変異型大腸菌易熱性エンテロトキシン
本発明は、アジュバントとして用いられうる、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）の変異サブユニットＡに関する。このサブユニットＡの変異体は、野生型ＬＴの６１位に対応する位置にアミノ酸置換を有する。そして、この変異サブユニットＡを含むＬＴの毒性は、野生型のそれと比較して低減されている。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
この出願は、２００７年７月１８日に出願された、米国特許出願第１１／７７９，４１９号からの優先権を主張する。当該出願の内容は全体が参照により本明細書に引用される。
【０００２】
背景
腸管毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は、２種のエンテロトキシン（すなわち、易熱性トキシン（ＬＴ）および耐熱性トキシン（ＳＴ））を産生することにより、ヒトおよび家畜において下痢を引き起こす（Hofstra et al., 1984, J. Bio. Chem. 259:15182-15187）。ＬＴは、機能的に、構造的に、そして免疫学的に、コレラトキシン（ＣＴ）と関連している（Clements et al., 1978, Infect. Immun. 21:1036-1039）。ＬＴおよびＣＴは、５つの同一のサブユニットＢと、酵素活性を有するサブユニットＡとからなるホロ毒素分子（ＡＢ５）として合成される（Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647）。サブユニットＢの５量体は、小腸上皮細胞またはＧＭ１を含む他の細胞の膜内でガングリオシドＧＭ１に結合する（van Heyningen, 1974, Science183:656-657）。細胞表面上でサブユニットＢがＧＭ１に結合すると、サブユニットＡが細胞質中に挿入され、タンパク質分解によって切断され、単一のジスルフィド結合部位で還元されて、酵素活性を有するＡ１ペプチドと、より短いＡ２ペプチドが産生される（Fishman PH, 1982, J. Membr. Biol. 69:85-97; Mekalanos et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:5855-5861; Moss et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:12861-12865）。このＡ１ペプチドはＮＡＤに結合し、アデニル酸シクラーゼに関連したＧＴＰ結合制御タンパク質であるＧｓαのＡＤＰ−リボシル化を触媒することができる（Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647）。これによりｃＡＭＰが増加すると、最終的には感染した細胞から電解質および細胞液が放出される（Cheng et al., 2000, Vaccine18:38-49）。
【０００３】
ＬＴは、粘膜アジュバントとして機能し、粘膜に共投与された抗原に対する免疫応答を誘導することが示されている（Clements et al., 1988, Vaccine6:269-277; Elson CO. 1989, Immunol. Today 146:29-33; Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647）。しかしながら、野生型のＬＴは毒性が高いため、臨床用途は限られていた。よって、免疫原性を保持しつつ毒性が低減された変異ＬＴを作り出すことが望まれている。
【０００４】
本明細書で用いられる「大腸菌易熱性エンテロトキシン」または「ＬＴ」との語は、任意の腸管毒素原性の大腸菌株により産生される易熱性エンテロトキシンを意味する。「大腸菌易熱性エンテロトキシンサブユニットＡ」または「ＬＴＡ」との語は、ＬＴのサブユニットＡを意味する。このＬＴＡには、シグナルペプチドを含む前駆体ＬＴＡ、およびシグナルペプチドが除去された成熟ＬＴＡの双方が含まれる。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、変異ＬＴＡを含むＬＴでは、免疫原性を保持しつつ野生型よりも毒性が低減されるという予期せぬ発見に基づいている。この変異ＬＴＡは、野生型ＬＴＡの６１位に対応する位置にアミノ酸置換を有する。当該野生型ＬＴＡのアミノ酸配列（配列番号５）については後述する。
【０００６】
このように、本発明は、配列番号５の６１位に対応する位置にＳ、Ｔ、およびＦ以外のアミノ酸残基を有する変異ＬＴＡを含む単離ポリペプチドを特徴とする。置換するアミノ酸残基は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｙ，またはＷでありうる。置換するアミノ酸残基は、天然のアミノ酸であってもよいし、天然でないアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸またはβ−アミノ酸）であってもよい。一例では、ＬＴＡは配列番号２、４、８、または１０のアミノ酸配列を有する。この変異ＬＴＡを含むＬＴは、配列番号５を含む野生型のＬＴよりも低減された（すなわち、１０−５倍未満の）毒性を示す。
【０００７】
他の形態では、本発明は、抗原および上述した変異ＬＴＡを含むワクチンを特徴とする。当該ワクチンはＬＴのサブユニットＢをさらに含んでもよく、このサブユニットＢは、変異ＬＴＡとともに全長ＬＴタンパク質を形成する。抗原は、細菌またはウイルスのいずれかを由来とするものでありうる。
【０００８】
さらに他の形態では、本発明は、上述したＬＴＡの変異体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を特徴とする。一例では、当該ヌクレオチド配列は配列番号１、３、７、または９である。上述した核酸を含むベクターや、当該ベクターを含む形質転換細胞もまた、本発明の範囲に包含される。
【０００９】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細について以下に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
解毒されたＬＴ（例えば、変異ＬＴＡを含むもの）は、免疫原性が高いため、望ましいワクチンアジュバントである。この目的を達成するために設計された本発明の変異ＬＴＡは、配列番号５の６１位に対応する位置で、ＬＴＡにアミノ酸置換を導入することにより作製される。異なる腸管毒素原性大腸菌株から作製されたＬＴＡ群は、相同性が高い。よって、当業者であれば、ＬＴＡのアミノ酸配列を配列番号５と比較することにより、当該ＬＴＡのどの位置が配列番号５の６１位に対応するかを把握することができる。配列番号５のＬＴＡと同様に、ほとんどすべての野生型ＬＴＡは、配列番号５の６１位に対応する位置にセリンを有している。例えばサイズや極性などの点でセリンとは異なるアミノ酸が、置換するアミノ酸として用いられうる。かような置換アミノ酸の例としては、疎水性アミノ酸残基（例えば、ＩおよびＬ）、荷電アミノ酸残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、およびＨ）、または嵩高い側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｙ、およびＷ）が挙げられる。プロリンは、一般的にポリペプチドの局所構造を変化させることから、同様に置換アミノ酸として用いられうる。かような置換アミノ酸には、天然でないアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸またはβ−アミノ酸）も含まれる。
【００１１】
本発明のＬＴＡ変異体は、本技術分野において周知の方法により調製されうる。例えば、当該変異体は、以下のような組換え法により作製される。まず、腸管毒素原性大腸菌株から野生型ＬＴＡをコードするｃＤＮＡを単離し、部位特異的突然変異誘発法に供して、所望のＬＴＡ変異体をコードするｃＤＮＡを作製する。Ho et al., Gene, 77:51-59, 1989を参照のこと。次いで、この変異を有するｃＤＮＡを、細胞に形質転換するための発現ベクター中に挿入する。最後に、形質転換された細胞において産生されたＬＴＡ変異体を精製し、ＬＴサブユニットＢと会合させて、全長ＬＴタンパク質を形成させる。
【００１２】
上述したＬＴＡ変異体を含むＬＴの毒性は、Ｙ−１副腎細胞アッセイ等のアッセイを用いて評価されうる。Cheng et al., Vaccine, 18:38-49, 2000を参照のこと。
【００１３】
本発明のＬＴＡ変異体は、ワクチンにおけるアジュバントとして用いられうる。ワクチン（すなわち、ヒトワクチンまたは動物ワクチン）は、抗原および、ＬＴＡ変異体そのもの、またはＬＴＡ変異体を含むＬＴを含有しうる。抗原は、細菌（例えば、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、淋菌（Neiseria gonorrhoea）、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オザナエ（Klebsiella ozaenae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、セレウス菌（Bacillus cereus）、腸炎エルシニア菌（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Yersinia pestis）、サルモネラ（Salmonella typhimurium）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、スピロヘータ（Borrelia vincentii）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、マイコプラズマ（Mycoplasma spp.）、発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazeki）、クラミジア（Chlamydia spp.）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））由来のものでありうる。抗原はまた、ウイルス（例えば、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エンテロウイルス、または日本脳炎ウイルス）由来のものであってもよい。
【００１４】
ワクチンは、リン酸緩衝生理食塩水または炭酸水素塩溶液などの製薬上許容されうる担体をさらに含んでもよい。当該担体は、投与の形態および経路のほか、標準的な薬学上の実務に基づいて選択される。適当な医薬担体や希釈剤、並びにこれらの使用のための薬学的に必須の成分については、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【００１５】
ワクチンを調製する方法は、米国特許第４，６０１，９０３号、米国特許第４，５９９，２３１号、米国特許第４，５９９，２３０号、および米国特許第４，５９６，７９２号に例示されるように、本技術分野において一般的に周知である。ワクチンは、溶液やエマルションのような注射可能な形態で調製されうる。抗原および、ＬＴＡ変異体またはこれを含むＬＴは、生理学的に許容されうる賦形剤と混合されうる。当該賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、湿潤化剤もしくは乳化剤、またはワクチンの有効性を向上させるためのｐＨ緩衝剤といった追加成分を少量含有しうる。ワクチンは、皮下または筋肉内への注射によって、非経口的に投与されうる。あるいは、坐薬製剤、経口製剤、または局所製剤などの他の投与形態が好ましいこともある。坐薬用の結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール類またはトリグリセリド類が挙げられる。経口製剤は、例えば医薬グレードの多糖、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられている賦形剤を含みうる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤または散剤の形態をとる。
【００１６】
ワクチンは、投与剤形と適合するように、治療上有効で、保護的であり、免疫原性を示す量で投与される。投与量は、処置される対象（例えば、個体の免疫系の抗体合成能や、必要な場合には細胞媒介性免疫応答の能力など）に依存する。投与が必要な有効成分の正確な量は、医師の判断に委ねられている。しかしながら、当業者であれば適当な用量範囲を容易に決定することができ、これは本発明のポリペプチドのｍｇオーダーでありうる。初回投与および追加投与のための適切な処方計画もまた、変動するものであるが、初回投与とそれに続く追加投与を含みうる。また、ワクチンの用量は、投与経路にも依存し、宿主のサイズによっても変動する。
【００１７】
後述する具体的な実施例は、単に例示のためのものであって、本明細書の開示以外の形態をいかようにも限定するものではないと解釈されるべきである。さらなる努力を必要とすることなく、当業者であれば、本明細書の開示に基づき、本発明を完全に実施することができるものと考えられる。本明細書において引用されている文献についてはすべて、その全体が参照により本明細書に引用されている。
【実施例】
【００１８】
実施例１：野生型ＬＴＡおよび、変異型ＬＴＡを含むＬＴをコードする遺伝子の構築
ＬＴ遺伝子の１．８ｋｂＤＮＡ断片（サブユニットＡおよびサブユニットＢを含む）を、ヒト腸管毒素原性大腸菌Ｈ１０４０７株から単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）ベクター中にクローニングした（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＬＴｈＷＴ）。このＬＴ遺伝子（サブユニットＡ、Ｂの双方をコードする）のヌクレオチド配列（配列番号６）、およびこのＬＴ遺伝子のサブユニットＡのアミノ酸配列（配列番号５）を以下に示す：
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
部位特異的突然変異誘発法を用いて、種々のＬＴＡ変異体が構築された（Ho et al., 1989, Gene77, 51-59）。より具体的には、配列番号５の６１位のセリンをＫ、Ｒ、Ｈ、Ｙ、およびＦでそれぞれ置換することにより、ＬＴＡ（Ｓ６１Ｋ）、ＬＴＡ（Ｓ６１Ｒ）、ＬＴＡ（Ｓ６１Ｈ）、ＬＴＡ（Ｓ６１Ｙ）、およびＬＴＡ（Ｓ６１Ｆ）などのＬＴＡ変異体が構築された。これらの変異体の構築には、以下のオリゴヌクレオチドプライマーが用いられている：ＬＴＡ（Ｓ６１Ｋ）［５’ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＴＴＴ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＡ ３’］（配列番号１１），ＬＴＡ（Ｓ６１Ｒ）［５’ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ３’］（配列番号１２），ＬＴＡ（Ｓ６１Ｆ）［５’ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ３’］（配列番号１３），ＬＴＡ（Ｓ６１Ｙ）［５’ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＡＴＡ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ３’］（配列番号１４），ＬＴＡ（Ｓ６１Ｈ）［５’ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＡＴＧ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ３’］（配列番号１５）。これらのＬＴＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下に示す：
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】
【表６】
【００２６】
【表７】
【００２７】
【表８】
【００２８】
【表９】
【００２９】
【表１０】
【００３０】
比較のために、サブユニットＡの６３位のアミノ酸であるセリンをリシンで置換することにより、ＥＷＤ２９９（Dallas et al., 1979, J. Bacteriol. 139, 850-859）由来の別のＬＴ変異体であるＬＴｐ（Ｓ６３Ｋ）も構築した。
【００３１】
実施例２：野生型ＬＴ、および変異型ＬＴＡを含むＬＴの調製
天然のＬＴ遺伝子または変異型ＬＴ遺伝子（サブユニットＡおよびサブユニットＢの双方の遺伝子を含む）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）ベクターを、大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬ培地を含有する３Ｌフラスコ中で一晩培養した培地から、天然および変異型のＬＴを精製した。遠心分離により細胞を回収し、ＴＥＡＮバッファ（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および３ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．４）に再懸濁させ、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）(Microfluidics Corporation, USA)を用いて溶解させた。遠心分離によって溶解物を清澄化した後、固体状硫酸アンモニウムを６５％飽和まで添加することにより、ＬＴを分画した。次いでこれをＴＥＡＮバッファに懸濁させ、同一のバッファに対して十分に透析し、粗ＬＴとして用いた。この粗ＬＴを、４℃にてＴＥＡＮバッファで平衡化した固定化Ｄ−ガラクトース（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）カラムによるクロマトグラフィに供した（Uesaka et al., 1994, Microbial Pathogenesis 16:71-76）。０．３ＭガラクトースのＴＥＡＮ溶液を用いて、天然および変異型のＬＴを溶出させた。精製された各毒素をＰＢＳバッファに対して透析し、生物学的アッセイおよび免疫学的アッセイに用いた。
【００３２】
精製された野生型および変異型ＬＴを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。この際、ＬＴサブユニットＡの分子量は約２８〜２９ｋＤａであり、ＬＴサブユニットＢの分子量は約１２〜１３ｋＤａであった。ＬＴＡ（Ｓ６１Ｋ）を含む全長ＬＴ（すなわち、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ））およびＬＴＡ（Ｓ６１Ｒ）を含む全長ＬＴ（すなわち、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｒ））の収率は、配列番号５のＬＴＡを含むＬＴと同等であった。
【００３３】
ｐＨ３〜１０の等電点分画ゲル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｇｅｌ）（インビトロジェン）により、ＬＴのＡＢ５ヘテロヘキサマーおよびＢ５ペンタマーを分離した。ＵＶＩＢａｎｄソフトウェア（ＵＶＩｔｅｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によりＡＢ５タンパク質およびＢ５タンパク質のバンドの強度を分析し、ＡＢ５ヘテロヘキサマーおよびＢ５ペンタマーの百分率を算出した（ＡＢ５の等電点（ｐＩ）の値は８．０〜７．８であり、Ｂ５のｐＩの値は８．３〜８．１であった）。これらの結果を表１に示す。
【００３４】
【表１１】
【００３５】
実施例３：野生型ＬＴおよび変異型ＬＴＡを含むＬＴの細胞内ｃＡＭＰレベルに与える影響の評価
２４ウェルプレートに、２０％ＦＢＳを添加したＭＥＭ−α培地中でＣａｃｏ−２細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３７）を５×１０４細胞／ウェルの濃度で維持し、コンフルエント近くまで培養し、１％ＦＢＳおよび１ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するＭＥＭ−α中、５％ＣＯ２下にて３０分間インキュベートし、その後に毒素を添加した（Grant et al., 1994, Infection and Iimmunity 62: 4270-4278）。天然のＬＴまたは変異型のＬＴを各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。次いで、冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。２００μＬの０．１Ｎ ＨＣｌを各ウェルに添加することにより細胞内ｃＡＭＰを抽出し、室温にて１５分間インキュベートした。０．１Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに添加した後に、細胞溶解物の上清を回収した（Cheng et al., 2000, Vaccine18: 38-49; Park et al., 1999, Experimental and Molecular Medicine 31: 101-107）。ｃＡＭＰ酵素イムノアッセイキット（アッセイデザイン；Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ−ＥＩＡ）を用いて、ｃＡＭＰを定量した。本実施例から得られた結果によれば、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させなかったことがわかる。
【００３６】
実施例４：Ｙ１副腎腫瘍細胞アッセイを用いた、変異型ＬＴＡを含むＬＴの毒性の評価
この試験では、ＬＴサンプル（野生型ＬＴ、ＬＴの活性部位変異体（ｈ６１Ｋ）、およびサブユニットＢ複合体（Ｂ５））について、腸管毒性作用を評価した。１５％ウマ血清、２．５％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地中で維持したマウスＹ−１副腎腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７９）を、９６ウェル平底プレート中、２×１０４細胞／ウェル（２００μＬ／ウェル）の濃度で、５％ＣＯ２下、３７℃にて４８時間播種した。９６ウェル平底プレート中の細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、次いで、５％ＣＯ２下、３７℃にて一晩、順次希釈ＬＴサンプル（１０μｇ／２００μＬ〜１０−１０μｇ／２００μＬ）で処置した。毒素処理の２４時間後、典型的な細胞の円形化を、光学顕微鏡により観察した。活性は、細胞の円形化を開始させるのに要した毒素の最小濃度（ＥＣｉ）または５０％の細胞の円形化に要した毒素の濃度（ＥＣ５０）として定義される。David et al., 1975, Infection and Immunity, 11:334-336; Cheng et al., 1999, Vaccine 18:38-49を参照のこと。野生型ＬＴと比較して、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｒ）、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｈ）の毒性は有意に低い（すなわち、１０−６対１）。以下の表２を参照のこと。ＬＴｈ（Ｓ６１Ｆ）の毒性も低い（すなわち、１０−５）が、その低下は他の変異体ほど有意なものではない。
【００３７】
【表１２】
【００３８】
実施例５：ラビット回腸ループアッセイによる、変異型ＬＴＡを含むＬＴの毒性の評価
本アッセイは、従来の開示に従って行った（Giannelli et al., 1997, Infection and Immunity 65: 331-334; Giuliani et al., 1998, J. Exp. Med. 187:1123-1132）。本アッセイでは、成体ニュージーランドラビット（それぞれ〜２．５ｋｇ）を用いた。ラビットの小腸の末端から開始し、胃へと向かって長さがそれぞれ５ｃｍのループを作製した。種々の量のＬＴまたはＬＴ変異体を含む０．５ｍＬサンプルを各ループに注入し、次いで腹部を閉鎖した。１８時間後、各ループに蓄積した液体を回収し、定量した。この実験を３回行ない、結果をｃｍあたりのｍＬで示した。本実験からの結果によれば、５００μｇのＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）では１ｍＬの液体がラビット回腸ループに蓄積したのみであり、蓄積した液体の体積は天然のコントロールと同等であった。０．１μｇの野生型ＬＴを用いたときには、野生型ＬＴの蓄積した液体の体積はＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）よりもかなり多かった。また、別のＬＴｐ（Ｓ６３Ｋ）での液体の蓄積もまた、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）よりもかなり多かった。
【００３９】
実施例６：鼻腔内免疫における変異型ＬＴＡを含むＬＴのアジュバント効果の評価
本実施例では、不活化インフルエンザウイルスであるＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９５）を用いた。従来開示されているように、ウイルス粒子を調製した（Aitken et al., 1980, Eur. J. Biochem. 107:51-56; Gallagher et al., 1984, J. Clin. Microbiol. 20:89-93; Johansson et al., 1989, J. Virol. 63:1239-1246）。簡単に言えば、１０日齢の孵化鶏卵の尿膜腔中で、３５℃にて２日間、ウイルスを増殖させた。ＰＲ８で感染させた卵由来の尿膜腔液を、まず低速で遠心分離し、次いで９６，０００×ｇにて１時間遠心分離してウイルス粒子を沈殿させて、これをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。これらの粒子を３０〜６０％ショ糖密度勾配上にロードし、９６，０００×ｇにて５時間遠心分離した。ウイルスを含む画分を回収し、ＰＢＳで希釈した。さらに９６，０００×ｇにて１時間、ウイルスをペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。精製したウイルスを、４℃にて１週間、０．０２５％ホルマリンで処理した。光学密度（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）に基づいてタンパク質濃度を測定して標準化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってヘマグルチニン（ＨＡ）量を定量した（Oxford et al., 1981, J. Biol. Stand. 9:483-491）。
【００４０】
台湾国家実験動物センター（Taiwan National Laboratory Animal Center）から、６〜８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを入手した。５匹のマウスからなる群をそれぞれ、麻酔下で、２０μｇの不活化インフルエンザウイルス（ｆｌｕ．Ａｇ）を単独でまたは８μｇの天然もしくは変異型のＬＴとともに含有する２５μＬのＰＢＳで鼻腔内に免疫した。これらのマウスを３週間後に再度免疫した。コントロールマウスには、同一条件下でＰＢＳを投与した。最後の免疫の２週間後に、各群のマウスを屠殺して血清を採取して、血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイを行なった。不活化ウイルスワクチンを単独で用いて鼻腔内に免疫したマウスと比べて、不活化ウイルスワクチンをＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）またはＬＴｐ（Ｓ６３Ｋ）と併用して鼻腔内に免疫したマウスで、ＨＩ力価の有意な向上が検出された。不活化ウイルスと併用したＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）のＨＩ力価は、大幅に上昇した。ウイルスと併用したＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）のＨＩ力価は８１３であり、これはウイルスと併用したＬＴｈ（Ｓ６３Ｋ）の値と同等であるが、ウイルス単独の値よりも大きい。
【００４１】
実施例７：筋肉内免疫における、変異型ＬＴＡを含むＬＴのアジュバント効果の評価
筋肉内投与によって免疫を行なったこと以外は、実施例６で行なった手法を繰り返した。筋肉内ワクチンについては、１０μｇの不活化ワクチンを単独でまたは４μｇの天然もしくは変異型のＬＴとともに含有する５０μＬのＰＢＳとして調製し、大腿後部の筋肉に注入した。上述したように、免疫処理およびサンプリングのプログラムを行なった。不活化ワクチンと併用したＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）のＨＩ力価は、大幅に上昇した。
【００４２】
ウイルスと併用したＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）のＨＩ力価は５１２であり、これはウイルスと併用した野生型ＬＴの値、またはウイルス単独の値よりも有意に大きい。
【００４３】
他の実施形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合されうる。本明細書に開示されたそれぞれの特徴は、同一の、等価な、または類似の目的に資する他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明記しない限り、開示されたそれぞれの特徴は、等価な、または類似の上位概念の一連の特徴の例示にすぎない。
【００４４】
上述の記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に把握することができ、その思想および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途および条件に適合させる目的で種々の変更および修飾を加えることが可能である。よって、他の実施形態もまた、後述する特許請求の範囲に含まれる。
【背景技術】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
この出願は、２００７年７月１８日に出願された、米国特許出願第１１／７７９，４１９号からの優先権を主張する。当該出願の内容は全体が参照により本明細書に引用される。
【０００２】
背景
腸管毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は、２種のエンテロトキシン（すなわち、易熱性トキシン（ＬＴ）および耐熱性トキシン（ＳＴ））を産生することにより、ヒトおよび家畜において下痢を引き起こす（Hofstra et al., 1984, J. Bio. Chem. 259:15182-15187）。ＬＴは、機能的に、構造的に、そして免疫学的に、コレラトキシン（ＣＴ）と関連している（Clements et al., 1978, Infect. Immun. 21:1036-1039）。ＬＴおよびＣＴは、５つの同一のサブユニットＢと、酵素活性を有するサブユニットＡとからなるホロ毒素分子（ＡＢ５）として合成される（Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647）。サブユニットＢの５量体は、小腸上皮細胞またはＧＭ１を含む他の細胞の膜内でガングリオシドＧＭ１に結合する（van Heyningen, 1974, Science183:656-657）。細胞表面上でサブユニットＢがＧＭ１に結合すると、サブユニットＡが細胞質中に挿入され、タンパク質分解によって切断され、単一のジスルフィド結合部位で還元されて、酵素活性を有するＡ１ペプチドと、より短いＡ２ペプチドが産生される（Fishman PH, 1982, J. Membr. Biol. 69:85-97; Mekalanos et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:5855-5861; Moss et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:12861-12865）。このＡ１ペプチドはＮＡＤに結合し、アデニル酸シクラーゼに関連したＧＴＰ結合制御タンパク質であるＧｓαのＡＤＰ−リボシル化を触媒することができる（Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647）。これによりｃＡＭＰが増加すると、最終的には感染した細胞から電解質および細胞液が放出される（Cheng et al., 2000, Vaccine18:38-49）。
【０００３】
ＬＴは、粘膜アジュバントとして機能し、粘膜に共投与された抗原に対する免疫応答を誘導することが示されている（Clements et al., 1988, Vaccine6:269-277; Elson CO. 1989, Immunol. Today 146:29-33; Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647）。しかしながら、野生型のＬＴは毒性が高いため、臨床用途は限られていた。よって、免疫原性を保持しつつ毒性が低減された変異ＬＴを作り出すことが望まれている。
【０００４】
本明細書で用いられる「大腸菌易熱性エンテロトキシン」または「ＬＴ」との語は、任意の腸管毒素原性の大腸菌株により産生される易熱性エンテロトキシンを意味する。「大腸菌易熱性エンテロトキシンサブユニットＡ」または「ＬＴＡ」との語は、ＬＴのサブユニットＡを意味する。このＬＴＡには、シグナルペプチドを含む前駆体ＬＴＡ、およびシグナルペプチドが除去された成熟ＬＴＡの双方が含まれる。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、変異ＬＴＡを含むＬＴでは、免疫原性を保持しつつ野生型よりも毒性が低減されるという予期せぬ発見に基づいている。この変異ＬＴＡは、野生型ＬＴＡの６１位に対応する位置にアミノ酸置換を有する。当該野生型ＬＴＡのアミノ酸配列（配列番号５）については後述する。
【０００６】
このように、本発明は、配列番号５の６１位に対応する位置にＳ、Ｔ、およびＦ以外のアミノ酸残基を有する変異ＬＴＡを含む単離ポリペプチドを特徴とする。置換するアミノ酸残基は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｙ，またはＷでありうる。置換するアミノ酸残基は、天然のアミノ酸であってもよいし、天然でないアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸またはβ−アミノ酸）であってもよい。一例では、ＬＴＡは配列番号２、４、８、または１０のアミノ酸配列を有する。この変異ＬＴＡを含むＬＴは、配列番号５を含む野生型のＬＴよりも低減された（すなわち、１０−５倍未満の）毒性を示す。
【０００７】
他の形態では、本発明は、抗原および上述した変異ＬＴＡを含むワクチンを特徴とする。当該ワクチンはＬＴのサブユニットＢをさらに含んでもよく、このサブユニットＢは、変異ＬＴＡとともに全長ＬＴタンパク質を形成する。抗原は、細菌またはウイルスのいずれかを由来とするものでありうる。
【０００８】
さらに他の形態では、本発明は、上述したＬＴＡの変異体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を特徴とする。一例では、当該ヌクレオチド配列は配列番号１、３、７、または９である。上述した核酸を含むベクターや、当該ベクターを含む形質転換細胞もまた、本発明の範囲に包含される。
【０００９】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細について以下に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
解毒されたＬＴ（例えば、変異ＬＴＡを含むもの）は、免疫原性が高いため、望ましいワクチンアジュバントである。この目的を達成するために設計された本発明の変異ＬＴＡは、配列番号５の６１位に対応する位置で、ＬＴＡにアミノ酸置換を導入することにより作製される。異なる腸管毒素原性大腸菌株から作製されたＬＴＡ群は、相同性が高い。よって、当業者であれば、ＬＴＡのアミノ酸配列を配列番号５と比較することにより、当該ＬＴＡのどの位置が配列番号５の６１位に対応するかを把握することができる。配列番号５のＬＴＡと同様に、ほとんどすべての野生型ＬＴＡは、配列番号５の６１位に対応する位置にセリンを有している。例えばサイズや極性などの点でセリンとは異なるアミノ酸が、置換するアミノ酸として用いられうる。かような置換アミノ酸の例としては、疎水性アミノ酸残基（例えば、ＩおよびＬ）、荷電アミノ酸残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、およびＨ）、または嵩高い側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｙ、およびＷ）が挙げられる。プロリンは、一般的にポリペプチドの局所構造を変化させることから、同様に置換アミノ酸として用いられうる。かような置換アミノ酸には、天然でないアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸またはβ−アミノ酸）も含まれる。
【００１１】
本発明のＬＴＡ変異体は、本技術分野において周知の方法により調製されうる。例えば、当該変異体は、以下のような組換え法により作製される。まず、腸管毒素原性大腸菌株から野生型ＬＴＡをコードするｃＤＮＡを単離し、部位特異的突然変異誘発法に供して、所望のＬＴＡ変異体をコードするｃＤＮＡを作製する。Ho et al., Gene, 77:51-59, 1989を参照のこと。次いで、この変異を有するｃＤＮＡを、細胞に形質転換するための発現ベクター中に挿入する。最後に、形質転換された細胞において産生されたＬＴＡ変異体を精製し、ＬＴサブユニットＢと会合させて、全長ＬＴタンパク質を形成させる。
【００１２】
上述したＬＴＡ変異体を含むＬＴの毒性は、Ｙ−１副腎細胞アッセイ等のアッセイを用いて評価されうる。Cheng et al., Vaccine, 18:38-49, 2000を参照のこと。
【００１３】
本発明のＬＴＡ変異体は、ワクチンにおけるアジュバントとして用いられうる。ワクチン（すなわち、ヒトワクチンまたは動物ワクチン）は、抗原および、ＬＴＡ変異体そのもの、またはＬＴＡ変異体を含むＬＴを含有しうる。抗原は、細菌（例えば、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、淋菌（Neiseria gonorrhoea）、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オザナエ（Klebsiella ozaenae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、セレウス菌（Bacillus cereus）、腸炎エルシニア菌（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Yersinia pestis）、サルモネラ（Salmonella typhimurium）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、スピロヘータ（Borrelia vincentii）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、マイコプラズマ（Mycoplasma spp.）、発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazeki）、クラミジア（Chlamydia spp.）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））由来のものでありうる。抗原はまた、ウイルス（例えば、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エンテロウイルス、または日本脳炎ウイルス）由来のものであってもよい。
【００１４】
ワクチンは、リン酸緩衝生理食塩水または炭酸水素塩溶液などの製薬上許容されうる担体をさらに含んでもよい。当該担体は、投与の形態および経路のほか、標準的な薬学上の実務に基づいて選択される。適当な医薬担体や希釈剤、並びにこれらの使用のための薬学的に必須の成分については、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【００１５】
ワクチンを調製する方法は、米国特許第４，６０１，９０３号、米国特許第４，５９９，２３１号、米国特許第４，５９９，２３０号、および米国特許第４，５９６，７９２号に例示されるように、本技術分野において一般的に周知である。ワクチンは、溶液やエマルションのような注射可能な形態で調製されうる。抗原および、ＬＴＡ変異体またはこれを含むＬＴは、生理学的に許容されうる賦形剤と混合されうる。当該賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、湿潤化剤もしくは乳化剤、またはワクチンの有効性を向上させるためのｐＨ緩衝剤といった追加成分を少量含有しうる。ワクチンは、皮下または筋肉内への注射によって、非経口的に投与されうる。あるいは、坐薬製剤、経口製剤、または局所製剤などの他の投与形態が好ましいこともある。坐薬用の結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール類またはトリグリセリド類が挙げられる。経口製剤は、例えば医薬グレードの多糖、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられている賦形剤を含みうる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤または散剤の形態をとる。
【００１６】
ワクチンは、投与剤形と適合するように、治療上有効で、保護的であり、免疫原性を示す量で投与される。投与量は、処置される対象（例えば、個体の免疫系の抗体合成能や、必要な場合には細胞媒介性免疫応答の能力など）に依存する。投与が必要な有効成分の正確な量は、医師の判断に委ねられている。しかしながら、当業者であれば適当な用量範囲を容易に決定することができ、これは本発明のポリペプチドのｍｇオーダーでありうる。初回投与および追加投与のための適切な処方計画もまた、変動するものであるが、初回投与とそれに続く追加投与を含みうる。また、ワクチンの用量は、投与経路にも依存し、宿主のサイズによっても変動する。
【００１７】
後述する具体的な実施例は、単に例示のためのものであって、本明細書の開示以外の形態をいかようにも限定するものではないと解釈されるべきである。さらなる努力を必要とすることなく、当業者であれば、本明細書の開示に基づき、本発明を完全に実施することができるものと考えられる。本明細書において引用されている文献についてはすべて、その全体が参照により本明細書に引用されている。
【実施例】
【００１８】
実施例１：野生型ＬＴＡおよび、変異型ＬＴＡを含むＬＴをコードする遺伝子の構築
ＬＴ遺伝子の１．８ｋｂＤＮＡ断片（サブユニットＡおよびサブユニットＢを含む）を、ヒト腸管毒素原性大腸菌Ｈ１０４０７株から単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）ベクター中にクローニングした（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＬＴｈＷＴ）。このＬＴ遺伝子（サブユニットＡ、Ｂの双方をコードする）のヌクレオチド配列（配列番号６）、およびこのＬＴ遺伝子のサブユニットＡのアミノ酸配列（配列番号５）を以下に示す：
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
部位特異的突然変異誘発法を用いて、種々のＬＴＡ変異体が構築された（Ho et al., 1989, Gene77, 51-59）。より具体的には、配列番号５の６１位のセリンをＫ、Ｒ、Ｈ、Ｙ、およびＦでそれぞれ置換することにより、ＬＴＡ（Ｓ６１Ｋ）、ＬＴＡ（Ｓ６１Ｒ）、ＬＴＡ（Ｓ６１Ｈ）、ＬＴＡ（Ｓ６１Ｙ）、およびＬＴＡ（Ｓ６１Ｆ）などのＬＴＡ変異体が構築された。これらの変異体の構築には、以下のオリゴヌクレオチドプライマーが用いられている：ＬＴＡ（Ｓ６１Ｋ）［５’ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＴＴＴ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＡ ３’］（配列番号１１），ＬＴＡ（Ｓ６１Ｒ）［５’ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ３’］（配列番号１２），ＬＴＡ（Ｓ６１Ｆ）［５’ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ３’］（配列番号１３），ＬＴＡ（Ｓ６１Ｙ）［５’ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＡＴＡ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ３’］（配列番号１４），ＬＴＡ（Ｓ６１Ｈ）［５’ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＡＴＧ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ３’］（配列番号１５）。これらのＬＴＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下に示す：
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】
【表６】
【００２６】
【表７】
【００２７】
【表８】
【００２８】
【表９】
【００２９】
【表１０】
【００３０】
比較のために、サブユニットＡの６３位のアミノ酸であるセリンをリシンで置換することにより、ＥＷＤ２９９（Dallas et al., 1979, J. Bacteriol. 139, 850-859）由来の別のＬＴ変異体であるＬＴｐ（Ｓ６３Ｋ）も構築した。
【００３１】
実施例２：野生型ＬＴ、および変異型ＬＴＡを含むＬＴの調製
天然のＬＴ遺伝子または変異型ＬＴ遺伝子（サブユニットＡおよびサブユニットＢの双方の遺伝子を含む）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）ベクターを、大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬ培地を含有する３Ｌフラスコ中で一晩培養した培地から、天然および変異型のＬＴを精製した。遠心分離により細胞を回収し、ＴＥＡＮバッファ（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および３ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．４）に再懸濁させ、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）(Microfluidics Corporation, USA)を用いて溶解させた。遠心分離によって溶解物を清澄化した後、固体状硫酸アンモニウムを６５％飽和まで添加することにより、ＬＴを分画した。次いでこれをＴＥＡＮバッファに懸濁させ、同一のバッファに対して十分に透析し、粗ＬＴとして用いた。この粗ＬＴを、４℃にてＴＥＡＮバッファで平衡化した固定化Ｄ−ガラクトース（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）カラムによるクロマトグラフィに供した（Uesaka et al., 1994, Microbial Pathogenesis 16:71-76）。０．３ＭガラクトースのＴＥＡＮ溶液を用いて、天然および変異型のＬＴを溶出させた。精製された各毒素をＰＢＳバッファに対して透析し、生物学的アッセイおよび免疫学的アッセイに用いた。
【００３２】
精製された野生型および変異型ＬＴを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。この際、ＬＴサブユニットＡの分子量は約２８〜２９ｋＤａであり、ＬＴサブユニットＢの分子量は約１２〜１３ｋＤａであった。ＬＴＡ（Ｓ６１Ｋ）を含む全長ＬＴ（すなわち、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ））およびＬＴＡ（Ｓ６１Ｒ）を含む全長ＬＴ（すなわち、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｒ））の収率は、配列番号５のＬＴＡを含むＬＴと同等であった。
【００３３】
ｐＨ３〜１０の等電点分画ゲル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｇｅｌ）（インビトロジェン）により、ＬＴのＡＢ５ヘテロヘキサマーおよびＢ５ペンタマーを分離した。ＵＶＩＢａｎｄソフトウェア（ＵＶＩｔｅｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によりＡＢ５タンパク質およびＢ５タンパク質のバンドの強度を分析し、ＡＢ５ヘテロヘキサマーおよびＢ５ペンタマーの百分率を算出した（ＡＢ５の等電点（ｐＩ）の値は８．０〜７．８であり、Ｂ５のｐＩの値は８．３〜８．１であった）。これらの結果を表１に示す。
【００３４】
【表１１】
【００３５】
実施例３：野生型ＬＴおよび変異型ＬＴＡを含むＬＴの細胞内ｃＡＭＰレベルに与える影響の評価
２４ウェルプレートに、２０％ＦＢＳを添加したＭＥＭ−α培地中でＣａｃｏ−２細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３７）を５×１０４細胞／ウェルの濃度で維持し、コンフルエント近くまで培養し、１％ＦＢＳおよび１ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するＭＥＭ−α中、５％ＣＯ２下にて３０分間インキュベートし、その後に毒素を添加した（Grant et al., 1994, Infection and Iimmunity 62: 4270-4278）。天然のＬＴまたは変異型のＬＴを各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。次いで、冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。２００μＬの０．１Ｎ ＨＣｌを各ウェルに添加することにより細胞内ｃＡＭＰを抽出し、室温にて１５分間インキュベートした。０．１Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに添加した後に、細胞溶解物の上清を回収した（Cheng et al., 2000, Vaccine18: 38-49; Park et al., 1999, Experimental and Molecular Medicine 31: 101-107）。ｃＡＭＰ酵素イムノアッセイキット（アッセイデザイン；Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ−ＥＩＡ）を用いて、ｃＡＭＰを定量した。本実施例から得られた結果によれば、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させなかったことがわかる。
【００３６】
実施例４：Ｙ１副腎腫瘍細胞アッセイを用いた、変異型ＬＴＡを含むＬＴの毒性の評価
この試験では、ＬＴサンプル（野生型ＬＴ、ＬＴの活性部位変異体（ｈ６１Ｋ）、およびサブユニットＢ複合体（Ｂ５））について、腸管毒性作用を評価した。１５％ウマ血清、２．５％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地中で維持したマウスＹ−１副腎腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７９）を、９６ウェル平底プレート中、２×１０４細胞／ウェル（２００μＬ／ウェル）の濃度で、５％ＣＯ２下、３７℃にて４８時間播種した。９６ウェル平底プレート中の細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、次いで、５％ＣＯ２下、３７℃にて一晩、順次希釈ＬＴサンプル（１０μｇ／２００μＬ〜１０−１０μｇ／２００μＬ）で処置した。毒素処理の２４時間後、典型的な細胞の円形化を、光学顕微鏡により観察した。活性は、細胞の円形化を開始させるのに要した毒素の最小濃度（ＥＣｉ）または５０％の細胞の円形化に要した毒素の濃度（ＥＣ５０）として定義される。David et al., 1975, Infection and Immunity, 11:334-336; Cheng et al., 1999, Vaccine 18:38-49を参照のこと。野生型ＬＴと比較して、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｒ）、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｈ）の毒性は有意に低い（すなわち、１０−６対１）。以下の表２を参照のこと。ＬＴｈ（Ｓ６１Ｆ）の毒性も低い（すなわち、１０−５）が、その低下は他の変異体ほど有意なものではない。
【００３７】
【表１２】
【００３８】
実施例５：ラビット回腸ループアッセイによる、変異型ＬＴＡを含むＬＴの毒性の評価
本アッセイは、従来の開示に従って行った（Giannelli et al., 1997, Infection and Immunity 65: 331-334; Giuliani et al., 1998, J. Exp. Med. 187:1123-1132）。本アッセイでは、成体ニュージーランドラビット（それぞれ〜２．５ｋｇ）を用いた。ラビットの小腸の末端から開始し、胃へと向かって長さがそれぞれ５ｃｍのループを作製した。種々の量のＬＴまたはＬＴ変異体を含む０．５ｍＬサンプルを各ループに注入し、次いで腹部を閉鎖した。１８時間後、各ループに蓄積した液体を回収し、定量した。この実験を３回行ない、結果をｃｍあたりのｍＬで示した。本実験からの結果によれば、５００μｇのＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）では１ｍＬの液体がラビット回腸ループに蓄積したのみであり、蓄積した液体の体積は天然のコントロールと同等であった。０．１μｇの野生型ＬＴを用いたときには、野生型ＬＴの蓄積した液体の体積はＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）よりもかなり多かった。また、別のＬＴｐ（Ｓ６３Ｋ）での液体の蓄積もまた、ＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）よりもかなり多かった。
【００３９】
実施例６：鼻腔内免疫における変異型ＬＴＡを含むＬＴのアジュバント効果の評価
本実施例では、不活化インフルエンザウイルスであるＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９５）を用いた。従来開示されているように、ウイルス粒子を調製した（Aitken et al., 1980, Eur. J. Biochem. 107:51-56; Gallagher et al., 1984, J. Clin. Microbiol. 20:89-93; Johansson et al., 1989, J. Virol. 63:1239-1246）。簡単に言えば、１０日齢の孵化鶏卵の尿膜腔中で、３５℃にて２日間、ウイルスを増殖させた。ＰＲ８で感染させた卵由来の尿膜腔液を、まず低速で遠心分離し、次いで９６，０００×ｇにて１時間遠心分離してウイルス粒子を沈殿させて、これをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。これらの粒子を３０〜６０％ショ糖密度勾配上にロードし、９６，０００×ｇにて５時間遠心分離した。ウイルスを含む画分を回収し、ＰＢＳで希釈した。さらに９６，０００×ｇにて１時間、ウイルスをペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。精製したウイルスを、４℃にて１週間、０．０２５％ホルマリンで処理した。光学密度（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）に基づいてタンパク質濃度を測定して標準化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってヘマグルチニン（ＨＡ）量を定量した（Oxford et al., 1981, J. Biol. Stand. 9:483-491）。
【００４０】
台湾国家実験動物センター（Taiwan National Laboratory Animal Center）から、６〜８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを入手した。５匹のマウスからなる群をそれぞれ、麻酔下で、２０μｇの不活化インフルエンザウイルス（ｆｌｕ．Ａｇ）を単独でまたは８μｇの天然もしくは変異型のＬＴとともに含有する２５μＬのＰＢＳで鼻腔内に免疫した。これらのマウスを３週間後に再度免疫した。コントロールマウスには、同一条件下でＰＢＳを投与した。最後の免疫の２週間後に、各群のマウスを屠殺して血清を採取して、血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイを行なった。不活化ウイルスワクチンを単独で用いて鼻腔内に免疫したマウスと比べて、不活化ウイルスワクチンをＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）またはＬＴｐ（Ｓ６３Ｋ）と併用して鼻腔内に免疫したマウスで、ＨＩ力価の有意な向上が検出された。不活化ウイルスと併用したＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）のＨＩ力価は、大幅に上昇した。ウイルスと併用したＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）のＨＩ力価は８１３であり、これはウイルスと併用したＬＴｈ（Ｓ６３Ｋ）の値と同等であるが、ウイルス単独の値よりも大きい。
【００４１】
実施例７：筋肉内免疫における、変異型ＬＴＡを含むＬＴのアジュバント効果の評価
筋肉内投与によって免疫を行なったこと以外は、実施例６で行なった手法を繰り返した。筋肉内ワクチンについては、１０μｇの不活化ワクチンを単独でまたは４μｇの天然もしくは変異型のＬＴとともに含有する５０μＬのＰＢＳとして調製し、大腿後部の筋肉に注入した。上述したように、免疫処理およびサンプリングのプログラムを行なった。不活化ワクチンと併用したＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）のＨＩ力価は、大幅に上昇した。
【００４２】
ウイルスと併用したＬＴｈ（Ｓ６１Ｋ）のＨＩ力価は５１２であり、これはウイルスと併用した野生型ＬＴの値、またはウイルス単独の値よりも有意に大きい。
【００４３】
他の実施形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合されうる。本明細書に開示されたそれぞれの特徴は、同一の、等価な、または類似の目的に資する他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明記しない限り、開示されたそれぞれの特徴は、等価な、または類似の上位概念の一連の特徴の例示にすぎない。
【００４４】
上述の記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に把握することができ、その思想および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途および条件に適合させる目的で種々の変更および修飾を加えることが可能である。よって、他の実施形態もまた、後述する特許請求の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌易熱性エンテロトキシンの変異サブユニットＡを含む単離ポリペプチドであって、
当該変異の位置が、配列番号５の６１位に対応し、Ｓ、Ｔ、およびＦ以外のアミノ酸残基であり、
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンが、配列番号５を含む野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンと比較して低い毒性を有する、単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性が、前記野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性の１０−６倍未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、およびＹからなる群から選択される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記変異サブユニットＡが、配列番号２、４、８、および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
抗原とアジュバントとを含むワクチンであって、
前記アジュバントが、大腸菌易熱性エンテロトキシンの変異サブユニットＡであり、
当該変異の位置が、配列番号５の６１位に対応し、Ｓ、Ｔ、およびＦ以外のアミノ酸残基であり、
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンが、配列番号５を含む野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンと比較して低い毒性を有する、ワクチン。
【請求項６】
前記抗原が、細菌またはウイルス由来である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記細菌が、肺炎連鎖球菌、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ、髄膜炎菌、およびインフルエンザ菌ｂ型からなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、エンテロウイルス、およびロタウイルスからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性が、前記野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性の１０−６倍未満である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記変異サブユニットＡが、配列番号５の６１位に対応する位置にＫ、Ｒ、Ｙ、またはＨを含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記変異サブユニットＡが、配列番号５の６１位に対応する位置にＫを含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記変異サブユニットＡが、配列番号５の６１位に対応する位置にＲを含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記変異サブユニットＡが、配列番号２、４、８、および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１４】
ＬＴのサブユニットＢをさらに含み、前記変異サブユニットＡと前記サブユニットＢとが全長の大腸菌易熱性エンテロトキシンを形成する、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１５】
大腸菌易熱性エンテロトキシンの変異サブユニットＡをコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸であって、
当該変異の位置が、配列番号５の６１位に対応し、Ｓ、Ｔ、およびＦ以外のアミノ酸残基であり、
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンが、配列番号５を含む野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンと比較して低い毒性を有する、単離核酸。
【請求項１６】
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性が、前記野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性の１０−６倍未満である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記アミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、およびＨからなる群から選択される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、７、および９からなる群から選択される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１５に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含む、形質転換細胞。
【請求項１】
大腸菌易熱性エンテロトキシンの変異サブユニットＡを含む単離ポリペプチドであって、
当該変異の位置が、配列番号５の６１位に対応し、Ｓ、Ｔ、およびＦ以外のアミノ酸残基であり、
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンが、配列番号５を含む野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンと比較して低い毒性を有する、単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性が、前記野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性の１０−６倍未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、およびＹからなる群から選択される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記変異サブユニットＡが、配列番号２、４、８、および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
抗原とアジュバントとを含むワクチンであって、
前記アジュバントが、大腸菌易熱性エンテロトキシンの変異サブユニットＡであり、
当該変異の位置が、配列番号５の６１位に対応し、Ｓ、Ｔ、およびＦ以外のアミノ酸残基であり、
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンが、配列番号５を含む野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンと比較して低い毒性を有する、ワクチン。
【請求項６】
前記抗原が、細菌またはウイルス由来である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記細菌が、肺炎連鎖球菌、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ、髄膜炎菌、およびインフルエンザ菌ｂ型からなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、エンテロウイルス、およびロタウイルスからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性が、前記野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性の１０−６倍未満である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記変異サブユニットＡが、配列番号５の６１位に対応する位置にＫ、Ｒ、Ｙ、またはＨを含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記変異サブユニットＡが、配列番号５の６１位に対応する位置にＫを含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記変異サブユニットＡが、配列番号５の６１位に対応する位置にＲを含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記変異サブユニットＡが、配列番号２、４、８、および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１４】
ＬＴのサブユニットＢをさらに含み、前記変異サブユニットＡと前記サブユニットＢとが全長の大腸菌易熱性エンテロトキシンを形成する、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１５】
大腸菌易熱性エンテロトキシンの変異サブユニットＡをコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸であって、
当該変異の位置が、配列番号５の６１位に対応し、Ｓ、Ｔ、およびＦ以外のアミノ酸残基であり、
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンが、配列番号５を含む野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンと比較して低い毒性を有する、単離核酸。
【請求項１６】
前記変異サブユニットＡを含む大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性が、前記野生型大腸菌易熱性エンテロトキシンの毒性の１０−６倍未満である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記アミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、およびＨからなる群から選択される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、７、および９からなる群から選択される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１５に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含む、形質転換細胞。
【公表番号】特表２０１０−５３３４８９（Ｐ２０１０−５３３４８９Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６９６７（Ｐ２０１０−５１６９６７）
【出願日】平成１９年８月１３日（２００７．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７５８０１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１１７０７
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０９２８５８６１）ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１３日（２００７．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７５８０１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１１７０７
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０９２８５８６１）ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジー (1)
【Ｆターム（参考）】
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