外来遺伝子高発現大腸菌株の選択方法、その方法により選択される大腸菌変異株及びそれを用いる酵素及び化合物の製造方法
過酸化水素分解能等のストレス耐性能を指標にした外来遺伝子を高発現する大腸菌変異株の選択方法、その選択方法により選択された大腸菌変異株、その変異株による酵素の製造方法、及びその変異株を用いたアミノ酸（特にＬ−アミノ酸）等の有用化合物の製造方法に関する。本発明によれば、継代しても遺伝子発現が低下しない大腸菌変異株を獲得でき、植物アンモニアリアーゼ等を利用した化合物を効率的に製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、外来遺伝子を高発現する大腸菌株の選択方法、その選択方法により選択される大腸菌、及びその菌株を用いる酵素及び化合物の製造方法に関する。さらに詳しくは、大腸菌内での発現が不安定な酵素遺伝子を導入した形質転換体群から当該遺伝子を安定的に高発現する突然変異株を選択する方法、この方法により選択した外来遺伝子高発現性突然変異株、及びその菌株を用いる酵素及び化合物、特にアンモニアリアーゼ及びアミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
大腸菌を用いた外来遺伝子の発現は、極めて多くの研究と実用技術の開発が成されている分野であり、分子生物学・遺伝子工学では最も進んだ分野の一つである。現在では工業における製造手段としての重要性は極めて高く、多くのバイオ医薬が大腸菌を用いた方法により工業的に製造されている。
分子生物学の研究に最も頻用されている大腸菌の菌株は、Ｋ１２株から誘導された菌株である（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｐ．ｐ．１６９３−１７１１）。近年ではＢＬ２１のような大腸菌Ｂ株から誘導された菌株も多く使用されており、組換えタンパク質の産生に最も頻用されている菌株の一覧表がＷｉｎｇｆｉｅｌｄ，１９９７によって提示されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．５．０．１−５．０．３）。
細菌宿主中でタンパク質を発現させる多数の系が文献に記載されている（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，７）。発現系は、プロモーター及びそのレギュレーター、リボソーム固定部位及びその下流で有益な遺伝子が挿入され得る制限部位、転写ターミネーターとして機能し得る構造、超発現した有益なタンパク質の品質を同時発現によって改善すべく任意に存在する遺伝子、並びに、これらの組合せを宿主に導入し得る１つまたは複数のベクターとから構成されている。
これらのベクターは、プラスミドＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩ（Ｐｏｌｉｓｋｙ，１９８８，Ｃｅｌｌ５５：９２９−９３２）によってコードされている２つのＲＮＡの相互作用によって決定される所定のコピー数で細胞中に存在している。大腸菌中の発現プラスミドのコピー数の調節に関しては、複数の戦略が文献に記載されている（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｐ．ｐ．１６９３−１７１１、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，７）。
大腸菌に外来遺伝子を組み込み発現させる場合、発現させようとする外来遺伝子と、これらの大腸菌とその遺伝子発現系には「相性」があり、試行錯誤法で選択されるのが一般的である。目的タンパク質が充分量得られない状況としては、生産されたタンパク質が本来有する正常な構造を取り得ず沈殿物（インクルージョン・ボディ）となる場合や、生産されても直ちに分解されるといった場合があるが、このような様々な問題を解決する多くの手段も文献で紹介されている（特開平１０−３１３８６３号公報、特開平８−１４０６７１号公報、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，７）。
上記のように、多くの情報と膨大な数の発現系や大腸菌株を以てしても、未だ安定に発現させることが困難な遺伝子は多く、目的とする外来遺伝子を発現させてタンパク質を得ようとする時、充分な量が得られないことは非常に多い。さらには、一度目的に合わせて作成した大腸菌菌株でも、保存中や継代する間に遺伝子発現が低下することもしばしば見られる現象であり、その原因はまだ不明な場合が多い。例えば、本明者らは、酵素アンモニアリアーゼのアミノ基付加反応を利用して各種の桂皮酸類からＬ−アミノ酸類を製造する方法を発明し特許出願している（特開２００３−２２５０９２号公報）が、この研究過程においても、大腸菌を形質転換して酵素アンモニアリアーゼを発現させた場合、継代を重ねるにつれ形質転換体の活性が低下する現象が見られた。この継代による活性低下は、一般に言われる発現調節部位のメチル化やプラスミドの脱落・変異等によるものでは無く、既知情報の何れによっても回避できない困難なものであった。
小スケールの培養で目的が果たせる基礎研究の場合は、新たに形質転換をやり直し、再度形質転換体を得ることで解決するのが一般的であるが、比較的大スケールで培養時間が長く、多数の継代を経る工業生産の場合、遺伝子発現の不安定さは極めて深刻な問題である。
しかしながら、遺伝子発現の安定化に関する問題としてこれまでに取り上げられ、対策が研究されているのは、プラスミドの脱落による外来遺伝子の脱落の防止、プラスミドの修飾や変異による転写不全の回避のみであり、宿主そのものの変異による発現低下の対策が論じられることは無かった。この事実は、実験室で宿主として用いられている大腸菌の多くはプラスミドの変異や修飾を行わず安定に保持するよう改変された変異株であり、これ以上の改変に関する情報は未だない状況であることによると思われる。さらにはプラスミドを含む外来遺伝子側の改変により問題を回避することが可能な場合もあり、通常は宿主大腸菌の変異に取り組むよりは技術的に実績のある外来遺伝子側の改変を試みることが多かった。しかしながら、外来遺伝子の改変は時間と労力を要する作業であり、必ずしも成功するものではない。また外来遺伝子の改変をもってしても安定化できない遺伝子の発現には対策がない状況であった。
【発明の開示】
本発明の課題は、継代や保存によって発現量が低下する傾向がある発現不安定な外来遺伝子から充分なタンパク質を得る時に有用な大腸菌変異株を提供すること、及びそのような菌株を用いた工業的に重要な化学物質の製造方法を提供することにある。
さらに詳細には、プラスミドの脱落・変異・修飾以外の原因で発現が低下する外来遺伝子の発現を安定化した大腸菌変異株を提供すること、及びそのような菌株を用いた工業的に重要な化学物質の製造方法を提供することにある。
特に、プラスミドの異常を伴わずに大腸菌における発現が低下する傾向の強い植物由来フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子の発現を安定化した大腸菌変異株を提供すること、及びそのような菌株を用いて工業的に重要なアミノ酸類を製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、過酸化水素分解能という、タンパク質生産には直接には関係しない一種のストレス耐性能を指標にして大腸菌株の選択を行なえば、継代しても遺伝子発現が低下しない変異株を獲得できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、継代や保存によって発現量が低下する傾向がある発現不安定な外来遺伝子から充分なタンパク質を得る時に有用な大腸菌変異株を与え、そのような菌株を用いて工業的に重要な化学物質を製造する方法を与えるものである。
すなわち、本発明は下記の大腸菌株選択方法、選択された大腸菌株、これを用いた酵素の製造方法及びその酵素を用いた有用化合物の製造方法を提供する。
［１］ ストレス応答の強さを指標として選抜することを特徴とする外来遺伝子高発現性大腸菌株の選択方法。
［２］ ストレス応答が過酸化水素分解活性である前記１に記載の選択方法。
［３］ 大腸菌に導入された際に、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子を高発現する前記１または２に記載の選択方法。
［４］ ストレス応答の強さを指標として選抜された外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［５］ ストレス応答が過酸化水素分解活性である前記４に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［６］ 大腸菌に導入された際に、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子を高発現する前記４または５に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［７］ 大腸菌株を３０世代継代する間に発現量が２分の１まで低下する遺伝子を発現させたときに、発現量が初代の水準に維持されるかまたは向上する前記４乃至６のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［８］ プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子が、アンモニアリアーゼの遺伝子である前記６または７に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［９］ アンモニアリアーゼの発現系遺伝子がフェニルアラニンアンモニアリアーゼの遺伝子である前記８に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１０］ フェニルアラニンアンモニアリアーゼの遺伝子が、植物由来である前記９に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１１］ 植物がムラサキ科ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）である前記１０に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１２］ 大腸菌株がＫ１２株由来である前記４乃至１１のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１３］ 大腸菌株がＸＬ１−Ｂｌｕｅ株由来である前記１２に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１４］ 大腸菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株である前記１３に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１５］ 大腸菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株からクローン選択または遺伝子操作によって得られる誘導株である前記１４に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１６］ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４６）。
［１７］ 前記４乃至１５のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株の外来遺伝子を発現させることを特徴とする酵素の製造方法。
［１８］ 前記４乃至１５のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株またはその産生する酵素を含む処理液をその酵素の基質と反応させることを特徴とする化合物の製造方法。
［１９］ 酵素がアンモニアリアーゼであり、基質が不飽和カルボン酸であり、得られる化合物がＬ−アミノ酸および／またはその誘導体である前記１８に記載の化合物の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
（１）高発現性大腸菌株の選択方法
本発明において外来遺伝子安定的高発現性大腸菌株とは、慣用の手法によって大腸菌に外来遺伝子を導入した際に相対的に発現量が大きく、さらに、その発現が安定している株を指す。発現させるべき外来遺伝子は特に限定されないが、「発現困難な外来遺伝子」を導入しようとする場合、本発明は特に有用である。ここで、「発現困難な外来遺伝子」とは、大腸菌に導入し形質を転換し当該形質転換大腸菌を継代培養したときに、継代する間に外来遺伝子の発現が低下する遺伝子をいう。より詳しくは、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子であり、大腸菌の発現プラスミド上に発現可能な形で組み込んで大腸菌に導入した時に、プラスミドの脱落や変異等の異常がないにもかかわらずタンパク質生産が行われない遺伝子を指す。
本発明の大腸菌変異株選択方法を、以下に詳細に説明する。なお、変異の誘導等は、特に明記しない限り、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年発行等に記載の方法を参考にして行うことができる。
まず、大腸菌変異株の製造方法を説明する。本変異株の選抜は、発現困難な遺伝子を有する組換えベクターで宿主大腸菌を形質転換した形質転換体を用いて行う。組換えベクターの作成には大腸菌での発現制御に必要な配列を有する発現プラスミド、例えば市販のｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３、ｐＵＣ１８等を用いることができる。これらの発現プラスミドの適当なサイトに発現困難な遺伝子を組み換えたベクター、すなわち、大腸菌プロモーター及びそのレギュレーター、好ましくはｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター等の下流に、リボソーム固定部位と連続した発現困難な遺伝子、転写ターミネーターとして機能し得る構造およびマーカー遺伝子等から構成されている大腸菌組換えベクターを構築する。
本発明において形質転換する大腸菌株は特に制限されないが、好ましくは、Ｋ１２株、Ｂ株等が用いられ、生物学的封じ込めの観点から、Ｋ１２株が好適に用いられる。例えば、一般的な宿主として市販されている（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、日本国内ではＴＯＹＯＢＯより購入可能）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＆ Ｓｈｏｒｔ，１９８７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５：３７６−３７８）、ＪＭ１０９株（ＴａＫａＲａより購入可能）、ＨＢ１０１株等、広く大腸菌宿主として用いられ、形質の安定した株を用いることができる。
通常用いられる大腸菌が生育可能な培地に、使用する組換えベクターに対応した形質転換体選抜物質（例えば、アンピシリン等の抗生物質）を適量加え、さらに寒天を加えて平板化した寒天平板培地、好ましくはＭ９グルコースプレートに、形質転換体を塗布し、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３５℃、より好ましくは２５℃でコロニーが明確に形成されるまで１６時間〜７２時間、好ましくは２４時間〜４８時間培養する。
発現困難な遺伝子を有する形質転換体は、多くの場合不均一なコロニーを形成する。本発明では、この形質転換体菌株の中からストレス応答の強さを指標として選抜を行なう。利用可能なストレス応答のタイプは特に限定されないが、利用可能なものとしては、過酸化水素分解活性、熱処理後の生育回復性（熱耐性）等が挙げられる。この中でも過酸化水素分解活性は、コロニーに微量の過酸化水素液を反応させた時、過酸化水素を分解して酸素を発生する量の大小でストレス応答の強さを目視により見分けることができるので好ましい。
必要であれば、一時選抜と同じ指標を以てさらに選抜を繰り返してもよい。また、選抜に際しては、ストレス応答を示す株の中で、コロニーの色調が他と比較して白色に近いものや、コロニー径が有意に小さいものが特に選抜対象として好ましい。また、二次選抜以降の株について、既知の手法による生成タンパク質の解析を併用してさらなる選抜を行なってもよい。
得られた変異株を薬剤圧のない培地で継代することにより、選択時に使用した組み換えベクターを脱落させることができ、これにより宿主大腸菌変株を得る。
得られた宿主大腸菌変異株の継代安定性は、菌株が生育する通常の条件で薬剤による選択圧をかけずに所定の分裂回数が得られるまで継代培養した後、外来遺伝子の発現を見ることで評価することができる。例えば、ＬＢブロスのごとき栄養培地に、初期濁度が０．１になる量の被検菌株を植菌し、濁度３以上に達するまで培養すると、約５世代の継代数となる。同じ条件で６回の培養を繰り返すことで３０世代継代の菌体を得ることができ、この菌体の外来遺伝子発現を、外来遺伝子に由来するタンパク質の生産量等を指標にして評価すればよい。
変異株の選抜中に特に変異処理を施す必要はないが、用いる宿主大腸菌によっては通常用いる変異処理、例えば紫外線照射、変異薬剤処理等を施すことが好適な場合もある。
こうして得られた本発明の大腸菌変異株は、親株と比べて成長速度、形質転換方法及び保存方法等に差異はなく、２５℃〜３７℃の温度範囲、通常の栄養培地において、通常の操作で取り扱いができる。
ストレス応答性の高い株が高発現・高活性を持つ理由は明らかではないが、外来遺伝子の発現がストレスの一種であることと関係していると思われる。もっとも、高ストレス応答性は、外来遺伝子の発現を抑圧してストレスを軽減する方向に働くとも考えられるから、ストレス応答性の高い株が高発現・高活性を持つことを見出した本発明の知見は全く予想外のものである。
（２）安定的高発現性大腸菌株
本発明は上記の方法により選択される大腸菌株を提供する。本発明により選択される大腸菌株は、上記の通り、実質的に任意の大腸菌株の任意の形質転換株における安定的高発現性大腸菌株である。
このようにして得られる変異株の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株が挙げられる。これは、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を親株とし、植物フェニルアラニン アンモニアリアーゼ遺伝子を導入した形質転換株から上記の手法により選抜された安定的高発現性大腸菌株であり、親株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の１０倍以上の外来遺伝子由来のタンパク質を生成し、さらに形質転換体の３０世代の継代によって変化することなく安定に発現する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し（受託日：２００２年９月２７日，受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０４７）、２００３年１１月１０日付で国際寄託に移管した（国際受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４６）。
本発明の選択方法により取得された大腸菌変異株の一つであるＳＤ８４０株の顕著な特徴を親株と対比して以下に挙げる。
さらに本発明の大腸菌変異株は、生育後期（定常期以降）のゲノム解析の結果、親株に比較して高い発現をしている特徴的な遺伝子によってもその性質が示される。これらの遺伝子には未だ機能が特定されていないものも含まれ、発現困難な遺伝子が安定発現される原因であるものと結果であるものが混在しているが、本変異株の一つであるＳＤ８４０株の性質を示すものである。有意に発現している特徴的な遺伝子は、ｏｐｐＡ、ｏｍｐＡ、ｔｕｆＢ、ｔｕｆＡ、ｆｕｓＡ、ｇａｐＡ、ｒｐｓＡ、ａｈｐＣ、ｉｎｆＣ、ｋａｔＥ、ｙｄｉＨ、ｌａｃＩ、ｉｃｄＡ、ｏｐｐＣ、ｒｐｏＢ、ｙｎｈＡ、ｏｍｐＸ、ｄｎａＪ、ｏｐｐＢ、ｙｃｅＤ、ｄｎａＫ、ａｃｏ２、ｃｌｄ、ｚｉｐＡ、ｍｉｎＣ、ｇａｌＦ、ｇｎｄ、ｙａｆＫ、ｆａｂＢ、ｔｒｍＤ、ｃｙｓＫ、ｃｙｄＡ、ｈｓｌＶ、ｐｅｐＮ、ｏｐｐＦ、ｒｐｏＣ、ｏｍｐＦ、ｒｐｏＡ、ｐｈｅＳ、ｒｐｓＢ、ｏｐｐＤ、ｐｅｐＤ、ｓｅｒＳ、ｔｏｐＡ、ｇｒｐＥ、ｙｅａＦ、ａｓｎＢ、ｓｅｒＣ、ｐｐｉＢ、ｔｏｌＢ、ｙｃｂＫ、ｙｂｅＹ、ｐｒｓＡ、ｒｐｓＧ、ｇｙｒＡ、ａｈｐＦ、ｔｙｒＳ、ｐｈｅＡ、ｃｌｐＢ、ｒｐｓＬ、ｃｙｄＢ、ａｓｐｓ、ｙｂｄＲ、ｆｔｓＺ、ａｒｏＧ、ｒｐｌＪ、ｔｓｆ、ｒｐｓＰ、Ｃｎｔ５、ｒｐｌＡ、ａｃｅＡ、ｍｄｈ、ｙｂｇＦ、ａｄｄ、ｙｊｊＺ、ｒｐｌＣ、（ｅｒｆＫ）、ｄｃｐ、ｇｌｆ、ａｍｎ、ａｃｅＢ、ｒｐｓＤ、ｍｏｐＢ、ｇｐｔ、ｙａｉＬ、ｒｐｏＤ、ｙｎｆＢ、ｐｇｍＵ、ｒｐｌＥ、ｒｆｂＢ、ｓｅｑＡ、ａｓｎＳ、ｚｗｆ、ｅｄａ、ｆａｂＺ、ｏｔｓＡ、Ｃｎｔ５、ｌｒｐ、ｙｃｈＢ、ｐａｌ、ｒｐｌＹ、ｆｏｌＥ、ｒｐｌＮ、ｇｌｎＳ、ｒｉｍＭ、ｙｅｆＧ、ｙｄｃＦ、ｒｌｐＡ、ｙａｃＡ、ｆａｂＤ、Ｃｎｔ５、ｒｆｂＤ、ｄｉｃＡ、ｍｅｔＧ、ｐｐｃ、（ｙｅｅＴ）、ｙａｆＪ、ａｓｐＣ、ｐｙｒＣ、ｌｅｕＳ、ｙｃｂＬ、ｒｐｌＴ、ｙｋｆＦ、ｓｏｄＢ、４３０＃６、ｒｎｂ、ｒｐｓＥ、ｙｅｂＣ、ｒｐｓＪ、６６４＃１１、ｙｌｉＪ、ｙｃｆＣ、ｐｎｐ、ｒｆｂＡ、ｙｂｉＣ、ｒｐｌＳ、ｔｒｐＡ、ｈｕｐＢ、ｈｉｓＣ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＨ、ｐｈｅＴ、ｙｅｆＩ、ｌｐｄＡ、ｓｅｒＡ、ｌｏｌＡ、ｗｂｂＪ、ｌｅｕＣ、ｒｌｐＢ、ｒｐｌＤ、ｓｕｃＢ、ｆｋｐＢ／ｓｌｐＡ、ｙｇｆＢ、ｒｐｌＸ、ｈｔｐＧ、ｍｏｐＡ、ｐｎｔＡ、ｒｐｓＦ、ｉｎｆＢ、ｙｃｉＩ、（ｙｈｈＸ）、ｍｏａＢ、ｙｃｊＸ、ｇｌｙＱ、ｙａｇＵ、ｔｏｌＣ、ｇｃｖＲ、ｇｄｈＡ、ｙａｄＦ、ｐｕｒＢ、ｓｐｅＥ、（ｙｅｆＪ）、ｙｇｇＢ、ａｃｃＡ、ｙｂｉＴ、ｍｏａＥ、ｒｐｓＫ、ｙｌｅＡ、ｍｕｋＥ／ｋｉｃＡ、ｐｒｆＢ、ｙｂａＤ、ｒｉｂＦ、ｈｓｌＵ、ａｄｋ、ｒｐｓＭ、ｒｐｌＱ、ｎｆｎＢ、ｙｆｈＦ、ｙｆｉＢ、ｙａｅＳ／ｕｐｐＳ／ｒｔｈ、ａｒｏＡ、ｄａｐＤ、２２１＃１５、ｔｋｔＡ、（ｃｙｂＢ）、ｙｈｂＨ、ｈｉｓＨ、ｐｂｐＢ／ｆｔｓＩ、ａｎｓＡ、ｇｌｔＢ、ｂｃｐ、ｇｍ４Ｄ、ｙｏａＢ、２３２＃７、ｕｇｄ、ｍａｐ、ｒｆａＬ、ｒｐｌＷ、ｒｆｂＣ、ｒｐｌＫ、ｒｐｓＣ、ｇｌｙＳ、ｓｐｅＧ、ｇｕａＡ、ｒｐｍＢ、ｒｐｌＦ、ｐｔｓＮ、ｓｍｔＡ、ｒｐｍＡ、ｙｋｇＡ、ｏｍｐＴ、ｒｐｌＵ、ｌｓｐＡ、ｅｘｏＸ、ｈｉｓＩ、ｄａｃＡ、ｆａｂＦ、ｙｃｂＷ、ｓｕｃＤ、１２０＃５、ｋｄｇＫ、ｔｒｍＵ、ｌｏｎ、ｎｔｐＡ、ｙｃｉＭ、ｔｏｌＱ、ｒｆａＰ、ｒｆａＩ、ｕｐ１８、ｙｆｇＭ、ｒｐｌＲ、ｇｕａＢ、ｒｉｂＨ、ａｔｐＢ、ｙａｅＬ、ａｔｏＥ、ｙａｇＢ、ｐｄｘＨ、ｃｓｐＪ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＯ、ｐｏｔＤ、ｒｆｂＸ、ｙｒｆＨ／ｈｓｌＲ、ｆｃｌ／ｗｃａＧ、ｔｒｘＢ、ｐｌｓＸ、ｇｌｔＸ、ｄｎａＡ、ｙｄｆＧ、ｐｒｉＢ、ｒｐｓＮ、ｙｈｃＮ、ｍａｎＡ、ｓｕｒＡ、ｐｕｒＥ、ｓｅｃＹ／ｐｒｌＡ、ｄｘｒ、ｙｅａＪ、ｙｆｃＢ、ｄｌｄ、ｃｙｓＰ、ｆｂｐ、３２３＃１、ｉｎｔＤ、ｈｕｐＡ、ｆｔｓＬ、ａｃｅＫ、ｃｏｄＡ等が挙げられる。
（３）安定的高発現性大腸菌株による酵素（タンパク質）の製造方法
さらに、本発明は、前記大腸菌変異株を用いる外来タンパク質、典型的には酵素の製造方法を提供する。
本発明の酵素その他のタンパク質の製造方法では、前記大腸菌変異株を培養し、必要があれば発現誘導を行う。形質転換体の培養方法は、通常の方法が用いられ、培地は栄養培地、合成培地いずれでも構わない。培養温度は、２０〜４２℃の範囲内で任意に選ばれるが、３０℃付近が最も好ましい。大腸菌変異株からの外来タンパク質の回収及び精製は、形質転換体を破砕して遠心分離し、上清を回収し、ゲル濾過や各種のカラムクロマトグラフィー等、タンパク質の精製に使用されている通常の方法（例えば、（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ６）で精製すればよい。また、目的タンパク質がペリプラズムに存在する場合には、Ｗｉｌｌｓｋｙらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２７，５９５−６０９（１９７６））等を参考にして精製することができる。
本発明の製造方法は、大腸菌に導入する遺伝子によって製造され得る任意の酵素その他の外来タンパク質について適用できるが、特に、従来、大腸菌内で発現困難であった遺伝子の発現により製造される酵素その他の外来タンパク質の製造方法として有用である。
こうした酵素その他の外来タンパク質としては、例えば、植物フェニルアラニン アンモニアリアーゼ等が挙げられる。特に植物フェニルアラニン アンモニアリアーゼは、例えばＳＤ８４０株において親株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の１０倍以上の外来遺伝子由来のタンパク質を生成し、さらに形質転換体の３０世代の継代によって変化することなく安定に発現する、非常に好ましい例である。
なお、遺伝子発現によって生成された酵素その他のタンパク質の定量は、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗体を用いたウエスタンブロッティング法等により行うことができる。タンパク質が酵素である場合は活性測定等により行うこともできる。
（４）アミノ酸等の製造方法
さらに、本発明は、前記大腸菌変異株を用いる有用物質の生産法を提供する。前記大腸菌変異株を前記と同様の方法で培養し、必要があれば発現誘導を行う。この培養液から得られる大腸菌変異株菌体、またはその処理物を目的の物質を与える基質物質と反応させ、生成物を得ることにより、野生株を用いた場合に対して、有意に効率的な物質生産を行うことができる。
本発明により生産される有用物質は大腸菌変異株が生産する酵素の種類により、例えば、酵素が分解酵素であれば基質の分解物、酵素が転移酵素であれば基質に所定の基が付加された化合物または基質から所定の基が除去された化合物等が得られる。例えば、アンモニアリアーゼはアンモニアの存在下に、不飽和カルボン酸の不飽和結合にアンモニアを付加してアミノ酸を生成する。
本発明によれば、植物フェニルアラニン アンモニアリアーゼを高発現するＳＤ８４０株を用いて、アンモニア存在下、桂皮酸類と反応させることにより、対応する各種の光学活性なアミノ酸類を生産することができる。ＳＤ８４０株は継代による発現低下等の問題が無く、多くの継代を要するスケールアップ製造において、親株ではなし得なかった安定高生産を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例で使用したプラスミドの制限地図である。
図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングの結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例の条件及び操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年発行に記載の方法による。
なお実施例において酵素活性を測定する場合は、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５、基質としてＬ−フェニルアラニン１０ｍＭの存在下、３０℃において毎分１μｍｏｌｅの桂皮酸を遊離する酵素量を１ユニット（Ｕ）と定義した。
酵素タンパク質量の定量は、ビウレット法により、ウシ血清アルブミンを基準として定量した。
また桂皮酸およびＬ−フェニルアラニンは、反応液を以下の条件下、ＨＰＬＣで分離定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＲＳｐａｋ ＮＮ−６１４（昭和電工株式会社製）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル／水／５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４水溶液（ｐＨ３）＝２０／７０／１０
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ ２１０ｎｍの吸収による
形質転換体の培養には、Ｍ９培地（リン酸水素二ナトリウム０．６％、リン酸二水素カリウム０．３％、塩化ナトリウム０．０５％、塩化アンモニウム０．１％、グルコース０．１％、硫酸マグネシウム１ｍＭ、チアミン塩酸塩０．００１％、塩化カルシウム０．１ｍＭ、ｐＨ７．４）にアンピシリン１００ｐｐｍを加えたものか、ＬＢ培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％）にアンピシリン１００ｐｐｍを加えた培地を用いた。用途に応じて、各培地に２％寒天を加えて固化した寒天平板培地を用いた。
形質転換体の酵素活性測定には、上記培地５〜１００ｍｌで２５℃、３８時間以上培養した培養液から遠心分離によって集菌した菌体を、培養液と等容量の生理食塩水で菌体を洗浄した後、この菌体を培養液の半容量の反応液（４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０．３））に懸濁し、終濃度０．２％（２０００ｍｇ／Ｌ）の基質を加えて３０℃で振盪しながら反応させた。この反応液の一部を適当な時間（通常２〜６時間の間）に取り、菌体を遠心分離して除き、上清をＨＰＬＣ分析して生成物量を定量した。
実施例１：組み換えベクターの作成
本実施例で用いた植物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子の取得法に関しては、本発明者らの先出願（特開２００３−２２５０９２号公報）に詳細に記載されている。特開２００３−２２５０９２号公報に記載の組み換えベクターを用いることもできるが、ここでは、矢崎らの報告（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７），６１（１２），１９９５−２００３）に記載されている組み換えベクターｐＱＥＰＡＬ２より、Ｈｉｓ−ｔａｇコード配列を削除したプラスミドｐＱＥＰＡＬ２／ΔＨｉｓ６（図１参照）を作成して用いた。
なお、図１中、各記号の意味は以下の通りである。ＰＴ５：Ｔ５プロモーター；ｌａｃ：ｌａｃオペレーター；ＲＢＳＩＩ：合成リボゾーム結合サイト；ｐａｌ：フェニルアラニン アンモニアリアーゼ遺伝子；ｔ０／Ｔ１：転写ターミネーター；６×Ｈｉｓ：Ｈｉｓ−ｔａｇコード配列；ＯＲＩ：複製起点；ｂｌａ：β−ラクタマーゼ遺伝子＝アンピシリン耐性遺伝子。
ｐＱＥＰＡＬ２よりＨｉｓ−ｔａｇコード配列を削除するには、組み換えベクターのＨｉｓ−ｔａｇコード配列の前後の位置に相当する、配列番号１に記載のプライマー（５’側；１８ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）及び配列番号２に記載のプライマー（３’側；１８ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）を合成し、Ｈｉｓ−ｔａｇコード配列以外の部分を下記条件のＰＣＲで増幅し、末端平滑化およびリン酸化処理の後、セルフライゲーションすることによって作成した。下記配列番号１のプライマーでは、目的物であることを容易に確認できるよう、ベクター由来のＨｉｎｄＩＩＩサイトの一つが消失するよう１塩基置換を施してある。
［ＰＣＲ条件］
反応液組成：
鋳型プラスミド １μｇ
プライマー 各１００ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ溶液 各１ｍＭ
１０ｘ反応バッファー １０μｌ
ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５Ｕ 計５０μｌ
反応条件：
熱変性 ９４℃、３０秒
アニーリング ５５℃、６０秒
伸長 ７２℃、３００秒
サイクル数 ３０回
以上の条件によりベクター断片の増幅を行ったところ、理論的に算出される断片長約５．５ｋｂの断片がほぼ特異的に増幅された。このＰＣＲ反応液を用いて、ＴａＫａＲａ ＢＫＬ Ｋｉｔ（宝酒造社製）の標準的なプロトコルに従って断片をセルフライゲーションした。続いてライゲーション溶液で宿主大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３５℃で２４時間培養した。
形成されたコロニー６株より、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを調整し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによるカットパターンを調べた。この結果、６株より抽出されたプラスミドは全て目的のＨｉｓ−ｔａｇコード配列が除かれたプラスミドであることが確認できた。
実施例２：ＰＡＬ（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）活性を示す形質転換体の作成
実施例１で得たｐＱＥＰＡＬ２／ΔＨｉｓ６で形質転換した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭおよびアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、２５℃で４８時間培養すると様々な大きさのコロニーが生成した。これらのコロニーから任意に各２４株を選択し、ＬＢ培地５ｍｌで培養した。培養開始３４時間後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭになるよう培養液に加えてさらに４時間培養した。得られた培養液をそれぞれ遠心分離して集菌し、得られた菌体を上記の方法で反応に供した。３時間反応後の生成物をＨＰＬＣにより定量したところ、表２に示すように、各形質転換体の活性は未分離の形質転換体株の活性を１として、相対活性０〜４倍の範囲で様々な活性を示した。
実施例３：単コロニー分離と継代後の形質転換体の活性
実施例２で得たコロニー２４株全てを、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭおよびアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に画線し、２５℃で４８時間培養した。この分離コロニーを、実施例２と同様に培養して活性測定したところ、表３に示すように、活性が変動する株が出現した。
本活性測定で高活性を示した株を、他の株と比較すると、Ｎｏ．７コロニーは生育不良であったが、Ｎｏ．８，１０，２３株は何れも有意に色調が白く、かつ表面光沢を帯び、形状の異なる株であった。
実施例４：ストレス応答性による高活性株の識別法
目視によるノイズの多い識別法ではなく、容易かつ確実に識別可能な特徴がないかを調べるため、各株の過酸化水素分解活性、熱処理後の生育回復性（熱耐性）を調べた。過酸化水素分解活性は、画線培養したＬＢ寒天平板培地上の菌体に、数μｌの過酸化水素水を加え、平板上で気泡の発生状況を観察した。
熱耐性試験は、寒天平板上の菌体を上記Ｍ９培地で１６時間培養した後遠心で集菌し、生理食塩水に懸濁し８時間穏やかに振とうして休止菌体とした。この休止菌体を５５℃で２分間処理した後、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に画線して２５℃で培養した。
この試験の結果、高活性株は全て一般〜低活性な株より生育初期から過酸化水素分解活性が高い傾向が認められた。一方、熱耐性は３株中２株で高い傾向が見られたが、１株は通常株と同様生育不良であった。そこでコロニー形状と生育初期の過酸化水素分解活性を指標に高活性株の分離選抜を試みた。
実施例５：高活性形質転換体の分離選抜
実施例１と同様にして、ｐＱＥＰＡＬ２／ΔＨｉｓ６で形質転換した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭおよびアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、２５℃で４８時間培養した。形成された各コロニーの一部に接するように３０％過酸化水素水１μｌを添加し、分解による発泡を観察したところ、幾つかのコロニーで旺盛な発泡が観察された。この中からコロニー２４株を単離し、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＭ９寒天平板培地に取り、２５℃で４８時間培養した。
単離した２４株の活性を実施例２と同様にして培養し、活性を測定したところ、表４に示すように全ての株で高い活性が確認された。この中から、比較的生育状況も良く、コロニー形成も明確な３株を選択した。
実施例６：高活性株の継代安定性
選択した高活性株Ｎｏ．１６，２０，２１株を、それぞれアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に画線し、２５℃で４８時間培養した。この培養菌体から、同じＬＢ寒天平板培地に画線培養することを５回繰り返した。各植え継ぎの間に、実施例２と同様にして培養し、植え継ぎ毎の活性の変動を確認した。表５に示すように、これらの株のうち２株（Ｎｏ．１６及び２０）については、植え継ぎによる活性変動は小さく、安定した形質として高活性を示すことが確認された。
実施例７：高活性株のプラスミド確認
活性の変化がプラスミドの変異に由来するものか、宿主の変異によるものかを調べる目的で、実施例６で安定高活性を示すことが判った２株よりＮｏ．１６株を選択し、その保持プラスミドを調整し、その全塩基配列（約５．５ｋｂ）および再形質転換体の活性を調べた。
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出し、全塩基配列を両鎖に対するジーンウォーキング解析により解読した。配列決定はＤＮＡシーケンサーｍｏｄｅｌ３７７ ｖｅｒ．３．０の標準的な使用法、すなわち標準的なＰＣＲ反応および泳動・データ解析方法によって決定した。決定した各部分配列の配列結合は核酸配列自動結合ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ／ＡＴＳＱ（ソフトウエア開発株式会社製）により行った。その結果、全配列に渡って置換・脱落等の異常はないことが確認された。
同じ上記プラスミドを用いて、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭおよびアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、２５℃で４８時間培養したところ、実施例２に記載したのと同様、様々な大きさのコロニーが生成した。本コロニーから任意に各２４株を選択し、実施例２と同様にして培養し活性を測定したところ、表６に示すように、各形質転換体の活性は未分離の形質転換体株の活性を１として、相対活性０〜３倍の範囲で様々な活性を示した。
これらの事実より、高活性株から抽出したプラスミドは選抜分離前のプラスミドと全く同じものであり、高活性化はプラスミドの変化によるものではなく、宿主大腸菌株の変化であることが確認された。
実施例８：高活性株のタンパク質生産の確認
実施例６で得られた高活性株Ｎｏ．１６と、実施例７のコロニーＮｏ．２４及びＮｏ．１２株を、実施例２に記載の方法に従い、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地５ｍｌで培養した。培養３４時間後イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭを添加し、さらに４時間培養した。得られた培養液の濁度（６６０ｎｍ）を測定し、ほぼ同じ濁度であることを確認後、培養液の０．１ｍｌを遠心分離して集菌した。この菌体を０．１５ｍｌの生理食塩水に懸濁し、４×ＳＤＳ泳動電気泳動サンプル処理液（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２．１ｍｌ、ＳＤＳ８６０ｍｇ、２−メルカプトエタノール２ｍｌ、グリセロール２．８ｍｌ、ＢＰＢ１ｍｇを混合し、脱イオン水で１０ｍｌにしたもの）０．０５ｍｌを加え、良く混合した後、１００℃で５分間煮沸した。
処理液を遠心（１２，０００ｒｐｍ×５分）して沈殿物を除いた上清１０μｌをそれぞれ１０〜２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２連）に供した。
分離後のアクリルアミドゲルの一方はＣＢＢ染色液でタンパク質染色した。他方のゲルは、標準的な条件のエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜へタンパク質を転写した後、抗ＰＡＬ（兎）抗体を一次抗体として、Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ−ＨＲＰ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の標準的な手法に従い、ウエスタンブロッティングを行った。その結果、活性の高低はＰＡＬ（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）タンパク質の生成量と一致することが確認された（図２参照）。
実施例９：高活性株よりプラスミド除去
実施例６で得られた高活性株Ｎｏ．１６をテトラサイクリン２０ｐｐｍを含むＬＢ培地５ｍｌ、３５℃、２４時間培養した後、培養液の一部を植え継ぎ同条件で培養行うことを１０日間繰り返して行った。１０日目の培養液をＬＢ寒天平板培地に塗布し、３５℃で２４時間培養し、コロニーを形成させた。
形成されたコロニーを、任意に５０個選択し、テトラサイクリン２０ｐｐｍとアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地と、テトラサイクリン２０ｐｐｍのみ含むＬＢ寒天平板培地上に植菌し、２５℃、４８時間培養した。アンピシリン含有培地で生育せず、含有しない培地で生育する株を単離し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株と命名した。
実施例１０：高活性株を用いた反応
実施例６で得た高活性株Ｎｏ．１６を、実施例２に記載の方法に従い、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地１００ｍｌで培養した。この培養液をさらにアンピシリン１００ｐｐｍとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭを含むＬＢ培地２１を入れた５Ｌジャーファーメンターに植菌し、３０℃、８００ｒｐｍ、通気１ｍｌ／ｍｉｎ．で３８時間通気攪拌培養した。
定常期の培養液を遠心分離して得た菌体を、４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０．３）１Ｌに再懸濁し、２０ｇの桂皮酸を加え、３０℃、８００ｒｐｍで撹拌しながら反応を行った。反応液の一部を１時間毎に取り、反応液中に生じたＬ−フェニルアラニンをＨＰＬＣにより定量した。基質濃度が約２％を保つよう基質を逐次添加しながら反応を継続して行ったところ、約３時間で反応液中に約３．５％のＬ−フェニルアラニンが蓄積した。
【産業上の利用可能性】
本発明の選択方法によれば、外来遺伝子を安定的かつ高水準で発現する大腸菌、特に大腸菌内で発現困難な遺伝子を安定的かつ高水準で発現する大腸菌を容易かつ確実に選択できる。植物由来アンモニアリアーゼは大腸菌内で発現困難な遺伝子と考えられてきたが、本発明の方法によれば、植物由来アンモニアリアーゼ遺伝子を安定的に高発現できる。従って、各種不飽和カルボン酸にアミノ基を付加してＬ−アミノ酸やアントシアニン等の化合物を合成するのに有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、外来遺伝子を高発現する大腸菌株の選択方法、その選択方法により選択される大腸菌、及びその菌株を用いる酵素及び化合物の製造方法に関する。さらに詳しくは、大腸菌内での発現が不安定な酵素遺伝子を導入した形質転換体群から当該遺伝子を安定的に高発現する突然変異株を選択する方法、この方法により選択した外来遺伝子高発現性突然変異株、及びその菌株を用いる酵素及び化合物、特にアンモニアリアーゼ及びアミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
大腸菌を用いた外来遺伝子の発現は、極めて多くの研究と実用技術の開発が成されている分野であり、分子生物学・遺伝子工学では最も進んだ分野の一つである。現在では工業における製造手段としての重要性は極めて高く、多くのバイオ医薬が大腸菌を用いた方法により工業的に製造されている。
分子生物学の研究に最も頻用されている大腸菌の菌株は、Ｋ１２株から誘導された菌株である（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｐ．ｐ．１６９３−１７１１）。近年ではＢＬ２１のような大腸菌Ｂ株から誘導された菌株も多く使用されており、組換えタンパク質の産生に最も頻用されている菌株の一覧表がＷｉｎｇｆｉｅｌｄ，１９９７によって提示されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．５．０．１−５．０．３）。
細菌宿主中でタンパク質を発現させる多数の系が文献に記載されている（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，７）。発現系は、プロモーター及びそのレギュレーター、リボソーム固定部位及びその下流で有益な遺伝子が挿入され得る制限部位、転写ターミネーターとして機能し得る構造、超発現した有益なタンパク質の品質を同時発現によって改善すべく任意に存在する遺伝子、並びに、これらの組合せを宿主に導入し得る１つまたは複数のベクターとから構成されている。
これらのベクターは、プラスミドＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩ（Ｐｏｌｉｓｋｙ，１９８８，Ｃｅｌｌ５５：９２９−９３２）によってコードされている２つのＲＮＡの相互作用によって決定される所定のコピー数で細胞中に存在している。大腸菌中の発現プラスミドのコピー数の調節に関しては、複数の戦略が文献に記載されている（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｐ．ｐ．１６９３−１７１１、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，７）。
大腸菌に外来遺伝子を組み込み発現させる場合、発現させようとする外来遺伝子と、これらの大腸菌とその遺伝子発現系には「相性」があり、試行錯誤法で選択されるのが一般的である。目的タンパク質が充分量得られない状況としては、生産されたタンパク質が本来有する正常な構造を取り得ず沈殿物（インクルージョン・ボディ）となる場合や、生産されても直ちに分解されるといった場合があるが、このような様々な問題を解決する多くの手段も文献で紹介されている（特開平１０−３１３８６３号公報、特開平８−１４０６７１号公報、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，７）。
上記のように、多くの情報と膨大な数の発現系や大腸菌株を以てしても、未だ安定に発現させることが困難な遺伝子は多く、目的とする外来遺伝子を発現させてタンパク質を得ようとする時、充分な量が得られないことは非常に多い。さらには、一度目的に合わせて作成した大腸菌菌株でも、保存中や継代する間に遺伝子発現が低下することもしばしば見られる現象であり、その原因はまだ不明な場合が多い。例えば、本明者らは、酵素アンモニアリアーゼのアミノ基付加反応を利用して各種の桂皮酸類からＬ−アミノ酸類を製造する方法を発明し特許出願している（特開２００３−２２５０９２号公報）が、この研究過程においても、大腸菌を形質転換して酵素アンモニアリアーゼを発現させた場合、継代を重ねるにつれ形質転換体の活性が低下する現象が見られた。この継代による活性低下は、一般に言われる発現調節部位のメチル化やプラスミドの脱落・変異等によるものでは無く、既知情報の何れによっても回避できない困難なものであった。
小スケールの培養で目的が果たせる基礎研究の場合は、新たに形質転換をやり直し、再度形質転換体を得ることで解決するのが一般的であるが、比較的大スケールで培養時間が長く、多数の継代を経る工業生産の場合、遺伝子発現の不安定さは極めて深刻な問題である。
しかしながら、遺伝子発現の安定化に関する問題としてこれまでに取り上げられ、対策が研究されているのは、プラスミドの脱落による外来遺伝子の脱落の防止、プラスミドの修飾や変異による転写不全の回避のみであり、宿主そのものの変異による発現低下の対策が論じられることは無かった。この事実は、実験室で宿主として用いられている大腸菌の多くはプラスミドの変異や修飾を行わず安定に保持するよう改変された変異株であり、これ以上の改変に関する情報は未だない状況であることによると思われる。さらにはプラスミドを含む外来遺伝子側の改変により問題を回避することが可能な場合もあり、通常は宿主大腸菌の変異に取り組むよりは技術的に実績のある外来遺伝子側の改変を試みることが多かった。しかしながら、外来遺伝子の改変は時間と労力を要する作業であり、必ずしも成功するものではない。また外来遺伝子の改変をもってしても安定化できない遺伝子の発現には対策がない状況であった。
【発明の開示】
本発明の課題は、継代や保存によって発現量が低下する傾向がある発現不安定な外来遺伝子から充分なタンパク質を得る時に有用な大腸菌変異株を提供すること、及びそのような菌株を用いた工業的に重要な化学物質の製造方法を提供することにある。
さらに詳細には、プラスミドの脱落・変異・修飾以外の原因で発現が低下する外来遺伝子の発現を安定化した大腸菌変異株を提供すること、及びそのような菌株を用いた工業的に重要な化学物質の製造方法を提供することにある。
特に、プラスミドの異常を伴わずに大腸菌における発現が低下する傾向の強い植物由来フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子の発現を安定化した大腸菌変異株を提供すること、及びそのような菌株を用いて工業的に重要なアミノ酸類を製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、過酸化水素分解能という、タンパク質生産には直接には関係しない一種のストレス耐性能を指標にして大腸菌株の選択を行なえば、継代しても遺伝子発現が低下しない変異株を獲得できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、継代や保存によって発現量が低下する傾向がある発現不安定な外来遺伝子から充分なタンパク質を得る時に有用な大腸菌変異株を与え、そのような菌株を用いて工業的に重要な化学物質を製造する方法を与えるものである。
すなわち、本発明は下記の大腸菌株選択方法、選択された大腸菌株、これを用いた酵素の製造方法及びその酵素を用いた有用化合物の製造方法を提供する。
［１］ ストレス応答の強さを指標として選抜することを特徴とする外来遺伝子高発現性大腸菌株の選択方法。
［２］ ストレス応答が過酸化水素分解活性である前記１に記載の選択方法。
［３］ 大腸菌に導入された際に、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子を高発現する前記１または２に記載の選択方法。
［４］ ストレス応答の強さを指標として選抜された外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［５］ ストレス応答が過酸化水素分解活性である前記４に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［６］ 大腸菌に導入された際に、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子を高発現する前記４または５に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［７］ 大腸菌株を３０世代継代する間に発現量が２分の１まで低下する遺伝子を発現させたときに、発現量が初代の水準に維持されるかまたは向上する前記４乃至６のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［８］ プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子が、アンモニアリアーゼの遺伝子である前記６または７に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［９］ アンモニアリアーゼの発現系遺伝子がフェニルアラニンアンモニアリアーゼの遺伝子である前記８に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１０］ フェニルアラニンアンモニアリアーゼの遺伝子が、植物由来である前記９に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１１］ 植物がムラサキ科ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）である前記１０に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１２］ 大腸菌株がＫ１２株由来である前記４乃至１１のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１３］ 大腸菌株がＸＬ１−Ｂｌｕｅ株由来である前記１２に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１４］ 大腸菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株である前記１３に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１５］ 大腸菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株からクローン選択または遺伝子操作によって得られる誘導株である前記１４に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
［１６］ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４６）。
［１７］ 前記４乃至１５のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株の外来遺伝子を発現させることを特徴とする酵素の製造方法。
［１８］ 前記４乃至１５のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株またはその産生する酵素を含む処理液をその酵素の基質と反応させることを特徴とする化合物の製造方法。
［１９］ 酵素がアンモニアリアーゼであり、基質が不飽和カルボン酸であり、得られる化合物がＬ−アミノ酸および／またはその誘導体である前記１８に記載の化合物の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
（１）高発現性大腸菌株の選択方法
本発明において外来遺伝子安定的高発現性大腸菌株とは、慣用の手法によって大腸菌に外来遺伝子を導入した際に相対的に発現量が大きく、さらに、その発現が安定している株を指す。発現させるべき外来遺伝子は特に限定されないが、「発現困難な外来遺伝子」を導入しようとする場合、本発明は特に有用である。ここで、「発現困難な外来遺伝子」とは、大腸菌に導入し形質を転換し当該形質転換大腸菌を継代培養したときに、継代する間に外来遺伝子の発現が低下する遺伝子をいう。より詳しくは、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子であり、大腸菌の発現プラスミド上に発現可能な形で組み込んで大腸菌に導入した時に、プラスミドの脱落や変異等の異常がないにもかかわらずタンパク質生産が行われない遺伝子を指す。
本発明の大腸菌変異株選択方法を、以下に詳細に説明する。なお、変異の誘導等は、特に明記しない限り、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年発行等に記載の方法を参考にして行うことができる。
まず、大腸菌変異株の製造方法を説明する。本変異株の選抜は、発現困難な遺伝子を有する組換えベクターで宿主大腸菌を形質転換した形質転換体を用いて行う。組換えベクターの作成には大腸菌での発現制御に必要な配列を有する発現プラスミド、例えば市販のｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３、ｐＵＣ１８等を用いることができる。これらの発現プラスミドの適当なサイトに発現困難な遺伝子を組み換えたベクター、すなわち、大腸菌プロモーター及びそのレギュレーター、好ましくはｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター等の下流に、リボソーム固定部位と連続した発現困難な遺伝子、転写ターミネーターとして機能し得る構造およびマーカー遺伝子等から構成されている大腸菌組換えベクターを構築する。
本発明において形質転換する大腸菌株は特に制限されないが、好ましくは、Ｋ１２株、Ｂ株等が用いられ、生物学的封じ込めの観点から、Ｋ１２株が好適に用いられる。例えば、一般的な宿主として市販されている（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、日本国内ではＴＯＹＯＢＯより購入可能）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＆ Ｓｈｏｒｔ，１９８７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５：３７６−３７８）、ＪＭ１０９株（ＴａＫａＲａより購入可能）、ＨＢ１０１株等、広く大腸菌宿主として用いられ、形質の安定した株を用いることができる。
通常用いられる大腸菌が生育可能な培地に、使用する組換えベクターに対応した形質転換体選抜物質（例えば、アンピシリン等の抗生物質）を適量加え、さらに寒天を加えて平板化した寒天平板培地、好ましくはＭ９グルコースプレートに、形質転換体を塗布し、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３５℃、より好ましくは２５℃でコロニーが明確に形成されるまで１６時間〜７２時間、好ましくは２４時間〜４８時間培養する。
発現困難な遺伝子を有する形質転換体は、多くの場合不均一なコロニーを形成する。本発明では、この形質転換体菌株の中からストレス応答の強さを指標として選抜を行なう。利用可能なストレス応答のタイプは特に限定されないが、利用可能なものとしては、過酸化水素分解活性、熱処理後の生育回復性（熱耐性）等が挙げられる。この中でも過酸化水素分解活性は、コロニーに微量の過酸化水素液を反応させた時、過酸化水素を分解して酸素を発生する量の大小でストレス応答の強さを目視により見分けることができるので好ましい。
必要であれば、一時選抜と同じ指標を以てさらに選抜を繰り返してもよい。また、選抜に際しては、ストレス応答を示す株の中で、コロニーの色調が他と比較して白色に近いものや、コロニー径が有意に小さいものが特に選抜対象として好ましい。また、二次選抜以降の株について、既知の手法による生成タンパク質の解析を併用してさらなる選抜を行なってもよい。
得られた変異株を薬剤圧のない培地で継代することにより、選択時に使用した組み換えベクターを脱落させることができ、これにより宿主大腸菌変株を得る。
得られた宿主大腸菌変異株の継代安定性は、菌株が生育する通常の条件で薬剤による選択圧をかけずに所定の分裂回数が得られるまで継代培養した後、外来遺伝子の発現を見ることで評価することができる。例えば、ＬＢブロスのごとき栄養培地に、初期濁度が０．１になる量の被検菌株を植菌し、濁度３以上に達するまで培養すると、約５世代の継代数となる。同じ条件で６回の培養を繰り返すことで３０世代継代の菌体を得ることができ、この菌体の外来遺伝子発現を、外来遺伝子に由来するタンパク質の生産量等を指標にして評価すればよい。
変異株の選抜中に特に変異処理を施す必要はないが、用いる宿主大腸菌によっては通常用いる変異処理、例えば紫外線照射、変異薬剤処理等を施すことが好適な場合もある。
こうして得られた本発明の大腸菌変異株は、親株と比べて成長速度、形質転換方法及び保存方法等に差異はなく、２５℃〜３７℃の温度範囲、通常の栄養培地において、通常の操作で取り扱いができる。
ストレス応答性の高い株が高発現・高活性を持つ理由は明らかではないが、外来遺伝子の発現がストレスの一種であることと関係していると思われる。もっとも、高ストレス応答性は、外来遺伝子の発現を抑圧してストレスを軽減する方向に働くとも考えられるから、ストレス応答性の高い株が高発現・高活性を持つことを見出した本発明の知見は全く予想外のものである。
（２）安定的高発現性大腸菌株
本発明は上記の方法により選択される大腸菌株を提供する。本発明により選択される大腸菌株は、上記の通り、実質的に任意の大腸菌株の任意の形質転換株における安定的高発現性大腸菌株である。
このようにして得られる変異株の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株が挙げられる。これは、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を親株とし、植物フェニルアラニン アンモニアリアーゼ遺伝子を導入した形質転換株から上記の手法により選抜された安定的高発現性大腸菌株であり、親株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の１０倍以上の外来遺伝子由来のタンパク質を生成し、さらに形質転換体の３０世代の継代によって変化することなく安定に発現する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し（受託日：２００２年９月２７日，受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０４７）、２００３年１１月１０日付で国際寄託に移管した（国際受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４６）。
本発明の選択方法により取得された大腸菌変異株の一つであるＳＤ８４０株の顕著な特徴を親株と対比して以下に挙げる。
さらに本発明の大腸菌変異株は、生育後期（定常期以降）のゲノム解析の結果、親株に比較して高い発現をしている特徴的な遺伝子によってもその性質が示される。これらの遺伝子には未だ機能が特定されていないものも含まれ、発現困難な遺伝子が安定発現される原因であるものと結果であるものが混在しているが、本変異株の一つであるＳＤ８４０株の性質を示すものである。有意に発現している特徴的な遺伝子は、ｏｐｐＡ、ｏｍｐＡ、ｔｕｆＢ、ｔｕｆＡ、ｆｕｓＡ、ｇａｐＡ、ｒｐｓＡ、ａｈｐＣ、ｉｎｆＣ、ｋａｔＥ、ｙｄｉＨ、ｌａｃＩ、ｉｃｄＡ、ｏｐｐＣ、ｒｐｏＢ、ｙｎｈＡ、ｏｍｐＸ、ｄｎａＪ、ｏｐｐＢ、ｙｃｅＤ、ｄｎａＫ、ａｃｏ２、ｃｌｄ、ｚｉｐＡ、ｍｉｎＣ、ｇａｌＦ、ｇｎｄ、ｙａｆＫ、ｆａｂＢ、ｔｒｍＤ、ｃｙｓＫ、ｃｙｄＡ、ｈｓｌＶ、ｐｅｐＮ、ｏｐｐＦ、ｒｐｏＣ、ｏｍｐＦ、ｒｐｏＡ、ｐｈｅＳ、ｒｐｓＢ、ｏｐｐＤ、ｐｅｐＤ、ｓｅｒＳ、ｔｏｐＡ、ｇｒｐＥ、ｙｅａＦ、ａｓｎＢ、ｓｅｒＣ、ｐｐｉＢ、ｔｏｌＢ、ｙｃｂＫ、ｙｂｅＹ、ｐｒｓＡ、ｒｐｓＧ、ｇｙｒＡ、ａｈｐＦ、ｔｙｒＳ、ｐｈｅＡ、ｃｌｐＢ、ｒｐｓＬ、ｃｙｄＢ、ａｓｐｓ、ｙｂｄＲ、ｆｔｓＺ、ａｒｏＧ、ｒｐｌＪ、ｔｓｆ、ｒｐｓＰ、Ｃｎｔ５、ｒｐｌＡ、ａｃｅＡ、ｍｄｈ、ｙｂｇＦ、ａｄｄ、ｙｊｊＺ、ｒｐｌＣ、（ｅｒｆＫ）、ｄｃｐ、ｇｌｆ、ａｍｎ、ａｃｅＢ、ｒｐｓＤ、ｍｏｐＢ、ｇｐｔ、ｙａｉＬ、ｒｐｏＤ、ｙｎｆＢ、ｐｇｍＵ、ｒｐｌＥ、ｒｆｂＢ、ｓｅｑＡ、ａｓｎＳ、ｚｗｆ、ｅｄａ、ｆａｂＺ、ｏｔｓＡ、Ｃｎｔ５、ｌｒｐ、ｙｃｈＢ、ｐａｌ、ｒｐｌＹ、ｆｏｌＥ、ｒｐｌＮ、ｇｌｎＳ、ｒｉｍＭ、ｙｅｆＧ、ｙｄｃＦ、ｒｌｐＡ、ｙａｃＡ、ｆａｂＤ、Ｃｎｔ５、ｒｆｂＤ、ｄｉｃＡ、ｍｅｔＧ、ｐｐｃ、（ｙｅｅＴ）、ｙａｆＪ、ａｓｐＣ、ｐｙｒＣ、ｌｅｕＳ、ｙｃｂＬ、ｒｐｌＴ、ｙｋｆＦ、ｓｏｄＢ、４３０＃６、ｒｎｂ、ｒｐｓＥ、ｙｅｂＣ、ｒｐｓＪ、６６４＃１１、ｙｌｉＪ、ｙｃｆＣ、ｐｎｐ、ｒｆｂＡ、ｙｂｉＣ、ｒｐｌＳ、ｔｒｐＡ、ｈｕｐＢ、ｈｉｓＣ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＨ、ｐｈｅＴ、ｙｅｆＩ、ｌｐｄＡ、ｓｅｒＡ、ｌｏｌＡ、ｗｂｂＪ、ｌｅｕＣ、ｒｌｐＢ、ｒｐｌＤ、ｓｕｃＢ、ｆｋｐＢ／ｓｌｐＡ、ｙｇｆＢ、ｒｐｌＸ、ｈｔｐＧ、ｍｏｐＡ、ｐｎｔＡ、ｒｐｓＦ、ｉｎｆＢ、ｙｃｉＩ、（ｙｈｈＸ）、ｍｏａＢ、ｙｃｊＸ、ｇｌｙＱ、ｙａｇＵ、ｔｏｌＣ、ｇｃｖＲ、ｇｄｈＡ、ｙａｄＦ、ｐｕｒＢ、ｓｐｅＥ、（ｙｅｆＪ）、ｙｇｇＢ、ａｃｃＡ、ｙｂｉＴ、ｍｏａＥ、ｒｐｓＫ、ｙｌｅＡ、ｍｕｋＥ／ｋｉｃＡ、ｐｒｆＢ、ｙｂａＤ、ｒｉｂＦ、ｈｓｌＵ、ａｄｋ、ｒｐｓＭ、ｒｐｌＱ、ｎｆｎＢ、ｙｆｈＦ、ｙｆｉＢ、ｙａｅＳ／ｕｐｐＳ／ｒｔｈ、ａｒｏＡ、ｄａｐＤ、２２１＃１５、ｔｋｔＡ、（ｃｙｂＢ）、ｙｈｂＨ、ｈｉｓＨ、ｐｂｐＢ／ｆｔｓＩ、ａｎｓＡ、ｇｌｔＢ、ｂｃｐ、ｇｍ４Ｄ、ｙｏａＢ、２３２＃７、ｕｇｄ、ｍａｐ、ｒｆａＬ、ｒｐｌＷ、ｒｆｂＣ、ｒｐｌＫ、ｒｐｓＣ、ｇｌｙＳ、ｓｐｅＧ、ｇｕａＡ、ｒｐｍＢ、ｒｐｌＦ、ｐｔｓＮ、ｓｍｔＡ、ｒｐｍＡ、ｙｋｇＡ、ｏｍｐＴ、ｒｐｌＵ、ｌｓｐＡ、ｅｘｏＸ、ｈｉｓＩ、ｄａｃＡ、ｆａｂＦ、ｙｃｂＷ、ｓｕｃＤ、１２０＃５、ｋｄｇＫ、ｔｒｍＵ、ｌｏｎ、ｎｔｐＡ、ｙｃｉＭ、ｔｏｌＱ、ｒｆａＰ、ｒｆａＩ、ｕｐ１８、ｙｆｇＭ、ｒｐｌＲ、ｇｕａＢ、ｒｉｂＨ、ａｔｐＢ、ｙａｅＬ、ａｔｏＥ、ｙａｇＢ、ｐｄｘＨ、ｃｓｐＪ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＯ、ｐｏｔＤ、ｒｆｂＸ、ｙｒｆＨ／ｈｓｌＲ、ｆｃｌ／ｗｃａＧ、ｔｒｘＢ、ｐｌｓＸ、ｇｌｔＸ、ｄｎａＡ、ｙｄｆＧ、ｐｒｉＢ、ｒｐｓＮ、ｙｈｃＮ、ｍａｎＡ、ｓｕｒＡ、ｐｕｒＥ、ｓｅｃＹ／ｐｒｌＡ、ｄｘｒ、ｙｅａＪ、ｙｆｃＢ、ｄｌｄ、ｃｙｓＰ、ｆｂｐ、３２３＃１、ｉｎｔＤ、ｈｕｐＡ、ｆｔｓＬ、ａｃｅＫ、ｃｏｄＡ等が挙げられる。
（３）安定的高発現性大腸菌株による酵素（タンパク質）の製造方法
さらに、本発明は、前記大腸菌変異株を用いる外来タンパク質、典型的には酵素の製造方法を提供する。
本発明の酵素その他のタンパク質の製造方法では、前記大腸菌変異株を培養し、必要があれば発現誘導を行う。形質転換体の培養方法は、通常の方法が用いられ、培地は栄養培地、合成培地いずれでも構わない。培養温度は、２０〜４２℃の範囲内で任意に選ばれるが、３０℃付近が最も好ましい。大腸菌変異株からの外来タンパク質の回収及び精製は、形質転換体を破砕して遠心分離し、上清を回収し、ゲル濾過や各種のカラムクロマトグラフィー等、タンパク質の精製に使用されている通常の方法（例えば、（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ６）で精製すればよい。また、目的タンパク質がペリプラズムに存在する場合には、Ｗｉｌｌｓｋｙらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２７，５９５−６０９（１９７６））等を参考にして精製することができる。
本発明の製造方法は、大腸菌に導入する遺伝子によって製造され得る任意の酵素その他の外来タンパク質について適用できるが、特に、従来、大腸菌内で発現困難であった遺伝子の発現により製造される酵素その他の外来タンパク質の製造方法として有用である。
こうした酵素その他の外来タンパク質としては、例えば、植物フェニルアラニン アンモニアリアーゼ等が挙げられる。特に植物フェニルアラニン アンモニアリアーゼは、例えばＳＤ８４０株において親株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の１０倍以上の外来遺伝子由来のタンパク質を生成し、さらに形質転換体の３０世代の継代によって変化することなく安定に発現する、非常に好ましい例である。
なお、遺伝子発現によって生成された酵素その他のタンパク質の定量は、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗体を用いたウエスタンブロッティング法等により行うことができる。タンパク質が酵素である場合は活性測定等により行うこともできる。
（４）アミノ酸等の製造方法
さらに、本発明は、前記大腸菌変異株を用いる有用物質の生産法を提供する。前記大腸菌変異株を前記と同様の方法で培養し、必要があれば発現誘導を行う。この培養液から得られる大腸菌変異株菌体、またはその処理物を目的の物質を与える基質物質と反応させ、生成物を得ることにより、野生株を用いた場合に対して、有意に効率的な物質生産を行うことができる。
本発明により生産される有用物質は大腸菌変異株が生産する酵素の種類により、例えば、酵素が分解酵素であれば基質の分解物、酵素が転移酵素であれば基質に所定の基が付加された化合物または基質から所定の基が除去された化合物等が得られる。例えば、アンモニアリアーゼはアンモニアの存在下に、不飽和カルボン酸の不飽和結合にアンモニアを付加してアミノ酸を生成する。
本発明によれば、植物フェニルアラニン アンモニアリアーゼを高発現するＳＤ８４０株を用いて、アンモニア存在下、桂皮酸類と反応させることにより、対応する各種の光学活性なアミノ酸類を生産することができる。ＳＤ８４０株は継代による発現低下等の問題が無く、多くの継代を要するスケールアップ製造において、親株ではなし得なかった安定高生産を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例で使用したプラスミドの制限地図である。
図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングの結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例の条件及び操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年発行に記載の方法による。
なお実施例において酵素活性を測定する場合は、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５、基質としてＬ−フェニルアラニン１０ｍＭの存在下、３０℃において毎分１μｍｏｌｅの桂皮酸を遊離する酵素量を１ユニット（Ｕ）と定義した。
酵素タンパク質量の定量は、ビウレット法により、ウシ血清アルブミンを基準として定量した。
また桂皮酸およびＬ−フェニルアラニンは、反応液を以下の条件下、ＨＰＬＣで分離定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＲＳｐａｋ ＮＮ−６１４（昭和電工株式会社製）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル／水／５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４水溶液（ｐＨ３）＝２０／７０／１０
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ ２１０ｎｍの吸収による
形質転換体の培養には、Ｍ９培地（リン酸水素二ナトリウム０．６％、リン酸二水素カリウム０．３％、塩化ナトリウム０．０５％、塩化アンモニウム０．１％、グルコース０．１％、硫酸マグネシウム１ｍＭ、チアミン塩酸塩０．００１％、塩化カルシウム０．１ｍＭ、ｐＨ７．４）にアンピシリン１００ｐｐｍを加えたものか、ＬＢ培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％）にアンピシリン１００ｐｐｍを加えた培地を用いた。用途に応じて、各培地に２％寒天を加えて固化した寒天平板培地を用いた。
形質転換体の酵素活性測定には、上記培地５〜１００ｍｌで２５℃、３８時間以上培養した培養液から遠心分離によって集菌した菌体を、培養液と等容量の生理食塩水で菌体を洗浄した後、この菌体を培養液の半容量の反応液（４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０．３））に懸濁し、終濃度０．２％（２０００ｍｇ／Ｌ）の基質を加えて３０℃で振盪しながら反応させた。この反応液の一部を適当な時間（通常２〜６時間の間）に取り、菌体を遠心分離して除き、上清をＨＰＬＣ分析して生成物量を定量した。
実施例１：組み換えベクターの作成
本実施例で用いた植物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子の取得法に関しては、本発明者らの先出願（特開２００３−２２５０９２号公報）に詳細に記載されている。特開２００３−２２５０９２号公報に記載の組み換えベクターを用いることもできるが、ここでは、矢崎らの報告（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７），６１（１２），１９９５−２００３）に記載されている組み換えベクターｐＱＥＰＡＬ２より、Ｈｉｓ−ｔａｇコード配列を削除したプラスミドｐＱＥＰＡＬ２／ΔＨｉｓ６（図１参照）を作成して用いた。
なお、図１中、各記号の意味は以下の通りである。ＰＴ５：Ｔ５プロモーター；ｌａｃ：ｌａｃオペレーター；ＲＢＳＩＩ：合成リボゾーム結合サイト；ｐａｌ：フェニルアラニン アンモニアリアーゼ遺伝子；ｔ０／Ｔ１：転写ターミネーター；６×Ｈｉｓ：Ｈｉｓ−ｔａｇコード配列；ＯＲＩ：複製起点；ｂｌａ：β−ラクタマーゼ遺伝子＝アンピシリン耐性遺伝子。
ｐＱＥＰＡＬ２よりＨｉｓ−ｔａｇコード配列を削除するには、組み換えベクターのＨｉｓ−ｔａｇコード配列の前後の位置に相当する、配列番号１に記載のプライマー（５’側；１８ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）及び配列番号２に記載のプライマー（３’側；１８ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）を合成し、Ｈｉｓ−ｔａｇコード配列以外の部分を下記条件のＰＣＲで増幅し、末端平滑化およびリン酸化処理の後、セルフライゲーションすることによって作成した。下記配列番号１のプライマーでは、目的物であることを容易に確認できるよう、ベクター由来のＨｉｎｄＩＩＩサイトの一つが消失するよう１塩基置換を施してある。
［ＰＣＲ条件］
反応液組成：
鋳型プラスミド １μｇ
プライマー 各１００ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ溶液 各１ｍＭ
１０ｘ反応バッファー １０μｌ
ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５Ｕ 計５０μｌ
反応条件：
熱変性 ９４℃、３０秒
アニーリング ５５℃、６０秒
伸長 ７２℃、３００秒
サイクル数 ３０回
以上の条件によりベクター断片の増幅を行ったところ、理論的に算出される断片長約５．５ｋｂの断片がほぼ特異的に増幅された。このＰＣＲ反応液を用いて、ＴａＫａＲａ ＢＫＬ Ｋｉｔ（宝酒造社製）の標準的なプロトコルに従って断片をセルフライゲーションした。続いてライゲーション溶液で宿主大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３５℃で２４時間培養した。
形成されたコロニー６株より、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを調整し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによるカットパターンを調べた。この結果、６株より抽出されたプラスミドは全て目的のＨｉｓ−ｔａｇコード配列が除かれたプラスミドであることが確認できた。
実施例２：ＰＡＬ（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）活性を示す形質転換体の作成
実施例１で得たｐＱＥＰＡＬ２／ΔＨｉｓ６で形質転換した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭおよびアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、２５℃で４８時間培養すると様々な大きさのコロニーが生成した。これらのコロニーから任意に各２４株を選択し、ＬＢ培地５ｍｌで培養した。培養開始３４時間後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭになるよう培養液に加えてさらに４時間培養した。得られた培養液をそれぞれ遠心分離して集菌し、得られた菌体を上記の方法で反応に供した。３時間反応後の生成物をＨＰＬＣにより定量したところ、表２に示すように、各形質転換体の活性は未分離の形質転換体株の活性を１として、相対活性０〜４倍の範囲で様々な活性を示した。
実施例３：単コロニー分離と継代後の形質転換体の活性
実施例２で得たコロニー２４株全てを、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭおよびアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に画線し、２５℃で４８時間培養した。この分離コロニーを、実施例２と同様に培養して活性測定したところ、表３に示すように、活性が変動する株が出現した。
本活性測定で高活性を示した株を、他の株と比較すると、Ｎｏ．７コロニーは生育不良であったが、Ｎｏ．８，１０，２３株は何れも有意に色調が白く、かつ表面光沢を帯び、形状の異なる株であった。
実施例４：ストレス応答性による高活性株の識別法
目視によるノイズの多い識別法ではなく、容易かつ確実に識別可能な特徴がないかを調べるため、各株の過酸化水素分解活性、熱処理後の生育回復性（熱耐性）を調べた。過酸化水素分解活性は、画線培養したＬＢ寒天平板培地上の菌体に、数μｌの過酸化水素水を加え、平板上で気泡の発生状況を観察した。
熱耐性試験は、寒天平板上の菌体を上記Ｍ９培地で１６時間培養した後遠心で集菌し、生理食塩水に懸濁し８時間穏やかに振とうして休止菌体とした。この休止菌体を５５℃で２分間処理した後、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に画線して２５℃で培養した。
この試験の結果、高活性株は全て一般〜低活性な株より生育初期から過酸化水素分解活性が高い傾向が認められた。一方、熱耐性は３株中２株で高い傾向が見られたが、１株は通常株と同様生育不良であった。そこでコロニー形状と生育初期の過酸化水素分解活性を指標に高活性株の分離選抜を試みた。
実施例５：高活性形質転換体の分離選抜
実施例１と同様にして、ｐＱＥＰＡＬ２／ΔＨｉｓ６で形質転換した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭおよびアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、２５℃で４８時間培養した。形成された各コロニーの一部に接するように３０％過酸化水素水１μｌを添加し、分解による発泡を観察したところ、幾つかのコロニーで旺盛な発泡が観察された。この中からコロニー２４株を単離し、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＭ９寒天平板培地に取り、２５℃で４８時間培養した。
単離した２４株の活性を実施例２と同様にして培養し、活性を測定したところ、表４に示すように全ての株で高い活性が確認された。この中から、比較的生育状況も良く、コロニー形成も明確な３株を選択した。
実施例６：高活性株の継代安定性
選択した高活性株Ｎｏ．１６，２０，２１株を、それぞれアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に画線し、２５℃で４８時間培養した。この培養菌体から、同じＬＢ寒天平板培地に画線培養することを５回繰り返した。各植え継ぎの間に、実施例２と同様にして培養し、植え継ぎ毎の活性の変動を確認した。表５に示すように、これらの株のうち２株（Ｎｏ．１６及び２０）については、植え継ぎによる活性変動は小さく、安定した形質として高活性を示すことが確認された。
実施例７：高活性株のプラスミド確認
活性の変化がプラスミドの変異に由来するものか、宿主の変異によるものかを調べる目的で、実施例６で安定高活性を示すことが判った２株よりＮｏ．１６株を選択し、その保持プラスミドを調整し、その全塩基配列（約５．５ｋｂ）および再形質転換体の活性を調べた。
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出し、全塩基配列を両鎖に対するジーンウォーキング解析により解読した。配列決定はＤＮＡシーケンサーｍｏｄｅｌ３７７ ｖｅｒ．３．０の標準的な使用法、すなわち標準的なＰＣＲ反応および泳動・データ解析方法によって決定した。決定した各部分配列の配列結合は核酸配列自動結合ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ／ＡＴＳＱ（ソフトウエア開発株式会社製）により行った。その結果、全配列に渡って置換・脱落等の異常はないことが確認された。
同じ上記プラスミドを用いて、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭおよびアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、２５℃で４８時間培養したところ、実施例２に記載したのと同様、様々な大きさのコロニーが生成した。本コロニーから任意に各２４株を選択し、実施例２と同様にして培養し活性を測定したところ、表６に示すように、各形質転換体の活性は未分離の形質転換体株の活性を１として、相対活性０〜３倍の範囲で様々な活性を示した。
これらの事実より、高活性株から抽出したプラスミドは選抜分離前のプラスミドと全く同じものであり、高活性化はプラスミドの変化によるものではなく、宿主大腸菌株の変化であることが確認された。
実施例８：高活性株のタンパク質生産の確認
実施例６で得られた高活性株Ｎｏ．１６と、実施例７のコロニーＮｏ．２４及びＮｏ．１２株を、実施例２に記載の方法に従い、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地５ｍｌで培養した。培養３４時間後イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭを添加し、さらに４時間培養した。得られた培養液の濁度（６６０ｎｍ）を測定し、ほぼ同じ濁度であることを確認後、培養液の０．１ｍｌを遠心分離して集菌した。この菌体を０．１５ｍｌの生理食塩水に懸濁し、４×ＳＤＳ泳動電気泳動サンプル処理液（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２．１ｍｌ、ＳＤＳ８６０ｍｇ、２−メルカプトエタノール２ｍｌ、グリセロール２．８ｍｌ、ＢＰＢ１ｍｇを混合し、脱イオン水で１０ｍｌにしたもの）０．０５ｍｌを加え、良く混合した後、１００℃で５分間煮沸した。
処理液を遠心（１２，０００ｒｐｍ×５分）して沈殿物を除いた上清１０μｌをそれぞれ１０〜２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２連）に供した。
分離後のアクリルアミドゲルの一方はＣＢＢ染色液でタンパク質染色した。他方のゲルは、標準的な条件のエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜へタンパク質を転写した後、抗ＰＡＬ（兎）抗体を一次抗体として、Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ−ＨＲＰ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の標準的な手法に従い、ウエスタンブロッティングを行った。その結果、活性の高低はＰＡＬ（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）タンパク質の生成量と一致することが確認された（図２参照）。
実施例９：高活性株よりプラスミド除去
実施例６で得られた高活性株Ｎｏ．１６をテトラサイクリン２０ｐｐｍを含むＬＢ培地５ｍｌ、３５℃、２４時間培養した後、培養液の一部を植え継ぎ同条件で培養行うことを１０日間繰り返して行った。１０日目の培養液をＬＢ寒天平板培地に塗布し、３５℃で２４時間培養し、コロニーを形成させた。
形成されたコロニーを、任意に５０個選択し、テトラサイクリン２０ｐｐｍとアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ寒天平板培地と、テトラサイクリン２０ｐｐｍのみ含むＬＢ寒天平板培地上に植菌し、２５℃、４８時間培養した。アンピシリン含有培地で生育せず、含有しない培地で生育する株を単離し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株と命名した。
実施例１０：高活性株を用いた反応
実施例６で得た高活性株Ｎｏ．１６を、実施例２に記載の方法に従い、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地１００ｍｌで培養した。この培養液をさらにアンピシリン１００ｐｐｍとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭを含むＬＢ培地２１を入れた５Ｌジャーファーメンターに植菌し、３０℃、８００ｒｐｍ、通気１ｍｌ／ｍｉｎ．で３８時間通気攪拌培養した。
定常期の培養液を遠心分離して得た菌体を、４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０．３）１Ｌに再懸濁し、２０ｇの桂皮酸を加え、３０℃、８００ｒｐｍで撹拌しながら反応を行った。反応液の一部を１時間毎に取り、反応液中に生じたＬ−フェニルアラニンをＨＰＬＣにより定量した。基質濃度が約２％を保つよう基質を逐次添加しながら反応を継続して行ったところ、約３時間で反応液中に約３．５％のＬ−フェニルアラニンが蓄積した。
【産業上の利用可能性】
本発明の選択方法によれば、外来遺伝子を安定的かつ高水準で発現する大腸菌、特に大腸菌内で発現困難な遺伝子を安定的かつ高水準で発現する大腸菌を容易かつ確実に選択できる。植物由来アンモニアリアーゼは大腸菌内で発現困難な遺伝子と考えられてきたが、本発明の方法によれば、植物由来アンモニアリアーゼ遺伝子を安定的に高発現できる。従って、各種不飽和カルボン酸にアミノ基を付加してＬ−アミノ酸やアントシアニン等の化合物を合成するのに有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス応答の強さを指標として選抜することを特徴とする外来遺伝子高発現性大腸菌株の選択方法。
【請求項２】
ストレス応答が過酸化水素分解活性である請求の範囲１に記載の選択方法。
【請求項３】
大腸菌に導入された際に、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子を高発現する請求の範囲１または２に記載の選択方法。
【請求項４】
ストレス応答の強さを指標として選抜された外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項５】
ストレス応答が過酸化水素分解活性である請求の範囲４に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項６】
大腸菌に導入された際に、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子を高発現する請求の範囲４または５に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項７】
大腸菌株を３０世代継代する間に発現量が２分の１まで低下する遺伝子を発現させたときに、発現量が初代の水準に維持されるかまたは向上する請求の範囲４乃至６のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項８】
プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子が、アンモニアリアーゼの遺伝子である請求の範囲６または７に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項９】
アンモニアリアーゼの発現系遺伝子がフェニルアラニンアンモニアリアーゼの遺伝子である請求の範囲８に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１０】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼの遺伝子が、植物由来である請求の範囲９に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１１】
植物がムラサキ科ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）である請求の範囲１０に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１２】
大腸菌株がＫ１２株由来である請求の範囲４乃至１１のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１３】
大腸菌株がＸＬ１−Ｂｌｕｅ株由来である請求の範囲１２に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１４】
大腸菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株である請求の範囲１３に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１５】
大腸菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株からクローン選択または遺伝子操作によって得られる誘導株である請求の範囲１４に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４６）。
【請求項１７】
請求の範囲４乃至１５のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株の外来遺伝子を発現させることを特徴とする酵素の製造方法。
【請求項１８】
請求の範囲４乃至１５のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株またはその産生する酵素を含む処理液をその酵素の基質と反応させることを特徴とする化合物の製造方法。
【請求項１９】
酵素がアンモニアリアーゼであり、基質が不飽和カルボン酸であり、得られる化合物がＬ−アミノ酸および／またはその誘導体である請求の範囲１８に記載の化合物の製造方法。
【請求項１】
ストレス応答の強さを指標として選抜することを特徴とする外来遺伝子高発現性大腸菌株の選択方法。
【請求項２】
ストレス応答が過酸化水素分解活性である請求の範囲１に記載の選択方法。
【請求項３】
大腸菌に導入された際に、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子を高発現する請求の範囲１または２に記載の選択方法。
【請求項４】
ストレス応答の強さを指標として選抜された外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項５】
ストレス応答が過酸化水素分解活性である請求の範囲４に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項６】
大腸菌に導入された際に、プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子を高発現する請求の範囲４または５に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項７】
大腸菌株を３０世代継代する間に発現量が２分の１まで低下する遺伝子を発現させたときに、発現量が初代の水準に維持されるかまたは向上する請求の範囲４乃至６のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項８】
プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子が、アンモニアリアーゼの遺伝子である請求の範囲６または７に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項９】
アンモニアリアーゼの発現系遺伝子がフェニルアラニンアンモニアリアーゼの遺伝子である請求の範囲８に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１０】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼの遺伝子が、植物由来である請求の範囲９に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１１】
植物がムラサキ科ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）である請求の範囲１０に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１２】
大腸菌株がＫ１２株由来である請求の範囲４乃至１１のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１３】
大腸菌株がＸＬ１−Ｂｌｕｅ株由来である請求の範囲１２に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１４】
大腸菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株である請求の範囲１３に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１５】
大腸菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株からクローン選択または遺伝子操作によって得られる誘導株である請求の範囲１４に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
【請求項１６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＤ８４０株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４６）。
【請求項１７】
請求の範囲４乃至１５のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株の外来遺伝子を発現させることを特徴とする酵素の製造方法。
【請求項１８】
請求の範囲４乃至１５のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株またはその産生する酵素を含む処理液をその酵素の基質と反応させることを特徴とする化合物の製造方法。
【請求項１９】
酵素がアンモニアリアーゼであり、基質が不飽和カルボン酸であり、得られる化合物がＬ−アミノ酸および／またはその誘導体である請求の範囲１８に記載の化合物の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５３１１１
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５８４７８（Ｐ２００４−５５８４７８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５８８２
【国際出願日】平成１５年１２月１１日（２００３．１２．１１）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５８８２
【国際出願日】平成１５年１２月１１日（２００３．１２．１１）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
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