変化した免疫原性を有するスブチラーゼ及びスブチラーゼ変異体
【課題】本発明は、免疫原性が変化したスブチラーゼ変異体及びスブチラーゼ、特にアレルギー性が減少したスブチラーゼ変異体及びスブチラーゼに関する。
【解決手段】スブチラーゼ変異体は、位置57が位置:170、181及び247のうちの少なくとも一つにおける修飾と組み合わせて修飾されている。使用される位置の番号は、バチルスアミロリケファシエンス由来のSubtilisin Novo(BPNAE)の位置を意味する。さらに、本発明は、前記スブチラーゼ変異体及びスブチラーゼの発現、及び洗浄剤及びオーラルケア製品における等のそれらの使用に関する。
【解決手段】スブチラーゼ変異体は、位置57が位置:170、181及び247のうちの少なくとも一つにおける修飾と組み合わせて修飾されている。使用される位置の番号は、バチルスアミロリケファシエンス由来のSubtilisin Novo(BPNAE)の位置を意味する。さらに、本発明は、前記スブチラーゼ変異体及びスブチラーゼの発現、及び洗浄剤及びオーラルケア製品における等のそれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変化した免疫原性を有するスブチラーゼ及びスブチラーゼ変異体、その使用、並びに前記スブチラーゼ及びスブチラーゼ変異体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素をはじめとする増加する数のタンパク質が、種々の産業、家庭及び医薬用として工業的に製造されている。タンパク質は、ヒト及び動物における免疫反応、例えば、アレルギー反応を刺激しやすい。
【０００３】
タンパク質の免疫原性を変更する種々の試みが、おこなわれてきた。一般的に、これは、免疫反応の誘発に関与するエピトープとして知られているタンパク質の局部的な部分のみである。エピトープは、多数のアミノ酸から構成されている。これらのアミノ酸は、一次配列は連続しているが、タンパク質の3次元構造においては互いに近接して位置していることがより多くみられる。エピトープにおける小さな変化が、抗体に対する結合に影響することがあることが判明した。これにより、このようなエピトープの重要性が減少することがあり、高親和性エピトープから低親和性エピトープに転化することがあり、又はエピトープの損失を生じることがある。すなわち、エピトープは、抗体を十分に結合して免疫反応を起こすことができない。
【０００４】
タンパク質の免疫原性を変化させる別の方法に、例えば、PEG等の化合物をタンパク質に付加することによりエピトープをマスクすることがある。
WO00/26230及びWO01/83559は、親タンパク質と比較して免疫原性が減少したタンパク質変異体を選択する2つの異なる方法を開示している。
WO99/38978は、IgE結合部位を修飾することによりアレルゲンを修飾してアレルギー性を低くする方法を開示している。
WO99/53038は、ヒトにおいてより低いアレルギー反応を示す突然変異タンパク質、及びこのようなタンパク質を構成、同定及び製造する方法を開示している。
【０００５】
洗剤工業内で広く使用されているスブチラーゼは、アレルギー等の免疫反応を起こす可能性がある酵素群である。したがって、免疫原性が変化、特にアレルギー性が減少し、同時に、それらの用途に必要とする酵素活性をまだ維持しているスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体が絶えず必要とされている。
WO00/22103は、免疫反応が減少したポリペプチドを開示し、WO01/83559は、修飾された免疫原性を有するタンパク質変異体を開示している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第一の態様によれば、位置57が、位置:170、181及び247のうちの少なくとも一つにおける修飾と組み合わせて修飾されているスブチラーゼ変異体が提供される。
【０００７】
本発明の第二の態様によれば、配列番号:1のスブチラーゼにおいて、Xaa残基が、位置3ではS又はTであり、位置4ではV又はIであり、位置27ではK又はRであり、位置55ではG、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、位置74ではN又はDであり、位置85ではS又はNであり、位置97ではS又はDであり、位置99ではS、G又はRであり、位置101ではS又はAであり、位置102ではV、N、Y又はIであり、位置121ではN又はSであり、位置157ではG、D又はSであり、位置188ではA又はPであり、位置193ではV又はMであり、位置199ではV又はIであり、位置211ではL又はDであり、位置216ではM又はSであり、位置226ではA又はVであり、位置230ではQ又はHであり、位置239ではQ又はRであり、位置242ではN又はDであり、位置246ではN又はKであり、位置268ではT又はAであり、
位置164のXaa残基、位置175のXaa残基及び位置241のXaa残基が、以下の組合せの1つである:
【０００８】
a)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
b)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
【０００９】
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
c)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在である、
スブチラーゼが提供される。
【００１０】
本発明の第三の態様によれば、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体をコードするDNA配列が提供される。
本発明の第四の態様によれば、前記DNA配列を含むベクターが提供される。
本発明の第五の態様によれば、前記ベクターを含む宿主細胞が提供される。
本発明の第六の態様によれば、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を含む組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本発明に関連して、用語「スブチラーゼ」とは、Siezen等、Protein Engng.4(1991)719-737及びSiezen等、Protein Science 6(1997)501-523に記載されているサブグループのセリンプロテアーゼである。
用語「親」は、本発明に関連して、タンパク質変異体を生成するために修飾されるタンパク質を意味する。親タンパク質は、天然(野生型)ポリペプチド、又はいずれかの好適な手段により調製された変異体であることができる。例えば、親タンパク質は、天然ポリペプチドの、一つ以上のアミノ酸残基の置換、化学的修飾、欠失又はトランケーションによるか、アミノ酸配列に対する一つ以上のアミノ酸残基の付加又は挿入により修飾された天然タンパク質の変異体であることができる。したがって、用語「親スブチラーゼ」は、スブチラーゼ変異体を生成するために修飾されるスブチラーゼを意味する。
【００１２】
用語「変異体」は、本発明に関連して、一つ以上のアミノ酸残基で、親タンパク質と比較して修飾されたタンパク質を意味する。
用語「修飾(単一又は複数)」又は「修飾された」とは、本発明に関連して、タンパク質の化学的修飾だけでなく、タンパク質をコードするDNAの遺伝子操作を含むことを意味する。修飾(単一又は複数)は、意図するアミノ酸(単一又は複数)におけるか又はそこでの、アミノ酸側鎖(単一又は複数)の置き換え(単一又は複数)、置換(単一又は複数)、欠失(単一又は複数)及び/又は挿入であることができる。したがって、用語「修飾されたタンパク質」、例えば、「修飾されたスブチラーゼ」は、親タンパク質と比較して修飾(単一又は複数)を含むタンパク質を意味する。
【００１３】
本発明における用語「位置」は、タンパク質におけるアミノ酸のN末端からの数を意味する。本発明で使用される位置数は、バチルスアミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)由来Subtilisin Novo(BPN’)の位置を意味する。しかしながら、他のスブチラーゼも、本発明によりカバーされる。他のスブチラーゼの対応位置は、GAPプログラムを用いることによるバチルスアミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)由来Subtilisin Novo(BPN’)との整合により定義される。GAPは、GCGプログラムパッケージ(Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8、1994年8月,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin USA 53711)(Needleman,S.B.及びWunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-45)で提供される。特記のない限りは、本発明において述べられている位置は、BPN‘の数え方で示され、整合により変換できる。
【００１４】
用語「タンパク質」は、本発明に関連して、タンパク質自体だけでなく、オリゴペプチド、ポリペプチドをカバーすることを意味する。
位置又はアミノ酸との関連で使用される用語「欠失」又は「欠失された」は、本発明に関連して、特定の位置におけるアミノ酸が欠失されたか、又はそれが不存在であることを意味する。
【００１５】
位置又はアミノ酸との関連で使用される用語「挿入」又は「挿入された」とは、本発明に関連して、一つ以上のアミノ酸、例えば、1〜5個のアミノ酸が挿入されたこと、又は一つ以上のアミノ酸、例えば、1〜5個のアミノ酸が特定の位置におけるアミノ酸の後に存在することを意味する。
位置又はアミノ酸との関連で使用される用語「置換」又は「置換された」とは、本発明に関連して、特定の位置におけるアミノ酸が、別のアミノ酸により置き換えられていることか、又は特定のタンパク質、例えば、タンパク質配列の一つとは異なるアミノ酸が存在することを意味する。
【００１６】
略語
配列番号:1'
用語「配列番号:1'」は、本発明の関連において、Xaa残基が、
位置3ではS又はTであり、
位置4ではV又はIであり、
位置27ではK又はRであり、
位置55ではG、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置74ではN又はDであり、
位置85ではS又はNであり、
位置97ではS又はDであり、
【００１７】
位置99ではS、G又はRであり、
位置101ではS又はAであり、
位置102ではV、N、Y又はIであり、
位置121ではN又はSであり、
位置157ではG、D又はSであり、
位置188ではA又はPであり、
位置193ではV又はMであり、
位置199ではV又はIであり、
位置211ではL又はDであり、
位置216ではM又はSであり、
【００１８】
位置226ではA又はVであり、
位置230ではQ又はHであり、
位置239ではQ又はRであり、
位置242ではN又はDであり、
位置246ではN又はKであり、
位置268ではT又はAであり、
位置164のXaa残基、位置175のXaa残基及び位置241のXaa残基が、以下の組合せの1つである:
【００１９】
a)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
【００２０】
b)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
【００２１】
c)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在である、
配列番号:1による配列の略語として使用される。
【００２２】
アミノ酸
アミノ酸について、周知の3文字及び1文字略語が使用される(例えば、Creighton TE(1993),Proteins;Structures and Molecular Properties(構造及び分子特性)、第2版、W.H.Freeman and Company、図1.1、第3頁参照)。略語「X」又は「Xaa」は、任意のアミノ酸について使用される。本発明に関連して、略語「aa」は、「アミノ酸」について使用される。
【００２３】
変異体
アミノ酸(単一又は複数)の欠失、挿入及び/又は置換の説明に際して、以下の命名法を、本発明において使用する:
最初のアミノ酸(単一又は複数)、位置(単一又は複数)、欠失/挿入された/置換アミノ酸(単一又は複数)
【００２４】
これにより、位置195におけるグリシンに対するグルタミン酸の置換は:
Gly195Glu又はG195E
として示され、同じ位置でのグリシンの欠失は:
Gly195*又はG195*
として示され、リジン等の追加のアミノ酸残基の挿入は:
Gly195GlyLys又はG195GK
として示される。
【００２５】
この番号付けについて使用される配列と比較して欠失を示した場所で、そのような位置での挿入は、
位置36におけるアスパラギン酸の挿入については、
*36Asp又は*36D
と示される。
複突然変異は、+により分離される。すなわち、
Arg170Tyr+Gly195Glu又はR170Y+G195E
は、位置170及び位置195において突然変異があり、それぞれアルギニン及びグリシンに対してそれぞれチロシン及びグルタミン酸が置換していることを表す。
【００２６】
本発明のスブチラーゼ変異体及びスブチラーゼ
本発明は、位置57が、位置:170、181及び247のうちの少なくとも一つにおける修飾と組み合わせて修飾されているスブチラーゼ変異体に関し、及び配列番号:1'のスブチラーゼに関する。本発明者等は、前記スブチラーゼ変異体及びスブチラーゼが、それぞれ親スブチラーゼ及びSavinaseと比較して変化した免疫原性を有することを見出した。
【００２７】
本発明のスブチラーゼ変異体の位置57、位置170、位置181及び/又は位置247におけるアミノ酸は、親スブチラーゼをコードするDNAの遺伝子操作によるか、例えば、アミノ酸側鎖(単一又は複数)の化学的修飾により修飾することができる。特に、前記位置は、例えば、欠失、挿入又は置換により、親スブチラーゼをコードするDNAの遺伝子操作により修飾されてもよい。挿入は、典型的にはアミノ酸1〜5個、例えば、1、2、3、4又は5個のアミノ酸の挿入を含む。
【００２８】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明のスブチラーゼ変異体における位置57、位置170、位置181及び/又は位置247は、置換により修飾されてもよい。特に、位置57、位置170、位置181及び/又は位置247におけるアミノ酸の置換は、異なるサイズ、親水性及び/又は極性のアミノ酸に対する置換、例えば、小さなアミノ酸対大きなアミノ酸、親水性アミノ酸対疎水性アミノ酸、極性アミノ酸対非極性アミノ酸、及び塩基性対酸性アミノ酸を含んでいてもよい。これは、これらの種類の置換が、免疫原性を変化されることがよくあるからである。
【００２９】
また、置換は、リジン(K)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)又はシステイン(C)に対する置換等化学的修飾に好適なアミノ酸に対する置換を含んでいてもよい。より詳細には、位置57におけるアミノ酸(aa)残基は、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つに対する置換であってもよく、位置170におけるaa残基が、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つに対する修飾であってもよく、位置181におけるaa残基が、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つに対する修飾であってもよく、及び/又は位置247におけるaa残基が、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つに対する修飾であってもよい。
【００３０】
例えば、本発明のスブチラーゼ変異体は、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hでもよく、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wでもよく、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yでもよく、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yでもよく、又はX57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yでもよい。
【００３１】
特に、本発明のスブチラーゼ変異体は、X57P+X170F、X57P+X170L、X57P+X181N、X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Q、X57P+X170L、より詳細にはX57P+X170L+X247Qのうちの一つであることができる。
【００３２】
特定の実施態様によれば、本発明のスブチラーゼ変異体は、位置:1、3、4、27、36、76、87、97、98、99、100、101、103、104、120、123、159、160、166、167、169、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252、274のうちの一つに、さらに置換、挿入又は欠失を含んでいてもよい。特に、これらの修飾は、X1G、X3T、X4I、X27L、X27R、X36*、X76D、X87N、X99D、X101G、X101R、X103A、X104I、X104N、X104Y、X120D、X123S、X159D、X160S、X167A、X170S、X194P、X195E、X199M、X205I、X217D、X217L、X218S、X222S、X222A、X232V、X235L、X236H、X245R、X248D、X252K、X274Aのうちの一つ以上でもよい。
【００３３】
別の実施態様によれば、本発明のスブチラーゼ変異体は、ループに挿入、すなわち、位置33〜43、位置95〜103、位置125〜132、位置153〜173、位置181〜195、位置202〜204又は位置218〜219のうちの一つ以上において挿入をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
また、本発明は、配列番号:1‘に記載のスブチラーゼに関する。本発明の一実施態様によれば、位置55、位置164、位置175及び/又は位置241のXaaが、欠失されているか、又はアミノ酸1〜5個、例えば、1、2、3、4又は5個のアミノ酸の挿入等の挿入を含む、配列番号:1‘に記載のスブチラーゼでもよい。また、位置55、位置164、位置175及び/又は位置241のXaaは、リシン(K)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)又はシステイン(C)等の化学的修飾に好適であるアミノ酸でもよい。
【００３５】
別の実施態様によれば、位置55のXaaは、残基:G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、Wのうちの一つでよく、及び/又は位置164におけるXaaは、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つでよく、及び/又は位置175におけるXaaは、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つでよく、及び/又は位置241におけるXaaは、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つでよい。特に、位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよい。
【００３６】
例えば、位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置164におけるXaaは、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つでよく、又は位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置175におけるXaaは、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つでよく、又は位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置241におけるXaaが、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つでよい。
【００３７】
より詳細には、位置55におけるXaaが、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置164におけるXaaが、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つでよく、位置241におけるXaaが、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つでよく、又は位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置175におけるXaaは、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つでよく、位置241におけるXaaが、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つでよい。
【００３８】
また、本発明のスブチラーゼは、位置3、位置4、位置27、位置74、位置85、位置97、位置99、位置101、位置102、位置121、位置157、位置188、位置193、位置199、位置211、位置216、位置226、位置230、位置230、位置239、位置242、位置246及び位置268におけるXaaの組合せが以下のうちの一つでもよい、配列番号:1‘に記載のスブチラーゼでもよい:
【００３９】
i)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４０】
ii)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではNであり、位置97ではSであり、位置99ではGであり、位置101ではSであり、 位置102ではNであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４１】
iii)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではNであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではSであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４２】
iv)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではRであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではYであり、位置121ではSであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではAであるか、
又は
【００４３】
v)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではDであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではAであり、 位置102ではIであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４４】
vi)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではGであり、位置101ではAであり、 位置102ではIであり、位置121ではNであり、位置157ではDであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではVであり、位置230ではHであり、位置239ではRであり、位置242ではDであり、位置246ではKであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４５】
vii)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではDであり、位置99ではRであり、位置101ではAであり、 位置102ではIであり、位置121ではNであり、位置157ではSであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではSであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４６】
viii)位置3ではTであり、位置4ではIであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではPであり、位置193ではMであり、位置199ではIであり、位置211ではDであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４７】
ix)位置3ではTであり、位置4ではIであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではMであり、位置199ではIであり、位置211ではDであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４８】
x)位置3ではTであり、位置4ではIであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではIであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTである。
【００４９】
また、本発明のスブチラーゼは、位置:1、35、95、96、98、118、158、161、163、164、189、212及び229のうちの一つ以上において置換、挿入又は欠失を含んでいてもよい。このような修飾の例としては、X1G、X27L、I35ID、X74D、X118D、A158AS、X161A、X164S、X189E、X212S及びX229Lなどがある。
また、本発明の一実施態様によれば、本発明のスブチラーゼは、ループに挿入、すなわち、位置33〜42、位置93〜101、位置123〜130、位置151〜167、位置175〜189、位置196〜198又は位置212〜213のうちの一つ以上において挿入を含んでいてもよい。
【００５０】
スブチラーゼ
上記したように、スブチラーゼは、Siezen等、Protein Engng.4(1991)719-737及びSiezen等、Protein Science 6(1997)501-523によるセリンプロテアーゼのサブグループを構成している。スブチラーゼは、これまでSubtilisin 様プロテアーゼと称されていたセリンプロテアーゼの170超アミノ酸配列の相同性分析により定義される。スブチラーゼは、6種類、すなわち、Subtilisin科、Thermitase科、Proteinase K科、Lantibioticペプチダーゼ科、Kexin科、Pyrolysin科に分類される。Subtilisin科は、さらに3種類、すなわち、I-S1(「真の」スブチリシン)、I-S2(高アルカリプロテアーゼ)及び細胞内スブチリシンに分類される。酵素の定義又は分類は、異なったり又は変更してもよいが、本発明の関連においては、上記したスブチラーゼのサブ分類又はサブグループへの分類は、Siezen等、Protein Engng.4(1991)719-737及びSiezen等、Protein Science 6(1997)501-523に記載のものである。
【００５１】
本発明のスブチラーゼ変異体は、親スブチラーゼの修飾により得られる。
本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、自然源から単離したスブチラーゼ、すなわち、野生型スブチラーゼであるか、又は続いての修飾がスブチラーゼの特徴を保持しながらなされた自然源から単離されたスブチラーゼであることができる。親スブチラーゼであることができるこのようなスブチラーゼ変異体としては、例えば、EP130756、EP214435、WO87/04461、WO87/05050、EP251446、EP260105、WO88/08028、WO88/08033、WO89/06279、WO91/00345、EP525610及びWO94/02618に開示されているものなどがある。
【００５２】
別の実施態様によれば、親サブチラーゼは、例えば、J.E.Ness等、Nature Biotechnology,17,893-896(1999)に記載されているDNAシャフリング法により調製されたサブチラーゼでもよい。さらに、親サブチラーゼは、人工的に多様性を得る標準的な方法、例えば、異なるスブチラーゼ遺伝子のDNAシャッフリングにより構築することができる(WO95/22625;Stemmer WPC,Nature 370: 389-91(1994))。例えば、親スブチラーゼは、例えば、Savinase（登録商標）をコードする遺伝子と、天然において確認される一つ以上の部分的なスブチラーゼ配列とのDNAシャフリングにより、構築できる。
【００５３】
特に、本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、スブチラーゼ、より詳細にはI-S1又はI-S2グループに属するスブチリシンであることができる。I-S1スブチラーゼの例としては、スブチリシンBPN'、スブチリシンアミロサッカリタス、スブチリシン168、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチリシンCarlsberg(Alcalase（登録商標）)及びスブチリシンDYなどが挙げられる。I-S2スブチラーゼの例としては、スブチリシン309(Savinase)、スブチリシン147、スブチリシンPB92、BLAP及びK16などが挙げられる。
【００５４】
別の実施態様によれば、本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、Thermitaseファミリーに属しているスブチラーゼ、例えば、Thermitaseでよい。
また、本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、ProteinaseKファミリーに属すもの、例えば、プロテアーゼKでもよい。
親スブチラーゼとして使用することができるスブチラーゼの他の例として、EP503346、EP610808及びWO95/27049に記載のようなPD498(WO93/24623)、アクアリシン、プロテアーゼTW7、プロテアーゼTW3、高アルカリプロテアーゼなどがある。
【００５５】
別の実施態様によれば、親スブチラーゼは、続いての修飾がスブチラーゼの特徴を保持しながらおこなわれたスブチラーゼであることができる。例えば、親スブチラーゼは、ループに挿入、すなわち、位置33〜43、位置95〜103、位置125〜132、位置153〜173、位置181〜195、位置202〜204又は位置218〜219のうちの一つ以上において挿入を含んでいてもよい。
【００５６】
また、親スブチラーゼは、さらなる修飾がなされたSavinaseであってもよい。このようなさらなる修飾には、例えば、位置:1、3、4、27、36、76、87、97、98、99、100、101、103、104、120、123、159、160、166、167、169、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252、274のうちの一つ以上に、さらに置換、挿入又は欠失を含んでいてもよい。これらの修飾としては、例えば、X1G、X3T、X4I、X27L、S27R、*36D、X76D、X87N、X99D、X101G、X101R、X103A、X104I、X104N、X104Y、X120D、X123S、X159D、X160S、X167A、X170S、X194P、X195E、X199M、X205I、X217D、X217L、X218S、X222S、X222A、X232V、X235L、X236H、X245R、X248D、X252K、X274Aなどがある。
【００５７】
特に、本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、Savinase様スブチリシン、すなわち、Savinaseと少なくとも40%が同一である、例えば、Savinaseと少なくとも50%が同一又は少なくとも60%が同一、より特にはSavinaseと少なくとも70%が同一又は少なくとも80%が同一、さらに特にはSavinaseと少なくとも90%が同一又は少なくとも95%が同一であるSavinase様スブチリシンでよい。ここで、この同一性は、本発明の親スブチラーゼ/スブチラーゼの核酸配列をSavinaseの核酸配列と比較したときのものである。
【００５８】
Savinaseに対する種々のスブチリシンプロテアーゼのアラインメントから、種々のスブチリシンプロテアーゼの核酸配列の間の同一性が100%〜40%であることが明らかである。
異なるプロテアーゼ対間の配列の同一性は、以下のとおりである:
【００５９】
【表１】
【００６０】
PD498のタンパク質構造は、WO98/35026(Novo Nordisk)に開示されている。Savinaseの構造は、BETZEL等、J.MOL.BIOL.,Vol.223,p.427(1992)(1svn.pdb)に記載されている。
スブチラーゼ及びスブチラーゼ変異体の活性は、「Methods of Enzymatic Analysis(酵素分析法)」、第3版、1984、Verlag Chemie,Weinheim,第5巻に記載の方法で求めることができる。
【００６１】
免疫原性
本発明者等は、本発明のスブチラーゼ変異体及びスブチラーゼは、それぞれ親スブチラーゼ及びSavinaseに対して変化した免疫原性を有していることを見出した。
本発明において、「免疫反応」とは、4種の標準的な反応(Coombs&GellによるタイプI、II、III及びIV)のいずれかによる免疫系を含む化合物に対する生体の応答を意味する。これに対して、本発明に関連して使用される化合物についての用語「免疫原性」は、ヒトを含む動物における免疫反応を誘発するこの化合物の能力を意味する。
【００６２】
本発明のスブチラーゼ変異体又はスブチラーゼとの関連において使用されるときの用語「変化した免疫原性」とは、前記スブチラーゼ変異体/スブチラーゼに対する生体の免疫応答が、それぞれ親スブチラーゼ/Savinaseに対する同種の免疫応答と比較して、異なる、すなわち、減少しているか、又は増加していることを意味する。
【００６３】
典型的には、これは、抗体結合又はT細胞活性化等の免疫応答の誘発に関与している、エピトープとも称されるタンパク質の一部分のみである。典型的には、エピトープは、一組の非順次アミノ酸、すなわち、一次配列が互いに隣接していないが、タンパク質の3次元構造においては、互いに近接しているアミノ酸からなる。抗体結合に関与するエピトープを同定する一つの特に有用な方法は、ペプチド-ファージ膜タンパク質融合のライブラリーをスクリーニングし、関連する抗原特異的抗体に結合するものを選択し、融合遺伝子のランダム化された部分の配列決定し、結合に関与する配列を整列させ、これらのアラインメントに基づいてコンセンサス配列を定義し、表面上のこれらのコンセンサス配列又は抗原の配列及び/又は構造をマッピングして、抗体結合に関与するエピトープを同定することである。エピトープを同定する方法は、WO01/83559及びWO99/53038に記載されている。
【００６４】
アレルギーは、一般的に予め存在している抗体及びT細胞の存在による、無害の異物に対する不都合な免疫反応として理解されている(Janeway及びTravers,Immunology,Current Biology,Blackwell,Garland,1994,第11章)。ほとんどのアレルギー反応は、IgE介在反応を含み、本発明の関連において、用語「アレルギー反応」は、IgE介在反応 (Coombs&GellによるタイプI反応)を含む化合物に対する生体の反応のことである。この化合物に暴露したときの感作(すなわち、化合物特異的IgE抗体の発現)は、「アレルギー反応」の定義に含まれる。これに対して、本発明に関連して使用される化合物についての用語「アレルゲン性」は、この化合物が、ヒトを含む動物においてアレルギー反応を誘発する能力を意味する。
【００６５】
アレルギー反応の一般的な機構は、感作フェーズと症候性フェーズとに分けられる。感作フェーズは、個体のアレルゲンへの最初の暴露を含む。これは、用途に応じて、吸入、皮膚や目との直接接触又は注射により生じることがある。これにより、特異的Tリンパ球及びBリンパ球が活性化され、アレルゲン特異的IgE抗体、すなわち、免疫グロブリンEの産生を生じる。これらのIgE抗体は、最終的には徴候性フェーズの始まりでのアレルゲンの捕捉及びTリンパ球への提供を容易にする。このフェーズは、同様又は似ている抗原への第二暴露により開始される。特異的IgE抗体は、とりわけマスト細胞及び好塩基球上の特異的IgE受容体に結合し、同時にアレルゲンを捕捉する。IgE抗体がポリクローナルであるとき、IgE受容体のブリッジ及びクラスターが生じる。これにより、マスト細胞及び好塩基球が活性化される。この活性化により、アレルギーの徴候フェーズの初期だけでなく後期の反応に関与する種々の化学伝達物質の放出が引き起こされる。
【００６６】
特に、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、減少したアレルギー性等の減少した免疫原性を有する。
本発明の関連において、アレルゲン性は、Balb/Cマウスにおいて発生したIgE反応として測定されなければならない。これは、マウスを、週一回、20週間にわたって、0.9%(wt/vol)NaCl(対照群)50マイクロリットル、又はタンパク質10マイクログラムを含有する0.9%(wt/vol)NaCl 50マイクロリットルで皮下免疫化し、血清を目から一週間おきに、次の免疫化の前に採取し、その後、IgEレベルを、マウスIgEに特異的なELISAを用いて求めることによっておこなう。
【００６７】
したがって、本発明のスブチラーゼ変異体/スブチラーゼとの関連において使用される用語「減少したアレルゲン性」とは、それぞれ親スブチラーゼ/Savinaseに比しIgE反応が前記アッセイにおいて少ないか、全くないことを意味する。特に、前記スブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼに反応して得られる前記アッセイにおいて測定されるIgEレベルは、それぞれ親スブチラーゼ/Savinaseに反応して得られるIgEレベルの35%、例えば、30%又は25%又は20%又は15%又は10%でよい。すなわち、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼに対するIgE反応は、それぞれ親スブチラーゼ/Savinaseに比して、少なくとも3倍、例えば、5倍又は10倍減少できる。
【００６８】
タンパク質に対する免疫/アレルギー反応についての試験に使用できる他の方法には、生体外アッセイ、例えば、用量反応曲線を用いて詳細に調べることができるタンパク質の抗体結合及び/又は官能性を試験するアッセイ、例えば、(WO99/47680)に記載されているような直接又は競合的ELISA(C-ELISA)、サイトカイン発現プロファイルに基づくアッセイ、並びにB細胞及びT細胞を含む上皮細胞及び他の細胞の増殖又は分化応答に基づくアッセイなどがある。アレルゲン性を試験するための生体内モデルとしては、例えば、モルモット気管内モデル(GPIT)(Ritz等,Fund.Appl.Toxicol.,21,pp.31-37,1993)、マウス皮下モデル(マウス-SC)(WO98/30682)、ラット気管内モデル(ラット-IT)(WO96/17929)及びマウス鼻腔内モデル(MINT)(Robinson等、Fund.Appl.Toxicol.,34,pp.15-24,1996)などがある。
【００６９】
本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、それぞれスブチラーゼ変異体/スブチラーゼの精製製剤を用いることにより、変化したアレルゲン性及び/又は免疫原性について試験できる。したがって、変化したアレルゲン性及び/又は免疫原性についてスブチラーゼ変異体又はスブチラーゼを試験する前に、これらを、通常の方法により、より大きなスケールで発現したり、及び/又は精製できる。
【００７０】
さらなる修飾
本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、例えば、突然変異及び/又は化学接合により、さらに修飾できる。この目的は、アレルゲン性をさらに減少すること、又は酵素のの性能、安定性、熱安定性又はいずれかの他の特徴を高めることでよい。
【００７１】
本発明の一実施態様によれば、スブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、例えば、化学的修飾に好適なアミノ酸を、例えば、エピトープ領域内に存在しているものと置き換えるようにした、タンパク質における置換によりさらに修飾できる。特に、置換は、タンパク質構造への影響を制限するように保存的であることができる。例えば、置換は、リシンに対するアルギニン、アスパラギン酸に対するアスパラギン、グルタミン酸に対するグルタミン、システインに対するスレオニン又はセリンでよい。また、化学的修飾は、最初に一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することなく、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼに存在するアミノ酸について実施してもよい。化学的修飾についての化学反応は、上記した通りである。
【００７２】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼを、さらに修飾して前記酵素のアレルゲン性をさらに減少させてもよい。特に、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、WO99/00489に記載の方法によりさらに修飾してもよい。この方法では、分子量が100Da〜750Da、特に100〜50Da、例えば、約300Daの高分子を、タンパク質に連結させる。
【００７３】
高分子は、天然及び合成ホモポリマー、例えば、ポリオール(すなわち、ポリ-OH)、ポリアミン(すなわち、ポリ-NH2)及びポリカルボン酸(すなわち、ポリ-COOH)、並びにさらにヘテロポリマー、すなわち、一つ以上の異なるカップリング基、例えば、ヒドロキシル基及びアミン基を含むポリマーなどのいずれかの好適な高分子でよい。具体例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)及びポリプロピレングリコールなどがある。ポリマーを、当業者に公知のいずれかの方法によりスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼに連結できる。典型的には、4〜50個の高分子、例えば、5〜35個の高分子を、前記酵素に連結できる。
【００７４】
本発明のスブチラーゼ変異体/スブチラーゼをさらに修飾するための他の手段として、例えば、スブチラーゼ変異体/スブチラーゼのエピトープ領域における翻訳後修飾についての認識部位の導入などがある。次に、スブチラーゼ変異体/スブチラーゼを、対応の翻訳後修飾ができる好適な宿主生体において発現されなければならない。これらの翻訳後修飾は、エピトープを保護し、したがって、さらに親スブチラーゼ/Savinaseと比して、それぞれスブチラーゼ変異体/スブチラーゼのアレルゲン性及び/又は免疫原性を低下する役割を果たすことができる。翻訳後修飾には、グリコシル化、リン酸化、N末端処理、アシル化、リボシル化及び硫酸化などがある。
【００７５】
良好な例としては、N-グリコシル化があげられる。N-グリコシル化は、Xaa残基も、トリペプチドコンセンサス配列に続くアミノ酸もプリンではない、配列Asn-Xaa-Ser、Asn-Xaa-Thr又はAsn-Xaa-Cysの部位でみられる(T.E.Creighton,「Proteins―Structures and Molecular Properties(タンパク質-構造と分子特性)」、第2版、W.H.Freeman and Co.、ニューヨーク、1993、pp.91-93)。グリコシル化タンパク質変異体のグリコシル鎖の特異的性は、タンパク質及び宿主細胞に依存して直鎖又は分岐鎖でよい。別の例は、リン酸化である。タンパク質配列は、cAMP依存性キナーゼによりリン酸化できる認識配列arg-arg-(xaa)n-ser(ここで、n=0、1又は2)を有するセリンリン酸化部位、又は通常チロシン特異的キナーゼによりリン酸化できる認識配列-lys/arg-(xaa)3-asp/glu-(xaa)3-tyrを有するチロシンリン酸化部位を導入するように修飾できる(T.E.Creighton,「Proteins―Structures and Molecular Properties(タンパク質-構造と分子特性)」、第2版、Freeman、NY、1993)。
【００７６】
化学的修飾
本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、化学的に修飾してもよい。当業者に公知の方法を使用して、前記酵素を化学修飾してもよい。
共有的バイオ接合の調整についての化学反応について、「Bioconjugate Techniques(バイオ接合法)」,Hermanson,G.T.(1996),Academic Press社に記載されている。
【００７７】
位置57、位置170、位置181及び/位置241のアミノ酸を、化学修飾に好適であるアミノ酸に置換することによりスブチラーゼ変異体を修飾する場合には、この置換は、特にポリペプチド構造に対する置換の影響が確実に制限されるように保存的でよい。追加のアミノ基を提供する場合には、これは、リシンに対するアルギニンの置換によりおこなうことができる。両方の残基は、正に帯電しているが、リシンのみが、結合基として好適な遊離アミン基を有する。追加のカルボン酸基を提供する場合には、保存的置換が、例えば、アスパラギンのアスパラギン酸への置換又はグルタミンのグルタミン酸への置換であることができる。これらの残基は、酸性残基上に存在するカルボン酸基を除いて、サイズ及び形状において互いに似ている。SH基を提供する場合には、保存的置換は、トレオニン又はセリンをシステインに変更することによりおこなうことができる。
【００７８】
化学的接合
化学的接合には、タンパク質は、活性又は活性化ポリマーとともにインキュベーションした後、未反応ポリマーから分離する必要がある。これは、溶液でおこなった後精製してもよいし、異なる反応環境及び洗浄に容易にあてることができる固定化タンパク質を用いておこなうのが都合がよい。
【００７９】
高分子が当該ポリペプチド接合すべきであり、且つ高分子が活性でない場合には、好適な手法を使用することにより活性化されなければならない。また、本発明では、高分子をポリペプチドに、リンカーを介して連結することも意図される。好適なリンカーは、当業者には周知である。高分子の活性化及びポリペプチドの接合についての方法及び化学反応は、文献に集中的に記載されている。
【００８０】
不溶性ポリマーの活性化で一般的に使用されている方法には、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジン等による官能基の活性化などがある(「Bioconjugate Techniques(バイオ接合法)」、Hermanson,G.T.(1996)、Academic Press社;「Protein immobilisation.Fundamental and applications(タンパク質の固定化、基礎及び応用)」,R.F.Taylor(1991),Marcel Dekker,NY.;「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking(タンパク質接合及び架橋の化学)」,S.S.Wong(1992),CRC Press,Boca Raton;「Immobilized Affinity Ligand Techniquies(固定化アフィニティーリガンド法)」,G.T.Hermanson等、(1993),Academic Press社,NY.参照)。
【００８１】
一部の方法は、不溶性ポリマーの活性化に関するが、また可溶性ポリマーの活性化に適用できる(例えば、過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、ハロゲン化スルホニル、ジビニルスルホン、カルボジイミド等)。官能基は、ポリマー上のアミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アルデヒド又はスルフヒドリルであり、タンパク質上の選択された結合基は、活性化及び接合化学反応を選択するのに考えなければならない。これらは、通常i)ポリマーの活性化、ii)接合及びiii)残留活性基のブロッキングからなる。
【００８２】
以下において、多数の好適なポリマー活性化法が、簡単に記載されている。しかしながら、他の方法も使用できる。
【００８３】
ポリペプチドの遊離酸基に高分子を連結することは、ジイミド及び例えば、アミノ-PEG又はヒドラジノ-PEG(Pollak等(1976),J.Am.Chem.Soc.,98,289 291)又はジアゾアセテート/アミド(Wong等、(1992),「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking(タンパク質接合及び架橋の化学反応)」、CRC Press)を用いて実施できる。
高分子をヒドロキシ基に連結するのは、水中で実施しなければならないので一般的に極めて困難である。通常、加水分解は、ヒドロキシル基との反応よりも優勢である。
【００８４】
遊離スルフィドリル基に高分子を連結するのは、マレイミドのような特殊な基又はオルト-ピリジルジスルフィドを用いて達成できる。また、ビニルスルホン(米国特許第5,414,135号(1995)、Snow等)は、スルフィドリル基よりも優先するが、述べられている他のものほど選択的ではない。
ポリペプチド鎖におけるアクセシブルなアルギニン残基は、2つのビシニルカルボニル基を含む基により標的とされることができる。
【００８５】
リシンのアミノ基に親電子的に活性化されたPEGを連結することを含む方法が、有用なこともある。アルコール類のための通常の脱離基の多くは、アミン結合を生じる。例えば、アルキルスルホネート、例えば、トレシレート(Nilsson等、(1984)、Methods in Enzymology vol.104,Jacoby,W.B.編,Academic Press:Orlando,pp.56 66;Nilsson等、(1987)、Methods in Enzymology vol.135;Mosbach,K.編;Academic Press:Orlando,pp.65 79;Scouten等、(1987),Methods in Enzymology vol.135,Mosbach,K.編,Academic Press:Orlando,1987;pp.79 84;Crossland等,(1971),J.Amr.Chem.Soc.1971,93,pp.4217 4219)、メシレート(Harris,(1985),上記;Harris等,(1984),J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22,pp.341 352)、アリールスルホネート、例えば、トシレート、及びパラ-ニトロベンゼンスルホネートを、使用することができる。
【００８６】
有機塩化スルホニル、例えば、塩化トレシルは、多数のポリマーにおけるヒドロキシ基、例えば、PEGを、良好な脱離基(スルホネート)に効果的に転化する。ポリペプチドにおけるアミノ基のような求核試薬と反応したとき、離脱基により、安定な結合がポリマーとポリペプチドとの間で形成できるようにする。高接合収率に加えて、反応条件は、一般的に温和(変質及び活性の破壊がほとんどないか、又は全くないようにするために、中性又はわずかにアルカリ性のpH)であり、ポリペプチドに対する非破壊要件を満足する。
トシレートは、メシレートよりも反応性があるが、安定性が小さく、PEG、ジオキサン及びスルホン酸に分解する(Zalipsky,(1995),Bioconjugate Chem.,6,150 165)。また、エポキシドは、アミン結合を生成するのに使用できるが、上記した基よりも反応性がはるかに小さい。
【００８７】
PEGをホスゲンを用いてクロロフォーメートに転化することにより、リシンに対するカルバメート結合を生じる。実質的に同じ反応を、数多くの変異体で実施して、塩素を、N-ヒドロキシスクシンイミド(米国特許第5,122,614号(1992);Zalipsky等,(1992)Biotechnol.Appl.Biochem.,15p.100 114;Mon-fardini等,(1995),Bioconjugate Chem.,6,62 69)、イミダゾール(Allen等、(1991),Carbohydr.Res.,213,pp309 319)、パラ-ニトロフェノール、DMAP(EP632082A1,(1993),Looze,Y.)等で置換することができる。誘導体は、クロロフォーメートを所望の離脱基と反応することにより通常製造される。全てのこれらの基は、ペプチドに対するカルバメート結合を生じる。
さらに、イソシアネートとイソチオシアネートを用いて、それぞれ尿素及びチオ尿素を得る。
【００８８】
アミドは、上記したのと同じ離脱基及び環状イミドトロンを用いてPEG酸から得ることができる(米国特許第5,349,001号(1994)、Greenwald等)。これらの化合物の反応性は、極めて高いが、加水分解を早くすることができる。
無水コハク酸との反応から得られるPEGスクシネートも、使用することができる。ここで構成したエステル基は、接合体をより加水分解しやすくする(米国特許第5,122,614号(1992)、Zalipsky)。この基は、N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化できる。
【００８９】
さらに、特殊なリンカーを、導入できる。塩化シアヌルが、最もよく研究されている(Abuchowski等,(1977),J.Biol.Chem.,252,3578 3581;米国特許第4,179,337号(1979)、Davis等;Shafer等,(1986),J.Polylm.Sci.Polym.Chem.Ed.,24,375 378)。
芳香族アミンにPEGを連結した後にジアゾ化することにより、極めて反応性のあるジアゾニウム塩を生じ、これは、ペプチドとインサイチュ反応することができる。また、アミド結合は、PEGのアズラクトン誘導体を反応させることにより得ることもでき(米国特許第5,321,095号,(1994),Greenwald,R.B.)、したがって追加のアミド結合が導入される。
【００９０】
ある種のペプチドは数多くのリシンを含まないので、複数のPEGを同じリシンに結合することが有利なことがある。これは、例えば、1,3-ジアミノ-2-プロパノールを使用することによりおこなうことができる。
また、PEGは、カルバメート結合を有する酵素のアミノ基にも結合できる(WO95/11924,Greenwald等)。また、リシン残基は、主鎖として使用することもできる。
【００９１】
実施例で使用されるカップリング法は、WO90/13590(Enzon)に記載れさているN-スクシンイミジルカーボネート接合法である。
特定の実施態様によれば、活性化ポリマーは、メチルPEGである。メチルPEGは、WO90/13590に記載のようにしてN-スクシンイミジルカーボネートにより活性化されたものである。カップリングは、アルカリ条件で高収量で実施できる。
【００９２】
ポリマーをタンパク質に連結するためには、WO96/17929及びWO99/00489(Novo Nordisk A/S)に記載されているものと同様の特定の条件において、例えば、分子量が100〜5000Daの範囲であるモノ又はビス活性化PEGを、使用できる。例えば、メチルPEG350は、N-スクシンイミジルカーボネートで活性化でき、活性化PEGの当量を意図するタンパク質におけるリシンのモル数により割ったものとして計算したときにモル比が5を超えるタンパク質変異体とともにインキュベーションできる。固定化タンパク質変異体に連結するためには、PEG:タンパク質比を、PEG濃度が、緩衝能がアルカリ性pHを反応全体を通じて維持するのに十分低いように最適化しなければならないとともに、PEG濃度は、タンパク質の修飾を十分な程度に確保するのに十分に高い。
【００９３】
さらに、活性化PEGは、加水分解を防止(すなわち、酸又は溶媒に溶解する)する条件に保持され、アルカリ性反応緩衝液で直接希釈されることが重要である。一級アミンは、タンパク質のリシン残基で発生するもの以外には存在しないことが必須である。これは、硼酸塩緩衝液において完全に洗浄することにより確実となる。この反応は、タンパク質及び誘導化タンパク質を含有する固相から未反応PEGを含有する流体相を分離することにより、停止される。必要に応じて、固相を、次にTris緩衝液で洗浄して、まだ存在しているいるかもしれないPEG鎖上に未反応部位をブロックことができる。
【００９４】
スブチラーゼ変異体及びスブチラーゼの産生方法
本発明のスブチラーゼ変異体及びスブチラーゼは、当該技術分野において公知のいずれかの方法により産生でき、また、本発明は、本発明のスブチラーゼ変異体又はスブチラーゼをコードする核酸、前記核酸を含むDNA構築物及び前記核酸配列を含む宿主細胞に関する。
【００９５】
一般的に、天然タンパク質は、タンパク質を発現する生物を培養し、続いてタンパク質を精製することにより製造できる。あるいは、天然のタンパク質は、核酸、例えば、ゲノムDNA又はcDNAをクローニングし、タンパク質を発現ベクターにエンコードし、前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培養し、発現したタンパク質を精製することにより製造できる。
典型的には、親タンパク質を部位特異的突然変異させ、発現ベクター、宿主細胞等に導入することにより、タンパク質変異体を製造できる。親タンパク質は、ポリペプチドを産生する株又は発現ライブラリーからクローニングできる。すなわち、親タンパク質は、ゲノムDNAから単離するか、又はcDNAから調製するか、又はそれらの組み合わせから得ることができる。
【００９６】
一般的に、遺伝子のクローニング及び/又は前記遺伝子に突然変異(ランダム及び/又は部位特異的)を導入するための標準的な方法を、親スブチラーゼ、又は本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体を得るために使用できる。好適な手法をさらに説明するために、分子クローニングを参照されたい:Molecular cloning:A laboratory manual(Sambrook等,(1989),Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel,F.M.等(編者);Current protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,1995;Harwood,C.R.及びCutting,S.M.(編者);Molecular Biological Methods for Bacillus(John Wiley and Sons,1990);DNA Cloning:A Practical Approach,第I巻及び第II巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及びS.J.Higgins編(1985));Transcription And Translation(B.D.Hames及びS.J.Higgins,編(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney編(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press(1986));A Practical Guide To Molecular Cloning(B.Perbal(1984));並びにWO96/34946。
【００９７】
発現ベクター
本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体をコードする核酸配列を含む組み換え発現ベクターは、組み換えDNA法に附するのが都合がよいことがあり、且つ核酸配列の発現を生じることがあるいずれかのベクターである。
【００９８】
ベクターの選択は、しばしばそれを導入する宿主細胞に依存することがある。好適なベクターとしては、例えば、直鎖又は閉鎖環状プラスミド又はウイルスを含む。ベクターは、自発的に複製するベクター、すなわち、複製が染色体複製とは無関係である染色体外エンティテーとして存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外因子、微小染色体又は人工染色体であることができる。ベクターは、自己複製を保証するいずれかの手段を含むことができる。複製の細菌性源としては、例えば、プラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060及びpAMβ1の複製源があげられる。酵母宿主細胞において使用するための複製源としては、例えば、2ミクロン複製源、CEN6とARS4との組み合わせ、及びCEN3とARS1との組み合わせである。複製源は、宿主細胞において温度感受性として機能させる突然変異を有するものであることができる(例えば、Ehrlich,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433参照)。
【００９９】
別法として、ベクターは、宿主細胞に導入したときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体(単一又は複数)とともに複製される。宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターは、ゲノムへの組み込みを可能にする核酸配列を含むことがある。特に、ベクターは、核酸配列を含んで、相同又は非相同組み換えによりゲノムへの組み込みが容易となる。ベクター系は、単一ベクター、例えば、プラスミド又はウイルス、又は二種以上のベクター、例えば、プラスミド又はウイルス(一緒に、宿主細胞のゲノムに導入されるべき総DNAを含む)、又はトランスポゾンであることができる。
【０１００】
ベクターは、本発明のスブチラーゼをコードするDNA配列が追加のセグメント、又はDNAの転写に必要とする制御配列に操作可能に連結する、特に発現ベクターであることができる。用語「操作可能に連結した」は、セグメントを、意図する目的のために一緒に機能するように配置することを示す。例えば、転写は、プロモーターにおいて開始し、スブチラーゼ変異体をコードするDNA配列を介して進行する。追加のセグメント又は制御配列は、プロモーター、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナル配列及び転写ターミネーターを含む。最小限、制御配列は、プロモーター並びに転写及び翻訳停止信号を含む。
【０１０１】
プロモーターは、最適の宿主細胞における転写活性を示し、且つ宿主細胞に相同又は非相同であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができるDNA配列である。
【０１０２】
細菌性宿主細胞に使用するのに好適なプロモーターとしては、例えば、バチルススブチリス(Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルスステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニックアミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)アルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)アルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルススブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルスピュミルス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)BANアミラーゼ遺伝子、バチルスリケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルススブチリスxylA及びxylB遺伝子、原核ベータ-ラクタマーゼ遺伝子(Villa-Kamaroff等,1987,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731)のプロモーターを含む。
【０１０３】
他の例として、ファージラムダPR又はPLプロモーター又はE.coli lac、trp若しくはtacプロモーター又はストレプトミセスコエリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)があげられる。さらなるプロモーターには、「Useful proteins from recombinant bacteria(組み換え細菌由来の有用なタンパク質)」,Scientific American,1980,242:74-94;及び上記Sambrook等、1989などがある。
【０１０４】
糸状菌宿主細胞に使用するのに好適なプロモーターとしては、例えば、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、リゾムコールミーハイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)中性アルファ-アミラーゼ、アスペルギルスニガー酸安定アルファ-アミラーゼ、アスペルギルスニガー又はアスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori)グルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコールミーハイリパーゼ、アスペルギルスオリゼーアルカリプロテアーゼ、アスペルギルスオリゼートリオースホスフェートイソメラーゼ、アスペルギルスニデュランス(Aspergillus nidulans)アセトアミダーゼ、フサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ(米国特許第4,288,627号に記載;引用することにより本明細書の内容とする)、及びそれらのハイブリッドをコードする遺伝子から得られたプロモーターである。
【０１０５】
糸状菌宿主細胞に使用するのに特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi(アスペルギルスニガーニュートラルをコードする遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド(-アミラーゼ及びアスペルギルスオリゼートリオースホスフェートイソメラーゼ)並びにglaAプロモーターである。糸状菌宿主細胞に使用するのにさらに好適なプロモーターは、ADH3プロモーター(McKnight等、The EMBO J.4(1985),2093-2099)又はtpiAプロモーターである。
【０１０６】
酵母宿主細胞に使用するのに好適なプロモーターとしては、例えば、酵母解糖遺伝子からのプロモーター(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255(1980),12073-12080;Alber及びKawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1(1982),419-434)又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young等,Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender等編),Plenum Press,ニューヨーク、1982)、又はTPI1(米国特許第4,599,311号)若しくはADH2-4c(Russell等,Nature 304(1983),652-654)プロモーターなどがある。
【０１０７】
さらに有用なプロモーターは、サッカロマイセスセレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロマイセスセレビジアエガラクトキナーゼ遺伝子(GAL1)、サッカロマイセスセレビジアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)、及びサッカロマイセスセレビジアエ3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得たものである。酵母宿主細胞についての他の有用なプロモーターは、Romonos等,1992,Yeast 8:423-488により記載されている。哺乳動物宿主細胞において、有用なプロモーターには、シミアンウイルス(Simian Virus)40(SV40)、ラウス肉腫(Rous sarcoma)ウィルス(RSV)、アデノウィルス及びウシ乳頭腫ウイルス(BPV)由来のもの等のウイルスプロモーターなどがある。
【０１０８】
哺乳動物細胞に使用するのに好適なプロモーターとしては、例えば、SV40プロモーター(Subramani等,Mol.Cell Biol.1(1981),854-864)、MT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter等,Science 222(1983),809-814)又はアデノウイルス2型の主要後期プロモーターがある。昆虫細胞に使用するのに好適なプロモーターの例には、ポリヘドリンプロモーター(米国特許第4,745,051号;Vasuvedan等,FEBS Lett.311,(1992)7-11)、P10プロモーター(J.M.Vlak等,J.Gen.Virology 69,1988,pp.765-776)、オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)ポリヘドロシスウィルス塩基性タンパク質プロモーター(EP397485)、バキュロウイルス先発型初期遺伝子1プロモーター(米国特許第5,155,037号;米国特許第5,162,222号)、バキュロウイルス39K後発型初期遺伝子プロモーター(米国特許第5,155,037号;米国特許第5,162,222号)がある。
【０１０９】
また、本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体をコードするDNA配列は、必要なら、好適なターミネーターに作用可能に接続してもよい。
本発明の組換えベクターは、ベクターが当該宿主細胞において複製できるようにするDNA配列をさらに含んでいてもよい。
【０１１０】
ベクターはまた、選択マーカー、例えば、宿主細胞における欠損を補足する産物をコードする遺伝子、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキセート等の抗生物質又は重金属、ウイルス若しくは除草剤に対する耐性をコードする遺伝子、又は原栄養菌株又は栄養要求体を提供する遺伝子を含んでいてもよい。細菌性選択マーカーの例として、バチルススブチリス(Bacillus subtilis)又はバチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)耐性由来のdal遺伝子があげられる。しばしば使用される哺乳動物マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)である。酵母宿主細胞に好適なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及びURA3である。
【０１１１】
糸状菌宿主細胞に使用するための選択性マーカーは、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hygB(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pryG(オロチジン-5‘-ホスフェートデカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、trpC(アントラニル酸シンターゼ)及びグルホシネート耐性マーカー、並びに他の種からの等価物(これらには限定されない)を含む群から選択することができる。特に、Aspergillus細胞には、アスペルギルスニデュランス(Aspergillus nidulans)又はアスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)のamdS及びpyrGマーカー、及びストレプトミセスハイグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)のbarマーカーが使用される。さらに、選択は、選択性マーカーが、別個のベクター上にある場合、例えば、WO91/17243に記載されているように、共形質転換によりおこなうことができる。
【０１１２】
本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体を宿主細胞の分泌経路に誘導するために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている)を、組み換えベクターに設けることができる。分泌シグナル配列を、的確なリーディングフレームにおける酵素をコードするDNA配列に接合する。分泌シグナル配列は、酵素をコードするDNA配列に対して5'に一般的に位置させる。分泌シグナル配列は、酵素と正常に関連しているものでもよいし、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものでもよい。
【０１１３】
本酵素をコードするDNA配列、プロモーター及び必要に応じてターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションするか、又は好適なPCR増幅スキームによりこれらの配列をアセンブルするか、及びそれらを、複製又は組み込みに必要な情報を含む好適なベクターに挿入するために使用される手順は、当業者には周知である(例えば、Sanbrook等参照)。
本発明の酵素をコードする核酸配列の複数のコピーを、宿主細胞に挿入して核酸配列の発現を増幅することができる。核酸配列の安定な増幅は、配列の少なくとも一つの追加のコピーを、当該技術分野において周知の方法を用いて宿主細胞ゲノムに組み込み、形質転換物を選択することにより得ることができる。
【０１１４】
また、本発明の核酸構築物は、ポリペプチドの発現において有利である一つ以上の因子、例えば、活性化因子(例えば、トランス作用因子)、シャプロン及び加工プロテアーゼをコードする一つ以上の核酸配列を含んでいてもよい。一般的に好まれる宿主細胞において機能的であるいずれかの因子を、本発明に用いてもよい。これらの因子の一つ以上をコードする核酸は、必ずしもポリペプチドをコードする核酸配列と並行ではない。
【０１１５】
宿主細胞
宿主細胞中に導入される、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体をコードするDNA配列は、宿主細胞に対して相同であっても、又は非相同であっても良い。宿主細胞に対して相同である場合、すなわち天然において宿主細胞により産生される場合、それは、典型的には、もう1つのプロモーター配列、又は適用できるなら、その天然の環境においてよりも、別の分泌シグナル配列及び/又はターミネーター配列に作用可能に接続される。用語「相同」とは、当該宿主生物に対して生来の酵素をコードするDNA配列を含むことが意図される。用語「非相同」とは天然において宿主細胞により発現されないDNA配列を含むことが意図される。従って、DNA配列は、もう1つの生物由来のものでもよいし、又は合成配列でもよい。
【０１１６】
本発明のDNA構築物又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を産生できるいずれかの細胞でよく、例えば、原核生物、例えば、バクテリア又は真核生物、例えば、菌細胞、例えば、酵母又は糸状菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳類細胞であることができる。
【０１１７】
培養により、本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体を産生することができる細菌性宿主細胞としては、例えば、グラム陽性細菌、例えばバチルス株、例えばバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス(B.alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス(B.coagulans)、バチルス・サーキュランス(B.circulans)、バチルス・ラウタス(B.lautus)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)又はバチルス・スリンジエンシス(B.thuringiensis)の株;又はストレプトミセス、例えばストレプトミセス・リビダンス(S.lividans)又はストレプトミセス・ムリナス(S.murinus)の株;又はグラム陰性細菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)又はシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp)の株である。
【０１１８】
細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体知られている方法でのコンピテント細胞を用いることによりおこなうことができる(上記したSambrook等参照)。
E.coli等の細菌においてスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を発現するとき、酵素は、典型的には不溶性粒質物(封入体として知られている)として細胞質に保持されてもよいし、細菌性分泌配列により細胞周辺腔に向けられてもよい。前者の場合、細胞が溶解され、そして粒質物が回収され、そして変性され、この後、酵素は変性剤を希釈することによってリフォールディングされる。後者の場合、酵素は、例えば音波処理又は浸透ショックにより細胞を破壊することにより細胞周辺腔の内容物を放出することにより、細胞周辺腔から回収できる。
【０１１９】
グラム陽性細菌、例えば、バチルス又はストレプトミセス株においてスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を発現する場合、酵素は細胞質に保持されてもよいし、又は細菌分泌配列により細胞外培地に向けられてもよい。。後者の場合、酵素は、下記のように培地から回収することができる。
【０１２０】
宿主酵素細胞としては、例えば、カンジダ(Candida)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、ハンセニューラ(Hansenula)又はヤロウィア(Yarrowia)の種の細胞などがある。特定の実施態様によれば、酵素宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・ダグラシー(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)又はサッカロミセス・オビフォルミス(Saccharomyces oviformis)細胞である。
【０１２１】
他の有用な酵素宿主細胞には、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)クルイベロミセス・フラジリス(Kluyveromyces fragilis)ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lypolytica)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ウスティルゴ・メイリス(Ustilgo maylis)、カンジダ・マルトース(Candida maltose)、ピキア・ギアモンディ(Pichia guillermondii)及びピキア・メタノリオ(Pichia methanolio)細胞がある(Gleeson等,J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459-3465;米国特許第4,882,279号及び米国特許第4,879,231号参照)。
【０１２２】
酵素の分類は将来変化することがあるので、本発明の目的のためには、酵素は、Biology and Activities of Yeast(酵素の生物学及び活性)(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.及びDavenport,R.R.編者,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)に記載されているように定義するものとする。酵素の生物学及び酵素遺伝学の操作は、当該技術分野において周知である(例えば、Biochemistry and Genetics of Yeast(酵素の生化学及び遺伝学),Bacil,M.,Horecker,B.J.及びStopani,A.O.M.(編者)、第2版、1987;The Yeasts(酵母),Rose,A.H.及びHarrison,J.S.(編者)、第2版、1987;並びにThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces(酵母Saccharomycesの分子生物学),Strathern等編、1981参照)。
【０１２３】
酵母は、Becker及びGuarente,In Abelson,J.N.及びSimon,M.I.(編者)Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology(酵母遺伝学及び分子生物学の指針並びに酵素学における方法)、第194巻、pp.182-187、Academic Press社、ニューヨーク;Ito等、1983,Journal of Bacteriology 153:163;並びにHinnen等、1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920)において記載されている方法を用いて形質転換できる。
【０１２４】
糸状菌細胞としては、例えば、真菌植物亜門及び卵菌亜門(上記したHawksworth等、1995により定義)の糸状形態などがあり、特に、アクレモニウム(Acremonium)、例えば、アクレモニウム・クリソゲヌム(A.chrysogenum)、アスペルギルス(Aspergillus)、例えば、アスペルギルス・アワモリ(A.awamori)、アスペルギルス・ホエチダス(A.foetidus)、アスペルギルス・ジャポニクス(A.japonicus)、アスペルギル・スニガー(A.niger)、アスペルギルス・ニードランス(A.nidulans)若しくはアスペルギルス・オリザエ(A.oryzae)、フサリウム(Fusarium)、例えば、フサリウム・バクテリジオイデス(F.bactridioides)、フサリウム・セレアリス(F.cerealis)、フサリウム・クルックベレンス(F.crookwellense)、フサリウム・クルモラム(F.culmorum)、フサリウム・グラミニアラム(F.graminearum)、フサリウム・グラミナム(F.graminum)、フサリウム・ヘテロスポラム(F.heterosporum)、フサリウム・ネガンジ(F.negundi)、フサリウム・レチクラタム(F.reticulatum)、フサリウム・ロゼウム(F.roseum)、フサリウム・サンバシナム(F.sambucinum)、フサリウム・サルコクロウム(F.sarcochroum)、フサリウム・スルファリューム(F.sulphureum)、フサリウム・トリコテシオイデス(F.trichothecioides)若しくはフサリウム・オキシスポラム(F.oxysporum)、フミコラ(Humicola)、例えば、フミコラ・インソレンス(H.insolens)若しくはフミコラ・ラヌギノセ(H.lanuginose)、ムコール(Mucor)、例えば、ムコール・ミエーイ(M.miehei)、マイセリオフソラ(Myceliophthora)、例えば、マイセリオフソラ・サーモフィラム(M.thermophilum)、ニューロスポラ(Neurospora)、例えば、ニューロスポラ・クラッサ(N.crassa)、ペニシリウム(Penicillium)、例えば、ペニシリウム・パーピュロジェナム(P.purpurogenum)、チエラビア(Thielavia)、例えば、チエラビア・テレストリス(T.terrestris)、トリポクラジウム(Tolypocladium)又はトリコデルマ(Trichoderma)、例えば、トリコデルマ・ハルジアナム(T.harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(T.koningii)、トリコデルマ・ロンギブラチアタム(T.longibrachiatum)、トリコデルマ・レエセイ(T.reesei)若しくはトリコデルマ・ビリデ(T.viride)の種の細胞でもよいし、又はそれらのテレオモルフ又はシノニムでもよい。タンパク質の発現にAspergillus spp.を使用することは、例えば、EP272277、EP230023に記載されている。
【０１２５】
昆虫細胞としては、例えば、鱗翅目細胞系、例えば、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞又はイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞(米国特許第5,077,214号参照)などがある。培養条件は、好適にはWO89/01029又はWO89/01028に記載されているものでよい。昆虫細胞の形質転換及び非相同ポリペプチドの産生は、米国特許第4,745,051号;米国特許第4,775,624号;米国特許第4,879,236号;米国特許第5,155,037号;米国特許第5,162,222号;EP397,485に記載のようにしておこなうことができる。
【０１２６】
哺乳類細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、新生児ハムスター腎臓(BHK)細胞、COS細胞、又は例えばAmerican Type Culture Collectionから入手可能な、いずれかの番号の他の不死化細胞系などがある。哺乳動物細胞をトランスフェクションし、細胞に導入したDNA配列を発現する方法は、例えば、Kaufman及びSharp,J.Mol.Biol.159(1982),601-621;Southern及びBerg,J.Mol.Appl.Genet.1(1982),327-341;Loyter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982),422-426;Wigler等,Cell 14(1978),725;Corsaro及びPearson,Somatic Cell Genetics 7(1981),603,Ausubel等、Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学における現在のプロトコール)、John Wiley and Sons社,NY,1987,Hawley-Nelson等、Focus 15(1993),73;Ciccarone等、Focus 15(1993),80;Graham及びvan der Eb,Virology 52(1973),456;並びにNeumann等,EMBO J.1(1982),841-845に記載されている。哺乳動物細胞は、Graham及びVan der Eb(1978、Virology 52:546)のカルシウムホスフェート沈降法を用いて直接吸収することによりトランスフェクションできる。
【０１２７】
タンパク質の発現及び単離の方法
本発明の酵素を発現するためには、本発明の酵素をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換又はトランスフェクションした上記した宿主細胞を、典型的には所望の分子を産生できる条件下で好適な栄養培地で培養し、その後、これらを、細胞又は培養液から回収する。
【０１２８】
宿主細胞を培養するのに使用される培地は、適切な補助剤を含有する最小又は複合培地等の宿主細胞を成長させるために好適ないずれかの通常の培地でよい。好適な培地は、商業的業者から入手できるし、又は公表されている処方(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に準じて調製できる。培地は、当該技術分野において公知の方法を用いて調製できる(例えば、細菌及び酵母についての文献;Bennett,J.W.及びLaSure,L.編者、More Gene Manipulations in Fungi(菌類におけるより多くの遺伝子操作),Academic Press,CA,1991参照)。
【０１２９】
本発明の酵素が栄養培地に分泌される場合、培地から直接回収できる。これらが分泌されない場合、細胞ライゼートから回収できる。本発明の酵素は、遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離し、上清又は濾液のタンパク質成分を塩、例えば、硫酸アンモニウムにより沈殿させ、種々のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等(当該酵素によって異なる)による精製を含む、通常の方法により培地から回収できる。
【０１３０】
本発明の酵素は、これらのタンパク質に特異的である当該技術分野において公知である方法を用いて検出できる。これらの検出方法には、特定の抗体の使用、産物の形成又は基質の消失などがある。例えば、酵素アッセイを使用して分子の活性を求めることができる。種々の種類の活性を求める方法は、当該技術分野において公知である。
本発明の酵素は、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除クロマトグラフィー)、電気泳動法(例えば、分離等電点電気泳動法(IEF)、分別溶解性(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、又は抽出を含む当該技術分野において公知の種々の方法により精製できるが(例えば、Protein Purification,J-C Janson及びLars Ryden編者,VCH Publishers,ニューヨーク、1989参照)、これらには限定されない。
【０１３１】
本発明の酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターを、非相同の宿主細胞に形質転換/トランスフェクションするとき、酵素の非相同の組み換え産生が可能となる。非相同の宿主細胞を使用することの利点は、タンパク質又はペプチドを相同な宿主細胞で発現するときに存在することがよくある相同不純物がないことを特徴とする、高度に精製された酵素組成物を製造できることである。これに関連して、相同不純物は、本発明の酵素が最初に得られる相同細胞に由来する不純物(例えば、本発明の酵素以外のポリペプチド)を意味する。
【０１３２】
商業的酵素の用途
また、本発明は、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を含む組成物に関する。例えば、スブチラーゼ/スブチラーゼ変異体は、パーソナルケア用組成物、例えば、シャンプー、固形石けん、化粧水、スキンクリーム、毛染剤、練り歯磨き粉、コンタクトレンズ、化粧品、洗面用化粧品、又は織物の処理、食品、例えば、パン焼き又は食料の製造に使用される組成物、又は清浄目的のための組成物、例えば、洗剤、食器洗い組成物のため、又は硬質表面を清浄にするための組成物において使用できる。
【０１３３】
洗剤
本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体は、例えば、洗剤組成物に使用できる。これは、無塵顆粒、安定化液体、又は保護酵素の形態において洗浄組成物中に含まれていてよい。無塵顆粒は、例えば米国第4,106,991号及び第4,661,452号に開示されているようにして製造でき、そして必要に応じて当該技術分野において公知の方法によりコーティングされていてよい。ワキシーコーティング材としては、例えば、1000〜20000の平均分子量を有するポリ(エチレンオキサイド)製品(ポリエチレングリコール、PEG);16〜50個のエチレンオキサイド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール;アルコールにおいて12〜20個の炭素原子を含み、且つ15〜80個のエチレンオキサイド単位のあるエトキシル化脂肪アルコール;脂肪アルコール;脂肪酸;並びに脂肪酸のモノ-、ジ-及びトリ-グリセリドがある。
【０１３４】
流動床技術による適用に好適な膜形成コーティング材の例としては、例えば、GB特許1483591号に示されている。液体スブチラーゼ/スブチラーゼ変異体調製品は、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又は硼酸等を確立された方法に従って添加することにより安定化できる。その他の酵素安定化剤は、当該技術分野において公知である。保護されたスブチラーゼ/スブチラーゼ変異体は、EP 238,216号に開示されている方法にしたがって調製できる。
【０１３５】
洗浄組成物は、いずれか都合のよい形態、例えば、粉末、顆粒、ペースト又は液体でよい。液体洗剤は水性であって、典型的には70%以下の水、及び0〜30%の有機溶媒を含むものであるか、又は非水性であってよい。
【０１３６】
洗浄組成物は、一種以上の界面活性剤を含んでいてよく、それぞれはアニオン、非イオン、カチオン又は両性であってよい。洗剤は、通常0〜50%のアニオン性界面活性剤、例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、アルファ-オレフィンスルホネート(AOS)、アルキルスルフェート(脂肪アルコールスルフェート)(AS)、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES)、2級アルカンスルホネート(SAS)、アルファ-スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル若しくはアルケニルコハク酸、又は石けんを含有する。それはまた、0〜40%の非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート(AEO又はAE)、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド(例えば、WO92/06154に記載)を含有していてもよい。
【０１３７】
洗剤組成物は、一種以上の他の酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、脂肪分解酵素、クチナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、及びさらに抗菌ポリペプチドをさらに含むことができる。
洗剤は、1〜65%の洗浄ビルダー又は錯化剤、例えば、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTMPA)、アルキル-又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート(例えばHoechst由来のSKS-6)を含有できる。洗剤は、ビルダー未添加、すなわち、実質的に洗剤ビルダーを含有していなくてもよい。
【０１３８】
洗剤は、一種以上のポリマーを含むことができる。これらの例としては、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリカルボン酸塩、例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーである。
洗剤は、過酸形成漂白活性剤、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート(NOBS)と組合せてよい、過硼酸塩又は過炭酸塩等のH2O2源を含む漂白系を含有することができる。別法として、漂白系は、例えば、アミド、イミド又はスルホン型の過オキシ酸を含んでいてもよい。
【０１３９】
洗剤組成物は、通常の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステルを利用して安定化でき、そしてこの組成物は、例えばWO92/19709及びWO92/19708に記載のようにして配合できる。
また、洗剤は、他の通常の洗剤成分、例えば、布帛コンディショナー、例えば粘土、発泡促進剤、泡立て抑制剤、防錆剤、土壌懸濁剤、防土壌再付着剤、染料、殺菌剤、光学増白剤、又は香料も含有できる。
pH(使用濃度で水溶液で測定)は、通常中性又はアルカリ性、例えば、7〜11の範囲である。
【０１４０】
食器洗い洗剤組成物
さらに、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体も、食器洗い洗剤に使用してもよい。
食器洗い洗剤組成物は、典型的にはアニオン性、非イオン性、カチオン性、両性又はこれらの種類の混合物であることができる界面活性剤を含む。洗剤は、低〜非泡形成エトキシル化プロポキシル化直鎖アルコール類等の非イオン性界面活性剤を0〜90%の量で含有してもよい。
洗剤組成物は、無機型及び/又は有機型の洗剤ビルダー塩を含有してもよい。洗剤ビルダーは、さらにリン含有型及び非リン含有型に分類できる。洗剤組成物は、通常1〜90%の洗剤ビルダーを含有する。
【０１４１】
リン含有無機アルカリ性洗剤ビルダーが存在するとき、それらの例としては、水溶性塩、とりわけアルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩及びポリリン酸塩などがある。リン含有有機アルカリ性洗剤ビルダーが存在するときには、それらの例として、ホスホネートの水溶性塩などがある。非リン含有無機ビルダーが存在するときには、それらの例として、水溶性アルカリ金属カーボネート、ボレート及びシリケートだけでなく、種々の種類の水溶性結晶性又は非晶質アルミノシリケートがあげられ、これらのうち、ゼオライトが、最もよく知られている代表例である。
【０１４２】
好適な有機ビルダーとしては、例えば、アルカリ金属、アンモニウム及び置換アンモニウム、シトレート、スクシネート、マロネート、脂肪酸スルホネート、カルボキシメトキシスクシネート、アンモニウムポリアセテート、カルボキシレート、ポリカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、ポリアセチルカルボキシレート及びポリヒドロキシスルホネートなどがある。
他の好適な有機ビルダーとしては、ビルダー性を有することが知られているより高い分子量のポリマー及びコポリマー、例えば、適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸及びポリアクリル酸/ポリマレイン酸共重合体及びそれらの塩があげられる。
【０１４３】
食器洗い洗剤組成物は、塩素/臭素型又は酸素型の漂白剤を含有していてもよい。無機塩素/臭素型漂白剤としては、例えば、次亜塩素酸及び次亜臭素酸リチウム、ナトリウム又はカルシウム、並びに塩素化リン酸三ナトリウムである。有機塩素/臭素型漂白剤としては、例えば、複素環式N-ブロモ及びN-クロロイミド、例えばトリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸、並びにそれと水溶性カチオン、例えばカリウム及びナトリウムとの塩である。ヒダントイン化合物も好適である。
【０１４４】
酸素漂白剤は、特に漂白前駆体との無機過塩の形態、又はペルオキシ酸化合物の形態でもよい。好適なペルオキシ漂白化合物としては、例えば、アルカリ金属ペルボレート、例えば、四水和物及び一水和物、アルカリ金属ペルカーボネート、ペルシリケート及びペルホスフェートなどがある。特に、活性剤材料としては、TAED及びグリセロールトリアセテートであることができる。
【０１４５】
食器洗い洗剤組成物は、酵素用の通常の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステルを利用して安定化できる。
また、食器洗い洗剤組成物は、他の通常の洗剤成分、例えば、解こう剤、フィラー材料、泡抑制剤、防錆剤、土壌懸濁剤、金属イオン封鎖剤、土壌再付着防止剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤及び香料も含有することができる。
【０１４６】
最後に、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体は、通常の食器洗い洗剤、例えば、以下の特許書類のいずれかにおいて記載されている洗剤のいずれかにおいて使用することができる:
EP518719、EP518720、EP518721、EP516553、EP516554、EP516555、GB2200132、DE3741617、DE3727911、DE4212166、DE4137470、DE3833047、WO93/17089、DE4205071、WO52/09680、WO93/18129、WO93/04153、WO92/06157、WO92/08777、EP429124、WO93/21299、US5141664、EP561452、EP561446、GB2234980、WO93/03129、EP481547、EP530870、EP533239、EP554943、EP346137、US5112518、EP318204、EP318279、EP271155、EP271156、EP346136、GB2228945、CA2006687、WO93/25651、EP530635、EP414197、US5240632。
【０１４７】
パーソナルケア用途
本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体のための別の有用な用途分野は、エンドユーザーがタンパク質と密着するパーソナルケア分野、及びアレルギー性の問題が実験装置でみられたパーソナルケア分野である(Kelling等、J.All.Clin.Imm.,1998,Vol.101,pp.179-187及びJohnston等、Hum.Exp.Toxicol.,1999,Vol.18,p.527)。
【０１４８】
まず最初に、本発明の複合体又は組成物は、パーソナルケア製品、例えば、ヘアーケア及びヘアートリートメント製品に有利に使用できる。これには、シャンプー、バルサム、ヘアーコンディショナー、ヘアーウェービング用組成物、染髪用組成物、ヘアートニック、ヘアーリキッド、ヘアークリーム、シャンプー、ヘアーリンス、ヘアースプレー等の製品などがある。
さらに意図するものとして、オーラルケア製品、例えば、歯磨剤、マウスウォッシュ、チューイングガムがある。
【０１４９】
また、意図するものとして、スキンケア製品及び化粧品、例えばスキンクリーム、スキンミルク、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングミルク、コールドクリーム、クリーム石けん、ナリシングエッセンス、スキンローション、ミルキーローション、カラミンローション、ハンドクリーム、パウダー石けん、透明石けん、サンオイル、サンスクリーン、シェービングフォーム、シェービングクリーム、ベビーオイル、口紅、リップクリーム、クリーミーファンデーション、フェースパウダー、パウダーアイシャドー、パウダー、ファンデーション、メークアップベース、エッセンスパウダー、ホワイトニングパウダーなどもある。
【０１５０】
また、コンタクトレンズ衛生製品についても、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体が有利に使用できる。このような製品には、コンタクトレンズ洗浄用及び消毒用製品などがある。
【０１５１】
食品及び飼料
本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、食品又は飼料に使用することもできる。例えば、前記スブチラーゼ変異体/スブチラーゼは、パン生地のグルテン相を調整するのに使用することができる。例えば、強力粉を、プロテアーゼで軟化できる。別の例は、未麦芽穀類による醸造及び/又は窒素含量を制御するために、前記スブチラーゼ/スブチラーゼ変異体が使用できる、醸造産業におけるものである。
動物飼料産業では、前記スブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼを、いわば、動物の消化系を拡張するのに使用することができる。
【０１５２】
材料及び方法
材料
ELISA試薬:
ホースラディシュペルオキシダーゼ標識ブタ抗-ウサギ-Ig(Dako,DK,P217,希釈度=1:1000)
マウス抗-ラットIgE(Serotec MCA193;希釈度=1:200)
ビオチン標識マウス抗-ラットIgG1モノクローナル抗体(Zymed03-9140;希釈度=1:1000)
【０１５３】
ビオチン標識ラット抗-マウスIgG1モノクローナル抗体(Serotec MCA336B;希釈度=1:2000)
ストレプトアビジン-ホースラディシュペルオキシダーゼ(Kirkegard&Perry 14-30-00;希釈度=1:1000)
OPD:o-フェニレン-ジアミン(Kementec cat no.4260)
従来の手段により調製されたウサギ抗SavinaseポリクローナルIgG
従来の手段により調製されたラット抗-SavinaseポリクローナルIgE
【０１５４】
緩衝液及び溶液:
-PBS(pH7.2(1リットル))
NaCl 8.00g
KCl 0.20g
K2HPO4 1.04g
KH2PO4 0.32g
-スクシニル-アラニン-アラニン-プロリン-フェニルアラニン-パラニトロ-アニリド(Suc-AAPF-pNP)Sigma no.S-7388、Mw624.6g/モル
【０１５５】
方法
ELISAによる皮下注射マウスモデルにおける特異的IgEの濃度の測定
タンパク質の皮下注射に反応して産生されるマウスにおける特異的IgE血清抗体の相対濃度が、以下の手順により3層サンドイッチELISAにより測定される:
1)ELISAプレートに、10マイクログラムのラット抗-マウスIgE(Serotech MCA419;希釈度=1:100)緩衝液1(50マイクロリットル/ウェル)をコーティングし、4℃で一晩インキュベーションした。
2)プレートを空にし、2(wt/v)%のスキムミルク、PBSで、室温で少なくとも1/2時間ブロックした(200マイクロリットル/ウェル)。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
【０１５６】
3)プレートを、マウス血清(50マイクロリットル/ウェル)とともにインキュベーションした。この場合、未希釈から開始して、2倍希釈で継続した。いくつかのウエルは、バッファ4のみ(ブランク)、空にした。室温で30分間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
4)スブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体を、0.05(v/v)%Tween20、0.5(wt/v)%スキムミルク、PBSで希釈して適切なタンパク質濃度とした。50マイクロリットル/ウエルを、室温で30分間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
【０１５７】
5)結合抗体を検出するための特異的ポリクロナール抗-スブチラーゼ又は抗-スブチラーゼ変異体抗血清(plg)を、0.05(v/v)%Tween20、0.5(wt/v)%スキムミルク、PBSで希釈した。50マイクロリットル/ウエルを、室温で30分間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
6)ホースラディシュペルオキシダーゼ接合抗-plg-抗体を、0.05(v/v)%Tween20、0.5(wt/v)%スキムミルク、PBSで希釈した。50マイクロリットル/ウエルを、室温で30分間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
【０１５８】
7)OPD 0.6mg/ml+H2O2 0.4マイクロリットル/mlを、クエン酸緩衝液(pH5.2)で混合した。
8)溶液は、使用直前に作製し、10分間インキュベーションした。
9)50マイクロリットル/ウェル
10)2N H4SO450マイクロリットル/ウェルを添加することにより、反応を停止した。
11)プレートを、492nmで、620nmを基準として読み取った。
【０１５９】
IgGについて、同様の測定を、抗マウス-IgG及び標準ラットIgG試薬を用いて実施できる。
【０１６０】
ELISAによるMINTアッセイにおける特異的IgEの濃度の測定
タンパク質の鼻腔内投与に反応して産生されるマウスにおける特異的IgE血清抗体の相対濃度が、以下の手順により3層サンドイッチELISAにより測定される:
1)ELISAプレート(Nunc Maxisorp)に、100マイクロリットル/ウェルラット抗-マウスIgE 重鎖(HD-212-85-IgE3(0.05M カーボネート緩衝液pH9.6において、希釈度=1:100))を、コーティングした。4℃で一晩インキュベーションした。
2)プレートを空にし、0.15M PBS緩衝液pH7.5において、200マイクロリットル/ウェルの2%のスキムミルクで、4℃で1時間ブロックした。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
【０１６１】
3)プレートを、マウス血清(100マイクロリットル/ウェル)の希釈液とともにインキュベーションした。この場合、0.5%スキムミルク及び0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液において、8倍希釈及びその2倍希釈から開始した。正及び負の対照血清試料+緩衝対照の適切な希釈液を、インキュベーションした。室温で、1時間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
4)0.5%スキムミルク及び0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液でタンパク質1マイクログラム/mlに希釈したスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体100マイクロリットル/ウェルを、プレートに添加した。プレートを、4℃で1時間インキュベーションした。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
【０１６２】
5)結合抗体を検出するための特異的ポリクロナール抗-スブチラーゼ又は抗-スブチラーゼ変異体抗血清(plg)を、0.15%スキムミルク及び0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で希釈した。100マイクロリットル/ウエルを、4℃で1時間インキュベーションした。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
6)0.5%スキムミルク及び0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で1:1000希釈したペルオキシダーゼで接合したブタ抗-ウサギIg 100マイクロリットル/ウエルを、プレートに添加した。4℃で1時間インキュベーションした。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
7)250マイクロリットル/ウェルの0.1Mクエン酸/リン酸緩衝液(pH5.0)を、プレートに添加した。約1分間、インキュベーションした。プレートを、空にした。
【０１６３】
8)100マイクロリットル/ウェルのオルトフェニレンジアミン(OPD)溶液(使用直前に、クエン酸/リン酸緩衝液(pH5)12.5ml及び30%過酸化水素12.5マイクロリットルを添加して希釈したOPD10mg)を、プレートに添加した。室温で4分間、インキュベーションした。
9)150マイクロリットル/ウェルの1M H2SO4を添加することにより、反応を停止した。
10)プレートを、490nmで、620nmを基準として読み取った。
【０１６４】
タンパク質工学
例えば、Sambrook等(1989),Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour,NYに記載されているようにして、対応の核酸配列の部位特異的突然変異により、Savinase/スブチラーゼ変異体を得た。
【０１６５】
抗体結合能の測定
CovaLinkプレートの活性化:
アセトンに10mg/mlの塩化シアヌルを添加することにより調製した新鮮な原液を、攪拌しながら、PBSで希釈して1mg/mlの最終濃度とし、直ちに等分してCovaLink NH2プレート(Nunc)(100マイクロリットル/ウェル)に添加し、室温で5分間インキュベーションした。PBSで3回洗浄した後、プレートを、50℃で30分間乾燥し、シールテープでシールし、室温で3週間、プラスチックバッグに保存する。
【０１６６】
抗体/競合的抗原の固定化:
活性化CovaLink NH2プレートに、PBSに添加した所望のタンパク質(5マイクログラム/ml)100マイクロリットルを、4℃で一晩コーティングした後、2(wt/v)%スキムミルク、PBSとともに、室温で30分間インキュベーションし、0.05(v/v)%Tween20、PBSで4回洗浄した。
【０１６７】
プロテアーゼ活性:
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNaでの分析:
プロテアーゼは、ペプチドと、p-ニトロアミンとの間の結合を開裂して、405nmで目に見える黄色の吸収が得られる。簡単に述べると、suc-AAPF-pNa100mgを、ジメチルスルホキシド(DMSO)1mlに溶解する。この100マイクロリットルを、ブリトン-ロビンソン緩衝液、pH8.3で希釈して10mlとし、プロテアーゼ用の基質として使用する。反応は、動力学的に分光光度計で検出する。
【０１６８】
抗-Savinase抗体への結合能の測定:
CovaLink NH2プレートを、マウス抗-ラットIgEモノクローナル抗体でコーティングし、続いて抗体を抗-Savinase特異的ラットポリクローナルIgEで飽和することにより、スブチラーゼ/スブチラーゼ変異体が抗-Savinase抗体に結合する能力を、Savinaseと比較した。プレートを、抗原、すなわち、Savinase(対照)、結合能を試験するスブチラーゼ(例えば、スブチラーゼ変異体を発現するスブチラーゼライブラリー)とともに、インキュベーションした。抗野生型Savinaseポリクローナルウサギ抗血清とともにインキュベーションすることにより、結合抗原の量を測定した。
【０１６９】
活性部位の官能性の測定:
「主鎖プロテアーゼ」インヒビターを、ウエルに固定化し、過剰のタンパク質変異体及び標識抗体とともにインキュベーションした。結合抗体のレベルを、測定する。
試料25マイクロリットル及び抗-Savinase抗体25マイクロリットル(両方とも、0.05(v/v)%Tween20、0.5%(wt/v)スキムミルク含有PBSで希釈)を、塗布ウエルに添加し、室温でインキュベーション(30分間)する。上清を除去し、ウエルを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄する。
【０１７０】
HRP標識種特異的抗-Ig抗体50マイクロリットルを、添加し、30分間インキュベーションした後、ウエルを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄する。最後に、ODP-H2O2混合物50マイクロリットルを添加し、A492を、動力学的に測定して結合抗体のレベルを求める。希釈倍率は、「主鎖タンパク質」について、結合抗体レベルがゼロであるか、ほとんどないように調整する。
別個の試料を官能性について分析し、2つの値を比較する。
所望のタンパク質変異体は、結合抗体レベルが少なくとも2回高く、又は少なくとも2回低く(少なくとも2のデルタ抗体結合値)を示し、同時に、「主鎖タンパク質」と同様な官能性を示す。
【実施例】
【０１７１】
例１. Savinaseにおけるエピトープ配列及びエピトープパターンの同定
エピトープ配列及びパターンを、以前にWO01/83559の実施例1に記載されているようにして決定した。
膜タンパク質の一部分としてのランダムヘキサ-、ノナ-又はドデカペプチドを発現するファージの高多様性ライブラリー(1012)を、精製特異的ウサギIgG並びに精製ラット及びマウスIgG1抗体及びIgE抗体を結合する能力についてスクリーニングした。ファージライブラリーを、従来技術にしたがって得た(WO9215679を参照;引用することにより本明細書の内容とする)。
【０１７２】
Savinase及び他のスブチラーゼをリン酸緩衝溶液(PBS)に溶解して含む選択された標的タンパク質(N=75)を、皮下注射、皮内又は気管内注射することにより、抗体をそれぞれの動物で産生した。それぞれの抗体を、ブタ抗ウサギIgG抗体、マウス抗ラットIgG1抗体若しくはIgE抗体、又はラット抗マウスIgG1抗体若しくはIgE抗体をロードした常磁性免疫ビーズ(Dynal AS)を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより免疫した動物の血清から精製した。
【０１７３】
それぞれのファージライブラリーを、IgG抗体、IgG1抗体及びIgE抗体コーテッドビーズとともにインキュベーションした。ウサギIgG抗体、又はラット若しくはマウスIgG1抗体若しくはIgE抗体に対する親和性を有するオリゴペプチドを発現するファージを、これらの常磁性ビーズを磁場に暴露することにより採取した。採取されたファージを、温和な酸処理によるか、又は無傷酵素で溶離することにより、固定化された抗体から溶離した。単離したファージを、スペシャリストに公知の方法で増幅した。別法として、固定化したファージを、E.coliとともに直接インキュベーションして感染させた。要するに、F因子陽性E.coli(例えば、XL-1 Blue、JM101、TG1)を、ヘルパーファージ(例えば、M13K07)の存在下でM13由来ベクターで感染させ、典型的にグルコース又はIPTGを含有する2xYT、及び適切な選択用抗生物質においてインキュベーションした。
【０１７４】
最後に、細胞を、遠心分離により除去した。これを、それぞれの細胞上清で2〜5回反復した。第2、3、4、及び5ラウンドの選択後、感染したE.coliの一部分を、選択的2xYT寒天平板でインキュベーションし、新生のファージの特異性を、免疫学的に評価した。すなわち、ファージを、ニトロセルラーゼ(NC)膜に移した。各プレートについて、2NCレプリカを作製した。一つのレプリカを、選択抗体とともにインキュベーションし、他のレプリカを、選択抗体、及び競合者としての抗体を得るために使用される免疫源とともにインキュベーションした。免疫源の存在下において不存在であったプラークを特異的であるとみなし、上記した手順で増幅した。
【０１７５】
特異的ファージ-クローンを、ポリエチレングリコールの存在下での遠心分離により、細胞上清から単離した。DNAを単離し、オリゴペプチドをコードするDNA配列をPCRにより増幅し、DNA配列を決定した。これらの全ては、標準法によりおこなった。対応のオリゴペプチドのアミノ酸配列を、DNA配列から推定した。
【０１７６】
このようにして、タンパク質特異的抗体に特異的な多数のペプチド配列を得た。これらの配列を、データベースに集め、配列アラインメントにより解析してエピトープパターンを同定した。この配列アラインメントについては、保存的置換(例えば、グルタメートについてアスパルテート、アルギニンについてリジン、スレオニンについてセリン)は、一つとしてみなした。これから、ほとんどの配列が、抗体が産生したタンパク質に特異的であることがわかった。しかしながら、2選択ラウンドのみを経たファージから、いくつかの交差反応配列が得られた。最初のラウンドでは、22のエピトープパターンを同定した。
【０１７７】
ファージディスプレイのさらなるラウンドでは、より多くの抗体結合配列が得られ、より多くのエピトープパターンが得られた。さらに、環境アレルゲン特異的抗体を結合することが判明したペプチド配列について、文献を調べた(J All Clin Immunol 93(1994)pp.34-43;Int Arch Appl Immunol 103(1994)pp.357-364;Clin Exp Allergy 24(1994)pp.250-256;Mol Immunol 29(1992)pp.1383-1389;J Immunol 121(1989)pp.275-280;J.Immunol 147(1991)pp.205-211;Mol Immunol 29(1992)pp.739-749;Mol Immunol 30(1993)pp.1511-1518;Mol Immunol 28(1991)pp.1225-1232;J.Immunol 151(1993)pp.7206-7213)。これらの抗体結合ペプチド配列を、データベースに含めた。
【０１７８】
これらの配列を、データベースに集め、配列アラインメントにより解析してエピトープパターンを同定した。この配列アラインメントについては、保存的置換(例えば、グルタメートについてアスパルテート、アルギニンについてリジン、スレオニンについてセリン)は、一つとしてみなした。これから、ほとんどの配列が、抗体が産生したタンパク質に特異的であることがわかった。しかしながら、エピトープパターンは、タンパク質、抗体型及び動物種について適用できることが分かった。さらに75エピトープパターンが同定された。
【０１７９】
これらのエピトープパターンを、Savinaseの3D構造について自動的に評価(WO01/83559に記載)し、各アミノ酸の一部分である潜在的エピトープの数(表2では頻度として示してある)を、算出した(表2)。
【０１８０】
【表２】
【０１８１】
例２. Savinaseの3次元構造への局在化;潜在的IgEエピトープに関与するアミノ酸位置
潜在的IgEエピトープに最も関与していると思われることが判明したアミノ酸位置(一般的に、これらは、少なくとも3つのIgEエピトープに潜在的に関与していることが判明したアミノ酸であった)を、Savinaseの3D構造に手動で局在化させた(Protein Data Bank entry 1SVN;Betzel,C.,Klupsch,S.,Papendorf,G.,Hastrup,S.,Branner,S.,Wilson,K.S.:Crystal structure of the alkaline proteinase Savinase from Bacillus lentus at 1.4Å resolution(1.4Å解像度でのバチルスレンツス由来のアルカリ性プロテイナーゼSavinaseの結晶構造).J Mol Biol 223 pp.427(1992))。この際には、適切なソフトウエア(例えば、SwissProt Pdb Viewer,WebLite Viewer)を、使用した。
【０１８２】
3次元構造にアミノ酸を局在化することにより、IgEエピトープに潜在的に関与しているアミノ酸が以下の3つの主要な領域において塊状化することが判明した:
・領域1:P14、A15、R19、G20、T22、A272、R275
・領域2:A48、F50、P52、E54、P55、S57、D60、G61、K94、V104,Q109
・領域3:P129、S130、E136、N140、S161、Y167、R170、A172、D181、R186、A194、G195、L196、R247、T260、L262
・位置P39及びN218は、独立している。
【０１８３】
例３. Savinaseの3次元構造への局在化;タンパク質工学について選択されたアミノ酸位置
アミノ酸が、構造及び酵素活性関連の事柄に基づいてエピトープタンパク質工学について選択された。このことは、3D解析、又は酵素の活性及び/又は安定性についての有利な効果を与える他のタンパク質工学概念からの経験により示唆された位置が優先されたことを意味する。
【０１８４】
選択されたアミノ酸は、
・領域1:A15、R19、R275
・領域2:S57
・領域3:E136、N140、Y167、R170、A172、D181、R186、A194、G195、R247、T260、L262
・位置N218
にある。
【０１８５】
これらの位置を、別個に設計するか、又は互いに組み合わせて設計した。組み合わせは、個々の突然変異の性能及び/又は地勢に基づいて選択した(できるだけ少ない突然変異でできるだけ大きな領域をカバーする)。これらのことに基づいて、表3に示す位置及び位置の組み合わせが、修飾された免疫原性/減少したアレルギー性を有するスブチラーゼを得るための設計に関連することが判明した。
【０１８６】
【表３】
【０１８７】
例４. 抗体結合能が減少したSavinase変異体の試験
有望な変異体の同定を、Bacillus sppにおいて発現した例3の酵素活性変異体の抗体結合能の変化を評価することにより実施した。
【０１８８】
少なくとも2倍の抗体結合能(デルタ結合)の変化は、有意であるとみなした(P<0.05)。これらの変異体に導入された突然変異を、標準法(例えば、A Molecular cloning:A laboratory manual(Sambrook等(1989)、Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel,F.M.等(編者))参照)を用いて、DNA配列解析により同定した。
デルタ結合値が少なくとも2.0であるスブチラーゼ変異体と、それらの抗体結合能を、表４に示す。
【０１８９】
【表４】
【０１９０】
例５. 皮下注射マウスモデルにおけるアレルギー性を減少させるためのSavinase変異体の試験
マウスを、週一回、20週間にわたって、0.9%(wt/vol)NaCl(対照群)50マイクロリットル、又はタンパク質10マイクログラムを含有する0.9%(wt/vol)NaCl 50マイクロリットルで皮下免疫化した。各群のマウスには、デンマーク国リュ、Bomholdtgaard社から購入した雌Balb/Cマウス10匹(約20グラム)が含まれていた。血液試料(100マイクロリットル)を、次の免疫化の前に1週間おきに目から採取した。血清を、血液凝固及び遠心分離により得た。
【０１９１】
各変異体及びSavinaseについて、20週の期間にわたって同じ群の各マウスにおいて検出されたIgEレベルの合計(積算IgEレベル)を、算出した。Savinaseについて、積算IgEレベルは100%に等しく、変異体については、Savinaseに準じて算出した。表5は、これらの変異体の積算IgEレベルは、Savinaseについてよりも少なくとも33%少なく、Savinaseとは統計的に異なることが明らかとなったことを示している。
【０１９２】
【表５】
【０１９３】
例６. 生体内においてアレルギー性を減少させるためのSavinase変異体の試験(MINTアッセイ)
マウス鼻腔内(MINT)モデル(Robinson等、Fund.Appl.Toxicol.34,pp.15-24,1996)。マウスに、実験の第1日目及び第3日目、及びそれから一週間に一回、6週間にわたってタンパク質を鼻腔内投与した。血液試料を、実験開始後15日目、31日目及び45日目に採取した。続いて、血清を、IgG1レベル又はIgEレベルについて分析した。
【０１９４】
変異体S57P+R170L+R247Q;S57P+R247Q;及びS221C(不活性)を、Alcalase（登録商標）及びSavinase（登録商標）(0.9%NaCl中)と比較した。
【０１９５】
平均力価を、表6〜表8に示す:IgG1及びIgEの力価を、最高希釈倍数の逆数として表し、正のELISA読み取り値をlog2に変換した。読み取り値は、OD平均+2×負の対照の標準偏差よりも高い場合には、正とみなす。投与レベル当たりマウス6匹であった。結果を、群平均力価として表す。
【０１９６】
【表６】
【０１９７】
【表７】
【０１９８】
【表８】
【０１９９】
表６〜表８から、変異体S57P+R170L+R247Q、S221C及びS57P+R247Qは、基準タンパク質(Alcalase及びSavinase)よりも、抗原特異的IgG1及びIgE抗体の産生を引き起こす可能性がかなり小さいこと結論できる。
【０２００】
例７. Savinase変異体の洗浄性能の試験
以下の例に、標記の条件下でおこなった多数の洗浄試験から得た結果を示す。
洗剤は、洗剤溶液を作製し、それを電子レンジにおいて85℃で5分間加熱することにより不活性化した市販の洗剤である。pHは、現状の洗剤溶液におけるpHの「そのまま」であり、調整しない。水の硬度は、CaCl2・2H2O;MgCl2・6H2O;NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-=2:1:6)を添加することにより、ミリQ水に調整した。
【０２０１】
洗浄条件は:
1)不活性化市販Tide粉末1g/リットル、30℃、12分洗浄、6dH
2)不活性化市販Tide液1.5g/リットル、30℃、12分洗浄、6dH
試験物質は、血液/ミルク/カーボンブラックで汚したポリエステル/綿材料見本である。
【０２０２】
洗浄後、試験材料の反射率(R)を、J&M Tidas MMS分光光度計を用いて、460nmで測定した。測定は、製造業者のプロトコールに準じておこなった:
R変異体:変異体で洗浄した試験材料の反射率
Rブランク:酵素で洗浄しなかった試験材料の反射率
Δ反射率:R変異体-Rブランク
Δ反射率が高いほど、洗浄性能がよい。Δ反射率は、投与量酵素5nMについて算出する。
表9は、マウスにおいて最低のアレルギー性(IgE産生の観点から)を示す4種のスブチラーゼ変異体のTide粉末洗浄剤における洗浄性能の結果を表す。
【０２０３】
【表９】
【０２０４】
表10は、マウスにおいて最低のアレルギー性(IgE産生の観点から)を示す4種のスブチラーゼ変異体のTide液状洗浄剤における洗浄性能の結果を表す。
【０２０５】
【表１０】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変化した免疫原性を有するスブチラーゼ及びスブチラーゼ変異体、その使用、並びに前記スブチラーゼ及びスブチラーゼ変異体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素をはじめとする増加する数のタンパク質が、種々の産業、家庭及び医薬用として工業的に製造されている。タンパク質は、ヒト及び動物における免疫反応、例えば、アレルギー反応を刺激しやすい。
【０００３】
タンパク質の免疫原性を変更する種々の試みが、おこなわれてきた。一般的に、これは、免疫反応の誘発に関与するエピトープとして知られているタンパク質の局部的な部分のみである。エピトープは、多数のアミノ酸から構成されている。これらのアミノ酸は、一次配列は連続しているが、タンパク質の3次元構造においては互いに近接して位置していることがより多くみられる。エピトープにおける小さな変化が、抗体に対する結合に影響することがあることが判明した。これにより、このようなエピトープの重要性が減少することがあり、高親和性エピトープから低親和性エピトープに転化することがあり、又はエピトープの損失を生じることがある。すなわち、エピトープは、抗体を十分に結合して免疫反応を起こすことができない。
【０００４】
タンパク質の免疫原性を変化させる別の方法に、例えば、PEG等の化合物をタンパク質に付加することによりエピトープをマスクすることがある。
WO00/26230及びWO01/83559は、親タンパク質と比較して免疫原性が減少したタンパク質変異体を選択する2つの異なる方法を開示している。
WO99/38978は、IgE結合部位を修飾することによりアレルゲンを修飾してアレルギー性を低くする方法を開示している。
WO99/53038は、ヒトにおいてより低いアレルギー反応を示す突然変異タンパク質、及びこのようなタンパク質を構成、同定及び製造する方法を開示している。
【０００５】
洗剤工業内で広く使用されているスブチラーゼは、アレルギー等の免疫反応を起こす可能性がある酵素群である。したがって、免疫原性が変化、特にアレルギー性が減少し、同時に、それらの用途に必要とする酵素活性をまだ維持しているスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体が絶えず必要とされている。
WO00/22103は、免疫反応が減少したポリペプチドを開示し、WO01/83559は、修飾された免疫原性を有するタンパク質変異体を開示している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第一の態様によれば、位置57が、位置:170、181及び247のうちの少なくとも一つにおける修飾と組み合わせて修飾されているスブチラーゼ変異体が提供される。
【０００７】
本発明の第二の態様によれば、配列番号:1のスブチラーゼにおいて、Xaa残基が、位置3ではS又はTであり、位置4ではV又はIであり、位置27ではK又はRであり、位置55ではG、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、位置74ではN又はDであり、位置85ではS又はNであり、位置97ではS又はDであり、位置99ではS、G又はRであり、位置101ではS又はAであり、位置102ではV、N、Y又はIであり、位置121ではN又はSであり、位置157ではG、D又はSであり、位置188ではA又はPであり、位置193ではV又はMであり、位置199ではV又はIであり、位置211ではL又はDであり、位置216ではM又はSであり、位置226ではA又はVであり、位置230ではQ又はHであり、位置239ではQ又はRであり、位置242ではN又はDであり、位置246ではN又はKであり、位置268ではT又はAであり、
位置164のXaa残基、位置175のXaa残基及び位置241のXaa残基が、以下の組合せの1つである:
【０００８】
a)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
b)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
【０００９】
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
c)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在である、
スブチラーゼが提供される。
【００１０】
本発明の第三の態様によれば、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体をコードするDNA配列が提供される。
本発明の第四の態様によれば、前記DNA配列を含むベクターが提供される。
本発明の第五の態様によれば、前記ベクターを含む宿主細胞が提供される。
本発明の第六の態様によれば、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を含む組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本発明に関連して、用語「スブチラーゼ」とは、Siezen等、Protein Engng.4(1991)719-737及びSiezen等、Protein Science 6(1997)501-523に記載されているサブグループのセリンプロテアーゼである。
用語「親」は、本発明に関連して、タンパク質変異体を生成するために修飾されるタンパク質を意味する。親タンパク質は、天然(野生型)ポリペプチド、又はいずれかの好適な手段により調製された変異体であることができる。例えば、親タンパク質は、天然ポリペプチドの、一つ以上のアミノ酸残基の置換、化学的修飾、欠失又はトランケーションによるか、アミノ酸配列に対する一つ以上のアミノ酸残基の付加又は挿入により修飾された天然タンパク質の変異体であることができる。したがって、用語「親スブチラーゼ」は、スブチラーゼ変異体を生成するために修飾されるスブチラーゼを意味する。
【００１２】
用語「変異体」は、本発明に関連して、一つ以上のアミノ酸残基で、親タンパク質と比較して修飾されたタンパク質を意味する。
用語「修飾(単一又は複数)」又は「修飾された」とは、本発明に関連して、タンパク質の化学的修飾だけでなく、タンパク質をコードするDNAの遺伝子操作を含むことを意味する。修飾(単一又は複数)は、意図するアミノ酸(単一又は複数)におけるか又はそこでの、アミノ酸側鎖(単一又は複数)の置き換え(単一又は複数)、置換(単一又は複数)、欠失(単一又は複数)及び/又は挿入であることができる。したがって、用語「修飾されたタンパク質」、例えば、「修飾されたスブチラーゼ」は、親タンパク質と比較して修飾(単一又は複数)を含むタンパク質を意味する。
【００１３】
本発明における用語「位置」は、タンパク質におけるアミノ酸のN末端からの数を意味する。本発明で使用される位置数は、バチルスアミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)由来Subtilisin Novo(BPN’)の位置を意味する。しかしながら、他のスブチラーゼも、本発明によりカバーされる。他のスブチラーゼの対応位置は、GAPプログラムを用いることによるバチルスアミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)由来Subtilisin Novo(BPN’)との整合により定義される。GAPは、GCGプログラムパッケージ(Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8、1994年8月,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin USA 53711)(Needleman,S.B.及びWunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-45)で提供される。特記のない限りは、本発明において述べられている位置は、BPN‘の数え方で示され、整合により変換できる。
【００１４】
用語「タンパク質」は、本発明に関連して、タンパク質自体だけでなく、オリゴペプチド、ポリペプチドをカバーすることを意味する。
位置又はアミノ酸との関連で使用される用語「欠失」又は「欠失された」は、本発明に関連して、特定の位置におけるアミノ酸が欠失されたか、又はそれが不存在であることを意味する。
【００１５】
位置又はアミノ酸との関連で使用される用語「挿入」又は「挿入された」とは、本発明に関連して、一つ以上のアミノ酸、例えば、1〜5個のアミノ酸が挿入されたこと、又は一つ以上のアミノ酸、例えば、1〜5個のアミノ酸が特定の位置におけるアミノ酸の後に存在することを意味する。
位置又はアミノ酸との関連で使用される用語「置換」又は「置換された」とは、本発明に関連して、特定の位置におけるアミノ酸が、別のアミノ酸により置き換えられていることか、又は特定のタンパク質、例えば、タンパク質配列の一つとは異なるアミノ酸が存在することを意味する。
【００１６】
略語
配列番号:1'
用語「配列番号:1'」は、本発明の関連において、Xaa残基が、
位置3ではS又はTであり、
位置4ではV又はIであり、
位置27ではK又はRであり、
位置55ではG、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置74ではN又はDであり、
位置85ではS又はNであり、
位置97ではS又はDであり、
【００１７】
位置99ではS、G又はRであり、
位置101ではS又はAであり、
位置102ではV、N、Y又はIであり、
位置121ではN又はSであり、
位置157ではG、D又はSであり、
位置188ではA又はPであり、
位置193ではV又はMであり、
位置199ではV又はIであり、
位置211ではL又はDであり、
位置216ではM又はSであり、
【００１８】
位置226ではA又はVであり、
位置230ではQ又はHであり、
位置239ではQ又はRであり、
位置242ではN又はDであり、
位置246ではN又はKであり、
位置268ではT又はAであり、
位置164のXaa残基、位置175のXaa残基及び位置241のXaa残基が、以下の組合せの1つである:
【００１９】
a)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
【００２０】
b)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
【００２１】
c)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在である、
配列番号:1による配列の略語として使用される。
【００２２】
アミノ酸
アミノ酸について、周知の3文字及び1文字略語が使用される(例えば、Creighton TE(1993),Proteins;Structures and Molecular Properties(構造及び分子特性)、第2版、W.H.Freeman and Company、図1.1、第3頁参照)。略語「X」又は「Xaa」は、任意のアミノ酸について使用される。本発明に関連して、略語「aa」は、「アミノ酸」について使用される。
【００２３】
変異体
アミノ酸(単一又は複数)の欠失、挿入及び/又は置換の説明に際して、以下の命名法を、本発明において使用する:
最初のアミノ酸(単一又は複数)、位置(単一又は複数)、欠失/挿入された/置換アミノ酸(単一又は複数)
【００２４】
これにより、位置195におけるグリシンに対するグルタミン酸の置換は:
Gly195Glu又はG195E
として示され、同じ位置でのグリシンの欠失は:
Gly195*又はG195*
として示され、リジン等の追加のアミノ酸残基の挿入は:
Gly195GlyLys又はG195GK
として示される。
【００２５】
この番号付けについて使用される配列と比較して欠失を示した場所で、そのような位置での挿入は、
位置36におけるアスパラギン酸の挿入については、
*36Asp又は*36D
と示される。
複突然変異は、+により分離される。すなわち、
Arg170Tyr+Gly195Glu又はR170Y+G195E
は、位置170及び位置195において突然変異があり、それぞれアルギニン及びグリシンに対してそれぞれチロシン及びグルタミン酸が置換していることを表す。
【００２６】
本発明のスブチラーゼ変異体及びスブチラーゼ
本発明は、位置57が、位置:170、181及び247のうちの少なくとも一つにおける修飾と組み合わせて修飾されているスブチラーゼ変異体に関し、及び配列番号:1'のスブチラーゼに関する。本発明者等は、前記スブチラーゼ変異体及びスブチラーゼが、それぞれ親スブチラーゼ及びSavinaseと比較して変化した免疫原性を有することを見出した。
【００２７】
本発明のスブチラーゼ変異体の位置57、位置170、位置181及び/又は位置247におけるアミノ酸は、親スブチラーゼをコードするDNAの遺伝子操作によるか、例えば、アミノ酸側鎖(単一又は複数)の化学的修飾により修飾することができる。特に、前記位置は、例えば、欠失、挿入又は置換により、親スブチラーゼをコードするDNAの遺伝子操作により修飾されてもよい。挿入は、典型的にはアミノ酸1〜5個、例えば、1、2、3、4又は5個のアミノ酸の挿入を含む。
【００２８】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明のスブチラーゼ変異体における位置57、位置170、位置181及び/又は位置247は、置換により修飾されてもよい。特に、位置57、位置170、位置181及び/又は位置247におけるアミノ酸の置換は、異なるサイズ、親水性及び/又は極性のアミノ酸に対する置換、例えば、小さなアミノ酸対大きなアミノ酸、親水性アミノ酸対疎水性アミノ酸、極性アミノ酸対非極性アミノ酸、及び塩基性対酸性アミノ酸を含んでいてもよい。これは、これらの種類の置換が、免疫原性を変化されることがよくあるからである。
【００２９】
また、置換は、リジン(K)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)又はシステイン(C)に対する置換等化学的修飾に好適なアミノ酸に対する置換を含んでいてもよい。より詳細には、位置57におけるアミノ酸(aa)残基は、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つに対する置換であってもよく、位置170におけるaa残基が、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つに対する修飾であってもよく、位置181におけるaa残基が、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つに対する修飾であってもよく、及び/又は位置247におけるaa残基が、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つに対する修飾であってもよい。
【００３０】
例えば、本発明のスブチラーゼ変異体は、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hでもよく、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wでもよく、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yでもよく、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yでもよく、又はX57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yでもよい。
【００３１】
特に、本発明のスブチラーゼ変異体は、X57P+X170F、X57P+X170L、X57P+X181N、X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Q、X57P+X170L、より詳細にはX57P+X170L+X247Qのうちの一つであることができる。
【００３２】
特定の実施態様によれば、本発明のスブチラーゼ変異体は、位置:1、3、4、27、36、76、87、97、98、99、100、101、103、104、120、123、159、160、166、167、169、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252、274のうちの一つに、さらに置換、挿入又は欠失を含んでいてもよい。特に、これらの修飾は、X1G、X3T、X4I、X27L、X27R、X36*、X76D、X87N、X99D、X101G、X101R、X103A、X104I、X104N、X104Y、X120D、X123S、X159D、X160S、X167A、X170S、X194P、X195E、X199M、X205I、X217D、X217L、X218S、X222S、X222A、X232V、X235L、X236H、X245R、X248D、X252K、X274Aのうちの一つ以上でもよい。
【００３３】
別の実施態様によれば、本発明のスブチラーゼ変異体は、ループに挿入、すなわち、位置33〜43、位置95〜103、位置125〜132、位置153〜173、位置181〜195、位置202〜204又は位置218〜219のうちの一つ以上において挿入をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
また、本発明は、配列番号:1‘に記載のスブチラーゼに関する。本発明の一実施態様によれば、位置55、位置164、位置175及び/又は位置241のXaaが、欠失されているか、又はアミノ酸1〜5個、例えば、1、2、3、4又は5個のアミノ酸の挿入等の挿入を含む、配列番号:1‘に記載のスブチラーゼでもよい。また、位置55、位置164、位置175及び/又は位置241のXaaは、リシン(K)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)又はシステイン(C)等の化学的修飾に好適であるアミノ酸でもよい。
【００３５】
別の実施態様によれば、位置55のXaaは、残基:G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、Wのうちの一つでよく、及び/又は位置164におけるXaaは、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つでよく、及び/又は位置175におけるXaaは、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つでよく、及び/又は位置241におけるXaaは、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つでよい。特に、位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよい。
【００３６】
例えば、位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置164におけるXaaは、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つでよく、又は位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置175におけるXaaは、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つでよく、又は位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置241におけるXaaが、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つでよい。
【００３７】
より詳細には、位置55におけるXaaが、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置164におけるXaaが、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つでよく、位置241におけるXaaが、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つでよく、又は位置55におけるXaaは、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つでよく、位置175におけるXaaは、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つでよく、位置241におけるXaaが、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つでよい。
【００３８】
また、本発明のスブチラーゼは、位置3、位置4、位置27、位置74、位置85、位置97、位置99、位置101、位置102、位置121、位置157、位置188、位置193、位置199、位置211、位置216、位置226、位置230、位置230、位置239、位置242、位置246及び位置268におけるXaaの組合せが以下のうちの一つでもよい、配列番号:1‘に記載のスブチラーゼでもよい:
【００３９】
i)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４０】
ii)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではNであり、位置97ではSであり、位置99ではGであり、位置101ではSであり、 位置102ではNであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４１】
iii)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではNであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではSであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４２】
iv)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではRであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではYであり、位置121ではSであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではAであるか、
又は
【００４３】
v)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではDであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではAであり、 位置102ではIであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４４】
vi)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではGであり、位置101ではAであり、 位置102ではIであり、位置121ではNであり、位置157ではDであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではVであり、位置230ではHであり、位置239ではRであり、位置242ではDであり、位置246ではKであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４５】
vii)位置3ではSであり、位置4ではVであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではDであり、位置99ではRであり、位置101ではAであり、 位置102ではIであり、位置121ではNであり、位置157ではSであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではVであり、位置211ではLであり、位置216ではSであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４６】
viii)位置3ではTであり、位置4ではIであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではPであり、位置193ではMであり、位置199ではIであり、位置211ではDであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４７】
ix)位置3ではTであり、位置4ではIであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではMであり、位置199ではIであり、位置211ではDであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTであるか、
又は
【００４８】
x)位置3ではTであり、位置4ではIであり、位置27ではKであり、位置74ではNであり、 位置85ではSであり、位置97ではSであり、位置99ではSであり、位置101ではSであり、 位置102ではVであり、位置121ではNであり、位置157ではGであり、位置188ではAであり、位置193ではVであり、位置199ではIであり、位置211ではLであり、位置216ではMであり、位置226ではAであり、位置230ではQであり、位置239ではQであり、位置242ではNであり、位置246ではNであり、位置268ではTである。
【００４９】
また、本発明のスブチラーゼは、位置:1、35、95、96、98、118、158、161、163、164、189、212及び229のうちの一つ以上において置換、挿入又は欠失を含んでいてもよい。このような修飾の例としては、X1G、X27L、I35ID、X74D、X118D、A158AS、X161A、X164S、X189E、X212S及びX229Lなどがある。
また、本発明の一実施態様によれば、本発明のスブチラーゼは、ループに挿入、すなわち、位置33〜42、位置93〜101、位置123〜130、位置151〜167、位置175〜189、位置196〜198又は位置212〜213のうちの一つ以上において挿入を含んでいてもよい。
【００５０】
スブチラーゼ
上記したように、スブチラーゼは、Siezen等、Protein Engng.4(1991)719-737及びSiezen等、Protein Science 6(1997)501-523によるセリンプロテアーゼのサブグループを構成している。スブチラーゼは、これまでSubtilisin 様プロテアーゼと称されていたセリンプロテアーゼの170超アミノ酸配列の相同性分析により定義される。スブチラーゼは、6種類、すなわち、Subtilisin科、Thermitase科、Proteinase K科、Lantibioticペプチダーゼ科、Kexin科、Pyrolysin科に分類される。Subtilisin科は、さらに3種類、すなわち、I-S1(「真の」スブチリシン)、I-S2(高アルカリプロテアーゼ)及び細胞内スブチリシンに分類される。酵素の定義又は分類は、異なったり又は変更してもよいが、本発明の関連においては、上記したスブチラーゼのサブ分類又はサブグループへの分類は、Siezen等、Protein Engng.4(1991)719-737及びSiezen等、Protein Science 6(1997)501-523に記載のものである。
【００５１】
本発明のスブチラーゼ変異体は、親スブチラーゼの修飾により得られる。
本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、自然源から単離したスブチラーゼ、すなわち、野生型スブチラーゼであるか、又は続いての修飾がスブチラーゼの特徴を保持しながらなされた自然源から単離されたスブチラーゼであることができる。親スブチラーゼであることができるこのようなスブチラーゼ変異体としては、例えば、EP130756、EP214435、WO87/04461、WO87/05050、EP251446、EP260105、WO88/08028、WO88/08033、WO89/06279、WO91/00345、EP525610及びWO94/02618に開示されているものなどがある。
【００５２】
別の実施態様によれば、親サブチラーゼは、例えば、J.E.Ness等、Nature Biotechnology,17,893-896(1999)に記載されているDNAシャフリング法により調製されたサブチラーゼでもよい。さらに、親サブチラーゼは、人工的に多様性を得る標準的な方法、例えば、異なるスブチラーゼ遺伝子のDNAシャッフリングにより構築することができる(WO95/22625;Stemmer WPC,Nature 370: 389-91(1994))。例えば、親スブチラーゼは、例えば、Savinase（登録商標）をコードする遺伝子と、天然において確認される一つ以上の部分的なスブチラーゼ配列とのDNAシャフリングにより、構築できる。
【００５３】
特に、本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、スブチラーゼ、より詳細にはI-S1又はI-S2グループに属するスブチリシンであることができる。I-S1スブチラーゼの例としては、スブチリシンBPN'、スブチリシンアミロサッカリタス、スブチリシン168、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチリシンCarlsberg(Alcalase（登録商標）)及びスブチリシンDYなどが挙げられる。I-S2スブチラーゼの例としては、スブチリシン309(Savinase)、スブチリシン147、スブチリシンPB92、BLAP及びK16などが挙げられる。
【００５４】
別の実施態様によれば、本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、Thermitaseファミリーに属しているスブチラーゼ、例えば、Thermitaseでよい。
また、本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、ProteinaseKファミリーに属すもの、例えば、プロテアーゼKでもよい。
親スブチラーゼとして使用することができるスブチラーゼの他の例として、EP503346、EP610808及びWO95/27049に記載のようなPD498(WO93/24623)、アクアリシン、プロテアーゼTW7、プロテアーゼTW3、高アルカリプロテアーゼなどがある。
【００５５】
別の実施態様によれば、親スブチラーゼは、続いての修飾がスブチラーゼの特徴を保持しながらおこなわれたスブチラーゼであることができる。例えば、親スブチラーゼは、ループに挿入、すなわち、位置33〜43、位置95〜103、位置125〜132、位置153〜173、位置181〜195、位置202〜204又は位置218〜219のうちの一つ以上において挿入を含んでいてもよい。
【００５６】
また、親スブチラーゼは、さらなる修飾がなされたSavinaseであってもよい。このようなさらなる修飾には、例えば、位置:1、3、4、27、36、76、87、97、98、99、100、101、103、104、120、123、159、160、166、167、169、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252、274のうちの一つ以上に、さらに置換、挿入又は欠失を含んでいてもよい。これらの修飾としては、例えば、X1G、X3T、X4I、X27L、S27R、*36D、X76D、X87N、X99D、X101G、X101R、X103A、X104I、X104N、X104Y、X120D、X123S、X159D、X160S、X167A、X170S、X194P、X195E、X199M、X205I、X217D、X217L、X218S、X222S、X222A、X232V、X235L、X236H、X245R、X248D、X252K、X274Aなどがある。
【００５７】
特に、本発明の親スブチラーゼ及び/又はスブチラーゼは、Savinase様スブチリシン、すなわち、Savinaseと少なくとも40%が同一である、例えば、Savinaseと少なくとも50%が同一又は少なくとも60%が同一、より特にはSavinaseと少なくとも70%が同一又は少なくとも80%が同一、さらに特にはSavinaseと少なくとも90%が同一又は少なくとも95%が同一であるSavinase様スブチリシンでよい。ここで、この同一性は、本発明の親スブチラーゼ/スブチラーゼの核酸配列をSavinaseの核酸配列と比較したときのものである。
【００５８】
Savinaseに対する種々のスブチリシンプロテアーゼのアラインメントから、種々のスブチリシンプロテアーゼの核酸配列の間の同一性が100%〜40%であることが明らかである。
異なるプロテアーゼ対間の配列の同一性は、以下のとおりである:
【００５９】
【表１】
【００６０】
PD498のタンパク質構造は、WO98/35026(Novo Nordisk)に開示されている。Savinaseの構造は、BETZEL等、J.MOL.BIOL.,Vol.223,p.427(1992)(1svn.pdb)に記載されている。
スブチラーゼ及びスブチラーゼ変異体の活性は、「Methods of Enzymatic Analysis(酵素分析法)」、第3版、1984、Verlag Chemie,Weinheim,第5巻に記載の方法で求めることができる。
【００６１】
免疫原性
本発明者等は、本発明のスブチラーゼ変異体及びスブチラーゼは、それぞれ親スブチラーゼ及びSavinaseに対して変化した免疫原性を有していることを見出した。
本発明において、「免疫反応」とは、4種の標準的な反応(Coombs&GellによるタイプI、II、III及びIV)のいずれかによる免疫系を含む化合物に対する生体の応答を意味する。これに対して、本発明に関連して使用される化合物についての用語「免疫原性」は、ヒトを含む動物における免疫反応を誘発するこの化合物の能力を意味する。
【００６２】
本発明のスブチラーゼ変異体又はスブチラーゼとの関連において使用されるときの用語「変化した免疫原性」とは、前記スブチラーゼ変異体/スブチラーゼに対する生体の免疫応答が、それぞれ親スブチラーゼ/Savinaseに対する同種の免疫応答と比較して、異なる、すなわち、減少しているか、又は増加していることを意味する。
【００６３】
典型的には、これは、抗体結合又はT細胞活性化等の免疫応答の誘発に関与している、エピトープとも称されるタンパク質の一部分のみである。典型的には、エピトープは、一組の非順次アミノ酸、すなわち、一次配列が互いに隣接していないが、タンパク質の3次元構造においては、互いに近接しているアミノ酸からなる。抗体結合に関与するエピトープを同定する一つの特に有用な方法は、ペプチド-ファージ膜タンパク質融合のライブラリーをスクリーニングし、関連する抗原特異的抗体に結合するものを選択し、融合遺伝子のランダム化された部分の配列決定し、結合に関与する配列を整列させ、これらのアラインメントに基づいてコンセンサス配列を定義し、表面上のこれらのコンセンサス配列又は抗原の配列及び/又は構造をマッピングして、抗体結合に関与するエピトープを同定することである。エピトープを同定する方法は、WO01/83559及びWO99/53038に記載されている。
【００６４】
アレルギーは、一般的に予め存在している抗体及びT細胞の存在による、無害の異物に対する不都合な免疫反応として理解されている(Janeway及びTravers,Immunology,Current Biology,Blackwell,Garland,1994,第11章)。ほとんどのアレルギー反応は、IgE介在反応を含み、本発明の関連において、用語「アレルギー反応」は、IgE介在反応 (Coombs&GellによるタイプI反応)を含む化合物に対する生体の反応のことである。この化合物に暴露したときの感作(すなわち、化合物特異的IgE抗体の発現)は、「アレルギー反応」の定義に含まれる。これに対して、本発明に関連して使用される化合物についての用語「アレルゲン性」は、この化合物が、ヒトを含む動物においてアレルギー反応を誘発する能力を意味する。
【００６５】
アレルギー反応の一般的な機構は、感作フェーズと症候性フェーズとに分けられる。感作フェーズは、個体のアレルゲンへの最初の暴露を含む。これは、用途に応じて、吸入、皮膚や目との直接接触又は注射により生じることがある。これにより、特異的Tリンパ球及びBリンパ球が活性化され、アレルゲン特異的IgE抗体、すなわち、免疫グロブリンEの産生を生じる。これらのIgE抗体は、最終的には徴候性フェーズの始まりでのアレルゲンの捕捉及びTリンパ球への提供を容易にする。このフェーズは、同様又は似ている抗原への第二暴露により開始される。特異的IgE抗体は、とりわけマスト細胞及び好塩基球上の特異的IgE受容体に結合し、同時にアレルゲンを捕捉する。IgE抗体がポリクローナルであるとき、IgE受容体のブリッジ及びクラスターが生じる。これにより、マスト細胞及び好塩基球が活性化される。この活性化により、アレルギーの徴候フェーズの初期だけでなく後期の反応に関与する種々の化学伝達物質の放出が引き起こされる。
【００６６】
特に、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、減少したアレルギー性等の減少した免疫原性を有する。
本発明の関連において、アレルゲン性は、Balb/Cマウスにおいて発生したIgE反応として測定されなければならない。これは、マウスを、週一回、20週間にわたって、0.9%(wt/vol)NaCl(対照群)50マイクロリットル、又はタンパク質10マイクログラムを含有する0.9%(wt/vol)NaCl 50マイクロリットルで皮下免疫化し、血清を目から一週間おきに、次の免疫化の前に採取し、その後、IgEレベルを、マウスIgEに特異的なELISAを用いて求めることによっておこなう。
【００６７】
したがって、本発明のスブチラーゼ変異体/スブチラーゼとの関連において使用される用語「減少したアレルゲン性」とは、それぞれ親スブチラーゼ/Savinaseに比しIgE反応が前記アッセイにおいて少ないか、全くないことを意味する。特に、前記スブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼに反応して得られる前記アッセイにおいて測定されるIgEレベルは、それぞれ親スブチラーゼ/Savinaseに反応して得られるIgEレベルの35%、例えば、30%又は25%又は20%又は15%又は10%でよい。すなわち、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼに対するIgE反応は、それぞれ親スブチラーゼ/Savinaseに比して、少なくとも3倍、例えば、5倍又は10倍減少できる。
【００６８】
タンパク質に対する免疫/アレルギー反応についての試験に使用できる他の方法には、生体外アッセイ、例えば、用量反応曲線を用いて詳細に調べることができるタンパク質の抗体結合及び/又は官能性を試験するアッセイ、例えば、(WO99/47680)に記載されているような直接又は競合的ELISA(C-ELISA)、サイトカイン発現プロファイルに基づくアッセイ、並びにB細胞及びT細胞を含む上皮細胞及び他の細胞の増殖又は分化応答に基づくアッセイなどがある。アレルゲン性を試験するための生体内モデルとしては、例えば、モルモット気管内モデル(GPIT)(Ritz等,Fund.Appl.Toxicol.,21,pp.31-37,1993)、マウス皮下モデル(マウス-SC)(WO98/30682)、ラット気管内モデル(ラット-IT)(WO96/17929)及びマウス鼻腔内モデル(MINT)(Robinson等、Fund.Appl.Toxicol.,34,pp.15-24,1996)などがある。
【００６９】
本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、それぞれスブチラーゼ変異体/スブチラーゼの精製製剤を用いることにより、変化したアレルゲン性及び/又は免疫原性について試験できる。したがって、変化したアレルゲン性及び/又は免疫原性についてスブチラーゼ変異体又はスブチラーゼを試験する前に、これらを、通常の方法により、より大きなスケールで発現したり、及び/又は精製できる。
【００７０】
さらなる修飾
本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、例えば、突然変異及び/又は化学接合により、さらに修飾できる。この目的は、アレルゲン性をさらに減少すること、又は酵素のの性能、安定性、熱安定性又はいずれかの他の特徴を高めることでよい。
【００７１】
本発明の一実施態様によれば、スブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、例えば、化学的修飾に好適なアミノ酸を、例えば、エピトープ領域内に存在しているものと置き換えるようにした、タンパク質における置換によりさらに修飾できる。特に、置換は、タンパク質構造への影響を制限するように保存的であることができる。例えば、置換は、リシンに対するアルギニン、アスパラギン酸に対するアスパラギン、グルタミン酸に対するグルタミン、システインに対するスレオニン又はセリンでよい。また、化学的修飾は、最初に一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することなく、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼに存在するアミノ酸について実施してもよい。化学的修飾についての化学反応は、上記した通りである。
【００７２】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼを、さらに修飾して前記酵素のアレルゲン性をさらに減少させてもよい。特に、本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、WO99/00489に記載の方法によりさらに修飾してもよい。この方法では、分子量が100Da〜750Da、特に100〜50Da、例えば、約300Daの高分子を、タンパク質に連結させる。
【００７３】
高分子は、天然及び合成ホモポリマー、例えば、ポリオール(すなわち、ポリ-OH)、ポリアミン(すなわち、ポリ-NH2)及びポリカルボン酸(すなわち、ポリ-COOH)、並びにさらにヘテロポリマー、すなわち、一つ以上の異なるカップリング基、例えば、ヒドロキシル基及びアミン基を含むポリマーなどのいずれかの好適な高分子でよい。具体例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)及びポリプロピレングリコールなどがある。ポリマーを、当業者に公知のいずれかの方法によりスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼに連結できる。典型的には、4〜50個の高分子、例えば、5〜35個の高分子を、前記酵素に連結できる。
【００７４】
本発明のスブチラーゼ変異体/スブチラーゼをさらに修飾するための他の手段として、例えば、スブチラーゼ変異体/スブチラーゼのエピトープ領域における翻訳後修飾についての認識部位の導入などがある。次に、スブチラーゼ変異体/スブチラーゼを、対応の翻訳後修飾ができる好適な宿主生体において発現されなければならない。これらの翻訳後修飾は、エピトープを保護し、したがって、さらに親スブチラーゼ/Savinaseと比して、それぞれスブチラーゼ変異体/スブチラーゼのアレルゲン性及び/又は免疫原性を低下する役割を果たすことができる。翻訳後修飾には、グリコシル化、リン酸化、N末端処理、アシル化、リボシル化及び硫酸化などがある。
【００７５】
良好な例としては、N-グリコシル化があげられる。N-グリコシル化は、Xaa残基も、トリペプチドコンセンサス配列に続くアミノ酸もプリンではない、配列Asn-Xaa-Ser、Asn-Xaa-Thr又はAsn-Xaa-Cysの部位でみられる(T.E.Creighton,「Proteins―Structures and Molecular Properties(タンパク質-構造と分子特性)」、第2版、W.H.Freeman and Co.、ニューヨーク、1993、pp.91-93)。グリコシル化タンパク質変異体のグリコシル鎖の特異的性は、タンパク質及び宿主細胞に依存して直鎖又は分岐鎖でよい。別の例は、リン酸化である。タンパク質配列は、cAMP依存性キナーゼによりリン酸化できる認識配列arg-arg-(xaa)n-ser(ここで、n=0、1又は2)を有するセリンリン酸化部位、又は通常チロシン特異的キナーゼによりリン酸化できる認識配列-lys/arg-(xaa)3-asp/glu-(xaa)3-tyrを有するチロシンリン酸化部位を導入するように修飾できる(T.E.Creighton,「Proteins―Structures and Molecular Properties(タンパク質-構造と分子特性)」、第2版、Freeman、NY、1993)。
【００７６】
化学的修飾
本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、化学的に修飾してもよい。当業者に公知の方法を使用して、前記酵素を化学修飾してもよい。
共有的バイオ接合の調整についての化学反応について、「Bioconjugate Techniques(バイオ接合法)」,Hermanson,G.T.(1996),Academic Press社に記載されている。
【００７７】
位置57、位置170、位置181及び/位置241のアミノ酸を、化学修飾に好適であるアミノ酸に置換することによりスブチラーゼ変異体を修飾する場合には、この置換は、特にポリペプチド構造に対する置換の影響が確実に制限されるように保存的でよい。追加のアミノ基を提供する場合には、これは、リシンに対するアルギニンの置換によりおこなうことができる。両方の残基は、正に帯電しているが、リシンのみが、結合基として好適な遊離アミン基を有する。追加のカルボン酸基を提供する場合には、保存的置換が、例えば、アスパラギンのアスパラギン酸への置換又はグルタミンのグルタミン酸への置換であることができる。これらの残基は、酸性残基上に存在するカルボン酸基を除いて、サイズ及び形状において互いに似ている。SH基を提供する場合には、保存的置換は、トレオニン又はセリンをシステインに変更することによりおこなうことができる。
【００７８】
化学的接合
化学的接合には、タンパク質は、活性又は活性化ポリマーとともにインキュベーションした後、未反応ポリマーから分離する必要がある。これは、溶液でおこなった後精製してもよいし、異なる反応環境及び洗浄に容易にあてることができる固定化タンパク質を用いておこなうのが都合がよい。
【００７９】
高分子が当該ポリペプチド接合すべきであり、且つ高分子が活性でない場合には、好適な手法を使用することにより活性化されなければならない。また、本発明では、高分子をポリペプチドに、リンカーを介して連結することも意図される。好適なリンカーは、当業者には周知である。高分子の活性化及びポリペプチドの接合についての方法及び化学反応は、文献に集中的に記載されている。
【００８０】
不溶性ポリマーの活性化で一般的に使用されている方法には、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジン等による官能基の活性化などがある(「Bioconjugate Techniques(バイオ接合法)」、Hermanson,G.T.(1996)、Academic Press社;「Protein immobilisation.Fundamental and applications(タンパク質の固定化、基礎及び応用)」,R.F.Taylor(1991),Marcel Dekker,NY.;「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking(タンパク質接合及び架橋の化学)」,S.S.Wong(1992),CRC Press,Boca Raton;「Immobilized Affinity Ligand Techniquies(固定化アフィニティーリガンド法)」,G.T.Hermanson等、(1993),Academic Press社,NY.参照)。
【００８１】
一部の方法は、不溶性ポリマーの活性化に関するが、また可溶性ポリマーの活性化に適用できる(例えば、過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、ハロゲン化スルホニル、ジビニルスルホン、カルボジイミド等)。官能基は、ポリマー上のアミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アルデヒド又はスルフヒドリルであり、タンパク質上の選択された結合基は、活性化及び接合化学反応を選択するのに考えなければならない。これらは、通常i)ポリマーの活性化、ii)接合及びiii)残留活性基のブロッキングからなる。
【００８２】
以下において、多数の好適なポリマー活性化法が、簡単に記載されている。しかしながら、他の方法も使用できる。
【００８３】
ポリペプチドの遊離酸基に高分子を連結することは、ジイミド及び例えば、アミノ-PEG又はヒドラジノ-PEG(Pollak等(1976),J.Am.Chem.Soc.,98,289 291)又はジアゾアセテート/アミド(Wong等、(1992),「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking(タンパク質接合及び架橋の化学反応)」、CRC Press)を用いて実施できる。
高分子をヒドロキシ基に連結するのは、水中で実施しなければならないので一般的に極めて困難である。通常、加水分解は、ヒドロキシル基との反応よりも優勢である。
【００８４】
遊離スルフィドリル基に高分子を連結するのは、マレイミドのような特殊な基又はオルト-ピリジルジスルフィドを用いて達成できる。また、ビニルスルホン(米国特許第5,414,135号(1995)、Snow等)は、スルフィドリル基よりも優先するが、述べられている他のものほど選択的ではない。
ポリペプチド鎖におけるアクセシブルなアルギニン残基は、2つのビシニルカルボニル基を含む基により標的とされることができる。
【００８５】
リシンのアミノ基に親電子的に活性化されたPEGを連結することを含む方法が、有用なこともある。アルコール類のための通常の脱離基の多くは、アミン結合を生じる。例えば、アルキルスルホネート、例えば、トレシレート(Nilsson等、(1984)、Methods in Enzymology vol.104,Jacoby,W.B.編,Academic Press:Orlando,pp.56 66;Nilsson等、(1987)、Methods in Enzymology vol.135;Mosbach,K.編;Academic Press:Orlando,pp.65 79;Scouten等、(1987),Methods in Enzymology vol.135,Mosbach,K.編,Academic Press:Orlando,1987;pp.79 84;Crossland等,(1971),J.Amr.Chem.Soc.1971,93,pp.4217 4219)、メシレート(Harris,(1985),上記;Harris等,(1984),J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22,pp.341 352)、アリールスルホネート、例えば、トシレート、及びパラ-ニトロベンゼンスルホネートを、使用することができる。
【００８６】
有機塩化スルホニル、例えば、塩化トレシルは、多数のポリマーにおけるヒドロキシ基、例えば、PEGを、良好な脱離基(スルホネート)に効果的に転化する。ポリペプチドにおけるアミノ基のような求核試薬と反応したとき、離脱基により、安定な結合がポリマーとポリペプチドとの間で形成できるようにする。高接合収率に加えて、反応条件は、一般的に温和(変質及び活性の破壊がほとんどないか、又は全くないようにするために、中性又はわずかにアルカリ性のpH)であり、ポリペプチドに対する非破壊要件を満足する。
トシレートは、メシレートよりも反応性があるが、安定性が小さく、PEG、ジオキサン及びスルホン酸に分解する(Zalipsky,(1995),Bioconjugate Chem.,6,150 165)。また、エポキシドは、アミン結合を生成するのに使用できるが、上記した基よりも反応性がはるかに小さい。
【００８７】
PEGをホスゲンを用いてクロロフォーメートに転化することにより、リシンに対するカルバメート結合を生じる。実質的に同じ反応を、数多くの変異体で実施して、塩素を、N-ヒドロキシスクシンイミド(米国特許第5,122,614号(1992);Zalipsky等,(1992)Biotechnol.Appl.Biochem.,15p.100 114;Mon-fardini等,(1995),Bioconjugate Chem.,6,62 69)、イミダゾール(Allen等、(1991),Carbohydr.Res.,213,pp309 319)、パラ-ニトロフェノール、DMAP(EP632082A1,(1993),Looze,Y.)等で置換することができる。誘導体は、クロロフォーメートを所望の離脱基と反応することにより通常製造される。全てのこれらの基は、ペプチドに対するカルバメート結合を生じる。
さらに、イソシアネートとイソチオシアネートを用いて、それぞれ尿素及びチオ尿素を得る。
【００８８】
アミドは、上記したのと同じ離脱基及び環状イミドトロンを用いてPEG酸から得ることができる(米国特許第5,349,001号(1994)、Greenwald等)。これらの化合物の反応性は、極めて高いが、加水分解を早くすることができる。
無水コハク酸との反応から得られるPEGスクシネートも、使用することができる。ここで構成したエステル基は、接合体をより加水分解しやすくする(米国特許第5,122,614号(1992)、Zalipsky)。この基は、N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化できる。
【００８９】
さらに、特殊なリンカーを、導入できる。塩化シアヌルが、最もよく研究されている(Abuchowski等,(1977),J.Biol.Chem.,252,3578 3581;米国特許第4,179,337号(1979)、Davis等;Shafer等,(1986),J.Polylm.Sci.Polym.Chem.Ed.,24,375 378)。
芳香族アミンにPEGを連結した後にジアゾ化することにより、極めて反応性のあるジアゾニウム塩を生じ、これは、ペプチドとインサイチュ反応することができる。また、アミド結合は、PEGのアズラクトン誘導体を反応させることにより得ることもでき(米国特許第5,321,095号,(1994),Greenwald,R.B.)、したがって追加のアミド結合が導入される。
【００９０】
ある種のペプチドは数多くのリシンを含まないので、複数のPEGを同じリシンに結合することが有利なことがある。これは、例えば、1,3-ジアミノ-2-プロパノールを使用することによりおこなうことができる。
また、PEGは、カルバメート結合を有する酵素のアミノ基にも結合できる(WO95/11924,Greenwald等)。また、リシン残基は、主鎖として使用することもできる。
【００９１】
実施例で使用されるカップリング法は、WO90/13590(Enzon)に記載れさているN-スクシンイミジルカーボネート接合法である。
特定の実施態様によれば、活性化ポリマーは、メチルPEGである。メチルPEGは、WO90/13590に記載のようにしてN-スクシンイミジルカーボネートにより活性化されたものである。カップリングは、アルカリ条件で高収量で実施できる。
【００９２】
ポリマーをタンパク質に連結するためには、WO96/17929及びWO99/00489(Novo Nordisk A/S)に記載されているものと同様の特定の条件において、例えば、分子量が100〜5000Daの範囲であるモノ又はビス活性化PEGを、使用できる。例えば、メチルPEG350は、N-スクシンイミジルカーボネートで活性化でき、活性化PEGの当量を意図するタンパク質におけるリシンのモル数により割ったものとして計算したときにモル比が5を超えるタンパク質変異体とともにインキュベーションできる。固定化タンパク質変異体に連結するためには、PEG:タンパク質比を、PEG濃度が、緩衝能がアルカリ性pHを反応全体を通じて維持するのに十分低いように最適化しなければならないとともに、PEG濃度は、タンパク質の修飾を十分な程度に確保するのに十分に高い。
【００９３】
さらに、活性化PEGは、加水分解を防止(すなわち、酸又は溶媒に溶解する)する条件に保持され、アルカリ性反応緩衝液で直接希釈されることが重要である。一級アミンは、タンパク質のリシン残基で発生するもの以外には存在しないことが必須である。これは、硼酸塩緩衝液において完全に洗浄することにより確実となる。この反応は、タンパク質及び誘導化タンパク質を含有する固相から未反応PEGを含有する流体相を分離することにより、停止される。必要に応じて、固相を、次にTris緩衝液で洗浄して、まだ存在しているいるかもしれないPEG鎖上に未反応部位をブロックことができる。
【００９４】
スブチラーゼ変異体及びスブチラーゼの産生方法
本発明のスブチラーゼ変異体及びスブチラーゼは、当該技術分野において公知のいずれかの方法により産生でき、また、本発明は、本発明のスブチラーゼ変異体又はスブチラーゼをコードする核酸、前記核酸を含むDNA構築物及び前記核酸配列を含む宿主細胞に関する。
【００９５】
一般的に、天然タンパク質は、タンパク質を発現する生物を培養し、続いてタンパク質を精製することにより製造できる。あるいは、天然のタンパク質は、核酸、例えば、ゲノムDNA又はcDNAをクローニングし、タンパク質を発現ベクターにエンコードし、前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培養し、発現したタンパク質を精製することにより製造できる。
典型的には、親タンパク質を部位特異的突然変異させ、発現ベクター、宿主細胞等に導入することにより、タンパク質変異体を製造できる。親タンパク質は、ポリペプチドを産生する株又は発現ライブラリーからクローニングできる。すなわち、親タンパク質は、ゲノムDNAから単離するか、又はcDNAから調製するか、又はそれらの組み合わせから得ることができる。
【００９６】
一般的に、遺伝子のクローニング及び/又は前記遺伝子に突然変異(ランダム及び/又は部位特異的)を導入するための標準的な方法を、親スブチラーゼ、又は本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体を得るために使用できる。好適な手法をさらに説明するために、分子クローニングを参照されたい:Molecular cloning:A laboratory manual(Sambrook等,(1989),Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel,F.M.等(編者);Current protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,1995;Harwood,C.R.及びCutting,S.M.(編者);Molecular Biological Methods for Bacillus(John Wiley and Sons,1990);DNA Cloning:A Practical Approach,第I巻及び第II巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及びS.J.Higgins編(1985));Transcription And Translation(B.D.Hames及びS.J.Higgins,編(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney編(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press(1986));A Practical Guide To Molecular Cloning(B.Perbal(1984));並びにWO96/34946。
【００９７】
発現ベクター
本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体をコードする核酸配列を含む組み換え発現ベクターは、組み換えDNA法に附するのが都合がよいことがあり、且つ核酸配列の発現を生じることがあるいずれかのベクターである。
【００９８】
ベクターの選択は、しばしばそれを導入する宿主細胞に依存することがある。好適なベクターとしては、例えば、直鎖又は閉鎖環状プラスミド又はウイルスを含む。ベクターは、自発的に複製するベクター、すなわち、複製が染色体複製とは無関係である染色体外エンティテーとして存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外因子、微小染色体又は人工染色体であることができる。ベクターは、自己複製を保証するいずれかの手段を含むことができる。複製の細菌性源としては、例えば、プラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060及びpAMβ1の複製源があげられる。酵母宿主細胞において使用するための複製源としては、例えば、2ミクロン複製源、CEN6とARS4との組み合わせ、及びCEN3とARS1との組み合わせである。複製源は、宿主細胞において温度感受性として機能させる突然変異を有するものであることができる(例えば、Ehrlich,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433参照)。
【００９９】
別法として、ベクターは、宿主細胞に導入したときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体(単一又は複数)とともに複製される。宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターは、ゲノムへの組み込みを可能にする核酸配列を含むことがある。特に、ベクターは、核酸配列を含んで、相同又は非相同組み換えによりゲノムへの組み込みが容易となる。ベクター系は、単一ベクター、例えば、プラスミド又はウイルス、又は二種以上のベクター、例えば、プラスミド又はウイルス(一緒に、宿主細胞のゲノムに導入されるべき総DNAを含む)、又はトランスポゾンであることができる。
【０１００】
ベクターは、本発明のスブチラーゼをコードするDNA配列が追加のセグメント、又はDNAの転写に必要とする制御配列に操作可能に連結する、特に発現ベクターであることができる。用語「操作可能に連結した」は、セグメントを、意図する目的のために一緒に機能するように配置することを示す。例えば、転写は、プロモーターにおいて開始し、スブチラーゼ変異体をコードするDNA配列を介して進行する。追加のセグメント又は制御配列は、プロモーター、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナル配列及び転写ターミネーターを含む。最小限、制御配列は、プロモーター並びに転写及び翻訳停止信号を含む。
【０１０１】
プロモーターは、最適の宿主細胞における転写活性を示し、且つ宿主細胞に相同又は非相同であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができるDNA配列である。
【０１０２】
細菌性宿主細胞に使用するのに好適なプロモーターとしては、例えば、バチルススブチリス(Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルスステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニックアミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)アルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)アルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルススブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルスピュミルス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)BANアミラーゼ遺伝子、バチルスリケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルススブチリスxylA及びxylB遺伝子、原核ベータ-ラクタマーゼ遺伝子(Villa-Kamaroff等,1987,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731)のプロモーターを含む。
【０１０３】
他の例として、ファージラムダPR又はPLプロモーター又はE.coli lac、trp若しくはtacプロモーター又はストレプトミセスコエリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)があげられる。さらなるプロモーターには、「Useful proteins from recombinant bacteria(組み換え細菌由来の有用なタンパク質)」,Scientific American,1980,242:74-94;及び上記Sambrook等、1989などがある。
【０１０４】
糸状菌宿主細胞に使用するのに好適なプロモーターとしては、例えば、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、リゾムコールミーハイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)中性アルファ-アミラーゼ、アスペルギルスニガー酸安定アルファ-アミラーゼ、アスペルギルスニガー又はアスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori)グルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコールミーハイリパーゼ、アスペルギルスオリゼーアルカリプロテアーゼ、アスペルギルスオリゼートリオースホスフェートイソメラーゼ、アスペルギルスニデュランス(Aspergillus nidulans)アセトアミダーゼ、フサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ(米国特許第4,288,627号に記載;引用することにより本明細書の内容とする)、及びそれらのハイブリッドをコードする遺伝子から得られたプロモーターである。
【０１０５】
糸状菌宿主細胞に使用するのに特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi(アスペルギルスニガーニュートラルをコードする遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド(-アミラーゼ及びアスペルギルスオリゼートリオースホスフェートイソメラーゼ)並びにglaAプロモーターである。糸状菌宿主細胞に使用するのにさらに好適なプロモーターは、ADH3プロモーター(McKnight等、The EMBO J.4(1985),2093-2099)又はtpiAプロモーターである。
【０１０６】
酵母宿主細胞に使用するのに好適なプロモーターとしては、例えば、酵母解糖遺伝子からのプロモーター(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255(1980),12073-12080;Alber及びKawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1(1982),419-434)又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young等,Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender等編),Plenum Press,ニューヨーク、1982)、又はTPI1(米国特許第4,599,311号)若しくはADH2-4c(Russell等,Nature 304(1983),652-654)プロモーターなどがある。
【０１０７】
さらに有用なプロモーターは、サッカロマイセスセレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロマイセスセレビジアエガラクトキナーゼ遺伝子(GAL1)、サッカロマイセスセレビジアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)、及びサッカロマイセスセレビジアエ3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得たものである。酵母宿主細胞についての他の有用なプロモーターは、Romonos等,1992,Yeast 8:423-488により記載されている。哺乳動物宿主細胞において、有用なプロモーターには、シミアンウイルス(Simian Virus)40(SV40)、ラウス肉腫(Rous sarcoma)ウィルス(RSV)、アデノウィルス及びウシ乳頭腫ウイルス(BPV)由来のもの等のウイルスプロモーターなどがある。
【０１０８】
哺乳動物細胞に使用するのに好適なプロモーターとしては、例えば、SV40プロモーター(Subramani等,Mol.Cell Biol.1(1981),854-864)、MT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter等,Science 222(1983),809-814)又はアデノウイルス2型の主要後期プロモーターがある。昆虫細胞に使用するのに好適なプロモーターの例には、ポリヘドリンプロモーター(米国特許第4,745,051号;Vasuvedan等,FEBS Lett.311,(1992)7-11)、P10プロモーター(J.M.Vlak等,J.Gen.Virology 69,1988,pp.765-776)、オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)ポリヘドロシスウィルス塩基性タンパク質プロモーター(EP397485)、バキュロウイルス先発型初期遺伝子1プロモーター(米国特許第5,155,037号;米国特許第5,162,222号)、バキュロウイルス39K後発型初期遺伝子プロモーター(米国特許第5,155,037号;米国特許第5,162,222号)がある。
【０１０９】
また、本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体をコードするDNA配列は、必要なら、好適なターミネーターに作用可能に接続してもよい。
本発明の組換えベクターは、ベクターが当該宿主細胞において複製できるようにするDNA配列をさらに含んでいてもよい。
【０１１０】
ベクターはまた、選択マーカー、例えば、宿主細胞における欠損を補足する産物をコードする遺伝子、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキセート等の抗生物質又は重金属、ウイルス若しくは除草剤に対する耐性をコードする遺伝子、又は原栄養菌株又は栄養要求体を提供する遺伝子を含んでいてもよい。細菌性選択マーカーの例として、バチルススブチリス(Bacillus subtilis)又はバチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)耐性由来のdal遺伝子があげられる。しばしば使用される哺乳動物マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)である。酵母宿主細胞に好適なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及びURA3である。
【０１１１】
糸状菌宿主細胞に使用するための選択性マーカーは、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hygB(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pryG(オロチジン-5‘-ホスフェートデカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、trpC(アントラニル酸シンターゼ)及びグルホシネート耐性マーカー、並びに他の種からの等価物(これらには限定されない)を含む群から選択することができる。特に、Aspergillus細胞には、アスペルギルスニデュランス(Aspergillus nidulans)又はアスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)のamdS及びpyrGマーカー、及びストレプトミセスハイグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)のbarマーカーが使用される。さらに、選択は、選択性マーカーが、別個のベクター上にある場合、例えば、WO91/17243に記載されているように、共形質転換によりおこなうことができる。
【０１１２】
本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体を宿主細胞の分泌経路に誘導するために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている)を、組み換えベクターに設けることができる。分泌シグナル配列を、的確なリーディングフレームにおける酵素をコードするDNA配列に接合する。分泌シグナル配列は、酵素をコードするDNA配列に対して5'に一般的に位置させる。分泌シグナル配列は、酵素と正常に関連しているものでもよいし、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものでもよい。
【０１１３】
本酵素をコードするDNA配列、プロモーター及び必要に応じてターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションするか、又は好適なPCR増幅スキームによりこれらの配列をアセンブルするか、及びそれらを、複製又は組み込みに必要な情報を含む好適なベクターに挿入するために使用される手順は、当業者には周知である(例えば、Sanbrook等参照)。
本発明の酵素をコードする核酸配列の複数のコピーを、宿主細胞に挿入して核酸配列の発現を増幅することができる。核酸配列の安定な増幅は、配列の少なくとも一つの追加のコピーを、当該技術分野において周知の方法を用いて宿主細胞ゲノムに組み込み、形質転換物を選択することにより得ることができる。
【０１１４】
また、本発明の核酸構築物は、ポリペプチドの発現において有利である一つ以上の因子、例えば、活性化因子(例えば、トランス作用因子)、シャプロン及び加工プロテアーゼをコードする一つ以上の核酸配列を含んでいてもよい。一般的に好まれる宿主細胞において機能的であるいずれかの因子を、本発明に用いてもよい。これらの因子の一つ以上をコードする核酸は、必ずしもポリペプチドをコードする核酸配列と並行ではない。
【０１１５】
宿主細胞
宿主細胞中に導入される、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体をコードするDNA配列は、宿主細胞に対して相同であっても、又は非相同であっても良い。宿主細胞に対して相同である場合、すなわち天然において宿主細胞により産生される場合、それは、典型的には、もう1つのプロモーター配列、又は適用できるなら、その天然の環境においてよりも、別の分泌シグナル配列及び/又はターミネーター配列に作用可能に接続される。用語「相同」とは、当該宿主生物に対して生来の酵素をコードするDNA配列を含むことが意図される。用語「非相同」とは天然において宿主細胞により発現されないDNA配列を含むことが意図される。従って、DNA配列は、もう1つの生物由来のものでもよいし、又は合成配列でもよい。
【０１１６】
本発明のDNA構築物又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を産生できるいずれかの細胞でよく、例えば、原核生物、例えば、バクテリア又は真核生物、例えば、菌細胞、例えば、酵母又は糸状菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳類細胞であることができる。
【０１１７】
培養により、本発明のスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体を産生することができる細菌性宿主細胞としては、例えば、グラム陽性細菌、例えばバチルス株、例えばバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス(B.alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス(B.coagulans)、バチルス・サーキュランス(B.circulans)、バチルス・ラウタス(B.lautus)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)又はバチルス・スリンジエンシス(B.thuringiensis)の株;又はストレプトミセス、例えばストレプトミセス・リビダンス(S.lividans)又はストレプトミセス・ムリナス(S.murinus)の株;又はグラム陰性細菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)又はシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp)の株である。
【０１１８】
細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体知られている方法でのコンピテント細胞を用いることによりおこなうことができる(上記したSambrook等参照)。
E.coli等の細菌においてスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を発現するとき、酵素は、典型的には不溶性粒質物(封入体として知られている)として細胞質に保持されてもよいし、細菌性分泌配列により細胞周辺腔に向けられてもよい。前者の場合、細胞が溶解され、そして粒質物が回収され、そして変性され、この後、酵素は変性剤を希釈することによってリフォールディングされる。後者の場合、酵素は、例えば音波処理又は浸透ショックにより細胞を破壊することにより細胞周辺腔の内容物を放出することにより、細胞周辺腔から回収できる。
【０１１９】
グラム陽性細菌、例えば、バチルス又はストレプトミセス株においてスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を発現する場合、酵素は細胞質に保持されてもよいし、又は細菌分泌配列により細胞外培地に向けられてもよい。。後者の場合、酵素は、下記のように培地から回収することができる。
【０１２０】
宿主酵素細胞としては、例えば、カンジダ(Candida)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、ハンセニューラ(Hansenula)又はヤロウィア(Yarrowia)の種の細胞などがある。特定の実施態様によれば、酵素宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・ダグラシー(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)又はサッカロミセス・オビフォルミス(Saccharomyces oviformis)細胞である。
【０１２１】
他の有用な酵素宿主細胞には、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)クルイベロミセス・フラジリス(Kluyveromyces fragilis)ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lypolytica)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ウスティルゴ・メイリス(Ustilgo maylis)、カンジダ・マルトース(Candida maltose)、ピキア・ギアモンディ(Pichia guillermondii)及びピキア・メタノリオ(Pichia methanolio)細胞がある(Gleeson等,J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459-3465;米国特許第4,882,279号及び米国特許第4,879,231号参照)。
【０１２２】
酵素の分類は将来変化することがあるので、本発明の目的のためには、酵素は、Biology and Activities of Yeast(酵素の生物学及び活性)(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.及びDavenport,R.R.編者,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)に記載されているように定義するものとする。酵素の生物学及び酵素遺伝学の操作は、当該技術分野において周知である(例えば、Biochemistry and Genetics of Yeast(酵素の生化学及び遺伝学),Bacil,M.,Horecker,B.J.及びStopani,A.O.M.(編者)、第2版、1987;The Yeasts(酵母),Rose,A.H.及びHarrison,J.S.(編者)、第2版、1987;並びにThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces(酵母Saccharomycesの分子生物学),Strathern等編、1981参照)。
【０１２３】
酵母は、Becker及びGuarente,In Abelson,J.N.及びSimon,M.I.(編者)Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology(酵母遺伝学及び分子生物学の指針並びに酵素学における方法)、第194巻、pp.182-187、Academic Press社、ニューヨーク;Ito等、1983,Journal of Bacteriology 153:163;並びにHinnen等、1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920)において記載されている方法を用いて形質転換できる。
【０１２４】
糸状菌細胞としては、例えば、真菌植物亜門及び卵菌亜門(上記したHawksworth等、1995により定義)の糸状形態などがあり、特に、アクレモニウム(Acremonium)、例えば、アクレモニウム・クリソゲヌム(A.chrysogenum)、アスペルギルス(Aspergillus)、例えば、アスペルギルス・アワモリ(A.awamori)、アスペルギルス・ホエチダス(A.foetidus)、アスペルギルス・ジャポニクス(A.japonicus)、アスペルギル・スニガー(A.niger)、アスペルギルス・ニードランス(A.nidulans)若しくはアスペルギルス・オリザエ(A.oryzae)、フサリウム(Fusarium)、例えば、フサリウム・バクテリジオイデス(F.bactridioides)、フサリウム・セレアリス(F.cerealis)、フサリウム・クルックベレンス(F.crookwellense)、フサリウム・クルモラム(F.culmorum)、フサリウム・グラミニアラム(F.graminearum)、フサリウム・グラミナム(F.graminum)、フサリウム・ヘテロスポラム(F.heterosporum)、フサリウム・ネガンジ(F.negundi)、フサリウム・レチクラタム(F.reticulatum)、フサリウム・ロゼウム(F.roseum)、フサリウム・サンバシナム(F.sambucinum)、フサリウム・サルコクロウム(F.sarcochroum)、フサリウム・スルファリューム(F.sulphureum)、フサリウム・トリコテシオイデス(F.trichothecioides)若しくはフサリウム・オキシスポラム(F.oxysporum)、フミコラ(Humicola)、例えば、フミコラ・インソレンス(H.insolens)若しくはフミコラ・ラヌギノセ(H.lanuginose)、ムコール(Mucor)、例えば、ムコール・ミエーイ(M.miehei)、マイセリオフソラ(Myceliophthora)、例えば、マイセリオフソラ・サーモフィラム(M.thermophilum)、ニューロスポラ(Neurospora)、例えば、ニューロスポラ・クラッサ(N.crassa)、ペニシリウム(Penicillium)、例えば、ペニシリウム・パーピュロジェナム(P.purpurogenum)、チエラビア(Thielavia)、例えば、チエラビア・テレストリス(T.terrestris)、トリポクラジウム(Tolypocladium)又はトリコデルマ(Trichoderma)、例えば、トリコデルマ・ハルジアナム(T.harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(T.koningii)、トリコデルマ・ロンギブラチアタム(T.longibrachiatum)、トリコデルマ・レエセイ(T.reesei)若しくはトリコデルマ・ビリデ(T.viride)の種の細胞でもよいし、又はそれらのテレオモルフ又はシノニムでもよい。タンパク質の発現にAspergillus spp.を使用することは、例えば、EP272277、EP230023に記載されている。
【０１２５】
昆虫細胞としては、例えば、鱗翅目細胞系、例えば、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞又はイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞(米国特許第5,077,214号参照)などがある。培養条件は、好適にはWO89/01029又はWO89/01028に記載されているものでよい。昆虫細胞の形質転換及び非相同ポリペプチドの産生は、米国特許第4,745,051号;米国特許第4,775,624号;米国特許第4,879,236号;米国特許第5,155,037号;米国特許第5,162,222号;EP397,485に記載のようにしておこなうことができる。
【０１２６】
哺乳類細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、新生児ハムスター腎臓(BHK)細胞、COS細胞、又は例えばAmerican Type Culture Collectionから入手可能な、いずれかの番号の他の不死化細胞系などがある。哺乳動物細胞をトランスフェクションし、細胞に導入したDNA配列を発現する方法は、例えば、Kaufman及びSharp,J.Mol.Biol.159(1982),601-621;Southern及びBerg,J.Mol.Appl.Genet.1(1982),327-341;Loyter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982),422-426;Wigler等,Cell 14(1978),725;Corsaro及びPearson,Somatic Cell Genetics 7(1981),603,Ausubel等、Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学における現在のプロトコール)、John Wiley and Sons社,NY,1987,Hawley-Nelson等、Focus 15(1993),73;Ciccarone等、Focus 15(1993),80;Graham及びvan der Eb,Virology 52(1973),456;並びにNeumann等,EMBO J.1(1982),841-845に記載されている。哺乳動物細胞は、Graham及びVan der Eb(1978、Virology 52:546)のカルシウムホスフェート沈降法を用いて直接吸収することによりトランスフェクションできる。
【０１２７】
タンパク質の発現及び単離の方法
本発明の酵素を発現するためには、本発明の酵素をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換又はトランスフェクションした上記した宿主細胞を、典型的には所望の分子を産生できる条件下で好適な栄養培地で培養し、その後、これらを、細胞又は培養液から回収する。
【０１２８】
宿主細胞を培養するのに使用される培地は、適切な補助剤を含有する最小又は複合培地等の宿主細胞を成長させるために好適ないずれかの通常の培地でよい。好適な培地は、商業的業者から入手できるし、又は公表されている処方(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に準じて調製できる。培地は、当該技術分野において公知の方法を用いて調製できる(例えば、細菌及び酵母についての文献;Bennett,J.W.及びLaSure,L.編者、More Gene Manipulations in Fungi(菌類におけるより多くの遺伝子操作),Academic Press,CA,1991参照)。
【０１２９】
本発明の酵素が栄養培地に分泌される場合、培地から直接回収できる。これらが分泌されない場合、細胞ライゼートから回収できる。本発明の酵素は、遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離し、上清又は濾液のタンパク質成分を塩、例えば、硫酸アンモニウムにより沈殿させ、種々のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等(当該酵素によって異なる)による精製を含む、通常の方法により培地から回収できる。
【０１３０】
本発明の酵素は、これらのタンパク質に特異的である当該技術分野において公知である方法を用いて検出できる。これらの検出方法には、特定の抗体の使用、産物の形成又は基質の消失などがある。例えば、酵素アッセイを使用して分子の活性を求めることができる。種々の種類の活性を求める方法は、当該技術分野において公知である。
本発明の酵素は、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除クロマトグラフィー)、電気泳動法(例えば、分離等電点電気泳動法(IEF)、分別溶解性(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、又は抽出を含む当該技術分野において公知の種々の方法により精製できるが(例えば、Protein Purification,J-C Janson及びLars Ryden編者,VCH Publishers,ニューヨーク、1989参照)、これらには限定されない。
【０１３１】
本発明の酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターを、非相同の宿主細胞に形質転換/トランスフェクションするとき、酵素の非相同の組み換え産生が可能となる。非相同の宿主細胞を使用することの利点は、タンパク質又はペプチドを相同な宿主細胞で発現するときに存在することがよくある相同不純物がないことを特徴とする、高度に精製された酵素組成物を製造できることである。これに関連して、相同不純物は、本発明の酵素が最初に得られる相同細胞に由来する不純物(例えば、本発明の酵素以外のポリペプチド)を意味する。
【０１３２】
商業的酵素の用途
また、本発明は、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体を含む組成物に関する。例えば、スブチラーゼ/スブチラーゼ変異体は、パーソナルケア用組成物、例えば、シャンプー、固形石けん、化粧水、スキンクリーム、毛染剤、練り歯磨き粉、コンタクトレンズ、化粧品、洗面用化粧品、又は織物の処理、食品、例えば、パン焼き又は食料の製造に使用される組成物、又は清浄目的のための組成物、例えば、洗剤、食器洗い組成物のため、又は硬質表面を清浄にするための組成物において使用できる。
【０１３３】
洗剤
本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体は、例えば、洗剤組成物に使用できる。これは、無塵顆粒、安定化液体、又は保護酵素の形態において洗浄組成物中に含まれていてよい。無塵顆粒は、例えば米国第4,106,991号及び第4,661,452号に開示されているようにして製造でき、そして必要に応じて当該技術分野において公知の方法によりコーティングされていてよい。ワキシーコーティング材としては、例えば、1000〜20000の平均分子量を有するポリ(エチレンオキサイド)製品(ポリエチレングリコール、PEG);16〜50個のエチレンオキサイド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール;アルコールにおいて12〜20個の炭素原子を含み、且つ15〜80個のエチレンオキサイド単位のあるエトキシル化脂肪アルコール;脂肪アルコール;脂肪酸;並びに脂肪酸のモノ-、ジ-及びトリ-グリセリドがある。
【０１３４】
流動床技術による適用に好適な膜形成コーティング材の例としては、例えば、GB特許1483591号に示されている。液体スブチラーゼ/スブチラーゼ変異体調製品は、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又は硼酸等を確立された方法に従って添加することにより安定化できる。その他の酵素安定化剤は、当該技術分野において公知である。保護されたスブチラーゼ/スブチラーゼ変異体は、EP 238,216号に開示されている方法にしたがって調製できる。
【０１３５】
洗浄組成物は、いずれか都合のよい形態、例えば、粉末、顆粒、ペースト又は液体でよい。液体洗剤は水性であって、典型的には70%以下の水、及び0〜30%の有機溶媒を含むものであるか、又は非水性であってよい。
【０１３６】
洗浄組成物は、一種以上の界面活性剤を含んでいてよく、それぞれはアニオン、非イオン、カチオン又は両性であってよい。洗剤は、通常0〜50%のアニオン性界面活性剤、例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、アルファ-オレフィンスルホネート(AOS)、アルキルスルフェート(脂肪アルコールスルフェート)(AS)、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES)、2級アルカンスルホネート(SAS)、アルファ-スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル若しくはアルケニルコハク酸、又は石けんを含有する。それはまた、0〜40%の非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート(AEO又はAE)、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド(例えば、WO92/06154に記載)を含有していてもよい。
【０１３７】
洗剤組成物は、一種以上の他の酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、脂肪分解酵素、クチナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、及びさらに抗菌ポリペプチドをさらに含むことができる。
洗剤は、1〜65%の洗浄ビルダー又は錯化剤、例えば、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTMPA)、アルキル-又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート(例えばHoechst由来のSKS-6)を含有できる。洗剤は、ビルダー未添加、すなわち、実質的に洗剤ビルダーを含有していなくてもよい。
【０１３８】
洗剤は、一種以上のポリマーを含むことができる。これらの例としては、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリカルボン酸塩、例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーである。
洗剤は、過酸形成漂白活性剤、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート(NOBS)と組合せてよい、過硼酸塩又は過炭酸塩等のH2O2源を含む漂白系を含有することができる。別法として、漂白系は、例えば、アミド、イミド又はスルホン型の過オキシ酸を含んでいてもよい。
【０１３９】
洗剤組成物は、通常の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステルを利用して安定化でき、そしてこの組成物は、例えばWO92/19709及びWO92/19708に記載のようにして配合できる。
また、洗剤は、他の通常の洗剤成分、例えば、布帛コンディショナー、例えば粘土、発泡促進剤、泡立て抑制剤、防錆剤、土壌懸濁剤、防土壌再付着剤、染料、殺菌剤、光学増白剤、又は香料も含有できる。
pH(使用濃度で水溶液で測定)は、通常中性又はアルカリ性、例えば、7〜11の範囲である。
【０１４０】
食器洗い洗剤組成物
さらに、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体も、食器洗い洗剤に使用してもよい。
食器洗い洗剤組成物は、典型的にはアニオン性、非イオン性、カチオン性、両性又はこれらの種類の混合物であることができる界面活性剤を含む。洗剤は、低〜非泡形成エトキシル化プロポキシル化直鎖アルコール類等の非イオン性界面活性剤を0〜90%の量で含有してもよい。
洗剤組成物は、無機型及び/又は有機型の洗剤ビルダー塩を含有してもよい。洗剤ビルダーは、さらにリン含有型及び非リン含有型に分類できる。洗剤組成物は、通常1〜90%の洗剤ビルダーを含有する。
【０１４１】
リン含有無機アルカリ性洗剤ビルダーが存在するとき、それらの例としては、水溶性塩、とりわけアルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩及びポリリン酸塩などがある。リン含有有機アルカリ性洗剤ビルダーが存在するときには、それらの例として、ホスホネートの水溶性塩などがある。非リン含有無機ビルダーが存在するときには、それらの例として、水溶性アルカリ金属カーボネート、ボレート及びシリケートだけでなく、種々の種類の水溶性結晶性又は非晶質アルミノシリケートがあげられ、これらのうち、ゼオライトが、最もよく知られている代表例である。
【０１４２】
好適な有機ビルダーとしては、例えば、アルカリ金属、アンモニウム及び置換アンモニウム、シトレート、スクシネート、マロネート、脂肪酸スルホネート、カルボキシメトキシスクシネート、アンモニウムポリアセテート、カルボキシレート、ポリカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、ポリアセチルカルボキシレート及びポリヒドロキシスルホネートなどがある。
他の好適な有機ビルダーとしては、ビルダー性を有することが知られているより高い分子量のポリマー及びコポリマー、例えば、適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸及びポリアクリル酸/ポリマレイン酸共重合体及びそれらの塩があげられる。
【０１４３】
食器洗い洗剤組成物は、塩素/臭素型又は酸素型の漂白剤を含有していてもよい。無機塩素/臭素型漂白剤としては、例えば、次亜塩素酸及び次亜臭素酸リチウム、ナトリウム又はカルシウム、並びに塩素化リン酸三ナトリウムである。有機塩素/臭素型漂白剤としては、例えば、複素環式N-ブロモ及びN-クロロイミド、例えばトリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸、並びにそれと水溶性カチオン、例えばカリウム及びナトリウムとの塩である。ヒダントイン化合物も好適である。
【０１４４】
酸素漂白剤は、特に漂白前駆体との無機過塩の形態、又はペルオキシ酸化合物の形態でもよい。好適なペルオキシ漂白化合物としては、例えば、アルカリ金属ペルボレート、例えば、四水和物及び一水和物、アルカリ金属ペルカーボネート、ペルシリケート及びペルホスフェートなどがある。特に、活性剤材料としては、TAED及びグリセロールトリアセテートであることができる。
【０１４５】
食器洗い洗剤組成物は、酵素用の通常の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステルを利用して安定化できる。
また、食器洗い洗剤組成物は、他の通常の洗剤成分、例えば、解こう剤、フィラー材料、泡抑制剤、防錆剤、土壌懸濁剤、金属イオン封鎖剤、土壌再付着防止剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤及び香料も含有することができる。
【０１４６】
最後に、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体は、通常の食器洗い洗剤、例えば、以下の特許書類のいずれかにおいて記載されている洗剤のいずれかにおいて使用することができる:
EP518719、EP518720、EP518721、EP516553、EP516554、EP516555、GB2200132、DE3741617、DE3727911、DE4212166、DE4137470、DE3833047、WO93/17089、DE4205071、WO52/09680、WO93/18129、WO93/04153、WO92/06157、WO92/08777、EP429124、WO93/21299、US5141664、EP561452、EP561446、GB2234980、WO93/03129、EP481547、EP530870、EP533239、EP554943、EP346137、US5112518、EP318204、EP318279、EP271155、EP271156、EP346136、GB2228945、CA2006687、WO93/25651、EP530635、EP414197、US5240632。
【０１４７】
パーソナルケア用途
本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体のための別の有用な用途分野は、エンドユーザーがタンパク質と密着するパーソナルケア分野、及びアレルギー性の問題が実験装置でみられたパーソナルケア分野である(Kelling等、J.All.Clin.Imm.,1998,Vol.101,pp.179-187及びJohnston等、Hum.Exp.Toxicol.,1999,Vol.18,p.527)。
【０１４８】
まず最初に、本発明の複合体又は組成物は、パーソナルケア製品、例えば、ヘアーケア及びヘアートリートメント製品に有利に使用できる。これには、シャンプー、バルサム、ヘアーコンディショナー、ヘアーウェービング用組成物、染髪用組成物、ヘアートニック、ヘアーリキッド、ヘアークリーム、シャンプー、ヘアーリンス、ヘアースプレー等の製品などがある。
さらに意図するものとして、オーラルケア製品、例えば、歯磨剤、マウスウォッシュ、チューイングガムがある。
【０１４９】
また、意図するものとして、スキンケア製品及び化粧品、例えばスキンクリーム、スキンミルク、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングミルク、コールドクリーム、クリーム石けん、ナリシングエッセンス、スキンローション、ミルキーローション、カラミンローション、ハンドクリーム、パウダー石けん、透明石けん、サンオイル、サンスクリーン、シェービングフォーム、シェービングクリーム、ベビーオイル、口紅、リップクリーム、クリーミーファンデーション、フェースパウダー、パウダーアイシャドー、パウダー、ファンデーション、メークアップベース、エッセンスパウダー、ホワイトニングパウダーなどもある。
【０１５０】
また、コンタクトレンズ衛生製品についても、本発明のスブチラーゼ及び/又はスブチラーゼ変異体が有利に使用できる。このような製品には、コンタクトレンズ洗浄用及び消毒用製品などがある。
【０１５１】
食品及び飼料
本発明のスブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼは、食品又は飼料に使用することもできる。例えば、前記スブチラーゼ変異体/スブチラーゼは、パン生地のグルテン相を調整するのに使用することができる。例えば、強力粉を、プロテアーゼで軟化できる。別の例は、未麦芽穀類による醸造及び/又は窒素含量を制御するために、前記スブチラーゼ/スブチラーゼ変異体が使用できる、醸造産業におけるものである。
動物飼料産業では、前記スブチラーゼ変異体及び/又はスブチラーゼを、いわば、動物の消化系を拡張するのに使用することができる。
【０１５２】
材料及び方法
材料
ELISA試薬:
ホースラディシュペルオキシダーゼ標識ブタ抗-ウサギ-Ig(Dako,DK,P217,希釈度=1:1000)
マウス抗-ラットIgE(Serotec MCA193;希釈度=1:200)
ビオチン標識マウス抗-ラットIgG1モノクローナル抗体(Zymed03-9140;希釈度=1:1000)
【０１５３】
ビオチン標識ラット抗-マウスIgG1モノクローナル抗体(Serotec MCA336B;希釈度=1:2000)
ストレプトアビジン-ホースラディシュペルオキシダーゼ(Kirkegard&Perry 14-30-00;希釈度=1:1000)
OPD:o-フェニレン-ジアミン(Kementec cat no.4260)
従来の手段により調製されたウサギ抗SavinaseポリクローナルIgG
従来の手段により調製されたラット抗-SavinaseポリクローナルIgE
【０１５４】
緩衝液及び溶液:
-PBS(pH7.2(1リットル))
NaCl 8.00g
KCl 0.20g
K2HPO4 1.04g
KH2PO4 0.32g
-スクシニル-アラニン-アラニン-プロリン-フェニルアラニン-パラニトロ-アニリド(Suc-AAPF-pNP)Sigma no.S-7388、Mw624.6g/モル
【０１５５】
方法
ELISAによる皮下注射マウスモデルにおける特異的IgEの濃度の測定
タンパク質の皮下注射に反応して産生されるマウスにおける特異的IgE血清抗体の相対濃度が、以下の手順により3層サンドイッチELISAにより測定される:
1)ELISAプレートに、10マイクログラムのラット抗-マウスIgE(Serotech MCA419;希釈度=1:100)緩衝液1(50マイクロリットル/ウェル)をコーティングし、4℃で一晩インキュベーションした。
2)プレートを空にし、2(wt/v)%のスキムミルク、PBSで、室温で少なくとも1/2時間ブロックした(200マイクロリットル/ウェル)。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
【０１５６】
3)プレートを、マウス血清(50マイクロリットル/ウェル)とともにインキュベーションした。この場合、未希釈から開始して、2倍希釈で継続した。いくつかのウエルは、バッファ4のみ(ブランク)、空にした。室温で30分間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
4)スブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体を、0.05(v/v)%Tween20、0.5(wt/v)%スキムミルク、PBSで希釈して適切なタンパク質濃度とした。50マイクロリットル/ウエルを、室温で30分間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
【０１５７】
5)結合抗体を検出するための特異的ポリクロナール抗-スブチラーゼ又は抗-スブチラーゼ変異体抗血清(plg)を、0.05(v/v)%Tween20、0.5(wt/v)%スキムミルク、PBSで希釈した。50マイクロリットル/ウエルを、室温で30分間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
6)ホースラディシュペルオキシダーゼ接合抗-plg-抗体を、0.05(v/v)%Tween20、0.5(wt/v)%スキムミルク、PBSで希釈した。50マイクロリットル/ウエルを、室温で30分間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄した。
【０１５８】
7)OPD 0.6mg/ml+H2O2 0.4マイクロリットル/mlを、クエン酸緩衝液(pH5.2)で混合した。
8)溶液は、使用直前に作製し、10分間インキュベーションした。
9)50マイクロリットル/ウェル
10)2N H4SO450マイクロリットル/ウェルを添加することにより、反応を停止した。
11)プレートを、492nmで、620nmを基準として読み取った。
【０１５９】
IgGについて、同様の測定を、抗マウス-IgG及び標準ラットIgG試薬を用いて実施できる。
【０１６０】
ELISAによるMINTアッセイにおける特異的IgEの濃度の測定
タンパク質の鼻腔内投与に反応して産生されるマウスにおける特異的IgE血清抗体の相対濃度が、以下の手順により3層サンドイッチELISAにより測定される:
1)ELISAプレート(Nunc Maxisorp)に、100マイクロリットル/ウェルラット抗-マウスIgE 重鎖(HD-212-85-IgE3(0.05M カーボネート緩衝液pH9.6において、希釈度=1:100))を、コーティングした。4℃で一晩インキュベーションした。
2)プレートを空にし、0.15M PBS緩衝液pH7.5において、200マイクロリットル/ウェルの2%のスキムミルクで、4℃で1時間ブロックした。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
【０１６１】
3)プレートを、マウス血清(100マイクロリットル/ウェル)の希釈液とともにインキュベーションした。この場合、0.5%スキムミルク及び0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液において、8倍希釈及びその2倍希釈から開始した。正及び負の対照血清試料+緩衝対照の適切な希釈液を、インキュベーションした。室温で、1時間インキュベーションした。穏やかに震盪した。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
4)0.5%スキムミルク及び0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液でタンパク質1マイクログラム/mlに希釈したスブチラーゼ又はスブチラーゼ変異体100マイクロリットル/ウェルを、プレートに添加した。プレートを、4℃で1時間インキュベーションした。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
【０１６２】
5)結合抗体を検出するための特異的ポリクロナール抗-スブチラーゼ又は抗-スブチラーゼ変異体抗血清(plg)を、0.15%スキムミルク及び0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で希釈した。100マイクロリットル/ウエルを、4℃で1時間インキュベーションした。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
6)0.5%スキムミルク及び0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で1:1000希釈したペルオキシダーゼで接合したブタ抗-ウサギIg 100マイクロリットル/ウエルを、プレートに添加した。4℃で1時間インキュベーションした。プレートを、0.05%Tween20を含有する0.15M PBS緩衝液で3回洗浄した。
7)250マイクロリットル/ウェルの0.1Mクエン酸/リン酸緩衝液(pH5.0)を、プレートに添加した。約1分間、インキュベーションした。プレートを、空にした。
【０１６３】
8)100マイクロリットル/ウェルのオルトフェニレンジアミン(OPD)溶液(使用直前に、クエン酸/リン酸緩衝液(pH5)12.5ml及び30%過酸化水素12.5マイクロリットルを添加して希釈したOPD10mg)を、プレートに添加した。室温で4分間、インキュベーションした。
9)150マイクロリットル/ウェルの1M H2SO4を添加することにより、反応を停止した。
10)プレートを、490nmで、620nmを基準として読み取った。
【０１６４】
タンパク質工学
例えば、Sambrook等(1989),Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour,NYに記載されているようにして、対応の核酸配列の部位特異的突然変異により、Savinase/スブチラーゼ変異体を得た。
【０１６５】
抗体結合能の測定
CovaLinkプレートの活性化:
アセトンに10mg/mlの塩化シアヌルを添加することにより調製した新鮮な原液を、攪拌しながら、PBSで希釈して1mg/mlの最終濃度とし、直ちに等分してCovaLink NH2プレート(Nunc)(100マイクロリットル/ウェル)に添加し、室温で5分間インキュベーションした。PBSで3回洗浄した後、プレートを、50℃で30分間乾燥し、シールテープでシールし、室温で3週間、プラスチックバッグに保存する。
【０１６６】
抗体/競合的抗原の固定化:
活性化CovaLink NH2プレートに、PBSに添加した所望のタンパク質(5マイクログラム/ml)100マイクロリットルを、4℃で一晩コーティングした後、2(wt/v)%スキムミルク、PBSとともに、室温で30分間インキュベーションし、0.05(v/v)%Tween20、PBSで4回洗浄した。
【０１６７】
プロテアーゼ活性:
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNaでの分析:
プロテアーゼは、ペプチドと、p-ニトロアミンとの間の結合を開裂して、405nmで目に見える黄色の吸収が得られる。簡単に述べると、suc-AAPF-pNa100mgを、ジメチルスルホキシド(DMSO)1mlに溶解する。この100マイクロリットルを、ブリトン-ロビンソン緩衝液、pH8.3で希釈して10mlとし、プロテアーゼ用の基質として使用する。反応は、動力学的に分光光度計で検出する。
【０１６８】
抗-Savinase抗体への結合能の測定:
CovaLink NH2プレートを、マウス抗-ラットIgEモノクローナル抗体でコーティングし、続いて抗体を抗-Savinase特異的ラットポリクローナルIgEで飽和することにより、スブチラーゼ/スブチラーゼ変異体が抗-Savinase抗体に結合する能力を、Savinaseと比較した。プレートを、抗原、すなわち、Savinase(対照)、結合能を試験するスブチラーゼ(例えば、スブチラーゼ変異体を発現するスブチラーゼライブラリー)とともに、インキュベーションした。抗野生型Savinaseポリクローナルウサギ抗血清とともにインキュベーションすることにより、結合抗原の量を測定した。
【０１６９】
活性部位の官能性の測定:
「主鎖プロテアーゼ」インヒビターを、ウエルに固定化し、過剰のタンパク質変異体及び標識抗体とともにインキュベーションした。結合抗体のレベルを、測定する。
試料25マイクロリットル及び抗-Savinase抗体25マイクロリットル(両方とも、0.05(v/v)%Tween20、0.5%(wt/v)スキムミルク含有PBSで希釈)を、塗布ウエルに添加し、室温でインキュベーション(30分間)する。上清を除去し、ウエルを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄する。
【０１７０】
HRP標識種特異的抗-Ig抗体50マイクロリットルを、添加し、30分間インキュベーションした後、ウエルを、0.05(v/v)%Tween20、PBSで3回洗浄する。最後に、ODP-H2O2混合物50マイクロリットルを添加し、A492を、動力学的に測定して結合抗体のレベルを求める。希釈倍率は、「主鎖タンパク質」について、結合抗体レベルがゼロであるか、ほとんどないように調整する。
別個の試料を官能性について分析し、2つの値を比較する。
所望のタンパク質変異体は、結合抗体レベルが少なくとも2回高く、又は少なくとも2回低く(少なくとも2のデルタ抗体結合値)を示し、同時に、「主鎖タンパク質」と同様な官能性を示す。
【実施例】
【０１７１】
例１. Savinaseにおけるエピトープ配列及びエピトープパターンの同定
エピトープ配列及びパターンを、以前にWO01/83559の実施例1に記載されているようにして決定した。
膜タンパク質の一部分としてのランダムヘキサ-、ノナ-又はドデカペプチドを発現するファージの高多様性ライブラリー(1012)を、精製特異的ウサギIgG並びに精製ラット及びマウスIgG1抗体及びIgE抗体を結合する能力についてスクリーニングした。ファージライブラリーを、従来技術にしたがって得た(WO9215679を参照;引用することにより本明細書の内容とする)。
【０１７２】
Savinase及び他のスブチラーゼをリン酸緩衝溶液(PBS)に溶解して含む選択された標的タンパク質(N=75)を、皮下注射、皮内又は気管内注射することにより、抗体をそれぞれの動物で産生した。それぞれの抗体を、ブタ抗ウサギIgG抗体、マウス抗ラットIgG1抗体若しくはIgE抗体、又はラット抗マウスIgG1抗体若しくはIgE抗体をロードした常磁性免疫ビーズ(Dynal AS)を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより免疫した動物の血清から精製した。
【０１７３】
それぞれのファージライブラリーを、IgG抗体、IgG1抗体及びIgE抗体コーテッドビーズとともにインキュベーションした。ウサギIgG抗体、又はラット若しくはマウスIgG1抗体若しくはIgE抗体に対する親和性を有するオリゴペプチドを発現するファージを、これらの常磁性ビーズを磁場に暴露することにより採取した。採取されたファージを、温和な酸処理によるか、又は無傷酵素で溶離することにより、固定化された抗体から溶離した。単離したファージを、スペシャリストに公知の方法で増幅した。別法として、固定化したファージを、E.coliとともに直接インキュベーションして感染させた。要するに、F因子陽性E.coli(例えば、XL-1 Blue、JM101、TG1)を、ヘルパーファージ(例えば、M13K07)の存在下でM13由来ベクターで感染させ、典型的にグルコース又はIPTGを含有する2xYT、及び適切な選択用抗生物質においてインキュベーションした。
【０１７４】
最後に、細胞を、遠心分離により除去した。これを、それぞれの細胞上清で2〜5回反復した。第2、3、4、及び5ラウンドの選択後、感染したE.coliの一部分を、選択的2xYT寒天平板でインキュベーションし、新生のファージの特異性を、免疫学的に評価した。すなわち、ファージを、ニトロセルラーゼ(NC)膜に移した。各プレートについて、2NCレプリカを作製した。一つのレプリカを、選択抗体とともにインキュベーションし、他のレプリカを、選択抗体、及び競合者としての抗体を得るために使用される免疫源とともにインキュベーションした。免疫源の存在下において不存在であったプラークを特異的であるとみなし、上記した手順で増幅した。
【０１７５】
特異的ファージ-クローンを、ポリエチレングリコールの存在下での遠心分離により、細胞上清から単離した。DNAを単離し、オリゴペプチドをコードするDNA配列をPCRにより増幅し、DNA配列を決定した。これらの全ては、標準法によりおこなった。対応のオリゴペプチドのアミノ酸配列を、DNA配列から推定した。
【０１７６】
このようにして、タンパク質特異的抗体に特異的な多数のペプチド配列を得た。これらの配列を、データベースに集め、配列アラインメントにより解析してエピトープパターンを同定した。この配列アラインメントについては、保存的置換(例えば、グルタメートについてアスパルテート、アルギニンについてリジン、スレオニンについてセリン)は、一つとしてみなした。これから、ほとんどの配列が、抗体が産生したタンパク質に特異的であることがわかった。しかしながら、2選択ラウンドのみを経たファージから、いくつかの交差反応配列が得られた。最初のラウンドでは、22のエピトープパターンを同定した。
【０１７７】
ファージディスプレイのさらなるラウンドでは、より多くの抗体結合配列が得られ、より多くのエピトープパターンが得られた。さらに、環境アレルゲン特異的抗体を結合することが判明したペプチド配列について、文献を調べた(J All Clin Immunol 93(1994)pp.34-43;Int Arch Appl Immunol 103(1994)pp.357-364;Clin Exp Allergy 24(1994)pp.250-256;Mol Immunol 29(1992)pp.1383-1389;J Immunol 121(1989)pp.275-280;J.Immunol 147(1991)pp.205-211;Mol Immunol 29(1992)pp.739-749;Mol Immunol 30(1993)pp.1511-1518;Mol Immunol 28(1991)pp.1225-1232;J.Immunol 151(1993)pp.7206-7213)。これらの抗体結合ペプチド配列を、データベースに含めた。
【０１７８】
これらの配列を、データベースに集め、配列アラインメントにより解析してエピトープパターンを同定した。この配列アラインメントについては、保存的置換(例えば、グルタメートについてアスパルテート、アルギニンについてリジン、スレオニンについてセリン)は、一つとしてみなした。これから、ほとんどの配列が、抗体が産生したタンパク質に特異的であることがわかった。しかしながら、エピトープパターンは、タンパク質、抗体型及び動物種について適用できることが分かった。さらに75エピトープパターンが同定された。
【０１７９】
これらのエピトープパターンを、Savinaseの3D構造について自動的に評価(WO01/83559に記載)し、各アミノ酸の一部分である潜在的エピトープの数(表2では頻度として示してある)を、算出した(表2)。
【０１８０】
【表２】
【０１８１】
例２. Savinaseの3次元構造への局在化;潜在的IgEエピトープに関与するアミノ酸位置
潜在的IgEエピトープに最も関与していると思われることが判明したアミノ酸位置(一般的に、これらは、少なくとも3つのIgEエピトープに潜在的に関与していることが判明したアミノ酸であった)を、Savinaseの3D構造に手動で局在化させた(Protein Data Bank entry 1SVN;Betzel,C.,Klupsch,S.,Papendorf,G.,Hastrup,S.,Branner,S.,Wilson,K.S.:Crystal structure of the alkaline proteinase Savinase from Bacillus lentus at 1.4Å resolution(1.4Å解像度でのバチルスレンツス由来のアルカリ性プロテイナーゼSavinaseの結晶構造).J Mol Biol 223 pp.427(1992))。この際には、適切なソフトウエア(例えば、SwissProt Pdb Viewer,WebLite Viewer)を、使用した。
【０１８２】
3次元構造にアミノ酸を局在化することにより、IgEエピトープに潜在的に関与しているアミノ酸が以下の3つの主要な領域において塊状化することが判明した:
・領域1:P14、A15、R19、G20、T22、A272、R275
・領域2:A48、F50、P52、E54、P55、S57、D60、G61、K94、V104,Q109
・領域3:P129、S130、E136、N140、S161、Y167、R170、A172、D181、R186、A194、G195、L196、R247、T260、L262
・位置P39及びN218は、独立している。
【０１８３】
例３. Savinaseの3次元構造への局在化;タンパク質工学について選択されたアミノ酸位置
アミノ酸が、構造及び酵素活性関連の事柄に基づいてエピトープタンパク質工学について選択された。このことは、3D解析、又は酵素の活性及び/又は安定性についての有利な効果を与える他のタンパク質工学概念からの経験により示唆された位置が優先されたことを意味する。
【０１８４】
選択されたアミノ酸は、
・領域1:A15、R19、R275
・領域2:S57
・領域3:E136、N140、Y167、R170、A172、D181、R186、A194、G195、R247、T260、L262
・位置N218
にある。
【０１８５】
これらの位置を、別個に設計するか、又は互いに組み合わせて設計した。組み合わせは、個々の突然変異の性能及び/又は地勢に基づいて選択した(できるだけ少ない突然変異でできるだけ大きな領域をカバーする)。これらのことに基づいて、表3に示す位置及び位置の組み合わせが、修飾された免疫原性/減少したアレルギー性を有するスブチラーゼを得るための設計に関連することが判明した。
【０１８６】
【表３】
【０１８７】
例４. 抗体結合能が減少したSavinase変異体の試験
有望な変異体の同定を、Bacillus sppにおいて発現した例3の酵素活性変異体の抗体結合能の変化を評価することにより実施した。
【０１８８】
少なくとも2倍の抗体結合能(デルタ結合)の変化は、有意であるとみなした(P<0.05)。これらの変異体に導入された突然変異を、標準法(例えば、A Molecular cloning:A laboratory manual(Sambrook等(1989)、Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel,F.M.等(編者))参照)を用いて、DNA配列解析により同定した。
デルタ結合値が少なくとも2.0であるスブチラーゼ変異体と、それらの抗体結合能を、表４に示す。
【０１８９】
【表４】
【０１９０】
例５. 皮下注射マウスモデルにおけるアレルギー性を減少させるためのSavinase変異体の試験
マウスを、週一回、20週間にわたって、0.9%(wt/vol)NaCl(対照群)50マイクロリットル、又はタンパク質10マイクログラムを含有する0.9%(wt/vol)NaCl 50マイクロリットルで皮下免疫化した。各群のマウスには、デンマーク国リュ、Bomholdtgaard社から購入した雌Balb/Cマウス10匹(約20グラム)が含まれていた。血液試料(100マイクロリットル)を、次の免疫化の前に1週間おきに目から採取した。血清を、血液凝固及び遠心分離により得た。
【０１９１】
各変異体及びSavinaseについて、20週の期間にわたって同じ群の各マウスにおいて検出されたIgEレベルの合計(積算IgEレベル)を、算出した。Savinaseについて、積算IgEレベルは100%に等しく、変異体については、Savinaseに準じて算出した。表5は、これらの変異体の積算IgEレベルは、Savinaseについてよりも少なくとも33%少なく、Savinaseとは統計的に異なることが明らかとなったことを示している。
【０１９２】
【表５】
【０１９３】
例６. 生体内においてアレルギー性を減少させるためのSavinase変異体の試験(MINTアッセイ)
マウス鼻腔内(MINT)モデル(Robinson等、Fund.Appl.Toxicol.34,pp.15-24,1996)。マウスに、実験の第1日目及び第3日目、及びそれから一週間に一回、6週間にわたってタンパク質を鼻腔内投与した。血液試料を、実験開始後15日目、31日目及び45日目に採取した。続いて、血清を、IgG1レベル又はIgEレベルについて分析した。
【０１９４】
変異体S57P+R170L+R247Q;S57P+R247Q;及びS221C(不活性)を、Alcalase（登録商標）及びSavinase（登録商標）(0.9%NaCl中)と比較した。
【０１９５】
平均力価を、表6〜表8に示す:IgG1及びIgEの力価を、最高希釈倍数の逆数として表し、正のELISA読み取り値をlog2に変換した。読み取り値は、OD平均+2×負の対照の標準偏差よりも高い場合には、正とみなす。投与レベル当たりマウス6匹であった。結果を、群平均力価として表す。
【０１９６】
【表６】
【０１９７】
【表７】
【０１９８】
【表８】
【０１９９】
表６〜表８から、変異体S57P+R170L+R247Q、S221C及びS57P+R247Qは、基準タンパク質(Alcalase及びSavinase)よりも、抗原特異的IgG1及びIgE抗体の産生を引き起こす可能性がかなり小さいこと結論できる。
【０２００】
例７. Savinase変異体の洗浄性能の試験
以下の例に、標記の条件下でおこなった多数の洗浄試験から得た結果を示す。
洗剤は、洗剤溶液を作製し、それを電子レンジにおいて85℃で5分間加熱することにより不活性化した市販の洗剤である。pHは、現状の洗剤溶液におけるpHの「そのまま」であり、調整しない。水の硬度は、CaCl2・2H2O;MgCl2・6H2O;NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-=2:1:6)を添加することにより、ミリQ水に調整した。
【０２０１】
洗浄条件は:
1)不活性化市販Tide粉末1g/リットル、30℃、12分洗浄、6dH
2)不活性化市販Tide液1.5g/リットル、30℃、12分洗浄、6dH
試験物質は、血液/ミルク/カーボンブラックで汚したポリエステル/綿材料見本である。
【０２０２】
洗浄後、試験材料の反射率(R)を、J&M Tidas MMS分光光度計を用いて、460nmで測定した。測定は、製造業者のプロトコールに準じておこなった:
R変異体:変異体で洗浄した試験材料の反射率
Rブランク:酵素で洗浄しなかった試験材料の反射率
Δ反射率:R変異体-Rブランク
Δ反射率が高いほど、洗浄性能がよい。Δ反射率は、投与量酵素5nMについて算出する。
表9は、マウスにおいて最低のアレルギー性(IgE産生の観点から)を示す4種のスブチラーゼ変異体のTide粉末洗浄剤における洗浄性能の結果を表す。
【０２０３】
【表９】
【０２０４】
表10は、マウスにおいて最低のアレルギー性(IgE産生の観点から)を示す4種のスブチラーゼ変異体のTide液状洗浄剤における洗浄性能の結果を表す。
【０２０５】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置57が、位置:170、181及び247のうちの少なくとも一つにおける修飾と組み合わせて修飾されている、スブチラーゼ変異体。
【請求項２】
前記位置57における修飾が、欠失、又は残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iの一つへの置換である、請求項1に記載の変異体。
【請求項３】
前記位置170における修飾が、欠失、又は残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つへの置換である、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記位置181における修飾が、欠失、又は残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つへの置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
前記位置247における修飾が、欠失、又は残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つへの置換である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hである、請求項2及び3の変異体。
【請求項７】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wである、請求項2及び4の変異体。
【請求項８】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yである、請求項2及び5の変異体。
【請求項９】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yである、請求項2、3及び5の変異体。
【請求項１０】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yである、請求項2、4及び5の変異体。
【請求項１１】
前記変異体が、X57P+X170F、X57P+X170L、X57P+X181N、X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Qのうちの一つである、請求項1〜5のいずれかの変異体。
【請求項１２】
前記修飾が、スブチリシンにおいてなされている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１３】
前記修飾が、I-S1型のスブチラーゼにおいてなされている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記スブチラーゼが、スブチリシンBPN’、スブチリシンアミロサッカリタス、スブチリシン168、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチリシンCarlsberg及びスブチリシンDYからなる群から選択されたものである、請求項13に記載の変異体。
【請求項１５】
前記修飾が、I-S2型のスブチラーゼにおいてなされている、請求項1〜12のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１６】
前記スブチラーゼが、スブチリシン309、スブチリシン147、スブチリシンPB92、BLAP及びK16からなる群から選択されたものである、請求項15に記載の変異体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のスブチラーゼ変異体をコードするDNA配列。
【請求項１８】
請求項17のDNA配列を含むベクター。
【請求項１９】
請求項18のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項1〜16のいずれかに記載のスブチラーゼ変異体を含む組成物。
【請求項２１】
洗浄組成物である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
パーソナルケア組成物である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２３】
配列番号:1のスブチラーゼにおいて、Xaa残基が、
位置3ではS又はTであり、
位置4ではV又はIであり、
位置27ではK又はRであり、
位置55ではG、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置74ではN又はDであり、
位置85ではS又はNであり、
位置97ではS又はDであり、
位置99ではS、G又はRであり、
位置101ではS又はAであり、
位置102ではV、N、Y又はIであり、
位置121ではN又はSであり、
位置157ではG、D又はSであり、
位置188ではA又はPであり、
位置193ではV又はMであり、
位置199ではV又はIであり、
位置211ではL又はDであり、
位置216ではM又はSであり、
位置226ではA又はVであり、
位置230ではQ又はHであり、
位置239ではQ又はRであり、
位置242ではN又はDであり、
位置246ではN又はKであり、
位置268ではT又はAであり、
位置164のXaa残基、位置175のXaa残基及び位置241のXaa残基が、以下の組合せの1つである:
a)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
b)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
c)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在である、
スブチラーゼ。
【請求項２４】
位置55におけるXaa残基が、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つである、請求項23に記載のスブチラーゼ。
【請求項２５】
位置164におけるXaa残基が、残基:G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在のうちの一つである、請求項23及び24のいずれかに記載のスブチラーゼ。
【請求項２６】
位置175におけるXaa残基が、残基:G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在のうちの一つである、請求項23〜25のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項２７】
位置241におけるXaa残基が、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つである、請求項23〜26のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項２８】
位置55におけるXaa残基が、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つであり、位置164におけるXaaが、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つであり、位置241におけるXaaが、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つである、請求項23〜27のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項２９】
位置55におけるXaa残基が、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つであり、位置175におけるXaaが、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つであり、Xaa位置241が、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つである、請求項23〜28のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項３０】
位置55のXaa残基が、Pであり、位置164のXaaが、Lである、請求項23〜29のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項３１】
位置55のXaa残基が、Pであり、位置164のXaaが、Lであり、位置241のXaaが、Qである、請求項23〜29のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項３２】
前記スブチラーゼが、スブチリシンである、請求項23〜31のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項３３】
前記スブチリシンが、I-S1型である、請求項32に記載のスブチラーゼ。
【請求項３４】
前記スブチリシンが、I-S2型である、請求項32に記載のスブチラーゼ。
【請求項３５】
請求項23〜34のいずれかに記載のスブチラーゼをコードするDNA配列。
【請求項３６】
請求項35のDNA配列を含むベクター。
【請求項３７】
請求項36のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項23〜34のいずれかに記載のスブチラーゼを含む組成物。
【請求項３９】
洗浄組成物である、請求項38に記載の組成物。
【請求項４０】
パーソナルケア組成物である、請求項38に記載の組成物。
【請求項１】
位置57が、位置:170、181及び247のうちの少なくとも一つにおける修飾と組み合わせて修飾されている、スブチラーゼ変異体。
【請求項２】
前記位置57における修飾が、欠失、又は残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iの一つへの置換である、請求項1に記載の変異体。
【請求項３】
前記位置170における修飾が、欠失、又は残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つへの置換である、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記位置181における修飾が、欠失、又は残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つへの置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
前記位置247における修飾が、欠失、又は残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つへの置換である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hである、請求項2及び3の変異体。
【請求項７】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wである、請求項2及び4の変異体。
【請求項８】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yである、請求項2及び5の変異体。
【請求項９】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yである、請求項2、3及び5の変異体。
【請求項１０】
前記変異体が、X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yである、請求項2、4及び5の変異体。
【請求項１１】
前記変異体が、X57P+X170F、X57P+X170L、X57P+X181N、X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Qのうちの一つである、請求項1〜5のいずれかの変異体。
【請求項１２】
前記修飾が、スブチリシンにおいてなされている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１３】
前記修飾が、I-S1型のスブチラーゼにおいてなされている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記スブチラーゼが、スブチリシンBPN’、スブチリシンアミロサッカリタス、スブチリシン168、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチリシンCarlsberg及びスブチリシンDYからなる群から選択されたものである、請求項13に記載の変異体。
【請求項１５】
前記修飾が、I-S2型のスブチラーゼにおいてなされている、請求項1〜12のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１６】
前記スブチラーゼが、スブチリシン309、スブチリシン147、スブチリシンPB92、BLAP及びK16からなる群から選択されたものである、請求項15に記載の変異体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のスブチラーゼ変異体をコードするDNA配列。
【請求項１８】
請求項17のDNA配列を含むベクター。
【請求項１９】
請求項18のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項1〜16のいずれかに記載のスブチラーゼ変異体を含む組成物。
【請求項２１】
洗浄組成物である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
パーソナルケア組成物である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２３】
配列番号:1のスブチラーゼにおいて、Xaa残基が、
位置3ではS又はTであり、
位置4ではV又はIであり、
位置27ではK又はRであり、
位置55ではG、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置74ではN又はDであり、
位置85ではS又はNであり、
位置97ではS又はDであり、
位置99ではS、G又はRであり、
位置101ではS又はAであり、
位置102ではV、N、Y又はIであり、
位置121ではN又はSであり、
位置157ではG、D又はSであり、
位置188ではA又はPであり、
位置193ではV又はMであり、
位置199ではV又はIであり、
位置211ではL又はDであり、
位置216ではM又はSであり、
位置226ではA又はVであり、
位置230ではQ又はHであり、
位置239ではQ又はRであり、
位置242ではN又はDであり、
位置246ではN又はKであり、
位置268ではT又はAであり、
位置164のXaa残基、位置175のXaa残基及び位置241のXaa残基が、以下の組合せの1つである:
a)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
b)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であるか、
又は
c)位置164のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置175のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在であり、
位置241のXaaは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在である、
スブチラーゼ。
【請求項２４】
位置55におけるXaa残基が、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つである、請求項23に記載のスブチラーゼ。
【請求項２５】
位置164におけるXaa残基が、残基:G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W又は不存在のうちの一つである、請求項23及び24のいずれかに記載のスブチラーゼ。
【請求項２６】
位置175におけるXaa残基が、残基:G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W又は不存在のうちの一つである、請求項23〜25のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項２７】
位置241におけるXaa残基が、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つである、請求項23〜26のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項２８】
位置55におけるXaa残基が、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つであり、位置164におけるXaaが、残基:C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、Hのうちの一つであり、位置241におけるXaaが、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つである、請求項23〜27のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項２９】
位置55におけるXaa残基が、残基:P、K、L、A、W、R、H、C、D、Iのうちの一つであり、位置175におけるXaaが、残基:A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、Wのうちの一つであり、Xaa位置241が、残基:A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Yのうちの一つである、請求項23〜28のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項３０】
位置55のXaa残基が、Pであり、位置164のXaaが、Lである、請求項23〜29のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項３１】
位置55のXaa残基が、Pであり、位置164のXaaが、Lであり、位置241のXaaが、Qである、請求項23〜29のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項３２】
前記スブチラーゼが、スブチリシンである、請求項23〜31のいずれか１項に記載のスブチラーゼ。
【請求項３３】
前記スブチリシンが、I-S1型である、請求項32に記載のスブチラーゼ。
【請求項３４】
前記スブチリシンが、I-S2型である、請求項32に記載のスブチラーゼ。
【請求項３５】
請求項23〜34のいずれかに記載のスブチラーゼをコードするDNA配列。
【請求項３６】
請求項35のDNA配列を含むベクター。
【請求項３７】
請求項36のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項23〜34のいずれかに記載のスブチラーゼを含む組成物。
【請求項３９】
洗浄組成物である、請求項38に記載の組成物。
【請求項４０】
パーソナルケア組成物である、請求項38に記載の組成物。
【公開番号】特開２０１０−６８８０８（Ｐ２０１０−６８８０８Ａ）
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−２７６７３６（Ｐ２００９−２７６７３６）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【分割の表示】特願２００４−５１６５１４（Ｐ２００４−５１６５１４）の分割
【原出願日】平成１５年６月２５日（２００３．６．２５）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７６７３６（Ｐ２００９−２７６７３６）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【分割の表示】特願２００４−５１６５１４（Ｐ２００４−５１６５１４）の分割
【原出願日】平成１５年６月２５日（２００３．６．２５）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
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