、水溶性グルコース脱水素酵素の第６番目のＷ−モチーフ、のＢストランドとＣストランドを結ぶループ領域（Ｗ６ＢＣ）中のアミノ酸残基の構造遺伝子の特定の部位に変異を導入することによりグルコースに対する選択性を改良しうることが考察されている（例えば、特許文献２を参照。）しかしながら、効果が実証されているのは実施例に開示されているものだけである。
【特許文献２】特開２００１−１９７８８８
【００３０】
ここで、本願発明の成果をもとにこれらの高次構造に関する知見を見直すと、二糖類に対する作用性の改変には、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸 の少なくとも１つ以上が関わっている可能性が考えられる。
【００３１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、および／または、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。
一方、非特許文献３および４には、ＰＱＱに結合するアミノ酸として、Ｙ３４４、Ｗ３４６、Ｒ２２８、Ｎ２２９、Ｋ３７７、Ｒ４０６、Ｒ４０８、Ｄ４２４、グルコースに結合するアミノ酸としては、Ｑ７６、Ｄ１４３、Ｈ１４４、Ｄ１６３、Ｑ１６８、Ｌ１６９、などの記載がある。
【００３２】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。
一方、非特許文献１には、活性中心のカルシウムイオンに結合するアミノ酸としては、Ｐ２４８、Ｇ２４７、Ｑ２４６、Ｄ２５２、Ｔ３４８などの記載がある。
【００３３】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造における活性中心から半径１５Å以内、好ましくは半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。
【００３４】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３５】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３６】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
【００３７】
以上の教示にしたがって、当業者は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とする配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質および配列番号２で示されるその塩基配列を参照し、これらとの相同性が高い（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する）他の起源（天然のもの、改変されたもの、人工的に合成されたものを問わない）に由来する改変型ＰＱＱＧＤＨについても、配列番号１に対応する位置（同等の位置）を探し出し、当該領域でアミノ酸残基を置換することにより、過度に試行錯誤を行うことなく、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【００３８】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１株由来酵素のアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９２．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似しているので、配列番号１におけるある残基が、他起源の酵素のどのアミノ酸残基に該当するかを容易に認識することができる。そして、本発明にしたがって、そのような１またはそれ以上の箇所においてアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換および／または他のアミノ酸を挿入することにより、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。これらの改変型ＰＱＱＧＤＨグルコース脱水素酵素も本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、微生物など種々の起源より得られる野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を改変することにより得られる可能性がある。具体的には、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌を挙げることができる。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター属、さらに好ましくは相同性の高いアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニのいずれかの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
【００４０】
野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００４１】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００４２】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００４３】
本発明において、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
なお、アシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７は、ＮＣＩＭＢまたはＵＫＮＣＣから入手することができる。
【００４４】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００４５】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００４６】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４７】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００４８】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０ 、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１ などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９ 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ などが例示される。
【００４９】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００５０】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０ 、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１ 、エシェリヒア・コリＪＭ１０９ 、エシェリヒア・コリＤＨ５ αなどを用いることができる。
【００５１】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５２】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＰＱＱの添加によりＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００５３】
上記の方法により得られたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００５４】
上記のようにして、一度選択されたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＰＱＱ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＰＱＱ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５５】
ＰＱＱ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ）属やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ）属の酢酸菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
【００５６】
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・アエルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
【００５７】
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、ＲＳＦ１０１０ 由来のベクターもしくはその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭＢ２４等（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ら，Ｇｅｎｅ，２６，２７３（１９８３））、ｐＣＮ４０ 、ｐＣＮ６０ 等（Ｃ．Ｃ．Ｎｉｅｔｏ ら，Ｇｅｎｅ，８７，１４５（１９９０））やｐＴＳ１１３７ 等を挙げることができる。また、ｐＭＥ２９０等（Ｙ．Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅ，３６，２７（１９８５））、ｐＮＩ１１１、ｐＮＩ２０Ｃ（Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，６１４（１９９１））も利用できる。
【００５８】
アシネトバクター属細菌では、ｐＷＭ４３ 等（Ｗ．Ｍｉｎａｓ ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ，５９，２８０７（１９９３））、ｐＫＴ２３０、ｐＷＨ１２６６ 等（Ｍ．Ｈｕｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８７，４５（１９９０））がベクターとして利用可能である。
【００５９】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００６０】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００６１】
培養温度は菌が成育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなＰＱＱ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変型ＰＱＱＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００６２】
培養物中の改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、改変型ＰＱＱＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、改変型ＰＱＱＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変型ＰＱＱＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００６３】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００６４】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００６５】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＧＤＨをより安定化することができる。
【００６６】
本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００６７】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの７４位、７５位、７６位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２４５位、２５８位、３４２位、３４４位、３４５位、４１６位、４２９位及び４３０位に着目し、これらのアミノ酸部位へ上記変異導入キットを用いてランダムに変異を導入したライブラリーを作製し、基質特異性の変化を指標にスクリーニングしたところ、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。基質特異性に関しては、（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）の多重変異体が特に好ましい。
【００６８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質は、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質は、グルコース測定用組成物として用いることが出来る。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質またはグルコース測定用組成物は、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーとして用いることができる。本発明のグルコース測定用組成物は、その形態や使用方法に応じて、精製された状態であっても良いし、種々の添加物が加えられていても良い。
例えば、精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。
【００６９】
精製された改変タンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
【００７０】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００７１】
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００７２】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７３】
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７４】
組成物には、さらに他の安定化剤などをＰＱＱＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００７５】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
【００７６】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
【００７７】
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
【００７８】
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００７９】
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００８０】
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００８１】
本願発明のグルコース測定用組成物は、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分（例えばＢＳＡ等の生体由来物質）を含有しない構成とすることもできる。
【００８２】
この場合、組成物は、改変型ＰＱＱＧＤＨとカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る。また、これらを含有した上で、アミノ酸、あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
【００８３】
カルシウムの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。また、粉末組成物において、カルシウムの含有量（Ｗ／Ｗ）は、０．０５％〜５％であることが望ましい。
【００８４】
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。但し、リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成するものは好ましくない。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＰＱＱ結合を不安定とするために好ましくない。このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましい。
【００８５】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００８６】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００８７】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１ ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００８９】
実施例２：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の作製
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＰＧ５と変異導入部位のアミノ酸をコードするトリプレットを中央に含む４０ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、７４位、７５位、７６位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２４５位、２５８位、３４２位、３４４位、３４５位、４１６位、４２９位及び４３０位にランダムに変異導入した多重変異ライブラリーを作製した。そして、基質特異性の変化を指標にスクリーニングして得られた候補株の塩基配列を決定して、配列番号１記載のアミノ酸配列の２２４番目のトレオニンがアラニンに、２３６番目のアラニンがトレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）を取得した。
次ぎに、ｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔを基に、その他の変異導入されていない部位の合成オリゴヌクレオチドを利用して、上記方法と同様にしてライブラリー作製、基質特異性を指標にしたスクリーニングを実施して、基質特異性が改善された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）を取得した。
その他上記と同様に、ライブラリー作製、スクリーニングを実施し、記質特異性が改善された多重変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）を取得し、各組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換して、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００９０】
実施例３：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例２で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６ＴのＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔと命名した。
ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐの各組換えプラスミドについても上記方法と同様にして発現プラスミドを取得した。得られた発現プラスミドそれぞれｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐと命名した。
【００９１】
実施例４：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例３で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔを０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐの各発現プラスミドについても上記方法と同様にして、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００９２】
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
【００９３】
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース ３０ｍＭ
ＰＭＳ ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ ０．２２ｍＭ
【００９４】
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
【００９５】
実施例５：ホロ型発現精製酵素の調製
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約３０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐによるシュードモナス・プチダＴＥ３４９３形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。
このようにして取得した精製酵素を用いて性能を評価した。
【００９６】
基質特異性
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とマルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。マルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性に際しては、０．５Ｍのマルトース溶液を調製して活性測定に用いた。結果を表１に示す。
なお、表１において、左欄「Ｔ２２４Ａ」は２２４位のＴをＡに置換したことを表す。また、左欄の「１７１Ａ」は１７１位の後ろにＡを挿入したことを表す。「Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ」は、上記と同様の原則によって表記したものを＋記号でつなげて多重変異体を表記している。
マルトース作用性は、これら多重変異体ＰＱＱＧＤＨのグルコースを基質とした活性値を１００％として、マルトースを基質とした場合の活性値と比較して、その割合（％）が低い程、マルトースに対する作用性が低下しているものと評価した。
また、これら多重変異体ＰＱＱＧＤＨの熱安定性は、菌体破砕液を４５℃、１時間処理後の残存活性（％）を測定して、野生型ＰＱＱＧＤＨと比較することにより熱安定性の優劣を評価した。
【００９７】
【表１】
【００９８】
野生型ＰＱＱＧＤＨでは、グルコースとマルトースの反応性がほぼ等しくなっているのに対し、本願発明の改変型ＰＱＱＧＤＨではマルトースの反応性が低下している。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によれば、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。この改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーに利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸置換が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）、のうちいずれか、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸変異のうちいずれかを有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項２】
あるアミノ酸をＰへ置換、あるいは、ある部位にＰを挿入することにより安定性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨにおいて、そのＰの前後に荷電アミノ酸を位置させることにより安定性を向上させた改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項３】
Ｐの置換または挿入が４３０位周辺である請求項２に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項４】
荷電アミノ酸がＤ，Ｅである請求項２、３に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項５】
二糖類がマルトースである、請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定用組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
【請求項１４】
ＰＱＱＧＤＨに請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法。
【請求項１５】
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
【請求項１６】
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法。
【請求項１】
アミノ酸置換が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、（Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ａ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１７１Ｓ＋Ｔ２２４Ａ＋Ａ２３６Ｔ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｅ＋４３０Ｐ）、のうちいずれか、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸変異のうちいずれかを有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項２】
あるアミノ酸をＰへ置換、あるいは、ある部位にＰを挿入することにより安定性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨにおいて、そのＰの前後に荷電アミノ酸を位置させることにより安定性を向上させた改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項３】
Ｐの置換または挿入が４３０位周辺である請求項２に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項４】
荷電アミノ酸がＤ，Ｅである請求項２、３に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項５】
二糖類がマルトースである、請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定用組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
【請求項１４】
ＰＱＱＧＤＨに請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法。
【請求項１５】
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
【請求項１６】
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法。
【公開番号】特開２００６−２１７８１１（Ｐ２００６−２１７８１１Ａ）
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３１４９８（Ｐ２００５−３１４９８）
【出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]