幹細胞をイメージングするための組成物及び方法
プロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び１以上の細胞が分化又は脱分化するのに応じて活性化又は不活性化する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでなる発現ベクターが提供される。かかる発現ベクターを含んでなる、幹細胞のイメージング及びモニタリングのための方法及びキットも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には細胞のイメージングに関し、さらに詳しくは、幹細胞中の新規な発現ベクターを用いて発現されたレポーター核酸配列をイメージングすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
生きている被験体における単一の細胞又は細胞群の非侵襲的で反復的なイメージングは、特に細胞ベース療法の分野では、インビボでの細胞の追跡のため決定的に重要である。細胞ベース療法、細胞トラフィッキング及び遺伝子療法研究を含む多くの用途において、正常生理学及び疾患進行を理解するために様々なイメージングモダリティーが使用されてきた。レポーター核酸配列を有する発現ベクターは、生きている被験体における遺伝子発現の非侵襲的な定量的イメージングの可能性を提供する。
【０００３】
分子及び細胞事象の複雑性及び動力学を解明するためには、単一又は複数レポーター遺伝子構築物の助けを借りて個々の細胞におけるレポーター遺伝子発現をイメージングすることが望ましい。イメージング用レポーター遺伝子は、各種の非侵襲的イメージング技法によって検出されるタンパク質をエンコードしている。レポーター遺伝子発現は、レポーター遺伝子のタイプに応じて光学イメージング、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用することで、生きている被験体においてイメージングすることができる。
【０００４】
幹細胞ベース療法は、特に再生医学の分野において多大の可能性を明らかにした。幹細胞ベース療法にとっての障害の１つは、使用した幹細胞を追跡するための効率的なモニタリング方法がないことである。幹細胞の分化状態のモニタリングは、治療効力並びに移植した幹細胞の腫瘍形成性のような副作用の可能性を判定するために不可欠である。細胞培養物又は生きている被験体における内因性遺伝子発現は、内因性プロモーターで駆動されるレポーター遺伝子を含むトランスジーンを用いることで評価できる。移植幹細胞の多分化能性の評価は、将来のテラトーマ形成の予測を可能にすることができる。多分化能性マーカー関連プロモーターで駆動されるレポーター遺伝子系は、幹細胞の分化状態を検出するために役立ち得る。
【０００５】
各モダリティーの欠点を解消するためには、複数の相異なるレポーター遺伝子発現を検出するマルチモダリティーアプローチが有用であり得る。その上、生きている動物において非侵襲的なレポーター遺伝子イメージング技法を用いて幹細胞活性をモニターするためのロバストな方法が極めて望ましい目標である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第２００４／０９４６４２号パンフレット
【発明の概要】
【０００７】
本発明は一般に、１以上のレポーター配列を含む発現ベクターを包含する。本発明はさらに、レポーター核酸配列をイメージングすることで細胞活性をモニターするための方法及びキットを包含する。
【０００８】
幹細胞をモニタリングするための発現ベクターの一例は、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。第１の発現制御配列はプロモーターを含んでいる。第２の発現制御配列は、細胞分化又は脱分化の１以上のステージに応答して活性化又は不活性化する応答要素を含んでいる。
【０００９】
発現ベクターの一例は、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。第１の発現制御配列は、１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含んでいる。第２の発現制御配列は、１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する応答要素を含んでいる。
【００１０】
幹細胞をモニタリングするための方法の一例は、第１のレポーター核酸配列及び第２のレポーター核酸配列を含む第１の発現ベクターを幹細胞に送達する段階、並びに第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方の発現をイメージングすることで幹細胞をモニタリングする段階を含んでいる。第１のレポーター核酸配列は、１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結されている。第２のレポーター核酸配列は、１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する応答要素又は１種以上の細胞特異的タンパク質によって調節される細胞特異的プロモーターを含む第２の発現制御配列と機能的に連結されている。
【００１１】
幹細胞をモニタリングするためのキットの一例は、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含む発現ベクターを含んでいる。第１の発現制御配列はＯｃｔ４プロモーターを含み、第２の発現制御配列はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素を含んでいる。
【００１２】
発現ベクターの一例は、１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び１種以上の細胞特異的タンパク質によって調節される細胞特異的プロモーターを含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で示されている。
【図１】図１は、構成的ユビキチンプロモーター及び細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターを含む本発明の構築物の一実施形態を示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、胚性幹細胞又は分化成体細胞株におけるＯｃｔ４発現の特異性を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、胚性幹細胞又は分化成体細胞株におけるＯｃｔ４発現の特異性を示すグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、胚性幹細胞又は分化成体細胞株におけるＯｃｔ４発現の特異性を示すグラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、胚性幹細胞又は分化成体細胞株におけるＯｃｔ４発現の特異性を示すグラフである。
【図３】図３は、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを一時的にトランスフェクトしたマウスＥＳ細胞におけるレニラルシフェラーゼ発現のグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞におけるルシフェラーゼ発現のグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞におけるルシフェラーゼ発現のグラフである。
【図５】図５は、経時的なＯｃｔ４ ｍＲＮＡレベル及びβ−アクチンｍＲＮＡレベルを示すＰＣＲ増幅生成物のアガロースゲル写真である。
【図６Ａ】図６Ａは、生きているマウスにおけるＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ発現ベクターを含むＥＳ細胞中でのルシフェラーゼ発現を示す、一連のマウスのグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、生きているマウスにおけるＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ発現ベクターを含むＥＳ細胞中でのルシフェラーゼ発現を示す、一連のマウスの画像である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、生きているマウスにおけるＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ発現ベクターを含むＥＳ細胞中でのルシフェラーゼ発現を示す、一連のマウスのグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、生きているマウスにおけるＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ発現ベクターを含むＥＳ細胞中でのルシフェラーゼ発現を示す、一連のマウスの画像である。
【図７】図７は、ＧＡＴＡタンパク質の結合に応答する応答要素及び最小プロモーター配列を複数のクローニング部位に挿入することで発現ベクターを作製する本発明の方法の一例を示す模式図である。図７は、出現の順序でそれぞれ配列番号５及び配列番号６を開示している。
【図８】図８は、ｐｃＤＮＡベクター骨格中にＧＡＴＡ４タンパク質をエンコードするｃＤＮＡを含む本発明の発現ベクターの一実施形態を示す模式図である。
【図９】図９は、ＧＡＴＡ４タンパク質をエンコードするｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅生成物のアガロースゲル写真である。
【図１０】図１０は、インビトロにおける、ＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素と機能的に連結されたレポーター核酸配列のルシフェラーゼ発現の棒グラフである。
【図１１】図１１は、ＨＥＫ ２９３細胞における、ＧＡＴＡ４結合に応答する応答要素と機能的に連結されたレポーター核酸配列のルシフェラーゼ発現の棒グラフである。
【図１２】図１２は、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞における、ＧＡＴＡ４結合に応答する応答要素と機能的に連結されたレポーター核酸配列のルシフェラーゼ発現の棒グラフである。
【図１３】図１３は、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞を５−アザシチジンで処理した後における、ＧＡＴＡ４結合に応答する応答要素と機能的に連結されたレポーター核酸配列のルシフェラーゼ発現の棒グラフである。
【図１４】図１４は、構成的プロモーター（ユビキチン）、細胞特異的プロモーター（Ｏｃｔ４）及び（ＧＡＴＡ４に応答する）応答要素を含む本発明の構築物の一実施形態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指摘するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。明細書全体を通じ、特定の用語の例示は非限定的な例と見なすべきである。
【００１５】
本明細書中で使用される「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、特定の遺伝子又は特定の核酸配列又は発現配列タグを標的細胞中に導入するために使用できるプラスミドをいう。発現ベクターが細胞内に存在すれば、核酸配列によってエンコードされるタンパク質が細胞の転写及び翻訳機構によって産生され得る。発現ベクターは、調節核酸配列又は発現制御配列、転写開始配列、興味ある核酸配列（例えば、レポーター核酸配列）、転写終止配列或いはこれらの組合せを含み得る。発現制御配列は、興味あるタンパク質をエンコードする核酸配列又は発現配列タグの効率的な転写のためのエンハンサー及び／又はプロモーターとして作用する配列を含み得る。
【００１６】
本明細書中で使用される「レポーター核酸配列」又は「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター活性を有するタンパク質又はペプチドをエンコードする核酸配列をいう。レポーター核酸配列は、独立に検出できるタンパク質又はペプチドをエンコードし得る。常用されるレポーター核酸配列は、視覚的に識別可能な特性を本質的に有するタンパク質又はペプチド（例えば、ＧＦＰのような蛍光タンパク質）或いは視覚的に識別可能な特性を生じ得るタンパク質又はペプチド（例えば、ルシフェラーゼのような生物発光タンパク質）をエンコードする。レポーター核酸配列は、レポーター核酸配列の発現がマーカーとして使用されるので、試験対象の細胞又は生物において天然に発現されないように選択すればよい。レポーター核酸配列の非限定的な例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ラクタマーゼ及びβ−ガラクトシダーゼをエンコードする核酸配列がある。
【００１７】
本明細書中で使用される「機能的に連結された」という用語は、核酸分子の２つの配列が互いに連結されていて、両方の配列が同じＲＮＡ転写物上に転写されるか、或いは一方の配列中で開始されたＲＮＡ転写が第２の配列中にまで延伸する場合を意味する。かくして、プロモーター配列（第１の配列）及びその他任意の第２のＤＮＡ配列のような２つの配列が機能的に連結されていれば、プロモーター配列で開始された転写は機能的に連結された第２の配列のＲＮＡ転写物を生み出すであろう。例えば、レポータータンパク質をエンコードするレポーター核酸配列及び発現制限配列を、発現制限配列中に存在するプロモーター又はエンハンサーの活性化によってレポーター核酸配列の発現が達成され得るようにして機能的に連結することができる。「機能的に連結されている」ためには、２つの配列が互いに直接に隣接している必要はない。
【００１８】
本明細書中で使用される「発現制限配列」という用語は、レポーター核酸配列の上流に位置する核酸配列をいう。これらの発現制限配列は、とりわけ、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に特異的に結合して転写を開始する位置を規定する。発現制限配列は、プロモーター、エンハンサー、遺伝子応答要素又は核酸応答要素、或いは転写開始配列を含み得る。発現制限配列は、転写の効率及び／又は下流のレポーター核酸配列の翻訳を向上させるように操作することができる。
【００１９】
本明細書中で使用される「応答要素」という用語は、プロモーターの直近又はプロモーターの内部に位置する場合に転写活性を調節できる核酸配列をいう。例えば、ＧＡＴＡ４タンパク質結合配列は、最小プロモーターの直近に位置する応答要素として使用できる。ＧＡＴＡ４タンパク質の結合は、最小プロモーターのプロモーター活性を調節できる。応答要素の非限定的な例には、ホルモン応答要素、ｃＡＭＰ応答要素及びＧＡＴＡ４タンパク質結合核酸配列がある。
【００２０】
本明細書中で使用される「構成的プロモーター」という用語は、その関連遺伝子の継続的な転写を可能にする調節されないプロモーターをいう。構成的プロモーターは、生きている被験体の発生期間を通じて絶えず、その様々な部分における遺伝子の発現を指示する。構成的プロモーターの非限定的な例には、ユビキチンプロモーター、（ＡＴＰスルフラーゼをエンコードする）ＣＴ２プロモーター、及びＣａＭＶ ３５Ｓ転写物又はアグロバクテリウムＴｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子に関連するプロモーターがある。
【００２１】
本明細書中で使用される「モニタリング」という用語は、インビトロ又はインビボで活性を観察又は記録することをいう。例えば、それは細胞、組織又は器官における生物学的過程の進行又は発現に関する情報を日常的に収集するプロセスであり得る。細胞、組織又は器官における特定の活性のモニタリングは、例えば、細胞で産生され又は細胞中に取り込まれるイメージング可能なタンパク質又はペプチドのイメージングによって達成できる。例えば、イメージング可能なタンパク質又はペプチドは生物発光性又は蛍光性であり得る。モニタリングは、例えば、細胞又は組織の存在、不存在、濃度、局在又は分化状態を確認するために実施できる。イメージング可能なタンパク質又はペプチドをモニタリングするための技法の非限定的な例は、光学イメージング（蛍光及び生物発光イメージング）、ＰＥＴ、ＭＲＩ及びＳＰＥＣＴを含んでいる。
【００２２】
本明細書中で使用される「分化」という用語は、特殊化の程度が低い細胞が特殊化の程度が高い細胞タイプになる過程をいう。多細胞生物は単一の接合体から組織及び細胞タイプの複雑な系に変化するので、分化は該生物の発生中に多数回起こる。成体幹細胞は、組織修復中及び正常な細胞代謝回転中に分裂して完全に分化した娘細胞を生み出す。分化は細胞のサイズ、形状、膜電位、代謝活性及びシグナルへの応答性を劇的に変化させる。これらの変化は、主として遺伝子発現の高度に制御された修飾に原因する。例えば、多くの細胞タイプに分化し得る細胞は多分化能性細胞として知られている。
【００２３】
本明細書中で使用される「脱分化」という用語は、部分的又は最終的に分化した細胞が、通常は再生過程の一部として早期発生段階に戻る細胞過程をいう。非限定的な例には、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）がある。脱分化した細胞は、特殊化細胞タイプに再分化できる。例えば、脂肪細胞のような特殊化細胞タイプは多分化能性幹細胞に脱分化させることができる。
【００２４】
本明細書中で使用される「多分化能性マーカー」という用語は、多分化能性細胞特異的マーカータンパク質をいう。本明細書中で使用される「多分化能性細胞」とは、３つの胚葉（例えば、内胚葉、中胚葉及び外胚葉）のすべてに分化し得る細胞集団をいう。多分化能性細胞は、各種の多分化能性細胞特異的マーカーを発現する。かかるマーカーは、未分化細胞の若干の典型的な細胞形態（例えば、コンパクトなコロニー、高い核／細胞質比又は顕著な仁）を有している。多分化能性マーカーは、細胞が未分化の多分化能状態又は脱分化された多分化能状態にある場合にのみ活性化される。多分化能性マーカーの非限定的な例には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＮａｎｏｇがある。
【００２５】
本発明の発現ベクターの１以上の実施形態は、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。第１の発現制御配列はプロモーターを含み得る。一実施形態では、第１の発現制御配列は、１以上の多分化能性マーカー（一例としてはＯｃｔ４プロモーター）に対するプロモーターを含み得る。第２の発現制御配列は、１種以上の応答要素特異的タンパク質（一例としてはＧＡＴＡ４タンパク質）の結合に応答する応答要素を含み得る。発現ベクターはさらに、第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含み得る。第３の発現制御配列は構成的プロモーターを含み得る。一実施形態では、構成的プロモーターはユビキチンプロモーターである。発現ベクターにおいては、第１、第２又は第３のレポーター核酸配列は、フレーム内でそれぞれ第１、第２又は第３の発現制御配列と機能的に連結することができる。若干の実施形態では、発現制御配列は、細胞が分化又は脱分化するのに伴い、活性化又は不活性化する任意のプロモーター或いは何らかのタンパク質の結合に応答する任意の応答要素を含み得る。かかる制御配列は、特に限定されないが、Ｏｃｔ４プロモーター又はＧＡＴＡ−４タンパク質の結合に応答する応答要素を含み得る。
【００２６】
発現ベクターにおいては、第１、第２又は第３の発現制御配列は、第１、第２又は第３のレポーター核酸配列の転写を調節するか、或いは前記レポーター核酸でエンコードされるタンパク質の翻訳を修飾する。発現制御配列とレポーター核酸配列との距離は、レポータータンパク質の効率的な転写が得られるように操作できる。発現ベクターはさらに、インビボ又はインビトロ或いは生体系においてレポータータンパク質を標識（例えば、蛍光タンパク質で標識）するために使用できる１以上の配列を含み得る。
【００２７】
発現ベクターは、レポーター核酸配列の構成的発現（一貫した発現）又は細胞特異的発現（特定タイプの細胞系統の下でのみの発現）のために使用できる。例えば、ユビキチンプロモーターは任意の生存可能な細胞において構成的発現を有する。レポーター核酸配列と機能的に連結されたユビキチンプロモーターを含む発現ベクターは、レポーター核酸配列の連続的発現のために使用できる。構成的プロモーター（例えば、ユビキチン）と機能的に連結されたレポーター核酸配列は、細胞の生存及び増殖をイメージングするために使用できる。細胞特異的発現は、特定の細胞タイプに応答するプロモーターを使用することで達成できる。細胞特異的プロモーターは、多分化能性マーカー特異的プロモーターと呼ばれる、多分化能性細胞に対して特異的なプロモーターであり得る。例えば、本発明の発現ベクター中で使用されるＯｃｔ４プロモーターは、発現ベクターが幹細胞中に存在する場合に活性化される。
【００２８】
第２の発現制御配列は、さらに最小プロモーターを含み得る。最小プロモーターは、転写因子の結合及びそれに続くプロモーターと機能的に連結された遺伝子の転写のために要求される基本的な最小核酸配列である。最小プロモーターは、応答要素と機能的に連結することができる。最小プロモーターは応答要素によって活性化され得る。応答要素は、特定の細胞系統において１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する。例えば、応答要素はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答し得る。最小プロモーターは、応答要素にＧＡＴＡ４タンパク質を結合することで誘導され得る。ＧＡＴＡ４タンパク質の発現は心筋細胞において増加する。したがって、ＧＡＴＡ４に対する応答要素と機能的に連結された最小プロモーターは、細胞が心臓特異的細胞系統（例えば、心筋細胞）への分化を受けている場合にのみ誘導される。一実施形態では、最小プロモーターはＣＭＶプロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター及びＴＡＴＡ Ｂｏｘプロモーターから選択できる。特定の実施形態では、最小プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【００２９】
一実施形態では、第１の発現制御配列はＯｃｔ４細胞特異的プロモーターを含み、第２の発現制御配列はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素と機能的に連結された最小プロモーター（例えば、ＣＭＶ最小プロモーター）を含んでいる。発現制御配列は、生物の成長中に核酸配列の発現を調節し得る。若干の調節可能な発現制御配列は、宿主細胞の増殖中にスイッチオフし、次いで所望の時点で再びスイッチオンして大量の所望タンパク質を有利に発現させることができる。
【００３０】
第１のレポーター核酸配列は、細胞が多分化能性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である場合に発現される多分化能性マーカーに対するプロモーターと機能的に連結されている。例えば、Ｏｃｔ４プロモーター活性は細胞が多分化能段階にある場合に増加し、特定の細胞系統への細胞分化後には減少する。したがって、レポーター遺伝子の発現は細胞分化段階ではダウンレギュレートされる。したがって、Ｏｃｔ４プロモーターと機能的に連結されたレポーター核酸配列のイメージングに関連するシグナルは、細胞が多分化能状態にある場合に「オン」であり、前記シグナルは細胞が分化した場合に「オフ」である。
【００３１】
第２のレポーター核酸配列は応答要素と機能的に連結されており、応答要素は最小プロモーターと機能的に連結されている。細胞プロモーターは、応答要素への応答要素特異的タンパク質（例えば、ＧＡＴＡ４タンパク質）の結合によって活性化され得る。若干の実施形態では、応答要素はＧＡＴＡ４結合配列の４回以上の反復を含んでいる。ＧＡＴＡ４タンパク質の発現は、幹細胞が心臓特異的細胞（例えば、心筋細胞）に分化した場合に増加する。したがって、ＧＡＴＡ４に連結されたレポーター核酸配列に関連するシグナルは、細胞が（心臓特異的細胞への）分化状態にある場合に「オン」であり、前記シグナルは細胞が多分化能状態又は脱分化状態にある場合に「オフ」である。例えば、幹細胞が心臓特異的細胞系統に分化した場合、ＧＡＴＡ４タンパク質の発現は増加する。しかし、ＧＡＴＡ４タンパク質の発現は心臓特異的細胞が脱分化して誘導多能性細胞（ｉＰＳ）になった場合に減少する。
【００３２】
若干の実施形態では、最小プロモーターと機能的に連結された第２のレポーター核酸配列は、応答要素への細胞特異的タンパク質の結合によって活性化され得る。一例として、幹細胞が内皮細胞に分化した場合、胎児肝臓キナーゼ−１（ＦＬＫ−１）が活性化され、第２の発現制御配列中に存在する応答要素に結合し、そして応答要素に関連する細胞プロモーターを活性化し得る。細胞特異的マーカーの非限定的な例を表１に示す。若干の実施形態では、第２の発現制御配列は分化細胞特異的プロモーターを含み得る。分化細胞特異的プロモーターには、特に限定されないが、ＦＬＫ−１、ＢＭ８８及びＨＬＡ−Ｄｒａがある。若干の実施形態では、細胞特異的マーカー（非限定的な例を表１に示す）は、応答要素に結合する応答要素特異的タンパク質、又は分化細胞中のプロモーターに結合する細胞特異的タンパク質であり得る。
【００３３】
【表１】
ユビキチンのような構成的プロモーターと機能的に連結された第３のレポーター核酸配列は、細胞が生存可能である場合に発現される。ユビキチンプロモーターはメチル化による遺伝子サイレンシングに耐え、細胞分化活性中にも調節されない。したがって、ユビキチンに連結されたレポーター核酸配列の発現に関連するシグナルは、細胞が生きている場合に「オン」である。前記シグナルは、分化段階、脱分化、多分化能性又は細胞再プログラミングにかかわらず、細胞が任意の時点で死んだ場合に「オフ」である。
【００３４】
１以上のレポーター核酸配列は、それ自体がイメージング可能であるか、或いは基質又はプローブ又は標的と反応した場合にイメージング可能であり得るポリペプチドをエンコードし得る。ポリペプチドは、光学イメージング、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ又はこれらの組合せによってイメージングすることができる。ＰＥＴはすべての生きている被験体に適用可能であるという利点を有する。しかし、ＰＥＴは比較的短寿命の放射性トレーサーを必要とする。ポリペプチドは生物発光性又は蛍光性であり得る。生物発光性又は蛍光性のポリペプチドは光学イメージングによってイメージングすることができる。本明細書中で使用される「バイオルミネセンスポリペプチド」又は「生物発光性ポリペプチド」という用語は、基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチド又はタンパク質である。バイオルミネセンスは単一細胞イメージングのために使用するのが比較的難しいのに対し、蛍光は単一細胞イメージングのために極めて高感度である。蛍光性レポータータンパク質はそれ自体がイメージング可能であるのに対し、生物発光性レポータータンパク質は基質と反応した後にイメージング可能である。ＰＥＴイメージング可能なレポータータンパク質は、プローブ又は標的を用いてイメージングすることができる。
【００３５】
一例では、第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の各々が生物発光性ポリペプチドをエンコードするのに対し、別の例では、第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の各々が蛍光性ポリペプチドをエンコードし得る。生物発光性ポリペプチドをエンコードするレポーター核酸配列は、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）、レニラルシフェラーゼ（ＲＬ）及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬ）から選択できる。本発明で使用するのに適した蛍光性ポリペプチドの例には、特に限定されないが、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がある。蛍光性ポリペプチドをエンコードするレポーター核酸配列の発現は、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を用いる蛍光ベースの細胞選別によって測定できる。第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の各々は、ＭＲＩイメージング可能なタンパク質であるタンパク質（例えば、フェリチン）をエンコードし得る。若干の実施形態では、第１、第２又は第３のレポーター核酸配列は、ＰＥＴイメージング可能なタンパク質であるＨＳＶ１−ｓｒ３９チミジンキナーゼをエンコードする。
【００３６】
一実施形態では、第１のレポーター核酸配列は生物発光性タンパク質をエンコードする一方、第２のレポーター核酸配列は蛍光性タンパク質をエンコードし、或いはその逆である。例えば、第１のレポーター核酸配列がＲＬをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＧＦＰをエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。別の実施形態では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に生物発光性タンパク質をエンコードしてよく、これらのタンパク質は相異なるものであり、２つの相異なる波長で独立にイメージングできる。一例としては、第１のレポーター核酸配列がＲＬをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＦＬをエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。ＦＬは５５０〜５７０ｎｍの範囲内の光を生じるのに対し、ＲＬは４８０ｎｍの青色光を生じる。これらの酵素は、基質要件及び光出力に違いがあるので、二重レポーターアッセイにおいて使用できる。別の実施形態では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に蛍光性タンパク質をエンコードしてよく、これらのタンパク質は相異なるものであり、２つの相異なる波長で独立にイメージングできる。一例としては、第１のレポーター核酸配列がＧＦＰをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＲＦＰをエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。
【００３７】
一態様では、第１のレポーター核酸配列がヘルペス・シンプレックス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）のようなＰＥＴレポータータンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＲＬのような生物発光性タンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。別の態様では、第１のレポーター核酸配列がＨＳＶ１−ＴＫのようなＰＥＴレポータータンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＲＦＰのような蛍光性タンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。他の態様では、第１のレポーター核酸配列がＨＳＶ１−ＴＫのようなＰＥＴレポータータンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がフェリチンのようなＭＲＩイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。さらに別の態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共にＰＥＴレポータータンパク質をエンコードしてよく、これらのタンパク質は相異なるものであり、２つの相異なる時点でイメージングできる。一実施形態では、第１のレポーター核酸配列がＦＬのような生物発光性タンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がフェリチンのようなＭＲＩイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。他の実施形態では、第１のレポーター核酸配列がＧＦＰのような蛍光性タンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がフェリチンのようなＭＲＩイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。別の実施形態では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共にＭＲＩイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、これら２種のタンパク質は相異なる共鳴シグナルによって区別される。
【００３８】
発現ベクターはさらに、第３のレポーター核酸配列を含み得る。この場合、第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の各々が生物発光性タンパク質又は蛍光性タンパク質をエンコードしてよく、これら３種のタンパク質は相異なるものであり、相異なる波長でイメージングできる。一例としては、第１のレポーター核酸配列がＲＬをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＦＬをエンコードし、第３のレポーター核酸配列がガウシアルシフェラーゼ（ＧＬ）をエンコードしてよい。一態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に生物発光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。他の態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に生物発光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。別の態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。さらに他の態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。第１のレポーター核酸配列が生物発光性タンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質又はＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてもよい。別の態様では、第１のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列が生物発光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質又はＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてもよい。
【００３９】
第１のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてもよい。第１のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードしてもよい。一態様では、第１のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質又は生物発光性タンパク質をエンコードしてもよい。
【００４０】
幹細胞をモニタリングするための方法の１以上の実施形態は、第１のレポーター核酸配列及び第２のレポーター核酸配列を含む第１の発現ベクターを幹細胞に送達する段階を含んでいる。本方法はさらに、第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方の発現をイメージングすることで幹細胞をモニタリングする段階を含んでいる。第１のレポーター核酸配列は、１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーター（一例としてはＯｃｔ４プロモーター）を含む第１の発現制御配列と機能的に連結されている。第２のレポーター核酸配列は、１種以上の応答要素特異的タンパク質（一例としてはＧＡＴＡ４タンパク質）の結合に応答する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結されている。第２の発現制御系は、さらに最小プロモーターを含んでいる。発現ベクターはさらに、第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含むことができ、第３の発現制御配列はユビキチンのような構成的プロモーターを含んでいる。
【００４１】
若干の実施形態では、本方法は、第１及び第２の発現ベクターを幹細胞に順次又は同時に送達する段階、次いで細胞をモニタリングする段階を含んでいる。第１の発現ベクターは、Ｏｃｔ４プロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及びＧＡＴＡ４の結合に応答する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。第２の発現ベクターは、ユビキチンのような構成的プロモーターを含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列を含んでいる。
【００４２】
若干の他の実施形態では、本方法は、第１、第２又は第３の発現ベクターを幹細胞に順次又は同時に送達する段階、次いで細胞をモニタリングする段階を含み得る。第１の発現ベクターは、Ｏｃｔ４を含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列を含み得る。第２の発現ベクターは、ＧＡＴＡ４の結合に応答する応答要素を含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列、及び該応答要素と機能的に連結された最小プロモーターを含んでいる。第３の発現ベクターは、ユビキチンを含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列を含み得る。
【００４３】
発現ベクターは、トランスフェクション、トランスダクション、ヌクレオフェクション又はこれらの組合せによって幹細胞に送達し得る。発現ベクターはエレクトロポレーションによっても送達でき、これは化学的トランスフェクションより約１０倍効果的である。この方法はまた、外来遺伝子を細胞（特に哺乳動物細胞）に導入するためにも極めて効率的である。例えば、エレクトロポレーションはノックアウトマウスの作製方法並びに腫瘍治療、遺伝子療法及び細胞ベース療法において使用できる。
【００４４】
一実施形態では、発現ベクターは、外来ＤＮＡを真核細胞中に導入するトランスフェクションによって細胞に送達できる。一例では、発現ベクターはヌクレオフェクションによって細胞に送達できる。ヌクレオフェクションは、ニューロン及び休止血液細胞のような非分裂細胞でもトランスフェクトする能力を提供する。他の実施形態では、発現ベクターの送達はＤＮＡナノ粒子技法によっても実施できる。ＤＮＡナノ粒子の移入は、ナノ粒子が細胞に侵入して核内にＤＮＡを遊離させる間にナノ粒子を追跡することにより、リアルタイム蛍光分光分析でモニタリングすることができる。
【００４５】
本発明の有用な幹細胞用送達系としては、センダイウイルスリポソーム送達系、陽イオン性リポソーム、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター及びこれらの組合せが挙げられる。送達ビヒクルとしてのリポソームの使用は、１つの特に興味深い方法である。リポソームは、標的部位の細胞と融合してその内容物を細胞内に送達することができる。
【００４６】
本発明の発現ベクターを含む幹細胞は、様々な生体系に移植できる。患者又はドナー動物から幹細胞試料を採取し、本発明の発現ベクターを挿入することによってエクスビボで修飾し、次いで患者に再移植するか、或いは別のレシピエントに移植すればよい。一例では、患者から幹細胞を採取し、培養で細胞数を拡大し、次いで心臓細胞のような特定の細胞として分化誘導する。かかる方法中の任意の時点で、レポーター核酸配列を含む発現ベクターを細胞中に導入し得る。かかる幹細胞を患者に移植するか、或いは同種又は異種の１以上の異なるレシピエントに移植し得る。次いで、細胞をモニタリングすることで幹細胞に関する様々な細胞段階を決定できる。
【００４７】
細胞への１以上の発現ベクターの送達は、レポータータンパク質の発現をモニタリングすることで観察できる。細胞は、単能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞及び誘導多能性幹細胞から選択された幹細胞であり得る。若干の実施形態では、培養細胞又は培養細胞の子孫は、２以上のレポーター核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【００４８】
幹細胞の分化状態をモニタリングするための方法は、インビボで実施される。幹細胞の分化状態は、特に限定されないが、筋肉組織、結合組織、神経組織、心臓組織及び脂肪組織を含む様々な組織でモニタリングすることができる。幹細胞のモニタリングは、幹細胞の存在、不存在、濃度、局在又は分化状態を確認し得る。発光性又は蛍光性レポータータンパク質から生じる光の強度に応じ、幹細胞の濃度を決定できる。イメージングされた細胞のモニタリング及び追跡により、特定の組織又は器官における特定の時点での幹細胞の局在を決定できる。様々なレポータータンパク質の色変化に応じ、分化又は多分化能性の段階を識別できる。
【００４９】
幹細胞には、第１、第２及び第３のレポーター核酸配列を含む発現ベクターをトランスフェクトし得る。第１のレポーター核酸配列は、細胞が幹細胞である場合にのみ活性化される細胞特異的プロモーターであるＯｃｔ４プロモーターと機能的に連結されている。したがって、第１のレポーター核酸は、細胞が多分化能性幹細胞である場合に発現されるレポータータンパク質をエンコードしている。しかし、このレポータータンパク質は幹細胞が分化状態にある場合には発現されない。第２のレポーター核酸配列は、ＧＡＴＡ４タンパク質の結合に対する応答要素と機能的に連結されている。ＧＡＴＡ４タンパク質は、細胞が心臓細胞である場合にのみ活性化される細胞特異的タンパク質である。したがって、第２のレポーター核酸は、細胞が心臓細胞である場合に発現されるレポータータンパク質をエンコードしている。しかし、このレポータータンパク質は心臓細胞が幹細胞に脱分化した場合には発現されない。
【００５０】
幹細胞をモニタリングするための本発明のキットの一実施形態は、発現ベクターを含んでいる。発現ベクターは、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含み得る。第１の発現制御配列はＯｃｔ４プロモーターを含み、第２の発現制御配列はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素及び最小プロモーターを含んでいる。
【００５１】
本キットは、さらに追加の発現ベクターを含み得る。追加の発現ベクターは、ユビキチンのような構成的プロモーターを含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列を含み得る。本キットはまた、（例えば、凍結状態の）細胞及び／又は細胞を培養するための培地を含み得る。本キットはさらに、発現ベクター及び／又は細胞の取扱い、細胞への発現ベクターの送達、或いは細胞の培養に関するプロトコルを含み得る。本キットは、キットの使用方法を記載した使用説明書と共にパッケージすることができる。特定の実施形態では、本キットは発現ベクターを含む幹細胞又は幹細胞の子孫を含み得る。この場合、発現ベクターは、Ｏｃｔ４プロモーターと機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、並びにＧＡＴＡ４タンパク質の結合に対する応答要素及び最小プロモーターと機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含み得る。
【００５２】
治療用途のための源としてＥＳ細胞を使用する場合、問題は移植ＥＳ細胞の免疫拒絶及び腫瘍形成性である。移植ＥＳ細胞の免疫拒絶に関連するこのような問題は、患者から採取した体細胞の再プログラミングによって生成された患者特異的な多分化能性幹細胞を使用することで排除できる。ＥＳ細胞の多分化能性のインビトロ及びインビボ評価は、腫瘍形成性の検出及び腫瘍形成性を防止するための方策の開発において役立ち得る。
【実施例１】
【００５３】
無血清培地を用いた未分化胚性幹細胞の培養
マウスＥＳ−Ｄ３細胞株（ＣＲＬ−１９３４）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、米国ヴァージニア州）から入手した。空気中５％ＣＯ2を有する給湿インキュベーター内において１０００ＩＵ／ｍＬの白血病阻害因子（ＬＩＦ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、ＥＳＧＲＯ、ＥＳＧ１１０７）と共に３７℃でインキュベートすることで、ＥＳ細胞を未分化の多能性状態に維持した。０．１％ゼラチン被覆プラスチック皿上において、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地であるＥＳ培地を用いてＥＳ細胞を培養した。イーグル培地には、１５％のノックアウト血清リプレースメント、０．１ｍｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノール及び２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンを補充した。ＥＳ培地は毎日交換し、ＥＳ細胞は２〜３日毎に継代した。
【実施例２】
【００５４】
胚性幹細胞のインビトロ分化
ＬＩＦを除去して高濃度のウシ胎児血清を添加することで、ＥＳ細胞のインビトロ分化を実施した。０．１％ゼラチン被覆プラスチック皿上において、１５％のウシ胎児血清、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのモノチオグリセロール及び２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタマックスを補充したＩｓｃｏｖｅのダルベッコ改変イーグル培地を含む分化培地中でＥＳ細胞を培養した。ＥＳ用の培地は、コエレンテラジン又はＤ−ルシフェリンで細胞の光学イメージングを行った後に毎日交換した。
【実施例３】
【００５５】
幹細胞特異的かつ構成的プロモーター駆動光学レポーター遺伝子系の構築
幹細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターの遺伝子フラグメントを、ＨｉｎｄIII及びＮｏｔＩ制限酵素での制限消化によってプラスミドから遊離させた。ｐＲＬ−ＣＭＶベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＣＭＶプロモーター領域中にＮｏｔＩ制限酵素部位を生成し、次いでＨｉｎｄIII及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。Ｏｃｔ４プロモーターの付着末端フラグメントをレニラルシフェラーゼ遺伝子の上流領域でｐＲＬ−ＣＭＶベクター中に連結することで、Ｏｃｔ４プロモーター駆動レニラルシフェラーゼ構築物（Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ）を作製した。ＨｉｎｄIII及びＢｇｌII制限酵素でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃからＯｃｔ４プロモーターの遺伝子フラグメントを遊離させ、多重クローニング部位のｐＧＬ４．１０ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に連結することで、Ｏｃｔ４プロモーター駆動ヒト化ホタルルシフェラーゼ構築物（Ｏｃｔ４−ＦＬｕｃ２）を作製した。Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを有するＥＳ細胞を作製するため、Ｏｃｔ４プロモーター駆動ｈＲＬｕｃセグメントをＢｇｌII及びＸｂａＩ制限酵素でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃから遊離させ、同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ ３．１ピューロ中に連結した（ピューロＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ）。ユビキチンプロモーター駆動ホタルルシフェラーゼ−エンハンスト緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質を含むレントウイルスベクター（Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ）を作製した。
【００５６】
ｅＧＦＰと融合したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエンコードする二官能性レポーター遺伝子系を生成するため、ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ及び切頭ヘルペス・シンプレックスチミジンキナーゼを含む三重融合レポーター遺伝子構築物からＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ（ＦＧ）をＰＣＲ増幅した。下記のプライマーを用いて、ｅＧＦＰに対する停止コドン並びにそれぞれ５’末端及び３’末端におけるクローニング部位ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩを生成した。使用したプライマーは、５’−ｇｃｇｇａｔｃｃＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡ−３’（配列番号１）及び５’−ｇｃｇｇｔａｃｃｃｔａＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号２）であった。次いで、このフラグメントをｐＨＲＧ（レニラルシフェラーゼ遺伝子を含むプロモーター無しのレポータープラスミド）中にクローニングしてｐＨＲＦＧを創製した。下記のプライマーを用いてｐＦＵＧからユビキチンプロモーターをＰＣＲ増幅することで、５’末端にＣｌａＩ部位を生成した。使用したプライマーは、５’−ｇｇｇｇａｔｃｇａｔＡＡＣＣＣＧＴＧＴＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣ−３’（配列番号４）であった。次いで、このフラグメントをｐＨＲＦＧのＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ部位に連結してｐＨＲＵＦＧを創製した。最後に、２つの異なる遺伝子Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰに対する２つの発現制御配列を含むベクター（図１）を作製した。図１は、構成的ユビキチンプロモーター及び細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターを含む本発明の構築物を示している。
【実施例４】
【００５７】
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＯｃｔ４−ＦＬｕｃ２の一時的トランスフェクション並びにホタル及びレニラルシフェラーゼアッセイによるその幹細胞特異性の評価
マウスＥＳ細胞、ラット筋芽細胞（Ｈ９Ｃ２）及びヒト腎臓癌細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）に、リポソームに基づく方法でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＰｏｃｔ４−ＦＬｕｃ２を一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションのためには２００ｎｇ／ウェルのＤＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を使用した。特記しない限り、すべての一時的トランスフェクション試験において、５ｎｇ／ウェルの他の光学レポーター（例えば、ＣＭＶプロモーター駆動ＦＬｕｃ２（ＣＭＶ−ＦＬｕｃ２）又はＣＭＶプロモーター駆動ｈＲＬｕｃ（ＣＭＶ−ｈＲＬｕｃ））をトランスフェクション基準化のために使用した。マウスＥＳ細胞、Ｈ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔに、対照としてＣＭＶ−ｈＲＬｕｃ及びＣＭＶ−ＦＬｕｃ２を一時的にトランスフェクトした。一時的トランスフェクションから４８時間後にホタル及びレニラルシフェラーゼアッセイを実施した。ホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼ活性に関するルミノメーターアッセイを下記のようにして実施した。簡単に述べれば、Ｐｒｏｍｅｇａ社から供給された氷冷１×受動溶解緩衝液２００ｍｌ中でトランスフェクト細胞を溶解し、氷上で１５分間振盪した。細胞溶解物を４℃で１．３×１０4ｇで５分間遠心して細胞破片を除去した。レニラルシフェラーゼ活性を測定するため、２０ｍｌの上澄み液にｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌに溶解した０．５ｍｇのコエレンテラジンを添加し、次いでルミノメーター（モデルＴ ２０／２０、Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ社、サニーベール、米国カリフォルニア州）で１０秒間光子計数することで分析した。ホタルルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ社からのルシフェラーゼアッセイ試薬II（ＬＡＲII）基質をコエレンテラジンの代わりに使用した点を除き、レニラルシフェラーゼ活性に関して記載されたようにして測定した。細胞溶解物中のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）によって測定した。レニラルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性を用いてタンパク質含有量及びトランスフェクション効率について基準化し、相対光単位（ＲＬＵ）／マイクログラム（タンパク質）／分（計数時間）として表した。ホタルルシフェラーゼ活性もまた、レニラルシフェラーゼ活性を用いてタンパク質含有量及びトランスフェクション効率について基準化した。
【００５８】
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＣＭＶ−ｈＲＬｕｃトランスフェクションでは、マウスＥＳ細胞はより高いＯｃｔ４プロモーター活性を示したが、ＣＭＶプロモーター活性はＨ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に比べて同等以下であった。（ＣＭＶプロモーター活性によって基準化した）Ｏｃｔ４プロモーター活性は、マウスＥＳ細胞では、Ｈ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に比べてそれぞれ４３倍及び６４７倍高かった（Ｔ検定、ｐ＝０．００２）。Ｏｃｔ４−ＦＬｕｃ２及びＣＭＶ−ＦＬｕｃ２トランスフェクションでは、マウスＥＳ細胞はより高いＯｃｔ４プロモーター活性を示したが、ＣＭＶプロモーター活性はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞より低かった。ＣＭＶプロモーター活性によって基準化したＯｃｔ４プロモーター活性は、マウスＥＳ細胞では、ＨＥＫ−２９３細胞に比べて４０１倍高かった（Ｔ検定、ｐ＝０．００１）。図２Ａ〜２Ｄは、胚性幹細胞に対するＯｃｔ４発現の特異性を分化成体細胞株と比較して示すグラフである。図２ＡはマウスＥＳ細胞に関してＨ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞より高いＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性を示しているが、ＣＭＶプロモーター活性はＨ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に比べて同等以下であった。図２ＢはＣＭＶ−ｈＲＬｕｃ活性によって基準化されたＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性を示しており、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性はＨ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３細胞のものより有意に高かった。図２ＣはマウスＥＳ細胞に関してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞より高いＯｃｔ４−ＦＬｕｃ２活性を示しているが、ＣＭＶプロモーター活性はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞より低かった。図２ＤはＣＭＶ−ＦＬｕｃ２活性によって基準化されたＯｃｔ４−ＦＬｕｃ２活性を示しており、Ｏｃｔ４−ＦＬｕｃ２活性はＨＥＫ−２９３細胞のものより有意に高かった。
【実施例５】
【００５９】
一時的なＥＳ細胞トランスフェクション及びＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性の経時的変化
マウスＥＳ細胞に、リポソームに基づく方法でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＣＭＶ−ＦＬｕｃ２を一時的にトランスフェクトし、分化培地中で培養した。トランスフェクションから１〜６日後の期間において、ルミノメーターアッセイを用いてホタル及びレニラルシフェラーゼアッセイを実施した。細胞当たりのＯｃｔ４プロモーター活性を評価するため、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性をＣＭＶ−ＦＬｕｃ２活性によって基準化した。
【００６０】
マウスＥＳ細胞において、ＣＭＶプロモーター活性によって基準化されたＯｃｔ４プロモーター活性を測定した。マウスＥＳ細胞に、リポソームを用いてＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＣＭＶ−ＦＬｕｃ２を一時的にトランスフェクトした。Ｏｃｔ４活性はトランスフェクションから２日後に最も高く、次いで活性は４日間にわたって徐々に減少した。図３は、トランスフェクトされたマウスＥＳ細胞がトランスフェクションから２日後に最も高い基準化ＲＬｕｃ活性を示し、その後は基準化ＲＬｕｃ活性が経時的に徐々に減少することを示している。
【実施例６】
【００６１】
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ−ｅＧＦＰを有する安定なＥＳ細胞の作製
マウスＥＳ細胞に、リポソームに基づくトランスフェクションによってピューロＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ−ｅＧＦＰをトランスフェクトし、ピューロマイシン（濃度５００ｎｇ／ｍｌ）で選択した。Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを安定に発現するマウスＥＳ細胞を得た後、かかる細胞を８μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ社）を含むＯｐｔｉＭＥＭ中に再懸濁した。３７℃及び５％ＣＯ2の細胞培養インキュベーター内において、５の感染多重度で細胞に３時間形質導入した。３時間後、新鮮な増殖培地を細胞に添加した。細胞を４８〜７２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー及びバイオルミネセンスイメージングによって選別し分析した。ウイルスのトランスフェクト効率は７１％であり、最高のｅＧＦＰ発現を示す細胞を選別してさらなる実験に供した。
【実施例７】
【００６２】
分化培地を用いた培養細胞におけるＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ活性の変化
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰの両方を安定に発現するマウスＥＳ細胞を、無血清ＥＳ細胞維持培地を用いて６ウェルプレート上にプレーティングした（１０5／ウェル）。２４時間後、細胞を分化培地に移した。冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、アラメダ、米国カリフォルニア州）を用いたバイオルミネセンスイメージングにより、Ｄ−ルシフェリン及びコエレンテラジンを用いてレニラルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６３】
分化培地を用いた細胞培養物においてＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞のｈＲＬｕｃ及びＦｌｕｃ２活性を経時的に測定した。Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ活性は細胞数の増加と共に増加するのに対し、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性は分化培地中では細胞数の増加にかかわらず減少する（図４Ａ）。Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性をＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ活性によって基準化した場合、両活性とも経時的に減少する（図４Ｂ）。図４Ａ〜４Ｂは、分化培地中においてＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞のルシフェラーゼ活性を経時的に示すグラフである。ＰＣＲ分析は、Ｏｃｔ４ ｍＲＮＡレベルの経時的な減少を示した。図５は、経時的に減少するＯｃｔ４のＰＣＲ増幅ｍＲＮＡレベルを示している。
【実施例８】
【００６４】
生きているマウスにおけるマウスＥＳ細胞異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ活性の変化
動物の取扱いは、スタンフォード大学動物研究委員会のガイドラインに従って行った。すべての注射及びイメージング処置中には、マウスをイソフルオラン（１００％酸素中２％イソフルラン、１Ｌ／分）を用いてガス麻酔した。冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ２９、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いてマウスのイメージングを行った。マウスＥＳ細胞（１×１０6）に、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定にコトランスフェクトした。次いで、細胞を７週齢の雌マウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に移植した。生きているマウスにおける移植ＥＳ細胞中のＯｃｔ４プロモーター活性を測定するため、５％エタノールと９５％ＰＢＳとの混合物に溶解した２０μｇのコエレンテラジン（最終容量２００μＬ）を尾静脈から注射し、１分の取得時間を有するＩＶＵＳシステムを用いてマウスを直ちにイメージングした。動物を光密チャンバー内に入れ、低レベル照明の下でグレースケールの参照画像を得た。画像は、移植細胞から放出される光子を集めた後、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｚｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）及びＩｇｏｒ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ社）を用いて得た。測定された光を定量化するため、移植細胞の領域にわたって平均及び最大光子数／秒／平方センチメートル／ステラジアンを求めた。
【００６５】
生きているマウスにおける移植ＥＳ細胞中でのユビキチンプロモーター活性を測定するため、ＰＢＳ中に溶解した３ｍｇのＤ−ルシフェリン（最終容量２００μＬ）を尾静脈から注射し、５分後に１分の取得時間を有するＩＶＵＳシステムを用いてマウスをイメージングし、光出力が最大点に達するまで続けた。データ解析は、上述したコエレンテラジンイメージングの場合と同じであった。
【００６６】
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞をモニタリングすることで、ルシフェラーゼ活性を測定した。異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性は急速に減少した。２４時間後に画像を取得したが、この時点でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性はマウスＥＳ細胞の移植から５分後に測定した活性の約１．７％であった。Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃも減少し、移植から２４時間後に画像を取得した時点で初期活性の１９％になったが、その後に活性は徐々に増加した。図６Ａ〜６Ｄは、生きているマウスにおける異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ活性の変化を示している。図６Ａ及び図６Ｂは、異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性が急速に減少し、２４時間後には細胞の移植から５分後に測定した活性の１．７％になったことを示している。図６Ｃ及び図６Ｄは、Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ活性が徐々に減少し、２４時間後には細胞の移植から５分後に測定した活性の１９％になったが、その後は徐々に増加したことを示している。図６Ａ〜６Ｂは、移植片から２４時間以内にシグナルの急速な減少を示した異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性をイメージングすることで得た細胞分化状態の画像を示している。図６Ｃは、Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ活性が最初は減少したが細胞の生存を追跡した７２時間後には徐々に増加したことをグラフであり、図６Ｄは、Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ活性をイメージングすることで得た移植後のマウスの一連の画像を示している。
【実施例９】
【００６７】
ＧＡＴＡ−４応答要素レポーター遺伝子系（ＧＲＥＲＧ）の創製
内胚葉及び心臓分化にとって決定的に重要なＧＡＴＡ４結合タンパク質の発現を測定するため、転写因子応答性レポーター遺伝子イメージング技法を開発した。ＧＡＴＡ４結合配列の４つのコピーを、ヒト化ホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動する（ＰＧ５ｌｕｃベクターからの）最小レポーターと連結することで、ＧＡＴＡ４結合タンパク質応答要素レポーター遺伝子系（ＧＲＥＲＧ）を構築した。（Ｐｒｏｍｅｇａ社からの）ＰＧＬ４．１０を骨格として使用した。４つのＧＡＴＡ結合配列及びアデノウイルスの主後期プロモーター配列をｐＧＬ４．１０の多重クローニング部位に順次に挿入した。ＧＡＴＡ応答要素を挿入するためにはＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII制限酵素部位を使用した（図７）。図７に示すように、４つのＧＡＴＡ結合配列及びアデノウイルスの主後期プロモーター配列をｐＧＬ４．１０の多重クローニング部位に順次に挿入した。
【実施例１０】
【００６８】
ＧＡＴＡ４結合タンパク質を産生するベクターの作製
ＧＡＴＡ４結合タンパク質に対するｃＤＮＡを有するプラスミドをＯｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から購入した。ｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩの制限酵素部位をＰＣＲ増幅ＤＮＡの各端に導入した。興味ある遺伝子を、ｐｃＤＮＡ ３．１ベクター（図８）を発現する哺乳動物細胞中にクローニングした。ベクターをＨＥＫ ２９３細胞中にトランスフェクトし、ＧＡＴＡ４結合タンパク質の発現を評価した。ベクターをトランスフェクトした細胞は、ＧＡＴＡ４結合タンパク質ｍＲＮＡのより高い発現を示した（図９）。図９は、ＧＡＴＡ４タンパク質をエンコードするｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を示す画像である。
【実施例１１】
【００６９】
レポーター遺伝子発現：ルミノメーターアッセイ（インビトロ）及びバイオルミネセンスイメージング（インビボ）
構築された発現ベクターをＨＥＫ ２９３細胞にコントランスフェクトすることで、ＧＡＴＡ４結合タンパク質応答要素駆動レポーター遺伝子系（ＧＲＥＲＧ）の発現を判定した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。適当なベクター用量を最適化するため、数種の濃度のＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを適用した。ＧＲＥＲＧのルシフェラーゼ活性は、図１０に示すようにＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターのコトランスフェクションでＧＲＥＲＧの活性を高めるルミノメーターアッセイによって測定した。一定濃度のＧＲＥ−ルシフェラーゼをトランスフェクトすると共に、ＧＡＴＡ結合タンパク質を発現するプラスミドベクターを増加する濃度でコトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞からのルシフェラーゼ活性を測定した（ルミノメーター）。ＧＡＴＡ４タンパク質の発現の増加は、ＧＡＴＡ４応答要素と結合することによってルシフェラーゼの発現を活性化する。
【００７０】
ＧＲＥＲＧ活性の増加率（約６倍）は、ＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターの濃度に比例している。ＨＥＫ ２９３細胞における（ＩＶＵＳを用いた）バイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）アッセイにより、ＧＲＥＲＧに関するルシフェラーゼ活性を測定した。ＧＲＥＲＧのＢＬＩ活性もまた、ＨＥＫ ２９３細胞にＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターをコトランスフェクトすることで増加した。ＧＲＥＲＧの活性は、１μｇのＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを細胞にコトランスフェクトした場合、（ＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを含まない）単独のＧＲＥＲＧに比べて約６倍に増加した。図１１は、一定濃度のＧＲＥ−ルシフェラーゼをトランスフェクトすると共に、ＧＡＴＡ結合タンパク質を発現するプラスミドベクターを増加する濃度でコトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から（ＣＣＤカメライメージングで）測定したルシフェラーゼ活性の棒グラフである。ＧＡＴＡ４タンパク質の発現の増加は、ＧＡＴＡ４応答要素と結合することによってルシフェラーゼの発現を活性化する。
【００７１】
構築された発現ベクターをＨＣＴ １１６細胞にコトランスフェクトすることで、ＧＡＴＡ４結合タンパク質応答要素レポーター遺伝子系（ＧＲＥＲＧ）の発現を測定した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって行った。ベクター用量を最適化するため、ＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを数種の濃度で適用した。（ＩＶＵＳを用いた）ＢＬＩによって測定したＧＲＥＲＧのルシフェラーゼ活性もまた、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞にＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターをコトランスフェクトすることで増加した。ＧＲＥＲＧの活性は、図１２に示すように、１．５μｇのＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを細胞にコトランスフェクトした場合、（ＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを含まない）単独のＧＲＥＲＧに比べて約１６倍に増加した。一定濃度のＧＲＥ−Ｆｌｕｃレポーターをトランスフェクトすると共に、ＧＡＴＡ結合タンパク質を様々な用量でコトランスフェクトしたＨＣＴ １１６結腸癌細胞からのルシフェラーゼ活性をバイオルミネセンスイメージングによって測定した（図１２）。（ＩＶＵＳを用いた）ＢＬＩアッセイによって測定したＧＲＥＲＧのルシフェラーゼ活性はまた、図１３に示すように、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞を５−アザシチジンで処理することによっても増加した。ＧＲＥ−ＦＬＵＣをトランスフェクトしたＨＣＴ １１６結腸癌細胞においては、ルシフェラーゼ発現は５−アザシチジンでの処理後に時間（１〜３時間）と共に増加する。５−アザシチジンは、通常は内因性ＧＡＴＡ発現を活性化する。
【実施例１２】
【００７２】
幹細胞特異的、構成的かつ誘導可能なプロモーター駆動光学レポーター遺伝子系の構築
幹細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターの遺伝子フラグメントを、ＨｉｎｄIII及びＮｏｔＩ制限酵素での制限消化によってプラスミドから遊離させた。Ｏｃｔ４プロモーターの付着末端フラグメントをレニラルシフェラーゼ遺伝子の上流領域でｐＲＬ−ＣＭＶベクター中に連結することで、Ｏｃｔ４プロモーター駆動レニラルシフェラーゼ構築物（Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ）を作製した。Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを有するＥＳ細胞を作製するため、Ｏｃｔ４プロモーター駆動ｈＲＬｕｃセグメントをＢｇｌII及びＸｂａＩ制限酵素でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃから遊離させ、同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ ３．１ピューロ中に連結した（ピューロＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ）。
【００７３】
ｅＧＦＰと融合したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエンコードする二官能性レポーター遺伝子系を生成するため、ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ及び切頭ヘルペス・シンプレックスチミジンキナーゼを含む三重融合レポーター遺伝子構築物からＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ（ＦＧ）をＰＣＲ増幅した。次いで、このフラグメントをｐＨＲＧ（レニラルシフェラーゼ遺伝子を含むプロモーター無しのレポータープラスミド）中にクローニングしてｐＨＲＦＧを創製した。下記のプライマーを用いてｐＦＵＧからユビキチンプロモーターをＰＣＲ増幅することで、５’末端にＣｌａＩ部位を生成した。使用したプライマーは、５’−ｇｇｇｇａｔｃｇａｔＡＡＣＣＣＧＴＧＴＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣ−３’（配列番号４）であった。次いで、このフラグメントをｐＨＲＦＧのＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ部位に連結してｐＨＲＵＦＧを創製した。さらに、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを含むｐｃＤＮＡ ３．１中にユビキチンに対する発現制御配列をクローニングすることで、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを有する構築物を形成した。ＧＡＴＡ４結合タンパク質に対するｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩの制限酵素部位をＰＣＲ増幅ＤＮＡの各端に導入した。興味ある遺伝子を、ｐｃＤＮＡ ３．１ベクターを発現する哺乳動物細胞中にクローニングした。最後に、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを含むｐｃＤＮＡ ３．１中にＧＲＥＲＧ配列を導入することで、３つの発現制御配列を有するベクターを形成した（図１４）。
【００７４】
以上、本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明してきたが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の技術的範囲に含まれるこのような修正及び変更のすべてを包含するように意図されていることを理解すべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には細胞のイメージングに関し、さらに詳しくは、幹細胞中の新規な発現ベクターを用いて発現されたレポーター核酸配列をイメージングすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
生きている被験体における単一の細胞又は細胞群の非侵襲的で反復的なイメージングは、特に細胞ベース療法の分野では、インビボでの細胞の追跡のため決定的に重要である。細胞ベース療法、細胞トラフィッキング及び遺伝子療法研究を含む多くの用途において、正常生理学及び疾患進行を理解するために様々なイメージングモダリティーが使用されてきた。レポーター核酸配列を有する発現ベクターは、生きている被験体における遺伝子発現の非侵襲的な定量的イメージングの可能性を提供する。
【０００３】
分子及び細胞事象の複雑性及び動力学を解明するためには、単一又は複数レポーター遺伝子構築物の助けを借りて個々の細胞におけるレポーター遺伝子発現をイメージングすることが望ましい。イメージング用レポーター遺伝子は、各種の非侵襲的イメージング技法によって検出されるタンパク質をエンコードしている。レポーター遺伝子発現は、レポーター遺伝子のタイプに応じて光学イメージング、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用することで、生きている被験体においてイメージングすることができる。
【０００４】
幹細胞ベース療法は、特に再生医学の分野において多大の可能性を明らかにした。幹細胞ベース療法にとっての障害の１つは、使用した幹細胞を追跡するための効率的なモニタリング方法がないことである。幹細胞の分化状態のモニタリングは、治療効力並びに移植した幹細胞の腫瘍形成性のような副作用の可能性を判定するために不可欠である。細胞培養物又は生きている被験体における内因性遺伝子発現は、内因性プロモーターで駆動されるレポーター遺伝子を含むトランスジーンを用いることで評価できる。移植幹細胞の多分化能性の評価は、将来のテラトーマ形成の予測を可能にすることができる。多分化能性マーカー関連プロモーターで駆動されるレポーター遺伝子系は、幹細胞の分化状態を検出するために役立ち得る。
【０００５】
各モダリティーの欠点を解消するためには、複数の相異なるレポーター遺伝子発現を検出するマルチモダリティーアプローチが有用であり得る。その上、生きている動物において非侵襲的なレポーター遺伝子イメージング技法を用いて幹細胞活性をモニターするためのロバストな方法が極めて望ましい目標である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第２００４／０９４６４２号パンフレット
【発明の概要】
【０００７】
本発明は一般に、１以上のレポーター配列を含む発現ベクターを包含する。本発明はさらに、レポーター核酸配列をイメージングすることで細胞活性をモニターするための方法及びキットを包含する。
【０００８】
幹細胞をモニタリングするための発現ベクターの一例は、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。第１の発現制御配列はプロモーターを含んでいる。第２の発現制御配列は、細胞分化又は脱分化の１以上のステージに応答して活性化又は不活性化する応答要素を含んでいる。
【０００９】
発現ベクターの一例は、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。第１の発現制御配列は、１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含んでいる。第２の発現制御配列は、１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する応答要素を含んでいる。
【００１０】
幹細胞をモニタリングするための方法の一例は、第１のレポーター核酸配列及び第２のレポーター核酸配列を含む第１の発現ベクターを幹細胞に送達する段階、並びに第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方の発現をイメージングすることで幹細胞をモニタリングする段階を含んでいる。第１のレポーター核酸配列は、１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結されている。第２のレポーター核酸配列は、１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する応答要素又は１種以上の細胞特異的タンパク質によって調節される細胞特異的プロモーターを含む第２の発現制御配列と機能的に連結されている。
【００１１】
幹細胞をモニタリングするためのキットの一例は、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含む発現ベクターを含んでいる。第１の発現制御配列はＯｃｔ４プロモーターを含み、第２の発現制御配列はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素を含んでいる。
【００１２】
発現ベクターの一例は、１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び１種以上の細胞特異的タンパク質によって調節される細胞特異的プロモーターを含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で示されている。
【図１】図１は、構成的ユビキチンプロモーター及び細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターを含む本発明の構築物の一実施形態を示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、胚性幹細胞又は分化成体細胞株におけるＯｃｔ４発現の特異性を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、胚性幹細胞又は分化成体細胞株におけるＯｃｔ４発現の特異性を示すグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、胚性幹細胞又は分化成体細胞株におけるＯｃｔ４発現の特異性を示すグラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、胚性幹細胞又は分化成体細胞株におけるＯｃｔ４発現の特異性を示すグラフである。
【図３】図３は、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを一時的にトランスフェクトしたマウスＥＳ細胞におけるレニラルシフェラーゼ発現のグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞におけるルシフェラーゼ発現のグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞におけるルシフェラーゼ発現のグラフである。
【図５】図５は、経時的なＯｃｔ４ ｍＲＮＡレベル及びβ−アクチンｍＲＮＡレベルを示すＰＣＲ増幅生成物のアガロースゲル写真である。
【図６Ａ】図６Ａは、生きているマウスにおけるＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ発現ベクターを含むＥＳ細胞中でのルシフェラーゼ発現を示す、一連のマウスのグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、生きているマウスにおけるＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ発現ベクターを含むＥＳ細胞中でのルシフェラーゼ発現を示す、一連のマウスの画像である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、生きているマウスにおけるＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ発現ベクターを含むＥＳ細胞中でのルシフェラーゼ発現を示す、一連のマウスのグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、生きているマウスにおけるＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ発現ベクターを含むＥＳ細胞中でのルシフェラーゼ発現を示す、一連のマウスの画像である。
【図７】図７は、ＧＡＴＡタンパク質の結合に応答する応答要素及び最小プロモーター配列を複数のクローニング部位に挿入することで発現ベクターを作製する本発明の方法の一例を示す模式図である。図７は、出現の順序でそれぞれ配列番号５及び配列番号６を開示している。
【図８】図８は、ｐｃＤＮＡベクター骨格中にＧＡＴＡ４タンパク質をエンコードするｃＤＮＡを含む本発明の発現ベクターの一実施形態を示す模式図である。
【図９】図９は、ＧＡＴＡ４タンパク質をエンコードするｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅生成物のアガロースゲル写真である。
【図１０】図１０は、インビトロにおける、ＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素と機能的に連結されたレポーター核酸配列のルシフェラーゼ発現の棒グラフである。
【図１１】図１１は、ＨＥＫ ２９３細胞における、ＧＡＴＡ４結合に応答する応答要素と機能的に連結されたレポーター核酸配列のルシフェラーゼ発現の棒グラフである。
【図１２】図１２は、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞における、ＧＡＴＡ４結合に応答する応答要素と機能的に連結されたレポーター核酸配列のルシフェラーゼ発現の棒グラフである。
【図１３】図１３は、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞を５−アザシチジンで処理した後における、ＧＡＴＡ４結合に応答する応答要素と機能的に連結されたレポーター核酸配列のルシフェラーゼ発現の棒グラフである。
【図１４】図１４は、構成的プロモーター（ユビキチン）、細胞特異的プロモーター（Ｏｃｔ４）及び（ＧＡＴＡ４に応答する）応答要素を含む本発明の構築物の一実施形態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指摘するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。明細書全体を通じ、特定の用語の例示は非限定的な例と見なすべきである。
【００１５】
本明細書中で使用される「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、特定の遺伝子又は特定の核酸配列又は発現配列タグを標的細胞中に導入するために使用できるプラスミドをいう。発現ベクターが細胞内に存在すれば、核酸配列によってエンコードされるタンパク質が細胞の転写及び翻訳機構によって産生され得る。発現ベクターは、調節核酸配列又は発現制御配列、転写開始配列、興味ある核酸配列（例えば、レポーター核酸配列）、転写終止配列或いはこれらの組合せを含み得る。発現制御配列は、興味あるタンパク質をエンコードする核酸配列又は発現配列タグの効率的な転写のためのエンハンサー及び／又はプロモーターとして作用する配列を含み得る。
【００１６】
本明細書中で使用される「レポーター核酸配列」又は「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター活性を有するタンパク質又はペプチドをエンコードする核酸配列をいう。レポーター核酸配列は、独立に検出できるタンパク質又はペプチドをエンコードし得る。常用されるレポーター核酸配列は、視覚的に識別可能な特性を本質的に有するタンパク質又はペプチド（例えば、ＧＦＰのような蛍光タンパク質）或いは視覚的に識別可能な特性を生じ得るタンパク質又はペプチド（例えば、ルシフェラーゼのような生物発光タンパク質）をエンコードする。レポーター核酸配列は、レポーター核酸配列の発現がマーカーとして使用されるので、試験対象の細胞又は生物において天然に発現されないように選択すればよい。レポーター核酸配列の非限定的な例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ラクタマーゼ及びβ−ガラクトシダーゼをエンコードする核酸配列がある。
【００１７】
本明細書中で使用される「機能的に連結された」という用語は、核酸分子の２つの配列が互いに連結されていて、両方の配列が同じＲＮＡ転写物上に転写されるか、或いは一方の配列中で開始されたＲＮＡ転写が第２の配列中にまで延伸する場合を意味する。かくして、プロモーター配列（第１の配列）及びその他任意の第２のＤＮＡ配列のような２つの配列が機能的に連結されていれば、プロモーター配列で開始された転写は機能的に連結された第２の配列のＲＮＡ転写物を生み出すであろう。例えば、レポータータンパク質をエンコードするレポーター核酸配列及び発現制限配列を、発現制限配列中に存在するプロモーター又はエンハンサーの活性化によってレポーター核酸配列の発現が達成され得るようにして機能的に連結することができる。「機能的に連結されている」ためには、２つの配列が互いに直接に隣接している必要はない。
【００１８】
本明細書中で使用される「発現制限配列」という用語は、レポーター核酸配列の上流に位置する核酸配列をいう。これらの発現制限配列は、とりわけ、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に特異的に結合して転写を開始する位置を規定する。発現制限配列は、プロモーター、エンハンサー、遺伝子応答要素又は核酸応答要素、或いは転写開始配列を含み得る。発現制限配列は、転写の効率及び／又は下流のレポーター核酸配列の翻訳を向上させるように操作することができる。
【００１９】
本明細書中で使用される「応答要素」という用語は、プロモーターの直近又はプロモーターの内部に位置する場合に転写活性を調節できる核酸配列をいう。例えば、ＧＡＴＡ４タンパク質結合配列は、最小プロモーターの直近に位置する応答要素として使用できる。ＧＡＴＡ４タンパク質の結合は、最小プロモーターのプロモーター活性を調節できる。応答要素の非限定的な例には、ホルモン応答要素、ｃＡＭＰ応答要素及びＧＡＴＡ４タンパク質結合核酸配列がある。
【００２０】
本明細書中で使用される「構成的プロモーター」という用語は、その関連遺伝子の継続的な転写を可能にする調節されないプロモーターをいう。構成的プロモーターは、生きている被験体の発生期間を通じて絶えず、その様々な部分における遺伝子の発現を指示する。構成的プロモーターの非限定的な例には、ユビキチンプロモーター、（ＡＴＰスルフラーゼをエンコードする）ＣＴ２プロモーター、及びＣａＭＶ ３５Ｓ転写物又はアグロバクテリウムＴｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子に関連するプロモーターがある。
【００２１】
本明細書中で使用される「モニタリング」という用語は、インビトロ又はインビボで活性を観察又は記録することをいう。例えば、それは細胞、組織又は器官における生物学的過程の進行又は発現に関する情報を日常的に収集するプロセスであり得る。細胞、組織又は器官における特定の活性のモニタリングは、例えば、細胞で産生され又は細胞中に取り込まれるイメージング可能なタンパク質又はペプチドのイメージングによって達成できる。例えば、イメージング可能なタンパク質又はペプチドは生物発光性又は蛍光性であり得る。モニタリングは、例えば、細胞又は組織の存在、不存在、濃度、局在又は分化状態を確認するために実施できる。イメージング可能なタンパク質又はペプチドをモニタリングするための技法の非限定的な例は、光学イメージング（蛍光及び生物発光イメージング）、ＰＥＴ、ＭＲＩ及びＳＰＥＣＴを含んでいる。
【００２２】
本明細書中で使用される「分化」という用語は、特殊化の程度が低い細胞が特殊化の程度が高い細胞タイプになる過程をいう。多細胞生物は単一の接合体から組織及び細胞タイプの複雑な系に変化するので、分化は該生物の発生中に多数回起こる。成体幹細胞は、組織修復中及び正常な細胞代謝回転中に分裂して完全に分化した娘細胞を生み出す。分化は細胞のサイズ、形状、膜電位、代謝活性及びシグナルへの応答性を劇的に変化させる。これらの変化は、主として遺伝子発現の高度に制御された修飾に原因する。例えば、多くの細胞タイプに分化し得る細胞は多分化能性細胞として知られている。
【００２３】
本明細書中で使用される「脱分化」という用語は、部分的又は最終的に分化した細胞が、通常は再生過程の一部として早期発生段階に戻る細胞過程をいう。非限定的な例には、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）がある。脱分化した細胞は、特殊化細胞タイプに再分化できる。例えば、脂肪細胞のような特殊化細胞タイプは多分化能性幹細胞に脱分化させることができる。
【００２４】
本明細書中で使用される「多分化能性マーカー」という用語は、多分化能性細胞特異的マーカータンパク質をいう。本明細書中で使用される「多分化能性細胞」とは、３つの胚葉（例えば、内胚葉、中胚葉及び外胚葉）のすべてに分化し得る細胞集団をいう。多分化能性細胞は、各種の多分化能性細胞特異的マーカーを発現する。かかるマーカーは、未分化細胞の若干の典型的な細胞形態（例えば、コンパクトなコロニー、高い核／細胞質比又は顕著な仁）を有している。多分化能性マーカーは、細胞が未分化の多分化能状態又は脱分化された多分化能状態にある場合にのみ活性化される。多分化能性マーカーの非限定的な例には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＮａｎｏｇがある。
【００２５】
本発明の発現ベクターの１以上の実施形態は、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。第１の発現制御配列はプロモーターを含み得る。一実施形態では、第１の発現制御配列は、１以上の多分化能性マーカー（一例としてはＯｃｔ４プロモーター）に対するプロモーターを含み得る。第２の発現制御配列は、１種以上の応答要素特異的タンパク質（一例としてはＧＡＴＡ４タンパク質）の結合に応答する応答要素を含み得る。発現ベクターはさらに、第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含み得る。第３の発現制御配列は構成的プロモーターを含み得る。一実施形態では、構成的プロモーターはユビキチンプロモーターである。発現ベクターにおいては、第１、第２又は第３のレポーター核酸配列は、フレーム内でそれぞれ第１、第２又は第３の発現制御配列と機能的に連結することができる。若干の実施形態では、発現制御配列は、細胞が分化又は脱分化するのに伴い、活性化又は不活性化する任意のプロモーター或いは何らかのタンパク質の結合に応答する任意の応答要素を含み得る。かかる制御配列は、特に限定されないが、Ｏｃｔ４プロモーター又はＧＡＴＡ−４タンパク質の結合に応答する応答要素を含み得る。
【００２６】
発現ベクターにおいては、第１、第２又は第３の発現制御配列は、第１、第２又は第３のレポーター核酸配列の転写を調節するか、或いは前記レポーター核酸でエンコードされるタンパク質の翻訳を修飾する。発現制御配列とレポーター核酸配列との距離は、レポータータンパク質の効率的な転写が得られるように操作できる。発現ベクターはさらに、インビボ又はインビトロ或いは生体系においてレポータータンパク質を標識（例えば、蛍光タンパク質で標識）するために使用できる１以上の配列を含み得る。
【００２７】
発現ベクターは、レポーター核酸配列の構成的発現（一貫した発現）又は細胞特異的発現（特定タイプの細胞系統の下でのみの発現）のために使用できる。例えば、ユビキチンプロモーターは任意の生存可能な細胞において構成的発現を有する。レポーター核酸配列と機能的に連結されたユビキチンプロモーターを含む発現ベクターは、レポーター核酸配列の連続的発現のために使用できる。構成的プロモーター（例えば、ユビキチン）と機能的に連結されたレポーター核酸配列は、細胞の生存及び増殖をイメージングするために使用できる。細胞特異的発現は、特定の細胞タイプに応答するプロモーターを使用することで達成できる。細胞特異的プロモーターは、多分化能性マーカー特異的プロモーターと呼ばれる、多分化能性細胞に対して特異的なプロモーターであり得る。例えば、本発明の発現ベクター中で使用されるＯｃｔ４プロモーターは、発現ベクターが幹細胞中に存在する場合に活性化される。
【００２８】
第２の発現制御配列は、さらに最小プロモーターを含み得る。最小プロモーターは、転写因子の結合及びそれに続くプロモーターと機能的に連結された遺伝子の転写のために要求される基本的な最小核酸配列である。最小プロモーターは、応答要素と機能的に連結することができる。最小プロモーターは応答要素によって活性化され得る。応答要素は、特定の細胞系統において１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する。例えば、応答要素はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答し得る。最小プロモーターは、応答要素にＧＡＴＡ４タンパク質を結合することで誘導され得る。ＧＡＴＡ４タンパク質の発現は心筋細胞において増加する。したがって、ＧＡＴＡ４に対する応答要素と機能的に連結された最小プロモーターは、細胞が心臓特異的細胞系統（例えば、心筋細胞）への分化を受けている場合にのみ誘導される。一実施形態では、最小プロモーターはＣＭＶプロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター及びＴＡＴＡ Ｂｏｘプロモーターから選択できる。特定の実施形態では、最小プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【００２９】
一実施形態では、第１の発現制御配列はＯｃｔ４細胞特異的プロモーターを含み、第２の発現制御配列はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素と機能的に連結された最小プロモーター（例えば、ＣＭＶ最小プロモーター）を含んでいる。発現制御配列は、生物の成長中に核酸配列の発現を調節し得る。若干の調節可能な発現制御配列は、宿主細胞の増殖中にスイッチオフし、次いで所望の時点で再びスイッチオンして大量の所望タンパク質を有利に発現させることができる。
【００３０】
第１のレポーター核酸配列は、細胞が多分化能性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である場合に発現される多分化能性マーカーに対するプロモーターと機能的に連結されている。例えば、Ｏｃｔ４プロモーター活性は細胞が多分化能段階にある場合に増加し、特定の細胞系統への細胞分化後には減少する。したがって、レポーター遺伝子の発現は細胞分化段階ではダウンレギュレートされる。したがって、Ｏｃｔ４プロモーターと機能的に連結されたレポーター核酸配列のイメージングに関連するシグナルは、細胞が多分化能状態にある場合に「オン」であり、前記シグナルは細胞が分化した場合に「オフ」である。
【００３１】
第２のレポーター核酸配列は応答要素と機能的に連結されており、応答要素は最小プロモーターと機能的に連結されている。細胞プロモーターは、応答要素への応答要素特異的タンパク質（例えば、ＧＡＴＡ４タンパク質）の結合によって活性化され得る。若干の実施形態では、応答要素はＧＡＴＡ４結合配列の４回以上の反復を含んでいる。ＧＡＴＡ４タンパク質の発現は、幹細胞が心臓特異的細胞（例えば、心筋細胞）に分化した場合に増加する。したがって、ＧＡＴＡ４に連結されたレポーター核酸配列に関連するシグナルは、細胞が（心臓特異的細胞への）分化状態にある場合に「オン」であり、前記シグナルは細胞が多分化能状態又は脱分化状態にある場合に「オフ」である。例えば、幹細胞が心臓特異的細胞系統に分化した場合、ＧＡＴＡ４タンパク質の発現は増加する。しかし、ＧＡＴＡ４タンパク質の発現は心臓特異的細胞が脱分化して誘導多能性細胞（ｉＰＳ）になった場合に減少する。
【００３２】
若干の実施形態では、最小プロモーターと機能的に連結された第２のレポーター核酸配列は、応答要素への細胞特異的タンパク質の結合によって活性化され得る。一例として、幹細胞が内皮細胞に分化した場合、胎児肝臓キナーゼ−１（ＦＬＫ−１）が活性化され、第２の発現制御配列中に存在する応答要素に結合し、そして応答要素に関連する細胞プロモーターを活性化し得る。細胞特異的マーカーの非限定的な例を表１に示す。若干の実施形態では、第２の発現制御配列は分化細胞特異的プロモーターを含み得る。分化細胞特異的プロモーターには、特に限定されないが、ＦＬＫ−１、ＢＭ８８及びＨＬＡ−Ｄｒａがある。若干の実施形態では、細胞特異的マーカー（非限定的な例を表１に示す）は、応答要素に結合する応答要素特異的タンパク質、又は分化細胞中のプロモーターに結合する細胞特異的タンパク質であり得る。
【００３３】
【表１】
ユビキチンのような構成的プロモーターと機能的に連結された第３のレポーター核酸配列は、細胞が生存可能である場合に発現される。ユビキチンプロモーターはメチル化による遺伝子サイレンシングに耐え、細胞分化活性中にも調節されない。したがって、ユビキチンに連結されたレポーター核酸配列の発現に関連するシグナルは、細胞が生きている場合に「オン」である。前記シグナルは、分化段階、脱分化、多分化能性又は細胞再プログラミングにかかわらず、細胞が任意の時点で死んだ場合に「オフ」である。
【００３４】
１以上のレポーター核酸配列は、それ自体がイメージング可能であるか、或いは基質又はプローブ又は標的と反応した場合にイメージング可能であり得るポリペプチドをエンコードし得る。ポリペプチドは、光学イメージング、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ又はこれらの組合せによってイメージングすることができる。ＰＥＴはすべての生きている被験体に適用可能であるという利点を有する。しかし、ＰＥＴは比較的短寿命の放射性トレーサーを必要とする。ポリペプチドは生物発光性又は蛍光性であり得る。生物発光性又は蛍光性のポリペプチドは光学イメージングによってイメージングすることができる。本明細書中で使用される「バイオルミネセンスポリペプチド」又は「生物発光性ポリペプチド」という用語は、基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチド又はタンパク質である。バイオルミネセンスは単一細胞イメージングのために使用するのが比較的難しいのに対し、蛍光は単一細胞イメージングのために極めて高感度である。蛍光性レポータータンパク質はそれ自体がイメージング可能であるのに対し、生物発光性レポータータンパク質は基質と反応した後にイメージング可能である。ＰＥＴイメージング可能なレポータータンパク質は、プローブ又は標的を用いてイメージングすることができる。
【００３５】
一例では、第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の各々が生物発光性ポリペプチドをエンコードするのに対し、別の例では、第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の各々が蛍光性ポリペプチドをエンコードし得る。生物発光性ポリペプチドをエンコードするレポーター核酸配列は、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）、レニラルシフェラーゼ（ＲＬ）及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬ）から選択できる。本発明で使用するのに適した蛍光性ポリペプチドの例には、特に限定されないが、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がある。蛍光性ポリペプチドをエンコードするレポーター核酸配列の発現は、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を用いる蛍光ベースの細胞選別によって測定できる。第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の各々は、ＭＲＩイメージング可能なタンパク質であるタンパク質（例えば、フェリチン）をエンコードし得る。若干の実施形態では、第１、第２又は第３のレポーター核酸配列は、ＰＥＴイメージング可能なタンパク質であるＨＳＶ１−ｓｒ３９チミジンキナーゼをエンコードする。
【００３６】
一実施形態では、第１のレポーター核酸配列は生物発光性タンパク質をエンコードする一方、第２のレポーター核酸配列は蛍光性タンパク質をエンコードし、或いはその逆である。例えば、第１のレポーター核酸配列がＲＬをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＧＦＰをエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。別の実施形態では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に生物発光性タンパク質をエンコードしてよく、これらのタンパク質は相異なるものであり、２つの相異なる波長で独立にイメージングできる。一例としては、第１のレポーター核酸配列がＲＬをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＦＬをエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。ＦＬは５５０〜５７０ｎｍの範囲内の光を生じるのに対し、ＲＬは４８０ｎｍの青色光を生じる。これらの酵素は、基質要件及び光出力に違いがあるので、二重レポーターアッセイにおいて使用できる。別の実施形態では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に蛍光性タンパク質をエンコードしてよく、これらのタンパク質は相異なるものであり、２つの相異なる波長で独立にイメージングできる。一例としては、第１のレポーター核酸配列がＧＦＰをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＲＦＰをエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。
【００３７】
一態様では、第１のレポーター核酸配列がヘルペス・シンプレックス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）のようなＰＥＴレポータータンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＲＬのような生物発光性タンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。別の態様では、第１のレポーター核酸配列がＨＳＶ１−ＴＫのようなＰＥＴレポータータンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＲＦＰのような蛍光性タンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。他の態様では、第１のレポーター核酸配列がＨＳＶ１−ＴＫのようなＰＥＴレポータータンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がフェリチンのようなＭＲＩイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。さらに別の態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共にＰＥＴレポータータンパク質をエンコードしてよく、これらのタンパク質は相異なるものであり、２つの相異なる時点でイメージングできる。一実施形態では、第１のレポーター核酸配列がＦＬのような生物発光性タンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がフェリチンのようなＭＲＩイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。他の実施形態では、第１のレポーター核酸配列がＧＦＰのような蛍光性タンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がフェリチンのようなＭＲＩイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。別の実施形態では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共にＭＲＩイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、これら２種のタンパク質は相異なる共鳴シグナルによって区別される。
【００３８】
発現ベクターはさらに、第３のレポーター核酸配列を含み得る。この場合、第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の各々が生物発光性タンパク質又は蛍光性タンパク質をエンコードしてよく、これら３種のタンパク質は相異なるものであり、相異なる波長でイメージングできる。一例としては、第１のレポーター核酸配列がＲＬをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＦＬをエンコードし、第３のレポーター核酸配列がガウシアルシフェラーゼ（ＧＬ）をエンコードしてよい。一態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に生物発光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。他の態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に生物発光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。別の態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。さらに他の態様では、第１及び第２のレポーター核酸配列が共に蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてよく、或いはその逆であってもよい。第１のレポーター核酸配列が生物発光性タンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質又はＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてもよい。別の態様では、第１のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列が生物発光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質又はＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてもよい。
【００３９】
第１のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードしてもよい。第１のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードしてもよい。一態様では、第１のレポーター核酸配列がＭＲイメージング可能なタンパク質をエンコードし、第２のレポーター核酸配列が蛍光性タンパク質をエンコードし、第３のレポーター核酸配列がＰＥＴイメージング可能なタンパク質又は生物発光性タンパク質をエンコードしてもよい。
【００４０】
幹細胞をモニタリングするための方法の１以上の実施形態は、第１のレポーター核酸配列及び第２のレポーター核酸配列を含む第１の発現ベクターを幹細胞に送達する段階を含んでいる。本方法はさらに、第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方の発現をイメージングすることで幹細胞をモニタリングする段階を含んでいる。第１のレポーター核酸配列は、１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーター（一例としてはＯｃｔ４プロモーター）を含む第１の発現制御配列と機能的に連結されている。第２のレポーター核酸配列は、１種以上の応答要素特異的タンパク質（一例としてはＧＡＴＡ４タンパク質）の結合に応答する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結されている。第２の発現制御系は、さらに最小プロモーターを含んでいる。発現ベクターはさらに、第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含むことができ、第３の発現制御配列はユビキチンのような構成的プロモーターを含んでいる。
【００４１】
若干の実施形態では、本方法は、第１及び第２の発現ベクターを幹細胞に順次又は同時に送達する段階、次いで細胞をモニタリングする段階を含んでいる。第１の発現ベクターは、Ｏｃｔ４プロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及びＧＡＴＡ４の結合に応答する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含んでいる。第２の発現ベクターは、ユビキチンのような構成的プロモーターを含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列を含んでいる。
【００４２】
若干の他の実施形態では、本方法は、第１、第２又は第３の発現ベクターを幹細胞に順次又は同時に送達する段階、次いで細胞をモニタリングする段階を含み得る。第１の発現ベクターは、Ｏｃｔ４を含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列を含み得る。第２の発現ベクターは、ＧＡＴＡ４の結合に応答する応答要素を含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列、及び該応答要素と機能的に連結された最小プロモーターを含んでいる。第３の発現ベクターは、ユビキチンを含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列を含み得る。
【００４３】
発現ベクターは、トランスフェクション、トランスダクション、ヌクレオフェクション又はこれらの組合せによって幹細胞に送達し得る。発現ベクターはエレクトロポレーションによっても送達でき、これは化学的トランスフェクションより約１０倍効果的である。この方法はまた、外来遺伝子を細胞（特に哺乳動物細胞）に導入するためにも極めて効率的である。例えば、エレクトロポレーションはノックアウトマウスの作製方法並びに腫瘍治療、遺伝子療法及び細胞ベース療法において使用できる。
【００４４】
一実施形態では、発現ベクターは、外来ＤＮＡを真核細胞中に導入するトランスフェクションによって細胞に送達できる。一例では、発現ベクターはヌクレオフェクションによって細胞に送達できる。ヌクレオフェクションは、ニューロン及び休止血液細胞のような非分裂細胞でもトランスフェクトする能力を提供する。他の実施形態では、発現ベクターの送達はＤＮＡナノ粒子技法によっても実施できる。ＤＮＡナノ粒子の移入は、ナノ粒子が細胞に侵入して核内にＤＮＡを遊離させる間にナノ粒子を追跡することにより、リアルタイム蛍光分光分析でモニタリングすることができる。
【００４５】
本発明の有用な幹細胞用送達系としては、センダイウイルスリポソーム送達系、陽イオン性リポソーム、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター及びこれらの組合せが挙げられる。送達ビヒクルとしてのリポソームの使用は、１つの特に興味深い方法である。リポソームは、標的部位の細胞と融合してその内容物を細胞内に送達することができる。
【００４６】
本発明の発現ベクターを含む幹細胞は、様々な生体系に移植できる。患者又はドナー動物から幹細胞試料を採取し、本発明の発現ベクターを挿入することによってエクスビボで修飾し、次いで患者に再移植するか、或いは別のレシピエントに移植すればよい。一例では、患者から幹細胞を採取し、培養で細胞数を拡大し、次いで心臓細胞のような特定の細胞として分化誘導する。かかる方法中の任意の時点で、レポーター核酸配列を含む発現ベクターを細胞中に導入し得る。かかる幹細胞を患者に移植するか、或いは同種又は異種の１以上の異なるレシピエントに移植し得る。次いで、細胞をモニタリングすることで幹細胞に関する様々な細胞段階を決定できる。
【００４７】
細胞への１以上の発現ベクターの送達は、レポータータンパク質の発現をモニタリングすることで観察できる。細胞は、単能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞及び誘導多能性幹細胞から選択された幹細胞であり得る。若干の実施形態では、培養細胞又は培養細胞の子孫は、２以上のレポーター核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【００４８】
幹細胞の分化状態をモニタリングするための方法は、インビボで実施される。幹細胞の分化状態は、特に限定されないが、筋肉組織、結合組織、神経組織、心臓組織及び脂肪組織を含む様々な組織でモニタリングすることができる。幹細胞のモニタリングは、幹細胞の存在、不存在、濃度、局在又は分化状態を確認し得る。発光性又は蛍光性レポータータンパク質から生じる光の強度に応じ、幹細胞の濃度を決定できる。イメージングされた細胞のモニタリング及び追跡により、特定の組織又は器官における特定の時点での幹細胞の局在を決定できる。様々なレポータータンパク質の色変化に応じ、分化又は多分化能性の段階を識別できる。
【００４９】
幹細胞には、第１、第２及び第３のレポーター核酸配列を含む発現ベクターをトランスフェクトし得る。第１のレポーター核酸配列は、細胞が幹細胞である場合にのみ活性化される細胞特異的プロモーターであるＯｃｔ４プロモーターと機能的に連結されている。したがって、第１のレポーター核酸は、細胞が多分化能性幹細胞である場合に発現されるレポータータンパク質をエンコードしている。しかし、このレポータータンパク質は幹細胞が分化状態にある場合には発現されない。第２のレポーター核酸配列は、ＧＡＴＡ４タンパク質の結合に対する応答要素と機能的に連結されている。ＧＡＴＡ４タンパク質は、細胞が心臓細胞である場合にのみ活性化される細胞特異的タンパク質である。したがって、第２のレポーター核酸は、細胞が心臓細胞である場合に発現されるレポータータンパク質をエンコードしている。しかし、このレポータータンパク質は心臓細胞が幹細胞に脱分化した場合には発現されない。
【００５０】
幹細胞をモニタリングするための本発明のキットの一実施形態は、発現ベクターを含んでいる。発現ベクターは、第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含み得る。第１の発現制御配列はＯｃｔ４プロモーターを含み、第２の発現制御配列はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素及び最小プロモーターを含んでいる。
【００５１】
本キットは、さらに追加の発現ベクターを含み得る。追加の発現ベクターは、ユビキチンのような構成的プロモーターを含む発現制御配列と機能的に連結されたレポーター核酸配列を含み得る。本キットはまた、（例えば、凍結状態の）細胞及び／又は細胞を培養するための培地を含み得る。本キットはさらに、発現ベクター及び／又は細胞の取扱い、細胞への発現ベクターの送達、或いは細胞の培養に関するプロトコルを含み得る。本キットは、キットの使用方法を記載した使用説明書と共にパッケージすることができる。特定の実施形態では、本キットは発現ベクターを含む幹細胞又は幹細胞の子孫を含み得る。この場合、発現ベクターは、Ｏｃｔ４プロモーターと機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、並びにＧＡＴＡ４タンパク質の結合に対する応答要素及び最小プロモーターと機能的に連結された第２のレポーター核酸配列を含み得る。
【００５２】
治療用途のための源としてＥＳ細胞を使用する場合、問題は移植ＥＳ細胞の免疫拒絶及び腫瘍形成性である。移植ＥＳ細胞の免疫拒絶に関連するこのような問題は、患者から採取した体細胞の再プログラミングによって生成された患者特異的な多分化能性幹細胞を使用することで排除できる。ＥＳ細胞の多分化能性のインビトロ及びインビボ評価は、腫瘍形成性の検出及び腫瘍形成性を防止するための方策の開発において役立ち得る。
【実施例１】
【００５３】
無血清培地を用いた未分化胚性幹細胞の培養
マウスＥＳ−Ｄ３細胞株（ＣＲＬ−１９３４）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、米国ヴァージニア州）から入手した。空気中５％ＣＯ2を有する給湿インキュベーター内において１０００ＩＵ／ｍＬの白血病阻害因子（ＬＩＦ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、ＥＳＧＲＯ、ＥＳＧ１１０７）と共に３７℃でインキュベートすることで、ＥＳ細胞を未分化の多能性状態に維持した。０．１％ゼラチン被覆プラスチック皿上において、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地であるＥＳ培地を用いてＥＳ細胞を培養した。イーグル培地には、１５％のノックアウト血清リプレースメント、０．１ｍｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノール及び２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンを補充した。ＥＳ培地は毎日交換し、ＥＳ細胞は２〜３日毎に継代した。
【実施例２】
【００５４】
胚性幹細胞のインビトロ分化
ＬＩＦを除去して高濃度のウシ胎児血清を添加することで、ＥＳ細胞のインビトロ分化を実施した。０．１％ゼラチン被覆プラスチック皿上において、１５％のウシ胎児血清、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのモノチオグリセロール及び２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタマックスを補充したＩｓｃｏｖｅのダルベッコ改変イーグル培地を含む分化培地中でＥＳ細胞を培養した。ＥＳ用の培地は、コエレンテラジン又はＤ−ルシフェリンで細胞の光学イメージングを行った後に毎日交換した。
【実施例３】
【００５５】
幹細胞特異的かつ構成的プロモーター駆動光学レポーター遺伝子系の構築
幹細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターの遺伝子フラグメントを、ＨｉｎｄIII及びＮｏｔＩ制限酵素での制限消化によってプラスミドから遊離させた。ｐＲＬ−ＣＭＶベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＣＭＶプロモーター領域中にＮｏｔＩ制限酵素部位を生成し、次いでＨｉｎｄIII及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。Ｏｃｔ４プロモーターの付着末端フラグメントをレニラルシフェラーゼ遺伝子の上流領域でｐＲＬ−ＣＭＶベクター中に連結することで、Ｏｃｔ４プロモーター駆動レニラルシフェラーゼ構築物（Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ）を作製した。ＨｉｎｄIII及びＢｇｌII制限酵素でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃからＯｃｔ４プロモーターの遺伝子フラグメントを遊離させ、多重クローニング部位のｐＧＬ４．１０ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に連結することで、Ｏｃｔ４プロモーター駆動ヒト化ホタルルシフェラーゼ構築物（Ｏｃｔ４−ＦＬｕｃ２）を作製した。Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを有するＥＳ細胞を作製するため、Ｏｃｔ４プロモーター駆動ｈＲＬｕｃセグメントをＢｇｌII及びＸｂａＩ制限酵素でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃから遊離させ、同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ ３．１ピューロ中に連結した（ピューロＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ）。ユビキチンプロモーター駆動ホタルルシフェラーゼ−エンハンスト緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質を含むレントウイルスベクター（Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ）を作製した。
【００５６】
ｅＧＦＰと融合したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエンコードする二官能性レポーター遺伝子系を生成するため、ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ及び切頭ヘルペス・シンプレックスチミジンキナーゼを含む三重融合レポーター遺伝子構築物からＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ（ＦＧ）をＰＣＲ増幅した。下記のプライマーを用いて、ｅＧＦＰに対する停止コドン並びにそれぞれ５’末端及び３’末端におけるクローニング部位ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩを生成した。使用したプライマーは、５’−ｇｃｇｇａｔｃｃＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡ−３’（配列番号１）及び５’−ｇｃｇｇｔａｃｃｃｔａＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号２）であった。次いで、このフラグメントをｐＨＲＧ（レニラルシフェラーゼ遺伝子を含むプロモーター無しのレポータープラスミド）中にクローニングしてｐＨＲＦＧを創製した。下記のプライマーを用いてｐＦＵＧからユビキチンプロモーターをＰＣＲ増幅することで、５’末端にＣｌａＩ部位を生成した。使用したプライマーは、５’−ｇｇｇｇａｔｃｇａｔＡＡＣＣＣＧＴＧＴＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣ−３’（配列番号４）であった。次いで、このフラグメントをｐＨＲＦＧのＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ部位に連結してｐＨＲＵＦＧを創製した。最後に、２つの異なる遺伝子Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰに対する２つの発現制御配列を含むベクター（図１）を作製した。図１は、構成的ユビキチンプロモーター及び細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターを含む本発明の構築物を示している。
【実施例４】
【００５７】
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＯｃｔ４−ＦＬｕｃ２の一時的トランスフェクション並びにホタル及びレニラルシフェラーゼアッセイによるその幹細胞特異性の評価
マウスＥＳ細胞、ラット筋芽細胞（Ｈ９Ｃ２）及びヒト腎臓癌細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）に、リポソームに基づく方法でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＰｏｃｔ４−ＦＬｕｃ２を一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションのためには２００ｎｇ／ウェルのＤＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を使用した。特記しない限り、すべての一時的トランスフェクション試験において、５ｎｇ／ウェルの他の光学レポーター（例えば、ＣＭＶプロモーター駆動ＦＬｕｃ２（ＣＭＶ−ＦＬｕｃ２）又はＣＭＶプロモーター駆動ｈＲＬｕｃ（ＣＭＶ−ｈＲＬｕｃ））をトランスフェクション基準化のために使用した。マウスＥＳ細胞、Ｈ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔに、対照としてＣＭＶ−ｈＲＬｕｃ及びＣＭＶ−ＦＬｕｃ２を一時的にトランスフェクトした。一時的トランスフェクションから４８時間後にホタル及びレニラルシフェラーゼアッセイを実施した。ホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼ活性に関するルミノメーターアッセイを下記のようにして実施した。簡単に述べれば、Ｐｒｏｍｅｇａ社から供給された氷冷１×受動溶解緩衝液２００ｍｌ中でトランスフェクト細胞を溶解し、氷上で１５分間振盪した。細胞溶解物を４℃で１．３×１０4ｇで５分間遠心して細胞破片を除去した。レニラルシフェラーゼ活性を測定するため、２０ｍｌの上澄み液にｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌに溶解した０．５ｍｇのコエレンテラジンを添加し、次いでルミノメーター（モデルＴ ２０／２０、Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ社、サニーベール、米国カリフォルニア州）で１０秒間光子計数することで分析した。ホタルルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ社からのルシフェラーゼアッセイ試薬II（ＬＡＲII）基質をコエレンテラジンの代わりに使用した点を除き、レニラルシフェラーゼ活性に関して記載されたようにして測定した。細胞溶解物中のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）によって測定した。レニラルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性を用いてタンパク質含有量及びトランスフェクション効率について基準化し、相対光単位（ＲＬＵ）／マイクログラム（タンパク質）／分（計数時間）として表した。ホタルルシフェラーゼ活性もまた、レニラルシフェラーゼ活性を用いてタンパク質含有量及びトランスフェクション効率について基準化した。
【００５８】
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＣＭＶ−ｈＲＬｕｃトランスフェクションでは、マウスＥＳ細胞はより高いＯｃｔ４プロモーター活性を示したが、ＣＭＶプロモーター活性はＨ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に比べて同等以下であった。（ＣＭＶプロモーター活性によって基準化した）Ｏｃｔ４プロモーター活性は、マウスＥＳ細胞では、Ｈ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に比べてそれぞれ４３倍及び６４７倍高かった（Ｔ検定、ｐ＝０．００２）。Ｏｃｔ４−ＦＬｕｃ２及びＣＭＶ−ＦＬｕｃ２トランスフェクションでは、マウスＥＳ細胞はより高いＯｃｔ４プロモーター活性を示したが、ＣＭＶプロモーター活性はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞より低かった。ＣＭＶプロモーター活性によって基準化したＯｃｔ４プロモーター活性は、マウスＥＳ細胞では、ＨＥＫ−２９３細胞に比べて４０１倍高かった（Ｔ検定、ｐ＝０．００１）。図２Ａ〜２Ｄは、胚性幹細胞に対するＯｃｔ４発現の特異性を分化成体細胞株と比較して示すグラフである。図２ＡはマウスＥＳ細胞に関してＨ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞より高いＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性を示しているが、ＣＭＶプロモーター活性はＨ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に比べて同等以下であった。図２ＢはＣＭＶ−ｈＲＬｕｃ活性によって基準化されたＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性を示しており、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性はＨ９Ｃ２及びＨＥＫ−２９３細胞のものより有意に高かった。図２ＣはマウスＥＳ細胞に関してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞より高いＯｃｔ４−ＦＬｕｃ２活性を示しているが、ＣＭＶプロモーター活性はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞より低かった。図２ＤはＣＭＶ−ＦＬｕｃ２活性によって基準化されたＯｃｔ４−ＦＬｕｃ２活性を示しており、Ｏｃｔ４−ＦＬｕｃ２活性はＨＥＫ−２９３細胞のものより有意に高かった。
【実施例５】
【００５９】
一時的なＥＳ細胞トランスフェクション及びＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性の経時的変化
マウスＥＳ細胞に、リポソームに基づく方法でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＣＭＶ−ＦＬｕｃ２を一時的にトランスフェクトし、分化培地中で培養した。トランスフェクションから１〜６日後の期間において、ルミノメーターアッセイを用いてホタル及びレニラルシフェラーゼアッセイを実施した。細胞当たりのＯｃｔ４プロモーター活性を評価するため、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性をＣＭＶ−ＦＬｕｃ２活性によって基準化した。
【００６０】
マウスＥＳ細胞において、ＣＭＶプロモーター活性によって基準化されたＯｃｔ４プロモーター活性を測定した。マウスＥＳ細胞に、リポソームを用いてＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＣＭＶ−ＦＬｕｃ２を一時的にトランスフェクトした。Ｏｃｔ４活性はトランスフェクションから２日後に最も高く、次いで活性は４日間にわたって徐々に減少した。図３は、トランスフェクトされたマウスＥＳ細胞がトランスフェクションから２日後に最も高い基準化ＲＬｕｃ活性を示し、その後は基準化ＲＬｕｃ活性が経時的に徐々に減少することを示している。
【実施例６】
【００６１】
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ−ｅＧＦＰを有する安定なＥＳ細胞の作製
マウスＥＳ細胞に、リポソームに基づくトランスフェクションによってピューロＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ−ｅＧＦＰをトランスフェクトし、ピューロマイシン（濃度５００ｎｇ／ｍｌ）で選択した。Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを安定に発現するマウスＥＳ細胞を得た後、かかる細胞を８μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ社）を含むＯｐｔｉＭＥＭ中に再懸濁した。３７℃及び５％ＣＯ2の細胞培養インキュベーター内において、５の感染多重度で細胞に３時間形質導入した。３時間後、新鮮な増殖培地を細胞に添加した。細胞を４８〜７２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー及びバイオルミネセンスイメージングによって選別し分析した。ウイルスのトランスフェクト効率は７１％であり、最高のｅＧＦＰ発現を示す細胞を選別してさらなる実験に供した。
【実施例７】
【００６２】
分化培地を用いた培養細胞におけるＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ活性の変化
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰの両方を安定に発現するマウスＥＳ細胞を、無血清ＥＳ細胞維持培地を用いて６ウェルプレート上にプレーティングした（１０5／ウェル）。２４時間後、細胞を分化培地に移した。冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、アラメダ、米国カリフォルニア州）を用いたバイオルミネセンスイメージングにより、Ｄ−ルシフェリン及びコエレンテラジンを用いてレニラルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６３】
分化培地を用いた細胞培養物においてＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞のｈＲＬｕｃ及びＦｌｕｃ２活性を経時的に測定した。Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ活性は細胞数の増加と共に増加するのに対し、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性は分化培地中では細胞数の増加にかかわらず減少する（図４Ａ）。Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性をＵｂｉｑ−Ｆｌｕｃ活性によって基準化した場合、両活性とも経時的に減少する（図４Ｂ）。図４Ａ〜４Ｂは、分化培地中においてＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞のルシフェラーゼ活性を経時的に示すグラフである。ＰＣＲ分析は、Ｏｃｔ４ ｍＲＮＡレベルの経時的な減少を示した。図５は、経時的に減少するＯｃｔ４のＰＣＲ増幅ｍＲＮＡレベルを示している。
【実施例８】
【００６４】
生きているマウスにおけるマウスＥＳ細胞異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ活性の変化
動物の取扱いは、スタンフォード大学動物研究委員会のガイドラインに従って行った。すべての注射及びイメージング処置中には、マウスをイソフルオラン（１００％酸素中２％イソフルラン、１Ｌ／分）を用いてガス麻酔した。冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ２９、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いてマウスのイメージングを行った。マウスＥＳ細胞（１×１０6）に、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定にコトランスフェクトした。次いで、細胞を７週齢の雌マウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に移植した。生きているマウスにおける移植ＥＳ細胞中のＯｃｔ４プロモーター活性を測定するため、５％エタノールと９５％ＰＢＳとの混合物に溶解した２０μｇのコエレンテラジン（最終容量２００μＬ）を尾静脈から注射し、１分の取得時間を有するＩＶＵＳシステムを用いてマウスを直ちにイメージングした。動物を光密チャンバー内に入れ、低レベル照明の下でグレースケールの参照画像を得た。画像は、移植細胞から放出される光子を集めた後、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｚｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）及びＩｇｏｒ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ社）を用いて得た。測定された光を定量化するため、移植細胞の領域にわたって平均及び最大光子数／秒／平方センチメートル／ステラジアンを求めた。
【００６５】
生きているマウスにおける移植ＥＳ細胞中でのユビキチンプロモーター活性を測定するため、ＰＢＳ中に溶解した３ｍｇのＤ−ルシフェリン（最終容量２００μＬ）を尾静脈から注射し、５分後に１分の取得時間を有するＩＶＵＳシステムを用いてマウスをイメージングし、光出力が最大点に達するまで続けた。データ解析は、上述したコエレンテラジンイメージングの場合と同じであった。
【００６６】
Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを安定に発現するマウスＥＳ細胞をモニタリングすることで、ルシフェラーゼ活性を測定した。異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性は急速に減少した。２４時間後に画像を取得したが、この時点でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性はマウスＥＳ細胞の移植から５分後に測定した活性の約１．７％であった。Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃも減少し、移植から２４時間後に画像を取得した時点で初期活性の１９％になったが、その後に活性は徐々に増加した。図６Ａ〜６Ｄは、生きているマウスにおける異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ活性の変化を示している。図６Ａ及び図６Ｂは、異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性が急速に減少し、２４時間後には細胞の移植から５分後に測定した活性の１．７％になったことを示している。図６Ｃ及び図６Ｄは、Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ活性が徐々に減少し、２４時間後には細胞の移植から５分後に測定した活性の１９％になったが、その後は徐々に増加したことを示している。図６Ａ〜６Ｂは、移植片から２４時間以内にシグナルの急速な減少を示した異種移植片のＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ活性をイメージングすることで得た細胞分化状態の画像を示している。図６Ｃは、Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ活性が最初は減少したが細胞の生存を追跡した７２時間後には徐々に増加したことをグラフであり、図６Ｄは、Ｕｂｉｑ−ＦＬｕｃ活性をイメージングすることで得た移植後のマウスの一連の画像を示している。
【実施例９】
【００６７】
ＧＡＴＡ−４応答要素レポーター遺伝子系（ＧＲＥＲＧ）の創製
内胚葉及び心臓分化にとって決定的に重要なＧＡＴＡ４結合タンパク質の発現を測定するため、転写因子応答性レポーター遺伝子イメージング技法を開発した。ＧＡＴＡ４結合配列の４つのコピーを、ヒト化ホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動する（ＰＧ５ｌｕｃベクターからの）最小レポーターと連結することで、ＧＡＴＡ４結合タンパク質応答要素レポーター遺伝子系（ＧＲＥＲＧ）を構築した。（Ｐｒｏｍｅｇａ社からの）ＰＧＬ４．１０を骨格として使用した。４つのＧＡＴＡ結合配列及びアデノウイルスの主後期プロモーター配列をｐＧＬ４．１０の多重クローニング部位に順次に挿入した。ＧＡＴＡ応答要素を挿入するためにはＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII制限酵素部位を使用した（図７）。図７に示すように、４つのＧＡＴＡ結合配列及びアデノウイルスの主後期プロモーター配列をｐＧＬ４．１０の多重クローニング部位に順次に挿入した。
【実施例１０】
【００６８】
ＧＡＴＡ４結合タンパク質を産生するベクターの作製
ＧＡＴＡ４結合タンパク質に対するｃＤＮＡを有するプラスミドをＯｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から購入した。ｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩの制限酵素部位をＰＣＲ増幅ＤＮＡの各端に導入した。興味ある遺伝子を、ｐｃＤＮＡ ３．１ベクター（図８）を発現する哺乳動物細胞中にクローニングした。ベクターをＨＥＫ ２９３細胞中にトランスフェクトし、ＧＡＴＡ４結合タンパク質の発現を評価した。ベクターをトランスフェクトした細胞は、ＧＡＴＡ４結合タンパク質ｍＲＮＡのより高い発現を示した（図９）。図９は、ＧＡＴＡ４タンパク質をエンコードするｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を示す画像である。
【実施例１１】
【００６９】
レポーター遺伝子発現：ルミノメーターアッセイ（インビトロ）及びバイオルミネセンスイメージング（インビボ）
構築された発現ベクターをＨＥＫ ２９３細胞にコントランスフェクトすることで、ＧＡＴＡ４結合タンパク質応答要素駆動レポーター遺伝子系（ＧＲＥＲＧ）の発現を判定した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。適当なベクター用量を最適化するため、数種の濃度のＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを適用した。ＧＲＥＲＧのルシフェラーゼ活性は、図１０に示すようにＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターのコトランスフェクションでＧＲＥＲＧの活性を高めるルミノメーターアッセイによって測定した。一定濃度のＧＲＥ−ルシフェラーゼをトランスフェクトすると共に、ＧＡＴＡ結合タンパク質を発現するプラスミドベクターを増加する濃度でコトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞からのルシフェラーゼ活性を測定した（ルミノメーター）。ＧＡＴＡ４タンパク質の発現の増加は、ＧＡＴＡ４応答要素と結合することによってルシフェラーゼの発現を活性化する。
【００７０】
ＧＲＥＲＧ活性の増加率（約６倍）は、ＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターの濃度に比例している。ＨＥＫ ２９３細胞における（ＩＶＵＳを用いた）バイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）アッセイにより、ＧＲＥＲＧに関するルシフェラーゼ活性を測定した。ＧＲＥＲＧのＢＬＩ活性もまた、ＨＥＫ ２９３細胞にＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターをコトランスフェクトすることで増加した。ＧＲＥＲＧの活性は、１μｇのＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを細胞にコトランスフェクトした場合、（ＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを含まない）単独のＧＲＥＲＧに比べて約６倍に増加した。図１１は、一定濃度のＧＲＥ−ルシフェラーゼをトランスフェクトすると共に、ＧＡＴＡ結合タンパク質を発現するプラスミドベクターを増加する濃度でコトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から（ＣＣＤカメライメージングで）測定したルシフェラーゼ活性の棒グラフである。ＧＡＴＡ４タンパク質の発現の増加は、ＧＡＴＡ４応答要素と結合することによってルシフェラーゼの発現を活性化する。
【００７１】
構築された発現ベクターをＨＣＴ １１６細胞にコトランスフェクトすることで、ＧＡＴＡ４結合タンパク質応答要素レポーター遺伝子系（ＧＲＥＲＧ）の発現を測定した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって行った。ベクター用量を最適化するため、ＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを数種の濃度で適用した。（ＩＶＵＳを用いた）ＢＬＩによって測定したＧＲＥＲＧのルシフェラーゼ活性もまた、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞にＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターをコトランスフェクトすることで増加した。ＧＲＥＲＧの活性は、図１２に示すように、１．５μｇのＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを細胞にコトランスフェクトした場合、（ＧＡＴＡ４結合タンパク質発現ベクターを含まない）単独のＧＲＥＲＧに比べて約１６倍に増加した。一定濃度のＧＲＥ−Ｆｌｕｃレポーターをトランスフェクトすると共に、ＧＡＴＡ結合タンパク質を様々な用量でコトランスフェクトしたＨＣＴ １１６結腸癌細胞からのルシフェラーゼ活性をバイオルミネセンスイメージングによって測定した（図１２）。（ＩＶＵＳを用いた）ＢＬＩアッセイによって測定したＧＲＥＲＧのルシフェラーゼ活性はまた、図１３に示すように、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞を５−アザシチジンで処理することによっても増加した。ＧＲＥ−ＦＬＵＣをトランスフェクトしたＨＣＴ １１６結腸癌細胞においては、ルシフェラーゼ発現は５−アザシチジンでの処理後に時間（１〜３時間）と共に増加する。５−アザシチジンは、通常は内因性ＧＡＴＡ発現を活性化する。
【実施例１２】
【００７２】
幹細胞特異的、構成的かつ誘導可能なプロモーター駆動光学レポーター遺伝子系の構築
幹細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターの遺伝子フラグメントを、ＨｉｎｄIII及びＮｏｔＩ制限酵素での制限消化によってプラスミドから遊離させた。Ｏｃｔ４プロモーターの付着末端フラグメントをレニラルシフェラーゼ遺伝子の上流領域でｐＲＬ−ＣＭＶベクター中に連結することで、Ｏｃｔ４プロモーター駆動レニラルシフェラーゼ構築物（Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ）を作製した。Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを有するＥＳ細胞を作製するため、Ｏｃｔ４プロモーター駆動ｈＲＬｕｃセグメントをＢｇｌII及びＸｂａＩ制限酵素でＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃから遊離させ、同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ ３．１ピューロ中に連結した（ピューロＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ）。
【００７３】
ｅＧＦＰと融合したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエンコードする二官能性レポーター遺伝子系を生成するため、ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ及び切頭ヘルペス・シンプレックスチミジンキナーゼを含む三重融合レポーター遺伝子構築物からＦＬｕｃ−ｅＧＦＰ（ＦＧ）をＰＣＲ増幅した。次いで、このフラグメントをｐＨＲＧ（レニラルシフェラーゼ遺伝子を含むプロモーター無しのレポータープラスミド）中にクローニングしてｐＨＲＦＧを創製した。下記のプライマーを用いてｐＦＵＧからユビキチンプロモーターをＰＣＲ増幅することで、５’末端にＣｌａＩ部位を生成した。使用したプライマーは、５’−ｇｇｇｇａｔｃｇａｔＡＡＣＣＣＧＴＧＴＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣ−３’（配列番号４）であった。次いで、このフラグメントをｐＨＲＦＧのＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ部位に連結してｐＨＲＵＦＧを創製した。さらに、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃを含むｐｃＤＮＡ ３．１中にユビキチンに対する発現制御配列をクローニングすることで、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを有する構築物を形成した。ＧＡＴＡ４結合タンパク質に対するｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩの制限酵素部位をＰＣＲ増幅ＤＮＡの各端に導入した。興味ある遺伝子を、ｐｃＤＮＡ ３．１ベクターを発現する哺乳動物細胞中にクローニングした。最後に、Ｏｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＯｃｔ４−ｈＲＬｕｃ及びＵｂｉｑ−ＦＬｕｃ−ｅＧＦＰを含むｐｃＤＮＡ ３．１中にＧＲＥＲＧ配列を導入することで、３つの発現制御配列を有するベクターを形成した（図１４）。
【００７４】
以上、本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明してきたが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の技術的範囲に含まれるこのような修正及び変更のすべてを包含するように意図されていることを理解すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞をモニタリングするための発現ベクターであって、
プロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び
第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列
を含んでなり、第２の発現制御配列は細胞分化又は脱分化の１以上のステージに応答して活性化又は不活性化する応答要素を含む、発現ベクター。
【請求項２】
１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び
１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列
を含んでなる発現ベクター。
【請求項３】
プロモーターがＯｃｔ４、ＦｏｘＤ３、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇから選択される、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項４】
プロモーターがＯｃｔ４である、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項５】
応答要素特異的タンパク質がＧＡＴＡ４である、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項６】
細胞特異的タンパク質がＦＬＫ−１、ＢＭ８８及びＨＬＡ−Ｄｒａから選択される、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項７】
第２の発現制御配列がさらに、応答要素と機能的に連結された最小プロモーターを含む、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項８】
最小プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター及びＴＡＴＡ Ｂｏｘプロモーターからなる群から選択される、請求項７記載の発現ベクター。
【請求項９】
応答要素がＧＡＴＡ−４タンパク質結合配列の４回以上の反復を含む、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１０】
さらに、第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含む、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１１】
第３の発現制御配列が構成的プロモーターを含む、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
構成的プロモーターがユビキチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）又はヒトＲＯＳＡプロモーターである、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の少なくとも１つが、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、陽電子放出断層撮影、単光子放出コンピューター断層撮影又はこれらの組合せによってイメージング可能なポリペプチドをエンコードする、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１４】
第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方が、陽電子放出断層撮影によってイメージング可能なポリペプチドをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１５】
第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方が、基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１６】
第１及び第２のレポーター核酸配列の両方が、基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１７】
基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドをエンコードする第１及び第２のレポーター核酸配列の一方が、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ及びガウシアルシフェラーゼから選択される、請求項１５又は請求項１６記載の発現ベクター。
【請求項１８】
第１又は第２のレポーター核酸配列或いはその両方がそれ自体で蛍光を発するポリペプチドをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１９】
第１のレポーター核酸配列がレニラルシフェラーゼをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がホタルルシフェラーゼをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項２記載の発現ベクターを含む培養細胞。
【請求項２１】
請求項１記載の発現ベクターを含む、請求項２０記載の培養細胞の子孫。
【請求項２２】
幹細胞をモニタリングするための方法であって、
第１のレポーター核酸配列及び第２のレポーター核酸配列を含む第１の発現ベクターを幹細胞に送達する段階、並びに
第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方の発現をイメージングすることで幹細胞をモニタリングする段階
を含んでなり、第１のレポーター核酸配列は１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結されており、第２のレポーター核酸配列は１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結されている、方法。
【請求項２３】
プロモーターがＯｃｔ４、ＦｏｘＤ３、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇから選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
プロモーターがＯｃｔ４である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
応答要素特異的タンパク質がＧＡＴＡ４である、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
応答要素特異的タンパク質がＦＬＫ−１、ＢＭ８８及びＨＬＡ−Ｄｒａから選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
第２の発現制御配列がさらに、応答要素と機能的に連結された最小プロモーターを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
最小プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター及びＴＡＴＡ Ｂｏｘプロモーターからなる群から選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
発現ベクターがさらに、第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
第３の発現制御配列が構成的プロモーターを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の少なくとも１つが、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、陽電子放出断層撮影、単光子放出コンピューター断層撮影又はこれらの組合せによってイメージング可能なポリペプチドをエンコードする、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
第１及び第２のレポーター核酸配列のいずれか一方又は両方が、基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドをエンコードする、請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ及びガウシアルシフェラーゼから選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
幹細胞が、単能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、誘導多能性幹細胞及びこれらの組合せから選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
発現ベクターが、トランスフェクション、トランスダクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション又はこれらの組合せによって幹細胞に送達される、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
幹細胞のモニタリング段階が生きている被験体において実施される、請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
モニタリング段階が、幹細胞の存在、不存在、濃度、局在又は分化状態を確認することを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３８】
分化状態があるタイプの成体細胞から幹細胞への脱分化を示す、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
さらに、モニタリング段階に先立って第２の発現ベクターを幹細胞に送達する段階を含み、第２の発現ベクターは構成的プロモーターを含む第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項４０】
幹細胞をモニタリングするためのキットであって、
第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び
第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列
を含む発現ベクターを含んでなり、第１の発現制御配列はＯｃｔ４プロモーターを含み、第２の発現制御配列はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素を含む、キット。
【請求項４１】
さらに追加の発現ベクターを含み、追加の発現ベクターは構成的プロモーターを含む第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含む、請求項４０記載のキット。
【請求項４２】
１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び
１種以上の細胞特異的タンパク質によって調節される細胞特異的プロモーターを含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列
を含んでなる発現ベクター。
【請求項１】
幹細胞をモニタリングするための発現ベクターであって、
プロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び
第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列
を含んでなり、第２の発現制御配列は細胞分化又は脱分化の１以上のステージに応答して活性化又は不活性化する応答要素を含む、発現ベクター。
【請求項２】
１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び
１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列
を含んでなる発現ベクター。
【請求項３】
プロモーターがＯｃｔ４、ＦｏｘＤ３、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇから選択される、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項４】
プロモーターがＯｃｔ４である、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項５】
応答要素特異的タンパク質がＧＡＴＡ４である、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項６】
細胞特異的タンパク質がＦＬＫ−１、ＢＭ８８及びＨＬＡ−Ｄｒａから選択される、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項７】
第２の発現制御配列がさらに、応答要素と機能的に連結された最小プロモーターを含む、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項８】
最小プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター及びＴＡＴＡ Ｂｏｘプロモーターからなる群から選択される、請求項７記載の発現ベクター。
【請求項９】
応答要素がＧＡＴＡ−４タンパク質結合配列の４回以上の反復を含む、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１０】
さらに、第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含む、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１１】
第３の発現制御配列が構成的プロモーターを含む、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
構成的プロモーターがユビキチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）又はヒトＲＯＳＡプロモーターである、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の少なくとも１つが、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、陽電子放出断層撮影、単光子放出コンピューター断層撮影又はこれらの組合せによってイメージング可能なポリペプチドをエンコードする、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１４】
第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方が、陽電子放出断層撮影によってイメージング可能なポリペプチドをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１５】
第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方が、基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１６】
第１及び第２のレポーター核酸配列の両方が、基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１７】
基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドをエンコードする第１及び第２のレポーター核酸配列の一方が、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ及びガウシアルシフェラーゼから選択される、請求項１５又は請求項１６記載の発現ベクター。
【請求項１８】
第１又は第２のレポーター核酸配列或いはその両方がそれ自体で蛍光を発するポリペプチドをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項１９】
第１のレポーター核酸配列がレニラルシフェラーゼをエンコードし、第２のレポーター核酸配列がホタルルシフェラーゼをエンコードする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項２記載の発現ベクターを含む培養細胞。
【請求項２１】
請求項１記載の発現ベクターを含む、請求項２０記載の培養細胞の子孫。
【請求項２２】
幹細胞をモニタリングするための方法であって、
第１のレポーター核酸配列及び第２のレポーター核酸配列を含む第１の発現ベクターを幹細胞に送達する段階、並びに
第１及び第２のレポーター核酸配列の少なくとも一方の発現をイメージングすることで幹細胞をモニタリングする段階
を含んでなり、第１のレポーター核酸配列は１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結されており、第２のレポーター核酸配列は１種以上の応答要素特異的タンパク質の結合に応答する応答要素を含む第２の発現制御配列と機能的に連結されている、方法。
【請求項２３】
プロモーターがＯｃｔ４、ＦｏｘＤ３、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇから選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
プロモーターがＯｃｔ４である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
応答要素特異的タンパク質がＧＡＴＡ４である、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
応答要素特異的タンパク質がＦＬＫ−１、ＢＭ８８及びＨＬＡ−Ｄｒａから選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
第２の発現制御配列がさらに、応答要素と機能的に連結された最小プロモーターを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
最小プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター及びＴＡＴＡ Ｂｏｘプロモーターからなる群から選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
発現ベクターがさらに、第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
第３の発現制御配列が構成的プロモーターを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
第１、第２及び第３のレポーター核酸配列の少なくとも１つが、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、陽電子放出断層撮影、単光子放出コンピューター断層撮影又はこれらの組合せによってイメージング可能なポリペプチドをエンコードする、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
第１及び第２のレポーター核酸配列のいずれか一方又は両方が、基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドをエンコードする、請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
基質と反応してバイオルミネセンスを生じるポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ及びガウシアルシフェラーゼから選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
幹細胞が、単能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、誘導多能性幹細胞及びこれらの組合せから選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
発現ベクターが、トランスフェクション、トランスダクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション又はこれらの組合せによって幹細胞に送達される、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
幹細胞のモニタリング段階が生きている被験体において実施される、請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
モニタリング段階が、幹細胞の存在、不存在、濃度、局在又は分化状態を確認することを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３８】
分化状態があるタイプの成体細胞から幹細胞への脱分化を示す、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
さらに、モニタリング段階に先立って第２の発現ベクターを幹細胞に送達する段階を含み、第２の発現ベクターは構成的プロモーターを含む第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項４０】
幹細胞をモニタリングするためのキットであって、
第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び
第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列
を含む発現ベクターを含んでなり、第１の発現制御配列はＯｃｔ４プロモーターを含み、第２の発現制御配列はＧＡＴＡ４タンパク質の結合に応答する応答要素を含む、キット。
【請求項４１】
さらに追加の発現ベクターを含み、追加の発現ベクターは構成的プロモーターを含む第３の発現制御配列と機能的に連結された第３のレポーター核酸配列を含む、請求項４０記載のキット。
【請求項４２】
１以上の多分化能性マーカーに対するプロモーターを含む第１の発現制御配列と機能的に連結された第１のレポーター核酸配列、及び
１種以上の細胞特異的タンパク質によって調節される細胞特異的プロモーターを含む第２の発現制御配列と機能的に連結された第２のレポーター核酸配列
を含んでなる発現ベクター。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１３−５０３６４８（Ｐ２０１３−５０３６４８Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２８３３６（Ｐ２０１２−５２８３３６）
【出願日】平成２２年９月６日（２０１０．９．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６３０５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２９７９８
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月６日（２０１０．９．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６３０５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２９７９８
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【Ｆターム（参考）】
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