多重腫瘍異常生長遺伝子
【課題】種々の良性および悪性いずれの腫瘍にも見られる異常細胞成長に関連する遺伝子およびタンパク質の提供。
【解決手段】高速移動群タンパク質遺伝子またはＬＩＭタンパク質遺伝子（これらの修飾体を含む）の成員の一つの鎖の一つのヌクレオチド配列を有する多重腫瘍異常生長（ＭＡＧ）遺伝子および多重腫瘍成長因子。遺伝子およびその誘導体は、非生理的増殖を有する細胞の診断、種々の腫瘍、その他診断的および治療的利用に供することができる。
【解決手段】高速移動群タンパク質遺伝子またはＬＩＭタンパク質遺伝子（これらの修飾体を含む）の成員の一つの鎖の一つのヌクレオチド配列を有する多重腫瘍異常生長（ＭＡＧ）遺伝子および多重腫瘍成長因子。遺伝子およびその誘導体は、非生理的増殖を有する細胞の診断、種々の腫瘍、その他診断的および治療的利用に供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の良性および悪性いずれの腫瘍にも見られる異常細胞生長にしばしば関連する遺伝子ファミリーとして、高速移動群（ＨＭＧ）タンパク質遺伝子ファミリーの同定に関する。本発明は特に、多くの腫瘍に関与する広範な作用の１２番染色体切断点領域遺伝子として、多くのＨＭＧ遺伝子ファミリーの同定に関する。これらの腫瘍には、限定はしないが、間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪腫、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍、さらに白血病およびリンパ腫が含まれる。本発明は、また６番染色体の切断に関連するのが見い出されたＨＭＧ遺伝子ファミリーの他の成員にも関する。
【０００２】
さらに、本発明は、これらの腫瘍における型特異切断点領域遺伝子の他の型およびＨＭＧ遺伝子の頻回融合相手として、ＬＩＭタンパク質ファミリーの成員の同定に関する。このファミリーのＬＰＰ（脂肪腫−先取相手）遺伝子は、脂肪腫に特異的であることが判明した。本発明は特に、診断および治療においてＨＭＧおよびＬＩＧ遺伝子ファミリーおよびそれらの誘導体を使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの独立した細胞遺伝子学的研究が、種々の良性および悪性の固形腫瘍型に１２番染色体の領域ｑ１３−ｑ１５が関連していることを示している。良性固形腫瘍については、１２ｑ１３−ｑ１５の関与が良性脂肪性組織腫瘍［１］（非特許文献１）、子宮平滑筋腫［２，３］（非特許文献２，３）および唾液腺の多形態性腺腫［４，５］（非特許文献４，５）においてしばしば観察される。同じ領域の関与が子宮内膜ポリープ［６，７］（非特許文献６，７）、血管外皮細胞腫［８］（非特許文献８）および軟骨腫瘍［９，１０，１１，１２］（非特許文献９，１０，１１，１２）についても報告されている。最近、染色体１２ｑ１３−ｑ１５の関与が肺軟骨様過誤腫［１３，１４］（非特許文献１３，１４）について報告された。最後に、染色体領域１２ｑ１３−ｑ１５の関与する固形腫瘍のいくつかの症例報告が公表されている。例えば、乳房腫瘍［１５，１６］（非特許文献１５，１６）、拡散星状細胞腫［１７］（非特許文献１７）および骨の巨人細胞腫瘍［１８］（非特許文献１８）である。１２ｑ１３−ｑ１５における再発異常を有する悪性腫瘍型には、粘膜様脂肪肉腫［１９］（非特許文献１９）、軟組織明細胞肉腫［２０，２１，２２］（非特許文献２０，２１，２２）および横紋筋肉腫［２３］（非特許文献２３）がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sreekantaiah, C., Leong, S.L.P., Karakousis, C.P., McGee, D.L., Rappaport, W.D., Villar, H.V., Neal, D., Fleming, S., Wankel, A., Herrington, P.N., Carmona, R. and Sandberg, A.A. (1991). Cytogenetic profile of 109 lipomas. Cancer Res. 51: 422-433.
【非特許文献２】Nilbert, M. and Heim, S. (1990). Uterine leiomyoma cytogenetics. Genes Chrom. Cancer 2: 3-13.
【非特許文献３】Pandis, N., Heim, S., Willen, H., Bardi, G., Floderus, U.M., Mandahl, N. and Mitelman, F. (1991). Chromosome analysis of 96 uterine leiomyomas. Cancer Genet. Cytogenet. 55: 11-18.
【非特許文献４】Sandros, J., Stenman, G. and Mark, J. (1990). Cytogenetic and molecular observations in human and experimental salivary gland tumours. Cancer Genet. Cytogenet. 44: 153-167.
【非特許文献５】Bullerdiek. J.. Wobst, G., Meyer-Bolte. K., Chilla, R., Haubrich, J., Thode, B. and Bartnitzke, S. (1993). Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic adenomas: correlation to occurrence, histological subtype, and in vitro cellular behavior. Cancer Genet. Cytogenet. 65: 27-31
【非特許文献６】Walter. T.A., Xuan Fan, S., Medchill, M.T., Berger, C.S., Decker, H-J.H and Sandberg, A.A. (1989). Inv(12)(p11.2ql3) in an endometrial polyp.Cancer Genet. Cytogenet. 41: 99-103.
【非特許文献７】Vanni, R., Dal Cin, P., Marras, S., Moerman, P., Andrtia, A., Valdes, E., Deprest, J., and Van den Berghe, H., (1993). Endometrial polyp: Another benign tumor characterized by 12q13-q15 changes. Cancer Genet. Cytogenet. 68: 32-33.
【非特許文献８】Mandahl, N., Orndal, C., Heim, S., willen, H., Rydholm, A., Bauer, H.C.F. and Mitelman, F. (1993). Aberrations of chromosome segment 12q13-15characterize a subgroup of hemangiopericytomas. Cancer 71: 3009-3013.
【非特許文献９】Mandahl, N., Heim, S., Arheden, K., Rydholm, A., Willen, H. and Mitelman, F. (1989). Chromosomal rearrangements in chondromataus tumors. Cancer 65:242-248.
【非特許文献１０】Bridge,J.A.,Persons,D.L.,Neff,J.R.and Bhatia,P.(1992). Clonal karyotypic aberrations in enchondroma. Cancer Detect. Prev. 16: 215-219.
【非特許文献１１】Hirabayashi, Y., Yoshida, M.A., Ikeuchi, T., Ishida,T., Kojima, T. Higaki, S., Machinami, R. and Tonomura, A. (1992). Chromosome rearrangements at 12q13 in two cases of chondrosarcomas. Cancer Geaet. Cytogenet. 60: 35-40.
【非特許文献１２】Mandahl, N., Willen, H., Rydholm, A. and Mitelman, F. (1993). Rearrangement of band q13 on both chromosomes 12 in a periosteal chondroma. Genes Chrom. Cancer 6: 121-123.
【非特許文献１３】Dal Cin, P., Kools, P., De Jonge, I., Moerman, Ph., Van de Ven W., Van den Berghe H. (1993a). Rearrangement of 12q14-15 in Pulmonary Chondroid Hamartoma. Genes Chrom. Cancer, 8, 131-133.
【非特許文献１４】Schoenberg Fejzo, M., Yoon, S.J., Montgomery, K.T., Rein, M.S.,Weremowicz, S., Krauter, K.S., Dorman, T.E., Fletcher, J.A., Mao, J., Moir, D.T., KucherlApati, R.S., and Morton, C.C. (1995). IdentificAtian of a YAC spanning the translocatian breakpoints in uterine leiomyomata, pulmonary chondroid hamartama and lipoma. Physical mapping of the 12q14-15 breakpoint region in uterine leiomyomata. Genomics 26: 265-275.
【非特許文献１５】Birdsal, S.H., MacLennan, K.A. and Gusterson, B.A. (1992). t(6;12)(q23;q13) and t(10;16)(q22;p11) in a phyllodes tumor of the breast. Cancer Genet. Cytogenet. 60: 74-77.
【非特許文献１６】Rohen, C.. Bont, U., Staats, B.. Bartnizke, S. and Bullerdiek, J. (1993). Two human breast tumors with translocatians involving 12q13-15 as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet. Cytogenet., 69: 68-71.
【非特許文献１７】Jenkins, R.B., Kilmmell, D.W., Moertel, C.A., Schulz, C.A., Menezes, R.M., Scheihauer, B.. Kelly, P.J. and Dewald, G.W. (1989). Recurrent cytogenetic abnormalities in 80 gliomas. Cytogenet. Cell Genet. 51: 1019.
【非特許文献１８】Noguera, R., Llombart-Bosch, A., Lopez-Gines, C., Carda, C. and Fernandez, C1. (1989). Giant-cell tumor of bone, stage II, displaying translocation t(12;14)(q13:q13). Virchows Archiv A Pathol. Anat. 415: 377-382.
【非特許文献１９】Turc-Carel, C., Limon, J., DaI Cin, P., Rao, U., Karakousis, C., andSandberg, A.A. (1986). Cytogenetic studies of adipose tissue tumours. ll.Recurrent reciprocal translocat.ion t(12;16)(q13;p11) in myxoid liposarcomas. Cancer Genet. Cytogenet. 23: 291-299.
【非特許文献２０】Rodiguez, E., Sreekantaiah, C., Reuter, V.E., Motzer, R.J. and Chaganti, R.S.K. (1992). t(12;22)(q13;q13) and trisomy 8 are nonrandom aberrations in clear-cell sarcoma. Cancer Genet. Cytogenet. 64:107-110.
【非特許文献２１】Reeves, B.R., Fletcher, C.D.M. and Gusterson, B.A. (1992). Translocation t(12;22)(q13;qI3) is a nonrandom rearrangement in clear cell sarcoma. Cancer Genet. Cytogenet. 64: 101-103.
【非特許文献２２】Fletcher, J.A. (1992). Translocation (12;22)(q13-14;q12) is a nonrandom aberration in soft-tissue clear cell sarcoma. Genes Chrom. Cancer 5: 184.
【非特許文献２３】Roberts, P., Browne, C.F., Lewis, I.J., Bailey, C.C., Spice, R.D., Williams, J. and Batcup, G. (1992). 12q13 Abnormality in rhabdomyosarcoma. A nonrandom Occurrence? Cancer Genet. Cytogenet. 60: 135-140.
【発明の概要】
【０００５】
これらの研究は、１２番染色体の同じ細胞遺伝子学的領域がこれらの固形腫瘍における転座（トランスロケーション）のような染色体異常にしばしば関与することを示唆しているが、種々の腫瘍における１２番染色体切断点の正確な本質は、なお分かっていない。転座によって直接どの遺伝子が影響を受けるのかも確認されていない。
以前の物理的マッピング研究において、脂肪腫、多形態性唾液腺腫および子宮平滑筋腫における染色体１２ｑ切断点は座Ｄ１２Ｓ８とＣＨＯＰ遺伝子との間に位置づけられ、Ｄ１２Ｓ８はＣＨＯＰの末端にあることが示された。最近、ＦＩＳＨ解析によって、乳房過誤腫、血管粘液腫および多重肺軟骨様過誤腫における染色体１２ｑ切断点は、このＤＮＡ間隙内に位置していることも発見された。種々の腫瘍における染色体１２ｑ１３−ｑ１５異常により影響される遺伝子を分子的にクローニングする努力において、本発明者らは、これらの切断点を包含するＤＮＡ領域を明確にするための構造的アプローチとして方向性染色体歩行を選択した。
染色体歩行の出発点として、座Ｄ１２Ｓ８を用いた。これらの歩行研究において、多数の子宮平滑筋腫−誘導細胞系中に存在する染色体切断点は４４５ｋｂ染色体断片内にクラスター状に群がっていることが示され、これは、１２番染色体上の子宮平滑筋腫クラスター領域 Uterine Leiomyoma Cluster Region on chromosome 12(ULCR12)と名付けられた［１２］。続いて、１２番染色体上の１.７Ｍｂ領域に、子宮平滑筋腫−、脂肪腫−および唾液腺腫−細胞の１２番染色体切断点が種々の腫瘍型重複の切断点クラスター領域を有して、存在することが判明した［２５、添付１］。１２番染色体の長腕上のこの１.７Ｍｂ領域は、明らかにＵＬＣＲ１２を含み、この特性を反映して多重異常領域 Multiple Aberration Region(MAR)と名付けられた。領域マッピング研究においてＭＡＲは最近、１２ｑ１５に割り当てられた。
【０００６】
このように、基本的に１.７Ｍｂ領域における１２番染色体地図のすべての切断点が"多重異常領域"すなわちＭＡＲとして関係することが分かった。更なる研究によって、この領域における高速移動群遺伝子ファミリーの成員であるＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子が仮定多重腫瘍異常生長遺伝子（ＭＡＧ）として同定され得ることが明らかにされた。同じことが、染色体異常に関与するのが発見されたＬＩＭファミリーの成員についても適用される。それらのうち３番染色体−誘導脂肪腫−先取相手（ＬＰＰ）は、特に脂肪腫に関係している。
【０００７】
ＬＩＭタンパク質は、システイン富化・亜鉛結合ドメイン、いわゆるＬＩＭドメインを有するタンパク質である。これはタンパク質−タンパク質相互作用に関与する［総説について、参考文献８０を参照］。タンパク質ファミリーの成員の一つは、ここに開示された３番染色体に位置するＬＰＰタンパク質である。
【０００８】
本発明によると、１２番染色体上のＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子および３番染色体上のＬＰＰ遺伝子における異常は、良性および悪性腫瘍におけるＨＭＧおよびＬＩＭ遺伝子ファミリーの成員の関与についての、より一般的な概念を明らかにするモデルとして用いられる。染色体再編成により影響を受けたときに、腫瘍生長の特定群に到達する遺伝子ファミリーの、より一般的な概念が存在することを明らかにするために、本発明者らは、ＨＭＧファミリーの成員であるＨＭＧＩ（Ｙ）遺伝子が６番染色体中の切断に関与することを明らかにした。両ＨＭＧおよびＬＩＭ遺伝子ファミリーはそれ自体知られているが、本発明に至るまでは、これらのファミリーと、転座、欠失、挿入および内返しのような腫瘍を起こす染色体異常との相関は予想されていなかった。さらに、現在まで、該遺伝子ファミリーの成員の生理的発現レベルにおける異常が腫瘍の発育に関係しているであろうことは、かつて明らかにされなかった。本発明によって、正常成人の細胞においてＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現レベルが実際的には検出不可能であり、一方、異常に生長した細胞においては発現レベルが有意に増加していることが明らかになった。
【０００９】
これらの知見を基にして、本発明は、該遺伝子ファミリーの成員またはその誘導体を分離した形で、および診断および治療におけるその使用を提供する。さらに、該遺伝子の位置およびヌクレオチド配列の知識は、その再編成または発現を研究するために、およびその発現レベルにおける潜在的増大または低下および細胞の生長に対するその作用を同定するために、用いることができる。この情報に基づき、診断検査法や治療的処置が設計される。
【００１０】
本出願において、用語"多重腫瘍異常生長（またはＭＡＧ）遺伝子"は、種々の型の癌におけるこれら型の遺伝子の関与を示すために用いられる。この用語は、非生理的な増殖生長に関与するＨＭＧおよびＬＩＭ遺伝子ファミリーのすべての成員を意味し、特に動脈硬化的プラークを含む悪性および良性の腫瘍に関与するものを意味する。しかし、本発明によって更に、実際の遺伝子外側の切断でも、その近隣であれば異常生長が結果として生じることもあるのが判明した。従って、用語ＭＡＧ遺伝子は該遺伝子の直接の近隣も含むことを意味している。"直接の近隣"が上記に明確にした非生理的増殖生長をもたらす切断または再編成がなされる遺伝子の周りを含むと理解されるべきことは、当業者は容易に分かるであろう。
【００１１】
用語"野生型細胞"は、異常染色体を保有していない細胞または関連遺伝子が生理的な発現レベルにある細胞を意味する。"野生型"すなわち"正常"染色体は、非異常染色体を意味する。
【００１２】
本発明は、該遺伝子から誘導される情報に基づく種々の診断的および治療的利用を提供する。この情報は、遺伝子から誘導される遺伝子産物のヌクレオチド配列やアミノ酸配列を包含するのみでなく、遺伝子の複製または翻訳レベルをも含む。
【００１３】
このように本発明は２重性である。一つは、細胞における異常が遺伝子またはその近隣で起きる物理的切断によって直接的または間接的に生じ得る。他方、細胞における異常が遺伝子の非生理的発現レベルによって生じ得る。この非生理的発現レベルは切断によって生じうるか、または遺伝子を活性化または不活性化する他の刺激によるものであり得る。現在のところ、異常細胞生長の正確なメカニズムまたは起源は分かっていない。しかし、このメカニズムについての正確な知識は、診断方法あるいは処置を確立するのに必要でない。
【００１４】
本発明の診断方法は、染色体における異常が染色体の外観または生化学的反応について検出可能な変化をもたらすとの事実に基づいている。例えば、転座は、染色体（および、その結果としてＭＡＧ遺伝子の）の第一部分が他の（第二）部分に置換されること（以後、"第一および第二置換部分"と言う）が結果として生じる。第一部分は、第二部分を生みだした他の染色体と違った場所にしばしば現れる。結果として、ハイブリドは、両（三重転座の場合は、より以上）染色体の残りの部分と転座相手により提供された置換部分との間で形成される。切断がＭＡＧ遺伝子において生じることが判明したので、これはそのＭＡＧ遺伝子のハイブリド遺伝子産物をもたらす。ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリドのようなハイブリド分子または抗生物質などのマーカーは、該ハイブリドをＤＮＡレベルおよびＲＮＡまたはタンパク質レベルのいずれでも検出することができる。
【００１５】
例えば、ハイブリドの転写物は、遺伝子／染色体の残りの部分により提供される領域を含んでいるが、転座された置換部分により提供される領域を欠いている。内返し、欠失および挿入の場合、遺伝子は等しく障害を受ける。
【００１６】
転座も細胞遺伝学的に常に検出可能である。他の異常は、細胞遺伝子レベルでみることがしばしばできないので、見い出すことはより難しい。本発明は、これらすべての型の染色体異常を診断し得る可能性を提供するものである。
【００１７】
転座において染色体の残りおよび置換部分についてのＭＡＧ遺伝子に基づくマーカーまたはプローブは元の染色体についての残り部分をインサイトゥ検出するが、他の染色体、転座相手についての置換部分を検出しない。
【００１８】
内返しにおいては例えば、２つのプローブは野生遺伝子において特殊な距離でハイブリダイズする。しかし、この距離は内返しにより変化することがある。インサイトゥかかる内返しは、一組の適当なプローブを蛍光ラベルなどの同じまたは相違するマーカーでラベルすることにより可視化される。欠失および挿入は同様の方法により検出される。
【００１９】
本発明により、上記インサイトゥ利用は、ＦＩＳＨ法を用いて非常に都合よく実施され得る。マーカーは例えば２コスミドであり、うち１つはＭＡＧ遺伝子のエキソン１−３を含み、他の１つはエキソン４および５を含む。両コスミドは相違する蛍光マーカー、例えば青および黄でラベルされる。正常な染色体は両ラベルの結合を示すのでグリーンの信号となり、一方、転座は１つの染色体の残りの部分（例えば１２番）に青信号として見られ、黄信号は置換部分を含む他の染色体に見られる。同じレベルを両プローブに用いた場合、正常染色体に対する信号強度は１００％であり、一方異常染色体に対しては５０％である。内返しの場合、信号の一つが正常染色体上の一つの場所から異常染色体上の他の場所に変わる。
【００２０】
上記の利用において比較のために参考が含まれねばならない。常に２つの染色体の一つが障害を受ける。このように正常染色体を内部参考として利用することは大変便利である。さらに、染色体の残りの未変化部分についてのマーカーを一つ、および置換または逆方向部分について他の一つを選択することが重要である。１２番染色体のＭＡＧ遺伝子の場合、本発明が示すように、切断は、エキソン３と４の間の大きいイントロンに通常は見い出される。さらに切断はエキソン４と５の間に検出された。エキソン１−３および４および５に基づくプローブ、またはエキソン４か５に基づくプローブは非常に有用である。別法として、両転座または融合相手に基づくプローブの組み合わせを用い得る。例えば、脂肪腫の同定に、一方、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子のエキソン１−３に基づき、および他方、ＬＰＰ−Ｃ遺伝子のエキソン１−３に基づくプローブを用いることができる。
【００２１】
さらに、切断が遺伝子の外側、すなわちその５'または３'でも起こり得ることが見い出された。プローブの選択は勿論遺伝子の５'または３'に位置するＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも一つのプローブを含む。
【００２２】
ここで用いられる"プローブ"は、広く解釈されるべきで、限定しないが、線状ＤＮＡまたはＤＮＡ鎖、イースト人工遺伝子（ＹＡＣｓ）または環状ＤＮＡ形、例えばプラスミド、ファージ、コスミドなどを含む。
これらのインサイトゥ方法は中間層および間層染色体に用いられる。
【００２３】
上記のインサイトゥ方法以外に、種々の診断方法がより多くの生化学レベルで実施され得、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質における変化または遺伝子の生理的発現レベルにおける変化に基づいている。
【００２４】
染色体の生化学行動における変化に基づく方法の基礎は、適当なプローブを選択することにより、遺伝子中の長さまたは構成、転写物またはタンパク質における多重性がゲルまたはブロット上で検出されることにある。正常遺伝子、転写物またはタンパク質がゲルまたはブロット上の他の位置に現れ、次いで異常遺伝子が現れるので、長さの変化が見られ得る。転座の場合、正常数よりも多くのスポットが現れる。
【００２５】
上記の原則を基にして本発明は、例えば、非生理的増殖能を有する細胞を診断する方法に関し、この方法は、診断すべき細胞の生体を採取し、それからＭＡＧ遺伝子−関連マクロ分子を分離し、得たマクロ分子を非生理的増殖能がない細胞から、望ましくは同じ個体から生じた参考分子と比較して分析する段階を含んでいる。ＭＡＧ遺伝子−関連マクロ分子はＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質であり得る。ＭＡＧ遺伝子は、ＨＭＧファミリーまたはＬＩＭファミリーのいずれかの成員である。
【００２６】
この型の診断方法の特定的実施態様において本発明は、診断すべき細胞の生検を採取し、その全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡ抽出物またはそのポリ−Ａ−選択フラクション中のｍＲＮＡ種の第一鎖ｃＤＮＡを調製し（ｃＤＮＡは適当なティルを含む）；ＭＡＧ遺伝子特異的ｃＤＮＡを増幅させるためにＭＡＧ遺伝子特異的プライマーおよびティル−特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い；ゲル上のＰＣＲ産物を分離してバンドのパターンを得；異常バンドの存在を、野生型バンド、望ましくは同じ個体から得たもの、と比較して、調べる段階を含む。
【００２７】
別の増幅方法が核酸配列に基づく増幅技法（ＮＡＳＢＡ）［８１］またはその変法により実施され得る。
【００２８】
他の実施態様において、該方法は、診断すべき細胞の生検を採取し、それから全タンパク質を単離し、ゲル上でタンパク質を分離して基本的に個人のバンドを得、任意でバンドをウエスタン・ブロットに転移し、得たバンドを、ＭＡＧ遺伝子の残りの部分によりコードされるタンパク質の部分に対する、およびＭＡＧ遺伝子の置換部分によりコードされるタンパク質の部分に対する抗体と共にハイブリダイズし；抗原−抗体反応を可視化し、そして異常バンドの存在を、野生型タンパク質からのバンド、望ましくは同じ個体から得たバンドと比較して確認する段階を含む。
【００２９】
更なる実施態様において、該方法は、診断すべき細胞の生検を採取し、その全ＤＮＡを単離し、１以上のいわゆる"希切断"制限酵素（典型的には"６−または以上の切断"）でもってＤＮＡを消化し、ゲル上に調製された消化物を分離して、分離パターンを得、任意で分離パターンをサーザン・ブロットに転移し；ゲル中またはブロット上の分離パターンを一組のプローブとハイブリダイズ条件でハイブリダイズし；ハイブリダイゼイションを可視化し、そして異常バンドの存在を野生型バンド、望ましくは同一個体から得たバンドとの比較により確認する段階を含む。
【００３０】
遺伝子の発現レベルにおける変化は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを適当なプローブの手段で測定することにより検定できる。
【００３１】
遺伝子の異常発現レベルに基づく診断方法は、診断すべき細胞のサンプルを採取し、それからｍＲＮＡを単離し、望むＭＡＧ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在および／または（比較の）量を対照と比較して確認する段階を含む。ｍＲＮＡの存在および／または（比較の）量の確認は、ＭＡＧのｍＲＮＡの少なくとも部分をＲＴ−ＰＣＲまたは類似の増幅技術により増幅して達成される。別の実施態様において、発現レベルは、例えばモノクローナル抗体の手段で遺伝子産物（例えばタンパク質）の存在および量を測定することにより確認される。
【００３２】
本発明の診断方法は、非生理的増殖能を有する細胞が間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪性組織腫瘍（例えば脂肪腫）、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍からなるグループから選択される疾患に用いられる。本発明は、いわゆる良性または悪性固形腫瘍の診断および治療に限定されず、その原理は、白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性腫瘍にも適用できることが分かった。
【００３３】
最近の報告によると、動脈硬化性プラークが主に平滑筋細胞の異常な増殖［２６］も含み、動脈硬化性プラークが良性腫瘍を形成すると推測された［２７］。従って、この型の障害も、ＭＡＧ遺伝子ファミリーの使用、特に診断的および治療的利用できるであろう適応症であることが分かる。
【００３４】
上述したように、ある種の悪性腫瘍においてＨＭＧの発現レベルが増大することは知られている［２８］。現在まで、この観察の関連性は理解されなかった。従って、本発明の別の側面は、治療におけるＭＡＧ遺伝子の同定を行うことに関する。例えば本発明は、遺伝子の発現を調節して、非生理的増殖能を有する細胞の疾患を処置するのに用いられるＭＡＧ遺伝子のアンチセンス分子または発現阻止剤を提供する。非生理的高発現は、細胞に投与されるかまたは発現され、そしてｍＲＮＡを結合するアンチセンスＲＮＡによる手段、または遺伝子産物に対する抗体による手段で正常化され得るであろう。これらの手段は順に細胞生長の正常化をもたらすであろう。実施例は、白血症細胞中のアンチセンスＲＮＡの発現が正常に反する細胞の再−区別を結果として生じること、を表すであろう。
【００３５】
本発明は、ＭＡＧ遺伝子の誘導体および／または診断に使用するその直接の環境および治療的組成物の調製を提供する。該誘導体は、センスおよびアンチ−センスｃＤＮＡまたはそのフラグメント、該遺伝子の転写物またはそのフラグメント、アンチセンスＲＮＡ、分子または他の型の"転写締め具"を誘発する三重ラセン、該遺伝子のフラグメントまたはその相補的鎖、該遺伝子またはそのフラグメントによりコードされたタンパク質、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、該遺伝子、該ｃＤＮＡ、該転写物、該タンパク質または該フラグメントに対する抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される。診断および治療における遺伝子およびその周辺（はさむ配列）の直接的利用以外に、発現阻害剤または発現促進剤のような他の分子が本発明による治療的処置に用いられる。この型の分子の例は、ＲＮＡ分子を破壊するリゾチームである。
【００３６】
上記した治療的および予防的方法以外に、本発明の原理は、ＭＡＧ遺伝子関連の悪性または良性腫瘍および動脈硬化性プラーグの処置のための医薬品を試験するのに役立つ形質転換動物モデルをつくるのに用いられる。実施例の１つはかかる動物モデルの産生を記述する。
【００３７】
本発明の原理は、説明の目的のために、１２番染色体におけるＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子マッピングおよび６番染色体におけるＨＭＧＩ（Ｙ）遺伝子マッピングおよび３番染色体上のＬＰＰ遺伝子についてのみ記載されたことが理解されるべきである。本発明により提供された情報に基づき、本発明の一般的概念の範囲を出ないで、当業者は、該遺伝子の対応遺伝子を単離し、配列し、そして本発明の原則を、遺伝子およびその配列を用いて利用し得るであろう。
【００３８】
本発明は下記の実施例によりさらに明らかになるであろう。これらは発明の範囲の制限を意図するものでない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】７５個の重複ＣＥＰＨ ＹＡＣクローンから構成され、様々な良性充実性腫瘍に存在する１２番染色体ｑ切断点に及ぶＹＡＣコンティグ由来の、ヒト１２番染色体長腕上にある６Ｍｂ領域の長距離物理的地図。ＹＡＣ挿入物によりカバーされる複合ゲノムＤＮＡの長距離物理的地図は、示した微量切断酵素の様々な制限部位の相対位置と共に黒線で示す。特定の制限酵素の付加的切断部位がみられるＤＮＡ領域は矢印で示す。多様な種類の制限エンドヌクレアーゼ部位はアステリスクで示す。他の研究者により単離され定義されたＤＮＡマーカーは緑で示す。我々が得たＤＮＡマーカーはボックスで示し、頭字語で標識する（図ＩおよびＩＩ参照）。これらのＤＮＡマーカーの長距離物理的地図における相対位置を示し、特定のＹＡＣ末端に対応する位置を点線でこれらと結ぶ。ＤＮＡマーカーのいくつかはＤＮＡ区間にあたり、これは矢印で示す。白いボックス中のＤＮＡマーカーとして、ＳＴＳが成長され、プライマーセットを表IIに示す。黄色のボックス中のものについては、何のプライマーセットも成長されていない。ＲＡＰ１Ｂ、ＥＳＴ０１０９６、またはＩＦＮＧ含有のＤＮＡ区間を表示する。適用可能な場合においては、Ｄ番号割り当てを示す。長距離物理的地図の下流には、共通した長距離の制限地図に一致する重複ＹＡＣクローンのサイズおよび相対位置を青の線で示す。共通の長距離の制限地図中内に適合しないＹＡＣ挿入物のＤＮＡ領域は点線の青い線で示す。ＹＡＣクローンのＣＥＰＨマイクロタイターアドレスを載せる。１２番染色体上にあるＹＡＣコンティグの方位が与えられる。ＵＬＣＲ１２およびＭＡＲの相対位置が対応する頭文字により表示された赤い線により示す。ＳＴＳのアクセス番号は表Ｉには載せていない：ＣＨ９（＃Ｕ２７１４２）；ＲＭ１（＃Ｕ２９０４９）；ＲＭ１１０（＃Ｕ２９０２２）；ＲＭ１１１（＃Ｕ２９０２３）；ＲＭ１３０（＃Ｕ２７１３９）；ＲＭ１３１（＃Ｕ２９００１）；ＲＭ１３２（＃Ｕ２７１３８）；ＲＭ１３３（＃Ｕ２７１３７）。制限部位：Ｂ：ＢｓｓＨＩＩ；Ｋ：ＫｓｐＩ（＝ＳａｃＩＩ）；Ｍ：ＭｌｕＩ；Ｎ：ＮｏｔＩ；Ｐ：ＰｖｕＩ；Ｓｆ：ＳｆｉＩ。
【図１−２】図１−１の続きを示す図である。
【図１−３】図１−２の続きを示す図である。
【図１−４】図１−３の続きを示す図である。
【図２】約４４５ｋｂのＭＡＲ断片に及ぶ、重複コスミドのコンティグ、長い範囲の制限およびＳＴＳ地図。コンティグ成分を数え、下記のリストで定義する。ＬＬ１２ＮＣ０１−由来のコスミドクローンはそのマイクロタイタープレートアドレスにちなんで名前がついている。様々なＳＴＳの遺伝子バンク・アクセス番号（＃）が下記に記載されている。ＳＴＳは略語で記載し、例えばＳＴＳ１２−ＲＭ３３ではなくＲＭ３３と記載する。コスミドコンティグ中のＳＴＳ"Ｋ"および"Ｏ"の間の４０ｋｂの差はλクローン（クローン３８および４０）およびＰＣＲ産物（クローン３７および３９）によりカバーされている。１２番染色体上の長腕上のコンティグの方位、ならびに３７個のＳＴＳの順序も与えられる（ボックス内に示すか、または丸で囲んだ大文字で表記）。図の上端にあるいくつかのＳＴＳ記号のまわりの斜めの線および矢印は、特定のＳＴＳが割り当てられている領域を示す。コスミドコンティグは大量でないことを認識すべきであり；黒い四角はコスミド末端のＳＴＳを示しており、ここで内部コスミド配列に対応するＳＴＳの存在は点で表現されている。長い範囲の制限地図：Ｂｓ：ＢｓｓＨＩＩ；Ｋ：ＫｓｐＩ（＝ＳａｃＩＩ）；Ｍ：ＭｌｕＩ；Ｎ：ＮｏｔＩ；Ｐ：ＰｖｕＩ；Ｓｆ：ＳｆｉＩ。図の末端に、詳細な制限地図においてＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子のエキソン（下記のボックス）を含んでいる領域が示されている。非コード領域が白抜きのボックスで、コード領域が黒のボックスで示す。イントロンの推定サイズ（ｋｂ）を表示する。ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子中の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）の相対位置ならびに可能性あるポリ−アデニル化信号を矢印で示す。詳細な制限地図：Ｂ：ＢａｍＨＩ；Ｅ：ＥｃｏＲＩ；Ｈ：ＨｉｎｄIII。ＭＡＲ：複合異常領域;ＤＢＤ：ＤＮＡ結合ドメイン。 1=140A3, 2=202A1, 3=78F11, 4=80C9, 5=109B12, 6=148C12, 7=14H6, 8=51F8, 9=57C3, 10=86A10, 11=142G8, 12=154A10, 13=163D1, 14=42H7, 15=113A5, 16=191H5, 17=248E4, 18=33H7, 19=50D7, 20=68B12, 21=124D8, 22=128A7, 23=129F9, 24=181C1, 25=238E1, 26=69B1, 27=260C7, 28=156A4, 29=27E12, 30=46G3, 31=59A1, 32=101D8, 33=175C7, 34=185H2, 35=189C2, 36=154B12, 37=pRM150, 38=pRM144, 39=PKXL, 40=pRM147, 41=128A2, 42=142H1, 43=204A10, 44=145E1, 45=245E8, 46=154F9, 47=62D8, 48=104A4, 49=184A9, 50=56C2, 51=65E6, 52=196E1, 53=215A8, 54=147G8, 55=211A9, 56=22D8, 57=116B7, 58=144D12, A = STS 12-EM12(#U27145), I = STS 12-CH12(#U27153), Q = STS 12-RM120(#U27161), B = STS 12-EM30(#U27146), J = STS 12-EM10(#U27154), R = STS 12-RM118(#U27162), C = STS 12-EM14(#U27147), K = STS 12-EM37(#U27155), S = STS 12-RM119(#U27163), D = STS 12-EM31(#U27148), L = STS 12-RM146(#U27156), T = STS 12-EM2(#U27164), E = STS 12-CH11(#U27149), M = STS 12-RM145(#U27157), U = STS 12-EM4(#U27165), F = STS 12-EM18(#U27150), N = STS 12-RM151(#U27158), V = STS 12-EM3(#U27166), G = STS 12-EM11(#U27151), O = STS 12-EM16(#U27159), W = STS 12-EM15(#U27167), H = STS 12-CH10(#U27152), P = STS 12-EM1(#U27160), X = STS 12-EM17(#U27168), STS 12-CH5(#U27136), STS 12-CH9(#U27142), STS 12-RM33(#U27131), STS 12-RM53(#U27134), STS 12-RM76(#U27132), STS 12-RM86(#U27133), STS 12-RM98(#U26647), STS 12-RM99(#U27130), STS 12-RM103(#U26689), STS 12-RM130(#U27139), STS 12-RM132(#U27138), STS 12-RM133(#U27137), STS 12-RM151(#U27158)
【図３】我々の以前のＦＩＳＨ研究に続く連続した実験において、８個の脂肪腫、１０個の子宮平滑筋腫、および８個の多形態性唾液腺腫細胞系を含めた１２番染色体ｑ１３−ｑ１５異常を有する腫瘍細胞系で得られたＦＩＳＨ地図の図示。使用したプローブはファージクローンｐＲＭ１４４（対応するＳＴＳ：ＲＭ８６およびＲＭ１３０）およびｐＲＭ１４７（ＲＭ１５１）、およびコスミドクローン７Ｄ３または１５２Ｆ２（ＲＭ１０３）、１５４Ｆ９（ＣＨ９）、２７Ｅ１２（ＥＭ１１）、２１１Ａ９（ＲＭ３３）、２４５Ｅ８（ＲＭ５３）、１８５Ｈ２（ＲＭ７６）、２０２Ａ１（ＲＭ９８）、１４２Ｈ１（ＲＭ９９）、１５４Ｂ１２（ＲＭ１３２）、および１２４Ｄ８（ＲＭ１３３）。ＲＭ３３およびＲＭ９８の間のＤＮＡ区間は約４４５ｋｂであると推定されている。点は、分子プローブとして上記のボックスで与えられたＳＴＳを含むクローンを使用して、特定の細胞系の中期染色体上で行われたＦＩＳＨ実験を示す。線は、ＤＮＡ区間を示し、特定の細胞系の切断点が位置づけられている。白抜きの三角形はＦＩＳＨ解析中に観察された欠失を示す。白抜きの丸は、細胞遺伝学的に正常な３番染色体上のハイブリダイゼーション信号と共にＬｉ−５０１／ＳＶ４０細胞の中期染色体上のＦＩＳＨ実験の結果を示す。ＭＡＲの外に位置する腫瘍細胞系の１２番染色体の切断点の位置は矢印で示す。ＬＭ−３０．１／ＳＶ４０およびＬＭ−６０８／ＳＶ４０の分子的にクローン化した切断点はアステリスクで示す。コスミド２７Ｅ１２（ＥＭ１１）を分断している様々な子宮平滑筋細胞系中の切断点は『二重斜線』で示す。
【図４】ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の一部およびＬＰＰ遺伝子の一部間の接合部位を含む３'−ＲＡＣＥ産物。使用したプライマーおよび接合部位を示している。ｃＤＮＡ合成は内部的にプライムし、真のポリ（Ａ）テイル上ではない。
【図５−１】ＬＰＰ遺伝子の部分的ｃＤＮＡ配列
【図５−２】図５−１の続きを示す図である。
【図５−３】図５−２の続きを示す図である。
【図６】ＬＰＰ遺伝子のアミノ酸配列。ＬＩＭドメインを四角で囲む。切断点を矢印で示す。
【図７−１】ＨＭＧＩ−Ｃ（Ｕ２８７４９）であればヌクレオチド配列。Manfioletti et al. が提案した翻訳開始部位を図示。（６７）を開始部位として任意に選択した。配列は完全なコード配列を含む。
【図７−２】図７−１の続きを示す図である。
【図８】実施例５に記載のようにして得たＰＣＲ産物のゲル。
【実施例】
【００４０】
実施例１
１.序
この実施例は、７５の一部重複するＹＡＣクローンの分離および分析、ならびに、遺伝子座Ｄ１２Ｓ８の周囲の約６ＭｂのゲノムＤＮＡにわたっており且つＭＡＲを含んでいるＹＡＣコンティグ(一部重複するクローンの集合体)の確立を記載するものである。１２番染色体の長腕上のＹＡＣコンティグの向きは、二色ＦＩＳＨ分析により決定された。ＳＴＳ含量マッピングおよび制限酵素分析に基づき、この６Ｍb ＤＮＡ領域の広範囲物理的地図が確立された。このコンティグは、様々な１２番染色体異常により直接影響を受ける遺伝子を包含する、１２ｑ１５に位置する遺伝子の同定を目的とする、ｃＤＮＡ捕捉の有用な供給源を表す。
【００４１】
２.材料および方法
２.１.細胞系
体細胞ハイブリッドを用いる染色体割り当て(ＣＡＳＨ)実験には、細胞系ＰＫ８９−１２およびＬＩＳ−３／ＳＶ４０／Ａ９−Ｂ４を使用した。ハムスターの遺伝的背景中に唯一のヒト染色体として１２番染色体を含むＰＫ８９−１２は、前に記載した[２９]。ＰＫ８９−１２細胞は、１０％ウシ胎児血清、２００ＩＵ／mlペニシリン、および２００μg／mlストレプトマイシンを添加したＤＭＥ−Ｆ１２培地中で生育させた。体細胞ハイブリッドＬＩＳ−３／ＳＶ４０／Ａ９−Ｂ４は、ｔ(１２；１６)(ｑ１３；ｐ１１.２)を有する粘液様脂肪肉腫細胞系ＬＩＳ−３／ＳＶ４０、およびマウスＡ９細胞の融合時に得られた。これは、der(１６)を含むが、der(１２)および正常な１２番染色体のいずれをも含まないことが以前に示されていたものである[３０]。ＬＩＳ−３／ＳＶ４０／Ａ９−Ｂ４細胞は、選択的ＡＯＡ培地(１０％ウシ胎児血清、０.０５ｍＭアデニン、０.０５ｍＭウワバイン、および０.０１ｍＭアザセリンを添加したＤＭＥ−Ｆ１２培地で構成されるＡＯＡ培地)中で生育させた。両細胞系は標準的細胞遺伝学技術により頻繁に検定した。
【００４２】
２.２.ヌクレオチド配列分析およびオリコヌクレオチド
Ｔ７ポリメラーゼ配列決定キット(ファルマシア／ＬＫＢ)またはｄｓＤＮＡサイクル配列決定システム(ギブコ／ＢＲＬ)を用いるジデオキシチェーンターミネーション法に従い、ヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ−３Ｚｆ(＋)中でサブクローニングし、ＦＩＴＣ標識した標準ＳＰ６もしくはＴ７プライマー、または新たに得られた配列に基づき合成された特異的プライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、自動レーザー蛍光(Ａ.Ｌ.Ｆ.)ＤＮＡシークエンサー(ファルマシア・バイオテク)および標準的な３０cm、６％ハイドロリンク(商標)、ロング・レインジ(商標)ゲル(ＡＴバイオケム)を使用して得た。ヌクレオチド配列は、配列分析ソフトウェアジーンプロ(リヴァーサイド・サィエンティフィック)、ＰＣ／ジーン(インテリジェネティクス)、インテリジェネティクス・スイート・ソフトウェア・パッケージ(インテリジェネティクス、Ｉｎｃ.)、およびオリゴを使用して分析した[３１]。オリゴヌクレオチドは全てファルマシア・バイオテクから購入した。
【００４３】
２.３.染色体の調製および蛍光インサイトゥハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)
ＹＡＣクローンのＦＩＳＨ分析を実施してそれらの染色体上位置を確認し、そしてキメラクローンを同定した。ＹＡＣ挿入物末端のＳＴＳに相当するコスミドクローンのＦＩＳＨ分析を実施して、それらの染色体上位置を確認した。コスミドは、ヒトゲノムライブラリーＣＭＬＷ−２５３８３から分離する[３２]か、または、ローレンス・リヴァーモア・ナショナル・ラボラトリーにおいて標準法に従って組み立てられた、整列させた１２番染色体特異的ライブラリー(ＬＬ１２ＮＣ０１、参考文献３３)から分離された[３４]。本質的には前記と同様にして常套的ＦＩＳＨ分析を実施した[３０、３５]。ＤＮＡは、キーヴィッツ等のプロトコルを用いてビオチン−１１−ｄＵＴＰ(ベーリンガー)で標識した[３６]。ＤＡＢＣＯ(２ｇ／１００ml、シグマ)、０.１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ８、０.０２％チメロサール、およびグリセロール(９０％)より成りヨウ化プロピジウム(０.５μg／ml、シグマ)を対比染色として含有する抗退色媒質を加え、１５分後に、ＦＩＴＣ／テキサスレッドに対するダブルバンド通過フィルター(オメガ・オプティカル、Ｉｎｃ.)を用いるザイス・アキシオフォト蛍光顕微鏡上で標本を分析した。結果はスコッチ(３Ｍ)６４０ＡＳＡフィルム上に記録した。
二色ＦＩＳＨ実験のために、ＬＬＮＬ１２ＮＣＯ１−９６Ｃ１１をジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ(ベーリンガー)で、そしてコスミドＬＬＮＬ１２ＮＣＯ１−１Ｆ６および−１９３Ｆ１０をビオチン−１１−ｄＵＴＰで標識した。各プローブの等量を合し、この混合物をハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーションの後、スライドをアビジン−ＦＩＴＣと共に２０分間インキュベートし、次いでキーヴィッツ等により記載されるように洗浄した[３６]。その後の一連の、ＴＮＢ緩衝液(０.１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ７.５、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.５％ベーリンガー遮断剤(ベーリンガー))中でのインキュベーション、および洗浄工程は、ＴＮＴ緩衝液(０.１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ７.５、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％トゥイーン２０)中で実施し、全てのインキュベーションは３７℃で３０分間行った。第二のインキュベーションの間にヤギ−α−アビジン−ビオチン(ベクター)およびマウス−α−ジゴキシゲニン(シグマ)を同時に適用した。第三のインキュベーションの間にアビジン−ＦＩＴＣおよびウサギ−α−マウス−ＴＲＩＴＣ(シグマ)を適用した。最後のインキュベーションの間にヤギ−α−ウサギ−ＴＲＩＴＣ(シグマ)を適用した。ＴＮＴ緩衝液中での最後の洗浄の後、試料を１ｘＰＢＳで二回洗浄し、次いでエタノール系列(７０％、９０％、１００％)により脱水した。対比染色として７５ng／μｌＤＡＰＩ(セルヴァ)を含有する抗退色媒質を使用した。標本を上記のようにザイス・アキシオフォト蛍光顕微鏡で分析した。
【００４４】
２.４.ＹＡＣライブラリーのスクリーニング
サートル・デテュドゥ・デュ・ポリフォルミズム・ヒュメ(ＣＥＰＨ)より取得可能となったＣＥＰＨヒトゲノムＹＡＣライブラリーマーク１および３からＹＡＣクローンを分離した[３７、３８]。前記のようにスクリーニングを実施した[３９]。時に遭遇するカンジダ・パラサイロシスの混入を、成長培地にテルビナフィン(ディーター・レーマー博士、サンド・ファルマ・ＬＴＤ、バースル、スイス、の好意により提供された)を添加(最終濃度：２５μｇ／ml)することにより根絶した。分離されたＹＡＣクローンを、ＳＴＳ含有量マッピング、カントゥア・クランプト均質電場(ＣＨＥＦ)ゲル電気泳動[４０]、制限マッピング、ならびにハイブリダイゼーション−およびＦＩＳＨ分析により特性決定した。
【００４５】
２.５.ＰＣＲ反応
ＰＣＲ増幅は、１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８.３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０１％ゼラチン、２ｍＭ ｄＮＴＰ、各アンプリマー２０pmole、アンプリタク２.５単位(パーキン−エルマー・シータス)、およびＤＮＡ１００ng(スーパープール用)または２０ng(プール用)を含有する最終容量１００μl中で、ファルマシア／ＬＫＢ・ジーン・ＡＴＡＱ・コントローラー(ファルマシア／ＬＫＢ)を使用して実施した。９４℃５分間の最初の変性の後、各々９４℃１分間の変性、適当な温度で１分間のアニーリング(表Ｉを参照されたい)および７２℃１分間の伸長で構成される３５サイクルの増幅を実施した。ＰＣＲ反応は７２℃５分間の最後の伸長により完結した。結果を、ポリアクリルアミドミニゲル上で反応生成物１０μlを分析することにより評価した。
【００４６】
２.６.パルスフィールドゲル電気泳動およびサザンブロット分析
パルスフィールドゲル電気泳動およびサザンブロット分析は、ショーンメイカーズ等による記載に厳密に従って実施した[３９]。高分子量ＹＡＣ ＤＮＡを含むアガロース充填剤(約１ｘ１０8酵母細胞に相当)をＴＥ緩衝液(ｐＨ８.０)およそ２５ml中、５０℃で３０分間２回平衡化し、引き続き室温で同様の平衡化を２回行った。その後充填剤を丸底２mlエッペンドルフ管に移し、適当な制限温度で適当な１ｘ制限緩衝液５００μl中、３０分間２回平衡化した。その後、消化反応当たり３０単位の制限エンドヌクレアーゼを使用し供給者(ベーリンガー)の指示に従って、ＤＮＡを充填剤中で４時間消化した。消化後、適当な分子量マーカーと共に充填剤を１％アガロース／０.２５ｘＴＢＥゲル上にロードし、ＬＭＰアガロースで密封し、そして１２０度のパルス角および１０秒間(３００kbpまでの分離)から２０秒間(５００kbpまでの分離)まで変化する定パルス時間を用いて、ＣＨＥＦ装置(バイオラド)上で１８時間６.０Ｖ／cmでサイズ分画した。大きな制限フラグメントの場合、５００kbpより大きなサイズのフラグメントの分離を目指して、さらなる泳動を行った。電気泳動は０.２５ｘＴＢＥ中１４℃で実施した。分子量マーカーとしては、λラダー(プロメガ)および制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで切断したλＤＮＡを含有する自家製充填剤を使用した。電気泳動の後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、撮影し、そして１２０ｍＪの設定でストラタリンカー(ストラタジーン)を用いてＵＶ照射した。続いて０.４Ｎ ＮａＯＨを転移緩衝液として使用し、ＤＮＡをハイボンドＮ+膜(アマーシャム)上に４−１６時間ブロッティングした。ブロッティング後、この膜を８０℃で１５分間乾燥し、２ｘＳＳＰＥ中で短時間中和し、そして５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート、０.１％ＳＤＳおよび２００μg／mlヘパリンで構成される溶液５０ml中、４２℃で少なくとも３時間プレハイブリダイズした。続いて、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、１ｘデンハート、０.１％ＳＤＳ、１００μg／mlヘバリン、０.５％硫酸デキストランおよび標識化したプローブ２−３ｘ１０6cpm／mlで構成される溶液１０ml中、フィルターを４２℃で１６時間ハイブリダイズした。その後、膜を、まず２ｘＳＳＰＥ／０.１％ＳＤＳ中室温で５分間２回、次いで２ｘＳＳＰＥ／０.１％ＳＤＳ中４２℃で３０分間、そして最後に０.１ｘＳＳＰＥ／０.１％ＳＤＳ中６５℃で２０分間洗浄した。プローブの挙動に応じてコダックＸＡＲ−５フィルムを−８０℃で３−１６時間露光した。補力スクリーン(キョッコー・スペシャル５００)を使用した。
【００４７】
２.７.ＹＡＣ挿入物末端からのＳＴＳの作成
ＹＡＣ挿入物末端由来のＳＴＳは、本質的にはギャーツ等の記載に従って、直接的ＤＮＡ配列決定分析と組み合わせたベクトレットＰＣＲ法を用いて取得した[４１]。基本的には上記の方法に従い、プライマーの組を創出し、ヒトゲノムＤＮＡ上で試験した。本明細書全体を通じ、ＳＴＳは簡便のためその略称で呼称する(例えば、ＳＴＳ１２−ＲＭ１の代わりにＲＭ１)。
【００４８】
３.結果
３.１.遺伝子座Ｄ１２Ｓ８の周囲のＹＡＣコンティグの組み立て
先の研究において[３９]、Ｄ１２Ｓ８の周囲の８００ｋｂ ＹＡＣコンティグが記載された。このコンティグは、部分的に重複した以下の３個の非キメラＣＥＰＨＹＡＣクローンで構成されていた：２５８Ｆ１１、３２０Ｆ６、および２３４Ｇ１１。このコンティグを染色体歩行プロジェクトのための出発点として使用して、様々な良性の充実性腫瘍の切断点を包含する、１２番染色体の長腕上のＤＮＡ領域を明確にするが、これらは全てＤ１２Ｓ８の近位およびＣＨＯＰの遠位に位置している。最初に、染色体歩行を、コンティグの大きさがその向きの信憑性ある決定を可能にするまで、二方向的に実施した。この二方向性およびその後の一方向性染色体歩行工程においては、以下の一般法を使用した。まず、ＹＡＣクローンの末端の救出および配列決定は、これらの左および右側に特性を与えるＤＮＡマーカーを産んだ(表Ｉ)。４０のＹＡＣ挿入物の末端の配列データに基づき、ＤＮＡの特異的増幅のためのプライマーの組を創出し、ＳＴＳを確立した(表II)。１２ｑ１３−ｑｔｅｒへのそれらの局在が、ＣＡＳＨによって、そして対応するコスミドクローンを分離した後、ＦＩＳＨによって決定された。さらに、分離されたＹＡＣクローンはしばしばＦＩＳＨ分析によって評価され、したがってそれら挿入物の染色体起源が明らかにされるのみならず、幾つかの場合については、それらのキメラ的性格が確立され規定されたことに留意すべきである。さらに、一部重複するＹＡＣクローンの制限エンドヌクレアーゼ分析により得られるデータは、ＹＡＣクローンの評価およびその後の並列の際に考慮されたことを強調すべきである。連続的に選択され評価されたプライマーの組により、ＹＡＣおよびコスミドライブラリーのスクリーニングが実施され、コンティグ組み立てのための構築ブロックが分離された。故に、ＦＩＳＨ−およびＳＴＳ−含有量マッピングならびに制限エンドヌクレアーゼ分析から誘導されるデータを使用して、コンティグ組み立てを実施した。このアプローチを使用して本発明者等は、およそ６ＭｂのＤＮＡをカバーする７５の部分重複するＹＡＣクローンから成るＹＡＣコンティグを確立した(図１)。このコンティグは、研究された全ての腫瘍由来細胞系の１２番染色体切断点を包含しているように見受けられた。このコンティグの構築に使用されたＹＡＣの特性を表Ｉに示す。
【００４９】
３.２.ＹＡＣコンティグの染色体方向の確立
１２番染色体の動原体に向かう一方向性染色体歩行を可能にするため、ＳＴＳＲＭ１４およびＲＭ２６に隣接するＤＮＡ領域(およその大きさ：１４５０kb)の向きを、二色間期ＦＩＳＨ分析によって決定した。これらのＳＴＳに対応するコスミドクローン(即ちＬＬ１２ＮＣ０１−１Ｆ６(ＲＭ１４)およびＬＬ１２ＮＣ０１−９６Ｃ１１(ＲＭ２６))を別個に標識すると、それぞれ緑色または赤色のシグナルを示した。対照遺伝子座としてコスミドＬＬ１２ＮＣ０１−１９３Ｆ１０を標識したところ、検出時に緑色シグナルを示した。ＬＬ１２ＮＣ０１−１９３Ｆ１０はかつて、脂肪腫細胞系Ｌｉ−１４／ＳＶ４０および子宮平滑筋腫細胞系ＬＭ−３０.１／ＳＶ４０において、ＬＩＳ−３／ＳＶ４０(即ちＣＨＯＰ)の切断点の遠位および染色体１２ｑ切断点の近位にマッピングされた。ＬＬ１２ＮＣ０１−１Ｆ６およびＬＬ１２ＮＣ０１−９６Ｃ１１は、脂肪腫細胞系Ｌｉ−１４／ＳＶ４０および子宮平滑筋腫細胞系ＬＭ−３０.１／ＳＶ４０において、１２ｑ切断点の遠位にマッピングされることが判明した。故に、ＬＬ１２ＮＣ０１−１９３Ｆ１０は、ＲＭ１４およびＲＭ２６の両方に対して近位にマッピングされると結論付けられた(未発表の結果)。１５０の採点された有用な間期のうち、１８％は赤−緑−緑のシグナル順序を示し、一方７２％が緑−赤−緑のシグナル順序を示した。これらの観察に基づき、本発明者等は、ＲＭ２６がＲＭ１４に対し近位にマッピングされると結論付け、よって本発明者等は、ＹＡＣコンティグを、本発明者等のコンティグのＲＭ２６(即ち近位)側からのみ伸長させ続けた。ＲＭ１４およびＲＭ２６を含むコスミドのみが二色間期マッピングによって順序付けられ、他の全ての順序はＹＡＣコンティグのデータから推理された。最後に、二色間期ＦＩＳＨ研究の結果に基づいて提起されたコンティグの染色体方向が、ＹＡＣコンティグを、種々の腫瘍細胞系中に存在する１２番染色体切断点を超えて伸長させた後に、個別に確認されたことに留意すべきである。この確認情報は膨大なＦＩＳＨ研究で得られ、そこでは、ＹＡＣおよびコスミドクローンの位置が、一次脂肪腫、子宮平滑筋腫、多形態性唾液腺腫、および肺軟骨様過誤腫または誘導細胞系の染色体１２ｑ１３−ｑ１５切断点に対して相対的に決定された[２４、４２、２５、４３]。
【００５０】
３.３.Ｄ１２Ｓ８周囲の６Ｍｂ ＹＡＣコンティグからの稀切断物理的地図の組み立て
稀切断酵素(材料および方法を参照されたい)で完全に消化しＣＨＥＦゲル上で分離した、ＹＡＣ ＤＮＡを加えた総酵母のサザンブロットを、ｉ)問題のＹＡＣの最初のスクリーニングのために使用されたＳＴＳ、ii)ｐＹＡＣ４右腕配列、iii)ｐＹＡＣ４左腕配列、およびiv)ヒトＡＬＵ−反復プローブ(ＢＬＵＲ−８)を用いて連続的にハイブリダイズした。このようにして得られた広範囲の制限地図を、ＰＣＲ分離されたＳＴＳ／ＹＡＣ末端プローブでプロービングすることにより完成した。時に二重消化を行った。個々のＹＡＣクローンの制限地図を並置し、共通制限地図を確立した。ここで、共通稀切断地図全体は、完全な内部一致を示す少なくとも２個の独立したクローンによって支持されることに留意することが重要である。
【００５１】
３.４.ＣＡ反復および単形態性ＳＴＳ／ＥＳＴの物理的地図作成
ヒト１２番染色体に関する第二回国際ワークショプで明らかとなった統合されたマッピングデータに基づき[４４]、幾つかの公表されているマーカーが、本明細書に提示されるＹＡＣコンティグ内にマッピングされることが期待された。本発明者等のマッピングデータを他者により得られたデータと完全に統合させるため、幾つかのマーカーを本発明者等のコンティグ上にＳＴＳ含量マッピングし、そして陽性であると判明したものをその後ＹＡＣサザンブロット上の(プライマー)ハイブリダイゼーションによってさらに位置決定した。本明細書中に提示されるコンティグ内に存在することが判明したマーカーのうちには、ＣＡ反復Ｄ１２Ｓ３１３(ＡＦＭ２０７ｘｆ２)およびＤ１２Ｓ３３５(ＡＦＭ２７３ｖｇ９)[４５]、Ｄ１２Ｓ３７５(ＣＨＬＣ ＧＡＴＡ３Ｆ０２)、およびＤ１２Ｓ５６があった[４６]。さらに、一般に入手し得る配列データに基づき本発明者等が開発したプライマーの組を使用して、インターフェロンγ遺伝子(ＩＦＮＧ)[４７]、ラス関連蛋白遺伝子Ｒａｐ１Ｂ[４８]、および発現された配列タグＥＳＴ０１０９６[４９]がマッピングされた(表IIを参照されたい)。試験され陰性であるとわかったマーカーは、Ｄ１２Ｓ８０(ＡＦＭ１０２ｘｄ６)、Ｄ１２Ｓ９２(ＡＦＭ２０３ｖａ７)、Ｄ１２Ｓ３２９(ＡＦＭ２４９ｘｈ９)およびＤ１２Ｓ３４４(ＡＦＭ２９６ｘｄ９)を包含した。
【００５２】
４.考察
本実施例においては、ＹＡＣコンティグ、および、幾つかの頻発する良性充実性腫瘍の染色体異常をマッピングすることが知られているＭＡＲを含むヒト１２番染色体の長腕上の領域である、１２ｑ１５上のおよそ６Ｍｂをカバーする稀切断物理的地図の確立が例示された。
コンティグの全長をおよそ６Ｍｂにおいて、個々のＹＡＣ間の重複の程度を注意深く測定した(図１)。ＹＡＣクローンの幾つかについての本発明者等の寸法別分類データは、ＣＥＰＨにより決定された大きさと僅かに相違することに留意すべきである[５０]。これは恐らく異なる研究所におけるパルスフィールドゲルの稼働のためのパラメータの相違に起因するというのが本発明者等の見解である。
【００５３】
制限マッピングおよびＳＴＳ含有量分析を使用して、共通する広範囲の物理的地図(図１)を組み立てた。全体の複合地図は少なくとも２倍のカバレッジにより支持される。合計で３０Ｍｂ以上のＹＡＣ ＤＮＡが制限およびＳＴＳ含有量分析により特性決定され、これは約５倍の平均コンティグカバレッジに相当する。このパルスフィールド電気泳動の技術に伴う「生来の」限定された分析では、非常に正確なサイズの判断はできないものの、本明細書に提示されるＹＡＣコンティグ内に含まれる５００kbコスミドコンティグから得られる制限マッピングデータとの比較は、極めて良好な相関を示した。コスミドデータからの外挿で、本発明者等は、本明細書に提示された稀切断物理的地図の精度を約１０kbと評価する。
【００５４】
本発明者等の物理的マッピング研究の結果は、３個の遺伝子特異的および他者により分離された名称の無い５個のマーカーの統合を可能にした(図１の矢印の間に示される)。この名称の無いマーカーは、１個の単形態性および４個の多形性マーカーを含む。かつて公刊された５個のＹＡＣ末端由来の単コピーＳＴＳ(ＲＭ１、ＲＭ４、ＲＭ５、ＲＭ７、およびＲＭ２１)ならびに４個の公刊されているＣＡ反復(Ｄ１２Ｓ５６、Ｄ１２Ｓ３１３、Ｄ１２Ｓ３３５、およびＤ１２Ｓ３７５)および３個の公刊されている遺伝子付随ＳＴＳ／ＥＳＴ(ＲＡＰ１Ｂ、ＥＳＴ０１０９６、およびＩＦＮＧ)が同じ物理的地図上に置かれたが、これは、その領域中にマッピングされる幾つかの特性／疾病遺伝子の(連鎖)マッピングおよび同定を容易にするであろう。さらに本発明者等は、同じ物理地図上に、染色体歩行の工程中に開発した、７２のＹＡＣ末端由来(表Ｉ)および８個のコスミド末端−またはインターＡＬＵ−由来のＤＮＡマーカー(ＣＨ９、ＲＭ１、ＲＭ１１０、ＲＭ１１１、ＲＭ１３０、ＲＭ１３１、ＲＭ１３２、およびＲＭ１３３)を置くことができた。ＰＹＴＨＩＡ＠ａｎｌ．ｇｏｖのＰＹＴＨＩＡ自動通信サーバーを使用して、これらＤＮＡマーカーの誘導された配列を反復の存在についてスクリーニングした。これら７２のＤＮＡマーカーのうち４３について(表IIに列挙されている)、プライマーの組を創出し、ＰＣＲおよびヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により、対応するＳＴＳが単コピーであることを決定した。残りの２９のＤＮＡマーカー(黄色の囲み内に示される)はＹＡＣ末端誘導配列を表し、これらについては本発明者等はプライマーの組を作らなかった。これらのＹＡＣ末端配列は、制限地図作成に基づき１２番染色体にマッピングされると思われる。最後の写真は、７０kb内にほぼ１個という、この領域における通算のマーカー密度を明らかにしている。
【００５５】
本明細書に提示されるコンティグの分析は、ハウスキーピング遺伝子に頻繁に付随することが知られているＨＴＦ島であるかも知れない、多数の富ＣｐＧ領域を明らかにした。これらＣpＧ島は、まだ未確認の遺伝子の５'末端に位置する可能性が高い：ＹＡＣ ＤＮＡ中、３またはそれ以上の稀切断制限部位が一致する、９０％の事例において、付随遺伝子のあることが示されている[５１]。これは、この領域内で尚同定されるべき遺伝子の数の過小評価であると思われ、何故なら、組織特異的遺伝子の６０％はＣｐＧ島を伴わない[５２]からであり、また、一つの島から２個の遺伝子が別の向きに転写されることが起こり得るからである。
【００５６】
ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリーマーク１から分離されたＹＡＣクローンの幾つかはキメラであることが判明したが、ＦＩＳＨ、制限マッピングおよびＳＴＳ含有量分析に基づき非キメラであるように見受けられる部分重複ＹＡＣクローンがそれぞれのスクリーニングで得られ、これは、該ライブラリーの報告されている複雑性に合致するものである。ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリーマーク１についてのキメラ性の程度が、本明細書中で研究されている領域について１８％(６８のうち１２)であると決定された。ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリーマーク３由来のＹＡＣの少数(この研究には７個のＭＥＧＡ ＹＡＣのみが含まれた)では、このライブラリー中に存在するキメラクローンのパーセンテージの信頼し得る評価ができなかった。マーク１ライブラリーから誘導されたＹＡＣの平均サイズは３８１kbであると算出され；非キメラ性ＹＡＣ(ｎ＝５８)は平均サイズが３６６kbであり、一方キメラ性ＹＡＣ(ｎ＝１２)はかなり大きな平均サイズ、即ち４５４kbを持つとわかった。
【００５７】
要約すると、本発明者等は、様々な良性充実性腫瘍において頻繁に再編成されるヒト染色体領域に対応する６Ｍｂ ＹＡＣコンティグを提示する。このコンティグは、３個の遺伝子付随ＳＴＳを含む８４の遺伝子座を連結している。さらに、制限地図作成により本発明者等は、そこに存在する遺伝子を暗示し得る少なくとも１２のＣｐＧ島を同定した。最後に、このコンティグ内に４個のＣＡ反復を位置決定した。該領域の遺伝学的、物理学的、および転写地図の統合は、１２番染色体のこの領域のさらなる研究のための基本的枠組みを提供する。初期の研究はＭＡＲおよびＵＬＣＲ１２に収束するようであったが、これは、これらの領域が少なくとも３つの別個の型の充実性腫瘍の切断点クラスター領域を含むためである。本発明者等が本明細書に記載する種々のＹＡＣクローンは、このような研究のための貴重な資源である。それらは、この領域に存在する遺伝子の探索および種々の良性充実性腫瘍の１２番ｑ染色体異常により直接影響を受けるものの同定を容易にするに相違ない。
【００５８】
実施例２
１.序
ヒト染色体１２ｑ１５上の１.７Ｍｂ複合異常領域は、異なる良性充実性腫瘍
型にしばしば見いだされる頻発する１２番染色体切断点を持っていることが判明した。この実施例においては、病因上の関連があるように見えるＭＡＲ内のＨＭＧ遺伝子の同定を述べる。ポジショナルクローニングのアプローチを用いて、高速移動群蛋白遺伝子ＨＭＧＩ−ＣをＭＡＲの１７５kbセグメント内部に同定し、そのゲノム機構の特性決定を行った。ＦＩＳＨによりこの遺伝子内部に、７つの異なる良性充実性腫瘍型の切断点の大半が精確に指摘された。サザンブロットおよび３'−ＲＡＣＥ分析により、ＨＭＧＩ−Ｃにおける矛盾のない再編成および／または変化したＨＭＧＩ−Ｃ転写物の発現が立証された。これらの結果は、ＨＭＧ遺伝子ファミリーの一員と良性充実性腫瘍の発達との間の連鎖を示すものである。
【００５９】
２.材料および方法
２.１.細胞培養および一次腫瘍標本
図３に列挙される腫瘍細胞系は、トランスフェクション法により確立され[５４]、前に[３９、２４]で、そして本出願に付属文書１として添付されているヴァン・ドウ・ヴェン等、Genes Chromosom. Cancer、１２、２９６−３０３(１９９５)という文献中に記載されている。２０％ウシ胎児血清を添加したＴＣ１９９培地で細胞を生育させ、標準的細胞遺伝学技術により規則正しい間隔で検定した。ヒト肝細胞性癌腫細胞系Ｈｅｐ ３ＢおよびＨｅｐ Ｇ２をＡＴＣＣより取得し(受理番号ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６４およびＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５)、４％アルトロサーを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２(ギブコ／ＢＲＬ)中で培養した。一次充実性腫瘍は様々な大学診療所から入手した。
【００６０】
２.２.ＹＡＣおよびコスミドクローン
ＹＡＣクローンは、ＰＣＲに基づくスクリーニング[５９]およびコロニーハイブリダイゼーション分析の組み合わせを用いてＣＥＰＨマーク１[５７]およびマーク３[５８]ＹＡＣライブラリーから分離した。コスミドクローンは、ローレンス・リヴァーモア・ナショナル・ラボラトリーから入手した(Ｐ.ドゥ・ジョングの好意による)整列させたヒト１２番染色体特異的コスミドライブラリー(ＬＬ１２ＮＣ０１)から分離した[６０]。ＬＬ１２ＮＣ０１由来のコスミドクローンは、それらの微量定量プレート上の番地により表示される；即ち例えば２７Ｅ１２というように。
【００６１】
コスミドＤＮＡは、キアゲンチップ(ディアゲン)での精製を含む標準技術を用いて抽出した。高分子量酵母＋ＹＡＣ ＤＮＡ(１ｘ１０9細胞ml-1に相当)を含有するアガロース充填剤を前記[６１]のように調製した。充填剤を、Ｔ10Ｅ1(ｐＨ８.０)２５ml４回、その後１ｘ制限緩衝液０.５ml２回に対し完全に透析した後、それらをパルスフィールド制限酵素マッピングまたはＹＡＣ末端救出のいずれかに付した。ＹＡＣ末端救出は、前記参考文献６１に記載のように、直接固相ＤＮＡ配列決定と組み合わせたベクトレット−ＰＣＲ法を用いて実施した。インターＡｌｕＰＣＲ生成物は、公表されているオリゴヌクレオチドＴＣ６５または５１７を用いて分離し[６２]、クローニングを容易にするためここにＳａｌＩ尾を付加した。配列分析後、ＯＬＩＧＯコンピューターアルゴリズムを用いてプライマー対を開発した[６１]。
【００６２】
２.３.ＤＮＡ標識化
ＹＡＣ、コスミド、ＰＣＲ生成物およびオリゴヌクレオチドからのＤＮＡを様々な技術を用いて標識した。ＦＩＳＨのために、コスミドクローンまたはＹＡＣのインターＡｌｕＰＣＲ生成物をニック翻訳によりビオチン−１１−ｄＵＴＰ(ベーリンガー)でビオチニル化した。フィルターハイブリダイゼーションのために、ランダム六量体を用いてプローブをα−32Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識した[６２]。サイズが２００bpより小さいＰＣＲ生成物の場合、同様のプロトコルを適用したが、標識化反応を開始させるために特異的オリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチドはγ−32Ｐ−ＡＴＰを用いて標識した。
【００６３】
２.４.ヌクレオチド配列分析およびＰＣＲ増幅
ヌクレオチド配列は実施例１に記載のように決定した。配列決定結果は、Ａ.Ｌ.Ｆ.ＤＮＡシークエンサー(商標)(ファルマシア・バイオテク)を使用し標準的３０cm、６％ハイドロリンク(商標)、ロングレインジ(商標)ゲル(ＡＴバイオテク)上で分析した。ＰＣＲ増幅は本質上前記と同様に実施した[３９]。
【００６４】
２.５.ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(ＲＡＣＥ)
３'ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(３'−ＲＡＣＥ)は、ギブコ／ＢＲＬ３'−ＥＴプロトコルの一部を僅かに改変した方法を用いて行った。第一鎖ｃＤＮＡ合成のためには、アダプタープライマー(ＡＰ２)ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＣＡＴ Ｃ(Ｔ)17を使用した。第一および第二回目のＰＣＲの両者のために、不変増幅プライマー(ＵＡＰ２)ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＣＡ ＴＣを「逆プライマー」として使用した。ＰＣＲの第一回目では以下の特異的「前進プライマー」を使用した：ｉ)５'−ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＡＣ−３'(エキソン１)、ii)５'−ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＡＣ ＣＴＡ ＧＧＡ−３'(エキソン３)、またはiii)５'−ＡＡＣ ＡＡＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＴＴ ＡＡＴ ＴＡＣ ＴＧ−３'(３'−ＵＴＲ)。ＰＣＲの第二回目では以下の特異的前進プライマー(第一回目で使用されたものと比較して入れ子状のプライマー)を使用した：ｉ)５'−ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＣ−３'(エキソン１)、ii)５'−ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＧＴＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＣＴ−３'(エキソン４)、またはiii)５'−ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＴＴＧ ＡＴＣ ＴＧＡ ＴＡＡ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＧＧ−３'(３'−ＵＴＲ)。入れ子状特異的プライマーのＣＵＡ／ＣＡＵ尾は、指向性のクローンアンプクローニング系(ギブコ／ＢＲＬ)の使用を可能にした。
【００６５】
３.結果
３.１.コスミドコンティグおよびＭＡＲセグメントのＳＴＳ地図の開発
ヒト１２番染色体の長腕に焦点を絞ったポジショナルクローニング作業工程の間に本発明者等は、約６Ｍｂにわたる、そして７５の部分重複ＹＡＣから成る酵母人工染色体(ＹＡＣ)コンティグを組み立てた。その説明については実施例１を参照されたい。このコンティグはＭＡＲを包含しており(図２をも参照されたい)、そこでは、様々な一次良性充実性腫瘍(これまで試験された８つの異なる型の３４の腫瘍；表５)および腫瘍細胞系(これまで試験された２６。脂肪腫、子宮平滑筋腫、および多形態性唾液腺腫より誘導；図３)に存在する殆どの染色体１２ｑ１３−ｑ１５の切断点の殆どが密集しているように見える。本発明者等は広範囲ＳＴＳおよびＭＡＲの稀切断物理的地図の両者を開発し、ＦＩＳＨ分析により、ＭＡＲの４４５kb亜領域内にマッピングされる切断点の殆どがＳＴＳ ＲＭ３３およびＲＭ９８の間に位置することを見いだした(図２および図３を参照されたい)。大規模な品質管理を含むＦＩＳＨ実験を、常法に従い前記のように実施した[２５、３９、２４、４２、３６]。この４４５kb ＭＡＲセグメント内部の切断点の分布をさらに精密にするため、５４の一部重複コスミドクローンで構成されるコスミドコンティグを開発し、稠密なＳＴＳ地図(図２)を確立した。このコスミドコンティグは、稀切断物理的地図との比較およびＳＴＳ含有量マッピングによって二重確認した。
【００６６】
３.２.ＭＡＲの１７５kbＤＮＡセグメント内部への染色体１２q切断点の密集
研究された様々な腫瘍細胞系中の染色体１２ｑ切断点が、ＦＩＳＨによりコスミドコンティグ内部に精確に指摘された(図３)。本発明者等の品質管理ＦＩＳＨ実験の一部として[２５、３９、２４、４２]、選択されたコスミドをまず、正常リンパ球から誘導された中期拡散について試験した。ＦＩＳＨの結果は、これら腫瘍細胞系中の１２番染色体切断点の大多数(少なくとも２６例のうちの１８)がＲＭ９９およびＲＭ１３３の間の１７５kbＤＮＡ間隔の中に密集して見いだされることを示し、これは、この間隔が中心的な切断的クラスター領域を構成することを示すものである。Ｌｉ−５０１／ＳＶ４０で得られたＦＩＳＨ結果は、ＭＡＲの一部は見掛け上正常な第３染色体に転座する事(応用細胞遺伝学により目撃された染色体異常)を示した。最後に、子宮平滑筋腫細胞系ＬＭ−５.１／ＳＶ４０、ＬＭ−６５／ＳＶ４０、およびＬＭ−６０８／ＳＶ４０の切断点が同じコスミドクローン、即ちコスミド２７Ｅ１２内部にマッピングされる事が見いだされたという事実は、興味を持って注目される。
本発明者はさらに、染色体１２ｑ１３−ｑ１５の異常を有する８つの異なる型の一次良性充実性腫瘍についてＦＩＳＨ実験を行った(表４)。コスミドクローン２７Ｅ１２および１４２Ｈ１の混合物を分子プローブとして使用した。要約すると、一次腫瘍のＦＩＳＨ研究の結果は、腫瘍細胞系について得られた結果と矛盾しなかった。試験された７つの異なる腫瘍型の各々の切断点がＭＡＲの同じ１７５kb ＤＮＡ間隔内部に見いだされたという観察は、この間隔がこれらの腫瘍の発達と決定的に関連し、故に可能性あるＭＡＧ遺伝子座またはその重要な部分を有しているかも知れないということを示唆した。
【００６７】
３.３.ＭＡＲ内部にマッピングされる候補遺伝子の同定
ＳＴＳ ＲＭ９９およびＲＭ１３３の間のＭＡＲの１７５kb亜領域内部にマッピングされる候補遺伝子を同定する試みにおいて、本発明者等は３'−末端エキソン捕捉およびゲノム配列サンプリング(ＧＳＳ)を使用した[６３]。ＧＳＳアプローチを使用して本発明者等はコスミド２７Ｅ１２の４.９kbＢａｍＨＩサブフラグメントの末端のＤＮＡ配列データを得、これはＦＩＳＨ分析により、試験された子宮平滑筋腫細胞系のうち３個において１２番染色体の異常によって分断されることが示された。ＢＬＡＳＴ[６４]探索は、これらの配列の一部が、ＨＭＧ遺伝子ファミリーの一員である[６６]高速移動群(ＨＭＧ)蛋白遺伝子ＨＭＧＩ−Ｃ[６５]の一般に入手し得る部分的ｃＤＮＡ配列(ＥＭＢＬ受理番号Ｚ３１５９５)と配列一致を示すことを明らかにした。これらの観察に照らし、ＨＭＧＩ−Ｃは候補ＭＡＧ遺伝子であると考えられ、さらに詳細に研究した。
【００６８】
３.４.ＨＭＧＩ−Ｃのゲノム機構および良性充実性腫瘍における再編成
ＨＭＧＩ−Ｃ転写物は１２００ヌクレオチド(報告されたサイズはおよそ４kb[６５、６７])が一般に入手し得るのみであるため、本発明者等はまず、ＨＭＧＩ−Ｃ転写物(ジェンバンク、＃Ｕ２８７４９)の残りのヌクレオチド配列の殆どを決定した。この事は、本発明者等にとって該遺伝子のゲノム機構の実質的な確立を可能にした。この配列データについて興味深く注目される事は、ＣＴ反復がＨＭＧＩ−Ｃの５'−ＵＴＲに、そしてＧＧＧＧＴペンタヌクレオチド反復が３'−ＵＴＲに存在することであり、これらは調節上の関連があるかも知れない。当該遺伝子の転写されたものをゲノムＤＮＡ配列(ジェンバンク、＃Ｕ２８７５０、Ｕ２８７５１、Ｕ２８７５２、Ｕ２８７５３、およびＵ２８７５４)と比較することにより、ＨＭＧＩ−Ｃが少なくとも５個のエキソンを含むことが明らかとなった(図２)。遺伝子の転写方向は染色体の長腕のテロメアに向かっている。最初の３個のエキソンの各々は、可能性あるＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)をコードしており、そしてエキソン５は、エキソン４によりコードされているスペーサードメインにより３個のＤＢＤから分離されている酸性ドメインをコードしている。３個のＤＢＤコード化エキソンは、互いに比較的近接して位置しており、約１４０kbの大きなイントロンによって他の２個のエキソンと分離され、そしてこの２個は互いに約１１kb離れている。ここで特段の興味を持って強調されることは、５個のエキソンは少なくとも１６０kbのゲノム領域にわたって散在しており、したがって上記の１７５kbの主要ＭＡＲ切断点クラスター領域全体を殆どカバーしているという事である。分子プローブとしてコスミド１４２Ｈ１(エキソン１−３を含む)および２７Ｅ１２(エキソン４および５を含む)の混合物を使用した分子細胞遺伝学的研究の結果は、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子が、評価された腫瘍および腫瘍細胞系の大多数において観察された１２番染色体の異常に直接影響を受けていることを明確に証明する(図３；表４)。これらの細胞遺伝学的観察は、ＬＭ−６０８／ＳＶ４０(結果は示されていない)、ＬＭ−３０.１／ＳＶ４０[２４]、およびＡｄ−３１２／ＳＶ４０(使用されたプローブはＣＨ７６、ＲＭ１１８−Ａ、およびＥＭ２６を包含した)の事例におけるサザンブロット分析によって独立して確認された。これら３つのプローブのいずれを用いてもＬＭ−６５／ＳＶ４０、ＬＭ−６０９／ＳＶ４０、Ａｄ−２１１／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０、Ｌｉ−１４／ＳＶ４０、およびＬｉ−５３８／ＳＶ４０の切断点を検出できなかったという事は、ＭＡＲ中の切断点の相対位置を確立したＦＩＳＨデータとも合致した(図３参照)。これらの結果により、ＨＭＧＩ−Ｃが、仮定的ＭＡＧ遺伝子の第一候補とされた。
【００６９】
３.５.良性充実性腫瘍細胞における異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物の発現
追跡的研究の内容において、可能性ある異常ＨＭＧＩ−Ｃ発現について試験することは興味深いものであった。最初のノーザンブロット研究により、ＨＭＧＩ−Ｃの転写物は、試験された多様な正常組織(脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、胎盤、骨格筋)ならびに図３に列挙される幾つかの腫瘍細胞系で検出することができないことが明らかとなった(データは示されていない)。正常な分化した組織中のＨＭＧＩ−ＣｍＲＭＡレベルは悪性組織中よりもずっと低いことが知られている[６５、６７]。本発明者等のノーザン研究の対照として、本発明者等は、比較的高いレベルのＨＭＧＩ−Ｃを発現することが知られる肝癌細胞系Ｈｅｐ３Ｂを含めた。本発明者等は、大きさがおよそ３.６および３.２kbである二つの主要なＨＭＧＩ−Ｃ転写物を容易に検出した(分子量の相違はそれらの５'−非コード化領域の相違に起因するというのが最もありそうなことである)。ＨＭＧＩ−Ｃまたは３'−異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物を検出する代替の且つより感受性の高いアプローチにおいて、本発明者等は３'−ＲＡＣＥ実験を行った。多様なＨＭＧＩ−Ｃ転写レベル(Ｈｅｐ ３Ｂ肝癌細胞では高レベル、Ｈｅｐ Ｇ２肝癌細胞では中等度、そして子宮筋層、正常脂肪組織、および偽粘液腫では低レベル)を有する幾つかの組織を用いた対照実験において、本発明者等は、３つの選択されたプライマーの組のいずれが使用されようとも、分子クローニングおよびヌクレオチド配列分析時に３'−ＨＭＧＩ−ＣｍＲＮＡ配列の完璧な部分ｃＤＮＡコピーを表すように見える３'−ＲＡＣＥクローンを取得した(方法論を参照されたい)。潜在性のまたは異常にスプライスされたＨＭＧＩ−Ｃ転写物に対応する可能性が最も高いＲＡＣＥ生成物が時に観察され、それらの異所性配列は、ＨＭＧＩ−Ｃイントロン３または４に戻ってマッピングされた。
【００７０】
１０の異なる一次腫瘍または脂肪腫、子宮平滑筋腫、および多形態性唾液腺腫から誘導された腫瘍細胞系の同様な３'−ＲＡＣＥ分析において、本発明者等は定常的および特異なＰＣＲ生成物の両者を検出した。定常的ＰＣＲ生成物は殆どの場合３'−ＨＭＧＩ−ＣｍＲＮＡ配列の完璧な部分ｃＤＮＡコピーを表すように見えた。それらは恐らくは変化を受けていないＨＭＧＩ−Ｃ対立遺伝子に起源する可能性が最も高く、内部対照として考えられるかも知れない。ここに提示された１０の腫瘍細胞試料の特異なＰＣＲ生成物は、ＨＭＧＩ−Ｃ配列と融合した異所性配列を含むように見受けられた。殆どの場合、異所性配列は、確立された転座相手から誘導されることが見いだされ、したがって、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の、転座で誘発される再編成のための独立した証拠を提供するものである。これらのＲＡＣＥ生成物の異所性配列のヌクレオチド配列、転換点、および染色体起源に関する情報を表５に要約する。異所性配列の染色体起源は、コリエル・セル・レポジトリーズから入手したＮＩＧＭＳ ヒト／齧歯類体細胞ハイブリッドマッピングパネル２を用いてＣＡＳＨ(体細胞ハイブリッドを用いる染色体割り当て)によって確立されたことに留意すべきである。染色体割り当ては、表５にさらに概説されるように、ｐＣＨ１１１１、ｐＣＨ１７２、ｐＣＨ１７４、ｐＣＨ１９３、およびｐＣＨ１１７の事例についてさらなるデータにより個別に確認された。常套的細胞遺伝学的分析の限界を考慮すると、複雑な核型の場合には特に、異所性配列の染色体割り当ては、かつての転座の細胞遺伝学的記載と良好に一致する。
【００７１】
得られる分子細胞遺伝学的分析が、その１２番染色体切断点がＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の遥か外側(１Ｍｂ以上)にマッピングされることを示したという、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０で得られたデータは、幾分予想外であった[４２]。異所性配列は、確立された転座相手である第１染色体(より正確には、部分的に１ｐ２２にマッピングされるＭ.Ｉ.Ｔ.ＹＡＣコンティグＷＣ−５１１内部のセグメント)に起源を発するように見えた(図２)。この特別の事例における異常ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の機能的発現への影響を正確に解明するためにはさらなる分子解析が必要とされる。ここでさらに興味を持って注目されることは、ＧＧＧＧＴ反復がＲＡＣＥ生成物中に存在しないことから、第１染色体に由来する配列が、ＨＭＧＩ−Ｃの３'−ＵＴＲ領域に観察されるＧＧＧＧＴ反復を除去するらしいことである。対照的に、やはり３'−ＵＴＲに切断点を有することが示された一次子宮平滑筋腫ＬＭ−＃５８(ｔ(８；１２)(ｑ２４；ｑ１４−ｑ１５))においては、この反復はＲＡＣＥ生成物中に存在するらしく思われた。故に、この反復の除去は、十中八九腫瘍の発達にとって決定的ではない。Ｘ染色体が細胞遺伝学的に指定された転座相手である、一次腫瘍ＬＭ−＃１６８.１に関する結果は、異所性配列が、平滑筋腫における優先的転座相手である第１４染色体から誘導されることを明らかにした。第１４染色体の関与は、Ｌｉ−５０１／ＳＶ４０の場合にそうであると判明したように、この特別の事例での標準的核型決定によっては検出できない可能性がある。一次脂肪腫Ｌｉ−＃２９４(ｔ(８；１２)(ｑ２２；ｑ１４))では、これに代わる２個の異所性配列が検出された。ヒト第８染色体に対するプローブの領域位置決定のためのハイブリッド細胞マッピングパネルを使用したさらなるＣＡＳＨ分析[６８]は、これらが共に染色体８ｑ２２−ｑｔｅｒから誘導されていることを明らかにした(表５)。これらのＲＡＣＥ生成物が、選択的にスプライシングされた転写物に相当するということは極めて可能性が高い。最後に、事例のうち４つにおいて(表５、ｐＣＨ１１４、ｐＣＨ１１０、ｐＣＨ１０９、ｐＣＨ１１６)、対応する異所性配列がＨＭＧＩ−Ｃイントロン３または４のいずれかから誘導されると判明したことから、ＲＡＣＥ生成物は潜在性のまたは異常にスプライスされたＨＭＧＩ−Ｃ転写物に相当するように見えた。このようなＲＡＣＥ生成物は上記の対照実験でも観察されている。結論として、腫瘍細胞における異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物の検出は、ＨＭＧＩ−Ｃが様々な１２番染色体異常により一貫して再編成されていることをさらに強く支持するものである。様々な事例における異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物は、生物学的な関わりについて何らかの最終的結論を引き出す前に、全長を特性決定すべきであるということに留意すべきである。
【００７２】
分離された異所性配列の最初のそして予備的評価は、変動する長さの、位相が同じオープンリーディングフレームを明らかにした。例えば一次腫瘍ＬＭ−＃２５の場合、その異所性配列の第二コドンが既に終止コドンであるらしい(表５)。配列データは２回の大規模な(恐らく突然変異を誘発する)ＰＣＲを経て生成されたクローンについてのみ得られているため、ここでは注意することがふさわしい。興味を持って注目されることは、Ｌｉ−５０１／ＳＶ４０については、ノーザンブロット分析において、分離された異所性配列が、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、および骨格筋を包含する種々の組織に１０kb以上の転写物を検出したが、脳には検出されなかった(データは示されていない)ということである。第３染色体は脂肪腫中の染色体１２ｑ１３−ｑ１５転座の好ましい相手であり、また種々の脂肪腫の第３染色体切断点はＹＡＣクローンＣＥＰＨ１９２Ｂ１０を横切っていることが見いだされたことから、検出された転写物は、可能性ある脂肪腫を好む相手遺伝子(ＬＰＰ)に相当するのかも知れない。
【００７３】
４.考察
付属文書１において、脂肪腫、多形態性唾液腺腫、および子宮平滑筋腫の染色体１２ｑ１３−ｑ１５切断点は、過去にそれらが１２番染色体のセグメントｑ１３、ｑ１４、またはｑ１５に細胞遺伝学的に割り当てられたことに関わりなく、全てＭＡＲと呼称される１.７Ｍｂ ＤＮＡ間隔内部に全て密集している。３つの腫瘍型のうち２つで１２番染色体転座切断点にかかっているＣＥＰＨメガ−ＹＡＣを同定しているシェーンベルク・フェッツォ等の最近の研究[１４]は、この主張されている切断点の密集を支持している。本研究において本発明者等は、ＦＩＳＨ分析により、７つの異なる充実性腫瘍型の１２番染色体切断点が、ＭＡＲの比較的小さな(１７５kb)セグメント内部に密集していることを決定的に立証した。幾つかの腫瘍細胞系についてはサザンブロットデータが得られ、これらは常にＦＩＳＨ結果を支持した。これら全ての観察から、本発明者等は、ＭＡＲのこのセグメントはこれらの腫瘍における１２番染色体異常のための主たる標的領域を構成していること、そしてそれは可能性あるＭＡＧ遺伝子座：これらの腫瘍における共通した通性と考えられ得る多腫瘍異常増殖遺伝子座を表していそうなことを結論付ける。
【００７４】
この１７５kb ＭＡＲセグメント内部に、本発明者等はＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子を同定し、そのゲノム機構の特性を決定した。構造的にはこのＨＭＧＩ−Ｃコード化燐蛋白は、３個の可能性あるＤＮＡ結合ドメイン、１個のスペーサー領域、および酸性カルボキシ末端ドメインで構成され、カゼインキナーゼIIおよびｐ３４／ｃｄｃ２の両者のための燐酸化の可能性ある部位を含んでいる[６５、６７]。本発明者等は、ＨＭＧＩ−Ｃが本明細書中で研究された様々な腫瘍型に関わる第一候補の標的遺伝子である強力な証拠を提供した。ＦＩＳＨ研究において、３３の一次腫瘍のうち２９の切断点は、２つの極めて有用なコスミド１４２Ｈ１および２７Ｅ１２の間にマッピングされることが判明した。第一のコスミドは３個のＤＢＤコード化エキソンを含み、第二のコスミドは別の２個のドメインをコードしている残りのエキソンを含んでいる。故に、切断点の大多数は該遺伝子の内部にマッピングされ、それらの殆どは恐らく１４０kbイントロン(イントロン３)内部にあり、これは、評価された２６の腫瘍細胞系で得られたＦＩＳＨ結果とも合致する。ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の５'末端はまだ完全には特性決定されていないことにも留意すべきである。この遺伝子ファミリーの別の成員であるＨＭＧＩ(Ｙ)は様々な代替第一エキソンを持っていることが知られていることから[６９]、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の大きさは、想像されているよりも大きいかも知れない。ＨＭＧＩ−Ｃが１２番染色体異常の影響を受けていることのさらなる支持は、３'−ＲＡＣＥ実験の結果から導くことができる。新たに獲得された配列に融合した転写されたＨＭＧＩ−Ｃ配列で構成される異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物が、腫瘍細胞に検出されたが、明らかに殆どの場合、細胞遺伝学的に転座相手として同定された染色体に起源を発している。多くの染色体が、研究された腫瘍中の転座相手として発見されているという事は注目すべきである。これらの転座に関与する相互切断点領域に観察されるこの不均一性は、ＭＬＬ遺伝子を含む染色体１１ｑ２３再編成を伴う様々な血液学的悪性腫瘍のそれと似ており[７０]、その翻訳産物はＨＭＧＩ蛋白のＤＮＡ結合モチーフに関連するアミノ末端モチーフを持っている。
【００７５】
興味をそそる論点は、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現に及ぼす１２番染色体異常の影響および直接の生理学的関わりに関係している。ＨＭＧＩ−Ｃの幾つかの機能的特徴は知られているか、または他のファミリー成員の研究から推測により導くことができる。それはＤＮＡの小溝で結合することから、ＨＭＧＩ−Ｃはサテライトクロマチンの組織化において役割を果たしているか、または転写因子として働いていると示唆されている[７１、７２]。ＨＭＧＩ−Ｃに最も密接に関連する成員であるＨＭＧＩ(Ｙ)に関する研究は、ＨＭＧＩ(Ｙ)はＮＦ−κ Ｂ転写活性のためのプロモーター特異的副因子として機能し得る事を示唆した。ＨＭＧＩ(Ｙ)はさらに、明瞭な転写因子ＡＴＦ−２イソ型のＤＮＡ結合を刺激または阻害することが示されている[７４]。どちらの研究も、該蛋白はプロモーター／エンハンサー事情において機能する転写装置の構造要素を構成しているに過ぎないことを示している。ＨＭＧＩ−Ｃと類似のドメイン構造を持ち、遺伝子転写において準転写因子として働くＨＭＧ遺伝子ファミリーのさらに別の成員である、高速移動群蛋白１(ＨＭＧ１)に関する最近の報告では、酸性カルボキシ末端領域を欠く末端切除ＨＭＧ１蛋白が遺伝子転写を阻害することが示された[７５]。ＤＮＡ結合により惹起される抑制の排除に加えて遺伝子発現の増強のためには、ＨＭＧ１分子の酸性末端が必須であることが提唱された。１２番染色体切断点の殆どが１４０kbイントロンに存在するらしいことから、酸性カルボキシ末端ドメインからのＤＢＤの分離は頻繁に起こっていると思われる。ＨＭＧＩ−Ｃの酸性ドメインがＨＧＭＩ(Ｙ)のそれと同様の機能を有する場合、１２番染色体異常の結果は遺伝子発現に影響する可能性がある。最後に、酸性カルボキシ末端領域をコードしている配列の結末はまだ知られていないことに留意すべきである。
【００７６】
ＨＭＧＩ−Ｃは、良性腫瘍の発達に関わり得るＨＭＧ遺伝子ファミリーの最初の成員であるため、このファミリーの他の成員もまた関与しているのかという疑問が生まれる。ＨＭＧ蛋白ファミリーは３つのサブファミリーで構成される：ｉ)ＨＭＧＩおよび２型蛋白。これらはインビトロで転写を促進することが判明しており、またＨＭＧボックスを有するずっと大きなクラスの調節物質の成員であり得る。ii)まだ知られていない機能を有するランダムコイル蛋白ＨＭＧ１４および１７。iii)ＨＭＧＩ−型蛋白。これらは小溝に結合し、ＨＭＧＩ−Ｃ、ＨＭＧＩ、およびＨＭＧＩ−Ｙを包含する。後者の二つは同じ遺伝子によりコードされている。ＨＭＧファミリー成員の公表されているマッピング位置が、本明細書で研究されているような良性充実性腫瘍の公表されている染色体切断点と一致するということは、興味を持って注目される。例えばＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子はヒト染色体６ｑ２１にマッピングされている[６９]が、これは、子宮平滑筋腫、脂肪腫、および多形態性唾液腺腫で観察される頻出する転座に関与していることが知られている[７６]。ヒトゲノムデータベースに列挙されるように、ＨＭＧファミリーの既知の成員全てが染色体上に割り当てられている訳ではないが、それらの幾つかについては比較的正確なマッピング位置が確立されている。例えば、ＨＭＧ１７は染色体１ｐ３６.１−ｐ３５に、ＨＭＧ１Ｌは１３ｑ１２に、そしてＨＭＧ１４は２１ｑ２２.３に割り当てられ、腫瘍型の染色体切断点が本明細書中で研究されている染色体セグメントは全て報告されている[７６]。ＨＭＧＩ(Ｙ)またはこれらＨＭＧ成員のうちの他のいずれかが実際にこれらの腫瘍の他の亜群に影響を及ぼしているかどうかは依然として確立されねばならない。さらに、バンナヤン−ゾナナ(マッククシック＃１５３４８０)、プロテウス(マッククシック＃１７６９２０)、およびコウデン(マッククシック＃１５８３５０)のような症候群(後者の症候群は多発性過誤腫症候群とも呼ばれる)を記載することは興味深い。先天性バンナヤン−ゾナナ症候群を有する個体の６０％には、中胚葉過誤腫を伴う家族性巨大頭蓋、離散した脂肪腫および血管腫が見いだされた[７０]。
【００７７】
最後に、本発明者等の結果の一つの局面を見逃すべきではない。この研究で評価された全ての腫瘍は間葉起源または間葉成分を含んでいた。観察されたＨＭＧＩ−Ｃの関与が間葉特異的であるのかまたは非間葉起源の腫瘍にも見いだされるのかを解明することは非常に興味深いことであろう。本発明者等がここに記載する様々なＤＮＡクローンは、この重要な問題に取り組むための貴重な原資であり、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子を腫瘍発生に最終的に関連付ける研究を容易にするに違いない。
【００７８】
実施例３
ＨＭＧ遺伝子ファミリーの他の成員の再編成
１.序
この実施例は、もしＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子またはＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子のいずれかが染色体再編成により影響を受けるならば、与えられた腫瘍実体(例えば肺軟骨様過誤腫、子宮平滑筋腫、子宮内膜ポリープ)内部に、組織学的に実際上互いに区別不可能な腫瘍が発生することを明確に証明する。したがって、ＨＭＧＩ−ＣおよびＨＭＧＩ(Ｙ)を包含する(但しこれらに限定されない)異常な間葉増殖につながる遺伝子の一群を、実際に解明することができる。
【００７９】
２.材料および方法
２.１.染色体の調製
染色体の調製は常法に従う。細胞をコルセミド(１０μg／ml)３０μlで２−３時間処理し、次いで、トリプシン法(０.０５％トリプシン、０.０２％ＥＤＴＡ)、その後室温下で２０分間の６倍希釈の培地ＴＣ１９９中の低張性ショックおよびメタノール：酢酸(３：１)固定を用いて収穫した。次いで染色体をＧＴＧバンド化した。
【００８０】
２.２.インサイトゥハイブリダイゼーション
インサイトゥハイブリダイゼーションは前記実施例の一つに概説されるようにして実施した。
【００８１】
２.３.ＰＡＣライブラリースクリーニング
ＰＡＣライブラリー(ゲノム・システムズ・ライブラリー・スクリーニング・サーヴィス、セントルイス、ミズーリ、ＵＳＡ)を、ＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子に特異的なプライマーの組を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。スクリーニングのために本発明者等は、配列：
５'−ＣＴＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＡＴＧ Ｔ−３'(イントロン３)
を有する前進プライマー、および逆プライマー：
５'−ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＴＴ ＣＡＡ ＡＣＴ Ａ−３'(イントロン３)
を設計し、３３８bpのフラグメントが生成した。増幅のため、以下の熱循環を使用した：９４℃、５分間(９４℃、１分間、５９℃、１分間、７２℃、２分間)ｘ３０、７２℃、１０分間。
【００８２】
２.４.ＰＡＣクローンからのＤＮＡの調製
単一のＰＡＣクローンを含む細菌コロニーをＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜増殖させた。この一夜培養６６０μlをＬＢ培地２５ml中に希釈し、０.０５−０.１のＯＤ550となるまで増殖させた。最終濃度０.５ｍＭとなるまでＩＰＴＧを添加することによりＰ１溶菌性レプリコンを誘導した。ＩＰＴＧ添加後、ＯＤ550が０.５−１.５となるまで増殖を継続し、そしてゲノムシステムズの推奨するアルカリ溶菌法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００８３】
３.結果
ヒトＰＡＣライブラリーをスクリーニングするためのプライマーの組は、ＨＭＧＩ(Ｙ)のイントロン３に属する配列から設計した。ＨＭＧＩ−ＣおよびＨＭＧＩ(Ｙ)の間の配列相同性の故に、増幅された３３８bpの配列を、ＨＭＧＩ(Ｙ)にのみ特異的である相同性探索によって試験した。ライブラリースクリーニングの結果、挿入物の平均の長さがおよそ１００kbである３個の陽性ＰＡＣクローンが得られた。これらのクローンのうち２個(Ｐａｃ６０４、Ｐａｃ６０５)を以下のＦＩＳＨ研究に使用した。ＨＭＧＩ(Ｙ)が単純または複雑な形で６ｐ２１.３を含む転座を伴う腫瘍において再編成されているか否かを証明するために、本発明者等は、全て６ｐ２１.３の異常を伴う４つの一次肺軟骨様過誤腫および２つの子宮内膜ポリープ由来の中期拡散についてＦＩＳＨ分析を実施した。各々の場合について２０の中期を採点した。上に記載した２つのＰＡＣクローンＰａｃ６０４およびＰａｃ６０５のうち少なくとも一方は、分析した６例全てにおいて切断点と交差していた。これらの結果は、本明細書で調査された６ｐ２１異常を伴う腫瘍の切断点がＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子内部またはその近傍のいずれかに密集していることを明白に示している。
【００８４】
実施例４
脂肪腫細胞におけるハイブリッドＨＭＧＩ−Ｃ
第３染色体由来の脂肪腫を好む相手遺伝子ＬＰＰ(＞５０kb)のｃＤＮＡクローンを分離し、そのヌクレオチド配列を確立した。複合ｃＤＮＡのデータを図４に示す。ニワトリのジキシンに対しアミノ酸配列類似性(５０％以上)を有する蛋白(６１２アミノ酸(ａａ))のためのオープンリーディングフレームを同定した。ジキシンは、その成員が全ていわゆるＬＩＭドメインを有するＬＩＭ蛋白ファミリーの一員である[７８]。ＬＩＭドメインは、転写レギュレーター、プロトオンコジーン生成物、および付着斑構成成分を包含する、種々の機能を有する漸増する数の蛋白に見いだされる、システインに富む亜鉛結合蛋白である。ＬＩＭファミリー成員の多くは、細胞シグナル生成および発達過程の細胞の運命の制御において役割を果たしていると考えられてきた。近年、ＬＩＭドメインはモジュラー蛋白結合界面であることが証明された[７９]。細胞外マトリックスへのおよび他の細胞への細胞接着部位に存在するジキシンと同様、推定されるＬＰＰコード化蛋白(図６)は３個のＬＩＭドメインを持ち、古典的なＤＮＡ結合ホメオドメインを欠く。
【００８５】
Ｌｉ−５０１／ＳＶ４０の３'−ＲＡＣＥ分析において、融合転写物を含むＨＭＧＩ−Ｃが同定され、ここからハイブリッド蛋白(３２４ａａ)を予想することができ、そして引き続きＨＭＧＩ−Ｃの３個のＤＢＤ(８３ａａ)と、これらのカルボキシ末端の、ＬＰＰによりコードされている３個のＬＩＭドメイン(２４１ａａ)で構成されると予想された。適当な入れ子状のアンプリマーの組を使用するＰＣＲ分析では、類似のＨＭＧＩ−Ｃ／ＬＰＰハイブリッド転写物が、ｔ(３；１２)を有する様々な一次脂肪腫および脂肪腫細胞系に、そして細胞遺伝学的に正常な脂肪腫にも検出された。これらのデータは、脂肪腫中の細胞遺伝学的に検出し得るおよび隠れたｔ(３；１２)転座は常に、ＬＰＰコード化蛋白の仮定的モジュラー蛋白結合界面とＨＭＧＩ−ＣのＤＮＡ結合分子との同調した融合をもたらし、それによりＨＭＧＩ−Ｃの酸性ドメインがＬＩＭドメインに置き換えられるように見える。その結果、これらの蛋白結合界面は、これら脂肪腫細胞の核環境で提供される可能性が高く、そこでそれらは遺伝子発現に影響を及ぼし、恐らくは異常な増殖調節を導き得る。染色体１２ｑ１３−ｑ１５異常を伴う多岐にわたる良性間葉性腫瘍の中で、これは、明確に定義された腫瘍関連ＨＭＧＩ−Ｃ融合蛋白の形成に頻繁に且つ不断に寄与する染色体転座相手の最初の例である。図５は、分離された完全なＬＰＰ遺伝子のｃＤＮＡ配列を示している。
【００８６】
実施例５
脂肪腫のための診断試験
脂肪腫を有する患者の生検試料を取得した。このようにして得られた材料から、製造者のマニュアルに記載されるようにして、ギブコ／ＢＲＬの標準トリゾール(商標)ＬＳプロトコルを用いて総ＲＮＡを抽出した。この総ＲＮＡを使用して、逆転写酵素(ギブコ／ＢＲＬ)および結合させた短い余分のヌクレオチドを含むオリゴｄＴ(１７)プライマーを用いてｃＤＮＡの第一鎖を調製した。使用したプライマーの配列は、実施例２の２.５.の項に記載される通りである。引き続きＲＮアーゼＨを使用して、合成されたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子からＲＮＡを除去した。遺伝子特異的プライマー(実施例２、２.５.項)および結合させた余分の短いヌクレオチドに対し相補的なプライマーを用いてＰＣＲを実施した。このようにして得られたＰＣＲ生成物をゲル電気泳動により分析した。それらを同じ個体の正常細胞のバックグラウンドバンドと比較することにより、融合組み立て物が検出された。
さらなる実験において、１個の内部プライマーおよび短いヌクレオチドに対し相補的なプライマーを用いて半入れ子状ＰＣＲの第二回目を実施した。したがってこの試験の感受性は有意に改善された。
図８は典型的なゲルを示す。
【００８７】
実施例６
肺軟骨様過誤腫における１２ｑ１４−１５および６ｐ２１の異常
１.序
肺軟骨様過誤腫(ＰＣＨ)は、いわゆる貨幣病変として肺のＸ線検査中にしばしば検出される。しかし、悪性腫瘍の肺転移および稀に肺癌もまた貨幣病変として存在し得る。この実施例は、最少量の腫瘍細胞しか必要としないＦＩＳＨを使用して、ＰＣＨの大多数と悪性腫瘍とを正しく識別できることを示すものである。したがって、この試験は、例えば微細な針での吸引により取得した腫瘍細胞にうまく適用することができる。
【００８８】
２.材料および方法
この研究には、組織学的に特性決定された合計８０のＰＣＨから得た試料が含まれる。細胞培養、染色体調製およびＦＩＳＨは、前記実施例に記載のように取得または実施した。
【００８９】
３.結果
細胞遺伝学的研究は、細胞遺伝学的に研究された８０のＰＣＨのうち５１が、１２ｑ１４−１５または６ｐ２１のいずれかを含む検出可能な異常を表すことを明らかにした。ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子に属するコスミドのプールまたは前記実施例に記載されたＨＭＧＩ(Ｙ)のＰＡＣクローンのいずれかを使用するＦＩＳＨにより、本発明者等は、さらなる４例においてそれらの領域の隠された構造的再編成を検出することができた(３例に１２ｑ、そして１例に６ｐの関与)。故に、ＦＩＳＨ試験単独をキットに使用して、ＰＣＨの５０％以上にＨＭＧＩ−Ｃの再配置またはＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子再配置のいずれかを正確に検出することができ、したがってこれは、これらの腫瘍の診断のための価値あるさらなる手段である(他の２つの実施例に示されるように、この型の腫瘍に制限される訳ではない)。
【００９０】
実施例７
軟組織腫瘍、特に含脂肪細胞起源の腫瘍の診断
１.序
含脂肪細胞組織腫瘍は、特に微細な針での吸引生検または低温切片を評価せねばならない場合には、しばしば診断上の困難をもたらす。この実施例は、含脂肪細胞組織腫瘍および稀な軟組織腫瘍の鑑別診断のためのＦＩＳＨ試験の妥当性を証明するものである。
【００９１】
２.材料および方法
２.１.腫瘍試料
３つの軟組織腫瘍からの腫瘍試料をＦＩＳＨにより調査した。試料１(１)は含脂肪細胞腫瘍からのものであり、組織学的にはそれは異型性脂肪腫または良く分化した脂肪肉腫のいずれかであった。第二の事例(腫瘍２)は、恐らく粘液様脂肪肉腫であろうと診断されたが、攻撃的な血管粘液腫を包含する他の型の悪性軟組織腫瘍もまた考慮された。第三の腫瘍(腫瘍３)もまた含脂肪細胞起源のものであって、脂肪腫および良く分化した脂肪肉腫の両者が考えられた。
【００９２】
２.２.細胞の分離およびＦＩＳＨ
腫瘍試料は常法に従い酵素で分散させた。得られた単一細胞懸濁液を遠心し、この懸濁液をメタノール：氷酢酸(３：１)を使用して室温で１時間固定した。次にこの細胞懸濁液を清浄な乾燥したスライド上に滴下し、６０℃で６時間経過させた。前記実施例に記載のようにＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子からの分子プローブを用いてＦＩＳＨを実施した。
【００９３】
３.結果
間期のレベルにおいて、腫瘍１および２はいずれも対立遺伝子の一方についての分断シグナルを示した。これらの発見は、良性腫瘍、即ち第一の事例では異型性脂肪腫、そして第二の事例では攻撃的な血管粘液腫であるとの診断と矛盾しない。それらは悪性の含脂肪細胞組織腫瘍の存在を除外することができる。
第三の事例では、ＦＩＳＨはＭＡＲ領域またはその一部の高度の増幅を明らかにした。良く分化した脂肪肉腫において、巨大マーカーまたは環状染色体で観察される増幅単位はＭＡＲ領域を含むことができることから、これらの発見は、良く分化した脂肪肉腫という診断へとつながる。この実施例に提示された３つの事例は、記載されたＤＮＡプローブの有用性を示す。それらは、軟組織腫瘍の診断用のさらなる手段を提供する、比較的単純且つ迅速な間期ＦＩＳＨ実験用のキットに使用することができる。
【００９４】
実施例８
正常組織におけるＨＭＧＩ−Ｃの発現
１.序
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現は主として胚および胎児の発達中の人間の組織に限定されるという事を示すのが、この実施例の目的である。対照的に、特にＨＭＧＩ−Ｃ再編成を伴う腫瘍が発生し得る組織および器官を包含する成人の殆どの正常組織においては、発現は現れない。この事は、該遺伝子の転写の再活性化でも腫瘍形成を開始させ得ることを示すものである。他方では、これは、腫瘍の成長を阻害または止めるためのアンチセンス法(正常ＨＭＧＩ−Ｃ ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子を包含する)の有用性を強調するものである。
【００９５】
２.材料および方法
２.１.組織試料
この研究のために使用される全ての成人組織試料は、採取後１５分以内液体窒素中で凍結させた外科的に採取された組織から得た。試料の殆どは、腫瘍手術の間に採取された隣接する正常組織由来のものであった。詳細には、本発明者等は、様々な解剖学的部位の脂肪組織から採った８個の試料、子宮筋層組織から採った２０個の試料、肺組織から採った８個の試料、唾液腺(耳下腺および顎下腺)から採った４個の試料、心筋から採った１個の組織試料、異なった年齢の患者の胸部組織から採った２５個の試料、脳由来の２個の試料、３個の肝臓試料、腎臓組織から採った７個の試料、および社会経済的理由での人工妊娠中絶後の胚／胎児(１０−１４妊娠週)由来の胚／胎児組織(四肢、６個の試料)を使用した。
さらに、３つの細胞系を使用した：ＨＭＧＩ−Ｃ発現用の対照として本発明者等は、肝癌細胞系Ｈｅｐ３Ｂおよび典型的な転座ｔ(３；１２)を伴う脂肪腫から確立された細胞系Ｌ１４を使用した。１０回再現したＲＴ実験では本発明者等自身の研究においてＨＭＧＩ−Ｃ発現を表さなかったため、負の対照としてＨｅＬａ細胞を使用した。
【００９６】
２.２.ＨＭＧＩ−Ｃの発現のためのＲＴ−ＰＣＲ
組織試料１００mgをホモジナイズし、フェノールおよびイソチオシアナートを含有するトリゾール試薬(ギブコＢＲＬ、エッゲンシュタイン、ドイツ)を用いてＲＮＡを分離した。ポリ(Ａ)−オリゴ(ｄｔ)１７プライマーおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素(ギブコＢＲＬ、エッゲンシュタイン、ドイツ)を用いてｃＤＮＡを合成した。次いで半入れ子状ＰＣＲを実施した。
第一および第二のＰＣＲのために同じ下部プライマー(レヴェックス４)(５'−ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＴＴＣ−３'(エキソン４／５)を使用した。ＰＣＲの第一回目では特異的上部プライマー(ＳＥ１)(５'−ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＡＣ−３'(エキソン１))を、そしてＰＣＲの第二回目で入れ子状上部プライマー(Ｐ１)(５'−ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＣ−３'(エキソン１))を使用した。いずれの回のＰＣＲも１０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８.０、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.００１％ゼラチン、１００μＭ ｄＡＴＰ、１００μＭ ｄＴＴＰ、１００μＭ ｄＧＴＰ、１００μＭ ｄＣＴＰ、２００ｎＭ上部プライマー、２００ｎＭ下部プライマー、および１単位／１００μlアンプリタクポリメラーゼ(パーキン・エルマー、ヴァイターシュタット、ドイツ)を含有する１００μl容量で実施した。増幅は３０周期の間実施した(９４℃１分間、５３℃１分間、７２℃２分間)。第１回目のＰＣＲでの鋳型としては２５０ng総ＲＮＡから誘導したｃＤＮＡを、そして第２回目のＰＣＲでは第一のＰＣＲ反応混合物１μlを使用した。
【００９７】
２.３.無傷のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡのための対照検定
無傷のＲＮＡおよびｃＤＮＡのＰＣＲのための対照反応として、試験はハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)のｃＤＮＡの増幅を基礎とした。ＰＣＲ反応は、ＨＭＧＩ−Ｃ発現のＰＣＲの第一回目について上に記載したものと同じ条件の下で３５周期実施した。
【００９８】
３.結果
発現実験については、全ての実験は少なくとも２回反復した。ＲＴ−ＰＣＲに使用されたＲＮＡおよびｃＤＮＡ調製物が全て無傷であることを確実とするため(さもなければ偽陰性結果が導かれる)、定型的にハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現のためのＲＴ−ＰＣＲを行った。陽性のＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲ結果は２９９bpフラグメントを生成した。陽性のＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲを示す試料のみをこの研究に使用した。Ｈｅｐ ３ＢおよびＬ１４のようなＨＭＧＩ−Ｃ陽性細胞におけるＲＴ−ＰＣＲの結果、特異的２２０bpフラグメントが検出できる。ＨｅＬａ細胞はＨＭＧＩ−Ｃの発現を示さなかった。２つの子宮筋層試料を除いて(ごく微少レベルの筋腫のためである可能性が高い)、成人個体から採取した全ての正常組織試料は、検出し得るレベルのＨＭＧＩ−Ｃ発現を示さなかった。対照的に、試験された全ての胎児／胚組織はＨＭＧＩ−Ｃ発現を表した。
【００９９】
実施例９
白血病の早期検出のための診断手段としてのＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現
１.序
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子を冒す細胞遺伝学的に検出し得る異常が、間葉起源の様々な良性充実性腫瘍中に発見されている。明らかにこの異常は該遺伝子の転写活性化をも導く。血液細胞もまた間葉起源であることから、白血病細胞をＨＭＧＩ−Ｃ発現について調べることに興味が持たれた。本実施例は、末梢血の細胞中の遺伝子の活性化が、白血病に見いだされる未熟な細胞／異常な幹細胞を示す好適なマーカーであることを示すものである。ＨＭＧＩ−Ｃの発現は高度の感受性を持って測定されるため、該遺伝子の発現のためのＲＴ−ＰＣＲは、様々な血液疾患のごく早期の検出に使用することができる。
【０１００】
２.材料および方法
フィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬの患者１９人、ＡＭＬの患者５人、およびＡＬＬの患者３人を包含する異なった型の白血病の患者２７人の末梢血由来の試料をＨＭＧＩ−Ｃ発現の測定に使用した。１５人の健康な家系発端者からの血液試料を対照として使用した。
ＨＭＧＩ−Ｃの発現のためのＲＴ−ＰＣＲは実施例８に概説されるように実施した。
【０１０１】
３.結果
白血病患者からの血液試料にはＨＭＧＩ−Ｃの発現が明白に検出できたのに対し、対照の人間から採取された血液試料のいずれにも発現は認められなかった。該遺伝子の転写活性化が遺伝子またはその周囲を冒している突然変異によるという事の証拠はなかった。活性化はむしろ、細胞の未熟性またはそれらの異常な増殖に関連する二次的効果であると想像することの方が、より理にかなっている。とは言え、高い、且つ改善され得る感受性は、例えばＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現のためのＲＴ−ＰＣＲに基づくキットを極めて好適な診断手段とする。
【０１０２】
実施例１０
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の転写再発現は腫瘍の始動を導き得る。
１.序
この実施例は、幾つかの腫瘍実体については、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の５'に位置する染色体切断点もまた事実存在することを明確に示し、この事は、該遺伝子の転写の上方調節が、対応する腫瘍型の増殖を開始させるのに充分であることを示唆している。
【０１０３】
２.材料および方法
２.１.細胞培養
外科手術の後、腫瘍試料(肺軟骨様過誤腫３個、子宮平滑筋腫１個)を、ペニシリン(２００ＩＵ／ml)およびストレプトマイシン(２００μｇ／ml)を添加したハンク溶液で洗浄した。腫瘍をコラゲナーゼにより３７℃で５−６時間分離させた。小フラグメントおよび単一細胞を含むこの懸濁液を、２０％ウシ胎児血清、２００ＩＵ／mlペニシリン、および２００μg／mlストレプトマイシンを添加したアール塩を伴う培養基ＴＣ１９９中に再懸濁した。
【０１０４】
２.２.染色体の調製
染色体の調製は常法に従った。細胞をコルセミド(１０μg／ml)３０μlで２−３時間処理し、次いで、トリプシン法(０.０５％トリプシン、０.０２％ＥＤＴＡ)、その後室温下で２０分間の６倍希釈の培地ＴＣ１９９中の低張性ショックおよびメタノール：酢酸(３：１)固定を用いて収穫した。次いで染色体をＧＴＧバンド化した。
【０１０５】
２.３.ＦＩＳＨ研究
染色体を確実に同定するため、同じ中期拡散のＧＴＧバンド化の後、ＦＩＳＨを実施した。ＤＮＡプローブとして、本発明者等は、図２のレジェンダに記載されるような、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子にまでかかっているＹＡＣ−コンティグに属する５個のコスミドを使用した。これらのコスミドのうち３個(２７Ｅ１２、１８５Ｈ２、１４２Ｈ１)はＨＭＧＩ−Ｃの第三イントロンにマッピングされ、一方コスミド２６０Ｃ７および２４５Ｅ８はそれぞれ３'または５'末端に位置する。スライドをザイス(ザイス、オバーコッヘン、ドイツ)アキシオプラン蛍光顕微鏡を用いて分析した。結果をパワー・ジーン・カリオタイピング・システム(ＰＳＩ、ハラデイル、英国)で処理し記録した。ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(ＲＡＣＥ)は前記実施例の一つに記載されるようにして実施した。
【０１０６】
３.結果
４つの腫瘍は全て同じ型の細胞遺伝学的異常、即ち２個の見掛け上正常な１２番染色体および余分の誘導体１４ der(１４)ｔ(１２；１４)(ｑ１４−１５；ｑ２４)を含むが、対応するder(１２)の無い４７の染色体の存在を示した。ＨＭＧＩ−Ｃの３'−５'の向きは動原体に向かっているため、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子内部の一つの破損はその５'部分の喪失ならびにder(１２)の喪失を導くであろう。故に本発明者等は、切断点をより正確に決定するため一連のＦＩＳＨ実験を行った。５個のコスミド２６０Ｃ７、２７Ｅ１２、１８５Ｈ２、１４２Ｈ１、および２４５Ｅ８を使用して、同じ強度のハイブリダイゼーションシグナルが、正常な１２番染色体および余分のder(１４)のいずれにも観察された。このＦＩＳＨ結果は、４つの事例全てにおいて、染色体切断点はＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の５'に位置することを明らかにした。
【０１０７】
４つの事例全てにおいて切断点がＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の５'に割り当てられたことは、ＲＡＣＥ−ＰＣＲの結果と良好に合致する。正常なＨＭＧＩ−Ｃ転写物に加えて本発明者等は、３つの腫瘍全てに異常転写物を検出することができた。配列は、それらが第１４染色体からではなく、恐らくは潜在性スプライス部位のためにＨＭＧＩ−Ｃのイントロン３から誘導されていることを示した。しかし、ＲＡＣＥ結果は、実際に４つの事例全てでＨＭＧＩ−Ｃ発現があることを明らかにした。
【０１０８】
実施例１１
白血病細胞の再分化
１.序
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現は、多岐にわたる腫瘍、充実性腫瘍、および白血病においてしばしば非常に上昇する。ＨＭＧＩ−Ｃ蛋白が細胞の形質転換で重要な役割を果たしているのではないかと考えられた。この実施例は、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現がアンチセンスＨＭＧＩ−Ｃ配列を発現することにより大きく低下し得ること、そして腫瘍細胞におけるＨＭＧＩ−Ｃレベルの低下は形質転換された表現型の復帰をもたらすことを示すものである。したがって、アンチセンス分子の発現または投与は、治療上成功裏に適用することができる。
【０１０９】
２.材料および方法
２.１.腫瘍細胞系
腫瘍細胞系は悪性一次唾液腺腫瘍および一次乳癌から作成した。細胞系は、B.カズミールチャク、B.ソード、S.バートニッケ、J.ブラーディエク、およびW.シュルート、「多形態性腺腫細胞は最初の核型に応じてそれらのＳＶ４０形質転換に対する感受性を変える」、Genes Chrom.Cancer、５巻３５−３９頁(１９９２)に記載のように確立した。
【０１１０】
２.２.形質転換された状態の検定
軟寒天コロニー検定を、マクファーソンおよびモンタニアー、「ポリオーマウイルスにより形質転換された細胞の選択検定のための寒天懸濁培養」、Virology、２３巻２９１−２９４頁(１９６４)に記載のように実施した。
唾液腺および胸部腫瘍細胞を、２０％ウシ胎児血清(ギブコ)、２００ＩＵ／mlペニシリン、および２００μg／mlストレプトマイシンを添加したアール塩を伴うＴＣ１９９培養基中で増殖させた。
トランスフェクトさせた唾液腺(ＡＤ６４)および胸の細胞系の腫瘍形成性を、無胸腺マウスに細胞を皮下注射することにより試験した。
【０１１１】
２.３.トランスフェクション検定
トランスフェクションは種々のプロトコルを用いて実施した。即ち：
１.グラハムおよびヴァン・デル・エプの燐酸カルシウム法(「ヒトアデノウイルスの感染性の検定のための新しい技術」、Virology、５２巻４５６−４６７頁(１９７３))。
２.リポフェクション：製造者の指針に従い、リポソーム仲介ＤＮＡ輸送(リポフェクタミン、ギブコＢＲＬ)を用いてトランスフェクションを実施した。
【０１１２】
２.４.アンチセンス組み立て物
種々のプロモーター状況、例えばモロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復、ＣＭＶプロモーター、またはＳＶ４０の初期プロモーターの転写調節の下で、ヒトＨＭＧＩ−Ｃ ｃＤＮＡ配列を、発現ベクター中に、センスおよびアンチセンスの両方向に挿入することにより、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子のセンスおよびアンチセンス組み立て物を得た。例えば、ヒトＨＭＧＩ−Ｃの全コード化配列を含むヒトＨＭＧＩ−Ｃ ｃＤＮＡフラグメントを、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターおよびエンハンサーの調節下での発現、およびＧ４１８耐性についての選択を可能にするｐＲＣ／ＣＭＶ(インビトロゲン）中にクローニングすることによって、ＣＭＶ／ＨＭＧＩ−Ｃプラスミドを組み立てた。
【０１１３】
３.結果
３.１.形質転換された表現型の復帰
胸および唾液腺の腫瘍細胞にアンチセンスＨＭＧＩ−Ｃ発現を誘導した後、これらの腫瘍細胞に、形質転換された表現型の復帰が観察された。軟寒天コロニー検定により測定されたように、そしてインビボ無胸腺マウスで、腫瘍形成性の著しい低下が観察された。免疫沈降およびウェスタンブロット分析は、アンチセンスＨＭＧＩ−Ｃ配列を発現している細胞にＨＭＧＩ−Ｃ蛋白レベルの著しい低下を示した。故に、このアプローチは、ＨＭＧＩ−Ｃの関与する腫瘍に治療的に使用することができる。
【０１１４】
実施例１２
インビボ治療薬試験の手段としての、ＨＭＧＩ−Ｃを含む動物腫瘍モデル
得られたＨＭＧＩ−Ｃの知識に基づき、インビボ薬物試験の手段としての動物腫瘍モデルを開発することができる。この目的(例えば子宮平滑筋腫のための)を達成するため、２つのアプローチを使用することができる。即ち、一方は遺伝子転移(形質転換動物の作成)であり、他方は遺伝子標的化技術(胚の幹細胞(ＥＳ細胞)でのホモローガスな組換えを介して特異的遺伝子異常をインビボで模倣する)である。
【０１１５】
これらの技術は、複雑な生態系の遺伝子機構の操作を特異的且っ予め設計されたように行うことを可能にする。広範な技術的詳細については、B.ホーガン、R.ベディングトン、F.コンスタンティーニ、およびE.レイシー、マウス胚の操作、研究室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、１９９４；ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３８４−３を参照されたい。
【０１１６】
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の不活性化または突然変異を、特に選択された細胞型において選択された時点で起こすために、近年記載されたＣｒｅ／ＬｏｘＰ系を使用することができる(H.グー等、細胞型特異的遺伝子標的化を用いたＴ細胞のＤＮＡポリメラーゼβ遺伝子セグメントの除去、Science、２６５、１０３−１０６、１９９４)。Ｃｒｅ酵素は、その生理的役割が、感染の間に互いに結合するようになったファージゲノムを分離する事である、バクテリオファージＰ１由来の組換え酵素である。これを達成するため、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ部位と呼ばれるファージＤＮＡの短い配列に並び、１個のｌｏｘＰ部位を残してそれらの間のＤＮＡを除去する。この系は現在、哺乳動物細胞中で、染色体ＤＮＡを高い効率で切り取るのに有効であることが示されている。この系を用いた遺伝子の組織特異的不活性化または突然変異は、Ｃｒｅ酵素の組織特異的発現を介して獲得することができる。
【０１１７】
一例として、該モデルが治療薬のインビボ試験の助けになるような、ＭＡＧ遺伝子ファミリーの一員を使用した子宮平滑筋腫のための動物モデル系の開発を下に概説する。
２つのアプローチに従うことができる：
ａ)人間の患者に観察されるような特異的遺伝子異常のインビボ誘導((条件的)遺伝子(同質遺伝子の)標的化アプローチ)；および、
ｂ)患者に観察される遺伝子異常を代表するＤＮＡ組み立て物の導入(遺伝子転移アプローチ)。
【０１１８】
遺伝子転移に使用されるＤＮＡ組み立て物は、構造および発現調節に関する限り、子宮平滑筋腫に罹患している患者でなされた観察に基づいて作成することができる；例えば、種々の転座相手遺伝子を伴うＨＭＧＩ−Ｃ融合遺伝子、特に、ＣＥＰＨ ＹＡＣ ６Ｃ３、８９Ｃ５、３０８Ｈ７、３３６Ｈ１２、４６０Ａ６、４８９Ｆ４、９０２Ｆ１０、９５２Ｆ５、９５８Ｃ２、９６１Ｅ１、および９７１Ｆ５により表されるＹＡＣコンティグに位置する第１４染色体の優先的転座相手遺伝子、基本的にＨＭＧＩ−Ｃの３個のＤＮＡ結合ドメインをコードしている末端切除遺伝子、ならびに完全なＨＭＧＩ−Ｃまたは強力なプロモーターの調節下でのＨＭＧＩ−Ｃの誘導体。
【０１１９】
実施例１３
ＨＭＧＩ−Ｃに対する抗体の調製
診断および治療に使用するための好適な分子の一つの型は、ＭＡＧ遺伝子に対する抗体である。ＨＭＧＩ−Ｃに対するウサギポリクローナル抗体の製造のためには、リサーチ・ジェネティクス・Ｉｎｃ.、ハンツヴィル、ＡＬ、ＵＳＡから入手し得る以下の３個の市販のペプチドを使用した：
(Ｈ−ＡＲＧＥＧＡＧＱＰＳＴＳＡＱＧＱＰＡＡＰＡＰＱＫＲ)８−多抗原ペプチド(ＭＡＰ)、
(Ｈ−ＳＰＳＫＡＡＱＫＫＡＥＡＴＧＥＫＲ)８−ＭＡＰ、
(Ｈ−ＰＲＫＷＰＱＱＶＶＱＫＫＰＡＱＥＥ)８−ＭＡＰ。
ポリクローナル抗体は標準技術に従って作製した。
【０１２０】
表
【０１２１】
【０１２２】
表２
PCRプライマー
【０１２３】
表２（続き）
PCRプライマー
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
原発性多形態性唾液腺腫から由来した７種の細胞系における染色体腕１２ｑの切断点を、９種のＤＮＡプローブに関してＦＩＳＨ分析によりマッピングした。これらのプローブは、すべて染色体断片１２ｑ１３−ｑ１５の２．８ＭｂゲノムＤＮＡ領域に存在し、以前に発表された配列標識部位（ＳＴＳ）に対応する。それらの相対的位置は、ＹＡＣクローニング並びに長距離物理的及びＳＴＳ含量マッピングにより確認した。５種の細胞系の１２ｑ切断点は、最近ＳＴＳＲＭ３３及びＲＭ９８間の１２番染色体子宮平滑筋腫クラスター領域の切断点と定義された４４５ｋｂＤＮＡ区間の３個の異なる亜領域内にマッピングされていることがわかった。７種の切断点は、すべてＳＴＳＲＭ３６およびＲＭ１０３間の１．７ＭｂＤＮＡ区間内に位置しているようであった。さらに、３種の原発性多形態性唾液腺腫の１２番染色体切断点もＲＭ３６及びＲＭ１０３間にマッピングされることがわかった。最後に、１２ｑ１３−ｑ１５異常をもつ２種の脂肪腫細胞系のＦＩＳＨ分析が、これらの切断点について、２種の原発性脂肪腫のものと同様にＲＭ３６とＲＭ１０３間に位置すると見られる比較的小さな隣接ＤＮＡ断片を鋭く指向していた。我々は、３種の明確な充実性腫瘍の１２ｑ切断点のクラスター観察から、ＲＭ３６とＲＭ１０３間の１２番染色体長腕１．７ＭｂＤＮＡ領域が、我々がＭＡＲと名付ける多重異常領域であると結論する。
【０１４０】
【０１４１】
緒論
１２番染色体のｑ１３−ｑ１５領域が関係する染色体転座は、広範囲の充実性腫瘍で観察されている（ミテルマン、１９９１年）。細胞遺伝学的に異常な子宮平滑筋腫（ニルバートおよびハイム、１９９０年；パンディスら、１９９１年）、多形態性唾液腺腫（サンドロスら、１９９０年；ブラーディークら１９９３年）及び良性脂肪組織腫（スリーカンティアら、１９９３年）のサブグループにおいて、１２ｑ１３−ｑ１５の異常はしばしば観察されている。最近の研究（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）において、我々は、１２番染色体切断点の子宮平滑筋腫クラスター領域であるＵＬＣＲ１２を同定し、分子として確認した。本研究では、我々は大または小唾液腺由来の良性上皮腫である多形態性唾液腺腫における染色体１２ｑ切断点に焦点を合わせる。これは最も一般的な型の唾液腺腫であり、この器官の全新生物中のほぼ５０％を説明する。腫瘍の約８５％は耳下腺に見られ、１０％は小唾液腺に、５％は顎下腺に見られる（ザイフェルトら、１９８６年）。これら腺腫の多数は正常な核型をもつようであるが、細胞遺伝学的研究は、頻発性の特異的染色体異常を明らかにした（サンドロスら、１９９０年；ブラーディークら、１９９３年）。８番染色体の異常に加えて、しばしば、１２番染色体の異常であるｔ（３；８）（ｐ２１；ｑ１２）を最も一般的な異常として伴う、８ｑ１２における切断点での転座も頻繁であり、転座は通常１２ｑ１３−ｑ１５が関係する。非頻発性のクローン性異常も報告されている。明確な充実性腫瘍タイプにおける頻繁な１２ｑ１３−ｑ１５領域の関与は、この染色体領域が、これらの腫瘍の発生と関係を持つ可能性がある遺伝子（類）を宿していることを示唆する。したがって、これらの腫瘍における１２番染色体の切断点の分子クローニング及び接合フラグメントの確認は、このような遺伝子（類）の同定に通ずる。
【０１４２】
我々は、先に、蛍光系内ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）データに基づいて、原発性多形態性唾液腺腫由来の幾つかの細胞系における１２番染色体切断点（カズミールチャックら、１９９０年；シェーンメーカーズら、１９９４年ａ）が、１２番染色体長腕上でＤ１２Ｓ１９及びＤ１２Ｓ８座間の区間に位置することを報告した（シェーンメーカーズら、１９９４年ａ）。このＤＮＡ区間は、約７ｃＭであると推定されている（キーツら、１９８９年；クレイグら、１９９３年）。これらの腫瘍細胞の１２番染色体切断点を含む区間は、さらに、すべての切断点が粘液脂肪肉腫に特徴的なｔ（１２；１６）転座により直接影響され（アマンら、１９９２年；クロザットら、１９９３年；ラビッツら、１９９３年）、Ｄ１２Ｓ１９及びＤ１２Ｓ８間に位置する、ＣＨＯＰ遺伝子から遠位に位置することが示されることにより狭められた。さらに最近の研究（クールスら、１９９５年）によると、多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体切断点は、１６５ｋｂより小さい大きさの配列標識部位（ＳＴＳ）ＲＭ１１０及びＲＭ１１１間のＤＮＡ領域を鋭く指向する。その他の多形態性唾液腺腫細胞系の１２番染色体切断点のＦＩＳＨによる評価は、それらがＡｄ−３１２／ＳＶ４０に近位に８００ｋｂより大きな距離で位置すべきことを示した（クールスら、１９９５年）。これらの結果は、１２番染色体切断点が１２番染色体長腕上の比較的大きなゲノム領域に亘り分散する可能性を指向するものであった。
ここでは、我々は、原発性腫瘍から得た多形態性唾液腺腫細胞及び樹立腫瘍細胞系における１２番染色体切断点の物理的マッピングを報告する。細胞に見られた核型の異常はすべて異なるが、常に１２番染色体のｑ１３−ｑ１５領域に関係する。我々は、６ＭｂＤＮＡ領域の長距離物理的マップにおける配列標識部位（ＳＴＳ）に対応し、染色体歩行実験で得られたＤ１２Ｓ８とＣＨＯＰ間のＤＮＡプローブを使用して、ＦＩＳＨ実験を実施し、多形態性唾液腺腫の大きな１２番染色体切断点クラスター領域をさらに精細に定義した。この切断点クラスター領域は、ＵＬＣＲ１２と重なるようであった。さらに、我々は、脂肪腫の１２ｑ１３−ｑ１５切断点もまた多形態性唾液腺腫及び子宮平滑筋腫のものと同じ領域内に位置するか否かについて試験した。
【０１４３】
材料及び方法
原発性充実性腫瘍及び誘導細胞系
多形態性唾液腺腫、脂肪腫及び子宮平滑筋腫を含む原発性充実性腫瘍は、ベルギー国ルーベン（Ｉ．ド・ウイバー博士）；ドイツ連邦共和国ブレーメン（Ｒ．チリ博士）；ドイツ連邦共和国クレフェルト（Ｊ．ハウプリッヒ博士）の大学診療所；及びスウェーデン国ゲーテボルクの病理学研究所（Ｇ．ステンマン博士）から入手した。細胞培養およびその後のＦＩＳＨ分析のために、腫瘍細胞を微細にみじん切りし、０．８％コラーゲナーゼ（ベーリンガーマンハイムＦＲＧ）で４−６時間処理し、常法によりＦＩＳＨ分析用操作を行った。
この研究に用いたヒト腫瘍細胞系は、既報の多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−２１１／ＳＶ４０、Ａｄ−２４８／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０、Ａｄ−３６６／ＳＶ４０、及びＡｄ−３８６／ＳＶ４０（カズミールチャックら、１９９０年；シェーンメーカーズら、１９９４年ａ）並びに最近開発されたＬｉ−１４／ＳＶ４０を含んでいた。これらの細胞に見られた１２番染色体異常は表１に記載する。細胞は２０％ウシ胎児血清を補充したアール塩含有ＴＣ１９９培地中で増殖させた。
【０１４４】
【０１４５】
ＤＮＡプローブ
我々は、１２番染色体の長腕に焦点を合わせたヒトゲノムプロジェクトに関連して、１２番染色体特異配列コスミドライブラリーＬＩＮＬ１２ＮＣ０１（モンゴメリーら、１９９３年）からコスミドクローンｃＲＭ３３、ｃＲＭ３６、ｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ７２、ｃＲＭ７６、ｃＲＭ９８、ｃＲＭ１０３、及びｃＲＭ１３３を分離した。これらのコスミドの詳細は、第２回国際１２番染色体ワークショップ（１９９４年）で発表し、他の文献に記載する（クチャーラパチら、１９９４年）。概略を述べると、先に報告したように（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）、最初のスクリーニングはＰＣＲベースのスクリーニング法（グリーン及びオルソン、１９９０年）を用いて実施し、その後最終スクリーニング段階としてフィルターハイブリダイゼーション分析を行った。コスミドクローンはＹＡＣクローン由来のＳＴＳ類を用いて分離した。ＳＴＳ類は、ベクトレットＰＣＲを含む方法を用いてＹＡＣ挿入物末端の回収後ＰＣＲ産物の直接固相蛍光配列決定法（ゲーツら、１９９４年）またはＡｌｕ間ＰＣＲ（ネルソンら、１９８９年）を行って得た。コスミドクローンは標準的方法（サムブルックら、１９８９年）により増殖させ処理した。
１２番染色体の長腕テロメア領域に向かって位置するコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒ（クールズら、１９９５年）を参照マーカーに使用した。
【０１４６】
染色体調製及び蛍光系内ハイブリダイゼーション
多形態性唾液腺腫細胞系または正常ヒトリンパ球中期塗抹を、先に報告したように調製した（シェーンメーカーズら、１９９３年）。ＦＩＳＨ実験における染色体の同一性を間違いなく確認するため、同じ中期塗抹のＧＴＧバンド形成後にＦＩＳＨ分析を行った。ＧＴＧバンド形成は、基本的にシュミットら（１９９０年）が報告したように実施した。系内ハイブリダイゼーションは、キービッツら（１９９０年）が報告したプロトコールに従い若干の修正を施して（クールズら、１９９４年；シェーンメーカーら、１９９４年ｂ）行った。コスミド及びＹＡＣのＤＮＡは、先に報告したように（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）ビオチン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム）またはビオチン−１４−ＡＴＰ（ＢＲＬ）で標識した。検体は、ＦＩＴＣフィルター（ツァイス）を用いてツァイスアクシオフォト蛍光顕微鏡で分析した。結果は、スコッチ（３Ｍ）のＡＳＡ６４０フィルムに記録した。
【０１４７】
結果
多形態性唾液腺腫細胞系における１２ｑ切断点のＦＩＳＨマッピング
我々は、先の研究（シェーンメーカーら、１９９４年ａ）において、若干の唾液腺の多形態性アデノームにおける幾つかの１２番染色体切断点を種々のＤＮＡマーカーに関してマッピングし、これらがすべてＤ１２Ｓ８座の近位でＣＨＯＰ遺伝子から遠位に位置することを確認した。この領域は、連結座Ｄ１２Ｓ８及びＤ１２Ｓ１９に包まれる７ｃＭより若干小さい領域である（キーツら、１９８９年）。ＹＡＣクローニングを使用し、最近報告されたようにして（クチャーラパチら、１９９４年）、この７ｃＭ領域の大部分を覆う長距離物理的／ＳＴＳ地図を作図した。さらに、多数のゲノムクローン（コスミドクローン）を分離し、この地図内におけるその相対的位置を確認した（クチャーラパチら、１９９４年）。これらのコスミド中、ｃＲＭ３３、ｃＲＭ３６、ｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ７２、ｃＲＭ７６、ｃＲＭ９８、ｃＲＭ１０３、及びｃＲＭ１３３を含めた９種をＦＩＳＨ研究に使用して、唾液腺の多形態性腺腫に由来する７種の細胞系（表１）における１２番染色体切断点の位置を確認した。約２．８Ｍｂの１２番染色体長腕上ゲノム領域を覆うこれら９種のコスミドクローンの相対的マッピング順位を図１に示し、種々のコスミドプローブによるＦＩＳＨ実験結果を同図に概略的に示す。実例として、ｃＲＭ７６及びｃＲＭ１０３をプローブとして使用しＡｄ−１９５／ＳＶ４０細胞系の中期細胞で得られたＦＩＳＨ結果を図２に示す。染色体の同定については、ＦＩＳＨ前ＧＴＧバンド形成を常に使用したことに注意すべきである。このようなバンド形成に基づき、ハイブリダイゼーションシグナルが既知の存在としての染色体のものとして決定的に帰属決定された。交差及び背景ハイブリダイゼーションシグナルがしばしば観察されるので、これらがある場合このことは大きな重要性をもつ。ハイブリダイゼーションシグナルが弱いかまたは不明確なバンド形成のために、ＧＴＧバンド形成とＦＩＳＨ分析の組み合わせが決定的でない結果をもたらした場合、参照プローブとしてコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒ（クールズら、１９９５年）を用いてＦＩＳＨ分析を実施した。
【０１４８】
ｃＲＭ１０３を用いて行ったた７種の多形態性唾液腺腫細胞系のそれぞれに関する中期染色体のＦＩＳＨ分析は、このコスミドが、ここで実験した７種の細胞系すべての１２番染色体切断点の遠位に位置することを示した。また、７種の細胞系中６種の中期染色体は、プローブｃＲＭ６９で試験し、２つの場合についてはｃＲＭ５１で試験した。後者の実験の結果はすべてｃＲＭ１０３で得た結果と矛盾しなかった。プローブとしてｃＲＭ３６を用いて行った同様なＦＩＳＨ分析は、このプローブがすべての切断点の近位に位置することを示した。これらの結果はすべて、ｃＲＭ７２を用いた実験における７種の細胞系中５種について得た結果と矛盾しなかった。全体として、我々のＦＩＳＨ実験の結果は、７種の細胞系すべてにおける１２番染色体切断点が、約１．７Ｍｂのゲノム領域に広がるｃＲＭ３６及びｃＲＭ１０３間に位置することを示した。
【０１４９】
唾液腺の多形態性アデノーム由来細胞系における１２ｑ切断点の精細マッピング
７種の多形態性唾液腺腫細胞系における１２番染色体切断点の精細マッピングのため、図１に概略を示すように別のＦＩＳＨ実験を行った。細胞系Ａｄ−２１１／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、及びＡｄ−３６６／ＳＶ４０の切断点は、約７５ｋｂと推定されるｃＲＭ７６及びｃＲＭ１３３間のＤＮＡ領域に位置すると思われた。他の４種の細胞系の切断点は、ｃＲＭ３６及びｃＲＭ１０３間の別の１．７Ｍｂ域に見つかった。Ａｄ−２４８／ＳＶ４０細胞系のものはｃＲＭ３３及びｃＲＭ７６間の約２７０ｋｂ断片に、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０細胞系のものはｃＲＭ９８及びｃＲＭ１０３間の約１Ｍｂ断片に、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０細胞系のものはｃＲＭ３３及びｃＲＭ３６間の約２４０ｋｂ断片に、Ａｄ−３８６／ＳＶ４０細胞系のものはｃＲＭ９８及びｃＲＭ１３３間の約１００ｋｂ断片にあった。結論として、これらの結果は、殆ど（７種中５種）の細胞系の１２番染色体切断点が、ｃＲＭ３３及びｃＲＭ９８間の１２番染色体長腕上の４４５ｋｂゲノム領域に亘って分散していることを示した。ここで、正確にこの領域が最近原発性子宮平滑筋腫由来細胞系における染色体１２ｑ切断点を含むことが示され（図３参照）、したがってＵＬＣＲ１２と命名されたこと（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）に注意することが重要である。この１２番染色体長腕断片は少なくとも２種の型の充実性腫瘍に関係し（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ；本研究）、また、下に示すように、第３の充実性腫瘍型に関係しているため、我々は、以下ｃＲＭ３６及びｃＲＭ１０３間のＤＮＡ区間をＭＡＲ（多重異常領域）と称する。
【０１５０】
原発性多形態性唾液腺腫における１２ｑ切断点のＦＩＳＨマッピング
以上に提示した唾液腺の多形態性腺腫中期染色体に関する我々のＦＩＳＨ研究は、原発性腫瘍由来の細胞系に限定されていた。細胞系における１２番染色体切断点が、対応する原発性腫瘍のものと、たとえ同一でないとしても類似はしていると仮定することが合理的ではあるが、細胞系の樹立またはその後の培養の結果相違が出ることは完全には除外できない。したがって、我々は、３種の原発性唾液腺腫における１２番染色体切断点もＭＡＲにマッピングされるか否かについて研究した。この可能性を試験するため、分子プローブとしてコスミドクローンｃＲＭ３３及びｃＲＭ１０３の組み合わせを使用した。３つの場合すべてにおいて、このコスミドプールは１２番染色体切断点に広がったが（データは記載せず）、これはこれらの切断点が実際にＭＡＲに局在することを示す。最近の研究（バンシュラら、投稿中）において、１２ｑ１４−１５異常をもつ５種の原発性子宮平滑筋腫の１２番染色体切断点が、すべて原発性子宮平滑筋腫由来の種々の細胞系の切断点を含むことが知られている１．５ＭｂＤＮＡ断片内のクラスターに見出されることが報告された（図３に概略を示す）。細胞系を使用した切断点マッピング研究の結果と一致して、２種の原発性充実性腫瘍型で得た結果から、原発性腫瘍細胞の切断点がＭＡＲに位置することが確認された。
【０１５１】
脂肪腫染色体断片１２ｑ１３−ｑ１５切断点のＭＡＲ内マッピング
１２ｑ１３−ｑ１５異常をもつ他の充実性腫瘍の１２番染色体切断点もまたＭＡＲ内に位置する可能性を試験するため、我々は、２種の脂肪腫細胞系−−−Ｌｉ−１４／ＳＶ４０およびＬｉ５３８／ＳＶ４０についてＦＩＳＨ分析により実験した。これら２種の１２番染色体異常を表１に示す。分子プローブとして、コスミドクローンｃＲＭ３３、ｃＲＭ５３、ｃＲＭ７２、ｃＲＭ７６、ｃＲＭ９９、ｃＲＭ１０３、及びｃＲＭ１３３を使用した。図３に略図を示すように、Ｌｉ−１４／ＳＶ４０の切断点は、ＲＭ７６及びＲＭ１３３間の７５ｋｂＤＮＡ区間にマッピングされ、Ｌｉ５３８／ＳＶ４０のそれは、ＲＭ７６及びＲＭ９９間の９０ｋｂｐ区間にマッピングされた（データは記載せず）。分子プローブとしてｃＲＭ３６及びｃＲＭ１０３を用いて行った２種の原発性脂肪腫のＦＩＳＨ分析は、ハイブリダイゼーションパターンをもたらしたが、これはプローブ混合物が切断点の両側の配列を検出したことを示す。これらの結果は、脂肪腫においても、ＭＡＲ内に位置する染色体１２ｑ１３−ｑ１５切断点が存在することの最初の徴候である。この観察に関する適当な説明を可能にするためには、さらに脂肪腫の事例について試験する必要がある。
【０１５２】
検討
我々は、この研究において、３種の原発性多形態性唾液腺腫及びこの腫瘍から由来した７種の樹立細胞系における１２番染色体の切断点をマッピングした。すべての切断点は、先に分子クローニングし確認された、約１．７Ｍｂの大きさの、１２番染色体の長腕上の染色体ＤＮＡ断片内に位置するようであり、そのうち５種は、５００ｋｂ未満のＤＮＡ区間に密集していた。１．７ＭｂＤＮＡ領域は、明らかにこの型の腫瘍の大きな切断点クラスター領域を含んでいた。我々は、先の研究において、多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０における１２番染色体切断点の確認を報告した（クールズら、１９９５年）。この細胞系の切断点は、現在ここに報告された大きな切断点クラスターから遠位に２Ｍｂより大きな距離に位置することが知られている。Ａｄ−３１２／ＳＶ４０切断点が、群がった切断点の影響を受けたもの以外の病原的に関係がある遺伝子配列を含む可能性がある。しかし、Ｂ細胞悪性腫瘍における１１ｑ１３切断点が想起されるように（レイノードら、１９９３年）、今までマッピングされた多形態性唾液腺腫における１２ｑ１３−ｑ１５切断点のすべてが同じカテゴリーに属し、この染色体の比較的大きなＤＮＡ領域に亘って分散する可能性もまだ排除されるべきでない。種々の切断点に関するさらに精細な指摘により、これに対してさらに光を注ぐことができるであろう。
【０１５３】
多形態性唾液腺腫の群がった１２ｑ切断点を含むＤＮＡ断片が、最近ＵＬＣＲ１２として知られる（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）１２番染色体切断点の子宮平滑筋種クラスター領域として定義されたＤＮＡ領域と一致するとの観察結果は重要である。この１２番染色体領域が、原発性脂肪腫及び１２ｑ１３−ｑ１５異常をもつ原発性腫瘍に由来する脂肪腫細胞系の切断点をも含むことにはさらに興味がある。全体として、すべてのこれらの研究の結果は、ここに、３種の明確な充実性腫瘍型における１２番染色体切断点が同じ１２番染色体長腕上の１．７Ｍｂゲノム領域に位置することを明らかに示すが、これは、この領域が多重異常領域であることを確認するものである。この特徴を反映するため、我々は、このＤＮＡ断片をＭＡＲと命名した。
【０１５４】
染色体領域１２ｑ１３−１５が関係する遺伝子異常は、既述の３種以外の種々の充実性腫瘍における細胞遺伝学的研究に関係がある。１２ｑ１３−ｑ１５の関係は、子宮内膜ポリープ（ウオルターら、１９８９年；バニら、１９９３年）、再発性ｔ（１２；２２）（ｑ１３；ｑ１３）を特徴とする明細胞肉腫（フレッチャー、１９９２年；リーブスら、１９９２年；ロドリゲスら、１９９２年）、横紋筋肉腫亜群（ロバーツら、１９９２年）および血管外皮腫（マンダールら、１９９３年ｂ）軟骨腫様腫瘍（マンダールら、１９８９年；ブリッジら、１９９２年；ヒラバヤシら、１９９２年；マンダールら、１９９３年ｂ）、及び肺過誤腫（ダル・チンら、１９９３年）についても報告された。最後に、染色体領域１２ｑ１３−ｑ１５が関与する充実性腫瘍の若干の事例の報告が発表された−−−例えば、乳腫瘍（バードサルら、１９９２年；ローエンら、１９９３年）、散在性星状細胞腫（ジェンキンスら、１９８９年）、及び骨巨細胞腫（ノゲラら、１９８９年）。細胞遺伝学的研究の結果に基づいても、これらの腫瘍型の相対的切断点分布に関して全く予言はできない。本研究の結果に照らすと、これらの充実性腫瘍の何れかにおける切断点がＭＡＲ内または近傍に位置するか否かを知ることには興味があるであろう。入手できる種々のコスミドクローンが今これを容易に試験する手段を提供する。
【０１５５】
少なくとも３種の異なる型の充実性腫瘍における１２ｑ切断点が同じＤＮＡ領域に位置するという観察結果は、それが、ＭＡＲ内の同じ遺伝子配列が種々の組織における腫瘍の発生に病因的に関係する可能性を指向し得るため、興味がそそられる。もしそうならば、遺伝子異常を含む遺伝子（類）は成長の調節に関係するかも知れないということを考えることができる。他方、観察されたＭＡＲ内遺伝子異常の群がりは、単に、種々の充実性腫瘍で明らかになるこの領域内の遺伝子の不安定性を反映しているという理由から、ＭＡＲの遺伝子配列が病因的に関係しない可能性もまだ除外することができない。これに対するより多くの洞察を得るためには、ＭＡＲ内に存在する遺伝子を同定確認することが必要であり、これは若干の技術を用いた種々の方法で達成することができる（パリッシュ及びネルソン、１９９３年）。
【０１５６】
謝辞
常務取締役Ｇ．エベラーッの組織上の支持に感謝する。著者は、本報で研究した充実性腫瘍の検体提供について、Ｐ．ダル・チン、Ｊ．ハウプリッヒ、Ｒ．ヒル、Ｇ．ステンマン及びＩ．ド・ウエーバーに対し；優れた技術的補助につきＣ．ハイスマンス、Ｅ．マイアン、Ｋ．マイアーボルト、Ｒ．モルス及びＭ．ウイレムスに対し；図版につきＭ．レイスに対し感謝する。本研究は、ドイチェ・フォルシュングスミッテルシャフト及びテンイェス−ファクト・スティフトゥンクのバイオメド１プログラム「モレキュラー・サイトジェネティックス・オブ・ソリッド・テュマー」、「ヘコンセルテールデ・オンデルゼカクティース１９９２−１９９６」、ザ・ナショナル・ファンド・フォー・サイエンティフィック・リサーチ（ＮＦＷＯ；コム・オプ・テーヘン・カンカー）、「ＡＬＳＫ−プログラマ・フォール・カンケロンデルゼク」、「シュベルプンクトプログラム：モレクラーレ・ウント・クラシッシェ・テュモルチトゲンエティク」を通してＥＣにより一部支援された。本書は、ベルジアン・ステート、プライム・ミニスターズ・オフィス、サイエンス・ポリシー・プログラミングにより提出されたベルジアン・プログラム・オン・インターユニバーシティ・ポールズ・オブ・アトラクションの結果を提示するものである。科学的信頼性は著者が責任を負う。Ｊ．Ｗ．Ｍ．ゲーツはザ・ナショナル・ファンド・フォー・サイエンティフィック・リサーチ（ＮＦＷＯ；コム・オプ・テーヘン・カンカー）の「アスピラント」である。
【０１５７】
文献
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
付属文書１の図の説明
図１．この研究で試験した７種の多形態性唾液腺腫細胞系について得られたＦＩＳＨマッピングデータの略図。ＦＩＳＨマッピング研究でプローブとして用いたコスミドクローンは、重複ＹＡＣクローンで得られた配列標識部位に位置する。これらは、枠内に示すように、ＳＴＳの頭文字にしたがって命名され、その相対的順位は図示のようである。ＲＭ６９とＲＭ７２間のＤＮＡ区間は約２．８Ｍｂと推定される。実線は、種々の細胞系の切断点が位置するＤＮＡ区間を示す。点線は、分子プローブとして上記のＳＴＳに対応するコスミドクローンを用いて種々の細胞系の中期染色体に実施したＦＩＳＨ実験を示す。ＭＡＲ及びＵＬＣＲ１２の相対的位置は図の下部に示す。Ａｄ：多形態性唾液腺腫、ＭＡＲ：多重異常領域、ＵＬＣＲ１２：１２番染色体切断点の子宮平滑筋腫クラスター領域。
【０１６４】
図２．a:ｄｅｒ（８）、ｄｅｒ（１２）、ｄｅｒ（１８）及び対応する正常染色体を示すＡｄ−２９５／ＳＶ４０の部分的核型。ｂ：分子プローブとしてコスミドクローンｃＲＭ７６のＤＮＡを用いたＡｄ−２９５／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析。１２番正常染色体（矢印）及びｄｅｒ（１２）（矢頭）のハイブリダイゼーションシグナル。ｃ：ｂに示したＡｄ−２９５／ＳＶ４０中期染色体のＧＴＧ−バンド形成パターン。ｄ：分子プローブとしてコスミドクローンｃＲＭ１０３のＤＮＡを用いたＡｄ−２９５／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析。１２番正常染色体（矢印）及びdｅｒ（１８）（矢頭）のハイブリダイゼーションシグナル。
【０１６５】
図３．原発性多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫及び脂肪腫並びにこれら充実性腫瘍に由来する細胞系について得られた１２番染色体マッピングデータの略図。結果は、原発性子宮平滑筋腫（バンシュラら、投稿中）及びこれらの腫瘍由来の細胞系（シェーンメーカーら、１９９４年ｂ）に対するデーダと比較して示す。ＦＩＳＨマッピング研究に用いたコスミドクローンは重複ＹＡＣクローンから得られた配列標識部位に対応する。コスミドクローンは、枠内に示すように、ＳＴＳの頭文字にしたがって命名され、その相対的順位は図示のようである。ＳＴＳ間のＤＮＡ区間の推定サイズは図に示す。Ａｄ：多形態性唾液腺腫、Ｌｉ：脂肪腫、ＬＭ：子宮平滑筋腫。
【０１６６】
付属文書２
【０１６７】
要約：ｔ（１；１２）（ｐ２２；ｑ１５）をもつ原発性多形態性唾液腺腫由来の細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０を、蛍光系内ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）で使用して、その１２番染色体上の転座切断点を確認した。先の研究結果によると、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体切断点は、Ｄ１２Ｓ８座の近位でＣＨＯＰ遺伝子の遠位に位置している。ここでは、我々は、我々がＤ１２Ｓ８及びＣＨＯＰを出発点とする染色体歩行プロジェクトに関係して分離した２種の部分的重複酵母人工染色体（ＹＡＣ）クローンＹ４８５４（５００ｋｂｐ）及びＹ９０９１（４６０ｋｂｐ）を報告する。ついで、我々は、これらＹＡＣクローンの挿入物内に位置する種々の配列標識部位（ＳＴＳ類）に対応するコスミドクローンを分離した。これらは、ｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ８５、ｃＲＭ９０、ｃＲＭ９１、ｃＲＭ１１０、およびｃＲＭ１１１を含むものであった。
我々は、これら２種のＹＡＣクローンの挿入物を包含する複合長距離制限地図を提示し、ＦＩＳＨ分析により、両ＹＡＣがＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞に存在する１２番染色体切断点にまたがることを示す。ＦＩＳＨ研究では、コスミドクローンｃＲＭ８５、ｃＲＭ９０及びｃＲＭ１１１は１２番染色体切断点の遠位に位置すると思われたが、他方コスミドクローンｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ９１及びｃＲＭ１１０はその近位に位置することが見出された。これらの結果から、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体切断点は１６５ｋｂｐより小さいＤＮＡ領域に帰属される。他の５種の多形態性唾液腺腫細胞系１２番染色体切断点のＦＩＳＨ分析の評価は、これらがＳＴＳ ＲＭ９１から０．９Ｍｂより大きな距離でＡｄ−３１２／ＳＶ４０のものの近位に位置することを示した。これらの結果は、１２番染色体上の重要と思われる領域を指向するものであるが、また他の場所に位置する染色体１２ｑ１３−ｑ１５配列が関与する可能性に関する証拠をも提供するものである。
【０１６８】
緒論
多形態性唾液腺腫は、大及び小唾液腺から由来する良性上皮性腫瘍の構成要素である。これは最も一般的な型の唾液腺腫であり、この器官の全新生物中のほぼ５０％を説明する。腫瘍の約８５％は耳下腺に見られ、１０％は小唾液腺に、５％は顎下腺に見られる［１］。これらアデノームの約５０％は正常な核型をもつようであるが、細胞遺伝学的研究は、頻発する特異的染色体異常を明らかにした［２，３］。頻繁に見られる異常は、通常８ｑ１２−ｑ１３領域が関係する８番染色体の異常、最も一般的な異常であるｔ（３；８）（ｐ２１；ｑ１２）及び通常１２ｑ１３−ｑ１５が関係する転座である１２番染色体の異常を含む。非頻発性のクローン性染色体異常も報告されている。一貫して８ｑ１２−ｑ１３及び１２ｑ１３−ｑ１５切断点をもつ染色体再編成の高度に特異的なパターンは、この染色体領域が、これらの腫瘍の発生と関係を持つ可能性がある遺伝子類を宿していることを示唆する。染色体切断点の分子クローニング及び接合フラグメントの確認は、病原的に関係がある遺伝子類の同定に通ずる可能性がある。現在、これらの腫瘍に関してこのような分子データはまだ報告されていない。
蛍光系内ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）データに基づいて、最近、６種の多形態性唾液腺腫細胞系の１２番染色体切断点が、１２ｑ１３−ｑ１５領域、さらに詳細にはＤ１２Ｓ１９とＤ１２Ｓ８間のゲノム区間にマッピングされることが示された［４，５］。このゲノムＤＮＡ区間の性平均遺伝子サイズは、ＨＧＭ１０において７ｃＭであると報告された［６］。また我々は、多形態性唾液腺腫の１２番染色体切断点がＣＨＯＰ遺伝子の遠位に位置すると報告したが、これは、唾液腺腫の１２ｑ１３−ｑ１５転座切断点が粘液腫様脂肪肉腫のそれと異なることを示す以前の研究を支持する［７］。本報では、我々は、唯一の細胞遺伝学的異常としてｔ（１；１２）（ｐ２２；ｑ１５）を有する多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０における１２番染色体切断点の物理的マッピングについて報告する。
【０１６９】
材料及び方法
腫瘍細胞系
この研究に用いたヒト腫瘍細胞系は、既報の多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−２４８／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０、及びＡｄ−３６６／ＳＶ４０［５，８］を含んでいる。細胞は２０％ウシ胎児血清を補充したアール塩含有ＴＣ１９９培地中で増殖させた。この研究に用いたその他の細胞系としては、ハムスターの遺伝背景中に唯一のヒト染色体として１２番染色体を含む体細胞雑種ＰＫ８９−１２［９］及び体細胞雑種ＬＩＳ−３／ＳＶＢ４０／Ａ９−Ｂ４［４］を含んでいる。後者の細胞系は、特異的ｔ（１２；１６）（ｑ１３；ｐ１１．２）を有する粘液腫様脂肪肉腫細胞系ＬＩＳ−３／ＳＶ４０とマウスＡ９細胞の融合で得られた。この体細胞雑種は、先にｄｅｒ（１６）を含むことが示されているが、ｄｅｒ（１２）も正常な１２番染色体も含まない［４］。ＰＫ８９−１２及びＬＩＳ−３／ＳＶＢ４０／Ａ９−Ｂ４細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＡ−Ｆ１２培地で増殖させた。細胞系は、標準的細胞遺伝学的技術により規則的な間隔をおいて分析した。
【０１７０】
ＹＡＣ及びコスミドクローンの分離
我々は、詳細を他の場所で報告する（シェーンメーカーズら、準備中）ヒトゲノムマッピング研究に関連して、第１世代ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリー［１０］からＹＡＣクローンＹ４８５４及びＹ９０９１を分離し、１２番染色体特異配列コスミドライブラリーＬＩＮＬＮＣ０１［１１］からコスミドクローンｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ８５、ｃＲＭ９０、ｃＲＭ９１、ｃＲＭ１０３、ｃＲＭ１１０、及びｃＲＭ１１１を分離した。ＹＡＣ及びコスミドクローンは、既報のように分離した［５］。ＹＡＣ及びコスミドライブラリーの最初のスクリーニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むスクリーニング法［１２］を用いて実施した。最終スクリーニング段階として、既報［５］のようにフィルターハイブリダイゼーション分析を使用した。コスミドクローンはＳＴＳ類を用いて分離し、ＹＡＣクローンＹ４８５４及びＹ９０９１の挿入物内のＳＴＳ類に対応するものは、図１に示す。ＳＴＳ類は、ベクトレットＰＣＲ［１３］またはＡｌｕ−ＰＣＲ［１４，１５］を用いてＹＡＣ挿入物末端の回収後に得た。ＰＣＲ産物は、直接固相蛍光配列決定法により配列決定した。コスミドクローンは標準的方法［１６］により増殖させ処理した。ＹＡＣクローンは、既報［５］のように、パルスフィールドゲル電気泳動［１７］、制限地図作製及びハイブリダイゼーションにより確認した。
【０１７１】
染色体調製及び蛍光系内ハイブリダイゼーション
多形態性唾液腺腫腫瘍細胞系は、コルセミド（０.０４μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、次いで常法により採取した。腫瘍細胞の中期塗抹は、既報［４］のように調製した。ＦＩＳＨ実験における染色体の同一性を確認するため、同じ中期塗抹のＧバンド形成後にＦＩＳＨ分析を行った。Ｇバンド形成は、基本的にシュミットら［１８］が報告したように実施した。系内ハイブリダイゼーションは、キービッツら［１９］が報告したプロトコールに従い若干の小修正を施して［５，２０］行った。コスミド及びＹＡＣのＤＮＡは、先に報告したように［５］ビオチン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム）またはビオチン−１４−ＡＴＰ（ＢＲＬ、ゲザースバーグ）で標識した。染色体は、よう化プロピディウムで対比染色後、ＦＩＴＣフィルター（ツァイス）を用いてツァイスアクシオフォト蛍光顕微鏡で分析した。結果は、スコッチ（３Ｍ）のＡＳＡ６４０フィルムに記録した。
【０１７２】
結果
多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０における１２番染色体切断点にまたがるＹＡＣクローンの分離と確認
我々は、先の研究［５］において、Ｄ１２Ｓ８座の近位でＣＨＯＰの遠位にある６種の多形態性唾液腺腫細胞系１２番染色体切断点をマッピングした。これらの座間のＤＮＡ区間は７ｃＭより若干小さかったが（Ｄ１２Ｓ８とＤ１２Ｓ１９座間の推定距離［６］）、それでも本質的に大きかった。Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の転座切断点を分子的に明確にするため、我々は、Ｄ１２Ｓ８座とＣＨＯＰ遺伝子間のＤＮＡ区間についてヒトゲノムマッピング実験を行った。Ｄ１２Ｓ８とＣＨＯＰ遺伝子から出発する直接染色体歩行法において、我々は、重複ＹＡＣクローンＹ９０９１及びＹ４８５４を得た。Ｙ９０９１のＤＮＡ挿入物は４６０ｋｂｐであり、Ｙ４８５４のそれは５００ｋｂｐであると思われた。さらに、下に示すように、ＹＡＣクローンのＤＮＡ挿入物は、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体切断点にまたがるようであった。これらＹＡＣクローン類の挿入物の長距離制限地図を、パルスフィールドゲル電気泳動とハイブリダイゼーション分析を用いて作成した（図１）。ＳＴＳ含量マッピング及びサザンブロット分析に基づくと、ＹＡＣクローンＹ９０９１及びＹ４８５４の挿入物は図１に示すように重複するようであった。試験したＳＴＳ類は、ここに記載しない他の重複ＹＡＣクローンの末端配列またはＡｌｕ間ＰＣＲにより得られた配列に対応する。これらの中、ＲＭ９０及びＲＭ９１はこのＹＡＣ Ｙ９０９１末端ＳＴＳ類を表し、ＲＭ１１０及びＲＭ１１１はＡｌｕ間ＰＣＲ由来ＳＴＳ類を表す。ＹＡＣクローンＹ４８５４とＹ９０９１挿入物内にマッピングする幾つかのＳＴＳ類について、対応コスミドをＦＩＳＨ分析に使用するために分離したが、その例は、ｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ８５、ｃＲＭ９０、ｃＲＭ９１、ｃＲＭ１１０、及びｃＲＭ１１１である。
【０１７３】
２種の重複するＹＡＣクローンの挿入物は、以下の観察から推論されるように、全くキメラとは思われない。Ｙ４８５４またはＹ９０９１を分子プローブとする正常ヒトリンパ球中期染色体のＦＩＳＨ分析は、染色体領域１２ｑ１３−ｑ１５でのみハイブリダイゼーションシグナルを示した。Ｙ９０９１については、これはさらにコスミドクローンｃＲＭ９０またはｃＲＭ９１をプローブとするＦＩＳＨ実験での観察により確認された。これら２種のコスミドそれぞれにおけるＤＮＡ挿入物は、もう一つのＹＡＣクローンＹ９０９１末端配列に対応する。最後に、ハムスター遺伝子背景中における唯一のヒト染色体としてヒト１２番染色体を含むＰＫ８９−１２、及び粘液腫様脂肪肉腫の特異的ｔ（１２；１６）からのｄｅｒ（１６）を含むがｄｅｒ（１２）も正常１２番染色体も含まないことが前に示されているＬＩＳ−３／ＳＶ４０／Ａ９−Ｂ４［４］に対するＰＣＲ分析で確認されたように、Ｙ９０９１の末端配列ＳＴＳ類は、１２番染色体上で、ＣＨＯＰ遺伝子の遠位に位置するようであった。染色体歩行実験から、我々は、２種のＹＡＣクローンの重複挿入物が、染色体１２ｑ上でＤ１２Ｓ８とＣＨＯＰ間に位置する約６４０ｋｂｐのＤＮＡ領域を表すと結論した。ＹＡＣ整列群の６４０ｋｂｐ複合体長距離制限地図は少なくとも全領域を２重にカバーして構成されているので、この点での微小欠失は排除できないけれども、６４０ｋｂｐ領域が染色体ＤＮＡと連続すると仮定するのは合理的でない。
【０１７４】
染色体歩行は、常にＹＡＣクローン及び／またはＹＡＣ挿入物配列に対応するコスミドクローンのＦＩＳＨマッピングにより調べた。染色体の同定については、殆どの場合Ｇ−バンド形成を使用したことに注意すべきである。このＧ−バンド形成に基づき、ハイブリダイゼーションシグナルが既知の存在としての染色体のものとして最終的に帰属決定された。これは、時に観察される交差及び背景ハイブリダイゼーションシグナルをもつ場合に重要である。時にＦＩＳＨ分析前のＧ−バンド形成が弱いハイブリダイゼーションシグナルまたは不明確なバンドパターンをもたらした。したがって、我々は、調べるべきＹＡＣ及びコスミドクローンを参照プローブと組み合わせて使用するＦＩＳＨ実験を行った。コスミドライブリーのスクリーニング中に幸運に得られたコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒを、参照マーカーとして選択した。正常リンパ球中期染色体のＦＩＳＨ分析（図２Ａ）は、ｃＰＫ１２ｑｔｅｒが１２番染色体の長腕テロメア領域に位置することを明らかにした。この実験における１２番染色体を同定するため、１２番動原体特異的プローブｐα１２Ｈ８［２１］を使用した。ＹＡＣクローンＹ４８５４（図２Ｂ）またはＹ９０９１（図２Ｃ）を参照プローブｃＰＫ１２ｑｔｅｒと組み合わせて用いるＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析は、何れの場合にも、ｄｅｒ（１）及びｄｅｒ（１２）上のＹＡＣ挿入物のハイブリダイゼーションシグナルを示した。これらの結果から、我々は、各ＹＡＣクローンの挿入物ＤＮＡがこの細胞系の１２番染色体切断点にまたがると結論した。Ｇバンド形成が、図２Ｃにおける１２番染色体短腕が関与するテロメア会合を明らかにしたことに注意すべきである。ＹＡＣクローンＹ９０９１がＡｄ−３１２／ＳＶ４０における１２番染色体切断点にまたがるという観察結果が、コスミドクローンｃＲＭ９０またはｃＲＭ９１を分子プローブとするＦＩＳＨ実験で独立に確認された。それらは、別のＹ９０９１末端配列を含むことが示された。ｃＲＭ９０は、１２番染色体切断点の遠位に位置するようであり、ｃＲＭ９１は近位に位置することがわかった（データは記載せず）。これらの結果から、また図１に示すＹＡＣ整列群の染色体上の配向をも確認した。要約すると、我々は、これらのＦＩＳＨ実験から、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体転座切断点が２種のＹＡＣクローンの重複配列（約３００ｋｂｐ）に対応するＤＮＡ区間に位置すべきと結論した。
【０１７５】
Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体転座切断点の精細マッピング
Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体転座切断点をさらに狭める方法として、ＹＡＣクローンＹ９０９１内に異なるマッピング位置をもつコスミドクローンを分離した。これらは、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ８５、ｃＲＭ１１０、及びｃＲＭ１１１を含む。ｃＲＭ６５及びｃＲＭ８５は、ここに記載しないＹＡＣクローンのＳＴＳ配列に基づいて分離した。ｃＲＭ１１０及びｃＲＭ１１１は、Ａｌｕ間ＰＣＲを経て得られた。ｃＲＭ１１０は、サザンブロット分析で、テロメア末端配列としてのＲＭ６９をもつ重複ＹＡＣクローンのＤＮＡ挿入物ではなく、Ｙ９０９１の末端ＭｌｕＩ断片にハイブリダイズすることが示された。ＲＭ１１０の位置は図１に示すとおりである。ＲＭ１１１は、Ｙ９０９１のＢｓｓＨＩＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩ及びＳｆｉＩ断片にハイブリダイズすることが示され、したがってＳＴＳＲＭ４８もまた位置するＹ９０９１のＰｖｕＩ−ＳｆｉＩ断片内に位置する（図１）。ｃＲＭ６９またはｃＲＭ１１０をプローブとするＡｄ３１２／ＳＶ４０中期染色体のＦＩＳＨ分析は、図３ＡでｃＲＭ６９について示すように、これらコスミドのＤＮＡ挿入物がこの細胞系の１２番染色体転座切断点の近位に位置することを示した。続いて行ったｃＲＭ８５またはｃＲＭ１１１をプローブとするＡｄ−３１２／ＳＶ４０のＦＩＳＨ分析は、図３ＢでｃＲＭ１１１について示すように、転座切断点の遠位にハイブリダイゼーションシグナルを示した。ｃＲＭ８５及びｃＲＭ１１１による結果は、ＹＡＣクローンＹ４８５４のテロメア末端をマークするＳＴＳ ＲＭ４８の遠位にｃＲＭ８５が位置し近くにｃＲＭ１１１が位置するので、ＹＡＣクローンＹ４８５４により観察された切断点の広がりと一致している。結論として、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体転座切断点は、図４に略示するように、ｃＲＭ１１０とｃＲＭ１１１間のＤＮＡ区間に位置するはずである。
【０１７６】
その他の多形態性唾液腺腫細胞系における１２番染色体切断点のＦＩＳＨ評価
Ａｄ−３１２／ＳＶ４０との関係で１２番染色体切断点の位置を決定するため、図４に略示するように、５種の他の多形態性唾液腺腫細胞系をＦＩＳＨ分析により調べた。原発性腫瘍から開発した［５，８］これらの細胞系は、Ａｄ−２４８／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０およびＡｄ−３６６／ＳＶ４０を含むものであった。これらの細胞系の染色体異常を図４に示す。ｃＲＭ９１を用いたこれらの細胞系中期染色体のＦＩＳＨ分析は、これらの細胞系すべての１２番染色体切断点がこのコスミドクローンの近位に位置することを示した（データは記載せず）。同様なＦＩＳＨ分析を、プローブとして配列標識部位ＲＭ１０３に対応するコスミドクローンを用いて行った。ＲＭ１０３は、ＲＭ９１の近位に約０．９Ｍｂｐの距離で位置することがわかった。全ての場合に、ｃＲＭ１０３は１２番染色体転座切断点の遠位に位置するようであり、このことは、これら５種の多形態性唾液腺腫細胞系における１２番染色体切断点が、Ａｄ３１２／ＳＶ４０のそれから比較的大きな距離で位置することを示す。
【０１７７】
検討
ここに提示する研究において、我々は、多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の転座切断点が位置すると思われる１２番染色体長椀上の、分子クローンされ確認された染色体領域を同定した。先の研究［５］において、我々は、既にこの細胞系の１２番染色体切断点がＤ１２Ｓ８とＣＨＯＰ間に位置することの証拠を提出した。ここに記載する２種の切断点に拡がるＹＡＣクローンは、最初の出発点としてＤ１２Ｓ８及びＣＨＯＰ遺伝子を用いる指向性染色体歩行実験で得られたので、ここに提出する１２番染色体切断点マッピング結果は先に示した我々の主張を確認した。分子プローブとしてＹ９０９１の完全ＹＡＣ挿入物を用いて得たＦＩＳＨ結果は、独立に、このＹＡＣクローンの挿入物の種々の領域に対応する配列を含むコスミドクローンを用いたＦＩＳＨ実験で確認された。独立の確認結果は、Ｙ９０９１完全挿入物で見られる分裂シグナルが、ＹＡＣに示される配列の実際の分裂以外のもので説明できる可能性を減らすので、このことは重要である。例えば、染色体切断点の両側にある関連性が高い遺伝子配列は、もしＹＡＣ挿入物のＦＩＳＨ結果のみに基づくならば容易に誤った結論に導くであろう。最後に、我々のマッピング実験はまた、この研究で我々が作り出した長距離制限地図の染色体配向を決定的に確認するものであった。この配向は、２色ＦＩＳＨ実験（未公表の観察結果）に基づいて既に予想されていたものである。
【０１７８】
ここに記載するＦＩＳＨ実験により、我々は、Ａｄ３１２−／ＳＶ４０細胞における１２番染色体切断点を、確認されているＳＴＳ ＲＭ４８とＲＭ６９間の１９０ｋｂｐｄ区間にマッピングするのが可能になった。しかし、切断点領域は、以下に基づいてさらに若干狭めることができる。Ｙ４８５４が切断点にまたがることが示されたということは、少なくともこのＹＡＣクローンのテロメア半片のかなりの部分が切断点の遠位に位置べきことを示している。精細に確認されていないことがまだ多く残存する。他方、ＳＴＳ ＲＭ６９は、コスミドクローンｃＲＭ６９ＤＮＡ挿入物のほぼ中央に位置すると思われ、これは切断点がＲＭ６９のほぼ２５ｋｐｂ遠位にあることを示唆する。さらに、ｃＲＭ６９はＲＭ１１０を欠くと思われ（データは記載せず）、ｃＲＭ１１０はＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞の１２番染色体切断点の近位に見られるので、切断点は先に述べた２５ｋｂｐよりもさらにＲＭ６９の遠位にあるべきである。全体的に見て、このことは１２番染色体切断点領域を、１６５ｋｂｐよりかなり小さくあるべきＤＮＡ区間に狭める。さらに、切断点へ鋭く指向することにより、我々が、１２番染色体を分子クローニングし、病理学的に関係がある配列の同定を導く可能性がある切断点結合領域の遺伝子配列を確認することができた。配列決定、直接ハイブリダイゼーション、直接選択またはエクソントラッピングによるＹＡＣクローンＹ４８５４及びＹ９０９１ＤＮＡ挿入物内遺伝子の同定は、多形態性唾液腺腫の腫瘍化に病理学的に必要である可能性があるこの１２番染色体長腕領域内の遺伝子の同定のための別の有用な方法をなす可能性がある。
【０１７９】
他の多形態性唾液腺腫における１２番染色体切断点が、１２番染色体長腕上の、離れた、より近位の領域に位置するという観察には、興味がそそられる。これは、多形態性唾液腺腫における１２番染色体切断点が、Ｂ細胞悪性腫瘍における１１ｑ１３切断点［２２］を思わせるような、１２番染色体長腕の比較的大きなＤＮＡ領域に亘って分散することを示唆する可能性がある。他の多形態性唾液腺腫細胞系における１２番染色体切断点の精細な解明がこの問題にさらに光を注ぐ可能性がある。他方、それは、重要であるかも知れない、おそらく多形態性唾液腺腫の成長調節のような、１２番染色体長腕上の別の配列を指向する可能性がある。ここに記載する１２番染色体切断点領域が今までＡｄ−３１２細胞系でしか見つかっていないということは、染色体の１２ｑ１３−ｑ１５異常をもつ多数の唾液腺腫を分析して、研究した細胞系に対する１２番染色体配列の影響が腫瘍形成と関連性をもつ可能性を検討する必要を生じさせるものである。もしこの１２番染色体の特定領域の異常が多くの事例に見つかるならば、これらの腫瘍が臨床的に亜群を形成するかどうかを知ることに興味がそそられる。最後に、ヒト１２番染色体のｑ１３−ｑ１５領域が関係する染色体転座は他の種々の充実性腫瘍：良性脂肪組織腫、子宮平滑筋腫、横紋筋肉腫、血管外皮腫、明細胞肉腫、軟骨腫様腫瘍及び肺過誤腫について報告されている。これらの腫瘍の幾つかにおいて１２番染色体切断点がＡｄ−３１２／ＳＶ４０のそれと同一領域内に位置するか否かについてはまだ確認されていない。本報告に記載したＹＡＣ及びコスミドクローンはこれを研究するための有用な手段を構成する。
【０１８０】
第１世代ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリー［１０］の複製及び配置１２番染色体特異的コスミドライブラリー（ＬＩＮＬ１２ＮＣ０１）［１１］の複写の入手につき深く感謝する。コスミドライブラリーは、契約番号Ｗ−７４０５−Ｅｎｇ−４８のアメリカエネルギー省ＬＬＮＬの援助下のナショナル・ラボラトリー・ジーン・ライブラリー・プロジェクトの一部として構築された。著者は、優れた技術的補助につきＭ．ドヘイン、Ｃ．ハイスマンス、Ｅ．マイアン、Ｋ．マイアーボルト及びＭ．ウイレムスに対し感謝し、図版につきＭ．レイスに対し感謝する。本研究は、ドイチェ・フォルシュングスミッテルシャフト及びテンイェス−ファクト・スティフトゥンクのバイオメド１プログラム「モレキュラー・サイトジェネティックス・オブ・ソリッド・テュマー」、「ヘコンセルテールデ・オンデルゼカクティース１９９２−１９９６」、ザ・ナショナル・ファンド・フォー・サイエンティフィック・リサーチ（ＮＦＷＯ；コム・オプ・テーヘン・カンカー）、「ＡＬＳＫ−プログラマ・フォール・カンケロンデルゼク」、「シュベルプンクトプログラム：モレクラーレ・ウント・クラシッシェ・テュモルチトゲンエティク」を通してＥＣにより一部支援された。本書は、ベルジアン・ステート、プライム・ミニスターズ・オフィス、サイエンス・ポリシー・プログラミングにより提出されたベルジアン・プログラム・オン・インターユニバーシティ・ポールズ・オブ・アトラクションの結果を提示するものである。科学的信頼性は著者が責任を負う。Ｊ．Ｗ．Ｍ．ゲーツはザ・ナショナル・ファンド・フォー・サイエンティフィック・リサーチ（ＮＦＷＯ；コム・オブ・テーヘン・カンカー）の「アスピラント」である。
【０１８１】
文献
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
付属文書２の図の説明
図１．ＹＡＣクローンＹ４８５４及びＹ９０９１の重複ＤＮＡ挿入物の複合物理的地図。ＹＡＣクローンの相対的位置は、長距離物理的地図の下の横線により示す。ここに記載しないＹＡＣを含めたＹＡＣ類の末端クローンに対応する配列標識部位（ＳＴＳ類）は、制限地図上のに枠内ＲＭコードにより示す。Ａｌｕ間ＰＣＲ産物から得られたＳＴＳ類は制限地図の下に示し、そのマッピングに対するＤＮＡ領域は矢印で示す。Ｂ：ＢｓｓＨＩＩ；Ｍ：ＭｌｕＩ；Ｐ：ＰｖｕＩ；Ｓｆ：ＳｆｉＩ。
【０１８６】
図２．Ａ）１２番染色体長腕テロメア領域に対するコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒのマッピング。１２番動原体特異的プローブｐα１２Ｈ８を、１２番染色体の同定確認に使用した。対照ヒトリンパ球の中期染色体についてＦＩＳＨ分析を実施した。ｃＰＫ１１２ｑｔｅｒのハイブリダイゼーションシグナルは小矢頭で示し、１２番動原体特異的プローブに対するそれはアステリスクで示す。Ｂ），Ｃ）ＹＡＣクローンＹ４８５４（Ｂ）またはＹ９０９１（Ｃ）のＤＮＡを分子プローブとし参照マーカーとしてコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒを組み合わせて用いるＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析。１２番染色体上のＹＡＣクローンのハイブリダイゼーションシグナルは大矢頭で示し、ｄｅｒ（１）上のものは大矢印で、ｄｅｒ（１２）上のものは小矢印でそれぞれ示す。コスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒのハイブリダイゼーションシグナルは小矢頭で示す。
【０１８７】
図３．コスミドクローン。ＲＭ６９（Ａ）またはｃＲＭ１１１（Ｂ）を分子プローブとし参照マーカーとしてコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒを組み合わせて用いるＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析。ｃＰＫ１２ｑｔｅｒのハイブリダイゼーションシグナル位置は小矢頭で示す。（Ａ）において、正常１２番染色体上のｃＲＭ６９のハイブリダイゼーションシグナル位置は大矢頭で、ｄｅｒ（１２）のものは小矢印で示す。（Ｂ）において、正常１２番染色体上のｃＲＭ１１１のハイブリダイゼーションシグナル位置は大矢頭で、ｄｅｒ（１）のものは大矢印で示す。
【０１８８】
図４．この研究で試験した６腫の多形態性唾液腺腫細胞系で得たＦＩＳＨマッピングデータの略図。種々の細胞系における特異的１２番染色体異常を示す。ＦＩＳＨマッピング実験でプローブとして用いたコスミドクローンは重複ＹＡＣクローンから得た配列標識部位に対応する。個々のＦＩＳＨ実験は点で示す。コスミドクローンは、枠内に示すように、ＳＴＳの頭文字により命名し、これらの相対的順位を提示した。ＲＭ９０とＲＭ１０３間のＤＮＡ区間は約１．３Ｍｂと推定される。挿入図：ｔ（１；１２）（ｐ２２；ｑ１５）を有するＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞系のＧバンド形成性誘導染色体ｄｅｒ（１）及びｄｅｒ（１２）の略図。Ａｄ−２４８／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０およびＡｄ−３６６／ＳＶ４０の１２番染色体切断点の位置は矢印で示すようにＲＭ１０３の遠位である。
【０１８９】
付属文書１図１
【０１９０】
付属文書１図２
【０１９１】
付属文書１図３
【０１９２】
付属文書２図１
【０１９３】
付属文書２図２
【０１９４】
付属文書２図３
【０１９５】
付属文書２図４
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の良性および悪性いずれの腫瘍にも見られる異常細胞生長にしばしば関連する遺伝子ファミリーとして、高速移動群（ＨＭＧ）タンパク質遺伝子ファミリーの同定に関する。本発明は特に、多くの腫瘍に関与する広範な作用の１２番染色体切断点領域遺伝子として、多くのＨＭＧ遺伝子ファミリーの同定に関する。これらの腫瘍には、限定はしないが、間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪腫、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍、さらに白血病およびリンパ腫が含まれる。本発明は、また６番染色体の切断に関連するのが見い出されたＨＭＧ遺伝子ファミリーの他の成員にも関する。
【０００２】
さらに、本発明は、これらの腫瘍における型特異切断点領域遺伝子の他の型およびＨＭＧ遺伝子の頻回融合相手として、ＬＩＭタンパク質ファミリーの成員の同定に関する。このファミリーのＬＰＰ（脂肪腫−先取相手）遺伝子は、脂肪腫に特異的であることが判明した。本発明は特に、診断および治療においてＨＭＧおよびＬＩＧ遺伝子ファミリーおよびそれらの誘導体を使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの独立した細胞遺伝子学的研究が、種々の良性および悪性の固形腫瘍型に１２番染色体の領域ｑ１３−ｑ１５が関連していることを示している。良性固形腫瘍については、１２ｑ１３−ｑ１５の関与が良性脂肪性組織腫瘍［１］（非特許文献１）、子宮平滑筋腫［２，３］（非特許文献２，３）および唾液腺の多形態性腺腫［４，５］（非特許文献４，５）においてしばしば観察される。同じ領域の関与が子宮内膜ポリープ［６，７］（非特許文献６，７）、血管外皮細胞腫［８］（非特許文献８）および軟骨腫瘍［９，１０，１１，１２］（非特許文献９，１０，１１，１２）についても報告されている。最近、染色体１２ｑ１３−ｑ１５の関与が肺軟骨様過誤腫［１３，１４］（非特許文献１３，１４）について報告された。最後に、染色体領域１２ｑ１３−ｑ１５の関与する固形腫瘍のいくつかの症例報告が公表されている。例えば、乳房腫瘍［１５，１６］（非特許文献１５，１６）、拡散星状細胞腫［１７］（非特許文献１７）および骨の巨人細胞腫瘍［１８］（非特許文献１８）である。１２ｑ１３−ｑ１５における再発異常を有する悪性腫瘍型には、粘膜様脂肪肉腫［１９］（非特許文献１９）、軟組織明細胞肉腫［２０，２１，２２］（非特許文献２０，２１，２２）および横紋筋肉腫［２３］（非特許文献２３）がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
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【非特許文献１８】Noguera, R., Llombart-Bosch, A., Lopez-Gines, C., Carda, C. and Fernandez, C1. (1989). Giant-cell tumor of bone, stage II, displaying translocation t(12;14)(q13:q13). Virchows Archiv A Pathol. Anat. 415: 377-382.
【非特許文献１９】Turc-Carel, C., Limon, J., DaI Cin, P., Rao, U., Karakousis, C., andSandberg, A.A. (1986). Cytogenetic studies of adipose tissue tumours. ll.Recurrent reciprocal translocat.ion t(12;16)(q13;p11) in myxoid liposarcomas. Cancer Genet. Cytogenet. 23: 291-299.
【非特許文献２０】Rodiguez, E., Sreekantaiah, C., Reuter, V.E., Motzer, R.J. and Chaganti, R.S.K. (1992). t(12;22)(q13;q13) and trisomy 8 are nonrandom aberrations in clear-cell sarcoma. Cancer Genet. Cytogenet. 64:107-110.
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【非特許文献２３】Roberts, P., Browne, C.F., Lewis, I.J., Bailey, C.C., Spice, R.D., Williams, J. and Batcup, G. (1992). 12q13 Abnormality in rhabdomyosarcoma. A nonrandom Occurrence? Cancer Genet. Cytogenet. 60: 135-140.
【発明の概要】
【０００５】
これらの研究は、１２番染色体の同じ細胞遺伝子学的領域がこれらの固形腫瘍における転座（トランスロケーション）のような染色体異常にしばしば関与することを示唆しているが、種々の腫瘍における１２番染色体切断点の正確な本質は、なお分かっていない。転座によって直接どの遺伝子が影響を受けるのかも確認されていない。
以前の物理的マッピング研究において、脂肪腫、多形態性唾液腺腫および子宮平滑筋腫における染色体１２ｑ切断点は座Ｄ１２Ｓ８とＣＨＯＰ遺伝子との間に位置づけられ、Ｄ１２Ｓ８はＣＨＯＰの末端にあることが示された。最近、ＦＩＳＨ解析によって、乳房過誤腫、血管粘液腫および多重肺軟骨様過誤腫における染色体１２ｑ切断点は、このＤＮＡ間隙内に位置していることも発見された。種々の腫瘍における染色体１２ｑ１３−ｑ１５異常により影響される遺伝子を分子的にクローニングする努力において、本発明者らは、これらの切断点を包含するＤＮＡ領域を明確にするための構造的アプローチとして方向性染色体歩行を選択した。
染色体歩行の出発点として、座Ｄ１２Ｓ８を用いた。これらの歩行研究において、多数の子宮平滑筋腫−誘導細胞系中に存在する染色体切断点は４４５ｋｂ染色体断片内にクラスター状に群がっていることが示され、これは、１２番染色体上の子宮平滑筋腫クラスター領域 Uterine Leiomyoma Cluster Region on chromosome 12(ULCR12)と名付けられた［１２］。続いて、１２番染色体上の１.７Ｍｂ領域に、子宮平滑筋腫−、脂肪腫−および唾液腺腫−細胞の１２番染色体切断点が種々の腫瘍型重複の切断点クラスター領域を有して、存在することが判明した［２５、添付１］。１２番染色体の長腕上のこの１.７Ｍｂ領域は、明らかにＵＬＣＲ１２を含み、この特性を反映して多重異常領域 Multiple Aberration Region(MAR)と名付けられた。領域マッピング研究においてＭＡＲは最近、１２ｑ１５に割り当てられた。
【０００６】
このように、基本的に１.７Ｍｂ領域における１２番染色体地図のすべての切断点が"多重異常領域"すなわちＭＡＲとして関係することが分かった。更なる研究によって、この領域における高速移動群遺伝子ファミリーの成員であるＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子が仮定多重腫瘍異常生長遺伝子（ＭＡＧ）として同定され得ることが明らかにされた。同じことが、染色体異常に関与するのが発見されたＬＩＭファミリーの成員についても適用される。それらのうち３番染色体−誘導脂肪腫−先取相手（ＬＰＰ）は、特に脂肪腫に関係している。
【０００７】
ＬＩＭタンパク質は、システイン富化・亜鉛結合ドメイン、いわゆるＬＩＭドメインを有するタンパク質である。これはタンパク質−タンパク質相互作用に関与する［総説について、参考文献８０を参照］。タンパク質ファミリーの成員の一つは、ここに開示された３番染色体に位置するＬＰＰタンパク質である。
【０００８】
本発明によると、１２番染色体上のＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子および３番染色体上のＬＰＰ遺伝子における異常は、良性および悪性腫瘍におけるＨＭＧおよびＬＩＭ遺伝子ファミリーの成員の関与についての、より一般的な概念を明らかにするモデルとして用いられる。染色体再編成により影響を受けたときに、腫瘍生長の特定群に到達する遺伝子ファミリーの、より一般的な概念が存在することを明らかにするために、本発明者らは、ＨＭＧファミリーの成員であるＨＭＧＩ（Ｙ）遺伝子が６番染色体中の切断に関与することを明らかにした。両ＨＭＧおよびＬＩＭ遺伝子ファミリーはそれ自体知られているが、本発明に至るまでは、これらのファミリーと、転座、欠失、挿入および内返しのような腫瘍を起こす染色体異常との相関は予想されていなかった。さらに、現在まで、該遺伝子ファミリーの成員の生理的発現レベルにおける異常が腫瘍の発育に関係しているであろうことは、かつて明らかにされなかった。本発明によって、正常成人の細胞においてＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現レベルが実際的には検出不可能であり、一方、異常に生長した細胞においては発現レベルが有意に増加していることが明らかになった。
【０００９】
これらの知見を基にして、本発明は、該遺伝子ファミリーの成員またはその誘導体を分離した形で、および診断および治療におけるその使用を提供する。さらに、該遺伝子の位置およびヌクレオチド配列の知識は、その再編成または発現を研究するために、およびその発現レベルにおける潜在的増大または低下および細胞の生長に対するその作用を同定するために、用いることができる。この情報に基づき、診断検査法や治療的処置が設計される。
【００１０】
本出願において、用語"多重腫瘍異常生長（またはＭＡＧ）遺伝子"は、種々の型の癌におけるこれら型の遺伝子の関与を示すために用いられる。この用語は、非生理的な増殖生長に関与するＨＭＧおよびＬＩＭ遺伝子ファミリーのすべての成員を意味し、特に動脈硬化的プラークを含む悪性および良性の腫瘍に関与するものを意味する。しかし、本発明によって更に、実際の遺伝子外側の切断でも、その近隣であれば異常生長が結果として生じることもあるのが判明した。従って、用語ＭＡＧ遺伝子は該遺伝子の直接の近隣も含むことを意味している。"直接の近隣"が上記に明確にした非生理的増殖生長をもたらす切断または再編成がなされる遺伝子の周りを含むと理解されるべきことは、当業者は容易に分かるであろう。
【００１１】
用語"野生型細胞"は、異常染色体を保有していない細胞または関連遺伝子が生理的な発現レベルにある細胞を意味する。"野生型"すなわち"正常"染色体は、非異常染色体を意味する。
【００１２】
本発明は、該遺伝子から誘導される情報に基づく種々の診断的および治療的利用を提供する。この情報は、遺伝子から誘導される遺伝子産物のヌクレオチド配列やアミノ酸配列を包含するのみでなく、遺伝子の複製または翻訳レベルをも含む。
【００１３】
このように本発明は２重性である。一つは、細胞における異常が遺伝子またはその近隣で起きる物理的切断によって直接的または間接的に生じ得る。他方、細胞における異常が遺伝子の非生理的発現レベルによって生じ得る。この非生理的発現レベルは切断によって生じうるか、または遺伝子を活性化または不活性化する他の刺激によるものであり得る。現在のところ、異常細胞生長の正確なメカニズムまたは起源は分かっていない。しかし、このメカニズムについての正確な知識は、診断方法あるいは処置を確立するのに必要でない。
【００１４】
本発明の診断方法は、染色体における異常が染色体の外観または生化学的反応について検出可能な変化をもたらすとの事実に基づいている。例えば、転座は、染色体（および、その結果としてＭＡＧ遺伝子の）の第一部分が他の（第二）部分に置換されること（以後、"第一および第二置換部分"と言う）が結果として生じる。第一部分は、第二部分を生みだした他の染色体と違った場所にしばしば現れる。結果として、ハイブリドは、両（三重転座の場合は、より以上）染色体の残りの部分と転座相手により提供された置換部分との間で形成される。切断がＭＡＧ遺伝子において生じることが判明したので、これはそのＭＡＧ遺伝子のハイブリド遺伝子産物をもたらす。ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリドのようなハイブリド分子または抗生物質などのマーカーは、該ハイブリドをＤＮＡレベルおよびＲＮＡまたはタンパク質レベルのいずれでも検出することができる。
【００１５】
例えば、ハイブリドの転写物は、遺伝子／染色体の残りの部分により提供される領域を含んでいるが、転座された置換部分により提供される領域を欠いている。内返し、欠失および挿入の場合、遺伝子は等しく障害を受ける。
【００１６】
転座も細胞遺伝学的に常に検出可能である。他の異常は、細胞遺伝子レベルでみることがしばしばできないので、見い出すことはより難しい。本発明は、これらすべての型の染色体異常を診断し得る可能性を提供するものである。
【００１７】
転座において染色体の残りおよび置換部分についてのＭＡＧ遺伝子に基づくマーカーまたはプローブは元の染色体についての残り部分をインサイトゥ検出するが、他の染色体、転座相手についての置換部分を検出しない。
【００１８】
内返しにおいては例えば、２つのプローブは野生遺伝子において特殊な距離でハイブリダイズする。しかし、この距離は内返しにより変化することがある。インサイトゥかかる内返しは、一組の適当なプローブを蛍光ラベルなどの同じまたは相違するマーカーでラベルすることにより可視化される。欠失および挿入は同様の方法により検出される。
【００１９】
本発明により、上記インサイトゥ利用は、ＦＩＳＨ法を用いて非常に都合よく実施され得る。マーカーは例えば２コスミドであり、うち１つはＭＡＧ遺伝子のエキソン１−３を含み、他の１つはエキソン４および５を含む。両コスミドは相違する蛍光マーカー、例えば青および黄でラベルされる。正常な染色体は両ラベルの結合を示すのでグリーンの信号となり、一方、転座は１つの染色体の残りの部分（例えば１２番）に青信号として見られ、黄信号は置換部分を含む他の染色体に見られる。同じレベルを両プローブに用いた場合、正常染色体に対する信号強度は１００％であり、一方異常染色体に対しては５０％である。内返しの場合、信号の一つが正常染色体上の一つの場所から異常染色体上の他の場所に変わる。
【００２０】
上記の利用において比較のために参考が含まれねばならない。常に２つの染色体の一つが障害を受ける。このように正常染色体を内部参考として利用することは大変便利である。さらに、染色体の残りの未変化部分についてのマーカーを一つ、および置換または逆方向部分について他の一つを選択することが重要である。１２番染色体のＭＡＧ遺伝子の場合、本発明が示すように、切断は、エキソン３と４の間の大きいイントロンに通常は見い出される。さらに切断はエキソン４と５の間に検出された。エキソン１−３および４および５に基づくプローブ、またはエキソン４か５に基づくプローブは非常に有用である。別法として、両転座または融合相手に基づくプローブの組み合わせを用い得る。例えば、脂肪腫の同定に、一方、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子のエキソン１−３に基づき、および他方、ＬＰＰ−Ｃ遺伝子のエキソン１−３に基づくプローブを用いることができる。
【００２１】
さらに、切断が遺伝子の外側、すなわちその５'または３'でも起こり得ることが見い出された。プローブの選択は勿論遺伝子の５'または３'に位置するＤＮＡ配列にハイブリダイズする少なくとも一つのプローブを含む。
【００２２】
ここで用いられる"プローブ"は、広く解釈されるべきで、限定しないが、線状ＤＮＡまたはＤＮＡ鎖、イースト人工遺伝子（ＹＡＣｓ）または環状ＤＮＡ形、例えばプラスミド、ファージ、コスミドなどを含む。
これらのインサイトゥ方法は中間層および間層染色体に用いられる。
【００２３】
上記のインサイトゥ方法以外に、種々の診断方法がより多くの生化学レベルで実施され得、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質における変化または遺伝子の生理的発現レベルにおける変化に基づいている。
【００２４】
染色体の生化学行動における変化に基づく方法の基礎は、適当なプローブを選択することにより、遺伝子中の長さまたは構成、転写物またはタンパク質における多重性がゲルまたはブロット上で検出されることにある。正常遺伝子、転写物またはタンパク質がゲルまたはブロット上の他の位置に現れ、次いで異常遺伝子が現れるので、長さの変化が見られ得る。転座の場合、正常数よりも多くのスポットが現れる。
【００２５】
上記の原則を基にして本発明は、例えば、非生理的増殖能を有する細胞を診断する方法に関し、この方法は、診断すべき細胞の生体を採取し、それからＭＡＧ遺伝子−関連マクロ分子を分離し、得たマクロ分子を非生理的増殖能がない細胞から、望ましくは同じ個体から生じた参考分子と比較して分析する段階を含んでいる。ＭＡＧ遺伝子−関連マクロ分子はＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質であり得る。ＭＡＧ遺伝子は、ＨＭＧファミリーまたはＬＩＭファミリーのいずれかの成員である。
【００２６】
この型の診断方法の特定的実施態様において本発明は、診断すべき細胞の生検を採取し、その全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡ抽出物またはそのポリ−Ａ−選択フラクション中のｍＲＮＡ種の第一鎖ｃＤＮＡを調製し（ｃＤＮＡは適当なティルを含む）；ＭＡＧ遺伝子特異的ｃＤＮＡを増幅させるためにＭＡＧ遺伝子特異的プライマーおよびティル−特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い；ゲル上のＰＣＲ産物を分離してバンドのパターンを得；異常バンドの存在を、野生型バンド、望ましくは同じ個体から得たもの、と比較して、調べる段階を含む。
【００２７】
別の増幅方法が核酸配列に基づく増幅技法（ＮＡＳＢＡ）［８１］またはその変法により実施され得る。
【００２８】
他の実施態様において、該方法は、診断すべき細胞の生検を採取し、それから全タンパク質を単離し、ゲル上でタンパク質を分離して基本的に個人のバンドを得、任意でバンドをウエスタン・ブロットに転移し、得たバンドを、ＭＡＧ遺伝子の残りの部分によりコードされるタンパク質の部分に対する、およびＭＡＧ遺伝子の置換部分によりコードされるタンパク質の部分に対する抗体と共にハイブリダイズし；抗原−抗体反応を可視化し、そして異常バンドの存在を、野生型タンパク質からのバンド、望ましくは同じ個体から得たバンドと比較して確認する段階を含む。
【００２９】
更なる実施態様において、該方法は、診断すべき細胞の生検を採取し、その全ＤＮＡを単離し、１以上のいわゆる"希切断"制限酵素（典型的には"６−または以上の切断"）でもってＤＮＡを消化し、ゲル上に調製された消化物を分離して、分離パターンを得、任意で分離パターンをサーザン・ブロットに転移し；ゲル中またはブロット上の分離パターンを一組のプローブとハイブリダイズ条件でハイブリダイズし；ハイブリダイゼイションを可視化し、そして異常バンドの存在を野生型バンド、望ましくは同一個体から得たバンドとの比較により確認する段階を含む。
【００３０】
遺伝子の発現レベルにおける変化は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを適当なプローブの手段で測定することにより検定できる。
【００３１】
遺伝子の異常発現レベルに基づく診断方法は、診断すべき細胞のサンプルを採取し、それからｍＲＮＡを単離し、望むＭＡＧ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在および／または（比較の）量を対照と比較して確認する段階を含む。ｍＲＮＡの存在および／または（比較の）量の確認は、ＭＡＧのｍＲＮＡの少なくとも部分をＲＴ−ＰＣＲまたは類似の増幅技術により増幅して達成される。別の実施態様において、発現レベルは、例えばモノクローナル抗体の手段で遺伝子産物（例えばタンパク質）の存在および量を測定することにより確認される。
【００３２】
本発明の診断方法は、非生理的増殖能を有する細胞が間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪性組織腫瘍（例えば脂肪腫）、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍からなるグループから選択される疾患に用いられる。本発明は、いわゆる良性または悪性固形腫瘍の診断および治療に限定されず、その原理は、白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性腫瘍にも適用できることが分かった。
【００３３】
最近の報告によると、動脈硬化性プラークが主に平滑筋細胞の異常な増殖［２６］も含み、動脈硬化性プラークが良性腫瘍を形成すると推測された［２７］。従って、この型の障害も、ＭＡＧ遺伝子ファミリーの使用、特に診断的および治療的利用できるであろう適応症であることが分かる。
【００３４】
上述したように、ある種の悪性腫瘍においてＨＭＧの発現レベルが増大することは知られている［２８］。現在まで、この観察の関連性は理解されなかった。従って、本発明の別の側面は、治療におけるＭＡＧ遺伝子の同定を行うことに関する。例えば本発明は、遺伝子の発現を調節して、非生理的増殖能を有する細胞の疾患を処置するのに用いられるＭＡＧ遺伝子のアンチセンス分子または発現阻止剤を提供する。非生理的高発現は、細胞に投与されるかまたは発現され、そしてｍＲＮＡを結合するアンチセンスＲＮＡによる手段、または遺伝子産物に対する抗体による手段で正常化され得るであろう。これらの手段は順に細胞生長の正常化をもたらすであろう。実施例は、白血症細胞中のアンチセンスＲＮＡの発現が正常に反する細胞の再−区別を結果として生じること、を表すであろう。
【００３５】
本発明は、ＭＡＧ遺伝子の誘導体および／または診断に使用するその直接の環境および治療的組成物の調製を提供する。該誘導体は、センスおよびアンチ−センスｃＤＮＡまたはそのフラグメント、該遺伝子の転写物またはそのフラグメント、アンチセンスＲＮＡ、分子または他の型の"転写締め具"を誘発する三重ラセン、該遺伝子のフラグメントまたはその相補的鎖、該遺伝子またはそのフラグメントによりコードされたタンパク質、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、該遺伝子、該ｃＤＮＡ、該転写物、該タンパク質または該フラグメントに対する抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される。診断および治療における遺伝子およびその周辺（はさむ配列）の直接的利用以外に、発現阻害剤または発現促進剤のような他の分子が本発明による治療的処置に用いられる。この型の分子の例は、ＲＮＡ分子を破壊するリゾチームである。
【００３６】
上記した治療的および予防的方法以外に、本発明の原理は、ＭＡＧ遺伝子関連の悪性または良性腫瘍および動脈硬化性プラーグの処置のための医薬品を試験するのに役立つ形質転換動物モデルをつくるのに用いられる。実施例の１つはかかる動物モデルの産生を記述する。
【００３７】
本発明の原理は、説明の目的のために、１２番染色体におけるＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子マッピングおよび６番染色体におけるＨＭＧＩ（Ｙ）遺伝子マッピングおよび３番染色体上のＬＰＰ遺伝子についてのみ記載されたことが理解されるべきである。本発明により提供された情報に基づき、本発明の一般的概念の範囲を出ないで、当業者は、該遺伝子の対応遺伝子を単離し、配列し、そして本発明の原則を、遺伝子およびその配列を用いて利用し得るであろう。
【００３８】
本発明は下記の実施例によりさらに明らかになるであろう。これらは発明の範囲の制限を意図するものでない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】７５個の重複ＣＥＰＨ ＹＡＣクローンから構成され、様々な良性充実性腫瘍に存在する１２番染色体ｑ切断点に及ぶＹＡＣコンティグ由来の、ヒト１２番染色体長腕上にある６Ｍｂ領域の長距離物理的地図。ＹＡＣ挿入物によりカバーされる複合ゲノムＤＮＡの長距離物理的地図は、示した微量切断酵素の様々な制限部位の相対位置と共に黒線で示す。特定の制限酵素の付加的切断部位がみられるＤＮＡ領域は矢印で示す。多様な種類の制限エンドヌクレアーゼ部位はアステリスクで示す。他の研究者により単離され定義されたＤＮＡマーカーは緑で示す。我々が得たＤＮＡマーカーはボックスで示し、頭字語で標識する（図ＩおよびＩＩ参照）。これらのＤＮＡマーカーの長距離物理的地図における相対位置を示し、特定のＹＡＣ末端に対応する位置を点線でこれらと結ぶ。ＤＮＡマーカーのいくつかはＤＮＡ区間にあたり、これは矢印で示す。白いボックス中のＤＮＡマーカーとして、ＳＴＳが成長され、プライマーセットを表IIに示す。黄色のボックス中のものについては、何のプライマーセットも成長されていない。ＲＡＰ１Ｂ、ＥＳＴ０１０９６、またはＩＦＮＧ含有のＤＮＡ区間を表示する。適用可能な場合においては、Ｄ番号割り当てを示す。長距離物理的地図の下流には、共通した長距離の制限地図に一致する重複ＹＡＣクローンのサイズおよび相対位置を青の線で示す。共通の長距離の制限地図中内に適合しないＹＡＣ挿入物のＤＮＡ領域は点線の青い線で示す。ＹＡＣクローンのＣＥＰＨマイクロタイターアドレスを載せる。１２番染色体上にあるＹＡＣコンティグの方位が与えられる。ＵＬＣＲ１２およびＭＡＲの相対位置が対応する頭文字により表示された赤い線により示す。ＳＴＳのアクセス番号は表Ｉには載せていない：ＣＨ９（＃Ｕ２７１４２）；ＲＭ１（＃Ｕ２９０４９）；ＲＭ１１０（＃Ｕ２９０２２）；ＲＭ１１１（＃Ｕ２９０２３）；ＲＭ１３０（＃Ｕ２７１３９）；ＲＭ１３１（＃Ｕ２９００１）；ＲＭ１３２（＃Ｕ２７１３８）；ＲＭ１３３（＃Ｕ２７１３７）。制限部位：Ｂ：ＢｓｓＨＩＩ；Ｋ：ＫｓｐＩ（＝ＳａｃＩＩ）；Ｍ：ＭｌｕＩ；Ｎ：ＮｏｔＩ；Ｐ：ＰｖｕＩ；Ｓｆ：ＳｆｉＩ。
【図１−２】図１−１の続きを示す図である。
【図１−３】図１−２の続きを示す図である。
【図１−４】図１−３の続きを示す図である。
【図２】約４４５ｋｂのＭＡＲ断片に及ぶ、重複コスミドのコンティグ、長い範囲の制限およびＳＴＳ地図。コンティグ成分を数え、下記のリストで定義する。ＬＬ１２ＮＣ０１−由来のコスミドクローンはそのマイクロタイタープレートアドレスにちなんで名前がついている。様々なＳＴＳの遺伝子バンク・アクセス番号（＃）が下記に記載されている。ＳＴＳは略語で記載し、例えばＳＴＳ１２−ＲＭ３３ではなくＲＭ３３と記載する。コスミドコンティグ中のＳＴＳ"Ｋ"および"Ｏ"の間の４０ｋｂの差はλクローン（クローン３８および４０）およびＰＣＲ産物（クローン３７および３９）によりカバーされている。１２番染色体上の長腕上のコンティグの方位、ならびに３７個のＳＴＳの順序も与えられる（ボックス内に示すか、または丸で囲んだ大文字で表記）。図の上端にあるいくつかのＳＴＳ記号のまわりの斜めの線および矢印は、特定のＳＴＳが割り当てられている領域を示す。コスミドコンティグは大量でないことを認識すべきであり；黒い四角はコスミド末端のＳＴＳを示しており、ここで内部コスミド配列に対応するＳＴＳの存在は点で表現されている。長い範囲の制限地図：Ｂｓ：ＢｓｓＨＩＩ；Ｋ：ＫｓｐＩ（＝ＳａｃＩＩ）；Ｍ：ＭｌｕＩ；Ｎ：ＮｏｔＩ；Ｐ：ＰｖｕＩ；Ｓｆ：ＳｆｉＩ。図の末端に、詳細な制限地図においてＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子のエキソン（下記のボックス）を含んでいる領域が示されている。非コード領域が白抜きのボックスで、コード領域が黒のボックスで示す。イントロンの推定サイズ（ｋｂ）を表示する。ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子中の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）の相対位置ならびに可能性あるポリ−アデニル化信号を矢印で示す。詳細な制限地図：Ｂ：ＢａｍＨＩ；Ｅ：ＥｃｏＲＩ；Ｈ：ＨｉｎｄIII。ＭＡＲ：複合異常領域;ＤＢＤ：ＤＮＡ結合ドメイン。 1=140A3, 2=202A1, 3=78F11, 4=80C9, 5=109B12, 6=148C12, 7=14H6, 8=51F8, 9=57C3, 10=86A10, 11=142G8, 12=154A10, 13=163D1, 14=42H7, 15=113A5, 16=191H5, 17=248E4, 18=33H7, 19=50D7, 20=68B12, 21=124D8, 22=128A7, 23=129F9, 24=181C1, 25=238E1, 26=69B1, 27=260C7, 28=156A4, 29=27E12, 30=46G3, 31=59A1, 32=101D8, 33=175C7, 34=185H2, 35=189C2, 36=154B12, 37=pRM150, 38=pRM144, 39=PKXL, 40=pRM147, 41=128A2, 42=142H1, 43=204A10, 44=145E1, 45=245E8, 46=154F9, 47=62D8, 48=104A4, 49=184A9, 50=56C2, 51=65E6, 52=196E1, 53=215A8, 54=147G8, 55=211A9, 56=22D8, 57=116B7, 58=144D12, A = STS 12-EM12(#U27145), I = STS 12-CH12(#U27153), Q = STS 12-RM120(#U27161), B = STS 12-EM30(#U27146), J = STS 12-EM10(#U27154), R = STS 12-RM118(#U27162), C = STS 12-EM14(#U27147), K = STS 12-EM37(#U27155), S = STS 12-RM119(#U27163), D = STS 12-EM31(#U27148), L = STS 12-RM146(#U27156), T = STS 12-EM2(#U27164), E = STS 12-CH11(#U27149), M = STS 12-RM145(#U27157), U = STS 12-EM4(#U27165), F = STS 12-EM18(#U27150), N = STS 12-RM151(#U27158), V = STS 12-EM3(#U27166), G = STS 12-EM11(#U27151), O = STS 12-EM16(#U27159), W = STS 12-EM15(#U27167), H = STS 12-CH10(#U27152), P = STS 12-EM1(#U27160), X = STS 12-EM17(#U27168), STS 12-CH5(#U27136), STS 12-CH9(#U27142), STS 12-RM33(#U27131), STS 12-RM53(#U27134), STS 12-RM76(#U27132), STS 12-RM86(#U27133), STS 12-RM98(#U26647), STS 12-RM99(#U27130), STS 12-RM103(#U26689), STS 12-RM130(#U27139), STS 12-RM132(#U27138), STS 12-RM133(#U27137), STS 12-RM151(#U27158)
【図３】我々の以前のＦＩＳＨ研究に続く連続した実験において、８個の脂肪腫、１０個の子宮平滑筋腫、および８個の多形態性唾液腺腫細胞系を含めた１２番染色体ｑ１３−ｑ１５異常を有する腫瘍細胞系で得られたＦＩＳＨ地図の図示。使用したプローブはファージクローンｐＲＭ１４４（対応するＳＴＳ：ＲＭ８６およびＲＭ１３０）およびｐＲＭ１４７（ＲＭ１５１）、およびコスミドクローン７Ｄ３または１５２Ｆ２（ＲＭ１０３）、１５４Ｆ９（ＣＨ９）、２７Ｅ１２（ＥＭ１１）、２１１Ａ９（ＲＭ３３）、２４５Ｅ８（ＲＭ５３）、１８５Ｈ２（ＲＭ７６）、２０２Ａ１（ＲＭ９８）、１４２Ｈ１（ＲＭ９９）、１５４Ｂ１２（ＲＭ１３２）、および１２４Ｄ８（ＲＭ１３３）。ＲＭ３３およびＲＭ９８の間のＤＮＡ区間は約４４５ｋｂであると推定されている。点は、分子プローブとして上記のボックスで与えられたＳＴＳを含むクローンを使用して、特定の細胞系の中期染色体上で行われたＦＩＳＨ実験を示す。線は、ＤＮＡ区間を示し、特定の細胞系の切断点が位置づけられている。白抜きの三角形はＦＩＳＨ解析中に観察された欠失を示す。白抜きの丸は、細胞遺伝学的に正常な３番染色体上のハイブリダイゼーション信号と共にＬｉ−５０１／ＳＶ４０細胞の中期染色体上のＦＩＳＨ実験の結果を示す。ＭＡＲの外に位置する腫瘍細胞系の１２番染色体の切断点の位置は矢印で示す。ＬＭ−３０．１／ＳＶ４０およびＬＭ−６０８／ＳＶ４０の分子的にクローン化した切断点はアステリスクで示す。コスミド２７Ｅ１２（ＥＭ１１）を分断している様々な子宮平滑筋細胞系中の切断点は『二重斜線』で示す。
【図４】ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の一部およびＬＰＰ遺伝子の一部間の接合部位を含む３'−ＲＡＣＥ産物。使用したプライマーおよび接合部位を示している。ｃＤＮＡ合成は内部的にプライムし、真のポリ（Ａ）テイル上ではない。
【図５−１】ＬＰＰ遺伝子の部分的ｃＤＮＡ配列
【図５−２】図５−１の続きを示す図である。
【図５−３】図５−２の続きを示す図である。
【図６】ＬＰＰ遺伝子のアミノ酸配列。ＬＩＭドメインを四角で囲む。切断点を矢印で示す。
【図７−１】ＨＭＧＩ−Ｃ（Ｕ２８７４９）であればヌクレオチド配列。Manfioletti et al. が提案した翻訳開始部位を図示。（６７）を開始部位として任意に選択した。配列は完全なコード配列を含む。
【図７−２】図７−１の続きを示す図である。
【図８】実施例５に記載のようにして得たＰＣＲ産物のゲル。
【実施例】
【００４０】
実施例１
１.序
この実施例は、７５の一部重複するＹＡＣクローンの分離および分析、ならびに、遺伝子座Ｄ１２Ｓ８の周囲の約６ＭｂのゲノムＤＮＡにわたっており且つＭＡＲを含んでいるＹＡＣコンティグ(一部重複するクローンの集合体)の確立を記載するものである。１２番染色体の長腕上のＹＡＣコンティグの向きは、二色ＦＩＳＨ分析により決定された。ＳＴＳ含量マッピングおよび制限酵素分析に基づき、この６Ｍb ＤＮＡ領域の広範囲物理的地図が確立された。このコンティグは、様々な１２番染色体異常により直接影響を受ける遺伝子を包含する、１２ｑ１５に位置する遺伝子の同定を目的とする、ｃＤＮＡ捕捉の有用な供給源を表す。
【００４１】
２.材料および方法
２.１.細胞系
体細胞ハイブリッドを用いる染色体割り当て(ＣＡＳＨ)実験には、細胞系ＰＫ８９−１２およびＬＩＳ−３／ＳＶ４０／Ａ９−Ｂ４を使用した。ハムスターの遺伝的背景中に唯一のヒト染色体として１２番染色体を含むＰＫ８９−１２は、前に記載した[２９]。ＰＫ８９−１２細胞は、１０％ウシ胎児血清、２００ＩＵ／mlペニシリン、および２００μg／mlストレプトマイシンを添加したＤＭＥ−Ｆ１２培地中で生育させた。体細胞ハイブリッドＬＩＳ−３／ＳＶ４０／Ａ９−Ｂ４は、ｔ(１２；１６)(ｑ１３；ｐ１１.２)を有する粘液様脂肪肉腫細胞系ＬＩＳ−３／ＳＶ４０、およびマウスＡ９細胞の融合時に得られた。これは、der(１６)を含むが、der(１２)および正常な１２番染色体のいずれをも含まないことが以前に示されていたものである[３０]。ＬＩＳ−３／ＳＶ４０／Ａ９−Ｂ４細胞は、選択的ＡＯＡ培地(１０％ウシ胎児血清、０.０５ｍＭアデニン、０.０５ｍＭウワバイン、および０.０１ｍＭアザセリンを添加したＤＭＥ−Ｆ１２培地で構成されるＡＯＡ培地)中で生育させた。両細胞系は標準的細胞遺伝学技術により頻繁に検定した。
【００４２】
２.２.ヌクレオチド配列分析およびオリコヌクレオチド
Ｔ７ポリメラーゼ配列決定キット(ファルマシア／ＬＫＢ)またはｄｓＤＮＡサイクル配列決定システム(ギブコ／ＢＲＬ)を用いるジデオキシチェーンターミネーション法に従い、ヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ−３Ｚｆ(＋)中でサブクローニングし、ＦＩＴＣ標識した標準ＳＰ６もしくはＴ７プライマー、または新たに得られた配列に基づき合成された特異的プライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、自動レーザー蛍光(Ａ.Ｌ.Ｆ.)ＤＮＡシークエンサー(ファルマシア・バイオテク)および標準的な３０cm、６％ハイドロリンク(商標)、ロング・レインジ(商標)ゲル(ＡＴバイオケム)を使用して得た。ヌクレオチド配列は、配列分析ソフトウェアジーンプロ(リヴァーサイド・サィエンティフィック)、ＰＣ／ジーン(インテリジェネティクス)、インテリジェネティクス・スイート・ソフトウェア・パッケージ(インテリジェネティクス、Ｉｎｃ.)、およびオリゴを使用して分析した[３１]。オリゴヌクレオチドは全てファルマシア・バイオテクから購入した。
【００４３】
２.３.染色体の調製および蛍光インサイトゥハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)
ＹＡＣクローンのＦＩＳＨ分析を実施してそれらの染色体上位置を確認し、そしてキメラクローンを同定した。ＹＡＣ挿入物末端のＳＴＳに相当するコスミドクローンのＦＩＳＨ分析を実施して、それらの染色体上位置を確認した。コスミドは、ヒトゲノムライブラリーＣＭＬＷ−２５３８３から分離する[３２]か、または、ローレンス・リヴァーモア・ナショナル・ラボラトリーにおいて標準法に従って組み立てられた、整列させた１２番染色体特異的ライブラリー(ＬＬ１２ＮＣ０１、参考文献３３)から分離された[３４]。本質的には前記と同様にして常套的ＦＩＳＨ分析を実施した[３０、３５]。ＤＮＡは、キーヴィッツ等のプロトコルを用いてビオチン−１１−ｄＵＴＰ(ベーリンガー)で標識した[３６]。ＤＡＢＣＯ(２ｇ／１００ml、シグマ)、０.１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ８、０.０２％チメロサール、およびグリセロール(９０％)より成りヨウ化プロピジウム(０.５μg／ml、シグマ)を対比染色として含有する抗退色媒質を加え、１５分後に、ＦＩＴＣ／テキサスレッドに対するダブルバンド通過フィルター(オメガ・オプティカル、Ｉｎｃ.)を用いるザイス・アキシオフォト蛍光顕微鏡上で標本を分析した。結果はスコッチ(３Ｍ)６４０ＡＳＡフィルム上に記録した。
二色ＦＩＳＨ実験のために、ＬＬＮＬ１２ＮＣＯ１−９６Ｃ１１をジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ(ベーリンガー)で、そしてコスミドＬＬＮＬ１２ＮＣＯ１−１Ｆ６および−１９３Ｆ１０をビオチン−１１−ｄＵＴＰで標識した。各プローブの等量を合し、この混合物をハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーションの後、スライドをアビジン−ＦＩＴＣと共に２０分間インキュベートし、次いでキーヴィッツ等により記載されるように洗浄した[３６]。その後の一連の、ＴＮＢ緩衝液(０.１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ７.５、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.５％ベーリンガー遮断剤(ベーリンガー))中でのインキュベーション、および洗浄工程は、ＴＮＴ緩衝液(０.１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ７.５、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％トゥイーン２０)中で実施し、全てのインキュベーションは３７℃で３０分間行った。第二のインキュベーションの間にヤギ−α−アビジン−ビオチン(ベクター)およびマウス−α−ジゴキシゲニン(シグマ)を同時に適用した。第三のインキュベーションの間にアビジン−ＦＩＴＣおよびウサギ−α−マウス−ＴＲＩＴＣ(シグマ)を適用した。最後のインキュベーションの間にヤギ−α−ウサギ−ＴＲＩＴＣ(シグマ)を適用した。ＴＮＴ緩衝液中での最後の洗浄の後、試料を１ｘＰＢＳで二回洗浄し、次いでエタノール系列(７０％、９０％、１００％)により脱水した。対比染色として７５ng／μｌＤＡＰＩ(セルヴァ)を含有する抗退色媒質を使用した。標本を上記のようにザイス・アキシオフォト蛍光顕微鏡で分析した。
【００４４】
２.４.ＹＡＣライブラリーのスクリーニング
サートル・デテュドゥ・デュ・ポリフォルミズム・ヒュメ(ＣＥＰＨ)より取得可能となったＣＥＰＨヒトゲノムＹＡＣライブラリーマーク１および３からＹＡＣクローンを分離した[３７、３８]。前記のようにスクリーニングを実施した[３９]。時に遭遇するカンジダ・パラサイロシスの混入を、成長培地にテルビナフィン(ディーター・レーマー博士、サンド・ファルマ・ＬＴＤ、バースル、スイス、の好意により提供された)を添加(最終濃度：２５μｇ／ml)することにより根絶した。分離されたＹＡＣクローンを、ＳＴＳ含有量マッピング、カントゥア・クランプト均質電場(ＣＨＥＦ)ゲル電気泳動[４０]、制限マッピング、ならびにハイブリダイゼーション−およびＦＩＳＨ分析により特性決定した。
【００４５】
２.５.ＰＣＲ反応
ＰＣＲ増幅は、１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８.３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０１％ゼラチン、２ｍＭ ｄＮＴＰ、各アンプリマー２０pmole、アンプリタク２.５単位(パーキン−エルマー・シータス)、およびＤＮＡ１００ng(スーパープール用)または２０ng(プール用)を含有する最終容量１００μl中で、ファルマシア／ＬＫＢ・ジーン・ＡＴＡＱ・コントローラー(ファルマシア／ＬＫＢ)を使用して実施した。９４℃５分間の最初の変性の後、各々９４℃１分間の変性、適当な温度で１分間のアニーリング(表Ｉを参照されたい)および７２℃１分間の伸長で構成される３５サイクルの増幅を実施した。ＰＣＲ反応は７２℃５分間の最後の伸長により完結した。結果を、ポリアクリルアミドミニゲル上で反応生成物１０μlを分析することにより評価した。
【００４６】
２.６.パルスフィールドゲル電気泳動およびサザンブロット分析
パルスフィールドゲル電気泳動およびサザンブロット分析は、ショーンメイカーズ等による記載に厳密に従って実施した[３９]。高分子量ＹＡＣ ＤＮＡを含むアガロース充填剤(約１ｘ１０8酵母細胞に相当)をＴＥ緩衝液(ｐＨ８.０)およそ２５ml中、５０℃で３０分間２回平衡化し、引き続き室温で同様の平衡化を２回行った。その後充填剤を丸底２mlエッペンドルフ管に移し、適当な制限温度で適当な１ｘ制限緩衝液５００μl中、３０分間２回平衡化した。その後、消化反応当たり３０単位の制限エンドヌクレアーゼを使用し供給者(ベーリンガー)の指示に従って、ＤＮＡを充填剤中で４時間消化した。消化後、適当な分子量マーカーと共に充填剤を１％アガロース／０.２５ｘＴＢＥゲル上にロードし、ＬＭＰアガロースで密封し、そして１２０度のパルス角および１０秒間(３００kbpまでの分離)から２０秒間(５００kbpまでの分離)まで変化する定パルス時間を用いて、ＣＨＥＦ装置(バイオラド)上で１８時間６.０Ｖ／cmでサイズ分画した。大きな制限フラグメントの場合、５００kbpより大きなサイズのフラグメントの分離を目指して、さらなる泳動を行った。電気泳動は０.２５ｘＴＢＥ中１４℃で実施した。分子量マーカーとしては、λラダー(プロメガ)および制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで切断したλＤＮＡを含有する自家製充填剤を使用した。電気泳動の後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、撮影し、そして１２０ｍＪの設定でストラタリンカー(ストラタジーン)を用いてＵＶ照射した。続いて０.４Ｎ ＮａＯＨを転移緩衝液として使用し、ＤＮＡをハイボンドＮ+膜(アマーシャム)上に４−１６時間ブロッティングした。ブロッティング後、この膜を８０℃で１５分間乾燥し、２ｘＳＳＰＥ中で短時間中和し、そして５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート、０.１％ＳＤＳおよび２００μg／mlヘパリンで構成される溶液５０ml中、４２℃で少なくとも３時間プレハイブリダイズした。続いて、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、１ｘデンハート、０.１％ＳＤＳ、１００μg／mlヘバリン、０.５％硫酸デキストランおよび標識化したプローブ２−３ｘ１０6cpm／mlで構成される溶液１０ml中、フィルターを４２℃で１６時間ハイブリダイズした。その後、膜を、まず２ｘＳＳＰＥ／０.１％ＳＤＳ中室温で５分間２回、次いで２ｘＳＳＰＥ／０.１％ＳＤＳ中４２℃で３０分間、そして最後に０.１ｘＳＳＰＥ／０.１％ＳＤＳ中６５℃で２０分間洗浄した。プローブの挙動に応じてコダックＸＡＲ−５フィルムを−８０℃で３−１６時間露光した。補力スクリーン(キョッコー・スペシャル５００)を使用した。
【００４７】
２.７.ＹＡＣ挿入物末端からのＳＴＳの作成
ＹＡＣ挿入物末端由来のＳＴＳは、本質的にはギャーツ等の記載に従って、直接的ＤＮＡ配列決定分析と組み合わせたベクトレットＰＣＲ法を用いて取得した[４１]。基本的には上記の方法に従い、プライマーの組を創出し、ヒトゲノムＤＮＡ上で試験した。本明細書全体を通じ、ＳＴＳは簡便のためその略称で呼称する(例えば、ＳＴＳ１２−ＲＭ１の代わりにＲＭ１)。
【００４８】
３.結果
３.１.遺伝子座Ｄ１２Ｓ８の周囲のＹＡＣコンティグの組み立て
先の研究において[３９]、Ｄ１２Ｓ８の周囲の８００ｋｂ ＹＡＣコンティグが記載された。このコンティグは、部分的に重複した以下の３個の非キメラＣＥＰＨＹＡＣクローンで構成されていた：２５８Ｆ１１、３２０Ｆ６、および２３４Ｇ１１。このコンティグを染色体歩行プロジェクトのための出発点として使用して、様々な良性の充実性腫瘍の切断点を包含する、１２番染色体の長腕上のＤＮＡ領域を明確にするが、これらは全てＤ１２Ｓ８の近位およびＣＨＯＰの遠位に位置している。最初に、染色体歩行を、コンティグの大きさがその向きの信憑性ある決定を可能にするまで、二方向的に実施した。この二方向性およびその後の一方向性染色体歩行工程においては、以下の一般法を使用した。まず、ＹＡＣクローンの末端の救出および配列決定は、これらの左および右側に特性を与えるＤＮＡマーカーを産んだ(表Ｉ)。４０のＹＡＣ挿入物の末端の配列データに基づき、ＤＮＡの特異的増幅のためのプライマーの組を創出し、ＳＴＳを確立した(表II)。１２ｑ１３−ｑｔｅｒへのそれらの局在が、ＣＡＳＨによって、そして対応するコスミドクローンを分離した後、ＦＩＳＨによって決定された。さらに、分離されたＹＡＣクローンはしばしばＦＩＳＨ分析によって評価され、したがってそれら挿入物の染色体起源が明らかにされるのみならず、幾つかの場合については、それらのキメラ的性格が確立され規定されたことに留意すべきである。さらに、一部重複するＹＡＣクローンの制限エンドヌクレアーゼ分析により得られるデータは、ＹＡＣクローンの評価およびその後の並列の際に考慮されたことを強調すべきである。連続的に選択され評価されたプライマーの組により、ＹＡＣおよびコスミドライブラリーのスクリーニングが実施され、コンティグ組み立てのための構築ブロックが分離された。故に、ＦＩＳＨ−およびＳＴＳ−含有量マッピングならびに制限エンドヌクレアーゼ分析から誘導されるデータを使用して、コンティグ組み立てを実施した。このアプローチを使用して本発明者等は、およそ６ＭｂのＤＮＡをカバーする７５の部分重複するＹＡＣクローンから成るＹＡＣコンティグを確立した(図１)。このコンティグは、研究された全ての腫瘍由来細胞系の１２番染色体切断点を包含しているように見受けられた。このコンティグの構築に使用されたＹＡＣの特性を表Ｉに示す。
【００４９】
３.２.ＹＡＣコンティグの染色体方向の確立
１２番染色体の動原体に向かう一方向性染色体歩行を可能にするため、ＳＴＳＲＭ１４およびＲＭ２６に隣接するＤＮＡ領域(およその大きさ：１４５０kb)の向きを、二色間期ＦＩＳＨ分析によって決定した。これらのＳＴＳに対応するコスミドクローン(即ちＬＬ１２ＮＣ０１−１Ｆ６(ＲＭ１４)およびＬＬ１２ＮＣ０１−９６Ｃ１１(ＲＭ２６))を別個に標識すると、それぞれ緑色または赤色のシグナルを示した。対照遺伝子座としてコスミドＬＬ１２ＮＣ０１−１９３Ｆ１０を標識したところ、検出時に緑色シグナルを示した。ＬＬ１２ＮＣ０１−１９３Ｆ１０はかつて、脂肪腫細胞系Ｌｉ−１４／ＳＶ４０および子宮平滑筋腫細胞系ＬＭ−３０.１／ＳＶ４０において、ＬＩＳ−３／ＳＶ４０(即ちＣＨＯＰ)の切断点の遠位および染色体１２ｑ切断点の近位にマッピングされた。ＬＬ１２ＮＣ０１−１Ｆ６およびＬＬ１２ＮＣ０１−９６Ｃ１１は、脂肪腫細胞系Ｌｉ−１４／ＳＶ４０および子宮平滑筋腫細胞系ＬＭ−３０.１／ＳＶ４０において、１２ｑ切断点の遠位にマッピングされることが判明した。故に、ＬＬ１２ＮＣ０１−１９３Ｆ１０は、ＲＭ１４およびＲＭ２６の両方に対して近位にマッピングされると結論付けられた(未発表の結果)。１５０の採点された有用な間期のうち、１８％は赤−緑−緑のシグナル順序を示し、一方７２％が緑−赤−緑のシグナル順序を示した。これらの観察に基づき、本発明者等は、ＲＭ２６がＲＭ１４に対し近位にマッピングされると結論付け、よって本発明者等は、ＹＡＣコンティグを、本発明者等のコンティグのＲＭ２６(即ち近位)側からのみ伸長させ続けた。ＲＭ１４およびＲＭ２６を含むコスミドのみが二色間期マッピングによって順序付けられ、他の全ての順序はＹＡＣコンティグのデータから推理された。最後に、二色間期ＦＩＳＨ研究の結果に基づいて提起されたコンティグの染色体方向が、ＹＡＣコンティグを、種々の腫瘍細胞系中に存在する１２番染色体切断点を超えて伸長させた後に、個別に確認されたことに留意すべきである。この確認情報は膨大なＦＩＳＨ研究で得られ、そこでは、ＹＡＣおよびコスミドクローンの位置が、一次脂肪腫、子宮平滑筋腫、多形態性唾液腺腫、および肺軟骨様過誤腫または誘導細胞系の染色体１２ｑ１３−ｑ１５切断点に対して相対的に決定された[２４、４２、２５、４３]。
【００５０】
３.３.Ｄ１２Ｓ８周囲の６Ｍｂ ＹＡＣコンティグからの稀切断物理的地図の組み立て
稀切断酵素(材料および方法を参照されたい)で完全に消化しＣＨＥＦゲル上で分離した、ＹＡＣ ＤＮＡを加えた総酵母のサザンブロットを、ｉ)問題のＹＡＣの最初のスクリーニングのために使用されたＳＴＳ、ii)ｐＹＡＣ４右腕配列、iii)ｐＹＡＣ４左腕配列、およびiv)ヒトＡＬＵ−反復プローブ(ＢＬＵＲ−８)を用いて連続的にハイブリダイズした。このようにして得られた広範囲の制限地図を、ＰＣＲ分離されたＳＴＳ／ＹＡＣ末端プローブでプロービングすることにより完成した。時に二重消化を行った。個々のＹＡＣクローンの制限地図を並置し、共通制限地図を確立した。ここで、共通稀切断地図全体は、完全な内部一致を示す少なくとも２個の独立したクローンによって支持されることに留意することが重要である。
【００５１】
３.４.ＣＡ反復および単形態性ＳＴＳ／ＥＳＴの物理的地図作成
ヒト１２番染色体に関する第二回国際ワークショプで明らかとなった統合されたマッピングデータに基づき[４４]、幾つかの公表されているマーカーが、本明細書に提示されるＹＡＣコンティグ内にマッピングされることが期待された。本発明者等のマッピングデータを他者により得られたデータと完全に統合させるため、幾つかのマーカーを本発明者等のコンティグ上にＳＴＳ含量マッピングし、そして陽性であると判明したものをその後ＹＡＣサザンブロット上の(プライマー)ハイブリダイゼーションによってさらに位置決定した。本明細書中に提示されるコンティグ内に存在することが判明したマーカーのうちには、ＣＡ反復Ｄ１２Ｓ３１３(ＡＦＭ２０７ｘｆ２)およびＤ１２Ｓ３３５(ＡＦＭ２７３ｖｇ９)[４５]、Ｄ１２Ｓ３７５(ＣＨＬＣ ＧＡＴＡ３Ｆ０２)、およびＤ１２Ｓ５６があった[４６]。さらに、一般に入手し得る配列データに基づき本発明者等が開発したプライマーの組を使用して、インターフェロンγ遺伝子(ＩＦＮＧ)[４７]、ラス関連蛋白遺伝子Ｒａｐ１Ｂ[４８]、および発現された配列タグＥＳＴ０１０９６[４９]がマッピングされた(表IIを参照されたい)。試験され陰性であるとわかったマーカーは、Ｄ１２Ｓ８０(ＡＦＭ１０２ｘｄ６)、Ｄ１２Ｓ９２(ＡＦＭ２０３ｖａ７)、Ｄ１２Ｓ３２９(ＡＦＭ２４９ｘｈ９)およびＤ１２Ｓ３４４(ＡＦＭ２９６ｘｄ９)を包含した。
【００５２】
４.考察
本実施例においては、ＹＡＣコンティグ、および、幾つかの頻発する良性充実性腫瘍の染色体異常をマッピングすることが知られているＭＡＲを含むヒト１２番染色体の長腕上の領域である、１２ｑ１５上のおよそ６Ｍｂをカバーする稀切断物理的地図の確立が例示された。
コンティグの全長をおよそ６Ｍｂにおいて、個々のＹＡＣ間の重複の程度を注意深く測定した(図１)。ＹＡＣクローンの幾つかについての本発明者等の寸法別分類データは、ＣＥＰＨにより決定された大きさと僅かに相違することに留意すべきである[５０]。これは恐らく異なる研究所におけるパルスフィールドゲルの稼働のためのパラメータの相違に起因するというのが本発明者等の見解である。
【００５３】
制限マッピングおよびＳＴＳ含有量分析を使用して、共通する広範囲の物理的地図(図１)を組み立てた。全体の複合地図は少なくとも２倍のカバレッジにより支持される。合計で３０Ｍｂ以上のＹＡＣ ＤＮＡが制限およびＳＴＳ含有量分析により特性決定され、これは約５倍の平均コンティグカバレッジに相当する。このパルスフィールド電気泳動の技術に伴う「生来の」限定された分析では、非常に正確なサイズの判断はできないものの、本明細書に提示されるＹＡＣコンティグ内に含まれる５００kbコスミドコンティグから得られる制限マッピングデータとの比較は、極めて良好な相関を示した。コスミドデータからの外挿で、本発明者等は、本明細書に提示された稀切断物理的地図の精度を約１０kbと評価する。
【００５４】
本発明者等の物理的マッピング研究の結果は、３個の遺伝子特異的および他者により分離された名称の無い５個のマーカーの統合を可能にした(図１の矢印の間に示される)。この名称の無いマーカーは、１個の単形態性および４個の多形性マーカーを含む。かつて公刊された５個のＹＡＣ末端由来の単コピーＳＴＳ(ＲＭ１、ＲＭ４、ＲＭ５、ＲＭ７、およびＲＭ２１)ならびに４個の公刊されているＣＡ反復(Ｄ１２Ｓ５６、Ｄ１２Ｓ３１３、Ｄ１２Ｓ３３５、およびＤ１２Ｓ３７５)および３個の公刊されている遺伝子付随ＳＴＳ／ＥＳＴ(ＲＡＰ１Ｂ、ＥＳＴ０１０９６、およびＩＦＮＧ)が同じ物理的地図上に置かれたが、これは、その領域中にマッピングされる幾つかの特性／疾病遺伝子の(連鎖)マッピングおよび同定を容易にするであろう。さらに本発明者等は、同じ物理地図上に、染色体歩行の工程中に開発した、７２のＹＡＣ末端由来(表Ｉ)および８個のコスミド末端−またはインターＡＬＵ−由来のＤＮＡマーカー(ＣＨ９、ＲＭ１、ＲＭ１１０、ＲＭ１１１、ＲＭ１３０、ＲＭ１３１、ＲＭ１３２、およびＲＭ１３３)を置くことができた。ＰＹＴＨＩＡ＠ａｎｌ．ｇｏｖのＰＹＴＨＩＡ自動通信サーバーを使用して、これらＤＮＡマーカーの誘導された配列を反復の存在についてスクリーニングした。これら７２のＤＮＡマーカーのうち４３について(表IIに列挙されている)、プライマーの組を創出し、ＰＣＲおよびヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により、対応するＳＴＳが単コピーであることを決定した。残りの２９のＤＮＡマーカー(黄色の囲み内に示される)はＹＡＣ末端誘導配列を表し、これらについては本発明者等はプライマーの組を作らなかった。これらのＹＡＣ末端配列は、制限地図作成に基づき１２番染色体にマッピングされると思われる。最後の写真は、７０kb内にほぼ１個という、この領域における通算のマーカー密度を明らかにしている。
【００５５】
本明細書に提示されるコンティグの分析は、ハウスキーピング遺伝子に頻繁に付随することが知られているＨＴＦ島であるかも知れない、多数の富ＣｐＧ領域を明らかにした。これらＣpＧ島は、まだ未確認の遺伝子の５'末端に位置する可能性が高い：ＹＡＣ ＤＮＡ中、３またはそれ以上の稀切断制限部位が一致する、９０％の事例において、付随遺伝子のあることが示されている[５１]。これは、この領域内で尚同定されるべき遺伝子の数の過小評価であると思われ、何故なら、組織特異的遺伝子の６０％はＣｐＧ島を伴わない[５２]からであり、また、一つの島から２個の遺伝子が別の向きに転写されることが起こり得るからである。
【００５６】
ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリーマーク１から分離されたＹＡＣクローンの幾つかはキメラであることが判明したが、ＦＩＳＨ、制限マッピングおよびＳＴＳ含有量分析に基づき非キメラであるように見受けられる部分重複ＹＡＣクローンがそれぞれのスクリーニングで得られ、これは、該ライブラリーの報告されている複雑性に合致するものである。ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリーマーク１についてのキメラ性の程度が、本明細書中で研究されている領域について１８％(６８のうち１２)であると決定された。ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリーマーク３由来のＹＡＣの少数(この研究には７個のＭＥＧＡ ＹＡＣのみが含まれた)では、このライブラリー中に存在するキメラクローンのパーセンテージの信頼し得る評価ができなかった。マーク１ライブラリーから誘導されたＹＡＣの平均サイズは３８１kbであると算出され；非キメラ性ＹＡＣ(ｎ＝５８)は平均サイズが３６６kbであり、一方キメラ性ＹＡＣ(ｎ＝１２)はかなり大きな平均サイズ、即ち４５４kbを持つとわかった。
【００５７】
要約すると、本発明者等は、様々な良性充実性腫瘍において頻繁に再編成されるヒト染色体領域に対応する６Ｍｂ ＹＡＣコンティグを提示する。このコンティグは、３個の遺伝子付随ＳＴＳを含む８４の遺伝子座を連結している。さらに、制限地図作成により本発明者等は、そこに存在する遺伝子を暗示し得る少なくとも１２のＣｐＧ島を同定した。最後に、このコンティグ内に４個のＣＡ反復を位置決定した。該領域の遺伝学的、物理学的、および転写地図の統合は、１２番染色体のこの領域のさらなる研究のための基本的枠組みを提供する。初期の研究はＭＡＲおよびＵＬＣＲ１２に収束するようであったが、これは、これらの領域が少なくとも３つの別個の型の充実性腫瘍の切断点クラスター領域を含むためである。本発明者等が本明細書に記載する種々のＹＡＣクローンは、このような研究のための貴重な資源である。それらは、この領域に存在する遺伝子の探索および種々の良性充実性腫瘍の１２番ｑ染色体異常により直接影響を受けるものの同定を容易にするに相違ない。
【００５８】
実施例２
１.序
ヒト染色体１２ｑ１５上の１.７Ｍｂ複合異常領域は、異なる良性充実性腫瘍
型にしばしば見いだされる頻発する１２番染色体切断点を持っていることが判明した。この実施例においては、病因上の関連があるように見えるＭＡＲ内のＨＭＧ遺伝子の同定を述べる。ポジショナルクローニングのアプローチを用いて、高速移動群蛋白遺伝子ＨＭＧＩ−ＣをＭＡＲの１７５kbセグメント内部に同定し、そのゲノム機構の特性決定を行った。ＦＩＳＨによりこの遺伝子内部に、７つの異なる良性充実性腫瘍型の切断点の大半が精確に指摘された。サザンブロットおよび３'−ＲＡＣＥ分析により、ＨＭＧＩ−Ｃにおける矛盾のない再編成および／または変化したＨＭＧＩ−Ｃ転写物の発現が立証された。これらの結果は、ＨＭＧ遺伝子ファミリーの一員と良性充実性腫瘍の発達との間の連鎖を示すものである。
【００５９】
２.材料および方法
２.１.細胞培養および一次腫瘍標本
図３に列挙される腫瘍細胞系は、トランスフェクション法により確立され[５４]、前に[３９、２４]で、そして本出願に付属文書１として添付されているヴァン・ドウ・ヴェン等、Genes Chromosom. Cancer、１２、２９６−３０３(１９９５)という文献中に記載されている。２０％ウシ胎児血清を添加したＴＣ１９９培地で細胞を生育させ、標準的細胞遺伝学技術により規則正しい間隔で検定した。ヒト肝細胞性癌腫細胞系Ｈｅｐ ３ＢおよびＨｅｐ Ｇ２をＡＴＣＣより取得し(受理番号ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６４およびＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５)、４％アルトロサーを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２(ギブコ／ＢＲＬ)中で培養した。一次充実性腫瘍は様々な大学診療所から入手した。
【００６０】
２.２.ＹＡＣおよびコスミドクローン
ＹＡＣクローンは、ＰＣＲに基づくスクリーニング[５９]およびコロニーハイブリダイゼーション分析の組み合わせを用いてＣＥＰＨマーク１[５７]およびマーク３[５８]ＹＡＣライブラリーから分離した。コスミドクローンは、ローレンス・リヴァーモア・ナショナル・ラボラトリーから入手した(Ｐ.ドゥ・ジョングの好意による)整列させたヒト１２番染色体特異的コスミドライブラリー(ＬＬ１２ＮＣ０１)から分離した[６０]。ＬＬ１２ＮＣ０１由来のコスミドクローンは、それらの微量定量プレート上の番地により表示される；即ち例えば２７Ｅ１２というように。
【００６１】
コスミドＤＮＡは、キアゲンチップ(ディアゲン)での精製を含む標準技術を用いて抽出した。高分子量酵母＋ＹＡＣ ＤＮＡ(１ｘ１０9細胞ml-1に相当)を含有するアガロース充填剤を前記[６１]のように調製した。充填剤を、Ｔ10Ｅ1(ｐＨ８.０)２５ml４回、その後１ｘ制限緩衝液０.５ml２回に対し完全に透析した後、それらをパルスフィールド制限酵素マッピングまたはＹＡＣ末端救出のいずれかに付した。ＹＡＣ末端救出は、前記参考文献６１に記載のように、直接固相ＤＮＡ配列決定と組み合わせたベクトレット−ＰＣＲ法を用いて実施した。インターＡｌｕＰＣＲ生成物は、公表されているオリゴヌクレオチドＴＣ６５または５１７を用いて分離し[６２]、クローニングを容易にするためここにＳａｌＩ尾を付加した。配列分析後、ＯＬＩＧＯコンピューターアルゴリズムを用いてプライマー対を開発した[６１]。
【００６２】
２.３.ＤＮＡ標識化
ＹＡＣ、コスミド、ＰＣＲ生成物およびオリゴヌクレオチドからのＤＮＡを様々な技術を用いて標識した。ＦＩＳＨのために、コスミドクローンまたはＹＡＣのインターＡｌｕＰＣＲ生成物をニック翻訳によりビオチン−１１−ｄＵＴＰ(ベーリンガー)でビオチニル化した。フィルターハイブリダイゼーションのために、ランダム六量体を用いてプローブをα−32Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識した[６２]。サイズが２００bpより小さいＰＣＲ生成物の場合、同様のプロトコルを適用したが、標識化反応を開始させるために特異的オリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチドはγ−32Ｐ−ＡＴＰを用いて標識した。
【００６３】
２.４.ヌクレオチド配列分析およびＰＣＲ増幅
ヌクレオチド配列は実施例１に記載のように決定した。配列決定結果は、Ａ.Ｌ.Ｆ.ＤＮＡシークエンサー(商標)(ファルマシア・バイオテク)を使用し標準的３０cm、６％ハイドロリンク(商標)、ロングレインジ(商標)ゲル(ＡＴバイオテク)上で分析した。ＰＣＲ増幅は本質上前記と同様に実施した[３９]。
【００６４】
２.５.ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(ＲＡＣＥ)
３'ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(３'−ＲＡＣＥ)は、ギブコ／ＢＲＬ３'−ＥＴプロトコルの一部を僅かに改変した方法を用いて行った。第一鎖ｃＤＮＡ合成のためには、アダプタープライマー(ＡＰ２)ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＣＡＴ Ｃ(Ｔ)17を使用した。第一および第二回目のＰＣＲの両者のために、不変増幅プライマー(ＵＡＰ２)ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＣＡ ＴＣを「逆プライマー」として使用した。ＰＣＲの第一回目では以下の特異的「前進プライマー」を使用した：ｉ)５'−ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＡＣ−３'(エキソン１)、ii)５'−ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＡＣ ＣＴＡ ＧＧＡ−３'(エキソン３)、またはiii)５'−ＡＡＣ ＡＡＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＴＴ ＡＡＴ ＴＡＣ ＴＧ−３'(３'−ＵＴＲ)。ＰＣＲの第二回目では以下の特異的前進プライマー(第一回目で使用されたものと比較して入れ子状のプライマー)を使用した：ｉ)５'−ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＣ−３'(エキソン１)、ii)５'−ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＧＴＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＣＴ−３'(エキソン４)、またはiii)５'−ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＣＡＵ ＴＴＧ ＡＴＣ ＴＧＡ ＴＡＡ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＧＧ−３'(３'−ＵＴＲ)。入れ子状特異的プライマーのＣＵＡ／ＣＡＵ尾は、指向性のクローンアンプクローニング系(ギブコ／ＢＲＬ)の使用を可能にした。
【００６５】
３.結果
３.１.コスミドコンティグおよびＭＡＲセグメントのＳＴＳ地図の開発
ヒト１２番染色体の長腕に焦点を絞ったポジショナルクローニング作業工程の間に本発明者等は、約６Ｍｂにわたる、そして７５の部分重複ＹＡＣから成る酵母人工染色体(ＹＡＣ)コンティグを組み立てた。その説明については実施例１を参照されたい。このコンティグはＭＡＲを包含しており(図２をも参照されたい)、そこでは、様々な一次良性充実性腫瘍(これまで試験された８つの異なる型の３４の腫瘍；表５)および腫瘍細胞系(これまで試験された２６。脂肪腫、子宮平滑筋腫、および多形態性唾液腺腫より誘導；図３)に存在する殆どの染色体１２ｑ１３−ｑ１５の切断点の殆どが密集しているように見える。本発明者等は広範囲ＳＴＳおよびＭＡＲの稀切断物理的地図の両者を開発し、ＦＩＳＨ分析により、ＭＡＲの４４５kb亜領域内にマッピングされる切断点の殆どがＳＴＳ ＲＭ３３およびＲＭ９８の間に位置することを見いだした(図２および図３を参照されたい)。大規模な品質管理を含むＦＩＳＨ実験を、常法に従い前記のように実施した[２５、３９、２４、４２、３６]。この４４５kb ＭＡＲセグメント内部の切断点の分布をさらに精密にするため、５４の一部重複コスミドクローンで構成されるコスミドコンティグを開発し、稠密なＳＴＳ地図(図２)を確立した。このコスミドコンティグは、稀切断物理的地図との比較およびＳＴＳ含有量マッピングによって二重確認した。
【００６６】
３.２.ＭＡＲの１７５kbＤＮＡセグメント内部への染色体１２q切断点の密集
研究された様々な腫瘍細胞系中の染色体１２ｑ切断点が、ＦＩＳＨによりコスミドコンティグ内部に精確に指摘された(図３)。本発明者等の品質管理ＦＩＳＨ実験の一部として[２５、３９、２４、４２]、選択されたコスミドをまず、正常リンパ球から誘導された中期拡散について試験した。ＦＩＳＨの結果は、これら腫瘍細胞系中の１２番染色体切断点の大多数(少なくとも２６例のうちの１８)がＲＭ９９およびＲＭ１３３の間の１７５kbＤＮＡ間隔の中に密集して見いだされることを示し、これは、この間隔が中心的な切断的クラスター領域を構成することを示すものである。Ｌｉ−５０１／ＳＶ４０で得られたＦＩＳＨ結果は、ＭＡＲの一部は見掛け上正常な第３染色体に転座する事(応用細胞遺伝学により目撃された染色体異常)を示した。最後に、子宮平滑筋腫細胞系ＬＭ−５.１／ＳＶ４０、ＬＭ−６５／ＳＶ４０、およびＬＭ−６０８／ＳＶ４０の切断点が同じコスミドクローン、即ちコスミド２７Ｅ１２内部にマッピングされる事が見いだされたという事実は、興味を持って注目される。
本発明者はさらに、染色体１２ｑ１３−ｑ１５の異常を有する８つの異なる型の一次良性充実性腫瘍についてＦＩＳＨ実験を行った(表４)。コスミドクローン２７Ｅ１２および１４２Ｈ１の混合物を分子プローブとして使用した。要約すると、一次腫瘍のＦＩＳＨ研究の結果は、腫瘍細胞系について得られた結果と矛盾しなかった。試験された７つの異なる腫瘍型の各々の切断点がＭＡＲの同じ１７５kb ＤＮＡ間隔内部に見いだされたという観察は、この間隔がこれらの腫瘍の発達と決定的に関連し、故に可能性あるＭＡＧ遺伝子座またはその重要な部分を有しているかも知れないということを示唆した。
【００６７】
３.３.ＭＡＲ内部にマッピングされる候補遺伝子の同定
ＳＴＳ ＲＭ９９およびＲＭ１３３の間のＭＡＲの１７５kb亜領域内部にマッピングされる候補遺伝子を同定する試みにおいて、本発明者等は３'−末端エキソン捕捉およびゲノム配列サンプリング(ＧＳＳ)を使用した[６３]。ＧＳＳアプローチを使用して本発明者等はコスミド２７Ｅ１２の４.９kbＢａｍＨＩサブフラグメントの末端のＤＮＡ配列データを得、これはＦＩＳＨ分析により、試験された子宮平滑筋腫細胞系のうち３個において１２番染色体の異常によって分断されることが示された。ＢＬＡＳＴ[６４]探索は、これらの配列の一部が、ＨＭＧ遺伝子ファミリーの一員である[６６]高速移動群(ＨＭＧ)蛋白遺伝子ＨＭＧＩ−Ｃ[６５]の一般に入手し得る部分的ｃＤＮＡ配列(ＥＭＢＬ受理番号Ｚ３１５９５)と配列一致を示すことを明らかにした。これらの観察に照らし、ＨＭＧＩ−Ｃは候補ＭＡＧ遺伝子であると考えられ、さらに詳細に研究した。
【００６８】
３.４.ＨＭＧＩ−Ｃのゲノム機構および良性充実性腫瘍における再編成
ＨＭＧＩ−Ｃ転写物は１２００ヌクレオチド(報告されたサイズはおよそ４kb[６５、６７])が一般に入手し得るのみであるため、本発明者等はまず、ＨＭＧＩ−Ｃ転写物(ジェンバンク、＃Ｕ２８７４９)の残りのヌクレオチド配列の殆どを決定した。この事は、本発明者等にとって該遺伝子のゲノム機構の実質的な確立を可能にした。この配列データについて興味深く注目される事は、ＣＴ反復がＨＭＧＩ−Ｃの５'−ＵＴＲに、そしてＧＧＧＧＴペンタヌクレオチド反復が３'−ＵＴＲに存在することであり、これらは調節上の関連があるかも知れない。当該遺伝子の転写されたものをゲノムＤＮＡ配列(ジェンバンク、＃Ｕ２８７５０、Ｕ２８７５１、Ｕ２８７５２、Ｕ２８７５３、およびＵ２８７５４)と比較することにより、ＨＭＧＩ−Ｃが少なくとも５個のエキソンを含むことが明らかとなった(図２)。遺伝子の転写方向は染色体の長腕のテロメアに向かっている。最初の３個のエキソンの各々は、可能性あるＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)をコードしており、そしてエキソン５は、エキソン４によりコードされているスペーサードメインにより３個のＤＢＤから分離されている酸性ドメインをコードしている。３個のＤＢＤコード化エキソンは、互いに比較的近接して位置しており、約１４０kbの大きなイントロンによって他の２個のエキソンと分離され、そしてこの２個は互いに約１１kb離れている。ここで特段の興味を持って強調されることは、５個のエキソンは少なくとも１６０kbのゲノム領域にわたって散在しており、したがって上記の１７５kbの主要ＭＡＲ切断点クラスター領域全体を殆どカバーしているという事である。分子プローブとしてコスミド１４２Ｈ１(エキソン１−３を含む)および２７Ｅ１２(エキソン４および５を含む)の混合物を使用した分子細胞遺伝学的研究の結果は、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子が、評価された腫瘍および腫瘍細胞系の大多数において観察された１２番染色体の異常に直接影響を受けていることを明確に証明する(図３；表４)。これらの細胞遺伝学的観察は、ＬＭ−６０８／ＳＶ４０(結果は示されていない)、ＬＭ−３０.１／ＳＶ４０[２４]、およびＡｄ−３１２／ＳＶ４０(使用されたプローブはＣＨ７６、ＲＭ１１８−Ａ、およびＥＭ２６を包含した)の事例におけるサザンブロット分析によって独立して確認された。これら３つのプローブのいずれを用いてもＬＭ−６５／ＳＶ４０、ＬＭ−６０９／ＳＶ４０、Ａｄ−２１１／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０、Ｌｉ−１４／ＳＶ４０、およびＬｉ−５３８／ＳＶ４０の切断点を検出できなかったという事は、ＭＡＲ中の切断点の相対位置を確立したＦＩＳＨデータとも合致した(図３参照)。これらの結果により、ＨＭＧＩ−Ｃが、仮定的ＭＡＧ遺伝子の第一候補とされた。
【００６９】
３.５.良性充実性腫瘍細胞における異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物の発現
追跡的研究の内容において、可能性ある異常ＨＭＧＩ−Ｃ発現について試験することは興味深いものであった。最初のノーザンブロット研究により、ＨＭＧＩ−Ｃの転写物は、試験された多様な正常組織(脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、胎盤、骨格筋)ならびに図３に列挙される幾つかの腫瘍細胞系で検出することができないことが明らかとなった(データは示されていない)。正常な分化した組織中のＨＭＧＩ−ＣｍＲＭＡレベルは悪性組織中よりもずっと低いことが知られている[６５、６７]。本発明者等のノーザン研究の対照として、本発明者等は、比較的高いレベルのＨＭＧＩ−Ｃを発現することが知られる肝癌細胞系Ｈｅｐ３Ｂを含めた。本発明者等は、大きさがおよそ３.６および３.２kbである二つの主要なＨＭＧＩ−Ｃ転写物を容易に検出した(分子量の相違はそれらの５'−非コード化領域の相違に起因するというのが最もありそうなことである)。ＨＭＧＩ−Ｃまたは３'−異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物を検出する代替の且つより感受性の高いアプローチにおいて、本発明者等は３'−ＲＡＣＥ実験を行った。多様なＨＭＧＩ−Ｃ転写レベル(Ｈｅｐ ３Ｂ肝癌細胞では高レベル、Ｈｅｐ Ｇ２肝癌細胞では中等度、そして子宮筋層、正常脂肪組織、および偽粘液腫では低レベル)を有する幾つかの組織を用いた対照実験において、本発明者等は、３つの選択されたプライマーの組のいずれが使用されようとも、分子クローニングおよびヌクレオチド配列分析時に３'−ＨＭＧＩ−ＣｍＲＮＡ配列の完璧な部分ｃＤＮＡコピーを表すように見える３'−ＲＡＣＥクローンを取得した(方法論を参照されたい)。潜在性のまたは異常にスプライスされたＨＭＧＩ−Ｃ転写物に対応する可能性が最も高いＲＡＣＥ生成物が時に観察され、それらの異所性配列は、ＨＭＧＩ−Ｃイントロン３または４に戻ってマッピングされた。
【００７０】
１０の異なる一次腫瘍または脂肪腫、子宮平滑筋腫、および多形態性唾液腺腫から誘導された腫瘍細胞系の同様な３'−ＲＡＣＥ分析において、本発明者等は定常的および特異なＰＣＲ生成物の両者を検出した。定常的ＰＣＲ生成物は殆どの場合３'−ＨＭＧＩ−ＣｍＲＮＡ配列の完璧な部分ｃＤＮＡコピーを表すように見えた。それらは恐らくは変化を受けていないＨＭＧＩ−Ｃ対立遺伝子に起源する可能性が最も高く、内部対照として考えられるかも知れない。ここに提示された１０の腫瘍細胞試料の特異なＰＣＲ生成物は、ＨＭＧＩ−Ｃ配列と融合した異所性配列を含むように見受けられた。殆どの場合、異所性配列は、確立された転座相手から誘導されることが見いだされ、したがって、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の、転座で誘発される再編成のための独立した証拠を提供するものである。これらのＲＡＣＥ生成物の異所性配列のヌクレオチド配列、転換点、および染色体起源に関する情報を表５に要約する。異所性配列の染色体起源は、コリエル・セル・レポジトリーズから入手したＮＩＧＭＳ ヒト／齧歯類体細胞ハイブリッドマッピングパネル２を用いてＣＡＳＨ(体細胞ハイブリッドを用いる染色体割り当て)によって確立されたことに留意すべきである。染色体割り当ては、表５にさらに概説されるように、ｐＣＨ１１１１、ｐＣＨ１７２、ｐＣＨ１７４、ｐＣＨ１９３、およびｐＣＨ１１７の事例についてさらなるデータにより個別に確認された。常套的細胞遺伝学的分析の限界を考慮すると、複雑な核型の場合には特に、異所性配列の染色体割り当ては、かつての転座の細胞遺伝学的記載と良好に一致する。
【００７１】
得られる分子細胞遺伝学的分析が、その１２番染色体切断点がＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の遥か外側(１Ｍｂ以上)にマッピングされることを示したという、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０で得られたデータは、幾分予想外であった[４２]。異所性配列は、確立された転座相手である第１染色体(より正確には、部分的に１ｐ２２にマッピングされるＭ.Ｉ.Ｔ.ＹＡＣコンティグＷＣ−５１１内部のセグメント)に起源を発するように見えた(図２)。この特別の事例における異常ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の機能的発現への影響を正確に解明するためにはさらなる分子解析が必要とされる。ここでさらに興味を持って注目されることは、ＧＧＧＧＴ反復がＲＡＣＥ生成物中に存在しないことから、第１染色体に由来する配列が、ＨＭＧＩ−Ｃの３'−ＵＴＲ領域に観察されるＧＧＧＧＴ反復を除去するらしいことである。対照的に、やはり３'−ＵＴＲに切断点を有することが示された一次子宮平滑筋腫ＬＭ−＃５８(ｔ(８；１２)(ｑ２４；ｑ１４−ｑ１５))においては、この反復はＲＡＣＥ生成物中に存在するらしく思われた。故に、この反復の除去は、十中八九腫瘍の発達にとって決定的ではない。Ｘ染色体が細胞遺伝学的に指定された転座相手である、一次腫瘍ＬＭ−＃１６８.１に関する結果は、異所性配列が、平滑筋腫における優先的転座相手である第１４染色体から誘導されることを明らかにした。第１４染色体の関与は、Ｌｉ−５０１／ＳＶ４０の場合にそうであると判明したように、この特別の事例での標準的核型決定によっては検出できない可能性がある。一次脂肪腫Ｌｉ−＃２９４(ｔ(８；１２)(ｑ２２；ｑ１４))では、これに代わる２個の異所性配列が検出された。ヒト第８染色体に対するプローブの領域位置決定のためのハイブリッド細胞マッピングパネルを使用したさらなるＣＡＳＨ分析[６８]は、これらが共に染色体８ｑ２２−ｑｔｅｒから誘導されていることを明らかにした(表５)。これらのＲＡＣＥ生成物が、選択的にスプライシングされた転写物に相当するということは極めて可能性が高い。最後に、事例のうち４つにおいて(表５、ｐＣＨ１１４、ｐＣＨ１１０、ｐＣＨ１０９、ｐＣＨ１１６)、対応する異所性配列がＨＭＧＩ−Ｃイントロン３または４のいずれかから誘導されると判明したことから、ＲＡＣＥ生成物は潜在性のまたは異常にスプライスされたＨＭＧＩ−Ｃ転写物に相当するように見えた。このようなＲＡＣＥ生成物は上記の対照実験でも観察されている。結論として、腫瘍細胞における異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物の検出は、ＨＭＧＩ−Ｃが様々な１２番染色体異常により一貫して再編成されていることをさらに強く支持するものである。様々な事例における異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物は、生物学的な関わりについて何らかの最終的結論を引き出す前に、全長を特性決定すべきであるということに留意すべきである。
【００７２】
分離された異所性配列の最初のそして予備的評価は、変動する長さの、位相が同じオープンリーディングフレームを明らかにした。例えば一次腫瘍ＬＭ−＃２５の場合、その異所性配列の第二コドンが既に終止コドンであるらしい(表５)。配列データは２回の大規模な(恐らく突然変異を誘発する)ＰＣＲを経て生成されたクローンについてのみ得られているため、ここでは注意することがふさわしい。興味を持って注目されることは、Ｌｉ−５０１／ＳＶ４０については、ノーザンブロット分析において、分離された異所性配列が、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、および骨格筋を包含する種々の組織に１０kb以上の転写物を検出したが、脳には検出されなかった(データは示されていない)ということである。第３染色体は脂肪腫中の染色体１２ｑ１３−ｑ１５転座の好ましい相手であり、また種々の脂肪腫の第３染色体切断点はＹＡＣクローンＣＥＰＨ１９２Ｂ１０を横切っていることが見いだされたことから、検出された転写物は、可能性ある脂肪腫を好む相手遺伝子(ＬＰＰ)に相当するのかも知れない。
【００７３】
４.考察
付属文書１において、脂肪腫、多形態性唾液腺腫、および子宮平滑筋腫の染色体１２ｑ１３−ｑ１５切断点は、過去にそれらが１２番染色体のセグメントｑ１３、ｑ１４、またはｑ１５に細胞遺伝学的に割り当てられたことに関わりなく、全てＭＡＲと呼称される１.７Ｍｂ ＤＮＡ間隔内部に全て密集している。３つの腫瘍型のうち２つで１２番染色体転座切断点にかかっているＣＥＰＨメガ−ＹＡＣを同定しているシェーンベルク・フェッツォ等の最近の研究[１４]は、この主張されている切断点の密集を支持している。本研究において本発明者等は、ＦＩＳＨ分析により、７つの異なる充実性腫瘍型の１２番染色体切断点が、ＭＡＲの比較的小さな(１７５kb)セグメント内部に密集していることを決定的に立証した。幾つかの腫瘍細胞系についてはサザンブロットデータが得られ、これらは常にＦＩＳＨ結果を支持した。これら全ての観察から、本発明者等は、ＭＡＲのこのセグメントはこれらの腫瘍における１２番染色体異常のための主たる標的領域を構成していること、そしてそれは可能性あるＭＡＧ遺伝子座：これらの腫瘍における共通した通性と考えられ得る多腫瘍異常増殖遺伝子座を表していそうなことを結論付ける。
【００７４】
この１７５kb ＭＡＲセグメント内部に、本発明者等はＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子を同定し、そのゲノム機構の特性を決定した。構造的にはこのＨＭＧＩ−Ｃコード化燐蛋白は、３個の可能性あるＤＮＡ結合ドメイン、１個のスペーサー領域、および酸性カルボキシ末端ドメインで構成され、カゼインキナーゼIIおよびｐ３４／ｃｄｃ２の両者のための燐酸化の可能性ある部位を含んでいる[６５、６７]。本発明者等は、ＨＭＧＩ−Ｃが本明細書中で研究された様々な腫瘍型に関わる第一候補の標的遺伝子である強力な証拠を提供した。ＦＩＳＨ研究において、３３の一次腫瘍のうち２９の切断点は、２つの極めて有用なコスミド１４２Ｈ１および２７Ｅ１２の間にマッピングされることが判明した。第一のコスミドは３個のＤＢＤコード化エキソンを含み、第二のコスミドは別の２個のドメインをコードしている残りのエキソンを含んでいる。故に、切断点の大多数は該遺伝子の内部にマッピングされ、それらの殆どは恐らく１４０kbイントロン(イントロン３)内部にあり、これは、評価された２６の腫瘍細胞系で得られたＦＩＳＨ結果とも合致する。ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の５'末端はまだ完全には特性決定されていないことにも留意すべきである。この遺伝子ファミリーの別の成員であるＨＭＧＩ(Ｙ)は様々な代替第一エキソンを持っていることが知られていることから[６９]、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の大きさは、想像されているよりも大きいかも知れない。ＨＭＧＩ−Ｃが１２番染色体異常の影響を受けていることのさらなる支持は、３'−ＲＡＣＥ実験の結果から導くことができる。新たに獲得された配列に融合した転写されたＨＭＧＩ−Ｃ配列で構成される異常ＨＭＧＩ−Ｃ転写物が、腫瘍細胞に検出されたが、明らかに殆どの場合、細胞遺伝学的に転座相手として同定された染色体に起源を発している。多くの染色体が、研究された腫瘍中の転座相手として発見されているという事は注目すべきである。これらの転座に関与する相互切断点領域に観察されるこの不均一性は、ＭＬＬ遺伝子を含む染色体１１ｑ２３再編成を伴う様々な血液学的悪性腫瘍のそれと似ており[７０]、その翻訳産物はＨＭＧＩ蛋白のＤＮＡ結合モチーフに関連するアミノ末端モチーフを持っている。
【００７５】
興味をそそる論点は、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現に及ぼす１２番染色体異常の影響および直接の生理学的関わりに関係している。ＨＭＧＩ−Ｃの幾つかの機能的特徴は知られているか、または他のファミリー成員の研究から推測により導くことができる。それはＤＮＡの小溝で結合することから、ＨＭＧＩ−Ｃはサテライトクロマチンの組織化において役割を果たしているか、または転写因子として働いていると示唆されている[７１、７２]。ＨＭＧＩ−Ｃに最も密接に関連する成員であるＨＭＧＩ(Ｙ)に関する研究は、ＨＭＧＩ(Ｙ)はＮＦ−κ Ｂ転写活性のためのプロモーター特異的副因子として機能し得る事を示唆した。ＨＭＧＩ(Ｙ)はさらに、明瞭な転写因子ＡＴＦ−２イソ型のＤＮＡ結合を刺激または阻害することが示されている[７４]。どちらの研究も、該蛋白はプロモーター／エンハンサー事情において機能する転写装置の構造要素を構成しているに過ぎないことを示している。ＨＭＧＩ−Ｃと類似のドメイン構造を持ち、遺伝子転写において準転写因子として働くＨＭＧ遺伝子ファミリーのさらに別の成員である、高速移動群蛋白１(ＨＭＧ１)に関する最近の報告では、酸性カルボキシ末端領域を欠く末端切除ＨＭＧ１蛋白が遺伝子転写を阻害することが示された[７５]。ＤＮＡ結合により惹起される抑制の排除に加えて遺伝子発現の増強のためには、ＨＭＧ１分子の酸性末端が必須であることが提唱された。１２番染色体切断点の殆どが１４０kbイントロンに存在するらしいことから、酸性カルボキシ末端ドメインからのＤＢＤの分離は頻繁に起こっていると思われる。ＨＭＧＩ−Ｃの酸性ドメインがＨＧＭＩ(Ｙ)のそれと同様の機能を有する場合、１２番染色体異常の結果は遺伝子発現に影響する可能性がある。最後に、酸性カルボキシ末端領域をコードしている配列の結末はまだ知られていないことに留意すべきである。
【００７６】
ＨＭＧＩ−Ｃは、良性腫瘍の発達に関わり得るＨＭＧ遺伝子ファミリーの最初の成員であるため、このファミリーの他の成員もまた関与しているのかという疑問が生まれる。ＨＭＧ蛋白ファミリーは３つのサブファミリーで構成される：ｉ)ＨＭＧＩおよび２型蛋白。これらはインビトロで転写を促進することが判明しており、またＨＭＧボックスを有するずっと大きなクラスの調節物質の成員であり得る。ii)まだ知られていない機能を有するランダムコイル蛋白ＨＭＧ１４および１７。iii)ＨＭＧＩ−型蛋白。これらは小溝に結合し、ＨＭＧＩ−Ｃ、ＨＭＧＩ、およびＨＭＧＩ−Ｙを包含する。後者の二つは同じ遺伝子によりコードされている。ＨＭＧファミリー成員の公表されているマッピング位置が、本明細書で研究されているような良性充実性腫瘍の公表されている染色体切断点と一致するということは、興味を持って注目される。例えばＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子はヒト染色体６ｑ２１にマッピングされている[６９]が、これは、子宮平滑筋腫、脂肪腫、および多形態性唾液腺腫で観察される頻出する転座に関与していることが知られている[７６]。ヒトゲノムデータベースに列挙されるように、ＨＭＧファミリーの既知の成員全てが染色体上に割り当てられている訳ではないが、それらの幾つかについては比較的正確なマッピング位置が確立されている。例えば、ＨＭＧ１７は染色体１ｐ３６.１−ｐ３５に、ＨＭＧ１Ｌは１３ｑ１２に、そしてＨＭＧ１４は２１ｑ２２.３に割り当てられ、腫瘍型の染色体切断点が本明細書中で研究されている染色体セグメントは全て報告されている[７６]。ＨＭＧＩ(Ｙ)またはこれらＨＭＧ成員のうちの他のいずれかが実際にこれらの腫瘍の他の亜群に影響を及ぼしているかどうかは依然として確立されねばならない。さらに、バンナヤン−ゾナナ(マッククシック＃１５３４８０)、プロテウス(マッククシック＃１７６９２０)、およびコウデン(マッククシック＃１５８３５０)のような症候群(後者の症候群は多発性過誤腫症候群とも呼ばれる)を記載することは興味深い。先天性バンナヤン−ゾナナ症候群を有する個体の６０％には、中胚葉過誤腫を伴う家族性巨大頭蓋、離散した脂肪腫および血管腫が見いだされた[７０]。
【００７７】
最後に、本発明者等の結果の一つの局面を見逃すべきではない。この研究で評価された全ての腫瘍は間葉起源または間葉成分を含んでいた。観察されたＨＭＧＩ−Ｃの関与が間葉特異的であるのかまたは非間葉起源の腫瘍にも見いだされるのかを解明することは非常に興味深いことであろう。本発明者等がここに記載する様々なＤＮＡクローンは、この重要な問題に取り組むための貴重な原資であり、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子を腫瘍発生に最終的に関連付ける研究を容易にするに違いない。
【００７８】
実施例３
ＨＭＧ遺伝子ファミリーの他の成員の再編成
１.序
この実施例は、もしＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子またはＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子のいずれかが染色体再編成により影響を受けるならば、与えられた腫瘍実体(例えば肺軟骨様過誤腫、子宮平滑筋腫、子宮内膜ポリープ)内部に、組織学的に実際上互いに区別不可能な腫瘍が発生することを明確に証明する。したがって、ＨＭＧＩ−ＣおよびＨＭＧＩ(Ｙ)を包含する(但しこれらに限定されない)異常な間葉増殖につながる遺伝子の一群を、実際に解明することができる。
【００７９】
２.材料および方法
２.１.染色体の調製
染色体の調製は常法に従う。細胞をコルセミド(１０μg／ml)３０μlで２−３時間処理し、次いで、トリプシン法(０.０５％トリプシン、０.０２％ＥＤＴＡ)、その後室温下で２０分間の６倍希釈の培地ＴＣ１９９中の低張性ショックおよびメタノール：酢酸(３：１)固定を用いて収穫した。次いで染色体をＧＴＧバンド化した。
【００８０】
２.２.インサイトゥハイブリダイゼーション
インサイトゥハイブリダイゼーションは前記実施例の一つに概説されるようにして実施した。
【００８１】
２.３.ＰＡＣライブラリースクリーニング
ＰＡＣライブラリー(ゲノム・システムズ・ライブラリー・スクリーニング・サーヴィス、セントルイス、ミズーリ、ＵＳＡ)を、ＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子に特異的なプライマーの組を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。スクリーニングのために本発明者等は、配列：
５'−ＣＴＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＡＴＧ Ｔ−３'(イントロン３)
を有する前進プライマー、および逆プライマー：
５'−ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＴＴ ＣＡＡ ＡＣＴ Ａ−３'(イントロン３)
を設計し、３３８bpのフラグメントが生成した。増幅のため、以下の熱循環を使用した：９４℃、５分間(９４℃、１分間、５９℃、１分間、７２℃、２分間)ｘ３０、７２℃、１０分間。
【００８２】
２.４.ＰＡＣクローンからのＤＮＡの調製
単一のＰＡＣクローンを含む細菌コロニーをＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜増殖させた。この一夜培養６６０μlをＬＢ培地２５ml中に希釈し、０.０５−０.１のＯＤ550となるまで増殖させた。最終濃度０.５ｍＭとなるまでＩＰＴＧを添加することによりＰ１溶菌性レプリコンを誘導した。ＩＰＴＧ添加後、ＯＤ550が０.５−１.５となるまで増殖を継続し、そしてゲノムシステムズの推奨するアルカリ溶菌法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００８３】
３.結果
ヒトＰＡＣライブラリーをスクリーニングするためのプライマーの組は、ＨＭＧＩ(Ｙ)のイントロン３に属する配列から設計した。ＨＭＧＩ−ＣおよびＨＭＧＩ(Ｙ)の間の配列相同性の故に、増幅された３３８bpの配列を、ＨＭＧＩ(Ｙ)にのみ特異的である相同性探索によって試験した。ライブラリースクリーニングの結果、挿入物の平均の長さがおよそ１００kbである３個の陽性ＰＡＣクローンが得られた。これらのクローンのうち２個(Ｐａｃ６０４、Ｐａｃ６０５)を以下のＦＩＳＨ研究に使用した。ＨＭＧＩ(Ｙ)が単純または複雑な形で６ｐ２１.３を含む転座を伴う腫瘍において再編成されているか否かを証明するために、本発明者等は、全て６ｐ２１.３の異常を伴う４つの一次肺軟骨様過誤腫および２つの子宮内膜ポリープ由来の中期拡散についてＦＩＳＨ分析を実施した。各々の場合について２０の中期を採点した。上に記載した２つのＰＡＣクローンＰａｃ６０４およびＰａｃ６０５のうち少なくとも一方は、分析した６例全てにおいて切断点と交差していた。これらの結果は、本明細書で調査された６ｐ２１異常を伴う腫瘍の切断点がＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子内部またはその近傍のいずれかに密集していることを明白に示している。
【００８４】
実施例４
脂肪腫細胞におけるハイブリッドＨＭＧＩ−Ｃ
第３染色体由来の脂肪腫を好む相手遺伝子ＬＰＰ(＞５０kb)のｃＤＮＡクローンを分離し、そのヌクレオチド配列を確立した。複合ｃＤＮＡのデータを図４に示す。ニワトリのジキシンに対しアミノ酸配列類似性(５０％以上)を有する蛋白(６１２アミノ酸(ａａ))のためのオープンリーディングフレームを同定した。ジキシンは、その成員が全ていわゆるＬＩＭドメインを有するＬＩＭ蛋白ファミリーの一員である[７８]。ＬＩＭドメインは、転写レギュレーター、プロトオンコジーン生成物、および付着斑構成成分を包含する、種々の機能を有する漸増する数の蛋白に見いだされる、システインに富む亜鉛結合蛋白である。ＬＩＭファミリー成員の多くは、細胞シグナル生成および発達過程の細胞の運命の制御において役割を果たしていると考えられてきた。近年、ＬＩＭドメインはモジュラー蛋白結合界面であることが証明された[７９]。細胞外マトリックスへのおよび他の細胞への細胞接着部位に存在するジキシンと同様、推定されるＬＰＰコード化蛋白(図６)は３個のＬＩＭドメインを持ち、古典的なＤＮＡ結合ホメオドメインを欠く。
【００８５】
Ｌｉ−５０１／ＳＶ４０の３'−ＲＡＣＥ分析において、融合転写物を含むＨＭＧＩ−Ｃが同定され、ここからハイブリッド蛋白(３２４ａａ)を予想することができ、そして引き続きＨＭＧＩ−Ｃの３個のＤＢＤ(８３ａａ)と、これらのカルボキシ末端の、ＬＰＰによりコードされている３個のＬＩＭドメイン(２４１ａａ)で構成されると予想された。適当な入れ子状のアンプリマーの組を使用するＰＣＲ分析では、類似のＨＭＧＩ−Ｃ／ＬＰＰハイブリッド転写物が、ｔ(３；１２)を有する様々な一次脂肪腫および脂肪腫細胞系に、そして細胞遺伝学的に正常な脂肪腫にも検出された。これらのデータは、脂肪腫中の細胞遺伝学的に検出し得るおよび隠れたｔ(３；１２)転座は常に、ＬＰＰコード化蛋白の仮定的モジュラー蛋白結合界面とＨＭＧＩ−ＣのＤＮＡ結合分子との同調した融合をもたらし、それによりＨＭＧＩ−Ｃの酸性ドメインがＬＩＭドメインに置き換えられるように見える。その結果、これらの蛋白結合界面は、これら脂肪腫細胞の核環境で提供される可能性が高く、そこでそれらは遺伝子発現に影響を及ぼし、恐らくは異常な増殖調節を導き得る。染色体１２ｑ１３−ｑ１５異常を伴う多岐にわたる良性間葉性腫瘍の中で、これは、明確に定義された腫瘍関連ＨＭＧＩ−Ｃ融合蛋白の形成に頻繁に且つ不断に寄与する染色体転座相手の最初の例である。図５は、分離された完全なＬＰＰ遺伝子のｃＤＮＡ配列を示している。
【００８６】
実施例５
脂肪腫のための診断試験
脂肪腫を有する患者の生検試料を取得した。このようにして得られた材料から、製造者のマニュアルに記載されるようにして、ギブコ／ＢＲＬの標準トリゾール(商標)ＬＳプロトコルを用いて総ＲＮＡを抽出した。この総ＲＮＡを使用して、逆転写酵素(ギブコ／ＢＲＬ)および結合させた短い余分のヌクレオチドを含むオリゴｄＴ(１７)プライマーを用いてｃＤＮＡの第一鎖を調製した。使用したプライマーの配列は、実施例２の２.５.の項に記載される通りである。引き続きＲＮアーゼＨを使用して、合成されたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子からＲＮＡを除去した。遺伝子特異的プライマー(実施例２、２.５.項)および結合させた余分の短いヌクレオチドに対し相補的なプライマーを用いてＰＣＲを実施した。このようにして得られたＰＣＲ生成物をゲル電気泳動により分析した。それらを同じ個体の正常細胞のバックグラウンドバンドと比較することにより、融合組み立て物が検出された。
さらなる実験において、１個の内部プライマーおよび短いヌクレオチドに対し相補的なプライマーを用いて半入れ子状ＰＣＲの第二回目を実施した。したがってこの試験の感受性は有意に改善された。
図８は典型的なゲルを示す。
【００８７】
実施例６
肺軟骨様過誤腫における１２ｑ１４−１５および６ｐ２１の異常
１.序
肺軟骨様過誤腫(ＰＣＨ)は、いわゆる貨幣病変として肺のＸ線検査中にしばしば検出される。しかし、悪性腫瘍の肺転移および稀に肺癌もまた貨幣病変として存在し得る。この実施例は、最少量の腫瘍細胞しか必要としないＦＩＳＨを使用して、ＰＣＨの大多数と悪性腫瘍とを正しく識別できることを示すものである。したがって、この試験は、例えば微細な針での吸引により取得した腫瘍細胞にうまく適用することができる。
【００８８】
２.材料および方法
この研究には、組織学的に特性決定された合計８０のＰＣＨから得た試料が含まれる。細胞培養、染色体調製およびＦＩＳＨは、前記実施例に記載のように取得または実施した。
【００８９】
３.結果
細胞遺伝学的研究は、細胞遺伝学的に研究された８０のＰＣＨのうち５１が、１２ｑ１４−１５または６ｐ２１のいずれかを含む検出可能な異常を表すことを明らかにした。ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子に属するコスミドのプールまたは前記実施例に記載されたＨＭＧＩ(Ｙ)のＰＡＣクローンのいずれかを使用するＦＩＳＨにより、本発明者等は、さらなる４例においてそれらの領域の隠された構造的再編成を検出することができた(３例に１２ｑ、そして１例に６ｐの関与)。故に、ＦＩＳＨ試験単独をキットに使用して、ＰＣＨの５０％以上にＨＭＧＩ−Ｃの再配置またはＨＭＧＩ(Ｙ)遺伝子再配置のいずれかを正確に検出することができ、したがってこれは、これらの腫瘍の診断のための価値あるさらなる手段である(他の２つの実施例に示されるように、この型の腫瘍に制限される訳ではない)。
【００９０】
実施例７
軟組織腫瘍、特に含脂肪細胞起源の腫瘍の診断
１.序
含脂肪細胞組織腫瘍は、特に微細な針での吸引生検または低温切片を評価せねばならない場合には、しばしば診断上の困難をもたらす。この実施例は、含脂肪細胞組織腫瘍および稀な軟組織腫瘍の鑑別診断のためのＦＩＳＨ試験の妥当性を証明するものである。
【００９１】
２.材料および方法
２.１.腫瘍試料
３つの軟組織腫瘍からの腫瘍試料をＦＩＳＨにより調査した。試料１(１)は含脂肪細胞腫瘍からのものであり、組織学的にはそれは異型性脂肪腫または良く分化した脂肪肉腫のいずれかであった。第二の事例(腫瘍２)は、恐らく粘液様脂肪肉腫であろうと診断されたが、攻撃的な血管粘液腫を包含する他の型の悪性軟組織腫瘍もまた考慮された。第三の腫瘍(腫瘍３)もまた含脂肪細胞起源のものであって、脂肪腫および良く分化した脂肪肉腫の両者が考えられた。
【００９２】
２.２.細胞の分離およびＦＩＳＨ
腫瘍試料は常法に従い酵素で分散させた。得られた単一細胞懸濁液を遠心し、この懸濁液をメタノール：氷酢酸(３：１)を使用して室温で１時間固定した。次にこの細胞懸濁液を清浄な乾燥したスライド上に滴下し、６０℃で６時間経過させた。前記実施例に記載のようにＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子からの分子プローブを用いてＦＩＳＨを実施した。
【００９３】
３.結果
間期のレベルにおいて、腫瘍１および２はいずれも対立遺伝子の一方についての分断シグナルを示した。これらの発見は、良性腫瘍、即ち第一の事例では異型性脂肪腫、そして第二の事例では攻撃的な血管粘液腫であるとの診断と矛盾しない。それらは悪性の含脂肪細胞組織腫瘍の存在を除外することができる。
第三の事例では、ＦＩＳＨはＭＡＲ領域またはその一部の高度の増幅を明らかにした。良く分化した脂肪肉腫において、巨大マーカーまたは環状染色体で観察される増幅単位はＭＡＲ領域を含むことができることから、これらの発見は、良く分化した脂肪肉腫という診断へとつながる。この実施例に提示された３つの事例は、記載されたＤＮＡプローブの有用性を示す。それらは、軟組織腫瘍の診断用のさらなる手段を提供する、比較的単純且つ迅速な間期ＦＩＳＨ実験用のキットに使用することができる。
【００９４】
実施例８
正常組織におけるＨＭＧＩ−Ｃの発現
１.序
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現は主として胚および胎児の発達中の人間の組織に限定されるという事を示すのが、この実施例の目的である。対照的に、特にＨＭＧＩ−Ｃ再編成を伴う腫瘍が発生し得る組織および器官を包含する成人の殆どの正常組織においては、発現は現れない。この事は、該遺伝子の転写の再活性化でも腫瘍形成を開始させ得ることを示すものである。他方では、これは、腫瘍の成長を阻害または止めるためのアンチセンス法(正常ＨＭＧＩ−Ｃ ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子を包含する)の有用性を強調するものである。
【００９５】
２.材料および方法
２.１.組織試料
この研究のために使用される全ての成人組織試料は、採取後１５分以内液体窒素中で凍結させた外科的に採取された組織から得た。試料の殆どは、腫瘍手術の間に採取された隣接する正常組織由来のものであった。詳細には、本発明者等は、様々な解剖学的部位の脂肪組織から採った８個の試料、子宮筋層組織から採った２０個の試料、肺組織から採った８個の試料、唾液腺(耳下腺および顎下腺)から採った４個の試料、心筋から採った１個の組織試料、異なった年齢の患者の胸部組織から採った２５個の試料、脳由来の２個の試料、３個の肝臓試料、腎臓組織から採った７個の試料、および社会経済的理由での人工妊娠中絶後の胚／胎児(１０−１４妊娠週)由来の胚／胎児組織(四肢、６個の試料)を使用した。
さらに、３つの細胞系を使用した：ＨＭＧＩ−Ｃ発現用の対照として本発明者等は、肝癌細胞系Ｈｅｐ３Ｂおよび典型的な転座ｔ(３；１２)を伴う脂肪腫から確立された細胞系Ｌ１４を使用した。１０回再現したＲＴ実験では本発明者等自身の研究においてＨＭＧＩ−Ｃ発現を表さなかったため、負の対照としてＨｅＬａ細胞を使用した。
【００９６】
２.２.ＨＭＧＩ−Ｃの発現のためのＲＴ−ＰＣＲ
組織試料１００mgをホモジナイズし、フェノールおよびイソチオシアナートを含有するトリゾール試薬(ギブコＢＲＬ、エッゲンシュタイン、ドイツ)を用いてＲＮＡを分離した。ポリ(Ａ)−オリゴ(ｄｔ)１７プライマーおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素(ギブコＢＲＬ、エッゲンシュタイン、ドイツ)を用いてｃＤＮＡを合成した。次いで半入れ子状ＰＣＲを実施した。
第一および第二のＰＣＲのために同じ下部プライマー(レヴェックス４)(５'−ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＴＴＣ−３'(エキソン４／５)を使用した。ＰＣＲの第一回目では特異的上部プライマー(ＳＥ１)(５'−ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＡＣ−３'(エキソン１))を、そしてＰＣＲの第二回目で入れ子状上部プライマー(Ｐ１)(５'−ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＣ−３'(エキソン１))を使用した。いずれの回のＰＣＲも１０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８.０、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.００１％ゼラチン、１００μＭ ｄＡＴＰ、１００μＭ ｄＴＴＰ、１００μＭ ｄＧＴＰ、１００μＭ ｄＣＴＰ、２００ｎＭ上部プライマー、２００ｎＭ下部プライマー、および１単位／１００μlアンプリタクポリメラーゼ(パーキン・エルマー、ヴァイターシュタット、ドイツ)を含有する１００μl容量で実施した。増幅は３０周期の間実施した(９４℃１分間、５３℃１分間、７２℃２分間)。第１回目のＰＣＲでの鋳型としては２５０ng総ＲＮＡから誘導したｃＤＮＡを、そして第２回目のＰＣＲでは第一のＰＣＲ反応混合物１μlを使用した。
【００９７】
２.３.無傷のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡのための対照検定
無傷のＲＮＡおよびｃＤＮＡのＰＣＲのための対照反応として、試験はハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)のｃＤＮＡの増幅を基礎とした。ＰＣＲ反応は、ＨＭＧＩ−Ｃ発現のＰＣＲの第一回目について上に記載したものと同じ条件の下で３５周期実施した。
【００９８】
３.結果
発現実験については、全ての実験は少なくとも２回反復した。ＲＴ−ＰＣＲに使用されたＲＮＡおよびｃＤＮＡ調製物が全て無傷であることを確実とするため(さもなければ偽陰性結果が導かれる)、定型的にハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現のためのＲＴ−ＰＣＲを行った。陽性のＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲ結果は２９９bpフラグメントを生成した。陽性のＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲを示す試料のみをこの研究に使用した。Ｈｅｐ ３ＢおよびＬ１４のようなＨＭＧＩ−Ｃ陽性細胞におけるＲＴ−ＰＣＲの結果、特異的２２０bpフラグメントが検出できる。ＨｅＬａ細胞はＨＭＧＩ−Ｃの発現を示さなかった。２つの子宮筋層試料を除いて(ごく微少レベルの筋腫のためである可能性が高い)、成人個体から採取した全ての正常組織試料は、検出し得るレベルのＨＭＧＩ−Ｃ発現を示さなかった。対照的に、試験された全ての胎児／胚組織はＨＭＧＩ−Ｃ発現を表した。
【００９９】
実施例９
白血病の早期検出のための診断手段としてのＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現
１.序
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子を冒す細胞遺伝学的に検出し得る異常が、間葉起源の様々な良性充実性腫瘍中に発見されている。明らかにこの異常は該遺伝子の転写活性化をも導く。血液細胞もまた間葉起源であることから、白血病細胞をＨＭＧＩ−Ｃ発現について調べることに興味が持たれた。本実施例は、末梢血の細胞中の遺伝子の活性化が、白血病に見いだされる未熟な細胞／異常な幹細胞を示す好適なマーカーであることを示すものである。ＨＭＧＩ−Ｃの発現は高度の感受性を持って測定されるため、該遺伝子の発現のためのＲＴ−ＰＣＲは、様々な血液疾患のごく早期の検出に使用することができる。
【０１００】
２.材料および方法
フィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬの患者１９人、ＡＭＬの患者５人、およびＡＬＬの患者３人を包含する異なった型の白血病の患者２７人の末梢血由来の試料をＨＭＧＩ−Ｃ発現の測定に使用した。１５人の健康な家系発端者からの血液試料を対照として使用した。
ＨＭＧＩ−Ｃの発現のためのＲＴ−ＰＣＲは実施例８に概説されるように実施した。
【０１０１】
３.結果
白血病患者からの血液試料にはＨＭＧＩ−Ｃの発現が明白に検出できたのに対し、対照の人間から採取された血液試料のいずれにも発現は認められなかった。該遺伝子の転写活性化が遺伝子またはその周囲を冒している突然変異によるという事の証拠はなかった。活性化はむしろ、細胞の未熟性またはそれらの異常な増殖に関連する二次的効果であると想像することの方が、より理にかなっている。とは言え、高い、且つ改善され得る感受性は、例えばＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現のためのＲＴ−ＰＣＲに基づくキットを極めて好適な診断手段とする。
【０１０２】
実施例１０
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の転写再発現は腫瘍の始動を導き得る。
１.序
この実施例は、幾つかの腫瘍実体については、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の５'に位置する染色体切断点もまた事実存在することを明確に示し、この事は、該遺伝子の転写の上方調節が、対応する腫瘍型の増殖を開始させるのに充分であることを示唆している。
【０１０３】
２.材料および方法
２.１.細胞培養
外科手術の後、腫瘍試料(肺軟骨様過誤腫３個、子宮平滑筋腫１個)を、ペニシリン(２００ＩＵ／ml)およびストレプトマイシン(２００μｇ／ml)を添加したハンク溶液で洗浄した。腫瘍をコラゲナーゼにより３７℃で５−６時間分離させた。小フラグメントおよび単一細胞を含むこの懸濁液を、２０％ウシ胎児血清、２００ＩＵ／mlペニシリン、および２００μg／mlストレプトマイシンを添加したアール塩を伴う培養基ＴＣ１９９中に再懸濁した。
【０１０４】
２.２.染色体の調製
染色体の調製は常法に従った。細胞をコルセミド(１０μg／ml)３０μlで２−３時間処理し、次いで、トリプシン法(０.０５％トリプシン、０.０２％ＥＤＴＡ)、その後室温下で２０分間の６倍希釈の培地ＴＣ１９９中の低張性ショックおよびメタノール：酢酸(３：１)固定を用いて収穫した。次いで染色体をＧＴＧバンド化した。
【０１０５】
２.３.ＦＩＳＨ研究
染色体を確実に同定するため、同じ中期拡散のＧＴＧバンド化の後、ＦＩＳＨを実施した。ＤＮＡプローブとして、本発明者等は、図２のレジェンダに記載されるような、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子にまでかかっているＹＡＣ−コンティグに属する５個のコスミドを使用した。これらのコスミドのうち３個(２７Ｅ１２、１８５Ｈ２、１４２Ｈ１)はＨＭＧＩ−Ｃの第三イントロンにマッピングされ、一方コスミド２６０Ｃ７および２４５Ｅ８はそれぞれ３'または５'末端に位置する。スライドをザイス(ザイス、オバーコッヘン、ドイツ)アキシオプラン蛍光顕微鏡を用いて分析した。結果をパワー・ジーン・カリオタイピング・システム(ＰＳＩ、ハラデイル、英国)で処理し記録した。ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(ＲＡＣＥ)は前記実施例の一つに記載されるようにして実施した。
【０１０６】
３.結果
４つの腫瘍は全て同じ型の細胞遺伝学的異常、即ち２個の見掛け上正常な１２番染色体および余分の誘導体１４ der(１４)ｔ(１２；１４)(ｑ１４−１５；ｑ２４)を含むが、対応するder(１２)の無い４７の染色体の存在を示した。ＨＭＧＩ−Ｃの３'−５'の向きは動原体に向かっているため、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子内部の一つの破損はその５'部分の喪失ならびにder(１２)の喪失を導くであろう。故に本発明者等は、切断点をより正確に決定するため一連のＦＩＳＨ実験を行った。５個のコスミド２６０Ｃ７、２７Ｅ１２、１８５Ｈ２、１４２Ｈ１、および２４５Ｅ８を使用して、同じ強度のハイブリダイゼーションシグナルが、正常な１２番染色体および余分のder(１４)のいずれにも観察された。このＦＩＳＨ結果は、４つの事例全てにおいて、染色体切断点はＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の５'に位置することを明らかにした。
【０１０７】
４つの事例全てにおいて切断点がＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の５'に割り当てられたことは、ＲＡＣＥ−ＰＣＲの結果と良好に合致する。正常なＨＭＧＩ−Ｃ転写物に加えて本発明者等は、３つの腫瘍全てに異常転写物を検出することができた。配列は、それらが第１４染色体からではなく、恐らくは潜在性スプライス部位のためにＨＭＧＩ−Ｃのイントロン３から誘導されていることを示した。しかし、ＲＡＣＥ結果は、実際に４つの事例全てでＨＭＧＩ−Ｃ発現があることを明らかにした。
【０１０８】
実施例１１
白血病細胞の再分化
１.序
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現は、多岐にわたる腫瘍、充実性腫瘍、および白血病においてしばしば非常に上昇する。ＨＭＧＩ−Ｃ蛋白が細胞の形質転換で重要な役割を果たしているのではないかと考えられた。この実施例は、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の発現がアンチセンスＨＭＧＩ−Ｃ配列を発現することにより大きく低下し得ること、そして腫瘍細胞におけるＨＭＧＩ−Ｃレベルの低下は形質転換された表現型の復帰をもたらすことを示すものである。したがって、アンチセンス分子の発現または投与は、治療上成功裏に適用することができる。
【０１０９】
２.材料および方法
２.１.腫瘍細胞系
腫瘍細胞系は悪性一次唾液腺腫瘍および一次乳癌から作成した。細胞系は、B.カズミールチャク、B.ソード、S.バートニッケ、J.ブラーディエク、およびW.シュルート、「多形態性腺腫細胞は最初の核型に応じてそれらのＳＶ４０形質転換に対する感受性を変える」、Genes Chrom.Cancer、５巻３５−３９頁(１９９２)に記載のように確立した。
【０１１０】
２.２.形質転換された状態の検定
軟寒天コロニー検定を、マクファーソンおよびモンタニアー、「ポリオーマウイルスにより形質転換された細胞の選択検定のための寒天懸濁培養」、Virology、２３巻２９１−２９４頁(１９６４)に記載のように実施した。
唾液腺および胸部腫瘍細胞を、２０％ウシ胎児血清(ギブコ)、２００ＩＵ／mlペニシリン、および２００μg／mlストレプトマイシンを添加したアール塩を伴うＴＣ１９９培養基中で増殖させた。
トランスフェクトさせた唾液腺(ＡＤ６４)および胸の細胞系の腫瘍形成性を、無胸腺マウスに細胞を皮下注射することにより試験した。
【０１１１】
２.３.トランスフェクション検定
トランスフェクションは種々のプロトコルを用いて実施した。即ち：
１.グラハムおよびヴァン・デル・エプの燐酸カルシウム法(「ヒトアデノウイルスの感染性の検定のための新しい技術」、Virology、５２巻４５６−４６７頁(１９７３))。
２.リポフェクション：製造者の指針に従い、リポソーム仲介ＤＮＡ輸送(リポフェクタミン、ギブコＢＲＬ)を用いてトランスフェクションを実施した。
【０１１２】
２.４.アンチセンス組み立て物
種々のプロモーター状況、例えばモロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復、ＣＭＶプロモーター、またはＳＶ４０の初期プロモーターの転写調節の下で、ヒトＨＭＧＩ−Ｃ ｃＤＮＡ配列を、発現ベクター中に、センスおよびアンチセンスの両方向に挿入することにより、ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子のセンスおよびアンチセンス組み立て物を得た。例えば、ヒトＨＭＧＩ−Ｃの全コード化配列を含むヒトＨＭＧＩ−Ｃ ｃＤＮＡフラグメントを、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターおよびエンハンサーの調節下での発現、およびＧ４１８耐性についての選択を可能にするｐＲＣ／ＣＭＶ(インビトロゲン）中にクローニングすることによって、ＣＭＶ／ＨＭＧＩ−Ｃプラスミドを組み立てた。
【０１１３】
３.結果
３.１.形質転換された表現型の復帰
胸および唾液腺の腫瘍細胞にアンチセンスＨＭＧＩ−Ｃ発現を誘導した後、これらの腫瘍細胞に、形質転換された表現型の復帰が観察された。軟寒天コロニー検定により測定されたように、そしてインビボ無胸腺マウスで、腫瘍形成性の著しい低下が観察された。免疫沈降およびウェスタンブロット分析は、アンチセンスＨＭＧＩ−Ｃ配列を発現している細胞にＨＭＧＩ−Ｃ蛋白レベルの著しい低下を示した。故に、このアプローチは、ＨＭＧＩ−Ｃの関与する腫瘍に治療的に使用することができる。
【０１１４】
実施例１２
インビボ治療薬試験の手段としての、ＨＭＧＩ−Ｃを含む動物腫瘍モデル
得られたＨＭＧＩ−Ｃの知識に基づき、インビボ薬物試験の手段としての動物腫瘍モデルを開発することができる。この目的(例えば子宮平滑筋腫のための)を達成するため、２つのアプローチを使用することができる。即ち、一方は遺伝子転移(形質転換動物の作成)であり、他方は遺伝子標的化技術(胚の幹細胞(ＥＳ細胞)でのホモローガスな組換えを介して特異的遺伝子異常をインビボで模倣する)である。
【０１１５】
これらの技術は、複雑な生態系の遺伝子機構の操作を特異的且っ予め設計されたように行うことを可能にする。広範な技術的詳細については、B.ホーガン、R.ベディングトン、F.コンスタンティーニ、およびE.レイシー、マウス胚の操作、研究室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、１９９４；ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３８４−３を参照されたい。
【０１１６】
ＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子の不活性化または突然変異を、特に選択された細胞型において選択された時点で起こすために、近年記載されたＣｒｅ／ＬｏｘＰ系を使用することができる(H.グー等、細胞型特異的遺伝子標的化を用いたＴ細胞のＤＮＡポリメラーゼβ遺伝子セグメントの除去、Science、２６５、１０３−１０６、１９９４)。Ｃｒｅ酵素は、その生理的役割が、感染の間に互いに結合するようになったファージゲノムを分離する事である、バクテリオファージＰ１由来の組換え酵素である。これを達成するため、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ部位と呼ばれるファージＤＮＡの短い配列に並び、１個のｌｏｘＰ部位を残してそれらの間のＤＮＡを除去する。この系は現在、哺乳動物細胞中で、染色体ＤＮＡを高い効率で切り取るのに有効であることが示されている。この系を用いた遺伝子の組織特異的不活性化または突然変異は、Ｃｒｅ酵素の組織特異的発現を介して獲得することができる。
【０１１７】
一例として、該モデルが治療薬のインビボ試験の助けになるような、ＭＡＧ遺伝子ファミリーの一員を使用した子宮平滑筋腫のための動物モデル系の開発を下に概説する。
２つのアプローチに従うことができる：
ａ)人間の患者に観察されるような特異的遺伝子異常のインビボ誘導((条件的)遺伝子(同質遺伝子の)標的化アプローチ)；および、
ｂ)患者に観察される遺伝子異常を代表するＤＮＡ組み立て物の導入(遺伝子転移アプローチ)。
【０１１８】
遺伝子転移に使用されるＤＮＡ組み立て物は、構造および発現調節に関する限り、子宮平滑筋腫に罹患している患者でなされた観察に基づいて作成することができる；例えば、種々の転座相手遺伝子を伴うＨＭＧＩ−Ｃ融合遺伝子、特に、ＣＥＰＨ ＹＡＣ ６Ｃ３、８９Ｃ５、３０８Ｈ７、３３６Ｈ１２、４６０Ａ６、４８９Ｆ４、９０２Ｆ１０、９５２Ｆ５、９５８Ｃ２、９６１Ｅ１、および９７１Ｆ５により表されるＹＡＣコンティグに位置する第１４染色体の優先的転座相手遺伝子、基本的にＨＭＧＩ−Ｃの３個のＤＮＡ結合ドメインをコードしている末端切除遺伝子、ならびに完全なＨＭＧＩ−Ｃまたは強力なプロモーターの調節下でのＨＭＧＩ−Ｃの誘導体。
【０１１９】
実施例１３
ＨＭＧＩ−Ｃに対する抗体の調製
診断および治療に使用するための好適な分子の一つの型は、ＭＡＧ遺伝子に対する抗体である。ＨＭＧＩ−Ｃに対するウサギポリクローナル抗体の製造のためには、リサーチ・ジェネティクス・Ｉｎｃ.、ハンツヴィル、ＡＬ、ＵＳＡから入手し得る以下の３個の市販のペプチドを使用した：
(Ｈ−ＡＲＧＥＧＡＧＱＰＳＴＳＡＱＧＱＰＡＡＰＡＰＱＫＲ)８−多抗原ペプチド(ＭＡＰ)、
(Ｈ−ＳＰＳＫＡＡＱＫＫＡＥＡＴＧＥＫＲ)８−ＭＡＰ、
(Ｈ−ＰＲＫＷＰＱＱＶＶＱＫＫＰＡＱＥＥ)８−ＭＡＰ。
ポリクローナル抗体は標準技術に従って作製した。
【０１２０】
表
【０１２１】
【０１２２】
表２
PCRプライマー
【０１２３】
表２（続き）
PCRプライマー
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
原発性多形態性唾液腺腫から由来した７種の細胞系における染色体腕１２ｑの切断点を、９種のＤＮＡプローブに関してＦＩＳＨ分析によりマッピングした。これらのプローブは、すべて染色体断片１２ｑ１３−ｑ１５の２．８ＭｂゲノムＤＮＡ領域に存在し、以前に発表された配列標識部位（ＳＴＳ）に対応する。それらの相対的位置は、ＹＡＣクローニング並びに長距離物理的及びＳＴＳ含量マッピングにより確認した。５種の細胞系の１２ｑ切断点は、最近ＳＴＳＲＭ３３及びＲＭ９８間の１２番染色体子宮平滑筋腫クラスター領域の切断点と定義された４４５ｋｂＤＮＡ区間の３個の異なる亜領域内にマッピングされていることがわかった。７種の切断点は、すべてＳＴＳＲＭ３６およびＲＭ１０３間の１．７ＭｂＤＮＡ区間内に位置しているようであった。さらに、３種の原発性多形態性唾液腺腫の１２番染色体切断点もＲＭ３６及びＲＭ１０３間にマッピングされることがわかった。最後に、１２ｑ１３−ｑ１５異常をもつ２種の脂肪腫細胞系のＦＩＳＨ分析が、これらの切断点について、２種の原発性脂肪腫のものと同様にＲＭ３６とＲＭ１０３間に位置すると見られる比較的小さな隣接ＤＮＡ断片を鋭く指向していた。我々は、３種の明確な充実性腫瘍の１２ｑ切断点のクラスター観察から、ＲＭ３６とＲＭ１０３間の１２番染色体長腕１．７ＭｂＤＮＡ領域が、我々がＭＡＲと名付ける多重異常領域であると結論する。
【０１４０】
【０１４１】
緒論
１２番染色体のｑ１３−ｑ１５領域が関係する染色体転座は、広範囲の充実性腫瘍で観察されている（ミテルマン、１９９１年）。細胞遺伝学的に異常な子宮平滑筋腫（ニルバートおよびハイム、１９９０年；パンディスら、１９９１年）、多形態性唾液腺腫（サンドロスら、１９９０年；ブラーディークら１９９３年）及び良性脂肪組織腫（スリーカンティアら、１９９３年）のサブグループにおいて、１２ｑ１３−ｑ１５の異常はしばしば観察されている。最近の研究（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）において、我々は、１２番染色体切断点の子宮平滑筋腫クラスター領域であるＵＬＣＲ１２を同定し、分子として確認した。本研究では、我々は大または小唾液腺由来の良性上皮腫である多形態性唾液腺腫における染色体１２ｑ切断点に焦点を合わせる。これは最も一般的な型の唾液腺腫であり、この器官の全新生物中のほぼ５０％を説明する。腫瘍の約８５％は耳下腺に見られ、１０％は小唾液腺に、５％は顎下腺に見られる（ザイフェルトら、１９８６年）。これら腺腫の多数は正常な核型をもつようであるが、細胞遺伝学的研究は、頻発性の特異的染色体異常を明らかにした（サンドロスら、１９９０年；ブラーディークら、１９９３年）。８番染色体の異常に加えて、しばしば、１２番染色体の異常であるｔ（３；８）（ｐ２１；ｑ１２）を最も一般的な異常として伴う、８ｑ１２における切断点での転座も頻繁であり、転座は通常１２ｑ１３−ｑ１５が関係する。非頻発性のクローン性異常も報告されている。明確な充実性腫瘍タイプにおける頻繁な１２ｑ１３−ｑ１５領域の関与は、この染色体領域が、これらの腫瘍の発生と関係を持つ可能性がある遺伝子（類）を宿していることを示唆する。したがって、これらの腫瘍における１２番染色体の切断点の分子クローニング及び接合フラグメントの確認は、このような遺伝子（類）の同定に通ずる。
【０１４２】
我々は、先に、蛍光系内ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）データに基づいて、原発性多形態性唾液腺腫由来の幾つかの細胞系における１２番染色体切断点（カズミールチャックら、１９９０年；シェーンメーカーズら、１９９４年ａ）が、１２番染色体長腕上でＤ１２Ｓ１９及びＤ１２Ｓ８座間の区間に位置することを報告した（シェーンメーカーズら、１９９４年ａ）。このＤＮＡ区間は、約７ｃＭであると推定されている（キーツら、１９８９年；クレイグら、１９９３年）。これらの腫瘍細胞の１２番染色体切断点を含む区間は、さらに、すべての切断点が粘液脂肪肉腫に特徴的なｔ（１２；１６）転座により直接影響され（アマンら、１９９２年；クロザットら、１９９３年；ラビッツら、１９９３年）、Ｄ１２Ｓ１９及びＤ１２Ｓ８間に位置する、ＣＨＯＰ遺伝子から遠位に位置することが示されることにより狭められた。さらに最近の研究（クールスら、１９９５年）によると、多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体切断点は、１６５ｋｂより小さい大きさの配列標識部位（ＳＴＳ）ＲＭ１１０及びＲＭ１１１間のＤＮＡ領域を鋭く指向する。その他の多形態性唾液腺腫細胞系の１２番染色体切断点のＦＩＳＨによる評価は、それらがＡｄ−３１２／ＳＶ４０に近位に８００ｋｂより大きな距離で位置すべきことを示した（クールスら、１９９５年）。これらの結果は、１２番染色体切断点が１２番染色体長腕上の比較的大きなゲノム領域に亘り分散する可能性を指向するものであった。
ここでは、我々は、原発性腫瘍から得た多形態性唾液腺腫細胞及び樹立腫瘍細胞系における１２番染色体切断点の物理的マッピングを報告する。細胞に見られた核型の異常はすべて異なるが、常に１２番染色体のｑ１３−ｑ１５領域に関係する。我々は、６ＭｂＤＮＡ領域の長距離物理的マップにおける配列標識部位（ＳＴＳ）に対応し、染色体歩行実験で得られたＤ１２Ｓ８とＣＨＯＰ間のＤＮＡプローブを使用して、ＦＩＳＨ実験を実施し、多形態性唾液腺腫の大きな１２番染色体切断点クラスター領域をさらに精細に定義した。この切断点クラスター領域は、ＵＬＣＲ１２と重なるようであった。さらに、我々は、脂肪腫の１２ｑ１３−ｑ１５切断点もまた多形態性唾液腺腫及び子宮平滑筋腫のものと同じ領域内に位置するか否かについて試験した。
【０１４３】
材料及び方法
原発性充実性腫瘍及び誘導細胞系
多形態性唾液腺腫、脂肪腫及び子宮平滑筋腫を含む原発性充実性腫瘍は、ベルギー国ルーベン（Ｉ．ド・ウイバー博士）；ドイツ連邦共和国ブレーメン（Ｒ．チリ博士）；ドイツ連邦共和国クレフェルト（Ｊ．ハウプリッヒ博士）の大学診療所；及びスウェーデン国ゲーテボルクの病理学研究所（Ｇ．ステンマン博士）から入手した。細胞培養およびその後のＦＩＳＨ分析のために、腫瘍細胞を微細にみじん切りし、０．８％コラーゲナーゼ（ベーリンガーマンハイムＦＲＧ）で４−６時間処理し、常法によりＦＩＳＨ分析用操作を行った。
この研究に用いたヒト腫瘍細胞系は、既報の多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−２１１／ＳＶ４０、Ａｄ−２４８／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０、Ａｄ−３６６／ＳＶ４０、及びＡｄ−３８６／ＳＶ４０（カズミールチャックら、１９９０年；シェーンメーカーズら、１９９４年ａ）並びに最近開発されたＬｉ−１４／ＳＶ４０を含んでいた。これらの細胞に見られた１２番染色体異常は表１に記載する。細胞は２０％ウシ胎児血清を補充したアール塩含有ＴＣ１９９培地中で増殖させた。
【０１４４】
【０１４５】
ＤＮＡプローブ
我々は、１２番染色体の長腕に焦点を合わせたヒトゲノムプロジェクトに関連して、１２番染色体特異配列コスミドライブラリーＬＩＮＬ１２ＮＣ０１（モンゴメリーら、１９９３年）からコスミドクローンｃＲＭ３３、ｃＲＭ３６、ｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ７２、ｃＲＭ７６、ｃＲＭ９８、ｃＲＭ１０３、及びｃＲＭ１３３を分離した。これらのコスミドの詳細は、第２回国際１２番染色体ワークショップ（１９９４年）で発表し、他の文献に記載する（クチャーラパチら、１９９４年）。概略を述べると、先に報告したように（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）、最初のスクリーニングはＰＣＲベースのスクリーニング法（グリーン及びオルソン、１９９０年）を用いて実施し、その後最終スクリーニング段階としてフィルターハイブリダイゼーション分析を行った。コスミドクローンはＹＡＣクローン由来のＳＴＳ類を用いて分離した。ＳＴＳ類は、ベクトレットＰＣＲを含む方法を用いてＹＡＣ挿入物末端の回収後ＰＣＲ産物の直接固相蛍光配列決定法（ゲーツら、１９９４年）またはＡｌｕ間ＰＣＲ（ネルソンら、１９８９年）を行って得た。コスミドクローンは標準的方法（サムブルックら、１９８９年）により増殖させ処理した。
１２番染色体の長腕テロメア領域に向かって位置するコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒ（クールズら、１９９５年）を参照マーカーに使用した。
【０１４６】
染色体調製及び蛍光系内ハイブリダイゼーション
多形態性唾液腺腫細胞系または正常ヒトリンパ球中期塗抹を、先に報告したように調製した（シェーンメーカーズら、１９９３年）。ＦＩＳＨ実験における染色体の同一性を間違いなく確認するため、同じ中期塗抹のＧＴＧバンド形成後にＦＩＳＨ分析を行った。ＧＴＧバンド形成は、基本的にシュミットら（１９９０年）が報告したように実施した。系内ハイブリダイゼーションは、キービッツら（１９９０年）が報告したプロトコールに従い若干の修正を施して（クールズら、１９９４年；シェーンメーカーら、１９９４年ｂ）行った。コスミド及びＹＡＣのＤＮＡは、先に報告したように（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）ビオチン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム）またはビオチン−１４−ＡＴＰ（ＢＲＬ）で標識した。検体は、ＦＩＴＣフィルター（ツァイス）を用いてツァイスアクシオフォト蛍光顕微鏡で分析した。結果は、スコッチ（３Ｍ）のＡＳＡ６４０フィルムに記録した。
【０１４７】
結果
多形態性唾液腺腫細胞系における１２ｑ切断点のＦＩＳＨマッピング
我々は、先の研究（シェーンメーカーら、１９９４年ａ）において、若干の唾液腺の多形態性アデノームにおける幾つかの１２番染色体切断点を種々のＤＮＡマーカーに関してマッピングし、これらがすべてＤ１２Ｓ８座の近位でＣＨＯＰ遺伝子から遠位に位置することを確認した。この領域は、連結座Ｄ１２Ｓ８及びＤ１２Ｓ１９に包まれる７ｃＭより若干小さい領域である（キーツら、１９８９年）。ＹＡＣクローニングを使用し、最近報告されたようにして（クチャーラパチら、１９９４年）、この７ｃＭ領域の大部分を覆う長距離物理的／ＳＴＳ地図を作図した。さらに、多数のゲノムクローン（コスミドクローン）を分離し、この地図内におけるその相対的位置を確認した（クチャーラパチら、１９９４年）。これらのコスミド中、ｃＲＭ３３、ｃＲＭ３６、ｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ７２、ｃＲＭ７６、ｃＲＭ９８、ｃＲＭ１０３、及びｃＲＭ１３３を含めた９種をＦＩＳＨ研究に使用して、唾液腺の多形態性腺腫に由来する７種の細胞系（表１）における１２番染色体切断点の位置を確認した。約２．８Ｍｂの１２番染色体長腕上ゲノム領域を覆うこれら９種のコスミドクローンの相対的マッピング順位を図１に示し、種々のコスミドプローブによるＦＩＳＨ実験結果を同図に概略的に示す。実例として、ｃＲＭ７６及びｃＲＭ１０３をプローブとして使用しＡｄ−１９５／ＳＶ４０細胞系の中期細胞で得られたＦＩＳＨ結果を図２に示す。染色体の同定については、ＦＩＳＨ前ＧＴＧバンド形成を常に使用したことに注意すべきである。このようなバンド形成に基づき、ハイブリダイゼーションシグナルが既知の存在としての染色体のものとして決定的に帰属決定された。交差及び背景ハイブリダイゼーションシグナルがしばしば観察されるので、これらがある場合このことは大きな重要性をもつ。ハイブリダイゼーションシグナルが弱いかまたは不明確なバンド形成のために、ＧＴＧバンド形成とＦＩＳＨ分析の組み合わせが決定的でない結果をもたらした場合、参照プローブとしてコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒ（クールズら、１９９５年）を用いてＦＩＳＨ分析を実施した。
【０１４８】
ｃＲＭ１０３を用いて行ったた７種の多形態性唾液腺腫細胞系のそれぞれに関する中期染色体のＦＩＳＨ分析は、このコスミドが、ここで実験した７種の細胞系すべての１２番染色体切断点の遠位に位置することを示した。また、７種の細胞系中６種の中期染色体は、プローブｃＲＭ６９で試験し、２つの場合についてはｃＲＭ５１で試験した。後者の実験の結果はすべてｃＲＭ１０３で得た結果と矛盾しなかった。プローブとしてｃＲＭ３６を用いて行った同様なＦＩＳＨ分析は、このプローブがすべての切断点の近位に位置することを示した。これらの結果はすべて、ｃＲＭ７２を用いた実験における７種の細胞系中５種について得た結果と矛盾しなかった。全体として、我々のＦＩＳＨ実験の結果は、７種の細胞系すべてにおける１２番染色体切断点が、約１．７Ｍｂのゲノム領域に広がるｃＲＭ３６及びｃＲＭ１０３間に位置することを示した。
【０１４９】
唾液腺の多形態性アデノーム由来細胞系における１２ｑ切断点の精細マッピング
７種の多形態性唾液腺腫細胞系における１２番染色体切断点の精細マッピングのため、図１に概略を示すように別のＦＩＳＨ実験を行った。細胞系Ａｄ−２１１／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、及びＡｄ−３６６／ＳＶ４０の切断点は、約７５ｋｂと推定されるｃＲＭ７６及びｃＲＭ１３３間のＤＮＡ領域に位置すると思われた。他の４種の細胞系の切断点は、ｃＲＭ３６及びｃＲＭ１０３間の別の１．７Ｍｂ域に見つかった。Ａｄ−２４８／ＳＶ４０細胞系のものはｃＲＭ３３及びｃＲＭ７６間の約２７０ｋｂ断片に、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０細胞系のものはｃＲＭ９８及びｃＲＭ１０３間の約１Ｍｂ断片に、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０細胞系のものはｃＲＭ３３及びｃＲＭ３６間の約２４０ｋｂ断片に、Ａｄ−３８６／ＳＶ４０細胞系のものはｃＲＭ９８及びｃＲＭ１３３間の約１００ｋｂ断片にあった。結論として、これらの結果は、殆ど（７種中５種）の細胞系の１２番染色体切断点が、ｃＲＭ３３及びｃＲＭ９８間の１２番染色体長腕上の４４５ｋｂゲノム領域に亘って分散していることを示した。ここで、正確にこの領域が最近原発性子宮平滑筋腫由来細胞系における染色体１２ｑ切断点を含むことが示され（図３参照）、したがってＵＬＣＲ１２と命名されたこと（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）に注意することが重要である。この１２番染色体長腕断片は少なくとも２種の型の充実性腫瘍に関係し（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ；本研究）、また、下に示すように、第３の充実性腫瘍型に関係しているため、我々は、以下ｃＲＭ３６及びｃＲＭ１０３間のＤＮＡ区間をＭＡＲ（多重異常領域）と称する。
【０１５０】
原発性多形態性唾液腺腫における１２ｑ切断点のＦＩＳＨマッピング
以上に提示した唾液腺の多形態性腺腫中期染色体に関する我々のＦＩＳＨ研究は、原発性腫瘍由来の細胞系に限定されていた。細胞系における１２番染色体切断点が、対応する原発性腫瘍のものと、たとえ同一でないとしても類似はしていると仮定することが合理的ではあるが、細胞系の樹立またはその後の培養の結果相違が出ることは完全には除外できない。したがって、我々は、３種の原発性唾液腺腫における１２番染色体切断点もＭＡＲにマッピングされるか否かについて研究した。この可能性を試験するため、分子プローブとしてコスミドクローンｃＲＭ３３及びｃＲＭ１０３の組み合わせを使用した。３つの場合すべてにおいて、このコスミドプールは１２番染色体切断点に広がったが（データは記載せず）、これはこれらの切断点が実際にＭＡＲに局在することを示す。最近の研究（バンシュラら、投稿中）において、１２ｑ１４−１５異常をもつ５種の原発性子宮平滑筋腫の１２番染色体切断点が、すべて原発性子宮平滑筋腫由来の種々の細胞系の切断点を含むことが知られている１．５ＭｂＤＮＡ断片内のクラスターに見出されることが報告された（図３に概略を示す）。細胞系を使用した切断点マッピング研究の結果と一致して、２種の原発性充実性腫瘍型で得た結果から、原発性腫瘍細胞の切断点がＭＡＲに位置することが確認された。
【０１５１】
脂肪腫染色体断片１２ｑ１３−ｑ１５切断点のＭＡＲ内マッピング
１２ｑ１３−ｑ１５異常をもつ他の充実性腫瘍の１２番染色体切断点もまたＭＡＲ内に位置する可能性を試験するため、我々は、２種の脂肪腫細胞系−−−Ｌｉ−１４／ＳＶ４０およびＬｉ５３８／ＳＶ４０についてＦＩＳＨ分析により実験した。これら２種の１２番染色体異常を表１に示す。分子プローブとして、コスミドクローンｃＲＭ３３、ｃＲＭ５３、ｃＲＭ７２、ｃＲＭ７６、ｃＲＭ９９、ｃＲＭ１０３、及びｃＲＭ１３３を使用した。図３に略図を示すように、Ｌｉ−１４／ＳＶ４０の切断点は、ＲＭ７６及びＲＭ１３３間の７５ｋｂＤＮＡ区間にマッピングされ、Ｌｉ５３８／ＳＶ４０のそれは、ＲＭ７６及びＲＭ９９間の９０ｋｂｐ区間にマッピングされた（データは記載せず）。分子プローブとしてｃＲＭ３６及びｃＲＭ１０３を用いて行った２種の原発性脂肪腫のＦＩＳＨ分析は、ハイブリダイゼーションパターンをもたらしたが、これはプローブ混合物が切断点の両側の配列を検出したことを示す。これらの結果は、脂肪腫においても、ＭＡＲ内に位置する染色体１２ｑ１３−ｑ１５切断点が存在することの最初の徴候である。この観察に関する適当な説明を可能にするためには、さらに脂肪腫の事例について試験する必要がある。
【０１５２】
検討
我々は、この研究において、３種の原発性多形態性唾液腺腫及びこの腫瘍から由来した７種の樹立細胞系における１２番染色体の切断点をマッピングした。すべての切断点は、先に分子クローニングし確認された、約１．７Ｍｂの大きさの、１２番染色体の長腕上の染色体ＤＮＡ断片内に位置するようであり、そのうち５種は、５００ｋｂ未満のＤＮＡ区間に密集していた。１．７ＭｂＤＮＡ領域は、明らかにこの型の腫瘍の大きな切断点クラスター領域を含んでいた。我々は、先の研究において、多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０における１２番染色体切断点の確認を報告した（クールズら、１９９５年）。この細胞系の切断点は、現在ここに報告された大きな切断点クラスターから遠位に２Ｍｂより大きな距離に位置することが知られている。Ａｄ−３１２／ＳＶ４０切断点が、群がった切断点の影響を受けたもの以外の病原的に関係がある遺伝子配列を含む可能性がある。しかし、Ｂ細胞悪性腫瘍における１１ｑ１３切断点が想起されるように（レイノードら、１９９３年）、今までマッピングされた多形態性唾液腺腫における１２ｑ１３−ｑ１５切断点のすべてが同じカテゴリーに属し、この染色体の比較的大きなＤＮＡ領域に亘って分散する可能性もまだ排除されるべきでない。種々の切断点に関するさらに精細な指摘により、これに対してさらに光を注ぐことができるであろう。
【０１５３】
多形態性唾液腺腫の群がった１２ｑ切断点を含むＤＮＡ断片が、最近ＵＬＣＲ１２として知られる（シェーンメーカーズら、１９９４年ｂ）１２番染色体切断点の子宮平滑筋種クラスター領域として定義されたＤＮＡ領域と一致するとの観察結果は重要である。この１２番染色体領域が、原発性脂肪腫及び１２ｑ１３−ｑ１５異常をもつ原発性腫瘍に由来する脂肪腫細胞系の切断点をも含むことにはさらに興味がある。全体として、すべてのこれらの研究の結果は、ここに、３種の明確な充実性腫瘍型における１２番染色体切断点が同じ１２番染色体長腕上の１．７Ｍｂゲノム領域に位置することを明らかに示すが、これは、この領域が多重異常領域であることを確認するものである。この特徴を反映するため、我々は、このＤＮＡ断片をＭＡＲと命名した。
【０１５４】
染色体領域１２ｑ１３−１５が関係する遺伝子異常は、既述の３種以外の種々の充実性腫瘍における細胞遺伝学的研究に関係がある。１２ｑ１３−ｑ１５の関係は、子宮内膜ポリープ（ウオルターら、１９８９年；バニら、１９９３年）、再発性ｔ（１２；２２）（ｑ１３；ｑ１３）を特徴とする明細胞肉腫（フレッチャー、１９９２年；リーブスら、１９９２年；ロドリゲスら、１９９２年）、横紋筋肉腫亜群（ロバーツら、１９９２年）および血管外皮腫（マンダールら、１９９３年ｂ）軟骨腫様腫瘍（マンダールら、１９８９年；ブリッジら、１９９２年；ヒラバヤシら、１９９２年；マンダールら、１９９３年ｂ）、及び肺過誤腫（ダル・チンら、１９９３年）についても報告された。最後に、染色体領域１２ｑ１３−ｑ１５が関与する充実性腫瘍の若干の事例の報告が発表された−−−例えば、乳腫瘍（バードサルら、１９９２年；ローエンら、１９９３年）、散在性星状細胞腫（ジェンキンスら、１９８９年）、及び骨巨細胞腫（ノゲラら、１９８９年）。細胞遺伝学的研究の結果に基づいても、これらの腫瘍型の相対的切断点分布に関して全く予言はできない。本研究の結果に照らすと、これらの充実性腫瘍の何れかにおける切断点がＭＡＲ内または近傍に位置するか否かを知ることには興味があるであろう。入手できる種々のコスミドクローンが今これを容易に試験する手段を提供する。
【０１５５】
少なくとも３種の異なる型の充実性腫瘍における１２ｑ切断点が同じＤＮＡ領域に位置するという観察結果は、それが、ＭＡＲ内の同じ遺伝子配列が種々の組織における腫瘍の発生に病因的に関係する可能性を指向し得るため、興味がそそられる。もしそうならば、遺伝子異常を含む遺伝子（類）は成長の調節に関係するかも知れないということを考えることができる。他方、観察されたＭＡＲ内遺伝子異常の群がりは、単に、種々の充実性腫瘍で明らかになるこの領域内の遺伝子の不安定性を反映しているという理由から、ＭＡＲの遺伝子配列が病因的に関係しない可能性もまだ除外することができない。これに対するより多くの洞察を得るためには、ＭＡＲ内に存在する遺伝子を同定確認することが必要であり、これは若干の技術を用いた種々の方法で達成することができる（パリッシュ及びネルソン、１９９３年）。
【０１５６】
謝辞
常務取締役Ｇ．エベラーッの組織上の支持に感謝する。著者は、本報で研究した充実性腫瘍の検体提供について、Ｐ．ダル・チン、Ｊ．ハウプリッヒ、Ｒ．ヒル、Ｇ．ステンマン及びＩ．ド・ウエーバーに対し；優れた技術的補助につきＣ．ハイスマンス、Ｅ．マイアン、Ｋ．マイアーボルト、Ｒ．モルス及びＭ．ウイレムスに対し；図版につきＭ．レイスに対し感謝する。本研究は、ドイチェ・フォルシュングスミッテルシャフト及びテンイェス−ファクト・スティフトゥンクのバイオメド１プログラム「モレキュラー・サイトジェネティックス・オブ・ソリッド・テュマー」、「ヘコンセルテールデ・オンデルゼカクティース１９９２−１９９６」、ザ・ナショナル・ファンド・フォー・サイエンティフィック・リサーチ（ＮＦＷＯ；コム・オプ・テーヘン・カンカー）、「ＡＬＳＫ−プログラマ・フォール・カンケロンデルゼク」、「シュベルプンクトプログラム：モレクラーレ・ウント・クラシッシェ・テュモルチトゲンエティク」を通してＥＣにより一部支援された。本書は、ベルジアン・ステート、プライム・ミニスターズ・オフィス、サイエンス・ポリシー・プログラミングにより提出されたベルジアン・プログラム・オン・インターユニバーシティ・ポールズ・オブ・アトラクションの結果を提示するものである。科学的信頼性は著者が責任を負う。Ｊ．Ｗ．Ｍ．ゲーツはザ・ナショナル・ファンド・フォー・サイエンティフィック・リサーチ（ＮＦＷＯ；コム・オプ・テーヘン・カンカー）の「アスピラント」である。
【０１５７】
文献
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
付属文書１の図の説明
図１．この研究で試験した７種の多形態性唾液腺腫細胞系について得られたＦＩＳＨマッピングデータの略図。ＦＩＳＨマッピング研究でプローブとして用いたコスミドクローンは、重複ＹＡＣクローンで得られた配列標識部位に位置する。これらは、枠内に示すように、ＳＴＳの頭文字にしたがって命名され、その相対的順位は図示のようである。ＲＭ６９とＲＭ７２間のＤＮＡ区間は約２．８Ｍｂと推定される。実線は、種々の細胞系の切断点が位置するＤＮＡ区間を示す。点線は、分子プローブとして上記のＳＴＳに対応するコスミドクローンを用いて種々の細胞系の中期染色体に実施したＦＩＳＨ実験を示す。ＭＡＲ及びＵＬＣＲ１２の相対的位置は図の下部に示す。Ａｄ：多形態性唾液腺腫、ＭＡＲ：多重異常領域、ＵＬＣＲ１２：１２番染色体切断点の子宮平滑筋腫クラスター領域。
【０１６４】
図２．a:ｄｅｒ（８）、ｄｅｒ（１２）、ｄｅｒ（１８）及び対応する正常染色体を示すＡｄ−２９５／ＳＶ４０の部分的核型。ｂ：分子プローブとしてコスミドクローンｃＲＭ７６のＤＮＡを用いたＡｄ−２９５／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析。１２番正常染色体（矢印）及びｄｅｒ（１２）（矢頭）のハイブリダイゼーションシグナル。ｃ：ｂに示したＡｄ−２９５／ＳＶ４０中期染色体のＧＴＧ−バンド形成パターン。ｄ：分子プローブとしてコスミドクローンｃＲＭ１０３のＤＮＡを用いたＡｄ−２９５／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析。１２番正常染色体（矢印）及びdｅｒ（１８）（矢頭）のハイブリダイゼーションシグナル。
【０１６５】
図３．原発性多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫及び脂肪腫並びにこれら充実性腫瘍に由来する細胞系について得られた１２番染色体マッピングデータの略図。結果は、原発性子宮平滑筋腫（バンシュラら、投稿中）及びこれらの腫瘍由来の細胞系（シェーンメーカーら、１９９４年ｂ）に対するデーダと比較して示す。ＦＩＳＨマッピング研究に用いたコスミドクローンは重複ＹＡＣクローンから得られた配列標識部位に対応する。コスミドクローンは、枠内に示すように、ＳＴＳの頭文字にしたがって命名され、その相対的順位は図示のようである。ＳＴＳ間のＤＮＡ区間の推定サイズは図に示す。Ａｄ：多形態性唾液腺腫、Ｌｉ：脂肪腫、ＬＭ：子宮平滑筋腫。
【０１６６】
付属文書２
【０１６７】
要約：ｔ（１；１２）（ｐ２２；ｑ１５）をもつ原発性多形態性唾液腺腫由来の細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０を、蛍光系内ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）で使用して、その１２番染色体上の転座切断点を確認した。先の研究結果によると、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体切断点は、Ｄ１２Ｓ８座の近位でＣＨＯＰ遺伝子の遠位に位置している。ここでは、我々は、我々がＤ１２Ｓ８及びＣＨＯＰを出発点とする染色体歩行プロジェクトに関係して分離した２種の部分的重複酵母人工染色体（ＹＡＣ）クローンＹ４８５４（５００ｋｂｐ）及びＹ９０９１（４６０ｋｂｐ）を報告する。ついで、我々は、これらＹＡＣクローンの挿入物内に位置する種々の配列標識部位（ＳＴＳ類）に対応するコスミドクローンを分離した。これらは、ｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ８５、ｃＲＭ９０、ｃＲＭ９１、ｃＲＭ１１０、およびｃＲＭ１１１を含むものであった。
我々は、これら２種のＹＡＣクローンの挿入物を包含する複合長距離制限地図を提示し、ＦＩＳＨ分析により、両ＹＡＣがＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞に存在する１２番染色体切断点にまたがることを示す。ＦＩＳＨ研究では、コスミドクローンｃＲＭ８５、ｃＲＭ９０及びｃＲＭ１１１は１２番染色体切断点の遠位に位置すると思われたが、他方コスミドクローンｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ９１及びｃＲＭ１１０はその近位に位置することが見出された。これらの結果から、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体切断点は１６５ｋｂｐより小さいＤＮＡ領域に帰属される。他の５種の多形態性唾液腺腫細胞系１２番染色体切断点のＦＩＳＨ分析の評価は、これらがＳＴＳ ＲＭ９１から０．９Ｍｂより大きな距離でＡｄ−３１２／ＳＶ４０のものの近位に位置することを示した。これらの結果は、１２番染色体上の重要と思われる領域を指向するものであるが、また他の場所に位置する染色体１２ｑ１３−ｑ１５配列が関与する可能性に関する証拠をも提供するものである。
【０１６８】
緒論
多形態性唾液腺腫は、大及び小唾液腺から由来する良性上皮性腫瘍の構成要素である。これは最も一般的な型の唾液腺腫であり、この器官の全新生物中のほぼ５０％を説明する。腫瘍の約８５％は耳下腺に見られ、１０％は小唾液腺に、５％は顎下腺に見られる［１］。これらアデノームの約５０％は正常な核型をもつようであるが、細胞遺伝学的研究は、頻発する特異的染色体異常を明らかにした［２，３］。頻繁に見られる異常は、通常８ｑ１２−ｑ１３領域が関係する８番染色体の異常、最も一般的な異常であるｔ（３；８）（ｐ２１；ｑ１２）及び通常１２ｑ１３−ｑ１５が関係する転座である１２番染色体の異常を含む。非頻発性のクローン性染色体異常も報告されている。一貫して８ｑ１２−ｑ１３及び１２ｑ１３−ｑ１５切断点をもつ染色体再編成の高度に特異的なパターンは、この染色体領域が、これらの腫瘍の発生と関係を持つ可能性がある遺伝子類を宿していることを示唆する。染色体切断点の分子クローニング及び接合フラグメントの確認は、病原的に関係がある遺伝子類の同定に通ずる可能性がある。現在、これらの腫瘍に関してこのような分子データはまだ報告されていない。
蛍光系内ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）データに基づいて、最近、６種の多形態性唾液腺腫細胞系の１２番染色体切断点が、１２ｑ１３−ｑ１５領域、さらに詳細にはＤ１２Ｓ１９とＤ１２Ｓ８間のゲノム区間にマッピングされることが示された［４，５］。このゲノムＤＮＡ区間の性平均遺伝子サイズは、ＨＧＭ１０において７ｃＭであると報告された［６］。また我々は、多形態性唾液腺腫の１２番染色体切断点がＣＨＯＰ遺伝子の遠位に位置すると報告したが、これは、唾液腺腫の１２ｑ１３−ｑ１５転座切断点が粘液腫様脂肪肉腫のそれと異なることを示す以前の研究を支持する［７］。本報では、我々は、唯一の細胞遺伝学的異常としてｔ（１；１２）（ｐ２２；ｑ１５）を有する多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０における１２番染色体切断点の物理的マッピングについて報告する。
【０１６９】
材料及び方法
腫瘍細胞系
この研究に用いたヒト腫瘍細胞系は、既報の多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−２４８／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０、及びＡｄ−３６６／ＳＶ４０［５，８］を含んでいる。細胞は２０％ウシ胎児血清を補充したアール塩含有ＴＣ１９９培地中で増殖させた。この研究に用いたその他の細胞系としては、ハムスターの遺伝背景中に唯一のヒト染色体として１２番染色体を含む体細胞雑種ＰＫ８９−１２［９］及び体細胞雑種ＬＩＳ−３／ＳＶＢ４０／Ａ９−Ｂ４［４］を含んでいる。後者の細胞系は、特異的ｔ（１２；１６）（ｑ１３；ｐ１１．２）を有する粘液腫様脂肪肉腫細胞系ＬＩＳ−３／ＳＶ４０とマウスＡ９細胞の融合で得られた。この体細胞雑種は、先にｄｅｒ（１６）を含むことが示されているが、ｄｅｒ（１２）も正常な１２番染色体も含まない［４］。ＰＫ８９−１２及びＬＩＳ−３／ＳＶＢ４０／Ａ９−Ｂ４細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＡ−Ｆ１２培地で増殖させた。細胞系は、標準的細胞遺伝学的技術により規則的な間隔をおいて分析した。
【０１７０】
ＹＡＣ及びコスミドクローンの分離
我々は、詳細を他の場所で報告する（シェーンメーカーズら、準備中）ヒトゲノムマッピング研究に関連して、第１世代ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリー［１０］からＹＡＣクローンＹ４８５４及びＹ９０９１を分離し、１２番染色体特異配列コスミドライブラリーＬＩＮＬＮＣ０１［１１］からコスミドクローンｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ８５、ｃＲＭ９０、ｃＲＭ９１、ｃＲＭ１０３、ｃＲＭ１１０、及びｃＲＭ１１１を分離した。ＹＡＣ及びコスミドクローンは、既報のように分離した［５］。ＹＡＣ及びコスミドライブラリーの最初のスクリーニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むスクリーニング法［１２］を用いて実施した。最終スクリーニング段階として、既報［５］のようにフィルターハイブリダイゼーション分析を使用した。コスミドクローンはＳＴＳ類を用いて分離し、ＹＡＣクローンＹ４８５４及びＹ９０９１の挿入物内のＳＴＳ類に対応するものは、図１に示す。ＳＴＳ類は、ベクトレットＰＣＲ［１３］またはＡｌｕ−ＰＣＲ［１４，１５］を用いてＹＡＣ挿入物末端の回収後に得た。ＰＣＲ産物は、直接固相蛍光配列決定法により配列決定した。コスミドクローンは標準的方法［１６］により増殖させ処理した。ＹＡＣクローンは、既報［５］のように、パルスフィールドゲル電気泳動［１７］、制限地図作製及びハイブリダイゼーションにより確認した。
【０１７１】
染色体調製及び蛍光系内ハイブリダイゼーション
多形態性唾液腺腫腫瘍細胞系は、コルセミド（０.０４μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、次いで常法により採取した。腫瘍細胞の中期塗抹は、既報［４］のように調製した。ＦＩＳＨ実験における染色体の同一性を確認するため、同じ中期塗抹のＧバンド形成後にＦＩＳＨ分析を行った。Ｇバンド形成は、基本的にシュミットら［１８］が報告したように実施した。系内ハイブリダイゼーションは、キービッツら［１９］が報告したプロトコールに従い若干の小修正を施して［５，２０］行った。コスミド及びＹＡＣのＤＮＡは、先に報告したように［５］ビオチン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム）またはビオチン−１４−ＡＴＰ（ＢＲＬ、ゲザースバーグ）で標識した。染色体は、よう化プロピディウムで対比染色後、ＦＩＴＣフィルター（ツァイス）を用いてツァイスアクシオフォト蛍光顕微鏡で分析した。結果は、スコッチ（３Ｍ）のＡＳＡ６４０フィルムに記録した。
【０１７２】
結果
多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０における１２番染色体切断点にまたがるＹＡＣクローンの分離と確認
我々は、先の研究［５］において、Ｄ１２Ｓ８座の近位でＣＨＯＰの遠位にある６種の多形態性唾液腺腫細胞系１２番染色体切断点をマッピングした。これらの座間のＤＮＡ区間は７ｃＭより若干小さかったが（Ｄ１２Ｓ８とＤ１２Ｓ１９座間の推定距離［６］）、それでも本質的に大きかった。Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の転座切断点を分子的に明確にするため、我々は、Ｄ１２Ｓ８座とＣＨＯＰ遺伝子間のＤＮＡ区間についてヒトゲノムマッピング実験を行った。Ｄ１２Ｓ８とＣＨＯＰ遺伝子から出発する直接染色体歩行法において、我々は、重複ＹＡＣクローンＹ９０９１及びＹ４８５４を得た。Ｙ９０９１のＤＮＡ挿入物は４６０ｋｂｐであり、Ｙ４８５４のそれは５００ｋｂｐであると思われた。さらに、下に示すように、ＹＡＣクローンのＤＮＡ挿入物は、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体切断点にまたがるようであった。これらＹＡＣクローン類の挿入物の長距離制限地図を、パルスフィールドゲル電気泳動とハイブリダイゼーション分析を用いて作成した（図１）。ＳＴＳ含量マッピング及びサザンブロット分析に基づくと、ＹＡＣクローンＹ９０９１及びＹ４８５４の挿入物は図１に示すように重複するようであった。試験したＳＴＳ類は、ここに記載しない他の重複ＹＡＣクローンの末端配列またはＡｌｕ間ＰＣＲにより得られた配列に対応する。これらの中、ＲＭ９０及びＲＭ９１はこのＹＡＣ Ｙ９０９１末端ＳＴＳ類を表し、ＲＭ１１０及びＲＭ１１１はＡｌｕ間ＰＣＲ由来ＳＴＳ類を表す。ＹＡＣクローンＹ４８５４とＹ９０９１挿入物内にマッピングする幾つかのＳＴＳ類について、対応コスミドをＦＩＳＨ分析に使用するために分離したが、その例は、ｃＲＭ５１、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ８５、ｃＲＭ９０、ｃＲＭ９１、ｃＲＭ１１０、及びｃＲＭ１１１である。
【０１７３】
２種の重複するＹＡＣクローンの挿入物は、以下の観察から推論されるように、全くキメラとは思われない。Ｙ４８５４またはＹ９０９１を分子プローブとする正常ヒトリンパ球中期染色体のＦＩＳＨ分析は、染色体領域１２ｑ１３−ｑ１５でのみハイブリダイゼーションシグナルを示した。Ｙ９０９１については、これはさらにコスミドクローンｃＲＭ９０またはｃＲＭ９１をプローブとするＦＩＳＨ実験での観察により確認された。これら２種のコスミドそれぞれにおけるＤＮＡ挿入物は、もう一つのＹＡＣクローンＹ９０９１末端配列に対応する。最後に、ハムスター遺伝子背景中における唯一のヒト染色体としてヒト１２番染色体を含むＰＫ８９−１２、及び粘液腫様脂肪肉腫の特異的ｔ（１２；１６）からのｄｅｒ（１６）を含むがｄｅｒ（１２）も正常１２番染色体も含まないことが前に示されているＬＩＳ−３／ＳＶ４０／Ａ９−Ｂ４［４］に対するＰＣＲ分析で確認されたように、Ｙ９０９１の末端配列ＳＴＳ類は、１２番染色体上で、ＣＨＯＰ遺伝子の遠位に位置するようであった。染色体歩行実験から、我々は、２種のＹＡＣクローンの重複挿入物が、染色体１２ｑ上でＤ１２Ｓ８とＣＨＯＰ間に位置する約６４０ｋｂｐのＤＮＡ領域を表すと結論した。ＹＡＣ整列群の６４０ｋｂｐ複合体長距離制限地図は少なくとも全領域を２重にカバーして構成されているので、この点での微小欠失は排除できないけれども、６４０ｋｂｐ領域が染色体ＤＮＡと連続すると仮定するのは合理的でない。
【０１７４】
染色体歩行は、常にＹＡＣクローン及び／またはＹＡＣ挿入物配列に対応するコスミドクローンのＦＩＳＨマッピングにより調べた。染色体の同定については、殆どの場合Ｇ−バンド形成を使用したことに注意すべきである。このＧ−バンド形成に基づき、ハイブリダイゼーションシグナルが既知の存在としての染色体のものとして最終的に帰属決定された。これは、時に観察される交差及び背景ハイブリダイゼーションシグナルをもつ場合に重要である。時にＦＩＳＨ分析前のＧ−バンド形成が弱いハイブリダイゼーションシグナルまたは不明確なバンドパターンをもたらした。したがって、我々は、調べるべきＹＡＣ及びコスミドクローンを参照プローブと組み合わせて使用するＦＩＳＨ実験を行った。コスミドライブリーのスクリーニング中に幸運に得られたコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒを、参照マーカーとして選択した。正常リンパ球中期染色体のＦＩＳＨ分析（図２Ａ）は、ｃＰＫ１２ｑｔｅｒが１２番染色体の長腕テロメア領域に位置することを明らかにした。この実験における１２番染色体を同定するため、１２番動原体特異的プローブｐα１２Ｈ８［２１］を使用した。ＹＡＣクローンＹ４８５４（図２Ｂ）またはＹ９０９１（図２Ｃ）を参照プローブｃＰＫ１２ｑｔｅｒと組み合わせて用いるＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析は、何れの場合にも、ｄｅｒ（１）及びｄｅｒ（１２）上のＹＡＣ挿入物のハイブリダイゼーションシグナルを示した。これらの結果から、我々は、各ＹＡＣクローンの挿入物ＤＮＡがこの細胞系の１２番染色体切断点にまたがると結論した。Ｇバンド形成が、図２Ｃにおける１２番染色体短腕が関与するテロメア会合を明らかにしたことに注意すべきである。ＹＡＣクローンＹ９０９１がＡｄ−３１２／ＳＶ４０における１２番染色体切断点にまたがるという観察結果が、コスミドクローンｃＲＭ９０またはｃＲＭ９１を分子プローブとするＦＩＳＨ実験で独立に確認された。それらは、別のＹ９０９１末端配列を含むことが示された。ｃＲＭ９０は、１２番染色体切断点の遠位に位置するようであり、ｃＲＭ９１は近位に位置することがわかった（データは記載せず）。これらの結果から、また図１に示すＹＡＣ整列群の染色体上の配向をも確認した。要約すると、我々は、これらのＦＩＳＨ実験から、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体転座切断点が２種のＹＡＣクローンの重複配列（約３００ｋｂｐ）に対応するＤＮＡ区間に位置すべきと結論した。
【０１７５】
Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体転座切断点の精細マッピング
Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体転座切断点をさらに狭める方法として、ＹＡＣクローンＹ９０９１内に異なるマッピング位置をもつコスミドクローンを分離した。これらは、ｃＲＭ６９、ｃＲＭ８５、ｃＲＭ１１０、及びｃＲＭ１１１を含む。ｃＲＭ６５及びｃＲＭ８５は、ここに記載しないＹＡＣクローンのＳＴＳ配列に基づいて分離した。ｃＲＭ１１０及びｃＲＭ１１１は、Ａｌｕ間ＰＣＲを経て得られた。ｃＲＭ１１０は、サザンブロット分析で、テロメア末端配列としてのＲＭ６９をもつ重複ＹＡＣクローンのＤＮＡ挿入物ではなく、Ｙ９０９１の末端ＭｌｕＩ断片にハイブリダイズすることが示された。ＲＭ１１０の位置は図１に示すとおりである。ＲＭ１１１は、Ｙ９０９１のＢｓｓＨＩＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩ及びＳｆｉＩ断片にハイブリダイズすることが示され、したがってＳＴＳＲＭ４８もまた位置するＹ９０９１のＰｖｕＩ−ＳｆｉＩ断片内に位置する（図１）。ｃＲＭ６９またはｃＲＭ１１０をプローブとするＡｄ３１２／ＳＶ４０中期染色体のＦＩＳＨ分析は、図３ＡでｃＲＭ６９について示すように、これらコスミドのＤＮＡ挿入物がこの細胞系の１２番染色体転座切断点の近位に位置することを示した。続いて行ったｃＲＭ８５またはｃＲＭ１１１をプローブとするＡｄ−３１２／ＳＶ４０のＦＩＳＨ分析は、図３ＢでｃＲＭ１１１について示すように、転座切断点の遠位にハイブリダイゼーションシグナルを示した。ｃＲＭ８５及びｃＲＭ１１１による結果は、ＹＡＣクローンＹ４８５４のテロメア末端をマークするＳＴＳ ＲＭ４８の遠位にｃＲＭ８５が位置し近くにｃＲＭ１１１が位置するので、ＹＡＣクローンＹ４８５４により観察された切断点の広がりと一致している。結論として、Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の１２番染色体転座切断点は、図４に略示するように、ｃＲＭ１１０とｃＲＭ１１１間のＤＮＡ区間に位置するはずである。
【０１７６】
その他の多形態性唾液腺腫細胞系における１２番染色体切断点のＦＩＳＨ評価
Ａｄ−３１２／ＳＶ４０との関係で１２番染色体切断点の位置を決定するため、図４に略示するように、５種の他の多形態性唾液腺腫細胞系をＦＩＳＨ分析により調べた。原発性腫瘍から開発した［５，８］これらの細胞系は、Ａｄ−２４８／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０およびＡｄ−３６６／ＳＶ４０を含むものであった。これらの細胞系の染色体異常を図４に示す。ｃＲＭ９１を用いたこれらの細胞系中期染色体のＦＩＳＨ分析は、これらの細胞系すべての１２番染色体切断点がこのコスミドクローンの近位に位置することを示した（データは記載せず）。同様なＦＩＳＨ分析を、プローブとして配列標識部位ＲＭ１０３に対応するコスミドクローンを用いて行った。ＲＭ１０３は、ＲＭ９１の近位に約０．９Ｍｂｐの距離で位置することがわかった。全ての場合に、ｃＲＭ１０３は１２番染色体転座切断点の遠位に位置するようであり、このことは、これら５種の多形態性唾液腺腫細胞系における１２番染色体切断点が、Ａｄ３１２／ＳＶ４０のそれから比較的大きな距離で位置することを示す。
【０１７７】
検討
ここに提示する研究において、我々は、多形態性唾液腺腫細胞系Ａｄ−３１２／ＳＶ４０の転座切断点が位置すると思われる１２番染色体長椀上の、分子クローンされ確認された染色体領域を同定した。先の研究［５］において、我々は、既にこの細胞系の１２番染色体切断点がＤ１２Ｓ８とＣＨＯＰ間に位置することの証拠を提出した。ここに記載する２種の切断点に拡がるＹＡＣクローンは、最初の出発点としてＤ１２Ｓ８及びＣＨＯＰ遺伝子を用いる指向性染色体歩行実験で得られたので、ここに提出する１２番染色体切断点マッピング結果は先に示した我々の主張を確認した。分子プローブとしてＹ９０９１の完全ＹＡＣ挿入物を用いて得たＦＩＳＨ結果は、独立に、このＹＡＣクローンの挿入物の種々の領域に対応する配列を含むコスミドクローンを用いたＦＩＳＨ実験で確認された。独立の確認結果は、Ｙ９０９１完全挿入物で見られる分裂シグナルが、ＹＡＣに示される配列の実際の分裂以外のもので説明できる可能性を減らすので、このことは重要である。例えば、染色体切断点の両側にある関連性が高い遺伝子配列は、もしＹＡＣ挿入物のＦＩＳＨ結果のみに基づくならば容易に誤った結論に導くであろう。最後に、我々のマッピング実験はまた、この研究で我々が作り出した長距離制限地図の染色体配向を決定的に確認するものであった。この配向は、２色ＦＩＳＨ実験（未公表の観察結果）に基づいて既に予想されていたものである。
【０１７８】
ここに記載するＦＩＳＨ実験により、我々は、Ａｄ３１２−／ＳＶ４０細胞における１２番染色体切断点を、確認されているＳＴＳ ＲＭ４８とＲＭ６９間の１９０ｋｂｐｄ区間にマッピングするのが可能になった。しかし、切断点領域は、以下に基づいてさらに若干狭めることができる。Ｙ４８５４が切断点にまたがることが示されたということは、少なくともこのＹＡＣクローンのテロメア半片のかなりの部分が切断点の遠位に位置べきことを示している。精細に確認されていないことがまだ多く残存する。他方、ＳＴＳ ＲＭ６９は、コスミドクローンｃＲＭ６９ＤＮＡ挿入物のほぼ中央に位置すると思われ、これは切断点がＲＭ６９のほぼ２５ｋｐｂ遠位にあることを示唆する。さらに、ｃＲＭ６９はＲＭ１１０を欠くと思われ（データは記載せず）、ｃＲＭ１１０はＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞の１２番染色体切断点の近位に見られるので、切断点は先に述べた２５ｋｂｐよりもさらにＲＭ６９の遠位にあるべきである。全体的に見て、このことは１２番染色体切断点領域を、１６５ｋｂｐよりかなり小さくあるべきＤＮＡ区間に狭める。さらに、切断点へ鋭く指向することにより、我々が、１２番染色体を分子クローニングし、病理学的に関係がある配列の同定を導く可能性がある切断点結合領域の遺伝子配列を確認することができた。配列決定、直接ハイブリダイゼーション、直接選択またはエクソントラッピングによるＹＡＣクローンＹ４８５４及びＹ９０９１ＤＮＡ挿入物内遺伝子の同定は、多形態性唾液腺腫の腫瘍化に病理学的に必要である可能性があるこの１２番染色体長腕領域内の遺伝子の同定のための別の有用な方法をなす可能性がある。
【０１７９】
他の多形態性唾液腺腫における１２番染色体切断点が、１２番染色体長腕上の、離れた、より近位の領域に位置するという観察には、興味がそそられる。これは、多形態性唾液腺腫における１２番染色体切断点が、Ｂ細胞悪性腫瘍における１１ｑ１３切断点［２２］を思わせるような、１２番染色体長腕の比較的大きなＤＮＡ領域に亘って分散することを示唆する可能性がある。他の多形態性唾液腺腫細胞系における１２番染色体切断点の精細な解明がこの問題にさらに光を注ぐ可能性がある。他方、それは、重要であるかも知れない、おそらく多形態性唾液腺腫の成長調節のような、１２番染色体長腕上の別の配列を指向する可能性がある。ここに記載する１２番染色体切断点領域が今までＡｄ−３１２細胞系でしか見つかっていないということは、染色体の１２ｑ１３−ｑ１５異常をもつ多数の唾液腺腫を分析して、研究した細胞系に対する１２番染色体配列の影響が腫瘍形成と関連性をもつ可能性を検討する必要を生じさせるものである。もしこの１２番染色体の特定領域の異常が多くの事例に見つかるならば、これらの腫瘍が臨床的に亜群を形成するかどうかを知ることに興味がそそられる。最後に、ヒト１２番染色体のｑ１３−ｑ１５領域が関係する染色体転座は他の種々の充実性腫瘍：良性脂肪組織腫、子宮平滑筋腫、横紋筋肉腫、血管外皮腫、明細胞肉腫、軟骨腫様腫瘍及び肺過誤腫について報告されている。これらの腫瘍の幾つかにおいて１２番染色体切断点がＡｄ−３１２／ＳＶ４０のそれと同一領域内に位置するか否かについてはまだ確認されていない。本報告に記載したＹＡＣ及びコスミドクローンはこれを研究するための有用な手段を構成する。
【０１８０】
第１世代ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリー［１０］の複製及び配置１２番染色体特異的コスミドライブラリー（ＬＩＮＬ１２ＮＣ０１）［１１］の複写の入手につき深く感謝する。コスミドライブラリーは、契約番号Ｗ−７４０５−Ｅｎｇ−４８のアメリカエネルギー省ＬＬＮＬの援助下のナショナル・ラボラトリー・ジーン・ライブラリー・プロジェクトの一部として構築された。著者は、優れた技術的補助につきＭ．ドヘイン、Ｃ．ハイスマンス、Ｅ．マイアン、Ｋ．マイアーボルト及びＭ．ウイレムスに対し感謝し、図版につきＭ．レイスに対し感謝する。本研究は、ドイチェ・フォルシュングスミッテルシャフト及びテンイェス−ファクト・スティフトゥンクのバイオメド１プログラム「モレキュラー・サイトジェネティックス・オブ・ソリッド・テュマー」、「ヘコンセルテールデ・オンデルゼカクティース１９９２−１９９６」、ザ・ナショナル・ファンド・フォー・サイエンティフィック・リサーチ（ＮＦＷＯ；コム・オプ・テーヘン・カンカー）、「ＡＬＳＫ−プログラマ・フォール・カンケロンデルゼク」、「シュベルプンクトプログラム：モレクラーレ・ウント・クラシッシェ・テュモルチトゲンエティク」を通してＥＣにより一部支援された。本書は、ベルジアン・ステート、プライム・ミニスターズ・オフィス、サイエンス・ポリシー・プログラミングにより提出されたベルジアン・プログラム・オン・インターユニバーシティ・ポールズ・オブ・アトラクションの結果を提示するものである。科学的信頼性は著者が責任を負う。Ｊ．Ｗ．Ｍ．ゲーツはザ・ナショナル・ファンド・フォー・サイエンティフィック・リサーチ（ＮＦＷＯ；コム・オブ・テーヘン・カンカー）の「アスピラント」である。
【０１８１】
文献
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
付属文書２の図の説明
図１．ＹＡＣクローンＹ４８５４及びＹ９０９１の重複ＤＮＡ挿入物の複合物理的地図。ＹＡＣクローンの相対的位置は、長距離物理的地図の下の横線により示す。ここに記載しないＹＡＣを含めたＹＡＣ類の末端クローンに対応する配列標識部位（ＳＴＳ類）は、制限地図上のに枠内ＲＭコードにより示す。Ａｌｕ間ＰＣＲ産物から得られたＳＴＳ類は制限地図の下に示し、そのマッピングに対するＤＮＡ領域は矢印で示す。Ｂ：ＢｓｓＨＩＩ；Ｍ：ＭｌｕＩ；Ｐ：ＰｖｕＩ；Ｓｆ：ＳｆｉＩ。
【０１８６】
図２．Ａ）１２番染色体長腕テロメア領域に対するコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒのマッピング。１２番動原体特異的プローブｐα１２Ｈ８を、１２番染色体の同定確認に使用した。対照ヒトリンパ球の中期染色体についてＦＩＳＨ分析を実施した。ｃＰＫ１１２ｑｔｅｒのハイブリダイゼーションシグナルは小矢頭で示し、１２番動原体特異的プローブに対するそれはアステリスクで示す。Ｂ），Ｃ）ＹＡＣクローンＹ４８５４（Ｂ）またはＹ９０９１（Ｃ）のＤＮＡを分子プローブとし参照マーカーとしてコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒを組み合わせて用いるＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析。１２番染色体上のＹＡＣクローンのハイブリダイゼーションシグナルは大矢頭で示し、ｄｅｒ（１）上のものは大矢印で、ｄｅｒ（１２）上のものは小矢印でそれぞれ示す。コスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒのハイブリダイゼーションシグナルは小矢頭で示す。
【０１８７】
図３．コスミドクローン。ＲＭ６９（Ａ）またはｃＲＭ１１１（Ｂ）を分子プローブとし参照マーカーとしてコスミドクローンｃＰＫ１２ｑｔｅｒを組み合わせて用いるＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞中期染色体のＦＩＳＨ分析。ｃＰＫ１２ｑｔｅｒのハイブリダイゼーションシグナル位置は小矢頭で示す。（Ａ）において、正常１２番染色体上のｃＲＭ６９のハイブリダイゼーションシグナル位置は大矢頭で、ｄｅｒ（１２）のものは小矢印で示す。（Ｂ）において、正常１２番染色体上のｃＲＭ１１１のハイブリダイゼーションシグナル位置は大矢頭で、ｄｅｒ（１）のものは大矢印で示す。
【０１８８】
図４．この研究で試験した６腫の多形態性唾液腺腫細胞系で得たＦＩＳＨマッピングデータの略図。種々の細胞系における特異的１２番染色体異常を示す。ＦＩＳＨマッピング実験でプローブとして用いたコスミドクローンは重複ＹＡＣクローンから得た配列標識部位に対応する。個々のＦＩＳＨ実験は点で示す。コスミドクローンは、枠内に示すように、ＳＴＳの頭文字により命名し、これらの相対的順位を提示した。ＲＭ９０とＲＭ１０３間のＤＮＡ区間は約１．３Ｍｂと推定される。挿入図：ｔ（１；１２）（ｐ２２；ｑ１５）を有するＡｄ−３１２／ＳＶ４０細胞系のＧバンド形成性誘導染色体ｄｅｒ（１）及びｄｅｒ（１２）の略図。Ａｄ−２４８／ＳＶ４０、Ａｄ−２６３／ＳＶ４０、Ａｄ−２９５／ＳＶ４０、Ａｄ−３０２／ＳＶ４０およびＡｄ−３６６／ＳＶ４０の１２番染色体切断点の位置は矢印で示すようにＲＭ１０３の遠位である。
【０１８９】
付属文書１図１
【０１９０】
付属文書１図２
【０１９１】
付属文書１図３
【０１９２】
付属文書２図１
【０１９３】
付属文書２図２
【０１９４】
付属文書２図３
【０１９５】
付属文書２図４
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速移動群タンパク質遺伝子またはＬＩＭタンパク質遺伝子（これらの修飾体を含む）の成員の一つの鎖の一つのヌクレオチド配列を有する多重腫瘍異常生長（ＭＡＧ）遺伝子。
【請求項２】
図７に示されたＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補的鎖（両鎖の修飾体または伸長体を含む）を基本的に有する、請求項１の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項３】
図５に示されたＬＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補的鎖（両鎖の修飾体または伸長体を含む）を基本的に有する、請求項１の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項４】
ヒトまたは動物における非生理的増殖現象の処置のための適切な発現調節の化合物または技術を設計するための開始点として使用する、請求項１または３の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項５】
非生理的増殖能を有する細胞を野生型細胞と比較して（臨床的に／医学的に）診断するための適切なヌクレオチド・プローブを設計するための開始点として使用する、請求項１または３の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項６】
非生理的増殖能を有する細胞を野生型細胞と比較して（臨床的に／医学的に）診断するための適切な抗体を製造するための開始点として使用する、請求項１または３の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項７】
ＭＡＧ遺伝子の誘導体がセンスおよびアンチセンスｃＤＮＡまたはそのフラグメント、該遺伝子の転写物またはその実際に用い得るフラグメント、アンチセンスＲＮＡ、該遺伝子のフラグメントまたはその相補的鎖、該遺伝子よりコードされたタンパク質またはそのフラグメント、該遺伝子、該ｃＤＮＡ、該転写物、該タンパク質またはそれらのフラグメントに対する抗体および抗体フラグメントからなる群より選ばれ、診断および治療的組成物の調製に使用される、請求項１または３のＭＡＧ遺伝子の、またはその直接の近隣の誘導体。
【請求項８】
下記の段階
ａ）請求項１または３のＭＡＧ遺伝子のヌクレオチド配列から得られる情報に基づく１セットのヌクレオチド・プローブを設計する（該プローブの一つは、野生型遺伝子の対応領域として、同じ座に実質的に位置する異常遺伝子の領域にハイブリダイズ可能であり、他のプローブは、野生型遺伝子の対応領域より異なる座に位置する異常遺伝子の領域にハイブリダイズ可能である）段階、
ｂ）非生理的増殖能を有する１以上の中間層または間層染色体または細胞をプローブと共にハイブリダイズ条件でインキュベートする段階、
ｃ）プローブと遺伝子とのハイブリダイゼイションを可視化する段階、
の少なくともいくつかを含む、非生理的増殖能を有する細胞を診断するためのインサイトゥ診断法。
【請求項９】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検より適当なＭＡＧ遺伝子関連マクロ分子を単離する段階、
ｃ）前記得られたマクロ分子を望ましくは同じ個体からの野生型参考分子と比較することにより分析する段階、
の少なくともいくつかを含む、非生理的増殖能を有する細胞を診断する方法。
【請求項１０】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検の全ＲＮＡを抽出する段階、
ｃ）全ＲＮＡ抽出物中のｍＲＮＡ種の少なくとも一つの第一鎖ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡは適当なティルを有する）を調製する段階、
ｄ）ＭＡＧ遺伝子特異ｃＤＮＡを増幅するために、ＭＡＧ遺伝子特異プライマーおよびティル−特異および／または相手特異／整列プライマーを用いてＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲを行う段階、
ｅ）バンドのパターンを得るために、ゲル上でＰＣＲ産物を分離する段階、
ｆ）異常バンドの存在を、望ましくは同じ個体からの野生型バンドとの比較により調べる段階、
の少なくともいくつかを含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検から全タンパク質を単離する段階、
ｃ）基本的に個々のバンドを得るためにゲル上で全タンパク質を分離し、そして任意でバンドをウエスタン・ブロットに移行する段階、
ｄ）前記得られたバンドを、ＭＡＧ遺伝子の残り部分によりコードされるタンパク質の部分に対する、およびＭＡＧ遺伝子の置換部分によりコードされたタンパク質の部分に対する抗体と共にハイブリダイズする段階、
ｅ）抗原−抗体反応を可視化し、望ましくは同じ個体の野生型タンパク質のバンドと比較して、異常バンドの存在を確認する段階、
の少なくともいくつかを含む、請求項９の方法。
【請求項１２】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検から全ＤＮＡを単離する段階、
ｃ）前記ＤＮＡを１以上のいわゆる“希切断”制限酵素で消化する段階、
ｄ）分離パターンを得るために、前記調製した消化物を分離する段階、
ｅ）任意で分離パターンをサザンブロットに移行する段階、
ｆ）ゲル中またはブロット上の分離パターンを１以上の情報プローブと共にハイブリダイズ条件でハイブリダイズする段階、
ｇ）ハイブリダイゼンションを可視化し、望ましくは同じ個体からの野生型タンパク質のバンドとの比較で異常バンドの存在を確認する段階、
の少なくともいくつかを含む、請求項９の方法。
【請求項１３】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検からｍＲＮＡを抽出する段階、
ｃ）ＭＡＧ遺伝子から誘導されるｍＲＮＡの存在または(比較の)量を確認する段階、
ｄ）段階ｃ）の結果を望ましくは同じ個体からの野生細胞での同様の実験結果と比較する段階、
の少なくともいくつかを含む、請求項９の方法。
【請求項１４】
非生理的増殖能を有する細胞が、間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪性組織腫瘍（例えば脂肪腫）、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍、さらに白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項８−１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
非生理的増殖能を有する細胞が関与する疾患を該遺伝子の発現を調節することにより処置するのに用いる、請求項１または３のＭＡＧ遺伝子のアンチセンス分子。
【請求項１６】
非生理的増殖能を有する細胞が関与する疾患の処置に用いる、請求項１または３のＭＡＧ遺伝子の阻害剤または促進剤（リボチームを含む）などの発現調節剤。
【請求項１７】
非生理的増殖能を有する細胞が関与する疾患の処置に用いる、請求項１または３のＭＡＧ遺伝子のｍＲＮＡ分子に相補的なアンチセンスＲＮＡ分子および／またはＭＡＧ遺伝子の遺伝子産物に対する抗体。
【請求項１８】
標識ヌクレオチド・プローブの適当なセットを含む、請求項８の方法を実施するための診断キット。
【請求項１９】
標識ヌクレオチド・プローブの適当なセットを含む、請求項１０の方法を実施するための診断キット。
【請求項２０】
標識ＭＡＧ遺伝子特異的およびティル特異的ＰＣＲプライマーの適当なセットを含む、請求項１１の方法を実施するための診断キット。
【請求項２１】
標識プローブの適当なセットおよび適当な希切断制限酵素を含む、請求項１１の方法を実施するための診断キット。
【請求項２２】
請求項７の誘導体を１以上および／または請求項１６の発現調節剤を１以上含む、非生理的増殖能を有する細胞におけるＭＡＧ遺伝子発現レベルを低下せしめるための医薬組成物。
【請求項２３】
非生理的増殖能を有する細胞が、間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪性組織腫瘍（例えば脂肪腫）、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍、さらに白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項２２の医薬組成物。
【請求項２４】
非生理的増殖能を有する細胞に関連する疾患または障害の診断または処置のための診断キットまたは医薬組成物の製造のための請求項７の誘導体の使用方法。
【請求項２５】
非生理的増殖能を有する細胞に関連する疾患または障害の診断または処置のための診断キットまたは医薬組成物の製造のための請求項１６の発現調節剤の使用方法。
【請求項２６】
非生理的増殖能を有する細胞が、間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪性組織腫瘍（例えば脂肪腫）、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍、さらに白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項２４および２５の使用方法。
【請求項２７】
分子トゥール（プローブ、プライマーなど）を設計するためのＭＡＧタンパク質の少なくとも一部分を用いて腫瘍細胞における融合遺伝子、融合転写物または融合タンパク質の存在に基づく他のＭＡＧ遺伝子を単離するための方法。
【請求項２８】
請求項２７の方法により得られるＭＡＧ遺伝子。
【請求項２９】
診断的または治療的方法に使用するための請求項２８のＭＡＧ遺伝子。
【請求項３０】
動物がそのゲノムにＭＡＧ遺伝子を所有する形質転換動物である、非生理的増殖能を有する細胞に関連する疾患または障害の処置における化合物または組成物の有用性検定のための動物モデル。
【請求項３１】
ＭＡＧ遺伝子が、遺伝子の残り部分およびその転座相手の置換部分の融合産物などの異常ＭＡＧ遺伝子である、請求項３０の動物モデル。
【請求項３２】
ＭＡＧ遺伝子が非生理的発現レベルを示す、請求項３０の動物モデル。
【請求項３３】
動物がその細胞の、少なくとも部分のゲノムにおいて請求項１または３のＭＡＧ遺伝子に影響を及ぼす特異的遺伝子異常を所有し、その異常が胚胎幹細胞における相同組換えを経由して誘導される、非生理的増殖能を有する細胞に関連する疾患または障害の処置における化合物または組成物の有用性検定のための動物モデル。
【請求項３４】
動物が哺乳動物、特にマウス、ラット、イヌ、ブタまたはチンパンジーのような高等霊長動物である、請求項３０−３３のいずれかの動物モデル。
【請求項３５】
詳細な説明および図面に開示したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・プローブおよびプライマー。
【請求項１】
高速移動群タンパク質遺伝子またはＬＩＭタンパク質遺伝子（これらの修飾体を含む）の成員の一つの鎖の一つのヌクレオチド配列を有する多重腫瘍異常生長（ＭＡＧ）遺伝子。
【請求項２】
図７に示されたＨＭＧＩ−Ｃ遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補的鎖（両鎖の修飾体または伸長体を含む）を基本的に有する、請求項１の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項３】
図５に示されたＬＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補的鎖（両鎖の修飾体または伸長体を含む）を基本的に有する、請求項１の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項４】
ヒトまたは動物における非生理的増殖現象の処置のための適切な発現調節の化合物または技術を設計するための開始点として使用する、請求項１または３の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項５】
非生理的増殖能を有する細胞を野生型細胞と比較して（臨床的に／医学的に）診断するための適切なヌクレオチド・プローブを設計するための開始点として使用する、請求項１または３の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項６】
非生理的増殖能を有する細胞を野生型細胞と比較して（臨床的に／医学的に）診断するための適切な抗体を製造するための開始点として使用する、請求項１または３の多重腫瘍異常生長因子。
【請求項７】
ＭＡＧ遺伝子の誘導体がセンスおよびアンチセンスｃＤＮＡまたはそのフラグメント、該遺伝子の転写物またはその実際に用い得るフラグメント、アンチセンスＲＮＡ、該遺伝子のフラグメントまたはその相補的鎖、該遺伝子よりコードされたタンパク質またはそのフラグメント、該遺伝子、該ｃＤＮＡ、該転写物、該タンパク質またはそれらのフラグメントに対する抗体および抗体フラグメントからなる群より選ばれ、診断および治療的組成物の調製に使用される、請求項１または３のＭＡＧ遺伝子の、またはその直接の近隣の誘導体。
【請求項８】
下記の段階
ａ）請求項１または３のＭＡＧ遺伝子のヌクレオチド配列から得られる情報に基づく１セットのヌクレオチド・プローブを設計する（該プローブの一つは、野生型遺伝子の対応領域として、同じ座に実質的に位置する異常遺伝子の領域にハイブリダイズ可能であり、他のプローブは、野生型遺伝子の対応領域より異なる座に位置する異常遺伝子の領域にハイブリダイズ可能である）段階、
ｂ）非生理的増殖能を有する１以上の中間層または間層染色体または細胞をプローブと共にハイブリダイズ条件でインキュベートする段階、
ｃ）プローブと遺伝子とのハイブリダイゼイションを可視化する段階、
の少なくともいくつかを含む、非生理的増殖能を有する細胞を診断するためのインサイトゥ診断法。
【請求項９】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検より適当なＭＡＧ遺伝子関連マクロ分子を単離する段階、
ｃ）前記得られたマクロ分子を望ましくは同じ個体からの野生型参考分子と比較することにより分析する段階、
の少なくともいくつかを含む、非生理的増殖能を有する細胞を診断する方法。
【請求項１０】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検の全ＲＮＡを抽出する段階、
ｃ）全ＲＮＡ抽出物中のｍＲＮＡ種の少なくとも一つの第一鎖ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡは適当なティルを有する）を調製する段階、
ｄ）ＭＡＧ遺伝子特異ｃＤＮＡを増幅するために、ＭＡＧ遺伝子特異プライマーおよびティル−特異および／または相手特異／整列プライマーを用いてＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲを行う段階、
ｅ）バンドのパターンを得るために、ゲル上でＰＣＲ産物を分離する段階、
ｆ）異常バンドの存在を、望ましくは同じ個体からの野生型バンドとの比較により調べる段階、
の少なくともいくつかを含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検から全タンパク質を単離する段階、
ｃ）基本的に個々のバンドを得るためにゲル上で全タンパク質を分離し、そして任意でバンドをウエスタン・ブロットに移行する段階、
ｄ）前記得られたバンドを、ＭＡＧ遺伝子の残り部分によりコードされるタンパク質の部分に対する、およびＭＡＧ遺伝子の置換部分によりコードされたタンパク質の部分に対する抗体と共にハイブリダイズする段階、
ｅ）抗原−抗体反応を可視化し、望ましくは同じ個体の野生型タンパク質のバンドと比較して、異常バンドの存在を確認する段階、
の少なくともいくつかを含む、請求項９の方法。
【請求項１２】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検から全ＤＮＡを単離する段階、
ｃ）前記ＤＮＡを１以上のいわゆる“希切断”制限酵素で消化する段階、
ｄ）分離パターンを得るために、前記調製した消化物を分離する段階、
ｅ）任意で分離パターンをサザンブロットに移行する段階、
ｆ）ゲル中またはブロット上の分離パターンを１以上の情報プローブと共にハイブリダイズ条件でハイブリダイズする段階、
ｇ）ハイブリダイゼンションを可視化し、望ましくは同じ個体からの野生型タンパク質のバンドとの比較で異常バンドの存在を確認する段階、
の少なくともいくつかを含む、請求項９の方法。
【請求項１３】
下記の段階
ａ）診断すべき細胞の生検を採取する段階、
ｂ）前記生検からｍＲＮＡを抽出する段階、
ｃ）ＭＡＧ遺伝子から誘導されるｍＲＮＡの存在または(比較の)量を確認する段階、
ｄ）段階ｃ）の結果を望ましくは同じ個体からの野生細胞での同様の実験結果と比較する段階、
の少なくともいくつかを含む、請求項９の方法。
【請求項１４】
非生理的増殖能を有する細胞が、間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪性組織腫瘍（例えば脂肪腫）、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍、さらに白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項８−１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
非生理的増殖能を有する細胞が関与する疾患を該遺伝子の発現を調節することにより処置するのに用いる、請求項１または３のＭＡＧ遺伝子のアンチセンス分子。
【請求項１６】
非生理的増殖能を有する細胞が関与する疾患の処置に用いる、請求項１または３のＭＡＧ遺伝子の阻害剤または促進剤（リボチームを含む）などの発現調節剤。
【請求項１７】
非生理的増殖能を有する細胞が関与する疾患の処置に用いる、請求項１または３のＭＡＧ遺伝子のｍＲＮＡ分子に相補的なアンチセンスＲＮＡ分子および／またはＭＡＧ遺伝子の遺伝子産物に対する抗体。
【請求項１８】
標識ヌクレオチド・プローブの適当なセットを含む、請求項８の方法を実施するための診断キット。
【請求項１９】
標識ヌクレオチド・プローブの適当なセットを含む、請求項１０の方法を実施するための診断キット。
【請求項２０】
標識ＭＡＧ遺伝子特異的およびティル特異的ＰＣＲプライマーの適当なセットを含む、請求項１１の方法を実施するための診断キット。
【請求項２１】
標識プローブの適当なセットおよび適当な希切断制限酵素を含む、請求項１１の方法を実施するための診断キット。
【請求項２２】
請求項７の誘導体を１以上および／または請求項１６の発現調節剤を１以上含む、非生理的増殖能を有する細胞におけるＭＡＧ遺伝子発現レベルを低下せしめるための医薬組成物。
【請求項２３】
非生理的増殖能を有する細胞が、間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪性組織腫瘍（例えば脂肪腫）、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍、さらに白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項２２の医薬組成物。
【請求項２４】
非生理的増殖能を有する細胞に関連する疾患または障害の診断または処置のための診断キットまたは医薬組成物の製造のための請求項７の誘導体の使用方法。
【請求項２５】
非生理的増殖能を有する細胞に関連する疾患または障害の診断または処置のための診断キットまたは医薬組成物の製造のための請求項１６の発現調節剤の使用方法。
【請求項２６】
非生理的増殖能を有する細胞が、間葉腫瘍過誤腫（例えば乳房および肺）、脂肪性組織腫瘍（例えば脂肪腫）、多形態性唾液腺腫、子宮平滑筋腫、血管筋腫、胸部線維腺腫、子宮内膜のポリープ、動脈硬化性プラークおよび他の良性腫瘍、さらに肉腫（例えば横紋筋肉腫、骨肉腫）および癌腫（例えば乳房、肺、皮膚、甲状線の）などの種々の悪性腫瘍、さらに白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項２４および２５の使用方法。
【請求項２７】
分子トゥール（プローブ、プライマーなど）を設計するためのＭＡＧタンパク質の少なくとも一部分を用いて腫瘍細胞における融合遺伝子、融合転写物または融合タンパク質の存在に基づく他のＭＡＧ遺伝子を単離するための方法。
【請求項２８】
請求項２７の方法により得られるＭＡＧ遺伝子。
【請求項２９】
診断的または治療的方法に使用するための請求項２８のＭＡＧ遺伝子。
【請求項３０】
動物がそのゲノムにＭＡＧ遺伝子を所有する形質転換動物である、非生理的増殖能を有する細胞に関連する疾患または障害の処置における化合物または組成物の有用性検定のための動物モデル。
【請求項３１】
ＭＡＧ遺伝子が、遺伝子の残り部分およびその転座相手の置換部分の融合産物などの異常ＭＡＧ遺伝子である、請求項３０の動物モデル。
【請求項３２】
ＭＡＧ遺伝子が非生理的発現レベルを示す、請求項３０の動物モデル。
【請求項３３】
動物がその細胞の、少なくとも部分のゲノムにおいて請求項１または３のＭＡＧ遺伝子に影響を及ぼす特異的遺伝子異常を所有し、その異常が胚胎幹細胞における相同組換えを経由して誘導される、非生理的増殖能を有する細胞に関連する疾患または障害の処置における化合物または組成物の有用性検定のための動物モデル。
【請求項３４】
動物が哺乳動物、特にマウス、ラット、イヌ、ブタまたはチンパンジーのような高等霊長動物である、請求項３０−３３のいずれかの動物モデル。
【請求項３５】
詳細な説明および図面に開示したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・プローブおよびプライマー。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２５４３７８（Ｐ２００９−２５４３７８Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７３８４７（Ｐ２００９−１７３８４７）
【出願日】平成２１年７月２７日（２００９．７．２７）
【分割の表示】特願２００７−２９０６７１（Ｐ２００７−２９０６７１）の分割
【原出願日】平成８年２月１９日（１９９６．２．１９）
【出願人】（５０６２９１９１１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２７日（２００９．７．２７）
【分割の表示】特願２００７−２９０６７１（Ｐ２００７−２９０６７１）の分割
【原出願日】平成８年２月１９日（１９９６．２．１９）
【出願人】（５０６２９１９１１）
【Ｆターム（参考）】
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