巨核球の計数方法及び装置
【課題】 正確に巨核球を計数する方法を提供する。
【解決手段】
巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製し、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出し、検出された前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて巨核球を識別し、識別された巨核球を計数する。
【解決手段】
巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製し、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出し、検出された前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて巨核球を識別し、識別された巨核球を計数する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球の計数方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、骨髄の巨核球を分類計数することにより、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な骨髄中には、巨核球が一定数で存在する。巨核球は血小板の母細胞であり、末梢血液中の血小板減少や血小板増多などの疾患の存在により、巨核球数は変動することがあり、この巨核球数を分類計数することは、疾患の存在についての情報を得る上で有用である。例えば、特発性血小板減少症紫斑病（ITP）・血栓性血小板減少症紫斑病（TTP）・本態性血小板血症・慢性骨髄性白血病においては、巨核球数が増加し、再生不良性貧血おいては巨核球数が減少する。
【０００３】
従来、巨核球数算定を行うには、骨髄穿刺液に適当な染色を施した後にFuchs-Rosenthal計算盤のような血球計算盤上に移し、顕微鏡で観察しながら、分類計数するのが一般的であった。巨核球の形態的な特徴としては、（１）細胞が大きい、（２）多核である、（３）細胞質がくすんで見えるなどの特徴があるが、判定基準が非常にあいまいであり、また、骨髄中の巨核球比率が非常に低いので、目視法は測定者によってバラつきが大きい。
【０００４】
近年、フローサイトメータの原理を利用し、巨核球を分類計数する試みが行われている。例えば、非特許文献１では、蛍光標識された抗血小板抗体及びプロピジウムアイオダイドを用いた２カラー測定法で巨核球を分類計数している。具体的には、まず、骨髄穿刺液から単核球を分離する。得られた単核球を含む試料には巨核球が含有されており、この試料中の巨核球を蛍光標識された抗血小板抗体で標識する。次に、２％パラホルムアルデヒドで試料中の細胞を固定した後、プロピジウムアイオダイドで染色する。こうして得られた試料をフローサイトメータで測定し、巨核球を分類・計数している。この方法では、単核球を分離するため、操作が煩雑になり、測定までの時間を要する。また、分離操作中に巨核球の一部を回収できない可能性があり、正確に巨核球数を分類計数することはできない。
【０００５】
一方、特許文献１では、自動血球計数装置を用いて巨核球を測定する方法が記載されている。具体的には、まず、巨核球系細胞株であるDami細胞を培養して巨核球を含有する試料を得る、又は、精製されたCD34陽性細胞を培養して巨核球を含有する試料を得る。そして、得られた試料を自動血球計数装置で測定し、得られた２次元分布図において巨核球が出現することが記載されている。また、精製された巨核球を含有する試料を測定して得られる２次元分布図と巨核球を含有しない試料を測定して得られる２次元分布図を比較することにより、２次元分布図において巨核球が出現する領域を決定することができることも記載されている。しかし、生体から採取された骨髄穿刺液には、巨核球以外に様々な細胞が含まれている。特に多発性骨髄腫に出現する形質細胞は、巨核球の出現位置と非常に良く似通っている。そのため、骨髄穿刺液に含まれる巨核球を、形質細胞などの他の細胞と区別して、より正確に巨核球を測定できる方法が求められている。
【０００６】
【非特許文献１】Tomer et al. , Blood, 1988;71: 1244-1252
【特許文献１】特開2005-024557号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より正確に巨核球を計数する方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題に鑑み本発明は、巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製する工程、測定用試料中の細胞に励起光を照射する工程、細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出する工程、検出された前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて巨核球を識別する工程、識別された巨核球を計数する工程、を含む巨核球の計数方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、巨核球を含む試料、赤血球を溶解するための溶血剤及び巨核球を染色するための核酸蛍光色素を混合して測定用試料を調製するための測定用試料調製部、測定用試料中の細胞に励起光を照射するための光源、細胞から発せられる前方散乱光を検出するための第１の散乱光検出器、細胞から発せられる側方散乱光を検出するための第２の散乱光検出器、細胞から発せられる蛍光を検出するための蛍光検出器、検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別し、識別された巨核球を計数するための解析部、を含む巨核球計数装置を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、より正確に巨核球を計数することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
巨核球は、他の血液細胞と比べて非常に大きな細胞である。そのため、細胞の大きさを反映する前方散乱光に基づいて、巨核球と他の血液細胞とを区別することができる。しかし、大きさが巨核球と類似する血液細胞（例えば、形質細胞）は、前方散乱光に基づいて巨核球と区別することは困難である。そこで、発明者らは、巨核球の核に関する次の特徴に着目した。巨核球は、核の大きさが大きく、核の形状が著明な陥凹ないし分葉したものが重なり著しい不整を呈し、核に含まれる核酸量が多い。そして、発明者らは、細胞内の構造を反映する側方散乱光及び核酸蛍光色素で染色された細胞の核酸量を反映する蛍光に基づいて、巨核球と大きさが類似する血液細胞とを区別して、正確に巨核球を計数する方法を見いだした。
【００１２】
具体的には、まず、巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製する。次に、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出する。検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別する。そして、識別された巨核球を計数する。ここで、前方散乱光により「巨核球」と「大きさが巨核球と異なる細胞」とが区別され、側方散乱光及び蛍光により「巨核球」と「大きさが巨核球と似ている細胞」とが区別される。これにより、試料に含まれる巨核球を、形質細胞などの他の細胞と区別して、より正確に計数することができる。
【００１３】
巨核球を含む試料としては、血液の細胞を造っている骨髄から骨髄穿刺により採取される骨髄穿刺液が挙げられる。骨髄穿刺液は、巨核球やその他の血液細胞を含む。試料として、骨髄穿刺液を使用する場合、骨片やフィブリン塊などの夾雑物が多数存在するため、適度な径のナイロンメッシュであらかじめろ過することが好ましい。この操作により、巨核球はナイロンメッシュを通過する一方、夾雑物は通過できないため、試料から夾雑物を取り除くことができる。
【００１４】
上述した試料から測定用試料を調製するために、試料中の赤血球を溶解するための溶血剤、及び、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色するための核酸蛍光色素を使用することができる。
【００１５】
溶血剤は、試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、測定対象とする巨核球の細胞膜に少なくとも色素分子が透過するのに十分な細孔をあけるために使用される。この目的に使用する溶血剤は、例えば、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、及びｐＨを一定に保つための緩衝剤を含むｐＨ4.5 - 11.0、好ましくはｐＨ5.0 -10.0の水溶液が挙げられる。
【００１６】
カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤やピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。４級アンモニウム塩型界面活性剤は、以下の化学式１で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。
【００１７】
【化１】
【００１８】
ピリジニウム塩型界面活性剤は、以下の化学式２で表される全炭素数１１〜３０の界面活性剤が挙げられる。
【００１９】
【化２】
【００２０】
なお、化学式１及び２において、Ｒ1は炭素数６〜１８のアルキル基又は炭素数６〜１８のアルケニル基である。化学式１において、Ｒ2およびＲ3は炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルケニル基である。化学式１において、Ｒ4は炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルケニル基又はベンジル基である。化学式１及び２において、Ｘはハロゲン原子である。Ｒ1のアルキル基又はアルケニル基としては、へキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デシル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。また、Ｒ2およびＲ3のアルキル基、アルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。さらに、Ｒ4のアルキル基又はアルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。カチオン性界面活性剤の濃度は、一般に200−1,500ppm、好ましくは500−1,000ppm、さらに好ましくは、600−800ppmである。
【００２１】
ノニオン性界面活性剤としては以下の式のポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい：Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ〔式中、Ｒ1は炭素数８〜２５のアルキル基、炭素数８〜２５のアルケニル基又は炭素数８〜２５のアルキニル基；Ｒ2はＯ、
【００２２】
【化３】
またはＣＯＯ；ｎは１０〜５０の整数を表す。〕ノニオン性界面活性剤の濃度は、一般に500−3,000ppm、好ましくは、1,000−2,500ppm、さらに好ましくは1,500−2,000ppmである。
【００２３】
さらに、溶血剤中に少なくとも１つの、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有させてもよい。例えば、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸もしくはその塩などが好適に使用できる。有機酸もしくはその塩の濃度は、一般的に10−100mM、好ましくは15−50mM、より好ましくは20−30mMである。
【００２４】
溶血剤のｐＨは4.5 -11.0、好ましくは5.0 - 10.0であり、ｐＨを一定に保つために例えば、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩などの緩衝剤を含む。緩衝剤の濃度は、一般的に5−100mM、好ましくは10−50mMである。なお、前述の有機酸が緩衝剤として作用する場合には、緩衝剤は必ずしも必要な成分ではない。
【００２５】
溶血剤を試料に添加して試料中の赤血球を溶解し、巨核球の細胞膜を色素が通過できるように処理する。これにより、巨核球を核酸蛍光色素で染色することができる。例えば試料として骨髄穿刺液を使用する場合、骨髄穿刺液と溶血剤の混合比は、一般的に1:20−1:200、好ましくは1:30−1:100、さらに好ましくは1:40−1:60である。
【００２６】
核酸蛍光色素とは、細胞内の核酸を特異的に染色する蛍光色素である。核酸蛍光色素としては、使用する光源の波長によって異なるが、例えば、以下の化学式４の構造を有する色素を使用することができる。
【００２７】
【化４】
【００２８】
（式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは０，1又は２であり；Ｘ-はアニオンである）。
【００２９】
上記の色素のうち、少なくともＲ1あるいはＲ4のいずれかが長鎖の（炭素数６〜１８の）アルキル基である色素が好ましい。
【００３０】
Ｒ1もしくはＲ4のアルキル基の炭素数が６、８、１０の色素が特に好適である。
【００３１】
Ｒ2およびＲ3における低級アルキル基又は低級アルコキシ基とは、炭素数１〜８の直鎖のアルキル基又は炭素数１〜８の直鎖のアルコキシ基をいい、好ましくはメチル基、メトキシ基、エチル基、エトキシ基である。
【００３２】
Ｘ−として好適なアニオンにはＦ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−等のハロゲンイオン、およびＣＦ3ＳＯ3−、ＢＦ4−などを含む。
【００３３】
Ｚとしては、硫黄原子、酸素原子、あるいはメチル基、エチル基、イソプロピル基などの低級アルキル基で置換されている炭素原子が好ましい。
【００３４】
光源として赤半導体レーザーを用いる場合、核酸蛍光色素としては、化学式４においてＲ1=メチル、Ｒ2=Ｒ3=Ｈ、Ｒ4=ｎ-オクチル、ｎ=１、Ｚ=Ｓ、X=ＣＦ3ＳＯ3−である色素が特に好ましい。以降、この核酸蛍光色素を化合物Ａと称す。
【００３５】
他の核酸蛍光色素としては、例えば、プロピジウムアイオダイド、N−メチル−４−（１−ピレン）ビニル−プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、TOTO-1、TOTO-3、YOYO-1、YOYO-3、BOBO-1、BOBO-3、エチジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウムホモダイマー−２（EthD-2）、POPO-1、POPO-3、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1等が挙げられる。
【００３６】
使用する核酸蛍光色素は、測定に使用する光源の波長によって適宜選択することができる。
【００３７】
色素の濃度は使用する色素により異なるが、一般に0.0001-1000ppm、好ましくは0.01-100ppm、さらに好ましくは0.1-10ppmである。なお、この濃度は溶血剤と核酸蛍光色素を混合したときの濃度である。
【００３８】
測定用試料の調製において上述した溶血剤及び核酸蛍光色素を使用する場合、例えば、核酸蛍光色素を含有する溶血剤からなる試薬と試料とを混合して測定用試料を調製してもよい。また、溶血剤からなる第１試薬、核酸蛍光色素を含む第２試薬及び試料を混合して測定用試料を調製してもよい。溶血剤からなる第１試薬、核酸蛍光色素を含む第２試薬及び試料を混合する順番は特に限定されない。例えば、溶血剤からなる第１試薬と核酸蛍光色素を含有する第２試薬とを混合し、その混合液と試料とを混合して測定用試料を調製してもよい。また、溶血剤からなる第１試薬と試料とを混合し、その混合液と核酸蛍光色素を含有する第２試薬とを混合して測定用試料を調製してもよい。
【００３９】
上述したように調製された測定用試料には、励起光が照射される。そして、測定用試料中の細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光が検出される。例えば、測定にフローサイトメータを使用する場合、調製された測定用試料はフローサイトメータのフローセルに導かれる。そして、フローセル中を流れる測定用試料に励起光が照射され、測定用試料中の細胞より発せられる散乱光及び蛍光を検出される。
【００４０】
本実施形態の巨核球計数装置の構成図の例を図１に示す。巨核球計数装置１００は、試料から測定用試料を調製することが可能な測定用試料調製部１０１、測定用試料調製部１０１で調製された測定用試料を測定するための検出部１０２、検出部１０２で検出された信号を解析するための解析部３５、解析部３５で解析された結果を表示するための表示部１０３から構成される。
【００４１】
検出部１０２として使用されるフローサイトメータの光学系の一例を図２に示す。図２において光源（例えばレーザダイオード）２１から出射された励起光はコリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。光源としては特に制限されず、アルゴンレーザー、Ｈｅ−Ｎｅレーザー、半導体レーザーなどが使用される。
【００４２】
ノズル６から吐出されオリフィス部を通過する細胞から発せられる前方散乱光は、集光レンズ２４とピンホール板２５を介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。
【００４３】
一方、オリフィス部を通過する細胞から発せられる側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とを介して側方散乱光検出器（フォトマルチプライアチューブ）２９に入射する。オリフィス部を通過する細胞から発せられる側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２９とピンホール板３０を介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。なお、巨核球は、他の血液細胞と比べて核酸量の多い細胞であることから、核酸蛍光色素で染色された巨核球の蛍光強度は強い。そのため、通常白血球を測定するときよりも蛍光検出器の感度を下げて巨核球が測定できるように調整しておくことが好ましい。
【００４４】
前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２、３３、３４により増幅され、解析部３５に入力される。
【００４５】
ここで、解析部３５は、入力された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号に基づいて、巨核球を識別するための解析を行う。例えば、前方散乱光強度と側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、前記第１の２次元分布図上で第１の巨核球領域を特定する。さらに、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、前記第２の２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定する。そして、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞数を計数し、所望の演算を行い計数結果や演算結果を表示部１０３に表示させる。
【００４６】
巨核球は、他の血液細胞と比べて非常に大きな細胞であるため、前方散乱光強度が大きくなる。さらに、巨核球は、核の大きさも大きく、その形状は著明な陥凹ないし分葉したものが重なり、著しい不整を呈するため、側方散乱光強度が大きくなる。また、巨核球は核酸量が非常に多いため、核酸蛍光色素で染色された巨核球の蛍光強度が大きくなる。
【００４７】
従って、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で、相対的に前方散乱光強度及び側方散乱光強度の大きい領域を第１の巨核球領域として特定し（例えば図３のMEG1領域）、この領域内に出現する細胞数を計数することで巨核球数を計数することができる。しかし、形質細胞などの大きさが巨核球と類似する細胞が試料に含まれる場合は、上記の領域内に形質細胞が混入して巨核球数が偽高値になる場合があるので、さらに、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で、相対的に側方散乱光強度が大きく、蛍光強度が大きい領域を第２の巨核球領域を特定する（例えば図４のMEG2領域）。次に、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として計数する。これにより、巨核球数を正確に計数することができる。
【００４８】
なお、次のような方法で巨核球数を求めてもよい。まず、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で、相対的に前方散乱光強度及び側方散乱光強度の大きい領域を第１の巨核球領域として特定する。そして、第１の巨核球領域に出現した細胞について、さらに、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で、相対的に側方散乱光強度が大きく、蛍光強度が大きい領域を第２の巨核球領域を特定し、第２の巨核球領域内の細胞を巨核球として計数する。
【００４９】
さらに、次のような方法で巨核球数を求めてもよい。まず、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で、相対的に側方散乱光強度が大きく、蛍光強度が大きい領域を第１の巨核球領域として特定する。そして、第１の巨核球領域に出現した細胞ついて、さらに、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で、相対的に前方散乱光強度及び側方散乱光強度の大きい領域を第２の巨核球領域を特定し、第２の巨核球領域内の細胞を巨核球として計数する。
【００５０】
なお、上述した方法では、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする２次元分布図を作成しているが、これに限定されない。前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする２次元分布図の代わりに、横軸が前方散乱光強度で縦軸が細胞数である粒度分布図を使用することができる。この場合、前方散乱光強度について所定の閾値を設定し、その閾値以上の前方散乱光強度を示す細胞を巨核球として識別することができる。
【００５１】
要するに、本実施形態では、検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別する。より具体的には、
（１）細胞の大きさを反映する前方散乱光に基づいて、巨核球を含む第1の細胞集団を特定し、
（２）細胞の内部情報を反映する側方散乱光及び核酸量を反映する蛍光に基づいて、巨核球を含む第２の細胞集団を特定し、
（３）第１の細胞集団に属し、且つ、第２の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別する。
【００５２】
また、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする２次元分布図上で、所定の散乱光強度と蛍光強度を有する領域を有核細胞領域（例えば図４のNC領域；図４において、NC領域はMEG2領域を含む）として特定し、その領域内の細胞数を有核細胞数として計数し、これと上記で得られた巨核球数より有核細胞中の巨核球比率を求めることができる。
【００５３】
実施例
（巨核球含有試料の調製）
骨髄穿刺液を孔径が100μmのナイロンメッシュでろ過し、骨片などの夾雑物を取り除き、巨核球含有試料を調製した。
【００５４】
（溶血剤）
HEPES（市販品） 10mM
フタル酸水素カリウム（市販品） 20mM
BC30TX（POE(30)セチルエーテル）（日光ケミカルズ） 1850ppm
ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド（市販品） 650ppm
精製水 1L
NaOHでpHを7.0に調整
【００５５】
（染色液）
色素化合物A 27.5ppm
エチレングリコール 1L
【００５６】
（測定）
溶血剤980μL及び上記の染色液20μLに対して巨核球含有試料20μLを加え、40℃で30秒間反応させた後、赤半導体レーザーを光源とするフローサイトメータで、側方散乱光、前方散乱光、蛍光を測定した。
【００５７】
次に、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で、相対的に前方散乱光強度及び側方散乱光強度の大きい領域を第１の巨核球領域（MEG1領域）とした。また、さらに、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で、相対的に側方散乱光強度が大きく、蛍光強度が大きい領域を第２の巨核球領域（MEG2領域）とした。MEG1領域内及びMEG2領域内に出現する細胞を巨核球として計数した。一方、対照法として、巨核球含有試料をチュルク氏液で染色し、Fuchs-Rosentalの血球計算盤に移し、目視法により巨核球を計数した。
【００５８】
図３、図５、図７は、それぞれ、測定に用いた３３検体のうち３検体の第１の２次元分布図である。特に、図７は、形質細胞を含有する検体の第１の２次元分布図である。図中のMEG1は第１の巨核球領域を示す。一方、図４は、図３と同じ検体についての第２の２次元分布図である。図６は、図５と同じ検体についての第２の２次元分布図である。図８は、図７と同じ検体についての第２の２次元分布図である。図中のMEG2は第２の巨核球領域を示し、NCは有核細胞領域を示す。
【００５９】
図４、図６及び図８を比較すること、図８には、図４や図６では見られなかった位置に細胞の集団が出現した。図８が形質細胞を含む検体を用いた測定により得られたデータであることから、前記の細胞集団が形質細胞であることが分かった。また、前記の細胞集団は巨核球が出現する領域（MEG2）とは異なる位置に出現した。これより、形質細胞が出現する領域と巨核球が出現する領域（MEG2）が異なることが分かった。
【００６０】
さらに、測定に用いた３３検体について、本実施形態の方法で得られた巨核球数と目視法により得られた巨核球数との相関を調べた（図９）。回帰直線式がy=1.0211x+19.034、相関係数がr=0.79となり、相関は良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、フローサイトメトリー法を採用した自動血球分析装置で、簡便、迅速に正確に巨核球を計数できるので、これまで目視法に頼らざるを得なかった巨核球検査の自動化に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施形態の巨核球計数装置の構成図である。
【図２】本発明の実施形態の巨核球計数装置の検出部として使用されるフローサイトメータの光学系の一例である。
【図３】実施例において得られた前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図である。
【図４】実施例において得られた側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図である。
【図５】実施例において得られた前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図である。
【図６】実施例において得られた側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図である。
【図７】実施例において得られた前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図である。
【図８】実施例において得られた側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図である。
【図９】実施例において得られた巨核球数と目視法で得られた巨核球数との相関を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球の計数方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、骨髄の巨核球を分類計数することにより、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な骨髄中には、巨核球が一定数で存在する。巨核球は血小板の母細胞であり、末梢血液中の血小板減少や血小板増多などの疾患の存在により、巨核球数は変動することがあり、この巨核球数を分類計数することは、疾患の存在についての情報を得る上で有用である。例えば、特発性血小板減少症紫斑病（ITP）・血栓性血小板減少症紫斑病（TTP）・本態性血小板血症・慢性骨髄性白血病においては、巨核球数が増加し、再生不良性貧血おいては巨核球数が減少する。
【０００３】
従来、巨核球数算定を行うには、骨髄穿刺液に適当な染色を施した後にFuchs-Rosenthal計算盤のような血球計算盤上に移し、顕微鏡で観察しながら、分類計数するのが一般的であった。巨核球の形態的な特徴としては、（１）細胞が大きい、（２）多核である、（３）細胞質がくすんで見えるなどの特徴があるが、判定基準が非常にあいまいであり、また、骨髄中の巨核球比率が非常に低いので、目視法は測定者によってバラつきが大きい。
【０００４】
近年、フローサイトメータの原理を利用し、巨核球を分類計数する試みが行われている。例えば、非特許文献１では、蛍光標識された抗血小板抗体及びプロピジウムアイオダイドを用いた２カラー測定法で巨核球を分類計数している。具体的には、まず、骨髄穿刺液から単核球を分離する。得られた単核球を含む試料には巨核球が含有されており、この試料中の巨核球を蛍光標識された抗血小板抗体で標識する。次に、２％パラホルムアルデヒドで試料中の細胞を固定した後、プロピジウムアイオダイドで染色する。こうして得られた試料をフローサイトメータで測定し、巨核球を分類・計数している。この方法では、単核球を分離するため、操作が煩雑になり、測定までの時間を要する。また、分離操作中に巨核球の一部を回収できない可能性があり、正確に巨核球数を分類計数することはできない。
【０００５】
一方、特許文献１では、自動血球計数装置を用いて巨核球を測定する方法が記載されている。具体的には、まず、巨核球系細胞株であるDami細胞を培養して巨核球を含有する試料を得る、又は、精製されたCD34陽性細胞を培養して巨核球を含有する試料を得る。そして、得られた試料を自動血球計数装置で測定し、得られた２次元分布図において巨核球が出現することが記載されている。また、精製された巨核球を含有する試料を測定して得られる２次元分布図と巨核球を含有しない試料を測定して得られる２次元分布図を比較することにより、２次元分布図において巨核球が出現する領域を決定することができることも記載されている。しかし、生体から採取された骨髄穿刺液には、巨核球以外に様々な細胞が含まれている。特に多発性骨髄腫に出現する形質細胞は、巨核球の出現位置と非常に良く似通っている。そのため、骨髄穿刺液に含まれる巨核球を、形質細胞などの他の細胞と区別して、より正確に巨核球を測定できる方法が求められている。
【０００６】
【非特許文献１】Tomer et al. , Blood, 1988;71: 1244-1252
【特許文献１】特開2005-024557号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より正確に巨核球を計数する方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題に鑑み本発明は、巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製する工程、測定用試料中の細胞に励起光を照射する工程、細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出する工程、検出された前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて巨核球を識別する工程、識別された巨核球を計数する工程、を含む巨核球の計数方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、巨核球を含む試料、赤血球を溶解するための溶血剤及び巨核球を染色するための核酸蛍光色素を混合して測定用試料を調製するための測定用試料調製部、測定用試料中の細胞に励起光を照射するための光源、細胞から発せられる前方散乱光を検出するための第１の散乱光検出器、細胞から発せられる側方散乱光を検出するための第２の散乱光検出器、細胞から発せられる蛍光を検出するための蛍光検出器、検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別し、識別された巨核球を計数するための解析部、を含む巨核球計数装置を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、より正確に巨核球を計数することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
巨核球は、他の血液細胞と比べて非常に大きな細胞である。そのため、細胞の大きさを反映する前方散乱光に基づいて、巨核球と他の血液細胞とを区別することができる。しかし、大きさが巨核球と類似する血液細胞（例えば、形質細胞）は、前方散乱光に基づいて巨核球と区別することは困難である。そこで、発明者らは、巨核球の核に関する次の特徴に着目した。巨核球は、核の大きさが大きく、核の形状が著明な陥凹ないし分葉したものが重なり著しい不整を呈し、核に含まれる核酸量が多い。そして、発明者らは、細胞内の構造を反映する側方散乱光及び核酸蛍光色素で染色された細胞の核酸量を反映する蛍光に基づいて、巨核球と大きさが類似する血液細胞とを区別して、正確に巨核球を計数する方法を見いだした。
【００１２】
具体的には、まず、巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製する。次に、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出する。検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別する。そして、識別された巨核球を計数する。ここで、前方散乱光により「巨核球」と「大きさが巨核球と異なる細胞」とが区別され、側方散乱光及び蛍光により「巨核球」と「大きさが巨核球と似ている細胞」とが区別される。これにより、試料に含まれる巨核球を、形質細胞などの他の細胞と区別して、より正確に計数することができる。
【００１３】
巨核球を含む試料としては、血液の細胞を造っている骨髄から骨髄穿刺により採取される骨髄穿刺液が挙げられる。骨髄穿刺液は、巨核球やその他の血液細胞を含む。試料として、骨髄穿刺液を使用する場合、骨片やフィブリン塊などの夾雑物が多数存在するため、適度な径のナイロンメッシュであらかじめろ過することが好ましい。この操作により、巨核球はナイロンメッシュを通過する一方、夾雑物は通過できないため、試料から夾雑物を取り除くことができる。
【００１４】
上述した試料から測定用試料を調製するために、試料中の赤血球を溶解するための溶血剤、及び、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色するための核酸蛍光色素を使用することができる。
【００１５】
溶血剤は、試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、測定対象とする巨核球の細胞膜に少なくとも色素分子が透過するのに十分な細孔をあけるために使用される。この目的に使用する溶血剤は、例えば、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、及びｐＨを一定に保つための緩衝剤を含むｐＨ4.5 - 11.0、好ましくはｐＨ5.0 -10.0の水溶液が挙げられる。
【００１６】
カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤やピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。４級アンモニウム塩型界面活性剤は、以下の化学式１で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。
【００１７】
【化１】
【００１８】
ピリジニウム塩型界面活性剤は、以下の化学式２で表される全炭素数１１〜３０の界面活性剤が挙げられる。
【００１９】
【化２】
【００２０】
なお、化学式１及び２において、Ｒ1は炭素数６〜１８のアルキル基又は炭素数６〜１８のアルケニル基である。化学式１において、Ｒ2およびＲ3は炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルケニル基である。化学式１において、Ｒ4は炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルケニル基又はベンジル基である。化学式１及び２において、Ｘはハロゲン原子である。Ｒ1のアルキル基又はアルケニル基としては、へキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デシル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。また、Ｒ2およびＲ3のアルキル基、アルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。さらに、Ｒ4のアルキル基又はアルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。カチオン性界面活性剤の濃度は、一般に200−1,500ppm、好ましくは500−1,000ppm、さらに好ましくは、600−800ppmである。
【００２１】
ノニオン性界面活性剤としては以下の式のポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい：Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ〔式中、Ｒ1は炭素数８〜２５のアルキル基、炭素数８〜２５のアルケニル基又は炭素数８〜２５のアルキニル基；Ｒ2はＯ、
【００２２】
【化３】
またはＣＯＯ；ｎは１０〜５０の整数を表す。〕ノニオン性界面活性剤の濃度は、一般に500−3,000ppm、好ましくは、1,000−2,500ppm、さらに好ましくは1,500−2,000ppmである。
【００２３】
さらに、溶血剤中に少なくとも１つの、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有させてもよい。例えば、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸もしくはその塩などが好適に使用できる。有機酸もしくはその塩の濃度は、一般的に10−100mM、好ましくは15−50mM、より好ましくは20−30mMである。
【００２４】
溶血剤のｐＨは4.5 -11.0、好ましくは5.0 - 10.0であり、ｐＨを一定に保つために例えば、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩などの緩衝剤を含む。緩衝剤の濃度は、一般的に5−100mM、好ましくは10−50mMである。なお、前述の有機酸が緩衝剤として作用する場合には、緩衝剤は必ずしも必要な成分ではない。
【００２５】
溶血剤を試料に添加して試料中の赤血球を溶解し、巨核球の細胞膜を色素が通過できるように処理する。これにより、巨核球を核酸蛍光色素で染色することができる。例えば試料として骨髄穿刺液を使用する場合、骨髄穿刺液と溶血剤の混合比は、一般的に1:20−1:200、好ましくは1:30−1:100、さらに好ましくは1:40−1:60である。
【００２６】
核酸蛍光色素とは、細胞内の核酸を特異的に染色する蛍光色素である。核酸蛍光色素としては、使用する光源の波長によって異なるが、例えば、以下の化学式４の構造を有する色素を使用することができる。
【００２７】
【化４】
【００２８】
（式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基、又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸素、あるいは低級アルキル基を有する炭素であり；ｎは０，1又は２であり；Ｘ-はアニオンである）。
【００２９】
上記の色素のうち、少なくともＲ1あるいはＲ4のいずれかが長鎖の（炭素数６〜１８の）アルキル基である色素が好ましい。
【００３０】
Ｒ1もしくはＲ4のアルキル基の炭素数が６、８、１０の色素が特に好適である。
【００３１】
Ｒ2およびＲ3における低級アルキル基又は低級アルコキシ基とは、炭素数１〜８の直鎖のアルキル基又は炭素数１〜８の直鎖のアルコキシ基をいい、好ましくはメチル基、メトキシ基、エチル基、エトキシ基である。
【００３２】
Ｘ−として好適なアニオンにはＦ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−等のハロゲンイオン、およびＣＦ3ＳＯ3−、ＢＦ4−などを含む。
【００３３】
Ｚとしては、硫黄原子、酸素原子、あるいはメチル基、エチル基、イソプロピル基などの低級アルキル基で置換されている炭素原子が好ましい。
【００３４】
光源として赤半導体レーザーを用いる場合、核酸蛍光色素としては、化学式４においてＲ1=メチル、Ｒ2=Ｒ3=Ｈ、Ｒ4=ｎ-オクチル、ｎ=１、Ｚ=Ｓ、X=ＣＦ3ＳＯ3−である色素が特に好ましい。以降、この核酸蛍光色素を化合物Ａと称す。
【００３５】
他の核酸蛍光色素としては、例えば、プロピジウムアイオダイド、N−メチル−４−（１−ピレン）ビニル−プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、TOTO-1、TOTO-3、YOYO-1、YOYO-3、BOBO-1、BOBO-3、エチジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウムホモダイマー−２（EthD-2）、POPO-1、POPO-3、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1等が挙げられる。
【００３６】
使用する核酸蛍光色素は、測定に使用する光源の波長によって適宜選択することができる。
【００３７】
色素の濃度は使用する色素により異なるが、一般に0.0001-1000ppm、好ましくは0.01-100ppm、さらに好ましくは0.1-10ppmである。なお、この濃度は溶血剤と核酸蛍光色素を混合したときの濃度である。
【００３８】
測定用試料の調製において上述した溶血剤及び核酸蛍光色素を使用する場合、例えば、核酸蛍光色素を含有する溶血剤からなる試薬と試料とを混合して測定用試料を調製してもよい。また、溶血剤からなる第１試薬、核酸蛍光色素を含む第２試薬及び試料を混合して測定用試料を調製してもよい。溶血剤からなる第１試薬、核酸蛍光色素を含む第２試薬及び試料を混合する順番は特に限定されない。例えば、溶血剤からなる第１試薬と核酸蛍光色素を含有する第２試薬とを混合し、その混合液と試料とを混合して測定用試料を調製してもよい。また、溶血剤からなる第１試薬と試料とを混合し、その混合液と核酸蛍光色素を含有する第２試薬とを混合して測定用試料を調製してもよい。
【００３９】
上述したように調製された測定用試料には、励起光が照射される。そして、測定用試料中の細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光が検出される。例えば、測定にフローサイトメータを使用する場合、調製された測定用試料はフローサイトメータのフローセルに導かれる。そして、フローセル中を流れる測定用試料に励起光が照射され、測定用試料中の細胞より発せられる散乱光及び蛍光を検出される。
【００４０】
本実施形態の巨核球計数装置の構成図の例を図１に示す。巨核球計数装置１００は、試料から測定用試料を調製することが可能な測定用試料調製部１０１、測定用試料調製部１０１で調製された測定用試料を測定するための検出部１０２、検出部１０２で検出された信号を解析するための解析部３５、解析部３５で解析された結果を表示するための表示部１０３から構成される。
【００４１】
検出部１０２として使用されるフローサイトメータの光学系の一例を図２に示す。図２において光源（例えばレーザダイオード）２１から出射された励起光はコリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。光源としては特に制限されず、アルゴンレーザー、Ｈｅ−Ｎｅレーザー、半導体レーザーなどが使用される。
【００４２】
ノズル６から吐出されオリフィス部を通過する細胞から発せられる前方散乱光は、集光レンズ２４とピンホール板２５を介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。
【００４３】
一方、オリフィス部を通過する細胞から発せられる側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とを介して側方散乱光検出器（フォトマルチプライアチューブ）２９に入射する。オリフィス部を通過する細胞から発せられる側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２９とピンホール板３０を介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。なお、巨核球は、他の血液細胞と比べて核酸量の多い細胞であることから、核酸蛍光色素で染色された巨核球の蛍光強度は強い。そのため、通常白血球を測定するときよりも蛍光検出器の感度を下げて巨核球が測定できるように調整しておくことが好ましい。
【００４４】
前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２、３３、３４により増幅され、解析部３５に入力される。
【００４５】
ここで、解析部３５は、入力された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号に基づいて、巨核球を識別するための解析を行う。例えば、前方散乱光強度と側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、前記第１の２次元分布図上で第１の巨核球領域を特定する。さらに、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、前記第２の２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定する。そして、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞数を計数し、所望の演算を行い計数結果や演算結果を表示部１０３に表示させる。
【００４６】
巨核球は、他の血液細胞と比べて非常に大きな細胞であるため、前方散乱光強度が大きくなる。さらに、巨核球は、核の大きさも大きく、その形状は著明な陥凹ないし分葉したものが重なり、著しい不整を呈するため、側方散乱光強度が大きくなる。また、巨核球は核酸量が非常に多いため、核酸蛍光色素で染色された巨核球の蛍光強度が大きくなる。
【００４７】
従って、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で、相対的に前方散乱光強度及び側方散乱光強度の大きい領域を第１の巨核球領域として特定し（例えば図３のMEG1領域）、この領域内に出現する細胞数を計数することで巨核球数を計数することができる。しかし、形質細胞などの大きさが巨核球と類似する細胞が試料に含まれる場合は、上記の領域内に形質細胞が混入して巨核球数が偽高値になる場合があるので、さらに、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で、相対的に側方散乱光強度が大きく、蛍光強度が大きい領域を第２の巨核球領域を特定する（例えば図４のMEG2領域）。次に、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として計数する。これにより、巨核球数を正確に計数することができる。
【００４８】
なお、次のような方法で巨核球数を求めてもよい。まず、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で、相対的に前方散乱光強度及び側方散乱光強度の大きい領域を第１の巨核球領域として特定する。そして、第１の巨核球領域に出現した細胞について、さらに、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で、相対的に側方散乱光強度が大きく、蛍光強度が大きい領域を第２の巨核球領域を特定し、第２の巨核球領域内の細胞を巨核球として計数する。
【００４９】
さらに、次のような方法で巨核球数を求めてもよい。まず、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で、相対的に側方散乱光強度が大きく、蛍光強度が大きい領域を第１の巨核球領域として特定する。そして、第１の巨核球領域に出現した細胞ついて、さらに、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で、相対的に前方散乱光強度及び側方散乱光強度の大きい領域を第２の巨核球領域を特定し、第２の巨核球領域内の細胞を巨核球として計数する。
【００５０】
なお、上述した方法では、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする２次元分布図を作成しているが、これに限定されない。前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする２次元分布図の代わりに、横軸が前方散乱光強度で縦軸が細胞数である粒度分布図を使用することができる。この場合、前方散乱光強度について所定の閾値を設定し、その閾値以上の前方散乱光強度を示す細胞を巨核球として識別することができる。
【００５１】
要するに、本実施形態では、検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別する。より具体的には、
（１）細胞の大きさを反映する前方散乱光に基づいて、巨核球を含む第1の細胞集団を特定し、
（２）細胞の内部情報を反映する側方散乱光及び核酸量を反映する蛍光に基づいて、巨核球を含む第２の細胞集団を特定し、
（３）第１の細胞集団に属し、且つ、第２の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別する。
【００５２】
また、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする２次元分布図上で、所定の散乱光強度と蛍光強度を有する領域を有核細胞領域（例えば図４のNC領域；図４において、NC領域はMEG2領域を含む）として特定し、その領域内の細胞数を有核細胞数として計数し、これと上記で得られた巨核球数より有核細胞中の巨核球比率を求めることができる。
【００５３】
実施例
（巨核球含有試料の調製）
骨髄穿刺液を孔径が100μmのナイロンメッシュでろ過し、骨片などの夾雑物を取り除き、巨核球含有試料を調製した。
【００５４】
（溶血剤）
HEPES（市販品） 10mM
フタル酸水素カリウム（市販品） 20mM
BC30TX（POE(30)セチルエーテル）（日光ケミカルズ） 1850ppm
ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド（市販品） 650ppm
精製水 1L
NaOHでpHを7.0に調整
【００５５】
（染色液）
色素化合物A 27.5ppm
エチレングリコール 1L
【００５６】
（測定）
溶血剤980μL及び上記の染色液20μLに対して巨核球含有試料20μLを加え、40℃で30秒間反応させた後、赤半導体レーザーを光源とするフローサイトメータで、側方散乱光、前方散乱光、蛍光を測定した。
【００５７】
次に、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で、相対的に前方散乱光強度及び側方散乱光強度の大きい領域を第１の巨核球領域（MEG1領域）とした。また、さらに、側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で、相対的に側方散乱光強度が大きく、蛍光強度が大きい領域を第２の巨核球領域（MEG2領域）とした。MEG1領域内及びMEG2領域内に出現する細胞を巨核球として計数した。一方、対照法として、巨核球含有試料をチュルク氏液で染色し、Fuchs-Rosentalの血球計算盤に移し、目視法により巨核球を計数した。
【００５８】
図３、図５、図７は、それぞれ、測定に用いた３３検体のうち３検体の第１の２次元分布図である。特に、図７は、形質細胞を含有する検体の第１の２次元分布図である。図中のMEG1は第１の巨核球領域を示す。一方、図４は、図３と同じ検体についての第２の２次元分布図である。図６は、図５と同じ検体についての第２の２次元分布図である。図８は、図７と同じ検体についての第２の２次元分布図である。図中のMEG2は第２の巨核球領域を示し、NCは有核細胞領域を示す。
【００５９】
図４、図６及び図８を比較すること、図８には、図４や図６では見られなかった位置に細胞の集団が出現した。図８が形質細胞を含む検体を用いた測定により得られたデータであることから、前記の細胞集団が形質細胞であることが分かった。また、前記の細胞集団は巨核球が出現する領域（MEG2）とは異なる位置に出現した。これより、形質細胞が出現する領域と巨核球が出現する領域（MEG2）が異なることが分かった。
【００６０】
さらに、測定に用いた３３検体について、本実施形態の方法で得られた巨核球数と目視法により得られた巨核球数との相関を調べた（図９）。回帰直線式がy=1.0211x+19.034、相関係数がr=0.79となり、相関は良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、フローサイトメトリー法を採用した自動血球分析装置で、簡便、迅速に正確に巨核球を計数できるので、これまで目視法に頼らざるを得なかった巨核球検査の自動化に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施形態の巨核球計数装置の構成図である。
【図２】本発明の実施形態の巨核球計数装置の検出部として使用されるフローサイトメータの光学系の一例である。
【図３】実施例において得られた前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図である。
【図４】実施例において得られた側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図である。
【図５】実施例において得られた前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図である。
【図６】実施例において得られた側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図である。
【図７】実施例において得られた前方散乱光強度及び側方散乱光強度を２軸とする第１の２次元分布図である。
【図８】実施例において得られた側方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする第２の２次元分布図である。
【図９】実施例において得られた巨核球数と目視法で得られた巨核球数との相関を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製し、
（２）測定用試料中の細胞に励起光を照射し、
（３）細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出し、
（４）検出された前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて巨核球を識別し、
（５）識別された巨核球を計数する、
ことからなる巨核球の計数方法。
【請求項２】
前記（１）の工程において、巨核球を含む試料、赤血球を溶解するための溶血剤及び蛍光色素を混合することにより測定用試料を調製する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項３】
前記（１）の工程において、巨核球を含む試料と溶血剤を混合し、その混合液に蛍光色素を添加することにより測定用試料を調製する請求項２記載の巨核球の計数方法。
【請求項４】
前記（２）の工程において、測定用試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に励起光を照射する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項５】
前記（４）の工程において、前方散乱光により、巨核球と大きさが巨核球と異なる細胞とが区別され、側方散乱光及び蛍光により、巨核球と大きさが巨核球と似ている細胞とが区別される請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項６】
前記（４）の工程において、検出された前方散乱光に基づいて巨核球を含む第１の細胞集団を特定し、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を含む第２の細胞集団を特定し、第１の細胞集団に属し、且つ、第２の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項７】
前記（４）の工程において、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第１の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光強度から取得される蛍光強度に基づいて２次元分布図を作成し、２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項８】
前記第１の巨核球領域内に出現した細胞について、側方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて２次元分布図を作成し、２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項７記載の巨核球の計数方法。
【請求項９】
前記第２の巨核球領域内に出現した細胞について、前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第１の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項７記載の巨核球の計数方法。
【請求項１０】
前記（４）の工程において、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度及び検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度に基づいて第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で第１の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項１１】
前記第１の巨核球領域内に出現した細胞について、側方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項１０記載の巨核球の計数方法。
【請求項１２】
前記第２の巨核球領域内に出現した細胞について、前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づいて第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で第１の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項１０記載の巨核球の計数方法。
【請求項１３】
さらに、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて有核細胞を識別する工程、及び、識別された有核細胞を計数する工程を含む請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項１４】
さらに、巨核球数と有核細胞数から巨核球比率を算出する工程を含む請求項１３記載の巨核球の計数方法。
【請求項１５】
巨核球を含む試料、赤血球を溶解するための溶血剤及び巨核球を染色するための核酸蛍光色素を混合して測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料中の細胞に励起光を照射するための光源、
細胞から発せられる前方散乱光を検出するための第１の散乱光検出器、
細胞から発せられる側方散乱光を検出するための第２の散乱光検出器、
細胞から発せられる蛍光を検出するための蛍光検出器、及び
検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別し、識別された巨核球を計数するための解析部、
からなることを特徴とする巨核球計数装置。
【請求項１６】
前記測定用試料調製部が、巨核球を含む試料と溶血剤を混合し、その混合液に核酸蛍光色素を含有する溶液を添加することにより測定用試料を調製することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項１７】
さらに、測定用試料を導入するためのフローセルを含み、前記光源が、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に励起光を照射することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項１８】
前記解析部において、前方散乱光により、巨核球と大きさが巨核球と異なる細胞とが区別され、側方散乱光及び蛍光により、巨核球と大きさが巨核球と似ている細胞とが区別されることを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項１９】
前記解析部が、検出された前方散乱光に基づいて巨核球を含む第１の細胞集団を特定し、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を含む第２の細胞集団を特定し、第１の細胞集団に属し、且つ、第２の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項２０】
前記解析部が、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第１の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて２次元分布図を作成し、２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球と識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項２１】
前記解析部が、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度及び検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度に基づいて第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で第１の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球と識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項１】
（１）巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製し、
（２）測定用試料中の細胞に励起光を照射し、
（３）細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出し、
（４）検出された前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて巨核球を識別し、
（５）識別された巨核球を計数する、
ことからなる巨核球の計数方法。
【請求項２】
前記（１）の工程において、巨核球を含む試料、赤血球を溶解するための溶血剤及び蛍光色素を混合することにより測定用試料を調製する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項３】
前記（１）の工程において、巨核球を含む試料と溶血剤を混合し、その混合液に蛍光色素を添加することにより測定用試料を調製する請求項２記載の巨核球の計数方法。
【請求項４】
前記（２）の工程において、測定用試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に励起光を照射する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項５】
前記（４）の工程において、前方散乱光により、巨核球と大きさが巨核球と異なる細胞とが区別され、側方散乱光及び蛍光により、巨核球と大きさが巨核球と似ている細胞とが区別される請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項６】
前記（４）の工程において、検出された前方散乱光に基づいて巨核球を含む第１の細胞集団を特定し、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を含む第２の細胞集団を特定し、第１の細胞集団に属し、且つ、第２の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項７】
前記（４）の工程において、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第１の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光強度から取得される蛍光強度に基づいて２次元分布図を作成し、２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項８】
前記第１の巨核球領域内に出現した細胞について、側方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて２次元分布図を作成し、２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項７記載の巨核球の計数方法。
【請求項９】
前記第２の巨核球領域内に出現した細胞について、前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第１の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項７記載の巨核球の計数方法。
【請求項１０】
前記（４）の工程において、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度及び検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度に基づいて第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で第１の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項１１】
前記第１の巨核球領域内に出現した細胞について、側方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項１０記載の巨核球の計数方法。
【請求項１２】
前記第２の巨核球領域内に出現した細胞について、前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づいて第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で第１の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項１０記載の巨核球の計数方法。
【請求項１３】
さらに、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて有核細胞を識別する工程、及び、識別された有核細胞を計数する工程を含む請求項１記載の巨核球の計数方法。
【請求項１４】
さらに、巨核球数と有核細胞数から巨核球比率を算出する工程を含む請求項１３記載の巨核球の計数方法。
【請求項１５】
巨核球を含む試料、赤血球を溶解するための溶血剤及び巨核球を染色するための核酸蛍光色素を混合して測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料中の細胞に励起光を照射するための光源、
細胞から発せられる前方散乱光を検出するための第１の散乱光検出器、
細胞から発せられる側方散乱光を検出するための第２の散乱光検出器、
細胞から発せられる蛍光を検出するための蛍光検出器、及び
検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別し、識別された巨核球を計数するための解析部、
からなることを特徴とする巨核球計数装置。
【請求項１６】
前記測定用試料調製部が、巨核球を含む試料と溶血剤を混合し、その混合液に核酸蛍光色素を含有する溶液を添加することにより測定用試料を調製することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項１７】
さらに、測定用試料を導入するためのフローセルを含み、前記光源が、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に励起光を照射することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項１８】
前記解析部において、前方散乱光により、巨核球と大きさが巨核球と異なる細胞とが区別され、側方散乱光及び蛍光により、巨核球と大きさが巨核球と似ている細胞とが区別されることを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項１９】
前記解析部が、検出された前方散乱光に基づいて巨核球を含む第１の細胞集団を特定し、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を含む第２の細胞集団を特定し、第１の細胞集団に属し、且つ、第２の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項２０】
前記解析部が、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第１の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて２次元分布図を作成し、２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球と識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【請求項２１】
前記解析部が、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度及び検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度に基づいて第１の２次元分布図を作成し、第１の２次元分布図上で第１の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて第２の２次元分布図を作成し、第２の２次元分布図上で第２の巨核球領域を特定し、第１の巨核球領域内に出現し、かつ、第２の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球と識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項１５記載の巨核球計数装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−３０８５７４（Ｐ２００６−３０８５７４Ａ）
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９２３８３（Ｐ２００６−９２３８３）
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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