実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンおよび実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを作製するための方法
本発明は、組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）およびｒＦｕｒｉｎの作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎおよび実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎの作製方法に関する。かかるｒＦｕｒｉｎは、通常ｒＦｕｒｉｎの作製に関係し得る他のタンパク質（血清タンパク質および宿主細胞タンパク質など）を実質的に含まない。このｒＦｕｒｉｎにより、高比活性および高純度を有し、ｒＦｕｒｉｎ調製物中のタンパク質夾雑物に関連する副次的悪影響のない成熟タンパク質を後に作製することが可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年１２月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，１５２号の優先権を主張する。米国仮特許出願第６１／０１８，１５２号は、その全体が本明細書中に参考により援用される。
【０００２】
本発明は、一般的に、組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）およびｒＦｕｒｉｎの作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎ、および実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
活性タンパク質または成熟タンパク質は、通常、生きている生物体には非常に少ない量で存在している。したがって、好ましくは、そのプロタンパク質またはプロ酵素を、活性化酵素（例えば、プロテアーゼ）と接触させることにより、インビトロで活性化させる。プロタンパク質（またはタンパク質前駆体）は不活性なタンパク質であり、１回以上の翻訳後修飾によって、特に、該プロタンパク質からのプロペプチドの切断によって活性となる。プロタンパク質の例としては、例えば、プロインスリン、プロトロンビン、プロフォンヴィレブランド因子（プロＶＷＦ）などが挙げられる。
【０００４】
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、凝固に関与している血液糖タンパク質である。ＶＷＦは、フォンヴィレブランド病において欠乏または欠損しており、非常の多くの他の疾患、例えば、血栓性血小板減少性紫斑病、ハイド症候群、および場合によっては溶血性尿毒症症候群に関与している。ＶＷＦは、約５００〜２０，０００ｋＤの範囲の大きさの一連の多量体として血漿中を循環している糖タンパク質である。ＶＷＦの多量体形態は、２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットが互いにジスルフィド結合によって連結されて構成されている。ＶＷＦは、損傷血管壁の内皮下層への初期の血小板付着を媒介し、ＶＷＦの大型多量体のみが止血活性を示すと考えられている。大きな分子量を有するＶＷＦ多量体は、内皮細胞のヴァイベル−パラーデ（Ｐａｌｌａｄｅ）小体内に貯蔵されており、刺激を受けると遊離する。遊離したＶＷＦは、次いで、血漿プロテアーゼによってさらにプロセッシングされ、ＶＷＦの低い分子量形態が生じる。
【０００５】
ヒトでは、プロペプチドの除去はほぼ完全であるが、高レベルの組換えＶＷＦ発現を有する哺乳動物細胞株では、このプロセスはあまり効率的ではない。したがって、かかる組換え細胞株由来の細胞培養上清みは、通常、成熟ＶＷＦと、ＶＷＦ前駆体（プロＶＷＦなど）の混合物を含む。したがって、成熟ＶＷＦが得られるためには、ＶＷＦ前駆体、特にプロＶＷＦが成熟ＶＷＦに変換されることが必要である。このプロセスは、通常、プロペプチドをプロテアーゼで切断することによりなされる。
【０００６】
現行の慣用的な方法では、プロ形態をプロテアーゼとともに液相中でインキュベートし、それにより成熟それ自体（すなわち、プロタンパク質からのプロペプチドの切断）を非結合状態の遊離溶液中で行なうこと、または、例えば特許文献１に記載のように、プロテアーゼを固相担体上に固定化し、これを、プロＶＷＦを含む調製物と接触させ、該調製物とともにインキュベートすること（例えば、特許文献１参照）のいずれかにより成熟ＶＷＦが生成される。しかしながら、これらの方法は、本発明による方法と比べて種々の不都合点を含む。
【０００７】
産業的には、ＶＷＦおよび、特に組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を、遺伝子操作したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株内で組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）とともに合成および発現させる。共発現ｒＶＷＦの機能は、細胞培養プロセスにおいてｒＦＶＩＩＩを安定させることである。ｒＶＷＦは該細胞内で、Ｎ末端に結合された大型プロペプチドを含むプロ形態で合成される。小胞体およびゴルジ装置内で成熟すると、プロペプチドが、細胞内プロテアーゼであるフリンの作用によって切断され、成熟タンパク質が、発現タンパク質の二量体からなる同一サブユニットのホモポリマーとして分泌される。しかしながら、この成熟は、典型的には不完全であり、プロＶＷＦと成熟ＶＷＦの混合物を含む生成物がもたらされる。
【０００８】
先の刊行物では、プロＶＷＦが成熟ＶＷＦに、フリン（ｆｕｒｉｎ）またはフリン様プロテアーゼでのインビトロ処理によって変換され得ることが示されている（非特許文献１；非特許文献２；およびＥＰ０７７５７５０Ａ）。特に、ＥＰ０７７５７５０Ａでは、フリンとＶＷＦを組換えにより共発現させると、ＶＷＦの成熟がインサイチュで起こり得ることが示唆されている。
【０００９】
組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）は、プロｒＶＷＦ（プロ組換えフォンヴィレブランド因子）を、Ａｒｇ７４１−Ｓｅｒ７４２ペプチド結合を切断することによりｒＶＷＦに変換させる。この成熟工程は、フォンヴィレブランド病Ｂ型の処置のためのｒＶＷＦ作製プロセスの一部であり、組換え第ＶＩＩＩ因子−半減期（ｒＦＶＩＩＩ−ＨＬ）の製造プロセスの一部である。フリンは、プロタンパク質コンバターゼファミリーに属し、カルシウム（Ｃａ２＋）に依存性である。フリンは、−１位と-４位にアルギニンを含む特定の配列内のアルギニンのＣ末端ペプチド結合を特異的に切断する。この配列は数多くのヒトタンパク質に見られ得、これは、フリンがいくつかのヒトプロタンパク質の成熟に主要な役割を果たしていることを示す。
【００１０】
活性化型タンパク質の作製は、臨床上および診断上、非常に重要である。例えば、活性タンパク質または成熟タンパク質（成熟ＶＷＦなど）は、血液凝固を制御するために使用され得る。本発明は、活性化型タンパク質を後に作製するための実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎである改善された組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）を提供する。より詳しくは、本発明は、プロＶＷＦを成熟ＶＷＦに変換させるための実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第００／４９０４７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｃｈｌｏｋａｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：２５７−２６７，１９９６
【非特許文献２】Ｐｒｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０：１−１５，１９９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）である組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）、およびその作製方法を提供する。かかるｒＦｕｒｉｎは、通常ｒＦｕｒｉｎの作製に関係し得る他のタンパク質（血清タンパク質および宿主細胞タンパク質など）を実質的に含まない。このｒＦｕｒｉｎにより、高比活性および高純度を有し、ｒＦｕｒｉｎ調製物中のタンパク質夾雑物に関連する副次的悪影響のない成熟タンパク質を後に作製することが可能になる。より詳しくは、このｒＦｕｒｉｎにより、高比活性および高純度を有する成熟ＶＷＦを作製することが可能になる。したがって、本発明は、組換え宿主細胞の選択および化学的に規定される培地への適応、ｒＦｕｒｉｎの発現および細胞培養上清み中への分泌、ならびに細胞除去後のｒＦｕｒｉｎの精製のための方法を提供する。
【００１４】
本発明の実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎは、約０．１〜０．６ｎｇ タンパク質／単位フリン活性もしくはそれ未満の、または約２〜１１μｇ タンパク質／ｍＬもしくはそれ未満の範囲の濃度の宿主細胞タンパク質を含み、培養培地中の血清由来の夾雑タンパク質が本質的にないｒＦｕｒｉｎの調製物または組成物を包含する。一態様において、実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎは、約０〜０．４ｐｇ ＤＮＡ／単位フリン活性もしくはそれ未満の、または約０〜２４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬもしくはそれ未満の濃度の夾雑宿主細胞ＤＮＡを含み、培養培地中の血清由来の夾雑タンパク質が本質的にないｒＦｕｒｉｎの調製物を包含する。
【００１５】
本発明は、少なくとも１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン、および約１１μｇ タンパク質／ｍＬ未満の濃度の宿主細胞タンパク質を含む組成物を包含する。また、かかる組成物は、約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕフリン活性未満の濃度の宿主細胞タンパク質を含むものであってもよい。一態様において、宿主細胞タンパク質はＣＨＯ細胞由来のものである。
【００１６】
別の態様において、本発明は、少なくとも１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン、および約１４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬ未満の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含む組成物を包含する。種々の態様において、かかる組成物はまた、約０．５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕフリン活性未満の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含むものであってもよい。一態様において、宿主細胞ＤＮＡはＣＨＯ細胞由来のものである。
【００１７】
また、本発明は、少なくとも約１００Ｕ／μｇのフリン比活性の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン、および約１１μｇ タンパク質／ｍＬ未満の濃度の宿主細胞タンパク質を含む組成物を包含する。また、かかる組成物は、約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕフリン活性未満の濃度の宿主細胞タンパク質を含むものであってもよい。一態様において、宿主細胞タンパク質はＣＨＯ細胞由来のものである。
【００１８】
さらに、本発明は、少なくとも約１００Ｕ／μｇのフリン比活性の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン、および約１４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬ未満の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含む組成物を包含する。また、かかる組成物は、約０．５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕフリン活性未満の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含むものであってもよい。一態様において、宿主細胞ＤＮＡはＣＨＯ細胞由来のものである。
【００１９】
また、本発明は、本明細書に記載の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを含む組成物の作製方法を包含する。かかる方法は、宿主細胞を培地中で、血清濃度をだんだん低下させながら、すべての血清が該培地から除去されるまで適応させる工程を含む。別の態様において、該方法は、宿主細胞を、血清を含む培地中での培養から無血清培地中での培養に移す工程を含む。例示的な態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを含む組成物の使用方法を包含する。かかる使用は、プロタンパク質を該組成物と、該プロタンパク質からプロペプチドが切断されて成熟タンパク質が形成される条件下で接触させる工程を含む。ｒＦｕｒｉｎは、フリンによって切断されるプロタンパク質からの任意の成熟タンパク質の形成に使用され得る。一態様において、成熟タンパク質はフォンヴィレブランド因子である。別の態様では、成熟タンパク質は第ＶＩＩＩ因子である。また、本発明では、本発明のｒＦｕｒｉｎが、これによって切断される任意のプロタンパク質のインビトロプロセッシングとインビボプロセッシングの両方に有用であることが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明のさらなる実例を、添付の図面を参照しながら示す。該実例を以下の図１〜１８に示す。
【図１】図１は、本発明の一実施形態における発現活性ｒＦｕｒｉｎプロテアーゼ構築物を示す。ｒＦｕｒｉｎ構築物は、Ｃｙｓリッチ膜貫通ドメインと細胞質ゾルドメインが除去されるようにＣ末端のＡＡ５７７が切断されている。
【図２】図２は、ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃４８８−３の作製の系図を示す。
【図３】図３は、ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃２８９−２０の作製の系図を示す。
【図４】図４は、ＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４の細胞集団におけるｒＦｕｒｉｎ産生細胞のグラフによる分布の比較を示す。ＰＭＣＢ＃０４の細胞の８０．７４％がｒＦｕｒｉｎを発現し、ＰＭＣＢ＃０１の細胞の７４．０６％がｒＦｕｒｉｎを発現している。
【図５】図５は、５つの温度を３つのｐＨ値と組み合わせて温度とｐＨの７つの組み合わせを得た「Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリックス」を示す。
【図６】図６は、容積生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）に関するデータの表面プロット解析を示す。図６のデータの座標を点で示す。表面は、単一データの推定相関を示す。
【図７】図７は、容積生産性に対する温度とｐＨの影響を示すコンタープロットを示す。点は、実験で試験した条件（ｐＨ／温度）を示す。
【図８】図８は、容積生産性に対して温度の影響が強く、ｐＨの影響が弱いことを示す３次元表示である表面プロットを示す。
【図９】図９は、モデル型相関を３次元的に示す表面プロットを示す；これは、二次方程式の関係を示し、３６．５℃で増殖速度が最大であることを明白に示す。
【図１０】図１０は、比生産性に関するデータの解析を示す。温度およびｐＨと比生産性との相関は、容積生産性で見られたものと同様である。
【図１１】図１１は、温度を３７℃から３５．１℃に下げることにより、容積生産性がおよそ２００ｋＵ／Ｌ／ｄから５４０ｋＵ／Ｌ／ｄに上昇し得ることを示す。
【図１２】図１２は、ｒＦｕｒｉｎのＳＤＳ−ｐａｇｅおよび銀染色を示す。キャンペーン（ｃａｍｐａｉｇｎ）ＯＲＦＵ０６００２とＯＲＦＵ０７００２のＣａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液のバンドパターンは、高度に相関している；試料はすべて、およそ６０ｋＤａに顕著なＦｕｒｉｎバンドを示す。キャンペーンＯＲＦＵ０６００２の試料のバッチＭＭＣ０１〜ＭＭＣ０８では、Ｆｕｒｉｎバンドがわずかに小さい分子量である傾向が見られる（図１２、レーン１〜８）。
【図１３】図１３は、モノクローナル抗Ｆｕｒｉｎ抗体を用いた試料のウエスタンブロット解析を示す。
【図１４】図１４は、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２のｒＦｕｒｉｎ試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）およびその後のウエスタンブロットによるｒＦｕｒｉｎの特異的バンドパターンを示す。
【図１５】図１５は、キャンペーンＯＲＦＵ０７００２のｒＦｕｒｉｎ試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）およびその後のウエスタンブロットによるｒＦｕｒｉｎの特異的バンドパターンを示す。
【図１６】図１６は、キャンペーンＯＲＦＵ０７００２のｒＦｕｒｉｎ試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）およびその後のウエスタンブロットによるｒＦｕｒｉｎのウエスタンブロットの結果を示す。
【図１７】図１７は、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液）の試料のＦｕｒｉｎ逆相ＨＰＬＣを示す。ｒＦｕｒｉｎのフィンガープリントパターンを確立するため、試料をＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。
【図１８】図１８は、キャンペーンＯＲＦＵ０７００２（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液）の試料のＦｕｒｉｎ逆相ＨＰＬＣを示す。ｒＦｕｒｉｎのフィンガープリントパターンを確立するため、試料をＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、無血清培地中で培養でき、かつ活性な組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）を細胞培養上清み中に分泌することができる組換え宿主細胞株の開発と作製に関する。組換えフリンをコードするプラスミドのトランスフェクションに選択される宿主細胞株は、一態様において、組換え第ＶＩＩＩ因子および組換えＶＷＦの発現に使用されるものと同じである。得られたｒＦｕｒｉｎは、次いで、動物性タンパク質を実質的に含まないように精製される。
【００２３】
フリンは、ＰＡＣＥ、ＰＡＣＥ４、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４およびＰＣ５／ＰＣ６としても知られており、プロタンパク質の切断、特に分泌型合成に重要な役割を果たしているサブチリシン様セリンプロテアーゼ群に属する（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎ．４：１１５−１３６，１９９３）。プロタンパク質は、翻訳後、ゴルジ装置内で内在プロテアーゼにより、その成熟形態に細胞内プロセッシングされる。プロテアーゼ切断部位は、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇを特徴とする認識配列を含む。プロテアーゼであるフリンはプロタンパク質を、このコンセンサス配列の後ろで特異的に切断する（Ｈｏｓａｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２１２７−１２１３０，１９９１）。
【００２４】
ヒトおよびマウスのフリン、ならびにサブチリシン様プロテアーゼ機能を有するさらなるタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が同定されている（Ｒｏｅｂｒｏｅｋら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１１：１１７−１２５，１９８６；Ｒｏｅｂｒｏｅｋら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：２１９７−２２０２，１９８６；Ｂａｒｒら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：３１９−３２８，１９９１；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７１０１−７１０２，１９８９；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６６４，１９９０；Ｓｍｅｅｋｅｎｓら、１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２９９７−３０００；Ｓｍｅｅｋｅｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．８８；３４０−３４４，１９９１；Ｋｉｅｆｅｒら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：７５７，１９９１；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５８９７−５９００，１９９２；およびＨａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２０７５−２２０７８，１９９０）。ヒトフリン遺伝子は、７９４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしており、一部の特定の機能は、個々の特徴的領域：触媒中心、中央ドメイン、シスチンリッチ領域、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに割り当て可能である（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎ．４：１１５−１３６，１９９３）。一態様において、ヒトフリンポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＡＸ０２１１１に示されたものである（米国立バイオテクノロジー情報センター、米国立医学図書館、ベテスダ、ＭＤ）。しかしながら、当業者には、フリンの生物学的活性、すなわち、プロタンパク質を切断する（例えば、プロＶＷＦを切断して成熟ＶＷＦを生成させる）能力を有する任意のタンパク質が、本明細書に記載の方法によって作製され得ることが認識されよう。
【００２５】
インタクトなフリンは、ゴルジ装置の膜系内に組み込まれ、そこで機能的に活性となる（Ｂｒｅｓｎａｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：２８５１−２８５９，１９９０）。７５〜８０ｋＤの過剰発現天然フリンの切断形態は、細胞上清み中に、分泌型タンパク質として検出され得る（Ｗｉｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９３７８−９３８２，１９９０）。この天然に分泌されるフリンは、「流入型（ｓｈｅｄ）フリン」として知られており（Ｖｉｄｒｉｃａｉｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９５：１０１１−１０１８，１９９３）、Ｎ末端側で膜貫通部分が切断されている（Ｖｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２７：１８２９−１８４２，１９９４）。
【００２６】
また、遺伝子操作による切断型フリン（膜貫通ドメインと細胞質ドメインのコード部分を欠失させたもの）を発現させ、相応して分泌させることができる。かかるＮ末端欠失は、アミノ酸７１４〜７９４（Ｌｅｄｕｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０４−１４３０８，１９９２，Ｍｏｌｌｏｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６３９６−１６４０２，１９９２）；アミノ酸７１６〜７９４（”ＳｏＩ−ＰＡＣＥ”）（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５，１９９３；およびＲｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｂｌｏｏｄ ７９：２３４９−２３５５，１９９２）；ならびにアミノ酸７０５〜７９４（Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６０９４−１６０９９，１９９２）について報告されている。また、シスチンリッチ領域の欠失をさらに含むフリン変異型も報告されている（Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１：２９６−３０１，１９９２；Ｃｒｅｅｍｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１８２６−２１８３４，１９９３）。
【００２７】
フリンの細胞内タンパク質分解の活性、およびその塩基性アミノ酸に対する選択性は、最初に、プロフォンヴィレブランド因子（プロｖＷＦ）を用いて実験において測定された。プロｖＷＦは、７４１個のアミノ酸を有するプロポリペプチドと、２０５０個のアミノ酸を有する成熟フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）からなる（Ｖｅｒｗｅｉｊら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１８３９−１８４７，１９８６）。プロｖＷＦからの成熟ｖＷＦの遊離は、Ａｒｇ７６３より後ろのタンパク質分解性切断によって起こる。真核生物用発現ベクター内のプロｖＷＦ ｃＤＮＡでのトランスフェクションにより、細胞培養上清み中に、等モル量の３６０ｋＤのプロｖＷＦと２６０ｋＤの成熟ｖＷＦの生成がもたらされる。おそらく、ｖＷＦは、トランスフェクト細胞内で内因的に存在するフリンにより、その成熟形態にプロセッシングされる（Ｗｉｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９３７８−９３８２，１９９０，Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１４：２６５−２７５，１９９０）。
【００２８】
中でも、それぞれフリンまたはサブチリシン様酵素によって切断されるさらなるプロタンパク質は、一連のホルモンおよび増殖因子（例えば、プロアクチビンＡ、肝細胞増殖因子）、血漿タンパク質（アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子）、受容体（インスリンプロ受容体）、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０、インフルエンザウイルス血球凝集素）ならびに細菌タンパク質（ジフテリア毒素、炭疽毒素）である（Ｄｅｃｒｏｌｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２２４０−１２２４７，１９９４；Ｓｔｉｅｎｅｋｅ−Ｇｒｏｂｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２４０７−２４１４，１９９２；Ｂａｒｒ，Ｃｅｌｌ ６６：１−３，１９９１，Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５，１９９３；Ｋｌｉｍｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０２７７−１０２８１，１９９２；Ｔｓｕｎｅｏｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６４６１−２６４６５，１９９３；Ｂｒｅｓｎａｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：２８５１−２８５９，１９９０；Ｈｏｓａｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２１２７−１２１３０，１９９１；およびＶｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：１８２９−１８４２，１９９４）。本発明のｒＦｕｒｉｎは、このようなプロタンパク質の切断における使用も想定される。
【００２９】
真核生物細胞培養物中でのインタクトなフリンおよびプロタンパク質をコードする核酸配列の共発現により、プロタンパク質のプロセッシングの増大がインビボで達成された。これは、例えば、プロ第ＩＸ因子（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５，１９９３）ならびにプロｖＷＦ（ＷＯ９１／０６３１４；Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．１４：２６５−２７５，１９９０；およびＲｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｂｌｏｏｄ ７９：２３４９−２３５５，１９９２）で示されている。本発明では、本発明のｒＦｕｒｉｎが、これによって切断される任意のプロタンパク質のインビトロプロセッシングとインビボプロセッシングの両方に有用であることが想定される。
【００３０】
インタクトなフリンとプロタンパク質との共発現の他に、切断型フリンがプロタンパク質とともに発現された。フリン欠失変異型は、インビボで分泌型として共発現させると、酵素的に活性であることが示されている；かかる欠失変異型の酵素活性は、とりわけ、プロ第ＩＸ因子（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５，１９９３）およびプロｖＷＦ（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｂｌｏｏｄ ７９：２３４９−２３５５，１９９２）のプロセッシングにおいて検出され得た。フリン欠失変異型を用いた共発現実験により、該タンパク質の膜貫通部分と細胞質部分は、触媒機能に必須ではないことが示された（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８２３５−８２３９，１９９２）。
【００３１】
ＷＯ９１／０６３１４には、原核生物細胞および真核生物細胞におけるフリンの組換え発現、フリン融合タンパク質、欠失変異型および断片の調製、組換えにより調製されたフリンの精製、ならびにインビトロでのプロタンパク質のプロセッシングのための精製フリンの使用の潜在性が、一般的に開示されている。ＷＯ９２／０９６９８には、ＰＡＣＥ（フリン）の発現、不活性なタンパク質前駆体（例えば、プロｖＷＦなど）との共発現、ならびに融合タンパク質の調製が記載されている。Ｓｔｉｅｎｅｋｅ−Ｇｒｏｂｅｒら（ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２４０７−２４１４，１９９２）には、精製フリンによるインフルエンザウイルスＨＡタンパク質のインビトロ切断が記載されている。Ｄｅｃｒｏｌｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２２４０−１２２４７，１９９４）には、フリンによるＨＩＶ ｇｐ１６０のインビトロ切断が記載されている。
【００３２】
Ｃ末端が短縮されたフリンを用いた実験において、プロアルブミンおよび相補プロＣ３（Ｏｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９：１３５３−１３６１，１９９２）、炭疽毒素（Ｋｌｉｍｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０２７７−１０２８１，１９９２）、ジフテリア毒素（Ｔｓｕｎｅｏｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６４６１−２６４６５，１９９３）ならびにプロ第ＩＸ因子（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６８，１９９３，Ｂｒｉｓｔｏｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１４１３６−１４１４３，１９９４）の切断が、インビトロで好成績で行なわれた。
【００３３】
したがって、本発明のｒＦｕｒｉｎは、上記のプロタンパク質のインビボおよびインビトロでのプロセッシングにおける使用が想定される。一態様において、本発明のｒＦｕｒｉｎは、プロＶＷＦおよびプロ第ＩＸ因子のインビトロプロセッシングに特に有用である。しかしながら、その使用は、前記タンパク質のプロセッシングに対する限定を解釈されるべきではない。さらなる態様において、本発明のｒＦｕｒｉｎは、組換えプロタンパク質のインビトロプロセッシングに特に有用である。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、プロｖＷＦとｒＦｕｒｉｎを発現する細胞の共培養である。
したがって、細胞培養上清み（ｓｕｐｅｒｎａｎｔａｎｔ）中のプロｖＷＦは、やはり細胞培養上清み中に存在するｒＦｕｒｉｎによってインビトロで切断されて活性形態となる。プロセッシングされたｖＷＦは、続いて、米国特許第６，２１０，９２９号（引用により本明細書に組み込まれる）に論考されているようにして培養液から単離され、精製される。共培養では、すべて共通の発現系を使用してもよく、プロｖＷＦとｒＦｕｒｉｎの発現に種々の系を互いに組み合わせてもよい。一態様において、同じ起源の宿主細胞内でプロｖＷＦとｒＦｕｒｉｎの両方が発現させる発現系が使用される。
【００３５】
用語「宿主細胞」は、形質転換された細胞、または核酸配列により形質転換され得、次いで対象の選択遺伝子を発現し得る細胞をいうために用いる。該用語は、親細胞の子孫を包含する（選択遺伝子が存在している限り、該子孫が元の親と形態構造または遺伝子構成が同一であっても、そうでなくても）。
【００３６】
本発明は、組換えタンパク質作製のための当該技術分野で知られた任意の宿主細胞または宿主を包含する。したがって、本発明における細胞は、任意の供給源に由来するものであり得る。一態様において、本発明は、真核生物および原核生物の宿主細胞を包含する。別の態様では、本発明は、植物細胞、動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、および酵母細胞を包含する。一態様において、例示的な酵母細胞としては、ピキア属（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびサッカロミセス属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ならびにＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋ．Ｚａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ、Ｋ．ｔｈｅｒｎｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；Ｋ．ｙａｒｒｏｗｉａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｔｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、ハンセヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、トルロプシス属、およびロドトルラ属が挙げられる。例示的な昆虫細胞としては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａおよびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ならびにショウジョウバエ属が挙げられる。
【００３７】
さらなる態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、一次上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）ならびに確立された細胞株およびその諸系統（例えば、２９３胚性腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ頸上皮細胞およびＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞、ＨｅＬａ ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ １８０細胞、ＬＳ １７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、クローンＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、ならびにＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、もしくはその誘導体細胞）、任意の組織または器官（例えば、限定されないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細管）、リンパ系組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、および血液）、脾臓由来の線維芽細胞、ならびに線維芽細胞株および線維芽様細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５７３細胞、ＨＥＬ ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ．ｓｕｂ．３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、２０７１系統（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ系統（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃ．ｓｕｂ．ｌｌ細胞、ならびにＪｅｎｓｅｎ細胞、またはその誘導体細胞）である。
【００３８】
例示的な哺乳動物細胞としては、さまざまなＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ−２９３、ＮＳ０、ＹＢ２／３、ＳＰ２／０細胞、およびヒト細胞（ＰＥＲ−Ｃ６またはＨＴ１０８０など）、ならびにＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｓａｏｓ、ＰＣ−１２、ＨＣＴ １１６、Ｌ９２９、Ｌｋｔ−、ＷＩ３８、ＣＶ１、ＴＭ４、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＭＭＴ、白血病細胞、胚性幹細胞または受精卵細胞が挙げられる。本発明の一態様において、例示的な宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本発明のさらなる態様において、ＣＨＯ細胞を浮遊培養するための培地が使用される。
【００３９】
宿主細胞は、当該技術分野で知られたさまざまな様式で、例えば限定されないが、所望のタンパク質をコードする外来核酸の挿入（任意選択で、発現ベクターの一部として）、所望のタンパク質をコードする宿主細胞の内在遺伝子の発現の増大が引き起こされるような外来発現制御配列の挿入、または所望のタンパク質をコードする内在遺伝子の発現を増大させる宿主細胞の内在発現制御配列（１つもしくは複数）の活性化によって、タンパク質を発現するように操作されたものであってもよい。
【００４０】
宿主細胞の培養物は、当該技術分野で知られた任意の方法に従って調製され得、かかる宿主細胞の培養方法および該細胞によって産生された組換えタンパク質の回収方法（該細胞から、または培養培地からのいずれであれ）は、当該技術分野で知られている。かかる培養方法は、培養培地に、タンパク質産生の化学的誘導因子を添加することを伴うものであり得る。例示的な宿主細胞および手順を後述する。
【００４１】
フリンポリペプチドをコードする核酸は、適切な発現ベクター内に、標準的な分子生物学的手法を用いて挿入される。一態様において、該核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＡＸ０２１１１（米国立バイオテクノロジー情報センター、米国立医学図書館、ベテスダ、ＭＤ）に示されたヒトフリンポリペプチドをコードするものであるが、当業者には、フリンの生物学的活性、すなわち、プロＶＷＦを切断して成熟ＶＷＦを生成させる能力を有する任意のタンパク質が本明細書に記載の方法によって作製され得ることが認識されよう。さらなる態様において、Ｃ末端が切断された完全分泌型ｒＦｕｒｉｎを、シスチンリッチドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むアミノ酸５７８〜７９４をコードするヌクレオチドを欠失させることにより設計した。なおさらなる態様において、精製プロセスを補助するためにアミノ酸テイルを付加してもよい。また別の態様では、１０ヒスチジン残基テイルを、アミノ酸５７７（フレキシブルリンカーとしての機能を果たす介在する４グリシン残基伴う、または伴わない）の後ろに付加した。
【００４２】
発現ベクターには、任意選択で、プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のリーダー配列またはシグナル配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入のためのポリリンカー領域、および／または選択可能マーカーエレメントを含めてもよい。これらの各配列は、後で論考する。
【００４３】
任意選択で、ベクターに「タグ」コード配列（すなわち、フリンポリペプチドコード配列の５’または３’末端に存在させたオリゴヌクレオチド配列；該オリゴヌクレオチド分子はポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）をコードする）を含めてもよく、市販の抗体を存在させるための別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃなどを含めてもよい。このタグは、典型的には、該ポリペプチドを発現させると該ポリペプチドに融合されており、宿主細胞からのフリンポリペプチドの検出またはアフィニティ精製のための手段としての機能を果たし得る。
【００４４】
好適なベクターとしては、限定されないが、コスミド、プラスミド、または修飾ウイルスが挙げられるが、ベクター系は、選択した宿主細胞と適合性でなければならないことは認識されよう。一態様において、ベクターはプラスミドである。さらなる態様では、プラスミドはｐＵＣ系クローニングベクターである。本発明において使用され得る他のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、配列決定ベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。本発明で想定されるベクターとしては、限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、ファージミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物（細菌など）；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）でトランスフェクトした、または細菌ｌ発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；さらには動物細胞系が挙げられる。
【００４５】
哺乳動物系発現ベクターは、典型的には、複製起点、適当なプロモーター、また、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、必要とされる発現制御エレメントを提供するために使用され得る。例示的な真核生物系ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、およびｐＶＩＴＲＯ３が挙げられる。
【００４６】
核酸は宿主細胞内に、当該技術分野で知られた任意の手段によって、例えば、ＤＮＡのリポソーム媒介性導入、受容体媒介性導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、塩化カルシウム、リン酸カルシウム沈降、微粒子ボンバードメント、ウイルスベクターでの感染、リポフェクション、トランスフェクション、または相同組換えによって導入することができる。
【００４７】
用語「形質転換された」または「トランスフェクトされた」は、本明細書で用いる場合、宿主細胞が外来ポリヌクレオチドを含むように変更されていることをいい、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体内に組み込まれてもよく、エピソームエレメントとして維持されてもよい。提供する本方法の一部の特定の態様では、宿主細胞が「トランスフェクション工程」においてトランスフェクトされることが想定される。該方法は、多数回のトランスフェクション工程を含むものであってもよい。また、宿主細胞内への外来ポリヌクレオチドの導入のための当該技術分野で知られた他の方法、例えば、手法的には「形質転換」でないエレクトロポレーションおよび細胞融合なども、本記載の解釈上、用語「形質転換」定義に含まれる。
【００４８】
また、本発明は、宿主細胞を、ｒＦｕｒｉｎタンパク質発現がもたらされる条件下で培養するため、すなわち増殖させるための方法を提供する。かかる方法は、宿主細胞によって産生されたｒＦｕｒｉｎを培養培地から回収する工程を含む。例示的な態様において、宿主細胞を、化学的に規定される無血清培地中で増殖する。血清は、生化学的に規定されない物質であり、充分に特定されていない多くの成分を含み、ロットごとに異なり、かつ多くの場合、微生物（ウイルスおよびマイコプラズマなど）が混入しているため、ｒＦｕｒｉｎの組換え生成物中に血清が存在することは望ましくない。さらに、培養培地中に血清中の動物性タンパク質が存在すると、長時間の精製手順が必要となり得る。
【００４９】
したがって、本発明は、ヒトフリン遺伝子で組換えによりトランスフェクトした細胞を培養するための、本質的に動物性タンパク質を含まない生物化学的に規定される培養培地を提供する。培地の成分は、たいてい、無機、合成または組換えであり、したがって、任意の動物源から直接得られるものではない。
【００５０】
本発明の細胞培養培地は、１種類以上の置換性（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）化合物を含むものであり得る、金属結合性化合物であり得る１種類以上の置換性化合物を含むものであり得る、および／または１種類以上の置換性化合物を含む１種類以上の複合体を含むものであり得る。一部の実施形態において、培地は、１種類以上の置換性化合物（金属結合性化合物であり得る）と複合体形成される１種類以上の遷移元素またはその塩もしくはイオンを含む１種類以上の複合体を含むものであり得る。一部の実施形態において、培地は、インビトロでの細胞の培養を補助することができ、培養細胞のトランスフェクションを可能にするものであり得る。
【００５１】
本発明の一態様によれば、遷移元素は、好ましくは、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルビジウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、およびアクチニウム、またはその塩もしくはイオンからなる群より選択され、好ましくは鉄塩である。好適な鉄塩としては、限定されないが、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３もしくはＦｅＳＯ４またはＦｅ＋＋＋もしくはＦｅ＋＋イオンを含有する他の化合物が挙げられる。
【００５２】
培地中の金属結合性化合物としては、遷移元素と相互作用または結合し、細胞によるその取込みを助長し得る任意の巨大分子が挙げられる。かかる相互作用／結合は、性質が共有結合性であっても非共有結合であってもよい。本発明のこの態様に使用される金属結合性化合物は、好ましくは、ポリオール、ヒドロキシピリジン誘導体、１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−テトラメチレンホスホン酸、トリスクシン、酸性の糖（例えば、グルコン酸第１鉄）、グリコサミノグリカン、ジエチレントリアミン五酢酸、ニコチン酸−Ｎ−オキシド、２−ヒドロキシ−ニコチン酸、一−、二−もしくは三置換２，２’−ビピリジン、ヒドロキサム酸誘導体（例えば、アセトヒドロキサム酸）、アミノ酸誘導体、デフェロキサミン、フェリオキサミン、鉄塩基性ポルフィンおよびその誘導体、ＤＯＴＡ−リシン、テキサフィリン、サフィリン、ポリアミノカルボン酸、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリエチレンカルバメート、エチルマルトール、３−ヒドロキシ−２−ピリジン、ならびにＩＲＣ０１１からなる群より選択される。一態様において、金属結合性化合物はポリオール、例えば、ソルビトールまたはデキストランなど、特にソルビトールである。関連する態様において、金属結合性化合物はヒドロキシピリジン誘導体、例えば、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、３−ヒドロキシ−４−ピロン、３−ヒドロキシピリド（ｐｙｐｙｐｙｒｉｄ）−２−オン、３−ヒドロキシピリド−２−オン、３−ヒドロキシピリド−４−オン、１−ヒドロキシピリド−２−オン、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリド−４−オン、１−メチル−３−ヒドロキシピリド−２−オン、３−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−ピリジノン、エチルマルトールまたはピリドキサルイソニコチニルヒドラゾンなどである。また、本発明の金属結合性化合物は、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋などの二価のカチオンに結合するものであってもよい。
【００５３】
本発明の培養培地には、アデニン、エタノールアミン、Ｄ−グルコース、ヘパリン、緩衝剤、ヒドロコルチゾン、インスリン、リノール酸、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、トリ−ヨードサイロニン、チミジン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−システイン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋＋−パントテン酸、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、プルロニックＦ６８、組換えインスリン、カルシウム塩、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＫＣｌ、マグネシウム塩、マンガン塩、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、セレン塩、ケイ素塩、モリブデン塩、バナジウム塩、ニッケル塩、スズ塩、ＺｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４または他の亜鉛塩からなる群より選択される１種類以上の成分が含まれ得、この場合、各成分は、インビトロ細胞培養が補助される量で添加される。
【００５４】
別の態様において、本発明の培養培地には、任意選択で、さらに１種類以上のサイトカイン、ダイズペプトン、１種類以上の酵母ペプチドおよび１種類以上の植物性ペプチド（最も好ましくは、米、アロエ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、マメ、スカッシュ、ホウレンソウ、ニンジン、イモ、サツマイモ、タピオカ、アボカド、オオムギ、ココナッツおよび／またはサヤインゲンの１種類以上、および／または１種類以上の他の植物）からなる群より選択される１種類以上の補給物を含めてもよく、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１８２５５（ＷＯ９８／１５６１４として公開）を参照のこと。
【００５５】
また、本発明の培養培地には、任意選択で、至適ｐＨを維持するための１種類以上の緩衝剤を含めてもよい。好適な緩衝剤としては、限定されないが、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、重炭酸塩および細胞培養適用用途における使用のための適当な他の緩衝剤が挙げられる。好適な緩衝剤は、培養細胞に対して実質的な細胞傷害性なく緩衝能をもたらすものである。適当な緩衝剤の選択は、細胞培養の技術分野の通常の技能の範囲内である。
【００５６】
上記の培地成分は、溶液中で一緒に混合されると、本発明の完全培養培地を形成する。完全培地は、本明細書においてより詳細に記載しているように、さまざまな哺乳動物細胞の培養における使用に適している。本明細書で得られる情報および当業者が有する知識に基づき、当業者は、必要以上に実験を行なうことなく、作業用の培地配合物を得ることができよう。
【００５７】
最初に、化学的に規定される無血清培地での増殖に適応させる前に、宿主細胞を、当業者には充分わかる標準的な培地で増殖してもよい。該培地は、通常、細胞の増殖と生存に必要なすべての栄養分を含有する。真核生物細胞の培養に好適な培地は、ロスウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート（ＲＰＭＩ）培地１６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、最小必須培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、およびＥｘＣｅｌｌ ３２５培地であり、これらにはすべて、培養対象の具体的な細胞株によって指示されるとおりに血清および／または増殖因子を補給してもよい。しかしながら、注目すべきことに、本発明は、次いで培地中の血清を培養液から除去し、無血清培地中で増殖することができる宿主細胞を得ることを提供する。したがって、本発明は、宿主細胞を、ｒＦｕｒｉｎの最大産生のための無血清条件下で培養するための至適培地を提供する。さらなる態様では、該細胞を無血清培地中で浮遊培養する。本発明の種々の培地の配合を、本明細書に記載の実施例に示す。
【００５８】
一態様において、形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物は、培地に対する補給物として添加される。使用される化合物は、宿主細胞を形質転換したプラスミド上に存在する選択可能マーカーエレメントによって決定される。通常動物細胞に対して毒性である特定の薬物に対して耐性を付与する選択可能マーカーが、本発明の方法および組成物において使用され得る。例えば、選択可能マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に添加される化合物はカナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、ジェネティシン、ネオマイシン、ゼオマイシン（ｚｅｏ）；プロマイシン（ＰＡＣ）；ブラストサイジンＳ（ＢｌａＳ）、およびＧＰＴが挙げられる。さらなる選択可能マーカーは、当該技術分野で知られており、本発明の組成物および方法に有用である。
【００５９】
また、所定の条件下で細胞生存をもたらすか、または細胞死を誘導する代謝酵素も、本発明の方法および組成物に使用することができる。例としては、限定されないが：ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）（これらは、それぞれ、ＴＫ、ＨＧＰＲＴまたはＡＰＲＴが欠損した細胞において使用され得る遺伝子である）が挙げられる。しかしながら、当業者には、本発明のｒＦｕｒｉｎ生成物に、本質的にこのような添加タンパク質は含まれないことが認識されよう。
【００６０】
該培地は、組換えタンパク質作製のための当該技術分野で知られた任意の宿主細胞または宿主を培養するために使用され得る。本発明の一態様において、例示的な宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本発明のさらなる態様において、該培地は、ＣＨＯ細胞を浮遊培養するために使用される。
【００６１】
対象の組換えタンパク質を宿主細胞によって培地中に分泌させる場合、数回の回収サイクルを通して同じ宿主細胞が使用され得るように、培地を定期的に回収してもよい。培養培地は、バッチプロセス（例えば、培養培地を単一のバッチ内の細胞に１回添加する）で添加してもよく、フィードバッチプロセス（少量バッチの培養培地を定期的に添加する）で添加してもよい。培地は、培養の最後に回収してもよく、培養中に数回回収してもよい。また、連続灌流生成プロセスも当該技術分野で知られており、培地への新鮮培地の連続供給をしつつ、反応器からの同容量の連続抜去を伴うものである。灌流培養は、一般的に、バッチ式培養よりも高い細胞密度で行なわれ、反復回収を伴って数週間または数カ月間維持され得る。したがって、ケモスタット培養およびバッチ式再供給（ｒｅｅｆｅｄ）培養は、ともにｒＦｕｒｉｎの製造に適しており、他の培養方法と同様、当該技術分野で知られている。
【００６２】
さまざまな培養系が当該技術分野で知られており、Ｔ字型フラスコ、攪拌振とうフラスコ、ローラーボトルおよび攪拌槽バイオリアクターが挙げられる。ローラーボトル培養は、一般的には、培地を一部充填して（例えば、最大容量の１０〜３０％）ゆっくり回転させたローラーボトル内に細胞を播種し、該細胞がボトルの側面に付着してコンフルエンシーまで増殖するのを可能にすることにより行なわれる。細胞培地を、上清みのデカンテーションによって回収し、新鮮培地と交換する。また、足場依存性細胞を、攪拌槽バイオリアクター内に浮遊状態で維持したマイクロ担体（例えば、ポリマースフィア）上で培養してもよい。あるいはまた、細胞を単一細胞懸濁物にて増殖してもよい。
【００６３】
宿主細胞によって産生されるｒＦｕｒｉｎの量は、当該技術分野で知られた標準的な方法を用いて評価され得る。かかる方法としては、限定されないが、ウエスタンブロット解析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、および／または活性のアッセイ（ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイなど）が挙げられる。また、本発明では、ｒＦｕｒｉｎの比生産性（タンパク質／細胞／日の量で表示）が、当該技術分野で知られた本明細書に記載の標準的な方法を用いて評価され得ることが想定される。
【００６４】
「実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎ」は、約０．１〜０．６ｎｇ タンパク質／単位フリン活性もしくはそれ未満の、または約２〜１１μｇ タンパク質／ｍＬもしくはそれ未満の範囲の濃度の宿主細胞タンパク質を含み、培養培地中の血清由来の夾雑タンパク質が本質的にないｒＦｕｒｉｎの調製物を包含すると規定する。一態様において、実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎは、約０〜０．４ｐｇ ＤＮＡ／単位フリン活性もしくはそれ未満の、または約０〜２４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬもしくはそれ未満の範囲の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含み、培養培地中の血清由来の夾雑タンパク質が本質的にないｒＦｕｒｉｎの調製物を包含する。一態様において、ｒＦｕｒｉｎを発現する宿主細胞は、化学的に規定される無血清培地中で増殖される。あるいはまた、該細胞を、血清を含む培地中で増殖し、本明細書において提供した方法に従って精製してもよい。
【００６５】
ｒＦｕｒｉｎを発現する宿主細胞は、動物（ヒトを含む）由来の物質を含まない培地中で、ケモスタット条件下で浮遊培養する。細胞を濾過によって除去し、ｒＦｕｒｉｎ含有細胞培養上清みを限外濾過によって濃縮し、イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、少なくとも約１０００単位／ｍｌ、少なくとも約２０００単位／ｍｌ、少なくとも約３０００単位／ｍｌ、少なくとも約４０００単位／ｍｌ、少なくとも約５０００単位／ｍｌ、少なくとも約６０００単位／ｍｌ、少なくとも約７０００単位／ｍｌ、少なくとも約８０００単位／ｍｌ、少なくとも約９０００単位／ｍｌ、少なくとも約１００００単位／ｍｌ、少なくとも約１５０００単位／ｍｌ、少なくとも約２００００単位／ｍｌ、少なくとも約２５０００単位／ｍｌ、少なくとも約３００００単位／ｍｌ、少なくとも約３５０００単位／ｍｌ、少なくとも約４００００単位／ｍｌ、少なくとも約４５０００単位／ｍｌ、少なくとも約５００００単位／ｍｌ、少なくとも約５５０００単位／ｍｌ、少なくとも約６００００単位／ｍｌ、少なくとも約６５０００単位／ｍｌ、少なくとも約７００００単位／ｍｌ、少なくとも約７５０００単位／ｍｌ、少なくとも約８００００単位／ｍｌ、少なくとも約８５０００単位／ｍｌ、少なくとも約９００００単位／ｍｌ、少なくとも約９５０００単位／ｍｌ、少なくとも約１０００００単位／ｍｌ、少なくとも約１２００００単位／ｍｌ、少なくとも約１４００００単位／ｍｌ、少なくとも約１６００００単位／ｍｌ、少なくとも約１８００００単位／ｍｌ、少なくとも約２０００００単位／ｍｌ、少なくとも約５０００００単位／ｍｌ、および５０００００Ｕ／ｍｌ超に至る活性を有するｒＦｕｒｉｎの溶液を得る。
【００６６】
別の態様において、本発明の組換えフリンの精製溶液は、少なくとも約１０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約２０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約３０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約４０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約６０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約７０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約８０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約９０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１２０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１４０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１６０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１８０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約２００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約２５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約３００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約３５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約４００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約４５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約５００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約５５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約６００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約６５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約７００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約７５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約８００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約８５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約９００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約９５０Ｕ／μｇタンパク質、および少なくとも約１０００Ｕ／μｇタンパク質の比活性を有する。
【００６７】
別の実施形態において、本発明におけるｒＦｕｒｉｎの精製溶液に含まれる宿主細胞タンパク質は、約２０．０μｇ／ｍｌ未満、約１９．０μｇ／ｍｌ未満、約１８．０μｇ／ｍｌ未満、約１７．０μｇ／ｍｌ未満、約１６．０μｇ／ｍｌ未満、約１５．０μｇ／ｍｌ未満、約１４．０μｇ／ｍｌ未満、約１３．０μｇ／ｍｌ未満、約１２．０μｇ未満／ｍｌ、約１１．０μｇ未満／ｍｌ、約１０．５μｇ未満／ｍｌ、約１０．０μｇ／ｍｌ未満、約９．５μｇ／ｍｌ未満、約９．０μｇ／ｍｌ未満、約８．５μｇ／ｍｌ未満、約８．０μｇ／ｍｌ未満、約７．５μｇ／ｍｌ未満、約７．０μｇ／ｍｌ未満、約６．５μｇ／ｍｌ未満、約６．０μｇ／ｍｌ未満、約５．５μｇ／ｍｌ未満、約５．０μｇ／ｍｌ未満、約４．５μｇ／ｍｌ未満、約４．０μｇ／ｍｌ未満、約４．０μｇ／ｍｌ未満、約３．５μｇ／ｍｌ未満、約３．０μｇ／ｍｌ未満、約２．５μｇ／ｍｌ未満、約２．０μｇ／ｍｌ未満、約１．５μｇ／ｍｌ未満、約１．０μｇ／ｍｌ未満、約０．５μｇ／ｍｌ未満、約０．４μｇ／ｍｌ未満、約０．３μｇ／ｍｌ未満、約０．２μｇ／ｍｌ未満、約０．１μｇ／ｍｌ未満、および約０μｇ／ｍｌの濃度である。
【００６８】
別の態様において、本発明におけるｒＦｕｒｉｎの精製溶液に含まれる宿主細胞タンパク質は、約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．９５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．９０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、０．８５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．８０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．７５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．７０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．６５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．６０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．５５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．５０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．４５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、０．４０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．３５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．３０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．２５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．２０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．１５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．１０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０４ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０３ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０２ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０１ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、および約０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎの濃度である。
【００６９】
以下の本明細書における実施例には、ｒＦｕｒｉｎの産生にＣＨＯ宿主細胞を用いた発明を示すが、当業者には、任意の宿主細胞型が、本発明のｒＦｕｒｉｎの産生に同様に適合され得ることが認識されよう。ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質の産生に広く使用されており、操作したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ細胞株を産生物の遺伝子と選択可能マーカー遺伝子でトランスフェクトしたもの）を、血清含有培養培地中で常套的に増殖する。しかしながら、血清の使用はいくつかの問題を呈する。血清は、高価な商品であり、商業的作製に必要とされる量で容易に入手可能ではない。また、血清は、生化学的に規定されない物質であり、充分に特定されておらず、かつ作用も測定されていない多くの成分を含む。したがって、血清はバッチごとに異なり、場合によっては、種々の該成分のレベルおよび細胞に対するその効果を調べるための試験が必要とされる。
【００７０】
また、血清は、多くの場合、ウイルスおよびマイコプラズマなどの微生物（その多くは無害であり得るが、それでもさらなる未知因子を構成する）が混入している。さらに、培養培地中に動物性タンパク質が存在すると、長時間の精製手順が必要となり得る。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中にウシ抗体が存在すると、組換えＣＨＯ細胞株によって発現された所望の抗体の精製が極めて困難になる。使用前に培地からウシ抗体を除去することは可能であるが、この除去および除去後に必要とされるさらなる生成物の試験は、該生成物の作製のコストを大きく増大させる。そのため、細胞（特にＣＨＯ細胞の）増殖を補助する動物性成分無含有培養培地を使用することは有益である。ＣＨＯ細胞は無血清条件では容易に増殖しないが、本発明は、無血清条件下でのＣＨＯ細胞増殖によるｒＦｕｒｉｎを提供する。
【００７１】
また、操作されたＣＨＯ細胞は、浮遊状態で増殖することが困難である。ｒＦｕｒｉｎなどの産物を発現させるために細胞を使用する場合、浮遊状態での増殖を行なうことが非常に望ましい。商業規模でのかかる生物学的タンパク質の生成のためには、相当な大きさの発酵槽内での増殖を補助できることが望ましい。また、適当な培地には、大量生成条件で増殖され得るように細胞を補助することが必要とされる。かかる適当な培地は、本明細書に記載の実施例に示している。当業者には、当該技術分野における任意の細胞培養方法が、本発明に示したｒＦｕｒｉｎを含む宿主細胞の培養に使用され得ることが認識されよう。培養方法の非限定的な例は、本明細書に記載の実施例に示している。
【００７２】
また、本発明は、細胞を無血清培地中で増殖した後に行なわれる、ＣＨＯ細胞タンパク質をｒＦｕｒｉｎから除去するための精製方法を提供する。当業者には、当該技術分野で知られた任意のタンパク質精製方法が、培養培地からのｒＦｕｒｉｎの精製に使用され得ることが認識されよう。精製方法の非限定的な例は、本明細書に記載の実施例に示している。したがって、あらゆる動物源タンパク質を本質的に実質的に含まないｒＦｕｒｉｎが作製され得る。実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎは、任意選択で、使用時まで凍結保存される。
【実施例】
【００７３】
実施例
本発明のさらなる態様および詳細は、以下の実施例から自明であろう。実施例は、限定ではなく例示を意図するものである。実施例１には、ｒＦｕｒｉｎ発現プラスミドの構築および宿主細胞のトランスフェクションを記載する；実施例２には、ｒＦｕｒｉｎ発現ＣＨＯ細胞クローンの無血清条件での増殖への適応プロセスを記載する；実施例３には、動物性タンパク質無含有培地中でのｒＦｕｒｉｎ製造のための最適化プロセスを記載する；実施例４には、ｒＦｕｒｉｎの精製を記載する；実施例５は、下流処理（濃縮および精製）ならびに大規模生成ｒＦｕｒｉｎの解析を示す；実施例６は、宿主細胞バンクの品質の測定および維持のために行なわれる安全性、無菌性および安定性の試験を示す。
【００７４】
実施例１：
組換えフリン発現プラスミドの構築および宿主細胞のトランスフェクション
＃５５６と表示するｒＦｕｒｉｎ発現プラスミドを構築するために使用したフリン前駆プラスミドの詳細説明を表１に示す。構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で発現させると、成熟ｒＦｕｒｉｎは、触媒ドメイン、Ｐドメイン、および小さなシスチンリッチドメイン部分を含むが、アミノ酸５７７のＣ末端の側に存在する領域は除去され、充分な活性プロテアーゼの分泌がもたらされる。
【００７５】
選択プラスミドとして使用したＤＨＦＲ−ベクターの構築の説明を表２に示す。安定発現ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ細胞クローン（＃４８８−３および＃２８９−２０で表示）の開発のため、機能性内在ＤＨＦＲ遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を、リン酸カルシウム共沈降を使用し、プラスミド＃５５６と＃７３でコトランスフェクトした。高レベルのｒＦｕｒｉｎを分泌するクローンを、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ選択系を用いた数回のサブクローニング／増幅にて選択した。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ＤＨＦＲ培地（ＤＭＥＭ ＮＵＴ ＭＩＸ Ｆ１２（１：１）、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンなし、Ｈｅｐｅｓ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシンを補給、５％または１０％の透析済γ照射ＦＢＳ（＝５％ＤＨＦＲ、１０％ＤＨＦＲ）を有するように構成）中で増殖した。透析済γ照射ＦＢＳは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（解析、起源および照射に関する充分な説明の証明書付き）から購入した。γ−トリプシン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の調製は、Ｂａｘｔｅｒ（オルト，オーストリア）の培地調製／ＰＣＣ部門によって行なわれた。
【００７８】
ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃４８８−３の作製の系図を図２に示す。クローンＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ ＃４８８−３は、１０％ＤＨＦＲ選択培地中で２回のサブクローニングを行なった後、１００ｎＭ ＭＴＸを補給した選択培地中での増幅を行なった（このとき、１回のサブクローニングは、未変更ＭＴＸ濃度を含有する培地中で行なった）初期クローンから得た。クローン＃４４８−３は、凍結のために拡大培養した。ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃２８９−２０も同様にして調製および拡大培養した。しかしながら、クローン＃２８９−２０は、クローン＃４８８−３由来の後続クローンである。ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃２８９−２０の作製の系図を図３に示す。
【００７９】
Ｆｕｒｉｎ活性を、無血清ＤＨＦＲ培地中で２４時間培養したクローンの馴化培地中で測定した。高フリン活性（Ｕ／１０６細胞／２４時間）を示した細胞クローンを選択した。選択した高産生細胞クローンを、凍結ストックアンプルの調製用に拡大培養し、次の回のクローニングのために分割するために使用した。高産生細胞クローンの単離および同定を行なった。Ｃａｓｙ細胞計数器を用いて細胞密度を解析した。２００〜３００Ｕ／１０６細胞／２４時間に至るまでのＦｕｒｉｎ発現レベルが、クローン＃４８８−３で得られた。クローン＃２８９−２０では、４００Ｕ／１０６細胞／２４時間に至るまでのＦｕｒｉｎ発現レベルが得られた。
【００８０】
実施例２：
組換えフリン発現細胞クローンの無血清条件での増殖への適応
細胞株の適応および選択のストラテジーは、段階的な希釈にて徐々に、または急激にのいずれかによって、細胞株を血清とタンパク質を含まない細胞株に適応させることである。この試験の目的は、無血清条件下で増殖され、安定的にｒＦｕｒｉｎを産生するＣＨＯ細胞集団を見い出すことであった。ＣＨＯ細胞クローン＃４８８−３を出発材料として使用した。ｒＦｕｒｉｎ発現細胞クローンＣＨＯ ＃４８８−３を、パラレルで実施した以下に詳細に示す３つの適応において、無血清条件に変更した。
【００８１】
血清枯渇プロセスは、スピナーフラスコにおいて開始し、適応相内の細胞を引き止める（ｈｏｌｄ ｂａｃｋ）手段を見い出すためのマイクロ担体を使用した（該相では細胞は通常、低速増殖を示すため）。この方法を使用することにより、その後の培地交換時、増殖が抑制され得るような濃度まで細胞が希釈されるのを回避することが可能であった。
【００８２】
３種類の異型の内部開発培地ＢＡＰ、ＢＡＳおよびＢＣＳ（表３に示す）を、この試験過程に使用した。
【００８３】
【表３】
それぞれの実験の目的に応じて、これらの培地異型に、表４に示すような異なる補給物を供給した。
【００８４】
【表４】
以下の表は、この試験過程で使用した培地と試薬の概要を示す。表５に、プレマスター細胞バンククローンＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４の確立に使用した培地と試薬を要約する。
【００８５】
【表５】
表６に、サブクローニング過程、ならびにサブクローン＃４８８−３／ＣＪ０６−１９／５Ｆ１０（５Ｆ１０）および＃４８８−３／ＣＪ０６−１９／１Ｅ８（１Ｅ８）の対応する評価細胞バンク（ＥＣＢ）の確立に使用した培地と試薬を要約する。
【００８６】
【表６】
培地に添加したすべての補給物のロット番号は、対応する培地の適切な製造プロトコルを参照している。他の培地添加物を表７に示す。
【００８７】
【表７】
無血清条件に対する適応は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）からの細胞の分離による細胞保持（遠心分離など）とともに、Ｔ字型フラスコまたはスピナーフラスコにおいて行なった。
【００８８】
Ｔ字型フラスコ内の浮遊培養物を、３６±２℃および７．５±１．０％ＣＯ２でインキュベートした。スピナーフラスコ内での培養は、ＴｅｃｈｎｅスピナーフラスコおよびＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で、担体なしで３６±２℃にて、それぞれ、８０ｒｐｍおよび１３０ｒｐｍで行なった。
【００８９】
無血清培地条件への適応後のＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ細胞クローン＃４８８−３のサブクローニングにより、無血清内部開発培地中で浮遊状態で増殖され、安定的にｒＦｕｒｉｎを大量に産生するＣＨＯ細胞クローンが得られた。この手順は、限定希釈法に基づくものであった。簡単には、細胞懸濁物を、１００μｌの懸濁物が１つの細胞を含むように希釈した。９６ウェルプレートのウェルに、この懸濁物１００μｌを充填した。理論的には、各ウェルに、クローン生成用の１つの細胞が含まれる。これらの単一細胞が増殖を開始するにつれて、クローンが生成される。したがって、新たに生成した細胞はいずれも、ウェル内の最初の元の細胞に遡ることができる。このクローンを２４ウェルプレート内で、次いでＴ２５フラスコ内で、次いでＴ７５フラスコ内で、次いでＴ１７５フラスコ内で拡大培養した。
【００９０】
培養中、増殖条件をモニターするため、およびｒＦｕｒｉｎ発現を測定するために、プロセス内制御（ｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＩＰＣ）を行なった。Ｃａｓｙ装置を用いて培養中の細胞密度を測定した。Ｎｕｃｌｅｏ計数装置を、ＣＴＸ抽出後の細胞核の検出に適用した。細胞密度および解凍後のバイアビリティの測定は、トリパンブルー排除法を用いて行なった（血球計を使用）。また、細胞密度とバイアビリティを、自動トリパンブルー排除法を使用することによっても解析した（Ｃｅｄｅｘ装置によって実施）。
【００９１】
細胞培養物の上清みを使用し、発現されたｒＦｕｒｉｎの量および活性を調べた。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を使用し、所与の細胞集団における非産生細胞に対する産生細胞の比を調べた。細胞の形態構造および増殖挙動を、光学的制御によって調べた。また、培地条件のモニター（ｐＨ値ならびにグルコース、グルタミン、乳酸およびアンモニウムの残留濃度の測定など）のためにも、細胞培養物の上清みも調べた。これらの解析は、ＮＯＶＡ装置によって行なった。
【００９２】
この試験過程では、２種類のプレマスター細胞バンク（ＰＭＣＢ）ＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４を作製し、以下に示す２つの細胞クローン株を確立した。また、評価細胞バンク（ＥＣＢ）（表１５参照）も作製した。
【００９３】
ＰＭＣＢ＃０１の調製およびＱＣ試験
ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ ＃４８８−３（ＥＣＢ＃０１）のバイアルの１つを、添加物（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅ）ならびに５％ＦＢＳを含有するＢＡＳ培地中で解凍した。細胞は、Ｔ１７５内で５日間培養した細胞であった。次いで、細胞を、以下に示すようにして無血清条件に適応させた。
【００９４】
細胞を、０．２ｇ／ｌの５％ＦＢＳを含有する１５０ｍｌの増殖培地（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅを含むＢＡＳ）中で調製した。無血清条件への適応にＣｙｔｏｐｏｒｅ ２担体を使用した。約２．０×１０５細胞／ｍｌの開始細胞密度がもたらされるように５日齢の細胞懸濁物を播種すると、細胞が最初の数時間以内に該多孔質担体に付着した。したがって、細胞はスピナーフラスコ内に維持され、その間、増殖培地を交換し、血清濃度を２工程で５％から３．８％から第０５日に０％まで低下させた。続く培養期間中に、細胞は無血清培地条件に適応状態となった。細胞は担体表面から剥離し、浮遊状態で増殖が継続された。懸濁細胞の細胞密度およびバイアビリティは、連続的に増大した。２〜３日ごとに、懸濁細胞を１：２の比で分割した。
【００９５】
次いで、評価細胞バンク（ＥＣＢ）を調製した。培養の第２８日目、６０％より高いバイアビリティを有する細胞を新たな実験に移行させた。培養物は、担体なしのＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内にて２００〜３００ｍｌのＢＡＳ培地（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅを含む）中で増殖した。測定されたＣＡＳＹ細胞密度に従い、浮遊培養物を、２〜３日ごとに開始細胞密度である約２．０×１０５細胞／ｍｌに分割した。１６日後、細胞培養物が８０％より高いバイアビリティに達したとき、６つのバイアルの細胞からなる評価細胞バンク（ＥＣＢ）を作製した。
【００９６】
ＥＣＢのバイアルの１つを新たな実験において解凍した。細胞を４日間、Ｔ１７５内で、Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、ＦｅおよびＺｎを含むＢＡＳ培地中で増殖した。次いで、細胞を、６００ｍｌまでのＢＡＳ培地をＰｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、ＦｅおよびＺｎとともに入れたＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコに移した。この場合も、２〜３日ごとに、 浮遊培養物を、開始細胞密度である約２．０×１０５細胞／ｍｌに分割した。培養の第１３日目、２０個のバイアルからなるＰＭＣＢ＃０１の調製のために、１４３ｍｌの細胞懸濁物を取り出した。細胞を拡大培養し、ＰＭＣＢ＃０１に対して品質管理試験を行なった。
【００９７】
ＰＭＣＢ＃０４の調製およびＱＣ試験
ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ ＃４８８−３（ＥＣＢ＃０１）のバイアルの１つを、Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、Ｆｅおよび５％ＦＢＳを含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ＢＡＳ培地中で解凍した。６日齢の培養物の半量を、無血清条件への適応のための新たな実験に移行させた。
【００９８】
ここでは、無血清条件への適応を段階的に行なうのではなく、急激に行なった。Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコに、ＦＢＳも担体も含まないＢＡＳ培地（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅの添加を伴う）を調製した。細胞を約２．５×１０５細胞／ｍｌの開始細胞密度で播種した。急激な無血清条件のため、細胞の倍加時間は、かなり低いレベルまで減少した。場合によっては増殖が抑制され得るような濃度まで細胞が希釈されるのを回避するため、細胞懸濁物をスピンダウンすることにより培地を交換した。細胞ペレットを新鮮増殖培地中に再懸濁させた。細胞密度が４．０×１０５細胞／ｍｌより大きくなったとき、培養物の分割を行なった。培養の第１５日目に約５０％の最小バイアビリティに達した後、細胞の回収を開始し、培養の第３２日目（当日を含む）から、バイアビリティは８５〜９０％まで増大した。培養の第６１日目、適応細胞を、１５個のバイアルからなるＥＣＢとして凍結させた。
【００９９】
ＥＣＢのバイアルの１つを新たな実験において、Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅを含む無血清ＢＡＳ培地中で解凍した。培養物をＴ１７５フラスコ内で７日間培養した後、Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコに移し、そこで、細胞をさらに２日間増殖した。次いで、Ｚｎの添加を試験した。約１００ｍｌの遠心分離した細胞懸濁物を、Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、ＦｅおよびＺｎを含有する無血清ＢＡＳ培地中に再懸濁させた。この懸濁物をＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で培養した。測定されたＣＡＳＹ細胞密度に従い、２〜３日ごとに、浮遊培養物を、開始細胞密度である約２．０×１０５細胞／ｍｌに分割した。
【０１００】
播種材料の調製のため、およびＰＭＣＢ＃０４の作製のための大量の均一な細胞懸濁物を生成させることができるようにするため、細胞培養を、Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で１０００ｍｌまでスケールアップした。培養の第０２日目、４６５ｍｌの細胞懸濁物を使用し、２０個のアンプルからなるＰＭＣＢ＃０４を作製した。細胞を拡大培養し、ＰＭＣＢ＃０４に対して品質管理試験を行なった。
【０１０１】
図４は、ＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４の細胞集団におけるｒＦｕｒｉｎ産生細胞のグラフによる分布の比較を示す。ＰＭＣＢ＃０４の細胞の８０．７４％がｒＦｕｒｉｎを発現している。ＰＭＣＢ＃０１の細胞の７４．０６％がｒＦｕｒｉｎを発現している。
【０１０２】
次いで、ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ ＃４８８−３ サブクローンＣＪ０６−１９／５Ｆ１０およびＣＪ０６−１９／１Ｅ８を作製した。ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃４８８−３のアンプルを解凍し、培養物をＴ１７５フラスコ内で継代した。培養の第１７日目、各々に５％ＦＢＳを含めた３種類の異なる培地、ＢＡＰ培地（Ｂａｘｔｅｒによって開発）、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏによって供給）およびＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ（ＪＲＨによって供給）を試験した。Ｔ１７５フラスコ内での増殖の４日後、ＥｘＣｅｌｌ培地中で増殖した細胞は、無血清条件に適応した。
【０１０３】
細胞を少数回の工程で血清から分離した。全手順は３回の実験に及んだ。まず、足場依存性細胞を最初に、Ｔ１７５フラスコ内にて、５％ＦＢＳ含有ＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ中で培養した。次いで、血清を、培養の第１３日目に０．５％までゆっくりと減少させた。次の１３日間の培養中、２回の分割を行ない、このとき、血清濃度を０．２５％までさらに減少させると、バイアビリティは７０％より低くなるまで低下した。細胞は足場依存性挙動を失い、だんだんと球形状を示し、浮遊状態での増殖が開始された。
【０１０４】
血清低減の最後の工程は、Ｔｅｃｈｎｅスピナーフラスコ内にて、０．２５％ＦＢＳを含有し、担体を含まないＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で行なった。２３日間の培養期間後、血清濃度は０％に達した。細胞を分割し、関連するすべてのパラメータが所定の範囲に維持されるように培養した。細胞密度は０．１５〜０．９×１０６細胞／ｍｌに移動した。バイアビリティは、最初の週の間に４０％未満に低下したが、次いで９０％より高い値に戻った。培養の第４２日目、適応細胞を凍結させ、２０個のバイアルからなるＥＣＢ／ＣＪ０６−２０とした。
【０１０５】
次いで、細胞をサブクローニングした。細胞懸濁物を事前に条件付けしたＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯで、１００μｌの懸濁物が理論的に０．５〜１．０個の細胞を含むように希釈した。このサブクローニング実験では、５つの９６ウェルプレートに、ウェル１つあたりこの細胞懸濁物１００μｌを充填した。細胞播種の翌日、ウェルを単一細胞について顕微鏡下で調べた。１つの細胞を含むウェルに印を付け、さらに観察した。事前に条件付けしたＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯの添加および交換は、必要時に行なった。次の２週間の間に細胞が死滅した場合、または細胞分裂がない場合、当該ウェルを実験から除外した。
【０１０６】
２つの単一細胞が増殖を示した。適切な大きさに達した進化クローンを２４ウェルプレートのウェルの１つに移した。また、ここで、事前に条件付けしたＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯの交換も、増殖および培養物の必要性に応じて行なった。サブクローンＣＪ０６−１９／５Ｆ１０およびＣＪ０６−１９／１Ｅ８を、それぞれ、培養の第０７日目および第１０日目にＴ２５フラスコに移した。
【０１０７】
ＥＣＢをＥｘＣｅｌｌ培地中で調製した。このＥＣＢは、該２つのサブクローンに関するさらなる研究（購入に費用がかかる培地からより経済的な配合（Ｂａｘｔｅｒで自社開発）への再適応など）のための原料物質を提示する。サブクローンＣＪ０６−１９／５Ｆ１０のＥＣＢ、ＣＪ０６−４２をＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で、Ｔ２５からＴ７５を経てＴ１７５まで、次いでＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で拡大培養した。第２１日目のＴ１７５からの１つの培養物に由来する１０個のバイアルからなるＥＣＢ／ＣＪ０６−６３を凍結させた。また、サブクローンＣＪ０６−１９／１Ｅ８のＥＣＢ、ＣＪ０６−４３もＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で拡大培養した。培養物は、Ｔ２５からＴ７５を経てＴ１７５まで、次いでＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で拡大培養した。第１８日目のＴ１７５からの１つの培養物に由来する１０個のバイアルからなるＥＣＢ／ＣＪ０６−６４を凍結させた。
【０１０８】
ＥＣＢ（サブクローン５Ｆ１０および１Ｅ８）をＢＣＳ培地に、以下に示すようにして適応させた。ＥＣＢクローンＣＪ０６−１９のサブクローンＣＪ０６−１９／５Ｆ１０を実験ＣＪ０６−６６において解凍し、次いで、ＢＣＳ培地をＥｘＣｅｌｌ培地に漸増容量で添加することにより、細胞をＥｘＣｅｌｌ培地から分離し、ＢＣＳ培地中での増殖能を獲得させた。同時に、ＥＣＢクローンＣＪ０６−１９のサブクローンＣＪ０６−１９／１Ｅ８も同様の様式でＢＣＳ培地に適応させた。
【０１０９】
表８は、この試験過程で調製したすべての無血清細胞バンクを示す。
【０１１０】
【表８】
ＰＭＣＢ＃０１とＰＭＣＢ＃０４およびサブクローン５Ｆ１０と１Ｅ８の比較を表９に示す。
【０１１１】
【表９】
実験ＣＪ０６−６９ならびにＳＫ０６−４９およびＳＫ０６−６３において培養した細胞集団は、ＰＭＣＢ用の細胞株の前駆培養物に相当する。これらの細胞をＢＡＳ培地（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、ＦｅおよびＺｎの添加を伴う）中で増殖し、それぞれ、ＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４として凍結させた。
【０１１２】
サブクローン５Ｆ１０および１Ｅ８を、市販の培地ＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ（ＪＲＨによって供給）中で増殖した。ＢＡＳの形成に基づいた培地中で増殖できることが好ましかったため、ＰＭＣＢ＃０１とＰＭＣＢ＃０４を、ｒＦｕｒｉｎのさらなる生成に選択した。
【０１１３】
表１０に示されるように、ＰＭＣＢ＃０４の細胞は、ＰＭＣＢ＃０１と比べ、より良好な増殖挙動を示した。ＰＭＣＢ＃０４の方が、バイアビリティおよび増殖速度が高く、生成倍加時間が短かった。また、ｒＦｕｒｉｎの細胞特異的生成比ならびに容積生成比も、評価期間を通して大きかった。さらなる実験において、バイアビリティに関するデータを確認した。各ＰＭＣＢのアンプルの１つを、添加物としてＺｎを含むＢＣＳ培地を入れたＴ１７５フラスコ内で解凍した。表１０に示されるように、ＰＭＣＢ＃０４のバイアビリティは、この場合もＰＭＣＢ＃０１より高かった。
【０１１４】
【表１０】
したがって、ＰＭＣＢ＃０４を、ｒＦｕｒｉｎマスターセルバンク（ＭＣＢ）およびあらゆるさらなる作業用細胞バンク（ＷＣＢ）のさらなる生成のための原料物質として選択した。２０個のバイアルからなるＰＭＣＢ＃０４を、現行のＧｏｏｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ規則に準じて確立した。ＩＣＨ−Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ Ｑ５Ｄの要請に従って品質管理（ＱＣ）試験を行なった。ＰＭＣＢ＃０４を、製造プロセスにおけるｒＦｕｒｉｎの生成に選択した。
【０１１５】
増殖培地は、ヒトまたは動物由来の物質を含まず、自社開発したものである。細胞を濾過によって除去し、ｒＦｕｒｉｎ含有上清みを限外濾過によって濃縮する。交換クロマトグラフィーによる精製後、ｒＦｕｒｉｎ溶液の活性を、少なくとも２００単位 ｒＦｕｒｉｎ／ｍｌに目標設定する。
【０１１６】
マイコプラズマ、ウイルス、外来因子、無菌性、および発現効率に関する試験を行なった。選択基準は、高Ｆｕｒｉｎ活性（例えば、Ｆｕｒｉｎタンパク質、ＥＬＩＳＡ）、および最初のクローン＃４８８−３および＃２８９−２０のそれぞれとの比較において、異なるサブクローンにおいて行なった免疫蛍光検査（ＦＡＣＳ）における細胞集団の均一性である。また、不純物プロフィールを定性的に比較しなければならない（例えば、ＲＰ ＨＰＬＣ後のＵＶ−ピークパターンまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー手法により）。
【０１１７】
実施例３：
動物性タンパク質無含有培地中での組換えフリン製造のための最適化
この実施例では、ｒＦｕｒｉｎ発現ＣＨＯクローン＃４８８−３の培養のための開発および最適化プロセスを記載する。アミノ酸、グルコース、およびＮａＨＣＯ３濃度に関して特定の培地最適化を行ない、これにより、細胞増殖速度が増大し、発酵プロセスの生産性が高くなった。インライン制御プロセスパラメータの最適化を、ｐＯ２（１０％、２０％および５０％）に対して最適化した培地配合物を用いて行ない、要因実験を行なって最適ｐＨ（７．１〜７．３の範囲）および温度（３５．１℃〜３７．９℃の範囲）を調べた。これにより、３５〜３６℃の低温で発酵を行なった場合、ＣＨＯクローン＃４８８−３について有意な収率の改善がもたらされた。
【０１１８】
可能な生産様式として、ケモスタット培養とバッチ式再供給培養を比較すると、どちらのプロセス型もｒＦｕｒｉｎの製造に適しており、同一のパラメータ設定条件で同等の収率が得られることが示された。異なるバイオリアクター設定での攪拌型と速度の影響を調べるための具体的な実験を行なった。比増殖速度および比発現速度、細胞密度、したがって容積生産性は、バイオリアクター設定における変動によって大きく影響されること、および攪拌速度増大条件下では、収率が有意に増大し得ることが示された。総合すると、ｒＦｕｒｉｎ上流プロセスの主要パラメータの影響は、その効果に関して充分特徴付けられ、高収率プロセスは、前臨床および臨床製造のためのパイロットプラントに移行され得る。詳細を以下に示す。
【０１１９】
サブクローン＃４８８−０３は自社開発したものであり、これを、血清無含有インスリン無含有培地に適応させた。以下の実験は、基本培地配合物としてＦＢＳ無含有インスリン無含有培地（ＢＡＣＤ培地）において行なった（表１１参照）。
【０１２０】
【表１１】
細胞増殖を改善するため、および細胞繁殖に対して至適条件を提供するため、ケモスタット培養の上清みのアミノ酸解析を行なった（表１２参照）。その結果、３つの必須アミノ酸、すなわち、メチオニン（１０ｍｇ／Ｌ）、ロイシン（４０ｍｇ／Ｌ）およびフェニルアラニン（１０ｍｇ／Ｌ）を培地に添加した。発酵は１．５Ｌ容バイオリアクター内で、３７℃、ｐＨ７．１５およびｐＯ２２０％にて行なった。
【０１２１】
【表１２】
培養物の上清み中のグルタミン濃度が低いため、グルタミンを培地に添加し（３００ｍｇ／Ｌ）、グルタミンの終濃度を９００ｍｇ／Ｌとした。グルタミンを培地に添加後、増殖速度は０．５５ｄ−１から０．６７ｄ−１に増大した（表１３および１４参照）。これらの上記の３つのアミノ酸（すなわち、メチオニン（１０ｍｇ／Ｌ）、ロイシン（４０ｍｇ／Ｌ）フェニルアラニン（１０ｍｇ／Ｌ））を培地に添加することにより、この場合も、細胞の増殖速度を増大させることができた（０．６９ｄ−１）（表１５参照）。容積生産性は、ほぼ２６７ｋＵ／Ｌ／ｄまで（＝＋１３％）上昇し、比生産性は１６％の増大を示した。培地へのグルタミン、メチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンの補給により、細胞増殖、ならびに容積比活性に対してプラスの効果が示され、したがって、さらなる培地調製のために保持した。
【０１２２】
【表１３】
【０１２３】
【表１４】
【０１２４】
【表１５】
培地中のアミノ酸の補給量が充分であるかどうかを確認するため、ケモスタット培養（１０Ｌ）の別のアミノ酸解析を行なった。培養物に、３００ｍｇ／Ｌのグルタミンと、それぞれの量の該３つのアミノ酸を供給した。培養の第７日目と第１５日目に試料を抜き取り、培養条件は上記のものと同様とした。結果（メチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンに関するデータのみを示した表１６参照）により、充分な量の補給アミノ酸が発酵ブイヨン中に存在することが確認された。
【０１２５】
【表１６】
ＮａＨＣＯ３濃度の減少およびグルコース濃度の増大。増殖および生産性に対する細胞培養における高溶存ＣＯ２濃度の影響を調べた。バイオリアクターでは生成規模が大きいため、細胞培養でのＣＯ２濃度は、２．５〜３２Ｌ容バイオリアクターよりも高いことが予測され得る。したがって、２つの発酵操作をパラレルで行ない、一方の操作はおよそ７．５％のＣＯ２濃度とし、他方はおよそ１２％のＣＯ２濃度とした。ＣＯ２濃度は、ヘッドスペースフロー内のＣＯ２割合を変更することにより調整した。細胞培養におけるＣＯ２濃度は、抜き取った試料をＮＯＶＡ装置で解析することにより測定した。発酵は、３７℃、ｐＨ７．１５およびｐＯ２２０％で行なった。
【０１２６】
１１〜１２％のＣＯ２濃度は、細胞増殖および生産性に対してマイナスの影響を有した。このＣＯ２濃度では、１．１×１０６細胞／ｍＬの細胞計数において、１２日間の期間で増殖速度が０．２９ｄ−１に達し、希釈速度は０．３０ｄ−１であった。およそ７．５％ＣＯ２での発酵操作では、１．４９×１０６細胞／ｍＬの細胞計数において、増殖速度は０．５２ｄ−１に達し、同じ期間での希釈速度は０．５３ｄ−１であった。高ＣＯ２濃度では、バイアビリティが８６．１％に低下したのに対し、７．５％ＣＯ２では９５．９％であった。また、容積生産性はおよそ３６％に、比生産性は５０％低下した。ＣＯ２濃度が高いため、比グルコース取込み速度は同様に低下した（−３９％）。細胞増殖および生産性に対する高ＣＯ２濃度（１１〜１２％）のマイナスの影響は非常に明白であり、したがって、発酵を７．５％ＣＯ２で行なうことが最適である。
【０１２７】
上記に示したように、実験により、１，０００Ｌ容バイオリアクターにおいてＣＯ２の濃度を１２％に増大させると、ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローン４８８−３の性能が大きく低下することが予測され得ることが示された。したがって、培地中のＮａＨＣＯ３濃度を２ｇ／Ｌから１．５ｇ／Ｌに下げることを決定した。培地中のＮａＨＣＯ３の量が少ないと、同様に培地の緩衝能が低下した。したがって、一方を培地中３．１５ｇ／Ｌのグルコースおよび２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３とし（ＦＵＲ＿０６／２４＿Ｆ０１）、他方を４．６５ｇ／Ｌのグルコースおよび１．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３（ＦＵＲ＿０６／２６＿Ｆ０４）として２つの発酵操作（１０Ｌ）を比較した。
【０１２８】
大規模バイオリアクター（１，０００Ｌ）での条件をシミュレーションするため、ヘッドスペース内への一定のＣＯ２ガス供給により、発酵中の溶存ＣＯ２の濃度を、２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３の発酵槽内では７〜８％に、１．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３の発酵槽内では６〜７％に調整した。両方の培養物の増殖速度は類似しており（０．５８および０ ５６ｄ−１）、培養物は、同等の容積生産性およびバイアビリティを示した。しかしながら、比グルコース取込み速度は、低ＮａＨＣＯ３濃度の培養物において、わずかに高かった（０．８３ｍｇ／１０６細胞／ｄ対０．６７ｍｇ／１０６細胞／ｄ）。したがって、４．６５ｇ／Ｌのグルコース濃度が妥当であるとみなし、さらなる培地調製において保持した。
【０１２９】
Ｆｕｒｉｎ培地中のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度の検討。細胞培養培地中のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８の通常濃度を０．２５ｇ／Ｌに設定した。培地中におけるＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８の目的は、細胞を液中酸素付加による損傷から保護することである。したがって、２×１０Ｌ容バイオリアクターにおいて、１．０ｇ／Ｌの高Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度と０．２５ｇ／Ｌの通常濃度を対比して調べる一例の実験を行なった。発酵は、３５．８℃、ｐＨ７．３０およびｐＯ２２０％で行なった。
【０１３０】
プルロニック濃度（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８）を増大させるにつれて、わずかに高い比増殖速度および細胞密度が達成され得た。したがって、比生産性の増大のため、容積生産性が比例して大きくなり、２７８ｋＵ／Ｌ／ｄに対して３６５ｋＵ／Ｌ／ｄが達成され得た。
【０１３１】
この実験の上清みを収集し、デプスフィルター（Ｃｕｎｏ Ｃａｒｔ．Ｚ０８Ｐ４Ａ３０ＳＰ ４ディスク）で濾過した後、薄膜フィルター（Ｐａｌｌ Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＩＩ ＫＡ２ＤＦＬＰ２）で濾過した。濾過した上清みを限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ３０Ｓ １４６３９０１ Ｅ−ＳＧ ＰＳＵ １０ＫＤ、０．２ｍ２）によって濃縮し、Ｆｕｒｉｎダイアフィルトレーションバッファーに対してダイアフィルトレーションを行なった。滅菌濾過した濃縮液（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ ５２３１３０７４８−００ ０．４５／０．２μ）を、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラムにて精製した。この精製実験の結果により、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８の増大は、精製ｒＦｕｒｉｎの品質および／または純度に対して有害な影響を及ぼさないことが明らかになった。Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラムの溶出液中において、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度の上昇は見られず、どちらの溶出液でも＜０．１５ｍｇ／ｍＬであった。
【０１３２】
このような結果にもかかわらず、ｒＦｕｒｉｎ培地中のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度は当初の０．２５ｇ／Ｌに維持した。しかしながら、液中酸素付加による問題が大きくなる場合では、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ濃度を１．０ｇ／Ｌまで増大させることが考慮され得、おそらく、最終のＦｕｒｉｎ生成物に有害な影響なく収率が増大する。
【０１３３】
発酵におけるｒＦｕｒｉｎ生成のための最終培地組成。培地最適化実験に基づき、以下の培地組成が、バイオリアクター培養におけるｒＦｕｒｉｎ生成のためのＣＨＯクローン４８８−３の発酵に最適であると示される。
【０１３４】
【表１７】
また、増殖速度および生産性に対する種々のｐＯ２設定点の影響も調べた。３つの異なるｐＯ２設定点、すなわち、１０％、２０％および５０％を試験した。実験は１．５Ｌ容バイオリアクターにおいて行ない、ヘッドスペースを介してガス供給を行なった。発酵操作はすべて、３５．１℃にてｐＨ７．２０で行なった。１０、２０および５０％のｐＯ２での発酵操作の比較により、ｐＯ２設定点の上昇に伴い、増殖速度のわずかな増大（０．５９、０．６２および０．６５ｄ−１）が示された。同様に、容積生産性は５０％ｐＯ２で最大であった。異なる発酵操作での平均細胞計数は、非常に類似していた。したがって、容積生産性の増大は、増殖速度の増大の結果であった。
【０１３５】
そのため、５０％のｐＯ２設定点は増殖速度にプラスの影響を及ぼすようであり、その結果、容積生産性は、標準条件（＝２０％ＰＯ２）の場合よりもおよそ４％高かった。バイアビリティに対する効果は観察されなかった。したがって、ｐＯ２＝２０％の設定点および通常１０％〜５０％の範囲が、ＣＨＯクローン＃４８８−３の発酵に適していると確認され得た。
【０１３６】
容積生産性を最大にするための温度とｐＨの最適化。ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの性能に対するｐＨおよび温度の影響を調べた。「実験方法の設計」を使用することにより、種々の温度を種々のｐＨ値と組み合わせ、最大容積生産性がもたらされる条件を確認した。「Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリックス」に従って５つの温度を３つのｐＨ値と組み合わせ、図５に示した温度とｐＨの７通りの組み合わせを得た。
【０１３７】
３６．５℃とｐＨ７．２０の組み合わせを中心点として選択し、これを２つの発酵ロットに適用した。表１８は、異なる発酵ロットで使用した培養条件を示す。
【０１３８】
【表１８】
【０１３９】
【表１９】
データを、応答曲面法（ＲＳＭ）により、「Ｍｉｎｉｔａｂ」ソフトウェアを用いて統計学的に解析した。ＲＳＭにより、いくつかの説明変数と１つ以上の反応変数との関係が調べられる。ＲＳＭの主な意図は、設計された一組の実験を用いて至適応答を得ることである。この解析では、容積生産性および比生産性ならびに増殖速度に焦点を当てた。
【０１４０】
容積生産性に関するデータの解析。第１の工程として、表面プロットを作成した（図６）。図６においてデータ座標を点で示す。表面は、単一データの推定相関を示す。
【０１４１】
表面プロットにより、パラメータ温度／ｐＨと応答容積生産性との間に線形相関が推定される。このチャートは、温度の低下に伴って容積生産性が増大することを示す。ｐＨの影響は小さいと考えられる。その後の計算により、データの線形相関が示された（計算は表示せず）。分散解析により、ｐＨ、温度および容積生産性間の相関を示す等式を作成した：
Ｐ ＝ ７６９３．１ − １６２．４＊Ｔｅｍｐ − ２０２．８＊ｐＨ
この数学モデルに基づき、容積生産性に対する温度とｐＨの影響を示すコンタープロットを作成した（図７）。点は、実験で試験した条件（ｐＨ／温度）を示す。
【０１４２】
このコンタープロットは、最大容積生産性が期待され得る領域が３５．１℃およびｐＨおよそ７．１０であることを示す。どちらの値も実験設計の端部であり、これは、実際の最大生産性は、これらよりもさらに低い値で見られ得ることを意味する。さらに、このコンタープロットは、容積生産性に対するｐＨ影響がわずかであり、低ｐＨ値での方がわずかに高いことを示す。
【０１４３】
この数学モデルの３次元表示である表面プロット（図８）でも、コンタープロットと同じ結果が得られる：容積生産性に対して温度の影響が大きく、ｐＨの影響は小さい。
【０１４４】
増殖速度μに関するデータの解析。増殖速度と温度およびｐＨとの相関は、二次方程式で示される。この場合も、温度の影響が大きく、ｐＨの影響は小さいことがわかる。増殖速度の大きな変動により、数学モデルの設計が障害される。分散および回帰の解析により以下の等式が得られる：
Ｐ ＝ −１０３．５３９ ＋ ５．７０６＊Ｔｅｍｐ − ０．０７９＊Ｔｅｍｐ２ − ０．２３３＊ｐＨ − ０．０２０＊ｐＨ２
増殖速度に対するｐＨの影響は、ｐＨの項のＰ値が０．９９であると計算され、高いこと（計算は表示せず）によって示されるように、統計学的に確認可能ではない。
【０１４５】
表面プロット（図９）は、モデル相関を３次元的に示し、二次方程式の関係であることを示し、３６．５℃において増殖速度が最大であることを示す。
【０１４６】
データの解析により、容積生産性で見られたものと同様の比生産性と温度およびｐＨとの相関が示されている（図１０）。この相関は、一次方程式によって示される。この場合も、分散解析（計算は表示せず）
によって示されるように、ｐＨの影響は小さい：
ｑＰ ＝ ４２６１．４０ − ９３．３５＊ｔｅｍｐ − ９３．７７＊ｐＨ
要約すると、温度およびｐＨの最適化のための実験およびその後のデータ解析により、非常に明白な結果が得られた。プロセス最適化に最も重要なパラメータであるとみなされる最大の容積生産性は、最も低い温度（３５．１℃）および低ｐＨ（７．１０）での培養によって得られた。ｐＨの影響は、統計学的にほとんど有意ではなく、７．１０〜７．３０のｐＨ値で非常に類似した結果が得られ得る。温度を３７℃から３５．１℃に下げることにより、容積生産性は、およそ２００ｋＵ／Ｌ／ｄから、２．７倍高い５４０ｋＵ／Ｌ／ｄに上昇し得る（図１１）。このような結果に基づき、ケモスタット様式でのＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの培養に対して、温度およびｐＨの新たな設定点を、３５．１℃および７．１５と決定した。
【０１４７】
ケモスタット様式とバッチ式再供給様式との比較。低温（３５．１℃）でケモスタット様式でのＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの培養により、小規模実験（１．５Ｌ、２．５Ｌ、１０Ｌおよび３２Ｌ）では高収率がもたらされ、ｒＦｕｒｉｎの生成のための大規模培養に適切な培養方法であるとみなした。しかしながら、大規模（ＰＰ１設備の１２００Ｌ容バイオリアクター）での初期の発酵操作において、ケモスタット様式で、増殖速度の大きな低下が示された。択一例として、より高い増殖速度を得るため、バッチ式再供給様式を大規模で設定した。１０Ｌ容規模のバイオリアクターで実験を行ない、ケモスタット様式とバッチ式再供給様式とで、増殖および生産性を比較した。細胞は、３６．５℃にてｐＨ７．１５およびｐＯ２２０％で培養した。培養２日目ごとに、バッチを０．６〜０．７×１０６細胞／ｍＬの細胞計数に分割した。
【０１４８】
ケモスタット発酵とバッチ式再供給発酵は、播種材料として同じ細胞培養を使用し、パラレルで操作した。細胞は、第６日目までケモスタット様式で培養した。次いで、発酵操作の一方をバッチ式再供給様式に切り替え（ＦＵＲ＿０６＿５０−Ｆ０３）、他方は、ケモスタット様式を継続した（ＦＵＲ＿０６＿５１−Ｆ０４）。バッチ式再供給様式での培養では、バッチ終了時に２．２２×１０６細胞／ｍＬの平均細胞計数が得られ、増殖速度は０．６４ｄ−１であった（表２０）。ケモスタット様式では、０．５０ｄ−１の増殖速度が得られ、平均細胞計数は１．６７×１０６細胞／ｍＬであった。バッチ式再供給様式の方が細胞計数と増殖速度が高いため、容積生産性も大きかった（１９７ｋＵ／Ｌ／ｄに対して２３８ｋＵ／Ｌ／ｄ）。
【０１４９】
データは、バッチ式再供給様式が、１０Ｌ規模でのＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンに好ましい培養方法であることを示し、この様式では、ケモスタット様式よりも、さらにわずかに高い容積生産性がもたらされる（３６．５℃およびｐＨ７．１５のとき）。しかしながら、バッチ式再供給様式では、回収プロセスおよび下流のさらなるプロセスが一定時間内に制限されるが、ケモスタット様式では回収は連続的に行なわれ得る。したがって、各方法がそれぞれ利点を有する。バッチ終了時の至適細胞計数または最良分割比率などのバッチ式再供給様式のパラメータについては、最適化実験は行なわなかった。
【０１５０】
【表２０】
規模拡大の検討。異なる攪拌速度におけるＲｕｓｈｔｏｎ型の羽根とｂａｌｌ型の羽根との比較。増殖速度および生産性に対する攪拌機の型の影響を調べた。ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンを用いた実験でのバイオリアクターに使用した標準設定条件は、Ｒｕｓｈｔｏｎ羽根と４枚のバッフルプレートで構成した。ｒＦｕｒｉｎ生成のための１，０００Ｌ容バイオリアクターに、バッフルプレートなしで３対のｂａｌｌ羽根を設置した。したがって、１０Ｌ容のバイオリアクターにおいて３つの異なる設定条件を試験する実験を行なった：反応器の１つには標準設定条件を設置し、別の反応器には、２対のｂａｌｌ羽根を設置してバッフルプレートは設置せず、第３の反応器は、標準のものと同様に組み立てたが、攪拌速度を１７０ｒｐｍから９０ｒｐｍに下げた。
【０１５１】
表２１は、バイオリアクターの設定の概要を示す。ｂａｌｌ羽根で６０ｒｐｍの攪拌速度では、ｒｕｓｈｔｏｎ羽根で９０ｒｐｍのときと同様の先端速度が得られる（表２１参照）。しかしながら、羽根の幾何的構造（形状、直径）が異なるため、先端速度は互いに等しくなり得ない。
【０１５２】
【表２１】
発酵条件は、以下のとおり：３７℃，ｐＨ７．１５，ｐＯ２２０％およびｐＣＯ２６〜７％（培地：４，６５ｇ／ＬのＧｌｃ、１，５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３）とした。発酵データの比較により、標準設定、すなわちｒｕｓｈｔｏｎ羽根を設置して１７０ｒｐｍの速度で攪拌したバイオリアクターの性能は、その他の設定のバイオリアクターよりも高いことが示された（表２２）。６０ｒｐｍでのｂａｌｌ羽根の使用では、ｒｕｓｈｔｏｎ羽根で１７０ｒｐｍのときと比べて、いくぶん遅い増殖速度（０．６１ｄ−１に対して０．５７）、低い容積生産性（２２７ｋＵ／Ｌ／Ｄに対して１９７）がもたらされた。しかしながら、バイアビリティはほとんど影響を受けなかった。１７０ｒｐｍではなく９０ｒｐｍの攪拌速度でのｒｕｓｈｔｏｎ羽根攪拌バイオリアクターを使用すると、増殖速度（０．６１ｄ−１に対して０．５４）、容積生産性（２２７ｋＵ／Ｌ／Ｄに対して１７５）および細胞比生産性（１３８Ｕ／１０６細胞／日に対して１１５）が明白に低下した。
【０１５３】
この実験のデータにより、ｂａｌｌ羽根で６０ｒｐｍのとき、およびＲｕｓｈｔｏｎ羽根で低攪拌速度のときはともに、Ｒｕｓｈｔｏｎ羽根で１７０ｒｐｍのときと比べ、ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの性能の低下がもたらされることが示された。とは言うものの、この結果により、ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの培養にｂａｌｌ羽根を使用することが可能であることも示された。試験した設定のうち、ｒｕｓｈｔｏｎ羽根で１７０ｒｐｍ＋４枚のバッフルプレートの設定は、最も荒い条件が示された。しかしながら、注目すべきことに、この条件下で細胞バイアビリティの低下は観察されず、これは、調べたＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの高い機械抵抗性を示す。
【０１５４】
【表２２】
３２Ｌ容バイオリアクターにおけるピッチブレード羽根での異なる攪拌速度の比較。ＧＭＰ操作のため、ＰＰ１バイオリアクター（作動容積９５０Ｌ）内のキャンペーンＯＲＦＵＲＦＢ０７００２に、先で使用したｂａｌｌ型の羽根の代わりに、ピッチブレード型の羽根（２枚、ｄ＝７００ｍｍ）を設置した。
【０１５５】
このキャンペーン中、２日間のバッチ式再供給サイクルを行なった。先のキャンペーンと比較したときのこの変化を評価するため、３２Ｌ容のバイオリアクターに、同様の型のピッチブレード羽根（１枚、ｄ＝１４０ｍｍ）を設定し、ＰＰ１設備由来の細胞懸濁物および同等の材料の使用を確保する培地を用いて発酵を行なった。
【０１５６】
同様のバッチ式再供給プロセスを行ない、このとき、２〜３回連続で２日間バッチサイクルを、０．５×１０Ｅ０６細胞／ｍＬの開始細胞密度で開始した。実験は、２つの異なる攪拌速度、すなわち５５ｒｐｍと１２０ｒｐｍ）で行なった。培養条件は、ＰＰ１で使用した培養条件と同一：ｐＨ−ＳＰ ７．１５，Ｔｅｍｐ−ＳＰ ３５．５℃，ｐＯ２−ＳＰ ２０％とした。最後のバッチのデータを、それぞれの攪拌条件への適応後に比較した。
【０１５７】
【表２３】
この実験により、この場合も、ＣＨＯクローン＃４８８−３の比増殖速度に対する攪拌条件の効果が示された。同じ開始細胞密度を適用した場合、増殖速度が増大すると、バッチ終了時の最終細胞密度は高くなった。容積生産性は２７６ｋＵ／Ｌ／Ｄから４４５ｋＵ／Ｌ／Ｄに増大した（＋６１％）が、最終細胞密度は３０％増大した（１．５×１０Ｅ０６細胞／ｍＬに対して１．９５）。この結果は、攪拌速度の増大が細胞の比生産性に対してプラスの影響を有したことを示す。
【０１５８】
また、ほぼ２００ｋＵ／Ｌ／Ｄの平均生産性がもたらされた発酵操作は、主に、２０ｒｐｍという低攪拌速度の適用の結果であって、羽根の設計そのもののためではなかったという結論付けがなされ得る。ここで、ピッチブレード羽根により、相応して攪拌速度を調整すると、＞４００ｋＵ／Ｌ／Ｄの収率がもたらされ得ることが示され得る。
【０１５９】
実施例４：
組換えフリン（ｒＦＵＲＩＮ）の精製
この実施例では、ｒＦｕｒｉｎの濾過および精製のための方法を示す。収集した細胞培養上清みを、まず、デプスフィルター（Ｃｕｎｏ Ｚｅｔａｐｌｕｓフィルター）で濾過して細胞無含有および微粒子無含有とした後、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（ＰＡＬＬ Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＩＩ）で薄膜濾過した。濾過したｒＦｕｒｉｎ含有細胞培養上清みを、次いで、１０ Ｋ ＰＥＳ ＵＦカセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製（Ｓａｒｔｏｃｏｎ ＰＥＳＵ １０ｋＤａ））での限外濾過により、１０〜５０の範囲の濃縮係数で濃縮した。次いで、フリン濃縮物（２９０〜１７００単位／ｍｌ範囲のフリン活性を有する）を、アリコートに分けて＜−６０℃で保存した。
【０１６０】
ＶＷＦ成熟プロセスにおける使用のためのより均一なｒＦｕｒｉｎ調製物を得る試みにおいて、細胞培養上清みからｒＦｕｒｉｎを一部精製する実験を行なった。一部精製ｒＦｕｒｉｎ試薬は、特性評価および放出試験での使用がより容易になる。また、ＶＷＦ成熟プロセスにおいてＣＨＯ宿主細胞タンパク質の存在の低減がもたらされる。
【０１６１】
ｒＦｕｒｉｎの効率的な結合に必要とされる負荷導電率が＜５ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）であるアニオン交換樹脂での精製手順を開発した。次いで、溶出を、およそ５００〜３００ｍＭ ＮａＣｌのイオン強度で段階的手順として行ない、このスクリーニング期間中、３００ｍＭ ＮａＣｌまでの勾配溶出を適用した（表２４の概要参照）。バッファーの最初のｐＨ６．７（ＲＴ）を７．５に上げると、特に、高タンパク質負荷量および高線形流速において、負荷量中のｒＦｕｒｉｎ結合が改善された（表２５の関連バッファーの概要参照）。精製実験は、充填流速の安定性および操作最大流速が異なるＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍｅｒｃｋ）およびＣａｐｔｏＱ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アニオン交換樹脂において行なった。表２６に要約した解析データは、ｒＦｕｒｉｎが細胞培養上清みから、２０〜７１％の範囲の収率で３６２倍まで濃縮され得ることを示す。溶出液プール中のｒＦｕｒｉｎ活性は、適応された負荷量に応じて６３９単位／ｍｌ〜２７６５１単位／ｍｌであった。溶出液中のＣＨＯ不純物レベルは、１０〜１３４ｎｇ ＣＨＯタンパク質／単位ｒＦｕｒｉｎの範囲であることがわかり、ＣａｐｔｏＱ樹脂では、１２．３までの減少割合により、ＣＨＯ減少に関してわずかに良好な性能が見られた。
【０１６２】
要約すると、アニオン交換クロマトグラフィーによるｒＦｕｒｉｎの精製は、＜−６０℃でのｒＦｕｒｉｎ試薬の保存に重要である濃縮の一選択肢であることが示された。また、３〜１２倍のわずかなＣＨＯの減少が、ＶＷＦの調製物中のＣＨＯタンパク質濃度の低減に重要である。
【０１６３】
【表２４】
【０１６４】
【表２５】
【０１６５】
【表２６】
実施例５：
ｒＦｕｒｉｎの濃縮、精製および解析
この実施例では、大規模ｒＦｕｒｉｎの濃縮および精製（すなわち、下流の処理）
に使用される他の方法を記載する。かかる処理の方法としては、限外濾過、ダイアフィルトレーション、およびｃａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィー（実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎの作製において実施）が挙げられる。また、タンパク質の濃度、比活性、ならびに宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡによる夾雑の解析方法を記載する。
【０１６６】
限外濾過。上清み（ケモスタットキャンペーンではおよそ８００〜１２００ｋｇ、およびＲＦＢキャンペーンではおよそ５５０〜７００ｋｇ）を細胞から分離し、限外濾過によって終容量３５〜４５Ｌまで濃縮した。濃縮工程での限外濾過／ダイアフィルトレーションシステム（ＵＦＳ）のパラメータおよび設定点を表２７に示す。
【０１６７】
【表２７】
ダイアフィルトレーション。濃縮工程の終了直後、保持液のダイアフィルトレーションを開始した。ダイアフィルトレーション工程でのＵＦＳのパラメータおよび設定点を表２８に示す。
【０１６８】
【表２８】
保持液の導電率が２ｍＳ／ｃｍ未満に下がったとき（ＵＦＳのインライン導電率プローブにより測定）、このプロセス工程を終了した。この低い導電率は、後続の精製工程でのクロマトグラフィーゲルに対するｒＦｕｒｉｎの定量的結合を確保するために必要とされる。ダイアフィルトレーション生成物を移し、このダイアフィルトレーション生成物のｐＨ値を１Ｍ酢酸溶液の添加によって６．０に調整した。この生成物を、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣカラムに適用する前に室温（ＲＴ）で保存した。
【０１６９】
Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィー。マルチモーダルカチオン交換体であるＣａｐｔｏ−ＭＭＣゲルを使用し、ｒＦｕｒｉｎを結合し、大部分の夾雑物をダイアフィルトレーション生成物から排除した。クロマトグラフィーゲルの平衡後、ダイアフィルトレーション生成物をカラムに負荷する。０．２２μｍフィルターカプセルを取り付け、ダイアフィルトレーション生成物のオンライン濾過を行なった。表２９に、さらなるクロマトグラフィー工程を列挙および詳述する。
【０１７０】
【表２９】
下流の処理では、問題は観察されなかった。下流工程（濾過、ＵＦ、ＤＦ）は、ケモスタット培養物からの回収に使用されるものと同じ条件で行なわれ得る。平均全ｒＦｕｒｉｎ活性収率９１％（キャンペーンＯＲＦＵ０６００２）、６６％（キャンペーンＯＲＦＵ０７００１）および８４％（キャンペーンＯＲＦＵ０７００２）が達成され得た。唯一の小さな変化は、ＵＦ工程の開始容量が連続的な培養と比べていくぶん少ないことによって示される。しかしながら、この変化は、精製生成物の品質に対して効果を有しない（全活性、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質に関するデータ参照；表３０参照）。
【０１７１】
宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡ含有量に関する３つのキャンペーンすべての平均値は、それぞれ、かなり低い平均最大値８．５５μｇ／ｍｌ（２．２〜１０．４μｇ／ｍｌの範囲）および１３．４８ｎｇ／ｍｌ（０．０〜２３．９ｎｇ／ｍｌの範囲）（表３０参照）を示す。クロマトグラフィー工程により、比夾雑を、低い平均最大値０．３５ｎｇ ＣＨＯタンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ活性（０．１３〜０．５２ｎｇ ＣＨＯタンパク質／Ｕの範囲）および０．１４８ｐｇ宿主細胞ＤＮＡ／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ活性（０．０〜．３６５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ活性の範囲）まで減少させることができた。
【０１７２】
【表３０】
Ｆｕｒｉｎ特性評価。ｒＦｕｒｉｎの品質および機能性を、以下の生化学的／生物物理学的方法によって評価した（表３１）。
【０１７３】
【表３１】
Ｆｕｒｉｎ活性のアッセイ。精製ｒＦｕｒｉｎバッチ（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液プール）を、Ｆｕｒｉｎの酵素活性について試験した。基質は、蛍光アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣ）基（これは、切断（ＢＯＣ−ＲＶＲＲ−ＡＭＣ）後に放出される）に結合された二塩基性認識配列を含む短鎖の合成ペプチドである。放出された蛍光発生基は、３８０ｎｍでの励起、続いて４３５ｎｍでの発光の測定によって検出され得る。１活性単位は、３０℃で１分あたり１ｐＭｏｌのＡＭＣの放出と定義する。
【０１７４】
発酵および精製の有効性に応じて、ｒＦｕｒｉｎ活性の測定値は約１００００Ｕ／ｍｌから約１０００００Ｕ／ｍｌ超までの範囲であり、平均値はおよそ６９０００Ｕ／ｍｌであった（表３２、表３２、および表３４）。ＲＦＢ様式キャンペーンでは、特に、ケモスタットキャンペーンＯＲＦＵ０６００２（４７７３７Ｕ／ｍｌ）の平均値と、ＲＦＢ キャンペーンＯＲＦＵ０７００１（７７６５３Ｕ／ｍｌ）およびＯＲＦＵ０７００２（９３１７８Ｕ／ｍｌ）の平均値を比較した場合、ｒＦｕｒｉｎ活性の増大がみとめられた（全般的には、ｒＦｕｒｉｎ活性は、約１００００から１０００００Ｕ／ｍｌ超までの範囲であった；すべてデータ表示せず）。
【０１７５】
Ｆｕｒｉｎの比活性は、活性Ｕ／μｇタンパク質で示す（表３２〜３４参照）。キャンペーンＯＲＦＵ０６００２の平均比活性は２６９Ｕ／μｇタンパク質であり、それぞれ、ＯＲＦＵ０７００１では５００Ｕ／μｇに、およびＯＲＦＵ０７００２では５６３Ｕ／μｇに増大した（全般的には、比活性は、１２４〜６２０Ｕ／μｇタンパク質の範囲であった；データ表示せず）。したがって、比活性はこの２つのＲＦＢ キャンペーンで倍加し、ケモスタット様式で生成させたバッチと比べてＲＦＢ ｒＦｕｒｉｎの酵素活性が高い結果である。
【０１７６】
【表３２】
【０１７７】
【表３３】
【０１７８】
【表３４】
フリン使用試験活性。フリン使用試験は、プロＶＷＦから成熟ｒＶＷＦにプロセッシングされるｒＦｕｒｉｎの有効性が定量されるように設計されたものである。成熟有効性は、１ＶＷＦ抗原単位の成熟に必要とされるＦｕｒｉｎ単位の量（Ｕフリン／Ｕ ＶＷＦ）で示す。基質は、パイロット規模で現行の製造手順（Ｆｕｒｉｎの成熟およびＳｕｐｅｒｏｓｅ ６での最終精製工程は省略）に従って精製されたプロＶＷＦ／ＶＷＦ調製物である。ｒＶＷＦ基質濃度は１００Ｕ Ａｇ／ｍｌであった（Ｆ８ＨＬ＿２４＿０１ ＵＦ０２−Ｒ）。
【０１７９】
試料の４つの希釈物を、１ｍｌ容のエッペンドルフ型チューブ内で、例えば、０．２５〜２．０Ｕ／Ｕ ＶＷＦの比Ｆｕｒｉｎ濃度を包含するように試験した。反応および希釈用バッファーは、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ７．０）とし、成熟実験は、わずかに攪拌下、３７℃で１６時間行なった。インキュベーション後、ＳＤＳ−試料バッファーの添加および＞９０℃で５分間の試料の加熱によって酵素反応を停止させる。次いで、試料を、８％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分離されたポリペプチドの銀染色の使用によって解析する。次いで、ゲルの目視検査（プロＶＷＦバンドは、成熟ＶＷＦバンドと比べ、５％未満を示すはずである）によって評価される成熟有効性＞９５％を得るのに必要とされる比Ｆｕｒｉｎ活性を報告し、試験したｒＦｕｒｉｎの品質条件として使用する。
【０１８０】
【表３５】
【０１８１】
【表３６】
【０１８２】
【表３７】
良好で一貫したプロＶＷＦの成熟活性が、試験したすべてのｒＦｕｒｉｎバッチで見られた。キャンペーンの平均値は、１．０Ｕ Ｆｕｒｉｎ／Ｕ ＶＷＦ未満である：Ａｇおよび成熟度は、すべての場合で９５％を超える（表３５〜３７）。ｒＦｕｒｉｎバッチの成熟活性はすべて同等であり、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２、ＯＲＦＵ０７００１およびＯＲＦＵ０７００２の平均計算値を参照すると、ケモスタット様式およびＲＦＢ様式で生成されたｒＦｕｒｉｎ間に、ほぼ違いは見い出され得ない。
【０１８３】
Ｆｕｒｉｎ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとともに銀染色およびウエスタンブロット解析を、すべてのｒＦｕｒｉｎバッチに対して行ない、一貫した品質を保証し、不純物の程度を可視化した。図１２に見られるように、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２とＯＲＦＵ０７００２のＣａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液のバンドパターンは、高度に相関している。；試料はすべて、およそ６０ｋＤａに顕著なＦｕｒｉｎバンドを示す。バッチＭＭＣ０１〜ＭＭＣ０８由来のキャンペーンＯＲＦＵ０６００２の試料では、Ｆｕｒｉｎバンドがわずかに小さい分子量である傾向が見られる（図１２、レーン１〜８）。このバッチの試料は脱グリコシル化されており、この傾向は、後続の銀染色を伴いＳＤＳ−ＰＡＧＥは見られなくなる（データ表示せず）という効果を有し、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２では、ｒＦｕｒｉｎが、発酵進行中の過程で、わずかに異なる程度またはより低い程度でグリコシル化されるという仮定を裏付ける。この傾向は、ＲＦＢ キャンペーンＯＲＦＵ０７００２ではみとめられず、全キャンペーンでのｒＦｕｒｉｎの定常的なグリコシル化を示す。ＯＲＦＵ０６００２およびＯＲＦＵ０７００２に由来するバッチ中の不純物は、ほぼ完全に同じである；しかしながら、ＲＦＢ様式キャンペーンＯＲＦＵ０７００２由来の試料は、４０ｋＤａの領域に強度の小さいバンド、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２の試料中で特に強く富化されたポリペプチドを示す。
【０１８４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット。すべての試料に対し、モノクローナル抗Ｆｕｒｉｎ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行なった（図１３）。約６０ｋＤａにおける顕著なバンドは、Ｆｕｒｉｎバンドと同定され得、すべての試料に見られる。試料の同等性は非常に高い。バンド強度におけるわずかな変動は、試料中のＦｕｒｉｎ濃度が異なることによるものである。全般的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、ケモスタットおよびＲＦＢ様式で生成されたｒＦｕｒｉｎの同等性が強調される。
【０１８５】
慣用的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを補助するため、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２およびＯＲＦＵ０７００２の試料に対して等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行なった。ＩＥＦは、垂直型ＩＥＦを使用し、ｐＨ７．０〜ｐＨ３．０で行なった。ポリペプチドは、クーマシー染色およびウエスタンブロット解析によって可視化した。キャンペーンＯＲＦＵ０６００２のｒＦｕｒｉｎ試料のＩＥＦおよびその後のウエスタンブロットにより、Ｆｕｒｉｎの特異的バンドパターンが示された（図１４参照）。ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の領域内に７個までの別個のバンドが確認され得、少なくとも５個のバンドは、すべての試料に存在する。
【０１８６】
キャンペーンＯＲＦＵ０７００２の試料のＩＥＦは、可視化のためにクーマシー染色およびウエスタンブロット解析を用いて行なった。クーマシー染色では、特異的バンドパターンが示され、すべての試料で、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の領域内に最小５個の別個のバンドが示され、８個までのバンドが確認され得る（図１５、レーン３参照）。
【０１８７】
ウエスタンブロット解析（図１６参照）により、これらの結果が確証され、一部の試料では、クーマシーゲルで見られたバンド全部は示されない（図１７参照）。これは、おそらく、ゲルからブロッティング膜へのタンパク質の移行が不完全なためである。
【０１８８】
Ｆｕｒｉｎ逆相ＨＰＬＣ。ｒＦｕｒｉｎのフィンガープリントパターンを確立するため、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２およびＯＲＦＵ０７００３由来の試料（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液）を、Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。この２つのキャンペーンの試料のピークパターンを比較した（図１７および図１８参照）。
【０１８９】
試験したすべての試料のクロマトグラムには、およそ１３分の保持時間の時点に特徴的なメインピークが示されており、これはＦｕｒｉｎに帰属され得る。ピークの高さは、試料中のＦｕｒｉｎ濃度と充分に相関している。他のタンパク質不純物は、８分〜１７分の範囲にマイナーピークとして見られ得る。キャンペーンＯＲＦＵ０７００２由来の試料はすべて、ＯＲＦＵ０６００２のものよりも有意に少なく小さい不純物由来のピークを示す。このことは、少数で少量の不純物が見られたＲＦＢ様式キャンペーンＯＲＦＵ０７００２の場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と充分に整合する。
【０１９０】
上記の特性評価方法で得られた解析データは、ケモスタット様式とＲＦＢ様式の両方で生成されたｒＦｕｒｉｎの非常に良好な同等性を示す。入手可能なデータからは、ｒＦｕｒｉｎの品質に大きな差は検出され得なかったが、ＲＦＢ様式で生成されたｒＦｕｒｉｎバッチでは、ケモスタット様式での生成と比べ、高い比活性および少ない不純物が示された。クロマトグラフィー工程により、原薬原料（ＢＤＳ）中の宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡの含有量は非常に低くなる。ＲＦＢ発酵および全下流処理（濾過、ＵＦ／ＤＦ、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィー）からなる少なくとも完全な生成プロセスは、おそらく、例えば、単独使用バイオリアクター（ＳＵＢ）系におけるｒＦｕｒｉｎの商業的作製のための実施が、より容易である。
【０１９１】
実施例６：
安全性、無菌性、および安定性の試験
この実施例では、ＣＨＯ細胞バンクの品質の測定および維持のために行なわれる安全性、無菌性および安定性の試験を記載する。無菌性／マイコプラズマに対する試験は、ＩＣＨ−Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ Ｑ５Ｄの要請に従って行なわれなければならない。細胞バンクの品質は、解凍細胞の平均バイアビリティおよび細胞密度の測定ならびにその後の培養物の増殖速度によって確認されなければならない。
【０１９２】
ウイルス安全性（表３８）、遺伝子安定性（表３９）、および同一性（表４０）について、細胞を試験した。細胞は無菌性であり、マイコプラズマを含まず、外来因子を含まず、レトロウイルスを含まず、ＭＶＭウイルスに対して陰性であり、外来ウイルスに対して陰性であり、齧歯類ウイルスに対して陰性であり、ブタおよびウシウイルスを含まず、Ｃａｃｈｅ Ｖａｌｌｌｅｙウイルス（ＣＶＶ）を含まないことがわかった。
【０１９３】
細胞バンクを、Ｆｕｒｉｎ産生細胞／非産生細胞比に関して、ＦＡＣＳ解析によって検査した。また、長期安定性（長期間にわたってＦｕｒｉｎを産生する能力）についても試験する。さらに、無血清条件下で産生された分泌型Ｆｕｒｉｎは、生成されるアイソフォームに関して調べなければならない。データはすべて、安定な培養およびＦｕｒｉｎ生成が、このような細胞バンクを用いて達成され得ることを示すはずである。
【０１９４】
ＭＣＢ／ＷＣＢ由来の細胞では、生成プロセス全体にわたって、安定な増殖およびＦｕｒｉｎ発現が示されるはずである。
【０１９５】
【表３８】
【０１９６】
【表３９】
【０１９７】
【表４０】
本発明を、本発明の実施のための好ましい様式を含むことがわかった、または含むと提案される特定の実施形態に関して説明したが、当業者には、本開示に鑑みると、例示した該特定の実施形態において本発明の意図する範囲を逸脱することなく、数多くの変形および変更がなされ得ることが認識されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲に記載の発明の範囲に含まれるかかるすべての均等な異型を包含するものとする。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年１２月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，１５２号の優先権を主張する。米国仮特許出願第６１／０１８，１５２号は、その全体が本明細書中に参考により援用される。
【０００２】
本発明は、一般的に、組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）およびｒＦｕｒｉｎの作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎ、および実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
活性タンパク質または成熟タンパク質は、通常、生きている生物体には非常に少ない量で存在している。したがって、好ましくは、そのプロタンパク質またはプロ酵素を、活性化酵素（例えば、プロテアーゼ）と接触させることにより、インビトロで活性化させる。プロタンパク質（またはタンパク質前駆体）は不活性なタンパク質であり、１回以上の翻訳後修飾によって、特に、該プロタンパク質からのプロペプチドの切断によって活性となる。プロタンパク質の例としては、例えば、プロインスリン、プロトロンビン、プロフォンヴィレブランド因子（プロＶＷＦ）などが挙げられる。
【０００４】
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、凝固に関与している血液糖タンパク質である。ＶＷＦは、フォンヴィレブランド病において欠乏または欠損しており、非常の多くの他の疾患、例えば、血栓性血小板減少性紫斑病、ハイド症候群、および場合によっては溶血性尿毒症症候群に関与している。ＶＷＦは、約５００〜２０，０００ｋＤの範囲の大きさの一連の多量体として血漿中を循環している糖タンパク質である。ＶＷＦの多量体形態は、２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットが互いにジスルフィド結合によって連結されて構成されている。ＶＷＦは、損傷血管壁の内皮下層への初期の血小板付着を媒介し、ＶＷＦの大型多量体のみが止血活性を示すと考えられている。大きな分子量を有するＶＷＦ多量体は、内皮細胞のヴァイベル−パラーデ（Ｐａｌｌａｄｅ）小体内に貯蔵されており、刺激を受けると遊離する。遊離したＶＷＦは、次いで、血漿プロテアーゼによってさらにプロセッシングされ、ＶＷＦの低い分子量形態が生じる。
【０００５】
ヒトでは、プロペプチドの除去はほぼ完全であるが、高レベルの組換えＶＷＦ発現を有する哺乳動物細胞株では、このプロセスはあまり効率的ではない。したがって、かかる組換え細胞株由来の細胞培養上清みは、通常、成熟ＶＷＦと、ＶＷＦ前駆体（プロＶＷＦなど）の混合物を含む。したがって、成熟ＶＷＦが得られるためには、ＶＷＦ前駆体、特にプロＶＷＦが成熟ＶＷＦに変換されることが必要である。このプロセスは、通常、プロペプチドをプロテアーゼで切断することによりなされる。
【０００６】
現行の慣用的な方法では、プロ形態をプロテアーゼとともに液相中でインキュベートし、それにより成熟それ自体（すなわち、プロタンパク質からのプロペプチドの切断）を非結合状態の遊離溶液中で行なうこと、または、例えば特許文献１に記載のように、プロテアーゼを固相担体上に固定化し、これを、プロＶＷＦを含む調製物と接触させ、該調製物とともにインキュベートすること（例えば、特許文献１参照）のいずれかにより成熟ＶＷＦが生成される。しかしながら、これらの方法は、本発明による方法と比べて種々の不都合点を含む。
【０００７】
産業的には、ＶＷＦおよび、特に組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を、遺伝子操作したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株内で組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）とともに合成および発現させる。共発現ｒＶＷＦの機能は、細胞培養プロセスにおいてｒＦＶＩＩＩを安定させることである。ｒＶＷＦは該細胞内で、Ｎ末端に結合された大型プロペプチドを含むプロ形態で合成される。小胞体およびゴルジ装置内で成熟すると、プロペプチドが、細胞内プロテアーゼであるフリンの作用によって切断され、成熟タンパク質が、発現タンパク質の二量体からなる同一サブユニットのホモポリマーとして分泌される。しかしながら、この成熟は、典型的には不完全であり、プロＶＷＦと成熟ＶＷＦの混合物を含む生成物がもたらされる。
【０００８】
先の刊行物では、プロＶＷＦが成熟ＶＷＦに、フリン（ｆｕｒｉｎ）またはフリン様プロテアーゼでのインビトロ処理によって変換され得ることが示されている（非特許文献１；非特許文献２；およびＥＰ０７７５７５０Ａ）。特に、ＥＰ０７７５７５０Ａでは、フリンとＶＷＦを組換えにより共発現させると、ＶＷＦの成熟がインサイチュで起こり得ることが示唆されている。
【０００９】
組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）は、プロｒＶＷＦ（プロ組換えフォンヴィレブランド因子）を、Ａｒｇ７４１−Ｓｅｒ７４２ペプチド結合を切断することによりｒＶＷＦに変換させる。この成熟工程は、フォンヴィレブランド病Ｂ型の処置のためのｒＶＷＦ作製プロセスの一部であり、組換え第ＶＩＩＩ因子−半減期（ｒＦＶＩＩＩ−ＨＬ）の製造プロセスの一部である。フリンは、プロタンパク質コンバターゼファミリーに属し、カルシウム（Ｃａ２＋）に依存性である。フリンは、−１位と-４位にアルギニンを含む特定の配列内のアルギニンのＣ末端ペプチド結合を特異的に切断する。この配列は数多くのヒトタンパク質に見られ得、これは、フリンがいくつかのヒトプロタンパク質の成熟に主要な役割を果たしていることを示す。
【００１０】
活性化型タンパク質の作製は、臨床上および診断上、非常に重要である。例えば、活性タンパク質または成熟タンパク質（成熟ＶＷＦなど）は、血液凝固を制御するために使用され得る。本発明は、活性化型タンパク質を後に作製するための実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎである改善された組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）を提供する。より詳しくは、本発明は、プロＶＷＦを成熟ＶＷＦに変換させるための実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第００／４９０４７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｃｈｌｏｋａｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：２５７−２６７，１９９６
【非特許文献２】Ｐｒｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０：１−１５，１９９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）である組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）、およびその作製方法を提供する。かかるｒＦｕｒｉｎは、通常ｒＦｕｒｉｎの作製に関係し得る他のタンパク質（血清タンパク質および宿主細胞タンパク質など）を実質的に含まない。このｒＦｕｒｉｎにより、高比活性および高純度を有し、ｒＦｕｒｉｎ調製物中のタンパク質夾雑物に関連する副次的悪影響のない成熟タンパク質を後に作製することが可能になる。より詳しくは、このｒＦｕｒｉｎにより、高比活性および高純度を有する成熟ＶＷＦを作製することが可能になる。したがって、本発明は、組換え宿主細胞の選択および化学的に規定される培地への適応、ｒＦｕｒｉｎの発現および細胞培養上清み中への分泌、ならびに細胞除去後のｒＦｕｒｉｎの精製のための方法を提供する。
【００１４】
本発明の実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎは、約０．１〜０．６ｎｇ タンパク質／単位フリン活性もしくはそれ未満の、または約２〜１１μｇ タンパク質／ｍＬもしくはそれ未満の範囲の濃度の宿主細胞タンパク質を含み、培養培地中の血清由来の夾雑タンパク質が本質的にないｒＦｕｒｉｎの調製物または組成物を包含する。一態様において、実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎは、約０〜０．４ｐｇ ＤＮＡ／単位フリン活性もしくはそれ未満の、または約０〜２４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬもしくはそれ未満の濃度の夾雑宿主細胞ＤＮＡを含み、培養培地中の血清由来の夾雑タンパク質が本質的にないｒＦｕｒｉｎの調製物を包含する。
【００１５】
本発明は、少なくとも１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン、および約１１μｇ タンパク質／ｍＬ未満の濃度の宿主細胞タンパク質を含む組成物を包含する。また、かかる組成物は、約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕフリン活性未満の濃度の宿主細胞タンパク質を含むものであってもよい。一態様において、宿主細胞タンパク質はＣＨＯ細胞由来のものである。
【００１６】
別の態様において、本発明は、少なくとも１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン、および約１４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬ未満の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含む組成物を包含する。種々の態様において、かかる組成物はまた、約０．５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕフリン活性未満の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含むものであってもよい。一態様において、宿主細胞ＤＮＡはＣＨＯ細胞由来のものである。
【００１７】
また、本発明は、少なくとも約１００Ｕ／μｇのフリン比活性の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン、および約１１μｇ タンパク質／ｍＬ未満の濃度の宿主細胞タンパク質を含む組成物を包含する。また、かかる組成物は、約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕフリン活性未満の濃度の宿主細胞タンパク質を含むものであってもよい。一態様において、宿主細胞タンパク質はＣＨＯ細胞由来のものである。
【００１８】
さらに、本発明は、少なくとも約１００Ｕ／μｇのフリン比活性の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリン、および約１４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬ未満の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含む組成物を包含する。また、かかる組成物は、約０．５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕフリン活性未満の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含むものであってもよい。一態様において、宿主細胞ＤＮＡはＣＨＯ細胞由来のものである。
【００１９】
また、本発明は、本明細書に記載の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを含む組成物の作製方法を包含する。かかる方法は、宿主細胞を培地中で、血清濃度をだんだん低下させながら、すべての血清が該培地から除去されるまで適応させる工程を含む。別の態様において、該方法は、宿主細胞を、血清を含む培地中での培養から無血清培地中での培養に移す工程を含む。例示的な態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載の実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを含む組成物の使用方法を包含する。かかる使用は、プロタンパク質を該組成物と、該プロタンパク質からプロペプチドが切断されて成熟タンパク質が形成される条件下で接触させる工程を含む。ｒＦｕｒｉｎは、フリンによって切断されるプロタンパク質からの任意の成熟タンパク質の形成に使用され得る。一態様において、成熟タンパク質はフォンヴィレブランド因子である。別の態様では、成熟タンパク質は第ＶＩＩＩ因子である。また、本発明では、本発明のｒＦｕｒｉｎが、これによって切断される任意のプロタンパク質のインビトロプロセッシングとインビボプロセッシングの両方に有用であることが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明のさらなる実例を、添付の図面を参照しながら示す。該実例を以下の図１〜１８に示す。
【図１】図１は、本発明の一実施形態における発現活性ｒＦｕｒｉｎプロテアーゼ構築物を示す。ｒＦｕｒｉｎ構築物は、Ｃｙｓリッチ膜貫通ドメインと細胞質ゾルドメインが除去されるようにＣ末端のＡＡ５７７が切断されている。
【図２】図２は、ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃４８８−３の作製の系図を示す。
【図３】図３は、ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃２８９−２０の作製の系図を示す。
【図４】図４は、ＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４の細胞集団におけるｒＦｕｒｉｎ産生細胞のグラフによる分布の比較を示す。ＰＭＣＢ＃０４の細胞の８０．７４％がｒＦｕｒｉｎを発現し、ＰＭＣＢ＃０１の細胞の７４．０６％がｒＦｕｒｉｎを発現している。
【図５】図５は、５つの温度を３つのｐＨ値と組み合わせて温度とｐＨの７つの組み合わせを得た「Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリックス」を示す。
【図６】図６は、容積生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）に関するデータの表面プロット解析を示す。図６のデータの座標を点で示す。表面は、単一データの推定相関を示す。
【図７】図７は、容積生産性に対する温度とｐＨの影響を示すコンタープロットを示す。点は、実験で試験した条件（ｐＨ／温度）を示す。
【図８】図８は、容積生産性に対して温度の影響が強く、ｐＨの影響が弱いことを示す３次元表示である表面プロットを示す。
【図９】図９は、モデル型相関を３次元的に示す表面プロットを示す；これは、二次方程式の関係を示し、３６．５℃で増殖速度が最大であることを明白に示す。
【図１０】図１０は、比生産性に関するデータの解析を示す。温度およびｐＨと比生産性との相関は、容積生産性で見られたものと同様である。
【図１１】図１１は、温度を３７℃から３５．１℃に下げることにより、容積生産性がおよそ２００ｋＵ／Ｌ／ｄから５４０ｋＵ／Ｌ／ｄに上昇し得ることを示す。
【図１２】図１２は、ｒＦｕｒｉｎのＳＤＳ−ｐａｇｅおよび銀染色を示す。キャンペーン（ｃａｍｐａｉｇｎ）ＯＲＦＵ０６００２とＯＲＦＵ０７００２のＣａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液のバンドパターンは、高度に相関している；試料はすべて、およそ６０ｋＤａに顕著なＦｕｒｉｎバンドを示す。キャンペーンＯＲＦＵ０６００２の試料のバッチＭＭＣ０１〜ＭＭＣ０８では、Ｆｕｒｉｎバンドがわずかに小さい分子量である傾向が見られる（図１２、レーン１〜８）。
【図１３】図１３は、モノクローナル抗Ｆｕｒｉｎ抗体を用いた試料のウエスタンブロット解析を示す。
【図１４】図１４は、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２のｒＦｕｒｉｎ試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）およびその後のウエスタンブロットによるｒＦｕｒｉｎの特異的バンドパターンを示す。
【図１５】図１５は、キャンペーンＯＲＦＵ０７００２のｒＦｕｒｉｎ試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）およびその後のウエスタンブロットによるｒＦｕｒｉｎの特異的バンドパターンを示す。
【図１６】図１６は、キャンペーンＯＲＦＵ０７００２のｒＦｕｒｉｎ試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）およびその後のウエスタンブロットによるｒＦｕｒｉｎのウエスタンブロットの結果を示す。
【図１７】図１７は、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液）の試料のＦｕｒｉｎ逆相ＨＰＬＣを示す。ｒＦｕｒｉｎのフィンガープリントパターンを確立するため、試料をＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。
【図１８】図１８は、キャンペーンＯＲＦＵ０７００２（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液）の試料のＦｕｒｉｎ逆相ＨＰＬＣを示す。ｒＦｕｒｉｎのフィンガープリントパターンを確立するため、試料をＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、無血清培地中で培養でき、かつ活性な組換えフリン（ｒＦｕｒｉｎ）を細胞培養上清み中に分泌することができる組換え宿主細胞株の開発と作製に関する。組換えフリンをコードするプラスミドのトランスフェクションに選択される宿主細胞株は、一態様において、組換え第ＶＩＩＩ因子および組換えＶＷＦの発現に使用されるものと同じである。得られたｒＦｕｒｉｎは、次いで、動物性タンパク質を実質的に含まないように精製される。
【００２３】
フリンは、ＰＡＣＥ、ＰＡＣＥ４、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４およびＰＣ５／ＰＣ６としても知られており、プロタンパク質の切断、特に分泌型合成に重要な役割を果たしているサブチリシン様セリンプロテアーゼ群に属する（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎ．４：１１５−１３６，１９９３）。プロタンパク質は、翻訳後、ゴルジ装置内で内在プロテアーゼにより、その成熟形態に細胞内プロセッシングされる。プロテアーゼ切断部位は、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇを特徴とする認識配列を含む。プロテアーゼであるフリンはプロタンパク質を、このコンセンサス配列の後ろで特異的に切断する（Ｈｏｓａｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２１２７−１２１３０，１９９１）。
【００２４】
ヒトおよびマウスのフリン、ならびにサブチリシン様プロテアーゼ機能を有するさらなるタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が同定されている（Ｒｏｅｂｒｏｅｋら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１１：１１７−１２５，１９８６；Ｒｏｅｂｒｏｅｋら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：２１９７−２２０２，１９８６；Ｂａｒｒら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：３１９−３２８，１９９１；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７１０１−７１０２，１９８９；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６６４，１９９０；Ｓｍｅｅｋｅｎｓら、１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２９９７−３０００；Ｓｍｅｅｋｅｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．８８；３４０−３４４，１９９１；Ｋｉｅｆｅｒら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：７５７，１９９１；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５８９７−５９００，１９９２；およびＨａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２０７５−２２０７８，１９９０）。ヒトフリン遺伝子は、７９４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしており、一部の特定の機能は、個々の特徴的領域：触媒中心、中央ドメイン、シスチンリッチ領域、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに割り当て可能である（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎ．４：１１５−１３６，１９９３）。一態様において、ヒトフリンポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＡＸ０２１１１に示されたものである（米国立バイオテクノロジー情報センター、米国立医学図書館、ベテスダ、ＭＤ）。しかしながら、当業者には、フリンの生物学的活性、すなわち、プロタンパク質を切断する（例えば、プロＶＷＦを切断して成熟ＶＷＦを生成させる）能力を有する任意のタンパク質が、本明細書に記載の方法によって作製され得ることが認識されよう。
【００２５】
インタクトなフリンは、ゴルジ装置の膜系内に組み込まれ、そこで機能的に活性となる（Ｂｒｅｓｎａｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：２８５１−２８５９，１９９０）。７５〜８０ｋＤの過剰発現天然フリンの切断形態は、細胞上清み中に、分泌型タンパク質として検出され得る（Ｗｉｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９３７８−９３８２，１９９０）。この天然に分泌されるフリンは、「流入型（ｓｈｅｄ）フリン」として知られており（Ｖｉｄｒｉｃａｉｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９５：１０１１−１０１８，１９９３）、Ｎ末端側で膜貫通部分が切断されている（Ｖｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２７：１８２９−１８４２，１９９４）。
【００２６】
また、遺伝子操作による切断型フリン（膜貫通ドメインと細胞質ドメインのコード部分を欠失させたもの）を発現させ、相応して分泌させることができる。かかるＮ末端欠失は、アミノ酸７１４〜７９４（Ｌｅｄｕｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０４−１４３０８，１９９２，Ｍｏｌｌｏｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６３９６−１６４０２，１９９２）；アミノ酸７１６〜７９４（”ＳｏＩ−ＰＡＣＥ”）（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５，１９９３；およびＲｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｂｌｏｏｄ ７９：２３４９−２３５５，１９９２）；ならびにアミノ酸７０５〜７９４（Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６０９４−１６０９９，１９９２）について報告されている。また、シスチンリッチ領域の欠失をさらに含むフリン変異型も報告されている（Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１：２９６−３０１，１９９２；Ｃｒｅｅｍｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１８２６−２１８３４，１９９３）。
【００２７】
フリンの細胞内タンパク質分解の活性、およびその塩基性アミノ酸に対する選択性は、最初に、プロフォンヴィレブランド因子（プロｖＷＦ）を用いて実験において測定された。プロｖＷＦは、７４１個のアミノ酸を有するプロポリペプチドと、２０５０個のアミノ酸を有する成熟フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）からなる（Ｖｅｒｗｅｉｊら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１８３９−１８４７，１９８６）。プロｖＷＦからの成熟ｖＷＦの遊離は、Ａｒｇ７６３より後ろのタンパク質分解性切断によって起こる。真核生物用発現ベクター内のプロｖＷＦ ｃＤＮＡでのトランスフェクションにより、細胞培養上清み中に、等モル量の３６０ｋＤのプロｖＷＦと２６０ｋＤの成熟ｖＷＦの生成がもたらされる。おそらく、ｖＷＦは、トランスフェクト細胞内で内因的に存在するフリンにより、その成熟形態にプロセッシングされる（Ｗｉｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９３７８−９３８２，１９９０，Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１４：２６５−２７５，１９９０）。
【００２８】
中でも、それぞれフリンまたはサブチリシン様酵素によって切断されるさらなるプロタンパク質は、一連のホルモンおよび増殖因子（例えば、プロアクチビンＡ、肝細胞増殖因子）、血漿タンパク質（アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子）、受容体（インスリンプロ受容体）、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０、インフルエンザウイルス血球凝集素）ならびに細菌タンパク質（ジフテリア毒素、炭疽毒素）である（Ｄｅｃｒｏｌｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２２４０−１２２４７，１９９４；Ｓｔｉｅｎｅｋｅ−Ｇｒｏｂｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２４０７−２４１４，１９９２；Ｂａｒｒ，Ｃｅｌｌ ６６：１−３，１９９１，Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５，１９９３；Ｋｌｉｍｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０２７７−１０２８１，１９９２；Ｔｓｕｎｅｏｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６４６１−２６４６５，１９９３；Ｂｒｅｓｎａｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：２８５１−２８５９，１９９０；Ｈｏｓａｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２１２７−１２１３０，１９９１；およびＶｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：１８２９−１８４２，１９９４）。本発明のｒＦｕｒｉｎは、このようなプロタンパク質の切断における使用も想定される。
【００２９】
真核生物細胞培養物中でのインタクトなフリンおよびプロタンパク質をコードする核酸配列の共発現により、プロタンパク質のプロセッシングの増大がインビボで達成された。これは、例えば、プロ第ＩＸ因子（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５，１９９３）ならびにプロｖＷＦ（ＷＯ９１／０６３１４；Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．１４：２６５−２７５，１９９０；およびＲｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｂｌｏｏｄ ７９：２３４９−２３５５，１９９２）で示されている。本発明では、本発明のｒＦｕｒｉｎが、これによって切断される任意のプロタンパク質のインビトロプロセッシングとインビボプロセッシングの両方に有用であることが想定される。
【００３０】
インタクトなフリンとプロタンパク質との共発現の他に、切断型フリンがプロタンパク質とともに発現された。フリン欠失変異型は、インビボで分泌型として共発現させると、酵素的に活性であることが示されている；かかる欠失変異型の酵素活性は、とりわけ、プロ第ＩＸ因子（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５，１９９３）およびプロｖＷＦ（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｂｌｏｏｄ ７９：２３４９−２３５５，１９９２）のプロセッシングにおいて検出され得た。フリン欠失変異型を用いた共発現実験により、該タンパク質の膜貫通部分と細胞質部分は、触媒機能に必須ではないことが示された（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８２３５−８２３９，１９９２）。
【００３１】
ＷＯ９１／０６３１４には、原核生物細胞および真核生物細胞におけるフリンの組換え発現、フリン融合タンパク質、欠失変異型および断片の調製、組換えにより調製されたフリンの精製、ならびにインビトロでのプロタンパク質のプロセッシングのための精製フリンの使用の潜在性が、一般的に開示されている。ＷＯ９２／０９６９８には、ＰＡＣＥ（フリン）の発現、不活性なタンパク質前駆体（例えば、プロｖＷＦなど）との共発現、ならびに融合タンパク質の調製が記載されている。Ｓｔｉｅｎｅｋｅ−Ｇｒｏｂｅｒら（ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２４０７−２４１４，１９９２）には、精製フリンによるインフルエンザウイルスＨＡタンパク質のインビトロ切断が記載されている。Ｄｅｃｒｏｌｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２２４０−１２２４７，１９９４）には、フリンによるＨＩＶ ｇｐ１６０のインビトロ切断が記載されている。
【００３２】
Ｃ末端が短縮されたフリンを用いた実験において、プロアルブミンおよび相補プロＣ３（Ｏｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９：１３５３−１３６１，１９９２）、炭疽毒素（Ｋｌｉｍｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０２７７−１０２８１，１９９２）、ジフテリア毒素（Ｔｓｕｎｅｏｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６４６１−２６４６５，１９９３）ならびにプロ第ＩＸ因子（Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６８，１９９３，Ｂｒｉｓｔｏｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１４１３６−１４１４３，１９９４）の切断が、インビトロで好成績で行なわれた。
【００３３】
したがって、本発明のｒＦｕｒｉｎは、上記のプロタンパク質のインビボおよびインビトロでのプロセッシングにおける使用が想定される。一態様において、本発明のｒＦｕｒｉｎは、プロＶＷＦおよびプロ第ＩＸ因子のインビトロプロセッシングに特に有用である。しかしながら、その使用は、前記タンパク質のプロセッシングに対する限定を解釈されるべきではない。さらなる態様において、本発明のｒＦｕｒｉｎは、組換えプロタンパク質のインビトロプロセッシングに特に有用である。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、プロｖＷＦとｒＦｕｒｉｎを発現する細胞の共培養である。
したがって、細胞培養上清み（ｓｕｐｅｒｎａｎｔａｎｔ）中のプロｖＷＦは、やはり細胞培養上清み中に存在するｒＦｕｒｉｎによってインビトロで切断されて活性形態となる。プロセッシングされたｖＷＦは、続いて、米国特許第６，２１０，９２９号（引用により本明細書に組み込まれる）に論考されているようにして培養液から単離され、精製される。共培養では、すべて共通の発現系を使用してもよく、プロｖＷＦとｒＦｕｒｉｎの発現に種々の系を互いに組み合わせてもよい。一態様において、同じ起源の宿主細胞内でプロｖＷＦとｒＦｕｒｉｎの両方が発現させる発現系が使用される。
【００３５】
用語「宿主細胞」は、形質転換された細胞、または核酸配列により形質転換され得、次いで対象の選択遺伝子を発現し得る細胞をいうために用いる。該用語は、親細胞の子孫を包含する（選択遺伝子が存在している限り、該子孫が元の親と形態構造または遺伝子構成が同一であっても、そうでなくても）。
【００３６】
本発明は、組換えタンパク質作製のための当該技術分野で知られた任意の宿主細胞または宿主を包含する。したがって、本発明における細胞は、任意の供給源に由来するものであり得る。一態様において、本発明は、真核生物および原核生物の宿主細胞を包含する。別の態様では、本発明は、植物細胞、動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、および酵母細胞を包含する。一態様において、例示的な酵母細胞としては、ピキア属（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびサッカロミセス属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ならびにＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋ．Ｚａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ、Ｋ．ｔｈｅｒｎｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；Ｋ．ｙａｒｒｏｗｉａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｔｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、ハンセヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、トルロプシス属、およびロドトルラ属が挙げられる。例示的な昆虫細胞としては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａおよびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ならびにショウジョウバエ属が挙げられる。
【００３７】
さらなる態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、一次上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）ならびに確立された細胞株およびその諸系統（例えば、２９３胚性腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ頸上皮細胞およびＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞、ＨｅＬａ ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ １８０細胞、ＬＳ １７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、クローンＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、ならびにＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、もしくはその誘導体細胞）、任意の組織または器官（例えば、限定されないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細管）、リンパ系組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、および血液）、脾臓由来の線維芽細胞、ならびに線維芽細胞株および線維芽様細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５７３細胞、ＨＥＬ ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ．ｓｕｂ．３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、２０７１系統（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ系統（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃ．ｓｕｂ．ｌｌ細胞、ならびにＪｅｎｓｅｎ細胞、またはその誘導体細胞）である。
【００３８】
例示的な哺乳動物細胞としては、さまざまなＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ−２９３、ＮＳ０、ＹＢ２／３、ＳＰ２／０細胞、およびヒト細胞（ＰＥＲ−Ｃ６またはＨＴ１０８０など）、ならびにＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｓａｏｓ、ＰＣ−１２、ＨＣＴ １１６、Ｌ９２９、Ｌｋｔ−、ＷＩ３８、ＣＶ１、ＴＭ４、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＭＭＴ、白血病細胞、胚性幹細胞または受精卵細胞が挙げられる。本発明の一態様において、例示的な宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本発明のさらなる態様において、ＣＨＯ細胞を浮遊培養するための培地が使用される。
【００３９】
宿主細胞は、当該技術分野で知られたさまざまな様式で、例えば限定されないが、所望のタンパク質をコードする外来核酸の挿入（任意選択で、発現ベクターの一部として）、所望のタンパク質をコードする宿主細胞の内在遺伝子の発現の増大が引き起こされるような外来発現制御配列の挿入、または所望のタンパク質をコードする内在遺伝子の発現を増大させる宿主細胞の内在発現制御配列（１つもしくは複数）の活性化によって、タンパク質を発現するように操作されたものであってもよい。
【００４０】
宿主細胞の培養物は、当該技術分野で知られた任意の方法に従って調製され得、かかる宿主細胞の培養方法および該細胞によって産生された組換えタンパク質の回収方法（該細胞から、または培養培地からのいずれであれ）は、当該技術分野で知られている。かかる培養方法は、培養培地に、タンパク質産生の化学的誘導因子を添加することを伴うものであり得る。例示的な宿主細胞および手順を後述する。
【００４１】
フリンポリペプチドをコードする核酸は、適切な発現ベクター内に、標準的な分子生物学的手法を用いて挿入される。一態様において、該核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＡＸ０２１１１（米国立バイオテクノロジー情報センター、米国立医学図書館、ベテスダ、ＭＤ）に示されたヒトフリンポリペプチドをコードするものであるが、当業者には、フリンの生物学的活性、すなわち、プロＶＷＦを切断して成熟ＶＷＦを生成させる能力を有する任意のタンパク質が本明細書に記載の方法によって作製され得ることが認識されよう。さらなる態様において、Ｃ末端が切断された完全分泌型ｒＦｕｒｉｎを、シスチンリッチドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むアミノ酸５７８〜７９４をコードするヌクレオチドを欠失させることにより設計した。なおさらなる態様において、精製プロセスを補助するためにアミノ酸テイルを付加してもよい。また別の態様では、１０ヒスチジン残基テイルを、アミノ酸５７７（フレキシブルリンカーとしての機能を果たす介在する４グリシン残基伴う、または伴わない）の後ろに付加した。
【００４２】
発現ベクターには、任意選択で、プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のリーダー配列またはシグナル配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入のためのポリリンカー領域、および／または選択可能マーカーエレメントを含めてもよい。これらの各配列は、後で論考する。
【００４３】
任意選択で、ベクターに「タグ」コード配列（すなわち、フリンポリペプチドコード配列の５’または３’末端に存在させたオリゴヌクレオチド配列；該オリゴヌクレオチド分子はポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）をコードする）を含めてもよく、市販の抗体を存在させるための別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃなどを含めてもよい。このタグは、典型的には、該ポリペプチドを発現させると該ポリペプチドに融合されており、宿主細胞からのフリンポリペプチドの検出またはアフィニティ精製のための手段としての機能を果たし得る。
【００４４】
好適なベクターとしては、限定されないが、コスミド、プラスミド、または修飾ウイルスが挙げられるが、ベクター系は、選択した宿主細胞と適合性でなければならないことは認識されよう。一態様において、ベクターはプラスミドである。さらなる態様では、プラスミドはｐＵＣ系クローニングベクターである。本発明において使用され得る他のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、配列決定ベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。本発明で想定されるベクターとしては、限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、ファージミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物（細菌など）；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）でトランスフェクトした、または細菌ｌ発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；さらには動物細胞系が挙げられる。
【００４５】
哺乳動物系発現ベクターは、典型的には、複製起点、適当なプロモーター、また、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、必要とされる発現制御エレメントを提供するために使用され得る。例示的な真核生物系ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、およびｐＶＩＴＲＯ３が挙げられる。
【００４６】
核酸は宿主細胞内に、当該技術分野で知られた任意の手段によって、例えば、ＤＮＡのリポソーム媒介性導入、受容体媒介性導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、塩化カルシウム、リン酸カルシウム沈降、微粒子ボンバードメント、ウイルスベクターでの感染、リポフェクション、トランスフェクション、または相同組換えによって導入することができる。
【００４７】
用語「形質転換された」または「トランスフェクトされた」は、本明細書で用いる場合、宿主細胞が外来ポリヌクレオチドを含むように変更されていることをいい、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体内に組み込まれてもよく、エピソームエレメントとして維持されてもよい。提供する本方法の一部の特定の態様では、宿主細胞が「トランスフェクション工程」においてトランスフェクトされることが想定される。該方法は、多数回のトランスフェクション工程を含むものであってもよい。また、宿主細胞内への外来ポリヌクレオチドの導入のための当該技術分野で知られた他の方法、例えば、手法的には「形質転換」でないエレクトロポレーションおよび細胞融合なども、本記載の解釈上、用語「形質転換」定義に含まれる。
【００４８】
また、本発明は、宿主細胞を、ｒＦｕｒｉｎタンパク質発現がもたらされる条件下で培養するため、すなわち増殖させるための方法を提供する。かかる方法は、宿主細胞によって産生されたｒＦｕｒｉｎを培養培地から回収する工程を含む。例示的な態様において、宿主細胞を、化学的に規定される無血清培地中で増殖する。血清は、生化学的に規定されない物質であり、充分に特定されていない多くの成分を含み、ロットごとに異なり、かつ多くの場合、微生物（ウイルスおよびマイコプラズマなど）が混入しているため、ｒＦｕｒｉｎの組換え生成物中に血清が存在することは望ましくない。さらに、培養培地中に血清中の動物性タンパク質が存在すると、長時間の精製手順が必要となり得る。
【００４９】
したがって、本発明は、ヒトフリン遺伝子で組換えによりトランスフェクトした細胞を培養するための、本質的に動物性タンパク質を含まない生物化学的に規定される培養培地を提供する。培地の成分は、たいてい、無機、合成または組換えであり、したがって、任意の動物源から直接得られるものではない。
【００５０】
本発明の細胞培養培地は、１種類以上の置換性（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）化合物を含むものであり得る、金属結合性化合物であり得る１種類以上の置換性化合物を含むものであり得る、および／または１種類以上の置換性化合物を含む１種類以上の複合体を含むものであり得る。一部の実施形態において、培地は、１種類以上の置換性化合物（金属結合性化合物であり得る）と複合体形成される１種類以上の遷移元素またはその塩もしくはイオンを含む１種類以上の複合体を含むものであり得る。一部の実施形態において、培地は、インビトロでの細胞の培養を補助することができ、培養細胞のトランスフェクションを可能にするものであり得る。
【００５１】
本発明の一態様によれば、遷移元素は、好ましくは、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルビジウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、およびアクチニウム、またはその塩もしくはイオンからなる群より選択され、好ましくは鉄塩である。好適な鉄塩としては、限定されないが、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３もしくはＦｅＳＯ４またはＦｅ＋＋＋もしくはＦｅ＋＋イオンを含有する他の化合物が挙げられる。
【００５２】
培地中の金属結合性化合物としては、遷移元素と相互作用または結合し、細胞によるその取込みを助長し得る任意の巨大分子が挙げられる。かかる相互作用／結合は、性質が共有結合性であっても非共有結合であってもよい。本発明のこの態様に使用される金属結合性化合物は、好ましくは、ポリオール、ヒドロキシピリジン誘導体、１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−テトラメチレンホスホン酸、トリスクシン、酸性の糖（例えば、グルコン酸第１鉄）、グリコサミノグリカン、ジエチレントリアミン五酢酸、ニコチン酸−Ｎ−オキシド、２−ヒドロキシ−ニコチン酸、一−、二−もしくは三置換２，２’−ビピリジン、ヒドロキサム酸誘導体（例えば、アセトヒドロキサム酸）、アミノ酸誘導体、デフェロキサミン、フェリオキサミン、鉄塩基性ポルフィンおよびその誘導体、ＤＯＴＡ−リシン、テキサフィリン、サフィリン、ポリアミノカルボン酸、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリエチレンカルバメート、エチルマルトール、３−ヒドロキシ−２−ピリジン、ならびにＩＲＣ０１１からなる群より選択される。一態様において、金属結合性化合物はポリオール、例えば、ソルビトールまたはデキストランなど、特にソルビトールである。関連する態様において、金属結合性化合物はヒドロキシピリジン誘導体、例えば、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、３−ヒドロキシ−４−ピロン、３−ヒドロキシピリド（ｐｙｐｙｐｙｒｉｄ）−２−オン、３−ヒドロキシピリド−２−オン、３−ヒドロキシピリド−４−オン、１−ヒドロキシピリド−２−オン、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリド−４−オン、１−メチル−３−ヒドロキシピリド−２−オン、３−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−ピリジノン、エチルマルトールまたはピリドキサルイソニコチニルヒドラゾンなどである。また、本発明の金属結合性化合物は、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋などの二価のカチオンに結合するものであってもよい。
【００５３】
本発明の培養培地には、アデニン、エタノールアミン、Ｄ−グルコース、ヘパリン、緩衝剤、ヒドロコルチゾン、インスリン、リノール酸、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、トリ−ヨードサイロニン、チミジン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−システイン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋＋−パントテン酸、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、プルロニックＦ６８、組換えインスリン、カルシウム塩、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＫＣｌ、マグネシウム塩、マンガン塩、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、セレン塩、ケイ素塩、モリブデン塩、バナジウム塩、ニッケル塩、スズ塩、ＺｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４または他の亜鉛塩からなる群より選択される１種類以上の成分が含まれ得、この場合、各成分は、インビトロ細胞培養が補助される量で添加される。
【００５４】
別の態様において、本発明の培養培地には、任意選択で、さらに１種類以上のサイトカイン、ダイズペプトン、１種類以上の酵母ペプチドおよび１種類以上の植物性ペプチド（最も好ましくは、米、アロエ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、マメ、スカッシュ、ホウレンソウ、ニンジン、イモ、サツマイモ、タピオカ、アボカド、オオムギ、ココナッツおよび／またはサヤインゲンの１種類以上、および／または１種類以上の他の植物）からなる群より選択される１種類以上の補給物を含めてもよく、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１８２５５（ＷＯ９８／１５６１４として公開）を参照のこと。
【００５５】
また、本発明の培養培地には、任意選択で、至適ｐＨを維持するための１種類以上の緩衝剤を含めてもよい。好適な緩衝剤としては、限定されないが、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、重炭酸塩および細胞培養適用用途における使用のための適当な他の緩衝剤が挙げられる。好適な緩衝剤は、培養細胞に対して実質的な細胞傷害性なく緩衝能をもたらすものである。適当な緩衝剤の選択は、細胞培養の技術分野の通常の技能の範囲内である。
【００５６】
上記の培地成分は、溶液中で一緒に混合されると、本発明の完全培養培地を形成する。完全培地は、本明細書においてより詳細に記載しているように、さまざまな哺乳動物細胞の培養における使用に適している。本明細書で得られる情報および当業者が有する知識に基づき、当業者は、必要以上に実験を行なうことなく、作業用の培地配合物を得ることができよう。
【００５７】
最初に、化学的に規定される無血清培地での増殖に適応させる前に、宿主細胞を、当業者には充分わかる標準的な培地で増殖してもよい。該培地は、通常、細胞の増殖と生存に必要なすべての栄養分を含有する。真核生物細胞の培養に好適な培地は、ロスウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート（ＲＰＭＩ）培地１６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、最小必須培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、およびＥｘＣｅｌｌ ３２５培地であり、これらにはすべて、培養対象の具体的な細胞株によって指示されるとおりに血清および／または増殖因子を補給してもよい。しかしながら、注目すべきことに、本発明は、次いで培地中の血清を培養液から除去し、無血清培地中で増殖することができる宿主細胞を得ることを提供する。したがって、本発明は、宿主細胞を、ｒＦｕｒｉｎの最大産生のための無血清条件下で培養するための至適培地を提供する。さらなる態様では、該細胞を無血清培地中で浮遊培養する。本発明の種々の培地の配合を、本明細書に記載の実施例に示す。
【００５８】
一態様において、形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物は、培地に対する補給物として添加される。使用される化合物は、宿主細胞を形質転換したプラスミド上に存在する選択可能マーカーエレメントによって決定される。通常動物細胞に対して毒性である特定の薬物に対して耐性を付与する選択可能マーカーが、本発明の方法および組成物において使用され得る。例えば、選択可能マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に添加される化合物はカナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、ジェネティシン、ネオマイシン、ゼオマイシン（ｚｅｏ）；プロマイシン（ＰＡＣ）；ブラストサイジンＳ（ＢｌａＳ）、およびＧＰＴが挙げられる。さらなる選択可能マーカーは、当該技術分野で知られており、本発明の組成物および方法に有用である。
【００５９】
また、所定の条件下で細胞生存をもたらすか、または細胞死を誘導する代謝酵素も、本発明の方法および組成物に使用することができる。例としては、限定されないが：ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）（これらは、それぞれ、ＴＫ、ＨＧＰＲＴまたはＡＰＲＴが欠損した細胞において使用され得る遺伝子である）が挙げられる。しかしながら、当業者には、本発明のｒＦｕｒｉｎ生成物に、本質的にこのような添加タンパク質は含まれないことが認識されよう。
【００６０】
該培地は、組換えタンパク質作製のための当該技術分野で知られた任意の宿主細胞または宿主を培養するために使用され得る。本発明の一態様において、例示的な宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本発明のさらなる態様において、該培地は、ＣＨＯ細胞を浮遊培養するために使用される。
【００６１】
対象の組換えタンパク質を宿主細胞によって培地中に分泌させる場合、数回の回収サイクルを通して同じ宿主細胞が使用され得るように、培地を定期的に回収してもよい。培養培地は、バッチプロセス（例えば、培養培地を単一のバッチ内の細胞に１回添加する）で添加してもよく、フィードバッチプロセス（少量バッチの培養培地を定期的に添加する）で添加してもよい。培地は、培養の最後に回収してもよく、培養中に数回回収してもよい。また、連続灌流生成プロセスも当該技術分野で知られており、培地への新鮮培地の連続供給をしつつ、反応器からの同容量の連続抜去を伴うものである。灌流培養は、一般的に、バッチ式培養よりも高い細胞密度で行なわれ、反復回収を伴って数週間または数カ月間維持され得る。したがって、ケモスタット培養およびバッチ式再供給（ｒｅｅｆｅｄ）培養は、ともにｒＦｕｒｉｎの製造に適しており、他の培養方法と同様、当該技術分野で知られている。
【００６２】
さまざまな培養系が当該技術分野で知られており、Ｔ字型フラスコ、攪拌振とうフラスコ、ローラーボトルおよび攪拌槽バイオリアクターが挙げられる。ローラーボトル培養は、一般的には、培地を一部充填して（例えば、最大容量の１０〜３０％）ゆっくり回転させたローラーボトル内に細胞を播種し、該細胞がボトルの側面に付着してコンフルエンシーまで増殖するのを可能にすることにより行なわれる。細胞培地を、上清みのデカンテーションによって回収し、新鮮培地と交換する。また、足場依存性細胞を、攪拌槽バイオリアクター内に浮遊状態で維持したマイクロ担体（例えば、ポリマースフィア）上で培養してもよい。あるいはまた、細胞を単一細胞懸濁物にて増殖してもよい。
【００６３】
宿主細胞によって産生されるｒＦｕｒｉｎの量は、当該技術分野で知られた標準的な方法を用いて評価され得る。かかる方法としては、限定されないが、ウエスタンブロット解析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、および／または活性のアッセイ（ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイなど）が挙げられる。また、本発明では、ｒＦｕｒｉｎの比生産性（タンパク質／細胞／日の量で表示）が、当該技術分野で知られた本明細書に記載の標準的な方法を用いて評価され得ることが想定される。
【００６４】
「実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎ」は、約０．１〜０．６ｎｇ タンパク質／単位フリン活性もしくはそれ未満の、または約２〜１１μｇ タンパク質／ｍＬもしくはそれ未満の範囲の濃度の宿主細胞タンパク質を含み、培養培地中の血清由来の夾雑タンパク質が本質的にないｒＦｕｒｉｎの調製物を包含すると規定する。一態様において、実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎは、約０〜０．４ｐｇ ＤＮＡ／単位フリン活性もしくはそれ未満の、または約０〜２４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬもしくはそれ未満の範囲の濃度の宿主細胞ＤＮＡを含み、培養培地中の血清由来の夾雑タンパク質が本質的にないｒＦｕｒｉｎの調製物を包含する。一態様において、ｒＦｕｒｉｎを発現する宿主細胞は、化学的に規定される無血清培地中で増殖される。あるいはまた、該細胞を、血清を含む培地中で増殖し、本明細書において提供した方法に従って精製してもよい。
【００６５】
ｒＦｕｒｉｎを発現する宿主細胞は、動物（ヒトを含む）由来の物質を含まない培地中で、ケモスタット条件下で浮遊培養する。細胞を濾過によって除去し、ｒＦｕｒｉｎ含有細胞培養上清みを限外濾過によって濃縮し、イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、少なくとも約１０００単位／ｍｌ、少なくとも約２０００単位／ｍｌ、少なくとも約３０００単位／ｍｌ、少なくとも約４０００単位／ｍｌ、少なくとも約５０００単位／ｍｌ、少なくとも約６０００単位／ｍｌ、少なくとも約７０００単位／ｍｌ、少なくとも約８０００単位／ｍｌ、少なくとも約９０００単位／ｍｌ、少なくとも約１００００単位／ｍｌ、少なくとも約１５０００単位／ｍｌ、少なくとも約２００００単位／ｍｌ、少なくとも約２５０００単位／ｍｌ、少なくとも約３００００単位／ｍｌ、少なくとも約３５０００単位／ｍｌ、少なくとも約４００００単位／ｍｌ、少なくとも約４５０００単位／ｍｌ、少なくとも約５００００単位／ｍｌ、少なくとも約５５０００単位／ｍｌ、少なくとも約６００００単位／ｍｌ、少なくとも約６５０００単位／ｍｌ、少なくとも約７００００単位／ｍｌ、少なくとも約７５０００単位／ｍｌ、少なくとも約８００００単位／ｍｌ、少なくとも約８５０００単位／ｍｌ、少なくとも約９００００単位／ｍｌ、少なくとも約９５０００単位／ｍｌ、少なくとも約１０００００単位／ｍｌ、少なくとも約１２００００単位／ｍｌ、少なくとも約１４００００単位／ｍｌ、少なくとも約１６００００単位／ｍｌ、少なくとも約１８００００単位／ｍｌ、少なくとも約２０００００単位／ｍｌ、少なくとも約５０００００単位／ｍｌ、および５０００００Ｕ／ｍｌ超に至る活性を有するｒＦｕｒｉｎの溶液を得る。
【００６６】
別の態様において、本発明の組換えフリンの精製溶液は、少なくとも約１０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約２０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約３０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約４０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約６０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約７０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約８０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約９０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１２０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１４０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１６０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約１８０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約２００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約２５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約３００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約３５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約４００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約４５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約５００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約５５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約６００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約６５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約７００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約７５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約８００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約８５０Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約９００Ｕ／μｇタンパク質、少なくとも約９５０Ｕ／μｇタンパク質、および少なくとも約１０００Ｕ／μｇタンパク質の比活性を有する。
【００６７】
別の実施形態において、本発明におけるｒＦｕｒｉｎの精製溶液に含まれる宿主細胞タンパク質は、約２０．０μｇ／ｍｌ未満、約１９．０μｇ／ｍｌ未満、約１８．０μｇ／ｍｌ未満、約１７．０μｇ／ｍｌ未満、約１６．０μｇ／ｍｌ未満、約１５．０μｇ／ｍｌ未満、約１４．０μｇ／ｍｌ未満、約１３．０μｇ／ｍｌ未満、約１２．０μｇ未満／ｍｌ、約１１．０μｇ未満／ｍｌ、約１０．５μｇ未満／ｍｌ、約１０．０μｇ／ｍｌ未満、約９．５μｇ／ｍｌ未満、約９．０μｇ／ｍｌ未満、約８．５μｇ／ｍｌ未満、約８．０μｇ／ｍｌ未満、約７．５μｇ／ｍｌ未満、約７．０μｇ／ｍｌ未満、約６．５μｇ／ｍｌ未満、約６．０μｇ／ｍｌ未満、約５．５μｇ／ｍｌ未満、約５．０μｇ／ｍｌ未満、約４．５μｇ／ｍｌ未満、約４．０μｇ／ｍｌ未満、約４．０μｇ／ｍｌ未満、約３．５μｇ／ｍｌ未満、約３．０μｇ／ｍｌ未満、約２．５μｇ／ｍｌ未満、約２．０μｇ／ｍｌ未満、約１．５μｇ／ｍｌ未満、約１．０μｇ／ｍｌ未満、約０．５μｇ／ｍｌ未満、約０．４μｇ／ｍｌ未満、約０．３μｇ／ｍｌ未満、約０．２μｇ／ｍｌ未満、約０．１μｇ／ｍｌ未満、および約０μｇ／ｍｌの濃度である。
【００６８】
別の態様において、本発明におけるｒＦｕｒｉｎの精製溶液に含まれる宿主細胞タンパク質は、約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．９５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．９０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、０．８５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．８０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．７５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．７０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．６５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．６０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．５５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．５０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．４５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、０．４０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．３５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．３０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．２５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．２０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．１５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．１０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０５ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０４ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０３ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０２ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、約０．０１ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ未満、および約０ｎｇ タンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎの濃度である。
【００６９】
以下の本明細書における実施例には、ｒＦｕｒｉｎの産生にＣＨＯ宿主細胞を用いた発明を示すが、当業者には、任意の宿主細胞型が、本発明のｒＦｕｒｉｎの産生に同様に適合され得ることが認識されよう。ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質の産生に広く使用されており、操作したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ細胞株を産生物の遺伝子と選択可能マーカー遺伝子でトランスフェクトしたもの）を、血清含有培養培地中で常套的に増殖する。しかしながら、血清の使用はいくつかの問題を呈する。血清は、高価な商品であり、商業的作製に必要とされる量で容易に入手可能ではない。また、血清は、生化学的に規定されない物質であり、充分に特定されておらず、かつ作用も測定されていない多くの成分を含む。したがって、血清はバッチごとに異なり、場合によっては、種々の該成分のレベルおよび細胞に対するその効果を調べるための試験が必要とされる。
【００７０】
また、血清は、多くの場合、ウイルスおよびマイコプラズマなどの微生物（その多くは無害であり得るが、それでもさらなる未知因子を構成する）が混入している。さらに、培養培地中に動物性タンパク質が存在すると、長時間の精製手順が必要となり得る。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中にウシ抗体が存在すると、組換えＣＨＯ細胞株によって発現された所望の抗体の精製が極めて困難になる。使用前に培地からウシ抗体を除去することは可能であるが、この除去および除去後に必要とされるさらなる生成物の試験は、該生成物の作製のコストを大きく増大させる。そのため、細胞（特にＣＨＯ細胞の）増殖を補助する動物性成分無含有培養培地を使用することは有益である。ＣＨＯ細胞は無血清条件では容易に増殖しないが、本発明は、無血清条件下でのＣＨＯ細胞増殖によるｒＦｕｒｉｎを提供する。
【００７１】
また、操作されたＣＨＯ細胞は、浮遊状態で増殖することが困難である。ｒＦｕｒｉｎなどの産物を発現させるために細胞を使用する場合、浮遊状態での増殖を行なうことが非常に望ましい。商業規模でのかかる生物学的タンパク質の生成のためには、相当な大きさの発酵槽内での増殖を補助できることが望ましい。また、適当な培地には、大量生成条件で増殖され得るように細胞を補助することが必要とされる。かかる適当な培地は、本明細書に記載の実施例に示している。当業者には、当該技術分野における任意の細胞培養方法が、本発明に示したｒＦｕｒｉｎを含む宿主細胞の培養に使用され得ることが認識されよう。培養方法の非限定的な例は、本明細書に記載の実施例に示している。
【００７２】
また、本発明は、細胞を無血清培地中で増殖した後に行なわれる、ＣＨＯ細胞タンパク質をｒＦｕｒｉｎから除去するための精製方法を提供する。当業者には、当該技術分野で知られた任意のタンパク質精製方法が、培養培地からのｒＦｕｒｉｎの精製に使用され得ることが認識されよう。精製方法の非限定的な例は、本明細書に記載の実施例に示している。したがって、あらゆる動物源タンパク質を本質的に実質的に含まないｒＦｕｒｉｎが作製され得る。実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎは、任意選択で、使用時まで凍結保存される。
【実施例】
【００７３】
実施例
本発明のさらなる態様および詳細は、以下の実施例から自明であろう。実施例は、限定ではなく例示を意図するものである。実施例１には、ｒＦｕｒｉｎ発現プラスミドの構築および宿主細胞のトランスフェクションを記載する；実施例２には、ｒＦｕｒｉｎ発現ＣＨＯ細胞クローンの無血清条件での増殖への適応プロセスを記載する；実施例３には、動物性タンパク質無含有培地中でのｒＦｕｒｉｎ製造のための最適化プロセスを記載する；実施例４には、ｒＦｕｒｉｎの精製を記載する；実施例５は、下流処理（濃縮および精製）ならびに大規模生成ｒＦｕｒｉｎの解析を示す；実施例６は、宿主細胞バンクの品質の測定および維持のために行なわれる安全性、無菌性および安定性の試験を示す。
【００７４】
実施例１：
組換えフリン発現プラスミドの構築および宿主細胞のトランスフェクション
＃５５６と表示するｒＦｕｒｉｎ発現プラスミドを構築するために使用したフリン前駆プラスミドの詳細説明を表１に示す。構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で発現させると、成熟ｒＦｕｒｉｎは、触媒ドメイン、Ｐドメイン、および小さなシスチンリッチドメイン部分を含むが、アミノ酸５７７のＣ末端の側に存在する領域は除去され、充分な活性プロテアーゼの分泌がもたらされる。
【００７５】
選択プラスミドとして使用したＤＨＦＲ−ベクターの構築の説明を表２に示す。安定発現ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ細胞クローン（＃４８８−３および＃２８９−２０で表示）の開発のため、機能性内在ＤＨＦＲ遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を、リン酸カルシウム共沈降を使用し、プラスミド＃５５６と＃７３でコトランスフェクトした。高レベルのｒＦｕｒｉｎを分泌するクローンを、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ選択系を用いた数回のサブクローニング／増幅にて選択した。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ＤＨＦＲ培地（ＤＭＥＭ ＮＵＴ ＭＩＸ Ｆ１２（１：１）、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンなし、Ｈｅｐｅｓ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシンを補給、５％または１０％の透析済γ照射ＦＢＳ（＝５％ＤＨＦＲ、１０％ＤＨＦＲ）を有するように構成）中で増殖した。透析済γ照射ＦＢＳは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（解析、起源および照射に関する充分な説明の証明書付き）から購入した。γ−トリプシン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の調製は、Ｂａｘｔｅｒ（オルト，オーストリア）の培地調製／ＰＣＣ部門によって行なわれた。
【００７８】
ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃４８８−３の作製の系図を図２に示す。クローンＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ ＃４８８−３は、１０％ＤＨＦＲ選択培地中で２回のサブクローニングを行なった後、１００ｎＭ ＭＴＸを補給した選択培地中での増幅を行なった（このとき、１回のサブクローニングは、未変更ＭＴＸ濃度を含有する培地中で行なった）初期クローンから得た。クローン＃４４８−３は、凍結のために拡大培養した。ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃２８９−２０も同様にして調製および拡大培養した。しかしながら、クローン＃２８９−２０は、クローン＃４８８−３由来の後続クローンである。ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃２８９−２０の作製の系図を図３に示す。
【００７９】
Ｆｕｒｉｎ活性を、無血清ＤＨＦＲ培地中で２４時間培養したクローンの馴化培地中で測定した。高フリン活性（Ｕ／１０６細胞／２４時間）を示した細胞クローンを選択した。選択した高産生細胞クローンを、凍結ストックアンプルの調製用に拡大培養し、次の回のクローニングのために分割するために使用した。高産生細胞クローンの単離および同定を行なった。Ｃａｓｙ細胞計数器を用いて細胞密度を解析した。２００〜３００Ｕ／１０６細胞／２４時間に至るまでのＦｕｒｉｎ発現レベルが、クローン＃４８８−３で得られた。クローン＃２８９−２０では、４００Ｕ／１０６細胞／２４時間に至るまでのＦｕｒｉｎ発現レベルが得られた。
【００８０】
実施例２：
組換えフリン発現細胞クローンの無血清条件での増殖への適応
細胞株の適応および選択のストラテジーは、段階的な希釈にて徐々に、または急激にのいずれかによって、細胞株を血清とタンパク質を含まない細胞株に適応させることである。この試験の目的は、無血清条件下で増殖され、安定的にｒＦｕｒｉｎを産生するＣＨＯ細胞集団を見い出すことであった。ＣＨＯ細胞クローン＃４８８−３を出発材料として使用した。ｒＦｕｒｉｎ発現細胞クローンＣＨＯ ＃４８８−３を、パラレルで実施した以下に詳細に示す３つの適応において、無血清条件に変更した。
【００８１】
血清枯渇プロセスは、スピナーフラスコにおいて開始し、適応相内の細胞を引き止める（ｈｏｌｄ ｂａｃｋ）手段を見い出すためのマイクロ担体を使用した（該相では細胞は通常、低速増殖を示すため）。この方法を使用することにより、その後の培地交換時、増殖が抑制され得るような濃度まで細胞が希釈されるのを回避することが可能であった。
【００８２】
３種類の異型の内部開発培地ＢＡＰ、ＢＡＳおよびＢＣＳ（表３に示す）を、この試験過程に使用した。
【００８３】
【表３】
それぞれの実験の目的に応じて、これらの培地異型に、表４に示すような異なる補給物を供給した。
【００８４】
【表４】
以下の表は、この試験過程で使用した培地と試薬の概要を示す。表５に、プレマスター細胞バンククローンＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４の確立に使用した培地と試薬を要約する。
【００８５】
【表５】
表６に、サブクローニング過程、ならびにサブクローン＃４８８−３／ＣＪ０６−１９／５Ｆ１０（５Ｆ１０）および＃４８８−３／ＣＪ０６−１９／１Ｅ８（１Ｅ８）の対応する評価細胞バンク（ＥＣＢ）の確立に使用した培地と試薬を要約する。
【００８６】
【表６】
培地に添加したすべての補給物のロット番号は、対応する培地の適切な製造プロトコルを参照している。他の培地添加物を表７に示す。
【００８７】
【表７】
無血清条件に対する適応は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）からの細胞の分離による細胞保持（遠心分離など）とともに、Ｔ字型フラスコまたはスピナーフラスコにおいて行なった。
【００８８】
Ｔ字型フラスコ内の浮遊培養物を、３６±２℃および７．５±１．０％ＣＯ２でインキュベートした。スピナーフラスコ内での培養は、ＴｅｃｈｎｅスピナーフラスコおよびＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で、担体なしで３６±２℃にて、それぞれ、８０ｒｐｍおよび１３０ｒｐｍで行なった。
【００８９】
無血清培地条件への適応後のＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ細胞クローン＃４８８−３のサブクローニングにより、無血清内部開発培地中で浮遊状態で増殖され、安定的にｒＦｕｒｉｎを大量に産生するＣＨＯ細胞クローンが得られた。この手順は、限定希釈法に基づくものであった。簡単には、細胞懸濁物を、１００μｌの懸濁物が１つの細胞を含むように希釈した。９６ウェルプレートのウェルに、この懸濁物１００μｌを充填した。理論的には、各ウェルに、クローン生成用の１つの細胞が含まれる。これらの単一細胞が増殖を開始するにつれて、クローンが生成される。したがって、新たに生成した細胞はいずれも、ウェル内の最初の元の細胞に遡ることができる。このクローンを２４ウェルプレート内で、次いでＴ２５フラスコ内で、次いでＴ７５フラスコ内で、次いでＴ１７５フラスコ内で拡大培養した。
【００９０】
培養中、増殖条件をモニターするため、およびｒＦｕｒｉｎ発現を測定するために、プロセス内制御（ｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＩＰＣ）を行なった。Ｃａｓｙ装置を用いて培養中の細胞密度を測定した。Ｎｕｃｌｅｏ計数装置を、ＣＴＸ抽出後の細胞核の検出に適用した。細胞密度および解凍後のバイアビリティの測定は、トリパンブルー排除法を用いて行なった（血球計を使用）。また、細胞密度とバイアビリティを、自動トリパンブルー排除法を使用することによっても解析した（Ｃｅｄｅｘ装置によって実施）。
【００９１】
細胞培養物の上清みを使用し、発現されたｒＦｕｒｉｎの量および活性を調べた。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を使用し、所与の細胞集団における非産生細胞に対する産生細胞の比を調べた。細胞の形態構造および増殖挙動を、光学的制御によって調べた。また、培地条件のモニター（ｐＨ値ならびにグルコース、グルタミン、乳酸およびアンモニウムの残留濃度の測定など）のためにも、細胞培養物の上清みも調べた。これらの解析は、ＮＯＶＡ装置によって行なった。
【００９２】
この試験過程では、２種類のプレマスター細胞バンク（ＰＭＣＢ）ＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４を作製し、以下に示す２つの細胞クローン株を確立した。また、評価細胞バンク（ＥＣＢ）（表１５参照）も作製した。
【００９３】
ＰＭＣＢ＃０１の調製およびＱＣ試験
ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ ＃４８８−３（ＥＣＢ＃０１）のバイアルの１つを、添加物（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅ）ならびに５％ＦＢＳを含有するＢＡＳ培地中で解凍した。細胞は、Ｔ１７５内で５日間培養した細胞であった。次いで、細胞を、以下に示すようにして無血清条件に適応させた。
【００９４】
細胞を、０．２ｇ／ｌの５％ＦＢＳを含有する１５０ｍｌの増殖培地（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅを含むＢＡＳ）中で調製した。無血清条件への適応にＣｙｔｏｐｏｒｅ ２担体を使用した。約２．０×１０５細胞／ｍｌの開始細胞密度がもたらされるように５日齢の細胞懸濁物を播種すると、細胞が最初の数時間以内に該多孔質担体に付着した。したがって、細胞はスピナーフラスコ内に維持され、その間、増殖培地を交換し、血清濃度を２工程で５％から３．８％から第０５日に０％まで低下させた。続く培養期間中に、細胞は無血清培地条件に適応状態となった。細胞は担体表面から剥離し、浮遊状態で増殖が継続された。懸濁細胞の細胞密度およびバイアビリティは、連続的に増大した。２〜３日ごとに、懸濁細胞を１：２の比で分割した。
【００９５】
次いで、評価細胞バンク（ＥＣＢ）を調製した。培養の第２８日目、６０％より高いバイアビリティを有する細胞を新たな実験に移行させた。培養物は、担体なしのＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内にて２００〜３００ｍｌのＢＡＳ培地（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅを含む）中で増殖した。測定されたＣＡＳＹ細胞密度に従い、浮遊培養物を、２〜３日ごとに開始細胞密度である約２．０×１０５細胞／ｍｌに分割した。１６日後、細胞培養物が８０％より高いバイアビリティに達したとき、６つのバイアルの細胞からなる評価細胞バンク（ＥＣＢ）を作製した。
【００９６】
ＥＣＢのバイアルの１つを新たな実験において解凍した。細胞を４日間、Ｔ１７５内で、Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、ＦｅおよびＺｎを含むＢＡＳ培地中で増殖した。次いで、細胞を、６００ｍｌまでのＢＡＳ培地をＰｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、ＦｅおよびＺｎとともに入れたＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコに移した。この場合も、２〜３日ごとに、 浮遊培養物を、開始細胞密度である約２．０×１０５細胞／ｍｌに分割した。培養の第１３日目、２０個のバイアルからなるＰＭＣＢ＃０１の調製のために、１４３ｍｌの細胞懸濁物を取り出した。細胞を拡大培養し、ＰＭＣＢ＃０１に対して品質管理試験を行なった。
【００９７】
ＰＭＣＢ＃０４の調製およびＱＣ試験
ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ ＃４８８−３（ＥＣＢ＃０１）のバイアルの１つを、Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、Ｆｅおよび５％ＦＢＳを含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ＢＡＳ培地中で解凍した。６日齢の培養物の半量を、無血清条件への適応のための新たな実験に移行させた。
【００９８】
ここでは、無血清条件への適応を段階的に行なうのではなく、急激に行なった。Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコに、ＦＢＳも担体も含まないＢＡＳ培地（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅの添加を伴う）を調製した。細胞を約２．５×１０５細胞／ｍｌの開始細胞密度で播種した。急激な無血清条件のため、細胞の倍加時間は、かなり低いレベルまで減少した。場合によっては増殖が抑制され得るような濃度まで細胞が希釈されるのを回避するため、細胞懸濁物をスピンダウンすることにより培地を交換した。細胞ペレットを新鮮増殖培地中に再懸濁させた。細胞密度が４．０×１０５細胞／ｍｌより大きくなったとき、培養物の分割を行なった。培養の第１５日目に約５０％の最小バイアビリティに達した後、細胞の回収を開始し、培養の第３２日目（当日を含む）から、バイアビリティは８５〜９０％まで増大した。培養の第６１日目、適応細胞を、１５個のバイアルからなるＥＣＢとして凍結させた。
【００９９】
ＥＣＢのバイアルの１つを新たな実験において、Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、ＳｙｎｐおよびＦｅを含む無血清ＢＡＳ培地中で解凍した。培養物をＴ１７５フラスコ内で７日間培養した後、Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコに移し、そこで、細胞をさらに２日間増殖した。次いで、Ｚｎの添加を試験した。約１００ｍｌの遠心分離した細胞懸濁物を、Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、ＦｅおよびＺｎを含有する無血清ＢＡＳ培地中に再懸濁させた。この懸濁物をＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で培養した。測定されたＣＡＳＹ細胞密度に従い、２〜３日ごとに、浮遊培養物を、開始細胞密度である約２．０×１０５細胞／ｍｌに分割した。
【０１００】
播種材料の調製のため、およびＰＭＣＢ＃０４の作製のための大量の均一な細胞懸濁物を生成させることができるようにするため、細胞培養を、Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で１０００ｍｌまでスケールアップした。培養の第０２日目、４６５ｍｌの細胞懸濁物を使用し、２０個のアンプルからなるＰＭＣＢ＃０４を作製した。細胞を拡大培養し、ＰＭＣＢ＃０４に対して品質管理試験を行なった。
【０１０１】
図４は、ＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４の細胞集団におけるｒＦｕｒｉｎ産生細胞のグラフによる分布の比較を示す。ＰＭＣＢ＃０４の細胞の８０．７４％がｒＦｕｒｉｎを発現している。ＰＭＣＢ＃０１の細胞の７４．０６％がｒＦｕｒｉｎを発現している。
【０１０２】
次いで、ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎ ＃４８８−３ サブクローンＣＪ０６−１９／５Ｆ１０およびＣＪ０６−１９／１Ｅ８を作製した。ＣＨＯ／ｒＦｕｒｉｎクローン＃４８８−３のアンプルを解凍し、培養物をＴ１７５フラスコ内で継代した。培養の第１７日目、各々に５％ＦＢＳを含めた３種類の異なる培地、ＢＡＰ培地（Ｂａｘｔｅｒによって開発）、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏによって供給）およびＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ（ＪＲＨによって供給）を試験した。Ｔ１７５フラスコ内での増殖の４日後、ＥｘＣｅｌｌ培地中で増殖した細胞は、無血清条件に適応した。
【０１０３】
細胞を少数回の工程で血清から分離した。全手順は３回の実験に及んだ。まず、足場依存性細胞を最初に、Ｔ１７５フラスコ内にて、５％ＦＢＳ含有ＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ中で培養した。次いで、血清を、培養の第１３日目に０．５％までゆっくりと減少させた。次の１３日間の培養中、２回の分割を行ない、このとき、血清濃度を０．２５％までさらに減少させると、バイアビリティは７０％より低くなるまで低下した。細胞は足場依存性挙動を失い、だんだんと球形状を示し、浮遊状態での増殖が開始された。
【０１０４】
血清低減の最後の工程は、Ｔｅｃｈｎｅスピナーフラスコ内にて、０．２５％ＦＢＳを含有し、担体を含まないＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で行なった。２３日間の培養期間後、血清濃度は０％に達した。細胞を分割し、関連するすべてのパラメータが所定の範囲に維持されるように培養した。細胞密度は０．１５〜０．９×１０６細胞／ｍｌに移動した。バイアビリティは、最初の週の間に４０％未満に低下したが、次いで９０％より高い値に戻った。培養の第４２日目、適応細胞を凍結させ、２０個のバイアルからなるＥＣＢ／ＣＪ０６−２０とした。
【０１０５】
次いで、細胞をサブクローニングした。細胞懸濁物を事前に条件付けしたＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯで、１００μｌの懸濁物が理論的に０．５〜１．０個の細胞を含むように希釈した。このサブクローニング実験では、５つの９６ウェルプレートに、ウェル１つあたりこの細胞懸濁物１００μｌを充填した。細胞播種の翌日、ウェルを単一細胞について顕微鏡下で調べた。１つの細胞を含むウェルに印を付け、さらに観察した。事前に条件付けしたＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯの添加および交換は、必要時に行なった。次の２週間の間に細胞が死滅した場合、または細胞分裂がない場合、当該ウェルを実験から除外した。
【０１０６】
２つの単一細胞が増殖を示した。適切な大きさに達した進化クローンを２４ウェルプレートのウェルの１つに移した。また、ここで、事前に条件付けしたＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯの交換も、増殖および培養物の必要性に応じて行なった。サブクローンＣＪ０６−１９／５Ｆ１０およびＣＪ０６−１９／１Ｅ８を、それぞれ、培養の第０７日目および第１０日目にＴ２５フラスコに移した。
【０１０７】
ＥＣＢをＥｘＣｅｌｌ培地中で調製した。このＥＣＢは、該２つのサブクローンに関するさらなる研究（購入に費用がかかる培地からより経済的な配合（Ｂａｘｔｅｒで自社開発）への再適応など）のための原料物質を提示する。サブクローンＣＪ０６−１９／５Ｆ１０のＥＣＢ、ＣＪ０６−４２をＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で、Ｔ２５からＴ７５を経てＴ１７５まで、次いでＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で拡大培養した。第２１日目のＴ１７５からの１つの培養物に由来する１０個のバイアルからなるＥＣＢ／ＣＪ０６−６３を凍結させた。また、サブクローンＣＪ０６−１９／１Ｅ８のＥＣＢ、ＣＪ０６−４３もＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で拡大培養した。培養物は、Ｔ２５からＴ７５を経てＴ１７５まで、次いでＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ内で拡大培養した。第１８日目のＴ１７５からの１つの培養物に由来する１０個のバイアルからなるＥＣＢ／ＣＪ０６−６４を凍結させた。
【０１０８】
ＥＣＢ（サブクローン５Ｆ１０および１Ｅ８）をＢＣＳ培地に、以下に示すようにして適応させた。ＥＣＢクローンＣＪ０６−１９のサブクローンＣＪ０６−１９／５Ｆ１０を実験ＣＪ０６−６６において解凍し、次いで、ＢＣＳ培地をＥｘＣｅｌｌ培地に漸増容量で添加することにより、細胞をＥｘＣｅｌｌ培地から分離し、ＢＣＳ培地中での増殖能を獲得させた。同時に、ＥＣＢクローンＣＪ０６−１９のサブクローンＣＪ０６−１９／１Ｅ８も同様の様式でＢＣＳ培地に適応させた。
【０１０９】
表８は、この試験過程で調製したすべての無血清細胞バンクを示す。
【０１１０】
【表８】
ＰＭＣＢ＃０１とＰＭＣＢ＃０４およびサブクローン５Ｆ１０と１Ｅ８の比較を表９に示す。
【０１１１】
【表９】
実験ＣＪ０６−６９ならびにＳＫ０６−４９およびＳＫ０６−６３において培養した細胞集団は、ＰＭＣＢ用の細胞株の前駆培養物に相当する。これらの細胞をＢＡＳ培地（Ｐｕｔ、Ｇｌｕｔ、Ｓｙｎｐ、ＦｅおよびＺｎの添加を伴う）中で増殖し、それぞれ、ＰＭＣＢ＃０１およびＰＭＣＢ＃０４として凍結させた。
【０１１２】
サブクローン５Ｆ１０および１Ｅ８を、市販の培地ＥｘＣｅｌｌ ３２５ＰＦ ＣＨＯ（ＪＲＨによって供給）中で増殖した。ＢＡＳの形成に基づいた培地中で増殖できることが好ましかったため、ＰＭＣＢ＃０１とＰＭＣＢ＃０４を、ｒＦｕｒｉｎのさらなる生成に選択した。
【０１１３】
表１０に示されるように、ＰＭＣＢ＃０４の細胞は、ＰＭＣＢ＃０１と比べ、より良好な増殖挙動を示した。ＰＭＣＢ＃０４の方が、バイアビリティおよび増殖速度が高く、生成倍加時間が短かった。また、ｒＦｕｒｉｎの細胞特異的生成比ならびに容積生成比も、評価期間を通して大きかった。さらなる実験において、バイアビリティに関するデータを確認した。各ＰＭＣＢのアンプルの１つを、添加物としてＺｎを含むＢＣＳ培地を入れたＴ１７５フラスコ内で解凍した。表１０に示されるように、ＰＭＣＢ＃０４のバイアビリティは、この場合もＰＭＣＢ＃０１より高かった。
【０１１４】
【表１０】
したがって、ＰＭＣＢ＃０４を、ｒＦｕｒｉｎマスターセルバンク（ＭＣＢ）およびあらゆるさらなる作業用細胞バンク（ＷＣＢ）のさらなる生成のための原料物質として選択した。２０個のバイアルからなるＰＭＣＢ＃０４を、現行のＧｏｏｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ規則に準じて確立した。ＩＣＨ−Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ Ｑ５Ｄの要請に従って品質管理（ＱＣ）試験を行なった。ＰＭＣＢ＃０４を、製造プロセスにおけるｒＦｕｒｉｎの生成に選択した。
【０１１５】
増殖培地は、ヒトまたは動物由来の物質を含まず、自社開発したものである。細胞を濾過によって除去し、ｒＦｕｒｉｎ含有上清みを限外濾過によって濃縮する。交換クロマトグラフィーによる精製後、ｒＦｕｒｉｎ溶液の活性を、少なくとも２００単位 ｒＦｕｒｉｎ／ｍｌに目標設定する。
【０１１６】
マイコプラズマ、ウイルス、外来因子、無菌性、および発現効率に関する試験を行なった。選択基準は、高Ｆｕｒｉｎ活性（例えば、Ｆｕｒｉｎタンパク質、ＥＬＩＳＡ）、および最初のクローン＃４８８−３および＃２８９−２０のそれぞれとの比較において、異なるサブクローンにおいて行なった免疫蛍光検査（ＦＡＣＳ）における細胞集団の均一性である。また、不純物プロフィールを定性的に比較しなければならない（例えば、ＲＰ ＨＰＬＣ後のＵＶ−ピークパターンまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー手法により）。
【０１１７】
実施例３：
動物性タンパク質無含有培地中での組換えフリン製造のための最適化
この実施例では、ｒＦｕｒｉｎ発現ＣＨＯクローン＃４８８−３の培養のための開発および最適化プロセスを記載する。アミノ酸、グルコース、およびＮａＨＣＯ３濃度に関して特定の培地最適化を行ない、これにより、細胞増殖速度が増大し、発酵プロセスの生産性が高くなった。インライン制御プロセスパラメータの最適化を、ｐＯ２（１０％、２０％および５０％）に対して最適化した培地配合物を用いて行ない、要因実験を行なって最適ｐＨ（７．１〜７．３の範囲）および温度（３５．１℃〜３７．９℃の範囲）を調べた。これにより、３５〜３６℃の低温で発酵を行なった場合、ＣＨＯクローン＃４８８−３について有意な収率の改善がもたらされた。
【０１１８】
可能な生産様式として、ケモスタット培養とバッチ式再供給培養を比較すると、どちらのプロセス型もｒＦｕｒｉｎの製造に適しており、同一のパラメータ設定条件で同等の収率が得られることが示された。異なるバイオリアクター設定での攪拌型と速度の影響を調べるための具体的な実験を行なった。比増殖速度および比発現速度、細胞密度、したがって容積生産性は、バイオリアクター設定における変動によって大きく影響されること、および攪拌速度増大条件下では、収率が有意に増大し得ることが示された。総合すると、ｒＦｕｒｉｎ上流プロセスの主要パラメータの影響は、その効果に関して充分特徴付けられ、高収率プロセスは、前臨床および臨床製造のためのパイロットプラントに移行され得る。詳細を以下に示す。
【０１１９】
サブクローン＃４８８−０３は自社開発したものであり、これを、血清無含有インスリン無含有培地に適応させた。以下の実験は、基本培地配合物としてＦＢＳ無含有インスリン無含有培地（ＢＡＣＤ培地）において行なった（表１１参照）。
【０１２０】
【表１１】
細胞増殖を改善するため、および細胞繁殖に対して至適条件を提供するため、ケモスタット培養の上清みのアミノ酸解析を行なった（表１２参照）。その結果、３つの必須アミノ酸、すなわち、メチオニン（１０ｍｇ／Ｌ）、ロイシン（４０ｍｇ／Ｌ）およびフェニルアラニン（１０ｍｇ／Ｌ）を培地に添加した。発酵は１．５Ｌ容バイオリアクター内で、３７℃、ｐＨ７．１５およびｐＯ２２０％にて行なった。
【０１２１】
【表１２】
培養物の上清み中のグルタミン濃度が低いため、グルタミンを培地に添加し（３００ｍｇ／Ｌ）、グルタミンの終濃度を９００ｍｇ／Ｌとした。グルタミンを培地に添加後、増殖速度は０．５５ｄ−１から０．６７ｄ−１に増大した（表１３および１４参照）。これらの上記の３つのアミノ酸（すなわち、メチオニン（１０ｍｇ／Ｌ）、ロイシン（４０ｍｇ／Ｌ）フェニルアラニン（１０ｍｇ／Ｌ））を培地に添加することにより、この場合も、細胞の増殖速度を増大させることができた（０．６９ｄ−１）（表１５参照）。容積生産性は、ほぼ２６７ｋＵ／Ｌ／ｄまで（＝＋１３％）上昇し、比生産性は１６％の増大を示した。培地へのグルタミン、メチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンの補給により、細胞増殖、ならびに容積比活性に対してプラスの効果が示され、したがって、さらなる培地調製のために保持した。
【０１２２】
【表１３】
【０１２３】
【表１４】
【０１２４】
【表１５】
培地中のアミノ酸の補給量が充分であるかどうかを確認するため、ケモスタット培養（１０Ｌ）の別のアミノ酸解析を行なった。培養物に、３００ｍｇ／Ｌのグルタミンと、それぞれの量の該３つのアミノ酸を供給した。培養の第７日目と第１５日目に試料を抜き取り、培養条件は上記のものと同様とした。結果（メチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンに関するデータのみを示した表１６参照）により、充分な量の補給アミノ酸が発酵ブイヨン中に存在することが確認された。
【０１２５】
【表１６】
ＮａＨＣＯ３濃度の減少およびグルコース濃度の増大。増殖および生産性に対する細胞培養における高溶存ＣＯ２濃度の影響を調べた。バイオリアクターでは生成規模が大きいため、細胞培養でのＣＯ２濃度は、２．５〜３２Ｌ容バイオリアクターよりも高いことが予測され得る。したがって、２つの発酵操作をパラレルで行ない、一方の操作はおよそ７．５％のＣＯ２濃度とし、他方はおよそ１２％のＣＯ２濃度とした。ＣＯ２濃度は、ヘッドスペースフロー内のＣＯ２割合を変更することにより調整した。細胞培養におけるＣＯ２濃度は、抜き取った試料をＮＯＶＡ装置で解析することにより測定した。発酵は、３７℃、ｐＨ７．１５およびｐＯ２２０％で行なった。
【０１２６】
１１〜１２％のＣＯ２濃度は、細胞増殖および生産性に対してマイナスの影響を有した。このＣＯ２濃度では、１．１×１０６細胞／ｍＬの細胞計数において、１２日間の期間で増殖速度が０．２９ｄ−１に達し、希釈速度は０．３０ｄ−１であった。およそ７．５％ＣＯ２での発酵操作では、１．４９×１０６細胞／ｍＬの細胞計数において、増殖速度は０．５２ｄ−１に達し、同じ期間での希釈速度は０．５３ｄ−１であった。高ＣＯ２濃度では、バイアビリティが８６．１％に低下したのに対し、７．５％ＣＯ２では９５．９％であった。また、容積生産性はおよそ３６％に、比生産性は５０％低下した。ＣＯ２濃度が高いため、比グルコース取込み速度は同様に低下した（−３９％）。細胞増殖および生産性に対する高ＣＯ２濃度（１１〜１２％）のマイナスの影響は非常に明白であり、したがって、発酵を７．５％ＣＯ２で行なうことが最適である。
【０１２７】
上記に示したように、実験により、１，０００Ｌ容バイオリアクターにおいてＣＯ２の濃度を１２％に増大させると、ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローン４８８−３の性能が大きく低下することが予測され得ることが示された。したがって、培地中のＮａＨＣＯ３濃度を２ｇ／Ｌから１．５ｇ／Ｌに下げることを決定した。培地中のＮａＨＣＯ３の量が少ないと、同様に培地の緩衝能が低下した。したがって、一方を培地中３．１５ｇ／Ｌのグルコースおよび２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３とし（ＦＵＲ＿０６／２４＿Ｆ０１）、他方を４．６５ｇ／Ｌのグルコースおよび１．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３（ＦＵＲ＿０６／２６＿Ｆ０４）として２つの発酵操作（１０Ｌ）を比較した。
【０１２８】
大規模バイオリアクター（１，０００Ｌ）での条件をシミュレーションするため、ヘッドスペース内への一定のＣＯ２ガス供給により、発酵中の溶存ＣＯ２の濃度を、２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３の発酵槽内では７〜８％に、１．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３の発酵槽内では６〜７％に調整した。両方の培養物の増殖速度は類似しており（０．５８および０ ５６ｄ−１）、培養物は、同等の容積生産性およびバイアビリティを示した。しかしながら、比グルコース取込み速度は、低ＮａＨＣＯ３濃度の培養物において、わずかに高かった（０．８３ｍｇ／１０６細胞／ｄ対０．６７ｍｇ／１０６細胞／ｄ）。したがって、４．６５ｇ／Ｌのグルコース濃度が妥当であるとみなし、さらなる培地調製において保持した。
【０１２９】
Ｆｕｒｉｎ培地中のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度の検討。細胞培養培地中のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８の通常濃度を０．２５ｇ／Ｌに設定した。培地中におけるＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８の目的は、細胞を液中酸素付加による損傷から保護することである。したがって、２×１０Ｌ容バイオリアクターにおいて、１．０ｇ／Ｌの高Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度と０．２５ｇ／Ｌの通常濃度を対比して調べる一例の実験を行なった。発酵は、３５．８℃、ｐＨ７．３０およびｐＯ２２０％で行なった。
【０１３０】
プルロニック濃度（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８）を増大させるにつれて、わずかに高い比増殖速度および細胞密度が達成され得た。したがって、比生産性の増大のため、容積生産性が比例して大きくなり、２７８ｋＵ／Ｌ／ｄに対して３６５ｋＵ／Ｌ／ｄが達成され得た。
【０１３１】
この実験の上清みを収集し、デプスフィルター（Ｃｕｎｏ Ｃａｒｔ．Ｚ０８Ｐ４Ａ３０ＳＰ ４ディスク）で濾過した後、薄膜フィルター（Ｐａｌｌ Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＩＩ ＫＡ２ＤＦＬＰ２）で濾過した。濾過した上清みを限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ３０Ｓ １４６３９０１ Ｅ−ＳＧ ＰＳＵ １０ＫＤ、０．２ｍ２）によって濃縮し、Ｆｕｒｉｎダイアフィルトレーションバッファーに対してダイアフィルトレーションを行なった。滅菌濾過した濃縮液（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ ５２３１３０７４８−００ ０．４５／０．２μ）を、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラムにて精製した。この精製実験の結果により、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８の増大は、精製ｒＦｕｒｉｎの品質および／または純度に対して有害な影響を及ぼさないことが明らかになった。Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラムの溶出液中において、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度の上昇は見られず、どちらの溶出液でも＜０．１５ｍｇ／ｍＬであった。
【０１３２】
このような結果にもかかわらず、ｒＦｕｒｉｎ培地中のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度は当初の０．２５ｇ／Ｌに維持した。しかしながら、液中酸素付加による問題が大きくなる場合では、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ濃度を１．０ｇ／Ｌまで増大させることが考慮され得、おそらく、最終のＦｕｒｉｎ生成物に有害な影響なく収率が増大する。
【０１３３】
発酵におけるｒＦｕｒｉｎ生成のための最終培地組成。培地最適化実験に基づき、以下の培地組成が、バイオリアクター培養におけるｒＦｕｒｉｎ生成のためのＣＨＯクローン４８８−３の発酵に最適であると示される。
【０１３４】
【表１７】
また、増殖速度および生産性に対する種々のｐＯ２設定点の影響も調べた。３つの異なるｐＯ２設定点、すなわち、１０％、２０％および５０％を試験した。実験は１．５Ｌ容バイオリアクターにおいて行ない、ヘッドスペースを介してガス供給を行なった。発酵操作はすべて、３５．１℃にてｐＨ７．２０で行なった。１０、２０および５０％のｐＯ２での発酵操作の比較により、ｐＯ２設定点の上昇に伴い、増殖速度のわずかな増大（０．５９、０．６２および０．６５ｄ−１）が示された。同様に、容積生産性は５０％ｐＯ２で最大であった。異なる発酵操作での平均細胞計数は、非常に類似していた。したがって、容積生産性の増大は、増殖速度の増大の結果であった。
【０１３５】
そのため、５０％のｐＯ２設定点は増殖速度にプラスの影響を及ぼすようであり、その結果、容積生産性は、標準条件（＝２０％ＰＯ２）の場合よりもおよそ４％高かった。バイアビリティに対する効果は観察されなかった。したがって、ｐＯ２＝２０％の設定点および通常１０％〜５０％の範囲が、ＣＨＯクローン＃４８８−３の発酵に適していると確認され得た。
【０１３６】
容積生産性を最大にするための温度とｐＨの最適化。ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの性能に対するｐＨおよび温度の影響を調べた。「実験方法の設計」を使用することにより、種々の温度を種々のｐＨ値と組み合わせ、最大容積生産性がもたらされる条件を確認した。「Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリックス」に従って５つの温度を３つのｐＨ値と組み合わせ、図５に示した温度とｐＨの７通りの組み合わせを得た。
【０１３７】
３６．５℃とｐＨ７．２０の組み合わせを中心点として選択し、これを２つの発酵ロットに適用した。表１８は、異なる発酵ロットで使用した培養条件を示す。
【０１３８】
【表１８】
【０１３９】
【表１９】
データを、応答曲面法（ＲＳＭ）により、「Ｍｉｎｉｔａｂ」ソフトウェアを用いて統計学的に解析した。ＲＳＭにより、いくつかの説明変数と１つ以上の反応変数との関係が調べられる。ＲＳＭの主な意図は、設計された一組の実験を用いて至適応答を得ることである。この解析では、容積生産性および比生産性ならびに増殖速度に焦点を当てた。
【０１４０】
容積生産性に関するデータの解析。第１の工程として、表面プロットを作成した（図６）。図６においてデータ座標を点で示す。表面は、単一データの推定相関を示す。
【０１４１】
表面プロットにより、パラメータ温度／ｐＨと応答容積生産性との間に線形相関が推定される。このチャートは、温度の低下に伴って容積生産性が増大することを示す。ｐＨの影響は小さいと考えられる。その後の計算により、データの線形相関が示された（計算は表示せず）。分散解析により、ｐＨ、温度および容積生産性間の相関を示す等式を作成した：
Ｐ ＝ ７６９３．１ − １６２．４＊Ｔｅｍｐ − ２０２．８＊ｐＨ
この数学モデルに基づき、容積生産性に対する温度とｐＨの影響を示すコンタープロットを作成した（図７）。点は、実験で試験した条件（ｐＨ／温度）を示す。
【０１４２】
このコンタープロットは、最大容積生産性が期待され得る領域が３５．１℃およびｐＨおよそ７．１０であることを示す。どちらの値も実験設計の端部であり、これは、実際の最大生産性は、これらよりもさらに低い値で見られ得ることを意味する。さらに、このコンタープロットは、容積生産性に対するｐＨ影響がわずかであり、低ｐＨ値での方がわずかに高いことを示す。
【０１４３】
この数学モデルの３次元表示である表面プロット（図８）でも、コンタープロットと同じ結果が得られる：容積生産性に対して温度の影響が大きく、ｐＨの影響は小さい。
【０１４４】
増殖速度μに関するデータの解析。増殖速度と温度およびｐＨとの相関は、二次方程式で示される。この場合も、温度の影響が大きく、ｐＨの影響は小さいことがわかる。増殖速度の大きな変動により、数学モデルの設計が障害される。分散および回帰の解析により以下の等式が得られる：
Ｐ ＝ −１０３．５３９ ＋ ５．７０６＊Ｔｅｍｐ − ０．０７９＊Ｔｅｍｐ２ − ０．２３３＊ｐＨ − ０．０２０＊ｐＨ２
増殖速度に対するｐＨの影響は、ｐＨの項のＰ値が０．９９であると計算され、高いこと（計算は表示せず）によって示されるように、統計学的に確認可能ではない。
【０１４５】
表面プロット（図９）は、モデル相関を３次元的に示し、二次方程式の関係であることを示し、３６．５℃において増殖速度が最大であることを示す。
【０１４６】
データの解析により、容積生産性で見られたものと同様の比生産性と温度およびｐＨとの相関が示されている（図１０）。この相関は、一次方程式によって示される。この場合も、分散解析（計算は表示せず）
によって示されるように、ｐＨの影響は小さい：
ｑＰ ＝ ４２６１．４０ − ９３．３５＊ｔｅｍｐ − ９３．７７＊ｐＨ
要約すると、温度およびｐＨの最適化のための実験およびその後のデータ解析により、非常に明白な結果が得られた。プロセス最適化に最も重要なパラメータであるとみなされる最大の容積生産性は、最も低い温度（３５．１℃）および低ｐＨ（７．１０）での培養によって得られた。ｐＨの影響は、統計学的にほとんど有意ではなく、７．１０〜７．３０のｐＨ値で非常に類似した結果が得られ得る。温度を３７℃から３５．１℃に下げることにより、容積生産性は、およそ２００ｋＵ／Ｌ／ｄから、２．７倍高い５４０ｋＵ／Ｌ／ｄに上昇し得る（図１１）。このような結果に基づき、ケモスタット様式でのＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの培養に対して、温度およびｐＨの新たな設定点を、３５．１℃および７．１５と決定した。
【０１４７】
ケモスタット様式とバッチ式再供給様式との比較。低温（３５．１℃）でケモスタット様式でのＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの培養により、小規模実験（１．５Ｌ、２．５Ｌ、１０Ｌおよび３２Ｌ）では高収率がもたらされ、ｒＦｕｒｉｎの生成のための大規模培養に適切な培養方法であるとみなした。しかしながら、大規模（ＰＰ１設備の１２００Ｌ容バイオリアクター）での初期の発酵操作において、ケモスタット様式で、増殖速度の大きな低下が示された。択一例として、より高い増殖速度を得るため、バッチ式再供給様式を大規模で設定した。１０Ｌ容規模のバイオリアクターで実験を行ない、ケモスタット様式とバッチ式再供給様式とで、増殖および生産性を比較した。細胞は、３６．５℃にてｐＨ７．１５およびｐＯ２２０％で培養した。培養２日目ごとに、バッチを０．６〜０．７×１０６細胞／ｍＬの細胞計数に分割した。
【０１４８】
ケモスタット発酵とバッチ式再供給発酵は、播種材料として同じ細胞培養を使用し、パラレルで操作した。細胞は、第６日目までケモスタット様式で培養した。次いで、発酵操作の一方をバッチ式再供給様式に切り替え（ＦＵＲ＿０６＿５０−Ｆ０３）、他方は、ケモスタット様式を継続した（ＦＵＲ＿０６＿５１−Ｆ０４）。バッチ式再供給様式での培養では、バッチ終了時に２．２２×１０６細胞／ｍＬの平均細胞計数が得られ、増殖速度は０．６４ｄ−１であった（表２０）。ケモスタット様式では、０．５０ｄ−１の増殖速度が得られ、平均細胞計数は１．６７×１０６細胞／ｍＬであった。バッチ式再供給様式の方が細胞計数と増殖速度が高いため、容積生産性も大きかった（１９７ｋＵ／Ｌ／ｄに対して２３８ｋＵ／Ｌ／ｄ）。
【０１４９】
データは、バッチ式再供給様式が、１０Ｌ規模でのＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンに好ましい培養方法であることを示し、この様式では、ケモスタット様式よりも、さらにわずかに高い容積生産性がもたらされる（３６．５℃およびｐＨ７．１５のとき）。しかしながら、バッチ式再供給様式では、回収プロセスおよび下流のさらなるプロセスが一定時間内に制限されるが、ケモスタット様式では回収は連続的に行なわれ得る。したがって、各方法がそれぞれ利点を有する。バッチ終了時の至適細胞計数または最良分割比率などのバッチ式再供給様式のパラメータについては、最適化実験は行なわなかった。
【０１５０】
【表２０】
規模拡大の検討。異なる攪拌速度におけるＲｕｓｈｔｏｎ型の羽根とｂａｌｌ型の羽根との比較。増殖速度および生産性に対する攪拌機の型の影響を調べた。ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンを用いた実験でのバイオリアクターに使用した標準設定条件は、Ｒｕｓｈｔｏｎ羽根と４枚のバッフルプレートで構成した。ｒＦｕｒｉｎ生成のための１，０００Ｌ容バイオリアクターに、バッフルプレートなしで３対のｂａｌｌ羽根を設置した。したがって、１０Ｌ容のバイオリアクターにおいて３つの異なる設定条件を試験する実験を行なった：反応器の１つには標準設定条件を設置し、別の反応器には、２対のｂａｌｌ羽根を設置してバッフルプレートは設置せず、第３の反応器は、標準のものと同様に組み立てたが、攪拌速度を１７０ｒｐｍから９０ｒｐｍに下げた。
【０１５１】
表２１は、バイオリアクターの設定の概要を示す。ｂａｌｌ羽根で６０ｒｐｍの攪拌速度では、ｒｕｓｈｔｏｎ羽根で９０ｒｐｍのときと同様の先端速度が得られる（表２１参照）。しかしながら、羽根の幾何的構造（形状、直径）が異なるため、先端速度は互いに等しくなり得ない。
【０１５２】
【表２１】
発酵条件は、以下のとおり：３７℃，ｐＨ７．１５，ｐＯ２２０％およびｐＣＯ２６〜７％（培地：４，６５ｇ／ＬのＧｌｃ、１，５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３）とした。発酵データの比較により、標準設定、すなわちｒｕｓｈｔｏｎ羽根を設置して１７０ｒｐｍの速度で攪拌したバイオリアクターの性能は、その他の設定のバイオリアクターよりも高いことが示された（表２２）。６０ｒｐｍでのｂａｌｌ羽根の使用では、ｒｕｓｈｔｏｎ羽根で１７０ｒｐｍのときと比べて、いくぶん遅い増殖速度（０．６１ｄ−１に対して０．５７）、低い容積生産性（２２７ｋＵ／Ｌ／Ｄに対して１９７）がもたらされた。しかしながら、バイアビリティはほとんど影響を受けなかった。１７０ｒｐｍではなく９０ｒｐｍの攪拌速度でのｒｕｓｈｔｏｎ羽根攪拌バイオリアクターを使用すると、増殖速度（０．６１ｄ−１に対して０．５４）、容積生産性（２２７ｋＵ／Ｌ／Ｄに対して１７５）および細胞比生産性（１３８Ｕ／１０６細胞／日に対して１１５）が明白に低下した。
【０１５３】
この実験のデータにより、ｂａｌｌ羽根で６０ｒｐｍのとき、およびＲｕｓｈｔｏｎ羽根で低攪拌速度のときはともに、Ｒｕｓｈｔｏｎ羽根で１７０ｒｐｍのときと比べ、ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの性能の低下がもたらされることが示された。とは言うものの、この結果により、ＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの培養にｂａｌｌ羽根を使用することが可能であることも示された。試験した設定のうち、ｒｕｓｈｔｏｎ羽根で１７０ｒｐｍ＋４枚のバッフルプレートの設定は、最も荒い条件が示された。しかしながら、注目すべきことに、この条件下で細胞バイアビリティの低下は観察されず、これは、調べたＣＨＯ−Ｆｕｒｉｎクローンの高い機械抵抗性を示す。
【０１５４】
【表２２】
３２Ｌ容バイオリアクターにおけるピッチブレード羽根での異なる攪拌速度の比較。ＧＭＰ操作のため、ＰＰ１バイオリアクター（作動容積９５０Ｌ）内のキャンペーンＯＲＦＵＲＦＢ０７００２に、先で使用したｂａｌｌ型の羽根の代わりに、ピッチブレード型の羽根（２枚、ｄ＝７００ｍｍ）を設置した。
【０１５５】
このキャンペーン中、２日間のバッチ式再供給サイクルを行なった。先のキャンペーンと比較したときのこの変化を評価するため、３２Ｌ容のバイオリアクターに、同様の型のピッチブレード羽根（１枚、ｄ＝１４０ｍｍ）を設定し、ＰＰ１設備由来の細胞懸濁物および同等の材料の使用を確保する培地を用いて発酵を行なった。
【０１５６】
同様のバッチ式再供給プロセスを行ない、このとき、２〜３回連続で２日間バッチサイクルを、０．５×１０Ｅ０６細胞／ｍＬの開始細胞密度で開始した。実験は、２つの異なる攪拌速度、すなわち５５ｒｐｍと１２０ｒｐｍ）で行なった。培養条件は、ＰＰ１で使用した培養条件と同一：ｐＨ−ＳＰ ７．１５，Ｔｅｍｐ−ＳＰ ３５．５℃，ｐＯ２−ＳＰ ２０％とした。最後のバッチのデータを、それぞれの攪拌条件への適応後に比較した。
【０１５７】
【表２３】
この実験により、この場合も、ＣＨＯクローン＃４８８−３の比増殖速度に対する攪拌条件の効果が示された。同じ開始細胞密度を適用した場合、増殖速度が増大すると、バッチ終了時の最終細胞密度は高くなった。容積生産性は２７６ｋＵ／Ｌ／Ｄから４４５ｋＵ／Ｌ／Ｄに増大した（＋６１％）が、最終細胞密度は３０％増大した（１．５×１０Ｅ０６細胞／ｍＬに対して１．９５）。この結果は、攪拌速度の増大が細胞の比生産性に対してプラスの影響を有したことを示す。
【０１５８】
また、ほぼ２００ｋＵ／Ｌ／Ｄの平均生産性がもたらされた発酵操作は、主に、２０ｒｐｍという低攪拌速度の適用の結果であって、羽根の設計そのもののためではなかったという結論付けがなされ得る。ここで、ピッチブレード羽根により、相応して攪拌速度を調整すると、＞４００ｋＵ／Ｌ／Ｄの収率がもたらされ得ることが示され得る。
【０１５９】
実施例４：
組換えフリン（ｒＦＵＲＩＮ）の精製
この実施例では、ｒＦｕｒｉｎの濾過および精製のための方法を示す。収集した細胞培養上清みを、まず、デプスフィルター（Ｃｕｎｏ Ｚｅｔａｐｌｕｓフィルター）で濾過して細胞無含有および微粒子無含有とした後、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（ＰＡＬＬ Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＩＩ）で薄膜濾過した。濾過したｒＦｕｒｉｎ含有細胞培養上清みを、次いで、１０ Ｋ ＰＥＳ ＵＦカセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製（Ｓａｒｔｏｃｏｎ ＰＥＳＵ １０ｋＤａ））での限外濾過により、１０〜５０の範囲の濃縮係数で濃縮した。次いで、フリン濃縮物（２９０〜１７００単位／ｍｌ範囲のフリン活性を有する）を、アリコートに分けて＜−６０℃で保存した。
【０１６０】
ＶＷＦ成熟プロセスにおける使用のためのより均一なｒＦｕｒｉｎ調製物を得る試みにおいて、細胞培養上清みからｒＦｕｒｉｎを一部精製する実験を行なった。一部精製ｒＦｕｒｉｎ試薬は、特性評価および放出試験での使用がより容易になる。また、ＶＷＦ成熟プロセスにおいてＣＨＯ宿主細胞タンパク質の存在の低減がもたらされる。
【０１６１】
ｒＦｕｒｉｎの効率的な結合に必要とされる負荷導電率が＜５ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）であるアニオン交換樹脂での精製手順を開発した。次いで、溶出を、およそ５００〜３００ｍＭ ＮａＣｌのイオン強度で段階的手順として行ない、このスクリーニング期間中、３００ｍＭ ＮａＣｌまでの勾配溶出を適用した（表２４の概要参照）。バッファーの最初のｐＨ６．７（ＲＴ）を７．５に上げると、特に、高タンパク質負荷量および高線形流速において、負荷量中のｒＦｕｒｉｎ結合が改善された（表２５の関連バッファーの概要参照）。精製実験は、充填流速の安定性および操作最大流速が異なるＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍｅｒｃｋ）およびＣａｐｔｏＱ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アニオン交換樹脂において行なった。表２６に要約した解析データは、ｒＦｕｒｉｎが細胞培養上清みから、２０〜７１％の範囲の収率で３６２倍まで濃縮され得ることを示す。溶出液プール中のｒＦｕｒｉｎ活性は、適応された負荷量に応じて６３９単位／ｍｌ〜２７６５１単位／ｍｌであった。溶出液中のＣＨＯ不純物レベルは、１０〜１３４ｎｇ ＣＨＯタンパク質／単位ｒＦｕｒｉｎの範囲であることがわかり、ＣａｐｔｏＱ樹脂では、１２．３までの減少割合により、ＣＨＯ減少に関してわずかに良好な性能が見られた。
【０１６２】
要約すると、アニオン交換クロマトグラフィーによるｒＦｕｒｉｎの精製は、＜−６０℃でのｒＦｕｒｉｎ試薬の保存に重要である濃縮の一選択肢であることが示された。また、３〜１２倍のわずかなＣＨＯの減少が、ＶＷＦの調製物中のＣＨＯタンパク質濃度の低減に重要である。
【０１６３】
【表２４】
【０１６４】
【表２５】
【０１６５】
【表２６】
実施例５：
ｒＦｕｒｉｎの濃縮、精製および解析
この実施例では、大規模ｒＦｕｒｉｎの濃縮および精製（すなわち、下流の処理）
に使用される他の方法を記載する。かかる処理の方法としては、限外濾過、ダイアフィルトレーション、およびｃａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィー（実質的に動物性タンパク質を含まないｒＦｕｒｉｎの作製において実施）が挙げられる。また、タンパク質の濃度、比活性、ならびに宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡによる夾雑の解析方法を記載する。
【０１６６】
限外濾過。上清み（ケモスタットキャンペーンではおよそ８００〜１２００ｋｇ、およびＲＦＢキャンペーンではおよそ５５０〜７００ｋｇ）を細胞から分離し、限外濾過によって終容量３５〜４５Ｌまで濃縮した。濃縮工程での限外濾過／ダイアフィルトレーションシステム（ＵＦＳ）のパラメータおよび設定点を表２７に示す。
【０１６７】
【表２７】
ダイアフィルトレーション。濃縮工程の終了直後、保持液のダイアフィルトレーションを開始した。ダイアフィルトレーション工程でのＵＦＳのパラメータおよび設定点を表２８に示す。
【０１６８】
【表２８】
保持液の導電率が２ｍＳ／ｃｍ未満に下がったとき（ＵＦＳのインライン導電率プローブにより測定）、このプロセス工程を終了した。この低い導電率は、後続の精製工程でのクロマトグラフィーゲルに対するｒＦｕｒｉｎの定量的結合を確保するために必要とされる。ダイアフィルトレーション生成物を移し、このダイアフィルトレーション生成物のｐＨ値を１Ｍ酢酸溶液の添加によって６．０に調整した。この生成物を、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣカラムに適用する前に室温（ＲＴ）で保存した。
【０１６９】
Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィー。マルチモーダルカチオン交換体であるＣａｐｔｏ−ＭＭＣゲルを使用し、ｒＦｕｒｉｎを結合し、大部分の夾雑物をダイアフィルトレーション生成物から排除した。クロマトグラフィーゲルの平衡後、ダイアフィルトレーション生成物をカラムに負荷する。０．２２μｍフィルターカプセルを取り付け、ダイアフィルトレーション生成物のオンライン濾過を行なった。表２９に、さらなるクロマトグラフィー工程を列挙および詳述する。
【０１７０】
【表２９】
下流の処理では、問題は観察されなかった。下流工程（濾過、ＵＦ、ＤＦ）は、ケモスタット培養物からの回収に使用されるものと同じ条件で行なわれ得る。平均全ｒＦｕｒｉｎ活性収率９１％（キャンペーンＯＲＦＵ０６００２）、６６％（キャンペーンＯＲＦＵ０７００１）および８４％（キャンペーンＯＲＦＵ０７００２）が達成され得た。唯一の小さな変化は、ＵＦ工程の開始容量が連続的な培養と比べていくぶん少ないことによって示される。しかしながら、この変化は、精製生成物の品質に対して効果を有しない（全活性、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質に関するデータ参照；表３０参照）。
【０１７１】
宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡ含有量に関する３つのキャンペーンすべての平均値は、それぞれ、かなり低い平均最大値８．５５μｇ／ｍｌ（２．２〜１０．４μｇ／ｍｌの範囲）および１３．４８ｎｇ／ｍｌ（０．０〜２３．９ｎｇ／ｍｌの範囲）（表３０参照）を示す。クロマトグラフィー工程により、比夾雑を、低い平均最大値０．３５ｎｇ ＣＨＯタンパク質／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ活性（０．１３〜０．５２ｎｇ ＣＨＯタンパク質／Ｕの範囲）および０．１４８ｐｇ宿主細胞ＤＮＡ／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ活性（０．０〜．３６５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕ ｒＦｕｒｉｎ活性の範囲）まで減少させることができた。
【０１７２】
【表３０】
Ｆｕｒｉｎ特性評価。ｒＦｕｒｉｎの品質および機能性を、以下の生化学的／生物物理学的方法によって評価した（表３１）。
【０１７３】
【表３１】
Ｆｕｒｉｎ活性のアッセイ。精製ｒＦｕｒｉｎバッチ（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液プール）を、Ｆｕｒｉｎの酵素活性について試験した。基質は、蛍光アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣ）基（これは、切断（ＢＯＣ−ＲＶＲＲ−ＡＭＣ）後に放出される）に結合された二塩基性認識配列を含む短鎖の合成ペプチドである。放出された蛍光発生基は、３８０ｎｍでの励起、続いて４３５ｎｍでの発光の測定によって検出され得る。１活性単位は、３０℃で１分あたり１ｐＭｏｌのＡＭＣの放出と定義する。
【０１７４】
発酵および精製の有効性に応じて、ｒＦｕｒｉｎ活性の測定値は約１００００Ｕ／ｍｌから約１０００００Ｕ／ｍｌ超までの範囲であり、平均値はおよそ６９０００Ｕ／ｍｌであった（表３２、表３２、および表３４）。ＲＦＢ様式キャンペーンでは、特に、ケモスタットキャンペーンＯＲＦＵ０６００２（４７７３７Ｕ／ｍｌ）の平均値と、ＲＦＢ キャンペーンＯＲＦＵ０７００１（７７６５３Ｕ／ｍｌ）およびＯＲＦＵ０７００２（９３１７８Ｕ／ｍｌ）の平均値を比較した場合、ｒＦｕｒｉｎ活性の増大がみとめられた（全般的には、ｒＦｕｒｉｎ活性は、約１００００から１０００００Ｕ／ｍｌ超までの範囲であった；すべてデータ表示せず）。
【０１７５】
Ｆｕｒｉｎの比活性は、活性Ｕ／μｇタンパク質で示す（表３２〜３４参照）。キャンペーンＯＲＦＵ０６００２の平均比活性は２６９Ｕ／μｇタンパク質であり、それぞれ、ＯＲＦＵ０７００１では５００Ｕ／μｇに、およびＯＲＦＵ０７００２では５６３Ｕ／μｇに増大した（全般的には、比活性は、１２４〜６２０Ｕ／μｇタンパク質の範囲であった；データ表示せず）。したがって、比活性はこの２つのＲＦＢ キャンペーンで倍加し、ケモスタット様式で生成させたバッチと比べてＲＦＢ ｒＦｕｒｉｎの酵素活性が高い結果である。
【０１７６】
【表３２】
【０１７７】
【表３３】
【０１７８】
【表３４】
フリン使用試験活性。フリン使用試験は、プロＶＷＦから成熟ｒＶＷＦにプロセッシングされるｒＦｕｒｉｎの有効性が定量されるように設計されたものである。成熟有効性は、１ＶＷＦ抗原単位の成熟に必要とされるＦｕｒｉｎ単位の量（Ｕフリン／Ｕ ＶＷＦ）で示す。基質は、パイロット規模で現行の製造手順（Ｆｕｒｉｎの成熟およびＳｕｐｅｒｏｓｅ ６での最終精製工程は省略）に従って精製されたプロＶＷＦ／ＶＷＦ調製物である。ｒＶＷＦ基質濃度は１００Ｕ Ａｇ／ｍｌであった（Ｆ８ＨＬ＿２４＿０１ ＵＦ０２−Ｒ）。
【０１７９】
試料の４つの希釈物を、１ｍｌ容のエッペンドルフ型チューブ内で、例えば、０．２５〜２．０Ｕ／Ｕ ＶＷＦの比Ｆｕｒｉｎ濃度を包含するように試験した。反応および希釈用バッファーは、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ７．０）とし、成熟実験は、わずかに攪拌下、３７℃で１６時間行なった。インキュベーション後、ＳＤＳ−試料バッファーの添加および＞９０℃で５分間の試料の加熱によって酵素反応を停止させる。次いで、試料を、８％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分離されたポリペプチドの銀染色の使用によって解析する。次いで、ゲルの目視検査（プロＶＷＦバンドは、成熟ＶＷＦバンドと比べ、５％未満を示すはずである）によって評価される成熟有効性＞９５％を得るのに必要とされる比Ｆｕｒｉｎ活性を報告し、試験したｒＦｕｒｉｎの品質条件として使用する。
【０１８０】
【表３５】
【０１８１】
【表３６】
【０１８２】
【表３７】
良好で一貫したプロＶＷＦの成熟活性が、試験したすべてのｒＦｕｒｉｎバッチで見られた。キャンペーンの平均値は、１．０Ｕ Ｆｕｒｉｎ／Ｕ ＶＷＦ未満である：Ａｇおよび成熟度は、すべての場合で９５％を超える（表３５〜３７）。ｒＦｕｒｉｎバッチの成熟活性はすべて同等であり、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２、ＯＲＦＵ０７００１およびＯＲＦＵ０７００２の平均計算値を参照すると、ケモスタット様式およびＲＦＢ様式で生成されたｒＦｕｒｉｎ間に、ほぼ違いは見い出され得ない。
【０１８３】
Ｆｕｒｉｎ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとともに銀染色およびウエスタンブロット解析を、すべてのｒＦｕｒｉｎバッチに対して行ない、一貫した品質を保証し、不純物の程度を可視化した。図１２に見られるように、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２とＯＲＦＵ０７００２のＣａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液のバンドパターンは、高度に相関している。；試料はすべて、およそ６０ｋＤａに顕著なＦｕｒｉｎバンドを示す。バッチＭＭＣ０１〜ＭＭＣ０８由来のキャンペーンＯＲＦＵ０６００２の試料では、Ｆｕｒｉｎバンドがわずかに小さい分子量である傾向が見られる（図１２、レーン１〜８）。このバッチの試料は脱グリコシル化されており、この傾向は、後続の銀染色を伴いＳＤＳ−ＰＡＧＥは見られなくなる（データ表示せず）という効果を有し、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２では、ｒＦｕｒｉｎが、発酵進行中の過程で、わずかに異なる程度またはより低い程度でグリコシル化されるという仮定を裏付ける。この傾向は、ＲＦＢ キャンペーンＯＲＦＵ０７００２ではみとめられず、全キャンペーンでのｒＦｕｒｉｎの定常的なグリコシル化を示す。ＯＲＦＵ０６００２およびＯＲＦＵ０７００２に由来するバッチ中の不純物は、ほぼ完全に同じである；しかしながら、ＲＦＢ様式キャンペーンＯＲＦＵ０７００２由来の試料は、４０ｋＤａの領域に強度の小さいバンド、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２の試料中で特に強く富化されたポリペプチドを示す。
【０１８４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット。すべての試料に対し、モノクローナル抗Ｆｕｒｉｎ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行なった（図１３）。約６０ｋＤａにおける顕著なバンドは、Ｆｕｒｉｎバンドと同定され得、すべての試料に見られる。試料の同等性は非常に高い。バンド強度におけるわずかな変動は、試料中のＦｕｒｉｎ濃度が異なることによるものである。全般的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、ケモスタットおよびＲＦＢ様式で生成されたｒＦｕｒｉｎの同等性が強調される。
【０１８５】
慣用的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを補助するため、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２およびＯＲＦＵ０７００２の試料に対して等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行なった。ＩＥＦは、垂直型ＩＥＦを使用し、ｐＨ７．０〜ｐＨ３．０で行なった。ポリペプチドは、クーマシー染色およびウエスタンブロット解析によって可視化した。キャンペーンＯＲＦＵ０６００２のｒＦｕｒｉｎ試料のＩＥＦおよびその後のウエスタンブロットにより、Ｆｕｒｉｎの特異的バンドパターンが示された（図１４参照）。ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の領域内に７個までの別個のバンドが確認され得、少なくとも５個のバンドは、すべての試料に存在する。
【０１８６】
キャンペーンＯＲＦＵ０７００２の試料のＩＥＦは、可視化のためにクーマシー染色およびウエスタンブロット解析を用いて行なった。クーマシー染色では、特異的バンドパターンが示され、すべての試料で、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の領域内に最小５個の別個のバンドが示され、８個までのバンドが確認され得る（図１５、レーン３参照）。
【０１８７】
ウエスタンブロット解析（図１６参照）により、これらの結果が確証され、一部の試料では、クーマシーゲルで見られたバンド全部は示されない（図１７参照）。これは、おそらく、ゲルからブロッティング膜へのタンパク質の移行が不完全なためである。
【０１８８】
Ｆｕｒｉｎ逆相ＨＰＬＣ。ｒＦｕｒｉｎのフィンガープリントパターンを確立するため、キャンペーンＯＲＦＵ０６００２およびＯＲＦＵ０７００３由来の試料（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣ溶出液）を、Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。この２つのキャンペーンの試料のピークパターンを比較した（図１７および図１８参照）。
【０１８９】
試験したすべての試料のクロマトグラムには、およそ１３分の保持時間の時点に特徴的なメインピークが示されており、これはＦｕｒｉｎに帰属され得る。ピークの高さは、試料中のＦｕｒｉｎ濃度と充分に相関している。他のタンパク質不純物は、８分〜１７分の範囲にマイナーピークとして見られ得る。キャンペーンＯＲＦＵ０７００２由来の試料はすべて、ＯＲＦＵ０６００２のものよりも有意に少なく小さい不純物由来のピークを示す。このことは、少数で少量の不純物が見られたＲＦＢ様式キャンペーンＯＲＦＵ０７００２の場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と充分に整合する。
【０１９０】
上記の特性評価方法で得られた解析データは、ケモスタット様式とＲＦＢ様式の両方で生成されたｒＦｕｒｉｎの非常に良好な同等性を示す。入手可能なデータからは、ｒＦｕｒｉｎの品質に大きな差は検出され得なかったが、ＲＦＢ様式で生成されたｒＦｕｒｉｎバッチでは、ケモスタット様式での生成と比べ、高い比活性および少ない不純物が示された。クロマトグラフィー工程により、原薬原料（ＢＤＳ）中の宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡの含有量は非常に低くなる。ＲＦＢ発酵および全下流処理（濾過、ＵＦ／ＤＦ、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣクロマトグラフィー）からなる少なくとも完全な生成プロセスは、おそらく、例えば、単独使用バイオリアクター（ＳＵＢ）系におけるｒＦｕｒｉｎの商業的作製のための実施が、より容易である。
【０１９１】
実施例６：
安全性、無菌性、および安定性の試験
この実施例では、ＣＨＯ細胞バンクの品質の測定および維持のために行なわれる安全性、無菌性および安定性の試験を記載する。無菌性／マイコプラズマに対する試験は、ＩＣＨ−Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ Ｑ５Ｄの要請に従って行なわれなければならない。細胞バンクの品質は、解凍細胞の平均バイアビリティおよび細胞密度の測定ならびにその後の培養物の増殖速度によって確認されなければならない。
【０１９２】
ウイルス安全性（表３８）、遺伝子安定性（表３９）、および同一性（表４０）について、細胞を試験した。細胞は無菌性であり、マイコプラズマを含まず、外来因子を含まず、レトロウイルスを含まず、ＭＶＭウイルスに対して陰性であり、外来ウイルスに対して陰性であり、齧歯類ウイルスに対して陰性であり、ブタおよびウシウイルスを含まず、Ｃａｃｈｅ Ｖａｌｌｌｅｙウイルス（ＣＶＶ）を含まないことがわかった。
【０１９３】
細胞バンクを、Ｆｕｒｉｎ産生細胞／非産生細胞比に関して、ＦＡＣＳ解析によって検査した。また、長期安定性（長期間にわたってＦｕｒｉｎを産生する能力）についても試験する。さらに、無血清条件下で産生された分泌型Ｆｕｒｉｎは、生成されるアイソフォームに関して調べなければならない。データはすべて、安定な培養およびＦｕｒｉｎ生成が、このような細胞バンクを用いて達成され得ることを示すはずである。
【０１９４】
ＭＣＢ／ＷＣＢ由来の細胞では、生成プロセス全体にわたって、安定な増殖およびＦｕｒｉｎ発現が示されるはずである。
【０１９５】
【表３８】
【０１９６】
【表３９】
【０１９７】
【表４０】
本発明を、本発明の実施のための好ましい様式を含むことがわかった、または含むと提案される特定の実施形態に関して説明したが、当業者には、本開示に鑑みると、例示した該特定の実施形態において本発明の意図する範囲を逸脱することなく、数多くの変形および変更がなされ得ることが認識されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲に記載の発明の範囲に含まれるかかるすべての均等な異型を包含するものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを含む組成物。
【請求項２】
少なくとも約１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の組換えフリン、および約１１μｇタンパク質／ｍＬ未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも約１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の組換えフリン、および約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕフリン活性未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも約１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の組換えフリン、および約１４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬ未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも約１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の組換えフリン、および約０．５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕフリン活性未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも約１００Ｕ／μｇの活性の組換えフリン、および約１１μｇ タンパク質／ｍＬ未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも約１００Ｕ／μｇの活性の組換えフリン、および約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕフリン活性未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも約１００Ｕ／μｇの活性の組換えフリン、および約１４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬ未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも約１００Ｕ／μｇの活性の組換えフリン、および約０．５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕフリン活性未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンの作製方法であって、フリンをコードするポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を無血清培地中で、該フリンの該培地中への分泌を可能にする条件下で増殖させる工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞を培地中で、血清濃度をだんだん低下させながら、すべての血清が該培地から除去されるまで適応させる工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞を、血清を含む培地中での増殖から無血清培地中での増殖に移すことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物の使用方法であって、プロタンパク質を該組成物と、該プロタンパク質からプロペプチドが切断されて成熟タンパク質が形成される条件下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項１５】
前記成熟タンパク質がフォンヴィレブランド因子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記成熟タンパク質が第ＶＩＩＩ因子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを含む組成物。
【請求項２】
少なくとも約１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の組換えフリン、および約１１μｇタンパク質／ｍＬ未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも約１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の組換えフリン、および約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕフリン活性未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも約１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の組換えフリン、および約１４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬ未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも約１００００Ｕフリン／ｍＬの活性の組換えフリン、および約０．５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕフリン活性未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも約１００Ｕ／μｇの活性の組換えフリン、および約１１μｇ タンパク質／ｍＬ未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも約１００Ｕ／μｇの活性の組換えフリン、および約１．０ｎｇ タンパク質／Ｕフリン活性未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも約１００Ｕ／μｇの活性の組換えフリン、および約１４ｎｇ ＤＮＡ／ｍＬ未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも約１００Ｕ／μｇの活性の組換えフリン、および約０．５ｐｇ ＤＮＡ／Ｕフリン活性未満の濃度のＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンの作製方法であって、フリンをコードするポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を無血清培地中で、該フリンの該培地中への分泌を可能にする条件下で増殖させる工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞を培地中で、血清濃度をだんだん低下させながら、すべての血清が該培地から除去されるまで適応させる工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞を、血清を含む培地中での増殖から無血清培地中での増殖に移すことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物の使用方法であって、プロタンパク質を該組成物と、該プロタンパク質からプロペプチドが切断されて成熟タンパク質が形成される条件下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項１５】
前記成熟タンパク質がフォンヴィレブランド因子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記成熟タンパク質が第ＶＩＩＩ因子である、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１１−５０７５５０（Ｐ２０１１−５０７５５０Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４０８１８（Ｐ２０１０−５４０８１８）
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８７７３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８８７１３
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８７７３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８８７１３
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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