幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤
【課題】ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有する物質を見出し、当該物質を有効成分とするＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤を提供する。
【解決手段】ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤に、アンペロプシンを有効成分として含有せしめる。
【解決手段】ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤に、アンペロプシンを有効成分として含有せしめる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞増殖因子（Stem Cell Factor，ＳＣＦ）は、Must Cell Growth Factor、C-Kit Ligand、Steel Factor等とも呼ばれ、角化細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨髄ストローマ細胞等から産生されるタンパク質である。ＳＣＦは、多能性造血幹細胞、生殖細胞、肥満細胞、巨核球系前駆細胞、顆粒球・マクロファージ系前駆細胞、色素細胞等の増殖や分化を促進する作用を有することが知られている。また、ＳＣＦは、シミ部位や紫外線照射等によって発現が亢進することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
ＳＣＦとしては、２７３のアミノ酸残基からなる膜結合型ＳＣＦと、タンパク質分解酵素の作用により切断され、膜から遊離する分泌型ＳＣＦとが知られている。膜結合型ＳＣＦは、角化細胞等に結合したまま色素細胞のＳＣＦレセプターに結合し、色素細胞の増殖を促進する。また、分泌型ＳＣＦは、その結合部位にて切断され、細胞膜から遊離し、色素細胞のＳＣＦレセプターに結合することによって、色素細胞の増殖を促進する。さらに、ＳＣＦは、急性骨髄性白血病患者において、インターロイキン−３（Interleukin-3，ＩＬ−３）や顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor，ＧＭ−ＣＳＦ）の共存下で骨髄芽球の増殖を促進することが知られている（非特許文献２参照）。
【０００４】
塩基性線維芽細胞増殖因子（basic Fibroblast Growth Factor，ｂＦＧＦ）は、ＦＧＦ−２とも呼ばれ、紫外線照射により角化細胞からの遊離が促進され、遊離されたｂＦＧＦが色素細胞に作用してメラニン合成を促進し、かつ色素細胞の細胞分裂をも促進すると考えられている（非特許文献３参照）。また、ｂＦＧＦは、血管新生促進因子として知られており、腫瘍細胞（特に、悪性腫瘍細胞）における血管新生を促進すること等が知られている。
【０００５】
そのため、ＳＣＦ及びｂＦＧＦの異常産生は、色素細胞の異常増殖につながり、メラニン産生を亢進させ、シミ、ソバカス、くすみ等の原因となると考えられる。また、ＳＣＦの異常産生は、骨髄芽球の異常増殖につながり、それにより骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等の疾患を引き起こすものと考えられ、ｂＦＧＦの異常産生は、腫瘍細胞における血管新生を促進し、それにより腫瘍細胞の増殖につながるものと考えられる。
【０００６】
したがって、ＳＣＦｍＲＮＡ及びｂＦＧＦｍＲＮＡの発現上昇を抑制することは、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防又は抑制に有用であると考えられる。また、ＳＣＦの発現上昇を抑制することは、骨髄芽球の異常増殖を抑制し、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病等の予防又は治療に有用であると考えられ、ｂＦＧＦの発現上昇を抑制することは、腫瘍細胞における血管新生を抑制し、腫瘍細胞の増殖を抑制することで、がん治療等に有用であると考えられる。
【０００７】
このような考えに基づき、ＳＣＦの産生・放出を抑制する作用を有するものとして、例えば、バラエキスローズ水、チャエキス、ホップエキス、サンザシエキス、アズキ末、シラカバエキス、ケイヒエキス、チョウジエキス、アルニカエキス、ボタンエキス、ボダイジュ、クロレラエキス、ローマカミツレエキス、紅茶エキス、ユーカリエキス、ソウジュツエキス末、ビャクジュツエキス末、ウーロン茶エキス末、オノニスエキス、アセンヤクエキス、ブドウ葉エキス、ボウフウエキス、クワエキス、パリエタリアエキス、アンソッコウエキス、ステビアエキス、ヒノキ、ショウブ根エキス、ダイズエキス、カギカズラ、サボンソウエキス、アルテアエキス、オトギリソウエキス及びヨモギエキス等が知られている（特許文献１参照）。また、ｂＦＧＦの作用を抑制し得るものとして、例えば、オノニスエキス等が知られている（特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００３−１９４８０９号公報
【特許文献２】特開２００５−１０４９０４号公報
【非特許文献１】Hachiya A et al.，J. Invest. Dermatol.，No.116，2001，p.578-586
【非特許文献２】Virginia C. Broudy et al.，Blood，Vol.80，No.1，1992，p.60-67
【非特許文献３】Halaban R. et al.，J. Cell. Biol.，No.107，1988，p.1611-1619
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有する物質を見出し、当該物質を有効成分とするＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、シミ、ソバカス、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）等を予防、治療又は改善可能なＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について説明する。
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンを有効成分として含有する。
【００１２】
アンペロプシンは、フラボノイドの一種であり、アンペロプシンを含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することができる。なお、本発明において「抽出物」には、植物を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１３】
アンペロプシンを含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって、アンペロプシンを含有する植物から得ることができる。アンペロプシンを含有する植物としては、例えば、藤茶（学名：Ampelopsis grossedentata）等が挙げられる。
【００１４】
藤茶（Ampelopsis grossedentata）は、ブドウ科に属する多年生の植物である。中国ではこの植物の葉部を飲料として利用する地域がある他、根部又は全草が黄疸性肝炎、風邪、のどの痛み、急性結膜炎症等の治療のための民間薬として利用されている。抽出原料として使用し得る部位としては、花部、花穂部、果皮部、果実部、蕾部、茎部、葉部、枝部、枝葉部、幹部、樹皮部、根部又は地上部等が挙げられるが、これらのうち、枝葉部を使用するのが好ましい。
【００１５】
藤茶抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１６】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１７】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００１９】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合することが好ましい。
【００２０】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２１】
以上のようにして得られた藤茶抽出物からアンペロプシンを単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、藤茶抽出物を、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコールの順で溶出させ、アルコールで溶出される画分として得ることができる。
【００２２】
カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール又はそれらの水溶液等が挙げられる。
【００２３】
さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたアルコール画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００２４】
以上のようにして得られるアンペロプシンは、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有しているため、それらの作用を利用して、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤の有効成分として使用することができる。
【００２５】
また、アンペロプシンは、そのＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を利用して、ＳＣＦの発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤（例えば、骨髄異形成症候群予防・治療剤、急性骨髄性白血病予防・治療剤、抗腫瘍剤等）の有効成分として用いることもできる。
【００２６】
さらに、アンペロプシンは、そのｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を利用して、ｂＦＧＦの発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤（例えば、血管新生抑制剤、抗がん剤、抗腫瘍剤、がん細胞の転移を抑制する医薬組成物等）の有効成分として用いることもできる。
【００２７】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンのみからなるものでもよいし、アンペロプシンを製剤化したものでもよい。
【００２８】
アンペロプシンは、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。アンペロプシンを製剤化したＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤の形態としては、例えば、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等が挙げられる。
【００２９】
なお、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、必要に応じて、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有する天然抽出物等を、アンペロプシンとともに配合して有効成分として用いることができる。
【００３０】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤の患者に対する投与方法としては、皮下組織内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経口投与、経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３１】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、アンペロプシンが有するＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を通じて、ＳＣＦの発現の上昇を抑制することができ、これにより色素細胞の増殖やメラニンの産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等を予防又は改善することができ、美白効果を得ることができる。また、アンペロプシンが有するＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を通じて、骨髄芽球の異常増殖を抑制することができ、これにより骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病等の疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、これらの用途以外にもＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３２】
本発明のｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、アンペロプシンが有するｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を通じて、ｂＦＧＦの発現の上昇を抑制することができ、これにより色素細胞の増殖やメラニンの産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等を予防又は改善することができ、美白効果を得ることができる。また、本発明のｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、アンペロプシンが有するｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を通じて、腫瘍細胞における異常な血管新生を抑制し、がん等の疾患を予防、治療又は改善をすることができる。ただし、本発明のｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、これらの用途以外にもｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３３】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンが有するＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を利用して、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患（例えば、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病等）を予防・治療することができる。
【００３４】
本発明のｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンが有するｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を利用して、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患（例えば、癌等）を予防・治療することができる。
【００３５】
なお、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００３６】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の試験例に何ら制限されるものではない。
【００３７】
藤茶の葉部の粉砕物１０００ｇを５０容量％エタノール（水とエタノールとの容量比＝１：１）５０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら３時間、８０℃に保った後、熱時濾過した。濾液を４０℃で減圧下に濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥して粉末状の藤茶葉部抽出物を得た。抽出物収率（質量％）は、１７．６質量％であった。
【００３８】
得られた藤茶５０容量％エタノール抽出物５．５ｇをメタノール：水＝３：７（容量比）の混合溶媒に溶解し、ＯＤＳ（商品名：クロマトレックスＯＤＳ ＤＭ１０２０Ｔ，富士シリシア化学社製）を充填したガラス製のカラム上部から注入して、ＯＤＳに吸着させた。次いで、移動相としてメタノール：水＝３：７（容量比）を流し、その溶出液を集め、脱溶媒した後、水／メタノールにより再結晶を行い、結晶を濾別した。得られた結晶を減圧乾燥機で乾燥して、精製物２．２ｇを得た。得られた精製物（試料１）を１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を下記に示す。
【００３９】
＜１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：ＤＭＳＯ−ｄ６＞
71.9（d，C-3），83.6（d，C-2），95.4（d，C-8），96.4（d，C-6），100.7（s，C-10），107.4（d，C-2'，C-6'），127.6（s，C-4'），133.6（s，C-1'），145.9（s，C-3'，C-5'），162.9（s，C-9），163.4（s，C-5），167.0（s，C-7），197.4（s，C-4）
【００４０】
以上の結果から、得られた精製物が、アンペロプシン（試料１）であることが確認された。
【００４１】
〔試験例１〕ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験
上記アンペロプシン（試料１）について、以下のようにしてＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。
【００４２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００４３】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度：１０μｇ／ｍＬ）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN（ニッポンジーン社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００４４】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＳＣＦ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No.RR063A，タカラバイオ社製）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。ＳＣＦのｍＲＮＡの発現量は、紫外線未照射・試料無添加、紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに紫外線未照射・試料無添加の補正値を１００とした時の紫外線照射・試料無添加および紫外線照射・試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＳＣＦｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００４５】
ｍＲＮＡ発現上昇抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中Ａは「紫外線未照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｂは「紫外線照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｃは「紫外線照射・試料添加時の補正値」を表す。
【００４６】
上記試験の結果、アンペロプシンのＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）は、５４．４％であった。このように、アンペロプシンは、優れたＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが確認された。
【００４７】
〔試験例２〕ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験
上記アンペロプシン（試料１）について、以下のようにしてｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。
【００４８】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００４９】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度は下記表１を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN（ニッポンジーン社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００５０】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ｂＦＧＦ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No．RR063A，タカラバイオ社製）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。ｂＦＧＦのｍＲＮＡの発現量は、紫外線未照射・試料無添加、紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに紫外線未照射・試料無添加の補正値を１００とした時の紫外線照射・試料無添加および紫外線照射・試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりｂＦＧＦｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００５１】
ｍＲＮＡ発現上昇抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中Ａは「紫外線未照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｂは「紫外線照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｃは「紫外線照射・試料添加時の補正値」を表す。
結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表１に示すように、アンペロプシンは、優れたｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、シミ、ソバカス、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）等の予防・改善に大きく貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞増殖因子（Stem Cell Factor，ＳＣＦ）は、Must Cell Growth Factor、C-Kit Ligand、Steel Factor等とも呼ばれ、角化細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨髄ストローマ細胞等から産生されるタンパク質である。ＳＣＦは、多能性造血幹細胞、生殖細胞、肥満細胞、巨核球系前駆細胞、顆粒球・マクロファージ系前駆細胞、色素細胞等の増殖や分化を促進する作用を有することが知られている。また、ＳＣＦは、シミ部位や紫外線照射等によって発現が亢進することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
ＳＣＦとしては、２７３のアミノ酸残基からなる膜結合型ＳＣＦと、タンパク質分解酵素の作用により切断され、膜から遊離する分泌型ＳＣＦとが知られている。膜結合型ＳＣＦは、角化細胞等に結合したまま色素細胞のＳＣＦレセプターに結合し、色素細胞の増殖を促進する。また、分泌型ＳＣＦは、その結合部位にて切断され、細胞膜から遊離し、色素細胞のＳＣＦレセプターに結合することによって、色素細胞の増殖を促進する。さらに、ＳＣＦは、急性骨髄性白血病患者において、インターロイキン−３（Interleukin-3，ＩＬ−３）や顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor，ＧＭ−ＣＳＦ）の共存下で骨髄芽球の増殖を促進することが知られている（非特許文献２参照）。
【０００４】
塩基性線維芽細胞増殖因子（basic Fibroblast Growth Factor，ｂＦＧＦ）は、ＦＧＦ−２とも呼ばれ、紫外線照射により角化細胞からの遊離が促進され、遊離されたｂＦＧＦが色素細胞に作用してメラニン合成を促進し、かつ色素細胞の細胞分裂をも促進すると考えられている（非特許文献３参照）。また、ｂＦＧＦは、血管新生促進因子として知られており、腫瘍細胞（特に、悪性腫瘍細胞）における血管新生を促進すること等が知られている。
【０００５】
そのため、ＳＣＦ及びｂＦＧＦの異常産生は、色素細胞の異常増殖につながり、メラニン産生を亢進させ、シミ、ソバカス、くすみ等の原因となると考えられる。また、ＳＣＦの異常産生は、骨髄芽球の異常増殖につながり、それにより骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等の疾患を引き起こすものと考えられ、ｂＦＧＦの異常産生は、腫瘍細胞における血管新生を促進し、それにより腫瘍細胞の増殖につながるものと考えられる。
【０００６】
したがって、ＳＣＦｍＲＮＡ及びｂＦＧＦｍＲＮＡの発現上昇を抑制することは、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防又は抑制に有用であると考えられる。また、ＳＣＦの発現上昇を抑制することは、骨髄芽球の異常増殖を抑制し、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病等の予防又は治療に有用であると考えられ、ｂＦＧＦの発現上昇を抑制することは、腫瘍細胞における血管新生を抑制し、腫瘍細胞の増殖を抑制することで、がん治療等に有用であると考えられる。
【０００７】
このような考えに基づき、ＳＣＦの産生・放出を抑制する作用を有するものとして、例えば、バラエキスローズ水、チャエキス、ホップエキス、サンザシエキス、アズキ末、シラカバエキス、ケイヒエキス、チョウジエキス、アルニカエキス、ボタンエキス、ボダイジュ、クロレラエキス、ローマカミツレエキス、紅茶エキス、ユーカリエキス、ソウジュツエキス末、ビャクジュツエキス末、ウーロン茶エキス末、オノニスエキス、アセンヤクエキス、ブドウ葉エキス、ボウフウエキス、クワエキス、パリエタリアエキス、アンソッコウエキス、ステビアエキス、ヒノキ、ショウブ根エキス、ダイズエキス、カギカズラ、サボンソウエキス、アルテアエキス、オトギリソウエキス及びヨモギエキス等が知られている（特許文献１参照）。また、ｂＦＧＦの作用を抑制し得るものとして、例えば、オノニスエキス等が知られている（特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００３−１９４８０９号公報
【特許文献２】特開２００５−１０４９０４号公報
【非特許文献１】Hachiya A et al.，J. Invest. Dermatol.，No.116，2001，p.578-586
【非特許文献２】Virginia C. Broudy et al.，Blood，Vol.80，No.1，1992，p.60-67
【非特許文献３】Halaban R. et al.，J. Cell. Biol.，No.107，1988，p.1611-1619
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有する物質を見出し、当該物質を有効成分とするＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、シミ、ソバカス、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）等を予防、治療又は改善可能なＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について説明する。
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンを有効成分として含有する。
【００１２】
アンペロプシンは、フラボノイドの一種であり、アンペロプシンを含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することができる。なお、本発明において「抽出物」には、植物を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１３】
アンペロプシンを含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって、アンペロプシンを含有する植物から得ることができる。アンペロプシンを含有する植物としては、例えば、藤茶（学名：Ampelopsis grossedentata）等が挙げられる。
【００１４】
藤茶（Ampelopsis grossedentata）は、ブドウ科に属する多年生の植物である。中国ではこの植物の葉部を飲料として利用する地域がある他、根部又は全草が黄疸性肝炎、風邪、のどの痛み、急性結膜炎症等の治療のための民間薬として利用されている。抽出原料として使用し得る部位としては、花部、花穂部、果皮部、果実部、蕾部、茎部、葉部、枝部、枝葉部、幹部、樹皮部、根部又は地上部等が挙げられるが、これらのうち、枝葉部を使用するのが好ましい。
【００１５】
藤茶抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１６】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１７】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００１９】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合することが好ましい。
【００２０】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２１】
以上のようにして得られた藤茶抽出物からアンペロプシンを単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、藤茶抽出物を、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコールの順で溶出させ、アルコールで溶出される画分として得ることができる。
【００２２】
カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール又はそれらの水溶液等が挙げられる。
【００２３】
さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたアルコール画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００２４】
以上のようにして得られるアンペロプシンは、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有しているため、それらの作用を利用して、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤の有効成分として使用することができる。
【００２５】
また、アンペロプシンは、そのＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を利用して、ＳＣＦの発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤（例えば、骨髄異形成症候群予防・治療剤、急性骨髄性白血病予防・治療剤、抗腫瘍剤等）の有効成分として用いることもできる。
【００２６】
さらに、アンペロプシンは、そのｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を利用して、ｂＦＧＦの発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤（例えば、血管新生抑制剤、抗がん剤、抗腫瘍剤、がん細胞の転移を抑制する医薬組成物等）の有効成分として用いることもできる。
【００２７】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンのみからなるものでもよいし、アンペロプシンを製剤化したものでもよい。
【００２８】
アンペロプシンは、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。アンペロプシンを製剤化したＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤の形態としては、例えば、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等が挙げられる。
【００２９】
なお、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、必要に応じて、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有する天然抽出物等を、アンペロプシンとともに配合して有効成分として用いることができる。
【００３０】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤の患者に対する投与方法としては、皮下組織内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経口投与、経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３１】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、アンペロプシンが有するＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を通じて、ＳＣＦの発現の上昇を抑制することができ、これにより色素細胞の増殖やメラニンの産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等を予防又は改善することができ、美白効果を得ることができる。また、アンペロプシンが有するＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を通じて、骨髄芽球の異常増殖を抑制することができ、これにより骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病等の疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、これらの用途以外にもＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３２】
本発明のｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、アンペロプシンが有するｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を通じて、ｂＦＧＦの発現の上昇を抑制することができ、これにより色素細胞の増殖やメラニンの産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等を予防又は改善することができ、美白効果を得ることができる。また、本発明のｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、アンペロプシンが有するｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を通じて、腫瘍細胞における異常な血管新生を抑制し、がん等の疾患を予防、治療又は改善をすることができる。ただし、本発明のｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、これらの用途以外にもｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３３】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンが有するＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を利用して、ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患（例えば、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病等）を予防・治療することができる。
【００３４】
本発明のｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アンペロプシンが有するｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を利用して、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患（例えば、癌等）を予防・治療することができる。
【００３５】
なお、本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００３６】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の試験例に何ら制限されるものではない。
【００３７】
藤茶の葉部の粉砕物１０００ｇを５０容量％エタノール（水とエタノールとの容量比＝１：１）５０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら３時間、８０℃に保った後、熱時濾過した。濾液を４０℃で減圧下に濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥して粉末状の藤茶葉部抽出物を得た。抽出物収率（質量％）は、１７．６質量％であった。
【００３８】
得られた藤茶５０容量％エタノール抽出物５．５ｇをメタノール：水＝３：７（容量比）の混合溶媒に溶解し、ＯＤＳ（商品名：クロマトレックスＯＤＳ ＤＭ１０２０Ｔ，富士シリシア化学社製）を充填したガラス製のカラム上部から注入して、ＯＤＳに吸着させた。次いで、移動相としてメタノール：水＝３：７（容量比）を流し、その溶出液を集め、脱溶媒した後、水／メタノールにより再結晶を行い、結晶を濾別した。得られた結晶を減圧乾燥機で乾燥して、精製物２．２ｇを得た。得られた精製物（試料１）を１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を下記に示す。
【００３９】
＜１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：ＤＭＳＯ−ｄ６＞
71.9（d，C-3），83.6（d，C-2），95.4（d，C-8），96.4（d，C-6），100.7（s，C-10），107.4（d，C-2'，C-6'），127.6（s，C-4'），133.6（s，C-1'），145.9（s，C-3'，C-5'），162.9（s，C-9），163.4（s，C-5），167.0（s，C-7），197.4（s，C-4）
【００４０】
以上の結果から、得られた精製物が、アンペロプシン（試料１）であることが確認された。
【００４１】
〔試験例１〕ＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験
上記アンペロプシン（試料１）について、以下のようにしてＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。
【００４２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００４３】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度：１０μｇ／ｍＬ）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN（ニッポンジーン社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００４４】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＳＣＦ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No.RR063A，タカラバイオ社製）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。ＳＣＦのｍＲＮＡの発現量は、紫外線未照射・試料無添加、紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに紫外線未照射・試料無添加の補正値を１００とした時の紫外線照射・試料無添加および紫外線照射・試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＳＣＦｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００４５】
ｍＲＮＡ発現上昇抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中Ａは「紫外線未照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｂは「紫外線照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｃは「紫外線照射・試料添加時の補正値」を表す。
【００４６】
上記試験の結果、アンペロプシンのＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）は、５４．４％であった。このように、アンペロプシンは、優れたＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが確認された。
【００４７】
〔試験例２〕ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験
上記アンペロプシン（試料１）について、以下のようにしてｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。
【００４８】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００４９】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度は下記表１を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN（ニッポンジーン社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００５０】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ｂＦＧＦ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No．RR063A，タカラバイオ社製）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。ｂＦＧＦのｍＲＮＡの発現量は、紫外線未照射・試料無添加、紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに紫外線未照射・試料無添加の補正値を１００とした時の紫外線照射・試料無添加および紫外線照射・試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりｂＦＧＦｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００５１】
ｍＲＮＡ発現上昇抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中Ａは「紫外線未照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｂは「紫外線照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｃは「紫外線照射・試料添加時の補正値」を表す。
結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表１に示すように、アンペロプシンは、優れたｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤及びｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制剤は、シミ、ソバカス、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）等の予防・改善に大きく貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤。
【請求項２】
アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤。
【請求項３】
アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤。
【請求項４】
アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤。
【請求項１】
アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤。
【請求項２】
アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤。
【請求項３】
アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤。
【請求項４】
アンペロプシンを有効成分として含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤。
【公開番号】特開２００９−２０９０５０（Ｐ２００９−２０９０５０Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０７３７（Ｐ２００８−５０７３７）
【出願日】平成２０年２月２９日（２００８．２．２９）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２９日（２００８．２．２９）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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