幹細胞への標的組込み
系譜特異的あるいは細胞運命リポーターコンストラクト、または幹細胞へのタンパク質コード配列などの、目的の配列の標的組込みについての方法および組成物を本明細書に開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本明細書は、米国仮特許出願第６１／２１２、２６５（出願日２００９年４月９日）および米国仮特許出願第６１／２６９、４３２（出願日２００９年６月２４日）を参照によりその全体を説明したものとしてここに含める。
【０００２】
（連邦支援による研究または開発に関する陳述）
該当なし。
【０００３】
本開示は、幹細胞のゲノム修飾の分野およびその用途に関係する。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞は、胚および哺乳類の成体の多くの組織に存在する未分化細胞である。成体および胚性幹細胞の両方は、種々の細胞型に分化でき、したがって、疾病、感染症、または先天性異常により損傷される細胞および組織の代替品としてのソースになり得る（例えば、Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４：８８−９１；Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４：９２−９７を参照）。多様な型の推定上の幹細胞が存在し、分化して成熟細胞になると、心臓、肝臓、または脳などの特定の組織の特有の機能を実行する。多能性幹細胞は、殆ど全ての細胞型に分化することができる潜在力を有すると考えられているが、組織幹細胞は、多くの細胞型に分化することができ潜在力があると思われている（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７５：１７３； ａｎｄ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ （１９９４） Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ． ６：５４３）。例えば、人為的な多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）は再プログラム因子の異所性発現による体細胞由来の多能性細胞である（例えば、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：１０１−１０６を参照）。これらの細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の全ての重要な特徴を備えていて、特異疾患のヒト患者から単離した細胞から産生することができる（例えば、Ｄｉｍｏｓ ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：１２１８−１２２１を参照）。
【０００５】
安定な遺伝子組換えおよび幹細胞への標的遺伝子挿入は、様々な応用がある。安定に形質移入した幹細胞は、タンパク質補充遺伝子治療のための細胞担体としておよび／または幹細胞を特定の系列に方向付けるために使用できる。例えば、Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４０（２）：２６３−２６４を参照されたい。さらに、系譜特異的レポーターコンストラクトの挿入によって系譜特異的細胞を単離でき、また創薬、標的バリデーション、および／またはこれらの結果に基づく遺伝子機能および同様な機能の幹細胞の視点による研究を可能にする。例えば、米国特許第５、６３９、６１８に、多能性胚性幹細胞を、ＤＮＡに作用可能なように結合した系譜特異的遺伝子の調節領域を持つコンストラクトで形質移入する事によって系譜特異的幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで単離することが記述されている。しかしながら、幹細胞形質移入の最近の戦略は、往々にして幹細胞に対象配列（レポーター）をランダムに挿入することである。例えば、Ｉｓｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｏｃｔ；１９（１０）：１０００−１００８； ＤｅＰａｌｍａ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｂｌｏｏｄ １０５（６）：２３０７−２３１５を参照されたい。ゲノム挿入の位置を制御できないと、ゲノム内の位置効果により幹細胞集団内で極めて様々なレベルでの発現が起こる。
【０００６】
そのうえ、導入遺伝子の安定的な遺伝子組換えおよび増幅の現法によって、導入遺伝子の物理的損失をすること、時間とともにまたは幹細胞分化が始まり次第導入遺伝子サイレンシングをすること、遺伝子の内部または隣接する導入遺伝子と自律プロモータを統合することによる挿入変異、ランダムに組み込まれた導入遺伝子に伴う異種性調節エレメントの原因による内在性遺伝子の異常な発現、再編成された遺伝子産物（内在性遺伝子、挿入された導入遺伝子、またはその両方からなる）の染色体異常および発現を生成すること、
および／または、安定的な導入遺伝子発現を提供するためのベクターの長期的持続性の必要性により永久に発現したベクター由来の遺伝子からのｉｎ ｖｉｖｏのベクターに関連した毒性または免疫原性の生成すること、を招く。その上に、系列マーカーである遺伝子などの正しい発現パターンが与えられた内在性遺伝子は、多数のｃｉｓ−エレメントの複合作用から出現する。例えばＬｅｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ （２００８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２２： ５７５−５８０を参照されたい。
【０００７】
ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用すると、相同性駆動型の修復（ＨＤＲ）経由で新規遺伝子配列を挿入するための相同的ドナー鋳型を使い極めて高効率で標的遺伝子挿入を操作できる。例えば、米国特許公報２００３０２３２４１０；２００５０２０８４８９；２００５００２６１５７；２００５００６４４７４；および２００６０１８８９８７、ならびに国際公開ＷＯ２００７／０１４２７５を参照されたい、これらの開示文献は、全ての目的について参照によりその全体を説明したものとしてここに含める。ジンクフィンガーヌクレアーゼ−駆動型遺伝子挿入により非組み込みベクターの一時的送達を使うことができ、長期に持続する送達ベクターを必要としない、よって挿入による変異と毒性またはベクター駆動遺伝子に由来する免疫原性の問題を回避する。
【０００８】
しかしながら、幹細胞集団への部位特異的組込みを制御する必要性が残る。
【発明の概要】
【０００９】
対象とする１つまたは複数の配列を幹細胞のゲノムを標的として組み込むための組成および方法をここに開示する。
【００１０】
幹細胞に挿入する配列は、タンパク質をコードする配列および／または系譜特異的レポーターコンストラクト、その他の対象とする内在性遺伝子のためのレポーター遺伝子の挿入、細胞運命決定に関わる内在性遺伝子のためのレポーター、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、およびプロモータと制御配列などの非タンパク−コード配列を含むことがある。レポーターコンストラクトは、対象とする遺伝子の恒常的な、誘導性のある、または組織特異的発現をもたらすことがある。系譜特異的レポーターで標識された幹細胞は、多様な分化の研究のために使うことができ、さらに選択した系譜特異的（または成熟）細胞型の分化細胞の精製のためにも使うことができる。系譜特異的レポーターで標識された幹細胞を、核酸、小分子、抗体またはサイトカインなどの生物製剤などの化合物を選別するのに使うことができ、および／または幹細胞の集団を操縦して対象とする特定の系列経路にそって系譜特異的細胞型に向かわせることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法で使うことができる。系譜特異的レポーターを含む幹細胞はまた、生体内での位置、究極的には最終的位置、分化の運命、および対象への導入に引き続く幹細胞の作用機序（例えば、組織への組込み）を追跡するトラッキングシステムとして使うことができる。幹細胞は、特定のレポータータンパク質をコードする配列（例えば、ＨＴＫ）が挿入された自殺カセットを含んでも良い。いくつかの実施形態では、自殺カセットは、より大きな細胞集団からの分化した亜集団の細胞の特定型を同定したり単離したりすることを促進するのに使われる。他の実施形態では、自殺カセットは、ｉｎ ｖｉｖｏで望ましくない状態（例えば、細胞が分化し奇形腫を形成した場合）に分化した幹細胞を破壊するのに使われる。同様に、１つまたは複数のポリペプチドを発現する幹細胞をタンパク質補充遺伝子治療のための細胞担体として使用できる。コンストラクトが宿主細胞にランダムに組み込こまれる伝統的な組込み方法とは対照的に本明細書に記述してあるように特定の部位にコンストラクトを組込みことによって、例えば系譜特異的レポーターコンストラクトの場合、同族の成熟細胞型に分化する場合にのみ発現を訂正し、またタンパク質発現コンストラクトの場合には、細胞集団間での均一な発現をさせる。
【００１１】
特異疾患の患者由来のｈｉＰＳＣｓをヒト疾患に対するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルを確立するために使用することもできる。遺伝子改変ｈＥＳＣｓおよびｈｉＰＳＣｓを使って、分化パラダイムを改善させたり、疾病関連遺伝子を過剰発現させたりでき、さらに機能喪失実験による疾病経路を研究することもできる。重要なことに、研究は、患者集団に見いだされるような適切な遺伝的または変異体バックグラウンドの状況で遂行できる。
【００１２】
従って、１つの態様では、幹細胞のゲノムの選択した領域に組み込まれた外来性配列（例えば、導入遺伝子）を含む幹細胞（または幹細胞の集団）を本明細書に提供する。特定の実施形態では、導入遺伝子は、系譜特異的プロモータおよび／または遺伝子産物（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉およびこれらの組み合わせを含む転写されたＲＮＡ産物などのタンパク質コード配列、非タンパクコード配列）を含み、幹細胞の選択した領域に組み込まれると、分化の開始または分化の経路中で、および／または幹細胞が分化して系譜特異的または成熟した細胞型に分化する時に、転写または翻訳される。遺伝子産物は、特定の細胞型への分化経路中に発現できる。さらに加えて、遺伝子産物は、幹細胞が分化しうるいくつかまたは全て細胞型で発現できる。特定の実施形態では、遺伝子産物は、系譜特異的または細胞運命遺伝子であり、例えば、その発現が、遺伝子が組み込まれた内在性遺伝子座に存在する調節制御領域（例えば、プロモータ）によって起動されように選択された遺伝子座に組み込まれるプロモータの無い遺伝子である。幹細胞は、哺乳類の幹細胞であっても良い。例えば、幹細胞は、造血幹細胞、間葉幹細胞、胚性幹細胞、神経細胞の幹細胞、筋幹細胞、肝臓幹細胞、皮膚幹細胞、胚性幹細胞、誘発多能性幹細胞およびこれらの組み合わせたものとされる。特定の実施形態では、幹細胞はヒト誘発多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。遺伝子産物は、誘発的に、または組織−特異的に恒常的に発現できる。
【００１３】
ある特定の実施形態では、遺伝子産物は、レポーターの発現が系譜特異的または細胞運命の遺伝子の調節エレメントによって操作されるように、系譜特異的または細胞運命
遺伝子に組み込まれた非プロモータレポーター遺伝子である。
【００１４】
この明細書に記述した幹細胞において、導入遺伝子は組換え部位に隣接するか、および／または自殺カセットであっても良い。
【００１５】
特定の実施形態では、本明細書に記述した幹細胞は、内在性遺伝子プロモータ配列に連結した２つのレポーターを含む。特定の実施形態では、１つのレポーターを、系列または運命に至る細胞を単離または除外するために使うことができる。例えば、所望しない細胞系列または運命に傾倒している細胞かどうかをレポートするレポーターを、細胞のプールからの、さもなければ所望の系列または運命へと分化するこれらの細胞を除外するために、使用しても良い。第２のレポーター（マーカー）は、所望の
系譜特異的または成熟細胞型で発現すると知られている内在性遺伝子に連結することができる。
【００１６】
二重にタグ付けされた幹細胞は、分化細胞集団由来の癌幹細胞の発生などの複雑なプロセスを研究する際に有用である。特定の実施形態では、二重にタグをつけされた分化細胞を、上記したように系譜特異的または細胞運命に連結するレポーター遺伝子を使って幹細胞集団から単離する。この幹細胞集団は、脱分化に関わる内在性遺伝子に連結する第２のレポーターを含み第２のレポーターは、どのような外部または内部条件が細胞を脱分化させ、潜在的に癌幹細胞に至るのかを決定するために使用される。
【００１７】
上記したように系列または細胞運命のレポーターを使用して単離した二重にタグ付けされた分化細胞集団を、細胞が潜在的に厄介な幹細胞のような状態に逆戻りするならば、脱分化が自殺遺伝子の発現を誘発し、これらの脱分化する細胞のみを死滅させるように
脱分化に関わる内在性遺伝子に連結する第２の自殺マーカーと一緒に使用する。この実施形態は、薬物療法としてのｉｎ ｖｉｖｏ幹細胞に関する安全性の懸念を強力に取り組む。
【００１８】
さらに加えて、野生型遺伝子のコピーを、変異内在性遺伝子を持つドナー由来の幹細胞に挿入することによって様々な治療が可能になる。例えば、血友病Ｂにおいて、コンピテント第ＩＸ因子タンパク質の欠乏を患っている患者など。第ＩＸ因子は、凝固系に関わるセリンプロテアーゼの１つをコードし、野生型第ＩＸ因子タンパク質の正常な循環レベルの３％を修復するだけで、自発性の出血を防ぐことができることが分かった。
【００１９】
従って、本開示は、配列（例えば、系譜特異的または細胞運命のレポーターコンストラクトまたはポリペプチドコードする配列）を幹細胞（例えばヒト、マウス、ウサギ、ブタまたはラットの細胞）に組み込む方法および組成を提供する。コンストラクトの標的組込みは、対象とする領域のゲノムを標的二重鎖切断することによって促進される。切断は、融合タンパク質の使用を通して特定の部位を標的とする。この融合タンパク質は対象とする領域、切断領域または切断半領域の選択したどのような配列にも結合するように設計できるジンクフィンガーＤＮＡ結合領域を含む。そのような切断によって、切断部位またはその近辺の外来性ポリヌクレオチド配列の標的組込みが刺激される。系譜特異的または細胞運命レポーターコンストラクトが幹細胞に組み込まれた実施形態において、レポーターコンストラクトは典型的に、レポーター配列をコードする非プロモータポリヌクレオチドに作用可能なように連結した分化する間に発現した遺伝子からのプロモータを必ずしも含む訳ではない。
【００２０】
１つの態様において、系譜特異的レポーターコンストラクトを幹細胞に標的組込みするための方法を本明細書に提供し、この方法は、以下を含む：（ａ）細胞内に第１の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第１の融合タンパク質は第１のジンクフィンガー結合領域と第１の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第１の標的部位と結合するように設計されている；（ｂ）細胞内に第２の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第２の融合タンパク質は第２のジンクフィンガー結合領域と第２の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第２の標的部位と結合し、第２の標的部位は第１の標的部位とは異なるように設計されている；および（ｃ）細胞を本明細書に記述したような系譜特異的または細胞運命レポーターコンストラクトに接触させること、ここで第１の融合タンパク質を第１の標的部位に結合させて、また第２の融合タンパク質を第２の標的部位に結合させて、細胞のゲノムが対象とする領域内で切断されるように切断半分領域を設置させ、それによって系譜特異的または細胞運命レポーターコンストラクトを対象とする領域内の細胞のゲノムに標的組込みされる。
【００２１】
別の態様では、コード配列を幹細胞に標的組込する方法を本明細書に提供し、この方法は以下を含む：（ａ）細胞内に第１の融合タンパク質を発現させること、ここで
この第１の融合タンパク質は第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合領域と第１の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第１の標的部位と結合するように設計されている；（ｂ）細胞内に第２の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第２の融合タンパク質は第２のジンクフィンガー結合領域と第２の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第２の標的部位と結合し、第２の標的部位は第１の標的部位とは異なるように設計されている；および（ｃ）細胞をコード配列に接触させること、ここで第１の融合タンパク質を第１の標的部位に結合させて、また第２の融合タンパク質を第２の標的部位に結合させて、細胞のゲノムが対象とする領域内で切断されるように切断半分領域を設置させ、それによってコード配列を対象とする領域内の細胞のゲノムに標的組込みこまれる。特定の実施形態では、コード配列は、治療上のタンパク質、レポーター遺伝子または陽性または陰性スクリーニングマーカー遺伝子をコードする配列含む。
【００２２】
別の態様では、２個以上の遺伝子産物を幹細胞（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉およびこれらの組み合わせを含む転写されたＲＮＡ産物などのタンパク質コード配列、非タンパクコード配列）に標的組込みさせる方法を提供する。この方法は以下を含む：（ａ）細胞内に第１の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第１の融合タンパク質は第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合領域と第１の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第１の標的部位と結合するように設計されている；（ｂ）細胞内に第２の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第２の融合タンパク質は第２のジンクフィンガー結合領域と第２の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第２の標的部位と結合し、第２の標的部位は第１の標的部位とは異なるように設計されている；および（ｃ）細胞内に第３の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第３の融合タンパク質は第３のジンクフィンガー結合領域と第３の切断半領域を含み、この第３のジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第３の標的部位と結合し、第３の標的部位は第１と第２の標的部位とは異なるように設計されている；（ｄ）細胞内に第４の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第４の融合タンパク質は第４のジンクフィンガー結合領域と第４の切断半領域を含み、この第４のジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第４の標的部位と結合し、第４の標的部位は第１、第２、第３の標的部位とは異なるように設計されている；
ならびに（ｅ）細胞を２つのコード配列または系譜特異的または細胞運命レポーター配列、またはこれらの任意の組み合わせに接触させること、ここで第１の融合タンパク質を第１の標的部位に結合させて、また第２の融合タンパク質を第２の標的部位に結合させて、
細胞のゲノムが対象とする領域内で切断されるように切断半分領域を設置させ、それによってコード配列または系譜特異的または細胞運命レポーター配列を対象とする領域内の細胞のゲノムに標的組込みこまれる、さらに、第３の融合タンパク質を第３の標的部位に結合させて、また第４の融合タンパク質を第４の標的部位に結合させて、細胞のゲノムが対象とする第２の領域内で切断されるように切断半分領域を設置させ、それによって２つのコード配列または系譜特異的または細胞運命レポーター配列を対象とする領域内の細胞のゲノムに標的組込みこまれる。特定の実施形態では、コード配列は、治療上のタンパク質、レポーター遺伝子または陽性または陰性スクリーニングマーカー遺伝子をコードする配列含む。
【００２３】
別の態様では、選択した細胞型（分化経路の細胞、系譜特異的細胞または成熟細胞）の細胞を単離する方法を本明細書に記載する。この方法は、本明細書に記述したように幹細胞集団を培養し（例えば、標的組込みを通して挿入され、選択された系譜特異的または成熟細胞型に発現する系譜特異的または細胞運命プロモータおよび／または系譜特異的または細胞運命遺伝子を含む）そして遺伝子産物を発現する細胞を単離し、それによって選択された系譜特異的または成熟細胞型の細胞を単離する。
【００２４】
さらに別の態様では、幹細胞分化における化合物、核酸または生物学的生成物の効果を測定する方法を本明細書に記述する。この方法は、化合物、核酸または生物学的産物の存在下での前記したような系譜特異的または細胞運命レポーター配列を含む幹細胞の第１の集団を培養すること、化合物、核酸または生物学的産物の非存在下での幹細胞の第１の集団としての系譜特異的または細胞運命レポーター配列を含む同じ幹細胞の第２の集団を培養すること、を含む。化合物、核酸または生物学的産物の存在下での遺伝子産物の発現の差異は、幹細胞の分化における化合物、核酸または生物学的産物の効果を示す。
【００２５】
別の態様では、幹細胞内に遺伝子産物を産生する方法を本明細書に記述する。この方法は、本明細書に記述したように遺伝子産物に転写または翻訳される配列を含む幹細胞の集団を提供することであり、ここで、この配列は、幹細胞の非必須部位に組み込まれ、幹細胞の集団を培養し、そこで、培養された幹細胞の集団は遺伝子産物を一様に発現する。
【００２６】
別の態様では、処置を必要とする被験者の機能的遺伝子産物の発現を減少させることによって特徴づけられる疾病を処置する方法を本明細書に提供し、この方法は、本明細書に記述してあるように機能的遺伝子産物発現する幹細胞の集団に投与することを含む。特定の実施形態では、機能遺伝子産物は第ＩＸ因子であり、かつ、疾病は血友病である。
【００２７】
本明細書に記述した方法および組成のいずれにおいても、挿入された配列（例えば、系譜特異的または細胞運命レポーターコンストラクト、コード配列など）および／またはジンクフィンガーヌクレアーゼはベクター、例えば、プラスミド、直鎖ＤＮＡ、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターのどれにも供給提供できる。特定の実施形態では、挿入される配列およびジンクフィンガーヌクレアーゼ−コード化配列は同じベクター上に供給される。特定の実施形態では、組み込まれる配列（例えばレポーターコンストラクト）が、組込み欠乏性レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）上に供給され、第１と第２のジンクフィンガータンパク質を含む融合タンパク質の１つまたは両方が、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）上に供給される。特定の実施形態では、配列をコードするジンクフィンガーヌクレアーゼがｍＲＮＡとして供給される。本明細書に記述した方法および組成のいずれにおいても、挿入された配列は、幹細胞の欠損および／または患者の欠陥を訂正する配列であっても良い。いくつかの実施形態では、挿入された配列は、野生型第ＩＸ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列であってもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述した方法および組成は、２人の異なるドナーを持つ細胞の対立遺伝子を修飾するのに使って良い。例えば、１つの対立遺伝子上の調整可能な遺伝子発現コンストラクト（例えば、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）への応答を組み入れられた発現コンストラクト）を有するセーフハーバ遺伝子、例えば、ＡＡＶＳ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとも知られている）の修飾は、相同的対立遺伝子上の制御されたプロモータのトランス活性化因子（例えばＭ２ｒｔＴＡ）でもって同時に修飾されたＡＡＶＳ１遺伝子を有する細胞内で対を成すことができる。これによって、挿入された導入遺伝子の発現の位置的変動効果を取り除けるであろう。
【００２９】
本明細書に記述する実施形態のいずれにおいても、コンストラクトのレポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼおよび／またはβガラクトシダーゼを含む。さらに、レポーター遺伝子の発現を駆動する調節領域（例えば、プロモータ）は、幹細胞の分化中に発現される任意の遺伝子から単離できる。そのようなレポーターシステムの使用によって、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ再プログラムのプロセスへの機構的洞察が得られる。ある特定の実施形態では、調節領域は、アディオポーズ（ａｄｉｏｐｏｓｅ）特異的マーカー遺伝子（例えばａｐ２．）由来である。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子発現コンストラクトは、ＣｒｅおよびＦＬＰなどの特異的リコンビナーゼの一過性発現を通してその引き続く除去を可能にするｌｏｘまたはＦＲＴなどの配列に隣接することがある。これらのリコンビナーゼ除去システムを、要望があればその他のドナー配列を除去するのに使われることがある。同様に、任意のコード配列は、幹細胞のゲノムの特定の領域を標的とすることができる。特定の実施形態では、コード配列は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＩＸ、ＶＥＧＦ、免疫グロブリン、可溶性細胞表面レセプター、可溶性細胞接着分子、Ｐ−セレクチンなどの血漿可溶性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、可溶性タンパク質は治療上の価値がある。
【００３０】
本明細書に記述されるような方法および組成は、どのような成体または胎性（胚性）幹細胞にもその用途が見いだされる。この胎性幹細胞は、限定されるわけではないが、造血幹細胞、間葉幹細胞、神経、筋、肝臓または皮膚幹細胞、胚性幹細胞、誘発多能性幹細胞などを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞は、哺乳類の幹細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタまたはヒトの幹細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】その中でａＰ２プロモータ／エンハンサー配列がＧＦＰの発現を駆動するレポーターカセットに隣接するＣＣＲ５に対して相同性アームを有する欠損組込みレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を表す模式図である。
【図２】パネルＡおよびＢは、非複製的組換え型Ａｄ５／Ｆ３５ベクター（以後Ａｄ．ＺＦＮと呼ぶ）によって運ばれるＣＣＲ５−特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼの存在下で図１に示されるヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）細胞に標的組込みされる脂肪細胞特異的ＩＤＬＶを示す図である。最上部のパネルの各レーンの底面は、レポーターコンストラクトが組み込まれた細胞の割合を示す。図２Ｂは、ＤＮＡ入力レベルへ規準化するためのＧＡＰＤＨ遺伝子座の制御増幅を示す。
【図３】パネルＡからＦは、ＩＤＬＶｓによって運ばれたＣＣＲ５遺伝子座へＺＦＮ−介在組込みのａＰ２−ＧＦＰカセットを含む分化したｈＭＳＣｓ内のＧＦＰ発現を示す図である。ｈＭＳＣｓは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化して骨原性（図３Ａおよび３Ｂ）または脂肪生成の系列（図３Ｃから３Ｆ）となる脂肪生成の系列のみが発現する。
【図４】パネルＡからＨは、標準組み込みレンチウイルスベクターを使用してこれらの細胞に導入されたランダムに組み込まれたａＰ２−ＧＦＰレポーターコンストラクトを有する分化したｈＭＳＣｓ内のＧＦＰ発現を示す図である。分化できなかったｈＭＳＣｓ（図４Ａおよび４Ｂ）または骨原性（図４Ｃおよび４Ｄ）または脂肪生成の系列（図４Ｅから４Ｈ）にｉｎ ｖｉｔｒｏ分化したそれらを図示する。強いＧＦＰ発現が、脂肪生成の系列で観察されるが、弱いＧＦＰ発現は、非分化の間葉系幹細胞と骨原性系列内の両方で見られる。
【図５】パネルＡからＣは、描写するレンチウイルスのドナーコンストラクトおよびこれらのコンストラクトの標的挿入を模式的に示す図である。図５Ａは、ＰＧＫ−ｅＧＦＰ（左側）と命名されたコンストラクトを発現するｅＧＦＰおよびＰＧＫ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰ（右側）と命名されたコンストラクトを発現するｍＥｐｏとｅＧＦＰを図示する。図５Ｂは、内在性ＣＣＲ遺伝子座内のＺＦＮ標的部位の位置を模式的に示す。図５Ｃは、ＰＧＫ−ｅＧＦＰまたはＰＧＫ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰの発現カセットの相同組換え媒介標的遺伝子組込み発現の後の期待される結果を模式的に示す。
【図６】パネルＡからＢは、ＦＡＣＳによって測定されたＡｄ．ＺＦＮ伝達の指示したＭＯＩにおける指示したドナーベクターによる形質導入に続くＧＦＰを発現する細胞の割合を図示するグラフである。黒色バーは、ＣＣＲ５−標的ＺＦＮｓ存在下でＩＤＬＶ−ｅＧＦＰコンストラクトで形質導入した細胞内のＧＦＰ発現を図示し、灰色バーは、ＣＣＲ５−標的ＺＦＮｓ存在下でＩＤＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰコンストラクトで形質導入した細胞内のＧＦＰ発現を図示する。図６Ａは、ジャーカット細胞（左側）およびＫ５６２細胞（右側）内でのＧＦＰ発現を示す。図６Ｂは、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）内でのＧＦＰ発現を示す。
【図７Ａ】パネルＡとＢは、ジャーカット細胞（図７Ａ、左側）、Ｋ５６２細胞（図７Ａ、右側）およびｈＭＳＣｓ（図７Ｂ）内におけるＣＣＲ５−ＺＦＮｓをコードするＡｄ５／Ｆ３５ベクターの非存在下（レーン標識Ａｄ．ＣＣＲ５−ＺＦＮ−）および存在下（レーン標識Ａｄ．ＣＣＲ５−ＺＦＮ＋）での、指示したドナーコンストラクトの標的組込のためのＰＣＲ法解析を示す。ＧＡＰＤＨＰＣＲ法は、ＤＮＡ入力レベルをコントローための各パネルの底面で示される。
【図７Ｂ】パネルＡとＢは、ジャーカット細胞（図７Ａ、左側）、Ｋ５６２細胞（図７Ａ、右側）およびｈＭＳＣｓ（図７Ｂ）内におけるＣＣＲ５−ＺＦＮｓをコードするＡｄ５／Ｆ３５ベクターの非存在下（レーン標識Ａｄ．ＣＣＲ５−ＺＦＮ−）および存在下（レーン標識Ａｄ．ＣＣＲ５−ＺＦＮ＋）での、指示したドナーコンストラクトの標的組込のためのＰＣＲ法解析を示す。ＧＡＰＤＨＰＣＲ法は、ＤＮＡ入力レベルをコントローための各パネルの底面で示される。
【図８】ＣＣＲ５−ＺＦＮｓをコードするＡｄ５／Ｆ３５ベクターの存在下の指示されたドナーコンストラクトでもって形質導入されたｈＭＳＣｓの条件培地内で、ＥＬＩＳＡによって測定された、Ｅｐｏタンパク質発現を示す。
【図９Ａ】パネルＡおよびＢは、Ｅｐｏドナー組込みコンストラクトとｈＭＳＣｓを一緒に腹腔内（ＩＰ）注射を受けたマウスのヘマトクリット（図９Ａ）と血漿内で測定されたＥｐｏタンパク質レベル（図９Ｂ）についてＥｐｏタンパク質発現の効果を示す。黒色ダイアモンドは、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＩＤＬＶ−ｅＧＦＰドナーコンストラクトでもって形質導入された１０7ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質レベルを図示する。黒色四角は、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＩＤＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰドナーコンストラクトでもって形質導入された１０7ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質レベルを図示する。黒色ダイアモンドは、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰ組込みドナーコンストラクトでもって形質導入された１０6ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質を図示する。
【図９Ｂ】パネルＡおよびＢは、Ｅｐｏドナー組込みコンストラクトとｈＭＳＣｓを一緒に腹腔内（ＩＰ）注射を受けたマウスの血漿内で測定されたヘマトクリット（図９Ａ）とＥｐｏタンパク質レベル（図９Ｂ）についてＥｐｏタンパク質発現の効果を示す。黒色ダイアモンドは、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＩＤＬＶ−ｅＧＦＰドナーコンストラクトでもって形質導入された１０7ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質レベルを図示する。黒色四角は、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＩＤＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰドナーコンストラクトでもって形質導入された１０7ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質レベルを図示する。黒色ダイアモンドは、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰ組込みドナーコンストラクトでもって形質導入された１０6ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質を図示する。
【図１０Ａ】パネルＡからＣは、ＯＣＴ４遺伝子座の標的を示す。図１０Ａは、ＯＣＴ４遺伝子座のための標的戦略の模式的概要を示す図である。サザンブロット解析に使われるプローブは赤色四角で示され、ＯＣＴ４遺伝子座のエクソンは青色四角で示され、さらに矢印はＺＦＮ対のそれぞれによって切られたゲノムの部位を指し示す。ＯＣＴ４遺伝子座を標的にするのに使われたドナープラスミドを、上に示す；ＳＡ−ＧＦＰ：スプライス受容体ｅＧＦＰ配列、２Ａ：自己−切断する２Ａペプチド配列、ＰＵＲＯ：ピューロマイシン抵抗性遺伝子、ｐｏｌｙＡ：ポリアデニル化配列．上部の左の挿入図は、ＦｏｋＩヌクレアーゼ領域の二量体形成に導かれる特異的ゲノムの部位（黄色）での２つのＺＦＮｓ結合の風刺画を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、対応するドナープラスミドを使用し指示したＺＦＮ対でもって標的にされた、ＢＧＯ１細胞のサザンブロット解析を示す。ゲノムＤＮＡは、ＥｃｏＲＩで消化して外側の３’プローブとハイブリッド形成するか、またはＳａｃＩで消化して外側の５’プローブとハイブリッド形成した。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、対応するドナープラスミドを使用し指示したＺＦＮ対でもって標的にされたＢＧＯ１野生型細胞およびＢＧＯ１細胞内のＯＣＴ４とｅＧＦＰの発現のウエスタンブロット解析を図示する。細胞抽出液は、未分化細胞（ＥＳ）またはｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した線維芽細胞様の細胞（Ｆｉｂ．）から取り出された。
【図１１】パネルＡおよびＢは、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子に対する標的戦略を示す図である。図１１Ａは、ＡＡＶＳ１遺伝子座のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子に対する標的戦略の模式的概要を図示する。サザンブロット解析に使われたプローブを赤色四角で表し、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子の最初の３エクソンを青色四角で表し、矢印はＺＦＮでカットされたゲノム部位を指し示す。遺伝子座を標的にするのに使われたドナープラスミドを上に示す；ＳＡ−Ｐｕｒｏ：スプライス受容体配列、次に２Ａ：自己切断ペプチド配列とピューロマイシン抵抗性遺伝子、ｐＡ：ポリアデニル化配列、ＰＧＫ：ヒトホスホグリセロールキナーゼプロモータ、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン抵抗性遺伝子。図１１Ｂは、ＡＡＶＳ１ ＺＦＮｓを使用し指示されたドナープラスミドでもって標的されたＢＧＯ１細胞のサザンブロット解析を示す。ゲノムＤＮＡは、ＳｐｈＩで消化して32Ｐ−標識された外側の３’プローブまたは内側の５’プローブとハイブリッド形成する。フラグメントの大きさは：ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ：５’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝４．２ｋｂ；３’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．７ｋｂ．ＳＡ−Ｐｕｒｏ：５’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．８ｋｂ；３’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．７ｋｂ。
【図１２】ｈｉＰＳＣｓ内のＡＡＶＳ１遺伝子座のＺＦＮ媒介遺伝子標的を示す図である。対応するドナープラスミドを使用し、指示したＺＦＮ対でもって標的されたｈｉＰＳＣ細胞株ＰＤ２１ｌｏｘ１７Ｐｕｒｏ−５のサザンブロット解析。ゲノムＤＮＡは、ＳｐｈＩで消化され、32Ｐ−標識された外側の３’プローブまたは内側の５’プローブとハイブリッド形成した。フラグメントの大きさは：ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ：５’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝４．２ｋｂ；３’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．７ｋｂ．ＳＡ−Ｐｕｒｏ：５’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．８ｋｂ；３’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．７ｋｂ。
【図１３】ＤＯＸ誘導性ＴｅｔＯ ＲＦＰ含むドナーコンストラクトを有するＡＡＶＳ１遺伝子座のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のための標的戦略のためのドナーヌクレオチドを模式的に示す図である。２Ａ−ＧＦＰは、ＧＦＰと融合した自己切断する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド間のヌクレオチド融合配列である。ＴｅｔＯは、テトラサイクリンリプレッサー標的（「オペレーター」）配列であり、それは、最小のＣＭＶプロモータと連結している。ＲＦＰは、赤色蛍光性タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【図１４】ＰＩＴＸ３−特異的ＺＦＮｓの２つの対でもって形質移入するのに引き続きＫ５６２細胞内のＰＩＴＸ３遺伝子座に生じるＮＨＥＪの量をアッセイすることへのＰＣＲ解析の結果を示す図である。このデータは、（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５（７）： ７７８−８５）に記述してあるようにＣＥＬ−Ｉミスマッチ−感受性エンドヌクレアーゼアッセイを使って生成した。ＮＨＥＪ％は、各レーンの底面に指し示す。’Ｇ’は、ＧＦＰ発現プラスミドで形質移入した対照細胞を指し示す。
【図１５】ＰＩＴＸ３−ｅＧＦＰノックイン細胞を産生するためのドナーヌクレオチド標的戦略の模式図である。５’アームと３’アームは、内在性ＰＩＴＸ３遺伝子座に相同であり、２ＡＲＦＰ−ｐＡは、ｐｏｌｙＡ配列に連結している赤色蛍光性タンパク質（ＲＦＰ）をコードする遺伝子と連結する自己切断２Ａペプチドを備えたオープンリーディングフレームを指し示す。ＰＧＫ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡは、オープンリーディングフレームを指し示し、ここでＰＧＫプロモータは、ＰＧＫｐｏｌｙＡ配列と連結している緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）と連結する。ｌｏｘは、ＧＦＰリーディングフレームに隣接するｌｏｘＰ部位を指し示す。
【図１６】ＣＥＬ−Ｉミスマッチアッセイの結果を表すアガロースゲルの図である。このゲルは、第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓによる形質移入に引き続くＫ５６２細胞に発生したＮＨＥＪの％を示す。ＮＨＥＪ％は、各レーンの底面に指し示すＺＦＮｓの対を、レーンの上に指し示す。また各セットは、形質移入ＺＦＮ−コード化プラスミドの１、２、または４ｕｇからの結果を示す。’Ｇ’は、ＧＦＰに特異的なＺＦＮｓによる形質移入に引き続く結果を指し示す。
【図１７】ＣＥＬ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示すアガロースゲルの図である。このゲルは、第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓによる形質移入に引き続くＨｅｐ３Ｂ細胞に発生したＮＨＥＪの％を示す。ＮＨＥＪ％は、各レーンの底面に指し示す。各レーンで使われたＺＦＮｓの対を、使用した形質移入するプラスミドと共にレーンの上に指し示す。「ＧＦＰ」は、ＧＦＰ−特異的ＺＦＮｓの制御形質移入からの結果を指し示す。
【図１８】パネルＡとＢは、制限酵素部位を含む３０ｂｐタグを内在性第ＩＸ因子遺伝子座に標的組込みすることを示す図である。この図は、組み込まれたタグを含む領域のＰＣＲ産物をＮｈｅＩで消化した産物を分解したポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。図１８Ａにおいて、形質移入後３日で細胞からＤＮＡを単離した。レーン１では、ＮｈｅＩで消化された第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓの非存在下ドナーＤＮＡのみで形質移入されたＫ５６２細胞から単離したＰＣＲ産物を含む。レーン２から５では、野生型Ｆｏｋ１二量体形成領域を含む第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓを、ドナープラスミド量を増加しながら使用した。レーン６から９では、ＥＬＤ／ＫＫＫ Ｆｏｋ１二量体形成領域を含む第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓを、ドナープラスミド量を増加しながら使用した。ＮｈｅＩ感受性ＤＮＡのＮｈｅＩのパーセントは、各レーンの下に指し示す。図１８Ｂは、形質移入後１０日目の同様の結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
対象とする配列（例えば、系譜特異的レポーターコンストラクトおよび／またはコード配列）を幹細胞標的組込みするための組成および方法を、本明細書に記述する。
【００３３】
概要
本明細書に開示した方法、同様に組成の準備および使用の実施は、その他の指示がなければ、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連する分野の通常の技術を、当業者の技術の範囲内として採用する。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ； Ｗｏｌｆｆｅ， ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９８； ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ３０４， “Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ” （Ｐ．Ｍ． Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ， ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９９； ａｎｄ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． １１９， “Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” （Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ， ｅｄ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３４】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用し、直線状または環状の高次構造、かつ単一または二重鎖の型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味する。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さについて制限があると解釈されるべきではない。これらの用語は、自然のヌクレオチドの既知の類似体、同様に塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエートバックボーン）が修飾されたヌクレオチドを含む。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、塩基対形成特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を成す。
【００３５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーとして互換的に使われる。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する自然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３６】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的、非共有結合性の相互作用を意味する。結合相互作用の全ての成分は、相互作用全体が配列特異的である限り、必ずしも配列特異的（例えば、ＤＮＡバックボーン内のリン酸残基との接触）である必要はない。そのような相互作用は、１０-6Ｍ-1またはより低い解離定数（Ｋｄ）によって一般に特徴づけられる。「親和性」とは、結合力を意味する：結合親和性の増加は、より低いＫｄに相関する。
【００３７】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）と結合する。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体（ホモ二量体、ホモ三量体、を形成することなど）に結合でき、および／または異なるタンパク質またはタンパク質の１つまたは複数の分子と結合することができる。結合タンパク質は、結合活性の１以上の型を持つことができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合性、ＲＮＡ結合性およびタンパク質結合活性を持つ。
【００３８】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合領域）は、１つまたは複数のジンクフィンガーを通して配列特異的様式でＤＮＡに結合するより大きなタンパク質内のタンパク質または領域である。これらは、その構造がＺｎイオンの配位を通して安定化している結合領域内のアミノ酸配列の領域である。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００３９】
ジンクフィンガー結合領域、例えばジンクフィンガーの認識らせん体は、予め決められたヌクレオチド配列と結合するように「設計」できる。ジンクフィンガータンパク質を設計するための方法の限定されない例は、デザインおよび選択である。デザインされたジンクフィンガータンパク質は、そのデザイン／組成が合理的判断基準から主に生じたものである自然界に起こりえないタンパク質である。デザインをする際の合理的判断基準は、現存するＺＦＰデザインおよび結合データの情報を貯蔵するデータベース内の情報を処理する置換規則とコンピュータ処理アルゴリズムの応用を含む。例えば、米国特許６，１４０，０８１号；６，４５３，２４２号；および６，５３４，２６１号を参照；さらに国際公開ＷＯ９８／５３０５８号；ＷＯ９８／５３０５９号；ＷＯ９８／５３０６０号；ＷＯ０２／０１６５３６号およびＷＯ０３／０１６４９６号を参照されたい。
【００４０】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、自然界に存在しないタンパク質であり、その産生物は主に実験的プロセス（ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択）から生み出されたものである。例えば、米国特許５，７８９，５３８号；米国特許５，９２５，５２３号；米国特許６，００７，９８８号；米国特許６，０１３，４５３号；米国特許６，２００，７５９号；国際公開ＷＯ９５／１９４３１号； ＷＯ９６／０６１６６号； ＷＯ９８／５３０５７号； ＷＯ９８／５４３１１号； ＷＯ００／２７８７８号； ＷＯ０１／６０９７０号；ＷＯ０１／８８１９７号およびＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００４１】
用語「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味し、ＤＮＡまたはＲＮＡでもあり；直線状、環状または分枝であっても良く、さらに一本鎖または二重鎖であっても良い。用語「ドナー配列」とは、ゲノムに挿入されたヌクレオチド配列である。ドナー配列は、任意の長さであって良く、例えば、長さが２から１０，０００ヌクレオチド（またはこれらの整数の間の任意の整数またはちょうどその値）であり、好ましくは長さが約１００から１，０００ヌクレオチド（またはこれらの整数間の任意の整数）でありより好ましくは長さが約２００から５００のヌクレオチドである。
【００４２】
「相同的、非同一配列」は第２の配列と配列相同性度を共有する第１の配列を意味する。しかしその配列は、第２の配列と同一のものではない。例えば、変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、相同的であり、また変異体遺伝子の配列とは同一でない。特定の実施形態では、２つの配列の相同性度は十分であり、２つの配列の間の相同組換え、正常な細胞の機序の利用を可能にする。２つの相同的で同一でない配列は、任意の長さであって良く、非相同性度は、単一のヌクレオチド（例えば、標的相同組換えによるゲノムの点変異の訂正）の小ささあっても良い、または１０キロベース（例えば、染色体内の予め決められた異所性部位の遺伝子の挿入について）あるいはそれ以上であっても良い。相同的非同一配列からなる２つのポリヌクレオチドは同じ長さである必要は無い。例えば、２０から１０，０００のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外来性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使って良い。
【００４３】
核酸とアミノ酸配列同一性を決定する技術は当業者に知られている。典型的に、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされたアミノ酸配列を決定すること、これらの配列と第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較することを含む。ゲノム配列も、この方法でまた決定でき、比較できる。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、それぞれ正確にヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をすることを意味する。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それぞれのアイデンティティ％を決定することによって比較することができる。２つの配列のアイデンティティ％は、核酸であろうとまたはアミノ酸配列であろうと、２つの整列させた配列の間の正確な一致の数を短い方の配列の長さで割って、それに１００を掛けたものである。配列間のアイデンティティ％または類似度を計算する適切なプログラムは、一般に当業者に知られており、例えば、別の整列化プログラムとしてデフォルトパラメータを使用するブラストがある。本明細書に記述する配列に関して、望ましい配列相同性度数の範囲は、約８０％から１００％およびこれらの値の間の整数値である。典型的に、配列間のアイデンティティ％は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、更に好ましくは９２％、もっと好ましくは９５％、さらに、最も好ましくは９８％配列相同性である。
【００４４】
代わりに、ポリヌクレオチド間の配列類似性度を、相同領域間で安定な二本鎖を形成ができ、次に一本鎖特異的ヌクレアーゼでもって消化させ、そして、消化した断片を測定するという条件のもとポリヌクレオチドのハイブリッド形成法によって測定することができる。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使って測定されるように分子の限定された長さに渡って、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、更に好ましくは９２％、もっと好ましくは９５％、さらに、最も好ましくは９８％配列相同性を示す時、実質的に互いに相同的である。本明細書に使われたように、実質的に相同的とは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列のことを意味する。実質的に相同的なＤＮＡ配列は、例えば、特定のシステムに対して定義したような厳密な条件の下で、サザンブロット法実験で同定できる。適切なハイブリッド形成条件を限定することは、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， （１９８５） Ｏｘｆｏｒｄ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【００４５】
２つの核酸断片の選択的ハイブリッド形成は、以下の通りに測定できる。２つの核酸分子間の配列相同性度は、そのような分子間のハイブリッド形成イベントの効率および強度に影響する。部分的に同一の塩基配列は、標的分子と完全に同一の配列のハイブリッド形成を少なくとも部分的に抑制する完全に同一の配列のハイブリッド形成の抑制は、当業者に良く知られたハイブリッド形成アッセイを使って評価できる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリッド形成法、または同様な方法、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照）。そのようなアッセイは、様々な選択度を使って（例えば、低から高厳密性に変わる条件を使って）実施できる。低厳密性の条件を採用するならば、非特異的結合の非存在は、配列相同性の部分的一致度さえない二次的なプローブ（例えば、標的分子と配列相同性が３０％未満のプローブ）を使って評価できる。即ち、非特異的結合イベントの非存在下で、二次的なプローブは、標的とハイブリッド形成しない。
【００４６】
ハイブリッド形成法ベースの検出システムを利用する時、参照塩基配列に相補的な核酸プローブが選択され、そして適切な条件を選択することによって、プローブと参照配列が選択的にハイブリッド形成し、互いに結合して二本鎖分子を形成する。中程度に厳密なハイブリッド形成条件の下で選択的に参照配列とハイブリッド形成できる核酸分子は、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列相同性を持つ少なくとも長さ約１０〜１４のヌクレオチドの標的塩基配列を検出できる条件の下で典型的にハイブリッド形成する。厳密なハイブリッド形成条件によって、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％以上の配列相同性を持つ少なくとも長さ約１０〜１４のヌクレオチドの標的塩基配列を典型的に検出できる。プローブ／参照配列がハイブリッド形成するための有用なハイブリッド形成法条件は、プローブと参照配列はある特定の配列相同性度を有し、当業者に知られた方法で測定できる。（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， （１９８５） Ｏｘｆｏｒｄ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）
【００４７】
ハイブリッド形成の条件は当業者には良く知られている。ハイブリッド形成厳密性とは、ハイブリッド形成条件が不一致のヌクレオチドを含むハイブリッド形成を嫌う度合いを意味し、より高い厳密性は、不一致ハイブリッドに対するより低い許容性に相関する。ハイブリッド形成の厳密性に影響する因子は、当業者に知られており、限定される訳ではないが、温度、ｐＨ、イオン強度、および例えば、ホルムアミドやジメチルスルホキシドなどの有機溶剤の濃度を含む。当業者に知られているように、ハイブリッド形成厳密性は、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度によって増加する。
【００４８】
ハイブリッド形成のための厳密な条件に関して、多数の等価の条件を採用できて、特定の厳密性を確立することが当業者に知られている。例えば、次の因子を変化させて特定の厳密性を確立する：配列の長さと性質、様々な配列の塩基組成、塩とハイブリッド形成溶液の濃度、ハイブリッド形成溶液中の遮断薬の存在または非存在（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）、ハイブリッド形成反応温度とタイムパラメータ、同様に、異なる洗浄条件。ハイブリッド形成条件の特定のセットを選択は、当業者の標準方法に従って行う。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照）．
【００４９】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを意味する。本開示の目的、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、細胞内の二重鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特定の型を意味する。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を使って「標的」分子を鋳型修復する（即ち、二重鎖切断を経験したもの）、また「非クロスオーバー遺伝子変換」または「短路遺伝子変換」としてさまざまに知られている、なぜならこのプロセスによってドナーから標的へ遺伝情報が伝達されるからである。特定の理論に拘束されずに、そのような伝達は壊れた標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡの不一致の訂正、および／またはドナーを使って標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスに関わることがある。そのような特定化したＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの一部または全てが標的ポリヌクレオチドに取り込まれるようにしばしば標的分子配列の変異を生み出す。
【００５０】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合性バックボーンの損傷を意味する。切断は、これに限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素のまたは化学的加水分解を含む様々な方法によって開始する。一本鎖の切断と二重鎖の切断両方が起こりうる、また二重鎖の切断は、２本の別々の一本鎖の切断イベントの結果として発生することがある。ＤＮＡ切断により、平滑断の端またはねじれ型の端の産生物を生み出すことがある。特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、二本鎖ＤＮＡ切断を標的するために使われる。
【００５１】
「切断半領域」は、第２のポリペプチドと連結して（同一のまたは異なる）、切断活性（好ましくは、二重鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１と第２の切断半領域」および「右と左の切断半領域」は、互換的に使われて二量体化する切断半領域の対を意味する。
【００５２】
「改変された切断半領域」とは、別の切断半領域と一緒に絶対ヘテロ二量体を形成するように（例えば、別の改変された切断半領域）修飾された切断半領域である。さらに、米国特許公報２００５／００６４４７４号；２００７／０２１８５２８号および２００８／０１３１９６２号をも参照されたい、参照によりその全体を本明細書に含める。
【００５３】
「条件突然変異」とは、特定の環境条件（「許容的」として知られている）の下および特定の「制限的」条件の下で、野生型表現形を持つ突然変異株である。条件突然変異株は、冷気感受性であることもある、ここで変異は、冷気に改変された表現形を生み、しかし暖気に触れると、表現形は、ほとんど野生型に戻る。逆に、条件突然変異株は、熱感受性（しばしば、「温熱感受性」と名付けられる）であることもあり、ここで野生型表現形が冷たい温度で見られるが、より暖かい温度に触れると変化する。「クロマチン」は、細胞のゲノムを含むヌクレオプロテイン構造である。細胞のクロマチンは核酸を含み、ヒストンと
非ヒストン性染色体タンパク質を有し、主にＤＮＡおよびタンパク質を含む。真核生物細胞のクロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形で存在し、ここでヌクレオソームコアは、
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の内各２ずつからなる八量体に付随するＤＮＡ約１５０塩基対を備え、およびリンカーＤＮＡ（可変長は、生物体に依存する）は、クレオソームコアの間に伸びる。ヒストンＨ１の分子は、一般にリンカーＤＮＡに付随する。本開示の目的のために、用語「クロマチン」とは、原核生物および真核生物ともに細胞のヌクレオプロテインの全ての型を含むことを意味する。細胞のクロマチンは、染色体性およびエピソーム性両方のクロマチンを含む。
【００５４】
「染色体」とは、細胞ゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞ゲノムは、しばしばその核型によって特徴づけられる。この核型は、細胞のゲノムを含む染色体全てのコレクションである。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含んで良い。
【００５５】
「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の部分でない核酸を含む核酸、ヌクレオプロテイン複合体またはその他の構造を複製する。エピソームの例として、プラスミドおよび特定のウイルスゲノムがある。
【００５６】
「到達可能領域」とは、その中で核酸内に存在する標的部位が標的部位を認識する外来性分子によって結合できる細胞のクロマチン内の部位である。特定の理論に束縛されることなく、到達可能領域とは、ヌクレオソーム構造にパッケージされない領域である。到達可能領域の明瞭な構造は、化学的かつ酵素のプローブ（例えば、ヌクレアーゼ）に対する感受性によってしばしば検出できる。
【００５７】
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在する十分な条件が仮定されているとして、結合分子が結合する核酸の部分を限定する塩基配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限酵素の標的部位である。
【００５８】
「外来性」分子は、細胞内に通常存在しない分子であり、１つまたは複数の遺伝的、生化学的またはその他の方法によって細胞に導入できる。「細胞内の通常の存在」を、細胞の特定の発生段階と環境条件に関して測定する。従って、例えば筋肉の胚発生の段階の期間のみ存在する分子は、成体筋細胞に関して外来性分子である。同様に、熱ショックによって誘発する分子は、熱ショックされなかった細胞に関して外来性分子である。外来性分子は、例えば、機能不全内在性分子の機能バージョンまたは正常機能内在性分子機能不全バージョンを含むことができる。
【００５９】
外来性分子は、その他の中で特に、例えばコンビナトリアルケミストリープロセスで産生されたような小分子、または、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子の任意の修飾された誘導体、または１つまたは複数の上記の分子を含む任意の複合体などの巨大分子であっても良い。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、単鎖または二重鎖であっても良く；直線状、分枝または環状であっても良く；さらに、任意の長さでも良い。核酸は、二本鎖を形成できるもの、同様に三重鎖を形成する核酸を含む。例えば、米国特許番号５，１７６，９９６号および５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質は、以下に制限される訳ではないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写制御因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、脱メチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、脱リン酸酵素、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼを含む。外来性分子もまた、内在性分子として同じ型の分子であっても良く、しかし、細胞が由来するところとは異なる種由来である。例えば、ヒト塩基配列は、マウスまたはハムスターに元来由来する細胞系列を導入できる。
【００６０】
外来性分子は、内在性分子（例えば、外来性タンパク質または核酸）と同じ型である。例えば、外来性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドまたはエピソーム、または細胞内に通常は存在しない染色体を含む。外来性分子を細胞に導入する方法は、当業者に知られており、以下に制限される訳ではないが、脂質媒介伝達（即ち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム類）、電気穿孔法、直接注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介伝達、およびウイルスベクター媒介伝達を含む。外来性分子とは、異なる種、例えば、ヒト遺伝子導入ハムスターゲノムからの核酸をも意味する。
【００６１】
対照的に、「内在性」分子とは、環境条件下で、特定の発生段階での特定の細胞内に通常存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリアゲノム、葉緑体またはその他の小器官、または自然に発生するエピソーム性核酸を含める。さらなる内在性分子は、例えば、転写制御因子および酵素などのタンパク質を含める。
【００６２】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が連結された、好しくは共有結合的に連結された分子である。このサブユニット分子は、同じ化学型の分子であるか、または異なる化学型の分子でありうる。融合分子の第１の型の例として、以下に制限される訳ではない、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断領域間の融合）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）を含む。融合分子の第２の型の例は、以下に制限される訳ではないが、三重形成核酸とポリペプチド間の融合、および副溝結合剤と核酸間の融合を含む。
【００６３】
細胞内の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質を細胞から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に運搬することによって生まれる、ここでポリヌクレオチドは転写され、そして転写物は翻訳されて融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結は、細胞内のタンパク質発現に関わることも出来る。ポリヌクレオチドとポリペプチドを細胞へ運搬する方法は、この開示の別のところで示す。
【００６４】
本開示の目的のための「遺伝子」は、そのような制御配列がコード領域および／または転写された配列に隣接するかどうかに関わらず遺伝子産物（下を見よ）をコードするＤＮＡ領域、同様に遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、必ずしも以下に制限される訳ではないが、リボソーム結合部位と配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、絶縁体、境界エレメント、複製開始点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域などのプロモータ配列、ターミネータ、翻訳制御配列を含む。
【００６５】
「系譜特異的」遺伝子とは、それらの発現が、分化した細胞または系譜特異的細胞型または成熟細胞型に分化するプロセス中の細胞などの特定の細胞型の特徴を示す遺伝子である。
【００６６】
「細胞運命」遺伝子は、細胞の指定先を特定の機能および／または系譜特異的または成熟細胞型に決定してそこへ導くことに関わる遺伝子である。
【００６７】
「分化経路」は、幹細胞に続く経路であり、系譜特異的または成熟細胞型に向かう、即ち幹細胞で始まり系譜特異的または成熟分化細胞で終わる。そのような経路に引き続き幹細胞は、多くの段階を通るだろう。例えば、成熟Ｂ細胞またはＴ細胞に分化する幹細胞は、最初にリンパ様前駆細胞に分化しなければならない。次に、リンパ系前駆細胞は、成熟Ｂ細胞または成熟Ｔ細胞になることに向かう経路に入る。
【００６８】
「自殺遺伝子」は、発現すると、それが発現する細胞の死を引き起こす。自殺遺伝子は、プロドラッグ小分子（シトシン脱アミノ酵素の場合５−フルオロサイトシン）に作用する酵素（例えば、シトシン脱アミノ酵素は）をコードし、そしてこれらを細胞内部の細胞傷害性化合物（５−フルオロウラシル）に転換する、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫまたはＨＴＫ）、または細胞が感作されてガンシクロビルなどの特異的化合物になるのを起こす水痘帯状疱疹チミジンキナーゼ（ＶＳＶ−ｔｋ）などの酵素をコードする。自殺遺伝子は、発現すると、細胞を誘発してアポトーシス性、壊死性になるか、さもなければ生存率を失う遺伝子を含む。アポトーシス促進性受容体刺激薬（例えば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド））が例であり、刺激されると、アポトーシスの開始を引き起こす。
【００６９】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれている情報を、遺伝子産物に転換することを意味する。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）リボザイム、構造ＲＮＡまたはその他の型ＲＮＡ）直接の転写産物であっても良いし、ｍＲＮＡを翻訳することによって産生したタンパク質であっても良い。遺伝子産物はまた、プロセスキャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン結合、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、および糖鎖付加などで修飾されたタンパク質を含む。
【００７０】
遺伝子発現の「調節とは、遺伝子の活性の変化を意味する。発現の調節は、これに制限しないが遺伝子活性化と遺伝子抑制を含む。遺伝子不活性化は、本明細書に記述するＺＦＰを含まない細胞と比較すると遺伝子発現の任意の減少を意味する。したがって、遺伝子不活性化は、完全（ノックアウト）でもまたは部分的（例えば、遺伝子が正常な発現レベルより少なく提示するハイポモルフ、または影響を及ぼす活性の部分的減少を示す変異遺伝子の産物）であっても良い。
【００７１】
「対象領域」とは、例えば、外来性分子と結合することが望ましいとされる、例えば、遺伝子または遺伝子内部のもしくは隣接する非コード配列などの細胞のクロマチンの任意の領域である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的のためである。対象領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリアの、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在しうる。対象領域は、遺伝子のコード領域、例えば、リーダー配列、トレーラ配列もしくはイントロンなどの転写非コード領域、またはコード領域の上流もしくは下流の非転写領域内にある。対象領域は、長さが最小は単一ヌクレオチド対または２，０００ヌクレオチド対まで、またはヌクレオチド対の整数値である。
【００７２】
「セーフハーバ」遺伝子座とは、遺伝子宿主細胞に有害な影響を及ぼすことなく挿入できるゲノム内の遺伝子座のことである。挿入された遺伝子配列の発現が、隣接する遺伝子のからのリードスルー発現によって攪乱させられることがないセーフハーバ遺伝子座が最も有利である。哺乳類細胞のセーフハーバ遺伝子座の例はＡＡＶＳ１遺伝子（米国特許第２００８０２９９５８０号を参照）またはＣＣＲ５遺伝子（米国特許２００８０１５９９９６号を参照）である。
【００７３】
用語「協調リンケージ」と「協調的に連結」（または操作可能に連結）とは、２つ以上の構成要素（配列エレメントなど）が並列することに関して互換的に使われる。これらの構成要素は、ように配列する両方の構成要素が正常に機能し、構成要素の内少なくとも１つが機能を媒介でき発揮する少なくとももう一方の構成要素の上で発揮される機能を媒介できる可能性を与える。図解のようにして、プロモータなどの転写制御配列は、１つまたは複数の転写性制御因子の存在または非存在に呼応して転写性制御配列がコード配列の転写のレベルをコントロールするならば、コード配列に協調的に連結する。転写性制御配列は、一般にコード配列を持つｃｉｓに協調的に連結するしかし、そこに直接的に隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接している訳ではないが、コード配列に協調的に連結する転写性制御配列である。
【００７４】
典型的な「調節領域」、以下に制限されないが、転写プロモータ、転写エンハンサーエレメント、ｃｉｓ作動性転写制御エレメント（転写制御装置、例えば、遺伝子の転写に影響を及ぼすｃｉｓ作動性エレメント、例えば、転写制御因子が相互作用して遺伝子の発現を調節するプロモータ領域）、転写終結シグナル、同様にポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの５’に位置する）、翻訳開始最適化のための配列（コード配列の５’に位置する）、翻訳増強する配列、および翻訳終結配列を含む。制御要素は、由来する要素に含まれる機能的断片、例えば、長さが約５と約５０の間のヌクレオチドのポリヌクレオチド（またはこれら数値間の整数）；好ましくは、長さが約５と約２５の間のヌクレオチドのポリヌクレオチド（またはこれら数値間の整数）、さらに好ましくは長さが約５と約１０の間のヌクレオチドのポリヌクレオチド（またはこれら数値間の整数）、および最も好ましくは９〜１０のヌクレオチドから導出したものである。転写プロモータは、誘導性プロモータ（ここでプロモータに協調可能なように連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補助因子、調節タンパク質などによって誘発される）、抑制可能なプロモータ（ここでプロモータに協調可能なように連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補助因子、調節タンパク質などによって抑制される）、および恒常的なプロモータを含む。
【００７５】
融合ポリペプチドに関して、用語「協調的に連結した」とは、各構成要素は、連結していないならば連結しているかのようにその他の構成要素に連結する同じ機能を遂行すると言う事実を意味する。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断領域と融合する融合ポリペプチド関して、融合ポリペプチド内で、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインの部分が標的部位、および／またはその結合部位と結合し、一方切断領域はＤＮＡを標的部位の近傍で切断することができるならば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断領域が協調的に連結する。
【００７６】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、容易に測定でき、ルーチンアッセイされるタンパク質産物を産生する任意の配列を意味する。適切なレポーター遺伝子は、以下に制限されないが、Ｍｅｌ１、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）、ＧＦＰ、ルシフェラーゼおよび／またはβ―ガラクトシダーゼなどの光産生タンパク質を含む。適切なレポーター遺伝子はまた、ＰＥＴ走査を使用してｉｎ ｖｉｖｏで測定できるチミジンキナーゼ、または全身発光イメージングを経由してｉｎ ｖｉｖｏで測定できるルシフェラーゼなど、ｉｎ ｖｉｖｏで測定できるマーカーまたは酵素をコードしても良い。選択可能なマーカーは、レポーターの代わりに、またはさらに加えて使うことができる。ポジティブ選択マーカーは、遺伝子を保有し、発現する細胞のみを残存させおよび／またはある条件の下で成長させる産物をコードするこれらのポリヌクレオチドである。例えば、ネオマイシン抵抗性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する細胞は、化合物Ｇ４１８に耐性を示すが、一方Ｎｅｏｒを発現しない細胞は、Ｇ４１８によって死滅させられる。ハイグロマイシン抵抗性などを含むポジティブ選択マーカーのその他の例は、当業者に良く知られている。ネガティブ選択マーカーとは、遺伝子を保有し、発現する細胞のみをある条件の下で死滅させる産物をコードするこれらのポリヌクレオチドである。例えば、チミジンキナーゼ（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ＨＳＶ−ＴＫ）を発現する細胞は、ガンシクロビルを加えると死滅する。その他のネガティブ選択マーカーは、当業者に知られている。選択可能なマーカーは、導入遺伝子である必要はないし、そのうえ、レポーターと選択可能なマーカーは、様々な組み合わせで使用できる。
【００７７】
タンパク質ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸としての同じ機能保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、より多くの、より少ない、または同数の残基を対応する未変性の分子として所有でき、および／または１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドの置換を持つことができる。核酸の機能を測定する方法（例えば、コーディング機能、別の核酸とハイブリッド形成する能力）は当業者に良く知られている。同様に、タンパク質機能決定する方法は良く知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合性機能は、例えば、フィルタ−結合、電気泳動的移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定できる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動でアッセイできる。上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、遺伝的および生化学的免疫共沈降、ツーハイブリッド法または相補性によって決定できる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６； 米国特許第 ５，５８５，２４５号および国際出願ＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００７８】
挿入配列
対象とする任意の配列を、幹細胞に標的挿入する方法を本明細書に記述する。挿入される配列は、そのレポーター遺伝子発現カセットが幹細胞の特定の分化系列に付随することが知られている遺伝子または遺伝子グループから選択した調節領域から構成される系譜特異的または細胞運命を含む。細胞運命または幹細胞分化のその他のマーカーに関わる遺伝子を含む配列もまた挿入できる。例えば、そのような遺伝子を含む非プロモータコンストラクトを、その遺伝子座の内在性プロモータが遺伝子産物の発現に導くように特定する領域（遺伝子座）に挿入できる。
【００７９】
内在性遺伝子の発生上のおよび系譜特異的発現を指示する遺伝子の有意な数とそれらの調節領域（プロモータとエンハンサー）は知られている。したがって、幹細胞に挿入された調節領域および／または遺伝子産物の選択は、発生のどの系列およびどのステージを対象とするのかに依存するさらに加えて、系譜特異的発現と幹細胞分化のより詳細の機序的区別についてより詳しく理解すると、それを実験的プロトコルに取り込むことができて、広い範囲の所望の幹細胞を効率的に単離のためにシステムを十分に最適化する。
【００８０】
任意の系譜特異的または細胞運命調節エレメント（例えばプロモータ）または細胞マーカー遺伝子を、本明細書に記述した組成と方法で使うことができる。系譜特異的と細胞運命遺伝子またはマーカーは、当業者に良く知られており、対象とする特定の系列を評価するために直ちに選択できる。非制限例として、以下に制限されるわけではないが、Ａｎｇ２、Ｆｌｋ１、ＶＥＧＦＲ、ＭＨＣ遺伝子、ａＰ２、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、Ｏｔｘ２などの遺伝子から得られた調節エレメントを含む。（例えば、米国特許第５，６３９，６１８号）、Ｄｌｘ（Ｐｏｒｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｅｕｒｏｎ ７：２２１−２２９）、 Ｎｌｘ （Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５１：７４８−７５１）、 Ｅｍｘ （Ｓｉｍｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． １１：２５４１−２５５０）、 Ｗｎｔ （Ｒｏｅｌｉｎｋ ａｎｄ Ｎｕｓｅ （１９９１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５：３８１−３８８）、 Ｅｎ （ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．）、 Ｈｏｘ （Ｃｈｉｓａｋａ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５０：４７３−４７９）、 ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ β ｃｈａｉｎ （ＡＣＨＲβ） （Ｏｔｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １８Ａ：１７７を参照されたい）。調節エレメントが得られる系譜特異的遺伝子のその他の例は、インターネット経由で容易にアクセスできて、得業者に良く知られているＮＣＢＩ−ＧＥＯのウエブサイトで入手可能である。
【００８１】
例えば、心筋細胞の系列を同定するために、αＭＨＣ遺伝子からの調節領域を使うことができる。平滑筋系列を同定するために、ＳＭ２２αプロモータを使うことができる。例えば、米国特許第６，０９０，６１８号を参照されたい。脂肪細胞系列を同定するために、ａＰ２調節領域を使うことができる。ニューロン系列を同定するために、シナプシスまたはニューロン特異的エノラーゼなどのニューロン特異的遺伝子調節領域を使うことができる。グリア細胞を同定するために、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子からの調節領域を使うことができる。
【００８２】
調節領域（例えば、プロモータ）として、標的細胞（例えば、ヒト細胞に導入するためのコンストラクト内で使われるヒトプロモータ）と同じ種由来、異なる種（例えば、ヒト細胞に導入するためのコンストラクト内で使われるマウスプロモータ）由来、または混合された調節領域（例えば、あるマウス遺伝子の調節領域をあるヒト遺伝子の調節領域と組み合わせたもの）由来のものがある。調節領域を、当業者に知られた方法（例えば、対象とするコントロール配列に隣接するプライマーを使うＰＣＲ法）で対象とする遺伝子から導くことができる。
【００８３】
系譜特異的または細胞運命プロモータを、当業者に知られた方法で対象とする遺伝子から得ることができる。例えば、商業データベース（例えば、ＥＮＴＲＥＺ ａｎｄ ＧＥＮＢＡＮＫ−−国立バイオテクノロジー情報センター；ＥＭＢＬ−ヨーロッパ生物情報学研究所，Ｈｉｎｘｔｏｎ， ＵＫ）および現代科学文献（ＭＥＤＬＩＮＥ Ｂ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ８６００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｐｉｋｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．）内をコードおよび制御配列の位置を含む選択された遺伝子の情報ついて検索できる。代わりに、特定の遺伝子に付随する制御配列を同定する方法は、当業者に知られている、例えば、選択された遺伝子の５’非コード領域由来の断片の欠失解析またはＰＣＲ増幅がある、ここでは、これらの断片は調節（またはコントロール）配列を同定するために
協調可能なようにレポーター遺伝子に連結している。制御配列に付随するそのようなレポーター遺伝子を例えば、培養細胞内でスクリーンできる。
【００８４】
幹細胞に挿入できる細胞マーカー遺伝子産物および／または系譜特異的または細胞運命プロモータの別の非限定例として、下表１に示される細胞マーカー由来の細胞マーカーおよび／またはプロモータ配列をコードする配列を含む。
【００８５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【００８６】
従って、細胞運命遺伝子もまた本発明の方法で使用しても良い。これらの遺伝子の内在性を、細胞運命特異的遺伝子の発現によって細胞が分化経路に入り分化経路を進行して所望の系譜特異的または成熟分化細胞型に向うように、セーフハーバ遺伝子座に挿入できる。いくつかの実施形態では、これらの細胞運命遺伝子をセーフハーバ遺伝子座に挿入し、発現が内在性プロモータによって駆動されないようにプロモータを含めない。
【００８７】
本発明の実施に有用なレポーター発現カセットを、適切なレポーター遺伝子コード配列に操作可能に連結された対象とする任意の調節領域を使って作製できる。容易にアッセイ可能なマーカーポリペプチドをコードするレポーター遺伝子は、当業者に良く知られている。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物体または組織には無くまたそれによって発現しない遺伝子であり、ある容易に検出可能な性質、例えば表現型の変化または酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子であり、したがって、対象とする遺伝子を持つレシピエントの細胞に同時形質移入すると、形質移入およびその他のイベントを検出する手段を提供する遺伝子である。適切なレポーターの非限定的例として、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）などが含まれる。抗生物質耐性をコードする遺伝子などの選択マーカーもまた採用して良い。そのうえ、幹細胞を持つ内在性遺伝子を、内在性遺伝子の発現に識別でき測定可能な変化を引き起こす異種性制御配列を特異的に挿入することによって、レポーター遺伝子として利用できる。
【００８８】
採用したレポーター遺伝子の型は、実験の所望のゴールに依存する。例えば、特異的系列の分化経路を辿るために、またはエンハンサーの発生上の特異性をテストするために、目視によってトラッキングを可能にするレポーターコンストラクトを、系譜特異的調節領域（すなわち、組織化学）と典型的に同時に使う。これを、細胞系列と分化枝分かれ部位をトラッキングし特徴づけのために使うことができる。一度系列が特徴づけられると、この同じシステムを、組織化学的マーカーから表面膜タンパク質にレポーター遺伝子の型を単純に置換することによって、系列およびステージ特異的幹細胞の単離ために使用できる。プロモータ特異性は、単離の所望のステージで表面タンパク質の発現を指示し、蛍光活性細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって所望の幹細胞を効率よく単離できる。パニングなどのその他の免疫学的分離技術もまた、幹細胞単離に適用可能である。
【００８９】
挿入可能な別の遺伝子配列として、例えば、野生型遺伝子を置換する変異させる配列を含める。例えば、野生型第ＩＸ因子遺伝子配列を、遺伝子の内在性コピーが変異した幹細胞のゲノムに挿入できる。野生型コピーを、内在性遺伝子座に挿入するか、または代わりにセーフハーバ遺伝子座に標的させる
【００９０】
本明細書の教授に引き続いて、そのような発現カセットの作製は、分子生物学の分野で良く知られた方法論を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照）。遺伝子導入動物を産生する発現カセットの使用前に、選択された調節領域を付随するストレス誘導物質に対する発現カセットの応答性を、発現カセットを適切な細胞系統に導入することによってテストことができる（例えば、一次細胞、形質転換した細胞、または不死化細胞系統）。
【００９１】
非コード（制御配列および非タンパクコード配列を含む）塩基配列の標的挿入も達成することができる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、低分子ヘアピン型ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列も標的挿入に使用できる。そのうえ、非連鎖のプロモータなどのその他のそのような核酸要素の制御配列を今後の研究のための細胞系統を作るために特に導入することができる。さらに、対象とする遺伝子の調節領域を、レポーター遺伝子に操作可能に連結してキメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作ることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子の調節領域は、小分子（例題のみとして、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン）に応答性がある。
【００９２】
その他の実施形態として、機能的ポリペプチドをコードする対象とする配列を、幹細胞のゲノム（例えば、治療上のポリペプチドをコードする配列）の標的点に挿入する。ポリペプチドコード化配列の非制限的例として以下コードする配列を含む：ＥＰＯ、ＶＥＧＦ、ＣＣＲ５、ＥＲα、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｂ型肝炎ウイルスＣ、Ｓ、Ｘ、およびＰ、ＬＤＬ−Ｒ、ＰＥＰＣＫ、ＣＹＰ７、フィブリノーゲン、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ（ａ）、レニン、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンド、アミロイド前駆タンパク質、心房性ｎａｔｕｒｅｔｉｃ因子、ｏｂ−レプチン、ｕｃｐ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＰＡＦ、ｐ５３、Ｒｂ、胎児ヘモグロビン、ジストロフィン、ｅｕｔｒｏｐｈｉｎ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ受容体ｆｌｔおよびｆｌｋ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ｂｃｌ−２、サイクリン、アンジオスタチン、ＩＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＳＴＡＴＳ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＴＨ、ＰＴＩ−１、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰ合成酵素、ＦＡＤ２−１、δ−１２不飽和化酵素、δ−９不飽和化酵素、δ−１５不飽和化酵素、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、デンプン合成酵素、セルロース合成酵素、ショ糖合成酵素、老化−付随する遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシド脱離酵素、ウイルス遺伝子、原生動物の遺伝子、真菌遺伝子、および細菌遺伝子。適切な治療上のタンパク質はまた、抗体、抗体断片、単鎖抗体、細胞内抗体などそれぞれの全体をコードする発現カセットを含む。タンパク質アプタマー、ゼータキネシス、修飾または設計したＴ細胞受容体および機能障害のまたはデコイタンパク質もまた熟慮される。別の治療上のタンパク質として、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、４−スルファターゼおよびαグルコシダーゼ酸など、酵素補充療法に使われるものがある。一般に、制御する適切な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、分裂促進因子、走化性因子、腫瘍活性因子、受容体、カリウムチャネル、Ｇタンパク質、シグナル伝達分子、およびその他の疾病関連遺伝子を含む。特定の実施形態では、組み込み配列は、Ｅｐｏ、ＶＥＧＦなどの血漿可溶性ポリペプチドをコードする。
【００９３】
本発明の異なる実施形態の様々な形態は、併用することができる。
【００９４】
どのような種の幹細胞も、本明細書に記述する組成と方法に使うことができる。適切な幹細胞の非制限的例として、造血幹細胞、間葉幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞、肝臓幹細胞、皮膚幹細胞、誘発性多能性幹細胞、腸幹細胞などを含む。別の幹細胞は、当業者に良く知られている。
【００９５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
本明細書に記述のレポーターコンストラクトは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）を用いて細胞のゲノムにうまく組込まれる。ＺＦＮｓはジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。
【００９６】
Ａ．ジンクフィンガータンパク質
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは選択した配列に結合するように操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１３５−１４１； Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：３１３−３４０； Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：６５６−６６０； Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：６３２−６３７； Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０：４１１−４１６を参照。天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、操作された（天然には存在しない）ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは新規の結合特異性を有することができる。一般に、天然には存在しない操作された認識ヘリックス領域は新規の結合特異性がある。操作方法は、限定されるものではないが、合理的設計と種々のタイプの選択を含む。例えば、合理的設計は３塩基連鎖（または４塩基連鎖）ヌクレオチド配列および個別のジンクフィンガーアミノ酸配列を含有したデータベースを使用しており、配列内では３塩基連鎖または４塩基連鎖配列がジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連し、これらは特定の３塩基連鎖または４塩基連鎖配列に結合している。例えば、共同出願の米国特許出願第６，４５３，２４２および６，５３４，２６１号（その全体が、参照により本明細書に援用される）を参照。
【００９７】
ファージ提示法およびツーハイブリッド系を含む、例示的選択方法は米国特許出願第５，７８９，５３８号、５，９２５，５２３号、６，００７，９８８号、６，０１３，４５３号、６，４１０，２４８号、６，１４０，４６６号、６，２００，７５９号、６，２４２，５６８号、ならびに、ＷＯ９８／３７１８６号、ＷＯ９８／５３０５７号、ＷＯ００／２７８７８号、ＷＯ０１／８８１９７号およびＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの結合特異性の増強については例えば、共同出願のＷＯ０２／０７７２２７号に記述されている。
【００９８】
標的部位の選択のなかで、ＺＦＰおよび融合タンパク質の設計と構築方法（およびこれをコードするポリヌクレオチド）は当業者には周知であり、米国特許出願第２００５００６４４７４号と２００６０１８８９８７号に詳細に記載され、これらの文献はその全文を引用することを以て本明細書の一部となす。
【００９９】
加えて、これらと他の文献に開示されていように、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含むリンカー配列を用いて、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガードジンクフィンガータンパク質は結合してもよい。さらに、リンカー配列６以上のアミノ酸長の例示には米国特許出願第６，４７９，６２６号、６，９０３，１８５号と７，１５３，９４９号を参照。本明細書に記載されるタンパク質はタンパク質の個別のジンクフィンガー間の適切なリンカーの組み合せを含んでもよい。追加的なリンカー構造の例は、２００８年５月２８日出願の米国仮出願第６１／１３０，０９９号に見られ、タイトルはＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｌｉｎｋｉｎｇ ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ Ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｏｍａｉｎｓである。
【０１００】
特定の実施形態では、４フィンガー、５フィンガー、または６フィンガーのジンクフィンガー結合ドメインは例えば、ＦｏｋＩのようなタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインである切断半ドメインに融合していく。そのようなジンクフィンガー／ヌクレアーゼ半ドメイン融合の１つ以上のペアは標的切断に使用され、例えば、米国特許公報第２００５００６４４７４号および２００７０２１８５２８号に開示されている。
【０１０１】
標的切断につては、結合部位のエッジ近傍が５つ以上のヌクレオチド対で分離されており、各融合タンパク質はＤＮＡ標的の反対鎖に結合することができる。本開示に則り、例えば、ＣＣＲ５、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶ Ｓ１として知れている）またはその他を含めて選択された幹細胞のいかなる遺伝子の配列にもＺＦＮｓを標的とすることができる。ＣＣＲ５とＡＡＶ Ｓ１を標的としたＺＦＮｓを記載した国際特許公開ＷＯ／２００８／１３３９３８号および米国特許公報第２００８０１５９９６号を参照（参照により本明細書に援用される）。特定の実施形態では、ＺＦＮｓは、ある部位への標的組込みが増殖および／または分化する細胞の能力を干渉しない範囲で「非必須」遺伝子を標的とする。
【０１０２】
切断ドメイン
さらに、ＺＦＮｓはヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断半ドメイン）を含む。本明細書で開示する融合タンパク質の切断ドメイン部分をエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得することができる。切断ドメインが由来する例示的なエンドヌクレアーゼは、限定されるものではないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ； および Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９−３３８８を参照。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ Ｎｕｃｌｅａｓｅ； ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ； ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ＤＮａｓｅ Ｉ； ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ； ｙｅａｓｔ ＨＯ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅを参照。さらにＬｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照。）。これらの酵素の内の１つ以上（またはその機能的断片）を切断ドメインおよび断片半ドメインの源として使用できる。
【０１０３】
同様に、上述したように切断半ドメインは切断活性に関する二量体化を必要とするヌクレアーゼまたはその部分から導くことができる。一般的に、融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合は２つの融合タンパク質が切断に必要である。または、２つの切断半ドメインを含有する単一のタンパク質を使用できる。２つの切断半ドメインを同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から導くことができ、または切断半ドメインのそれぞれは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から導くことができる。加えて、好ましくは２つの融合タンパク質の標的部位を相互に配置し、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位との結合により他方へ向かった空間方向において切断半ドメインが配置され、そこで例えば二量体化により切断半ドメインが機能的切断ドメインを形成する。従って、特定の実施形態では、標的部位の端近傍は５−８ヌクレオチドまたは１５−１８ヌクレオチドにより分離される。しかしながら、整数個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は２つの標的部位を介在することができる（例えば、２から５０ヌクレオチド対）。一般に、切断の部位は標的部位の間に位置する。
【０１０４】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、かつ、結合の部位あるいはその近傍でＤＮＡ（認識部位において）および切断ＤＮＡへの配列特異性結合が可能である。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、かつ別々の結合と切断ドメインをもつ。例えば、一方の鎖にある認識部位からの９のヌクレオチドおよび他方の認識部位からの１３のヌクレオチドにおいて、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩはＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許５，３５６，８０２； ５，４３６，１５０ および ５，４８７，９９４；並びに Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９； Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８３−８８７； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ｂ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照。従って、一実施形態では、操作あるいは未操作の場合もあるが、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインからの融合タンパク質は切断ドメイン（または切断半ドメイン）を含む。
【０１０５】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的ＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素はダイマーとして活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １０，５７０−１０，５７５を参照。従って、本開示の目的上、開示された融合タンパク質に使用されたＦｏｋＩ酵素の部分は切断半ドメインと考えられる。従って、ジンクフィンガーとＦｏｋＩとの融合を用いた標的二本鎖切断および／または細胞配列の標的置換については、それぞれがＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する２つの融合タンパク質が触媒的に活性な切断ドメインの再構成に使用できる。別法として、さらにジンクフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用できる。ジンクフィンガーＦｏｋＩ融合を用いた標的切断および標的配列変化のパラメータについては本開示の別の個所で述べる。
【０１０６】
切断ドメインまたは切断半ドメインは切断活性を保持するか、または機能的切断ドメインを形成するために多量体化する（例えば二量体化）活性を保持するタンパク質のいかなる部分でもあってよい。
【０１０７】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は国際特許公開ＷＯ０７／０１４２７５号（参照により本明細書に援用される）に記載されている。さらに、追加的な制限酵素は別々の結合と切断ドメインを含み、かつ、これらは本開示が意図することである。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：４１８−４２０を参照。
【０１０８】
特定の実施形態では、切断ドメインはホモ二量体化を最小化するか防止する１つ以上の操作された切断半ドメイン（二量化ドメイン変異体ともいう）を含有し、例えば、米国特許公報第２００５００６４４７４号、２００６０１８８９８７号および２００８０１３１９６２号に記載されており、これら出願の全てを参考文献としてここに援用する。ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８でのアミノ酸残基はＦｏｋＩ切断半ドメインの二量化に影響を与える全ての標的である。
【０１０９】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作した切断半ドメインは第１の切断半ドメインがＦｏｋＩの位置４９０と５３８にあるアミノ酸残基における変異を含有し、かつ第２の切断半ドメインはアミノ酸残基４８６および４９９における変異を含有する対を含む。
【０１１０】
従って、一実施形態では、４９０における変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、５３８における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、４８６における変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し、位置４９９における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的には、本明細書に記載の操作された切断半ドメインは「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名される操作された切断半ドメインを産生するために１つの切断半ドメインにおける変異位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）により、さらに「Ｑ４８６：Ｉ４９９Ｌ」と命名される操作された切断半ドメインを産生するために別の切断半ドメインにおける変異位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）により調製した。実施例に記載のように、一方のＺＦＮが「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」切断ドメインを含有し、他方のＺＦＮが「Ｑ４８６：Ｉ４９９Ｌ」切断ドメインを含有するＺＦＮの対は「ＥＬ／ＫＫ」ＺＦＮ対とも呼ばれる。本明細書記載の操作された切断半ドメインは、切断ドメインを含有するヌクレアーゼの１つ以上の対が切断に使用される場合に異常な切断が最小化されるか、または除かれた偏性ヘテロ二量体変異である。例えば、米国特許公報第２００８０１３１９６２号を参照し、全ての目的のためにこれらの出願の内容全体を本明細書中に引用によって援用する。
【０１１１】
特定の実施形態では、操作された切断半ドメインは例えば位置４８６における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、かつ、位置４９９における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、位置４９６における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ「ＥＬＤ］および「ＥＬＥ」ドメインともいう）で置き換える変異である位置４８６、４９９、および４９６（野生型ＦｏｋＩに番号が振られている）の変異を含む。別の実施形態では、操作された切断半ドメインは例えば位置４９０における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、位置５３８における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および位置５３７における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基、またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインともいう）で置換える変異である位置４９０、５３８および５３７の変異を含む。
【０１１２】
別の態様では、条件による活性化を示す操作された切断半ドメインを提示した。いくつかの実施形態では、条件付きで操作された切断半ドメインは温度低下の条件下では活性の減少を示した。いくつかの実施形態では、条件付きで操作された切断半ドメインは温度上昇の条件下では活性の減少を示した。
【０１１３】
更に別の態様では、操作された切断半ドメインは非正準亜鉛配位残基（例えば、正準Ｃ２Ｈ２配置よりもＣＣＨＣである）を含有するジンクフィンガーヌクレアーゼに組入れられてよい。
【０１１４】
本明細書に記載される操作された切断半ドメインは例えば、米国特許公報第２００５００６４４７４号（実施例５）および２００７０１３４７９６号（実施例３８）に記載した野生型切断半ドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発による適切な方法を用いて調製することができる。
【０１１５】
さらに他の実施形態では、１本鎖ニックを標的部位に導入するように半ドメインの１つが酵素的に非活性である、２つの切断半ドメインを使用する（例えば、共同出願の米国特許出願第６１／１８９、８００号を参照）。
【０１１６】
幹細胞への標的組込みに関する追加的方法
いずれのヌクレアーゼも本明細書で開示する方法で使用できる。例えば、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは認識配列が非常に長いが、ホトサイズのゲノムになれば統計上、一部は存在することが多い。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。これらの認識配列は周知である。さらに、米国特許第５，４２０，０３２； 米国特許第６，８３３，２５２； Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９-３３８８； Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ８２：１１５-１１８； Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， １１２５-１１２７； Ｊａｓｉｎ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２：２２４-２２８； Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：１６３-１８０； Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０：３４５-３５３ および ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照。
【０１１７】
非天然標的部位を結合するためにホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性を操作することも報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５； Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：２９５２−２９６２； Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９； Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６を参照。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは植物病原体キサントモナス由来のＴＡＬエフェクターからの操作されたドメインである（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ｏｃｔ ２００９ （１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１） および Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ｏｃｔ ２００９ （１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７を参照）。
【０１１９】
従って、幹細胞への系譜特異的レポーターなどの配列の標的組込みについては、独特の標的部位をもつ任煮の天然に存在する、または操作されたヌクレアーゼをジンクフィンガーヌクレアーゼの代わり、またはそれに加えて使用することができる。加えて、この天然に存在する、または操作されたヌクレアーゼからのドメインを単離することができ、種々の組み合せで使用できる。例えば、天然に存在する、または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼからのＤＮＡ結合ドメインを、非相同の切断ドメインまたは半ドメイン（例えば、他のホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＩＩＳ型エンドヌクレアーゼからの）と融合することができる。上述のように、この融合タンパク質をジンクフィンガーヌクレアーゼとの組み合わせで使用することもできる。
【０１２０】
送達
いずれかの適切な手段によって本明細書に掲載のレポーターコンストラクトおよびヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮｓ）を標的幹細胞に送達してもよい。
【０１２１】
例えば、ジンクフィンガーを含有するタンパク質の送達方法は米国特許第６，４５３，２４２； ６，５０３，７１７； ６，５３４，２６１； ６，５９９，６９２； ６，６０７，８８２； ６，６８９，５５８； ６，８２４，９７８； ６，９３３，１１３； ６，９７９，５３９； ７，０１３，２１９；および７，１６３，８２４に記載されており、これら出願の全てを参考文献としてここに援用する。
【０１２２】
本明細書に記載のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮｓ）をコードするポリヌクレオチドおよび組込まれる配列（例えば、系譜特異的レポーターコンストラクト）をＺＦＮｓおよび／または組込まれる配列の１つ以上をコードする配列を含有するベクターを用いて送達してもよい。任意のベクター系は、限定されるものではないが、プラスミドベクター、レトロウィルス・ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む。米国特許第６，５３４，２６１； ６，６０７，８８２； ６，８２４，９７８； ６，９３３，１１３； ６，９７９，５３９； ７，０１３，２１９；および７，１６３，８２４をも参照し、これら出願の全てを参考文献としてここに援用する。さらに、これらのベクターが１つ以上のＺＦＮコード配列および／または１つ以上の目的の配列を含んでよいことは明白であろう。例えば、１つ以上のＺＦＮの対を細胞に導入する場合、ＺＦＮを同じベクターまたは異なるベクター上で行ってもよい。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは１つまたは複数のＺＦＮおよび／または１つまたは複数のリポーターコンストラクトをコードする配列を含んでもよい。
【０１２３】
従来のウイルスおよび非ウイルスをベースとする遺伝子導入補法を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的細胞においてＺＦＮをコードし、および／または配列（例えばリポータコンストラクト）を組込む核酸の導入に使用することができる。また、そのような方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞に核酸を投与するのに使用することができる。特定の実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療用に投与できる。非ウイルスベクター送達系はＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、リポソームまたはポロキサマなどの送達媒体と複合した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は細胞に送達した後にエピゾーム状ゲノムまたは組込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療のレビューにはＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３ （１９９２）； Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７ （１９９３）； Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６ （１９９３）； Ｄｉｌｌｏｎ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５ （１９９３）； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０ （１９９２）； Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４ （１９８８）； Ｖｉｇｎｅ， Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６ （１９９５）； Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４ （１９９５）； Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ （ｅｄｓ．）（１９９５）； および Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６ （１９９４）を参照し、参照によりここに取り込まれる。
【０１２４】
操作されたＺＦＰをコードする核酸の非ウイルス送達方法はエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質‐核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用物質増強型取り込みを含む。また、例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ ２０００ ｓｙｓｔｅｍ （Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションを核酸の送達に使用することができる。加えて、本分野において知られる任意の手段で操作されたＺＦＰをコードするｍＲＮＡを細胞に送達してもよい。
【０１２５】
追加的な例示的核酸送達系はＡｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｃｏｌｏｇｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）， Ｍａｘｃｙｔｅ， Ｉｎｃ． （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）、およびＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ， ＭＡ）、Ｃｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， （例えば、米国特許第６、００８、３３６号を参照）が提供する系を含める。
【０１２６】
例えば、リポフェクションは米国第５，０４９，３８６号、４，９４６，７８７号、および４，８９７，３５５号に記載され、さらにリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）とＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオン性および中性脂質はフェルグナーのものを含む、（ＷＯ ９１／１７４２４号、ＷＯ ９１／１６０２４号）。細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）へ送達ができる。
【０１２７】
脂質の調製：免疫脂質複合体などの標的リポソームを含有する核酸複合体は当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０ （１９９５）； Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２９１−２９７ （１９９５）； Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２−３８９ （１９９４）； Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７−６５４ （１９９４）； Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２ （１９９５）； Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７−４８２０ （１９９２）； 米国特許第 ４，１８６，１８３、 ４，２１７，３４４、 ４，２３５，８７１、 ４，２６１，９７５、 ４，４８５，０５４、 ４，５０１，７２８、 ４，７７４，０８５、 ４，８３７，０２８および４，９４６，７８７を参照）。
【０１２８】
操作されたＺＦＰをコードする核酸の送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系の使用は、体の中の特定の細胞にウイルスを標的化し、かつ、核へのウイルス負荷の輸送という高度に進化したプロセスを利用している。ウイルスベクターは患者（ｉｎ ｖｉｖｏ）に直接投与するか、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の処理に利用してから改変細胞が患者（ｅｘ ｖｉｖｏ）に投与される。ＺＦＰを送達する従来のウイルスに基づく系は、限定されるものではないが、遺伝子導入するためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含む。ホストゲノムでの組込みはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法で可能であり、しばしば挿入されたトランス遺伝子の長期発現という結果になる。さらに、多くの異なる細胞型と標的細胞において高導入効率が認められる。
【０１２９】
レトロウイルスの向性は外来エンベロープタンパク質を組み込んで変えることができ、標的細胞の有望な標的集団を拡大する。非分裂細胞を形質導入または感染させ、かつ、典型的には高ウイルス価を産生するレンチウイルスベクターはレトロウィルス・ベクターである。レトロウイルス遺伝子導入の系の選択は標的細胞に依存する。レトロウイルスは外来性配列の６−１０ｋｂまでのパッケージ容量を有するシス作用性長末端反復で構成している。最小シス作用性ＬＴＲが恒久トランス遺伝子発現させるためには、治療遺伝子を標的細胞に組込むのに使用するベクターの複製および詰め込みで十分である。広く使用されているレトロウイルスベクターはマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合せに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２７３１−２７３９ （１９９２）； Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：１６３５−１６４０ （１９９２）； Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． １７６：５８−５９ （１９９０）； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：２３７４−２３７８ （１９８９）； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：２２２０−２２２４ （１９９１）； ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
【０１３０】
特定の実施形態では、核酸（例えば、ＺＦＮおよび／または組込む配列をコードする）はレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて送達される。一般的に、レンチウイルス導入ベクターは当該分野で周知の方法で産生できる。例えば、米国特許第５，９９４，１３６； ６，１６５，７８２；および６，４２８，９５３を参照。好ましくは、レンチウイルスドーナーコンストラクトはインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）である。例えば、記述したように天然のインテグラーゼ遺伝子において１つ以上の変異を含有するレンチウイルスベクターを用いてＩＤＬＶを産生してもよく、例えば、Ｌｅａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０（２）：７２１−７２８； Ｐｈｉｌｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３（４７）：１７６８４-１７６８９； およびＷＯ ０６／０１０８３４に開示されている。特定の実施形態では、Ｌｅａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０（２）：７２１−７２８に記載したように、ＩＤＬＶはインテグラーゼタンパク質（Ｄ６４Ｖ）の位置６４において変異を含むＨＩＶレンチウイルスベクターである。本明細書においての使用に適した追加のＩＤＬＶベクターは米国特許出願第１２／２８８，８４７号に記載されており、参照により本明細書に援用される。
【０１３１】
ＺＦＰ融合タンパク質の一過性の発現が好まれるような用途では、アデノウイルスに基づく系が使用される。アデノウイルスに基づくベクターでは多くの細胞型の高導入効率が可能で、かつ、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターでは高力価と高い発現レベルが得られている。このベクターは比較的簡単な系で大量に産生することができる。さらに、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、さらにｉｎ ｖｉｖｏとｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子診療手順について標的核酸を用いて細胞に形質導入することに使用する（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７ （１９８７）；米国特許第 ４，７９７，３６８； ＷＯ ９３／２４６４１； Ｋｏｔｉｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１ （１９９４）； Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１ （１９９４）を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０ （１９８５）； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１ （１９８４）； Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ， ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０ （１９８４）； およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：０３８２２−３８２８ （１９８９）を含めて多くの文献に記載されている。
【０１３２】
現在、導入物質を生成するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含有するアプローチを用いている少なくとも６つのウイルスベクターが臨床試験において遺伝子を導入するアプローチとして使用可能である。
【０１３３】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓが臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５ （１９９５）； Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：１０１７−１０２ （１９９５）； Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８ （１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった（（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０ （１９９５））。５０％以上の伝達効率がＭＦＧ−Ｓパッケージベクターについて認められてきた。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４４（１）：１０−２０ （１９９７）； Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：１１１−２ （１９９７））
【０１３４】
組換え型アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は欠損性かつ非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターはトランス遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復のみを維持するプラスミドから導かれる。形質導入した細胞のゲノムの組込みにより、有効な遺伝子導入と安定したトランス遺伝子送達がこのベクター系の主要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３ （１９９８）， Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７４８−５５ （１９９６））。
【０１３５】
複製欠損性組換え型アデノウイルスベクター（Ａｄ）は高力価で産生することができ、かつ、多くの異なる細胞型を容易に感染する。アデノウイルスベクターの多くはトランス遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ，および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され、さらに、複製欠損ベクターは別の場所で欠失した遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞において増殖する。Ａｄベクターは肝臓、腎臓および筋肉にある非分裂、分化細胞を含有してｉｎ ｖｉｖｏで複数の型の組織を形質導入することができる。従来のＡｄベクターは大きな運搬能を有する。臨床試験でのＡｄベクターの使用例は筋肉注射で抗腫瘍免疫化をするポリヌクレオチド治療を含む（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３−９ （１９９８））。臨床試験で遺伝子導入のためにアデノウイルスベクターを使用する追加的な例はＲｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０ （１９９６）； Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７ １０８３−１０８９ （１９９８）； Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２０５−１８ （１９９５）； Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５９７−６１３ （１９９７）； Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５０７−５１３ （１９９８）； Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３−１０８９ （１９９８）を含む。さらに、ＺＦＮの送達のためのＡｄ５／３５ベクターの使用を記載した米国特許公報第２００８０１５９９９６号を参照し、参照により本明細書に援用される。
【０１３６】
宿主細胞を感染することができるウイルス粒子の形成にパッケージング細胞を使用する。そのような細胞はアデノウイルスを詰め込む２９３細胞、レトロウイルス細胞を詰め込むψ２細胞またはＰＡ３１７細胞含む。通常、遺伝子治療に使うウイルスベクターは核酸ベクターをウイルス粒子に詰め込む産生細胞株で生成する。典型的には、ベクターは詰め込みおよびその後の宿主（該当する場合には）への組込みで要求される最小値のウイルス配列、発現しているタンパク質をコードする発現カセットにより置換された他のウイルス配列を含む。欠けているウイルス機能をパッケージング細胞株により別の場所で供給する。例えば、典型的には遺伝子治療で使用するＡＡＶベクターは詰め込みと宿主ゲノムへの組込みに要求されるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列に欠けているヘルパープラスミドを含有する細胞株で詰め込まれる。また、この細胞株はヘルパーであるアデノウイルスに感染している。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠いており大きな量では詰め込まれない。アデノウイルスによる汚染をＡＡＶよりもアデノウイルスがより高い感受性を示す例えば熱処理で低めることができる。
【０１３７】
多くの用途において、高度な特異性でベクターが特定の組織型に送達されることが望ましい。従って、ウイルスの外面上にウイルスコートタンパク質がある融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、ウイルスベクターを所与の細胞型に対して特異性を有するように改変できる。目的の細胞型に存在することが知られている受容体について親和性を有するリガンドを選択する。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現させることができ、かつ、その組換えウイルスがヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞‐表面受容体についてリガンドを含む融合タンパク質を発現するような他のウイルス‐標的細胞の対に拡張することができる。例えば、事実上任意に選択された細胞受容体について特異的結合親和性を有する抗体断片（例えばＦａｂまたはＦｖ）を提示するように繊維状ファージを操作できる。前述の説明は、ウイルスベクターに主として適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することもできる。そのようなベクターを特定の標的細胞による取込みを促進すると考えられている特定の取込み配列を含有するように操作できる。
【０１３８】
ベクターは後述するように個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、真皮下、もしくは頭蓋内への注入）または局所適用によってｉｎ ｖｉｖｏに送達することができる。あるいは、ベクターは個々の患者（例えば、リンパ球、骨髄穿刺、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞から外植された細胞のようにｅｘ ｖｉｖｏで細胞に送達することもでき、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択して患者に細胞を再移植する。
【０１３９】
診断、研究用または形質移入された細胞（例えば、幹細胞）の再注入用にする宿主生物へのｅｘ ｖｉｖｏ細胞形質移入は当業者には周知である。好ましい実施形態では、細胞は被験対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）で形質移入され、かつ、被験対象生物（例えば、患者）に再注入される。ｅｘ ｖｉｖｏでの形質移入に適した様々な細胞型は、当業者に周知である（患者から細胞を単離し、培養する方法の考察については、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ． １９９４）およびその中で引用される参考文献を参照）。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインを用いて臨床的に重要な免疫細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３４＋細胞を分化する方法は周知である（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２ （１９９２）を参照）。
【０１４０】
周知の方法で形質導入と分化のために幹細胞を単離する。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（パンＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化抗原提示細胞）などの不要な細胞を結合する抗体がある骨髄細胞を選り分けて骨髄細胞から幹細胞を単離する（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２ （１９９２）） ｏｒ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ＣＤ３４＋ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （Ｄ Ｊ Ｒｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．， （２０００）． Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２５： ２４３−２４９を参照）。
【０１４１】
ｉｎ ｖｉｖｏで細胞の形質導入についての治療ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）を生物に直接投与することができる。または、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は分子を導入して、最終的に血液または組織細胞と接触させるために通常使用される経路のうちいずれか、限定されるものではないが、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーション法を含める。このような核酸を投与する適切な方法は当業者にとって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために複数の経路を使用できるが、特定の経路が別の経路と比べてより速やかで、かつより効果的な反応をしばしば提供することが可能である。
【０１４２】
例えば、造血性幹細胞にＤＮＡを導入する方法は米国特許第５、９２８、６３８号に開示されている。トランス遺伝子を造血性幹細胞、例えばＣＤ３４+細胞に導入することに有用なベクターはアデノウイルス３５型を含む。
【０１４３】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）にリポーターコンストラクトを導入することに適したベクターは非組込み型レンチウイルスベクターを含む。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８； Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１； Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０； Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照。
【０１４４】
薬学的に許容される担体は投与される個々の組成物によって、ならびに、その組成物を投与することに使用される個々の方法によって、ある程度決定される。したがって、後述するように、本発明の薬学的組成物の多種多様の適切な製剤がある（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８９を参照）。
【０１４５】
用途
本明細書に開示した方法と組成物は幅広い用途が可能である。コード配列（リポーター）に作動可能に連結された内在性遺伝子からのプロモータ（例えば、系譜特異的または細胞運命プロモータ）を含有する１つ以上の配列の幹細胞への標的組込みを内在性遺伝子の発現パターンを同定することに使用することができる。内在性プロモータは幹細胞の細胞運命について特異的分化状態または決定を伴うプロモータであってもよい。特定の実施形態では、挿入された配列は「セーフハーバ」（非必須遺伝子）遺伝子座に組込まれ、それによりゲノムを害することがなく、かつ、周囲の内因性調整配列からの偽性の調整をすることがなく目的の発現をさせることができる。
【０１４６】
発現は低分子などの外因性因子の導入で調整され、構成的な規則的系、組織特異性調整配列により挿入された配列を調整することができ、または誘導性系とともに用いてもよい。幹細胞に挿入された配列はタンパク質コード配列および／または系譜特異的レポーターコンストラクト、目的とする他の遺伝子に対する一般的リポーター遺伝子の挿入、細胞運命決定に含まれる遺伝子に対するリポーター、およびミクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）、ｓｈＲＮＡｓ、ＲＮＡｉｓなどの非タンパク質コード配列プロモータおよび調整配列を含んでもよい。
【０１４７】
ゲノムの指定領域に組込まれたトランス遺伝子を含有する幹細胞（系譜特異的または細胞運命リポーター、タンパク質コード配列など）を種々の分化の研究、分化細胞の精製およびタンパク質産生などに使用することができる。例えば、系譜特異的または細胞運命リポーターをあらゆる型の幹細胞に標的挿入することで、分化研究用と細胞画分精製用に使用することができる。従来の組込み法でリポーターカセットを宿主細胞ゲノムに無作為に組込む。隣接配列からの位置効果はリポーター遺伝子発現に影響を与え、大きくかつ変動する背景またはトランス遺伝子サイレンシングを起こす。従って、本明細書に記載の幹細胞では標的組込みリポーターカセットは同様のクロマチン環境を有し、従って異なる細胞においても均一に発現する。加えて、標的組込みは幹細胞から選択された細胞系譜成熟のみにおいてトランス遺伝子の発現（例えば、系譜特異的または細胞運命リポーターコンストラクト）を可能にさせる。
【０１４８】
また、本明細書に記載の幹細胞は選択された座において内因性調整配列により駆動される遺伝子産物（例えば、系譜特異的または細胞運命遺伝子）が発現するように、プロモータ欠損コンストラクトが内因性遺伝子座に組み込まれる細胞を含有し、これにより当該座を細胞運命または発生系譜に変換する。
【０１４９】
系譜特異的または細胞運命リポーターを標識する幹細胞は、幹細胞の集団を目的の特定の細胞系譜経路から系譜特異的または成熟細胞型への駆動をおこなうことができ、幹細胞または低分子などの化合物のスクリーニングおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法に使用することができる。また、系譜特異的または細胞運命リポーターを標識する幹細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ位置、さらに最終的には最終位置、全般的な生体内分布、分化運命、および被験対象に導入した後の幹細胞の組織組込みの機序を追跡するトラッキングシステムに使用することができる。配列は宿主細胞の１つ以上の対立遺伝子に挿入してもよく、あるいは、異なる対立遺伝子は異なる挿入配列を含んでもよい。
【０１５０】
幹細胞はリポータータンパク質（例えば、ＨＴＫ）を標識することも、または挿入配列を自殺カセットの導入用にも使用できる。加えて、非分化細胞内または望まない細胞系譜へ分化した細胞内のいずれかで制御をする調整要素の制御下で自殺遺伝子を挿入して分化細胞集団の精製を実現することもできる。次に、分化に影響する可能性がある低分子または他の因子についてスクリーニングと特性研究にこの精製された亜集団を使用できる。いくつかの実施形態では、自殺カセットは大きな細胞集団からの細胞の特異的な型の分化亜集団同定および単離を促進することに使用される。別の実施形態では、自殺カセットはｉｎ ｖｉｖｏで望ましくない状態に例えば、細胞が分化し奇形腫が形成された場合、分化した幹細胞を破壊することに使用する。
【０１５１】
また、特定の疾患の患者からの患者由来ｈｉＰＳＣｓをヒト疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのモデルを作るのに使用することができる。遺伝子操作されたｈＥＳＣｓおよびｈｉＰＳＣｓは分化パラダイムの向上、疾患関連遺伝子の過剰発現、さらには機能喪失経験による疾患経路の研究に使用することができる。
【０１５２】
野生型か患者由来かのいずれかにおいて、リポータータグ化幹細胞は細胞の選択された同質セット中で疾患過程研究をすることに使用することができる。例えば、特定の組織中の特定の疾患の病態に関係があると知られている遺伝子からのプロモータは、本明細書に記載したようにリポーター遺伝子に結合し、かつ、幹細胞に導入されている可能性がある。選択された細胞型に幹細胞が分化した後、リポーター系はこの同質の細胞集団における疾患を研究することに使用することができる。この細胞はタグ化遺伝子の発現を調節する化合物のスクリーニングに使用することができる。または、組織特異的毒性（例えば、肝細胞のｐ４５０）に関係があると知られている遺伝子に結合したリポーターは、標識された幹細胞から分化した標的細胞の整合する同質の集団に対する薬物の安全性をスクリーニングするツールとして使用することができる。
【０１５３】
同様に、１つ以上のポリペプチドを発現する幹細胞はタンパク質補充遺伝子療法向けの細胞ビヒクルとして使用することができる。コンストラクトが無作為に宿主細胞ゲノムに組込まれる従来の組込み方法に比較して、本明細書に記載の特定の部位へのコンストラクトの組込みは、例えば、系譜特異的または細胞運命リポーターコンストラクトの場合、コグネート系譜特異的細胞型または成熟細胞型に分化した場合のみ正しい発現を可能にし、タンパク質発現コンストラクトの場合は、集団の細胞間の均一な発現を可能にする。幹細胞へのコード配列の標的挿入はタンパク質補充遺伝子療法向けの細胞ビヒクルを提示する一方で、非特異的組込みにより起こる挿入変異のリスクを最低化または除去する。治療タンパク質の特異的組込みを含有する幹細胞は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、血友病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、やけど、肺疾患、鎌状赤血球貧血、臓器不全、心疾患、糖尿病、関節炎、Ｇａｕｃｈｅｒ病、Ｆａｂｒｙ病、常染色体劣性遺伝病ムコ多糖症およびポンペ病などの各種の疾患または病態の治療に使用してもよい。例示のみであるが、利用可能性がある治療タンパク質をコードする遺伝子は第ＩＸ 因子、エリスロポイエチンなどを含んでもよい。加えて、突然変異内因性遺伝子をもつドナー由来の幹細胞への遺伝子の野生型複製物の挿入で種々の治療が行われる。
【０１５４】
他の実施形態では、２つの内因性遺伝子に結合した２つのリポーターをもつ幹細胞が構想されている。１つのリポーターは特定の細胞運命に向かう細胞を単離することに使用できる。第２の標識は所望の系譜特異的または成熟分化細胞において発現が知られている遺伝子に結合している。このように、特定の代謝経路に関係していると知られているタグ化内因性遺伝子を含有する分化細胞を産生することができる（例えば、膵β細胞におけるインシュリンの産生）。
【０１５５】
二重タグ化幹細胞は、分化細胞集団から癌幹細胞への進展などの複雑な経路を研究することに使用できる。上述したように、分化細胞は細胞運命リポーターに結合したリポーター遺伝子を用いて幹細胞集団から単離することができ、さらに、どのような外的または内的条件が細胞を癌幹細胞株に脱分化させる可能性があるのかを決定する作業において第２リポーターを脱分化標識に結合することができる。
【０１５６】
上述した細胞系譜または細胞運命のリポーターを用いて単離された分化細胞集団は、細胞が潜在的に混乱する幹細胞様状態に戻り始める場合には、脱分化が自殺遺伝子を誘発し細胞を殺すように脱分化標識に結合した自殺標的を含有する第２の標識遺伝子を持つことができる。潜在的に、このことは治療としてのｉｎ ｖｉｖｏでの幹細胞の使用に関して安全性の懸念を提示することになる。
【０１５７】
従って、本開示は配列（例えば、系譜特異的または細胞運命リポーターコンストラクトまたはポリペプチドコード配列）を幹細胞、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ブタまたはラットの細胞に組込む方法および組成物を提供する。コンストラクトの標識組込みは目的の領域内におけるゲノムの標識２本鎖切断により促進される。目的の領域内さらには切断ドメインまたは切断半ドメイン内の選択した配列に結合するように操作することができるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含有する融合タンパク質の使用により特定の部位を標的として切断がなされる。そのような切断は切断部位またはその近傍で外因性ポリヌクレオチド配列の標的組込みを刺激する。系譜特異的または細胞運命リポーターコンストラクトが幹細胞に組込まれている実施形態において、典型的にはリポーターコンストラクトはリポーター配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された分化の間に発現した遺伝子からのプロモータを含む。
【０１５８】
以下の実施例は本発明の特異的な実施形態を定める。系譜特異的分化の標識である他の遺伝子からの他の細胞特異的調整性領域はａＰ２を置換することができ、かつ、本発明の範囲から離れることなく種々のリポータータンパク質、培養条件および単離方法を置換することができることに留意しなければならない。同様に、Ｅｐｏ以外またはＥｐｏに加えたポリペプチドコード配列は幹細胞ゲノムの特定の領域に組込まれることができることを認識しなければならない。
【実施例】
【０１５９】
実施例１ 脂肪細胞特異的リポーターの標的組込み
脂肪細胞特異的リポーターコンストラクトは脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質のａＰ２またはＡＬＢＰをＧＦＰリポーター配列に作動可能に連結したプロモータ配列により 生成された。例えば、ヒト、マウスおよびニワトリ ａＰ２プロモータ配列を記載し、参照により本明細書において援用するＣｒｅａｓｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４（１３）：２５９７−２６０６を参照。
【０１６０】
簡単に述べれば、マウスａＰ２遺伝子の６００ｂｐエンハンサーおよび２００ｂｐ基本プロモータをクローニングして連結した。続いて、連結したａＰ２制御要素を米国特許出願第１２／２８８，８４７に記載されているようにＣＣＲ−ＬＶＧＦＰと名づけられたＩＤＶＬレンチウイルスベクターにおいてｈＰＧＫプロモータの代わりにクローニングした。ＣＣＲ５−ａＰ２−ｅＧＦＰと名付けられ、得られたリポーターコンストラクトはＧＦＰの発現を駆動し、かつＣＣＲ５遺伝子に相同性を示す配列に隣接したａＰ２制御要素（プロモータ／エンヘンサー）を含む。図１を参照。加えて、ａＰ２‐ＧＦＰリポーターカセットに隣接するＣＣＲ５相同アームを含有する組込み型レンチウイルスベクターを制御として構築した。
【０１６１】
組込み型および組込み欠損レンチウイルスドナーコンストラクトを異なるＭＯＩでのＣＣＲ５を標的としたＡｄ５／Ｆ３５組換えベクターにより送達されたＣＣＲ−５特異的ＺＦＮｓの存在下でヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）に分離して形質導入した。参照により本明細書において援用するＡｄ５／Ｆ３５ベクターによる送達されるＣＣＲ−５特異的ＺＦＮｓについては米国特許公報第２００８０１５９９９６号を参照。４継代の後、ゲノムＤＮＡを形質導入細胞から単離し、さらにＣＣＲ５遺伝子座でａＰ２−ｅＧＦＰ発現カセット標的組込みを検知するためにＰＣＲを実施した。図２は、組込みの結果を示す。「１００％」、「３０％」、「１０％」等から「１％」まで標識されたレーンは混合物が「１００％」、「３０％」、「１％」までの標的組込みのいずれかの結果を刺激するように作製されスパイクされた制御を示す。レーンの下部にはＰＣＲにより検出された結果を示す。「Ｄのみ」はレンチウイルスドナーのみ（ＺＦＮｓを用いない）で形質導入した細胞を示す。上方のパネルはプライマーがドナーアームの外側の領域（「外側ＰＣＲ」）に特異的であるＰＣＲ実験の結果を示す一方で、中間のパネルは１つのプライマーが相同アームの外側の領域に特異的であるが、他の１つはドナー配列内の領域（「インーアウトＰＣＲ」）に特異的であるＰＣＲ実験の結果を示す。
【０１６２】
図２に示したように、明瞭なＰＣＲバンドがレンチウイルスドナーとＡｄＺＦＮの両方で形質導入された細胞からのすべての試料において認められた。制御として等量のＤＮＡがＰＣＲ反応に装填したのかを検証するＧＡＰＤＨ‐特異的ＰＣＲを実施された。
【０１６３】
さらに、組込み型リポーターコンストラクトを有する細胞については、ｈＭＳＣｓのｉｎ ｖｉｔｒｏ脂肪細胞または骨細胞の分化後にＧＦＰ発現を測定した。組込み欠損性リポーターを含有する細胞において、未分化細胞または分化した骨細胞にもＧＦＰシグナルは認められないが一部の分化した脂肪細胞で明瞭なＧＦＰシグナルが認められた。図３を参照。無作為な組込みＣＣＲ５ ａＰＣ２−ｅＧＦＰドナーレンチウイルスベクターを含有する細胞において、分化が無い場合でもゲノムに無作為に組込みされた場合にはベクターからの位置依存性漏出性発現を示し確認できる弱いバックグランドＧＦＰ発現が認められる。図４を参照。明瞭なＧＦＰシグナル上昇は脂肪細胞が分化する時に認められる。この結果は脂肪細胞においてマウスａＰ２プロモータ特異性を示すだけでなく、リポーターａＰ２−ｅＧＦＰ発現はゲノムの位置効果に影響を受けることを示している。
【０１６４】
上述の結果を評価するために、未分化細胞および脂肪細胞と骨細胞分化させた細胞についてＧＦＰ発現の測定をした。組込み型レンチウイルスベクター形質導入細胞についてＧＦＰ発現レベル上昇のみが認められたが、脂肪細胞分化の間、ＧＦＰ陽性細胞の割合が増加することはなかった。対照的に、ＣＣＲ５でａＰ２−ｅＧＦＰ標的組込み型を有するｈＭＳＣｓはＧＦＰ陽性細胞の割合の上昇とＧＦＰ発現レベルの上昇の両方を示した。
【０１６５】
この結果は核酸系譜特異的リポーター標識においては無作為組込みより標識遺伝子の挿入を標的化とすることの明瞭な利点を示す。
【０１６６】
実施例２ ＥＰＯコード配列の標的組込み
ＣＣＲ５遺伝子に相同である配列に隣接するｅＧＦＰ（ＰＧＫ−ｅＧＦＰ）のＰＧＫプロモータ駆動発現 またはＥＰＯおよびｅＧＦＰ（ＰＧＫ‐ｍＥｐｏ−２Ａ‐ｅＧＦＰ）のいずれかを含有して、レンチウイルスドナーベクター（組込み型または非組込み型）を生成した。図５Ａおよび米国特許出願第１２／２８８，８４７号を参照。
【０１６７】
ジャーカットおよび骨髄由来のＫ５６２ヒト細胞株およびヒト間葉系幹細胞（ＢＭ‐ＭＳｃ）をＩＤＬＶ ＣＣＲ５標的化ドナー（ＰＧＫ‐ｅＧＦＰまたはＰＧＫ‐ｍＥｐｏ‐２Ａ‐ｅＧＦＰカセット）のみで、または指示されたＭＯＩにおいてＺＦＮ発現Ａｄ５／Ｆ３５との組み合わせで形質導入し、さらに、形質導入から１カ月後にＦＡＣＳでＧＦＰ発現を解析した。ＣＣＲ５ Ａｄ５／３５ ＺＦＮｓの完全な記述については参照により本明細書において援用する米国特許公報第２００８０１５９９９６号を参照。ｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ， Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを参照）によって定量化される７５ｎｇ／ｍＬのＩＤＬＶを使用した。図６に示したように、ジャーカットおよびＫ５６２ヒト細胞株（図６Ａ）およびヒト間葉系幹細胞（図６Ｂ）のＦＡＣＳ解析はドナーコンストラクトの標的組込み後、（ＭＯＩに依存するが）３５％超のジャーカット細胞、約１５％のＫ５６２細胞および約１５％から５０％のヒト間葉系幹細胞がＧＦＰを発現したことを示した。
【０１６８】
加えて、１カ月の導入後ゲノムＤＮＡを形質導入した細胞から単離し、ＣＣＲ５遺伝子座においてドナー標的組込みの検出のためにＰＣＲを実施した。図７で示したように、ジャーカットおよびＫ５６２細胞（図７Ａ）およびヒト間葉系幹細胞（図７Ｂ）におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）の存在下で標的組込みを示す明瞭なＰＣＲバンドが認められた。
【０１６９】
さらに、形質導入されたｈＭＳＣｓの培地でのＥｐｏタンパク質濃度を計測した。簡単に述べれば、ｅＧＦＰおよびｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰ発現カセットについてレンチウイルス（ＬＶ）か、またはＡＤ．ＺＦＮとＩＤＬＶドナーの両方かで、形質導入後１カ月での１００％ｅＧＦＰ陽性ＩＤＬＶドナー処理ｈＭＳＣｓから得た２４時間、馴化培地でＥＬＩＳＡを実施した。図８で示したように、組込み型または非組込み型レンチウイルスドナーコンストラクトで形質導入したｈＭＳＣｓから得た培地でＥｐｏタンパク質を検出した。
【０１７０】
実施例３ ＺＦＮ修飾幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
さらに、ヒトＭＳＣｓ発現ｍＥｐをマウスに投与し、かつ、ヘマトクリットに対する効果ならびにＥｐｏの血漿中濃度を測定した。簡単に述べれば、ＬＶ‐ｅＧＦＰまたはＬＶ−ｍＥｐｏ‐２Ａ‐ｅＧＦＰで修飾した１０6ｈＭＳＣｓか、Ａｄ．ＺＦＮとＩＤＬＶドナー（ｅＧＦＰまたはｍＥｐｏ．２ＡｅＧＦＰ発現カセット）の両方のいずれかで修飾した１０7ｈＭＳＣｓのいずれかを用いてＮＯＤ／ＳＣＩＤγＣマウスにＩＰ注射した。ＬＶ形質導入した細胞がＩＤＬＶ形質導入した細胞よりも１０倍大きな可溶性Ｅｐｏ発現を示すＥｐｏ−ＥＬＩＳＡに従って注射されたＭＳＣｓの数を決定したが、これはＩＤＬＶドナーと比べた場合の組込まれたドナーＤＮＡの数の増加が原因とおもわれる。６０日の間に末梢血を下顎静脈から採取した。ヘマトクリット値を測定し、血漿Ｅｐｏ値をＥＬＩＳＡで測定した。
【０１７１】
図９Ａと図９Ｂに示したように、ヘマトクリットの上昇（図９Ａ）と可溶性血漿タンパク質の上昇（図９Ｂ）の両方で証明しているようにＥｐｏタンパク質発現のレベルにおいてＩＤＬＶドナーコンストラクトで形質導入したｈＭＳＣｓが検出可能な上昇を示した。
【０１７２】
この結果は、目的のポリペプチドコード配列を幹細胞導入することができ、かつ形質導入した幹細胞の投与でポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで発現することを示した。
【０１７３】
実施例４ リポーターコンストラクトのヒトＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）遺伝子座への標的組込み
マウスＯＣＴ４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１でも知られる、以下ヒトＯＣＴ４という）のヒトオーソログを標的するため、ヒトＯＣＴ４遺伝子（表３）の第１イントロンにおける固有な配列を認識する４つのＺＦＮ対（下の表２を参照）を設計した。ヒトＯＣＴ４を標的としたＺＦＮｓを設計し、本質的に、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１， Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ （２００８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（７）： ８０８−８１６， および米国特許公報 ２００８／０１３１９６２に記述されているプラスミドに組込んだ。
【０１７４】
【表１０】
【０１７５】
【表１１】
【０１７６】
二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を予想したゲノム標的位置に導入する個別のＺＦＮ対の効率を測るために、それぞれのＺＦＮ対を一過的にｈＥＳＣｓに発現させた。細胞培養技術はすでに記載されている（Ｓｏｌｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｃｅｌｌ ３６： ９６４−９７７）。ｈＥＳＣｓ培地［１５ ％ ＦＢＳ （Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） 、５％ ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ ｍＭ グルタミン （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ 非必須アミノ酸 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ ｍＭ -メルカプトエタノール （Ｓｉｇｍａ）および４ ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２ （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）］でマイトマイシンＣ不活性マウス胚線維芽（ＭＥＦ）フィーダー層上にｈＥＳＣｓ株ＢＧ０１（ＮＩＨ Ｃｏｄｅ： ＢＧ０１； ＢｒｅｓａＧｅｎ， Ｉｎｃ．， Ａｔｈｅｎｓ， ＧＡ）を維持する。手動または酵素的にＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； １．５ ｍｇ／ｍｌ）で５日から７日ごとに培養を継代培養した。記載されているように（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３：３４６−３５３）ＧＦＰ発現カセットをＦＵＷ−Ｍ２ｒｔＴＡレンチウイルスにクローン化した。簡単に述べれば、先に記載されているように（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１５１−１５９）２９３細胞にＶＳＶＧ外層を持つレンチウイルスを生成した。培地を形質移入後１２時間でかえて、ウイルスを含有する上清を形質移入後６０時間から７２時間後に回収した。ウイルス上清を０．４５μｍフィルターで濾過した。ウイルスを含有する上清をコラーゲナーゼ処理および連続洗浄でフィーダ細胞から分離したｈＥＳＣｓ集合体を感染させるのに使用した。２μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で２回連続の感染を懸濁液に１２時間実施した。フィーダに感染後、ｈＥＳＣｓ細胞集合体を再度プレーティングした。２日間ドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； ２ μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した細胞のｅＧＦＰおよびＳＳＥＡ４についてＦＡＣＳ解析を用いて感染効率を計測した。形質導入した細胞を濃縮するために、ＲＯＣＫ抑制剤（ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ； ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で標的され感染されたｈＥＳＣｓを、ドキシサイクリン誘発後ｅＧＦＰ発現細胞を単一細胞溶液として２日間ＦＡＣＳ選別し、ＥＳＣ培地を含有するＲＯＣＫ抑制剤中で再プレーティングした。
【０１７７】
標的部位のＺＦＮ仲介破壊の頻度をＣＥＬ‐Ｉミスマッチアッセイで解析し、製造者の指示書（Ｔｒａｎｇｅｎｏｍｉｃ ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））に本質的に従って実施した。４つのテストしたＺＦＮ対のうち３つは効率的にＤＳＢをヒトＯＣＴ４遺伝子座の予想した位置に導入することができた。
【０１７８】
この３つのＺＦＮ対に対応してＤＳＢ標的部位に隣接する約７００ｂｐのヒトＯＣＴ４配列をカバーする５’と３’の相同領域を有するドナープラスミドを設計した。このドナープラスミドは、２Ａ自己切断ペプチド配列をピューロマイシン耐性遺伝子（ピューロマイシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼ）、そして続けてポリアデニル化配列に接続させているスプライス受容体ｅＧＦＰカセットを含めた（図１０Ａ）。このドナーコンストラクトをヒトＯＣＴ４遺伝子座の第１イントロンへ正確に標的化するこで、２つのタンパク質の発現になると予想されるが、それらはｅＧＦＰ（ＯＣＴ４ＥＸ１−ｅＧＦＰ）に融合するヒトＯＣＴ４の第１１３２ａａからなる融合タンパク質、およびピューロマイシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼであり、両方とも内因性ヒトＯＣＴ４プロモータの転写制御下においてである。独立した細胞株を作るために拡張したピューロマイシン選択の１４日後に、１０ｘ１０6ｈＥＳＣｓ（ＢＧＯ１）に対するそれぞれのＺＦＮ対を有するドナープラスミドのコエレクトロポレーションがコロニーをもたらした。適切な酵素で制限消化後に０．７％アガロースゲル上で分離されたゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット分析を行い、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、さらに32Ｐランダムプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）標識プローブとハイブリタイズした。ｅＧＦＰ（図１０Ｂを参照）に対する内部プローブと同様に、ドナー相同性に対する外部プローブ３’および５’を使用した。
【０１７９】
表４に示したように、単離され、かつ拡張されたピューロマイシン耐性ＺＦＮ処理クローンを典型的に、正確に、かつ効率的に標的した。
【０１８０】
【表１２】
【０１８１】
多能性状態を維持したＯＣＴ４ＥＸ１-ｅＧＦＰ標的細胞を確認する場合、ｈＥＳＣｓの特徴として知られる多能性マーカーであるＮＡＮＯＧ，ＳＯＸ２、Ｔｒａ-１-６０およびＳＳＥＡ４を検討するためにそれらを免疫染色した。簡単に述べれば、以下の第1抗体を使い標準の規約に従って細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し免疫染色した：ＳＳＥＡ４ （マウスモノクローナル， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）； Ｔｒａ−１−６０， （マウスモノクローナル， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）； ｈＳＯＸ２ （ヤギポリクローナル， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）； Ｏｃｔ−３／４ （マウスモノクローナル， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）； ｈＮＡＮＯＧ （ヤギポリクローナル Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ） 、さらに適切なＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素複合体第２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０１８２】
さらに、ＳＣＩＤマウスに注射した場合、この細胞は多能性状態を確認しながら３つの発生過程の胚葉すべてから起因する細胞型に分化できる奇形腫を誘導した。ｈＥＳＣｓをコラーゲナーゼ処理（１．５ｍｇ／ｍｌ）で回収し、培地をその後での洗浄および重力による沈降によりフィーダ細胞から分離した。遠心分離によりｈＥＳＣｓ集合体を回収し、２５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁した。ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の背中にｈＥＳＣｓを皮下注射した。一般的に、腫瘍が４週から８週の間に発生し、腫瘍のサイズが直径１．５ｃｍを超える前に動物を犠牲にした。犠牲にした後で奇形腫を単離し、ホルマリンに固定した。切断後、ヘマトキシリン−エオシン染色に基づき奇形腫を検査した。
ｈＥＳＣｓ中でヒトＯＣＴ遺伝子座の正確な標的化、内因性プロモータの制御下でのＯＣＴ４ＥＸ１‐ＧＦＰの発現、およびヒトＯＣＴ４の発現を機能的にバリデートするために、予想されたＯＣＴ４ＥＸ１‐ｅＧＦＰ融合タンパク質をＯＣＴ４およびｅＧＦＰについての抗体を用いてウエスタンブロット解析で確認した（図１０Ｃ）。簡単に述べれば、ｈＥＳＣｓをコラーゲナーゼ処理で（１．５ｍｇ／ｍｌ）回収し、培地をその後での洗浄および重力による沈降によりフィーダ細胞から分離した。トリプシン処理でｈＥＳＣ由来線維芽細胞を回収した。細胞を遠心分離によりベレット化し、１ｘＰＢＳで洗浄し、さらに遠心分離により回収した。氷冷噴霧緩衝液（プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ， Ｒｏｃｈｅ）を添加した５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）， ２０％ グリセロール， １ ｍＭ ＥＤＴＡ， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．０２％ ＳＤＳ， １ ｍＭ ジチオスレイトール ［ＤＴＴ］， ２ ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ［ＰＭＳＦ］）中で細胞を溶解した。氷冷５分後、最終的な［ＮａＣｌ］を４００ｍＭにするために５Ｍ ＮａＣｌを添加した。さらなる氷冷５分後、等容の氷冷水を添加し、遠心分離をすぐに始める前に微量遠心管（１４ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ）中で完全に混合した。上清のタンパク質濃度をブラッドフォード法で測定し、４％から１２％ビス−トリス勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１５μｇのタンパク質を分離した。ＰＶＤＦ膜に移し、ＯＣＴ４（マウスモノクローナル抗体、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＧＦＰ（Ｒｂｔ ｐＡＢ ｔｏ ＧＦＰ Ａｂｃａｍ ａｂ２９０−５０）抗体で探索後、ＺＦＮ処理細胞がＯＣＴ４ＥＸ１−ｅＧＦＰタンパク質を様々なレベルで発現した。
【０１８３】
最終的に、トランス遺伝子発現が適切に調整されているかをテストするために、標的ｈＥＳＣｓを線維芽細胞に分化させ、分化細胞にはＯＴＣ４およびＯＣＴ４ＥＸ１−ｅＧＦＰタンパク質が存在しないことを発見した（図１０Ｃ）。ＥＢ誘導分化では、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｈＥＳＣｓコロニーを採取し、ＭＥＦフィーダ細胞から重力で分離し、１５％で添加したＤＭＥＭに非接着懸濁液培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で緩やかに７日間圧潰し培養した。接着組織培養ディッシュにＥＢｓをプレーティングし、実験開始前に少なくとも４つの継代培養にトリプシン処理をしてプライマリ線維芽細胞プロトコルに従い継代培養した。さらに、０．５μｇ／ｍｌまで低いピューロマイシン濃度では生存できなことが証明されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導線維芽細胞がピューロマイシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼを発現することはなかった。
【０１８４】
この結果はＺＦＮ介在遺伝子標的化がヒトＥＳ細胞の多能性状態に関するレポーター系を生成するのに効率的に使用できることを示す。
【０１８５】
実施例５ ヒトＥＳ細胞におけるセイフ―ハーバー遺伝子座の高効率組入れ
部位特異的クローン多様化および後成的サイレンシング効果がなくトランス遺伝子の画定された過剰発現をする信頼性が有り使いやすい発現系の欠如がｈＥＳＣｓにおける過剰発現の研究を阻んでいる。染色体１９のＡＡＶＳ１遺伝子座は先に記述したが、トランス遺伝子サイレンシングが無く多数形質転換され、かつ初代細胞株においてトランス遺伝子を安定的に発現させるのに使用し続けてきた最も良く特徴付けされている遺伝子座を表す（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：４９６−５０４）。この遺伝子座はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ）に関するウイルス組込み部位として同定されており、プロテインホスファターゼ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）の調節サブユニット１２Ｃをコードする遺伝子を妨げる。さらに、アデノ随伴ウイルス遺伝子送達技術を用いてＡＡＶＳ１遺伝子座で標的されているｈＥＳＣｓが長期間のトランス遺伝子発現を示し、かつ多能性状態を維持した（（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ｉｂｉｄ）。
【０１８６】
ｈＥＳＣｓ培養に好適で堅牢な過剰発現系を構築するために、形質転換された多数の細胞株において効率的にトランス遺伝子をＡＡＶＳ１に標的する、先に設計され使用してきたＺＦＮ対を使ってＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの第１イントロンを標的する（米国公報ＵＳ ２００８０２９９５８０を参照）。
【０１８７】
２つの異なる標的化戦略を用いてヒトＥＳ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座を標的した。ＡＡＶＳ１遺伝子座のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子をｈＥＳＣｓ中で発現させているので、ＯＣＴ４を標的として使ったものと類似するスプライス受容体−ピューロマイシン選択カセットを用いてプロモータなしのドナーコンストラクトを設計した（図１１Ａ）。ＺＦＮ仲介標的化の高い効率は遺伝子トラップアプローチの使用に制限されるのか、またはプロモータ駆動選択カセットにより達成できるのかをテストするために、ヒトホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータによりピューロマイシン選択カセットを含有する第２のＡＡＶＳ１ドナープラスミドを構築した（図１１Ａ）。並行実験において、ＡＡＶＳ１遺伝子座に対する２つのドナープラスミドおよびＺＦＮｓを使用してＢＧＯ１ｈＥＳ細胞をエレクトロポレーションし（米国特許出願第２００８０２９９５８０号に詳しく説明）、ピューロマイシン耐性コロニーのために選択した。
【０１８８】
予想通り、プロモータなしの標的化ドナープラスミドではＰＧＫ−ピューロマイシンカセットをはこぶドナープラスミドよりもピューロマイシン耐性クローンがより少なく（約５０％）回収した。サザンブロット分析により、両方のアプローチではＡＡＶＳ１遺伝子座において正しいヘテロ接合体標的化事象になったことが確認された（図１１Ｂ）。加えて、両方のアプローチはホモ接合体標的クローンを回収し、ここでサザンブロット分析が両方のＡＡＶＳ１対立遺伝子が正しい組込みパターンであることを示した。 標的化効率の定量化は、一方または両方の対立遺伝子において約５０％のピューロマイシン耐性クローンが正しく標的していることを示した（表５）。表５の最初の６行に示された結果はＢＧＯ１細胞における結果、最後の３行に示した結果は ｉＰＳ ＰＤ２lox‐１７Ｐｕｒｏ−５細胞で実施された実験のものである。標的化の高い効率を両方のドナープラスミドで達成し、外因性プロモータ駆動選択カセットを使用する場合にＺＦＮ標的化を効率的に達成することができることを示した。
【０１８９】
【表１３】
【０１９０】
実施例４で述べたＯＣＴ４標的化のように、標的とされてもクローンの一部は追加的組込みを伴う（表５）。大半のクローンは一方または両方のＺＦＮ‐標的対立遺伝子に正しく標的されており、かつ、無作為に組込まれたＤＮＡを欠いているので、さらなる分析がされていない。重要なことには、テストされたすべてのＡＡＶＳ１−標的ｈＥＳＣｓは、多能性マーカーおよび奇形腫の形成アッセイについての免疫蛍光染色に基づき正常な核型および多能性状態を維持した。
【０１９１】
次に、ｈｉＰＳＣｓ中でＺＦＮアプローチが遺伝子を標的にすることに使えるかどうか確認することをした。この点について、ｈＥＳＣｓについて上述したものと同じ戦略を用いてパーキンソン病の患者から先に生成されたｈｉＰＳＣ株中のＡＡＶＳ１遺伝子座を標的として行った（Ｓｏｌｄｎｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｃｅｌｌ １３６：９６４−９７７）。表５に示した通り、スプライス受容体とＰＧＫプロモータ駆動ピューロマイシンカセットの両方を用いるＺＦＮ-介在標的化は、ｈＥＳＣｓの場合と同様の効率でヘテロ接合体およびホモ接合体の正しい標的クーロン（図１２）になった。
【０１９２】
実施例６ ＡＡＶＳ１遺伝子座へ組込まれた遺伝子の発現
ＡＡＶＳ１遺伝子座がヒトＥＳ細胞においての誘導性トランス遺伝子過剰発現系を発生することに使用できるかを調べる。最小ＣＭＶプロモータおよび赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）ｃＤＮＡ（ＴｅｔＯ‐ＲＦＰ）を駆動するテトラサイクリン応答エレメントで構成する追加的発現カセットを含有するために、先に使用したプロモータなしのＡＡＶＳ１ドナープラスミドを再設計する。このドナー分子に含有されるものは、３’末端でポリアデニル化シグナルに結合したＧＦＰ遺伝子をコードするヌクレオチド配列および５’末端で自己切断２Ａペプチドをコードする配列である（図１３を参照）。このようにして、ＧＦＰの発現は内因性プロモータによって駆動され、かつ、ドナー陽性クローンをスクリーニングすることに使用することができる。ドナーコンストラクトをｈＥＳ細胞の代行システムとして働くＫ５６２細胞に形質移入する。ＤＯＸに細胞を反応させるために、Ｍ２ｒｔＴＡ逆トランスアクチベーターを伴うレンチウイルスで正しく標的したＫ５６２ｓを形質導入する。ＲＦＰ発現はＤＯＸの追加およびＭ２ｒｔＴＡの存在に依存する。
【０１９３】
実施例７ ヒトＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓにおけるＰＩＴＸ３遺伝子座の標的
外因性選択カセットをｈＥＳＣｓおよびｈｉＰＳＣｓ中でＡＡＶＳ１遺伝子座を効果的に標的することに使用することができるという観察により、ｈＥＳＣｓおよびｈｉＰＳＣｓ中で発現しない遺伝子を修飾することにＺＦＮｓを使用することができるかどうかを検討することとした。この点を検討するために、ｈＥＳＣｓではなくドーパミン作動性ニューロンなどの分化細胞に発現する転写因子をコードする遺伝子であるＰＩＴＸ３の第１コードエキソンに対して２つのＺＦＮ対を生成した。ＰＩＴＸ３ ＺＦＮｓおよびその標的部位を下記の表６と表７に示す。
【０１９４】
【表１４】
【０１９５】
【表１５】
【０１９６】
ＰＩＴＸ３‐ｅＧＦＰノックイン細胞を生成するために、予測されたＺＦＮ標的部位に隣接する約８００ｂｐの５’と３’の相同配列を含有し、かつ、ＰＩＴＸ３の第１コードドエキソンに相同性を含有するドナープラスミドを構築する。ＰＩＴＸ３リポーターを生成するために、ＰＩＴＸ３オープンリーディングフレームをポリアデニルシグナルに続いてＲＦＰのリーディングフレームに結合させる。従って、ＲＦＰの発現はＰＩＴＸ３プロモータおよび、それらが活性の場合は随伴ｃｉｓ 調節因子により駆動する。３’相同アームの上流ではＰＧＫ‐ＧＦＰスクリーニングカセットをｌｏｘＰ部位に隣接するように位置を定める（図１５）。上述したように、このコンストラクトはｈＥＳまたはｈｉＰＳＣｓに形質移入する。
【０１９７】
ＰＧＫ‐ＧＦＰスクリーニングカセットに起因する転写干渉のリスクを無くすために、その後カセットをＣｒｅ‐リコンビナーゼの一過性の発現により除去する。ＰＧＫ−ＧＦＰスクリーニングカセットを除去するために、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を採取し、さらに１ｘ１０7細胞をＰＢＳ中で再懸濁する。次いで、製造業者（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ： ２５０ Ｖ， ５００μＦ， ０．４ ｃｍ ｃｕｖｅｔｔｅｓ）の指示書に従ってｐＴｕｒｂｏ‐Ｃｒｅ（４０μｇ； Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ３３４８２７）およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１（１０μｇ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、ＥＧＦＰ発現細胞に関して単細胞懸濁液をＦＡＣＳ選別（ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ； ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）することでＣｒｅ‐リコンビナーゼ発現細胞を６０時間濃縮する。エレクトロポレーション後の１０日から１４日の間で個々のコロニーを拾う。このアプローチを用いることで細胞型特異的リポーター系を生成するためにｈＥＳ細胞中で発現しない遺伝子を標的し、および／または修飾することができる。
【０１９８】
実施例８ 第ＩＸ因子遺伝子座のＺＦＮ標的
第ＩＸ因子遺伝子座を標的するように設計したＺＦＮｓを下記のように構築した。第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓおよびその標的部位を下記の表８に示す。
【０１９９】
【表１６】
【０２００】
上記したように、図１６のＫ５６２細胞に関して三角形の短い辺が１μｇ、長い辺が４μｇである拡大する三角形で示され、ヌクレオフェクションについて１、２または４μｇのＺＦＮ対を用いることでＺＦＮ発現プラスミドをＫ５６２またはＨｐｅ３Ｂ細胞のいずれかに導入した。図１７はＨｅｐ３Ｂ細胞の類似のデータを示す。ヌクレオフェクションの３日後に、先に記載したように細胞を採取しゲノムＤＮＡを単離した。
【０２０１】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（ＣＥＬ−Ｉ）ヌクレアーゼアッセイでの解析を実施し、第ＩＸ因子特異的ＺＦＮ対がＫ５６２およびＨｅｐ３Ｂ細胞の予想した標的部位にＤＳＢｓを効率的に導入したことを図１６と図１７が示している。ＮＨＥＪで測定された修飾対立遺伝子の割合を各レーンの下部に示した。この結果はＫ５６２およびＨｅｐ３Ｂ細胞の両方においてヒト第ＩＸ因子に特異的なＺＦＮｓを効率的に切断することができることを示した。
【０２０２】
第ＩＸ因子遺伝子座の配列を導入する能力をテストするために、Ｎｈｅｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する短い（３０ｂｐ）タグ配列を包含するドナープラスミドを構築した。３０ｂｐタグの配列は5’-gctagcgatatcgtcgaccatatgggatcc-3’（配列番号６２）であった。イントロン１内にある内因性遺伝子のＺＦＮ標的部位に隣接する相同性の１０００ｂｐ領域がタグ配列を両側で隣接した。第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓおよび上述したドナーＤＮＡを含有するドナープラスミドについての発現カセットを伴うプラスミドでＫ５６２細胞を形質移入した。また、対照実験をＺＦＮ発現プラスミドの不存在下においてドナーＤＮＡを使用して実施した。ゲノムＤＮＡを３日後と１０後に抽出し、さらにドナーアームに相同である領域外の領域にハイブリタイズするプライマーを用いて放射標識したｄＮＴＰｓの存在下で第ＩＸ因子遺伝子座をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＮｈｅｌで消化し、この産物を５％ＰＡＧＥにより分離した。つぎに、ゲルをオートラジオグラフした。
【０２０３】
図１８はＮｈｅｌに対する修復ＤＮＡの感受性を示し、ＺＦＮ誘導二本鎖切断により望まれる核酸から内因性ヒト第ＩＸ因子遺伝子座への効率的で相同性をベースにした標的組込みに繋げることができることを示している。
【０２０４】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０２０５】
本開示について、理解を明瞭にする目的で、図示および実施例を用いてある程度詳細に提示したが、当業者には、本開示の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、種々の変更および修正が為され得ることが容易に明らかになる。従って、前述の記載および実施例を限定であるとみなしてはならない。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本明細書は、米国仮特許出願第６１／２１２、２６５（出願日２００９年４月９日）および米国仮特許出願第６１／２６９、４３２（出願日２００９年６月２４日）を参照によりその全体を説明したものとしてここに含める。
【０００２】
（連邦支援による研究または開発に関する陳述）
該当なし。
【０００３】
本開示は、幹細胞のゲノム修飾の分野およびその用途に関係する。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞は、胚および哺乳類の成体の多くの組織に存在する未分化細胞である。成体および胚性幹細胞の両方は、種々の細胞型に分化でき、したがって、疾病、感染症、または先天性異常により損傷される細胞および組織の代替品としてのソースになり得る（例えば、Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４：８８−９１；Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４：９２−９７を参照）。多様な型の推定上の幹細胞が存在し、分化して成熟細胞になると、心臓、肝臓、または脳などの特定の組織の特有の機能を実行する。多能性幹細胞は、殆ど全ての細胞型に分化することができる潜在力を有すると考えられているが、組織幹細胞は、多くの細胞型に分化することができ潜在力があると思われている（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７５：１７３； ａｎｄ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ （１９９４） Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ． ６：５４３）。例えば、人為的な多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）は再プログラム因子の異所性発現による体細胞由来の多能性細胞である（例えば、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：１０１−１０６を参照）。これらの細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の全ての重要な特徴を備えていて、特異疾患のヒト患者から単離した細胞から産生することができる（例えば、Ｄｉｍｏｓ ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：１２１８−１２２１を参照）。
【０００５】
安定な遺伝子組換えおよび幹細胞への標的遺伝子挿入は、様々な応用がある。安定に形質移入した幹細胞は、タンパク質補充遺伝子治療のための細胞担体としておよび／または幹細胞を特定の系列に方向付けるために使用できる。例えば、Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４０（２）：２６３−２６４を参照されたい。さらに、系譜特異的レポーターコンストラクトの挿入によって系譜特異的細胞を単離でき、また創薬、標的バリデーション、および／またはこれらの結果に基づく遺伝子機能および同様な機能の幹細胞の視点による研究を可能にする。例えば、米国特許第５、６３９、６１８に、多能性胚性幹細胞を、ＤＮＡに作用可能なように結合した系譜特異的遺伝子の調節領域を持つコンストラクトで形質移入する事によって系譜特異的幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで単離することが記述されている。しかしながら、幹細胞形質移入の最近の戦略は、往々にして幹細胞に対象配列（レポーター）をランダムに挿入することである。例えば、Ｉｓｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｏｃｔ；１９（１０）：１０００−１００８； ＤｅＰａｌｍａ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｂｌｏｏｄ １０５（６）：２３０７−２３１５を参照されたい。ゲノム挿入の位置を制御できないと、ゲノム内の位置効果により幹細胞集団内で極めて様々なレベルでの発現が起こる。
【０００６】
そのうえ、導入遺伝子の安定的な遺伝子組換えおよび増幅の現法によって、導入遺伝子の物理的損失をすること、時間とともにまたは幹細胞分化が始まり次第導入遺伝子サイレンシングをすること、遺伝子の内部または隣接する導入遺伝子と自律プロモータを統合することによる挿入変異、ランダムに組み込まれた導入遺伝子に伴う異種性調節エレメントの原因による内在性遺伝子の異常な発現、再編成された遺伝子産物（内在性遺伝子、挿入された導入遺伝子、またはその両方からなる）の染色体異常および発現を生成すること、
および／または、安定的な導入遺伝子発現を提供するためのベクターの長期的持続性の必要性により永久に発現したベクター由来の遺伝子からのｉｎ ｖｉｖｏのベクターに関連した毒性または免疫原性の生成すること、を招く。その上に、系列マーカーである遺伝子などの正しい発現パターンが与えられた内在性遺伝子は、多数のｃｉｓ−エレメントの複合作用から出現する。例えばＬｅｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ （２００８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２２： ５７５−５８０を参照されたい。
【０００７】
ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用すると、相同性駆動型の修復（ＨＤＲ）経由で新規遺伝子配列を挿入するための相同的ドナー鋳型を使い極めて高効率で標的遺伝子挿入を操作できる。例えば、米国特許公報２００３０２３２４１０；２００５０２０８４８９；２００５００２６１５７；２００５００６４４７４；および２００６０１８８９８７、ならびに国際公開ＷＯ２００７／０１４２７５を参照されたい、これらの開示文献は、全ての目的について参照によりその全体を説明したものとしてここに含める。ジンクフィンガーヌクレアーゼ−駆動型遺伝子挿入により非組み込みベクターの一時的送達を使うことができ、長期に持続する送達ベクターを必要としない、よって挿入による変異と毒性またはベクター駆動遺伝子に由来する免疫原性の問題を回避する。
【０００８】
しかしながら、幹細胞集団への部位特異的組込みを制御する必要性が残る。
【発明の概要】
【０００９】
対象とする１つまたは複数の配列を幹細胞のゲノムを標的として組み込むための組成および方法をここに開示する。
【００１０】
幹細胞に挿入する配列は、タンパク質をコードする配列および／または系譜特異的レポーターコンストラクト、その他の対象とする内在性遺伝子のためのレポーター遺伝子の挿入、細胞運命決定に関わる内在性遺伝子のためのレポーター、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、およびプロモータと制御配列などの非タンパク−コード配列を含むことがある。レポーターコンストラクトは、対象とする遺伝子の恒常的な、誘導性のある、または組織特異的発現をもたらすことがある。系譜特異的レポーターで標識された幹細胞は、多様な分化の研究のために使うことができ、さらに選択した系譜特異的（または成熟）細胞型の分化細胞の精製のためにも使うことができる。系譜特異的レポーターで標識された幹細胞を、核酸、小分子、抗体またはサイトカインなどの生物製剤などの化合物を選別するのに使うことができ、および／または幹細胞の集団を操縦して対象とする特定の系列経路にそって系譜特異的細胞型に向かわせることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法で使うことができる。系譜特異的レポーターを含む幹細胞はまた、生体内での位置、究極的には最終的位置、分化の運命、および対象への導入に引き続く幹細胞の作用機序（例えば、組織への組込み）を追跡するトラッキングシステムとして使うことができる。幹細胞は、特定のレポータータンパク質をコードする配列（例えば、ＨＴＫ）が挿入された自殺カセットを含んでも良い。いくつかの実施形態では、自殺カセットは、より大きな細胞集団からの分化した亜集団の細胞の特定型を同定したり単離したりすることを促進するのに使われる。他の実施形態では、自殺カセットは、ｉｎ ｖｉｖｏで望ましくない状態（例えば、細胞が分化し奇形腫を形成した場合）に分化した幹細胞を破壊するのに使われる。同様に、１つまたは複数のポリペプチドを発現する幹細胞をタンパク質補充遺伝子治療のための細胞担体として使用できる。コンストラクトが宿主細胞にランダムに組み込こまれる伝統的な組込み方法とは対照的に本明細書に記述してあるように特定の部位にコンストラクトを組込みことによって、例えば系譜特異的レポーターコンストラクトの場合、同族の成熟細胞型に分化する場合にのみ発現を訂正し、またタンパク質発現コンストラクトの場合には、細胞集団間での均一な発現をさせる。
【００１１】
特異疾患の患者由来のｈｉＰＳＣｓをヒト疾患に対するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルを確立するために使用することもできる。遺伝子改変ｈＥＳＣｓおよびｈｉＰＳＣｓを使って、分化パラダイムを改善させたり、疾病関連遺伝子を過剰発現させたりでき、さらに機能喪失実験による疾病経路を研究することもできる。重要なことに、研究は、患者集団に見いだされるような適切な遺伝的または変異体バックグラウンドの状況で遂行できる。
【００１２】
従って、１つの態様では、幹細胞のゲノムの選択した領域に組み込まれた外来性配列（例えば、導入遺伝子）を含む幹細胞（または幹細胞の集団）を本明細書に提供する。特定の実施形態では、導入遺伝子は、系譜特異的プロモータおよび／または遺伝子産物（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉およびこれらの組み合わせを含む転写されたＲＮＡ産物などのタンパク質コード配列、非タンパクコード配列）を含み、幹細胞の選択した領域に組み込まれると、分化の開始または分化の経路中で、および／または幹細胞が分化して系譜特異的または成熟した細胞型に分化する時に、転写または翻訳される。遺伝子産物は、特定の細胞型への分化経路中に発現できる。さらに加えて、遺伝子産物は、幹細胞が分化しうるいくつかまたは全て細胞型で発現できる。特定の実施形態では、遺伝子産物は、系譜特異的または細胞運命遺伝子であり、例えば、その発現が、遺伝子が組み込まれた内在性遺伝子座に存在する調節制御領域（例えば、プロモータ）によって起動されように選択された遺伝子座に組み込まれるプロモータの無い遺伝子である。幹細胞は、哺乳類の幹細胞であっても良い。例えば、幹細胞は、造血幹細胞、間葉幹細胞、胚性幹細胞、神経細胞の幹細胞、筋幹細胞、肝臓幹細胞、皮膚幹細胞、胚性幹細胞、誘発多能性幹細胞およびこれらの組み合わせたものとされる。特定の実施形態では、幹細胞はヒト誘発多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。遺伝子産物は、誘発的に、または組織−特異的に恒常的に発現できる。
【００１３】
ある特定の実施形態では、遺伝子産物は、レポーターの発現が系譜特異的または細胞運命の遺伝子の調節エレメントによって操作されるように、系譜特異的または細胞運命
遺伝子に組み込まれた非プロモータレポーター遺伝子である。
【００１４】
この明細書に記述した幹細胞において、導入遺伝子は組換え部位に隣接するか、および／または自殺カセットであっても良い。
【００１５】
特定の実施形態では、本明細書に記述した幹細胞は、内在性遺伝子プロモータ配列に連結した２つのレポーターを含む。特定の実施形態では、１つのレポーターを、系列または運命に至る細胞を単離または除外するために使うことができる。例えば、所望しない細胞系列または運命に傾倒している細胞かどうかをレポートするレポーターを、細胞のプールからの、さもなければ所望の系列または運命へと分化するこれらの細胞を除外するために、使用しても良い。第２のレポーター（マーカー）は、所望の
系譜特異的または成熟細胞型で発現すると知られている内在性遺伝子に連結することができる。
【００１６】
二重にタグ付けされた幹細胞は、分化細胞集団由来の癌幹細胞の発生などの複雑なプロセスを研究する際に有用である。特定の実施形態では、二重にタグをつけされた分化細胞を、上記したように系譜特異的または細胞運命に連結するレポーター遺伝子を使って幹細胞集団から単離する。この幹細胞集団は、脱分化に関わる内在性遺伝子に連結する第２のレポーターを含み第２のレポーターは、どのような外部または内部条件が細胞を脱分化させ、潜在的に癌幹細胞に至るのかを決定するために使用される。
【００１７】
上記したように系列または細胞運命のレポーターを使用して単離した二重にタグ付けされた分化細胞集団を、細胞が潜在的に厄介な幹細胞のような状態に逆戻りするならば、脱分化が自殺遺伝子の発現を誘発し、これらの脱分化する細胞のみを死滅させるように
脱分化に関わる内在性遺伝子に連結する第２の自殺マーカーと一緒に使用する。この実施形態は、薬物療法としてのｉｎ ｖｉｖｏ幹細胞に関する安全性の懸念を強力に取り組む。
【００１８】
さらに加えて、野生型遺伝子のコピーを、変異内在性遺伝子を持つドナー由来の幹細胞に挿入することによって様々な治療が可能になる。例えば、血友病Ｂにおいて、コンピテント第ＩＸ因子タンパク質の欠乏を患っている患者など。第ＩＸ因子は、凝固系に関わるセリンプロテアーゼの１つをコードし、野生型第ＩＸ因子タンパク質の正常な循環レベルの３％を修復するだけで、自発性の出血を防ぐことができることが分かった。
【００１９】
従って、本開示は、配列（例えば、系譜特異的または細胞運命のレポーターコンストラクトまたはポリペプチドコードする配列）を幹細胞（例えばヒト、マウス、ウサギ、ブタまたはラットの細胞）に組み込む方法および組成を提供する。コンストラクトの標的組込みは、対象とする領域のゲノムを標的二重鎖切断することによって促進される。切断は、融合タンパク質の使用を通して特定の部位を標的とする。この融合タンパク質は対象とする領域、切断領域または切断半領域の選択したどのような配列にも結合するように設計できるジンクフィンガーＤＮＡ結合領域を含む。そのような切断によって、切断部位またはその近辺の外来性ポリヌクレオチド配列の標的組込みが刺激される。系譜特異的または細胞運命レポーターコンストラクトが幹細胞に組み込まれた実施形態において、レポーターコンストラクトは典型的に、レポーター配列をコードする非プロモータポリヌクレオチドに作用可能なように連結した分化する間に発現した遺伝子からのプロモータを必ずしも含む訳ではない。
【００２０】
１つの態様において、系譜特異的レポーターコンストラクトを幹細胞に標的組込みするための方法を本明細書に提供し、この方法は、以下を含む：（ａ）細胞内に第１の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第１の融合タンパク質は第１のジンクフィンガー結合領域と第１の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第１の標的部位と結合するように設計されている；（ｂ）細胞内に第２の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第２の融合タンパク質は第２のジンクフィンガー結合領域と第２の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第２の標的部位と結合し、第２の標的部位は第１の標的部位とは異なるように設計されている；および（ｃ）細胞を本明細書に記述したような系譜特異的または細胞運命レポーターコンストラクトに接触させること、ここで第１の融合タンパク質を第１の標的部位に結合させて、また第２の融合タンパク質を第２の標的部位に結合させて、細胞のゲノムが対象とする領域内で切断されるように切断半分領域を設置させ、それによって系譜特異的または細胞運命レポーターコンストラクトを対象とする領域内の細胞のゲノムに標的組込みされる。
【００２１】
別の態様では、コード配列を幹細胞に標的組込する方法を本明細書に提供し、この方法は以下を含む：（ａ）細胞内に第１の融合タンパク質を発現させること、ここで
この第１の融合タンパク質は第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合領域と第１の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第１の標的部位と結合するように設計されている；（ｂ）細胞内に第２の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第２の融合タンパク質は第２のジンクフィンガー結合領域と第２の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第２の標的部位と結合し、第２の標的部位は第１の標的部位とは異なるように設計されている；および（ｃ）細胞をコード配列に接触させること、ここで第１の融合タンパク質を第１の標的部位に結合させて、また第２の融合タンパク質を第２の標的部位に結合させて、細胞のゲノムが対象とする領域内で切断されるように切断半分領域を設置させ、それによってコード配列を対象とする領域内の細胞のゲノムに標的組込みこまれる。特定の実施形態では、コード配列は、治療上のタンパク質、レポーター遺伝子または陽性または陰性スクリーニングマーカー遺伝子をコードする配列含む。
【００２２】
別の態様では、２個以上の遺伝子産物を幹細胞（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉およびこれらの組み合わせを含む転写されたＲＮＡ産物などのタンパク質コード配列、非タンパクコード配列）に標的組込みさせる方法を提供する。この方法は以下を含む：（ａ）細胞内に第１の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第１の融合タンパク質は第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合領域と第１の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第１の標的部位と結合するように設計されている；（ｂ）細胞内に第２の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第２の融合タンパク質は第２のジンクフィンガー結合領域と第２の切断半領域を含み、このジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第２の標的部位と結合し、第２の標的部位は第１の標的部位とは異なるように設計されている；および（ｃ）細胞内に第３の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第３の融合タンパク質は第３のジンクフィンガー結合領域と第３の切断半領域を含み、この第３のジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第３の標的部位と結合し、第３の標的部位は第１と第２の標的部位とは異なるように設計されている；（ｄ）細胞内に第４の融合タンパク質を発現させること、ここでこの第４の融合タンパク質は第４のジンクフィンガー結合領域と第４の切断半領域を含み、この第４のジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、細胞のゲノム内の対象とする領域の第４の標的部位と結合し、第４の標的部位は第１、第２、第３の標的部位とは異なるように設計されている；
ならびに（ｅ）細胞を２つのコード配列または系譜特異的または細胞運命レポーター配列、またはこれらの任意の組み合わせに接触させること、ここで第１の融合タンパク質を第１の標的部位に結合させて、また第２の融合タンパク質を第２の標的部位に結合させて、
細胞のゲノムが対象とする領域内で切断されるように切断半分領域を設置させ、それによってコード配列または系譜特異的または細胞運命レポーター配列を対象とする領域内の細胞のゲノムに標的組込みこまれる、さらに、第３の融合タンパク質を第３の標的部位に結合させて、また第４の融合タンパク質を第４の標的部位に結合させて、細胞のゲノムが対象とする第２の領域内で切断されるように切断半分領域を設置させ、それによって２つのコード配列または系譜特異的または細胞運命レポーター配列を対象とする領域内の細胞のゲノムに標的組込みこまれる。特定の実施形態では、コード配列は、治療上のタンパク質、レポーター遺伝子または陽性または陰性スクリーニングマーカー遺伝子をコードする配列含む。
【００２３】
別の態様では、選択した細胞型（分化経路の細胞、系譜特異的細胞または成熟細胞）の細胞を単離する方法を本明細書に記載する。この方法は、本明細書に記述したように幹細胞集団を培養し（例えば、標的組込みを通して挿入され、選択された系譜特異的または成熟細胞型に発現する系譜特異的または細胞運命プロモータおよび／または系譜特異的または細胞運命遺伝子を含む）そして遺伝子産物を発現する細胞を単離し、それによって選択された系譜特異的または成熟細胞型の細胞を単離する。
【００２４】
さらに別の態様では、幹細胞分化における化合物、核酸または生物学的生成物の効果を測定する方法を本明細書に記述する。この方法は、化合物、核酸または生物学的産物の存在下での前記したような系譜特異的または細胞運命レポーター配列を含む幹細胞の第１の集団を培養すること、化合物、核酸または生物学的産物の非存在下での幹細胞の第１の集団としての系譜特異的または細胞運命レポーター配列を含む同じ幹細胞の第２の集団を培養すること、を含む。化合物、核酸または生物学的産物の存在下での遺伝子産物の発現の差異は、幹細胞の分化における化合物、核酸または生物学的産物の効果を示す。
【００２５】
別の態様では、幹細胞内に遺伝子産物を産生する方法を本明細書に記述する。この方法は、本明細書に記述したように遺伝子産物に転写または翻訳される配列を含む幹細胞の集団を提供することであり、ここで、この配列は、幹細胞の非必須部位に組み込まれ、幹細胞の集団を培養し、そこで、培養された幹細胞の集団は遺伝子産物を一様に発現する。
【００２６】
別の態様では、処置を必要とする被験者の機能的遺伝子産物の発現を減少させることによって特徴づけられる疾病を処置する方法を本明細書に提供し、この方法は、本明細書に記述してあるように機能的遺伝子産物発現する幹細胞の集団に投与することを含む。特定の実施形態では、機能遺伝子産物は第ＩＸ因子であり、かつ、疾病は血友病である。
【００２７】
本明細書に記述した方法および組成のいずれにおいても、挿入された配列（例えば、系譜特異的または細胞運命レポーターコンストラクト、コード配列など）および／またはジンクフィンガーヌクレアーゼはベクター、例えば、プラスミド、直鎖ＤＮＡ、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターのどれにも供給提供できる。特定の実施形態では、挿入される配列およびジンクフィンガーヌクレアーゼ−コード化配列は同じベクター上に供給される。特定の実施形態では、組み込まれる配列（例えばレポーターコンストラクト）が、組込み欠乏性レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）上に供給され、第１と第２のジンクフィンガータンパク質を含む融合タンパク質の１つまたは両方が、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）上に供給される。特定の実施形態では、配列をコードするジンクフィンガーヌクレアーゼがｍＲＮＡとして供給される。本明細書に記述した方法および組成のいずれにおいても、挿入された配列は、幹細胞の欠損および／または患者の欠陥を訂正する配列であっても良い。いくつかの実施形態では、挿入された配列は、野生型第ＩＸ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列であってもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述した方法および組成は、２人の異なるドナーを持つ細胞の対立遺伝子を修飾するのに使って良い。例えば、１つの対立遺伝子上の調整可能な遺伝子発現コンストラクト（例えば、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）への応答を組み入れられた発現コンストラクト）を有するセーフハーバ遺伝子、例えば、ＡＡＶＳ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとも知られている）の修飾は、相同的対立遺伝子上の制御されたプロモータのトランス活性化因子（例えばＭ２ｒｔＴＡ）でもって同時に修飾されたＡＡＶＳ１遺伝子を有する細胞内で対を成すことができる。これによって、挿入された導入遺伝子の発現の位置的変動効果を取り除けるであろう。
【００２９】
本明細書に記述する実施形態のいずれにおいても、コンストラクトのレポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼおよび／またはβガラクトシダーゼを含む。さらに、レポーター遺伝子の発現を駆動する調節領域（例えば、プロモータ）は、幹細胞の分化中に発現される任意の遺伝子から単離できる。そのようなレポーターシステムの使用によって、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ再プログラムのプロセスへの機構的洞察が得られる。ある特定の実施形態では、調節領域は、アディオポーズ（ａｄｉｏｐｏｓｅ）特異的マーカー遺伝子（例えばａｐ２．）由来である。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子発現コンストラクトは、ＣｒｅおよびＦＬＰなどの特異的リコンビナーゼの一過性発現を通してその引き続く除去を可能にするｌｏｘまたはＦＲＴなどの配列に隣接することがある。これらのリコンビナーゼ除去システムを、要望があればその他のドナー配列を除去するのに使われることがある。同様に、任意のコード配列は、幹細胞のゲノムの特定の領域を標的とすることができる。特定の実施形態では、コード配列は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＩＸ、ＶＥＧＦ、免疫グロブリン、可溶性細胞表面レセプター、可溶性細胞接着分子、Ｐ−セレクチンなどの血漿可溶性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、可溶性タンパク質は治療上の価値がある。
【００３０】
本明細書に記述されるような方法および組成は、どのような成体または胎性（胚性）幹細胞にもその用途が見いだされる。この胎性幹細胞は、限定されるわけではないが、造血幹細胞、間葉幹細胞、神経、筋、肝臓または皮膚幹細胞、胚性幹細胞、誘発多能性幹細胞などを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞は、哺乳類の幹細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタまたはヒトの幹細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】その中でａＰ２プロモータ／エンハンサー配列がＧＦＰの発現を駆動するレポーターカセットに隣接するＣＣＲ５に対して相同性アームを有する欠損組込みレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を表す模式図である。
【図２】パネルＡおよびＢは、非複製的組換え型Ａｄ５／Ｆ３５ベクター（以後Ａｄ．ＺＦＮと呼ぶ）によって運ばれるＣＣＲ５−特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼの存在下で図１に示されるヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）細胞に標的組込みされる脂肪細胞特異的ＩＤＬＶを示す図である。最上部のパネルの各レーンの底面は、レポーターコンストラクトが組み込まれた細胞の割合を示す。図２Ｂは、ＤＮＡ入力レベルへ規準化するためのＧＡＰＤＨ遺伝子座の制御増幅を示す。
【図３】パネルＡからＦは、ＩＤＬＶｓによって運ばれたＣＣＲ５遺伝子座へＺＦＮ−介在組込みのａＰ２−ＧＦＰカセットを含む分化したｈＭＳＣｓ内のＧＦＰ発現を示す図である。ｈＭＳＣｓは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化して骨原性（図３Ａおよび３Ｂ）または脂肪生成の系列（図３Ｃから３Ｆ）となる脂肪生成の系列のみが発現する。
【図４】パネルＡからＨは、標準組み込みレンチウイルスベクターを使用してこれらの細胞に導入されたランダムに組み込まれたａＰ２−ＧＦＰレポーターコンストラクトを有する分化したｈＭＳＣｓ内のＧＦＰ発現を示す図である。分化できなかったｈＭＳＣｓ（図４Ａおよび４Ｂ）または骨原性（図４Ｃおよび４Ｄ）または脂肪生成の系列（図４Ｅから４Ｈ）にｉｎ ｖｉｔｒｏ分化したそれらを図示する。強いＧＦＰ発現が、脂肪生成の系列で観察されるが、弱いＧＦＰ発現は、非分化の間葉系幹細胞と骨原性系列内の両方で見られる。
【図５】パネルＡからＣは、描写するレンチウイルスのドナーコンストラクトおよびこれらのコンストラクトの標的挿入を模式的に示す図である。図５Ａは、ＰＧＫ−ｅＧＦＰ（左側）と命名されたコンストラクトを発現するｅＧＦＰおよびＰＧＫ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰ（右側）と命名されたコンストラクトを発現するｍＥｐｏとｅＧＦＰを図示する。図５Ｂは、内在性ＣＣＲ遺伝子座内のＺＦＮ標的部位の位置を模式的に示す。図５Ｃは、ＰＧＫ−ｅＧＦＰまたはＰＧＫ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰの発現カセットの相同組換え媒介標的遺伝子組込み発現の後の期待される結果を模式的に示す。
【図６】パネルＡからＢは、ＦＡＣＳによって測定されたＡｄ．ＺＦＮ伝達の指示したＭＯＩにおける指示したドナーベクターによる形質導入に続くＧＦＰを発現する細胞の割合を図示するグラフである。黒色バーは、ＣＣＲ５−標的ＺＦＮｓ存在下でＩＤＬＶ−ｅＧＦＰコンストラクトで形質導入した細胞内のＧＦＰ発現を図示し、灰色バーは、ＣＣＲ５−標的ＺＦＮｓ存在下でＩＤＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰコンストラクトで形質導入した細胞内のＧＦＰ発現を図示する。図６Ａは、ジャーカット細胞（左側）およびＫ５６２細胞（右側）内でのＧＦＰ発現を示す。図６Ｂは、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）内でのＧＦＰ発現を示す。
【図７Ａ】パネルＡとＢは、ジャーカット細胞（図７Ａ、左側）、Ｋ５６２細胞（図７Ａ、右側）およびｈＭＳＣｓ（図７Ｂ）内におけるＣＣＲ５−ＺＦＮｓをコードするＡｄ５／Ｆ３５ベクターの非存在下（レーン標識Ａｄ．ＣＣＲ５−ＺＦＮ−）および存在下（レーン標識Ａｄ．ＣＣＲ５−ＺＦＮ＋）での、指示したドナーコンストラクトの標的組込のためのＰＣＲ法解析を示す。ＧＡＰＤＨＰＣＲ法は、ＤＮＡ入力レベルをコントローための各パネルの底面で示される。
【図７Ｂ】パネルＡとＢは、ジャーカット細胞（図７Ａ、左側）、Ｋ５６２細胞（図７Ａ、右側）およびｈＭＳＣｓ（図７Ｂ）内におけるＣＣＲ５−ＺＦＮｓをコードするＡｄ５／Ｆ３５ベクターの非存在下（レーン標識Ａｄ．ＣＣＲ５−ＺＦＮ−）および存在下（レーン標識Ａｄ．ＣＣＲ５−ＺＦＮ＋）での、指示したドナーコンストラクトの標的組込のためのＰＣＲ法解析を示す。ＧＡＰＤＨＰＣＲ法は、ＤＮＡ入力レベルをコントローための各パネルの底面で示される。
【図８】ＣＣＲ５−ＺＦＮｓをコードするＡｄ５／Ｆ３５ベクターの存在下の指示されたドナーコンストラクトでもって形質導入されたｈＭＳＣｓの条件培地内で、ＥＬＩＳＡによって測定された、Ｅｐｏタンパク質発現を示す。
【図９Ａ】パネルＡおよびＢは、Ｅｐｏドナー組込みコンストラクトとｈＭＳＣｓを一緒に腹腔内（ＩＰ）注射を受けたマウスのヘマトクリット（図９Ａ）と血漿内で測定されたＥｐｏタンパク質レベル（図９Ｂ）についてＥｐｏタンパク質発現の効果を示す。黒色ダイアモンドは、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＩＤＬＶ−ｅＧＦＰドナーコンストラクトでもって形質導入された１０7ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質レベルを図示する。黒色四角は、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＩＤＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰドナーコンストラクトでもって形質導入された１０7ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質レベルを図示する。黒色ダイアモンドは、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰ組込みドナーコンストラクトでもって形質導入された１０6ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質を図示する。
【図９Ｂ】パネルＡおよびＢは、Ｅｐｏドナー組込みコンストラクトとｈＭＳＣｓを一緒に腹腔内（ＩＰ）注射を受けたマウスの血漿内で測定されたヘマトクリット（図９Ａ）とＥｐｏタンパク質レベル（図９Ｂ）についてＥｐｏタンパク質発現の効果を示す。黒色ダイアモンドは、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＩＤＬＶ−ｅＧＦＰドナーコンストラクトでもって形質導入された１０7ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質レベルを図示する。黒色四角は、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＩＤＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰドナーコンストラクトでもって形質導入された１０7ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質レベルを図示する。黒色ダイアモンドは、Ａｄ／ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトとＬＶ−ｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰ組込みドナーコンストラクトでもって形質導入された１０6ｈＭＣＳｓの投与に引き続くｉｎ ｖｉｖｏでのＥｐｏタンパク質を図示する。
【図１０Ａ】パネルＡからＣは、ＯＣＴ４遺伝子座の標的を示す。図１０Ａは、ＯＣＴ４遺伝子座のための標的戦略の模式的概要を示す図である。サザンブロット解析に使われるプローブは赤色四角で示され、ＯＣＴ４遺伝子座のエクソンは青色四角で示され、さらに矢印はＺＦＮ対のそれぞれによって切られたゲノムの部位を指し示す。ＯＣＴ４遺伝子座を標的にするのに使われたドナープラスミドを、上に示す；ＳＡ−ＧＦＰ：スプライス受容体ｅＧＦＰ配列、２Ａ：自己−切断する２Ａペプチド配列、ＰＵＲＯ：ピューロマイシン抵抗性遺伝子、ｐｏｌｙＡ：ポリアデニル化配列．上部の左の挿入図は、ＦｏｋＩヌクレアーゼ領域の二量体形成に導かれる特異的ゲノムの部位（黄色）での２つのＺＦＮｓ結合の風刺画を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、対応するドナープラスミドを使用し指示したＺＦＮ対でもって標的にされた、ＢＧＯ１細胞のサザンブロット解析を示す。ゲノムＤＮＡは、ＥｃｏＲＩで消化して外側の３’プローブとハイブリッド形成するか、またはＳａｃＩで消化して外側の５’プローブとハイブリッド形成した。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、対応するドナープラスミドを使用し指示したＺＦＮ対でもって標的にされたＢＧＯ１野生型細胞およびＢＧＯ１細胞内のＯＣＴ４とｅＧＦＰの発現のウエスタンブロット解析を図示する。細胞抽出液は、未分化細胞（ＥＳ）またはｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した線維芽細胞様の細胞（Ｆｉｂ．）から取り出された。
【図１１】パネルＡおよびＢは、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子に対する標的戦略を示す図である。図１１Ａは、ＡＡＶＳ１遺伝子座のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子に対する標的戦略の模式的概要を図示する。サザンブロット解析に使われたプローブを赤色四角で表し、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子の最初の３エクソンを青色四角で表し、矢印はＺＦＮでカットされたゲノム部位を指し示す。遺伝子座を標的にするのに使われたドナープラスミドを上に示す；ＳＡ−Ｐｕｒｏ：スプライス受容体配列、次に２Ａ：自己切断ペプチド配列とピューロマイシン抵抗性遺伝子、ｐＡ：ポリアデニル化配列、ＰＧＫ：ヒトホスホグリセロールキナーゼプロモータ、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン抵抗性遺伝子。図１１Ｂは、ＡＡＶＳ１ ＺＦＮｓを使用し指示されたドナープラスミドでもって標的されたＢＧＯ１細胞のサザンブロット解析を示す。ゲノムＤＮＡは、ＳｐｈＩで消化して32Ｐ−標識された外側の３’プローブまたは内側の５’プローブとハイブリッド形成する。フラグメントの大きさは：ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ：５’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝４．２ｋｂ；３’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．７ｋｂ．ＳＡ−Ｐｕｒｏ：５’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．８ｋｂ；３’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．７ｋｂ。
【図１２】ｈｉＰＳＣｓ内のＡＡＶＳ１遺伝子座のＺＦＮ媒介遺伝子標的を示す図である。対応するドナープラスミドを使用し、指示したＺＦＮ対でもって標的されたｈｉＰＳＣ細胞株ＰＤ２１ｌｏｘ１７Ｐｕｒｏ−５のサザンブロット解析。ゲノムＤＮＡは、ＳｐｈＩで消化され、32Ｐ−標識された外側の３’プローブまたは内側の５’プローブとハイブリッド形成した。フラグメントの大きさは：ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ：５’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝４．２ｋｂ；３’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．７ｋｂ．ＳＡ−Ｐｕｒｏ：５’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．８ｋｂ；３’プローブ：ｗｔ＝６．５ｋｂ、標的＝３．７ｋｂ。
【図１３】ＤＯＸ誘導性ＴｅｔＯ ＲＦＰ含むドナーコンストラクトを有するＡＡＶＳ１遺伝子座のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のための標的戦略のためのドナーヌクレオチドを模式的に示す図である。２Ａ−ＧＦＰは、ＧＦＰと融合した自己切断する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド間のヌクレオチド融合配列である。ＴｅｔＯは、テトラサイクリンリプレッサー標的（「オペレーター」）配列であり、それは、最小のＣＭＶプロモータと連結している。ＲＦＰは、赤色蛍光性タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【図１４】ＰＩＴＸ３−特異的ＺＦＮｓの２つの対でもって形質移入するのに引き続きＫ５６２細胞内のＰＩＴＸ３遺伝子座に生じるＮＨＥＪの量をアッセイすることへのＰＣＲ解析の結果を示す図である。このデータは、（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５（７）： ７７８−８５）に記述してあるようにＣＥＬ−Ｉミスマッチ−感受性エンドヌクレアーゼアッセイを使って生成した。ＮＨＥＪ％は、各レーンの底面に指し示す。’Ｇ’は、ＧＦＰ発現プラスミドで形質移入した対照細胞を指し示す。
【図１５】ＰＩＴＸ３−ｅＧＦＰノックイン細胞を産生するためのドナーヌクレオチド標的戦略の模式図である。５’アームと３’アームは、内在性ＰＩＴＸ３遺伝子座に相同であり、２ＡＲＦＰ−ｐＡは、ｐｏｌｙＡ配列に連結している赤色蛍光性タンパク質（ＲＦＰ）をコードする遺伝子と連結する自己切断２Ａペプチドを備えたオープンリーディングフレームを指し示す。ＰＧＫ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡは、オープンリーディングフレームを指し示し、ここでＰＧＫプロモータは、ＰＧＫｐｏｌｙＡ配列と連結している緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）と連結する。ｌｏｘは、ＧＦＰリーディングフレームに隣接するｌｏｘＰ部位を指し示す。
【図１６】ＣＥＬ−Ｉミスマッチアッセイの結果を表すアガロースゲルの図である。このゲルは、第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓによる形質移入に引き続くＫ５６２細胞に発生したＮＨＥＪの％を示す。ＮＨＥＪ％は、各レーンの底面に指し示すＺＦＮｓの対を、レーンの上に指し示す。また各セットは、形質移入ＺＦＮ−コード化プラスミドの１、２、または４ｕｇからの結果を示す。’Ｇ’は、ＧＦＰに特異的なＺＦＮｓによる形質移入に引き続く結果を指し示す。
【図１７】ＣＥＬ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示すアガロースゲルの図である。このゲルは、第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓによる形質移入に引き続くＨｅｐ３Ｂ細胞に発生したＮＨＥＪの％を示す。ＮＨＥＪ％は、各レーンの底面に指し示す。各レーンで使われたＺＦＮｓの対を、使用した形質移入するプラスミドと共にレーンの上に指し示す。「ＧＦＰ」は、ＧＦＰ−特異的ＺＦＮｓの制御形質移入からの結果を指し示す。
【図１８】パネルＡとＢは、制限酵素部位を含む３０ｂｐタグを内在性第ＩＸ因子遺伝子座に標的組込みすることを示す図である。この図は、組み込まれたタグを含む領域のＰＣＲ産物をＮｈｅＩで消化した産物を分解したポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。図１８Ａにおいて、形質移入後３日で細胞からＤＮＡを単離した。レーン１では、ＮｈｅＩで消化された第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓの非存在下ドナーＤＮＡのみで形質移入されたＫ５６２細胞から単離したＰＣＲ産物を含む。レーン２から５では、野生型Ｆｏｋ１二量体形成領域を含む第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓを、ドナープラスミド量を増加しながら使用した。レーン６から９では、ＥＬＤ／ＫＫＫ Ｆｏｋ１二量体形成領域を含む第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓを、ドナープラスミド量を増加しながら使用した。ＮｈｅＩ感受性ＤＮＡのＮｈｅＩのパーセントは、各レーンの下に指し示す。図１８Ｂは、形質移入後１０日目の同様の結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
対象とする配列（例えば、系譜特異的レポーターコンストラクトおよび／またはコード配列）を幹細胞標的組込みするための組成および方法を、本明細書に記述する。
【００３３】
概要
本明細書に開示した方法、同様に組成の準備および使用の実施は、その他の指示がなければ、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連する分野の通常の技術を、当業者の技術の範囲内として採用する。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ； Ｗｏｌｆｆｅ， ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９８； ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ３０４， “Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ” （Ｐ．Ｍ． Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ， ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９９； ａｎｄ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． １１９， “Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” （Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ， ｅｄ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３４】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用し、直線状または環状の高次構造、かつ単一または二重鎖の型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味する。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さについて制限があると解釈されるべきではない。これらの用語は、自然のヌクレオチドの既知の類似体、同様に塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエートバックボーン）が修飾されたヌクレオチドを含む。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、塩基対形成特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を成す。
【００３５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーとして互換的に使われる。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する自然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３６】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的、非共有結合性の相互作用を意味する。結合相互作用の全ての成分は、相互作用全体が配列特異的である限り、必ずしも配列特異的（例えば、ＤＮＡバックボーン内のリン酸残基との接触）である必要はない。そのような相互作用は、１０-6Ｍ-1またはより低い解離定数（Ｋｄ）によって一般に特徴づけられる。「親和性」とは、結合力を意味する：結合親和性の増加は、より低いＫｄに相関する。
【００３７】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）と結合する。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体（ホモ二量体、ホモ三量体、を形成することなど）に結合でき、および／または異なるタンパク質またはタンパク質の１つまたは複数の分子と結合することができる。結合タンパク質は、結合活性の１以上の型を持つことができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合性、ＲＮＡ結合性およびタンパク質結合活性を持つ。
【００３８】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合領域）は、１つまたは複数のジンクフィンガーを通して配列特異的様式でＤＮＡに結合するより大きなタンパク質内のタンパク質または領域である。これらは、その構造がＺｎイオンの配位を通して安定化している結合領域内のアミノ酸配列の領域である。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００３９】
ジンクフィンガー結合領域、例えばジンクフィンガーの認識らせん体は、予め決められたヌクレオチド配列と結合するように「設計」できる。ジンクフィンガータンパク質を設計するための方法の限定されない例は、デザインおよび選択である。デザインされたジンクフィンガータンパク質は、そのデザイン／組成が合理的判断基準から主に生じたものである自然界に起こりえないタンパク質である。デザインをする際の合理的判断基準は、現存するＺＦＰデザインおよび結合データの情報を貯蔵するデータベース内の情報を処理する置換規則とコンピュータ処理アルゴリズムの応用を含む。例えば、米国特許６，１４０，０８１号；６，４５３，２４２号；および６，５３４，２６１号を参照；さらに国際公開ＷＯ９８／５３０５８号；ＷＯ９８／５３０５９号；ＷＯ９８／５３０６０号；ＷＯ０２／０１６５３６号およびＷＯ０３／０１６４９６号を参照されたい。
【００４０】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、自然界に存在しないタンパク質であり、その産生物は主に実験的プロセス（ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択）から生み出されたものである。例えば、米国特許５，７８９，５３８号；米国特許５，９２５，５２３号；米国特許６，００７，９８８号；米国特許６，０１３，４５３号；米国特許６，２００，７５９号；国際公開ＷＯ９５／１９４３１号； ＷＯ９６／０６１６６号； ＷＯ９８／５３０５７号； ＷＯ９８／５４３１１号； ＷＯ００／２７８７８号； ＷＯ０１／６０９７０号；ＷＯ０１／８８１９７号およびＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００４１】
用語「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味し、ＤＮＡまたはＲＮＡでもあり；直線状、環状または分枝であっても良く、さらに一本鎖または二重鎖であっても良い。用語「ドナー配列」とは、ゲノムに挿入されたヌクレオチド配列である。ドナー配列は、任意の長さであって良く、例えば、長さが２から１０，０００ヌクレオチド（またはこれらの整数の間の任意の整数またはちょうどその値）であり、好ましくは長さが約１００から１，０００ヌクレオチド（またはこれらの整数間の任意の整数）でありより好ましくは長さが約２００から５００のヌクレオチドである。
【００４２】
「相同的、非同一配列」は第２の配列と配列相同性度を共有する第１の配列を意味する。しかしその配列は、第２の配列と同一のものではない。例えば、変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、相同的であり、また変異体遺伝子の配列とは同一でない。特定の実施形態では、２つの配列の相同性度は十分であり、２つの配列の間の相同組換え、正常な細胞の機序の利用を可能にする。２つの相同的で同一でない配列は、任意の長さであって良く、非相同性度は、単一のヌクレオチド（例えば、標的相同組換えによるゲノムの点変異の訂正）の小ささあっても良い、または１０キロベース（例えば、染色体内の予め決められた異所性部位の遺伝子の挿入について）あるいはそれ以上であっても良い。相同的非同一配列からなる２つのポリヌクレオチドは同じ長さである必要は無い。例えば、２０から１０，０００のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外来性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使って良い。
【００４３】
核酸とアミノ酸配列同一性を決定する技術は当業者に知られている。典型的に、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされたアミノ酸配列を決定すること、これらの配列と第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較することを含む。ゲノム配列も、この方法でまた決定でき、比較できる。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、それぞれ正確にヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をすることを意味する。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それぞれのアイデンティティ％を決定することによって比較することができる。２つの配列のアイデンティティ％は、核酸であろうとまたはアミノ酸配列であろうと、２つの整列させた配列の間の正確な一致の数を短い方の配列の長さで割って、それに１００を掛けたものである。配列間のアイデンティティ％または類似度を計算する適切なプログラムは、一般に当業者に知られており、例えば、別の整列化プログラムとしてデフォルトパラメータを使用するブラストがある。本明細書に記述する配列に関して、望ましい配列相同性度数の範囲は、約８０％から１００％およびこれらの値の間の整数値である。典型的に、配列間のアイデンティティ％は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、更に好ましくは９２％、もっと好ましくは９５％、さらに、最も好ましくは９８％配列相同性である。
【００４４】
代わりに、ポリヌクレオチド間の配列類似性度を、相同領域間で安定な二本鎖を形成ができ、次に一本鎖特異的ヌクレアーゼでもって消化させ、そして、消化した断片を測定するという条件のもとポリヌクレオチドのハイブリッド形成法によって測定することができる。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使って測定されるように分子の限定された長さに渡って、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、更に好ましくは９２％、もっと好ましくは９５％、さらに、最も好ましくは９８％配列相同性を示す時、実質的に互いに相同的である。本明細書に使われたように、実質的に相同的とは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列のことを意味する。実質的に相同的なＤＮＡ配列は、例えば、特定のシステムに対して定義したような厳密な条件の下で、サザンブロット法実験で同定できる。適切なハイブリッド形成条件を限定することは、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， （１９８５） Ｏｘｆｏｒｄ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【００４５】
２つの核酸断片の選択的ハイブリッド形成は、以下の通りに測定できる。２つの核酸分子間の配列相同性度は、そのような分子間のハイブリッド形成イベントの効率および強度に影響する。部分的に同一の塩基配列は、標的分子と完全に同一の配列のハイブリッド形成を少なくとも部分的に抑制する完全に同一の配列のハイブリッド形成の抑制は、当業者に良く知られたハイブリッド形成アッセイを使って評価できる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリッド形成法、または同様な方法、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照）。そのようなアッセイは、様々な選択度を使って（例えば、低から高厳密性に変わる条件を使って）実施できる。低厳密性の条件を採用するならば、非特異的結合の非存在は、配列相同性の部分的一致度さえない二次的なプローブ（例えば、標的分子と配列相同性が３０％未満のプローブ）を使って評価できる。即ち、非特異的結合イベントの非存在下で、二次的なプローブは、標的とハイブリッド形成しない。
【００４６】
ハイブリッド形成法ベースの検出システムを利用する時、参照塩基配列に相補的な核酸プローブが選択され、そして適切な条件を選択することによって、プローブと参照配列が選択的にハイブリッド形成し、互いに結合して二本鎖分子を形成する。中程度に厳密なハイブリッド形成条件の下で選択的に参照配列とハイブリッド形成できる核酸分子は、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列相同性を持つ少なくとも長さ約１０〜１４のヌクレオチドの標的塩基配列を検出できる条件の下で典型的にハイブリッド形成する。厳密なハイブリッド形成条件によって、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％以上の配列相同性を持つ少なくとも長さ約１０〜１４のヌクレオチドの標的塩基配列を典型的に検出できる。プローブ／参照配列がハイブリッド形成するための有用なハイブリッド形成法条件は、プローブと参照配列はある特定の配列相同性度を有し、当業者に知られた方法で測定できる。（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， （１９８５） Ｏｘｆｏｒｄ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）
【００４７】
ハイブリッド形成の条件は当業者には良く知られている。ハイブリッド形成厳密性とは、ハイブリッド形成条件が不一致のヌクレオチドを含むハイブリッド形成を嫌う度合いを意味し、より高い厳密性は、不一致ハイブリッドに対するより低い許容性に相関する。ハイブリッド形成の厳密性に影響する因子は、当業者に知られており、限定される訳ではないが、温度、ｐＨ、イオン強度、および例えば、ホルムアミドやジメチルスルホキシドなどの有機溶剤の濃度を含む。当業者に知られているように、ハイブリッド形成厳密性は、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度によって増加する。
【００４８】
ハイブリッド形成のための厳密な条件に関して、多数の等価の条件を採用できて、特定の厳密性を確立することが当業者に知られている。例えば、次の因子を変化させて特定の厳密性を確立する：配列の長さと性質、様々な配列の塩基組成、塩とハイブリッド形成溶液の濃度、ハイブリッド形成溶液中の遮断薬の存在または非存在（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）、ハイブリッド形成反応温度とタイムパラメータ、同様に、異なる洗浄条件。ハイブリッド形成条件の特定のセットを選択は、当業者の標準方法に従って行う。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照）．
【００４９】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを意味する。本開示の目的、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、細胞内の二重鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特定の型を意味する。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を使って「標的」分子を鋳型修復する（即ち、二重鎖切断を経験したもの）、また「非クロスオーバー遺伝子変換」または「短路遺伝子変換」としてさまざまに知られている、なぜならこのプロセスによってドナーから標的へ遺伝情報が伝達されるからである。特定の理論に拘束されずに、そのような伝達は壊れた標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡの不一致の訂正、および／またはドナーを使って標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスに関わることがある。そのような特定化したＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの一部または全てが標的ポリヌクレオチドに取り込まれるようにしばしば標的分子配列の変異を生み出す。
【００５０】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合性バックボーンの損傷を意味する。切断は、これに限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素のまたは化学的加水分解を含む様々な方法によって開始する。一本鎖の切断と二重鎖の切断両方が起こりうる、また二重鎖の切断は、２本の別々の一本鎖の切断イベントの結果として発生することがある。ＤＮＡ切断により、平滑断の端またはねじれ型の端の産生物を生み出すことがある。特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、二本鎖ＤＮＡ切断を標的するために使われる。
【００５１】
「切断半領域」は、第２のポリペプチドと連結して（同一のまたは異なる）、切断活性（好ましくは、二重鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１と第２の切断半領域」および「右と左の切断半領域」は、互換的に使われて二量体化する切断半領域の対を意味する。
【００５２】
「改変された切断半領域」とは、別の切断半領域と一緒に絶対ヘテロ二量体を形成するように（例えば、別の改変された切断半領域）修飾された切断半領域である。さらに、米国特許公報２００５／００６４４７４号；２００７／０２１８５２８号および２００８／０１３１９６２号をも参照されたい、参照によりその全体を本明細書に含める。
【００５３】
「条件突然変異」とは、特定の環境条件（「許容的」として知られている）の下および特定の「制限的」条件の下で、野生型表現形を持つ突然変異株である。条件突然変異株は、冷気感受性であることもある、ここで変異は、冷気に改変された表現形を生み、しかし暖気に触れると、表現形は、ほとんど野生型に戻る。逆に、条件突然変異株は、熱感受性（しばしば、「温熱感受性」と名付けられる）であることもあり、ここで野生型表現形が冷たい温度で見られるが、より暖かい温度に触れると変化する。「クロマチン」は、細胞のゲノムを含むヌクレオプロテイン構造である。細胞のクロマチンは核酸を含み、ヒストンと
非ヒストン性染色体タンパク質を有し、主にＤＮＡおよびタンパク質を含む。真核生物細胞のクロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形で存在し、ここでヌクレオソームコアは、
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の内各２ずつからなる八量体に付随するＤＮＡ約１５０塩基対を備え、およびリンカーＤＮＡ（可変長は、生物体に依存する）は、クレオソームコアの間に伸びる。ヒストンＨ１の分子は、一般にリンカーＤＮＡに付随する。本開示の目的のために、用語「クロマチン」とは、原核生物および真核生物ともに細胞のヌクレオプロテインの全ての型を含むことを意味する。細胞のクロマチンは、染色体性およびエピソーム性両方のクロマチンを含む。
【００５４】
「染色体」とは、細胞ゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞ゲノムは、しばしばその核型によって特徴づけられる。この核型は、細胞のゲノムを含む染色体全てのコレクションである。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含んで良い。
【００５５】
「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の部分でない核酸を含む核酸、ヌクレオプロテイン複合体またはその他の構造を複製する。エピソームの例として、プラスミドおよび特定のウイルスゲノムがある。
【００５６】
「到達可能領域」とは、その中で核酸内に存在する標的部位が標的部位を認識する外来性分子によって結合できる細胞のクロマチン内の部位である。特定の理論に束縛されることなく、到達可能領域とは、ヌクレオソーム構造にパッケージされない領域である。到達可能領域の明瞭な構造は、化学的かつ酵素のプローブ（例えば、ヌクレアーゼ）に対する感受性によってしばしば検出できる。
【００５７】
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在する十分な条件が仮定されているとして、結合分子が結合する核酸の部分を限定する塩基配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限酵素の標的部位である。
【００５８】
「外来性」分子は、細胞内に通常存在しない分子であり、１つまたは複数の遺伝的、生化学的またはその他の方法によって細胞に導入できる。「細胞内の通常の存在」を、細胞の特定の発生段階と環境条件に関して測定する。従って、例えば筋肉の胚発生の段階の期間のみ存在する分子は、成体筋細胞に関して外来性分子である。同様に、熱ショックによって誘発する分子は、熱ショックされなかった細胞に関して外来性分子である。外来性分子は、例えば、機能不全内在性分子の機能バージョンまたは正常機能内在性分子機能不全バージョンを含むことができる。
【００５９】
外来性分子は、その他の中で特に、例えばコンビナトリアルケミストリープロセスで産生されたような小分子、または、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子の任意の修飾された誘導体、または１つまたは複数の上記の分子を含む任意の複合体などの巨大分子であっても良い。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、単鎖または二重鎖であっても良く；直線状、分枝または環状であっても良く；さらに、任意の長さでも良い。核酸は、二本鎖を形成できるもの、同様に三重鎖を形成する核酸を含む。例えば、米国特許番号５，１７６，９９６号および５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質は、以下に制限される訳ではないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写制御因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、脱メチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、脱リン酸酵素、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼを含む。外来性分子もまた、内在性分子として同じ型の分子であっても良く、しかし、細胞が由来するところとは異なる種由来である。例えば、ヒト塩基配列は、マウスまたはハムスターに元来由来する細胞系列を導入できる。
【００６０】
外来性分子は、内在性分子（例えば、外来性タンパク質または核酸）と同じ型である。例えば、外来性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドまたはエピソーム、または細胞内に通常は存在しない染色体を含む。外来性分子を細胞に導入する方法は、当業者に知られており、以下に制限される訳ではないが、脂質媒介伝達（即ち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム類）、電気穿孔法、直接注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介伝達、およびウイルスベクター媒介伝達を含む。外来性分子とは、異なる種、例えば、ヒト遺伝子導入ハムスターゲノムからの核酸をも意味する。
【００６１】
対照的に、「内在性」分子とは、環境条件下で、特定の発生段階での特定の細胞内に通常存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリアゲノム、葉緑体またはその他の小器官、または自然に発生するエピソーム性核酸を含める。さらなる内在性分子は、例えば、転写制御因子および酵素などのタンパク質を含める。
【００６２】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が連結された、好しくは共有結合的に連結された分子である。このサブユニット分子は、同じ化学型の分子であるか、または異なる化学型の分子でありうる。融合分子の第１の型の例として、以下に制限される訳ではない、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断領域間の融合）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）を含む。融合分子の第２の型の例は、以下に制限される訳ではないが、三重形成核酸とポリペプチド間の融合、および副溝結合剤と核酸間の融合を含む。
【００６３】
細胞内の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質を細胞から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に運搬することによって生まれる、ここでポリヌクレオチドは転写され、そして転写物は翻訳されて融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結は、細胞内のタンパク質発現に関わることも出来る。ポリヌクレオチドとポリペプチドを細胞へ運搬する方法は、この開示の別のところで示す。
【００６４】
本開示の目的のための「遺伝子」は、そのような制御配列がコード領域および／または転写された配列に隣接するかどうかに関わらず遺伝子産物（下を見よ）をコードするＤＮＡ領域、同様に遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、必ずしも以下に制限される訳ではないが、リボソーム結合部位と配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、絶縁体、境界エレメント、複製開始点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域などのプロモータ配列、ターミネータ、翻訳制御配列を含む。
【００６５】
「系譜特異的」遺伝子とは、それらの発現が、分化した細胞または系譜特異的細胞型または成熟細胞型に分化するプロセス中の細胞などの特定の細胞型の特徴を示す遺伝子である。
【００６６】
「細胞運命」遺伝子は、細胞の指定先を特定の機能および／または系譜特異的または成熟細胞型に決定してそこへ導くことに関わる遺伝子である。
【００６７】
「分化経路」は、幹細胞に続く経路であり、系譜特異的または成熟細胞型に向かう、即ち幹細胞で始まり系譜特異的または成熟分化細胞で終わる。そのような経路に引き続き幹細胞は、多くの段階を通るだろう。例えば、成熟Ｂ細胞またはＴ細胞に分化する幹細胞は、最初にリンパ様前駆細胞に分化しなければならない。次に、リンパ系前駆細胞は、成熟Ｂ細胞または成熟Ｔ細胞になることに向かう経路に入る。
【００６８】
「自殺遺伝子」は、発現すると、それが発現する細胞の死を引き起こす。自殺遺伝子は、プロドラッグ小分子（シトシン脱アミノ酵素の場合５−フルオロサイトシン）に作用する酵素（例えば、シトシン脱アミノ酵素は）をコードし、そしてこれらを細胞内部の細胞傷害性化合物（５−フルオロウラシル）に転換する、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫまたはＨＴＫ）、または細胞が感作されてガンシクロビルなどの特異的化合物になるのを起こす水痘帯状疱疹チミジンキナーゼ（ＶＳＶ−ｔｋ）などの酵素をコードする。自殺遺伝子は、発現すると、細胞を誘発してアポトーシス性、壊死性になるか、さもなければ生存率を失う遺伝子を含む。アポトーシス促進性受容体刺激薬（例えば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド））が例であり、刺激されると、アポトーシスの開始を引き起こす。
【００６９】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれている情報を、遺伝子産物に転換することを意味する。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）リボザイム、構造ＲＮＡまたはその他の型ＲＮＡ）直接の転写産物であっても良いし、ｍＲＮＡを翻訳することによって産生したタンパク質であっても良い。遺伝子産物はまた、プロセスキャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン結合、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、および糖鎖付加などで修飾されたタンパク質を含む。
【００７０】
遺伝子発現の「調節とは、遺伝子の活性の変化を意味する。発現の調節は、これに制限しないが遺伝子活性化と遺伝子抑制を含む。遺伝子不活性化は、本明細書に記述するＺＦＰを含まない細胞と比較すると遺伝子発現の任意の減少を意味する。したがって、遺伝子不活性化は、完全（ノックアウト）でもまたは部分的（例えば、遺伝子が正常な発現レベルより少なく提示するハイポモルフ、または影響を及ぼす活性の部分的減少を示す変異遺伝子の産物）であっても良い。
【００７１】
「対象領域」とは、例えば、外来性分子と結合することが望ましいとされる、例えば、遺伝子または遺伝子内部のもしくは隣接する非コード配列などの細胞のクロマチンの任意の領域である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的のためである。対象領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリアの、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在しうる。対象領域は、遺伝子のコード領域、例えば、リーダー配列、トレーラ配列もしくはイントロンなどの転写非コード領域、またはコード領域の上流もしくは下流の非転写領域内にある。対象領域は、長さが最小は単一ヌクレオチド対または２，０００ヌクレオチド対まで、またはヌクレオチド対の整数値である。
【００７２】
「セーフハーバ」遺伝子座とは、遺伝子宿主細胞に有害な影響を及ぼすことなく挿入できるゲノム内の遺伝子座のことである。挿入された遺伝子配列の発現が、隣接する遺伝子のからのリードスルー発現によって攪乱させられることがないセーフハーバ遺伝子座が最も有利である。哺乳類細胞のセーフハーバ遺伝子座の例はＡＡＶＳ１遺伝子（米国特許第２００８０２９９５８０号を参照）またはＣＣＲ５遺伝子（米国特許２００８０１５９９９６号を参照）である。
【００７３】
用語「協調リンケージ」と「協調的に連結」（または操作可能に連結）とは、２つ以上の構成要素（配列エレメントなど）が並列することに関して互換的に使われる。これらの構成要素は、ように配列する両方の構成要素が正常に機能し、構成要素の内少なくとも１つが機能を媒介でき発揮する少なくとももう一方の構成要素の上で発揮される機能を媒介できる可能性を与える。図解のようにして、プロモータなどの転写制御配列は、１つまたは複数の転写性制御因子の存在または非存在に呼応して転写性制御配列がコード配列の転写のレベルをコントロールするならば、コード配列に協調的に連結する。転写性制御配列は、一般にコード配列を持つｃｉｓに協調的に連結するしかし、そこに直接的に隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接している訳ではないが、コード配列に協調的に連結する転写性制御配列である。
【００７４】
典型的な「調節領域」、以下に制限されないが、転写プロモータ、転写エンハンサーエレメント、ｃｉｓ作動性転写制御エレメント（転写制御装置、例えば、遺伝子の転写に影響を及ぼすｃｉｓ作動性エレメント、例えば、転写制御因子が相互作用して遺伝子の発現を調節するプロモータ領域）、転写終結シグナル、同様にポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの５’に位置する）、翻訳開始最適化のための配列（コード配列の５’に位置する）、翻訳増強する配列、および翻訳終結配列を含む。制御要素は、由来する要素に含まれる機能的断片、例えば、長さが約５と約５０の間のヌクレオチドのポリヌクレオチド（またはこれら数値間の整数）；好ましくは、長さが約５と約２５の間のヌクレオチドのポリヌクレオチド（またはこれら数値間の整数）、さらに好ましくは長さが約５と約１０の間のヌクレオチドのポリヌクレオチド（またはこれら数値間の整数）、および最も好ましくは９〜１０のヌクレオチドから導出したものである。転写プロモータは、誘導性プロモータ（ここでプロモータに協調可能なように連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補助因子、調節タンパク質などによって誘発される）、抑制可能なプロモータ（ここでプロモータに協調可能なように連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補助因子、調節タンパク質などによって抑制される）、および恒常的なプロモータを含む。
【００７５】
融合ポリペプチドに関して、用語「協調的に連結した」とは、各構成要素は、連結していないならば連結しているかのようにその他の構成要素に連結する同じ機能を遂行すると言う事実を意味する。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断領域と融合する融合ポリペプチド関して、融合ポリペプチド内で、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインの部分が標的部位、および／またはその結合部位と結合し、一方切断領域はＤＮＡを標的部位の近傍で切断することができるならば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断領域が協調的に連結する。
【００７６】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、容易に測定でき、ルーチンアッセイされるタンパク質産物を産生する任意の配列を意味する。適切なレポーター遺伝子は、以下に制限されないが、Ｍｅｌ１、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）、ＧＦＰ、ルシフェラーゼおよび／またはβ―ガラクトシダーゼなどの光産生タンパク質を含む。適切なレポーター遺伝子はまた、ＰＥＴ走査を使用してｉｎ ｖｉｖｏで測定できるチミジンキナーゼ、または全身発光イメージングを経由してｉｎ ｖｉｖｏで測定できるルシフェラーゼなど、ｉｎ ｖｉｖｏで測定できるマーカーまたは酵素をコードしても良い。選択可能なマーカーは、レポーターの代わりに、またはさらに加えて使うことができる。ポジティブ選択マーカーは、遺伝子を保有し、発現する細胞のみを残存させおよび／またはある条件の下で成長させる産物をコードするこれらのポリヌクレオチドである。例えば、ネオマイシン抵抗性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する細胞は、化合物Ｇ４１８に耐性を示すが、一方Ｎｅｏｒを発現しない細胞は、Ｇ４１８によって死滅させられる。ハイグロマイシン抵抗性などを含むポジティブ選択マーカーのその他の例は、当業者に良く知られている。ネガティブ選択マーカーとは、遺伝子を保有し、発現する細胞のみをある条件の下で死滅させる産物をコードするこれらのポリヌクレオチドである。例えば、チミジンキナーゼ（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ＨＳＶ−ＴＫ）を発現する細胞は、ガンシクロビルを加えると死滅する。その他のネガティブ選択マーカーは、当業者に知られている。選択可能なマーカーは、導入遺伝子である必要はないし、そのうえ、レポーターと選択可能なマーカーは、様々な組み合わせで使用できる。
【００７７】
タンパク質ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸としての同じ機能保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、より多くの、より少ない、または同数の残基を対応する未変性の分子として所有でき、および／または１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドの置換を持つことができる。核酸の機能を測定する方法（例えば、コーディング機能、別の核酸とハイブリッド形成する能力）は当業者に良く知られている。同様に、タンパク質機能決定する方法は良く知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合性機能は、例えば、フィルタ−結合、電気泳動的移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定できる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動でアッセイできる。上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、遺伝的および生化学的免疫共沈降、ツーハイブリッド法または相補性によって決定できる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６； 米国特許第 ５，５８５，２４５号および国際出願ＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００７８】
挿入配列
対象とする任意の配列を、幹細胞に標的挿入する方法を本明細書に記述する。挿入される配列は、そのレポーター遺伝子発現カセットが幹細胞の特定の分化系列に付随することが知られている遺伝子または遺伝子グループから選択した調節領域から構成される系譜特異的または細胞運命を含む。細胞運命または幹細胞分化のその他のマーカーに関わる遺伝子を含む配列もまた挿入できる。例えば、そのような遺伝子を含む非プロモータコンストラクトを、その遺伝子座の内在性プロモータが遺伝子産物の発現に導くように特定する領域（遺伝子座）に挿入できる。
【００７９】
内在性遺伝子の発生上のおよび系譜特異的発現を指示する遺伝子の有意な数とそれらの調節領域（プロモータとエンハンサー）は知られている。したがって、幹細胞に挿入された調節領域および／または遺伝子産物の選択は、発生のどの系列およびどのステージを対象とするのかに依存するさらに加えて、系譜特異的発現と幹細胞分化のより詳細の機序的区別についてより詳しく理解すると、それを実験的プロトコルに取り込むことができて、広い範囲の所望の幹細胞を効率的に単離のためにシステムを十分に最適化する。
【００８０】
任意の系譜特異的または細胞運命調節エレメント（例えばプロモータ）または細胞マーカー遺伝子を、本明細書に記述した組成と方法で使うことができる。系譜特異的と細胞運命遺伝子またはマーカーは、当業者に良く知られており、対象とする特定の系列を評価するために直ちに選択できる。非制限例として、以下に制限されるわけではないが、Ａｎｇ２、Ｆｌｋ１、ＶＥＧＦＲ、ＭＨＣ遺伝子、ａＰ２、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、Ｏｔｘ２などの遺伝子から得られた調節エレメントを含む。（例えば、米国特許第５，６３９，６１８号）、Ｄｌｘ（Ｐｏｒｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｅｕｒｏｎ ７：２２１−２２９）、 Ｎｌｘ （Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５１：７４８−７５１）、 Ｅｍｘ （Ｓｉｍｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． １１：２５４１−２５５０）、 Ｗｎｔ （Ｒｏｅｌｉｎｋ ａｎｄ Ｎｕｓｅ （１９９１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５：３８１−３８８）、 Ｅｎ （ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．）、 Ｈｏｘ （Ｃｈｉｓａｋａ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５０：４７３−４７９）、 ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ β ｃｈａｉｎ （ＡＣＨＲβ） （Ｏｔｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １８Ａ：１７７を参照されたい）。調節エレメントが得られる系譜特異的遺伝子のその他の例は、インターネット経由で容易にアクセスできて、得業者に良く知られているＮＣＢＩ−ＧＥＯのウエブサイトで入手可能である。
【００８１】
例えば、心筋細胞の系列を同定するために、αＭＨＣ遺伝子からの調節領域を使うことができる。平滑筋系列を同定するために、ＳＭ２２αプロモータを使うことができる。例えば、米国特許第６，０９０，６１８号を参照されたい。脂肪細胞系列を同定するために、ａＰ２調節領域を使うことができる。ニューロン系列を同定するために、シナプシスまたはニューロン特異的エノラーゼなどのニューロン特異的遺伝子調節領域を使うことができる。グリア細胞を同定するために、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子からの調節領域を使うことができる。
【００８２】
調節領域（例えば、プロモータ）として、標的細胞（例えば、ヒト細胞に導入するためのコンストラクト内で使われるヒトプロモータ）と同じ種由来、異なる種（例えば、ヒト細胞に導入するためのコンストラクト内で使われるマウスプロモータ）由来、または混合された調節領域（例えば、あるマウス遺伝子の調節領域をあるヒト遺伝子の調節領域と組み合わせたもの）由来のものがある。調節領域を、当業者に知られた方法（例えば、対象とするコントロール配列に隣接するプライマーを使うＰＣＲ法）で対象とする遺伝子から導くことができる。
【００８３】
系譜特異的または細胞運命プロモータを、当業者に知られた方法で対象とする遺伝子から得ることができる。例えば、商業データベース（例えば、ＥＮＴＲＥＺ ａｎｄ ＧＥＮＢＡＮＫ−−国立バイオテクノロジー情報センター；ＥＭＢＬ−ヨーロッパ生物情報学研究所，Ｈｉｎｘｔｏｎ， ＵＫ）および現代科学文献（ＭＥＤＬＩＮＥ Ｂ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ８６００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｐｉｋｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．）内をコードおよび制御配列の位置を含む選択された遺伝子の情報ついて検索できる。代わりに、特定の遺伝子に付随する制御配列を同定する方法は、当業者に知られている、例えば、選択された遺伝子の５’非コード領域由来の断片の欠失解析またはＰＣＲ増幅がある、ここでは、これらの断片は調節（またはコントロール）配列を同定するために
協調可能なようにレポーター遺伝子に連結している。制御配列に付随するそのようなレポーター遺伝子を例えば、培養細胞内でスクリーンできる。
【００８４】
幹細胞に挿入できる細胞マーカー遺伝子産物および／または系譜特異的または細胞運命プロモータの別の非限定例として、下表１に示される細胞マーカー由来の細胞マーカーおよび／またはプロモータ配列をコードする配列を含む。
【００８５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【００８６】
従って、細胞運命遺伝子もまた本発明の方法で使用しても良い。これらの遺伝子の内在性を、細胞運命特異的遺伝子の発現によって細胞が分化経路に入り分化経路を進行して所望の系譜特異的または成熟分化細胞型に向うように、セーフハーバ遺伝子座に挿入できる。いくつかの実施形態では、これらの細胞運命遺伝子をセーフハーバ遺伝子座に挿入し、発現が内在性プロモータによって駆動されないようにプロモータを含めない。
【００８７】
本発明の実施に有用なレポーター発現カセットを、適切なレポーター遺伝子コード配列に操作可能に連結された対象とする任意の調節領域を使って作製できる。容易にアッセイ可能なマーカーポリペプチドをコードするレポーター遺伝子は、当業者に良く知られている。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物体または組織には無くまたそれによって発現しない遺伝子であり、ある容易に検出可能な性質、例えば表現型の変化または酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子であり、したがって、対象とする遺伝子を持つレシピエントの細胞に同時形質移入すると、形質移入およびその他のイベントを検出する手段を提供する遺伝子である。適切なレポーターの非限定的例として、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）などが含まれる。抗生物質耐性をコードする遺伝子などの選択マーカーもまた採用して良い。そのうえ、幹細胞を持つ内在性遺伝子を、内在性遺伝子の発現に識別でき測定可能な変化を引き起こす異種性制御配列を特異的に挿入することによって、レポーター遺伝子として利用できる。
【００８８】
採用したレポーター遺伝子の型は、実験の所望のゴールに依存する。例えば、特異的系列の分化経路を辿るために、またはエンハンサーの発生上の特異性をテストするために、目視によってトラッキングを可能にするレポーターコンストラクトを、系譜特異的調節領域（すなわち、組織化学）と典型的に同時に使う。これを、細胞系列と分化枝分かれ部位をトラッキングし特徴づけのために使うことができる。一度系列が特徴づけられると、この同じシステムを、組織化学的マーカーから表面膜タンパク質にレポーター遺伝子の型を単純に置換することによって、系列およびステージ特異的幹細胞の単離ために使用できる。プロモータ特異性は、単離の所望のステージで表面タンパク質の発現を指示し、蛍光活性細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって所望の幹細胞を効率よく単離できる。パニングなどのその他の免疫学的分離技術もまた、幹細胞単離に適用可能である。
【００８９】
挿入可能な別の遺伝子配列として、例えば、野生型遺伝子を置換する変異させる配列を含める。例えば、野生型第ＩＸ因子遺伝子配列を、遺伝子の内在性コピーが変異した幹細胞のゲノムに挿入できる。野生型コピーを、内在性遺伝子座に挿入するか、または代わりにセーフハーバ遺伝子座に標的させる
【００９０】
本明細書の教授に引き続いて、そのような発現カセットの作製は、分子生物学の分野で良く知られた方法論を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照）。遺伝子導入動物を産生する発現カセットの使用前に、選択された調節領域を付随するストレス誘導物質に対する発現カセットの応答性を、発現カセットを適切な細胞系統に導入することによってテストことができる（例えば、一次細胞、形質転換した細胞、または不死化細胞系統）。
【００９１】
非コード（制御配列および非タンパクコード配列を含む）塩基配列の標的挿入も達成することができる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、低分子ヘアピン型ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列も標的挿入に使用できる。そのうえ、非連鎖のプロモータなどのその他のそのような核酸要素の制御配列を今後の研究のための細胞系統を作るために特に導入することができる。さらに、対象とする遺伝子の調節領域を、レポーター遺伝子に操作可能に連結してキメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作ることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子の調節領域は、小分子（例題のみとして、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン）に応答性がある。
【００９２】
その他の実施形態として、機能的ポリペプチドをコードする対象とする配列を、幹細胞のゲノム（例えば、治療上のポリペプチドをコードする配列）の標的点に挿入する。ポリペプチドコード化配列の非制限的例として以下コードする配列を含む：ＥＰＯ、ＶＥＧＦ、ＣＣＲ５、ＥＲα、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｂ型肝炎ウイルスＣ、Ｓ、Ｘ、およびＰ、ＬＤＬ−Ｒ、ＰＥＰＣＫ、ＣＹＰ７、フィブリノーゲン、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ（ａ）、レニン、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンド、アミロイド前駆タンパク質、心房性ｎａｔｕｒｅｔｉｃ因子、ｏｂ−レプチン、ｕｃｐ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＰＡＦ、ｐ５３、Ｒｂ、胎児ヘモグロビン、ジストロフィン、ｅｕｔｒｏｐｈｉｎ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ受容体ｆｌｔおよびｆｌｋ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ｂｃｌ−２、サイクリン、アンジオスタチン、ＩＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＳＴＡＴＳ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＴＨ、ＰＴＩ−１、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰ合成酵素、ＦＡＤ２−１、δ−１２不飽和化酵素、δ−９不飽和化酵素、δ−１５不飽和化酵素、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、デンプン合成酵素、セルロース合成酵素、ショ糖合成酵素、老化−付随する遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシド脱離酵素、ウイルス遺伝子、原生動物の遺伝子、真菌遺伝子、および細菌遺伝子。適切な治療上のタンパク質はまた、抗体、抗体断片、単鎖抗体、細胞内抗体などそれぞれの全体をコードする発現カセットを含む。タンパク質アプタマー、ゼータキネシス、修飾または設計したＴ細胞受容体および機能障害のまたはデコイタンパク質もまた熟慮される。別の治療上のタンパク質として、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、４−スルファターゼおよびαグルコシダーゼ酸など、酵素補充療法に使われるものがある。一般に、制御する適切な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、分裂促進因子、走化性因子、腫瘍活性因子、受容体、カリウムチャネル、Ｇタンパク質、シグナル伝達分子、およびその他の疾病関連遺伝子を含む。特定の実施形態では、組み込み配列は、Ｅｐｏ、ＶＥＧＦなどの血漿可溶性ポリペプチドをコードする。
【００９３】
本発明の異なる実施形態の様々な形態は、併用することができる。
【００９４】
どのような種の幹細胞も、本明細書に記述する組成と方法に使うことができる。適切な幹細胞の非制限的例として、造血幹細胞、間葉幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞、肝臓幹細胞、皮膚幹細胞、誘発性多能性幹細胞、腸幹細胞などを含む。別の幹細胞は、当業者に良く知られている。
【００９５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
本明細書に記述のレポーターコンストラクトは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）を用いて細胞のゲノムにうまく組込まれる。ＺＦＮｓはジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。
【００９６】
Ａ．ジンクフィンガータンパク質
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは選択した配列に結合するように操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１３５−１４１； Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：３１３−３４０； Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：６５６−６６０； Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：６３２−６３７； Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０：４１１−４１６を参照。天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、操作された（天然には存在しない）ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは新規の結合特異性を有することができる。一般に、天然には存在しない操作された認識ヘリックス領域は新規の結合特異性がある。操作方法は、限定されるものではないが、合理的設計と種々のタイプの選択を含む。例えば、合理的設計は３塩基連鎖（または４塩基連鎖）ヌクレオチド配列および個別のジンクフィンガーアミノ酸配列を含有したデータベースを使用しており、配列内では３塩基連鎖または４塩基連鎖配列がジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連し、これらは特定の３塩基連鎖または４塩基連鎖配列に結合している。例えば、共同出願の米国特許出願第６，４５３，２４２および６，５３４，２６１号（その全体が、参照により本明細書に援用される）を参照。
【００９７】
ファージ提示法およびツーハイブリッド系を含む、例示的選択方法は米国特許出願第５，７８９，５３８号、５，９２５，５２３号、６，００７，９８８号、６，０１３，４５３号、６，４１０，２４８号、６，１４０，４６６号、６，２００，７５９号、６，２４２，５６８号、ならびに、ＷＯ９８／３７１８６号、ＷＯ９８／５３０５７号、ＷＯ００／２７８７８号、ＷＯ０１／８８１９７号およびＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの結合特異性の増強については例えば、共同出願のＷＯ０２／０７７２２７号に記述されている。
【００９８】
標的部位の選択のなかで、ＺＦＰおよび融合タンパク質の設計と構築方法（およびこれをコードするポリヌクレオチド）は当業者には周知であり、米国特許出願第２００５００６４４７４号と２００６０１８８９８７号に詳細に記載され、これらの文献はその全文を引用することを以て本明細書の一部となす。
【００９９】
加えて、これらと他の文献に開示されていように、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含むリンカー配列を用いて、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガードジンクフィンガータンパク質は結合してもよい。さらに、リンカー配列６以上のアミノ酸長の例示には米国特許出願第６，４７９，６２６号、６，９０３，１８５号と７，１５３，９４９号を参照。本明細書に記載されるタンパク質はタンパク質の個別のジンクフィンガー間の適切なリンカーの組み合せを含んでもよい。追加的なリンカー構造の例は、２００８年５月２８日出願の米国仮出願第６１／１３０，０９９号に見られ、タイトルはＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｌｉｎｋｉｎｇ ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ Ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｏｍａｉｎｓである。
【０１００】
特定の実施形態では、４フィンガー、５フィンガー、または６フィンガーのジンクフィンガー結合ドメインは例えば、ＦｏｋＩのようなタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインである切断半ドメインに融合していく。そのようなジンクフィンガー／ヌクレアーゼ半ドメイン融合の１つ以上のペアは標的切断に使用され、例えば、米国特許公報第２００５００６４４７４号および２００７０２１８５２８号に開示されている。
【０１０１】
標的切断につては、結合部位のエッジ近傍が５つ以上のヌクレオチド対で分離されており、各融合タンパク質はＤＮＡ標的の反対鎖に結合することができる。本開示に則り、例えば、ＣＣＲ５、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶ Ｓ１として知れている）またはその他を含めて選択された幹細胞のいかなる遺伝子の配列にもＺＦＮｓを標的とすることができる。ＣＣＲ５とＡＡＶ Ｓ１を標的としたＺＦＮｓを記載した国際特許公開ＷＯ／２００８／１３３９３８号および米国特許公報第２００８０１５９９６号を参照（参照により本明細書に援用される）。特定の実施形態では、ＺＦＮｓは、ある部位への標的組込みが増殖および／または分化する細胞の能力を干渉しない範囲で「非必須」遺伝子を標的とする。
【０１０２】
切断ドメイン
さらに、ＺＦＮｓはヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断半ドメイン）を含む。本明細書で開示する融合タンパク質の切断ドメイン部分をエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得することができる。切断ドメインが由来する例示的なエンドヌクレアーゼは、限定されるものではないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ； および Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９−３３８８を参照。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ Ｎｕｃｌｅａｓｅ； ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ； ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ＤＮａｓｅ Ｉ； ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ； ｙｅａｓｔ ＨＯ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅを参照。さらにＬｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照。）。これらの酵素の内の１つ以上（またはその機能的断片）を切断ドメインおよび断片半ドメインの源として使用できる。
【０１０３】
同様に、上述したように切断半ドメインは切断活性に関する二量体化を必要とするヌクレアーゼまたはその部分から導くことができる。一般的に、融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合は２つの融合タンパク質が切断に必要である。または、２つの切断半ドメインを含有する単一のタンパク質を使用できる。２つの切断半ドメインを同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から導くことができ、または切断半ドメインのそれぞれは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から導くことができる。加えて、好ましくは２つの融合タンパク質の標的部位を相互に配置し、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位との結合により他方へ向かった空間方向において切断半ドメインが配置され、そこで例えば二量体化により切断半ドメインが機能的切断ドメインを形成する。従って、特定の実施形態では、標的部位の端近傍は５−８ヌクレオチドまたは１５−１８ヌクレオチドにより分離される。しかしながら、整数個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は２つの標的部位を介在することができる（例えば、２から５０ヌクレオチド対）。一般に、切断の部位は標的部位の間に位置する。
【０１０４】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、かつ、結合の部位あるいはその近傍でＤＮＡ（認識部位において）および切断ＤＮＡへの配列特異性結合が可能である。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、かつ別々の結合と切断ドメインをもつ。例えば、一方の鎖にある認識部位からの９のヌクレオチドおよび他方の認識部位からの１３のヌクレオチドにおいて、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩはＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許５，３５６，８０２； ５，４３６，１５０ および ５，４８７，９９４；並びに Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９； Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８３−８８７； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ｂ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照。従って、一実施形態では、操作あるいは未操作の場合もあるが、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインからの融合タンパク質は切断ドメイン（または切断半ドメイン）を含む。
【０１０５】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的ＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素はダイマーとして活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １０，５７０−１０，５７５を参照。従って、本開示の目的上、開示された融合タンパク質に使用されたＦｏｋＩ酵素の部分は切断半ドメインと考えられる。従って、ジンクフィンガーとＦｏｋＩとの融合を用いた標的二本鎖切断および／または細胞配列の標的置換については、それぞれがＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する２つの融合タンパク質が触媒的に活性な切断ドメインの再構成に使用できる。別法として、さらにジンクフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用できる。ジンクフィンガーＦｏｋＩ融合を用いた標的切断および標的配列変化のパラメータについては本開示の別の個所で述べる。
【０１０６】
切断ドメインまたは切断半ドメインは切断活性を保持するか、または機能的切断ドメインを形成するために多量体化する（例えば二量体化）活性を保持するタンパク質のいかなる部分でもあってよい。
【０１０７】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は国際特許公開ＷＯ０７／０１４２７５号（参照により本明細書に援用される）に記載されている。さらに、追加的な制限酵素は別々の結合と切断ドメインを含み、かつ、これらは本開示が意図することである。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：４１８−４２０を参照。
【０１０８】
特定の実施形態では、切断ドメインはホモ二量体化を最小化するか防止する１つ以上の操作された切断半ドメイン（二量化ドメイン変異体ともいう）を含有し、例えば、米国特許公報第２００５００６４４７４号、２００６０１８８９８７号および２００８０１３１９６２号に記載されており、これら出願の全てを参考文献としてここに援用する。ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８でのアミノ酸残基はＦｏｋＩ切断半ドメインの二量化に影響を与える全ての標的である。
【０１０９】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作した切断半ドメインは第１の切断半ドメインがＦｏｋＩの位置４９０と５３８にあるアミノ酸残基における変異を含有し、かつ第２の切断半ドメインはアミノ酸残基４８６および４９９における変異を含有する対を含む。
【０１１０】
従って、一実施形態では、４９０における変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、５３８における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、４８６における変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し、位置４９９における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的には、本明細書に記載の操作された切断半ドメインは「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名される操作された切断半ドメインを産生するために１つの切断半ドメインにおける変異位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）により、さらに「Ｑ４８６：Ｉ４９９Ｌ」と命名される操作された切断半ドメインを産生するために別の切断半ドメインにおける変異位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）により調製した。実施例に記載のように、一方のＺＦＮが「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」切断ドメインを含有し、他方のＺＦＮが「Ｑ４８６：Ｉ４９９Ｌ」切断ドメインを含有するＺＦＮの対は「ＥＬ／ＫＫ」ＺＦＮ対とも呼ばれる。本明細書記載の操作された切断半ドメインは、切断ドメインを含有するヌクレアーゼの１つ以上の対が切断に使用される場合に異常な切断が最小化されるか、または除かれた偏性ヘテロ二量体変異である。例えば、米国特許公報第２００８０１３１９６２号を参照し、全ての目的のためにこれらの出願の内容全体を本明細書中に引用によって援用する。
【０１１１】
特定の実施形態では、操作された切断半ドメインは例えば位置４８６における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、かつ、位置４９９における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、位置４９６における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ「ＥＬＤ］および「ＥＬＥ」ドメインともいう）で置き換える変異である位置４８６、４９９、および４９６（野生型ＦｏｋＩに番号が振られている）の変異を含む。別の実施形態では、操作された切断半ドメインは例えば位置４９０における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、位置５３８における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および位置５３７における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基、またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインともいう）で置換える変異である位置４９０、５３８および５３７の変異を含む。
【０１１２】
別の態様では、条件による活性化を示す操作された切断半ドメインを提示した。いくつかの実施形態では、条件付きで操作された切断半ドメインは温度低下の条件下では活性の減少を示した。いくつかの実施形態では、条件付きで操作された切断半ドメインは温度上昇の条件下では活性の減少を示した。
【０１１３】
更に別の態様では、操作された切断半ドメインは非正準亜鉛配位残基（例えば、正準Ｃ２Ｈ２配置よりもＣＣＨＣである）を含有するジンクフィンガーヌクレアーゼに組入れられてよい。
【０１１４】
本明細書に記載される操作された切断半ドメインは例えば、米国特許公報第２００５００６４４７４号（実施例５）および２００７０１３４７９６号（実施例３８）に記載した野生型切断半ドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発による適切な方法を用いて調製することができる。
【０１１５】
さらに他の実施形態では、１本鎖ニックを標的部位に導入するように半ドメインの１つが酵素的に非活性である、２つの切断半ドメインを使用する（例えば、共同出願の米国特許出願第６１／１８９、８００号を参照）。
【０１１６】
幹細胞への標的組込みに関する追加的方法
いずれのヌクレアーゼも本明細書で開示する方法で使用できる。例えば、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは認識配列が非常に長いが、ホトサイズのゲノムになれば統計上、一部は存在することが多い。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。これらの認識配列は周知である。さらに、米国特許第５，４２０，０３２； 米国特許第６，８３３，２５２； Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９-３３８８； Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ８２：１１５-１１８； Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， １１２５-１１２７； Ｊａｓｉｎ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２：２２４-２２８； Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：１６３-１８０； Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０：３４５-３５３ および ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照。
【０１１７】
非天然標的部位を結合するためにホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性を操作することも報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５； Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：２９５２−２９６２； Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９； Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６を参照。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは植物病原体キサントモナス由来のＴＡＬエフェクターからの操作されたドメインである（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ｏｃｔ ２００９ （１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１） および Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ｏｃｔ ２００９ （１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７を参照）。
【０１１９】
従って、幹細胞への系譜特異的レポーターなどの配列の標的組込みについては、独特の標的部位をもつ任煮の天然に存在する、または操作されたヌクレアーゼをジンクフィンガーヌクレアーゼの代わり、またはそれに加えて使用することができる。加えて、この天然に存在する、または操作されたヌクレアーゼからのドメインを単離することができ、種々の組み合せで使用できる。例えば、天然に存在する、または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼからのＤＮＡ結合ドメインを、非相同の切断ドメインまたは半ドメイン（例えば、他のホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＩＩＳ型エンドヌクレアーゼからの）と融合することができる。上述のように、この融合タンパク質をジンクフィンガーヌクレアーゼとの組み合わせで使用することもできる。
【０１２０】
送達
いずれかの適切な手段によって本明細書に掲載のレポーターコンストラクトおよびヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮｓ）を標的幹細胞に送達してもよい。
【０１２１】
例えば、ジンクフィンガーを含有するタンパク質の送達方法は米国特許第６，４５３，２４２； ６，５０３，７１７； ６，５３４，２６１； ６，５９９，６９２； ６，６０７，８８２； ６，６８９，５５８； ６，８２４，９７８； ６，９３３，１１３； ６，９７９，５３９； ７，０１３，２１９；および７，１６３，８２４に記載されており、これら出願の全てを参考文献としてここに援用する。
【０１２２】
本明細書に記載のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮｓ）をコードするポリヌクレオチドおよび組込まれる配列（例えば、系譜特異的レポーターコンストラクト）をＺＦＮｓおよび／または組込まれる配列の１つ以上をコードする配列を含有するベクターを用いて送達してもよい。任意のベクター系は、限定されるものではないが、プラスミドベクター、レトロウィルス・ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む。米国特許第６，５３４，２６１； ６，６０７，８８２； ６，８２４，９７８； ６，９３３，１１３； ６，９７９，５３９； ７，０１３，２１９；および７，１６３，８２４をも参照し、これら出願の全てを参考文献としてここに援用する。さらに、これらのベクターが１つ以上のＺＦＮコード配列および／または１つ以上の目的の配列を含んでよいことは明白であろう。例えば、１つ以上のＺＦＮの対を細胞に導入する場合、ＺＦＮを同じベクターまたは異なるベクター上で行ってもよい。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは１つまたは複数のＺＦＮおよび／または１つまたは複数のリポーターコンストラクトをコードする配列を含んでもよい。
【０１２３】
従来のウイルスおよび非ウイルスをベースとする遺伝子導入補法を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的細胞においてＺＦＮをコードし、および／または配列（例えばリポータコンストラクト）を組込む核酸の導入に使用することができる。また、そのような方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞に核酸を投与するのに使用することができる。特定の実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療用に投与できる。非ウイルスベクター送達系はＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、リポソームまたはポロキサマなどの送達媒体と複合した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は細胞に送達した後にエピゾーム状ゲノムまたは組込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療のレビューにはＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３ （１９９２）； Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７ （１９９３）； Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６ （１９９３）； Ｄｉｌｌｏｎ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５ （１９９３）； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０ （１９９２）； Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４ （１９８８）； Ｖｉｇｎｅ， Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６ （１９９５）； Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４ （１９９５）； Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ （ｅｄｓ．）（１９９５）； および Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６ （１９９４）を参照し、参照によりここに取り込まれる。
【０１２４】
操作されたＺＦＰをコードする核酸の非ウイルス送達方法はエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質‐核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用物質増強型取り込みを含む。また、例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ ２０００ ｓｙｓｔｅｍ （Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションを核酸の送達に使用することができる。加えて、本分野において知られる任意の手段で操作されたＺＦＰをコードするｍＲＮＡを細胞に送達してもよい。
【０１２５】
追加的な例示的核酸送達系はＡｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｃｏｌｏｇｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）， Ｍａｘｃｙｔｅ， Ｉｎｃ． （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）、およびＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ， ＭＡ）、Ｃｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， （例えば、米国特許第６、００８、３３６号を参照）が提供する系を含める。
【０１２６】
例えば、リポフェクションは米国第５，０４９，３８６号、４，９４６，７８７号、および４，８９７，３５５号に記載され、さらにリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）とＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオン性および中性脂質はフェルグナーのものを含む、（ＷＯ ９１／１７４２４号、ＷＯ ９１／１６０２４号）。細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）へ送達ができる。
【０１２７】
脂質の調製：免疫脂質複合体などの標的リポソームを含有する核酸複合体は当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０ （１９９５）； Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２９１−２９７ （１９９５）； Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２−３８９ （１９９４）； Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７−６５４ （１９９４）； Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２ （１９９５）； Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７−４８２０ （１９９２）； 米国特許第 ４，１８６，１８３、 ４，２１７，３４４、 ４，２３５，８７１、 ４，２６１，９７５、 ４，４８５，０５４、 ４，５０１，７２８、 ４，７７４，０８５、 ４，８３７，０２８および４，９４６，７８７を参照）。
【０１２８】
操作されたＺＦＰをコードする核酸の送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系の使用は、体の中の特定の細胞にウイルスを標的化し、かつ、核へのウイルス負荷の輸送という高度に進化したプロセスを利用している。ウイルスベクターは患者（ｉｎ ｖｉｖｏ）に直接投与するか、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の処理に利用してから改変細胞が患者（ｅｘ ｖｉｖｏ）に投与される。ＺＦＰを送達する従来のウイルスに基づく系は、限定されるものではないが、遺伝子導入するためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含む。ホストゲノムでの組込みはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法で可能であり、しばしば挿入されたトランス遺伝子の長期発現という結果になる。さらに、多くの異なる細胞型と標的細胞において高導入効率が認められる。
【０１２９】
レトロウイルスの向性は外来エンベロープタンパク質を組み込んで変えることができ、標的細胞の有望な標的集団を拡大する。非分裂細胞を形質導入または感染させ、かつ、典型的には高ウイルス価を産生するレンチウイルスベクターはレトロウィルス・ベクターである。レトロウイルス遺伝子導入の系の選択は標的細胞に依存する。レトロウイルスは外来性配列の６−１０ｋｂまでのパッケージ容量を有するシス作用性長末端反復で構成している。最小シス作用性ＬＴＲが恒久トランス遺伝子発現させるためには、治療遺伝子を標的細胞に組込むのに使用するベクターの複製および詰め込みで十分である。広く使用されているレトロウイルスベクターはマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合せに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２７３１−２７３９ （１９９２）； Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：１６３５−１６４０ （１９９２）； Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． １７６：５８−５９ （１９９０）； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：２３７４−２３７８ （１９８９）； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：２２２０−２２２４ （１９９１）； ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
【０１３０】
特定の実施形態では、核酸（例えば、ＺＦＮおよび／または組込む配列をコードする）はレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて送達される。一般的に、レンチウイルス導入ベクターは当該分野で周知の方法で産生できる。例えば、米国特許第５，９９４，１３６； ６，１６５，７８２；および６，４２８，９５３を参照。好ましくは、レンチウイルスドーナーコンストラクトはインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）である。例えば、記述したように天然のインテグラーゼ遺伝子において１つ以上の変異を含有するレンチウイルスベクターを用いてＩＤＬＶを産生してもよく、例えば、Ｌｅａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０（２）：７２１−７２８； Ｐｈｉｌｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３（４７）：１７６８４-１７６８９； およびＷＯ ０６／０１０８３４に開示されている。特定の実施形態では、Ｌｅａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０（２）：７２１−７２８に記載したように、ＩＤＬＶはインテグラーゼタンパク質（Ｄ６４Ｖ）の位置６４において変異を含むＨＩＶレンチウイルスベクターである。本明細書においての使用に適した追加のＩＤＬＶベクターは米国特許出願第１２／２８８，８４７号に記載されており、参照により本明細書に援用される。
【０１３１】
ＺＦＰ融合タンパク質の一過性の発現が好まれるような用途では、アデノウイルスに基づく系が使用される。アデノウイルスに基づくベクターでは多くの細胞型の高導入効率が可能で、かつ、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターでは高力価と高い発現レベルが得られている。このベクターは比較的簡単な系で大量に産生することができる。さらに、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、さらにｉｎ ｖｉｖｏとｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子診療手順について標的核酸を用いて細胞に形質導入することに使用する（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７ （１９８７）；米国特許第 ４，７９７，３６８； ＷＯ ９３／２４６４１； Ｋｏｔｉｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１ （１９９４）； Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１ （１９９４）を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０ （１９８５）； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１ （１９８４）； Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ， ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０ （１９８４）； およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：０３８２２−３８２８ （１９８９）を含めて多くの文献に記載されている。
【０１３２】
現在、導入物質を生成するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含有するアプローチを用いている少なくとも６つのウイルスベクターが臨床試験において遺伝子を導入するアプローチとして使用可能である。
【０１３３】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓが臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５ （１９９５）； Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：１０１７−１０２ （１９９５）； Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８ （１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった（（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０ （１９９５））。５０％以上の伝達効率がＭＦＧ−Ｓパッケージベクターについて認められてきた。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４４（１）：１０−２０ （１９９７）； Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：１１１−２ （１９９７））
【０１３４】
組換え型アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は欠損性かつ非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターはトランス遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復のみを維持するプラスミドから導かれる。形質導入した細胞のゲノムの組込みにより、有効な遺伝子導入と安定したトランス遺伝子送達がこのベクター系の主要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３ （１９９８）， Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７４８−５５ （１９９６））。
【０１３５】
複製欠損性組換え型アデノウイルスベクター（Ａｄ）は高力価で産生することができ、かつ、多くの異なる細胞型を容易に感染する。アデノウイルスベクターの多くはトランス遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ，および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され、さらに、複製欠損ベクターは別の場所で欠失した遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞において増殖する。Ａｄベクターは肝臓、腎臓および筋肉にある非分裂、分化細胞を含有してｉｎ ｖｉｖｏで複数の型の組織を形質導入することができる。従来のＡｄベクターは大きな運搬能を有する。臨床試験でのＡｄベクターの使用例は筋肉注射で抗腫瘍免疫化をするポリヌクレオチド治療を含む（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３−９ （１９９８））。臨床試験で遺伝子導入のためにアデノウイルスベクターを使用する追加的な例はＲｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０ （１９９６）； Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７ １０８３−１０８９ （１９９８）； Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２０５−１８ （１９９５）； Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５９７−６１３ （１９９７）； Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５０７−５１３ （１９９８）； Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３−１０８９ （１９９８）を含む。さらに、ＺＦＮの送達のためのＡｄ５／３５ベクターの使用を記載した米国特許公報第２００８０１５９９９６号を参照し、参照により本明細書に援用される。
【０１３６】
宿主細胞を感染することができるウイルス粒子の形成にパッケージング細胞を使用する。そのような細胞はアデノウイルスを詰め込む２９３細胞、レトロウイルス細胞を詰め込むψ２細胞またはＰＡ３１７細胞含む。通常、遺伝子治療に使うウイルスベクターは核酸ベクターをウイルス粒子に詰め込む産生細胞株で生成する。典型的には、ベクターは詰め込みおよびその後の宿主（該当する場合には）への組込みで要求される最小値のウイルス配列、発現しているタンパク質をコードする発現カセットにより置換された他のウイルス配列を含む。欠けているウイルス機能をパッケージング細胞株により別の場所で供給する。例えば、典型的には遺伝子治療で使用するＡＡＶベクターは詰め込みと宿主ゲノムへの組込みに要求されるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列に欠けているヘルパープラスミドを含有する細胞株で詰め込まれる。また、この細胞株はヘルパーであるアデノウイルスに感染している。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠いており大きな量では詰め込まれない。アデノウイルスによる汚染をＡＡＶよりもアデノウイルスがより高い感受性を示す例えば熱処理で低めることができる。
【０１３７】
多くの用途において、高度な特異性でベクターが特定の組織型に送達されることが望ましい。従って、ウイルスの外面上にウイルスコートタンパク質がある融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、ウイルスベクターを所与の細胞型に対して特異性を有するように改変できる。目的の細胞型に存在することが知られている受容体について親和性を有するリガンドを選択する。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現させることができ、かつ、その組換えウイルスがヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞‐表面受容体についてリガンドを含む融合タンパク質を発現するような他のウイルス‐標的細胞の対に拡張することができる。例えば、事実上任意に選択された細胞受容体について特異的結合親和性を有する抗体断片（例えばＦａｂまたはＦｖ）を提示するように繊維状ファージを操作できる。前述の説明は、ウイルスベクターに主として適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することもできる。そのようなベクターを特定の標的細胞による取込みを促進すると考えられている特定の取込み配列を含有するように操作できる。
【０１３８】
ベクターは後述するように個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、真皮下、もしくは頭蓋内への注入）または局所適用によってｉｎ ｖｉｖｏに送達することができる。あるいは、ベクターは個々の患者（例えば、リンパ球、骨髄穿刺、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞から外植された細胞のようにｅｘ ｖｉｖｏで細胞に送達することもでき、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択して患者に細胞を再移植する。
【０１３９】
診断、研究用または形質移入された細胞（例えば、幹細胞）の再注入用にする宿主生物へのｅｘ ｖｉｖｏ細胞形質移入は当業者には周知である。好ましい実施形態では、細胞は被験対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）で形質移入され、かつ、被験対象生物（例えば、患者）に再注入される。ｅｘ ｖｉｖｏでの形質移入に適した様々な細胞型は、当業者に周知である（患者から細胞を単離し、培養する方法の考察については、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ． １９９４）およびその中で引用される参考文献を参照）。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインを用いて臨床的に重要な免疫細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３４＋細胞を分化する方法は周知である（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２ （１９９２）を参照）。
【０１４０】
周知の方法で形質導入と分化のために幹細胞を単離する。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（パンＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化抗原提示細胞）などの不要な細胞を結合する抗体がある骨髄細胞を選り分けて骨髄細胞から幹細胞を単離する（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２ （１９９２）） ｏｒ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ＣＤ３４＋ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （Ｄ Ｊ Ｒｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．， （２０００）． Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２５： ２４３−２４９を参照）。
【０１４１】
ｉｎ ｖｉｖｏで細胞の形質導入についての治療ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）を生物に直接投与することができる。または、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は分子を導入して、最終的に血液または組織細胞と接触させるために通常使用される経路のうちいずれか、限定されるものではないが、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーション法を含める。このような核酸を投与する適切な方法は当業者にとって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために複数の経路を使用できるが、特定の経路が別の経路と比べてより速やかで、かつより効果的な反応をしばしば提供することが可能である。
【０１４２】
例えば、造血性幹細胞にＤＮＡを導入する方法は米国特許第５、９２８、６３８号に開示されている。トランス遺伝子を造血性幹細胞、例えばＣＤ３４+細胞に導入することに有用なベクターはアデノウイルス３５型を含む。
【０１４３】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）にリポーターコンストラクトを導入することに適したベクターは非組込み型レンチウイルスベクターを含む。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８； Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１； Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０； Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照。
【０１４４】
薬学的に許容される担体は投与される個々の組成物によって、ならびに、その組成物を投与することに使用される個々の方法によって、ある程度決定される。したがって、後述するように、本発明の薬学的組成物の多種多様の適切な製剤がある（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８９を参照）。
【０１４５】
用途
本明細書に開示した方法と組成物は幅広い用途が可能である。コード配列（リポーター）に作動可能に連結された内在性遺伝子からのプロモータ（例えば、系譜特異的または細胞運命プロモータ）を含有する１つ以上の配列の幹細胞への標的組込みを内在性遺伝子の発現パターンを同定することに使用することができる。内在性プロモータは幹細胞の細胞運命について特異的分化状態または決定を伴うプロモータであってもよい。特定の実施形態では、挿入された配列は「セーフハーバ」（非必須遺伝子）遺伝子座に組込まれ、それによりゲノムを害することがなく、かつ、周囲の内因性調整配列からの偽性の調整をすることがなく目的の発現をさせることができる。
【０１４６】
発現は低分子などの外因性因子の導入で調整され、構成的な規則的系、組織特異性調整配列により挿入された配列を調整することができ、または誘導性系とともに用いてもよい。幹細胞に挿入された配列はタンパク質コード配列および／または系譜特異的レポーターコンストラクト、目的とする他の遺伝子に対する一般的リポーター遺伝子の挿入、細胞運命決定に含まれる遺伝子に対するリポーター、およびミクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）、ｓｈＲＮＡｓ、ＲＮＡｉｓなどの非タンパク質コード配列プロモータおよび調整配列を含んでもよい。
【０１４７】
ゲノムの指定領域に組込まれたトランス遺伝子を含有する幹細胞（系譜特異的または細胞運命リポーター、タンパク質コード配列など）を種々の分化の研究、分化細胞の精製およびタンパク質産生などに使用することができる。例えば、系譜特異的または細胞運命リポーターをあらゆる型の幹細胞に標的挿入することで、分化研究用と細胞画分精製用に使用することができる。従来の組込み法でリポーターカセットを宿主細胞ゲノムに無作為に組込む。隣接配列からの位置効果はリポーター遺伝子発現に影響を与え、大きくかつ変動する背景またはトランス遺伝子サイレンシングを起こす。従って、本明細書に記載の幹細胞では標的組込みリポーターカセットは同様のクロマチン環境を有し、従って異なる細胞においても均一に発現する。加えて、標的組込みは幹細胞から選択された細胞系譜成熟のみにおいてトランス遺伝子の発現（例えば、系譜特異的または細胞運命リポーターコンストラクト）を可能にさせる。
【０１４８】
また、本明細書に記載の幹細胞は選択された座において内因性調整配列により駆動される遺伝子産物（例えば、系譜特異的または細胞運命遺伝子）が発現するように、プロモータ欠損コンストラクトが内因性遺伝子座に組み込まれる細胞を含有し、これにより当該座を細胞運命または発生系譜に変換する。
【０１４９】
系譜特異的または細胞運命リポーターを標識する幹細胞は、幹細胞の集団を目的の特定の細胞系譜経路から系譜特異的または成熟細胞型への駆動をおこなうことができ、幹細胞または低分子などの化合物のスクリーニングおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法に使用することができる。また、系譜特異的または細胞運命リポーターを標識する幹細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ位置、さらに最終的には最終位置、全般的な生体内分布、分化運命、および被験対象に導入した後の幹細胞の組織組込みの機序を追跡するトラッキングシステムに使用することができる。配列は宿主細胞の１つ以上の対立遺伝子に挿入してもよく、あるいは、異なる対立遺伝子は異なる挿入配列を含んでもよい。
【０１５０】
幹細胞はリポータータンパク質（例えば、ＨＴＫ）を標識することも、または挿入配列を自殺カセットの導入用にも使用できる。加えて、非分化細胞内または望まない細胞系譜へ分化した細胞内のいずれかで制御をする調整要素の制御下で自殺遺伝子を挿入して分化細胞集団の精製を実現することもできる。次に、分化に影響する可能性がある低分子または他の因子についてスクリーニングと特性研究にこの精製された亜集団を使用できる。いくつかの実施形態では、自殺カセットは大きな細胞集団からの細胞の特異的な型の分化亜集団同定および単離を促進することに使用される。別の実施形態では、自殺カセットはｉｎ ｖｉｖｏで望ましくない状態に例えば、細胞が分化し奇形腫が形成された場合、分化した幹細胞を破壊することに使用する。
【０１５１】
また、特定の疾患の患者からの患者由来ｈｉＰＳＣｓをヒト疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのモデルを作るのに使用することができる。遺伝子操作されたｈＥＳＣｓおよびｈｉＰＳＣｓは分化パラダイムの向上、疾患関連遺伝子の過剰発現、さらには機能喪失経験による疾患経路の研究に使用することができる。
【０１５２】
野生型か患者由来かのいずれかにおいて、リポータータグ化幹細胞は細胞の選択された同質セット中で疾患過程研究をすることに使用することができる。例えば、特定の組織中の特定の疾患の病態に関係があると知られている遺伝子からのプロモータは、本明細書に記載したようにリポーター遺伝子に結合し、かつ、幹細胞に導入されている可能性がある。選択された細胞型に幹細胞が分化した後、リポーター系はこの同質の細胞集団における疾患を研究することに使用することができる。この細胞はタグ化遺伝子の発現を調節する化合物のスクリーニングに使用することができる。または、組織特異的毒性（例えば、肝細胞のｐ４５０）に関係があると知られている遺伝子に結合したリポーターは、標識された幹細胞から分化した標的細胞の整合する同質の集団に対する薬物の安全性をスクリーニングするツールとして使用することができる。
【０１５３】
同様に、１つ以上のポリペプチドを発現する幹細胞はタンパク質補充遺伝子療法向けの細胞ビヒクルとして使用することができる。コンストラクトが無作為に宿主細胞ゲノムに組込まれる従来の組込み方法に比較して、本明細書に記載の特定の部位へのコンストラクトの組込みは、例えば、系譜特異的または細胞運命リポーターコンストラクトの場合、コグネート系譜特異的細胞型または成熟細胞型に分化した場合のみ正しい発現を可能にし、タンパク質発現コンストラクトの場合は、集団の細胞間の均一な発現を可能にする。幹細胞へのコード配列の標的挿入はタンパク質補充遺伝子療法向けの細胞ビヒクルを提示する一方で、非特異的組込みにより起こる挿入変異のリスクを最低化または除去する。治療タンパク質の特異的組込みを含有する幹細胞は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、血友病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、やけど、肺疾患、鎌状赤血球貧血、臓器不全、心疾患、糖尿病、関節炎、Ｇａｕｃｈｅｒ病、Ｆａｂｒｙ病、常染色体劣性遺伝病ムコ多糖症およびポンペ病などの各種の疾患または病態の治療に使用してもよい。例示のみであるが、利用可能性がある治療タンパク質をコードする遺伝子は第ＩＸ 因子、エリスロポイエチンなどを含んでもよい。加えて、突然変異内因性遺伝子をもつドナー由来の幹細胞への遺伝子の野生型複製物の挿入で種々の治療が行われる。
【０１５４】
他の実施形態では、２つの内因性遺伝子に結合した２つのリポーターをもつ幹細胞が構想されている。１つのリポーターは特定の細胞運命に向かう細胞を単離することに使用できる。第２の標識は所望の系譜特異的または成熟分化細胞において発現が知られている遺伝子に結合している。このように、特定の代謝経路に関係していると知られているタグ化内因性遺伝子を含有する分化細胞を産生することができる（例えば、膵β細胞におけるインシュリンの産生）。
【０１５５】
二重タグ化幹細胞は、分化細胞集団から癌幹細胞への進展などの複雑な経路を研究することに使用できる。上述したように、分化細胞は細胞運命リポーターに結合したリポーター遺伝子を用いて幹細胞集団から単離することができ、さらに、どのような外的または内的条件が細胞を癌幹細胞株に脱分化させる可能性があるのかを決定する作業において第２リポーターを脱分化標識に結合することができる。
【０１５６】
上述した細胞系譜または細胞運命のリポーターを用いて単離された分化細胞集団は、細胞が潜在的に混乱する幹細胞様状態に戻り始める場合には、脱分化が自殺遺伝子を誘発し細胞を殺すように脱分化標識に結合した自殺標的を含有する第２の標識遺伝子を持つことができる。潜在的に、このことは治療としてのｉｎ ｖｉｖｏでの幹細胞の使用に関して安全性の懸念を提示することになる。
【０１５７】
従って、本開示は配列（例えば、系譜特異的または細胞運命リポーターコンストラクトまたはポリペプチドコード配列）を幹細胞、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ブタまたはラットの細胞に組込む方法および組成物を提供する。コンストラクトの標識組込みは目的の領域内におけるゲノムの標識２本鎖切断により促進される。目的の領域内さらには切断ドメインまたは切断半ドメイン内の選択した配列に結合するように操作することができるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含有する融合タンパク質の使用により特定の部位を標的として切断がなされる。そのような切断は切断部位またはその近傍で外因性ポリヌクレオチド配列の標的組込みを刺激する。系譜特異的または細胞運命リポーターコンストラクトが幹細胞に組込まれている実施形態において、典型的にはリポーターコンストラクトはリポーター配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された分化の間に発現した遺伝子からのプロモータを含む。
【０１５８】
以下の実施例は本発明の特異的な実施形態を定める。系譜特異的分化の標識である他の遺伝子からの他の細胞特異的調整性領域はａＰ２を置換することができ、かつ、本発明の範囲から離れることなく種々のリポータータンパク質、培養条件および単離方法を置換することができることに留意しなければならない。同様に、Ｅｐｏ以外またはＥｐｏに加えたポリペプチドコード配列は幹細胞ゲノムの特定の領域に組込まれることができることを認識しなければならない。
【実施例】
【０１５９】
実施例１ 脂肪細胞特異的リポーターの標的組込み
脂肪細胞特異的リポーターコンストラクトは脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質のａＰ２またはＡＬＢＰをＧＦＰリポーター配列に作動可能に連結したプロモータ配列により 生成された。例えば、ヒト、マウスおよびニワトリ ａＰ２プロモータ配列を記載し、参照により本明細書において援用するＣｒｅａｓｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４（１３）：２５９７−２６０６を参照。
【０１６０】
簡単に述べれば、マウスａＰ２遺伝子の６００ｂｐエンハンサーおよび２００ｂｐ基本プロモータをクローニングして連結した。続いて、連結したａＰ２制御要素を米国特許出願第１２／２８８，８４７に記載されているようにＣＣＲ−ＬＶＧＦＰと名づけられたＩＤＶＬレンチウイルスベクターにおいてｈＰＧＫプロモータの代わりにクローニングした。ＣＣＲ５−ａＰ２−ｅＧＦＰと名付けられ、得られたリポーターコンストラクトはＧＦＰの発現を駆動し、かつＣＣＲ５遺伝子に相同性を示す配列に隣接したａＰ２制御要素（プロモータ／エンヘンサー）を含む。図１を参照。加えて、ａＰ２‐ＧＦＰリポーターカセットに隣接するＣＣＲ５相同アームを含有する組込み型レンチウイルスベクターを制御として構築した。
【０１６１】
組込み型および組込み欠損レンチウイルスドナーコンストラクトを異なるＭＯＩでのＣＣＲ５を標的としたＡｄ５／Ｆ３５組換えベクターにより送達されたＣＣＲ−５特異的ＺＦＮｓの存在下でヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）に分離して形質導入した。参照により本明細書において援用するＡｄ５／Ｆ３５ベクターによる送達されるＣＣＲ−５特異的ＺＦＮｓについては米国特許公報第２００８０１５９９９６号を参照。４継代の後、ゲノムＤＮＡを形質導入細胞から単離し、さらにＣＣＲ５遺伝子座でａＰ２−ｅＧＦＰ発現カセット標的組込みを検知するためにＰＣＲを実施した。図２は、組込みの結果を示す。「１００％」、「３０％」、「１０％」等から「１％」まで標識されたレーンは混合物が「１００％」、「３０％」、「１％」までの標的組込みのいずれかの結果を刺激するように作製されスパイクされた制御を示す。レーンの下部にはＰＣＲにより検出された結果を示す。「Ｄのみ」はレンチウイルスドナーのみ（ＺＦＮｓを用いない）で形質導入した細胞を示す。上方のパネルはプライマーがドナーアームの外側の領域（「外側ＰＣＲ」）に特異的であるＰＣＲ実験の結果を示す一方で、中間のパネルは１つのプライマーが相同アームの外側の領域に特異的であるが、他の１つはドナー配列内の領域（「インーアウトＰＣＲ」）に特異的であるＰＣＲ実験の結果を示す。
【０１６２】
図２に示したように、明瞭なＰＣＲバンドがレンチウイルスドナーとＡｄＺＦＮの両方で形質導入された細胞からのすべての試料において認められた。制御として等量のＤＮＡがＰＣＲ反応に装填したのかを検証するＧＡＰＤＨ‐特異的ＰＣＲを実施された。
【０１６３】
さらに、組込み型リポーターコンストラクトを有する細胞については、ｈＭＳＣｓのｉｎ ｖｉｔｒｏ脂肪細胞または骨細胞の分化後にＧＦＰ発現を測定した。組込み欠損性リポーターを含有する細胞において、未分化細胞または分化した骨細胞にもＧＦＰシグナルは認められないが一部の分化した脂肪細胞で明瞭なＧＦＰシグナルが認められた。図３を参照。無作為な組込みＣＣＲ５ ａＰＣ２−ｅＧＦＰドナーレンチウイルスベクターを含有する細胞において、分化が無い場合でもゲノムに無作為に組込みされた場合にはベクターからの位置依存性漏出性発現を示し確認できる弱いバックグランドＧＦＰ発現が認められる。図４を参照。明瞭なＧＦＰシグナル上昇は脂肪細胞が分化する時に認められる。この結果は脂肪細胞においてマウスａＰ２プロモータ特異性を示すだけでなく、リポーターａＰ２−ｅＧＦＰ発現はゲノムの位置効果に影響を受けることを示している。
【０１６４】
上述の結果を評価するために、未分化細胞および脂肪細胞と骨細胞分化させた細胞についてＧＦＰ発現の測定をした。組込み型レンチウイルスベクター形質導入細胞についてＧＦＰ発現レベル上昇のみが認められたが、脂肪細胞分化の間、ＧＦＰ陽性細胞の割合が増加することはなかった。対照的に、ＣＣＲ５でａＰ２−ｅＧＦＰ標的組込み型を有するｈＭＳＣｓはＧＦＰ陽性細胞の割合の上昇とＧＦＰ発現レベルの上昇の両方を示した。
【０１６５】
この結果は核酸系譜特異的リポーター標識においては無作為組込みより標識遺伝子の挿入を標的化とすることの明瞭な利点を示す。
【０１６６】
実施例２ ＥＰＯコード配列の標的組込み
ＣＣＲ５遺伝子に相同である配列に隣接するｅＧＦＰ（ＰＧＫ−ｅＧＦＰ）のＰＧＫプロモータ駆動発現 またはＥＰＯおよびｅＧＦＰ（ＰＧＫ‐ｍＥｐｏ−２Ａ‐ｅＧＦＰ）のいずれかを含有して、レンチウイルスドナーベクター（組込み型または非組込み型）を生成した。図５Ａおよび米国特許出願第１２／２８８，８４７号を参照。
【０１６７】
ジャーカットおよび骨髄由来のＫ５６２ヒト細胞株およびヒト間葉系幹細胞（ＢＭ‐ＭＳｃ）をＩＤＬＶ ＣＣＲ５標的化ドナー（ＰＧＫ‐ｅＧＦＰまたはＰＧＫ‐ｍＥｐｏ‐２Ａ‐ｅＧＦＰカセット）のみで、または指示されたＭＯＩにおいてＺＦＮ発現Ａｄ５／Ｆ３５との組み合わせで形質導入し、さらに、形質導入から１カ月後にＦＡＣＳでＧＦＰ発現を解析した。ＣＣＲ５ Ａｄ５／３５ ＺＦＮｓの完全な記述については参照により本明細書において援用する米国特許公報第２００８０１５９９９６号を参照。ｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ， Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを参照）によって定量化される７５ｎｇ／ｍＬのＩＤＬＶを使用した。図６に示したように、ジャーカットおよびＫ５６２ヒト細胞株（図６Ａ）およびヒト間葉系幹細胞（図６Ｂ）のＦＡＣＳ解析はドナーコンストラクトの標的組込み後、（ＭＯＩに依存するが）３５％超のジャーカット細胞、約１５％のＫ５６２細胞および約１５％から５０％のヒト間葉系幹細胞がＧＦＰを発現したことを示した。
【０１６８】
加えて、１カ月の導入後ゲノムＤＮＡを形質導入した細胞から単離し、ＣＣＲ５遺伝子座においてドナー標的組込みの検出のためにＰＣＲを実施した。図７で示したように、ジャーカットおよびＫ５６２細胞（図７Ａ）およびヒト間葉系幹細胞（図７Ｂ）におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）の存在下で標的組込みを示す明瞭なＰＣＲバンドが認められた。
【０１６９】
さらに、形質導入されたｈＭＳＣｓの培地でのＥｐｏタンパク質濃度を計測した。簡単に述べれば、ｅＧＦＰおよびｍＥｐｏ−２Ａ−ｅＧＦＰ発現カセットについてレンチウイルス（ＬＶ）か、またはＡＤ．ＺＦＮとＩＤＬＶドナーの両方かで、形質導入後１カ月での１００％ｅＧＦＰ陽性ＩＤＬＶドナー処理ｈＭＳＣｓから得た２４時間、馴化培地でＥＬＩＳＡを実施した。図８で示したように、組込み型または非組込み型レンチウイルスドナーコンストラクトで形質導入したｈＭＳＣｓから得た培地でＥｐｏタンパク質を検出した。
【０１７０】
実施例３ ＺＦＮ修飾幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
さらに、ヒトＭＳＣｓ発現ｍＥｐをマウスに投与し、かつ、ヘマトクリットに対する効果ならびにＥｐｏの血漿中濃度を測定した。簡単に述べれば、ＬＶ‐ｅＧＦＰまたはＬＶ−ｍＥｐｏ‐２Ａ‐ｅＧＦＰで修飾した１０6ｈＭＳＣｓか、Ａｄ．ＺＦＮとＩＤＬＶドナー（ｅＧＦＰまたはｍＥｐｏ．２ＡｅＧＦＰ発現カセット）の両方のいずれかで修飾した１０7ｈＭＳＣｓのいずれかを用いてＮＯＤ／ＳＣＩＤγＣマウスにＩＰ注射した。ＬＶ形質導入した細胞がＩＤＬＶ形質導入した細胞よりも１０倍大きな可溶性Ｅｐｏ発現を示すＥｐｏ−ＥＬＩＳＡに従って注射されたＭＳＣｓの数を決定したが、これはＩＤＬＶドナーと比べた場合の組込まれたドナーＤＮＡの数の増加が原因とおもわれる。６０日の間に末梢血を下顎静脈から採取した。ヘマトクリット値を測定し、血漿Ｅｐｏ値をＥＬＩＳＡで測定した。
【０１７１】
図９Ａと図９Ｂに示したように、ヘマトクリットの上昇（図９Ａ）と可溶性血漿タンパク質の上昇（図９Ｂ）の両方で証明しているようにＥｐｏタンパク質発現のレベルにおいてＩＤＬＶドナーコンストラクトで形質導入したｈＭＳＣｓが検出可能な上昇を示した。
【０１７２】
この結果は、目的のポリペプチドコード配列を幹細胞導入することができ、かつ形質導入した幹細胞の投与でポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで発現することを示した。
【０１７３】
実施例４ リポーターコンストラクトのヒトＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）遺伝子座への標的組込み
マウスＯＣＴ４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１でも知られる、以下ヒトＯＣＴ４という）のヒトオーソログを標的するため、ヒトＯＣＴ４遺伝子（表３）の第１イントロンにおける固有な配列を認識する４つのＺＦＮ対（下の表２を参照）を設計した。ヒトＯＣＴ４を標的としたＺＦＮｓを設計し、本質的に、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１， Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ （２００８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（７）： ８０８−８１６， および米国特許公報 ２００８／０１３１９６２に記述されているプラスミドに組込んだ。
【０１７４】
【表１０】
【０１７５】
【表１１】
【０１７６】
二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を予想したゲノム標的位置に導入する個別のＺＦＮ対の効率を測るために、それぞれのＺＦＮ対を一過的にｈＥＳＣｓに発現させた。細胞培養技術はすでに記載されている（Ｓｏｌｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｃｅｌｌ ３６： ９６４−９７７）。ｈＥＳＣｓ培地［１５ ％ ＦＢＳ （Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） 、５％ ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ ｍＭ グルタミン （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ 非必須アミノ酸 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ ｍＭ -メルカプトエタノール （Ｓｉｇｍａ）および４ ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２ （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）］でマイトマイシンＣ不活性マウス胚線維芽（ＭＥＦ）フィーダー層上にｈＥＳＣｓ株ＢＧ０１（ＮＩＨ Ｃｏｄｅ： ＢＧ０１； ＢｒｅｓａＧｅｎ， Ｉｎｃ．， Ａｔｈｅｎｓ， ＧＡ）を維持する。手動または酵素的にＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； １．５ ｍｇ／ｍｌ）で５日から７日ごとに培養を継代培養した。記載されているように（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３：３４６−３５３）ＧＦＰ発現カセットをＦＵＷ−Ｍ２ｒｔＴＡレンチウイルスにクローン化した。簡単に述べれば、先に記載されているように（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１５１−１５９）２９３細胞にＶＳＶＧ外層を持つレンチウイルスを生成した。培地を形質移入後１２時間でかえて、ウイルスを含有する上清を形質移入後６０時間から７２時間後に回収した。ウイルス上清を０．４５μｍフィルターで濾過した。ウイルスを含有する上清をコラーゲナーゼ処理および連続洗浄でフィーダ細胞から分離したｈＥＳＣｓ集合体を感染させるのに使用した。２μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で２回連続の感染を懸濁液に１２時間実施した。フィーダに感染後、ｈＥＳＣｓ細胞集合体を再度プレーティングした。２日間ドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； ２ μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した細胞のｅＧＦＰおよびＳＳＥＡ４についてＦＡＣＳ解析を用いて感染効率を計測した。形質導入した細胞を濃縮するために、ＲＯＣＫ抑制剤（ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ； ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で標的され感染されたｈＥＳＣｓを、ドキシサイクリン誘発後ｅＧＦＰ発現細胞を単一細胞溶液として２日間ＦＡＣＳ選別し、ＥＳＣ培地を含有するＲＯＣＫ抑制剤中で再プレーティングした。
【０１７７】
標的部位のＺＦＮ仲介破壊の頻度をＣＥＬ‐Ｉミスマッチアッセイで解析し、製造者の指示書（Ｔｒａｎｇｅｎｏｍｉｃ ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））に本質的に従って実施した。４つのテストしたＺＦＮ対のうち３つは効率的にＤＳＢをヒトＯＣＴ４遺伝子座の予想した位置に導入することができた。
【０１７８】
この３つのＺＦＮ対に対応してＤＳＢ標的部位に隣接する約７００ｂｐのヒトＯＣＴ４配列をカバーする５’と３’の相同領域を有するドナープラスミドを設計した。このドナープラスミドは、２Ａ自己切断ペプチド配列をピューロマイシン耐性遺伝子（ピューロマイシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼ）、そして続けてポリアデニル化配列に接続させているスプライス受容体ｅＧＦＰカセットを含めた（図１０Ａ）。このドナーコンストラクトをヒトＯＣＴ４遺伝子座の第１イントロンへ正確に標的化するこで、２つのタンパク質の発現になると予想されるが、それらはｅＧＦＰ（ＯＣＴ４ＥＸ１−ｅＧＦＰ）に融合するヒトＯＣＴ４の第１１３２ａａからなる融合タンパク質、およびピューロマイシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼであり、両方とも内因性ヒトＯＣＴ４プロモータの転写制御下においてである。独立した細胞株を作るために拡張したピューロマイシン選択の１４日後に、１０ｘ１０6ｈＥＳＣｓ（ＢＧＯ１）に対するそれぞれのＺＦＮ対を有するドナープラスミドのコエレクトロポレーションがコロニーをもたらした。適切な酵素で制限消化後に０．７％アガロースゲル上で分離されたゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット分析を行い、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、さらに32Ｐランダムプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）標識プローブとハイブリタイズした。ｅＧＦＰ（図１０Ｂを参照）に対する内部プローブと同様に、ドナー相同性に対する外部プローブ３’および５’を使用した。
【０１７９】
表４に示したように、単離され、かつ拡張されたピューロマイシン耐性ＺＦＮ処理クローンを典型的に、正確に、かつ効率的に標的した。
【０１８０】
【表１２】
【０１８１】
多能性状態を維持したＯＣＴ４ＥＸ１-ｅＧＦＰ標的細胞を確認する場合、ｈＥＳＣｓの特徴として知られる多能性マーカーであるＮＡＮＯＧ，ＳＯＸ２、Ｔｒａ-１-６０およびＳＳＥＡ４を検討するためにそれらを免疫染色した。簡単に述べれば、以下の第1抗体を使い標準の規約に従って細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し免疫染色した：ＳＳＥＡ４ （マウスモノクローナル， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）； Ｔｒａ−１−６０， （マウスモノクローナル， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）； ｈＳＯＸ２ （ヤギポリクローナル， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）； Ｏｃｔ−３／４ （マウスモノクローナル， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）； ｈＮＡＮＯＧ （ヤギポリクローナル Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ） 、さらに適切なＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素複合体第２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０１８２】
さらに、ＳＣＩＤマウスに注射した場合、この細胞は多能性状態を確認しながら３つの発生過程の胚葉すべてから起因する細胞型に分化できる奇形腫を誘導した。ｈＥＳＣｓをコラーゲナーゼ処理（１．５ｍｇ／ｍｌ）で回収し、培地をその後での洗浄および重力による沈降によりフィーダ細胞から分離した。遠心分離によりｈＥＳＣｓ集合体を回収し、２５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁した。ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の背中にｈＥＳＣｓを皮下注射した。一般的に、腫瘍が４週から８週の間に発生し、腫瘍のサイズが直径１．５ｃｍを超える前に動物を犠牲にした。犠牲にした後で奇形腫を単離し、ホルマリンに固定した。切断後、ヘマトキシリン−エオシン染色に基づき奇形腫を検査した。
ｈＥＳＣｓ中でヒトＯＣＴ遺伝子座の正確な標的化、内因性プロモータの制御下でのＯＣＴ４ＥＸ１‐ＧＦＰの発現、およびヒトＯＣＴ４の発現を機能的にバリデートするために、予想されたＯＣＴ４ＥＸ１‐ｅＧＦＰ融合タンパク質をＯＣＴ４およびｅＧＦＰについての抗体を用いてウエスタンブロット解析で確認した（図１０Ｃ）。簡単に述べれば、ｈＥＳＣｓをコラーゲナーゼ処理で（１．５ｍｇ／ｍｌ）回収し、培地をその後での洗浄および重力による沈降によりフィーダ細胞から分離した。トリプシン処理でｈＥＳＣ由来線維芽細胞を回収した。細胞を遠心分離によりベレット化し、１ｘＰＢＳで洗浄し、さらに遠心分離により回収した。氷冷噴霧緩衝液（プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ， Ｒｏｃｈｅ）を添加した５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）， ２０％ グリセロール， １ ｍＭ ＥＤＴＡ， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．０２％ ＳＤＳ， １ ｍＭ ジチオスレイトール ［ＤＴＴ］， ２ ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ［ＰＭＳＦ］）中で細胞を溶解した。氷冷５分後、最終的な［ＮａＣｌ］を４００ｍＭにするために５Ｍ ＮａＣｌを添加した。さらなる氷冷５分後、等容の氷冷水を添加し、遠心分離をすぐに始める前に微量遠心管（１４ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ）中で完全に混合した。上清のタンパク質濃度をブラッドフォード法で測定し、４％から１２％ビス−トリス勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１５μｇのタンパク質を分離した。ＰＶＤＦ膜に移し、ＯＣＴ４（マウスモノクローナル抗体、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＧＦＰ（Ｒｂｔ ｐＡＢ ｔｏ ＧＦＰ Ａｂｃａｍ ａｂ２９０−５０）抗体で探索後、ＺＦＮ処理細胞がＯＣＴ４ＥＸ１−ｅＧＦＰタンパク質を様々なレベルで発現した。
【０１８３】
最終的に、トランス遺伝子発現が適切に調整されているかをテストするために、標的ｈＥＳＣｓを線維芽細胞に分化させ、分化細胞にはＯＴＣ４およびＯＣＴ４ＥＸ１−ｅＧＦＰタンパク質が存在しないことを発見した（図１０Ｃ）。ＥＢ誘導分化では、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｈＥＳＣｓコロニーを採取し、ＭＥＦフィーダ細胞から重力で分離し、１５％で添加したＤＭＥＭに非接着懸濁液培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で緩やかに７日間圧潰し培養した。接着組織培養ディッシュにＥＢｓをプレーティングし、実験開始前に少なくとも４つの継代培養にトリプシン処理をしてプライマリ線維芽細胞プロトコルに従い継代培養した。さらに、０．５μｇ／ｍｌまで低いピューロマイシン濃度では生存できなことが証明されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導線維芽細胞がピューロマイシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼを発現することはなかった。
【０１８４】
この結果はＺＦＮ介在遺伝子標的化がヒトＥＳ細胞の多能性状態に関するレポーター系を生成するのに効率的に使用できることを示す。
【０１８５】
実施例５ ヒトＥＳ細胞におけるセイフ―ハーバー遺伝子座の高効率組入れ
部位特異的クローン多様化および後成的サイレンシング効果がなくトランス遺伝子の画定された過剰発現をする信頼性が有り使いやすい発現系の欠如がｈＥＳＣｓにおける過剰発現の研究を阻んでいる。染色体１９のＡＡＶＳ１遺伝子座は先に記述したが、トランス遺伝子サイレンシングが無く多数形質転換され、かつ初代細胞株においてトランス遺伝子を安定的に発現させるのに使用し続けてきた最も良く特徴付けされている遺伝子座を表す（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：４９６−５０４）。この遺伝子座はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ）に関するウイルス組込み部位として同定されており、プロテインホスファターゼ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）の調節サブユニット１２Ｃをコードする遺伝子を妨げる。さらに、アデノ随伴ウイルス遺伝子送達技術を用いてＡＡＶＳ１遺伝子座で標的されているｈＥＳＣｓが長期間のトランス遺伝子発現を示し、かつ多能性状態を維持した（（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ｉｂｉｄ）。
【０１８６】
ｈＥＳＣｓ培養に好適で堅牢な過剰発現系を構築するために、形質転換された多数の細胞株において効率的にトランス遺伝子をＡＡＶＳ１に標的する、先に設計され使用してきたＺＦＮ対を使ってＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの第１イントロンを標的する（米国公報ＵＳ ２００８０２９９５８０を参照）。
【０１８７】
２つの異なる標的化戦略を用いてヒトＥＳ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座を標的した。ＡＡＶＳ１遺伝子座のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子をｈＥＳＣｓ中で発現させているので、ＯＣＴ４を標的として使ったものと類似するスプライス受容体−ピューロマイシン選択カセットを用いてプロモータなしのドナーコンストラクトを設計した（図１１Ａ）。ＺＦＮ仲介標的化の高い効率は遺伝子トラップアプローチの使用に制限されるのか、またはプロモータ駆動選択カセットにより達成できるのかをテストするために、ヒトホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータによりピューロマイシン選択カセットを含有する第２のＡＡＶＳ１ドナープラスミドを構築した（図１１Ａ）。並行実験において、ＡＡＶＳ１遺伝子座に対する２つのドナープラスミドおよびＺＦＮｓを使用してＢＧＯ１ｈＥＳ細胞をエレクトロポレーションし（米国特許出願第２００８０２９９５８０号に詳しく説明）、ピューロマイシン耐性コロニーのために選択した。
【０１８８】
予想通り、プロモータなしの標的化ドナープラスミドではＰＧＫ−ピューロマイシンカセットをはこぶドナープラスミドよりもピューロマイシン耐性クローンがより少なく（約５０％）回収した。サザンブロット分析により、両方のアプローチではＡＡＶＳ１遺伝子座において正しいヘテロ接合体標的化事象になったことが確認された（図１１Ｂ）。加えて、両方のアプローチはホモ接合体標的クローンを回収し、ここでサザンブロット分析が両方のＡＡＶＳ１対立遺伝子が正しい組込みパターンであることを示した。 標的化効率の定量化は、一方または両方の対立遺伝子において約５０％のピューロマイシン耐性クローンが正しく標的していることを示した（表５）。表５の最初の６行に示された結果はＢＧＯ１細胞における結果、最後の３行に示した結果は ｉＰＳ ＰＤ２lox‐１７Ｐｕｒｏ−５細胞で実施された実験のものである。標的化の高い効率を両方のドナープラスミドで達成し、外因性プロモータ駆動選択カセットを使用する場合にＺＦＮ標的化を効率的に達成することができることを示した。
【０１８９】
【表１３】
【０１９０】
実施例４で述べたＯＣＴ４標的化のように、標的とされてもクローンの一部は追加的組込みを伴う（表５）。大半のクローンは一方または両方のＺＦＮ‐標的対立遺伝子に正しく標的されており、かつ、無作為に組込まれたＤＮＡを欠いているので、さらなる分析がされていない。重要なことには、テストされたすべてのＡＡＶＳ１−標的ｈＥＳＣｓは、多能性マーカーおよび奇形腫の形成アッセイについての免疫蛍光染色に基づき正常な核型および多能性状態を維持した。
【０１９１】
次に、ｈｉＰＳＣｓ中でＺＦＮアプローチが遺伝子を標的にすることに使えるかどうか確認することをした。この点について、ｈＥＳＣｓについて上述したものと同じ戦略を用いてパーキンソン病の患者から先に生成されたｈｉＰＳＣ株中のＡＡＶＳ１遺伝子座を標的として行った（Ｓｏｌｄｎｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｃｅｌｌ １３６：９６４−９７７）。表５に示した通り、スプライス受容体とＰＧＫプロモータ駆動ピューロマイシンカセットの両方を用いるＺＦＮ-介在標的化は、ｈＥＳＣｓの場合と同様の効率でヘテロ接合体およびホモ接合体の正しい標的クーロン（図１２）になった。
【０１９２】
実施例６ ＡＡＶＳ１遺伝子座へ組込まれた遺伝子の発現
ＡＡＶＳ１遺伝子座がヒトＥＳ細胞においての誘導性トランス遺伝子過剰発現系を発生することに使用できるかを調べる。最小ＣＭＶプロモータおよび赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）ｃＤＮＡ（ＴｅｔＯ‐ＲＦＰ）を駆動するテトラサイクリン応答エレメントで構成する追加的発現カセットを含有するために、先に使用したプロモータなしのＡＡＶＳ１ドナープラスミドを再設計する。このドナー分子に含有されるものは、３’末端でポリアデニル化シグナルに結合したＧＦＰ遺伝子をコードするヌクレオチド配列および５’末端で自己切断２Ａペプチドをコードする配列である（図１３を参照）。このようにして、ＧＦＰの発現は内因性プロモータによって駆動され、かつ、ドナー陽性クローンをスクリーニングすることに使用することができる。ドナーコンストラクトをｈＥＳ細胞の代行システムとして働くＫ５６２細胞に形質移入する。ＤＯＸに細胞を反応させるために、Ｍ２ｒｔＴＡ逆トランスアクチベーターを伴うレンチウイルスで正しく標的したＫ５６２ｓを形質導入する。ＲＦＰ発現はＤＯＸの追加およびＭ２ｒｔＴＡの存在に依存する。
【０１９３】
実施例７ ヒトＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓにおけるＰＩＴＸ３遺伝子座の標的
外因性選択カセットをｈＥＳＣｓおよびｈｉＰＳＣｓ中でＡＡＶＳ１遺伝子座を効果的に標的することに使用することができるという観察により、ｈＥＳＣｓおよびｈｉＰＳＣｓ中で発現しない遺伝子を修飾することにＺＦＮｓを使用することができるかどうかを検討することとした。この点を検討するために、ｈＥＳＣｓではなくドーパミン作動性ニューロンなどの分化細胞に発現する転写因子をコードする遺伝子であるＰＩＴＸ３の第１コードエキソンに対して２つのＺＦＮ対を生成した。ＰＩＴＸ３ ＺＦＮｓおよびその標的部位を下記の表６と表７に示す。
【０１９４】
【表１４】
【０１９５】
【表１５】
【０１９６】
ＰＩＴＸ３‐ｅＧＦＰノックイン細胞を生成するために、予測されたＺＦＮ標的部位に隣接する約８００ｂｐの５’と３’の相同配列を含有し、かつ、ＰＩＴＸ３の第１コードドエキソンに相同性を含有するドナープラスミドを構築する。ＰＩＴＸ３リポーターを生成するために、ＰＩＴＸ３オープンリーディングフレームをポリアデニルシグナルに続いてＲＦＰのリーディングフレームに結合させる。従って、ＲＦＰの発現はＰＩＴＸ３プロモータおよび、それらが活性の場合は随伴ｃｉｓ 調節因子により駆動する。３’相同アームの上流ではＰＧＫ‐ＧＦＰスクリーニングカセットをｌｏｘＰ部位に隣接するように位置を定める（図１５）。上述したように、このコンストラクトはｈＥＳまたはｈｉＰＳＣｓに形質移入する。
【０１９７】
ＰＧＫ‐ＧＦＰスクリーニングカセットに起因する転写干渉のリスクを無くすために、その後カセットをＣｒｅ‐リコンビナーゼの一過性の発現により除去する。ＰＧＫ−ＧＦＰスクリーニングカセットを除去するために、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を採取し、さらに１ｘ１０7細胞をＰＢＳ中で再懸濁する。次いで、製造業者（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ： ２５０ Ｖ， ５００μＦ， ０．４ ｃｍ ｃｕｖｅｔｔｅｓ）の指示書に従ってｐＴｕｒｂｏ‐Ｃｒｅ（４０μｇ； Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ３３４８２７）およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１（１０μｇ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、ＥＧＦＰ発現細胞に関して単細胞懸濁液をＦＡＣＳ選別（ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ； ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）することでＣｒｅ‐リコンビナーゼ発現細胞を６０時間濃縮する。エレクトロポレーション後の１０日から１４日の間で個々のコロニーを拾う。このアプローチを用いることで細胞型特異的リポーター系を生成するためにｈＥＳ細胞中で発現しない遺伝子を標的し、および／または修飾することができる。
【０１９８】
実施例８ 第ＩＸ因子遺伝子座のＺＦＮ標的
第ＩＸ因子遺伝子座を標的するように設計したＺＦＮｓを下記のように構築した。第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓおよびその標的部位を下記の表８に示す。
【０１９９】
【表１６】
【０２００】
上記したように、図１６のＫ５６２細胞に関して三角形の短い辺が１μｇ、長い辺が４μｇである拡大する三角形で示され、ヌクレオフェクションについて１、２または４μｇのＺＦＮ対を用いることでＺＦＮ発現プラスミドをＫ５６２またはＨｐｅ３Ｂ細胞のいずれかに導入した。図１７はＨｅｐ３Ｂ細胞の類似のデータを示す。ヌクレオフェクションの３日後に、先に記載したように細胞を採取しゲノムＤＮＡを単離した。
【０２０１】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（ＣＥＬ−Ｉ）ヌクレアーゼアッセイでの解析を実施し、第ＩＸ因子特異的ＺＦＮ対がＫ５６２およびＨｅｐ３Ｂ細胞の予想した標的部位にＤＳＢｓを効率的に導入したことを図１６と図１７が示している。ＮＨＥＪで測定された修飾対立遺伝子の割合を各レーンの下部に示した。この結果はＫ５６２およびＨｅｐ３Ｂ細胞の両方においてヒト第ＩＸ因子に特異的なＺＦＮｓを効率的に切断することができることを示した。
【０２０２】
第ＩＸ因子遺伝子座の配列を導入する能力をテストするために、Ｎｈｅｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する短い（３０ｂｐ）タグ配列を包含するドナープラスミドを構築した。３０ｂｐタグの配列は5’-gctagcgatatcgtcgaccatatgggatcc-3’（配列番号６２）であった。イントロン１内にある内因性遺伝子のＺＦＮ標的部位に隣接する相同性の１０００ｂｐ領域がタグ配列を両側で隣接した。第ＩＸ因子特異的ＺＦＮｓおよび上述したドナーＤＮＡを含有するドナープラスミドについての発現カセットを伴うプラスミドでＫ５６２細胞を形質移入した。また、対照実験をＺＦＮ発現プラスミドの不存在下においてドナーＤＮＡを使用して実施した。ゲノムＤＮＡを３日後と１０後に抽出し、さらにドナーアームに相同である領域外の領域にハイブリタイズするプライマーを用いて放射標識したｄＮＴＰｓの存在下で第ＩＸ因子遺伝子座をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＮｈｅｌで消化し、この産物を５％ＰＡＧＥにより分離した。つぎに、ゲルをオートラジオグラフした。
【０２０３】
図１８はＮｈｅｌに対する修復ＤＮＡの感受性を示し、ＺＦＮ誘導二本鎖切断により望まれる核酸から内因性ヒト第ＩＸ因子遺伝子座への効率的で相同性をベースにした標的組込みに繋げることができることを示している。
【０２０４】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０２０５】
本開示について、理解を明瞭にする目的で、図示および実施例を用いてある程度詳細に提示したが、当業者には、本開示の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、種々の変更および修正が為され得ることが容易に明らかになる。従って、前述の記載および実施例を限定であるとみなしてはならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス遺伝子が遺伝子産物を含有し、さらに、幹細胞が系譜特異的細胞型または成熟細胞型に分化したときまたはその間、遺伝子産物が転写または翻訳されるようにトランス遺伝子が幹細胞のゲノムの特定の領域に組込まれる、トランス遺伝子を含む幹細胞。
【請求項２】
前記トランス遺伝子が、前記遺伝子産物に作動可能に連結された系譜特異的または細胞運命プロモータをさらに含む、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
系譜特異的または細胞運命遺伝子の発現が内因性プロモータにより駆動されるように、前記遺伝子産物がゲノムに組込まれる系譜特異的または細胞運命遺伝子を含む、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項４】
前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚幹細胞、ニューロン幹細胞、筋幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、誘導多能性幹細胞、およびこれらを組み合せたものからなる群から選択される、請求項１から請求項３のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項５】
前記幹細胞が哺乳動物幹細胞である、請求項１から請求項４のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項６】
前記幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、請求項５に記載の幹細胞。
【請求項７】
前記遺伝子産物がミクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）、ｓｈＲＮＡｓ、ＲＮＡｉｓおよびこれらを組み合せたものからなる群から選択されるＲＮＡ産物に転写されるタンパク質または配列を含有する、請求項１から請求項６のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項８】
前記トランス遺伝子がリコンビナーゼ部位で隣接される、請求項１から請求項７のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項９】
追加的なリポータ―コンストラクトをさらに有する請求項１から請求項８のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項１０】
選択された細胞型の細胞を単離する方法であって、該方法は、
遺伝子産物が前記選択された細胞型の細胞で発現する、請求項１から請求項９のいずれかに従う幹細胞の集団を培養し、かつ、
前記遺伝子産物を発現する細胞を単離し、それにより前記選択された型の細胞を単離すること、
を含む方法。
【請求項１１】
幹細胞の分化に対する化合物の効果を測定する方法であって、該方法は、
前記化合物の存在下および非存在下で請求項１から請求項９のいずれかに従う幹細胞の第１及び第２の集団を培養し、かつ
前記化合物の存在下で前記遺伝子産物の発現の違いが幹細胞分化に対する化合物の効果を示す、前記第１及び第２の集団における前記遺伝子産物の発現を評価することを含む方法。
【請求項１２】
幹細胞における遺伝子産物を産生する方法であって、該方法は、
配列が前記幹細胞内の非必須部位に組込まれる、請求項１から９のいずれかに従う幹細胞の集団を提供し、かつ、
前記培養された幹細胞の集団が前記遺伝子産物を均一に発現する、幹細胞の集団を培養することを含む方法。
【請求項１３】
治療が必要な被験対象の機能的な遺伝子産物の発現が減少することを特徴とする疾患を治療する方法であって、幹細胞が前記機能的な遺伝子産物を発現する、請求項１から請求項９のいずれかに従う幹細胞の集団を前記被験対象に投与することを含む方法。
方法。
【請求項１４】
前記疾患が血友病Ｂであり、かつ、前記タンパク質が第ＩＸ因子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記トランス遺伝子がプラスミド、線状ＤＮＡ、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いて前記幹細胞に導入される、請求項１０から請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
幹細胞の特定の領域へのトランス遺伝子挿入に伴う位置変化作用を減少または除去する方法であって、
前記特定の領域の一方の対立遺伝子において挿入された前記トランス遺伝子が調節可能なコンストラクトを含む遺伝子発現コンストラクトを含有し、かつ、前記特定の領域の他方の対立遺伝子が調節可能なプロモータについてのトランス活性化因子を含有する、幹細胞を提供することを含む方法。
【請求項１】
トランス遺伝子が遺伝子産物を含有し、さらに、幹細胞が系譜特異的細胞型または成熟細胞型に分化したときまたはその間、遺伝子産物が転写または翻訳されるようにトランス遺伝子が幹細胞のゲノムの特定の領域に組込まれる、トランス遺伝子を含む幹細胞。
【請求項２】
前記トランス遺伝子が、前記遺伝子産物に作動可能に連結された系譜特異的または細胞運命プロモータをさらに含む、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
系譜特異的または細胞運命遺伝子の発現が内因性プロモータにより駆動されるように、前記遺伝子産物がゲノムに組込まれる系譜特異的または細胞運命遺伝子を含む、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項４】
前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚幹細胞、ニューロン幹細胞、筋幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、誘導多能性幹細胞、およびこれらを組み合せたものからなる群から選択される、請求項１から請求項３のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項５】
前記幹細胞が哺乳動物幹細胞である、請求項１から請求項４のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項６】
前記幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、請求項５に記載の幹細胞。
【請求項７】
前記遺伝子産物がミクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）、ｓｈＲＮＡｓ、ＲＮＡｉｓおよびこれらを組み合せたものからなる群から選択されるＲＮＡ産物に転写されるタンパク質または配列を含有する、請求項１から請求項６のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項８】
前記トランス遺伝子がリコンビナーゼ部位で隣接される、請求項１から請求項７のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項９】
追加的なリポータ―コンストラクトをさらに有する請求項１から請求項８のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項１０】
選択された細胞型の細胞を単離する方法であって、該方法は、
遺伝子産物が前記選択された細胞型の細胞で発現する、請求項１から請求項９のいずれかに従う幹細胞の集団を培養し、かつ、
前記遺伝子産物を発現する細胞を単離し、それにより前記選択された型の細胞を単離すること、
を含む方法。
【請求項１１】
幹細胞の分化に対する化合物の効果を測定する方法であって、該方法は、
前記化合物の存在下および非存在下で請求項１から請求項９のいずれかに従う幹細胞の第１及び第２の集団を培養し、かつ
前記化合物の存在下で前記遺伝子産物の発現の違いが幹細胞分化に対する化合物の効果を示す、前記第１及び第２の集団における前記遺伝子産物の発現を評価することを含む方法。
【請求項１２】
幹細胞における遺伝子産物を産生する方法であって、該方法は、
配列が前記幹細胞内の非必須部位に組込まれる、請求項１から９のいずれかに従う幹細胞の集団を提供し、かつ、
前記培養された幹細胞の集団が前記遺伝子産物を均一に発現する、幹細胞の集団を培養することを含む方法。
【請求項１３】
治療が必要な被験対象の機能的な遺伝子産物の発現が減少することを特徴とする疾患を治療する方法であって、幹細胞が前記機能的な遺伝子産物を発現する、請求項１から請求項９のいずれかに従う幹細胞の集団を前記被験対象に投与することを含む方法。
方法。
【請求項１４】
前記疾患が血友病Ｂであり、かつ、前記タンパク質が第ＩＸ因子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記トランス遺伝子がプラスミド、線状ＤＮＡ、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いて前記幹細胞に導入される、請求項１０から請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
幹細胞の特定の領域へのトランス遺伝子挿入に伴う位置変化作用を減少または除去する方法であって、
前記特定の領域の一方の対立遺伝子において挿入された前記トランス遺伝子が調節可能なコンストラクトを含む遺伝子発現コンストラクトを含有し、かつ、前記特定の領域の他方の対立遺伝子が調節可能なプロモータについてのトランス活性化因子を含有する、幹細胞を提供することを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１２−５２３２３２（Ｐ２０１２−５２３２３２Ａ）
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０４６７４（Ｐ２０１２−５０４６７４）
【出願日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００１０６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１７４６４
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５０８２４１２００）サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド (28)
【出願人】（５０６１８８７６９）ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００１０６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１７４６４
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５０８２４１２００）サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド (28)
【出願人】（５０６１８８７６９）ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ (5)
【Ｆターム（参考）】
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