変異酵素
本発明は、強化された特性を有する変異酵素と、かかる酵素を用いて有機化合物基質を酸化するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強化された特性を有する変異酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、Ｐ４５０ＢＭ−３酵素等の生物学的酵素触媒は、ファインケミカル、中間体、医薬品及び薬物代謝産物の合成から、有機化学混入物質及び汚染物質の分解までにわたる、様々な工業的利用において多くの用途が見出されている。定向進化又は部位特異的突然変異誘発を用いたタンパク質工学を利用することにより、既知の酵素の変異体を単離することができ、これら変異体は、それらの触媒活性に対する新たな機会及び用途を生み出し得る。
【０００３】
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＰ４５０ＢＭ−３（１）は、チトクロームＰ４５０酵素のスーパーファミリーに属する。各種遺伝子配列データベース中に、Ｐ４５０酵素をコードする７，７００を超える遺伝子が存在する。Ｐ４５０酵素の命名は、体系化されている。この酵素のスーパーファミリーは、ＣＹＰと称され、その後に酵素のファミリーに対する数字が続き（すなわち、ＣＹＰｌ、ＣＹＰ５１、ＣＹＰ１０２等の名前がある）、これらはさらにアルファベットによって表されるサブファミリーへと分かれ（すなわち、ＣＹＰｌＡ、ＣＹＰｌ０ｌＢ等の名前がある）、各サブファミリーのメンバーは数字によって表される（すなわち、ＣＹＰｌＡｌ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１０１Ｄ３等）。ＣＹＰ酵素をコードする遺伝子はイタリック体によって表される、例えば、ＣＹＰｌ０ｌＡｌ（イタリック体）遺伝子。Ｐ４５０ＢＭ−３は、ＣＹＰ１０２Ａ１と指定されており、すなわち、それは、ＣＹＰ１０２ファミリーの初めてのメンバーである。以下、ＣＹＰ１０２Ａｌという系統名を、Ｐ４５０ＢＭ−３の代わりに使用する。
【０００４】
ＣＹＰ１０２Ａ１（１）は、触媒として自己充足的であることから、生体内変換に適用するための注目度の高い酵素である。その他のＰ４５０酵素と異なり、この酵素においては、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼと電子伝達共同因子タンパク質とは別の物質であり、ＣＹＰ１０２Ａｌは、単一のポリペプチド中にＦＡＤ及びＦＭＮ補欠分子族の両方を含む、ジフラビン電子伝達還元酵素ドメインと融合したヘムモノオキシゲナーゼドメインを有する。ＣＹＰ１０２Ａ１の天然の基質は、直鎖状又は分枝鎖状の中鎖脂肪酸であると考えられている（１，２）。１９９３年に、ＣＹＰ１０２Ａ１ヘムドメインの結晶構造が入手可能となり（３）、これによって、活性部位構造と、基質アクセスチャンネルの存在とが明らかとなった。結合基質と一緒になった結晶構造が、４年後に発表され、これは、基質結合時におけるＦ８７の側鎖の構造の変化を示していた（４）。
【０００５】
ＣＹＰ１０２Ａ１のタンパク質工学については概説されている（５−７）。初期の研究は、活性部位残基Ｆ８７に焦点が置かれており、Ｆ８７Ｖ、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｙ及びＦ８７Ｇ変異は、活性及び脂肪酸酸化の選択性に対し、様々な影響を及ぼすことが示されている（８−１１）。Ｆ８７における変異は、様々な基質の酸化に対して有益であることが見出されている（７）。基質アクセスチャンネルへの入り口に位置するＦ４２、Ｒ４７、及びＹ５１等の残基も研究対象とされた。４７位の電荷を中和又は逆転させることにより、基質特異性が変化し（８，１２）、疎水性置換Ｙ５１Ａも同様であったが、Ｆ４２Ａ変異は、酵素活性を低下させた（１０）。ＷＯ００３１２７３は、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ変異対の使用が、多環芳香族及びテルペノイド炭化水素等の疎水性有機分子の進入、結合及び酸化を促進することを開示した。この変異対は、Ｆ８７Ａ、Ｉ２６３Ａ、Ａ２６４Ｇ及びＭ３５４Ａ変異とも組み合わされて、増大した活性及び／又は基質酸化における生成物選択性をもたらした（１３，１４）。Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆの組み合わせ、並びに、Ｒ４７Ｌ及びＹ５１Ｆの変異は、単独で、ＣＹＰ１０２Ａ１工学において現在、一般的に使用されている（１５−１９）。
【０００６】
変異部位の合理的選択に加えて、スクリーニング技術を利用して、活性及び選択性に所望の効果を及ぼすその他の変異及び変異部位を同定した。１９９７年には早くも、ランダム又は飽和突然変異誘発が、ＣＹＰ１０２Ａｌに対して適用された（２０）。ＮＯ２００２０３８０は、新規活性を有するＣＹＰ１０２Ａｌ変異体を発見するためのスクリーニング法として、インドール酸化を介したインディゴ形成の使用を開示した。基質結合に影響を与える可能性の高い多数の残基に飽和突然変異誘発が適用され、変異Ａ７４Ｇ／Ｆ８７Ｖ／Ｌ１８８Ｑは、野生型と比較して、増大した活性及び変化した選択性によって、広範な有機分子を酸化することが報告された（２１−２５）。ＡＴ３４２３５１Ｔは、一連のランダム突然変異誘発実験におけるスクリーニング手順として、ω−ｐ−ニトロフェノキシ−カルボン酸の酸化を介した、分光学的に検出されるｐ−ニトロフェノールの形成を開示した。変異Ｖ２６Ｔ、Ｒ４７Ｆ、Ｓ７２Ｇ、Ａ７４Ｇ、Ｆ８７Ａ＆Ｖ、Ｌ１８８Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｓ＆Ｗ、Ｍ３５４Ｔが開示された（２６，２７）。
【０００７】
ｐ−ニトロフェノールスクリーニング法は、代替基質としてｐ−ニトロフェノキシオクタンを使用することにより拡大された。ＷＯ２００２０８３８６８、ＥＰ１４７０２１９及びＵＳ２００５２０２４１９（その後、ＷＯ２００５０１７１１６、ＥＰ１６６０６４６、及びＵＳ２００５０３７４１１と修正）は、変異Ｌ５２Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｆ８７Ａ、Ｈｌ００Ｒ、Ｓ１０６Ｒ、Ｆ１０７Ｌ、Ａ１３５Ｓ、Ｍ１４５Ａ＆Ｖ、Ａｌ８４Ｖ、Ｎ２３９Ｈ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ３２４Ｉ、Ｖ３４０Ｍ、Ｉ３６６Ｖ、Ｋ４３４Ｅ、Ｅ４４２Ｋ、Ｖ４４６Ｉを開示した。
【０００８】
ＷＯ２００３００８５６３及びＵＳ２００３１００７４４は、ランダム突然変異誘発のさらなる実施、遺伝子シャッフリング及び同じ方法を用いたスクリーニングの結果を開示し、変異Ｍ３０Ｉ、Ｅ６４Ａ、Ｖ７８Ａ、Ｆ８７Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｖ＆Ｗ、Ｈ１３８Ｙ、Ｆ１６２Ｓ、Ｈ１７１Ｑ、Ｔ１７５Ｉ、Ｖ１７８Ｉ、Ａ１８４Ｖ、Ｎ１８６Ｄ、Ｄ２１７Ｖ、Ｉ２２０Ｔ、Ｋ２２４Ｉ、Ｓ２２６Ｉ、Ｄ２３２Ｇ、Ｔ２３５Ａ、Ｈ２３６Ｑ、Ｅ２５２Ｇ、Ｒ２５５Ｓ、Ｉ２５８Ｔ、Ｉ２５９Ｖ、Ｔ２６８Ｑ、Ａ２９０Ｖ、Ａ２９５Ｔ、Ｌ３５３Ｖ、Ｄ３７０Ｑ、Ｅ３８０Ｇ、Ｇ３９６Ｍ、Ｔ４１１Ａ、Ｍ４１６Ｌを報告した。
【０００９】
ＷＯ２００５０１７１０５、ＵＳ２００５０５９１２８、及びＥＰ１６３９０９１は、同じ方法の使用を開示し、変異Ｒ４７Ｃ、Ｌ７５Ｉ＆Ｗ、Ｖ７８Ａ、Ｆ＆Ｔ、Ａ８２Ｌ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ＆Ｔ、Ｆ８７Ｉ、Ｌ＆Ｖ、Ｔ８８Ｃ、Ｋ９４Ｉ、Ｐ１４２Ｓ、Ｔ１７５Ｉ、Ａ１８４Ｖ、Ｆ２０５Ｃ、Ｓ２２６Ｒ、Ｈ２３６Ｑ、Ｅ２５２Ｇ、Ｒ２５５Ｓ、Ｔ２６０、Ｌ、Ｎ＆Ｓ、Ａ２９０Ｖ、Ａ３２８Ｖ＆Ｍ、Ｌ３５３Ｖを報告した。
【００１０】
その後、ＷＯ２００６１０５０８２が、変異Ｒ４７Ｃ、Ｖ７８Ｆ、Ａ８２Ｓ、Ｋ９４Ｉ、Ｐ１４１Ｓ、Ｔ１７５Ｉ、Ａ１８４Ｖ、Ｆ２０５Ｃ、Ｓ２２６Ｒ、Ｈ２３６Ｑ、Ｅ２５２Ｇ、Ｒ２５５Ｓ、Ａ２９０Ｖ、Ａ２９１Ｖ、Ａ３２８Ｆ、Ｌ３５３Ｖを開示した。
【００１１】
ランダム突然変異誘発によって作製されるこれらの一連の変異は、エタンから中鎖アルカンまでのアルカン類の酸化に対して強化された活性を示す（２８−３０）。特に、部位特異的突然変異誘発法によって活性部位へ導入される変異に定向進化変異が組み合わされた場合に、例えば、この変異によって末端炭素に対する酸化の部位をシフトさせた場合のオクタン酸化（３１）、末端アルケンの選択的エポキシ化（３２）、及びシクロペンタンカルボン酸誘導体の酸化におけるエナンチオ選択性（３３）において、選択性の変化も生じた。定向進化と合理的再設計を組み合わせることにより、より優れた結果を取得し得ることは注目すべきである。
【００１２】
ＣＹＰ１０２Ａ３は、ＣＹＰ１０２Ａ１と同じサブファミリーのＰ４５０酵素である。ＣＹＰ１０２Ａ３のランダム突然変異誘発、続く、アルカン酸化、及び、アルコールに対して特異的なアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でのＮＡＤＨ形成のモニタリングにより、オクタン酸化によって５０％の１−オクタノールを形成する変異体を生じた。このことは、改変されたＣＹＰ１０２ファミリーＰ４５０酵素によって今日まで観察されている、直鎖状アルカンの最大の割合での末端Ｃ−Ｈ結合の酸化である（３４）。
【００１３】
酵素の触媒メカニズムに及ぼす構造変化の影響をさらに理解するため、それら酵素の触媒的代謝回転を向上するため、並びに、基質及び／又は生成物に対するそれら酵素の範囲を拡張するために、産業上有用な酵素、例えば、ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素のさらなる変異体を単離する継続的必要性が存在する。一般的に、ＣＹＰ１０２Ａｌ等のＰ４５０酵素の改変は、酵素活性を増大させるために行われ、生成物選択性及び基質特異性の制御は、重要な二次的な目的である。選択性の制御と強化されたモノオキシゲナーゼ活性とを結び付け得る変異及び変異部位は明らかに欠けており、その結果、化合物に対する酵素的代謝回転が速いが十分に選択的ではないか、ある程度の選択性はあるが反応が遅いか、あるいは、所望の生成物が形成されない。強化された活性及び／又は所望の選択性を有する変異体を提供し得るスクリーニング法も必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明にしたがう、ＣＹＰ１０２Ａｌの特定の位置における置換変異は、モノオキシゲナーゼ活性を増大させるという所望の効果を有し、変化した選択性をも提供することが、現在、分かっている。これらの変異部位は、増大した活性及び増大／変化した選択性の両方の選択を提供する、画期的スクリーニング法の使用によって同定された。
【００１５】
本発明は、増大したモノオキシゲナーゼ活性及び／又は変化した選択性を有し、ＣＹＰ１０２Ａ１の位置１１７、１３１、１９１、２１５、２７６、３０７、３３０、３７７、４０１、４０３、４２５のうちの一つ又はそれ以上に置換を含む、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素を提供する。さらに、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素を用いて有機化合物を酸化させる工程を含む、有機化合物である基質を酸化させる方法が提供される。
【００１６】
主張されている置換は、同じ発明の概念を形成し、何故ならば、それらの置換は、ＣＹＰ１０２Ａｌのモノオキシゲナーゼ活性を増大させ、且つ／又は、選択性を変化させるという効果を共有するからである。位置３３０、４０１及び４０３の置換はまた、以下に概説するように、共通の構造的及び／又は機能的メカニズムを介して、それらの効果を及ぼす。
【００１７】
配列リスト中の配列
配列番号１は、ＣＹＰ１０２Ａｌの配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＣＹＰ１０２Ａｌ（Ｐ４５０ＢＭ−３）において関連する残基の場所を表す。Ｐａｌｍは、酵素の脂肪酸基質を示す。
【００１９】
【図２】図２は、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１とＡ３３０Ｐ変異体の基質アクセスチャンネル及び活性部位における主要残基の比較を表し、Ａ３３０Ｐ変異から生じるＰ３２９及びＡ３２８における構造的な摂動状態をハイライトしている。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＹＰ１０２Ａｌの天然及び人工の相同体、例えば、ＣＹＰ１０２Ａｌに対して少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むもの、に対して適用することができる。かかる相同体は、通常、ＣＹＰ１０２Ａｌのヘムモノオキシゲナーゼドメイン（アミノ酸位置１〜４８０によって表される）に相当する（すなわち、これと相同する又は同一である）アミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明の酵素は、配列番号１（ＣＹＰ１０２Ａ１の配列）と少なくとも４０％の相同性を有する配列を含む（又は、からなる）。好ましい実施形態において、その配列は、相同体の少なくとも２０個、好ましくは、少なくとも３０個、例えば、少なくとも４０、６０、１００、２００、３００、４００個又はそれ以上の連続するアミノ酸、あるいは、全体配列に対して、少なくとも５５％、６５％、８０％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％相同であり得る。一実施形態において、本発明の酵素は、ＣＹＰ１０２Ａｌのアミノ酸残基１〜４８０と比較した場合に、任意の特定の割合の相同性を有する。この連続するアミノ酸は、活性部位を含み得る。あるいは、この相同性は、連続するアミノ酸に対してではなく、活性部位のアミノ酸のみに対して測定してもよい。すなわち、相同体は、通常、アミノ酸の同一性を基準として、ＣＹＰ１０２Ａｌに対して少なくとも４０％相同である。本発明の酵素は、ＣＹＰ１０２Ａｌ配列と一定の割合の同一性を有し得、それは、上記した任意の長さの配列に対する任意の特定の割合の相同性値と同じである（すなわち、それは、少なくとも４０％、５５％、８０％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％の同一性を有し得る）。
【００２２】
相同配列は、ＣＹＰ１０２Ａ１配列の変異部分を表し得、且つ／又は、本発明の酵素の全長融合ポリペプチドの形態で表し得る。
【００２３】
本明細書において記載される任意の相同タンパク質（すなわち、別のタンパク質と相同であると記載されるもの）は、通常、関連するタンパク質と少なくとも４０％相同である。相同性は既知の方法を用いて測定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用し得る（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ ＭｏＩ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０に記載されるようにして、（通常は、それらのデフォルト設定において）相同性を計算するため又は配列を整列させるために使用することができる。
【００２４】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、ある正値閾値Ｔと適合する又は満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近傍（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ）ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（上掲））。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するための出発点（ｓｅｅｄｓ）として機能する。ヒットしたワードは、累積アラインメントスコアを増加可能な範囲まで、各配列に沿って両方向に延長される。ヒットしたワードの各方向における延長は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ低下した場合；一つ又はそれ以上の負に評価された残基アラインメントの蓄積により、累積スコアが０若しくはそれより下った場合；又は、いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。
【００２５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二つの配列間における類似性の統計的解析を行う。例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供された類似性の尺度の一つは最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは二つのヌクレオチド配列間の適合又は二つのアミノ酸配列間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、第一配列の第二配列に対する比較において最小合計確率が約１より少なく、好ましくは約０．１より少なく、より好ましくは約０．０１より少なく、最も好ましくは約０．００１より少ない場合に、ある配列が別の配列に類似していると考えられる。
【００２６】
通常、相同タンパク質は、関連するタンパク質と、上記したタンパク質の全て又は任意の長さの連続するアミノ酸と比較した場合に、少なくとも２、５、１０、２０、４０、５０又は６０個又はそれ未満の変異（それぞれの変異は置換、挿入又は欠失であり得る）で異なる。
【００２７】
本発明のＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の酵素活性は、通常、本明細書において記載される基質又は条件のいずれかを用いて、インビトロで測定され、ＮＡＤＰＨ酸化率、生成物形成率及び結合効率として与えられる。この比率は代謝回転頻度であり、（ｎｍｏｌ ＮＡＤＰＨ）（ｎｍｏｌ ＣＹＰｌ０２Ａｌ）−１（ｍｉｎ）−１又は（ｎｍｏｌ 生成物）（ｎｍｏｌ ＣＹＰｌ０２Ａｌ）−１（ｍｉｎ）−１として与えられる。結合効率は、消費されるＮＡＤＰＨのパーセンテージであり、生成物形成に対して利用した、すなわち、理論的最大効率のパーセンテージである。本発明のＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は（例えば、本発明の方法において使用される場合）、通常、少なくとも１％、例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、２０％、４０％、８０％又はそれ以上の結合効率を有し得る。ＣＹＰ１０２Ａ１酵素（例えば、本発明の方法において使用される場合）、通常、少なくとも２ｍｉｎ−１、例えば、少なくとも４、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、３００、５００、７００、１０００、２０００ｍｉｎ−１又はそれ以上の生成物形成率を有する。２つ以上の生成物が形成される場合（通常はそうである）、生成物形成率は、形成された全酸化生成物の合計量を表す。いくつかの実施形態において、特定の酸化生成物の生成物形成率が測定され、すなわち、全ての酸化生成物について測定しなくてもよい。
【００２８】
本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、対応する野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素に対して、増大したモノオキシゲナーゼ活性及び／又は変化した選択性を示す。増大したモノオキシゲナーゼ活性は、酸化に対する一つ又はそれ以上の基質の増大した結合効率又は増大した生成物形成率という点で特徴づけられ得る。増大した結合効率又は増大した生成物形成率については、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって利用される全ての基質について共有していてもよいし、共共有していなくてもよい。変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、通常、野生型酵素の結合効率よりも、少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％又は１５００％大きい結合効率を示す。変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素はまた、野生型酵素の生成物形成率よりも、少なくとも５０％、１００％、１５０％、５００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％大きい生成物形成率を有し得る。
【００２９】
本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、対応する野生型酵素及び文献に開示されている変異体に対して、その他の変化した特徴も示し得、結果として、その効果は、限定するものではないが、増大したモノオキシゲナーゼ活性を含み得ることを理解すべきである。例えば、変異酵素は、変化した基質特異性を示し、それにより、特異的な基質の選択的利用が可能となる場合もあり、又は、野生型酵素若しくは既知の変異体が、基質の有機化合物を酸化することができない場合に、モノオキシゲナーゼ活性を示す場合もある。
【００３０】
本発明の変異酵素は、野生型では微量に形成される生成物が変異体では主要な生成物となる場合、又は、野生型では微量に形成される若しくは全く形成されない新しい生成物が主要な若しくは支配的な生成物となる場合に、変化した生成物選択性を示す場合もある。変異酵素及びこの変異酵素によって行われる酸化工程のさらなる変化した特徴を、以下に記載する。変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、ＣＹＰｌ０２Ａｌの位置１１７、１３１、１９１、２１５、２７６、３０７、３３０、３７７、４０１、４０３、及び４２５のうちの一つ又はそれ以上に置換を含む。通常、それらは、上記の位置のうちの２ヶ所又はそれ以上、３ヶ所又はそれ以上、４ヶ所又はそれ以上、５ヶ所又はそれ以上、６ヶ所又はそれ以上に置換を含んでもよい。一つの好ましい実施形態において、位置３３０に置換が存在する場合、５ヶ所未満、例えば、３ヶ所未満のその他の置換が存在し、又は、一実施形態においては、その他の位置のいずれも置換されていない。
【００３１】
ＣＹＰ１０２Ａ１の特定の変異体について記載する場合、天然の形態のＣＹＰ１０２Ａｌ中に存在するアミノ酸残基の文字の次に位置が続き、次に、変異体中のアミノ酸が続く。これらの位置は、配列番号１に示される番号付けと関連させることができる。同じタンパク質中の複数の変異を示すために、各変異はスラッシュで分けて示される。また、特に好ましい変異体は、以下に概説される内部呼称を用いて記載され得る。
【００３２】
変異はＣＹＰ１０２Ａｌ中の位置を参照することによって規定されるが、本発明は、配列番号１と少なくとも４０％のアミノ酸同一性を共有するＣＹＰ１０２Ａｌの相同体のポリペプチド鎖中の相同する又は対応する位置における同等の置換変異をも包含する。同等な位置は、配列番号１のアミノ酸配列を参照することにより決定される。相同する又は対応する位置は、配列間の相同性に基づき、相同体の配列とＣＹＰ１０２Ａ１の配列（配列番号１）を整列させることにより、容易に推定することができる。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いることにより、配列を整列させることができる。参照された相同する又は対応するアミノ酸残基が活性部位である場合、通常、以下に記載される特定のアミノ酸のいずれも、相同体の活性部位の同様の位置に存在し得るであろう。
【００３３】
高度に保存された三次構造を有するにもかかわらず、Ｐ４５０スーパーファミリーの酵素は、相同性の低い一次構造を有するという点で、タンパク質及び酵素の中では珍しいということが当業者には良く知られている（３５-３７）。現在、ゲノムデータベース中には、６５００を超えるＣＹＰ遺伝子が存在し、タンパク質データバンク中には、１５０を超える構造が存在する。今日までに決定されている全てのＰ４５０構造は、初めて報告されたＰ４５０酵素（ＣＹＰｌ０ｌＡｌ）の結晶構造においてＰｏｕｌｏｓ及び共同研究者によって記載されているように、主たるβ鎖ドメインに対して集められた、らせん構造が豊富なドメインを含む特徴的なトポグラフィーを示す（３８）。らせん構造はＡ−Ｌと命名され、β鎖はβｌ−β５と命名され、全体のトポグラフィーは、現在、「Ｐ４５０折り畳み構造」として知られている（３８−４２）。二次構造要素のうち、ヘムの遠位側にあるＢ及びＢ’らせん、ＢＣループ、Ｆ及びＧらせん、並びにＦＧループは、基質結合ポケットを形成する。配列アラインメントによって、これらのらせん構造及びループ構造内の残基は容易に同定することができるが、アミノ酸配列及び構造的配列の両方の点で、この全般的フレームワーク内において高程度に可変的であり、このことが、Ｐ４５０触媒の多様な特異性、活性及び選択性パターンをもたらしている。
【００３４】
異なるファミリーのＰ４５０酵素は、２０％程度の低さの相同性（アミノ酸同一性）を有する（３５−３７）。ＣＹＰ１０２Ａ１と構造的に特徴付けられているＰ４５０酵素のアラインメントの例を、表Ａに示す。最近まで継続された配列分析によって、Ｐ４５０酵素又はドメイン中の通常は４００−４６０個のうちのわずか３残基が確実に保存されていることが示唆された：ヘムとの会合及び結合に関与し得る、ヘム鉄に近接するシステインリガンド、及びＫらせん構造中のＥＸＸＲモチーフ（４３）。しかしながら、２００６年に発表されたＣＹＰ１５７ファミリーにおける結果は、ＥＸＸＲモチーフさえ保存されておらず、全Ｐ４５０スーパーファミリーにわたり唯一保存されている残基として近接システインのみが残されていることを示した。Ｐ４５０スーパーファミリーの体系的分類においては（４４）、したがって、わずか４０％のアミノ酸同一性を有する酵素が同じファミリー内に置かれ、密接に関連するファミリーメンバー（５５％を超える同一性を有するもの）はサブファミリーへと分類された（例えば、表Ｂ参照）。
【００３５】
実際、詳細な分子構造、基質特異性及び生成物選択性は、配列同一性よりもむしろファミリー内で保存されており、配列同一性は低い場合が多い。最も特筆すべき例は、全ての生物界で見られるＣＹＰ５１ファミリーのステロール１４α−デメチラーゼである。これらは、スクアレンオキシドの酸化後に形成される中間体のＣ１４メチル基の酸化的脱メチル化において極めて重要な役割を果たす。配列アラインメントによって、全生物界における既知のＣＹＰ５１ファミリー遺伝子間の相同性は平均３０％であり、哺乳類等の密接に関連する種においては９５％まで高くなり、下等動物間では２３％と低くなることが示された（４５）。酵素を同じファミリーに割り当てるための４０％というカットオフ値は、ある場合においては高すぎる場合があり、酵素活性と、活性部位残基において見られることの多い高い相同性とをこれからはより考慮すべきであるという認識が増えている。
【００３６】
すなわち、アミノ酸同一性に基づきＣＹＰ１０２Ａｌと通常少なくとも４０％相同である相同体は、「Ｐ４５０折り畳み構造」に基づき容易に同定することもでき、対応する又は相同する位置に同等の変異を導入するための相同体の配列のアラインメントは、この酵素ファミリーを通じて共有されているＰ４５０折り畳み構造を含む、αヘリックス及びβ鎖の配列の保存されている特徴についての知識によって補助され得る。
【００３７】
ＣＹＰ１０２Ａｌは、電子伝達還元酵素ドメインとヘムモノオキシゲナーゼドメインの融合体であることを理解すべきである。これらのドメインは、タンパク分解的に、又は全長遺伝子の切断により、切断することができる。活性部位（基質結合ポケット）は、ヘムドメイン中に位置する。ＣＹＰ１０２ファミリーのいくつかのメンバーは、融合タンパク質ではないが、ＣＹＰ１０２Ａｌヘムドメインとの配列相同性は４０％である。したがって、配列相同性は、これらの環境にあるヘムドメインに対してのみ測定してもよい。本発明において開示されるＣＹＰ１０２Ａｌ中の残基に対するこれらの酵素中の同等の残基は、当業者に公知の配列相同性及び構造分析によって同定することができる。
【００３８】
活性部位におけるアミノ酸は、触媒作用時に基質が結合している部位を線引き若しくは規定するものであるか、又は、触媒部位に到達する前に基質が通過する必要がある部位を線引き若しくは規定するものである。したがって、かかるアミノ酸は、通常、触媒部位への進入時又は触媒作用時に、基質と相互作用する。かかる相互作用は、通常、静電相互作用（荷電又は極性基間）、疎水相互作用、水素結合又はファンデルワールス力によって生じる。活性部位のアミノ酸は、配列アラインメント、並びに、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌのヘムドメインの既知の結晶構造、又は相同体の結晶構造に対する参照、によって同定することができる。
【００３９】
変異残基が活性部位残基ではない場合、相同体とＣＹＰ１０２Ａｌの配列のコンピューター化された又はマニュアルのアラインメントが、相同する又は対応する位置を推定するために行われ、これは、ＣＹＰ１０２Ａｌの変異した位置に隣接する残基の知識によって補助され得る。すなわち、例えば、ＣＹＰ１０２Ａｌの以下の位置に対してＮ末端側及びＣ末端側に隣接する１０残基は、以下の通りである：
ＦＳＱＱＡＭＫＧＹＨ（Ａ１１７）ＭＭＶＤＩＡＶＱＬＶ；
ＤＩＡＶＱＬＶＱＫＷ（Ｅ１３１）ＲＬＮＡＤＥＨＩＥＶ；
ＬＤＥＡＭＮＫＬＱＲ（Ａ１９１）ＮＰＤＤＰＡＹＤＥＮ；
ＦＱＥＤＩＫＶＭＮＤ（Ｌ２１５）ＶＤＫＩＩＡＤＲＫＡ；
ＨＥＴＴＳＧＬＬＳＦ（Ａ２７６）ＬＹＦＬＶＫＮＰＨＶ；
ＶＬＶＤＰＡＰＳＹＫ（Ｑ３０７）ＶＫＱＬＫＴＶＧＭＶ；
ＥＡＬＲＬＷＰＴＡＰ（Ａ３３０）ＦＳＬＹＡＫＥＤＴＶ；
ＧＤＤＶＥＥＦＲＰ（Ｅ３７７）ＲＦＥＮＰＳＡＩＰＱ；
ＫＰＦＧＮＧＱＲＡＣ（Ｉ４０１）ＧＱＱＦＡＬＨＥＡＴ；
ＦＧＮＧＱＲＡＣＩＧ（Ｑ４０３）ＱＦＡＬＨＥＡＴＬＶ；
ＧＭＭＬＫＨＦＤＦＥ（Ｄ４２５）ＨＴＮＹＥＬＤＩＫＥ。
【００４０】
２個、３個又はそれ以上のＮ末端側及び／又はＣ末端側の隣接する残基の保存は、変異が導入される相同する又は対応する位置の推定を可能にし得る。
【００４１】
ＣＹＰ１０２Ａｌの天然の相同体における相同する又は対応する部位を同定するために、明細書中で参照されるＣＹＰ１０２Ａｌ中の任意のその他の位置に対して同様の分析を行うことができる。
【００４２】
ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の機能的断片も本発明に包含される。すなわち、これらの断片は、酸化活性に必要とされるアミノ酸のみを含んでもよい。したがって、ＣＹＰ１０２Ａｌのポリペプチド配列に関して、還元酵素ドメイン、及び／又は、モノオキシゲナーゼドメインのＮ末端又はＣ末端部分の最大２０残基は、活性部位の折り畳み又はモノオキシゲナーゼドメイン固有の基質酸化能には有意に影響を与えることなく削除することができた。ＣＹＰ１０２Ａｌの相同体の場合、同様の切断が可能であり、可能な切断の程度は、本明細書において記載される酸化活性をモニタリングするための方法によって決定され得る。切断された形態の酵素は、タンパク質の安定性、発現レベル、及び活性に関して、有利な特性を有し得る。
【００４３】
本明細書中に記載されたＣＹＰｌ０２Ａｌの位置（又は、上記の同等の位置）において置換されたアミノ酸の特性は、主として、増大したモノオキシゲナーゼ活性を示す変異体の要件によって決定される。したがって、導入されるアミノ酸は、通常、モノオキシゲナーゼ活性を増大し得る。ＣＹＰ１０２Ａ１における特定の置換変異のいずれかについて言及する場合、ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の酸化活性に対する特定の置換変異の効果よりも余剰な又は類似する効果を示す、同じ位置の別のアミノ酸残基の任意の置換が、本発明に包含されることを理解すべきである。同様に、特定の置換変異が、ＣＹＰ１０２Ａ１酵素の別のパラメーター、例えば、基質特異性、又は、所定の基質の酸化で得られる酸化生成物の範囲若しくは割合、に対する効果も示す場合、余剰な又は類似の効果も誘導するその他のアミノ酸残基の置換も、本発明の使用に対して意図されることを理解すべきである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、置換は、保存的変化を導入し、アミノ酸を、類似した化学構造、類似した化学特性又は類似した側鎖体積の別のアミノ酸と交換する。保存的なアミノ酸の変化は、当技術分野において周知であり、表Ｃに規定される変化にしたがって選択され得る。アミノ酸が類似した極性を有する場合、これは、アミノ酸側鎖のハイドロパシースケールを参照することにより決定することもできる（表Ｄ）。
【００４５】
保存的なアミノ酸の変化は、アミノ酸配列の保存のための採点マトリックスである、許容される点突然変異（ＰＡＭ）又はブロック置換マトリックス（ＢＬＯＳＵＭ）ファミリーを参照することにより決定してもよい。したがって、保存的なアミノ酸の変化は、基準及び変異ポリペプチド鎖のアラインメントにおいて使用するために選択された、採点マトリックスの類似性表示において互いに正のスコアを有するアミノ酸の組である、同等のグループのメンバーであってもよい。
【００４６】
表Ｃに示される物理的特性の定義は、本発明を限定するものであると考えるのではなく、非極性アミノ酸は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸及び芳香族側鎖を有するアミノ酸を含む、ということを理解すべきである。アミノ酸プロリンは、非極性として分類されるが、剛性であるという特性も有し、二次構造の変化を引き起こし得る。例えば、プロリンは、らせん構造の端部に見られることが多い。また、所定のアミノ酸残基の側鎖の特定の状況にもよるが、例えば、アミノ酸チロシン（通常は、その芳香環のために非極性と分類される）は、スレオニン等の極性アミノ酸残基と、その水酸基を介することにより、類似した機能的効果を示し得る。したがって、チロシンは、本発明の目的に対しては、非極性及び極性アミノ酸の両方であると考えてもよい。さらに、極性又は親水性と記載されるアミノ酸は、電荷を有していなくても、有していてもよく、又、塩基性であっても、酸性であってもよい。アミノ酸ヒスチジンは、約７のｐＫａ値を有することが良く知られており、したがって、タンパク質の環境に応じた中性のｐＨにおいては、その側鎖でプロトン化されていても、プロトン化されていなくてもよく、すなわち、電荷を有していても、有していなくてもよい。したがって、ヒスチジンは、本発明の目的に対しては、極性を有し電荷を有したアミノ酸及び極性を有し電荷を有していないアミノ酸の両方であると考えてもよい。
【００４７】
ＣＹＰ１０２Ａ１の位置１１７、１３１、２１５、３０７、３３０、４０１、及び４０３（又は、それと同等の位置）における保存的アミノ酸変化の具体例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
Ａｌ１７Ｖ、Ａｌ１７Ｉ、Ａ１１７Ｌ、Ａ１１７Ｐ、Ａ１１７Ｍ、Ａ１１７Ｆ、Ａ１１７Ｗ、Ａ１１７Ｙ；
Ｅ１３１Ｄ；
Ｌ２１５Ｉ、Ｌ２１５Ｖ、Ｌ２１５Ｐ、Ｌ２１５Ｆ、Ｌ２１５Ｗ、Ｌ２１５Ｙ；
Ｑ３０７Ｈ、Ｑ３０７Ｎ、Ｑ３０７Ｓ、Ｑ３０７Ｔ、Ｑ３０７Ｙ；
Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｙ；
Ｉ４０１Ｐ、Ｉ４０１Ｉ、Ｉ４０１Ｌ、Ｉ４０１Ｍ、Ｉ４０１Ｖ、Ｉ４０１Ｆ、Ｉ４０１Ｗ、Ｉ４０１Ｙ；
Ｑ４０３Ｎ、Ｑ４０３Ｈ、Ｑ４０３Ａ、Ｑ４０３Ｔ、Ｑ４０３Ｙ。
【００４８】
その他の好ましい実施形態において、アミノ酸置換によって、通常、既存の残基が非極性残基である野生型酵素の所定の位置に極性アミノ酸を導入することにより、極性を変化させる。ＣＹＰ１０２Ａ１の位置１９１及び２７６（又は、それと同等の位置）における極性アミノ酸置換の具体例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
Ａ１９１Ｔ、Ａ１９１Ｓ、Ａ１９１Ｃ、Ａ１９１Ｙ、Ａ１９１Ｈ、Ａ１９１Ｋ；Ａ１９１Ｒ、Ａ１９１Ｎ、Ａ１９１Ｑ；
Ａ２７６Ｔ、Ａ２７６Ｓ、Ａ２７６Ｃ、Ａ２７６Ｙ、Ａ２７６Ｈ、Ａ２７６Ｋ、Ａ２７６Ｒ、Ａ２７６Ｎ、Ａ２７６Ｑ。
【００４９】
対照的に、その他の好ましい実施形態において、アミノ酸置換によって、通常、既存の残基が極性残基である野生型酵素の所定の位置に非極性アミノ酸を導入する。例えば、非極性アミノ酸を、位置３７７若しくは４０３、又は、それと同等の位置に導入してもよい。具体例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
Ｅ３７７Ａ、Ｅ３７７Ｖ、Ｅ３７７Ｌ、Ｅ３７７Ｉ、Ｅ３７７Ｐ、Ｅ３７７Ｆ、Ｅ３７７Ｙ、Ｅ３７７Ｗ；
Ｑ４０３Ｐ、Ｑ４０３Ｗ、Ｑ４０３Ｆ、Ｑ４０３Ｙ。
【００５０】
さらなる実施形態において、アミノ酸置換は、野生型酵素の所定の位置において、電荷を有する側鎖基の欠失を引き起こす。したがって、置換によって、電荷を有していないアミノ酸が関連する位置に導入される。このことは、この位置における極性の喪失を引き起こすかもしれないし、引き起こさないかもしれず、したがって、極性を有し電荷を有していない又は非極性の（芳香族又は脂肪族の）残基が導入される。例えば、非極性又は極性の電荷を有していない残基は、位置４２５又はそれと同等の位置に導入してもよい。具体例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
Ｄ４２５Ｎ、Ｄ４２５Ｑ、Ｄ４２５Ｈ、Ｄ４２５Ｓ、Ｄ４２５Ｔ、Ｄ４２５Ａ、Ｄ４２５Ｌ、Ｄ４２５Ｖ、Ｄ４２５Ｉ、Ｄ４２５Ｐ、Ｄ４２５Ｗ、Ｄ４２５Ｙ、Ｄ４２５Ｆ。
【００５１】
さらにさらなる実施形態において、大きな側鎖体積のアミノ酸が、本発明の位置に導入される。好ましい実施形態において、大きな側鎖体積のアミノ酸、通常、嵩高い非極性のアミノ酸が、位置３３０、４０１、４０３又はそれと同等の位置に導入される。位置３３０に関して特に好ましい置換は、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３ＯＬ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｙである。位置４０３に関して特に好ましい置換は、Ｑ４０３Ｐ、Ｑ４０３Ｗ、Ｑ４０３Ｆである。その他の実施形態において、例えば、位置３７７においては、小さな側鎖体積を有するアミノ酸が導入されるのが好ましい場合もある（例えば、Ｅ３７７Ａ又はＥ３７７Ｇ）。
【００５２】
本明細書において記載される変異は、通常、酵素の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ及び遺伝子シャッフリング法等の当技術分野において公知の方法を用いることにより、又は、部位特異的突然変異誘発のサイクルにおける複数の変異原性オリゴヌクレオチドを用いることにより、酵素中に導入される。したがって、変異は、特異的な又はランダムな様式で導入され得る。したがって、変異誘発法は、一つ又はそれ以上の異なる変異体をコードする一つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを生成する。通常、変異体遺伝子のライブラリーが作製され、それを用いて、変異酵素のライブラリーを作製することができる。
【００５３】
酵素は、上記した一つ又はそれ以上の変異の他に、１、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜４０個又はそれ以上のその他の変異、例えば、置換、挿入又は欠失、を含んでもよい。これらのさらなる変異は、変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素のモノオキシゲナーゼ活性を増大するかもしれないし、増大しないかもしれない。その他の変異は、活性部位内にあってもよいし、活性部位の外にあってもよい。例えば、変異は、第二の範囲、すなわち、活性部位のアミノ酸のうちの一つ又はそれ以上の位置又は方向に影響を与える又はそれらと接触する残基、にあってもよい。挿入は、通常、Ｎ末端及び／又はＣ末端的であり得る。したがって、酵素は、最大２０個のアミノ酸からなる短いペプチドを含んでもよいし、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる又は固体マトリックス上での固定化によるタンパク質精製を助けるために、一端又は両端に融合させた全長タンパク質を含んでもよい。欠失は、通常、触媒作用に関与しないアミノ酸、例えば、活性部位の外にあるもの、の欠失を含む（したがって、酵素は、天然の酵素の変異断片である）。
【００５４】
活性部位におけるその他の変異は、通常、活性部位に基質が結合した時に、基質の位置及び／又は立体構造を変化させる。変異は、ヘム基により接近し得る、酸化される基質上の部位を作り得る。したがって、変異は、より小さな若しくはより大きな、又は、より極性の大きい若しくはより極性の小さい側鎖を有するアミノ酸との置換であってもよい。
【００５５】
さらなる変異には、酵素の安定性を増大し得るアミノ酸残基の変更を含むことができる。これらの変異は、通常、タンパク質のオリゴマー化を防ぎ、例えば、Ｐ４５０ｃａｍ（ＣＹＰｌ０ｌＡｌ）のダイマー化は、Ｃｙｓ３４４の、好ましくは、アラニンとの、置換により除去される。全長ＣＹＰ１０２Ａ１の結晶構造は未だ得られておらず、得られているのは、ヘムドメイン及びＦＡＤ／ＦＭＮドメイン別々のもののみである。同様の置換は、ＣＹＰ１０２Ａ１については必要とされない、何故ならば、ＣＹＰｌ０ｌＡｌのＣｙｓ３３４は、ＣＹＰ１０２Ａ１のＡｓｐ３７０と一致するからである。しかしながら、全長ＣＹＰ１０２Ａ１及び／又は還元酵素ドメインの結晶構造は、タンパク質の安定性を向上させるためにアラニンとの置換によって除去され得る、システイン残基を明らかにし得る。その他の変異も、タンパク質表面の疎水パッチ間の接触により生じるオリゴマー化を阻害することができる。さらにさらなる変異は、酵素精製及び／又は固定化を助ける挿入／欠失と、タンパク質が可溶形態で調製されることを可能にする変異とを、例えば、欠失又はポリヒスチジンタグの導入により、又は、Ｎ末端の膜アンカー配列の変異により含む。
【００５６】
好ましくは、さらなる変異は、ＣＹＰ１０２Ａｌ中の以下の変異のうちの一つ又はそれ以上から、又は、それと同等の位置の同じ変異から選択される：Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ、Ａ７４Ｇ、Ａ２６４Ｇ、Ｎ２３９Ｈ、Ｉ２５９Ｖ、Ｌ３５３Ｉ、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｌ、Ｆ８７Ｇ、Ｈ１７１Ｌ、Ｌ１８８Ｑ、Ｎ３１９Ｙ、Ｉ２６３Ａ、Ａ３２８Ｐ。特定して示された効果に対して余剰な又は同様の効果を有するその他のアミノ酸変化を選択するのに関連して、位置１１７、１３１、１９１、２１５、２７６、３０７、３３０、３７７、４０１、４０３及び４２５について上記に概説したように、同じ考慮すべき事柄が当てはまることも理解すべきである。したがって、例えば、上記された特定のさらなる変異が、保存的変化であるかどうか、極性を変化させるかどうか、又は電荷を有していないアミノ酸を導入するかどうかに応じて、アミノ酸の類似範囲は、各付加的位置における導入に対して適合し得る。
【００５７】
特に好ましい実施形態において、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、以下のＣＹＰ１０２Ａｌ中の変異群から選択される一つ又はそれ以上の変異群を含むか：
ｉ） Ａ３３０Ｐ
ｉｉ） Ａ１９１Ｔ／Ｎ２３９Ｈ／Ｉ２５９Ｖ／Ａ２７６Ｔ／Ｌ３５３Ｉ；
ｉｉｉ） Ｆ８７Ａ／Ｈ１７１Ｌ／Ｑ３０７Ｈ／Ｎ３１９Ｙ；
ｉｖ） Ｆ８７Ａ／Ａ３３０Ｐ／Ｅ３７７Ａ／Ｄ４２５Ｎ；
ｖ） Ｆ８７Ａ／Ａ１１７Ｖ／Ｅ１３１Ｄ／Ｌ２１５Ｉ；
ｖｉ） Ｉ４０１Ｐ；
ｖｉｉ） Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ；
ｖｉｉｉ）Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ；
ｉｘ） Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ；
ｘ） Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐ；
ｘｉ） Ｑ４０３Ｐ；
ｘｉｉ） Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｑ４０３Ｐ；
ｘｉｉｉ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｆ８７Ａ／Ｑ４０３Ｐ
、又は、これらと同等の変異群を含む。
【００５８】
ｉ）に規定されるＡ３３０Ｐ変異は、その効果が、協力して作用する変化した残基の混成状態に左右され得る、その他の定向進化変異とは異なり、その活性は、単一の点突然変異から生じることから、いくつかの点において通常の変異と異なる。ＣＹＰ１０２Ａｌにおいて、Ａ３３０は、位置３２９の天然のプロリン残基の隣に位置するので、Ａ３３０Ｐは、βシート領域中の一次基質接触ポイントにおける２つのプロリンと並列する（３）。この変異体の結晶構造（図２）は、これが、アクセスチャンネルを妨げ、活性部位をより接近しにくいものとしており、それによって、より接近した活性部位をもたらし、基質に対する結合配置が変化することを、示唆している。以下に見られるように、このことは、モノオキシゲナーゼ活性及び生成物選択性に対して特徴的効果を及ぼす。
【００５９】
変異ｉｉ）及びｉｉｉ）のグループは、野生型酵素によって示される特異的な形質を広く反映しながら、ＣＹＰ１０２Ａｌの活性を増大させる。グループｉｉｉ）〜ｖ）の残基８７は例外として、任意の変異グループにおいて変異した位置のいずれもが、活性部位残基ではない。
【００６０】
例えば、グループｉｉ）において、位置３５３は、基質アクセスチャンネルの残基３５４の隣に位置する一方、残基１９１、２３９、２５９、２７６及び３５３は、タンパク質表面に位置する。Ａｌ９１は、結晶構造によれば、明らかにパルミチン酸塩結合部位上に移動されており（４）、アクセスチャンネルの外縁上に位置している。この残基を変異させることが、基質の誘引及び／又は捕捉に対して影響を及ぼし得ると推測されている。
【００６１】
グループｉｉｉ）において、位置１７１は、タンパク質表面上又は表面近くに位置する一方、残基３０７及び３１９は、電子伝達還元酵素ドメインに対するドッキング部位であると考えられている領域に近いので、電子伝達動態に及ぼす影響によるモノオキシゲナーゼ活性の増大に対するその影響を潜在的に介在し得る。
【００６２】
変異ｉｖ）のグループは、基質接触ポイントにおけるＡ３３０Ｐ変異と、変異ｖ）における位置１１７、１３１、及び２１５と同様に、タンパク質表面に近い酵素構造の周辺に配置されている位置３７７及び４２５の変異とを含む。
【００６３】
さらに好ましい実施形態において、上記に規定された分類の本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は：
ｉ）ＣＹＰ１０２Ａ１中の以下の変異、又は、それと同等の変異のうちの一つ又はそれ以上をさらに含み：Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ、Ａ７４Ｇ、Ａ２６４Ｇ；
ｉｉ）ＣＹＰ１０２Ａ１中の以下の変異のうちの一つ又はそれ以上をさらに含み：Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｌ；及び
ｉｉｉ）ＣＹＰ１０２Ａ１中の以下の変異のうちの一つ又はそれ以上をさらに含む：Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｇ、Ｉ２５９Ｖ、Ｉ２６３Ａ。
【００６４】
上記された特定の変異又は特定のさらなる変異に加えて、最大１、２、３、４、５〜１０、１０〜２０個又はそれ以上のその他の変異も、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素のこれらの好ましい実施形態に含まれ得ることを理解すべきである。
【００６５】
酸化工程のための基質は、任意の有機化合物であり、より典型的には、モノオキシゲナーゼ酵素によって酸化され得る任意の有機化合物である。モノオキシゲナーゼ酵素による酸化に対する任意の有機化合物の適合性は、日常的に、本明細書において記載される方法によって調べられ得る。
【００６６】
酸化工程は、一般的に、炭素−水素結合の酸化によるアルコールのように、化合物中にＣ−Ｏ結合の形成を引き起こすが、エポキシドは、Ｃ＝Ｃ結合の酸化から形成され得る。したがって、酸化は、アルコール、アルデヒド、ケトン又はエポキシド基を導入し得る。あるいは、酸化は、例えば、アルコール基を、アルデヒド又はケトンへと変換させるように、酸素含有基のさらなる酸化を引き起こし得る。１、２個又はそれ以上の炭素原子が、同じ基質分子中で攻撃されてもよい。酸化は、基質分子のＮ−及びＯ−脱アルキル化も生じ得る。
【００６７】
酸化は、通常、１、２又はそれ以上の酸化生成物を生じる。これらの異なる生成物は、攻撃される異なる炭素原子から、及び／又は、所定の炭素原子において生じる異なる程度の酸化から得られ得る。
【００６８】
酸化は、環炭素原子又は置換基炭素原子のいずれか又はその両方で起こり得る。少なくとも初期酸化は、活性化され得る若しくは活性化され得ないＣ−Ｈ結合への攻撃、又は、炭素−炭素二重結合における攻撃（通常、エポキシドを生じる）を伴い得る。一般的に、活性化されるＣ−Ｈ結合は、炭素原子がベンジル又はアリルの位置にある。芳香環及びオレフィン性二重結合は、反応経路中で生成されるラジカル中間体又は任意の電荷の集合を安定化することにより、攻撃するＣ−Ｈ結合を活性化する。Ｃ−Ｈ結合の炭素原子は、一級、二級又は三級であってもよい。酸化は、酸素原子の挿入よりもむしろ、Ｃ＝Ｃ二重結合の形成をもたらす脱水素化を生じるように起こり得る。このことは、アルキル置換基が分岐している場合、又は、脱水素化が、芳香環と共役するＣ＝Ｃ結合を生じる場合、又は、脱水素化が、芳香族系の形成をもたらす場合に、最も起こり得る。
【００６９】
基質は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の天然の基質、又は、通常は野生型酵素の基質ではないが、変異酵素中で基質として利用され得る基質、のいずれかであり得る。ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素のための天然の基質の例は、分岐鎖状又は直鎖状の脂肪酸であり、これらは、端部近くの位置（ω−１〜ω−３）で野生型ＣＹＰ１０２Ａ１によって水酸化される。好ましい例は、ラウリン酸、ウンデカン酸、デカン酸、ノナン酸及びオクタン酸である。
【００７０】
好ましい実施形態において、基質は、短鎖アルカン又は中鎖アルカン又はアルキルベンゼンである。用語アルカンは、一般式ＣｎＨ２ｎ＋２を有する非環状の分岐している又は分岐していない炭化水素のことをいう。
【００７１】
短鎖アルカンは、通常、１〜約９個の炭素原子、より好ましくは、１〜８個、１〜６個、又は、１〜４個の炭素原子を有する。Ｃ１−Ｃ８アルキル基又は部分は、直鎖状又は分岐鎖状であることができる。それがＣ１−Ｃ４アルキル部分である場合、それは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル及びｔ−ブチルであることができる。
【００７２】
アルキルベンゼンは、ベンジル芳香環上の位置で置換されている１個又はそれ以上のアルキル基又は部分を有する。アルキル基又は部分中の炭素原子の数は、通常、１〜約８個の炭素原子、より好ましくは、１〜８個、１〜６個、又は、１〜４個の炭素原子であり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態においては、短鎖又は中鎖アルカンの骨格上に、１、２、３個又はそれ以上の置換基が存在していてもよいし、又は、ベンジル環上で、若しくは、アルキルベンゼンのアルキル置換基上で、直接置換されていてもよい。以下の置換基の任意の組み合わせが存在し得る。置換基は、通常、ハロゲン原子、又は、一般的に１〜６個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル基であり、置換基は、１個又はそれ以上のハロゲンによって置換されていてもよい。置換基は、１、２個又はそれ以上の酸素、ハロゲン又は窒素原子を含んでもよく、例えば、アルコール、アルデヒド、ケトン、エーテル、アミン又はエポキシド基であり得る。
【００７４】
好ましい短鎖アルカン基質の例としては、限定するものではないが、ペンタン、３−メチルペンタン、２−メチルブタン、ブタン、プロパン、エタン及びメタン、オクタン及びノナンを挙げることができる。好ましいアルキルベンゼン基質の例としては、限定するものではないが、プロピルベンゼン、エチルベンゼン、ブチルベンゼン、クメン、ｔ−ブチルベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−シメン及びエチルアニソールを挙げることができる。その他の好ましい芳香族化合物は、ナフタレン及びフルオレンである。
【００７５】
ブタン、ナフタレン、特に、プロパン、ｔ−ブチルベンゼン及びｏ−キシレン等の有機化合物は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素に対する「非天然の」基質として広く分類されるが、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって酸化され得ることに注目すべきである。非天然基質は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌと一緒にインキュベートした時に検出可能な結合率及び／又は生成物形成を有しない分子として規定することができる。非天然基質は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素による天然の基質に対する割合の１０％未満で酸化される分子を含んでもよく、したがって、それらは、真の基質とは見なされ得ない。
【００７６】
本発明のその他の実施形態において、基質は、テルペン、例えば、モノテルペン又はセスキテルペンである。基質はシクロアルケンであることもできる。本発明において使用されるテルペンは、通常、ｎが２又はそれ以上、より具体的には２又は３である式（Ｃ５Ｈ８）ｎを有し得るが、用語「テルペン」は、断片、一般的にはメチル基、の喪失又は移動を含む「テルペノイド」と厳密に称される化合物にも及ぶことを理解すべきである。したがって、例えば、本発明において使用し得るセスキテルペン（この場合、ｎは３である）は、１５個よりもむしろ、わずか、すなわち１４個の炭素原子を含んでもよい。一般的に、テルペンは、イソプレン単位から組み立て得るものである。テルペンは、環状であっても、環状でなくてもよい。さらに、「テルペノイド」は、テルペンに関連する化合物にもその範囲は及び、例えば、アルコール又はケトン基の形態で、１個又はそれ以上の酸素を含んでもよい（例えば、ダマスコン及びイオノン、特にβ−イオノン）。
【００７７】
モノテルペン（この場合、ｎは２である）は、一般的に１０個の炭素原子を有し、通常１〜３個の二重結合、特に１又は２個の環二重結合、及び、通常０〜２個の環を含み得る。環の一つは、通常０又は１個の炭素原子を含む架橋部として形成され得る。すなわち、それは、現在ある環の２個の炭素原子同士の又は中間体のメチレン基との直接的結合によって形成され得る。テルペンが非環状である場合には、一般的に、少なくとも２個の二重結合、通常３個の二重結合を含み得る。
【００７８】
セスキテルペンは、通常、１４又は１５個の炭素原子を含み得、通常０〜２個の二重結合、及び、通常１〜３個の環を含み、融合環及び／又は架橋環であってもよい。
【００７９】
テルペンに存在し得る環は、通常、３〜９個の炭素原子、特に、５又は６個の炭素原子を有し得る。したがって、特に、テルペンは、シクロヘキサン又はシクロヘキサジエン環を含み得る。
【００８０】
テルペンは、通常、合計３又は４個の環外メチル又はメチレン基、例えば、モノテルペンに対しては、２個のメチル基と１個のメチレン基又は３個のメチル基、セスキテルペンに対しては、３個のメチル基と１個のメチレン基又は４個のメチル基を含み得る。
【００８１】
モノテルペンは、通常、Ｒ−リモネン等のリモネン、（＋）−α−ピネン等のピネン、テルピネン、サビネン、ツジェン、ミルセン、オシメム、ネロール又はゲラニトールである。
【００８２】
セスキテルペンは、３つのイソプレン単位の頭部−尾部配列化によって形成される。セスキテルペンは、通常、アロマデンドレン、カリオフィレン、ロンジフォレン、バレンセン、イソバザネン、シルフィネン、イシュワラン、イソパッチショール−３−エン、又はイソセスキカレンである。セスキテルペン基質がバレンセンであるのが特に好ましい。
【００８３】
シクロアルケンは、通常、最大９個の環要素を含み、例えば、それは、５、６、７、８、９個又はそれ以上の要素の環である。シクロアルケンは、通常、シクロヘキセンである。
【００８４】
上記した任意のテルペン又はシクロアルケンの置換誘導体を使用してもよい。通常、１、２、３個又はそれ以上の置換基が存在する。以下の置換基の任意の組み合わせで存在してもよい。置換基は、通常、ハロゲン原子若しくは酸素若しくは窒素含有基、又は、一般的に、１〜６個の炭素原子を有する、アルキル若しくはアルケニル基であり、この置換基は、１個又はそれ以上のハロゲンによって置換されていてもよい。
【００８５】
置換基は、通常、式ＣｎＨｋＸｍで示され、式中、Ｘはハロゲン、酸素又は窒素含有基であり、ｎは１、２、３又はそれ以上であり、ｍは１、２、３、４又はそれ以上であり、ｋは、置換基ＣｎＨｋＸｍの価数が満たされるような適当な値の整数である。アルキル置換基の場合、ｋ＋ｍ＝２ｎ＋ｌである。通常、ｋは１、２、３、４又はそれ以上であり、０であってもよく、すなわち、置換基が、ペルハロアルキル基である。ハロゲンは、通常、フッ素、塩素又は臭素である。置換基は、１、２個又はそれ以上の酸素原子を含んでもよく、例えば、アルコール、アルデヒド、ケトン又はエポキシド基であってもよい。
【００８６】
本発明のさらなる実施形態において、基質はハロ芳香族化合物である。ハロ芳香族化合物は、通常、ベンゼン又はビフェニル化合物である。ベンゼン環は融合していてもよく、置換していてもよい。ハロゲンは、通常、塩素である。多くの場合、分子中に１個より多い、通常、２〜５個又は６個、例えば、３個のハロゲン原子が存在する。一般的に、２個のハロゲン原子は、互いにオルト又はパラであり得る。化合物は、水酸基、アリールオキシ基又はカルボキシ基等の酸素原子を含んでいても、含んでいなくてもよい。化合物は、クロロフェノール又はクロロフェノキシ酢酸化合物であっても、なくてもよい。
【００８７】
本発明の方法によって酸化され得る具体的な化合物としては、１，２−；１，３−及び１，４−ジクロロベンゼン、１，２，４−；１，２，３−及び１，３，５−トリクロロベンゼン、１，２，４，５−及び１，２，３，５−テトラクロロベンゼン、ペンタンパク質クロロベンゼン、ヘキサクロロベンゼン、及び、３，３’−ジクロロビフェニル等を挙げることができる。
【００８８】
本発明の方法によって酸化され得るその他の化合物としては、取り扱い難いハロ芳香族化合物、特にダイオキシン及びハロゲン化ジベンゾフラン、並びに、１個又は両方の酸素原子が硫黄と置換されている対応する化合物、特に、少なくとも１個のハロ置換基を有するダイオキシン類化合物、例えば、ダイオキシン自体、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾダイオキシン等を挙げることができる。
【００８９】
ハロ芳香族化合物の酸化は、通常、１、２又はそれ以上の酸化生成物を生じる。酸化される原子は環炭素であってもよい。これらの酸化生成物は、一般的に、１個又はそれ以上の水酸基を含み得る。したがって一般的に、酸化生成物はフェノールであり、これらは、各種シュードモナス及びその他の細菌によって容易に分解され得るのに対して、非酸化ハロ芳香族化合物は酸化に対して耐性を有する。以下に記載されるように、このことが、本発明の酵素を、ハロ芳香族化合物で汚染された場所の汚染除去に適合させる。
【００９０】
本発明の方法における使用が意図される、さらにさらなる基質としては、限定するものではないが、クロロオキサゾン、アニリン、ｐ−ニトロフェノール、ニフェジピン、ツジョンジアステレオマー、アルケン（プロペン、１−ヘキセン及びスチレンを含む）、インドール、多環式芳香族炭化水素、プロパノールオール、アルコキシレゾルフィン（７−エトキシレゾルフィン、７−メトキシレゾルフィン、７−ペントキシレゾルフィン、７−ベンジルオキシレゾルフィンを含む）、ブスピロン、テストステロン、アモジアキン、デキストロメトルファン、アセトアミノフェン、３，４−メチレンジオキシメチルアンフェタミン（ＭＤＭＡ）等を挙げることができる。
【００９１】
本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素を用いて行われる酸化工程は、上記したような向上した結合率又は生成物形成率の点で、別の野生型又は変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって行われる工程とは区別され得る。本発明の方法は、酸化される基質からの特定の生成物、通常、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１酵素若しくは別の変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素によっては形成されないもの、又は、無視し得る量、すなわち、生成物の全体量の１０％未満、８％、５％、２％、１％又はそれ未満、で形成されるもの、の形成によっても特徴付けられ得る。例えば、プロピルベンゼンの酸化は、高い選択性で、２−プロピルフェノール、又は、１−フェニル−２−プロパノールを生成し得、エチルベンゼンの酸化は、２−フェニルエタノール及びスチレンを生成し得る。
【００９２】
本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素を用いて行われる工程は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素又はその他の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって行われる酸化工程と比較して、変化した割合又は数の酸化生成物も示し得る。変化した割合の生成物が存在する場合、特定の酸化生成物に関する生成物形成率は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素又はその他の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって行われる対応工程に対して、通常、増加する。特定の酸化生成物の普及の増加は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素又はその他の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって形成される場合の生成物混合物中の当該酸化生成物の量と比較して、少なくとも１０％、２０％、５０％、より好ましくは１００％、２００％、３００％、５００％又はそれ以上であり得る。
【００９３】
本発明の工程において増大した普及を示し得る酸化生成物の具体例は：ｉ）ｌ−フェニル−２−プロパノール、この場合、酸化される基質はプロピルベンゼンである；ｉｉ）２−エチルフェノール、この場合、酸化される基質はエチルベンゼンである；ｉｉｉ）１−フェニル−２−ブタノール又は４−フェニル−２−ブタノール、この場合、酸化される基質はブチルベンゼンである；ｉｖ）ベンジルアルコール、この場合、酸化される基質はトルエンである；ｖ）２−メチル−２−フェニルプロパン−ｌ−オール、この場合、酸化される基質はｔ−ブチルベンゼンである；ｖｉ）２−メチルベンジルアルコール、この場合、酸化される基質はｏ−キシレンである；ｖｉｉ）カルバクロール又はチモール又は４−イソプロピルベンジルアルコール、この場合、酸化される基質はｐ−シメンである；ｖｉｉｉ）ヌートカトン、この場合、酸化される基質はバレンセンである；ｉｘ）２−ノナノール、この場合、酸化される基質はノナンである；ｘ）２−ブタノン又は２−ブタノール、この場合、酸化される基質はブタンである；ｘｉ）３−メチル−３−ペンタノール、この場合、酸化される基質は３−メチルペンタンである；ｘｉｉ）２−プロパノール、この場合、酸化される基質はプロパンである；ｘｉｉｉ）トランス−イソピペリテノール、この場合、酸化される基質はＲ−リモネンである；ｘｉｖ）２，３−ピネンエポキシド、シス−ベルベノール、トランス−ベルベノール、この場合、酸化される基質はα−ピネンである；ｘｖ）９−フルオレノール、この場合、酸化される基質はフルオレンである；ｘｖｉ）８−ヒドロキシドデカン酸及び７−ヒドロキシドデカン酸、この場合、酸化される基質はラウリン酸である。
【００９４】
この工程は、通常、ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素、基質及び酵素の天然の補因子（ＮＡＤＰＨ及び酸素である）の存在下で行われる。一実施形態において、本発明の工程は、デヒドロゲナーゼ等の酵素、及び、デヒドロゲナーゼ酵素の補基質の酸化に付随するＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生するための補基質を用いて行われる。別の実施形態において、本発明の工程は、当技術分野において公知の電気化学的方法によってＮＡＤＰＨ補因子を再生することにより行われる。
【００９５】
増大した活性及び変化した選択性は、ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素のヘムドメイン中の置換によって生じることが理解される。したがって、本発明は、基質酸化が、酵素のヘムドメイン（ａ）、基質、電子伝達還元酵素（ｂ）、電子伝達レドキシン（ｃ）、酵素に対する補因子及び酸素供与体の存在下で行われる系も提供する。この系において電子の流れは、一般的に：補因子→（ｂ）→（ｃ）→（ａ）である。
【００９６】
（ｂ）は、一般的に、補因子から（ｃ）への電子伝達を仲介し得る電子伝達還元酵素であり、例えば、天然の還元酵素、又は、天然の還元酵素と相同性を有する（通常、少なくとも７０％の相同性を有する）タンパク質であるか；あるいは、還元酵素又は相同体の断片である。（ｂ）は、通常、天然のＰ４５０酵素系に見られる任意の電子伝達連鎖における還元酵素であり、通常、フラビン依存性の還元酵素、例えば、プチダレドキシン還元酵素である。
【００９７】
（ｃ）は、一般的に、補因子から（ｂ）を経由した（ａ）への電子伝達を仲介し得る電子伝達レドキシンである。（ｃ）は、天然の電子伝達レドキシン、又は、天然の電子伝達レドキシンと相同性を有する（通常、少なくとも７０％の相同性を有する）タンパク質であるか；あるいは、レドキシン又は相同体の断片である。（ｃ）は、通常、天然のＰ４５０酵素系に見られる任意の電子伝達連鎖におけるレドキシンである。（ｃ）は、通常、２Ｆｅ−２Ｓレドキシン、例えば、プチダレドキシン、又はフラボドキシンである。
【００９８】
通常、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、別々のタンパク質として存在するが、それらは、同じ融合タンパク質中に存在してもよい。通常、それらのうちの２つのみが、好ましくは、（ｂ）及び（ｃ）が、融合タンパク質中に存在する。通常、これらの成分は融合タンパク質中で連続的であるので、リンカーペプチドは存在しない。
【００９９】
あるいは、リンカーがこれら成分間に存在してもよい。リンカーは、一般的に、嵩張る側鎖は有しないので、タンパク質サブユニットの折り畳みを妨げない。好ましくは、リンカー中のアミノ酸は電荷を有していない。リンカー中の好ましいアミノ酸は、グリシン、セリン、アラニン又はスレオニンである。一実施形態において、リンカーは、配列Ｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃを含む。リンカーは、通常、少なくとも５アミノ酸長からであり、例えば、少なくとも１０、３０又は５０又はそれ以上のアミノ酸長である。
【０１００】
本発明の工程において、酵素、（ｂ）又は（ｃ）の濃度は、通常、１０−８〜１０−２Ｍ、好ましくは、１０−７〜１０−４Ｍである。一般的に、本発明の工程は、酵素が機能的である温度及び／又はｐＨにおいて、例えば、酵素が、ピーク活性の少なくとも２０％、５０％、８０％又はそれ以上を有する場合の温度及び／又はｐＨにおいて行われる。通常、ｐＨは、３〜１１、例えば、５〜９又は６〜８、好ましくは、７〜７．８又は７．４である。通常、温度は、ｉｓ １０℃〜９０℃、例えば、２５℃〜７５℃又は３０℃〜６０℃である。
【０１０１】
本発明の工程において、２つ以上の異なる本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素が存在してもよい。通常、各変異体は、異なる基質を酸化し得るし、あるいは、所定の基質を、別の酵素よりも良好に酸化し得るので、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の混合物を用いることにより、広範にわたる基質を酸化することができる。本発明の工程は、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１酵素、その他のＰ４５０酵素又はそれらの相同体、任意のモノオキシゲナーゼ酵素、及び、所望の合成又は酸化反応において有用な任意のその他の酵素も含んでもよい。
【０１０２】
一実施形態において、本発明の工程は、過酸化水素副生成物を除去し得る物質（例えば、カタラーゼ）の存在下で行われる。別の実施形態において、本発明の工程は、全長酵素又は酵素のヘムドメイン、基質及び酸素原子供与体（例えば、過酸化水素又はｔ−ブチルヒドロペルオキシド）の存在下で、例えば、ペルオキシドシャントを使用することにより、行われる。
【０１０３】
さらなる実施形態において、本発明の工程は、全長酵素又は酵素のヘムドメインのみ、基質及び電気化学セル中の酸素の存在下で行われ、したがって、酸素の活性化及び活性中間体の生成に必要とされる２つの電子は、電極からの直接的電子伝達により又は小分子メディエーターを介して間接的に、電極によって供給される。
【０１０４】
本発明の工程は、細胞内又は細胞外で行ってもよい。細胞は、通常、培養状態で、ある場所に、インビボ又はインプランタ（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）で存在する（これらの態様については以下に記載する）。本発明の工程は、通常、土壌中（例えば、土中）又は水中（例えば、淡水又は海水）等の場所において行われる。本発明の工程が培養中で行われる場合、培養は、通常、異なるタイプの本発明の細胞を、例えば、本発明の異なる変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素を発現する細胞を含む。一般的に、そのような細胞は、同化可能な炭素及び窒素源の存在下で培養される。
【０１０５】
通常、本発明の工程が行われる細胞は、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａ１、又は、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１が天然には存在しないものである。別の実施形態において、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌが天然には存在しない細胞中で、しかし、天然のレベルよりも高いレベルで発現される。この細胞は、１、２、３、４又はそれ以上の異なる本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素を生成し得る。これらの変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、異なる有機化合物基質、異なる短鎖アルカン又は異なるアルキルベンゼンを酸化し得る。
【０１０６】
この細胞は、原核細胞であっても、真核細胞であってもよく、一般的には、本明細書において記載される任意の細胞又は任意の生物の細胞である。好ましい細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、フラボバクテリア又は真菌細胞（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及び酵母、特に、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））である。また、本発明にしたがい使用することが意図されるのは、ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）及びバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）である。細胞は、その天然の形態で、任意の基質を酸化し得る又は本明細書において記載される任意の酸化生成物を生成し得るものであっても、そうでなくてもよい。通常、細胞は、実質的に単離された形態及び／又は実質的に精製された形態であり、この場合、細胞は、一般的に、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％又は９９％の細胞又は乾燥重量の調製物を含み得る。
【０１０７】
本発明の細胞は、通常、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することにより（すなわち、細胞を形質転換することにより）作製される。ヌクレオチドコードの縮重のため、２つ以上のポリヌクレオチドが各本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素をコードし得ることを理解すべきである。ヌクレオチド配列を特定の細胞又は生物に適合するコドン傾向を示すように改変し得ることも理解すべきである。ベクターは、細胞のゲノム中に組み入れても、染色体外に留まらせていてもよい。細胞は以下に記載される動物又は植物へと成長し得る。通常、ポリヌクレオチドのコード配列は、宿主細胞によってコード配列の発現がもたらされ得る調節配列と、機能的に連結されている。調節配列は、一般的に（通常、モノオキシゲナーゼが発現される細胞の）プロモーターである。
【０１０８】
用語「機能的に連結された」とは、記載された要素が、それらの意図された様式で機能し得る関係にあるように並列させることをいう。コード配列に「機能的に連結された」調節配列は、調節配列と適合し得る条件下でコード配列の発現が達成されるように連結されている。
【０１０９】
ベクターは、通常、トランスポゾン、プラスミド、ウィルス又はファージベクターである。ベクターは、通常、複製開始点を含む。ベクターは、通常、１つ又はそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子、を含む。ベクターは、通常、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン、又はエレクトロポレーション等の従来技術を用いて宿主細胞中に導入される。
【０１１０】
本発明はさらに、その細胞が本発明の細胞のいずれかであるトランスジェニック動物又は植物を提供する。この動物又は植物は、１つ又はそれ以上の変異ＣＹＰ１０２Ａ１遺伝子に関してトランスジェニックである。それらは、かかる遺伝子に関してホモ接合性であっても、ヘテロ接合性であってもよく、それらは、通常、細胞中に一過的に導入されるか、又は、（例えば、ゲノム中に）安定的に組み入れられる。動物は、通常、虫（例えば、ミミズ）又は線虫である。植物又は動物は、適当な細胞（例えば、胚性幹細胞、カルス又は生殖細胞）を形質転換し、必要であれば、細胞の発達を促し、次に、細胞を動物又は植物へと成長させ、必要であれば、その動物又は植物に餌を与えることによって得ることができる。動物又は植物は、有性生殖又は無性生殖（例えば、クローニング）、本発明の動物若しくは植物又はＦｌ生物（あるいは、Ｆｌから除かれた任意の世代、又は、形質転換された細胞から発達させたキメラ）の繁殖によって得ることができる。
【０１１１】
上記したように、本発明の工程は、ある場所において行われ得る。したがって、本発明は、本発明の基質、例えば、短鎖アルカン、アルキルベンゼン又はハロ芳香族化合物、で汚染された場所を処理する方法も提供する。この方法は、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素、細胞、動物又は植物を、この場所と接触させることを含む。次に、通常、これらの生物を用いて、ハロ芳香族化合物を酸化させる。一実施形態において、この場所を処理するために使用される生物は、この場所に対して天然である。したがって、それらは、（例えば、汚染されている）場所から取得し、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ（及び、任意には、適当な電子伝達還元酵素及び／又はレドキシン）を発現するように（上記の通り）形質転換／トランスフェクトさせてもよい。
【０１１２】
一実施形態において、この場所は、本発明の２つ以上のタイプの生物、例えば、異なる有機化合物基質、例えば、異なる短鎖アルカン、アルキルベンゼン又はハロ芳香族化合物、を酸化する、異なるモノオキシゲナーゼを発現する２つ、３つ、４つ又はそれ以上のタイプの生物を用いて処理される。一実施形態において、かかる生物の一群は、それら同士で、特定のグループの基質、すなわち、汚染領域に存在する短鎖アルカンの全てを酸化することができる。
【０１１３】
（例えば、一群の形態の）生物は、バイオリアクター中で本発明の工程を行い得る（例えば、この場合、生物は固定された形態で存在する）。したがって、処理すべき水又は土壌を、かかるバイオリアクターに通してもよい。土壌は、界面活性剤又はエタノールを添加した水で洗浄してから、バイオリアクター中に導入してもよい。
【０１１４】
スクリーニング法の設計／本発明の変異体の単離
ランダム突然変異誘発及び遺伝子シャッフリングによって作製されたＣＹＰ１０２Ａｌ変異体ライブラリーをスクリーニングするための、今日までに開示されている方法は、インドール（インディゴ形成）及びｐ−ニトロフェノール誘導体（放出されるｐ−ニトロフェノールの検出）等の代替基質を使用する傾向がある。代替基質に対して増大した酸化活性を示す選択された変異体のうちのいくつかは、異なる構造を示す化合物に対しては増大した活性を有するが、生成物選択性の変化はあまり一般的ではないことが分かっている。
【０１１５】
生成物選択性のためのスクリーニングに関しては、ＷＯ２００６１０５０８２が、生成物であるアルコールを、分光的に検出され得る化合物と共役させる方法を開示した。同様に、ＣＹＰ１０２Ａ３によるオクタン酸化における１−オクタノールについての増大した選択性は、デヒドロゲナーゼスクリーニング法においてこの生成物を標的とすることにより得られた（３４）。これらの方法は、調査を選択性へと偏らせ、活性に関してはわずかに増えただけであった。また、特定の標的化合物の形成を促進する変異のみが見つけられ、一方で、広範な化合物に対して異なる、潜在的には所望の様式で生成物選択性に影響を及ぼす部位での変異は明らかにされなかった。
【０１１６】
対照的に、本発明の変異体を単離するために使用されるスクリーニング法は、インドール酸化を介したインディゴ形成に関した変異体のランダムライブラリーのスクリーニング、続く、化学対象の生成物に対しての増大した活性及び選択性の検索、の組み合わせを利用する。したがって、インドール酸化スクリーニングからの最も活性な変異体を、ナフタレン、プロピルベンゼン及びオクタンのインビボ酸化を介してさらにスクリーニングした。生成物をガス−液体クロマトグラフィーによって分析した（実施例の項を参照）。ナフタレンは、インドールよりも疎水性であり、Ｐ４５０の触媒作用において標的とされることが多い炭化水素基質とより密接に似ている。プロピルベンゼンは、ナフタレンよりも小さいが、芳香環の酸化、ベンジルの酸化、及び、２つの活性化されていない脂肪族炭素中心での攻撃の間での競合のため、生成物選択性の変化に関する試験をもたらす。オクタンは、柔軟且つ密集度の低い様々な攻撃を可能にし、酸化のために利用可能な４つの異なるセットのＣ−Ｈ結合を有し、末端及び内部の位置に対する選択性に偏らせる変異を招く。増大した生成物形成率及び／又は変化した生成物プロファイルを有する変異体を、インビトロにおける活性研究に対して選択した。
【０１１７】
この多段階式手法中、初期のインディゴ形成（活性）段階において、約ｌ，５００コロニーをスクリーニングし、この数は、１１の第１世代の変異体の遺伝子シャッフリング後に約８００コロニーに減少させた。これら８００のうちの１３０コロニーを、インビボ基質酸化スクリーニング段階へと供した。これら１３０のうち、５つの変異体をインビトロでのさらなる研究のために選択し、これらの全てが、ナフタレンからペンタンまでの広範な有機化合物に対して増大した活性及び／又は変化した生成物選択性を示した。したがって、本発明の変異体を単離するために使用されるスクリーニング法は、増大した活性及び／又は生成物選択性を有する変異体の効率的な、ストリンジェントな選択を可能にする。変異の探索のためにスクリーニングされた小サイズの初期ライブラリーは、ＣＹＰ１０２Ａｌの変異体の探索のために本発明者等によって用いられた方法が、未だそのポテンシャルを使い果たしていないことをも示唆している。
【０１１８】
これまでに開示されている定向進化技法とのさらなる違いは、インディゴ形成を用いるＣＹＰ１０２Ａｌに対するスクリーニングは、ＣＹＰ１０２Ａｌヘムドメインにおける特定の部位での突然変異誘発（例えば、部位飽和）を含んだのに対して、本発明のスクリーニングは、全長ヘムドメイン遺伝子のランダム突然変異誘発を含むことである。したがって、本発明のスクリーニングは、多くの数の変異体を単離する能力を有している。さらに、部位飽和突然変異誘発を、さらなる有用な変異体を単離するために、本発明にしたがって単離された特定の変異体に対して適用し得ることは明らかである。
【実施例】
【０１１９】
材料及び方法
分析用グレード又はより高い品質の一般的試薬及び化学基質は、Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、又はそれらの子会社から取得した。ＨＰＬＣ品質の溶媒は、Ｒａｔｈｂｕｒｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＵＫ）並びにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＭｅｒｃｋの子会社から取得した。バッファー成分は、Ａｎａｃｈｅｍ，ＵＫから取得した。ＮＡＤＰＨ（四ナトリウム塩）は、Ａｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＭｅｌｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、Ｍｅｌｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、及び関連するバッファーは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから取得した。Ｔａｑ及びＫＯＤポリメラーゼは、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得した。コンピテント及びスーパーコンピテント大腸菌は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから取得した。部位特異的突然変異誘発法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットに記載されるＰＣＲ方法を用いて行った。変異原性のオリゴヌクレオチド中の変化したコドンに隣接する適当な長さのオリゴヌクレオチドは、製造業者の説明書にしたがって設計した。オリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈから取得した。一般的な分子生物学的手法は、文献に記載される方法にしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。全ての変異体の遺伝子は、オックスフォード大学、生化学科の施設のＡＢＩ ３７７ＸＬ Ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ自動配列決定装置で完全に配列決定された。ＵＶ／可視スペクトルアッセイ及び酵素活性アッセイは、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ５０ 分光光度計で３０℃にて行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ ＵｎｉｔｙＰｌｕｓ ５００ＭＨｚスペクトロメーターで取得した。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）は、ＤＢ−１を融合させたシリカキャピラリーカラム及びキャリアーガスとしてのヘリウムを用いる炎イオン化検出装置（ＦＩＤ）を装備した、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ａｎｄ ８０００ Ｔｏｐ装置で行った。注入装置は２００℃又は２５０℃に維持し、ＦＥＤは２５０℃に維持した。
【０１２０】
突然変異誘発、設計、定向進化及びスクリーニング手法
ＳｐｅＩ制限部位を、以下のオリゴヌクレオチド：
5’GCTCATAATACGCCGCTACTAGTGCTATACGGTTCAAATATG-3’（Ｓｐｅｌ制限配列に下線を付した）及びその逆相補配列を用いて、ＣＹＰ１０２Ａｌ遺伝子のｐＧＬＷｌ１ヘムドメインコード領域（１３）の下流に導入し、それにより、残基４８２及び４８３においてサイレント変異を生じた。
【０１２１】
変異性ＰＣＲを、以下の正方向及び逆方向プライマーを用いて、この部位とヘムドメインコード領域の上流のＥｃｏＲＩ部位との間で行った：
5’TCTCGAGAATTCATAATCATCGGAGACGCC-3’（ＥｃｏＲＩ制限配列に下線を付した）；及び、5’-TGGATCCACTAGTAGCGGCGTATTATGAGC-3’（ＳｐｅＩ制限配列に下線を付した）。
【０１２２】
使用したＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＧｅｎｅＭｏｒｐｈプロトコールにしたがい、１，０００ｂｐあたり１〜３個の変異を導入するように設計された条件の下、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ（ＷＴ）及び変異体Ｆ８７Ａテンプレートからライブラリーを構築した。１サイクルあたり、鎖分離を９４℃にて６０秒間、アニーリングを４５℃にて９０秒間、伸長を６８℃にて１１０秒間＋２秒間を３０サイクル行うことにより、遺伝子を増幅させた。ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて小断片をｐＧＬＷｌ１に再び導入して（ＳｐｅＩ ＷＴ変異体）、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞中に形質転換し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレート上で３６時間培養した。
【０１２３】
約１５００のコロニーをスクリーニングした。インディゴ形成を示したもの（Ｇｉｌｌａｍ，Ε．Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２６５，４６９−４７２；Ｌｉ，Ｑ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．６，１５３１−１５３６）を単離し、新しいプレートに移して、配列決定前に疑陽性を最小限にするためにさらに３６時間培養した。次に、対象となり得る１６の新しい変異を表す１１の変異体を、ランダムプライム組み換えによってシャッフルした（Ｓｈａｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，６８１−６８３）。
【０１２４】
ＶｏｌｋｏｖとＡｒｎｏｌｄ（Ｖｏｌｋｏｖ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３２８，４４７−４５６）に示されるプロトコールを、段階９にて改変した。この時、Ｐｆｕポリメラーゼではなく、Ｔａｑ及びＫＯＤポリメラーゼを、２μＬのＭｇＳＯ４と一緒に使用した。ＰＣＲは、ＫＯＤポリメラーゼを用いたが、上記のようにして、アセンブリ鎖で行った。サンプルは、上記の通り、切断して、連結し、プレートに播いた。
【０１２５】
約８００のコロニーのうち、約１３０はインディゴ形成を示した。これらを、５〜１０ｍＬの規模で培養し、ガスクロマトグラフィーを用いて、ナフタレン及びプロピルベンゼンに対するインビボ酸化活性をスクリーニングした。ＷＴと比較して、生成物ピーク面積の最大の増加又は変化した生成物プロファイルを示した１２の変異体について配列決定し、より大規模で培養し、同じ２つの基質に対してスクリーニングした。これらのうち、５つをインビトロ研究のために選択した。
【０１２６】
我々はまた、様々な単一部位変異体と、ランダム突然変異誘発スクリーニング法による５つの変異体とそれらの組み合わせとを調製し、インディゴ形成について、及び、ガスクロマトグラフィーを用いて、ナフタレン、プロピルベンゼン及びオクタンに対する酸化活性について、これらをインビボで調べた。単一部位変異は、Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ、Ｅ２６７Ｖ、Ｉ２６３Ａ、Ａ７４Ｇ、Ｌ１８８Ｑ、Ｍ１７７Ｖ／Ｋ、Ａ３９９Ｐ、Ｉ４０１Ｐ、Ｇ４０２Ｐ、Ｑ４０３Ｐ、Ｖ３０２Ｉ、Ａ２６４Ｇ、Ａ９９Ｔ、Ｓ２７０Ｉ、Ｒ１７９Ｈ、及びＦ８７Ｌ／Ａ／Ｇであった。これらのうちの大部分は、これまでに公知の変異（Ｒ４７、Ｙ５１、Ｉ２６３、Ａ７４、Ｌ１８８、Ｍ１７７、Ａ２６４、Ｆ８７におけるもの）、又は、ランダム突然変異誘発／スクリーニング手法の初期の実施回において我々が見出した変異（Ｅ２６７、Ｖ３０２、Ａ９９、Ｓ２７０、Ｒ１７９におけるもの）である（その変異は、基質の結合に何らかの影響を及ぼし得る構造の位置を基準として、別の実施回に選択した）。Ａ３９９、Ｉ４０１、Ｇ４０２及びＱ４０３におけるプロリン変異は、上記のスクリーニング方法によって選択された５つの変異体のうちの１つであるＡ３３０Ｐ変異体の結晶構造（図２）で観察される構造変化に基づいて選択された。次に、これらの変異体を、増大した活性の証拠のために、インビボスクリーニング方法によってスクリーニングした。
【０１２７】
Ｒ４７Ｌ及びＹ５１Ｆ変異は、それら自体で又はその他の変異と組み合わせて、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ対と同程度の効果は有しなかった。その他の単一部位変異は、インディゴ形成スクリーニングにおいて、異なる効果を示したが、Ｉ４０１Ｐ及びＱ４０３Ｐ単一部位変異体は、インビボ酸化スクリーニングにおいて、野生型と比較して、増大した生成物形成率をし、これらの変異体を調製して、インビトロでそれらの活性について試験した。変異Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ（ＲＬＹＦ）及びＦ８７Ａを、記載されるようにして調製した（１３）。標準的クローニング手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で、ＮｃｏＩ及びＡｆｌＩＩ制限部位を用いて、ＲＬＹＦ対を、変異体ＫＴ２及びＡ３３０Ｐ中に導入した。部位特異的突然変異誘発法によって、Ｆ８７Ａ変異を、ＫＴ２、Ｉ４０１Ｐ、ＲＹＬＦ／Ｉ４０１Ｐ、及びＲＹＬＦ／Ｑ４０３Ｐ変異体に導入した。部位特異的突然変異誘発法によって、Ｉ４０１Ｐ及びＱ４０３Ｐ変異を、ＲＬＹＦ及びＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐ変異体に導入した。
【０１２８】
タンパク質の発現及び精製
対象の変異体を、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を用いて、ｐＥＴ２８ベクター中に移し、その結果、ｐＧＬＷｌ１ベクター中のｔａｃプロモーターと比較して、発現レベルが、Ｔ７プロモーターによって、より厳密に調節され得る。このプラスミドを担持する大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）の３０ｍｌ．Ｌ−１の一晩培養物を、０．４％（ｖ／ｖ）グリセロール及び３０ｍｇ．Ｌ−１のカナマイシンを含むＬＢ培地中に接種し、１８０ｒｐｍで振盪させながら、ＯＤ６００が１より大きくなるまで３７℃にて培養した。タンパク質の発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＰＴＧ）を０．４ｍＭになるまで添加することによって誘導した。温度は３０℃まで下げて、さらに３０℃にて１２時間培養した後、細胞を遠心分離によって回収した。各１Ｌの培養物からの赤褐色のペレットを、ジチオスレイトール中でｐＨ７．４、１ｍＭに緩衝化させた２５ｍＬ ４０ｍＭのリン酸カリウム（リン酸バッファー）中で再び懸濁させた。細胞を超音波処理によって溶解し、細胞残屑を、３７，５００ｇ、３０分間、４℃での遠心分離によって除去した。上清を、リン酸バッファーを用いて予め平衡化したＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＤＥＡＥ高速流セファロースカラム（２００ｘ５０ｍｍ）に充填し、そこからタンパク質を、リン酸バッファー中硫酸アンモニウムの８０−４００ｍＭの直線勾配を用いて溶出させた。赤色のＰ４５０画分を回収して、限外濾過により濃縮し、リン酸バッファーを用いて予め平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを用いて脱塩してから、限外濾過によって再び濃縮した。この溶液を、９，２５０ｇ、５分間、４℃にて遠心分離し、濾過滅菌した。ＦＰＬＣ陰イオン交換精製を、１５ｘリン酸バッファーの０−３０％の直線勾配を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｏｕｒｃｅ−Ｑカラム（１２０ｘ２６ｍｍ）上で行った。Ａ４１８／Ａ２８０＞０．３５である画分を回収して、限外濾過によって濃縮し、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中で−２０℃にて保存する前に、濾過滅菌した。グリセロール及び塩を、５０ｍＭ、ｐＨ７．４のＴｒｉｓバッファーで予め平衡化したＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ５ｍｌ ＰＤ−１０カラムを用いて、実験直前にタンパク質から除去した。
【０１２９】
ＮＡＤＰＨ代謝回転率の測定
ＮＡＤＰＨ代謝回転（ブタン及びプロパンを除く）を、３０℃にて酸化され、ＤＭＳＯ中、１００ｍＭのストックとして添加される０．１又は０．２５μＭの酵素、１２５μｇのウシ肝臓カタラーゼ及び１ｍＭの基質を含む、１２５０μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で行った。タンパク質濃度は、（１３）に記載されるようにして、又は、ＣＯ−示差スペクトルを介して測定した（Ｏｍｕｒａ，Ｔ ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ｒ（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，２３７９−８５）。最終濃度約１６０μＭ又は約３２０μＭ（１又は２ＡＵと等量）となるように、２０ｍｇ．ｍｌ−１ストックとしてＮＡＤＰＨを添加する前に、アッセイを３０℃にて１分間行った。ブタン及びプロパンについての代謝回転の場合、基質を、最低３０分間、氷上で、３０００μＬのＴｒｉｓ中にバブリングさせながら、氷上で、１０００μＬのＴｒｉｓ中に酸素をバブリングさせた。ＣＹＰ１０２Ａｌ（０．２５μＭ）及びカタラーゼ（上記と同じ濃度）を、酸化画分、続いて、基質を飽和させたＴｒｉｓに、ゆっくりと添加した。一杯になったキュベットを迅速に密閉し、数回逆さまにして、１ＡＵのＮＡＤＰＨの添加前に、３０℃にて２分間維持した。
【０１３０】
全ての代謝回転において、３４０ｎｍでの吸光度の減少をモニタリングし、ＮＡＤＰＨ消費率を、ε３４０＝６．２２ｍＭ−１．ｃｍ−１を用いて導いた。正確な結合率の測定を確実に行うために、最大２．５μＭの酵素濃度を使用して、ＷＴ及びＦ８７Ａの代謝回転を、必要な場合には完了するまで、より遅くさせた。少なくとも３つの実験から得られたデータを平均して、±５％以内（芳香族）又は±１０％以内（アルカン並びに２００ｍｉｎ−１以下のＮＡＤＰＨとの全ての代謝回転率）とした。
【０１３１】
生成物分析
ラウリン酸以外の基質に関しては、３μＬの内部標準（ＤＭＳＯ中、１００ｍＭ）を、 ４００μＬの酢酸エチル又はクロロホルム中への抽出前に、１０００μＬの各代謝回転完了物に添加した。遠心分離を、１５００μＬの微小遠心管中で、２１，０００ｇ、３分半行った。真正相当物について観察されるＧＣ溶出時間と照合することにより、生成物を同定した。異性体による一酸化生成物は比較可能な反応を生じ得るという仮定に基づき、ＦＩＤ反応を、以下の表で詳述される各生成物群に対する代表的相当物を用いて較正した。一定範囲の既知濃度の選択された生成物を含有し、ＤＭＳＯ中、１ｍＭであるサンプルを、Ｔｒｉｓ中で調製し、上記のようにして抽出した。導かれた積分ピーク面積は、内部標準のピーク面積の割合として表され、生成物濃度に対してプロットされた。２−メチル−２−フェニル−プロパン−ｌ−オール（これは、商業的に供給され得なかった）を、インビボで生成し、単離して、ＭＳによって同定した：Ｍ１４９．００；及び、１Ｈ ＮＭＲ：ｄ１．３８（６Ｈ，ｓ，ｇｅｍ ジメチル），３．５９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２），７．２４（１Ｈ，ｍ，ｐ−フェニル），７．３４（２Ｈ，ｍ，ｍ−フェニル），７．３７（２Ｈ，ｍ，ｏ−フェニル）。ＣＹＰ１０２Ａｌ及びその変異体によるラウリン酸の酸化に関しては、９９０μＬのインキュベーション混合物を、１０μＬの内部標準溶液（エタノール中、２５ｍＭのデカン酸）及び２μＬの濃ＨＣｌと一緒に混合した。得られた混合物は、４００μＬの酢酸エチルを用いて３回抽出し、有機抽出物を合わせて、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。
【０１３２】
溶媒を窒素流の下で蒸発させ、サンプルを２００μＬのアセトニトリル中に溶解させた。過剰な（２５μＬの）Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド及びトリメチルクロロシラン（ＢＳＴＦＡ＋ＴＭＣＳ，９９：１）を添加し、この混合物を少なくとも１２０分間放置することにより、形成される場合には、カルボン酸グループのトリメチルシリルエステルと、アルコールのトリメチルシリルエーテルとを生成した。反応混合物は、ＧＣ分析のために直接使用した。
【０１３３】
【表１】
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
結果
強化された活性及び変化したインビボでの生成物選択性の両方に関してスクリーニングされたランダム突然変異誘発によって作製された変異体において、５つの特定の変異体がインビトロの試験のために選択された。これらは、以下であった：
（ｉ） Ａ３３０Ｐ
（ｉｉ） Ａ１９１Ｔ／Ｎ２３９Ｈ／Ｉ２５９Ｖ／Ａ２７６Ｔ／Ｌ３５３Ｉ （変異体ＫＴ２）
（ｉｉｉ） Ｆ８７Ａ／Ｈ１７１Ｌ／Ｑ３０７Ｈ／Ｎ３１９Ｙ （変異体 ＫＳＫ１９）
（ｉｖ） Ｆ８７Ａ／Ａ３３０Ｐ／Ｅ３７７Ａ／Ｄ４２５Ｎ （変異体 ＫＴ５）
（ｖ） Ｆ８７Ａ／Ａ１１７Ｖ／Ｅ１３１Ｄ／Ｌ２１５Ｉ （変異体 ＬＯ２５）
【０１３６】
全ての５つの変異体は容易に発現され、標準的な手法によって精製された（１３）。５０％ ｖ／ｖのグリセロール中、−２０℃での保存において、少なくとも１５ヶ月の間、不活性な“Ｐ４２０”が生成した証拠は何ら示されなかった。変異体ＬＯ２５は、その他の４つの変異体と比べてあまり研究されていないが、これら５つの初期変異体において最も高い活性およびダマスコン／イオノンクラスの分子に関する選択性を有しており、例えば、８６％のヒドロキシダマスコン生成物を形成する。Ａ３３ＯＰ、ＫＴ２、ＫＳＫ１９、およびＫＴ５の活性を、広範な基質を用いてアッセイした。これらのうちのいくつかに関するデータを、表１〜２０中に示す。そこにおいて、ＮＡＤＰＨの酸化および生成物の形成速度（ＰＦＲ）がｎｍｏｌ（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１ｍｉｎ−１の単位で示され、以下、文中ではｍｉｎ−１と略される。結合効率は、消費されたＮＡＤＰＨに基づく生成物の収率であり、パーセンテージで示され、る。いくつかの場合においては、ＮＯ２００２０３８０中に開示されたＡ７４Ｇ／Ｆ８７Ｖ／Ｌ１８８Ｑ（ＧＶＱ）変異体と、触媒パラメーターを比較している。
【０１３７】
本発明の４つの変異体（Ａ３３０Ｐ、ＫＴ２、ＫＴ５、ＫＳＫ１９）は、ナフタレン（３．１ｍｉｎ−１）によるＷＴのＰＦＲを少なくとも大幅に増大させ、Ａ３３０Ｐは最も効果的であり、１５５ｍｉｎ−１であったが、ＧＶＱ変異体（表１）により記録される４８７ｍｉｎ−１とはいずれも合致しなかった。全ての場合において、１−ナフトールが、唯一のＧＣで検出可能な生成物であった（２３）。
【０１３８】
ＷＴは、６０６ｍｉｎ−１において、プロピルベンゼンに対して顕著に活性であり７０％の結合であった。本発明における４つの変異体のうちの３つは、ＧＶＱ変異体（９４３ｍｉｎ−１）と同様のＰＦＲを有し、一方、４つめのＫＴ２は、顕著に大きい２２０５ｍｉｎ−１を有していた（表２）。ＷＴ及びＫＴ２は９９％以上の１−フェニル−１−プロパノール収率を得たが、その他の新たな変異体は、活性化ベンジル位から離れた酸化を導いた。変異体Ａ３３０Ｐは、ＣＹＰ１０２Ａ１の代謝回転において先に報告されている生成物のタイプではない３０％のオルト−フェノールを与え、一方、変異Ｆ８７ＡおよびＡ３３０Ｐの組み合わせを有する変異体ＫＴ５は、８０％の１−フェニル−２−プロパノールを与えた。変異Ｆ８７Ａは、１−フェニル−２−プロパノールの生成を促進することが知られているが、単独で作用する場合には、わずか５４％の収率であった（４６）。
【０１３９】
生成物形成速度をさらに上昇させるために、いくつかの基質（１３，１４，１７）に対するＣＹＰ１０２Ａ１活性を増大させることが示されているＲ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ（ＲＬＹＦ）対を、変異体Ａ３３０ＰおよびＫＴ２へと取り込ませた。得られた２つの非常に活性な第二世代の変異体は、ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐであった。単独部位変異も、ヘム表面ならびに活性部位の周辺の各種の残基へと導入され、これらはまた、第一ラウンドで同定された前記５つの変異体と組み合わされた。これら第二世代の変異体の活性を、インディゴ形成およびインビボ酸化スクリーニング手法によりスクリーニングした。Ｉ４０１ＰおよびＱ４０３Ｐ変異体を、インビボ酸化手法から得られる新たな変異体として見込みがあるものとして同定し、それらを調製した。組み合わせ変異体Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ、Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１ＰおよびＲ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐも調製した。
【０１４０】
ＲＬＹＦ／ＫＴ２は、４９６ｍｉｎ−１でナフタレン代謝回転におけるＧＶＱ変異体のＰＦＲに匹敵し、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、６６６ｍｉｎ−１で、３５％程度上回り、一方、Ｉ４０１Ｐは１１８３ｍｉｎ−１で、依然としてさらに活性であった。Ｑ４０３Ｐは１２１ｍｉｎ−１のＰＦＲおよび２５％の結合を示し、それらは変異体ＫＴ２の値と同様であった。プロピルベンゼンにおけるＲＬＹＦ／ＫＴ２のＰＦＲは２６８８ｍｉｎ−１で、ＫＴ２に対し２２％向上した。この速度は、天然基質（４７）におけるＷＴに関し報告されていた値に接近するもので、一方、Ｉ４０１Ｐは３５７８ｍｉｎ−１で、天然基質に対する値を上回った。生成物のプロファイルは、第一世代の変異体に対してほとんど変化がなかったが、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、いくらかのｐ−プロピルフェノールを与えた（表２）。また、Ｆ８７Ａ指向生成物プロファイルを高い割合で得るために、ＫＴ２を変異Ｆ８７Ａと組み合わせた。変異体Ｆ８７Ａを伴う系列において、変異体Ｆ８７Ａ／ＫＴ２は、プロピルベンゼンを酸化して、ほぼ等量の１−フェニル−１−プロパノールおよび１−フェニル−２−プロパノールとしたが、Ｆ８７Ａに関する２４１ｍｉｎ−１に対し、５６６ｍｉｎ−１のＰＦＲであった。その他のアルキルベンゼンも、ＷＴ ＣＹＰ１０２Ａ１および新たな変異体に対する基質として試験した。トルエンに関し、特にＲＬＹＦ／ＫＴ２、ＲＬＹＦ／Ａ３３０ＰおよびＩ４０１Ｐにおいて、劇的な活性強化が観察された（表３）。Ｑ４０３Ｐ変異体の効果は、変異体ＫＴ２のそれと再び同様であった。生成物形成速度が最も早い変異体より、低い速度で行われる変異体に関してではあるが、大きな選択性のシフトも明白であった。ＷＴ ＣＹＰ１０２Ａ１は、トルエンを主にｏ−クレゾールへと酸化した（９８％）。この環の酸化は予期せぬことであった、なぜなら、ベンジル性のＣ−Ｈ結合は高度に活性であるからである。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のＷＴ ＣＹＰ１０１Ａ１は、ベンジル位を攻撃して９５％を上回るベンジルアルコールを形成した。変異体ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、６０〜１８９ｍｉｎ−１の係数でＰＥＦを増加させ、結合効率は９％から５２％へと上昇、一方で側鎖の酸化は最小限に保たれていた。Ｉ４０１Ｐ変異の付加は、活性において別の増加を与え、ＮＡＤＰＨおよび基質の酸化速度は３７３２ｍｉｎ−１および１８２４ｍｉｎ−１にそれぞれ増加した。とりわけ、４９％という結合効率は、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐのそれ（５２％）およびＡ３３０Ｐ変異体（４５％）のそれから大きく変化せず、Ｉ４０１Ｐ変異の主たる効果がＮＡＤＰＨ代謝回転速度の増大であることを示唆した。その他の示された変異体は共に、代謝回転活性および選択性を増大させ、例えば、変異体Ｆ８７Ａ／ＫＴ２は４８％のベンジルアルコールを与え、一方、変異体ＫＴ５は収率９５％のベンジルアルコールおよびちょうど５％のｏ−クレゾールを与えた（表３）。
【０１４１】
ＮＡＤＰＨの速度および結合は、通常、プロピルベンゼンよりもブチルベンゼンにおいて低く、ＷＴおよび最も速度が速い変異体であるＲＬＹＦ／ＫＴ２に関し、２２９ｍｉｎ−１および１６７０ｍｉｎ−１のＰＦＲが記録されている（表４）。ヒドロキシル化は、ＷＴ−ＲＬＹＦ／ＫＴ２のサブグループ内であってさえ、ベンジルのみに起こるのでは何らなく、〜１０％程度は側鎖の隣の２つの位置で起こる。ほとんどのその他の特異性変化は、プロピルベンゼンについて観察されるものと酷似していた。Ｆ８７Ａ変異体は非ベンジル位置における酸化を増加（ＫＴ５では８０％程度）させ、一方、変異体Ｆ８７Ｌ／ＫＴ２はｏ−ブチルフェノールの十分量（３２％）を形成した。しかしながら、Ａ３３０Ｐは、特にＲＬＹＦとの組み合わせた場合に、ｐ−ブチルフェノールの形成を指向し（２６％）、一方でベンジル位の酸化レベルは１０〜１３％程度に低減された。
【０１４２】
ほとんどの変異体に関し、ｔ−ブチルベンゼンによるＮＡＤＰＨ代謝回転速度は、ブチルベンゼンに対するそれらと調和していたが、結合のレベルは、Ｆ８７Ａ変異体の場合を除き、大幅に減少していた（表５）。ＧＶＱ変異体である、Ｆ８７Ａ／ＫＴ２およびＫＳＫｌ９は、全てＷＴに対し２桁強度でＰＦＲが向上し、最も高い速度は、新たな変異体であるＦ８７Ａ７ＫＴ２において与えられ、ＷＴの２．４ｍｉｎ−１に対し、２３４−１であった。Ｆ８７ＡおよびＦ８７Ｖ変異体は、側鎖における非活性のＣ−Ｈ結合において専ら酸化を行い、従来の方法では合成しにくい２−メチル−２−フェニル−１−プロパノールを得た。ＷＴおよびその他の変異体により形成される生成物の主たるものはフェノール性で、オルト−ヒドロキシル化よりもパラ−ヒドロキシル化を伴うが、Ａ３３０Ｐ変異は芳香性の酸化の傾向を増大させ、生成物をさらにパラ−フェノールへとシフトさせた。
【０１４３】
エチルベンゼン（表６）により、本発明の変異体は、通常、ＷＴ（６０ｍｉｎ−１）を超える強化された活性を示した。最も速度が速い変異体であるＲＬＹＦ／ＫＴ２は、１０９８ｍｉｎ−１のＰＦＲを示した。ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐはまた、高いＰＦＲ（１０６２ｍｉｎ−１）を与え、これは、部分的には、Ａ３３０Ｐ変異体がＷＴよりもエチルベンゼンに良好に結合する（２８％に対し５５〜６２％）ためである。変異体の結合速度は、対照的に、ＷＴのそれよりも低値（２２〜３０％）に留まる。ＷＴは再び、プロピルベンゼンの代謝回転よりもベンジル位に対する低い特異性を示し、１０％のｏ−エチルフェノールを形成する。Ａ３３０Ｐを含有する変異体は、この生成物をより高いパーセンテージ（２１〜２７％）で形成し、一方、ＫＳＫ１９およびＧＶＱ等のＦ８７ＡおよびＦ８７Ｖ変異体は、生成物混合物からそれを無くさせ、１００％の１−フェニルエタノールを得た。ＫＴ５の代謝回転は、少量の２つのその他の生成物：２−フェニルエタノールおよびスチレンを産生した。前者は、活性化されていないエチル置換基のＣ−Ｈ一次結合における酸化から生じる。一方、後者は、ＣＹＰ１０２Ａ１により触媒される単純炭化水素の脱水素に関する発明者らの知識に対しては初めての観察結果である。
【０１４４】
活性化ベンジル性炭素の隣のメチル基における周辺攻撃は、達成されにくい、なぜなら、もしこれらの２つのタイプの結合が同じ距離に存在し、同程度にＰ４５０フェリ中間体へと接近可能であったとすると、より多くの活性化Ｃ−Ｈ結合が、より迅速に攻撃を受けるからである。すなわち、ＫＴ５は、ベンジル性Ｃ−Ｈ結合よりもメチルＣ−Ｈ結合の方を、よりフェリの近くへと配置させる方向で、エチルベンゼンと結合し得る。脱水素反応において、フェリ中間体は、水素原子を取り去ってＦｅＩＶ中間体を形成し、次いで、基質ラジカルは、ＦｅＩＶ部分に由来するヒドロキシラジカルと組み合わさることによって崩壊するかわりに、基質から第二の水素を取り去って、アルケンおよび水を形成する。哺乳類のＰ４５０酵素による３−メチルインドールの脱水素は１９９６年に初めて報告され、以来、これがインドール、カプサイシン、および薬物のヒトＰ４５０酵素による脱水素（４８−５２）へと拡張してきた。ＣＹＰ１０２Ａ１による脱水素を経由した、ニフェジピンの芳香族化が報告されている（５３）。しかしながら、この反応は、２つの非局在化芳香族系の形成によって引き起こされる。
【０１４５】
天然の炭化水素であるｐ−シメン（４−イソプロピルトルエン）は、それが４つのフレーバー化合物の前駆体であるため、興味深い基質である。ＷＴは、８２％のｐ−α，α−トリメチルベンジルアルコールを与え、それはイソプロピル側鎖のメチンＣ−Ｈ結合が酸化されて生じる。少量の２つの可能性がある芳香族ヒドロキシル化生成物である、チモール（３％）およびカルバクロール（７％）、および、わずか２％の４−イソプロピルベンジルアルコールが見出されている。対照的に、変異体Ａ３３０Ｐは１９％のチモール、１７％のカルバクロール、２２％の４−イソプロピルベンジルアルコール、およびわずか３７％の７−α，α−トリメチルベンジルアルコール（表７）を形成した。Ｆ８７Ｌ／ＫＴ２は、７４％の４−イソプロピルベンジルアルコールおよび２１％のカルバクロールを、通常的な主要生成物であるｐ−α，α−トリメチルベンジルアルコールをわずか５％の生成物混合物として伴って与えた。変異体ＫＳＫ１９において活性の促進が観察され、ＷＴの１６８ｍｉｎ−１に対して１４４２ｍｉｎ−１のＰＦＲが得られた。イソプロピル環の置換基における脱水素を介して、ｐ−α−ジメチルスチレンが形成された。さらに、いったん形成されると、この化合物はこの酵素の基質でもあり、少量（総生成物の１〜３％）の相当するスチレンオキシドが観察される。Ｆ８７Ａ−およびＦ８７Ｖ−含有変異体は、フェノールの形成を最小化するか、または完全になくしたが、顕著な量（＞２０％）のｐ−α−ジメチルスチレンを与えた。
【０１４６】
本発明の変異体は、クメン酸化活性の増加を示した。単独部位変異体のＡ３３０ＰおよびＱ４０３Ｐ、およびＫＳＫ１９変異体は、野生型を超える、同様の強化された活性を示し、それは主として、増加ＫＴ５変異体に関するものよりも高いＮＡＤＰＨの代謝回転速度の増加に起因する。ＷＴは、ほとんどはベンジル性酸化生成物を生じたが、ＫＴ５は、脱水素から２７％の１−メチルスチレンを生じ、また、さらなる酸化から、１％のスチレンオキシド生成物を生じた（表８ａ）。結果は、アルキル置換基における２位の一次Ｃ−Ｈ結合を伴う芳香族化合物は、脱水素を引き起こすことを示す。この反応経路は、例えば、エチルアニソールからのビニルアニソールの調製等のポリマーへの前駆体である置換されたスチレンの合成方法の基礎を形成し得る。
【０１４７】
ＫＴ２およびＡ３３０Ｐは、特にＲＬＹＦと組み合わせた場合に、野生型に比べ、短鎖アルカンに対する非常に強化された活性を示した（表９〜１３）。Ｉ４０１Ｐ変異体も、高度に活性であることがわかった。ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、ペンタンに対し同様の生成物形成を示し（それぞれ、１２０６ｍｉｎ−１および１１８３ｍｉｎ−１、結合効率６０％および６７％に基づく）、それらはＷＴのものの７５倍であった。これらの変異体における結合効率の向上は重要であり、なぜなら、それらは、活性部位のトポロジーおよび基質の間のマッチングを大いに向上させることを示すからである。
【０１４８】
これらの変異体における高い活性は、３−メチルペンタン（全て、ＷＴに関する２０ｍｉｎ−１に対して１０００ｍｉｎ−１を上回る、表１０）、２−メチルブタン（ＷＴに関する５１ｍｉｎ−１に対して、ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐの両方で１０００ｍｉｎ−１を上回る、Ｉ４０１Ｐではより低い活性で７２１ｍｉｎ−１、表１１）、およびブタンを通じて維持されていた。Ｉ４０１Ｐ変異は、それ自体で主としてＮＡＤＰＨの代謝回転速度を増加させ、およびＲＬＹＦ対と良好に組み合わされて、３−メチルペンタンの酸化に関するＰＦＲを２９８０ｍｉｎ−１へと上昇させた。一方、三重変異体のＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、プロパンに対し、ＲＬＹＦ／ＫＴ２と比べて顕著に良好な結合を示し、２−プロパノールを５．８ｍｉｎ−１に対し４６ｍｉｎ−１で形成した。Ｉ４０１Ｐ変異の追加は、ＮＡＤＰＨの代謝回転速度を増加させ、結合における中程度の増加を伴い、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐ変異体に関するプロパン酸化について、４３０ｍｉｎ−１のＰＦＲをもたらした。これらの速度は、先に報告されたＣＹＰ１０２Ａ１変異体９−１０Ａ、１−１２Ｇおよび５３−５Ｈ、それに次ぐ世代の１３−１５変異を個々に含むアルカンヒドロキシラーゼ（３０，３１）に関する２３ｍｉｎ−１、１６０ｍｉｎ−１および３７０ｍｉｎ−１に匹敵する。比較として使用したＧＶＱ変異体は、プロパンに関しＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐよりも高いＮＡＤＰＨ代謝回転速度（１８０ｍｉｎ−１に対し４００ｍｉｎ−１）を与えた。我々が気づいている限りで、この基質によるその向上は報告されていない。しかしながら、結合は、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐの２１％に対し、わずか０．７％であった。このことは、研究された基質の範囲にわたり、どのようにＡ３３０ＰおよびＫＴ２がＧＶＱと比較されかに関する、大きな特徴的な例である。これら２つの変異体におけるＮＡＤＰＨの速度はしばしば、より低いことが多く、全体的な生成物の形成は、一般的に、より効率的な結合を行うために、より高い。この特性が主として代謝回転速度を増加させるＩ４０１Ｐ変異と組み合わされた場合、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐ等の得られた変異体は、一定範囲の非天然基質に関し、野生型を超える通常では考えられない活性の増加を達成することができる。
【０１４９】
アルカンの鎖長が長くなるほど、ほとんどの変異体について基質はより乏しくなり、ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、オクタンについて、ＷＴの５３ｍｉｎ−１に対し、それぞれ２４６ｍｉｎ−１および２３０ｍｉｎ−１のＰＦＲを与えた（表１３）。Ｑ４０３Ｐは、野生型を２倍超える中程度活性の増加を示し、１０４ｍｉｎ−１のＰＦＲを与え、一方、Ｉ４０１Ｐはより活性が高く、７０９ｍｉｎ−１であった。ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＩ４０１Ｐは野生型と同様の生成物選択性を示したが、変異体Ａ３３０Ｐは、−および４−オクタノール（３１，５４）を費やした場合の２−オクタノール形成が顕著に増大した（ＷＴに関する１５％に比較して５３％、表１３）。末端位置におけるアルカンの指向性酸化の効果は、直接的なアルカンの酸化を介して末端アルコールを合成するための全体的な研究においてその他の変異を組み合わせる際の資産として有用である。
【０１５０】
本発明の変異体はまた、１，４−ジクロロベンゼン（１，４−ＤＣＢ）により例示されるような塩素化した芳香族化合物の酸化に関する活性の増加を示した。この増加は主としてより高いＮＡＤＰＨ代謝回転活性に起因し、一方で、結合はＷＴよりもさほど高まらない。最も高い結合はＡ３３０Ｐ変異体における１５％であった（表１４）。ガスクロマトグラフィーにおいては、１つの生成物のみが検出されたが、用いた条件下ではこれが２，４−または２，５−ジクロロフェノールのいずれであるかは決定できなかった。塩素化されたベンゼン および芳香性酸化に関する本発明の変異体の効率が結果として示された。
【０１５１】
我々は、ＷＴのＣＹＰ１０２Ａ１およびＦ８７Ａ等の変異体によるセスキテルペンのバレンセンの酸化を先に報告している（１４）。その酵素は、ヌートカトール、ヌートカトンおよびエポキシ化生成物を含む多数の生成物を形成した。Ｆ８７Ａ変異は、生成物選択性をわずかにヌートカトンへとシフトさせることが示された（約２０％）。比較として、変異体ＫＳＫｌ１９は、バレンセンの酸化速度をＷＴに対し３０倍に高めた（表１５）。より重大には、それはグレープフルーツフレーバーであるヌートカトンの産生を変異体Ｆ８７Ａに対し２倍にした。変異体Ｆ８７Ａ／ＫＴ２およびＫＴ５は、ヌートカトンの産生を〜３０％増加させ、Ｆ８７Ａそれ自体を超えてＰＦＲを増大させた。
【０１５２】
ＷＯ００３１２７３は、ＣＹＰ１０２Ａ１によるモノテルペンの酸化を開示した。この新たな変異体は、ＷＴおよび先に報告された変異体よりも高い活性を示した。この新たな変異体の触媒活性を、Ｒ−およびＳ−リモネンの酸化に関し、ＷＴのそれらと比較した（表１６；１６ａ）。形成される２つのエナンチオマーは、両酵素により異なる生成物を生成したが、代謝回転活性および結合は非常に近いことは特筆すべきであり、ＣＹＰ１０２Ａ１基質ポケットの非対称構造が立証された。リモネンの酸化活性は全ての変異体で増加しており、Ｑ４０３Ｐ、Ｉ４０１ＰおよびＲ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ三重変異体は、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１による脂肪酸天然基質（ラウリル酸）の酸化に関し、同程度または、より高い活性を示した（１４３９ｍｉｎ−１、表２０参照）。再度、これらの変異体は、野生型と同様の生成物選択性を示し、主としてカルベオールを形成し、一方、Ａ３３０Ｐ−およびＦ８７Ａ−含有変異は、主たる生成物であるイソピペリテノールに関する選択性の変化を有していた。ＫＴ２およびＩ４０１Ｐの両方が一般的な加速因子変異として機能することも明白である。（＋）−α−ピネンについて、ＷＴは活性をほとんど有さなかったが、 Ｆ８７Ａ／ＫＴ２変異体は２０６ｍｉｎ−１のＰＦＲを有し、およびベルベノールに対する生成物選択性が変化した（表１７）。Ｆ８７Ｇ変異を導入することの効果は、興味深い。主たる生成物としてベルベノールを維持した場合に、Ｉ４０１ＰおよびＦ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ変異体はより活性であった。Ｉ４０１ＰとＲ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ対との組み合わせは、ＰＦＲを１１４６ｍｉｎ−１まで上昇させたが、その生成物は５６．５％までｃｉｓ−ｌ，２−オキシドに変化し、Ａ３３０Ｐ変異によって選択性の傾向はさらに強化された。
【０１５３】
フルオレンは、ナフタレンよりも、より立体的に厳しい基質であり、インビボスクリーニング手法において用いた。Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆの組み合わせは、活性をわずかに上昇させ、Ａ３３０Ｐ変異の追加はＮＡＤＰＨの代謝回転速度を５１０ｍｉｎ−１に増加させたが、結合効率は低かった（表１８）。Ｑ４０３ＰおよびＩ４０１Ｐ変異はより顕著な効果を有し、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐの組み合わせは特に活性で、野生型の０．１ｍｉｎ−１に対し５８２ｍｉｎ−１のＰＦＲを示した。イオノンクラスの化合物は、フレーバー化合物の前駆体である。表１９に野生型およびいくつかの新たな変異体のβ−イオノン酸化活性を示し、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ等の組み合わせ変異体における有望な活性の増加が強調される。
【０１５４】
ラウリル酸（ドデカノイル酸）は、ＣＹＰ１０２Ａ１が認識する天然基質で、２７７７ｍｉｎ−１のＮＡＤＰＨの代謝回転速度および１４３９ｍｉｎ−１のＰＦＲを伴う。Ａ３３０Ｐ変異により誘導される構造的な摂動は、事実上ＣＹＰ１０２Ａ１によるラウリル酸の酸化を廃止させ、一方、Ｉ４０１Ｐ変異はＮＡＤＰＨの代謝回転速度を増大させ、結合効率は維持して、天然基質の酸化に関し、野生型より４０％以上、変異体の活性を高めることに導いた。明らかに最初の電子伝達の速度は増加し、このことは、この変異体におけるプロセスに関する、酸化還元電位、ヘムのスピン状態、および再組織化エネルギーの変化を示唆する。Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ変異体は、より高いＮＡＤＰＨの代謝回転速度を示しさえしたが、結合は低下し、これは多分、Ｒ４７およびＹ５１側鎖が炭化水素アンカーのためには適用可能ではなく、結合およびそれによる結合が変化したためであろうと思われる。Ｆ８７Ａ変異はラウリル酸を酸化してサブターミナルな炭素へと変化させることが知られており、Ｉ４０１Ｐ変異は、Ｆ８７Ａ変異の選択性変更効果を維持しながら、活性を増加させた。
【０１５５】
これらの知見は、先行技術の顕著な集合にもかかわらず、ＣＹＰ１０２Ａ１系が依然として、定向進化および部位特異的突然変異誘発法の応用に関して、向上した活性および生成物選択性を有する変異体が特徴付けられ得る余地（ｆｅｒｔｉｌｅ ｇｒｏｕｎｄ）を残していることを示す。本発明の全ての変異体は、発明者らの知見が先に開示していない数多くの変異を含む。
【０１５６】
Ａ３３０Ｐ変異は、広範な化合物に対する活性増大という需要の多い効果を有し、一方、それ自体で、ならびに別の選択性変更変異（Ｆ８７Ａ）と組み合わせたときに、生成物プロファイルを変化させる。一方、Ｉ４０１Ｐは、選択性における影響はほとんどない一般的な速度加速因子として機能する。Ｉ４０１は、ヘムに近接したβバルジ上に存在し、電子伝達に影響を及ぼし得る。Ａ３３０Ｐは、定向進化生成物ではありそうになく、知られているような残基を変化させて協調させて集めたものというよりも、単独点変異に由来する孤立性の置換におけるその有効性に頼っていると思われる。プロリンは、β鎖の末端における基質接触残基である３２９位に存在するプロリンの横に、直接的に導入される。結果として生じるバックボーンの柔軟性減少が結晶構造から予測され（図２）、活性部位ポケットがくびれさせられて基質結合がよりタイトになり、活性が強化されることが予測される。この説明は、観察される通常的でない、かつ可能性として有用な選択性効果と合致し、ＷＴよりも活性部位ポケットがより広く開いているＦ８７Ａによってもたらされる効果においては、通常逆となる。ＣＹＰ１０２Ａ１において、または、実際にその他の酵素系の設計変更において、隣接するプロリン残基の配列が各所に配置されているかどうかを調べることは興味深いであろう。
【０１５７】
Ａ３３０Ｐ変異体の結晶構造が得られ、これを図２に示す。この変異体のＣａｌｐｈａの位置は野生型のそれと広く重ね合わせることができたが、位置３２８、３２９および３３０における顕著な再配置が存在した。図２に示すように、導入されたＡ３３０Ｐ変異は、基質結合ポケットに対するＰｒｏ３２９の環における劇的なシフトを誘導し、活性部位の体積を減らし、かつ、重要な領域における基質アクセスチャンネルを制限した。これらの構造変化が、Ｐｒｏ３２９環が基質ポケットの方向へと突出することに起因する、非天然基質の結合増大や、生成物選択性の変化等の、Ａ３３０Ｐ変異で観察される通常的でない効果のほとんどをもたらすと考えられる。しかしながら、それらはヘリックス等の二次構造要素の終結停止をもたらすことはない。
【０１５８】
これらの予期せぬ知見に基づいて、プロリン等のかさの大きい残基を取り込むことを介したループ領域の再編成に関する可能性をさらに調べた。具体的には、近位のヘムリガンドのＣｙｓ４００を提供するＡｌａ３９９−Ｇｌｎ４０３ループ中でプロリン置換を実行した。Ａｒｇ３９８は静電的相互作用および水素結合相互作用に関与し、タンパク質の折り畳みを安定化するのに重要であると考えられ、一方、Ｇｌｎ４０３を越えたところにある残基は、多分、何らかの影響を及ぼすには、ヘムからあまりに離れていると考えられる。探索された変異は、したがって、Ａ３９９Ｐ、Ｉ４０１Ｐ、Ｇ４０２ＰおよびＱ４０３Ｐであった。実施例の項に示すように、Ｉ４０１ＰおよびＱ４０３Ｐの両方は、酵素活性に対し顕著な強化をもたらした。
【０１５９】
例えばＦｅ−Ｓの距離を変化させてＦｅ−Ｓ結合相互作用の強度を変化させるように、残基４０１および４０３をプロリンへと変異させることは、近位のループにおける構造的変化を誘導し得る。このことは、ヘム鉄がより容易に還元されるように導き得、電子伝達への再組織化エネルギーを低め、触媒サイクル中で、ヘム鉄が容易にポルフィリン環における平面へと移動できるようになる。
【０１６０】
プロリン等のかさの大きい残基を取り込むことを介したＣＹＰ１０２Ａ１におけるループ領域の再編成は、顕著であり特異的な構造メカニズムであり、本発明のＡ３３０Ｐ、Ｉ４０１ＰおよびＱ４０３Ｐ置換変異体に対し共通である。
【０１６１】
その中にＡ３３０ＰおよびＦ８７Ａが共に生じている変異体ＫＴ５は、Ａ３３０ＰよりもＦ８７Ａにおける選択性変化特徴を促す。しかしながら、関与されるその変化は、その他のＦ８７Ａ含有変異体によりもたらされるものよりも顕著であり得（例えば、トルエンから、Ｆ８７Ａ／ＫＴ２での４８％、Ｆ８７Ａでの２３％、および、ＷＴでの２％に対し、９５％のベンジルアルコールを生じる）、かつ、しばしば生成物形成速度は増大し、一定範囲の補完的可能性を創出する。そのことは、Ａ３３０Ｐを、Ａ２６４Ｇ、Ａ８２ＬおよびＡ３２８Ｖ等のその他の公知の選択性指向変異とどのように組み合わせるかを考えるために興味深い。
【０１６２】
変異体ＫＴ２（Ａ１９１Ｔ／Ｎ２３９Ｈ／Ｉ２５９Ｖ／Ａ２７６Ｔ／Ｌ３５３Ｉ）およびＦ８７Ａ／ＫＴ２は、ＷＴおよび変異体Ｆ８７Ａのそれとそれぞれ似通った生成物プロファイルを与えた。同様に、Ｉ４０１Ｐは野生型の場合と同一の生成物を生じる一定範囲の基質に関する速度を加速させた。したがって、ＫＴ２およびＩ４０１Ｐは、加速因子として機能する。ＫＴ２における部分変異Ｎ２３９Ｈおよび１２５９Ｖは先に報告されている（５５）。しかしながら、変異体ＫＳＫ１９は、初期のＦ８７Ａを含み、Ｆ８７Ａ／ＫＴ２と同様の選択性パターンを有し、わずか３個のその他の変異を含んでいるにもかかわらず、一定範囲の基質にわたり、やや高まった活性を有する。このことは、Ｆ８７Ａを含まないＫＳＫ１９の誘導体は、それが調製されたときに、加速因子としてＫＴ２よりも可能性があると示され得ることを示唆する。
【０１６３】
ＫＴ２およびＫＳＫ１９において速度を加速させる因子として作用すると思われる変異（Ｈ１７１Ｌ、Ａ１９１Ｔ、Ｎ２３９Ｈ、Ｉ２５９Ｖ、Ａ２７６Ｔ、Ｑ３０７Ｈ、Ｎ３１９ＹおよびＬ３５３Ｉ）のうち、Ｇｌｎ３０７およびＡｓｎ３１９（図１）は、レダクターゼドメインに対するドッキング部位であり、そこからヘムドメインが電子を受け取ると考えられる領域に対し接近して存在し（５６）、電子伝達動力学に影響を与え得ると考えられる。Ｌｅｕ３５３は基質アクセルチャネル残基であるＭｅｔ３５４，のとなりに位置し、一方、アクセルチャネルの外縁上に配置されるＡｌａ１９１はパルミチンが結合した場合に顕著に動かされ（５７）、かつ、基質の誘致および／または捕捉に役割を果たし得る。残る４つの変異（Ｈｉｓ１７１、Ａｓｎ２３９、Ｉｌｅ２５９、Ａｌａ２７６）は、タンパク質表面上に、または接近して存在し、それらが機能する詳細なメカニズムは依然として解明されていない。少なくとも、変異のうちのいくつかは、ＣＹＰ１０２Ａ１の構造におけるそれらの状況に関して合理性を有し得ると推測される。Ｐ４５０酵素の代謝回転活性は、触媒サイクルを開始する最初の電子伝達ステップにより速度制限されている。電子伝達反応の速度は一般にマーカス理論で議論され、この理論は、電子伝達に対する活性化エネルギーは熱力学的駆動力（反応の自由エネルギー変化）および再組織化エネルギー（反応物の状態を変化させて生成物の状態へと近づけるために必要とされるエネルギー入力）に依存するということを述べている。基質の結合は、ヘムの電子的特性を変化させることにより、主要な役割を担い、ほとんどの場合、ヘム鉄に対する６番目のリガンドが外れ、従って、反応熱力学がより好都合になり（より高い駆動力）、電子伝達に関する再組織化エネルギー障壁がより低くなる（より少ない反応物の状態を変形させる必要がより少なくなる）（５８）。例えば、活性部位の置換などにより、活性部位の構造が変化すれば、非天然基質の結合は促進され、より迅速な基質の酸化が見られるようになる。
【０１６４】
基質結合（および、すなわちヘムの電子特性）を変化させるための別のメカニズムは、基質ポケット周辺の二次構造要素における変化の導入であり得る。Ｐ４５０酵素において、基質ポケットは、通常、ＢおよびＢ’ヘリックス、ＢＣループ、Ｆ／Ｇループ、ＧヘリックスおよびＩヘリックスに由来する残基によって規定される。これらの二次構造要素の位置に変異を導入することによって、基質ポケットから遠く離れた残基におけるアミノ酸の置換が、基質結合を変化させ得る。Ｈｉｓ１７１はＦヘリックスの始まりに位置し、Ｌ２１５においてＧヘリックスと接触する。Ｎ２３９はＨヘリックス中に存在し、このヘリックスはＩヘリックスのＮ末端終結部に接触する。Ｈ１７１およびＮ２３９における置換は、ＧおよびＩヘリックスの配置にそれぞれ影響を及ぼすであろうもので、基質結合を変化させ得る。Ｉｌｅ２５９およびＡｌａ２７６は共にＩヘリックス中に存在する。これらの残基は基質には接触しないが、アミノ酸の置換が、例えば、活性部位中に配置され、間にあるＩ２６３の構造変化を引き起こすなどの活性部位の構造に影響を及ぼし得、ＣＹＰ１０２Ａ１の活性を変化させることが、発明者等の先の研究により示されている（１３）。
【０１６５】
変異体ＬＯ２５がＬ２１５Ｉ変異を含み、それがＨ１７１／Ｌ２１５の密接な接近においてＦおよびＧへリックスの間の接触に影響を及ぼし得るということは特に興味深い。全体的に見れば、いずれの変異も、活性部位には存在していない一方で、それらの全ては、二次構造要素の間のパッキング／相互作用において何らかの役割を果たす残基において存在している。Ａ３３０Ｐにより導入されるタンデムなプロリンの配置は独特であり、全く予期しなかったが高度に有益な効果を示す。
【０１６６】
本発明において開示された変異は、プロセスの開発のために、現存する変異体（例えば、Ｌ１８８Ｑ、Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ変異を含むもの）に導入してもよいが、さらなる進化のための出発点として導入してもよい。
【０１６７】
【表３】
【０１６８】
【表４】
【０１６９】
【表５】
【０１７０】
表Ａ．ＣＹＰｌ０２Ａｌヘムドメイン（アミノ酸残基１〜４７０）と各種の構造的に特徴付けられたチトクロームＰ４５０酵素との間の配列相同性
【０１７１】
【表６】
【０１７２】
＊ＣＹＰ５０５（Ｐ４５０ｆｏｘｙ）は、構造的に特徴付けられておらず、アラインメントは、ヘムドメインのみを使用した。
【０１７３】
表Ｂ．ＣＹＰ１０２Ａｌの全体配列と各種チトクロームＰ４５０酵素との間の配列相同性（アラインメントはＳｗｉｓｓｐｒｏｔタンパク質データバンク中のタンパク質に対して行われた）。同じサブファミリーであるにもかかわらず、ＣＹＰ１０２Ａ２及びＣＹＰ１０２Ａ３は、ＣＹＰｌ０２Ａｌとわずか５９％及び５８％の相同性であることに留意されたい。
【０１７４】
【表７】
【０１７５】
表Ｃ．アミノ酸の物理的特性
【０１７６】
【表８】
【０１７７】
表Ｄ．ハイドロパシースケール
【０１７８】
【表９】
【０１７９】
表１：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のナフタレンとのインビトロ酸化活性、結合効率、選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。唯一検出可能な生成物は、１−ナフトール（ｌ−オール）であった。
【０１８０】
【表１０】
【０１８１】
表２：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のプロピルベンゼンとのインビトロ酸化活性、選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、１−フェニル−１−プロパノール（ｌ−オール）、ｌ−フェニル−２−プロパノール（２−オール）、２−プロピルフェノール（オルト）及び４−プロピルフェノール（パラ）であった。少量の１−フェニル−１−プロパノン（１％以下）及び３−フェニル−ｌ−プロパノール（０．５％未満、ＫＴ５のみ）も形成された。「−」は、検出されなかったことを示す。（＊）パーセンテージは、これらの及びその他の微量生成物のため、１００になるようには合計しなかった。
【０１８２】
【表１１】
【０１８３】
表３：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のトルエンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、ベンジルアルコール（ｌ−オール）、ｏ−クレゾール（オルト）及びｐ−クレゾール（パラ）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１８４】
【表１２】
【０１８５】
表４：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のブチルベンゼンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、１−フェニル−ｌ−ブタノール（ｌ−オール）、ｌ−フェニル−２−ブタノール（２−オール）、４−フェニル−２−ブタノール（３−オール）、２−ブチルフェノール（オルト）及び４−ブチルフェノール（パラ）であった。（＊）は、１−３％の１−フェニル−１−ブタノンを含む。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１８６】
【表１３】
【０１８７】
表５ａ：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のｔ−ブチルベンゼンとのインビトロ酸化活性、選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−ｔ−ブチルフェノール（オルト）、４−ｔ−ブチルフェノール（パラ）及び２−メチル−２−フェニル−プロパン−ｌ−オール（ｌ−オール）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１８８】
【表１４】
【０１８９】
表５ｂ：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のエチルベンゼンとのインビトロ酸化活性／選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、１−フェニルエタノール（ｌ−オール）、２−フェニルエタノール（２−オール）、２−エチルフェノール（オルト）及びスチレンであった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１９０】
【表１５】
【０１９１】
ＮＢ／結果が、検出装置の反応による再較正後に、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ａ／ＫＴ２、ＫＳＫｌ９及びＧＶＱについても得られた。ＮＡＤＰＨ代謝回転率は同一であった。結合効率は、２３（Ｆ８７Ａ）、２１（Ｆ８７Ａ／ＫＴ２）、２５（ＫＳＫ１９）、２６（ＧＶＱ）であった。生成物形成率は、３２（Ｆ８７Ａ）、１２０（Ｆ８７Ａ／ＫＴ２）、１７８（ＫＳＫ１９）、５７２（ＧＶＱ）であった。ｌ−オールは、９９％（Ｆ８７Ａ）、９６％（Ｆ８７Ａ／ＫＴ２）、９５％（ＫＳＫｌ９）、９９％（ＧＶＱ）であった。スチレンは、今回、これらの変異体との反応において、２％（Ｆ８７Ａ）、４％（Ｆ８７Ａ／ＫＴ２）、５％（ＫＳＫ１９）、１％（ＧＶＱ）検出された。
【０１９２】
表６ａ：ＣＹＰｌ０２変異体のｏ−キシレンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−メチルベンジルアルコール（ｌ−オール）、２，３−ジメチルフェノール（２，３−フェノール）、３，４−ジメチルフェノール（３，４−フェノール）、２，３−ジメチル−ｐ−ベンゾキノン（ヒドロキノン）及びピロカテコール（カテコール）であった。（＊）パーセンテージは、微量生成物のため、１００になるようには合計しなかった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１９３】
【表１６】
【０１９４】
表６ｂ：ＣＹＰｌ０２Ａ１変異体のｍ−キシレンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、３−メチルベンジルアルコール（ｌ−オール）、２，４−ジメチルフェノール（２，４−フェノール）及び２，６−ジメチルフェノール（２，６−フェノール）であった。（＊）パーセンテージは、微量生成物のため、１００になるようには合計しなかった。
【０１９５】
【表１７】
【０１９６】
表７：ＣＹＰｌ０２Ａ１変異体のｐ−シメンとのインビトロ酸化活性／選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、ｐ−α−ジメチルスチレン（ｐ−α−ＤＭＳ）、ｐ−α−α−トリメチルベンジルアルコール（ｉ−Ｐｒ−オール）、４−イソプロピルベンジルアルコール（Ｍｅ−オール）、チモール、カルバクロール及び非同定生成物であった。（＊）は、最大３％のｐ−α−ジメチルスチレンオキシドを含む。（＊＊）パーセンテージは、その他の微量生成物のため、１００になるようには合計しなかった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１９７】
【表１８】
【０１９８】
表８：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａ１変異体のクメンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、α−メチルスチレン（スチレン）、α−メチルスチレンオキシド（スチレンオキシド）、２−フェニル−ｌ−プロパノール（ｌ−オール）、２−フェニル−２−プロパノール（２−オール）、２−イソプロピルフェノール（オルト）及び４−イソプロピルフェノール（パラ）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１９９】
【表１９】
【０２００】
表８ａ：ＧＣ分析後における、いくつかのＣＹＰｌ０２Ａ１変異体のクメンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、α−メチルスチレン（スチレン）、α−メチルスチレンオキシド（スチレンオキシド）、２−フェニル−ｌ−プロパノール（ｌ−オール）、２−フェニル−２−プロパノール（２−オール）、２−イソプロピルフェノール（オルト）及び４−イソプロピルフェノール（パラ）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０２０１】
【表２０】
【０２０２】
表９：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のペンタンとのインビトロ酸化活性、選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−ペンタノール（２−オール）、３−ペンタノール（３−オール）、２−ペンタノン（２−オン）及び３−ペンタノン（３−オン）であった。
【０２０３】
【表２１】
【０２０４】
表１０：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の３−メチルペンタンとのインビトロ酸化活性／選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、３−メチル−２−ペンタノール（２−オール）−２つのジアステレオマーは、（Ａ）及び（Ｂ）と指名された、及び３−メチル−３−ペンタノール（３−オール）であった。
【０２０５】
【表２２】
【０２０６】
表１１：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の２−メチルブタンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−メチル−ｌ−ブタノール（ｌ−オール）、２−メチル−２−ブタノール（２−オール）、３−メチル−２−ブタノール（３−オール）、３−メチル−１−ブタノール（４−オール）及び３−メチル−２−ブタノン（３−オン）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０２０７】
【表２３】
【０２０８】
表１２：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のブタン及びプロパンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、ブタンに対しては、１−ブタノール（ｌ−オール）、２−ブタノール（２−オール）及び２−ブタノン（２−オンｏｎｅ）であって、プロパンに対しては、２−プロパノールのみであった。
【０２０９】
【表２４】
【０２１０】
表１３：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のオクタンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−オクタノール（２−オール）、３−オクタノール（３−オール）、４−オクタノール（４−オール）、３−オクタノン（３−オン）及び４−オクタノン（４−オン）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０２１１】
【表２４】
【０２１２】
表１４：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の１，４−ジクロロベンゼンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２，４−ジクロロフェノール及び／又は２，５−ジクロロフェノールであり、これらは、同一のＧＣ溶出時間を有する。ＧＣで検出不可能なセミキノンに対するさらなる酸化は、結合の数値を信用し得ないものとし得る。
【０２１３】
【表２５】
【０２１４】
表１５：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のバレンセンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、シス−及びトランス−ヌートカトール（ヌートカトール）、ヌートカトン、シス−及びトランス−バレンセンエポキシド（Ｖａｌ．ｅｐｏｘ．）並びにシス−及びトランス−ヌートカトンエポキシド（Ｎｏｏｔ．ｅｐｏｘ．）であった。
【０２１５】
【表２６】
【０２１６】
表１６：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のＲ−及びＳ−リモネンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、１，２−リモネンエポキシド（エポキシド）、シス−及びトランス−イソピペリテノール（イソピペリ）、並びに、シス−及びトランス−カルベロール（カルベロール）であった。
【０２１７】
【表２７】
【０２１８】
表１６ａ：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のＲ−リモネンとのインビトロ酸化活性及び選択性。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、シス−１，２−リモネンエポキシド（シス−１，２）、トランス−１，２−リモネンエポキシド（トランス−１，２）、非同定生成物（Ｕ）、シス−イソピペリテノール（シス−３−オール）、トランス−イソピペリテノール（トランス−３−オール）、カルベロール（２つの異性体）（６−オール（Ａ）及び（Ｂ））、カルボン（６−オン）及びペリリルアルコール（１０−オール）であった。
【０２１９】
【表２８】
【０２２０】
表１７：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の（＋）−α−ピネンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２，３−ピネンエポキシド（エポキシド）、シス−及びトランス−ベルベノール（ベルベノール）、ベルベノン、並びに、ミルテノールであった。基質中の不純物質のため、データは、結合効率を誇張して示している。
【０２２１】
【表２９】
【０２２２】
表１７ａ：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の（＋）−α−ピネンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、（−）−２，３−ピネンエポキシド（（−）−２，３）、（＋）−２，３−ピネンエポキシド（（＋）−２，３）、シス−ベルベノール（シス−４−オール）、トランス−ベルベノール（トランス−４−オール）、ベルベノン（４−オン）並びにミルテノール（１０−オール）であった。
【０２２３】
【表３０】
【０２２４】
表１８：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のフルオレンとのインビトロ酸化活性及び選択性。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。全ての割合は、単位ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１で示される。生成物は、９−フルオレノール（９−オール）及び２−フルオレノン（９−オン）であった。
【０２２５】
【表３１】
【０２２６】
表１９：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のβ−イオノンとのインビトロ酸化活性及び選択性。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。割合は、単位ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１で示される。生成物は、４−ヒドロキシ−β−イオノン（４−オール）であった。
【０２２７】
【表３２】
【０２２８】
表２０：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のラウリン（ドデカン）酸とのインビトロ酸化活性及び選択性。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。割合は、単位ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１で示される。生成物は、１１−ヒドロキシドデカン酸（ω−１）、１０−ヒドロキシドデカン酸（ω−２）、９−ヒドロキシドデカン酸（ω−３）、８−ヒドロキシドデカン酸（ω−４）及び７−ヒドロキシドデカン酸（ω−５）であった。
【０２２９】
【表３３】
【０２３０】
【表３４】
【０２３１】
【表３５】
【０２３２】
【表３６】
【０２３３】
【表３７】
【０２３４】
【表３８】
【０２３５】
【表３９】
【０２３６】
【表４０】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強化された特性を有する変異酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、Ｐ４５０ＢＭ−３酵素等の生物学的酵素触媒は、ファインケミカル、中間体、医薬品及び薬物代謝産物の合成から、有機化学混入物質及び汚染物質の分解までにわたる、様々な工業的利用において多くの用途が見出されている。定向進化又は部位特異的突然変異誘発を用いたタンパク質工学を利用することにより、既知の酵素の変異体を単離することができ、これら変異体は、それらの触媒活性に対する新たな機会及び用途を生み出し得る。
【０００３】
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＰ４５０ＢＭ−３（１）は、チトクロームＰ４５０酵素のスーパーファミリーに属する。各種遺伝子配列データベース中に、Ｐ４５０酵素をコードする７，７００を超える遺伝子が存在する。Ｐ４５０酵素の命名は、体系化されている。この酵素のスーパーファミリーは、ＣＹＰと称され、その後に酵素のファミリーに対する数字が続き（すなわち、ＣＹＰｌ、ＣＹＰ５１、ＣＹＰ１０２等の名前がある）、これらはさらにアルファベットによって表されるサブファミリーへと分かれ（すなわち、ＣＹＰｌＡ、ＣＹＰｌ０ｌＢ等の名前がある）、各サブファミリーのメンバーは数字によって表される（すなわち、ＣＹＰｌＡｌ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１０１Ｄ３等）。ＣＹＰ酵素をコードする遺伝子はイタリック体によって表される、例えば、ＣＹＰｌ０ｌＡｌ（イタリック体）遺伝子。Ｐ４５０ＢＭ−３は、ＣＹＰ１０２Ａ１と指定されており、すなわち、それは、ＣＹＰ１０２ファミリーの初めてのメンバーである。以下、ＣＹＰ１０２Ａｌという系統名を、Ｐ４５０ＢＭ−３の代わりに使用する。
【０００４】
ＣＹＰ１０２Ａ１（１）は、触媒として自己充足的であることから、生体内変換に適用するための注目度の高い酵素である。その他のＰ４５０酵素と異なり、この酵素においては、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼと電子伝達共同因子タンパク質とは別の物質であり、ＣＹＰ１０２Ａｌは、単一のポリペプチド中にＦＡＤ及びＦＭＮ補欠分子族の両方を含む、ジフラビン電子伝達還元酵素ドメインと融合したヘムモノオキシゲナーゼドメインを有する。ＣＹＰ１０２Ａ１の天然の基質は、直鎖状又は分枝鎖状の中鎖脂肪酸であると考えられている（１，２）。１９９３年に、ＣＹＰ１０２Ａ１ヘムドメインの結晶構造が入手可能となり（３）、これによって、活性部位構造と、基質アクセスチャンネルの存在とが明らかとなった。結合基質と一緒になった結晶構造が、４年後に発表され、これは、基質結合時におけるＦ８７の側鎖の構造の変化を示していた（４）。
【０００５】
ＣＹＰ１０２Ａ１のタンパク質工学については概説されている（５−７）。初期の研究は、活性部位残基Ｆ８７に焦点が置かれており、Ｆ８７Ｖ、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｙ及びＦ８７Ｇ変異は、活性及び脂肪酸酸化の選択性に対し、様々な影響を及ぼすことが示されている（８−１１）。Ｆ８７における変異は、様々な基質の酸化に対して有益であることが見出されている（７）。基質アクセスチャンネルへの入り口に位置するＦ４２、Ｒ４７、及びＹ５１等の残基も研究対象とされた。４７位の電荷を中和又は逆転させることにより、基質特異性が変化し（８，１２）、疎水性置換Ｙ５１Ａも同様であったが、Ｆ４２Ａ変異は、酵素活性を低下させた（１０）。ＷＯ００３１２７３は、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ変異対の使用が、多環芳香族及びテルペノイド炭化水素等の疎水性有機分子の進入、結合及び酸化を促進することを開示した。この変異対は、Ｆ８７Ａ、Ｉ２６３Ａ、Ａ２６４Ｇ及びＭ３５４Ａ変異とも組み合わされて、増大した活性及び／又は基質酸化における生成物選択性をもたらした（１３，１４）。Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆの組み合わせ、並びに、Ｒ４７Ｌ及びＹ５１Ｆの変異は、単独で、ＣＹＰ１０２Ａ１工学において現在、一般的に使用されている（１５−１９）。
【０００６】
変異部位の合理的選択に加えて、スクリーニング技術を利用して、活性及び選択性に所望の効果を及ぼすその他の変異及び変異部位を同定した。１９９７年には早くも、ランダム又は飽和突然変異誘発が、ＣＹＰ１０２Ａｌに対して適用された（２０）。ＮＯ２００２０３８０は、新規活性を有するＣＹＰ１０２Ａｌ変異体を発見するためのスクリーニング法として、インドール酸化を介したインディゴ形成の使用を開示した。基質結合に影響を与える可能性の高い多数の残基に飽和突然変異誘発が適用され、変異Ａ７４Ｇ／Ｆ８７Ｖ／Ｌ１８８Ｑは、野生型と比較して、増大した活性及び変化した選択性によって、広範な有機分子を酸化することが報告された（２１−２５）。ＡＴ３４２３５１Ｔは、一連のランダム突然変異誘発実験におけるスクリーニング手順として、ω−ｐ−ニトロフェノキシ−カルボン酸の酸化を介した、分光学的に検出されるｐ−ニトロフェノールの形成を開示した。変異Ｖ２６Ｔ、Ｒ４７Ｆ、Ｓ７２Ｇ、Ａ７４Ｇ、Ｆ８７Ａ＆Ｖ、Ｌ１８８Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｓ＆Ｗ、Ｍ３５４Ｔが開示された（２６，２７）。
【０００７】
ｐ−ニトロフェノールスクリーニング法は、代替基質としてｐ−ニトロフェノキシオクタンを使用することにより拡大された。ＷＯ２００２０８３８６８、ＥＰ１４７０２１９及びＵＳ２００５２０２４１９（その後、ＷＯ２００５０１７１１６、ＥＰ１６６０６４６、及びＵＳ２００５０３７４１１と修正）は、変異Ｌ５２Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｆ８７Ａ、Ｈｌ００Ｒ、Ｓ１０６Ｒ、Ｆ１０７Ｌ、Ａ１３５Ｓ、Ｍ１４５Ａ＆Ｖ、Ａｌ８４Ｖ、Ｎ２３９Ｈ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ３２４Ｉ、Ｖ３４０Ｍ、Ｉ３６６Ｖ、Ｋ４３４Ｅ、Ｅ４４２Ｋ、Ｖ４４６Ｉを開示した。
【０００８】
ＷＯ２００３００８５６３及びＵＳ２００３１００７４４は、ランダム突然変異誘発のさらなる実施、遺伝子シャッフリング及び同じ方法を用いたスクリーニングの結果を開示し、変異Ｍ３０Ｉ、Ｅ６４Ａ、Ｖ７８Ａ、Ｆ８７Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｖ＆Ｗ、Ｈ１３８Ｙ、Ｆ１６２Ｓ、Ｈ１７１Ｑ、Ｔ１７５Ｉ、Ｖ１７８Ｉ、Ａ１８４Ｖ、Ｎ１８６Ｄ、Ｄ２１７Ｖ、Ｉ２２０Ｔ、Ｋ２２４Ｉ、Ｓ２２６Ｉ、Ｄ２３２Ｇ、Ｔ２３５Ａ、Ｈ２３６Ｑ、Ｅ２５２Ｇ、Ｒ２５５Ｓ、Ｉ２５８Ｔ、Ｉ２５９Ｖ、Ｔ２６８Ｑ、Ａ２９０Ｖ、Ａ２９５Ｔ、Ｌ３５３Ｖ、Ｄ３７０Ｑ、Ｅ３８０Ｇ、Ｇ３９６Ｍ、Ｔ４１１Ａ、Ｍ４１６Ｌを報告した。
【０００９】
ＷＯ２００５０１７１０５、ＵＳ２００５０５９１２８、及びＥＰ１６３９０９１は、同じ方法の使用を開示し、変異Ｒ４７Ｃ、Ｌ７５Ｉ＆Ｗ、Ｖ７８Ａ、Ｆ＆Ｔ、Ａ８２Ｌ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｓ＆Ｔ、Ｆ８７Ｉ、Ｌ＆Ｖ、Ｔ８８Ｃ、Ｋ９４Ｉ、Ｐ１４２Ｓ、Ｔ１７５Ｉ、Ａ１８４Ｖ、Ｆ２０５Ｃ、Ｓ２２６Ｒ、Ｈ２３６Ｑ、Ｅ２５２Ｇ、Ｒ２５５Ｓ、Ｔ２６０、Ｌ、Ｎ＆Ｓ、Ａ２９０Ｖ、Ａ３２８Ｖ＆Ｍ、Ｌ３５３Ｖを報告した。
【００１０】
その後、ＷＯ２００６１０５０８２が、変異Ｒ４７Ｃ、Ｖ７８Ｆ、Ａ８２Ｓ、Ｋ９４Ｉ、Ｐ１４１Ｓ、Ｔ１７５Ｉ、Ａ１８４Ｖ、Ｆ２０５Ｃ、Ｓ２２６Ｒ、Ｈ２３６Ｑ、Ｅ２５２Ｇ、Ｒ２５５Ｓ、Ａ２９０Ｖ、Ａ２９１Ｖ、Ａ３２８Ｆ、Ｌ３５３Ｖを開示した。
【００１１】
ランダム突然変異誘発によって作製されるこれらの一連の変異は、エタンから中鎖アルカンまでのアルカン類の酸化に対して強化された活性を示す（２８−３０）。特に、部位特異的突然変異誘発法によって活性部位へ導入される変異に定向進化変異が組み合わされた場合に、例えば、この変異によって末端炭素に対する酸化の部位をシフトさせた場合のオクタン酸化（３１）、末端アルケンの選択的エポキシ化（３２）、及びシクロペンタンカルボン酸誘導体の酸化におけるエナンチオ選択性（３３）において、選択性の変化も生じた。定向進化と合理的再設計を組み合わせることにより、より優れた結果を取得し得ることは注目すべきである。
【００１２】
ＣＹＰ１０２Ａ３は、ＣＹＰ１０２Ａ１と同じサブファミリーのＰ４５０酵素である。ＣＹＰ１０２Ａ３のランダム突然変異誘発、続く、アルカン酸化、及び、アルコールに対して特異的なアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でのＮＡＤＨ形成のモニタリングにより、オクタン酸化によって５０％の１−オクタノールを形成する変異体を生じた。このことは、改変されたＣＹＰ１０２ファミリーＰ４５０酵素によって今日まで観察されている、直鎖状アルカンの最大の割合での末端Ｃ−Ｈ結合の酸化である（３４）。
【００１３】
酵素の触媒メカニズムに及ぼす構造変化の影響をさらに理解するため、それら酵素の触媒的代謝回転を向上するため、並びに、基質及び／又は生成物に対するそれら酵素の範囲を拡張するために、産業上有用な酵素、例えば、ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素のさらなる変異体を単離する継続的必要性が存在する。一般的に、ＣＹＰ１０２Ａｌ等のＰ４５０酵素の改変は、酵素活性を増大させるために行われ、生成物選択性及び基質特異性の制御は、重要な二次的な目的である。選択性の制御と強化されたモノオキシゲナーゼ活性とを結び付け得る変異及び変異部位は明らかに欠けており、その結果、化合物に対する酵素的代謝回転が速いが十分に選択的ではないか、ある程度の選択性はあるが反応が遅いか、あるいは、所望の生成物が形成されない。強化された活性及び／又は所望の選択性を有する変異体を提供し得るスクリーニング法も必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明にしたがう、ＣＹＰ１０２Ａｌの特定の位置における置換変異は、モノオキシゲナーゼ活性を増大させるという所望の効果を有し、変化した選択性をも提供することが、現在、分かっている。これらの変異部位は、増大した活性及び増大／変化した選択性の両方の選択を提供する、画期的スクリーニング法の使用によって同定された。
【００１５】
本発明は、増大したモノオキシゲナーゼ活性及び／又は変化した選択性を有し、ＣＹＰ１０２Ａ１の位置１１７、１３１、１９１、２１５、２７６、３０７、３３０、３７７、４０１、４０３、４２５のうちの一つ又はそれ以上に置換を含む、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素を提供する。さらに、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素を用いて有機化合物を酸化させる工程を含む、有機化合物である基質を酸化させる方法が提供される。
【００１６】
主張されている置換は、同じ発明の概念を形成し、何故ならば、それらの置換は、ＣＹＰ１０２Ａｌのモノオキシゲナーゼ活性を増大させ、且つ／又は、選択性を変化させるという効果を共有するからである。位置３３０、４０１及び４０３の置換はまた、以下に概説するように、共通の構造的及び／又は機能的メカニズムを介して、それらの効果を及ぼす。
【００１７】
配列リスト中の配列
配列番号１は、ＣＹＰ１０２Ａｌの配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＣＹＰ１０２Ａｌ（Ｐ４５０ＢＭ−３）において関連する残基の場所を表す。Ｐａｌｍは、酵素の脂肪酸基質を示す。
【００１９】
【図２】図２は、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１とＡ３３０Ｐ変異体の基質アクセスチャンネル及び活性部位における主要残基の比較を表し、Ａ３３０Ｐ変異から生じるＰ３２９及びＡ３２８における構造的な摂動状態をハイライトしている。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＹＰ１０２Ａｌの天然及び人工の相同体、例えば、ＣＹＰ１０２Ａｌに対して少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むもの、に対して適用することができる。かかる相同体は、通常、ＣＹＰ１０２Ａｌのヘムモノオキシゲナーゼドメイン（アミノ酸位置１〜４８０によって表される）に相当する（すなわち、これと相同する又は同一である）アミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明の酵素は、配列番号１（ＣＹＰ１０２Ａ１の配列）と少なくとも４０％の相同性を有する配列を含む（又は、からなる）。好ましい実施形態において、その配列は、相同体の少なくとも２０個、好ましくは、少なくとも３０個、例えば、少なくとも４０、６０、１００、２００、３００、４００個又はそれ以上の連続するアミノ酸、あるいは、全体配列に対して、少なくとも５５％、６５％、８０％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％相同であり得る。一実施形態において、本発明の酵素は、ＣＹＰ１０２Ａｌのアミノ酸残基１〜４８０と比較した場合に、任意の特定の割合の相同性を有する。この連続するアミノ酸は、活性部位を含み得る。あるいは、この相同性は、連続するアミノ酸に対してではなく、活性部位のアミノ酸のみに対して測定してもよい。すなわち、相同体は、通常、アミノ酸の同一性を基準として、ＣＹＰ１０２Ａｌに対して少なくとも４０％相同である。本発明の酵素は、ＣＹＰ１０２Ａｌ配列と一定の割合の同一性を有し得、それは、上記した任意の長さの配列に対する任意の特定の割合の相同性値と同じである（すなわち、それは、少なくとも４０％、５５％、８０％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％の同一性を有し得る）。
【００２２】
相同配列は、ＣＹＰ１０２Ａ１配列の変異部分を表し得、且つ／又は、本発明の酵素の全長融合ポリペプチドの形態で表し得る。
【００２３】
本明細書において記載される任意の相同タンパク質（すなわち、別のタンパク質と相同であると記載されるもの）は、通常、関連するタンパク質と少なくとも４０％相同である。相同性は既知の方法を用いて測定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用し得る（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ ＭｏＩ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０に記載されるようにして、（通常は、それらのデフォルト設定において）相同性を計算するため又は配列を整列させるために使用することができる。
【００２４】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、ある正値閾値Ｔと適合する又は満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近傍（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ）ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（上掲））。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するための出発点（ｓｅｅｄｓ）として機能する。ヒットしたワードは、累積アラインメントスコアを増加可能な範囲まで、各配列に沿って両方向に延長される。ヒットしたワードの各方向における延長は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ低下した場合；一つ又はそれ以上の負に評価された残基アラインメントの蓄積により、累積スコアが０若しくはそれより下った場合；又は、いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。
【００２５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二つの配列間における類似性の統計的解析を行う。例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供された類似性の尺度の一つは最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは二つのヌクレオチド配列間の適合又は二つのアミノ酸配列間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、第一配列の第二配列に対する比較において最小合計確率が約１より少なく、好ましくは約０．１より少なく、より好ましくは約０．０１より少なく、最も好ましくは約０．００１より少ない場合に、ある配列が別の配列に類似していると考えられる。
【００２６】
通常、相同タンパク質は、関連するタンパク質と、上記したタンパク質の全て又は任意の長さの連続するアミノ酸と比較した場合に、少なくとも２、５、１０、２０、４０、５０又は６０個又はそれ未満の変異（それぞれの変異は置換、挿入又は欠失であり得る）で異なる。
【００２７】
本発明のＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の酵素活性は、通常、本明細書において記載される基質又は条件のいずれかを用いて、インビトロで測定され、ＮＡＤＰＨ酸化率、生成物形成率及び結合効率として与えられる。この比率は代謝回転頻度であり、（ｎｍｏｌ ＮＡＤＰＨ）（ｎｍｏｌ ＣＹＰｌ０２Ａｌ）−１（ｍｉｎ）−１又は（ｎｍｏｌ 生成物）（ｎｍｏｌ ＣＹＰｌ０２Ａｌ）−１（ｍｉｎ）−１として与えられる。結合効率は、消費されるＮＡＤＰＨのパーセンテージであり、生成物形成に対して利用した、すなわち、理論的最大効率のパーセンテージである。本発明のＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は（例えば、本発明の方法において使用される場合）、通常、少なくとも１％、例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、２０％、４０％、８０％又はそれ以上の結合効率を有し得る。ＣＹＰ１０２Ａ１酵素（例えば、本発明の方法において使用される場合）、通常、少なくとも２ｍｉｎ−１、例えば、少なくとも４、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、３００、５００、７００、１０００、２０００ｍｉｎ−１又はそれ以上の生成物形成率を有する。２つ以上の生成物が形成される場合（通常はそうである）、生成物形成率は、形成された全酸化生成物の合計量を表す。いくつかの実施形態において、特定の酸化生成物の生成物形成率が測定され、すなわち、全ての酸化生成物について測定しなくてもよい。
【００２８】
本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、対応する野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素に対して、増大したモノオキシゲナーゼ活性及び／又は変化した選択性を示す。増大したモノオキシゲナーゼ活性は、酸化に対する一つ又はそれ以上の基質の増大した結合効率又は増大した生成物形成率という点で特徴づけられ得る。増大した結合効率又は増大した生成物形成率については、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって利用される全ての基質について共有していてもよいし、共共有していなくてもよい。変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、通常、野生型酵素の結合効率よりも、少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％又は１５００％大きい結合効率を示す。変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素はまた、野生型酵素の生成物形成率よりも、少なくとも５０％、１００％、１５０％、５００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％大きい生成物形成率を有し得る。
【００２９】
本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、対応する野生型酵素及び文献に開示されている変異体に対して、その他の変化した特徴も示し得、結果として、その効果は、限定するものではないが、増大したモノオキシゲナーゼ活性を含み得ることを理解すべきである。例えば、変異酵素は、変化した基質特異性を示し、それにより、特異的な基質の選択的利用が可能となる場合もあり、又は、野生型酵素若しくは既知の変異体が、基質の有機化合物を酸化することができない場合に、モノオキシゲナーゼ活性を示す場合もある。
【００３０】
本発明の変異酵素は、野生型では微量に形成される生成物が変異体では主要な生成物となる場合、又は、野生型では微量に形成される若しくは全く形成されない新しい生成物が主要な若しくは支配的な生成物となる場合に、変化した生成物選択性を示す場合もある。変異酵素及びこの変異酵素によって行われる酸化工程のさらなる変化した特徴を、以下に記載する。変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、ＣＹＰｌ０２Ａｌの位置１１７、１３１、１９１、２１５、２７６、３０７、３３０、３７７、４０１、４０３、及び４２５のうちの一つ又はそれ以上に置換を含む。通常、それらは、上記の位置のうちの２ヶ所又はそれ以上、３ヶ所又はそれ以上、４ヶ所又はそれ以上、５ヶ所又はそれ以上、６ヶ所又はそれ以上に置換を含んでもよい。一つの好ましい実施形態において、位置３３０に置換が存在する場合、５ヶ所未満、例えば、３ヶ所未満のその他の置換が存在し、又は、一実施形態においては、その他の位置のいずれも置換されていない。
【００３１】
ＣＹＰ１０２Ａ１の特定の変異体について記載する場合、天然の形態のＣＹＰ１０２Ａｌ中に存在するアミノ酸残基の文字の次に位置が続き、次に、変異体中のアミノ酸が続く。これらの位置は、配列番号１に示される番号付けと関連させることができる。同じタンパク質中の複数の変異を示すために、各変異はスラッシュで分けて示される。また、特に好ましい変異体は、以下に概説される内部呼称を用いて記載され得る。
【００３２】
変異はＣＹＰ１０２Ａｌ中の位置を参照することによって規定されるが、本発明は、配列番号１と少なくとも４０％のアミノ酸同一性を共有するＣＹＰ１０２Ａｌの相同体のポリペプチド鎖中の相同する又は対応する位置における同等の置換変異をも包含する。同等な位置は、配列番号１のアミノ酸配列を参照することにより決定される。相同する又は対応する位置は、配列間の相同性に基づき、相同体の配列とＣＹＰ１０２Ａ１の配列（配列番号１）を整列させることにより、容易に推定することができる。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いることにより、配列を整列させることができる。参照された相同する又は対応するアミノ酸残基が活性部位である場合、通常、以下に記載される特定のアミノ酸のいずれも、相同体の活性部位の同様の位置に存在し得るであろう。
【００３３】
高度に保存された三次構造を有するにもかかわらず、Ｐ４５０スーパーファミリーの酵素は、相同性の低い一次構造を有するという点で、タンパク質及び酵素の中では珍しいということが当業者には良く知られている（３５-３７）。現在、ゲノムデータベース中には、６５００を超えるＣＹＰ遺伝子が存在し、タンパク質データバンク中には、１５０を超える構造が存在する。今日までに決定されている全てのＰ４５０構造は、初めて報告されたＰ４５０酵素（ＣＹＰｌ０ｌＡｌ）の結晶構造においてＰｏｕｌｏｓ及び共同研究者によって記載されているように、主たるβ鎖ドメインに対して集められた、らせん構造が豊富なドメインを含む特徴的なトポグラフィーを示す（３８）。らせん構造はＡ−Ｌと命名され、β鎖はβｌ−β５と命名され、全体のトポグラフィーは、現在、「Ｐ４５０折り畳み構造」として知られている（３８−４２）。二次構造要素のうち、ヘムの遠位側にあるＢ及びＢ’らせん、ＢＣループ、Ｆ及びＧらせん、並びにＦＧループは、基質結合ポケットを形成する。配列アラインメントによって、これらのらせん構造及びループ構造内の残基は容易に同定することができるが、アミノ酸配列及び構造的配列の両方の点で、この全般的フレームワーク内において高程度に可変的であり、このことが、Ｐ４５０触媒の多様な特異性、活性及び選択性パターンをもたらしている。
【００３４】
異なるファミリーのＰ４５０酵素は、２０％程度の低さの相同性（アミノ酸同一性）を有する（３５−３７）。ＣＹＰ１０２Ａ１と構造的に特徴付けられているＰ４５０酵素のアラインメントの例を、表Ａに示す。最近まで継続された配列分析によって、Ｐ４５０酵素又はドメイン中の通常は４００−４６０個のうちのわずか３残基が確実に保存されていることが示唆された：ヘムとの会合及び結合に関与し得る、ヘム鉄に近接するシステインリガンド、及びＫらせん構造中のＥＸＸＲモチーフ（４３）。しかしながら、２００６年に発表されたＣＹＰ１５７ファミリーにおける結果は、ＥＸＸＲモチーフさえ保存されておらず、全Ｐ４５０スーパーファミリーにわたり唯一保存されている残基として近接システインのみが残されていることを示した。Ｐ４５０スーパーファミリーの体系的分類においては（４４）、したがって、わずか４０％のアミノ酸同一性を有する酵素が同じファミリー内に置かれ、密接に関連するファミリーメンバー（５５％を超える同一性を有するもの）はサブファミリーへと分類された（例えば、表Ｂ参照）。
【００３５】
実際、詳細な分子構造、基質特異性及び生成物選択性は、配列同一性よりもむしろファミリー内で保存されており、配列同一性は低い場合が多い。最も特筆すべき例は、全ての生物界で見られるＣＹＰ５１ファミリーのステロール１４α−デメチラーゼである。これらは、スクアレンオキシドの酸化後に形成される中間体のＣ１４メチル基の酸化的脱メチル化において極めて重要な役割を果たす。配列アラインメントによって、全生物界における既知のＣＹＰ５１ファミリー遺伝子間の相同性は平均３０％であり、哺乳類等の密接に関連する種においては９５％まで高くなり、下等動物間では２３％と低くなることが示された（４５）。酵素を同じファミリーに割り当てるための４０％というカットオフ値は、ある場合においては高すぎる場合があり、酵素活性と、活性部位残基において見られることの多い高い相同性とをこれからはより考慮すべきであるという認識が増えている。
【００３６】
すなわち、アミノ酸同一性に基づきＣＹＰ１０２Ａｌと通常少なくとも４０％相同である相同体は、「Ｐ４５０折り畳み構造」に基づき容易に同定することもでき、対応する又は相同する位置に同等の変異を導入するための相同体の配列のアラインメントは、この酵素ファミリーを通じて共有されているＰ４５０折り畳み構造を含む、αヘリックス及びβ鎖の配列の保存されている特徴についての知識によって補助され得る。
【００３７】
ＣＹＰ１０２Ａｌは、電子伝達還元酵素ドメインとヘムモノオキシゲナーゼドメインの融合体であることを理解すべきである。これらのドメインは、タンパク分解的に、又は全長遺伝子の切断により、切断することができる。活性部位（基質結合ポケット）は、ヘムドメイン中に位置する。ＣＹＰ１０２ファミリーのいくつかのメンバーは、融合タンパク質ではないが、ＣＹＰ１０２Ａｌヘムドメインとの配列相同性は４０％である。したがって、配列相同性は、これらの環境にあるヘムドメインに対してのみ測定してもよい。本発明において開示されるＣＹＰ１０２Ａｌ中の残基に対するこれらの酵素中の同等の残基は、当業者に公知の配列相同性及び構造分析によって同定することができる。
【００３８】
活性部位におけるアミノ酸は、触媒作用時に基質が結合している部位を線引き若しくは規定するものであるか、又は、触媒部位に到達する前に基質が通過する必要がある部位を線引き若しくは規定するものである。したがって、かかるアミノ酸は、通常、触媒部位への進入時又は触媒作用時に、基質と相互作用する。かかる相互作用は、通常、静電相互作用（荷電又は極性基間）、疎水相互作用、水素結合又はファンデルワールス力によって生じる。活性部位のアミノ酸は、配列アラインメント、並びに、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌのヘムドメインの既知の結晶構造、又は相同体の結晶構造に対する参照、によって同定することができる。
【００３９】
変異残基が活性部位残基ではない場合、相同体とＣＹＰ１０２Ａｌの配列のコンピューター化された又はマニュアルのアラインメントが、相同する又は対応する位置を推定するために行われ、これは、ＣＹＰ１０２Ａｌの変異した位置に隣接する残基の知識によって補助され得る。すなわち、例えば、ＣＹＰ１０２Ａｌの以下の位置に対してＮ末端側及びＣ末端側に隣接する１０残基は、以下の通りである：
ＦＳＱＱＡＭＫＧＹＨ（Ａ１１７）ＭＭＶＤＩＡＶＱＬＶ；
ＤＩＡＶＱＬＶＱＫＷ（Ｅ１３１）ＲＬＮＡＤＥＨＩＥＶ；
ＬＤＥＡＭＮＫＬＱＲ（Ａ１９１）ＮＰＤＤＰＡＹＤＥＮ；
ＦＱＥＤＩＫＶＭＮＤ（Ｌ２１５）ＶＤＫＩＩＡＤＲＫＡ；
ＨＥＴＴＳＧＬＬＳＦ（Ａ２７６）ＬＹＦＬＶＫＮＰＨＶ；
ＶＬＶＤＰＡＰＳＹＫ（Ｑ３０７）ＶＫＱＬＫＴＶＧＭＶ；
ＥＡＬＲＬＷＰＴＡＰ（Ａ３３０）ＦＳＬＹＡＫＥＤＴＶ；
ＧＤＤＶＥＥＦＲＰ（Ｅ３７７）ＲＦＥＮＰＳＡＩＰＱ；
ＫＰＦＧＮＧＱＲＡＣ（Ｉ４０１）ＧＱＱＦＡＬＨＥＡＴ；
ＦＧＮＧＱＲＡＣＩＧ（Ｑ４０３）ＱＦＡＬＨＥＡＴＬＶ；
ＧＭＭＬＫＨＦＤＦＥ（Ｄ４２５）ＨＴＮＹＥＬＤＩＫＥ。
【００４０】
２個、３個又はそれ以上のＮ末端側及び／又はＣ末端側の隣接する残基の保存は、変異が導入される相同する又は対応する位置の推定を可能にし得る。
【００４１】
ＣＹＰ１０２Ａｌの天然の相同体における相同する又は対応する部位を同定するために、明細書中で参照されるＣＹＰ１０２Ａｌ中の任意のその他の位置に対して同様の分析を行うことができる。
【００４２】
ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の機能的断片も本発明に包含される。すなわち、これらの断片は、酸化活性に必要とされるアミノ酸のみを含んでもよい。したがって、ＣＹＰ１０２Ａｌのポリペプチド配列に関して、還元酵素ドメイン、及び／又は、モノオキシゲナーゼドメインのＮ末端又はＣ末端部分の最大２０残基は、活性部位の折り畳み又はモノオキシゲナーゼドメイン固有の基質酸化能には有意に影響を与えることなく削除することができた。ＣＹＰ１０２Ａｌの相同体の場合、同様の切断が可能であり、可能な切断の程度は、本明細書において記載される酸化活性をモニタリングするための方法によって決定され得る。切断された形態の酵素は、タンパク質の安定性、発現レベル、及び活性に関して、有利な特性を有し得る。
【００４３】
本明細書中に記載されたＣＹＰｌ０２Ａｌの位置（又は、上記の同等の位置）において置換されたアミノ酸の特性は、主として、増大したモノオキシゲナーゼ活性を示す変異体の要件によって決定される。したがって、導入されるアミノ酸は、通常、モノオキシゲナーゼ活性を増大し得る。ＣＹＰ１０２Ａ１における特定の置換変異のいずれかについて言及する場合、ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の酸化活性に対する特定の置換変異の効果よりも余剰な又は類似する効果を示す、同じ位置の別のアミノ酸残基の任意の置換が、本発明に包含されることを理解すべきである。同様に、特定の置換変異が、ＣＹＰ１０２Ａ１酵素の別のパラメーター、例えば、基質特異性、又は、所定の基質の酸化で得られる酸化生成物の範囲若しくは割合、に対する効果も示す場合、余剰な又は類似の効果も誘導するその他のアミノ酸残基の置換も、本発明の使用に対して意図されることを理解すべきである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、置換は、保存的変化を導入し、アミノ酸を、類似した化学構造、類似した化学特性又は類似した側鎖体積の別のアミノ酸と交換する。保存的なアミノ酸の変化は、当技術分野において周知であり、表Ｃに規定される変化にしたがって選択され得る。アミノ酸が類似した極性を有する場合、これは、アミノ酸側鎖のハイドロパシースケールを参照することにより決定することもできる（表Ｄ）。
【００４５】
保存的なアミノ酸の変化は、アミノ酸配列の保存のための採点マトリックスである、許容される点突然変異（ＰＡＭ）又はブロック置換マトリックス（ＢＬＯＳＵＭ）ファミリーを参照することにより決定してもよい。したがって、保存的なアミノ酸の変化は、基準及び変異ポリペプチド鎖のアラインメントにおいて使用するために選択された、採点マトリックスの類似性表示において互いに正のスコアを有するアミノ酸の組である、同等のグループのメンバーであってもよい。
【００４６】
表Ｃに示される物理的特性の定義は、本発明を限定するものであると考えるのではなく、非極性アミノ酸は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸及び芳香族側鎖を有するアミノ酸を含む、ということを理解すべきである。アミノ酸プロリンは、非極性として分類されるが、剛性であるという特性も有し、二次構造の変化を引き起こし得る。例えば、プロリンは、らせん構造の端部に見られることが多い。また、所定のアミノ酸残基の側鎖の特定の状況にもよるが、例えば、アミノ酸チロシン（通常は、その芳香環のために非極性と分類される）は、スレオニン等の極性アミノ酸残基と、その水酸基を介することにより、類似した機能的効果を示し得る。したがって、チロシンは、本発明の目的に対しては、非極性及び極性アミノ酸の両方であると考えてもよい。さらに、極性又は親水性と記載されるアミノ酸は、電荷を有していなくても、有していてもよく、又、塩基性であっても、酸性であってもよい。アミノ酸ヒスチジンは、約７のｐＫａ値を有することが良く知られており、したがって、タンパク質の環境に応じた中性のｐＨにおいては、その側鎖でプロトン化されていても、プロトン化されていなくてもよく、すなわち、電荷を有していても、有していなくてもよい。したがって、ヒスチジンは、本発明の目的に対しては、極性を有し電荷を有したアミノ酸及び極性を有し電荷を有していないアミノ酸の両方であると考えてもよい。
【００４７】
ＣＹＰ１０２Ａ１の位置１１７、１３１、２１５、３０７、３３０、４０１、及び４０３（又は、それと同等の位置）における保存的アミノ酸変化の具体例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
Ａｌ１７Ｖ、Ａｌ１７Ｉ、Ａ１１７Ｌ、Ａ１１７Ｐ、Ａ１１７Ｍ、Ａ１１７Ｆ、Ａ１１７Ｗ、Ａ１１７Ｙ；
Ｅ１３１Ｄ；
Ｌ２１５Ｉ、Ｌ２１５Ｖ、Ｌ２１５Ｐ、Ｌ２１５Ｆ、Ｌ２１５Ｗ、Ｌ２１５Ｙ；
Ｑ３０７Ｈ、Ｑ３０７Ｎ、Ｑ３０７Ｓ、Ｑ３０７Ｔ、Ｑ３０７Ｙ；
Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｙ；
Ｉ４０１Ｐ、Ｉ４０１Ｉ、Ｉ４０１Ｌ、Ｉ４０１Ｍ、Ｉ４０１Ｖ、Ｉ４０１Ｆ、Ｉ４０１Ｗ、Ｉ４０１Ｙ；
Ｑ４０３Ｎ、Ｑ４０３Ｈ、Ｑ４０３Ａ、Ｑ４０３Ｔ、Ｑ４０３Ｙ。
【００４８】
その他の好ましい実施形態において、アミノ酸置換によって、通常、既存の残基が非極性残基である野生型酵素の所定の位置に極性アミノ酸を導入することにより、極性を変化させる。ＣＹＰ１０２Ａ１の位置１９１及び２７６（又は、それと同等の位置）における極性アミノ酸置換の具体例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
Ａ１９１Ｔ、Ａ１９１Ｓ、Ａ１９１Ｃ、Ａ１９１Ｙ、Ａ１９１Ｈ、Ａ１９１Ｋ；Ａ１９１Ｒ、Ａ１９１Ｎ、Ａ１９１Ｑ；
Ａ２７６Ｔ、Ａ２７６Ｓ、Ａ２７６Ｃ、Ａ２７６Ｙ、Ａ２７６Ｈ、Ａ２７６Ｋ、Ａ２７６Ｒ、Ａ２７６Ｎ、Ａ２７６Ｑ。
【００４９】
対照的に、その他の好ましい実施形態において、アミノ酸置換によって、通常、既存の残基が極性残基である野生型酵素の所定の位置に非極性アミノ酸を導入する。例えば、非極性アミノ酸を、位置３７７若しくは４０３、又は、それと同等の位置に導入してもよい。具体例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
Ｅ３７７Ａ、Ｅ３７７Ｖ、Ｅ３７７Ｌ、Ｅ３７７Ｉ、Ｅ３７７Ｐ、Ｅ３７７Ｆ、Ｅ３７７Ｙ、Ｅ３７７Ｗ；
Ｑ４０３Ｐ、Ｑ４０３Ｗ、Ｑ４０３Ｆ、Ｑ４０３Ｙ。
【００５０】
さらなる実施形態において、アミノ酸置換は、野生型酵素の所定の位置において、電荷を有する側鎖基の欠失を引き起こす。したがって、置換によって、電荷を有していないアミノ酸が関連する位置に導入される。このことは、この位置における極性の喪失を引き起こすかもしれないし、引き起こさないかもしれず、したがって、極性を有し電荷を有していない又は非極性の（芳香族又は脂肪族の）残基が導入される。例えば、非極性又は極性の電荷を有していない残基は、位置４２５又はそれと同等の位置に導入してもよい。具体例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：
Ｄ４２５Ｎ、Ｄ４２５Ｑ、Ｄ４２５Ｈ、Ｄ４２５Ｓ、Ｄ４２５Ｔ、Ｄ４２５Ａ、Ｄ４２５Ｌ、Ｄ４２５Ｖ、Ｄ４２５Ｉ、Ｄ４２５Ｐ、Ｄ４２５Ｗ、Ｄ４２５Ｙ、Ｄ４２５Ｆ。
【００５１】
さらにさらなる実施形態において、大きな側鎖体積のアミノ酸が、本発明の位置に導入される。好ましい実施形態において、大きな側鎖体積のアミノ酸、通常、嵩高い非極性のアミノ酸が、位置３３０、４０１、４０３又はそれと同等の位置に導入される。位置３３０に関して特に好ましい置換は、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３ＯＬ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｙである。位置４０３に関して特に好ましい置換は、Ｑ４０３Ｐ、Ｑ４０３Ｗ、Ｑ４０３Ｆである。その他の実施形態において、例えば、位置３７７においては、小さな側鎖体積を有するアミノ酸が導入されるのが好ましい場合もある（例えば、Ｅ３７７Ａ又はＥ３７７Ｇ）。
【００５２】
本明細書において記載される変異は、通常、酵素の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ及び遺伝子シャッフリング法等の当技術分野において公知の方法を用いることにより、又は、部位特異的突然変異誘発のサイクルにおける複数の変異原性オリゴヌクレオチドを用いることにより、酵素中に導入される。したがって、変異は、特異的な又はランダムな様式で導入され得る。したがって、変異誘発法は、一つ又はそれ以上の異なる変異体をコードする一つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを生成する。通常、変異体遺伝子のライブラリーが作製され、それを用いて、変異酵素のライブラリーを作製することができる。
【００５３】
酵素は、上記した一つ又はそれ以上の変異の他に、１、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜４０個又はそれ以上のその他の変異、例えば、置換、挿入又は欠失、を含んでもよい。これらのさらなる変異は、変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素のモノオキシゲナーゼ活性を増大するかもしれないし、増大しないかもしれない。その他の変異は、活性部位内にあってもよいし、活性部位の外にあってもよい。例えば、変異は、第二の範囲、すなわち、活性部位のアミノ酸のうちの一つ又はそれ以上の位置又は方向に影響を与える又はそれらと接触する残基、にあってもよい。挿入は、通常、Ｎ末端及び／又はＣ末端的であり得る。したがって、酵素は、最大２０個のアミノ酸からなる短いペプチドを含んでもよいし、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる又は固体マトリックス上での固定化によるタンパク質精製を助けるために、一端又は両端に融合させた全長タンパク質を含んでもよい。欠失は、通常、触媒作用に関与しないアミノ酸、例えば、活性部位の外にあるもの、の欠失を含む（したがって、酵素は、天然の酵素の変異断片である）。
【００５４】
活性部位におけるその他の変異は、通常、活性部位に基質が結合した時に、基質の位置及び／又は立体構造を変化させる。変異は、ヘム基により接近し得る、酸化される基質上の部位を作り得る。したがって、変異は、より小さな若しくはより大きな、又は、より極性の大きい若しくはより極性の小さい側鎖を有するアミノ酸との置換であってもよい。
【００５５】
さらなる変異には、酵素の安定性を増大し得るアミノ酸残基の変更を含むことができる。これらの変異は、通常、タンパク質のオリゴマー化を防ぎ、例えば、Ｐ４５０ｃａｍ（ＣＹＰｌ０ｌＡｌ）のダイマー化は、Ｃｙｓ３４４の、好ましくは、アラニンとの、置換により除去される。全長ＣＹＰ１０２Ａ１の結晶構造は未だ得られておらず、得られているのは、ヘムドメイン及びＦＡＤ／ＦＭＮドメイン別々のもののみである。同様の置換は、ＣＹＰ１０２Ａ１については必要とされない、何故ならば、ＣＹＰｌ０ｌＡｌのＣｙｓ３３４は、ＣＹＰ１０２Ａ１のＡｓｐ３７０と一致するからである。しかしながら、全長ＣＹＰ１０２Ａ１及び／又は還元酵素ドメインの結晶構造は、タンパク質の安定性を向上させるためにアラニンとの置換によって除去され得る、システイン残基を明らかにし得る。その他の変異も、タンパク質表面の疎水パッチ間の接触により生じるオリゴマー化を阻害することができる。さらにさらなる変異は、酵素精製及び／又は固定化を助ける挿入／欠失と、タンパク質が可溶形態で調製されることを可能にする変異とを、例えば、欠失又はポリヒスチジンタグの導入により、又は、Ｎ末端の膜アンカー配列の変異により含む。
【００５６】
好ましくは、さらなる変異は、ＣＹＰ１０２Ａｌ中の以下の変異のうちの一つ又はそれ以上から、又は、それと同等の位置の同じ変異から選択される：Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ、Ａ７４Ｇ、Ａ２６４Ｇ、Ｎ２３９Ｈ、Ｉ２５９Ｖ、Ｌ３５３Ｉ、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｌ、Ｆ８７Ｇ、Ｈ１７１Ｌ、Ｌ１８８Ｑ、Ｎ３１９Ｙ、Ｉ２６３Ａ、Ａ３２８Ｐ。特定して示された効果に対して余剰な又は同様の効果を有するその他のアミノ酸変化を選択するのに関連して、位置１１７、１３１、１９１、２１５、２７６、３０７、３３０、３７７、４０１、４０３及び４２５について上記に概説したように、同じ考慮すべき事柄が当てはまることも理解すべきである。したがって、例えば、上記された特定のさらなる変異が、保存的変化であるかどうか、極性を変化させるかどうか、又は電荷を有していないアミノ酸を導入するかどうかに応じて、アミノ酸の類似範囲は、各付加的位置における導入に対して適合し得る。
【００５７】
特に好ましい実施形態において、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、以下のＣＹＰ１０２Ａｌ中の変異群から選択される一つ又はそれ以上の変異群を含むか：
ｉ） Ａ３３０Ｐ
ｉｉ） Ａ１９１Ｔ／Ｎ２３９Ｈ／Ｉ２５９Ｖ／Ａ２７６Ｔ／Ｌ３５３Ｉ；
ｉｉｉ） Ｆ８７Ａ／Ｈ１７１Ｌ／Ｑ３０７Ｈ／Ｎ３１９Ｙ；
ｉｖ） Ｆ８７Ａ／Ａ３３０Ｐ／Ｅ３７７Ａ／Ｄ４２５Ｎ；
ｖ） Ｆ８７Ａ／Ａ１１７Ｖ／Ｅ１３１Ｄ／Ｌ２１５Ｉ；
ｖｉ） Ｉ４０１Ｐ；
ｖｉｉ） Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ；
ｖｉｉｉ）Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ；
ｉｘ） Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ；
ｘ） Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐ；
ｘｉ） Ｑ４０３Ｐ；
ｘｉｉ） Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｑ４０３Ｐ；
ｘｉｉｉ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｆ８７Ａ／Ｑ４０３Ｐ
、又は、これらと同等の変異群を含む。
【００５８】
ｉ）に規定されるＡ３３０Ｐ変異は、その効果が、協力して作用する変化した残基の混成状態に左右され得る、その他の定向進化変異とは異なり、その活性は、単一の点突然変異から生じることから、いくつかの点において通常の変異と異なる。ＣＹＰ１０２Ａｌにおいて、Ａ３３０は、位置３２９の天然のプロリン残基の隣に位置するので、Ａ３３０Ｐは、βシート領域中の一次基質接触ポイントにおける２つのプロリンと並列する（３）。この変異体の結晶構造（図２）は、これが、アクセスチャンネルを妨げ、活性部位をより接近しにくいものとしており、それによって、より接近した活性部位をもたらし、基質に対する結合配置が変化することを、示唆している。以下に見られるように、このことは、モノオキシゲナーゼ活性及び生成物選択性に対して特徴的効果を及ぼす。
【００５９】
変異ｉｉ）及びｉｉｉ）のグループは、野生型酵素によって示される特異的な形質を広く反映しながら、ＣＹＰ１０２Ａｌの活性を増大させる。グループｉｉｉ）〜ｖ）の残基８７は例外として、任意の変異グループにおいて変異した位置のいずれもが、活性部位残基ではない。
【００６０】
例えば、グループｉｉ）において、位置３５３は、基質アクセスチャンネルの残基３５４の隣に位置する一方、残基１９１、２３９、２５９、２７６及び３５３は、タンパク質表面に位置する。Ａｌ９１は、結晶構造によれば、明らかにパルミチン酸塩結合部位上に移動されており（４）、アクセスチャンネルの外縁上に位置している。この残基を変異させることが、基質の誘引及び／又は捕捉に対して影響を及ぼし得ると推測されている。
【００６１】
グループｉｉｉ）において、位置１７１は、タンパク質表面上又は表面近くに位置する一方、残基３０７及び３１９は、電子伝達還元酵素ドメインに対するドッキング部位であると考えられている領域に近いので、電子伝達動態に及ぼす影響によるモノオキシゲナーゼ活性の増大に対するその影響を潜在的に介在し得る。
【００６２】
変異ｉｖ）のグループは、基質接触ポイントにおけるＡ３３０Ｐ変異と、変異ｖ）における位置１１７、１３１、及び２１５と同様に、タンパク質表面に近い酵素構造の周辺に配置されている位置３７７及び４２５の変異とを含む。
【００６３】
さらに好ましい実施形態において、上記に規定された分類の本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は：
ｉ）ＣＹＰ１０２Ａ１中の以下の変異、又は、それと同等の変異のうちの一つ又はそれ以上をさらに含み：Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ、Ａ７４Ｇ、Ａ２６４Ｇ；
ｉｉ）ＣＹＰ１０２Ａ１中の以下の変異のうちの一つ又はそれ以上をさらに含み：Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｌ；及び
ｉｉｉ）ＣＹＰ１０２Ａ１中の以下の変異のうちの一つ又はそれ以上をさらに含む：Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｇ、Ｉ２５９Ｖ、Ｉ２６３Ａ。
【００６４】
上記された特定の変異又は特定のさらなる変異に加えて、最大１、２、３、４、５〜１０、１０〜２０個又はそれ以上のその他の変異も、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素のこれらの好ましい実施形態に含まれ得ることを理解すべきである。
【００６５】
酸化工程のための基質は、任意の有機化合物であり、より典型的には、モノオキシゲナーゼ酵素によって酸化され得る任意の有機化合物である。モノオキシゲナーゼ酵素による酸化に対する任意の有機化合物の適合性は、日常的に、本明細書において記載される方法によって調べられ得る。
【００６６】
酸化工程は、一般的に、炭素−水素結合の酸化によるアルコールのように、化合物中にＣ−Ｏ結合の形成を引き起こすが、エポキシドは、Ｃ＝Ｃ結合の酸化から形成され得る。したがって、酸化は、アルコール、アルデヒド、ケトン又はエポキシド基を導入し得る。あるいは、酸化は、例えば、アルコール基を、アルデヒド又はケトンへと変換させるように、酸素含有基のさらなる酸化を引き起こし得る。１、２個又はそれ以上の炭素原子が、同じ基質分子中で攻撃されてもよい。酸化は、基質分子のＮ−及びＯ−脱アルキル化も生じ得る。
【００６７】
酸化は、通常、１、２又はそれ以上の酸化生成物を生じる。これらの異なる生成物は、攻撃される異なる炭素原子から、及び／又は、所定の炭素原子において生じる異なる程度の酸化から得られ得る。
【００６８】
酸化は、環炭素原子又は置換基炭素原子のいずれか又はその両方で起こり得る。少なくとも初期酸化は、活性化され得る若しくは活性化され得ないＣ−Ｈ結合への攻撃、又は、炭素−炭素二重結合における攻撃（通常、エポキシドを生じる）を伴い得る。一般的に、活性化されるＣ−Ｈ結合は、炭素原子がベンジル又はアリルの位置にある。芳香環及びオレフィン性二重結合は、反応経路中で生成されるラジカル中間体又は任意の電荷の集合を安定化することにより、攻撃するＣ−Ｈ結合を活性化する。Ｃ−Ｈ結合の炭素原子は、一級、二級又は三級であってもよい。酸化は、酸素原子の挿入よりもむしろ、Ｃ＝Ｃ二重結合の形成をもたらす脱水素化を生じるように起こり得る。このことは、アルキル置換基が分岐している場合、又は、脱水素化が、芳香環と共役するＣ＝Ｃ結合を生じる場合、又は、脱水素化が、芳香族系の形成をもたらす場合に、最も起こり得る。
【００６９】
基質は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の天然の基質、又は、通常は野生型酵素の基質ではないが、変異酵素中で基質として利用され得る基質、のいずれかであり得る。ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素のための天然の基質の例は、分岐鎖状又は直鎖状の脂肪酸であり、これらは、端部近くの位置（ω−１〜ω−３）で野生型ＣＹＰ１０２Ａ１によって水酸化される。好ましい例は、ラウリン酸、ウンデカン酸、デカン酸、ノナン酸及びオクタン酸である。
【００７０】
好ましい実施形態において、基質は、短鎖アルカン又は中鎖アルカン又はアルキルベンゼンである。用語アルカンは、一般式ＣｎＨ２ｎ＋２を有する非環状の分岐している又は分岐していない炭化水素のことをいう。
【００７１】
短鎖アルカンは、通常、１〜約９個の炭素原子、より好ましくは、１〜８個、１〜６個、又は、１〜４個の炭素原子を有する。Ｃ１−Ｃ８アルキル基又は部分は、直鎖状又は分岐鎖状であることができる。それがＣ１−Ｃ４アルキル部分である場合、それは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル及びｔ−ブチルであることができる。
【００７２】
アルキルベンゼンは、ベンジル芳香環上の位置で置換されている１個又はそれ以上のアルキル基又は部分を有する。アルキル基又は部分中の炭素原子の数は、通常、１〜約８個の炭素原子、より好ましくは、１〜８個、１〜６個、又は、１〜４個の炭素原子であり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態においては、短鎖又は中鎖アルカンの骨格上に、１、２、３個又はそれ以上の置換基が存在していてもよいし、又は、ベンジル環上で、若しくは、アルキルベンゼンのアルキル置換基上で、直接置換されていてもよい。以下の置換基の任意の組み合わせが存在し得る。置換基は、通常、ハロゲン原子、又は、一般的に１〜６個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル基であり、置換基は、１個又はそれ以上のハロゲンによって置換されていてもよい。置換基は、１、２個又はそれ以上の酸素、ハロゲン又は窒素原子を含んでもよく、例えば、アルコール、アルデヒド、ケトン、エーテル、アミン又はエポキシド基であり得る。
【００７４】
好ましい短鎖アルカン基質の例としては、限定するものではないが、ペンタン、３−メチルペンタン、２−メチルブタン、ブタン、プロパン、エタン及びメタン、オクタン及びノナンを挙げることができる。好ましいアルキルベンゼン基質の例としては、限定するものではないが、プロピルベンゼン、エチルベンゼン、ブチルベンゼン、クメン、ｔ−ブチルベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−シメン及びエチルアニソールを挙げることができる。その他の好ましい芳香族化合物は、ナフタレン及びフルオレンである。
【００７５】
ブタン、ナフタレン、特に、プロパン、ｔ−ブチルベンゼン及びｏ−キシレン等の有機化合物は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素に対する「非天然の」基質として広く分類されるが、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって酸化され得ることに注目すべきである。非天然基質は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌと一緒にインキュベートした時に検出可能な結合率及び／又は生成物形成を有しない分子として規定することができる。非天然基質は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素による天然の基質に対する割合の１０％未満で酸化される分子を含んでもよく、したがって、それらは、真の基質とは見なされ得ない。
【００７６】
本発明のその他の実施形態において、基質は、テルペン、例えば、モノテルペン又はセスキテルペンである。基質はシクロアルケンであることもできる。本発明において使用されるテルペンは、通常、ｎが２又はそれ以上、より具体的には２又は３である式（Ｃ５Ｈ８）ｎを有し得るが、用語「テルペン」は、断片、一般的にはメチル基、の喪失又は移動を含む「テルペノイド」と厳密に称される化合物にも及ぶことを理解すべきである。したがって、例えば、本発明において使用し得るセスキテルペン（この場合、ｎは３である）は、１５個よりもむしろ、わずか、すなわち１４個の炭素原子を含んでもよい。一般的に、テルペンは、イソプレン単位から組み立て得るものである。テルペンは、環状であっても、環状でなくてもよい。さらに、「テルペノイド」は、テルペンに関連する化合物にもその範囲は及び、例えば、アルコール又はケトン基の形態で、１個又はそれ以上の酸素を含んでもよい（例えば、ダマスコン及びイオノン、特にβ−イオノン）。
【００７７】
モノテルペン（この場合、ｎは２である）は、一般的に１０個の炭素原子を有し、通常１〜３個の二重結合、特に１又は２個の環二重結合、及び、通常０〜２個の環を含み得る。環の一つは、通常０又は１個の炭素原子を含む架橋部として形成され得る。すなわち、それは、現在ある環の２個の炭素原子同士の又は中間体のメチレン基との直接的結合によって形成され得る。テルペンが非環状である場合には、一般的に、少なくとも２個の二重結合、通常３個の二重結合を含み得る。
【００７８】
セスキテルペンは、通常、１４又は１５個の炭素原子を含み得、通常０〜２個の二重結合、及び、通常１〜３個の環を含み、融合環及び／又は架橋環であってもよい。
【００７９】
テルペンに存在し得る環は、通常、３〜９個の炭素原子、特に、５又は６個の炭素原子を有し得る。したがって、特に、テルペンは、シクロヘキサン又はシクロヘキサジエン環を含み得る。
【００８０】
テルペンは、通常、合計３又は４個の環外メチル又はメチレン基、例えば、モノテルペンに対しては、２個のメチル基と１個のメチレン基又は３個のメチル基、セスキテルペンに対しては、３個のメチル基と１個のメチレン基又は４個のメチル基を含み得る。
【００８１】
モノテルペンは、通常、Ｒ−リモネン等のリモネン、（＋）−α−ピネン等のピネン、テルピネン、サビネン、ツジェン、ミルセン、オシメム、ネロール又はゲラニトールである。
【００８２】
セスキテルペンは、３つのイソプレン単位の頭部−尾部配列化によって形成される。セスキテルペンは、通常、アロマデンドレン、カリオフィレン、ロンジフォレン、バレンセン、イソバザネン、シルフィネン、イシュワラン、イソパッチショール−３−エン、又はイソセスキカレンである。セスキテルペン基質がバレンセンであるのが特に好ましい。
【００８３】
シクロアルケンは、通常、最大９個の環要素を含み、例えば、それは、５、６、７、８、９個又はそれ以上の要素の環である。シクロアルケンは、通常、シクロヘキセンである。
【００８４】
上記した任意のテルペン又はシクロアルケンの置換誘導体を使用してもよい。通常、１、２、３個又はそれ以上の置換基が存在する。以下の置換基の任意の組み合わせで存在してもよい。置換基は、通常、ハロゲン原子若しくは酸素若しくは窒素含有基、又は、一般的に、１〜６個の炭素原子を有する、アルキル若しくはアルケニル基であり、この置換基は、１個又はそれ以上のハロゲンによって置換されていてもよい。
【００８５】
置換基は、通常、式ＣｎＨｋＸｍで示され、式中、Ｘはハロゲン、酸素又は窒素含有基であり、ｎは１、２、３又はそれ以上であり、ｍは１、２、３、４又はそれ以上であり、ｋは、置換基ＣｎＨｋＸｍの価数が満たされるような適当な値の整数である。アルキル置換基の場合、ｋ＋ｍ＝２ｎ＋ｌである。通常、ｋは１、２、３、４又はそれ以上であり、０であってもよく、すなわち、置換基が、ペルハロアルキル基である。ハロゲンは、通常、フッ素、塩素又は臭素である。置換基は、１、２個又はそれ以上の酸素原子を含んでもよく、例えば、アルコール、アルデヒド、ケトン又はエポキシド基であってもよい。
【００８６】
本発明のさらなる実施形態において、基質はハロ芳香族化合物である。ハロ芳香族化合物は、通常、ベンゼン又はビフェニル化合物である。ベンゼン環は融合していてもよく、置換していてもよい。ハロゲンは、通常、塩素である。多くの場合、分子中に１個より多い、通常、２〜５個又は６個、例えば、３個のハロゲン原子が存在する。一般的に、２個のハロゲン原子は、互いにオルト又はパラであり得る。化合物は、水酸基、アリールオキシ基又はカルボキシ基等の酸素原子を含んでいても、含んでいなくてもよい。化合物は、クロロフェノール又はクロロフェノキシ酢酸化合物であっても、なくてもよい。
【００８７】
本発明の方法によって酸化され得る具体的な化合物としては、１，２−；１，３−及び１，４−ジクロロベンゼン、１，２，４−；１，２，３−及び１，３，５−トリクロロベンゼン、１，２，４，５−及び１，２，３，５−テトラクロロベンゼン、ペンタンパク質クロロベンゼン、ヘキサクロロベンゼン、及び、３，３’−ジクロロビフェニル等を挙げることができる。
【００８８】
本発明の方法によって酸化され得るその他の化合物としては、取り扱い難いハロ芳香族化合物、特にダイオキシン及びハロゲン化ジベンゾフラン、並びに、１個又は両方の酸素原子が硫黄と置換されている対応する化合物、特に、少なくとも１個のハロ置換基を有するダイオキシン類化合物、例えば、ダイオキシン自体、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾダイオキシン等を挙げることができる。
【００８９】
ハロ芳香族化合物の酸化は、通常、１、２又はそれ以上の酸化生成物を生じる。酸化される原子は環炭素であってもよい。これらの酸化生成物は、一般的に、１個又はそれ以上の水酸基を含み得る。したがって一般的に、酸化生成物はフェノールであり、これらは、各種シュードモナス及びその他の細菌によって容易に分解され得るのに対して、非酸化ハロ芳香族化合物は酸化に対して耐性を有する。以下に記載されるように、このことが、本発明の酵素を、ハロ芳香族化合物で汚染された場所の汚染除去に適合させる。
【００９０】
本発明の方法における使用が意図される、さらにさらなる基質としては、限定するものではないが、クロロオキサゾン、アニリン、ｐ−ニトロフェノール、ニフェジピン、ツジョンジアステレオマー、アルケン（プロペン、１−ヘキセン及びスチレンを含む）、インドール、多環式芳香族炭化水素、プロパノールオール、アルコキシレゾルフィン（７−エトキシレゾルフィン、７−メトキシレゾルフィン、７−ペントキシレゾルフィン、７−ベンジルオキシレゾルフィンを含む）、ブスピロン、テストステロン、アモジアキン、デキストロメトルファン、アセトアミノフェン、３，４−メチレンジオキシメチルアンフェタミン（ＭＤＭＡ）等を挙げることができる。
【００９１】
本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素を用いて行われる酸化工程は、上記したような向上した結合率又は生成物形成率の点で、別の野生型又は変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって行われる工程とは区別され得る。本発明の方法は、酸化される基質からの特定の生成物、通常、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１酵素若しくは別の変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素によっては形成されないもの、又は、無視し得る量、すなわち、生成物の全体量の１０％未満、８％、５％、２％、１％又はそれ未満、で形成されるもの、の形成によっても特徴付けられ得る。例えば、プロピルベンゼンの酸化は、高い選択性で、２−プロピルフェノール、又は、１−フェニル−２−プロパノールを生成し得、エチルベンゼンの酸化は、２−フェニルエタノール及びスチレンを生成し得る。
【００９２】
本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素を用いて行われる工程は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素又はその他の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって行われる酸化工程と比較して、変化した割合又は数の酸化生成物も示し得る。変化した割合の生成物が存在する場合、特定の酸化生成物に関する生成物形成率は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素又はその他の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって行われる対応工程に対して、通常、増加する。特定の酸化生成物の普及の増加は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素又はその他の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素によって形成される場合の生成物混合物中の当該酸化生成物の量と比較して、少なくとも１０％、２０％、５０％、より好ましくは１００％、２００％、３００％、５００％又はそれ以上であり得る。
【００９３】
本発明の工程において増大した普及を示し得る酸化生成物の具体例は：ｉ）ｌ−フェニル−２−プロパノール、この場合、酸化される基質はプロピルベンゼンである；ｉｉ）２−エチルフェノール、この場合、酸化される基質はエチルベンゼンである；ｉｉｉ）１−フェニル−２−ブタノール又は４−フェニル−２−ブタノール、この場合、酸化される基質はブチルベンゼンである；ｉｖ）ベンジルアルコール、この場合、酸化される基質はトルエンである；ｖ）２−メチル−２−フェニルプロパン−ｌ−オール、この場合、酸化される基質はｔ−ブチルベンゼンである；ｖｉ）２−メチルベンジルアルコール、この場合、酸化される基質はｏ−キシレンである；ｖｉｉ）カルバクロール又はチモール又は４−イソプロピルベンジルアルコール、この場合、酸化される基質はｐ−シメンである；ｖｉｉｉ）ヌートカトン、この場合、酸化される基質はバレンセンである；ｉｘ）２−ノナノール、この場合、酸化される基質はノナンである；ｘ）２−ブタノン又は２−ブタノール、この場合、酸化される基質はブタンである；ｘｉ）３−メチル−３−ペンタノール、この場合、酸化される基質は３−メチルペンタンである；ｘｉｉ）２−プロパノール、この場合、酸化される基質はプロパンである；ｘｉｉｉ）トランス−イソピペリテノール、この場合、酸化される基質はＲ−リモネンである；ｘｉｖ）２，３−ピネンエポキシド、シス−ベルベノール、トランス−ベルベノール、この場合、酸化される基質はα−ピネンである；ｘｖ）９−フルオレノール、この場合、酸化される基質はフルオレンである；ｘｖｉ）８−ヒドロキシドデカン酸及び７−ヒドロキシドデカン酸、この場合、酸化される基質はラウリン酸である。
【００９４】
この工程は、通常、ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素、基質及び酵素の天然の補因子（ＮＡＤＰＨ及び酸素である）の存在下で行われる。一実施形態において、本発明の工程は、デヒドロゲナーゼ等の酵素、及び、デヒドロゲナーゼ酵素の補基質の酸化に付随するＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生するための補基質を用いて行われる。別の実施形態において、本発明の工程は、当技術分野において公知の電気化学的方法によってＮＡＤＰＨ補因子を再生することにより行われる。
【００９５】
増大した活性及び変化した選択性は、ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素のヘムドメイン中の置換によって生じることが理解される。したがって、本発明は、基質酸化が、酵素のヘムドメイン（ａ）、基質、電子伝達還元酵素（ｂ）、電子伝達レドキシン（ｃ）、酵素に対する補因子及び酸素供与体の存在下で行われる系も提供する。この系において電子の流れは、一般的に：補因子→（ｂ）→（ｃ）→（ａ）である。
【００９６】
（ｂ）は、一般的に、補因子から（ｃ）への電子伝達を仲介し得る電子伝達還元酵素であり、例えば、天然の還元酵素、又は、天然の還元酵素と相同性を有する（通常、少なくとも７０％の相同性を有する）タンパク質であるか；あるいは、還元酵素又は相同体の断片である。（ｂ）は、通常、天然のＰ４５０酵素系に見られる任意の電子伝達連鎖における還元酵素であり、通常、フラビン依存性の還元酵素、例えば、プチダレドキシン還元酵素である。
【００９７】
（ｃ）は、一般的に、補因子から（ｂ）を経由した（ａ）への電子伝達を仲介し得る電子伝達レドキシンである。（ｃ）は、天然の電子伝達レドキシン、又は、天然の電子伝達レドキシンと相同性を有する（通常、少なくとも７０％の相同性を有する）タンパク質であるか；あるいは、レドキシン又は相同体の断片である。（ｃ）は、通常、天然のＰ４５０酵素系に見られる任意の電子伝達連鎖におけるレドキシンである。（ｃ）は、通常、２Ｆｅ−２Ｓレドキシン、例えば、プチダレドキシン、又はフラボドキシンである。
【００９８】
通常、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、別々のタンパク質として存在するが、それらは、同じ融合タンパク質中に存在してもよい。通常、それらのうちの２つのみが、好ましくは、（ｂ）及び（ｃ）が、融合タンパク質中に存在する。通常、これらの成分は融合タンパク質中で連続的であるので、リンカーペプチドは存在しない。
【００９９】
あるいは、リンカーがこれら成分間に存在してもよい。リンカーは、一般的に、嵩張る側鎖は有しないので、タンパク質サブユニットの折り畳みを妨げない。好ましくは、リンカー中のアミノ酸は電荷を有していない。リンカー中の好ましいアミノ酸は、グリシン、セリン、アラニン又はスレオニンである。一実施形態において、リンカーは、配列Ｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃを含む。リンカーは、通常、少なくとも５アミノ酸長からであり、例えば、少なくとも１０、３０又は５０又はそれ以上のアミノ酸長である。
【０１００】
本発明の工程において、酵素、（ｂ）又は（ｃ）の濃度は、通常、１０−８〜１０−２Ｍ、好ましくは、１０−７〜１０−４Ｍである。一般的に、本発明の工程は、酵素が機能的である温度及び／又はｐＨにおいて、例えば、酵素が、ピーク活性の少なくとも２０％、５０％、８０％又はそれ以上を有する場合の温度及び／又はｐＨにおいて行われる。通常、ｐＨは、３〜１１、例えば、５〜９又は６〜８、好ましくは、７〜７．８又は７．４である。通常、温度は、ｉｓ １０℃〜９０℃、例えば、２５℃〜７５℃又は３０℃〜６０℃である。
【０１０１】
本発明の工程において、２つ以上の異なる本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素が存在してもよい。通常、各変異体は、異なる基質を酸化し得るし、あるいは、所定の基質を、別の酵素よりも良好に酸化し得るので、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素の混合物を用いることにより、広範にわたる基質を酸化することができる。本発明の工程は、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１酵素、その他のＰ４５０酵素又はそれらの相同体、任意のモノオキシゲナーゼ酵素、及び、所望の合成又は酸化反応において有用な任意のその他の酵素も含んでもよい。
【０１０２】
一実施形態において、本発明の工程は、過酸化水素副生成物を除去し得る物質（例えば、カタラーゼ）の存在下で行われる。別の実施形態において、本発明の工程は、全長酵素又は酵素のヘムドメイン、基質及び酸素原子供与体（例えば、過酸化水素又はｔ−ブチルヒドロペルオキシド）の存在下で、例えば、ペルオキシドシャントを使用することにより、行われる。
【０１０３】
さらなる実施形態において、本発明の工程は、全長酵素又は酵素のヘムドメインのみ、基質及び電気化学セル中の酸素の存在下で行われ、したがって、酸素の活性化及び活性中間体の生成に必要とされる２つの電子は、電極からの直接的電子伝達により又は小分子メディエーターを介して間接的に、電極によって供給される。
【０１０４】
本発明の工程は、細胞内又は細胞外で行ってもよい。細胞は、通常、培養状態で、ある場所に、インビボ又はインプランタ（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）で存在する（これらの態様については以下に記載する）。本発明の工程は、通常、土壌中（例えば、土中）又は水中（例えば、淡水又は海水）等の場所において行われる。本発明の工程が培養中で行われる場合、培養は、通常、異なるタイプの本発明の細胞を、例えば、本発明の異なる変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素を発現する細胞を含む。一般的に、そのような細胞は、同化可能な炭素及び窒素源の存在下で培養される。
【０１０５】
通常、本発明の工程が行われる細胞は、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａ１、又は、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１が天然には存在しないものである。別の実施形態において、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌが天然には存在しない細胞中で、しかし、天然のレベルよりも高いレベルで発現される。この細胞は、１、２、３、４又はそれ以上の異なる本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａ１酵素を生成し得る。これらの変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素は、異なる有機化合物基質、異なる短鎖アルカン又は異なるアルキルベンゼンを酸化し得る。
【０１０６】
この細胞は、原核細胞であっても、真核細胞であってもよく、一般的には、本明細書において記載される任意の細胞又は任意の生物の細胞である。好ましい細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、フラボバクテリア又は真菌細胞（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及び酵母、特に、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））である。また、本発明にしたがい使用することが意図されるのは、ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）及びバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）である。細胞は、その天然の形態で、任意の基質を酸化し得る又は本明細書において記載される任意の酸化生成物を生成し得るものであっても、そうでなくてもよい。通常、細胞は、実質的に単離された形態及び／又は実質的に精製された形態であり、この場合、細胞は、一般的に、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％又は９９％の細胞又は乾燥重量の調製物を含み得る。
【０１０７】
本発明の細胞は、通常、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することにより（すなわち、細胞を形質転換することにより）作製される。ヌクレオチドコードの縮重のため、２つ以上のポリヌクレオチドが各本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素をコードし得ることを理解すべきである。ヌクレオチド配列を特定の細胞又は生物に適合するコドン傾向を示すように改変し得ることも理解すべきである。ベクターは、細胞のゲノム中に組み入れても、染色体外に留まらせていてもよい。細胞は以下に記載される動物又は植物へと成長し得る。通常、ポリヌクレオチドのコード配列は、宿主細胞によってコード配列の発現がもたらされ得る調節配列と、機能的に連結されている。調節配列は、一般的に（通常、モノオキシゲナーゼが発現される細胞の）プロモーターである。
【０１０８】
用語「機能的に連結された」とは、記載された要素が、それらの意図された様式で機能し得る関係にあるように並列させることをいう。コード配列に「機能的に連結された」調節配列は、調節配列と適合し得る条件下でコード配列の発現が達成されるように連結されている。
【０１０９】
ベクターは、通常、トランスポゾン、プラスミド、ウィルス又はファージベクターである。ベクターは、通常、複製開始点を含む。ベクターは、通常、１つ又はそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子、を含む。ベクターは、通常、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン、又はエレクトロポレーション等の従来技術を用いて宿主細胞中に導入される。
【０１１０】
本発明はさらに、その細胞が本発明の細胞のいずれかであるトランスジェニック動物又は植物を提供する。この動物又は植物は、１つ又はそれ以上の変異ＣＹＰ１０２Ａ１遺伝子に関してトランスジェニックである。それらは、かかる遺伝子に関してホモ接合性であっても、ヘテロ接合性であってもよく、それらは、通常、細胞中に一過的に導入されるか、又は、（例えば、ゲノム中に）安定的に組み入れられる。動物は、通常、虫（例えば、ミミズ）又は線虫である。植物又は動物は、適当な細胞（例えば、胚性幹細胞、カルス又は生殖細胞）を形質転換し、必要であれば、細胞の発達を促し、次に、細胞を動物又は植物へと成長させ、必要であれば、その動物又は植物に餌を与えることによって得ることができる。動物又は植物は、有性生殖又は無性生殖（例えば、クローニング）、本発明の動物若しくは植物又はＦｌ生物（あるいは、Ｆｌから除かれた任意の世代、又は、形質転換された細胞から発達させたキメラ）の繁殖によって得ることができる。
【０１１１】
上記したように、本発明の工程は、ある場所において行われ得る。したがって、本発明は、本発明の基質、例えば、短鎖アルカン、アルキルベンゼン又はハロ芳香族化合物、で汚染された場所を処理する方法も提供する。この方法は、本発明の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素、細胞、動物又は植物を、この場所と接触させることを含む。次に、通常、これらの生物を用いて、ハロ芳香族化合物を酸化させる。一実施形態において、この場所を処理するために使用される生物は、この場所に対して天然である。したがって、それらは、（例えば、汚染されている）場所から取得し、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ（及び、任意には、適当な電子伝達還元酵素及び／又はレドキシン）を発現するように（上記の通り）形質転換／トランスフェクトさせてもよい。
【０１１２】
一実施形態において、この場所は、本発明の２つ以上のタイプの生物、例えば、異なる有機化合物基質、例えば、異なる短鎖アルカン、アルキルベンゼン又はハロ芳香族化合物、を酸化する、異なるモノオキシゲナーゼを発現する２つ、３つ、４つ又はそれ以上のタイプの生物を用いて処理される。一実施形態において、かかる生物の一群は、それら同士で、特定のグループの基質、すなわち、汚染領域に存在する短鎖アルカンの全てを酸化することができる。
【０１１３】
（例えば、一群の形態の）生物は、バイオリアクター中で本発明の工程を行い得る（例えば、この場合、生物は固定された形態で存在する）。したがって、処理すべき水又は土壌を、かかるバイオリアクターに通してもよい。土壌は、界面活性剤又はエタノールを添加した水で洗浄してから、バイオリアクター中に導入してもよい。
【０１１４】
スクリーニング法の設計／本発明の変異体の単離
ランダム突然変異誘発及び遺伝子シャッフリングによって作製されたＣＹＰ１０２Ａｌ変異体ライブラリーをスクリーニングするための、今日までに開示されている方法は、インドール（インディゴ形成）及びｐ−ニトロフェノール誘導体（放出されるｐ−ニトロフェノールの検出）等の代替基質を使用する傾向がある。代替基質に対して増大した酸化活性を示す選択された変異体のうちのいくつかは、異なる構造を示す化合物に対しては増大した活性を有するが、生成物選択性の変化はあまり一般的ではないことが分かっている。
【０１１５】
生成物選択性のためのスクリーニングに関しては、ＷＯ２００６１０５０８２が、生成物であるアルコールを、分光的に検出され得る化合物と共役させる方法を開示した。同様に、ＣＹＰ１０２Ａ３によるオクタン酸化における１−オクタノールについての増大した選択性は、デヒドロゲナーゼスクリーニング法においてこの生成物を標的とすることにより得られた（３４）。これらの方法は、調査を選択性へと偏らせ、活性に関してはわずかに増えただけであった。また、特定の標的化合物の形成を促進する変異のみが見つけられ、一方で、広範な化合物に対して異なる、潜在的には所望の様式で生成物選択性に影響を及ぼす部位での変異は明らかにされなかった。
【０１１６】
対照的に、本発明の変異体を単離するために使用されるスクリーニング法は、インドール酸化を介したインディゴ形成に関した変異体のランダムライブラリーのスクリーニング、続く、化学対象の生成物に対しての増大した活性及び選択性の検索、の組み合わせを利用する。したがって、インドール酸化スクリーニングからの最も活性な変異体を、ナフタレン、プロピルベンゼン及びオクタンのインビボ酸化を介してさらにスクリーニングした。生成物をガス−液体クロマトグラフィーによって分析した（実施例の項を参照）。ナフタレンは、インドールよりも疎水性であり、Ｐ４５０の触媒作用において標的とされることが多い炭化水素基質とより密接に似ている。プロピルベンゼンは、ナフタレンよりも小さいが、芳香環の酸化、ベンジルの酸化、及び、２つの活性化されていない脂肪族炭素中心での攻撃の間での競合のため、生成物選択性の変化に関する試験をもたらす。オクタンは、柔軟且つ密集度の低い様々な攻撃を可能にし、酸化のために利用可能な４つの異なるセットのＣ−Ｈ結合を有し、末端及び内部の位置に対する選択性に偏らせる変異を招く。増大した生成物形成率及び／又は変化した生成物プロファイルを有する変異体を、インビトロにおける活性研究に対して選択した。
【０１１７】
この多段階式手法中、初期のインディゴ形成（活性）段階において、約ｌ，５００コロニーをスクリーニングし、この数は、１１の第１世代の変異体の遺伝子シャッフリング後に約８００コロニーに減少させた。これら８００のうちの１３０コロニーを、インビボ基質酸化スクリーニング段階へと供した。これら１３０のうち、５つの変異体をインビトロでのさらなる研究のために選択し、これらの全てが、ナフタレンからペンタンまでの広範な有機化合物に対して増大した活性及び／又は変化した生成物選択性を示した。したがって、本発明の変異体を単離するために使用されるスクリーニング法は、増大した活性及び／又は生成物選択性を有する変異体の効率的な、ストリンジェントな選択を可能にする。変異の探索のためにスクリーニングされた小サイズの初期ライブラリーは、ＣＹＰ１０２Ａｌの変異体の探索のために本発明者等によって用いられた方法が、未だそのポテンシャルを使い果たしていないことをも示唆している。
【０１１８】
これまでに開示されている定向進化技法とのさらなる違いは、インディゴ形成を用いるＣＹＰ１０２Ａｌに対するスクリーニングは、ＣＹＰ１０２Ａｌヘムドメインにおける特定の部位での突然変異誘発（例えば、部位飽和）を含んだのに対して、本発明のスクリーニングは、全長ヘムドメイン遺伝子のランダム突然変異誘発を含むことである。したがって、本発明のスクリーニングは、多くの数の変異体を単離する能力を有している。さらに、部位飽和突然変異誘発を、さらなる有用な変異体を単離するために、本発明にしたがって単離された特定の変異体に対して適用し得ることは明らかである。
【実施例】
【０１１９】
材料及び方法
分析用グレード又はより高い品質の一般的試薬及び化学基質は、Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、又はそれらの子会社から取得した。ＨＰＬＣ品質の溶媒は、Ｒａｔｈｂｕｒｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＵＫ）並びにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＭｅｒｃｋの子会社から取得した。バッファー成分は、Ａｎａｃｈｅｍ，ＵＫから取得した。ＮＡＤＰＨ（四ナトリウム塩）は、Ａｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＭｅｌｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、Ｍｅｌｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、及び関連するバッファーは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから取得した。Ｔａｑ及びＫＯＤポリメラーゼは、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得した。コンピテント及びスーパーコンピテント大腸菌は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから取得した。部位特異的突然変異誘発法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットに記載されるＰＣＲ方法を用いて行った。変異原性のオリゴヌクレオチド中の変化したコドンに隣接する適当な長さのオリゴヌクレオチドは、製造業者の説明書にしたがって設計した。オリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈから取得した。一般的な分子生物学的手法は、文献に記載される方法にしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。全ての変異体の遺伝子は、オックスフォード大学、生化学科の施設のＡＢＩ ３７７ＸＬ Ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ自動配列決定装置で完全に配列決定された。ＵＶ／可視スペクトルアッセイ及び酵素活性アッセイは、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ５０ 分光光度計で３０℃にて行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ ＵｎｉｔｙＰｌｕｓ ５００ＭＨｚスペクトロメーターで取得した。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）は、ＤＢ−１を融合させたシリカキャピラリーカラム及びキャリアーガスとしてのヘリウムを用いる炎イオン化検出装置（ＦＩＤ）を装備した、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ａｎｄ ８０００ Ｔｏｐ装置で行った。注入装置は２００℃又は２５０℃に維持し、ＦＥＤは２５０℃に維持した。
【０１２０】
突然変異誘発、設計、定向進化及びスクリーニング手法
ＳｐｅＩ制限部位を、以下のオリゴヌクレオチド：
5’GCTCATAATACGCCGCTACTAGTGCTATACGGTTCAAATATG-3’（Ｓｐｅｌ制限配列に下線を付した）及びその逆相補配列を用いて、ＣＹＰ１０２Ａｌ遺伝子のｐＧＬＷｌ１ヘムドメインコード領域（１３）の下流に導入し、それにより、残基４８２及び４８３においてサイレント変異を生じた。
【０１２１】
変異性ＰＣＲを、以下の正方向及び逆方向プライマーを用いて、この部位とヘムドメインコード領域の上流のＥｃｏＲＩ部位との間で行った：
5’TCTCGAGAATTCATAATCATCGGAGACGCC-3’（ＥｃｏＲＩ制限配列に下線を付した）；及び、5’-TGGATCCACTAGTAGCGGCGTATTATGAGC-3’（ＳｐｅＩ制限配列に下線を付した）。
【０１２２】
使用したＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＧｅｎｅＭｏｒｐｈプロトコールにしたがい、１，０００ｂｐあたり１〜３個の変異を導入するように設計された条件の下、野生型ＣＹＰ１０２Ａｌ（ＷＴ）及び変異体Ｆ８７Ａテンプレートからライブラリーを構築した。１サイクルあたり、鎖分離を９４℃にて６０秒間、アニーリングを４５℃にて９０秒間、伸長を６８℃にて１１０秒間＋２秒間を３０サイクル行うことにより、遺伝子を増幅させた。ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて小断片をｐＧＬＷｌ１に再び導入して（ＳｐｅＩ ＷＴ変異体）、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞中に形質転換し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレート上で３６時間培養した。
【０１２３】
約１５００のコロニーをスクリーニングした。インディゴ形成を示したもの（Ｇｉｌｌａｍ，Ε．Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２６５，４６９−４７２；Ｌｉ，Ｑ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．６，１５３１−１５３６）を単離し、新しいプレートに移して、配列決定前に疑陽性を最小限にするためにさらに３６時間培養した。次に、対象となり得る１６の新しい変異を表す１１の変異体を、ランダムプライム組み換えによってシャッフルした（Ｓｈａｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，６８１−６８３）。
【０１２４】
ＶｏｌｋｏｖとＡｒｎｏｌｄ（Ｖｏｌｋｏｖ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３２８，４４７−４５６）に示されるプロトコールを、段階９にて改変した。この時、Ｐｆｕポリメラーゼではなく、Ｔａｑ及びＫＯＤポリメラーゼを、２μＬのＭｇＳＯ４と一緒に使用した。ＰＣＲは、ＫＯＤポリメラーゼを用いたが、上記のようにして、アセンブリ鎖で行った。サンプルは、上記の通り、切断して、連結し、プレートに播いた。
【０１２５】
約８００のコロニーのうち、約１３０はインディゴ形成を示した。これらを、５〜１０ｍＬの規模で培養し、ガスクロマトグラフィーを用いて、ナフタレン及びプロピルベンゼンに対するインビボ酸化活性をスクリーニングした。ＷＴと比較して、生成物ピーク面積の最大の増加又は変化した生成物プロファイルを示した１２の変異体について配列決定し、より大規模で培養し、同じ２つの基質に対してスクリーニングした。これらのうち、５つをインビトロ研究のために選択した。
【０１２６】
我々はまた、様々な単一部位変異体と、ランダム突然変異誘発スクリーニング法による５つの変異体とそれらの組み合わせとを調製し、インディゴ形成について、及び、ガスクロマトグラフィーを用いて、ナフタレン、プロピルベンゼン及びオクタンに対する酸化活性について、これらをインビボで調べた。単一部位変異は、Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ、Ｅ２６７Ｖ、Ｉ２６３Ａ、Ａ７４Ｇ、Ｌ１８８Ｑ、Ｍ１７７Ｖ／Ｋ、Ａ３９９Ｐ、Ｉ４０１Ｐ、Ｇ４０２Ｐ、Ｑ４０３Ｐ、Ｖ３０２Ｉ、Ａ２６４Ｇ、Ａ９９Ｔ、Ｓ２７０Ｉ、Ｒ１７９Ｈ、及びＦ８７Ｌ／Ａ／Ｇであった。これらのうちの大部分は、これまでに公知の変異（Ｒ４７、Ｙ５１、Ｉ２６３、Ａ７４、Ｌ１８８、Ｍ１７７、Ａ２６４、Ｆ８７におけるもの）、又は、ランダム突然変異誘発／スクリーニング手法の初期の実施回において我々が見出した変異（Ｅ２６７、Ｖ３０２、Ａ９９、Ｓ２７０、Ｒ１７９におけるもの）である（その変異は、基質の結合に何らかの影響を及ぼし得る構造の位置を基準として、別の実施回に選択した）。Ａ３９９、Ｉ４０１、Ｇ４０２及びＱ４０３におけるプロリン変異は、上記のスクリーニング方法によって選択された５つの変異体のうちの１つであるＡ３３０Ｐ変異体の結晶構造（図２）で観察される構造変化に基づいて選択された。次に、これらの変異体を、増大した活性の証拠のために、インビボスクリーニング方法によってスクリーニングした。
【０１２７】
Ｒ４７Ｌ及びＹ５１Ｆ変異は、それら自体で又はその他の変異と組み合わせて、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ対と同程度の効果は有しなかった。その他の単一部位変異は、インディゴ形成スクリーニングにおいて、異なる効果を示したが、Ｉ４０１Ｐ及びＱ４０３Ｐ単一部位変異体は、インビボ酸化スクリーニングにおいて、野生型と比較して、増大した生成物形成率をし、これらの変異体を調製して、インビトロでそれらの活性について試験した。変異Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ（ＲＬＹＦ）及びＦ８７Ａを、記載されるようにして調製した（１３）。標準的クローニング手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で、ＮｃｏＩ及びＡｆｌＩＩ制限部位を用いて、ＲＬＹＦ対を、変異体ＫＴ２及びＡ３３０Ｐ中に導入した。部位特異的突然変異誘発法によって、Ｆ８７Ａ変異を、ＫＴ２、Ｉ４０１Ｐ、ＲＹＬＦ／Ｉ４０１Ｐ、及びＲＹＬＦ／Ｑ４０３Ｐ変異体に導入した。部位特異的突然変異誘発法によって、Ｉ４０１Ｐ及びＱ４０３Ｐ変異を、ＲＬＹＦ及びＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐ変異体に導入した。
【０１２８】
タンパク質の発現及び精製
対象の変異体を、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を用いて、ｐＥＴ２８ベクター中に移し、その結果、ｐＧＬＷｌ１ベクター中のｔａｃプロモーターと比較して、発現レベルが、Ｔ７プロモーターによって、より厳密に調節され得る。このプラスミドを担持する大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）の３０ｍｌ．Ｌ−１の一晩培養物を、０．４％（ｖ／ｖ）グリセロール及び３０ｍｇ．Ｌ−１のカナマイシンを含むＬＢ培地中に接種し、１８０ｒｐｍで振盪させながら、ＯＤ６００が１より大きくなるまで３７℃にて培養した。タンパク質の発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＰＴＧ）を０．４ｍＭになるまで添加することによって誘導した。温度は３０℃まで下げて、さらに３０℃にて１２時間培養した後、細胞を遠心分離によって回収した。各１Ｌの培養物からの赤褐色のペレットを、ジチオスレイトール中でｐＨ７．４、１ｍＭに緩衝化させた２５ｍＬ ４０ｍＭのリン酸カリウム（リン酸バッファー）中で再び懸濁させた。細胞を超音波処理によって溶解し、細胞残屑を、３７，５００ｇ、３０分間、４℃での遠心分離によって除去した。上清を、リン酸バッファーを用いて予め平衡化したＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＤＥＡＥ高速流セファロースカラム（２００ｘ５０ｍｍ）に充填し、そこからタンパク質を、リン酸バッファー中硫酸アンモニウムの８０−４００ｍＭの直線勾配を用いて溶出させた。赤色のＰ４５０画分を回収して、限外濾過により濃縮し、リン酸バッファーを用いて予め平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを用いて脱塩してから、限外濾過によって再び濃縮した。この溶液を、９，２５０ｇ、５分間、４℃にて遠心分離し、濾過滅菌した。ＦＰＬＣ陰イオン交換精製を、１５ｘリン酸バッファーの０−３０％の直線勾配を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｏｕｒｃｅ−Ｑカラム（１２０ｘ２６ｍｍ）上で行った。Ａ４１８／Ａ２８０＞０．３５である画分を回収して、限外濾過によって濃縮し、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中で−２０℃にて保存する前に、濾過滅菌した。グリセロール及び塩を、５０ｍＭ、ｐＨ７．４のＴｒｉｓバッファーで予め平衡化したＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ５ｍｌ ＰＤ−１０カラムを用いて、実験直前にタンパク質から除去した。
【０１２９】
ＮＡＤＰＨ代謝回転率の測定
ＮＡＤＰＨ代謝回転（ブタン及びプロパンを除く）を、３０℃にて酸化され、ＤＭＳＯ中、１００ｍＭのストックとして添加される０．１又は０．２５μＭの酵素、１２５μｇのウシ肝臓カタラーゼ及び１ｍＭの基質を含む、１２５０μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で行った。タンパク質濃度は、（１３）に記載されるようにして、又は、ＣＯ−示差スペクトルを介して測定した（Ｏｍｕｒａ，Ｔ ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ｒ（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，２３７９−８５）。最終濃度約１６０μＭ又は約３２０μＭ（１又は２ＡＵと等量）となるように、２０ｍｇ．ｍｌ−１ストックとしてＮＡＤＰＨを添加する前に、アッセイを３０℃にて１分間行った。ブタン及びプロパンについての代謝回転の場合、基質を、最低３０分間、氷上で、３０００μＬのＴｒｉｓ中にバブリングさせながら、氷上で、１０００μＬのＴｒｉｓ中に酸素をバブリングさせた。ＣＹＰ１０２Ａｌ（０．２５μＭ）及びカタラーゼ（上記と同じ濃度）を、酸化画分、続いて、基質を飽和させたＴｒｉｓに、ゆっくりと添加した。一杯になったキュベットを迅速に密閉し、数回逆さまにして、１ＡＵのＮＡＤＰＨの添加前に、３０℃にて２分間維持した。
【０１３０】
全ての代謝回転において、３４０ｎｍでの吸光度の減少をモニタリングし、ＮＡＤＰＨ消費率を、ε３４０＝６．２２ｍＭ−１．ｃｍ−１を用いて導いた。正確な結合率の測定を確実に行うために、最大２．５μＭの酵素濃度を使用して、ＷＴ及びＦ８７Ａの代謝回転を、必要な場合には完了するまで、より遅くさせた。少なくとも３つの実験から得られたデータを平均して、±５％以内（芳香族）又は±１０％以内（アルカン並びに２００ｍｉｎ−１以下のＮＡＤＰＨとの全ての代謝回転率）とした。
【０１３１】
生成物分析
ラウリン酸以外の基質に関しては、３μＬの内部標準（ＤＭＳＯ中、１００ｍＭ）を、 ４００μＬの酢酸エチル又はクロロホルム中への抽出前に、１０００μＬの各代謝回転完了物に添加した。遠心分離を、１５００μＬの微小遠心管中で、２１，０００ｇ、３分半行った。真正相当物について観察されるＧＣ溶出時間と照合することにより、生成物を同定した。異性体による一酸化生成物は比較可能な反応を生じ得るという仮定に基づき、ＦＩＤ反応を、以下の表で詳述される各生成物群に対する代表的相当物を用いて較正した。一定範囲の既知濃度の選択された生成物を含有し、ＤＭＳＯ中、１ｍＭであるサンプルを、Ｔｒｉｓ中で調製し、上記のようにして抽出した。導かれた積分ピーク面積は、内部標準のピーク面積の割合として表され、生成物濃度に対してプロットされた。２−メチル−２−フェニル−プロパン−ｌ−オール（これは、商業的に供給され得なかった）を、インビボで生成し、単離して、ＭＳによって同定した：Ｍ１４９．００；及び、１Ｈ ＮＭＲ：ｄ１．３８（６Ｈ，ｓ，ｇｅｍ ジメチル），３．５９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２），７．２４（１Ｈ，ｍ，ｐ−フェニル），７．３４（２Ｈ，ｍ，ｍ−フェニル），７．３７（２Ｈ，ｍ，ｏ−フェニル）。ＣＹＰ１０２Ａｌ及びその変異体によるラウリン酸の酸化に関しては、９９０μＬのインキュベーション混合物を、１０μＬの内部標準溶液（エタノール中、２５ｍＭのデカン酸）及び２μＬの濃ＨＣｌと一緒に混合した。得られた混合物は、４００μＬの酢酸エチルを用いて３回抽出し、有機抽出物を合わせて、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。
【０１３２】
溶媒を窒素流の下で蒸発させ、サンプルを２００μＬのアセトニトリル中に溶解させた。過剰な（２５μＬの）Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド及びトリメチルクロロシラン（ＢＳＴＦＡ＋ＴＭＣＳ，９９：１）を添加し、この混合物を少なくとも１２０分間放置することにより、形成される場合には、カルボン酸グループのトリメチルシリルエステルと、アルコールのトリメチルシリルエーテルとを生成した。反応混合物は、ＧＣ分析のために直接使用した。
【０１３３】
【表１】
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
結果
強化された活性及び変化したインビボでの生成物選択性の両方に関してスクリーニングされたランダム突然変異誘発によって作製された変異体において、５つの特定の変異体がインビトロの試験のために選択された。これらは、以下であった：
（ｉ） Ａ３３０Ｐ
（ｉｉ） Ａ１９１Ｔ／Ｎ２３９Ｈ／Ｉ２５９Ｖ／Ａ２７６Ｔ／Ｌ３５３Ｉ （変異体ＫＴ２）
（ｉｉｉ） Ｆ８７Ａ／Ｈ１７１Ｌ／Ｑ３０７Ｈ／Ｎ３１９Ｙ （変異体 ＫＳＫ１９）
（ｉｖ） Ｆ８７Ａ／Ａ３３０Ｐ／Ｅ３７７Ａ／Ｄ４２５Ｎ （変異体 ＫＴ５）
（ｖ） Ｆ８７Ａ／Ａ１１７Ｖ／Ｅ１３１Ｄ／Ｌ２１５Ｉ （変異体 ＬＯ２５）
【０１３６】
全ての５つの変異体は容易に発現され、標準的な手法によって精製された（１３）。５０％ ｖ／ｖのグリセロール中、−２０℃での保存において、少なくとも１５ヶ月の間、不活性な“Ｐ４２０”が生成した証拠は何ら示されなかった。変異体ＬＯ２５は、その他の４つの変異体と比べてあまり研究されていないが、これら５つの初期変異体において最も高い活性およびダマスコン／イオノンクラスの分子に関する選択性を有しており、例えば、８６％のヒドロキシダマスコン生成物を形成する。Ａ３３ＯＰ、ＫＴ２、ＫＳＫ１９、およびＫＴ５の活性を、広範な基質を用いてアッセイした。これらのうちのいくつかに関するデータを、表１〜２０中に示す。そこにおいて、ＮＡＤＰＨの酸化および生成物の形成速度（ＰＦＲ）がｎｍｏｌ（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１ｍｉｎ−１の単位で示され、以下、文中ではｍｉｎ−１と略される。結合効率は、消費されたＮＡＤＰＨに基づく生成物の収率であり、パーセンテージで示され、る。いくつかの場合においては、ＮＯ２００２０３８０中に開示されたＡ７４Ｇ／Ｆ８７Ｖ／Ｌ１８８Ｑ（ＧＶＱ）変異体と、触媒パラメーターを比較している。
【０１３７】
本発明の４つの変異体（Ａ３３０Ｐ、ＫＴ２、ＫＴ５、ＫＳＫ１９）は、ナフタレン（３．１ｍｉｎ−１）によるＷＴのＰＦＲを少なくとも大幅に増大させ、Ａ３３０Ｐは最も効果的であり、１５５ｍｉｎ−１であったが、ＧＶＱ変異体（表１）により記録される４８７ｍｉｎ−１とはいずれも合致しなかった。全ての場合において、１−ナフトールが、唯一のＧＣで検出可能な生成物であった（２３）。
【０１３８】
ＷＴは、６０６ｍｉｎ−１において、プロピルベンゼンに対して顕著に活性であり７０％の結合であった。本発明における４つの変異体のうちの３つは、ＧＶＱ変異体（９４３ｍｉｎ−１）と同様のＰＦＲを有し、一方、４つめのＫＴ２は、顕著に大きい２２０５ｍｉｎ−１を有していた（表２）。ＷＴ及びＫＴ２は９９％以上の１−フェニル−１−プロパノール収率を得たが、その他の新たな変異体は、活性化ベンジル位から離れた酸化を導いた。変異体Ａ３３０Ｐは、ＣＹＰ１０２Ａ１の代謝回転において先に報告されている生成物のタイプではない３０％のオルト−フェノールを与え、一方、変異Ｆ８７ＡおよびＡ３３０Ｐの組み合わせを有する変異体ＫＴ５は、８０％の１−フェニル−２−プロパノールを与えた。変異Ｆ８７Ａは、１−フェニル−２−プロパノールの生成を促進することが知られているが、単独で作用する場合には、わずか５４％の収率であった（４６）。
【０１３９】
生成物形成速度をさらに上昇させるために、いくつかの基質（１３，１４，１７）に対するＣＹＰ１０２Ａ１活性を増大させることが示されているＲ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ（ＲＬＹＦ）対を、変異体Ａ３３０ＰおよびＫＴ２へと取り込ませた。得られた２つの非常に活性な第二世代の変異体は、ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐであった。単独部位変異も、ヘム表面ならびに活性部位の周辺の各種の残基へと導入され、これらはまた、第一ラウンドで同定された前記５つの変異体と組み合わされた。これら第二世代の変異体の活性を、インディゴ形成およびインビボ酸化スクリーニング手法によりスクリーニングした。Ｉ４０１ＰおよびＱ４０３Ｐ変異体を、インビボ酸化手法から得られる新たな変異体として見込みがあるものとして同定し、それらを調製した。組み合わせ変異体Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ、Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１ＰおよびＲ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐも調製した。
【０１４０】
ＲＬＹＦ／ＫＴ２は、４９６ｍｉｎ−１でナフタレン代謝回転におけるＧＶＱ変異体のＰＦＲに匹敵し、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、６６６ｍｉｎ−１で、３５％程度上回り、一方、Ｉ４０１Ｐは１１８３ｍｉｎ−１で、依然としてさらに活性であった。Ｑ４０３Ｐは１２１ｍｉｎ−１のＰＦＲおよび２５％の結合を示し、それらは変異体ＫＴ２の値と同様であった。プロピルベンゼンにおけるＲＬＹＦ／ＫＴ２のＰＦＲは２６８８ｍｉｎ−１で、ＫＴ２に対し２２％向上した。この速度は、天然基質（４７）におけるＷＴに関し報告されていた値に接近するもので、一方、Ｉ４０１Ｐは３５７８ｍｉｎ−１で、天然基質に対する値を上回った。生成物のプロファイルは、第一世代の変異体に対してほとんど変化がなかったが、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、いくらかのｐ−プロピルフェノールを与えた（表２）。また、Ｆ８７Ａ指向生成物プロファイルを高い割合で得るために、ＫＴ２を変異Ｆ８７Ａと組み合わせた。変異体Ｆ８７Ａを伴う系列において、変異体Ｆ８７Ａ／ＫＴ２は、プロピルベンゼンを酸化して、ほぼ等量の１−フェニル−１−プロパノールおよび１−フェニル−２−プロパノールとしたが、Ｆ８７Ａに関する２４１ｍｉｎ−１に対し、５６６ｍｉｎ−１のＰＦＲであった。その他のアルキルベンゼンも、ＷＴ ＣＹＰ１０２Ａ１および新たな変異体に対する基質として試験した。トルエンに関し、特にＲＬＹＦ／ＫＴ２、ＲＬＹＦ／Ａ３３０ＰおよびＩ４０１Ｐにおいて、劇的な活性強化が観察された（表３）。Ｑ４０３Ｐ変異体の効果は、変異体ＫＴ２のそれと再び同様であった。生成物形成速度が最も早い変異体より、低い速度で行われる変異体に関してではあるが、大きな選択性のシフトも明白であった。ＷＴ ＣＹＰ１０２Ａ１は、トルエンを主にｏ−クレゾールへと酸化した（９８％）。この環の酸化は予期せぬことであった、なぜなら、ベンジル性のＣ−Ｈ結合は高度に活性であるからである。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のＷＴ ＣＹＰ１０１Ａ１は、ベンジル位を攻撃して９５％を上回るベンジルアルコールを形成した。変異体ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、６０〜１８９ｍｉｎ−１の係数でＰＥＦを増加させ、結合効率は９％から５２％へと上昇、一方で側鎖の酸化は最小限に保たれていた。Ｉ４０１Ｐ変異の付加は、活性において別の増加を与え、ＮＡＤＰＨおよび基質の酸化速度は３７３２ｍｉｎ−１および１８２４ｍｉｎ−１にそれぞれ増加した。とりわけ、４９％という結合効率は、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐのそれ（５２％）およびＡ３３０Ｐ変異体（４５％）のそれから大きく変化せず、Ｉ４０１Ｐ変異の主たる効果がＮＡＤＰＨ代謝回転速度の増大であることを示唆した。その他の示された変異体は共に、代謝回転活性および選択性を増大させ、例えば、変異体Ｆ８７Ａ／ＫＴ２は４８％のベンジルアルコールを与え、一方、変異体ＫＴ５は収率９５％のベンジルアルコールおよびちょうど５％のｏ−クレゾールを与えた（表３）。
【０１４１】
ＮＡＤＰＨの速度および結合は、通常、プロピルベンゼンよりもブチルベンゼンにおいて低く、ＷＴおよび最も速度が速い変異体であるＲＬＹＦ／ＫＴ２に関し、２２９ｍｉｎ−１および１６７０ｍｉｎ−１のＰＦＲが記録されている（表４）。ヒドロキシル化は、ＷＴ−ＲＬＹＦ／ＫＴ２のサブグループ内であってさえ、ベンジルのみに起こるのでは何らなく、〜１０％程度は側鎖の隣の２つの位置で起こる。ほとんどのその他の特異性変化は、プロピルベンゼンについて観察されるものと酷似していた。Ｆ８７Ａ変異体は非ベンジル位置における酸化を増加（ＫＴ５では８０％程度）させ、一方、変異体Ｆ８７Ｌ／ＫＴ２はｏ−ブチルフェノールの十分量（３２％）を形成した。しかしながら、Ａ３３０Ｐは、特にＲＬＹＦとの組み合わせた場合に、ｐ−ブチルフェノールの形成を指向し（２６％）、一方でベンジル位の酸化レベルは１０〜１３％程度に低減された。
【０１４２】
ほとんどの変異体に関し、ｔ−ブチルベンゼンによるＮＡＤＰＨ代謝回転速度は、ブチルベンゼンに対するそれらと調和していたが、結合のレベルは、Ｆ８７Ａ変異体の場合を除き、大幅に減少していた（表５）。ＧＶＱ変異体である、Ｆ８７Ａ／ＫＴ２およびＫＳＫｌ９は、全てＷＴに対し２桁強度でＰＦＲが向上し、最も高い速度は、新たな変異体であるＦ８７Ａ７ＫＴ２において与えられ、ＷＴの２．４ｍｉｎ−１に対し、２３４−１であった。Ｆ８７ＡおよびＦ８７Ｖ変異体は、側鎖における非活性のＣ−Ｈ結合において専ら酸化を行い、従来の方法では合成しにくい２−メチル−２−フェニル−１−プロパノールを得た。ＷＴおよびその他の変異体により形成される生成物の主たるものはフェノール性で、オルト−ヒドロキシル化よりもパラ−ヒドロキシル化を伴うが、Ａ３３０Ｐ変異は芳香性の酸化の傾向を増大させ、生成物をさらにパラ−フェノールへとシフトさせた。
【０１４３】
エチルベンゼン（表６）により、本発明の変異体は、通常、ＷＴ（６０ｍｉｎ−１）を超える強化された活性を示した。最も速度が速い変異体であるＲＬＹＦ／ＫＴ２は、１０９８ｍｉｎ−１のＰＦＲを示した。ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐはまた、高いＰＦＲ（１０６２ｍｉｎ−１）を与え、これは、部分的には、Ａ３３０Ｐ変異体がＷＴよりもエチルベンゼンに良好に結合する（２８％に対し５５〜６２％）ためである。変異体の結合速度は、対照的に、ＷＴのそれよりも低値（２２〜３０％）に留まる。ＷＴは再び、プロピルベンゼンの代謝回転よりもベンジル位に対する低い特異性を示し、１０％のｏ−エチルフェノールを形成する。Ａ３３０Ｐを含有する変異体は、この生成物をより高いパーセンテージ（２１〜２７％）で形成し、一方、ＫＳＫ１９およびＧＶＱ等のＦ８７ＡおよびＦ８７Ｖ変異体は、生成物混合物からそれを無くさせ、１００％の１−フェニルエタノールを得た。ＫＴ５の代謝回転は、少量の２つのその他の生成物：２−フェニルエタノールおよびスチレンを産生した。前者は、活性化されていないエチル置換基のＣ−Ｈ一次結合における酸化から生じる。一方、後者は、ＣＹＰ１０２Ａ１により触媒される単純炭化水素の脱水素に関する発明者らの知識に対しては初めての観察結果である。
【０１４４】
活性化ベンジル性炭素の隣のメチル基における周辺攻撃は、達成されにくい、なぜなら、もしこれらの２つのタイプの結合が同じ距離に存在し、同程度にＰ４５０フェリ中間体へと接近可能であったとすると、より多くの活性化Ｃ−Ｈ結合が、より迅速に攻撃を受けるからである。すなわち、ＫＴ５は、ベンジル性Ｃ−Ｈ結合よりもメチルＣ−Ｈ結合の方を、よりフェリの近くへと配置させる方向で、エチルベンゼンと結合し得る。脱水素反応において、フェリ中間体は、水素原子を取り去ってＦｅＩＶ中間体を形成し、次いで、基質ラジカルは、ＦｅＩＶ部分に由来するヒドロキシラジカルと組み合わさることによって崩壊するかわりに、基質から第二の水素を取り去って、アルケンおよび水を形成する。哺乳類のＰ４５０酵素による３−メチルインドールの脱水素は１９９６年に初めて報告され、以来、これがインドール、カプサイシン、および薬物のヒトＰ４５０酵素による脱水素（４８−５２）へと拡張してきた。ＣＹＰ１０２Ａ１による脱水素を経由した、ニフェジピンの芳香族化が報告されている（５３）。しかしながら、この反応は、２つの非局在化芳香族系の形成によって引き起こされる。
【０１４５】
天然の炭化水素であるｐ−シメン（４−イソプロピルトルエン）は、それが４つのフレーバー化合物の前駆体であるため、興味深い基質である。ＷＴは、８２％のｐ−α，α−トリメチルベンジルアルコールを与え、それはイソプロピル側鎖のメチンＣ−Ｈ結合が酸化されて生じる。少量の２つの可能性がある芳香族ヒドロキシル化生成物である、チモール（３％）およびカルバクロール（７％）、および、わずか２％の４−イソプロピルベンジルアルコールが見出されている。対照的に、変異体Ａ３３０Ｐは１９％のチモール、１７％のカルバクロール、２２％の４−イソプロピルベンジルアルコール、およびわずか３７％の７−α，α−トリメチルベンジルアルコール（表７）を形成した。Ｆ８７Ｌ／ＫＴ２は、７４％の４−イソプロピルベンジルアルコールおよび２１％のカルバクロールを、通常的な主要生成物であるｐ−α，α−トリメチルベンジルアルコールをわずか５％の生成物混合物として伴って与えた。変異体ＫＳＫ１９において活性の促進が観察され、ＷＴの１６８ｍｉｎ−１に対して１４４２ｍｉｎ−１のＰＦＲが得られた。イソプロピル環の置換基における脱水素を介して、ｐ−α−ジメチルスチレンが形成された。さらに、いったん形成されると、この化合物はこの酵素の基質でもあり、少量（総生成物の１〜３％）の相当するスチレンオキシドが観察される。Ｆ８７Ａ−およびＦ８７Ｖ−含有変異体は、フェノールの形成を最小化するか、または完全になくしたが、顕著な量（＞２０％）のｐ−α−ジメチルスチレンを与えた。
【０１４６】
本発明の変異体は、クメン酸化活性の増加を示した。単独部位変異体のＡ３３０ＰおよびＱ４０３Ｐ、およびＫＳＫ１９変異体は、野生型を超える、同様の強化された活性を示し、それは主として、増加ＫＴ５変異体に関するものよりも高いＮＡＤＰＨの代謝回転速度の増加に起因する。ＷＴは、ほとんどはベンジル性酸化生成物を生じたが、ＫＴ５は、脱水素から２７％の１−メチルスチレンを生じ、また、さらなる酸化から、１％のスチレンオキシド生成物を生じた（表８ａ）。結果は、アルキル置換基における２位の一次Ｃ−Ｈ結合を伴う芳香族化合物は、脱水素を引き起こすことを示す。この反応経路は、例えば、エチルアニソールからのビニルアニソールの調製等のポリマーへの前駆体である置換されたスチレンの合成方法の基礎を形成し得る。
【０１４７】
ＫＴ２およびＡ３３０Ｐは、特にＲＬＹＦと組み合わせた場合に、野生型に比べ、短鎖アルカンに対する非常に強化された活性を示した（表９〜１３）。Ｉ４０１Ｐ変異体も、高度に活性であることがわかった。ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、ペンタンに対し同様の生成物形成を示し（それぞれ、１２０６ｍｉｎ−１および１１８３ｍｉｎ−１、結合効率６０％および６７％に基づく）、それらはＷＴのものの７５倍であった。これらの変異体における結合効率の向上は重要であり、なぜなら、それらは、活性部位のトポロジーおよび基質の間のマッチングを大いに向上させることを示すからである。
【０１４８】
これらの変異体における高い活性は、３−メチルペンタン（全て、ＷＴに関する２０ｍｉｎ−１に対して１０００ｍｉｎ−１を上回る、表１０）、２−メチルブタン（ＷＴに関する５１ｍｉｎ−１に対して、ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐの両方で１０００ｍｉｎ−１を上回る、Ｉ４０１Ｐではより低い活性で７２１ｍｉｎ−１、表１１）、およびブタンを通じて維持されていた。Ｉ４０１Ｐ変異は、それ自体で主としてＮＡＤＰＨの代謝回転速度を増加させ、およびＲＬＹＦ対と良好に組み合わされて、３−メチルペンタンの酸化に関するＰＦＲを２９８０ｍｉｎ−１へと上昇させた。一方、三重変異体のＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、プロパンに対し、ＲＬＹＦ／ＫＴ２と比べて顕著に良好な結合を示し、２−プロパノールを５．８ｍｉｎ−１に対し４６ｍｉｎ−１で形成した。Ｉ４０１Ｐ変異の追加は、ＮＡＤＰＨの代謝回転速度を増加させ、結合における中程度の増加を伴い、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐ変異体に関するプロパン酸化について、４３０ｍｉｎ−１のＰＦＲをもたらした。これらの速度は、先に報告されたＣＹＰ１０２Ａ１変異体９−１０Ａ、１−１２Ｇおよび５３−５Ｈ、それに次ぐ世代の１３−１５変異を個々に含むアルカンヒドロキシラーゼ（３０，３１）に関する２３ｍｉｎ−１、１６０ｍｉｎ−１および３７０ｍｉｎ−１に匹敵する。比較として使用したＧＶＱ変異体は、プロパンに関しＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐよりも高いＮＡＤＰＨ代謝回転速度（１８０ｍｉｎ−１に対し４００ｍｉｎ−１）を与えた。我々が気づいている限りで、この基質によるその向上は報告されていない。しかしながら、結合は、ＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐの２１％に対し、わずか０．７％であった。このことは、研究された基質の範囲にわたり、どのようにＡ３３０ＰおよびＫＴ２がＧＶＱと比較されかに関する、大きな特徴的な例である。これら２つの変異体におけるＮＡＤＰＨの速度はしばしば、より低いことが多く、全体的な生成物の形成は、一般的に、より効率的な結合を行うために、より高い。この特性が主として代謝回転速度を増加させるＩ４０１Ｐ変異と組み合わされた場合、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐ等の得られた変異体は、一定範囲の非天然基質に関し、野生型を超える通常では考えられない活性の増加を達成することができる。
【０１４９】
アルカンの鎖長が長くなるほど、ほとんどの変異体について基質はより乏しくなり、ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＲＬＹＦ／Ａ３３０Ｐは、オクタンについて、ＷＴの５３ｍｉｎ−１に対し、それぞれ２４６ｍｉｎ−１および２３０ｍｉｎ−１のＰＦＲを与えた（表１３）。Ｑ４０３Ｐは、野生型を２倍超える中程度活性の増加を示し、１０４ｍｉｎ−１のＰＦＲを与え、一方、Ｉ４０１Ｐはより活性が高く、７０９ｍｉｎ−１であった。ＲＬＹＦ／ＫＴ２およびＩ４０１Ｐは野生型と同様の生成物選択性を示したが、変異体Ａ３３０Ｐは、−および４−オクタノール（３１，５４）を費やした場合の２−オクタノール形成が顕著に増大した（ＷＴに関する１５％に比較して５３％、表１３）。末端位置におけるアルカンの指向性酸化の効果は、直接的なアルカンの酸化を介して末端アルコールを合成するための全体的な研究においてその他の変異を組み合わせる際の資産として有用である。
【０１５０】
本発明の変異体はまた、１，４−ジクロロベンゼン（１，４−ＤＣＢ）により例示されるような塩素化した芳香族化合物の酸化に関する活性の増加を示した。この増加は主としてより高いＮＡＤＰＨ代謝回転活性に起因し、一方で、結合はＷＴよりもさほど高まらない。最も高い結合はＡ３３０Ｐ変異体における１５％であった（表１４）。ガスクロマトグラフィーにおいては、１つの生成物のみが検出されたが、用いた条件下ではこれが２，４−または２，５−ジクロロフェノールのいずれであるかは決定できなかった。塩素化されたベンゼン および芳香性酸化に関する本発明の変異体の効率が結果として示された。
【０１５１】
我々は、ＷＴのＣＹＰ１０２Ａ１およびＦ８７Ａ等の変異体によるセスキテルペンのバレンセンの酸化を先に報告している（１４）。その酵素は、ヌートカトール、ヌートカトンおよびエポキシ化生成物を含む多数の生成物を形成した。Ｆ８７Ａ変異は、生成物選択性をわずかにヌートカトンへとシフトさせることが示された（約２０％）。比較として、変異体ＫＳＫｌ１９は、バレンセンの酸化速度をＷＴに対し３０倍に高めた（表１５）。より重大には、それはグレープフルーツフレーバーであるヌートカトンの産生を変異体Ｆ８７Ａに対し２倍にした。変異体Ｆ８７Ａ／ＫＴ２およびＫＴ５は、ヌートカトンの産生を〜３０％増加させ、Ｆ８７Ａそれ自体を超えてＰＦＲを増大させた。
【０１５２】
ＷＯ００３１２７３は、ＣＹＰ１０２Ａ１によるモノテルペンの酸化を開示した。この新たな変異体は、ＷＴおよび先に報告された変異体よりも高い活性を示した。この新たな変異体の触媒活性を、Ｒ−およびＳ−リモネンの酸化に関し、ＷＴのそれらと比較した（表１６；１６ａ）。形成される２つのエナンチオマーは、両酵素により異なる生成物を生成したが、代謝回転活性および結合は非常に近いことは特筆すべきであり、ＣＹＰ１０２Ａ１基質ポケットの非対称構造が立証された。リモネンの酸化活性は全ての変異体で増加しており、Ｑ４０３Ｐ、Ｉ４０１ＰおよびＲ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ三重変異体は、野生型ＣＹＰ１０２Ａ１による脂肪酸天然基質（ラウリル酸）の酸化に関し、同程度または、より高い活性を示した（１４３９ｍｉｎ−１、表２０参照）。再度、これらの変異体は、野生型と同様の生成物選択性を示し、主としてカルベオールを形成し、一方、Ａ３３０Ｐ−およびＦ８７Ａ−含有変異は、主たる生成物であるイソピペリテノールに関する選択性の変化を有していた。ＫＴ２およびＩ４０１Ｐの両方が一般的な加速因子変異として機能することも明白である。（＋）−α−ピネンについて、ＷＴは活性をほとんど有さなかったが、 Ｆ８７Ａ／ＫＴ２変異体は２０６ｍｉｎ−１のＰＦＲを有し、およびベルベノールに対する生成物選択性が変化した（表１７）。Ｆ８７Ｇ変異を導入することの効果は、興味深い。主たる生成物としてベルベノールを維持した場合に、Ｉ４０１ＰおよびＦ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ変異体はより活性であった。Ｉ４０１ＰとＲ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ対との組み合わせは、ＰＦＲを１１４６ｍｉｎ−１まで上昇させたが、その生成物は５６．５％までｃｉｓ−ｌ，２−オキシドに変化し、Ａ３３０Ｐ変異によって選択性の傾向はさらに強化された。
【０１５３】
フルオレンは、ナフタレンよりも、より立体的に厳しい基質であり、インビボスクリーニング手法において用いた。Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆの組み合わせは、活性をわずかに上昇させ、Ａ３３０Ｐ変異の追加はＮＡＤＰＨの代謝回転速度を５１０ｍｉｎ−１に増加させたが、結合効率は低かった（表１８）。Ｑ４０３ＰおよびＩ４０１Ｐ変異はより顕著な効果を有し、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐの組み合わせは特に活性で、野生型の０．１ｍｉｎ−１に対し５８２ｍｉｎ−１のＰＦＲを示した。イオノンクラスの化合物は、フレーバー化合物の前駆体である。表１９に野生型およびいくつかの新たな変異体のβ−イオノン酸化活性を示し、Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ等の組み合わせ変異体における有望な活性の増加が強調される。
【０１５４】
ラウリル酸（ドデカノイル酸）は、ＣＹＰ１０２Ａ１が認識する天然基質で、２７７７ｍｉｎ−１のＮＡＤＰＨの代謝回転速度および１４３９ｍｉｎ−１のＰＦＲを伴う。Ａ３３０Ｐ変異により誘導される構造的な摂動は、事実上ＣＹＰ１０２Ａ１によるラウリル酸の酸化を廃止させ、一方、Ｉ４０１Ｐ変異はＮＡＤＰＨの代謝回転速度を増大させ、結合効率は維持して、天然基質の酸化に関し、野生型より４０％以上、変異体の活性を高めることに導いた。明らかに最初の電子伝達の速度は増加し、このことは、この変異体におけるプロセスに関する、酸化還元電位、ヘムのスピン状態、および再組織化エネルギーの変化を示唆する。Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｉ４０１Ｐ変異体は、より高いＮＡＤＰＨの代謝回転速度を示しさえしたが、結合は低下し、これは多分、Ｒ４７およびＹ５１側鎖が炭化水素アンカーのためには適用可能ではなく、結合およびそれによる結合が変化したためであろうと思われる。Ｆ８７Ａ変異はラウリル酸を酸化してサブターミナルな炭素へと変化させることが知られており、Ｉ４０１Ｐ変異は、Ｆ８７Ａ変異の選択性変更効果を維持しながら、活性を増加させた。
【０１５５】
これらの知見は、先行技術の顕著な集合にもかかわらず、ＣＹＰ１０２Ａ１系が依然として、定向進化および部位特異的突然変異誘発法の応用に関して、向上した活性および生成物選択性を有する変異体が特徴付けられ得る余地（ｆｅｒｔｉｌｅ ｇｒｏｕｎｄ）を残していることを示す。本発明の全ての変異体は、発明者らの知見が先に開示していない数多くの変異を含む。
【０１５６】
Ａ３３０Ｐ変異は、広範な化合物に対する活性増大という需要の多い効果を有し、一方、それ自体で、ならびに別の選択性変更変異（Ｆ８７Ａ）と組み合わせたときに、生成物プロファイルを変化させる。一方、Ｉ４０１Ｐは、選択性における影響はほとんどない一般的な速度加速因子として機能する。Ｉ４０１は、ヘムに近接したβバルジ上に存在し、電子伝達に影響を及ぼし得る。Ａ３３０Ｐは、定向進化生成物ではありそうになく、知られているような残基を変化させて協調させて集めたものというよりも、単独点変異に由来する孤立性の置換におけるその有効性に頼っていると思われる。プロリンは、β鎖の末端における基質接触残基である３２９位に存在するプロリンの横に、直接的に導入される。結果として生じるバックボーンの柔軟性減少が結晶構造から予測され（図２）、活性部位ポケットがくびれさせられて基質結合がよりタイトになり、活性が強化されることが予測される。この説明は、観察される通常的でない、かつ可能性として有用な選択性効果と合致し、ＷＴよりも活性部位ポケットがより広く開いているＦ８７Ａによってもたらされる効果においては、通常逆となる。ＣＹＰ１０２Ａ１において、または、実際にその他の酵素系の設計変更において、隣接するプロリン残基の配列が各所に配置されているかどうかを調べることは興味深いであろう。
【０１５７】
Ａ３３０Ｐ変異体の結晶構造が得られ、これを図２に示す。この変異体のＣａｌｐｈａの位置は野生型のそれと広く重ね合わせることができたが、位置３２８、３２９および３３０における顕著な再配置が存在した。図２に示すように、導入されたＡ３３０Ｐ変異は、基質結合ポケットに対するＰｒｏ３２９の環における劇的なシフトを誘導し、活性部位の体積を減らし、かつ、重要な領域における基質アクセスチャンネルを制限した。これらの構造変化が、Ｐｒｏ３２９環が基質ポケットの方向へと突出することに起因する、非天然基質の結合増大や、生成物選択性の変化等の、Ａ３３０Ｐ変異で観察される通常的でない効果のほとんどをもたらすと考えられる。しかしながら、それらはヘリックス等の二次構造要素の終結停止をもたらすことはない。
【０１５８】
これらの予期せぬ知見に基づいて、プロリン等のかさの大きい残基を取り込むことを介したループ領域の再編成に関する可能性をさらに調べた。具体的には、近位のヘムリガンドのＣｙｓ４００を提供するＡｌａ３９９−Ｇｌｎ４０３ループ中でプロリン置換を実行した。Ａｒｇ３９８は静電的相互作用および水素結合相互作用に関与し、タンパク質の折り畳みを安定化するのに重要であると考えられ、一方、Ｇｌｎ４０３を越えたところにある残基は、多分、何らかの影響を及ぼすには、ヘムからあまりに離れていると考えられる。探索された変異は、したがって、Ａ３９９Ｐ、Ｉ４０１Ｐ、Ｇ４０２ＰおよびＱ４０３Ｐであった。実施例の項に示すように、Ｉ４０１ＰおよびＱ４０３Ｐの両方は、酵素活性に対し顕著な強化をもたらした。
【０１５９】
例えばＦｅ−Ｓの距離を変化させてＦｅ−Ｓ結合相互作用の強度を変化させるように、残基４０１および４０３をプロリンへと変異させることは、近位のループにおける構造的変化を誘導し得る。このことは、ヘム鉄がより容易に還元されるように導き得、電子伝達への再組織化エネルギーを低め、触媒サイクル中で、ヘム鉄が容易にポルフィリン環における平面へと移動できるようになる。
【０１６０】
プロリン等のかさの大きい残基を取り込むことを介したＣＹＰ１０２Ａ１におけるループ領域の再編成は、顕著であり特異的な構造メカニズムであり、本発明のＡ３３０Ｐ、Ｉ４０１ＰおよびＱ４０３Ｐ置換変異体に対し共通である。
【０１６１】
その中にＡ３３０ＰおよびＦ８７Ａが共に生じている変異体ＫＴ５は、Ａ３３０ＰよりもＦ８７Ａにおける選択性変化特徴を促す。しかしながら、関与されるその変化は、その他のＦ８７Ａ含有変異体によりもたらされるものよりも顕著であり得（例えば、トルエンから、Ｆ８７Ａ／ＫＴ２での４８％、Ｆ８７Ａでの２３％、および、ＷＴでの２％に対し、９５％のベンジルアルコールを生じる）、かつ、しばしば生成物形成速度は増大し、一定範囲の補完的可能性を創出する。そのことは、Ａ３３０Ｐを、Ａ２６４Ｇ、Ａ８２ＬおよびＡ３２８Ｖ等のその他の公知の選択性指向変異とどのように組み合わせるかを考えるために興味深い。
【０１６２】
変異体ＫＴ２（Ａ１９１Ｔ／Ｎ２３９Ｈ／Ｉ２５９Ｖ／Ａ２７６Ｔ／Ｌ３５３Ｉ）およびＦ８７Ａ／ＫＴ２は、ＷＴおよび変異体Ｆ８７Ａのそれとそれぞれ似通った生成物プロファイルを与えた。同様に、Ｉ４０１Ｐは野生型の場合と同一の生成物を生じる一定範囲の基質に関する速度を加速させた。したがって、ＫＴ２およびＩ４０１Ｐは、加速因子として機能する。ＫＴ２における部分変異Ｎ２３９Ｈおよび１２５９Ｖは先に報告されている（５５）。しかしながら、変異体ＫＳＫ１９は、初期のＦ８７Ａを含み、Ｆ８７Ａ／ＫＴ２と同様の選択性パターンを有し、わずか３個のその他の変異を含んでいるにもかかわらず、一定範囲の基質にわたり、やや高まった活性を有する。このことは、Ｆ８７Ａを含まないＫＳＫ１９の誘導体は、それが調製されたときに、加速因子としてＫＴ２よりも可能性があると示され得ることを示唆する。
【０１６３】
ＫＴ２およびＫＳＫ１９において速度を加速させる因子として作用すると思われる変異（Ｈ１７１Ｌ、Ａ１９１Ｔ、Ｎ２３９Ｈ、Ｉ２５９Ｖ、Ａ２７６Ｔ、Ｑ３０７Ｈ、Ｎ３１９ＹおよびＬ３５３Ｉ）のうち、Ｇｌｎ３０７およびＡｓｎ３１９（図１）は、レダクターゼドメインに対するドッキング部位であり、そこからヘムドメインが電子を受け取ると考えられる領域に対し接近して存在し（５６）、電子伝達動力学に影響を与え得ると考えられる。Ｌｅｕ３５３は基質アクセルチャネル残基であるＭｅｔ３５４，のとなりに位置し、一方、アクセルチャネルの外縁上に配置されるＡｌａ１９１はパルミチンが結合した場合に顕著に動かされ（５７）、かつ、基質の誘致および／または捕捉に役割を果たし得る。残る４つの変異（Ｈｉｓ１７１、Ａｓｎ２３９、Ｉｌｅ２５９、Ａｌａ２７６）は、タンパク質表面上に、または接近して存在し、それらが機能する詳細なメカニズムは依然として解明されていない。少なくとも、変異のうちのいくつかは、ＣＹＰ１０２Ａ１の構造におけるそれらの状況に関して合理性を有し得ると推測される。Ｐ４５０酵素の代謝回転活性は、触媒サイクルを開始する最初の電子伝達ステップにより速度制限されている。電子伝達反応の速度は一般にマーカス理論で議論され、この理論は、電子伝達に対する活性化エネルギーは熱力学的駆動力（反応の自由エネルギー変化）および再組織化エネルギー（反応物の状態を変化させて生成物の状態へと近づけるために必要とされるエネルギー入力）に依存するということを述べている。基質の結合は、ヘムの電子的特性を変化させることにより、主要な役割を担い、ほとんどの場合、ヘム鉄に対する６番目のリガンドが外れ、従って、反応熱力学がより好都合になり（より高い駆動力）、電子伝達に関する再組織化エネルギー障壁がより低くなる（より少ない反応物の状態を変形させる必要がより少なくなる）（５８）。例えば、活性部位の置換などにより、活性部位の構造が変化すれば、非天然基質の結合は促進され、より迅速な基質の酸化が見られるようになる。
【０１６４】
基質結合（および、すなわちヘムの電子特性）を変化させるための別のメカニズムは、基質ポケット周辺の二次構造要素における変化の導入であり得る。Ｐ４５０酵素において、基質ポケットは、通常、ＢおよびＢ’ヘリックス、ＢＣループ、Ｆ／Ｇループ、ＧヘリックスおよびＩヘリックスに由来する残基によって規定される。これらの二次構造要素の位置に変異を導入することによって、基質ポケットから遠く離れた残基におけるアミノ酸の置換が、基質結合を変化させ得る。Ｈｉｓ１７１はＦヘリックスの始まりに位置し、Ｌ２１５においてＧヘリックスと接触する。Ｎ２３９はＨヘリックス中に存在し、このヘリックスはＩヘリックスのＮ末端終結部に接触する。Ｈ１７１およびＮ２３９における置換は、ＧおよびＩヘリックスの配置にそれぞれ影響を及ぼすであろうもので、基質結合を変化させ得る。Ｉｌｅ２５９およびＡｌａ２７６は共にＩヘリックス中に存在する。これらの残基は基質には接触しないが、アミノ酸の置換が、例えば、活性部位中に配置され、間にあるＩ２６３の構造変化を引き起こすなどの活性部位の構造に影響を及ぼし得、ＣＹＰ１０２Ａ１の活性を変化させることが、発明者等の先の研究により示されている（１３）。
【０１６５】
変異体ＬＯ２５がＬ２１５Ｉ変異を含み、それがＨ１７１／Ｌ２１５の密接な接近においてＦおよびＧへリックスの間の接触に影響を及ぼし得るということは特に興味深い。全体的に見れば、いずれの変異も、活性部位には存在していない一方で、それらの全ては、二次構造要素の間のパッキング／相互作用において何らかの役割を果たす残基において存在している。Ａ３３０Ｐにより導入されるタンデムなプロリンの配置は独特であり、全く予期しなかったが高度に有益な効果を示す。
【０１６６】
本発明において開示された変異は、プロセスの開発のために、現存する変異体（例えば、Ｌ１８８Ｑ、Ｒ４７Ｌ、Ｙ５１Ｆ変異を含むもの）に導入してもよいが、さらなる進化のための出発点として導入してもよい。
【０１６７】
【表３】
【０１６８】
【表４】
【０１６９】
【表５】
【０１７０】
表Ａ．ＣＹＰｌ０２Ａｌヘムドメイン（アミノ酸残基１〜４７０）と各種の構造的に特徴付けられたチトクロームＰ４５０酵素との間の配列相同性
【０１７１】
【表６】
【０１７２】
＊ＣＹＰ５０５（Ｐ４５０ｆｏｘｙ）は、構造的に特徴付けられておらず、アラインメントは、ヘムドメインのみを使用した。
【０１７３】
表Ｂ．ＣＹＰ１０２Ａｌの全体配列と各種チトクロームＰ４５０酵素との間の配列相同性（アラインメントはＳｗｉｓｓｐｒｏｔタンパク質データバンク中のタンパク質に対して行われた）。同じサブファミリーであるにもかかわらず、ＣＹＰ１０２Ａ２及びＣＹＰ１０２Ａ３は、ＣＹＰｌ０２Ａｌとわずか５９％及び５８％の相同性であることに留意されたい。
【０１７４】
【表７】
【０１７５】
表Ｃ．アミノ酸の物理的特性
【０１７６】
【表８】
【０１７７】
表Ｄ．ハイドロパシースケール
【０１７８】
【表９】
【０１７９】
表１：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のナフタレンとのインビトロ酸化活性、結合効率、選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。唯一検出可能な生成物は、１−ナフトール（ｌ−オール）であった。
【０１８０】
【表１０】
【０１８１】
表２：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のプロピルベンゼンとのインビトロ酸化活性、選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、１−フェニル−１−プロパノール（ｌ−オール）、ｌ−フェニル−２−プロパノール（２−オール）、２−プロピルフェノール（オルト）及び４−プロピルフェノール（パラ）であった。少量の１−フェニル−１−プロパノン（１％以下）及び３−フェニル−ｌ−プロパノール（０．５％未満、ＫＴ５のみ）も形成された。「−」は、検出されなかったことを示す。（＊）パーセンテージは、これらの及びその他の微量生成物のため、１００になるようには合計しなかった。
【０１８２】
【表１１】
【０１８３】
表３：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のトルエンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、ベンジルアルコール（ｌ−オール）、ｏ−クレゾール（オルト）及びｐ−クレゾール（パラ）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１８４】
【表１２】
【０１８５】
表４：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のブチルベンゼンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、１−フェニル−ｌ−ブタノール（ｌ−オール）、ｌ−フェニル−２−ブタノール（２−オール）、４−フェニル−２−ブタノール（３−オール）、２−ブチルフェノール（オルト）及び４−ブチルフェノール（パラ）であった。（＊）は、１−３％の１−フェニル−１−ブタノンを含む。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１８６】
【表１３】
【０１８７】
表５ａ：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のｔ−ブチルベンゼンとのインビトロ酸化活性、選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−ｔ−ブチルフェノール（オルト）、４−ｔ−ブチルフェノール（パラ）及び２−メチル−２−フェニル−プロパン−ｌ−オール（ｌ−オール）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１８８】
【表１４】
【０１８９】
表５ｂ：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のエチルベンゼンとのインビトロ酸化活性／選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、１−フェニルエタノール（ｌ−オール）、２−フェニルエタノール（２−オール）、２−エチルフェノール（オルト）及びスチレンであった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１９０】
【表１５】
【０１９１】
ＮＢ／結果が、検出装置の反応による再較正後に、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ａ／ＫＴ２、ＫＳＫｌ９及びＧＶＱについても得られた。ＮＡＤＰＨ代謝回転率は同一であった。結合効率は、２３（Ｆ８７Ａ）、２１（Ｆ８７Ａ／ＫＴ２）、２５（ＫＳＫ１９）、２６（ＧＶＱ）であった。生成物形成率は、３２（Ｆ８７Ａ）、１２０（Ｆ８７Ａ／ＫＴ２）、１７８（ＫＳＫ１９）、５７２（ＧＶＱ）であった。ｌ−オールは、９９％（Ｆ８７Ａ）、９６％（Ｆ８７Ａ／ＫＴ２）、９５％（ＫＳＫｌ９）、９９％（ＧＶＱ）であった。スチレンは、今回、これらの変異体との反応において、２％（Ｆ８７Ａ）、４％（Ｆ８７Ａ／ＫＴ２）、５％（ＫＳＫ１９）、１％（ＧＶＱ）検出された。
【０１９２】
表６ａ：ＣＹＰｌ０２変異体のｏ−キシレンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−メチルベンジルアルコール（ｌ−オール）、２，３−ジメチルフェノール（２，３−フェノール）、３，４−ジメチルフェノール（３，４−フェノール）、２，３−ジメチル−ｐ−ベンゾキノン（ヒドロキノン）及びピロカテコール（カテコール）であった。（＊）パーセンテージは、微量生成物のため、１００になるようには合計しなかった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１９３】
【表１６】
【０１９４】
表６ｂ：ＣＹＰｌ０２Ａ１変異体のｍ−キシレンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、３−メチルベンジルアルコール（ｌ−オール）、２，４−ジメチルフェノール（２，４−フェノール）及び２，６−ジメチルフェノール（２，６−フェノール）であった。（＊）パーセンテージは、微量生成物のため、１００になるようには合計しなかった。
【０１９５】
【表１７】
【０１９６】
表７：ＣＹＰｌ０２Ａ１変異体のｐ−シメンとのインビトロ酸化活性／選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、ｐ−α−ジメチルスチレン（ｐ−α−ＤＭＳ）、ｐ−α−α−トリメチルベンジルアルコール（ｉ−Ｐｒ−オール）、４−イソプロピルベンジルアルコール（Ｍｅ−オール）、チモール、カルバクロール及び非同定生成物であった。（＊）は、最大３％のｐ−α−ジメチルスチレンオキシドを含む。（＊＊）パーセンテージは、その他の微量生成物のため、１００になるようには合計しなかった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１９７】
【表１８】
【０１９８】
表８：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａ１変異体のクメンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、α−メチルスチレン（スチレン）、α−メチルスチレンオキシド（スチレンオキシド）、２−フェニル−ｌ−プロパノール（ｌ−オール）、２−フェニル−２−プロパノール（２−オール）、２−イソプロピルフェノール（オルト）及び４−イソプロピルフェノール（パラ）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０１９９】
【表１９】
【０２００】
表８ａ：ＧＣ分析後における、いくつかのＣＹＰｌ０２Ａ１変異体のクメンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、α−メチルスチレン（スチレン）、α−メチルスチレンオキシド（スチレンオキシド）、２−フェニル−ｌ−プロパノール（ｌ−オール）、２−フェニル−２−プロパノール（２−オール）、２−イソプロピルフェノール（オルト）及び４−イソプロピルフェノール（パラ）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０２０１】
【表２０】
【０２０２】
表９：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のペンタンとのインビトロ酸化活性、選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−ペンタノール（２−オール）、３−ペンタノール（３−オール）、２−ペンタノン（２−オン）及び３−ペンタノン（３−オン）であった。
【０２０３】
【表２１】
【０２０４】
表１０：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の３−メチルペンタンとのインビトロ酸化活性／選択性及びスピンシフト。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、３−メチル−２−ペンタノール（２−オール）−２つのジアステレオマーは、（Ａ）及び（Ｂ）と指名された、及び３−メチル−３−ペンタノール（３−オール）であった。
【０２０５】
【表２２】
【０２０６】
表１１：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の２−メチルブタンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−メチル−ｌ−ブタノール（ｌ−オール）、２−メチル−２−ブタノール（２−オール）、３−メチル−２−ブタノール（３−オール）、３−メチル−１−ブタノール（４−オール）及び３−メチル−２−ブタノン（３−オン）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０２０７】
【表２３】
【０２０８】
表１２：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のブタン及びプロパンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、ブタンに対しては、１−ブタノール（ｌ−オール）、２−ブタノール（２−オール）及び２−ブタノン（２−オンｏｎｅ）であって、プロパンに対しては、２−プロパノールのみであった。
【０２０９】
【表２４】
【０２１０】
表１３：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のオクタンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２−オクタノール（２−オール）、３−オクタノール（３−オール）、４−オクタノール（４−オール）、３−オクタノン（３−オン）及び４−オクタノン（４−オン）であった。「−」は、検出されなかったことを示す。
【０２１１】
【表２４】
【０２１２】
表１４：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の１，４−ジクロロベンゼンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２，４−ジクロロフェノール及び／又は２，５−ジクロロフェノールであり、これらは、同一のＧＣ溶出時間を有する。ＧＣで検出不可能なセミキノンに対するさらなる酸化は、結合の数値を信用し得ないものとし得る。
【０２１３】
【表２５】
【０２１４】
表１５：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のバレンセンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、シス−及びトランス−ヌートカトール（ヌートカトール）、ヌートカトン、シス−及びトランス−バレンセンエポキシド（Ｖａｌ．ｅｐｏｘ．）並びにシス−及びトランス−ヌートカトンエポキシド（Ｎｏｏｔ．ｅｐｏｘ．）であった。
【０２１５】
【表２６】
【０２１６】
表１６：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のＲ−及びＳ−リモネンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、１，２−リモネンエポキシド（エポキシド）、シス−及びトランス−イソピペリテノール（イソピペリ）、並びに、シス−及びトランス−カルベロール（カルベロール）であった。
【０２１７】
【表２７】
【０２１８】
表１６ａ：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のＲ−リモネンとのインビトロ酸化活性及び選択性。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、シス−１，２−リモネンエポキシド（シス−１，２）、トランス−１，２−リモネンエポキシド（トランス−１，２）、非同定生成物（Ｕ）、シス−イソピペリテノール（シス−３−オール）、トランス−イソピペリテノール（トランス−３−オール）、カルベロール（２つの異性体）（６−オール（Ａ）及び（Ｂ））、カルボン（６−オン）及びペリリルアルコール（１０−オール）であった。
【０２１９】
【表２８】
【０２２０】
表１７：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の（＋）−α−ピネンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、２，３−ピネンエポキシド（エポキシド）、シス−及びトランス−ベルベノール（ベルベノール）、ベルベノン、並びに、ミルテノールであった。基質中の不純物質のため、データは、結合効率を誇張して示している。
【０２２１】
【表２９】
【０２２２】
表１７ａ：いくつかのＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体の（＋）−α−ピネンとのインビトロ酸化活性及び選択性。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。割合は、ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１の単位で示される。生成物は、（−）−２，３−ピネンエポキシド（（−）−２，３）、（＋）−２，３−ピネンエポキシド（（＋）−２，３）、シス−ベルベノール（シス−４−オール）、トランス−ベルベノール（トランス−４−オール）、ベルベノン（４−オン）並びにミルテノール（１０−オール）であった。
【０２２３】
【表３０】
【０２２４】
表１８：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のフルオレンとのインビトロ酸化活性及び選択性。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。全ての割合は、単位ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１で示される。生成物は、９−フルオレノール（９−オール）及び２−フルオレノン（９−オン）であった。
【０２２５】
【表３１】
【０２２６】
表１９：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のβ−イオノンとのインビトロ酸化活性及び選択性。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。割合は、単位ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１で示される。生成物は、４−ヒドロキシ−β−イオノン（４−オール）であった。
【０２２７】
【表３２】
【０２２８】
表２０：ＣＹＰｌ０２Ａｌ変異体のラウリン（ドデカン）酸とのインビトロ酸化活性及び選択性。Ｎ＝ＮＡＤＰＨ代謝回転率。Ｃ＝結合効率。ＰＦＲ＝生成物形成率。割合は、単位ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・（ｎｍｏｌ Ｐ４５０）−１で示される。生成物は、１１−ヒドロキシドデカン酸（ω−１）、１０−ヒドロキシドデカン酸（ω−２）、９−ヒドロキシドデカン酸（ω−３）、８−ヒドロキシドデカン酸（ω−４）及び７−ヒドロキシドデカン酸（ω−５）であった。
【０２２９】
【表３３】
【０２３０】
【表３４】
【０２３１】
【表３５】
【０２３２】
【表３６】
【０２３３】
【表３７】
【０２３４】
【表３８】
【０２３５】
【表３９】
【０２３６】
【表４０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大したモノオキシゲナーゼ活性及び／又は変化した生成物選択性を有し、アミノ酸残基位置３３０、１９１、４０１、４０３、３０７、３７７、４２５、２７６、１１７、１３１、又は２１５のうちの一ヶ所又はそれ以上に置換を含む、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素。
【請求項２】
ＣＹＰ１０２Ａｌのアミノ酸残基１〜４８０と少なくとも４０％の相同性を有し、任意にはその変異断片である、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
ＣＹＰ１０２Ａｌの非変異断片を表す、１、２、３、４、５個又はそれ以上の幅の少なくとも１５個又は少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
以下：
ｉ）位置１１７、１３１、２１５、３３０、４０１のうちの一ヶ所又はそれ以上における保存的変異；及び／又は
ｉｉ）位置１９１及び２７６のうちの一ヶ所又はそれ以上における極性アミノ酸；及び／又は
ｉｉｉ）位置３７７及び４０３のうちの一ヶ所又はそれ以上における非極性アミノ酸；及び／又は
ｉｖ）位置４２５における非荷電性残基、
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素であって、任意には、位置１１７、１３１、１９１、２１５、２７６、３０７、３３０、３７７、４０１、４０３又は４２５のうちの一ヶ所又はそれ以上に隣接する位置に変異が存在しない、前記酵素。
【請求項５】
以下の位置：４７、５１、７４、８２、８７、１７１、１８８、２３９、２５９、２６３、２６４、２６７、３１９、３２８、又は３５３のうちの一ヶ所又はそれ以上に置換をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
以下：Ｒ４７Ｌ、Ｙ５ＩＦ、Ａ７４Ｇ、Ａ８２Ｌ、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｇ、Ｆ８７Ｌ、Ｈ１７１Ｌ、Ｌ１８８Ｑ、Ｎ２３９Ｈ、Ｉ２５９Ｖ、Ｉ２６３Ａ、Ａ２６４Ｇ、Ｅ２６７Ｖ、Ｎ３１９Ｙ、Ａ３２８Ｖ、又はＬ３５３Ｉ、から選択される変異を含む、請求項５に記載の酵素。
【請求項７】
前記変異体が、以下の変異又は変異群のうちの一つ又はそれ以上を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素：
ｉ）Ａ３３０Ｐ；
ｉｉ）Ａ１９１Ｔ／Ｎ２３９Ｈ／Ｉ２５９Ｖ／Ａ２７６Ｔ／Ｌ３５３Ｉ；
ｉｉｉ）Ｆ８７Ａ／Ｈ１７１Ｌ／Ｑ３０７Ｈ／Ｎ３１９Ｙ；
ｉｖ）Ｆ８７Ａ／Ａ３３０Ｐ／Ｅ３７７Ａ／Ｄ４２５Ｎ；
ｖ）Ｆ８７Ａ／Ａ１１７Ｖ／Ｅ１３１Ｄ／Ｌ２１５Ｉ；
ｖｉ）Ｉ４０１Ｐ；
ｖｉｉ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５ＩＦ／１４０ＩＰ；
ｖｉｉｉ）Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ；
ｉｘ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ；
ｘ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐ；
ｘｉ）Ｑ４０３Ｐ；
ｘｉｉ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｑ４０３Ｐ；
ｘｉｉｉ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｆ８７Ａ／Ｑ４０３Ｐ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素を用いて、前記有機化合物基質を酸化する工程を含む、有機化合物である基質を酸化する方法。
【請求項９】
前記基質が、短鎖アルカン、若しくは、その置換誘導体であるか、又は、芳香族化合物、若しくはアルキルベンゼン、若しくはそれらの置換誘導体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質が、ハロ芳香族化合物又は非環状又は環状のテルペン又はテルペノイド又はセスキテルペン、又はシクロアルケン又は飽和脂肪酸；又はそれらいずれかの置換誘導体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記短鎖アルカンが、ペンタン、３−メチルペンタン、２−メチルブタン、ブタン、プロパン、エタン及びメタンであるか；又は、前記アルキルベンゼンが、プロピルベンゼン、エチルベンゼン、トルエン、ブチルベンゼン、ｔ−ブチルベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、クメン、ｐ−シメン、及びエチルアニソールであるか；又は、前記芳香族化合物が、ナフタレン又はフルオレンであるか；又は、前記モノテルペンが、リモネン又はピネンであるか；又は、前記セスキテルペンが、バレンセンであるか；又は、前記テルペノイドが、β−イオノン又はダマスコン等のイオノンであるか；又は、前記飽和脂肪酸が、ラウリン酸又はデカン酸である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素と選択的に結合し、ＣＹＰ１０２Ａｌと結合しない、抗体。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素をコードする配列を、任意に、ベクターの形態で含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素を発現する細胞。
【請求項１５】
原核細胞又は真核細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
大腸菌、シュードモナス種、酵母、ピチア種、ロドコッカス種、バチルス種の株である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
その細胞が請求項１４〜１６のいずれか一項に記載されている、トランスジェニック動物又は植物。
【請求項１８】
前記有機化合物基質が、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞中において酸化される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の基質で汚染された場所を処理する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素又はその一つ若しくはそれ以上の酵素の混合物、又は、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞、又は、請求項１７に記載のトランスジェニック動物若しくは植物と、該場所とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
ＣＹＰｌ０２Ａｌを用いて行われた場合の方法と比較して異なる数の生成物が形成される、請求項８〜１１又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
増大したモノオキシゲナーゼ活性及び／又は変化した生成物選択性を有し、アミノ酸残基位置３３０、１９１、４０１、４０３、３０７、３７７、４２５、２７６、１１７、１３１、又は２１５のうちの一ヶ所又はそれ以上に置換を含む、変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素。
【請求項２】
ＣＹＰ１０２Ａｌのアミノ酸残基１〜４８０と少なくとも４０％の相同性を有し、任意にはその変異断片である、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
ＣＹＰ１０２Ａｌの非変異断片を表す、１、２、３、４、５個又はそれ以上の幅の少なくとも１５個又は少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
以下：
ｉ）位置１１７、１３１、２１５、３３０、４０１のうちの一ヶ所又はそれ以上における保存的変異；及び／又は
ｉｉ）位置１９１及び２７６のうちの一ヶ所又はそれ以上における極性アミノ酸；及び／又は
ｉｉｉ）位置３７７及び４０３のうちの一ヶ所又はそれ以上における非極性アミノ酸；及び／又は
ｉｖ）位置４２５における非荷電性残基、
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素であって、任意には、位置１１７、１３１、１９１、２１５、２７６、３０７、３３０、３７７、４０１、４０３又は４２５のうちの一ヶ所又はそれ以上に隣接する位置に変異が存在しない、前記酵素。
【請求項５】
以下の位置：４７、５１、７４、８２、８７、１７１、１８８、２３９、２５９、２６３、２６４、２６７、３１９、３２８、又は３５３のうちの一ヶ所又はそれ以上に置換をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
以下：Ｒ４７Ｌ、Ｙ５ＩＦ、Ａ７４Ｇ、Ａ８２Ｌ、Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｇ、Ｆ８７Ｌ、Ｈ１７１Ｌ、Ｌ１８８Ｑ、Ｎ２３９Ｈ、Ｉ２５９Ｖ、Ｉ２６３Ａ、Ａ２６４Ｇ、Ｅ２６７Ｖ、Ｎ３１９Ｙ、Ａ３２８Ｖ、又はＬ３５３Ｉ、から選択される変異を含む、請求項５に記載の酵素。
【請求項７】
前記変異体が、以下の変異又は変異群のうちの一つ又はそれ以上を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＣＹＰ１０２Ａｌ酵素：
ｉ）Ａ３３０Ｐ；
ｉｉ）Ａ１９１Ｔ／Ｎ２３９Ｈ／Ｉ２５９Ｖ／Ａ２７６Ｔ／Ｌ３５３Ｉ；
ｉｉｉ）Ｆ８７Ａ／Ｈ１７１Ｌ／Ｑ３０７Ｈ／Ｎ３１９Ｙ；
ｉｖ）Ｆ８７Ａ／Ａ３３０Ｐ／Ｅ３７７Ａ／Ｄ４２５Ｎ；
ｖ）Ｆ８７Ａ／Ａ１１７Ｖ／Ｅ１３１Ｄ／Ｌ２１５Ｉ；
ｖｉ）Ｉ４０１Ｐ；
ｖｉｉ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５ＩＦ／１４０ＩＰ；
ｖｉｉｉ）Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ；
ｉｘ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｆ８７Ａ／Ｉ４０１Ｐ；
ｘ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ａ３３０Ｐ／Ｉ４０１Ｐ；
ｘｉ）Ｑ４０３Ｐ；
ｘｉｉ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｑ４０３Ｐ；
ｘｉｉｉ）Ｒ４７Ｌ／Ｙ５１Ｆ／Ｆ８７Ａ／Ｑ４０３Ｐ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素を用いて、前記有機化合物基質を酸化する工程を含む、有機化合物である基質を酸化する方法。
【請求項９】
前記基質が、短鎖アルカン、若しくは、その置換誘導体であるか、又は、芳香族化合物、若しくはアルキルベンゼン、若しくはそれらの置換誘導体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質が、ハロ芳香族化合物又は非環状又は環状のテルペン又はテルペノイド又はセスキテルペン、又はシクロアルケン又は飽和脂肪酸；又はそれらいずれかの置換誘導体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記短鎖アルカンが、ペンタン、３−メチルペンタン、２−メチルブタン、ブタン、プロパン、エタン及びメタンであるか；又は、前記アルキルベンゼンが、プロピルベンゼン、エチルベンゼン、トルエン、ブチルベンゼン、ｔ−ブチルベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、クメン、ｐ−シメン、及びエチルアニソールであるか；又は、前記芳香族化合物が、ナフタレン又はフルオレンであるか；又は、前記モノテルペンが、リモネン又はピネンであるか；又は、前記セスキテルペンが、バレンセンであるか；又は、前記テルペノイドが、β−イオノン又はダマスコン等のイオノンであるか；又は、前記飽和脂肪酸が、ラウリン酸又はデカン酸である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素と選択的に結合し、ＣＹＰ１０２Ａｌと結合しない、抗体。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素をコードする配列を、任意に、ベクターの形態で含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素を発現する細胞。
【請求項１５】
原核細胞又は真核細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
大腸菌、シュードモナス種、酵母、ピチア種、ロドコッカス種、バチルス種の株である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
その細胞が請求項１４〜１６のいずれか一項に記載されている、トランスジェニック動物又は植物。
【請求項１８】
前記有機化合物基質が、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞中において酸化される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の基質で汚染された場所を処理する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素又はその一つ若しくはそれ以上の酵素の混合物、又は、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞、又は、請求項１７に記載のトランスジェニック動物若しくは植物と、該場所とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
ＣＹＰｌ０２Ａｌを用いて行われた場合の方法と比較して異なる数の生成物が形成される、請求項８〜１１又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５３９９６７（Ｐ２０１０−５３９９６７Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７５３９（Ｐ２０１０−５２７５３９）
【出願日】平成２０年１０月８日（２００８．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３４０７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７４９８
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５１００９２１９９）アイシス イノベーション リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＳＩＳ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月８日（２００８．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３４０７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７４９８
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５１００９２１９９）アイシス イノベーション リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＳＩＳ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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