多次元生体材料およびその製造方法
多次元構造を有し、かつ分化したＭＳＣ組織および脱灰骨基質を含む生体材料であって、前記脱灰骨基質は分化したＭＳＣ組織内に分散されている生体材料、その製造方法および使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多次元組織もしくは生体材料もしくは基質の製造のための間葉系幹細胞およびそれらの分化の分野に関する。本発明の製品は、リウマチ学、組織再建および／または外科、特に外傷学、整形外科、形成外科および顎顔面外科において有用となり得る。特に、本発明の製品は、骨もしくは軟骨修復またはそれらの置換において有用となり得る。
【背景技術】
【０００２】
組織工学は成長分野であり、この分野では、体内に移植するための新しい材料が開発されている。１つの重要な領域では、外傷または疾患（例えば腫瘍切除）によって失われた骨の領域を置換するために骨移植材料が必要とされる。伝統的に、移植材料は、移植材料を受け入れる個体の骨から採取される。しかし、これにより、さらなる外科手術およびさらなる回復が必要となる。骨は他人から、または死体からでさえも採取可能であるが、これによって生体適合性の問題ならびに疾患転移のリスクが生じる。
【０００３】
組織を製造するために、幹細胞分化の分野では研究が行われている。例えば、国際公開第２００７／１０３４４２号は、絹の足場と、脂肪由来の幹細胞である成体幹細胞とを含む組成物を開示している。
【０００４】
（技術的な問題）
しかし、骨移植または骨の補強あるいは骨の再建に使用される多次元組織の製造には、現実的な技術的問題が残されている。軟骨再建または軟骨欠損の軽減においても同じ問題が残されている。
【０００５】
従って、完全に生体適合性であり、かつ指定された用途にとって適当な機械的特徴を提供する組織工学材料が当該技術分野において今もなお必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、分化した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）組織および脱灰骨基質（ＤＢＭ）を含み、前記脱灰骨基質が分化したＭＳＣ組織内に分散されている、多次元構造を有する自然のヒト骨誘導性生体材料に関する。
【０００７】
分化したＭＳＣ組織を製造するために使用されるＭＳＣは、ヒトまたは動物由来であってもよい。
【０００８】
第１の実施形態によれば、ＭＳＣは脂肪組織から単離されたものであり、以下、脂肪組織間葉系幹細胞（ＡＭＳＣ）と呼ぶ。
【０００９】
別の実施形態によれば、ＭＳＣは骨髄から単離されたものであり、以下、骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）と呼ぶ。好ましくは、本発明の生体材料に含まれるＭＳＣは、継代培養後期の脂肪組織由来幹細胞である。
【００１０】
本発明の生体材料は、ヒトまたは動物の体内に移植することを目的としている。移植される生体材料は自家由来であっても同種異系であってもよい。本発明の生体材料は、骨もしくは軟骨領域に移植可能であってもよい。本発明の生体材料は、ヒトまたは動物の体の異例な領域に移植してもよい。
【００１１】
本発明の生体材料は生体適合性である。
【００１２】
典型的には、本発明の生体材料は均質であり、それは本生体材料の構造および／または構成が組織全体にわたって類似していることを意味する。典型的には、本発明の生体材料は、自然の疾患領域への移植に必要とされる望ましい取扱いおよび機械的特性を有する。
【００１３】
特定の実施形態によれば、本発明の生体材料は、引き裂かれることなく外科手術器具で保持することができる。
【００１４】
本発明の一実施形態では、本生体材料は、粘着剤（ｃｏｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ ａｇｅｎｔ）も結合剤も全く含んでいない。
【００１５】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る生体材料は３次元である。本実施形態では、本発明の生体材料は、少なくとも１ｍｍの厚さを有する厚膜を形成してもよい。本生体材料の大きさは、使用に好都合なように適合させてもよい。別の実施形態では、本生体材料によって足場が形成されるため、本発明の生体材料は、さらなる合成の足場の使用を全く必要としない。
【００１６】
別の実施形態によれば、本発明の生体材料は１ｍｍ未満の薄膜を形成してもよい。本実施形態では、本生体材料は前記２次元である。
【００１７】
第１の実施形態によれば、本発明の生体材料は、オステオカルシン発現および無機化特性を有する本物の骨と同じ特性を有する。すなわち、本生体材料は、骨細胞および相互結合組織を含む。特定の実施形態によれば、本発明の生体材料は、骨細胞（骨細胞様細胞ともいう）と、コラーゲン（好ましくは、石灰化し、無機化したコラーゲン）と、骨基質と、骨細胞上の無機質コーティングとを含み、このコーティングは組織化されたリンカルシウム結晶（ｐｈｏｓｐｈｏｃａｌｃｉｃ ｃｒｙｓｔａｌ）である。典型的には、本発明の生体材料は、自然の骨に近い気孔率を有する。
【００１８】
第２の実施形態によれば、本発明の生体材料は本物の軟骨と同じ特性を有する。すなわち、本生体材料は、軟骨細胞と、コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む細胞外基質とを含む。
【００１９】
本発明の生体材料の再コロニー形成特性は、本生体材料が移植される環境に依存していてもよく、本発明の生体材料は、骨環境に配置された場合は再コロニー形成可能であってもよく、非骨環境に配置された場合は再コロニー形成不可能であってもよい。
【００２０】
本発明の生体材料は、生体材料の細胞の分化が終点に達したものであり、移植された場合に生体材料の表現型は変化しない。本発明のインプラントは多層であってもよい。すなわち、本インプラントは、例えば外科用接着剤または任意の好適な固定手段などの任意の好適な手段によって互いに縫合または固定され得る少なくとも二層の生体材料を含む。
【００２１】
典型的には、本発明の生体材料は、５０〜２５００μｍの平均径を有する粒子の形態の脱灰骨基質を含み、第１の実施形態では、粒子は５０〜１２５μｍの平均径を有し、第２の実施形態では、粒子は１２５〜２００μｍの平均径を有し、第３の実施形態では、粒子は５００〜１０００μｍの平均径を有する。典型的には、脱灰骨基質は、４０歳未満のドナーから得られる。一実施形態によれば、骨基質の脱灰率は９０〜９９％、好ましくは９５〜９８％、さらにより好ましくは約９７％である。この脱灰率は、有利には、ＨＣｌ（０．６Ｎ）を用いた３時間のプロセスによって生じる。具体的な実施形態によれば、脱灰骨基質は滅菌されている。
【００２２】
特定の実施形態によれば、脱灰骨基質は、大学組織バンク（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ）（ルーバン大学医学部付属病院（Ｃｌｉｎｉｑｕｅｓ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅｓ Ｓａｉｎｔ−Ｌｕｃ）、ベルギーのブリュッセル）から提供される。
【００２３】
本発明は、骨芽細胞培地および／または軟骨形成培地でＭＳＣを１５〜２５日間インキュベートし、次いで前記培地に脱灰骨基質を添加し、かつ１５〜３０日間、好ましくは１５〜２５日間、より好ましくは２０日間のさらなる期間にわたってインキュベーションを維持し、このさらなる期間の間に、好ましくは脱灰骨基質を取り出さずに培地を２日に１回取り替えることを含む、多次元生体材料の製造方法にも関する。
【００２４】
脱灰骨基質の添加前にＭＳＣをインキュベートすることは、本発明の方法の重要な工程である。そのような工程は、ＭＳＣの軟骨形成細胞および／または骨芽細胞への分化を可能にするために必要である。さらに、この工程は、３次元骨様構造を得るために必要である。
【００２５】
好ましい実施形態によれば、ＭＳＣは、継代培養後期の脂肪組織間葉系幹細胞である。
【００２６】
一実施形態によれば、培地１ｍｌ当たり１〜２０ｍｇの脱灰骨基質を添加する。好ましい実施形態によれば、培地１ｍｌ当たり１〜１０ｍｇの脱灰骨基質を添加する。
【００２７】
最も好ましくは、培地１ｍｌ当たり５〜１０ｍｇの脱灰骨基質を添加する。脱灰骨基質の前記量は、生体材料の３次元骨様構造を得るために最適な濃度である。
【００２８】
一実施形態によれば、全ての培地は、動物タンパク質を含んでいない。
【００２９】
第２の実施形態によれば、分化培地はヒト血清を含んでいる。有利には、分化培地は動物血清を全く含んでおらず、好ましくは、ヒト血清以外の血清を含んでいない。
【００３０】
本発明は、本発明に係る方法によって得られる多次元生体材料にも関する。本発明の方法によって得られる生体材料は、ヒトまたは動物の体内に移植することを目的としている。移植される本生体材料は自家由来であっても同種異系であってもよい。本発明の生体材料は、骨もしくは軟骨領域に移植可能であってもよい。本生体材料は、ヒトまたは動物の体の異例な領域に移植してもよい。
【００３１】
本発明の方法によって得られる生体材料は生体適合性である。
【００３２】
本生体材料は均質であり、それは生体材料の構造および／または構成が組織全体にわたって類似していることを意味する。好ましくは、本生体材料は、自然の疾患領域への移植に必要とされる望ましい取扱いおよび機械的特性を有する。典型的には、本発明の方法によって得られる生体材料は、引き裂かれることなく外科手術器具で保持することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、本生体材料は、粘着剤も結合剤のどれも含んでいない。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の方法によって得られる生体材料は３次元である。本実施形態では、本生体材料は、少なくとも１ｍｍの厚さを有する厚膜を形成してもよい。本生体材料の大きさは、使用に好都合なように適合させてもよい。別の実施形態では、本生体材料によって足場が形成されるため、本発明の方法によって得られる生体材料は、さらなる合成の足場の使用を全く必要としない。
【００３５】
さらに他の実施形態では、本発明の方法によって得られる生体材料は、１ｍｍ未満の薄膜を形成してもよい。本実施形態では、本生体材料は２次元である。
【００３６】
第１の実施形態によれば、本発明の方法によって得られる生体材料は、オステオカルシン発現および石灰化特性の点で本物の骨と同じ特性を有する。すなわち、本生体材料は、骨細胞および相互結合組織を含む。一実施形態では、本生体材料は、骨細胞（骨細胞様細胞ともいう）と、コラーゲン（好ましくは、石灰化し、無機化したコラーゲン）と、骨基質と、骨細胞上の無機質コーティングとを含み、この無機質コーティングは、組織化されたリンカルシウム結晶である。典型的には、本生体材料は自然の骨に近い気孔率を有する。
【００３７】
第２の実施形態によれば、本発明の方法によって得られる生体材料は本物の軟骨と同じ特性を有する。すなわち、本生体材料は、軟骨細胞と、コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む細胞外基質とを含む。
【００３８】
本発明の方法によって得られる生体材料は、生体材料の細胞の分化が終点に達したものであり、移植された場合も生体材料の表現型は変化しない。本発明のインプラントは多層であってもよい。すなわち、本インプラントは、例えば外科用接着剤または任意の好適な固定手段などの任意の好適な手段によって互いに縫合または固定され得る少なくとも二層の生体材料を含む。
【００３９】
本発明の方法によって得られる生体材料は、５０〜２５００μｍの平均径を有する粒子の形態の脱灰骨基質を含み、第１の実施形態では、粒子は５０〜１２５μｍの平均径を有し、第２の実施形態では、粒子は１２５〜２００μｍの平均径を有し、第３の実施形態では、粒子は５００〜１０００μｍの平均径を有する。典型的には、脱灰骨基質は、４０歳未満のドナーから得られる。一実施形態によれば、骨基質の脱灰率は９０〜９９％、好ましくは９５〜９８％、さらにより好ましくは約９７％である。この脱灰率は、有利には、ＨＣｌ（０．６Ｎ）を用いた３時間のプロセスによって生じる。好ましい実施形態によれば、脱灰骨基質は滅菌されている。
【００４０】
典型的には、脱灰骨基質は、大学組織バンク（ルーバン大学医学部付属病院、ベルギーのブリュッセル）から提供される。
【００４１】
本発明は、医療機器として、または医療機器に含まれるものとして、あるいは医薬組成物としての本発明の生体材料の任意の使用に関する。
【００４２】
本発明は、本発明の生体材料と、例えば、外科用接着剤もしくは組織接着剤、または生体適合性で、外科的使用に対して毒性がなく、かつ生体吸収性であって、特に生物組織を互いにまたは移植された生体材料に接合するための任意の接着剤組成物などの好適な固定手段とを含む医療機器を含むキットにも関する。
【００４３】
さらに、本発明は、本発明の生体材料と、例えば外科用接着剤もしくは組織接着剤、または生体適合性で、外科的使用に対して毒性がなく、かつ生体吸収性であって、特に生物組織を互いにまたは移植された生体材料に接合するための任意の接着剤組成物などの好適な固定手段とを含むキットに関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療する方法で使用される本発明に係る生体材料に関する。
【００４５】
本発明は、哺乳類における骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療する方法であって、本明細書に説明するように、骨もしくは軟骨欠損を有する前記哺乳類に生体材料の治療的有効量を投与することを含む方法にも関する。
【００４６】
本生体材料は、哺乳類における骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療するための治療的有効量で使用される。
【００４７】
骨もしくは軟骨欠損の非限定的な例としては、骨折、生まれつきの虚弱、骨塩量の減少、関節炎、骨粗鬆症、骨軟化症、骨減少症、骨癌、パジェット病、硬化性病変、骨の浸潤性疾患、代謝性骨減少症（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ）である。
【００４８】
本発明は、整形外科、特に顎顔面外科または形成外科における本生体材料の使用にも関する。本発明の生体材料はリウマチ学においても使用してもよい。
【００４９】
さらに、本発明は、関節の先天的もしくは後天的な異常部分、頭蓋顔面上顎骨、歯科矯正処置部分、術後の骨もしくは関節骨の置換部分、外傷または他の先天的もしくは後天的な異常部分を支持または矯正するため、および他の筋骨格インプラント、特に人工および合成インプラントを支持するために本発明の生体材料を使用する方法に関する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体にある骨空洞を充填するために使用される本発明の生体材料に関する。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は、再建もしくは美容整形手術に使用される本発明の生体材料に関する。本発明の生体材料は自家であっても同種異系でもあってもよい。本生体材料を組織移植に使用してもよい。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明の生体材料を投与する工程を含むヒトまたは動物の体内の空胴を充填する方法に関する。
【００５３】
本発明の生体材料は、同種異系インプラントとして、あるいは自家インプラントとして使用してもよい。
【００５４】
また、本生体材料は、非免疫原性であるという点および免疫調節性を有するという点で有利である。驚くべきことに、本発明の生体材料では、未分化ＭＳＣの免疫調節特性が保持され、そのため、ヒトまたは動物の体内への本発明の生体材料の移植によっては、どんな炎症反応も起きない。それどころか、本生体材料の存在によって移植部位の炎症は軽減される。
【００５５】
従って、本発明の生体材料は、抗炎症薬の代わりとして、あるいは前記炎症の結果に苦しむ患者に必要な抗炎症薬の量を減少させる手段として、関節炎、特に炎症性関節炎の治療に特に適している。
【００５６】
本発明の生体材料は、血管新生を刺激するためにさらに有利である。実際、本生体材料のＭＳＣは、新しい血管の成長を刺激する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を放出する。そのような本発明の態様は、骨もしくは軟骨形成にとって最適な条件を提供するため、非常に有望である。
【００５７】
（定義）
本発明の意味において、「組織」という用語は、自然のヒト組織内で類似した機能を果たす相互に結合した細胞の集合体（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指す。
【００５８】
本発明の意味において、「間葉系幹細胞」またはＭＳＣという用語は、様々な細胞型に分化させることができる多分化能幹細胞のことである。
【００５９】
「脂肪」は任意の脂肪組織を指す。脂肪組織は、茶色、黄色または白色脂肪組織であってもよい。好ましくは、脂肪組織は、皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、脂肪細胞および間質を含む。脂肪組織は、動物の体内全体に存在している場合もある。例えば、哺乳類では、脂肪組織は、網、骨髄、皮下腔、脂肪体（例えば、肩甲骨または膝蓋下脂肪体）に存在し、大部分の臓器を取り囲んでいる。脂肪組織から得られる細胞は、初代細胞培養物または前駆細胞株を含んでもよい。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物に由来していてもよい。
【００６０】
「脂肪組織由来細胞」という用語は、脂肪組織に由来する細胞を指す。脂肪組織から単離される最初の細胞集団は、間質血管画分（ＳＶＦ）細胞などのこれらに限定されない異種細胞集団である。
【００６１】
本明細書に使用されている「脂肪組織間葉系幹細胞」（ＡＭＳＣ）という用語は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などのこれらに限定されない様々な異なる細胞型の前駆体として用いることができる脂肪組織に由来する間質細胞を指す。
【００６２】
本明細書に使用されている「継代培養後期の脂肪組織間葉系幹細胞」という用語は、より初期に継代された細胞と比較した場合、より低度の免疫原特性を呈している細胞を指す。脂肪組織に由来する間質細胞の免疫原性は、継代の数に対応する。好ましくは、脂肪組織は、少なくとも第４継代まで培養され、より好ましくは少なくとも第６継代まで培養され、最も好ましくは少なくとも第６継代まで培養される。
【００６３】
本明細書に使用されている「生体適合性」とは、哺乳類に移植された場合に、哺乳類において有害な反応を誘発しない任意の材料を指す。生体適合性材料は、個体に導入された場合に、有毒でなく、その個体を損傷せず、また、哺乳類において当該材料の免疫拒絶を誘導しない。
【００６４】
本明細書に使用されている「自家」とは、その材料が後で再導入される同じ個体に由来する生物学的材料を指す。
【００６５】
本明細書に使用されている「同種異系」とは、その材料が導入される個体と同じ種の遺伝的に異なる個体由来の生物学的材料を指す。
【００６６】
本明細書に使用されている「移植片」とは、典型的には欠損部を置換、矯正またはそれ以外の方法で解決するために個体に移植される細胞、組織または臓器を指す。組織または臓器は、同じ個体に由来する細胞で構成されていてもよく、この移植片を、本明細書では、「自己移植片」、「自家移植体」、「自家インプラント」および「自家移植片」という言い換え可能な用語で呼ぶ。同種の遺伝的に異なる個体からの細胞を含む移植片は、本明細書では、「同種移植片」、「同種異系移植体」、「同種異系インプラント」および「同種異系移植片」という言い換え可能な用語で呼ぶ。ある個体からその一卵性双生児への移植片は、本明細書では、「種族内移植片」、「同系移植体」、「同系インプラント」または「同系移植片」と呼ぶ。「異種移植片」「異種移植体」または「異種インプラント」は、ある個体から異なる種の別の個体への移植片を指す。
【００６７】
本明細書に使用されている「組織移植」および「組織再建」という用語はどちらも、骨欠損または軟骨欠損などの組織欠損を治療または軽減するために個体に移植片を移植することを指す。
【００６８】
本明細書に使用されている、疾患、欠損、障害または病気を「軽減する」とは、疾患、欠損、障害または病気の１つまたは複数の症状の重症度を減少させることを意味する。
【００６９】
本明細書に使用されている「治療する」とは、患者が経験する疾患、欠損、障害または病気などの症状の頻度を減少させることを意味する。
【００７０】
本明細書に使用されている「治療的有効量」とは、本発明の組成物が投与される個体に有益な効果を与えるのに十分な本組成物の量である。
【００７１】
本明細書に使用されている「骨欠損」とは、骨折、ひび割れ、部分的欠損またはそれ以外の方法で損傷を受けた骨を指す。そのような損傷は、先天性奇形、疾患、疾患治療、外傷または骨感染症によるものであってもよく、急性であっても慢性であってもよい。例えば、骨減少は、腫瘍切除によって骨欠損が生じたことによるものであってもよい。骨欠損の非限定的な例としては、骨折、骨／脊椎変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症、脊柱側弯症、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、線維性骨異形成症、腎性骨異栄養症および骨のパジェット病が挙げられる。
【００７２】
本明細書に使用されている「軟骨欠損」は、喪失したか、量が減少したか、あるいはそれ以外の方法で損傷を受けた軟骨組織を指す。軟骨組織欠損は、先天性奇形、疾患、疾患治療または外傷によって生じたものであってもよく、急性であっても慢性（骨関節炎）であってもよい。
【００７３】
本明細書に使用されている「骨芽細胞培地および／または軟骨形成培地」という用語は、骨芽細胞および／または軟骨形成細胞の増殖および分化を促進する培地を指すことを意図している。
【００７４】
有利には、骨形成は、ヒトまたは動物血清（好ましくは、ウシ胎児もしくはウシ血清（ＦＣＳ、ＦＢＳ））、デキサメタゾン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンを標準的な培地に添加することによって誘導される。細胞は、２日ごとに培地を取り替えて、骨形成培養物中に維持する。
【００７５】
好ましい実施形態では、骨芽細胞培地は、１０％ｖ／ｖのヒト血清、１μＭのデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウム、３６ｍｇ／ｍｌのジヒドロリン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加された標準的な培地（好ましくはＤＭＥＭ）である。
【００７６】
有利には、軟骨形成は、ヒトまたは動物血清（好ましくは、ウシ胎児もしくはウシ血清（ＦＣＳ、ＦＢＳ））、デキサメタゾン、ＴＧＦ−Ｂ３、Ｌ−プロリン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン（例えば、Ｓｉｇｍａ社から入手可能なインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加用凍結乾燥粉末由来）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを標準的な培地に添加することによって誘導される。
【００７７】
好ましい軟骨形成培地は、１０％ｖ／ｖのヒト血清、１μＭのデキサメタゾン、１０ｎｇのＴＧＦ−Ｂ３、４０μｇ／ｍｌのＬ−プロリン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウム、３６ｍｇ／ｍｌのジヒドロリン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム、１００μｌ／ｍｌのＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン（例えば、Ｓｉｇｍａ社から入手可能なインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加用凍結乾燥粉末由来）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加された標準的な培地（好ましくはＤＭＥＭ）である。
【００７８】
骨形成および軟骨形成培地の両方に適した標準的な培地としては、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩおよびＧＭＥＭが挙げられるがこれらに限定されず、ＤＭＥＭが好ましい標準的な培地である。
【００７９】
本明細書に使用されている「足場」とは、薄膜（例えば、実質的に３次元よりも大きな２次元を有する形態）、リボン、ひも、シート、平たい円盤、円筒体、球体、３次元非晶質形状などのこれらに限定されない形態の構造を指す。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ヒト血清およびＤＢＭが添加された骨形成培地におけるヒトＡＭＳＣの分化を示す。組織の退縮および相互結合組織（Ｂ）を有する多層構造（Ａ）を、マッソン三色染色法（Ｃ）で染色して確認した。
【図２】ＤＢＭを含まない軟骨形成培地（Ａ、Ｂ）およびＤＢＭを含む軟骨形成培地（Ｃ、Ｄ、Ｅ）におけるＡＭＳＣの分化を示す。コンフルエントな細胞を有する単層構造（Ａ）は、ＤＢＭを含まない軟骨形成培地（Ｂ）で生成された。対照的に、細胞組織の退縮（Ｄ）によって得られた多層構造（Ｃ）は、アルシアンブルーによって染色された軟骨形成様基質（ギムザ染色によるＥおよび長方形）で構成されていた。
【図３】ＤＢＭを含まない骨形成培地（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびＤＢＭを含む骨形成培地（Ｄ、Ｅ、Ｆ）におけるヒトＡＭＳＣの分化を示す。個々の骨小節（アリザリンレッド染色、Ｂ）および小節間コラーゲン組織（Ｃ）からなる単層構造（Ａ）は、ＤＢＭを含まない骨形成培地で生成された。対照的に、オステオカルシンを発現している細胞（Ｆ、右側長方形）を有する無機化コラーゲン（Ｆ、黒のフォン・コッサ染色：左側長方形）からなる相互結合組織（Ｅ）を有する細胞組織の退縮（Ｄ）。
【図４】ヌードラットの傍脊柱筋における、移植から６０日後のＢＭ−ＭＳＣおよびＡＭＳＣの生存率を示す。ＧＦＰおよびオステオカルシン抗体に対する免疫組織化学によって間葉系幹細胞を検出した。骨を単独で移植した場合、ＧＦＰおよびオステオカルシン染色細胞の発現は全く認められなかった。「ＭＳＣ−ヒト骨移植片」からなる複合移植の場合には、ＧＦＰおよびオステオカルシンの細胞が検出された。
【図５】ＤＢＭを添加した骨形成培地（Ａ〜Ｃ）および軟骨形成培地（Ｅ〜Ｆ）でインキュベートしたＡＭＳＣについての多次元構造の発達を示す。組織の退縮（Ａ、Ｄ）、ＤＢＭ相互結合（Ｂ、Ｅ）およびオステオカルシン（Ｃ）およびプロテオグリカン（Ｆ）タンパク質の発現。
【図６】ＡＭＳＣ対ＢＭ−ＭＳＣの血管新生の可能性を示す。異なる酸素濃度（０．１、３、５および２１％のＯ２）での両細胞のインキュベーションによって生体外での可能性が認められた。ＡＭＳＣは、各Ｏ２濃度において、ＢＭ−ＭＳＣよりも有意に高いＶＥＧＦの放出を示した。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）本発明に係る多次元生体材料の調製
前臨床モデルにおけるＡＭＳＣの動物源
骨髄および脂肪細胞幹細胞のドナーとして緑色蛍光遺伝子導入ブタを使用した（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ Ｄ， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｉｌｓ， ｅｕｐｂ ２００８）。ベルギー農業および動物管理省（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）の指針に従って動物を収容した。全ての手順は、ルーヴァン・カトリック大学の地域動物実験倫理委員会によって認可されていた。
【００８２】
動物由来のＡＭＳＣの供給源
コラゲナーゼ（０．０７５ｇ）をハンクス液（カルシウムイオンを含む）で再構成し、消化前に２〜８℃で保存する。脂肪組織（平均１５ｇ）を０．００９％ＮａＣｌで３回洗浄し、ペトリ皿の中で切断して、血管および線維結合組織を除去した。脂肪を消化前に計量し、酵素を含む５０ｍｌのファルコン管に移す。この組織を、６０分間連続的に撹拌しながら３７℃の振盪水浴に入れる。消化後、コラゲナーゼを、５０ｍｌのヒト血清、Ｌ−グルタミン（５ｍｌ）および５ｍｌの抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を添加したＤＭＥＭ（５００ｍｌ）で失活させる。回収した組織を、室温（２０〜２５℃）、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。成熟脂肪細胞を含む上澄みを吸引する。このペレットを、１０％ヒト血清および抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を添加したＤＭＥＭからなる２０ｍｌの増殖培地（ＭＰ）に再懸濁し、５００μｍのメッシュスクリーンで濾過する。回収した組織（濾過後）を、室温（２０〜２５℃）、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、このペレットをＭＰに再懸濁し、間質血管画分（ＳＶＦ）細胞として特定する。初代細胞の最初の継代を継代０（Ｐ０）と呼んだ。５％ＣＯ２中３７℃で２４〜４８時間インキュベートした後、培養物をＰＢＳで洗浄し、Ｐ４（第４継代）までＭＰ中に維持した後、特異的培地（下記参照）で分化させた。
【００８３】
ヒト由来のＡＭＳＣの供給源
ヒト脂肪組織（皮下脂肪組織の小片、１〜２ｇ、ｎ＝４）を、ルーチンな手術（腹部および整形外科手術）の間に取り出し、処理のために研究室に運ぶまで４℃の冷たい生理溶液に保存した。ブタ脂肪組織処理について上述したように、ヒトの脂肪の消化を行った。消化後、ヒトＡＭＳＣをＭＰ中で培養し、（ｉ）ウシ胎児血清（１０％ｖ／ｖ）または（ｉｉ）ヒト血清（１０％ｖ／ｖ）を添加した特異的培地（正確な組成については下記参照）中で分化させた。
【００８４】
ＦＢＳを含む分化培地およびヒト血清を含む分化培地の両方においてＡＭＳＣが分化したことが観察された。
【００８５】
脱灰骨基質の供給源
ヒト脱灰骨基質は、大学組織バンク（ルーバン大学医学部付属病院、ベルギーのブリュッセル）から提供され、多臓器ヒトドナーから産生された。大腿骨または脛骨の骨幹を切断し、脱灰処理（下記参照）のために１０００μｍ以下の粒子に粉砕する。
【００８６】
ヒトＤＢＭは、選択したヒトのドナーからの皮質骨を粉砕して行う。最初に、ヒトの骨組織をアセトン（９９％）浴で一晩脱脂し、次いで、脱灰水で２時間洗浄する。脱灰は、室温で撹拌しながら、０．６ＮのＨＣＬに３時間浸漬（骨１グラム当たり２０ｍｌの溶液）することによって行う。次いで、脱灰骨粉を２時間脱灰水でリンスし、ｐＨを制御する。ｐＨは、酸性が強すぎる場合には、ＤＢＭを撹拌しながら０．１Ｍのリン酸塩溶液で緩衝する。最後に、ＤＢＭを乾燥し、計量する。ＤＢＭを、凍結温度でガンマ照射（２５キログレイ）によって滅菌する。
【００８７】
幹細胞の分化および特徴づけ
脂肪生成
ＡＭＳＣのコンフルエントな培養物を、２０％ヒト血清、Ｌ−グルタミン（５ｍｌ）、ウシのインスリン（５μｇ／ｍｌ）、インドメタシン（５０μＭ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、０．５ｍＭ）、デキサメタゾン（１μＭ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）からなる脂肪細胞誘導培地でＭＰを置き換えて脂肪生成を引き起こすように誘導した（Ｍａｕｎｅｙ ＪＲ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００５， ｖｏｌ ２６： ６１６７）。２日ごとに培地を取り替えて、脂肪生成培養物中に細胞を維持した。培養物をＰＢＳでリンスし、ホルマリン溶液で固定し、中性脂質をオイルレッドで染色して脂肪細胞分化を測定した。
【００８８】
骨形成
ＡＭＳＣのコンフルエントな培養物を、ヒト血清（１０％ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）、ジヒドロリン酸ナトリウム（３６ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭに添加して得られる骨形成培地を用いて骨形成を引き起こすように誘導した（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃを参照）。２日ごとに培地を取り替えて、骨形成培養物中に細胞を維持した。培養物をＰＢＳでリンスし、７０％エタノールで固定し、リン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色して骨形成分化を測定した。さらに、オステオカルシンの免疫組織化学法およびフォン・コッサ染色を行って「骨」の表現型を確認した（図４を参照）。
【００８９】
軟骨形成
ＡＭＳＣのコンフルエントな培養物を、ヒト血清（１０％ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（１μＭ）、ＴＧＦ−Ｂ３（１０ｎｇ）、Ｌ−プロリン（４０μｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）、ジヒドロリン酸ナトリウム（３６ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン（例えば、Ｓｉｇｍａ社から入手可能なインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加用凍結乾燥粉末由来）（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭに添加して得られる軟骨形成培地を用いて軟骨形成を引き起こすように誘導した（Ｔａｉｐａｌｅｅｎｍａｋｉ Ｈ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８ ｖｏｌ ３１４： ２４００）。２日ごとに培地を取り替えて、軟骨形成培養物中に細胞を維持した。
【００９０】
分化培地（ＡＭＳＣによる骨形成および軟骨形成）増殖の影響
細胞および培養条件
ＡＭＳＣを増殖培地（ＭＰ）で増殖させ、約８５〜９０％コンフルエントになるまで３７℃（９５％空気および５％ＣＯ２）に維持した。培地を２日ごとに取り替えた。細胞毒性アッセイ用に細胞を懸濁するために、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ混合物を用いて３７℃で１０分間、培養フラスコから細胞を剥離し、培地に再懸濁した。細胞を、１×１０４細胞／ウェルの密度で、ＭＴＳ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシメトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）のために、９６ウェルマイクロプレートに播種した。それらを、異なる試験培地（ｉ）ＭＰ、（ｉｉ）骨形成培地および（ｉｉｉ）軟骨形成培地に５日間曝露する前に、コンフルエントに近い状態まで３７℃で９６時間増殖させた。
【００９１】
ＭＴＳアッセイ
抽出物と細胞の接触から２４時間後、２０μｌの「Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＯｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を、１００μｌの抽出物培地を含む各ウェルに直接添加した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした。マイクロタイタープレート分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｅｘ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、ベルギーのブリュッセル）を用いて４９２ｎｍで吸光度を測定した。参照波長は６９０ｎｍであった。光学濃度差ＯＤ＝ＯＤ４９２ｎｍ−ＯＤ６９０ｎｍを試算した。
【００９２】
特異的分化培地を使用した場合のみに分化が生じたことが観察された。
【００９３】
多次元構造の発達
特異的培地（骨形成もしくは軟骨形成）におけるＡＭＳＣ（第４継代）のインキュベーションを１５〜２０日間行った後に、骨形成および軟骨形成培地に脱灰骨基質（ＤＢＭ）を添加することにより、さらなる２０日の期間に多次元構造（分化培地１ｍｌあたり１ｍｇのＤＢＭ）が得られた。この培地を、ＤＢＭを除去せずに２日ごとに取り替える。
【００９４】
分化終了後、培養物をＰＢＳでリンスし、オステオカルシンの組織学的検査、アルシアンブルーおよびギムザ染色による骨および軟骨形成の特徴づけのために、ホルマリン溶液で固定した（図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ）。
【００９５】
細胞ペレットを４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。連続切片（厚さ５μｍ）を、脱塩水と共にガラス製のスライドに乗せ、３７℃で１２時間乾燥し、免疫学的古典的検出（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）または組織化学的検査の処理をした。切片を過酸化水素水（０．３％Ｈ２Ｏ２）中に３０分間置いて内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止した。Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｔｏｎ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−０．０５Ｍ、０．０５％、ｐＨ＝７．４）で洗浄した後、スライドを、正常なヤギ血清（１：１０；ＢＩＯＳＹＳ社、フランスのブッサン）と共に室温で３０分間インキュベートし、そして１：１００に希釈したオステオカルシンを染色するための一次抗体（抗オステオカルシンマウスモノクローナル抗体；ＡＢＣＡＭ社、英国ケンブリッジ）と共に一晩インキュベートした。Ｔｒｉｓ−ＴＢＳで洗浄した後、免疫ペルオキシダーゼの検出のために、二次抗マウス免疫グロブリンＧと共にスライドを１時間インキュベートした。
【００９６】
コラーゲンの構造を、全種類の未分化／分化細胞の各試料に対するマッソン三色染色法によって調査した。増殖および分化（骨形成、軟骨形成および脂肪生成）培地中でインキュベートした線維芽細胞を陰性対照として用いた。
【００９７】
プロテオグリカンを分泌している軟骨細胞を、アルシアンブルーおよびギムザで染色した。
【００９８】
ＡＭＳＣを、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートしたＣＤ９０モノクローナル抗体の飽和量で染色した。少なくとも１５，０００の事象を、Ｃｅｌｉｑｕｅｓｔソフトウェアを備えたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。
【００９９】
骨形成および軟骨形成分化培地において、ＤＢＭの添加によって、細胞構築、コラーゲン合成および脱灰骨基質粒子の再編成による３次元構造の発達が誘導された（図５Ａ〜図５Ｅを参照）。顕微鏡によって、オステオカルシン発現およびプロテオグリカン分泌がそれぞれ、骨形成（図５Ｃ）および軟骨形成（図５Ｆ）条件において明らかとなった。
【０１００】
生体内移植および組織学的分析
骨芽細胞の分化したＧＦＰ−ブタＡＭＳＣを、大学組織バンク（ルーバン大学医学部付属病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓａｉｎｔ−Ｌｕｃ）、ベルギーのブリュッセル）から提供されたヒトの処理済み／脱細胞化骨基質に播種した（Ｄｕｆｒａｎｅ Ｄ， Ｅｕｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅｒ， ｖｏｌ １： ５２， ２００１）。複合移植片を、ヌードラット（１レシピエントにつき２つのインプラント、ｎ＝１０）（雄、６〜８週齢）の傍脊椎領域に皮下移植した。６０日後、動物を屠殺し、免疫組織化学的処理のためにインプラントを外植した。次いで、インプラントをＨＣＬで脱灰し、処理し、パラフィンに包埋し、薄片（５μｍ）にした。次いで、オステオカルシンおよび「緑色蛍光タンパク質」（モノクローナル抗体）に対して、マッソン三色染色法および免疫組織化学的検査を行った。
【０１０１】
（実施例２）脂肪間葉系幹細胞からの多次元骨様移植片の可能性
材料および方法
ブタおよびヒトＡＭＳＣの単離
実験のために、実施例１に開示したように、ブタおよびヒトＡＭＳＣの単離を行った。
【０１０２】
ＡＭＳＣの血管新生の可能性
生体外
正常酸素圧および低酸素条件において生体外での幹細胞の血管新生促進能力を評価するために、ブタの骨髄ＭＳＣおよび脂肪ＭＳＣを、０．１、３、５および２１％Ｏ２の低酸素室に２４、４８および７２時間置き、ＶＥＧＦの放出をＥＬＩＳＡ試験で定量化した。
【０１０３】
脱灰骨基質による多次元構造の最適化
ＡＭＳＣを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）、ジヒドロリン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンをＭＰに添加して骨形成を引き起こすように誘導した。２日ごとに培地を取り替えて、骨形成培養物中に細胞を維持した（Ｐｏｓｔ ｅｔ Ａｌ． Ｂｏｎｅ ２００８， ４３，１； ３２−３９， Ｑｕ ｅｔ Ａｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ａｎｉｍ． ２００７； ４３； ９５−１００）。培養物をＰＢＳでリンスし、７０％エタノールで固定し、リン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色して骨形成分化を測定した。さらに、オステオカルシンの免疫組織化学法およびフォン・コッサ染色を行って「骨」の表現型を確認した。
【０１０４】
ＡＭＳＣを含む多次元構造を、大学組織バンク（ルーバン大学医学部付属病院、ベルギーのブリュッセル）によって調達された「脱灰骨基質（ＤＢＭ）」の存在下で共インキュベーションによって行った。脱灰骨基質の製造は、実施例１の「脱灰骨の供給源」に開示されている。
【０１０５】
基質
ＤＢＭの効力を以下によって評価する：（ｉ）脱灰プロセス後の残留カルシウム濃度の測定（９７％超の［カルシウム］低下）、および（ｉｉ）移植から１ヵ月後の生体内での（ヌードラットにおける）骨生成の可能性。平均１５〜１８日間の骨芽細胞培地におけるＡＭＳＣ（第４継代）のインキュベーション後に、異なる濃度（０／１／５／１０および２０ｍｇ／ｍｌ）のＤＢＭを特異的分化培地に添加する。培地を、ＤＢＭを除去せずに２日ごとに取り替える。３次元構造の程度、細胞構造、オステオカルシン発現およびフォン・コッサ染色（カルシウム沈着のため）を評価して、３次元骨様構造にとって適当なＤＢＭ濃度を選択する。
【０１０６】
移植手順ならびに脱灰骨基質およびＡＭＳＣを含む多次元構造の追跡調査
（多次元構造にとって）最適なＤＢＭ濃度を有する骨形成培養物（第４継代）から得られたＡＭＳＣを移植のために回収した。
− ヌードラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国マサチューセッツ州ウィルミントン）をレシピエントとして使用した。細胞を傍脊柱筋に移植した。脊柱を中心とした縦切開を行い、皮下組織を切開して筋膜を露出させた。多次元構造を傍脊柱筋組織に直接移植した（大学組織バンク、ルーヴァン・カトリック大学、ベルギーのブリュッセル）。対照は、同じラットの反対側の傍脊柱筋に凍結乾燥した海綿骨を単独で移植して確保した。移植部位の早期回復を可能にするために、再吸収不可能な縫合糸を用いて筋膜を閉じた。動物を屠殺し、全身麻酔下でのＴ６１心臓内注射（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔ．社、ドイツ）による移植から３０日後に外植を行った。次いで、インプラントを回収し、組織学およびマイクロコンピュータ断層撮影のために処理した。
− ブタのレシピエント。２つの異なる外科的モデルで移植片を試験する。本発明者らは（ｉ）大腿皮質骨欠損部におけるそれらの架橋能力および（ｉｉ）腰椎前方固定術（ＡＬＩＦ）におけるそれらの融合性を分析する。
− （ｉ）皮質骨欠損モデルは、実験的整形外科において、および主にＣ．Ｄｅｌｌｏｙｅ教授の研究を通して本発明者らの研究室においてよく知られている。ブタを類似モデルに使用し、骨幹骨欠損部を長骨上に形成した後、そこに移植材料を充填するか空のままにする。本発明者らの実験では、ブタの両大腿部を手術する。１．５ｃｍの皮質骨欠損部を形成し、標準的な４．５ｍｍのチタン製ロッキング圧迫プレートによって安定させる。片方の大腿骨欠損部を空のままにし、反対側の脚にＡＭＳＣ移植片を移植する。
− （ｉｉ）ブタの実験的外科手術においてＡＬＩＦモデルが十分に確立されている。本発明者らの技術は、後側方到達法による４つのレベルのＡＬＩＦ法からなる。融合は、椎体間ポリエチルポリエチルケトン（ＰＥＥＫ）ケージによって得られる。椎間板を開き、髄核を除去し、軟骨を広げて軟骨下骨を露出させた後、ＰＥＥＫケージを挿入する。これらのケージは空として設計するが、様々な実験材料を充填することができる。この場合、各レベルに異なる移植片組織を入れて、４つの異なる群を構成する。１つのケージは、陰性対照として空のままにし、１つのケージは、凍結乾燥した照射済み海綿骨を充填し（臨床分野で実施される場合が多い）、１つのケージは自家海綿骨移植片を含み（融合法における至適基準であるため、本発明者らの陽性対照とみなす）、最後のケージはＡＭＳＣ移植片を有する。動物を屠殺し、全身麻酔下でのＴ６１心臓内注射（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔ．社、ドイツ）による移植から７週間後に外植を行った。次いで、インプラントを回収し、組織学およびコンピュータ断層撮影のために処理した。
【０１０７】
追跡調査
ヌードラット：
外植したインプラントをＨＣＬで脱灰し、処理し、パラフィンに包埋し、薄片にした（５μｍ）。組織学的染色のために、ヘマルン・エオシン（Ｈｅｍａｌｕｎ Ｅｏｓｉｎ）染色、マッソン緑色三色（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｇｒｅｅｎ Ｔｒｉｃｈｒｏｍ）染色、オステオカルシンおよびフォン・コッサ染色による標準的な呈色反応を使用した。オステオカルシン染色は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｓｙｓｔｅｍモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ社、デンマーク）によって公開されたモノクローナル抗体（ＯＣ４−３０、Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ）によって得られた。回収したインプラントのミクロ構造を、ｐＱＣＴ（末梢骨用定量的コンピュータ断層装置、ＸＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＡ型、Ｓｔｒａｔｅｃ社、ドイツのプフォルツハイム）を用いて分析した。皮質および総骨密度を、各インプラントの複数のスライドを用いて測定した。フォンヴィルブラント染色（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ）（上記参照）後に、新しく形成された血管の定量化によって生体内での血管新生の定量化を行った。
【０１０８】
ブタ：
食品および水を自由に摂取できる状態でブタを個々に収容する。術後処置および鎮痛は、実験動物管理のための標準的な実験計画書に従って行う。自家移植片モデルでは、生物学的追跡調査は、血液試料による炎症評価で構成される。
【０１０９】
放射線学的追跡調査によって、移植から１、５および７週間後にコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンによって生体内での骨形成を比較することができる。臨床ＣＴスキャンの高解像度および多断面変換は非常に精密であるため、本発明者らは、生体内でのＰＥＥＫケージの内容を分析することができ、従って、融合プロセスの評価が可能となる。
【０１１０】
１回のスキャン掃引によって集められた全ての情報を用いて、大腿骨に対して同じ手順を使用する。マイクロＣＴによって外植した移植片を処理することによって、安楽死後にさらにより良好な解像度が得られる。外植した移植片に対する組織学的および免疫組織化学的調査は、自然の皮質の架橋および融合能力と比較して、新生骨形成および移植片血管再建（血管内皮増殖因子、ＣＤ５１、フォンウィルブランド因子）、硬化（オステオカルシン）および無機化（フォン・コッサ）を評価するために現在行われている。
【０１１１】
脱灰プロセスによって、移植した材料の組織学的および免疫組織化学的調査が可能となる。組織学、組織形態計測およびマイクロラジオグラフィは、組織を石灰化された状態に維持する必要があるため、非脱灰処理も必須となる。
【０１１２】
統計
ボンフェローニのポストホックテストを含む一元配置分散分析法によって群間の差の統計的有意性を試験した。Ｓｙｓｔａｔバージョン８．０によって統計的検定を行った。差はｐ＜０．０５で有意であるとみなした。
【０１１３】
結果
最適なＤＢＭ濃度を有する多次元構造についての構想の証明：生体外での骨様構造
ＡＭＳＣ細胞移植の生物学的支持体を回避するために、多次元構造をＤＢＭと組み合わせて発達させた。ヌードラットにおいて生体内で骨形成分化促進能力を有する脱灰骨基質（平均径７００μｍ）（ＡＭＳＣに接触させて用いる前に品質管理が必要とされる）は、ＡＭＳＣとの共インキュベーションにおいて生体外細胞リモデリングを達成するために必要となる。
【０１１４】
両方の骨形成分化培地において、ＤＢＭの添加によって、ＤＢＭを含まない単独のＡＭＳＣと比較して、細胞収縮、コラーゲン合成およびＤＢＭ粒子の再編成による３次元構造の発達が誘導された。多次元構造の発達を最適化するために、段階的なＤＢＭ用量を試験した。極端な濃度（２０ｍｇ／ｍｌ超）は適していないことが分かった。１ｍｇ／ｍｌでは、外科的用途のための移植処理に最適な３次元構造は発達しなかった。対照的に、５および１０ｍｇ／ｍｌでは、移植片除去および外科的用途に最適な組織の退縮が生じることが分かった。顕微鏡によって、オステオカルシン発現および無機化プロセス（フォン・コッサ染色）がこれらの最新のＤＢＭ濃度によって明らかとなった。骨形成条件においてＡＭＳＣを含む３次元構造を得るために、平均２０±３日のＤＢＭとの共インキュベーションが必要となる。
【０１１５】
最適なＤＢＭ濃度を有する多次元構造についての構想の証明：生体内での骨形成
ヌードラット
ヌードラットにおける移植から３０日後に、ＤＢＭを含まない単独のＡＭＳＣでは、新しい骨様構造の形成は誘導されなかった。フォン・コッサによって染色された小さい骨小節（オステオカルシン＋）のみがヌードラット筋肉組織内にまばらに分散していた。対照的に、多次元構造の移植は、移植部位の良好な局在化によって容易に行われた。移植から３０日後に、小型で強力な骨様構造が、ＤＢＭ粒子内の顕微鏡的に高密度の結合組織を有する筋肉内に認められた。骨様構造は、オステオカルシン染色結合組織および無機化プロセスに認められた。
【０１１６】
ブタのレシピエント
移植から５週間後に、ブタにおいて、ＣＴスキャンによって示されるように、大腿骨の欠損部（処理なし）には自然発生の硬化が全く認められなかった。足場を全く使用せずに、骨欠損部に多次元構造を組み込むことは容易であった。この最新の移植は、自然の皮質骨欠損部を架橋する骨様構造によって、移植後の初期（移植から５週間後）に骨硬化を有意に向上させる。
【０１１７】
最適なＤＢＭ濃度を有する多次元構造についての構想の証明：生体内での血管新生
正常酸素圧および低酸素条件において、生体外で幹細胞の血管新生促進能力を評価するために、前臨床ブタ骨髄ＭＳＣおよび脂肪ＭＳＣを、０．１、３、５および２１％Ｏ２の低酸素室内に２４、４８および７２時間置き、ＶＥＧＦの放出をＥＬＩＳＡで定量化した。ＢＭ−ＭＳＣは、正常酸素圧条件よりも低酸素条件においてより多くのＶＥＧＦを放出し、２４時間よりも４８および７２時間（より高レベルのＶＥＧＦを有する時間）後に、この分泌を維持した（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＡＭＳＣからのＶＥＧＦの放出は、複数の異なる培養条件において類似していたが、有意なより高レベルのＶＥＧＦは、ＢＭ−ＭＳＣよりもＡＭＳＣによって放出された（それぞれ２３６４±９４ｐｇ／ｍｌ対１１２７４±６７９、ｐ＜０．０５）（図６）。
【０１１８】
これらの結果は、ＢＭ−ＭＳＣおよびＡＭＳＣの移植後に生体内で確認された。有意なより高い血管新生は、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、骨形成ＡＭＳＣ移植の場合に認められた（ｐ＜０．０５）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多次元組織もしくは生体材料もしくは基質の製造のための間葉系幹細胞およびそれらの分化の分野に関する。本発明の製品は、リウマチ学、組織再建および／または外科、特に外傷学、整形外科、形成外科および顎顔面外科において有用となり得る。特に、本発明の製品は、骨もしくは軟骨修復またはそれらの置換において有用となり得る。
【背景技術】
【０００２】
組織工学は成長分野であり、この分野では、体内に移植するための新しい材料が開発されている。１つの重要な領域では、外傷または疾患（例えば腫瘍切除）によって失われた骨の領域を置換するために骨移植材料が必要とされる。伝統的に、移植材料は、移植材料を受け入れる個体の骨から採取される。しかし、これにより、さらなる外科手術およびさらなる回復が必要となる。骨は他人から、または死体からでさえも採取可能であるが、これによって生体適合性の問題ならびに疾患転移のリスクが生じる。
【０００３】
組織を製造するために、幹細胞分化の分野では研究が行われている。例えば、国際公開第２００７／１０３４４２号は、絹の足場と、脂肪由来の幹細胞である成体幹細胞とを含む組成物を開示している。
【０００４】
（技術的な問題）
しかし、骨移植または骨の補強あるいは骨の再建に使用される多次元組織の製造には、現実的な技術的問題が残されている。軟骨再建または軟骨欠損の軽減においても同じ問題が残されている。
【０００５】
従って、完全に生体適合性であり、かつ指定された用途にとって適当な機械的特徴を提供する組織工学材料が当該技術分野において今もなお必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、分化した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）組織および脱灰骨基質（ＤＢＭ）を含み、前記脱灰骨基質が分化したＭＳＣ組織内に分散されている、多次元構造を有する自然のヒト骨誘導性生体材料に関する。
【０００７】
分化したＭＳＣ組織を製造するために使用されるＭＳＣは、ヒトまたは動物由来であってもよい。
【０００８】
第１の実施形態によれば、ＭＳＣは脂肪組織から単離されたものであり、以下、脂肪組織間葉系幹細胞（ＡＭＳＣ）と呼ぶ。
【０００９】
別の実施形態によれば、ＭＳＣは骨髄から単離されたものであり、以下、骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）と呼ぶ。好ましくは、本発明の生体材料に含まれるＭＳＣは、継代培養後期の脂肪組織由来幹細胞である。
【００１０】
本発明の生体材料は、ヒトまたは動物の体内に移植することを目的としている。移植される生体材料は自家由来であっても同種異系であってもよい。本発明の生体材料は、骨もしくは軟骨領域に移植可能であってもよい。本発明の生体材料は、ヒトまたは動物の体の異例な領域に移植してもよい。
【００１１】
本発明の生体材料は生体適合性である。
【００１２】
典型的には、本発明の生体材料は均質であり、それは本生体材料の構造および／または構成が組織全体にわたって類似していることを意味する。典型的には、本発明の生体材料は、自然の疾患領域への移植に必要とされる望ましい取扱いおよび機械的特性を有する。
【００１３】
特定の実施形態によれば、本発明の生体材料は、引き裂かれることなく外科手術器具で保持することができる。
【００１４】
本発明の一実施形態では、本生体材料は、粘着剤（ｃｏｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ ａｇｅｎｔ）も結合剤も全く含んでいない。
【００１５】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る生体材料は３次元である。本実施形態では、本発明の生体材料は、少なくとも１ｍｍの厚さを有する厚膜を形成してもよい。本生体材料の大きさは、使用に好都合なように適合させてもよい。別の実施形態では、本生体材料によって足場が形成されるため、本発明の生体材料は、さらなる合成の足場の使用を全く必要としない。
【００１６】
別の実施形態によれば、本発明の生体材料は１ｍｍ未満の薄膜を形成してもよい。本実施形態では、本生体材料は前記２次元である。
【００１７】
第１の実施形態によれば、本発明の生体材料は、オステオカルシン発現および無機化特性を有する本物の骨と同じ特性を有する。すなわち、本生体材料は、骨細胞および相互結合組織を含む。特定の実施形態によれば、本発明の生体材料は、骨細胞（骨細胞様細胞ともいう）と、コラーゲン（好ましくは、石灰化し、無機化したコラーゲン）と、骨基質と、骨細胞上の無機質コーティングとを含み、このコーティングは組織化されたリンカルシウム結晶（ｐｈｏｓｐｈｏｃａｌｃｉｃ ｃｒｙｓｔａｌ）である。典型的には、本発明の生体材料は、自然の骨に近い気孔率を有する。
【００１８】
第２の実施形態によれば、本発明の生体材料は本物の軟骨と同じ特性を有する。すなわち、本生体材料は、軟骨細胞と、コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む細胞外基質とを含む。
【００１９】
本発明の生体材料の再コロニー形成特性は、本生体材料が移植される環境に依存していてもよく、本発明の生体材料は、骨環境に配置された場合は再コロニー形成可能であってもよく、非骨環境に配置された場合は再コロニー形成不可能であってもよい。
【００２０】
本発明の生体材料は、生体材料の細胞の分化が終点に達したものであり、移植された場合に生体材料の表現型は変化しない。本発明のインプラントは多層であってもよい。すなわち、本インプラントは、例えば外科用接着剤または任意の好適な固定手段などの任意の好適な手段によって互いに縫合または固定され得る少なくとも二層の生体材料を含む。
【００２１】
典型的には、本発明の生体材料は、５０〜２５００μｍの平均径を有する粒子の形態の脱灰骨基質を含み、第１の実施形態では、粒子は５０〜１２５μｍの平均径を有し、第２の実施形態では、粒子は１２５〜２００μｍの平均径を有し、第３の実施形態では、粒子は５００〜１０００μｍの平均径を有する。典型的には、脱灰骨基質は、４０歳未満のドナーから得られる。一実施形態によれば、骨基質の脱灰率は９０〜９９％、好ましくは９５〜９８％、さらにより好ましくは約９７％である。この脱灰率は、有利には、ＨＣｌ（０．６Ｎ）を用いた３時間のプロセスによって生じる。具体的な実施形態によれば、脱灰骨基質は滅菌されている。
【００２２】
特定の実施形態によれば、脱灰骨基質は、大学組織バンク（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ）（ルーバン大学医学部付属病院（Ｃｌｉｎｉｑｕｅｓ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅｓ Ｓａｉｎｔ−Ｌｕｃ）、ベルギーのブリュッセル）から提供される。
【００２３】
本発明は、骨芽細胞培地および／または軟骨形成培地でＭＳＣを１５〜２５日間インキュベートし、次いで前記培地に脱灰骨基質を添加し、かつ１５〜３０日間、好ましくは１５〜２５日間、より好ましくは２０日間のさらなる期間にわたってインキュベーションを維持し、このさらなる期間の間に、好ましくは脱灰骨基質を取り出さずに培地を２日に１回取り替えることを含む、多次元生体材料の製造方法にも関する。
【００２４】
脱灰骨基質の添加前にＭＳＣをインキュベートすることは、本発明の方法の重要な工程である。そのような工程は、ＭＳＣの軟骨形成細胞および／または骨芽細胞への分化を可能にするために必要である。さらに、この工程は、３次元骨様構造を得るために必要である。
【００２５】
好ましい実施形態によれば、ＭＳＣは、継代培養後期の脂肪組織間葉系幹細胞である。
【００２６】
一実施形態によれば、培地１ｍｌ当たり１〜２０ｍｇの脱灰骨基質を添加する。好ましい実施形態によれば、培地１ｍｌ当たり１〜１０ｍｇの脱灰骨基質を添加する。
【００２７】
最も好ましくは、培地１ｍｌ当たり５〜１０ｍｇの脱灰骨基質を添加する。脱灰骨基質の前記量は、生体材料の３次元骨様構造を得るために最適な濃度である。
【００２８】
一実施形態によれば、全ての培地は、動物タンパク質を含んでいない。
【００２９】
第２の実施形態によれば、分化培地はヒト血清を含んでいる。有利には、分化培地は動物血清を全く含んでおらず、好ましくは、ヒト血清以外の血清を含んでいない。
【００３０】
本発明は、本発明に係る方法によって得られる多次元生体材料にも関する。本発明の方法によって得られる生体材料は、ヒトまたは動物の体内に移植することを目的としている。移植される本生体材料は自家由来であっても同種異系であってもよい。本発明の生体材料は、骨もしくは軟骨領域に移植可能であってもよい。本生体材料は、ヒトまたは動物の体の異例な領域に移植してもよい。
【００３１】
本発明の方法によって得られる生体材料は生体適合性である。
【００３２】
本生体材料は均質であり、それは生体材料の構造および／または構成が組織全体にわたって類似していることを意味する。好ましくは、本生体材料は、自然の疾患領域への移植に必要とされる望ましい取扱いおよび機械的特性を有する。典型的には、本発明の方法によって得られる生体材料は、引き裂かれることなく外科手術器具で保持することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、本生体材料は、粘着剤も結合剤のどれも含んでいない。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の方法によって得られる生体材料は３次元である。本実施形態では、本生体材料は、少なくとも１ｍｍの厚さを有する厚膜を形成してもよい。本生体材料の大きさは、使用に好都合なように適合させてもよい。別の実施形態では、本生体材料によって足場が形成されるため、本発明の方法によって得られる生体材料は、さらなる合成の足場の使用を全く必要としない。
【００３５】
さらに他の実施形態では、本発明の方法によって得られる生体材料は、１ｍｍ未満の薄膜を形成してもよい。本実施形態では、本生体材料は２次元である。
【００３６】
第１の実施形態によれば、本発明の方法によって得られる生体材料は、オステオカルシン発現および石灰化特性の点で本物の骨と同じ特性を有する。すなわち、本生体材料は、骨細胞および相互結合組織を含む。一実施形態では、本生体材料は、骨細胞（骨細胞様細胞ともいう）と、コラーゲン（好ましくは、石灰化し、無機化したコラーゲン）と、骨基質と、骨細胞上の無機質コーティングとを含み、この無機質コーティングは、組織化されたリンカルシウム結晶である。典型的には、本生体材料は自然の骨に近い気孔率を有する。
【００３７】
第２の実施形態によれば、本発明の方法によって得られる生体材料は本物の軟骨と同じ特性を有する。すなわち、本生体材料は、軟骨細胞と、コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む細胞外基質とを含む。
【００３８】
本発明の方法によって得られる生体材料は、生体材料の細胞の分化が終点に達したものであり、移植された場合も生体材料の表現型は変化しない。本発明のインプラントは多層であってもよい。すなわち、本インプラントは、例えば外科用接着剤または任意の好適な固定手段などの任意の好適な手段によって互いに縫合または固定され得る少なくとも二層の生体材料を含む。
【００３９】
本発明の方法によって得られる生体材料は、５０〜２５００μｍの平均径を有する粒子の形態の脱灰骨基質を含み、第１の実施形態では、粒子は５０〜１２５μｍの平均径を有し、第２の実施形態では、粒子は１２５〜２００μｍの平均径を有し、第３の実施形態では、粒子は５００〜１０００μｍの平均径を有する。典型的には、脱灰骨基質は、４０歳未満のドナーから得られる。一実施形態によれば、骨基質の脱灰率は９０〜９９％、好ましくは９５〜９８％、さらにより好ましくは約９７％である。この脱灰率は、有利には、ＨＣｌ（０．６Ｎ）を用いた３時間のプロセスによって生じる。好ましい実施形態によれば、脱灰骨基質は滅菌されている。
【００４０】
典型的には、脱灰骨基質は、大学組織バンク（ルーバン大学医学部付属病院、ベルギーのブリュッセル）から提供される。
【００４１】
本発明は、医療機器として、または医療機器に含まれるものとして、あるいは医薬組成物としての本発明の生体材料の任意の使用に関する。
【００４２】
本発明は、本発明の生体材料と、例えば、外科用接着剤もしくは組織接着剤、または生体適合性で、外科的使用に対して毒性がなく、かつ生体吸収性であって、特に生物組織を互いにまたは移植された生体材料に接合するための任意の接着剤組成物などの好適な固定手段とを含む医療機器を含むキットにも関する。
【００４３】
さらに、本発明は、本発明の生体材料と、例えば外科用接着剤もしくは組織接着剤、または生体適合性で、外科的使用に対して毒性がなく、かつ生体吸収性であって、特に生物組織を互いにまたは移植された生体材料に接合するための任意の接着剤組成物などの好適な固定手段とを含むキットに関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療する方法で使用される本発明に係る生体材料に関する。
【００４５】
本発明は、哺乳類における骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療する方法であって、本明細書に説明するように、骨もしくは軟骨欠損を有する前記哺乳類に生体材料の治療的有効量を投与することを含む方法にも関する。
【００４６】
本生体材料は、哺乳類における骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療するための治療的有効量で使用される。
【００４７】
骨もしくは軟骨欠損の非限定的な例としては、骨折、生まれつきの虚弱、骨塩量の減少、関節炎、骨粗鬆症、骨軟化症、骨減少症、骨癌、パジェット病、硬化性病変、骨の浸潤性疾患、代謝性骨減少症（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ）である。
【００４８】
本発明は、整形外科、特に顎顔面外科または形成外科における本生体材料の使用にも関する。本発明の生体材料はリウマチ学においても使用してもよい。
【００４９】
さらに、本発明は、関節の先天的もしくは後天的な異常部分、頭蓋顔面上顎骨、歯科矯正処置部分、術後の骨もしくは関節骨の置換部分、外傷または他の先天的もしくは後天的な異常部分を支持または矯正するため、および他の筋骨格インプラント、特に人工および合成インプラントを支持するために本発明の生体材料を使用する方法に関する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体にある骨空洞を充填するために使用される本発明の生体材料に関する。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は、再建もしくは美容整形手術に使用される本発明の生体材料に関する。本発明の生体材料は自家であっても同種異系でもあってもよい。本生体材料を組織移植に使用してもよい。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明の生体材料を投与する工程を含むヒトまたは動物の体内の空胴を充填する方法に関する。
【００５３】
本発明の生体材料は、同種異系インプラントとして、あるいは自家インプラントとして使用してもよい。
【００５４】
また、本生体材料は、非免疫原性であるという点および免疫調節性を有するという点で有利である。驚くべきことに、本発明の生体材料では、未分化ＭＳＣの免疫調節特性が保持され、そのため、ヒトまたは動物の体内への本発明の生体材料の移植によっては、どんな炎症反応も起きない。それどころか、本生体材料の存在によって移植部位の炎症は軽減される。
【００５５】
従って、本発明の生体材料は、抗炎症薬の代わりとして、あるいは前記炎症の結果に苦しむ患者に必要な抗炎症薬の量を減少させる手段として、関節炎、特に炎症性関節炎の治療に特に適している。
【００５６】
本発明の生体材料は、血管新生を刺激するためにさらに有利である。実際、本生体材料のＭＳＣは、新しい血管の成長を刺激する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を放出する。そのような本発明の態様は、骨もしくは軟骨形成にとって最適な条件を提供するため、非常に有望である。
【００５７】
（定義）
本発明の意味において、「組織」という用語は、自然のヒト組織内で類似した機能を果たす相互に結合した細胞の集合体（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指す。
【００５８】
本発明の意味において、「間葉系幹細胞」またはＭＳＣという用語は、様々な細胞型に分化させることができる多分化能幹細胞のことである。
【００５９】
「脂肪」は任意の脂肪組織を指す。脂肪組織は、茶色、黄色または白色脂肪組織であってもよい。好ましくは、脂肪組織は、皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、脂肪細胞および間質を含む。脂肪組織は、動物の体内全体に存在している場合もある。例えば、哺乳類では、脂肪組織は、網、骨髄、皮下腔、脂肪体（例えば、肩甲骨または膝蓋下脂肪体）に存在し、大部分の臓器を取り囲んでいる。脂肪組織から得られる細胞は、初代細胞培養物または前駆細胞株を含んでもよい。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物に由来していてもよい。
【００６０】
「脂肪組織由来細胞」という用語は、脂肪組織に由来する細胞を指す。脂肪組織から単離される最初の細胞集団は、間質血管画分（ＳＶＦ）細胞などのこれらに限定されない異種細胞集団である。
【００６１】
本明細書に使用されている「脂肪組織間葉系幹細胞」（ＡＭＳＣ）という用語は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などのこれらに限定されない様々な異なる細胞型の前駆体として用いることができる脂肪組織に由来する間質細胞を指す。
【００６２】
本明細書に使用されている「継代培養後期の脂肪組織間葉系幹細胞」という用語は、より初期に継代された細胞と比較した場合、より低度の免疫原特性を呈している細胞を指す。脂肪組織に由来する間質細胞の免疫原性は、継代の数に対応する。好ましくは、脂肪組織は、少なくとも第４継代まで培養され、より好ましくは少なくとも第６継代まで培養され、最も好ましくは少なくとも第６継代まで培養される。
【００６３】
本明細書に使用されている「生体適合性」とは、哺乳類に移植された場合に、哺乳類において有害な反応を誘発しない任意の材料を指す。生体適合性材料は、個体に導入された場合に、有毒でなく、その個体を損傷せず、また、哺乳類において当該材料の免疫拒絶を誘導しない。
【００６４】
本明細書に使用されている「自家」とは、その材料が後で再導入される同じ個体に由来する生物学的材料を指す。
【００６５】
本明細書に使用されている「同種異系」とは、その材料が導入される個体と同じ種の遺伝的に異なる個体由来の生物学的材料を指す。
【００６６】
本明細書に使用されている「移植片」とは、典型的には欠損部を置換、矯正またはそれ以外の方法で解決するために個体に移植される細胞、組織または臓器を指す。組織または臓器は、同じ個体に由来する細胞で構成されていてもよく、この移植片を、本明細書では、「自己移植片」、「自家移植体」、「自家インプラント」および「自家移植片」という言い換え可能な用語で呼ぶ。同種の遺伝的に異なる個体からの細胞を含む移植片は、本明細書では、「同種移植片」、「同種異系移植体」、「同種異系インプラント」および「同種異系移植片」という言い換え可能な用語で呼ぶ。ある個体からその一卵性双生児への移植片は、本明細書では、「種族内移植片」、「同系移植体」、「同系インプラント」または「同系移植片」と呼ぶ。「異種移植片」「異種移植体」または「異種インプラント」は、ある個体から異なる種の別の個体への移植片を指す。
【００６７】
本明細書に使用されている「組織移植」および「組織再建」という用語はどちらも、骨欠損または軟骨欠損などの組織欠損を治療または軽減するために個体に移植片を移植することを指す。
【００６８】
本明細書に使用されている、疾患、欠損、障害または病気を「軽減する」とは、疾患、欠損、障害または病気の１つまたは複数の症状の重症度を減少させることを意味する。
【００６９】
本明細書に使用されている「治療する」とは、患者が経験する疾患、欠損、障害または病気などの症状の頻度を減少させることを意味する。
【００７０】
本明細書に使用されている「治療的有効量」とは、本発明の組成物が投与される個体に有益な効果を与えるのに十分な本組成物の量である。
【００７１】
本明細書に使用されている「骨欠損」とは、骨折、ひび割れ、部分的欠損またはそれ以外の方法で損傷を受けた骨を指す。そのような損傷は、先天性奇形、疾患、疾患治療、外傷または骨感染症によるものであってもよく、急性であっても慢性であってもよい。例えば、骨減少は、腫瘍切除によって骨欠損が生じたことによるものであってもよい。骨欠損の非限定的な例としては、骨折、骨／脊椎変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症、脊柱側弯症、骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、線維性骨異形成症、腎性骨異栄養症および骨のパジェット病が挙げられる。
【００７２】
本明細書に使用されている「軟骨欠損」は、喪失したか、量が減少したか、あるいはそれ以外の方法で損傷を受けた軟骨組織を指す。軟骨組織欠損は、先天性奇形、疾患、疾患治療または外傷によって生じたものであってもよく、急性であっても慢性（骨関節炎）であってもよい。
【００７３】
本明細書に使用されている「骨芽細胞培地および／または軟骨形成培地」という用語は、骨芽細胞および／または軟骨形成細胞の増殖および分化を促進する培地を指すことを意図している。
【００７４】
有利には、骨形成は、ヒトまたは動物血清（好ましくは、ウシ胎児もしくはウシ血清（ＦＣＳ、ＦＢＳ））、デキサメタゾン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンを標準的な培地に添加することによって誘導される。細胞は、２日ごとに培地を取り替えて、骨形成培養物中に維持する。
【００７５】
好ましい実施形態では、骨芽細胞培地は、１０％ｖ／ｖのヒト血清、１μＭのデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウム、３６ｍｇ／ｍｌのジヒドロリン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加された標準的な培地（好ましくはＤＭＥＭ）である。
【００７６】
有利には、軟骨形成は、ヒトまたは動物血清（好ましくは、ウシ胎児もしくはウシ血清（ＦＣＳ、ＦＢＳ））、デキサメタゾン、ＴＧＦ−Ｂ３、Ｌ−プロリン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン（例えば、Ｓｉｇｍａ社から入手可能なインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加用凍結乾燥粉末由来）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを標準的な培地に添加することによって誘導される。
【００７７】
好ましい軟骨形成培地は、１０％ｖ／ｖのヒト血清、１μＭのデキサメタゾン、１０ｎｇのＴＧＦ−Ｂ３、４０μｇ／ｍｌのＬ−プロリン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウム、３６ｍｇ／ｍｌのジヒドロリン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム、１００μｌ／ｍｌのＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン（例えば、Ｓｉｇｍａ社から入手可能なインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加用凍結乾燥粉末由来）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加された標準的な培地（好ましくはＤＭＥＭ）である。
【００７８】
骨形成および軟骨形成培地の両方に適した標準的な培地としては、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩおよびＧＭＥＭが挙げられるがこれらに限定されず、ＤＭＥＭが好ましい標準的な培地である。
【００７９】
本明細書に使用されている「足場」とは、薄膜（例えば、実質的に３次元よりも大きな２次元を有する形態）、リボン、ひも、シート、平たい円盤、円筒体、球体、３次元非晶質形状などのこれらに限定されない形態の構造を指す。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ヒト血清およびＤＢＭが添加された骨形成培地におけるヒトＡＭＳＣの分化を示す。組織の退縮および相互結合組織（Ｂ）を有する多層構造（Ａ）を、マッソン三色染色法（Ｃ）で染色して確認した。
【図２】ＤＢＭを含まない軟骨形成培地（Ａ、Ｂ）およびＤＢＭを含む軟骨形成培地（Ｃ、Ｄ、Ｅ）におけるＡＭＳＣの分化を示す。コンフルエントな細胞を有する単層構造（Ａ）は、ＤＢＭを含まない軟骨形成培地（Ｂ）で生成された。対照的に、細胞組織の退縮（Ｄ）によって得られた多層構造（Ｃ）は、アルシアンブルーによって染色された軟骨形成様基質（ギムザ染色によるＥおよび長方形）で構成されていた。
【図３】ＤＢＭを含まない骨形成培地（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびＤＢＭを含む骨形成培地（Ｄ、Ｅ、Ｆ）におけるヒトＡＭＳＣの分化を示す。個々の骨小節（アリザリンレッド染色、Ｂ）および小節間コラーゲン組織（Ｃ）からなる単層構造（Ａ）は、ＤＢＭを含まない骨形成培地で生成された。対照的に、オステオカルシンを発現している細胞（Ｆ、右側長方形）を有する無機化コラーゲン（Ｆ、黒のフォン・コッサ染色：左側長方形）からなる相互結合組織（Ｅ）を有する細胞組織の退縮（Ｄ）。
【図４】ヌードラットの傍脊柱筋における、移植から６０日後のＢＭ−ＭＳＣおよびＡＭＳＣの生存率を示す。ＧＦＰおよびオステオカルシン抗体に対する免疫組織化学によって間葉系幹細胞を検出した。骨を単独で移植した場合、ＧＦＰおよびオステオカルシン染色細胞の発現は全く認められなかった。「ＭＳＣ−ヒト骨移植片」からなる複合移植の場合には、ＧＦＰおよびオステオカルシンの細胞が検出された。
【図５】ＤＢＭを添加した骨形成培地（Ａ〜Ｃ）および軟骨形成培地（Ｅ〜Ｆ）でインキュベートしたＡＭＳＣについての多次元構造の発達を示す。組織の退縮（Ａ、Ｄ）、ＤＢＭ相互結合（Ｂ、Ｅ）およびオステオカルシン（Ｃ）およびプロテオグリカン（Ｆ）タンパク質の発現。
【図６】ＡＭＳＣ対ＢＭ−ＭＳＣの血管新生の可能性を示す。異なる酸素濃度（０．１、３、５および２１％のＯ２）での両細胞のインキュベーションによって生体外での可能性が認められた。ＡＭＳＣは、各Ｏ２濃度において、ＢＭ−ＭＳＣよりも有意に高いＶＥＧＦの放出を示した。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）本発明に係る多次元生体材料の調製
前臨床モデルにおけるＡＭＳＣの動物源
骨髄および脂肪細胞幹細胞のドナーとして緑色蛍光遺伝子導入ブタを使用した（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ Ｄ， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｉｌｓ， ｅｕｐｂ ２００８）。ベルギー農業および動物管理省（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）の指針に従って動物を収容した。全ての手順は、ルーヴァン・カトリック大学の地域動物実験倫理委員会によって認可されていた。
【００８２】
動物由来のＡＭＳＣの供給源
コラゲナーゼ（０．０７５ｇ）をハンクス液（カルシウムイオンを含む）で再構成し、消化前に２〜８℃で保存する。脂肪組織（平均１５ｇ）を０．００９％ＮａＣｌで３回洗浄し、ペトリ皿の中で切断して、血管および線維結合組織を除去した。脂肪を消化前に計量し、酵素を含む５０ｍｌのファルコン管に移す。この組織を、６０分間連続的に撹拌しながら３７℃の振盪水浴に入れる。消化後、コラゲナーゼを、５０ｍｌのヒト血清、Ｌ−グルタミン（５ｍｌ）および５ｍｌの抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を添加したＤＭＥＭ（５００ｍｌ）で失活させる。回収した組織を、室温（２０〜２５℃）、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。成熟脂肪細胞を含む上澄みを吸引する。このペレットを、１０％ヒト血清および抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を添加したＤＭＥＭからなる２０ｍｌの増殖培地（ＭＰ）に再懸濁し、５００μｍのメッシュスクリーンで濾過する。回収した組織（濾過後）を、室温（２０〜２５℃）、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、このペレットをＭＰに再懸濁し、間質血管画分（ＳＶＦ）細胞として特定する。初代細胞の最初の継代を継代０（Ｐ０）と呼んだ。５％ＣＯ２中３７℃で２４〜４８時間インキュベートした後、培養物をＰＢＳで洗浄し、Ｐ４（第４継代）までＭＰ中に維持した後、特異的培地（下記参照）で分化させた。
【００８３】
ヒト由来のＡＭＳＣの供給源
ヒト脂肪組織（皮下脂肪組織の小片、１〜２ｇ、ｎ＝４）を、ルーチンな手術（腹部および整形外科手術）の間に取り出し、処理のために研究室に運ぶまで４℃の冷たい生理溶液に保存した。ブタ脂肪組織処理について上述したように、ヒトの脂肪の消化を行った。消化後、ヒトＡＭＳＣをＭＰ中で培養し、（ｉ）ウシ胎児血清（１０％ｖ／ｖ）または（ｉｉ）ヒト血清（１０％ｖ／ｖ）を添加した特異的培地（正確な組成については下記参照）中で分化させた。
【００８４】
ＦＢＳを含む分化培地およびヒト血清を含む分化培地の両方においてＡＭＳＣが分化したことが観察された。
【００８５】
脱灰骨基質の供給源
ヒト脱灰骨基質は、大学組織バンク（ルーバン大学医学部付属病院、ベルギーのブリュッセル）から提供され、多臓器ヒトドナーから産生された。大腿骨または脛骨の骨幹を切断し、脱灰処理（下記参照）のために１０００μｍ以下の粒子に粉砕する。
【００８６】
ヒトＤＢＭは、選択したヒトのドナーからの皮質骨を粉砕して行う。最初に、ヒトの骨組織をアセトン（９９％）浴で一晩脱脂し、次いで、脱灰水で２時間洗浄する。脱灰は、室温で撹拌しながら、０．６ＮのＨＣＬに３時間浸漬（骨１グラム当たり２０ｍｌの溶液）することによって行う。次いで、脱灰骨粉を２時間脱灰水でリンスし、ｐＨを制御する。ｐＨは、酸性が強すぎる場合には、ＤＢＭを撹拌しながら０．１Ｍのリン酸塩溶液で緩衝する。最後に、ＤＢＭを乾燥し、計量する。ＤＢＭを、凍結温度でガンマ照射（２５キログレイ）によって滅菌する。
【００８７】
幹細胞の分化および特徴づけ
脂肪生成
ＡＭＳＣのコンフルエントな培養物を、２０％ヒト血清、Ｌ−グルタミン（５ｍｌ）、ウシのインスリン（５μｇ／ｍｌ）、インドメタシン（５０μＭ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、０．５ｍＭ）、デキサメタゾン（１μＭ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）からなる脂肪細胞誘導培地でＭＰを置き換えて脂肪生成を引き起こすように誘導した（Ｍａｕｎｅｙ ＪＲ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００５， ｖｏｌ ２６： ６１６７）。２日ごとに培地を取り替えて、脂肪生成培養物中に細胞を維持した。培養物をＰＢＳでリンスし、ホルマリン溶液で固定し、中性脂質をオイルレッドで染色して脂肪細胞分化を測定した。
【００８８】
骨形成
ＡＭＳＣのコンフルエントな培養物を、ヒト血清（１０％ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）、ジヒドロリン酸ナトリウム（３６ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭに添加して得られる骨形成培地を用いて骨形成を引き起こすように誘導した（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃを参照）。２日ごとに培地を取り替えて、骨形成培養物中に細胞を維持した。培養物をＰＢＳでリンスし、７０％エタノールで固定し、リン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色して骨形成分化を測定した。さらに、オステオカルシンの免疫組織化学法およびフォン・コッサ染色を行って「骨」の表現型を確認した（図４を参照）。
【００８９】
軟骨形成
ＡＭＳＣのコンフルエントな培養物を、ヒト血清（１０％ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（１μＭ）、ＴＧＦ−Ｂ３（１０ｎｇ）、Ｌ−プロリン（４０μｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）、ジヒドロリン酸ナトリウム（３６ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン（例えば、Ｓｉｇｍａ社から入手可能なインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加用凍結乾燥粉末由来）（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭに添加して得られる軟骨形成培地を用いて軟骨形成を引き起こすように誘導した（Ｔａｉｐａｌｅｅｎｍａｋｉ Ｈ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８ ｖｏｌ ３１４： ２４００）。２日ごとに培地を取り替えて、軟骨形成培養物中に細胞を維持した。
【００９０】
分化培地（ＡＭＳＣによる骨形成および軟骨形成）増殖の影響
細胞および培養条件
ＡＭＳＣを増殖培地（ＭＰ）で増殖させ、約８５〜９０％コンフルエントになるまで３７℃（９５％空気および５％ＣＯ２）に維持した。培地を２日ごとに取り替えた。細胞毒性アッセイ用に細胞を懸濁するために、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ混合物を用いて３７℃で１０分間、培養フラスコから細胞を剥離し、培地に再懸濁した。細胞を、１×１０４細胞／ウェルの密度で、ＭＴＳ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシメトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）のために、９６ウェルマイクロプレートに播種した。それらを、異なる試験培地（ｉ）ＭＰ、（ｉｉ）骨形成培地および（ｉｉｉ）軟骨形成培地に５日間曝露する前に、コンフルエントに近い状態まで３７℃で９６時間増殖させた。
【００９１】
ＭＴＳアッセイ
抽出物と細胞の接触から２４時間後、２０μｌの「Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＯｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を、１００μｌの抽出物培地を含む各ウェルに直接添加した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした。マイクロタイタープレート分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｅｘ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、ベルギーのブリュッセル）を用いて４９２ｎｍで吸光度を測定した。参照波長は６９０ｎｍであった。光学濃度差ＯＤ＝ＯＤ４９２ｎｍ−ＯＤ６９０ｎｍを試算した。
【００９２】
特異的分化培地を使用した場合のみに分化が生じたことが観察された。
【００９３】
多次元構造の発達
特異的培地（骨形成もしくは軟骨形成）におけるＡＭＳＣ（第４継代）のインキュベーションを１５〜２０日間行った後に、骨形成および軟骨形成培地に脱灰骨基質（ＤＢＭ）を添加することにより、さらなる２０日の期間に多次元構造（分化培地１ｍｌあたり１ｍｇのＤＢＭ）が得られた。この培地を、ＤＢＭを除去せずに２日ごとに取り替える。
【００９４】
分化終了後、培養物をＰＢＳでリンスし、オステオカルシンの組織学的検査、アルシアンブルーおよびギムザ染色による骨および軟骨形成の特徴づけのために、ホルマリン溶液で固定した（図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ）。
【００９５】
細胞ペレットを４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。連続切片（厚さ５μｍ）を、脱塩水と共にガラス製のスライドに乗せ、３７℃で１２時間乾燥し、免疫学的古典的検出（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）または組織化学的検査の処理をした。切片を過酸化水素水（０．３％Ｈ２Ｏ２）中に３０分間置いて内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止した。Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｔｏｎ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−０．０５Ｍ、０．０５％、ｐＨ＝７．４）で洗浄した後、スライドを、正常なヤギ血清（１：１０；ＢＩＯＳＹＳ社、フランスのブッサン）と共に室温で３０分間インキュベートし、そして１：１００に希釈したオステオカルシンを染色するための一次抗体（抗オステオカルシンマウスモノクローナル抗体；ＡＢＣＡＭ社、英国ケンブリッジ）と共に一晩インキュベートした。Ｔｒｉｓ−ＴＢＳで洗浄した後、免疫ペルオキシダーゼの検出のために、二次抗マウス免疫グロブリンＧと共にスライドを１時間インキュベートした。
【００９６】
コラーゲンの構造を、全種類の未分化／分化細胞の各試料に対するマッソン三色染色法によって調査した。増殖および分化（骨形成、軟骨形成および脂肪生成）培地中でインキュベートした線維芽細胞を陰性対照として用いた。
【００９７】
プロテオグリカンを分泌している軟骨細胞を、アルシアンブルーおよびギムザで染色した。
【００９８】
ＡＭＳＣを、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートしたＣＤ９０モノクローナル抗体の飽和量で染色した。少なくとも１５，０００の事象を、Ｃｅｌｉｑｕｅｓｔソフトウェアを備えたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。
【００９９】
骨形成および軟骨形成分化培地において、ＤＢＭの添加によって、細胞構築、コラーゲン合成および脱灰骨基質粒子の再編成による３次元構造の発達が誘導された（図５Ａ〜図５Ｅを参照）。顕微鏡によって、オステオカルシン発現およびプロテオグリカン分泌がそれぞれ、骨形成（図５Ｃ）および軟骨形成（図５Ｆ）条件において明らかとなった。
【０１００】
生体内移植および組織学的分析
骨芽細胞の分化したＧＦＰ−ブタＡＭＳＣを、大学組織バンク（ルーバン大学医学部付属病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓａｉｎｔ−Ｌｕｃ）、ベルギーのブリュッセル）から提供されたヒトの処理済み／脱細胞化骨基質に播種した（Ｄｕｆｒａｎｅ Ｄ， Ｅｕｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅｒ， ｖｏｌ １： ５２， ２００１）。複合移植片を、ヌードラット（１レシピエントにつき２つのインプラント、ｎ＝１０）（雄、６〜８週齢）の傍脊椎領域に皮下移植した。６０日後、動物を屠殺し、免疫組織化学的処理のためにインプラントを外植した。次いで、インプラントをＨＣＬで脱灰し、処理し、パラフィンに包埋し、薄片（５μｍ）にした。次いで、オステオカルシンおよび「緑色蛍光タンパク質」（モノクローナル抗体）に対して、マッソン三色染色法および免疫組織化学的検査を行った。
【０１０１】
（実施例２）脂肪間葉系幹細胞からの多次元骨様移植片の可能性
材料および方法
ブタおよびヒトＡＭＳＣの単離
実験のために、実施例１に開示したように、ブタおよびヒトＡＭＳＣの単離を行った。
【０１０２】
ＡＭＳＣの血管新生の可能性
生体外
正常酸素圧および低酸素条件において生体外での幹細胞の血管新生促進能力を評価するために、ブタの骨髄ＭＳＣおよび脂肪ＭＳＣを、０．１、３、５および２１％Ｏ２の低酸素室に２４、４８および７２時間置き、ＶＥＧＦの放出をＥＬＩＳＡ試験で定量化した。
【０１０３】
脱灰骨基質による多次元構造の最適化
ＡＭＳＣを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）、ジヒドロリン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンをＭＰに添加して骨形成を引き起こすように誘導した。２日ごとに培地を取り替えて、骨形成培養物中に細胞を維持した（Ｐｏｓｔ ｅｔ Ａｌ． Ｂｏｎｅ ２００８， ４３，１； ３２−３９， Ｑｕ ｅｔ Ａｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ａｎｉｍ． ２００７； ４３； ９５−１００）。培養物をＰＢＳでリンスし、７０％エタノールで固定し、リン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色して骨形成分化を測定した。さらに、オステオカルシンの免疫組織化学法およびフォン・コッサ染色を行って「骨」の表現型を確認した。
【０１０４】
ＡＭＳＣを含む多次元構造を、大学組織バンク（ルーバン大学医学部付属病院、ベルギーのブリュッセル）によって調達された「脱灰骨基質（ＤＢＭ）」の存在下で共インキュベーションによって行った。脱灰骨基質の製造は、実施例１の「脱灰骨の供給源」に開示されている。
【０１０５】
基質
ＤＢＭの効力を以下によって評価する：（ｉ）脱灰プロセス後の残留カルシウム濃度の測定（９７％超の［カルシウム］低下）、および（ｉｉ）移植から１ヵ月後の生体内での（ヌードラットにおける）骨生成の可能性。平均１５〜１８日間の骨芽細胞培地におけるＡＭＳＣ（第４継代）のインキュベーション後に、異なる濃度（０／１／５／１０および２０ｍｇ／ｍｌ）のＤＢＭを特異的分化培地に添加する。培地を、ＤＢＭを除去せずに２日ごとに取り替える。３次元構造の程度、細胞構造、オステオカルシン発現およびフォン・コッサ染色（カルシウム沈着のため）を評価して、３次元骨様構造にとって適当なＤＢＭ濃度を選択する。
【０１０６】
移植手順ならびに脱灰骨基質およびＡＭＳＣを含む多次元構造の追跡調査
（多次元構造にとって）最適なＤＢＭ濃度を有する骨形成培養物（第４継代）から得られたＡＭＳＣを移植のために回収した。
− ヌードラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国マサチューセッツ州ウィルミントン）をレシピエントとして使用した。細胞を傍脊柱筋に移植した。脊柱を中心とした縦切開を行い、皮下組織を切開して筋膜を露出させた。多次元構造を傍脊柱筋組織に直接移植した（大学組織バンク、ルーヴァン・カトリック大学、ベルギーのブリュッセル）。対照は、同じラットの反対側の傍脊柱筋に凍結乾燥した海綿骨を単独で移植して確保した。移植部位の早期回復を可能にするために、再吸収不可能な縫合糸を用いて筋膜を閉じた。動物を屠殺し、全身麻酔下でのＴ６１心臓内注射（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔ．社、ドイツ）による移植から３０日後に外植を行った。次いで、インプラントを回収し、組織学およびマイクロコンピュータ断層撮影のために処理した。
− ブタのレシピエント。２つの異なる外科的モデルで移植片を試験する。本発明者らは（ｉ）大腿皮質骨欠損部におけるそれらの架橋能力および（ｉｉ）腰椎前方固定術（ＡＬＩＦ）におけるそれらの融合性を分析する。
− （ｉ）皮質骨欠損モデルは、実験的整形外科において、および主にＣ．Ｄｅｌｌｏｙｅ教授の研究を通して本発明者らの研究室においてよく知られている。ブタを類似モデルに使用し、骨幹骨欠損部を長骨上に形成した後、そこに移植材料を充填するか空のままにする。本発明者らの実験では、ブタの両大腿部を手術する。１．５ｃｍの皮質骨欠損部を形成し、標準的な４．５ｍｍのチタン製ロッキング圧迫プレートによって安定させる。片方の大腿骨欠損部を空のままにし、反対側の脚にＡＭＳＣ移植片を移植する。
− （ｉｉ）ブタの実験的外科手術においてＡＬＩＦモデルが十分に確立されている。本発明者らの技術は、後側方到達法による４つのレベルのＡＬＩＦ法からなる。融合は、椎体間ポリエチルポリエチルケトン（ＰＥＥＫ）ケージによって得られる。椎間板を開き、髄核を除去し、軟骨を広げて軟骨下骨を露出させた後、ＰＥＥＫケージを挿入する。これらのケージは空として設計するが、様々な実験材料を充填することができる。この場合、各レベルに異なる移植片組織を入れて、４つの異なる群を構成する。１つのケージは、陰性対照として空のままにし、１つのケージは、凍結乾燥した照射済み海綿骨を充填し（臨床分野で実施される場合が多い）、１つのケージは自家海綿骨移植片を含み（融合法における至適基準であるため、本発明者らの陽性対照とみなす）、最後のケージはＡＭＳＣ移植片を有する。動物を屠殺し、全身麻酔下でのＴ６１心臓内注射（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔ．社、ドイツ）による移植から７週間後に外植を行った。次いで、インプラントを回収し、組織学およびコンピュータ断層撮影のために処理した。
【０１０７】
追跡調査
ヌードラット：
外植したインプラントをＨＣＬで脱灰し、処理し、パラフィンに包埋し、薄片にした（５μｍ）。組織学的染色のために、ヘマルン・エオシン（Ｈｅｍａｌｕｎ Ｅｏｓｉｎ）染色、マッソン緑色三色（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｇｒｅｅｎ Ｔｒｉｃｈｒｏｍ）染色、オステオカルシンおよびフォン・コッサ染色による標準的な呈色反応を使用した。オステオカルシン染色は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｓｙｓｔｅｍモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ社、デンマーク）によって公開されたモノクローナル抗体（ＯＣ４−３０、Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ）によって得られた。回収したインプラントのミクロ構造を、ｐＱＣＴ（末梢骨用定量的コンピュータ断層装置、ＸＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＡ型、Ｓｔｒａｔｅｃ社、ドイツのプフォルツハイム）を用いて分析した。皮質および総骨密度を、各インプラントの複数のスライドを用いて測定した。フォンヴィルブラント染色（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ）（上記参照）後に、新しく形成された血管の定量化によって生体内での血管新生の定量化を行った。
【０１０８】
ブタ：
食品および水を自由に摂取できる状態でブタを個々に収容する。術後処置および鎮痛は、実験動物管理のための標準的な実験計画書に従って行う。自家移植片モデルでは、生物学的追跡調査は、血液試料による炎症評価で構成される。
【０１０９】
放射線学的追跡調査によって、移植から１、５および７週間後にコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンによって生体内での骨形成を比較することができる。臨床ＣＴスキャンの高解像度および多断面変換は非常に精密であるため、本発明者らは、生体内でのＰＥＥＫケージの内容を分析することができ、従って、融合プロセスの評価が可能となる。
【０１１０】
１回のスキャン掃引によって集められた全ての情報を用いて、大腿骨に対して同じ手順を使用する。マイクロＣＴによって外植した移植片を処理することによって、安楽死後にさらにより良好な解像度が得られる。外植した移植片に対する組織学的および免疫組織化学的調査は、自然の皮質の架橋および融合能力と比較して、新生骨形成および移植片血管再建（血管内皮増殖因子、ＣＤ５１、フォンウィルブランド因子）、硬化（オステオカルシン）および無機化（フォン・コッサ）を評価するために現在行われている。
【０１１１】
脱灰プロセスによって、移植した材料の組織学的および免疫組織化学的調査が可能となる。組織学、組織形態計測およびマイクロラジオグラフィは、組織を石灰化された状態に維持する必要があるため、非脱灰処理も必須となる。
【０１１２】
統計
ボンフェローニのポストホックテストを含む一元配置分散分析法によって群間の差の統計的有意性を試験した。Ｓｙｓｔａｔバージョン８．０によって統計的検定を行った。差はｐ＜０．０５で有意であるとみなした。
【０１１３】
結果
最適なＤＢＭ濃度を有する多次元構造についての構想の証明：生体外での骨様構造
ＡＭＳＣ細胞移植の生物学的支持体を回避するために、多次元構造をＤＢＭと組み合わせて発達させた。ヌードラットにおいて生体内で骨形成分化促進能力を有する脱灰骨基質（平均径７００μｍ）（ＡＭＳＣに接触させて用いる前に品質管理が必要とされる）は、ＡＭＳＣとの共インキュベーションにおいて生体外細胞リモデリングを達成するために必要となる。
【０１１４】
両方の骨形成分化培地において、ＤＢＭの添加によって、ＤＢＭを含まない単独のＡＭＳＣと比較して、細胞収縮、コラーゲン合成およびＤＢＭ粒子の再編成による３次元構造の発達が誘導された。多次元構造の発達を最適化するために、段階的なＤＢＭ用量を試験した。極端な濃度（２０ｍｇ／ｍｌ超）は適していないことが分かった。１ｍｇ／ｍｌでは、外科的用途のための移植処理に最適な３次元構造は発達しなかった。対照的に、５および１０ｍｇ／ｍｌでは、移植片除去および外科的用途に最適な組織の退縮が生じることが分かった。顕微鏡によって、オステオカルシン発現および無機化プロセス（フォン・コッサ染色）がこれらの最新のＤＢＭ濃度によって明らかとなった。骨形成条件においてＡＭＳＣを含む３次元構造を得るために、平均２０±３日のＤＢＭとの共インキュベーションが必要となる。
【０１１５】
最適なＤＢＭ濃度を有する多次元構造についての構想の証明：生体内での骨形成
ヌードラット
ヌードラットにおける移植から３０日後に、ＤＢＭを含まない単独のＡＭＳＣでは、新しい骨様構造の形成は誘導されなかった。フォン・コッサによって染色された小さい骨小節（オステオカルシン＋）のみがヌードラット筋肉組織内にまばらに分散していた。対照的に、多次元構造の移植は、移植部位の良好な局在化によって容易に行われた。移植から３０日後に、小型で強力な骨様構造が、ＤＢＭ粒子内の顕微鏡的に高密度の結合組織を有する筋肉内に認められた。骨様構造は、オステオカルシン染色結合組織および無機化プロセスに認められた。
【０１１６】
ブタのレシピエント
移植から５週間後に、ブタにおいて、ＣＴスキャンによって示されるように、大腿骨の欠損部（処理なし）には自然発生の硬化が全く認められなかった。足場を全く使用せずに、骨欠損部に多次元構造を組み込むことは容易であった。この最新の移植は、自然の皮質骨欠損部を架橋する骨様構造によって、移植後の初期（移植から５週間後）に骨硬化を有意に向上させる。
【０１１７】
最適なＤＢＭ濃度を有する多次元構造についての構想の証明：生体内での血管新生
正常酸素圧および低酸素条件において、生体外で幹細胞の血管新生促進能力を評価するために、前臨床ブタ骨髄ＭＳＣおよび脂肪ＭＳＣを、０．１、３、５および２１％Ｏ２の低酸素室内に２４、４８および７２時間置き、ＶＥＧＦの放出をＥＬＩＳＡで定量化した。ＢＭ−ＭＳＣは、正常酸素圧条件よりも低酸素条件においてより多くのＶＥＧＦを放出し、２４時間よりも４８および７２時間（より高レベルのＶＥＧＦを有する時間）後に、この分泌を維持した（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＡＭＳＣからのＶＥＧＦの放出は、複数の異なる培養条件において類似していたが、有意なより高レベルのＶＥＧＦは、ＢＭ−ＭＳＣよりもＡＭＳＣによって放出された（それぞれ２３６４±９４ｐｇ／ｍｌ対１１２７４±６７９、ｐ＜０．０５）（図６）。
【０１１８】
これらの結果は、ＢＭ−ＭＳＣおよびＡＭＳＣの移植後に生体内で確認された。有意なより高い血管新生は、ＢＭ−ＭＳＣと比較して、骨形成ＡＭＳＣ移植の場合に認められた（ｐ＜０．０５）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多次元構造を有し、かつ分化したＭＳＣ組織および脱灰骨基質を含む生体材料であって、前記脱灰骨基質が前記分化したＭＳＣ組織内に分散されており、前記ＭＳＣが脂肪組織由来幹細胞である生体材料。
【請求項２】
前記分化したＭＳＣ組織を製造するために使用される前記ＭＳＣはヒトまたは動物由来である、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
前記ＭＳＣは、継代培養後期の脂肪組織由来幹細胞である、請求項１または２に記載の生体材料。
【請求項４】
３次元である請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項５】
無機質コーティングでコーティングされた骨細胞と、コラーゲンを含む相互結合組織とを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項６】
軟骨細胞と、コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む細胞外基質とを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項７】
前記脱灰骨基質は、５０〜２５００μｍの平均径を有する粒子の形態である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体材料を含むインプラント。
【請求項９】
骨芽細胞培地および／または軟骨形成培地でＭＳＣを１５〜２５日間インキュベートし、次いで前記培地に脱灰骨基質を添加し、かつ１５〜３０日のさらなる期間にわたってインキュベーションを維持することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多次元生体材料の製造方法。
【請求項１０】
前記骨芽細胞培地は、ヒト血清、デキサメタゾン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された標準的な培地である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記軟骨形成培地は、ヒト血清、デキサメタゾン、ＴＧＦ−Ｂ３、Ｌ−プロリン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、インスリン−トランスフェリン−セレン、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された標準的な培地である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記脱灰骨基質を５〜１０ｍｇ／ｍｌの量で前記培地に添加する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られる多次元生体材料。
【請求項１４】
請求項１〜７および１３のいずれか１項に記載の生体材料を含む医療機器。
【請求項１５】
請求項１〜７および１３のいずれか１項に記載の生体材料と、好適な固定手段とを含むキット。
【請求項１６】
骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療する方法で使用される請求項１〜７および１３のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１７】
関節の先天的もしくは後天的な異常部分、頭蓋顔面上顎骨、歯科矯正処置部分、術後の骨もしくは関節骨の置換部分、外傷もしくは他の先天的もしくは後天的な異常部分を支持または矯正するため、または他の筋骨格インプラント、特に人工および合成インプラントを支持するための方法で使用される、請求項１〜７および１３のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１】
多次元構造を有し、かつ分化したＭＳＣ組織および脱灰骨基質を含む生体材料であって、前記脱灰骨基質が前記分化したＭＳＣ組織内に分散されており、前記ＭＳＣが脂肪組織由来幹細胞である生体材料。
【請求項２】
前記分化したＭＳＣ組織を製造するために使用される前記ＭＳＣはヒトまたは動物由来である、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
前記ＭＳＣは、継代培養後期の脂肪組織由来幹細胞である、請求項１または２に記載の生体材料。
【請求項４】
３次元である請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項５】
無機質コーティングでコーティングされた骨細胞と、コラーゲンを含む相互結合組織とを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項６】
軟骨細胞と、コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む細胞外基質とを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項７】
前記脱灰骨基質は、５０〜２５００μｍの平均径を有する粒子の形態である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体材料を含むインプラント。
【請求項９】
骨芽細胞培地および／または軟骨形成培地でＭＳＣを１５〜２５日間インキュベートし、次いで前記培地に脱灰骨基質を添加し、かつ１５〜３０日のさらなる期間にわたってインキュベーションを維持することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多次元生体材料の製造方法。
【請求項１０】
前記骨芽細胞培地は、ヒト血清、デキサメタゾン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された標準的な培地である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記軟骨形成培地は、ヒト血清、デキサメタゾン、ＴＧＦ−Ｂ３、Ｌ−プロリン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、インスリン−トランスフェリン−セレン、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された標準的な培地である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記脱灰骨基質を５〜１０ｍｇ／ｍｌの量で前記培地に添加する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られる多次元生体材料。
【請求項１４】
請求項１〜７および１３のいずれか１項に記載の生体材料を含む医療機器。
【請求項１５】
請求項１〜７および１３のいずれか１項に記載の生体材料と、好適な固定手段とを含むキット。
【請求項１６】
骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療する方法で使用される請求項１〜７および１３のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１７】
関節の先天的もしくは後天的な異常部分、頭蓋顔面上顎骨、歯科矯正処置部分、術後の骨もしくは関節骨の置換部分、外傷もしくは他の先天的もしくは後天的な異常部分を支持または矯正するため、または他の筋骨格インプラント、特に人工および合成インプラントを支持するための方法で使用される、請求項１〜７および１３のいずれか１項に記載の生体材料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２８６４３（Ｐ２０１２−５２８６４３Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１３６３５（Ｐ２０１２−５１３６３５）
【出願日】平成２２年６月４日（２０１０．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５７８４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３９７９２
【国際公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【出願人】（５１１２９４５３４）ウニベルシテ カソリーク デ ルーベン (1)
【出願人】（５１１２９４５４５）クリニークス ウニベルシタレス セント−ルーク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月４日（２０１０．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５７８４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３９７９２
【国際公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【出願人】（５１１２９４５３４）ウニベルシテ カソリーク デ ルーベン (1)
【出願人】（５１１２９４５４５）クリニークス ウニベルシタレス セント−ルーク (1)
【Ｆターム（参考）】
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