微生物センサーおよびその製造方法
【課題】感度よく、複数種の微生物の存在を同時的に検出できる微生物センサー及びその製造方法を提供すること。
【解決手段】微生物センサー１００は、被検体中の微生物１５２の存在を検出する微生物センサー１００であって、電極１２１と、抗生物質４１とを有し、抗生物質４１は、電極１２１の表面に自己組織化単分子膜２を介して固定化されている。
微生物センサー１００の製造方法は、抗生物質４１を含む複合機能分子４を用意する第１の工程と、複合機能分子４を電極１２１の一方の面側に供給して複合機能分子４を電極１２１表面に固定化する第２の工程とを有する。
【解決手段】微生物センサー１００は、被検体中の微生物１５２の存在を検出する微生物センサー１００であって、電極１２１と、抗生物質４１とを有し、抗生物質４１は、電極１２１の表面に自己組織化単分子膜２を介して固定化されている。
微生物センサー１００の製造方法は、抗生物質４１を含む複合機能分子４を用意する第１の工程と、複合機能分子４を電極１２１の一方の面側に供給して複合機能分子４を電極１２１表面に固定化する第２の工程とを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物センサーおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
飲食品、医薬品、化粧品等においては、微生物汚染の有無の判定を目的として微生物の菌種同定及び菌数測定が行われている。
従来、検体中の菌数、例えば、火落ち菌数を定量する方法としては、主に寒天培地に菌含有溶液を散布して数日間培養した後、発現するコロニー数を目視あるいは検出器でカウントする。その結果から逆算することにより求める方法が行われている。
また、菌種を同定する方法としては、主に寒天培地に特定菌がコロニーを形成すると特定の色を発色するような添加物を培地に添加して、その発色により同定する方法等が一般に行われている。
【０００３】
しかしながら、従来の寒天培地で培養する方法においては、約２４〜１２０時間と長時間の培養を必要とする。また、培地の作製、菌液の調整、菌液の培地への散布、培養条件検討及びコロニーカウント等その実施には熟練を要する。そのため、より迅速かつ簡便な測定法が望まれている。
また、最近では、電気化学反応、遺伝子を利用した検出方法、免疫反応、ＡＴＰの発光等を用いる方法が考案されている。
【０００４】
しかしながら、電気化学反応、遺伝子を利用した検出方法、免疫反応、ＡＴＰの発光等を用いる方法においては、いずれも前培養や操作に熟練を必要とする。また、検出感度の問題や装置の価格等の問題等があり、前述の寒天培地を用いた培養法に置き換わっていない。
このように、菌を簡単にかつ高感度に検出できる測定手法および原理の開発が、酒類のより高い品質管理の点から強く望まれている。
【０００５】
一方で、電極表面への微生物の結合で生じる周波数の変化により当該微生物を測定する方法において、電極表面に抗微生物抗体を固定化した水晶振動子を用いる方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この方法は、測定感度が低く、実用化されるに至っていない。
また、測定感度を高める目的で電極表面にプロテインＡ又はプロテインＧを介して抗微生物抗体を固定化した水晶振動子微生物センサーが提案されている（例えば、特許文献２参照）。このセンサーは、複数種の微生物を同時的に測定したいという目的に際しては適当ではない。
さらに、試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材を備え、該基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置からなる微生物の迅速検出装置が提案されている（例えば、特許文献３参照）。この方法も、複数種の微生物を同時的に測定したいという目的に際しては適当ではない。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−６４９３４号
【特許文献２】特開２００２−３４０７６６号
【特許文献３】特開２００５−１７２６８０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、感度よく、複数種の微生物の存在を同時的に検出できる微生物センサーおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の微生物センサーは、被検体中の微生物の存在を検出する微生物センサーであって、
電極と、抗生物質とを有し、前記抗生物質は、前記電極の表面に自己組織化単分子膜を介して固定化されていることを特徴とする。
これにより、微生物が抗生物質に結合するので、複数種の微生物を高感度に検出することができる。
【０００９】
本発明の微生物センサーでは、前記自己組織化単分子膜は、前記電極の表面に結合し得るスルフィド基、ジスルフィド基またはメルカプト基を含み、当該自己組織化単分子膜において前記電極の表面に結合していることが好ましい。
これにより、電極表面に自己組織化単分子膜が効率的に形成するので、抗生物質を自己組織化単分子膜を介して電極表面に容易に固定化することができる。
本発明の微生物センサーでは、前記自己組織化単分子膜は、ストレプトアビジンと結合するビオチンを有するものであることが好ましい。
これにより、抗生物質を自己組織化単分子膜を介して電極表面に効率的に固定化することできる。
【００１０】
本発明の微生物センサーでは、前記抗生物質を含む複合機能分子を有し、
当該複合機能分子は、前記抗生物質に結合するカルボキシル基、アミド基、エーテル基、エステル基またはチオエステル基を有することが好ましい。
これにより、抗生物質が確実に結合した複合機能分子を得ることができる。
本発明の微生物センサーでは、前記複合機能分子は、重合性基を含むものであることが好ましい。
これにより、重合性基に機能性分子などを結合することができるので、より高感度に微生物の存在を検出することができる。
【００１１】
本発明の微生物センサーでは、前記複合機能分子は、ストレプトアビジンと結合するビオチンを含むものであることが好ましい。
これにより、ストレプトアビジンに２つの複合機能分子が結合するので、より高感度に微生物の存在を検出することができる。
本発明の微生物センサーでは、前記抗生物質は、抗菌剤または抗ウイルス剤で構成されるものであることが好ましい。
これにより、高感度に細菌またはウイルスの存在を検出することができる。
【００１２】
本発明の微生物センサーでは、前記抗菌剤は、β−ラクタム系抗生物質で構成されるものであることが好ましい。
これにより、抗生物質が細菌と効率的に結合するので、感度よく、複数種の細菌の存在を検出することができる。
本発明の微生物センサーでは、前記β−ラクタム系抗生物質は、ペニシリンで構成されるものであることが好ましい。
これにより、抗生物質が細菌とより効率的に結合するので、より感度よく、複数種の細菌の存在を検出することができる。
【００１３】
本発明の微生物センサーでは、前記抗生物質と前記微生物との結合で生じる周波数の変化により前記微生物の存在を検出するものであることが好ましい。
これにより、簡易、迅速かつ高感度に複数種の微生物の存在を検出することができる。
本発明の微生物センサーでは、前記抗生物質と前記微生物との結合で生じるインピーダンスの変化により前記微生物の存在を検出するものであることが好ましい。
これにより、簡易、迅速かつ高感度に複数種の微生物の存在を検出することができる。
【００１４】
本発明の微生物センサーの製造方法は、抗生物質を含む複合機能分子を用意する第１の工程と、
前記複合機能分子を電極の一方の面側に供給して前記複合機能分子を前記電極表面に固定化する第２の工程とを有することを特徴とする。
これにより、複合機能分子と電極の一方の面側とを接触するだけでセンサーが得られるので、簡易かつ迅速に微生物センサーを得ることができる。
【００１５】
本発明の微生物センサーの製造方法では、前記複合機能分子は、前記抗生物質と反対側の末端にビオチンを有することが好ましい。
これにより、ストレプトアビジンを用いた場合に、該ストレプトアビジンにビオチンを強固に結合することができる。
本発明の微生物センサーの製造方法では、前記第２の工程において、前記複合機能分子を固定化する前に、ビオチンを含む自己組織化単分子膜を形成した後、当該自己組織化単分子膜をストレプトアビジンで処理することが好ましい。
これにより、自己組織化単分子膜上のストレプトアビジンと複合機能分子のビオチンとが強固に結合するので、安定な微生物センサーを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の微生物センサーおよび微生物センサーの製造方法について、図を用いて詳細に説明する。
＜第１実施形態＞
１．微生物センサー
図１は、本実施形態の微生物センサーを測定装置に装着した状態を示す模式図（斜視図）、図２は、図１に示す微生物センサーを模式的に示す平面図、図３は、図２に示す微生物センサーのＡ−Ａ線断面図、図４は、図３に示すＡ−Ａ線断面図の部分拡大図である。
なお、以下の説明では、図２中の紙面手前側を「上」、紙面奥側を「下」と言う。また、図３および図４中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【００１７】
図１に示す測定装置（電子機器）１０１は、微生物センサー１００と、微生物センサー１００で得られた電流値（インピーダンス）を解析する処理回路２００を備えた演算装置１０２と、微生物センサー１００を装着するコネクタ１３１と、処理回路２００とコネクタ１３１とを接続する配線１３２とを有する。
微生物センサー１００は、図２に示すように、基板１２０上に、作用電極１２１、対向電極１２２および参照電極１２３を備える検出部１１０を有している。
【００１８】
これらの各電極１２１、１２２、１２３は、それぞれ独立して、配線１３０、コネクタ１３１および配線１３２を介して、処理回路２００と電気的に接続されている。また、微生物センサー１００は、コネクタ１３１において着脱可能となっている。
また、検出部１１０以外の基板１２０上の範囲は、図３に示すように、絶縁膜１６０で覆われている。すなわち、基板１２０上に絶縁膜１６０が設けられ、検出部１１０は、絶縁膜１６０の一部に設けられた開口部１６５から露出している。
【００１９】
このような微生物センサー１００は、図３に示すように、基板１２０と絶縁膜１６０とで画成される試料供給空間１５０に、液体試料１５１を供給することにより、作用電極１２１上に設けられた後述する反応層１と液体試料１５１とが接触する。そして、図４に示すように、液体試料１５１中の微生物１５２と反応層１とが反応することにより、電流値が変化する。これにより、この電流値と電圧とからインピーダンスの変化に基づいて、液体試料１５１中の微生物１５２の量を測定することができる。
【００２０】
ここで、液体試料（被検体）１５１としては、例えば、血液、尿、汗、リンパ液、髄液、胆汁、唾液等の体液や、これらの体液に各種処理を施した処理済み液、清涼飲料水やお酒などの飲食品、医薬品、化粧品等が挙げられる。
また、液体試料１５１中に含まれる微生物１５２は、その細胞表面５で後述する抗生物質４１と反応することにより、抗生物質４１と結合するものである。
このような微生物１５２としては、例えば、乳酸菌、火落ち菌、ブドウ球菌のような細菌、インフルエンザウイルス、ノロウイルスなどのようなウイルス、酵母やカビなどのような真菌類などが挙げられる。
【００２１】
基板１２０は、微生物センサー１００を構成する各部を支持するとともに、前述した各電極１２１、１２２、１２３および配線１３０を、互いに絶縁するものである。
基板１２０の構成材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＳ）、ポリイミド（ＰＩ）等の各種樹脂材料、石英ガラスのような各種ガラス材料、アルミナ、ジルコニアのような各種セラミックス材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２２】
作用電極１２１の構成材料としては、例えば、金、銀、銅、白金またはこれらを含む合金のような金属材料、ＩＴＯ（インジウム−酸化スズ）のような金属酸化物系材料、グラファイトのような炭素系材料等が挙げられる。これらのうち、金属材料であることが好ましく、金または銀であることがより好ましい。作用電極１２１の構成材料が金または銀であることにより、後述する自己組織化単分子膜２を構成する有機分子２１と接触するだけで自己組織化単分子膜２を形成できるので、より簡単に微生物センサー１００を製造することができる。
【００２３】
作用電極１２１の上側には、反応層１が設けられている。
図３に示すように、反応層１の一部は、試料供給空間１５０に露出している。そして、試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給することにより、液体試料１５１を反応層１に接触させることができる。
対向電極１２２は、作用電極１２１との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給した状態で、作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加すると、微生物１５２と抗生物質４１との結合により、電流値の変化を確実に捉えることができる。
【００２４】
対向電極１２２の構成材料としては、前述の作用電極１２１の構成材料と同様の材料が挙げられる。
また、対向電極１２２の面積は、作用電極１２１の２倍以上であるのが好ましく、１０倍以上であるのがより好ましい。これにより、より高い精度で電流値を測定することができる。
【００２５】
参照電極１２３は、対向電極１２２との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給した状態で、参照電極１２３と対向電極１２２との間に電圧を印加する。そして、これらの電極間に流れる電流値と、前述の作用電極１２１と対向電極１２２との間に流れる電流値とを比較することにより、微生物１５２と抗生物質４１との反応により生じた電流値を、より高い精度で測定することができる。
参照電極１２３の構成材料としては、例えば、銀−塩化銀、水銀−塩化水銀等が挙げられる。
【００２６】
また、前述の作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３、および配線１３０は、導電性材料粉末の集合体で構成されていてもよい。これにより、これらの電極１２１、１２２、１２３および配線１３０を、各種印刷法を用いて容易に形成することができる。その結果、微生物センサー１００の製造工程を大幅に簡素化することができ、微生物センサー１００の低コスト化を図ることができる。
作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３の平均厚さは、特に限定されないが、１０〜５００ｎｍであることが好ましく、５０〜３００ｎｍであることがより好ましい。
【００２７】
絶縁膜１６０は、前述したように、検出部１１０付近に開口する開口部１６５を有し、この開口部１６５により試料供給空間１５０を形成している。
このような絶縁膜１６０は、絶縁性の材料で構成されている。絶縁膜１６０の種類は特に限定されず、有機材料や無機材料のいずれも用いることができる。
有機材料としては、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルフェノール、ポリイミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテートなどの高分子化合物が挙げられる。これらは、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２８】
無機材料としては、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化タンタル、酸化ジルコニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、酸化コバルトなどの金属酸化物、窒化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ジルコニウム、窒化セリウム、窒化亜鉛、窒化コバルト、窒化チタン、窒化タンタルなどの金属窒化物、チタン酸バリウムストロンチウム、ジルコニウムチタン酸鉛などの金属複合酸化物が挙げられる。これらは、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
このような絶縁膜１６０の平均厚さは、特に限定されないが、１０〜５０００ｎｍ程度であるのが好ましく、５０〜１０００ｎｍ程度であるのがより好ましい。絶縁膜１６０の厚さを前記範囲とすることにより、各電極１２１、１２２、１２３同士および配線１３０同士を、確実に絶縁することができる。
【００２９】
さて、本実施形態の微生物センサー１００は、作用電極１２１表面側に微生物１５２が結合することにより微生物１５２の存在の有無を検出するセンサーである。この微生物センサー１００では、作用電極１２１に抗生物質４１が自己組織化単分子膜２を介して固定化され、反応層１を形成している。
すなわち、図４に示す反応層１は、作用電極１２１表面に自己組織化単分子膜２が形成されている。この自己組織化単分子膜２（ビオチン２２）上には、ストレプトアビジン３が吸着（結合）している。そして、このストレプトアビジン３に複合機能分子４のビオチン４２が結合している。以下、各部の構成について説明する。
【００３０】
自己組織化単分子膜２は、作用電極１２１を保護し、抗生物質４１を作用電極１２１に固定化（固相化）するためのものである。
この自己組織化単分子膜２は、作用電極１２１の上面と結合する結合基を有する有機分子２１で構成されている。
この結合基は、本実施形態では、スルフィド基で構成されるものであるが、ジスルフィド基またはメルカプト基などであってもよい。
このような有機分子２１としては、例えば、次のような化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）に示す化合物が挙げられる。
【００３１】
【化１】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００３２】
【化２】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００３３】
【化３】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００３４】
【化４】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００３５】
これらの化合物のうち、有機分子２１は化合物（Ｉ）および（ＩＩ）であることが好ましい。
このように分子の一端にメルカプト基を有することにより、メルカプト基が作用電極１２１と容易に反応し、スルフィド結合（金属−チオール結合）を形成するので、簡単かつ迅速に作用電極１２１上に有機分子２１を結合することができる。
【００３６】
また、他端にビオチン２２を有することにより、該ビオチン２２を後述するストレプトアビジン３で処理すれば、２つのビオチン２２がストレプトアビジン３と結合できる。このため、図４に示すように、ストレプトアビジン３に複合機能分子４のビオチン４２を２つ結合させることができる。その結果、１つのストレプトアビジン３からビオチン４２を介して２つの抗生物質４１を結合させることができ、微生物センサー１００としての感度を向上させることができる。
【００３７】
また、化合物（ＩＩＩ）および（ＶＩ）は、カルボキシル基またはスクシンイミドなどの活性基を有するので、抗生物質を４１を有機分子２１（自己組織化単分子膜２）に直接結合することができる。
以上のような有機分子２１が作用電極１２２に結合することにより、図４に示すように、自己組織化単分子膜２が形成される。なお、図４中のＢは、上記化合物（ＩＩ）のビオチン２２を意味する。
【００３８】
自己組織化単分子膜２の上端部に位置するビオチン２２には、ストレプトアビジン３が結合（吸着）している。ストレプトアビジン３は、一般に４つのアビジンと結合する。本実施形態では、ストレプトアビジン３は、その下端で自己組織化単分子膜２の２つのビオチン２２と、上端で複合機能分子の２つのビオチン４２と結合する。
ストレプトアビジン３の上端側には、複合機能分子４が結合している。この複合機能分子４は、抗生物質４１とビオチン４２とを有している。そして、複合機能分子４は、ストレプトアビジン３に結合することで、微生物１５２を検出する機能を有する。
【００３９】
抗生物質４１は、前述したように、液体試料１５１中の微生物１５２の細胞表面５と結合する。微生物１５２が抗生物質４１に結合すると、例えば、微生物１５２の表面電気等に基づいて、反応層１における荷電量が変化する。これにより、反応層１のインピーダンスが変化する。
このような抗生物質４１としては、微生物１５２の種類によって異なるが、測定対象である微生物１５２の細胞表面５に作用するものであればよい。
【００４０】
微生物１５２が細菌である場合には、例えば、抗菌剤が用いられる。該抗菌剤としては、例えば、β−ラクタム系、グリコペプチド系などの抗菌剤が挙げられる。これらのうち、特にβ−ラクタム系の抗菌剤が好ましい。
細菌の細胞壁のペプチドグリカン生合成においては、トランスペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼが直鎖状ペプチドグリカンに作用し、末端のＤ−アラニンが離脱するとともにペプチドによる架橋が形成される。このとき、β−ラクタム系の抗菌剤は、これらの酵素に作用し、架橋形成を阻止する。
【００４１】
すなわち、直鎖状ペプチドグリカンのペプチド末端のＤ−アラニルアラニンの立体構造とβ−ラクタム系の抗菌剤の立体構造とが類似しているため、β−ラクタム系の抗菌剤はトランスペプチダーゼと結合し、その活性中心をアシル化することによって不活性化する。
したがって、抗生物質４１がβ−ラクタム系の抗菌剤であることにより、抗生物質４１が細菌の細胞壁と効率的に結合する。そのため、液体試料１５１に含まれる細胞壁を有する種々の細菌（微生物１５２）の存在を検出することができる。
【００４２】
β−ラクタム系の抗菌剤としては、例えば、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、ペニシリンＮ、ペニシリンＯ、メチシリン、クロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、ピペラシリン、オキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、フェネチシリン、プロピシリン、バカンピシリン、タランピシリン、テモシリン、アパラシリン、ヘタシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、スルタミシリン、アゾシリン、ビブメシリナムまたはスルベニシリンなどのペニシリン系、セファロジン、セファピリン、セファロリジン、セファゾリン、セファレキシン、セファラジ、セファドロキシル、セフマンドール、セフォニシド、セフォラニド、セファクロル、セフィキシム、セフプロジル、セフトリアキソン、セフタジシム、セホキシチン、セフォタテン、セフメタゾール、セフロキシム、セフチゾキシム、セフォタキシム、セフブペラゾン、セフミノクス、セフスロジン、セフォペラゾン、セフチブテン、セフィキシム、セフェタメット、セフェピム、セフピロム、セフェム系、メシリナム、キサラクタム、ノカルジシン、スルファゼシンなどが挙げられる。
【００４３】
これらのうち、ペニシリン系であることが好ましく、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）であることがより好ましい。
ペニシリン系の抗菌剤、特にペニシリンＶは、前述したトランスペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼの活性をより強く阻害する。そのため、ペニシリン系の抗菌剤は、各種細菌と容易かつ強固に結合することができる。
【００４４】
また、微生物１５２がウイルスである場合は、例えば、抗ウイルス剤が用いられる。該抗ウイルス剤としては、例えば、ノイラミターゼ阻害剤、オセルタミビル、リン酸オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、リマンタジンなどが挙げられる。
このような抗生物質４１を含む複合機能分子４は、例えば、次に示すような化合物（Ｖ）、（ＶＩ）が挙げられる。
【００４５】
【化５】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００４６】
【化６】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００４７】
これらの複合機能分子４は、その末端に抗生物質（ペニシリン）４１がアミド結合で結合しているので、脱水反応により容易に複合機能分子４を得ることができる。
また、抗生物質４１の反対側の端部にビオチン４２を有するので、当該ビオチン４２がストレプトアビジン３に共有結合に匹敵する強さで強固に結合することができる。その結果、ストレプトアビジン３、自己組織化単分子膜２を介して抗生物質４１を有する複合機能分子４を作用電極１２１に確実に固定化することができる。
【００４８】
また、図４に示すように、ストレプトアビジン３は２つのビオチン４２と結合できるので、ストレプトアビジン３に２つの複合機能分子４を結合することができる。その結果、微生物１５２に対する検出感度を向上することができる。
特に、化合物（Ｖ）は、抗生物質４１とビオチン４２との間にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する。そのため、抗生物質４１が、作用電極１２１から所定距離離間し、微生物１５２の検出感度を高めることができる。
複合機能分子４の他の構成例として、例えば、下記に示す化合物（ＶＩＩ）であってもよい。
【００４９】
【化７】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００５０】
化合物（ＶＩＩ）は、自己組織化単分子膜２に前記化合物（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表される有機分子２１を用いた場合に、化合物（ＶＩＩ）のアミノ基と化合物（ＩＩＩ）のカルボキシル基または化合物（ＩＶ）のスクシンイミドとで容易に反応することができる。そのため、複合機能分子４を自己組織化単分子膜２を介して作用電極１２１に容易に固定化することができる。
なお、複合機能分子４中の抗生物質４１に結合する基としては、アミド基に限らず、カルボキシル基、エーテル基、エステル基またはチオエステル基などであってもよく、結合する抗生物質４１の種類によって適宜選択される。
【００５１】
複合機能分子４には、アクリル基、メタクリル基などの重合性基を含んでいてもよい。これにより、重合性基に別途フェロセンなどの機能性物質など種々の化合物を結合することができる。このため、微生物センサー１００に目的に応じた種々の機能を持たせることができる。
例えば、この重合性基に抗生物質４１とは異なる抗生物質を結合すれば、抗生物質４１以外に、複数の抗生物質が結合するので、微生物１５２に対する検出感度が向上する。
【００５２】
以上説明したように、反応層１が図４のように構成されることにより、前述した効果を有する。また、抗生物質４１が、例えば、抗菌剤であるペニシリンＶで構成されている場合、ペニシリンＶが細菌の細胞壁に結合し、種々の細菌を同時に検出することができる。その結果、微生物センサー１００の感度が向上する。
また、本実施形態の反応層１には、図４に示すように、前記化合物（Ｉ）がスルフィド結合で作用電極１２１に結合している。これにより、自己組織化単分子膜２において、ビオチン２２同士の間に適度の間隔が生じる。したがって、ストレプトアビジン３に複合機能分子４が２つ結合しても、複合機能分子４同士の立体障害を防止または低減できる。その結果、各抗生物質４１が確実に機能し、微生物１５２を補足することができる。
なお、反応層１には、電子を後述する作用電極１２１に媒介するメディエータ（媒介体）を含むのが好ましい。メディエータを電子移動の媒介とすることにより、反応層１から電子を効率よく移動させ、検出部１１０から、より高い感度で電流を取り出すことができる。
【００５３】
このメディエータとしては、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセンまたはフェロセン誘導体、ニッケロセンまたはニッケロセン誘導体、ピリジンまたはピリジン誘導体、キノンまたはキノン誘導体（例えばｐ−ベンゾキノン、ピロロキノリンキノン等）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のようなフラビン誘導体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のようなニコチンアミド誘導体、フェナジンメトサルファート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ヘキサシアノ鉄（III）酸塩、オクタシアノタングステンイオン、ポルフィリン誘導体、フタロシアニン誘導体等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５４】
２．微生物センサーの製造方法
次に、図３に示す微生物センサーの製造方法について説明する。
図５および図６は、それぞれ、図３に示す微生物センサーの製造方法を説明するための図（縦断面図）である。
なお、以下の説明では、図５および図６中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
本実施形態の微生物センサー１００の製造方法は、［１］複合機能分子４を合成するの工程と、［２］基板１２０上に電極１２１、１２２、１２３を形成する工程と、［３］検出部１１０の領域以外に絶縁膜１６０を形成する工程と、［４］作用電極１２１上に反応層１を形成する工程とを有している。以下、これらの各工程について、順次説明する。
【００５５】
［１］複合機能分子合成工程
＜１＞まず、抗生物質４１とビオチン含有化合物とを用意する。
抗生物質４１の濃度としては、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、ビオチン含有化合物の濃度としては、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌあることが好ましく、０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
抗生物質４１およびビオチン含有化合物の濃度が前記範囲であることにより、抗生物質４１とビオチン含有化合物とが過不足なく反応するので、複合機能分子４を効率的に得ることができる。
【００５６】
＜２＞次に、抗生物質４１とビオチン含有化合物とを反応させて複合機能分子４を合成する。
抗生物質４１とビオチン含有化合物とを反応する時間は、０．１〜１０時間であることが好ましく、０．５〜３時間であることがより好ましい。
抗生物質４１とビオチン含有化合物とを反応する温度は、０〜８０℃であることが好ましく、２０〜６０℃であることがより好ましい。
【００５７】
抗生物質４１とビオチン含有化合物とを反応する時間、温度が前記範囲であることにより、抗生物質４１とビオチン含有化合物とが過不足なく反応するので、複合機能分子４を収率よく得ることができる。
本実施形態では、例えば、下記式に示すような反応により、複合機能分子（ビオチン−ペニシリン複合機能分子）４を得ることができる。
【００５８】
（式１）
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００５９】
このような複合機能分子４を得ることにより、ストレプトアビジン３と複合機能分子４中のビオチン４２とが簡単に結合するので、作用電極１２１に自己組織化単分子膜２を介して抗生物質４１を容易に固定化することができる。
また、抗生物質４１が少なくともビオチン４２−ＰＥＧ鎖を介して作用電極１２１に結合することができるので、抗生物質４１は、作用電極１２１と離間し、より感度よく液体試料１５１中の微生物１５２を検出することができる。
本工程の他の構成例として、下記式に示すような反応により、複合機能分子４を得ることもできる。
【００６０】
（式２）
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００６１】
このような反応では、ビオチン含有化合物を使用していないので、使用する原料を簡単に得ることができ、結果として、複合機能分子４を容易に得ることができる。
また、本工程の他の構成例として、下記式に示すような反応により、複合機能分子４を得ることもできる。
【００６２】
（式３）
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
（Ｘは、臭素、塩素、ヨウ素などのハロゲン、ｃａｔは塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化銅などの触媒を示す。）
【００６３】
このような反応により、抗生物質４１であるペニシリンＶにメルカプト基が直接結合しているので、複合機能分子４をより一層簡単に得ることができる。
【００６４】
［２］電極形成工程
＜１＞まず、基板１２０を用意する。
そして、図５（ａ）に示すように、基板１２０上に金属膜（金属層）９を形成する。
これは、例えば、プラズマＣＶＤ、熱ＣＶＤ、レーザーＣＶＤのような化学蒸着法（ＣＶＤ）、真空蒸着、スパッタリング（低温スパッタリング）、イオンプレーティング等の乾式メッキ法、電解メッキ、浸漬メッキ、無電解メッキ等の湿式メッキ法、溶射法、ゾル・ゲル法、ＭＯＤ法、金属箔の接合等により形成することができる。
【００６５】
＜２＞この金属膜９上に、フォトリソグラフィー法により、作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３および配線１３０の形状に対応する形状のレジスト層を形成する。このレジスト層をマスクとして用いて、金属膜９の不要部分を除去する。
この金属膜９の除去には、例えば、プラズマエッチング、リアクティブイオンエッチング、ビームエッチング、光アシストエッチング等の物理的エッチング法、ウェットエッチング等の化学的エッチング法等のうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６６】
＜３＞その後、レジスト層を除去することにより、図５（ｂ）に示すように、基板１２０上に、作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３および配線１３０（図示せず）が得られる。
なお、これらの作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３および配線１３０（図示せず）は、それぞれ、例えば、導電性粒子を含有するコロイド液（分散液）、導電性ポリマーを含有する液体（溶液または分散液）等の液状材料を基板１２０上に供給して被膜を形成した後、必要に応じて、この被膜に対して後処理（例えば加熱、赤外線の照射、超音波の付与等）を施すことにより形成することもできる。
【００６７】
前記液状材料を基板１２０上に供給する方法としては、例えば、ディッピング法、スピンコート法、キャスティング法、マイクログラビアコート法、グラビアコート法、バーコート法、ロールコート法、ワイヤーバーコート法、ディップコート法、スプレーコート法、スクリーン印刷法、フレキソ印刷法、オフセット印刷法、インクジェット法、マイクロコンタクトプリンティング法等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
これらの中でも、特に、インクジェット法（液滴吐出法）を用いるのが好ましい。インクジェット法（液滴吐出法）によれば、作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３および配線１３０を、容易かつ寸法精度よく形成することができる。
【００６８】
［３］絶縁膜形成工程
＜１＞図５（ｅ）に示すように、検出部１１０の領域に対応した開口部１６５を有する絶縁膜１６０を形成する。
まず、所定の絶縁性材料を含む液状材料を調製する。そして、この液状材料を、前記工程［２］で各電極１２１、１２２、１２３および配線１３０が形成された基板１２０上に供給する。これにより、図５（ｃ）に示すような絶縁膜１６０を得る。
【００６９】
絶縁膜１６０を無機材料で構成する場合、絶縁膜１６０は、例えば、熱酸化法、ＣＶＤ法、ＳＯＧ法により形成することができる。また、原材料にポリシラザンを用いることにより、絶縁膜１６０として、シリカ膜、窒化珪素膜を湿式プロセスで成膜することが可能となる。
絶縁膜１６０を有機材料で構成する場合、絶縁膜１６０は、有機材料またはその前駆体を含む液体材料を、基板１２０上を覆うように塗布した後、必要に応じて、この塗膜に対して後処理（例えば加熱、赤外線の照射、超音波の付与等）を施すことにより形成することができる。有機材料またはその前駆体を含む液体材料を、基板１２０上へ塗布する方法としては、スピンコート法やディップコート法のような塗布法、インクジェット法やスクリーン法などの印刷法等を用いることができる。
なお、本工程において調製する液状材料には、前述の絶縁性材料の他に、必要に応じて、バインダ等の添加剤を添加することができる。
【００７０】
＜２＞次に、図５（ｄ）に示すように、検出部１１０を形成すべき領域にマスク１７０を設置して、絶縁膜１６０に向けて光を照射する。これにより、絶縁膜１６０をパターニングする。これにより、図５（ｅ）に示すような絶縁膜１６０を得る。
なお、絶縁膜１６０に向けて光を照射した後、必要に応じて、絶縁膜１６０を洗浄液等で洗浄してもよい。これにより、マスク１７０の遮光部に対応する領域に存在する絶縁膜１６０を効率よく除去することができる。
【００７１】
［４］反応層形成工程
図５（ｆ）に示すように、作用電極１２１上に反応層１を形成する。
本工程は、［４−１］作用電極１２１表面にビオチン２２を含む自己組織化単分子膜２を形成する工程と、［４−２］自己組織化単分子膜２をストレプトアビジン３で処理する工程と、［４−３］複合機能分子４をストレプトアビジン３に接触して複合機能分子４をストレプトアビジン３に固定化する工程とを有する。
【００７２】
以下、各工程について説明する。
［４−１］自己組織化単分子膜形成工程
本工程では、図４に示すような反応層１の場合を例に、その形成方法を拡大図を用いて説明する。
図６は、作用電極１２１に反応層１の一部を構成する自己組織化単分子膜２を形成する方法を模式的に示す図である。
【００７３】
まず、有機分子２１、例えば、前記化合物（Ｉ）および（ＩＩ）を混合した液状材料を調製し、これを作用電極１２１上に供給する。
この場合、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）とは、９．５：０．５〜５．５：４．５の比で用いることが好ましい。このような比で化合物（Ｉ）を用いることにより、化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）とが作用電極１２１表面に結合したとき、化合物（Ｉ）で表される化合物の方が作用電極１２１上に多く結合する。このため、後述するストレプトアビジン３処理により、ストレプトアビジン３に２つの複合機能分子４が結合しても立体障害を生じることを防止または低減することができる。その結果、複合機能分子４をストレプトアビジン３を介して自己組織化単分子膜２に効率的に結合することができる。
なお、液状材料中には、必要に応じて、架橋剤などを添加してもよい。
化合物（ＩＩ）の濃度（使用量）は、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌとなるように設定する。
【００７４】
化合物（ＩＩ）の作用電極１２１表面への供給方法は、前記［２］＜３＞の液状材料を基板１２０上に供給する方法と同様の方法で行うことができる。
そして、化合物（ＩＩ）を含有する液状材料を作用電極１２１表面へ供給した後、一定時間放置し、洗浄、乾燥することにより、図６（ａ）に示すように、ビオチン２２を含む自己組織化単分子膜２を形成することができる。
【００７５】
［４−２］ストレプトアビジン処理工程
ストレプトアビジン３溶液を調製し、これを用いて［４−１］の工程で得られた自己組織化単分子膜２を処理する。すなわち、自己組織化単分子膜２のビオチン２２にストレプトアビジン３を吸着させる。
ストレプトアビジン３溶液は、ストレプトアビジン３を緩衝液に溶解して調製する。この緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液などが挙げられる。
【００７６】
ストレプトアビジン３溶液中のストレプトアビジン３の濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．１〜５ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。
ストレプトアビジン３溶液の自己組織化単分子膜２への供給方法は、前記［２］＜３＞の液状材料を基板１２０上に供給する方法と同様の方法で行うことができる。
そして、ストレプトアビジン３溶液を自己組織化単分子膜２へ供給した後、一定時間放置し、洗浄、乾燥することにより、図６の（ｂ）に示すように、自己組織化単分子膜２が処理され、自己組織化単分子膜２のビオチン２２にストレプトアビジン３が吸着する。
このように自己組織化単分子膜２をストレプトアビジン３で処理することにより、自己組織化単分子膜２のビオチン２２とストレプトアビジン３が共有結合に匹敵する強さで結合する。そのため、ストレプトアビジン３の一端に自己組織化単分子膜２のビオチン２２を強固に結合することができる。
【００７７】
また、自己組織化単分子膜２をストレプトアビジン３で処理することにより、ストレプトアビジン３は、４つのビオチンと結合することができるので、ストレプトアビジン３の上端に複合機能分子４のビオチン４２を２つ結合することができる。
すなわち、図４に示すように、ストレプトアビジン３は、その下端で２つのビオチン２２と、上端で２つのビオチン４２と結合するので、１つのストレプトアビジン３を介して複合機能分子４を２つ結合することができる。その結果、微生物１５２の検出感度を一層向上することができる。
【００７８】
［４−３］複合機能分子固定化工程
前記第１の工程で得られた複合機能分子４を前記［４−２］でストレプトアビジン３処理された自己組織化単分子膜２（作用電極１２１の一方の面側）に供給する。
複合機能分子４の供給方法は、前記［２］＜３＞の液状材料を基板１２０上に供給する方法と同様の方法で行うことができる。
【００７９】
供給する複合機能分子４の濃度は、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜８ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
そして、一定時間放置した後、洗浄、乾燥する。
これにより、図４に示すように、作用電極１２１に自己組織化単分子膜２、ストレプトアビジン３を介して抗生物質４１が固定化される。
【００８０】
本工程の他の構成例として、第１の工程の式２で得られた複合機能分子４を、作用電極１２１表面に直接供給して該複合機能分子４を作用電極１２１上に固定化することもできる。この場合、複合機能分子４がＳＨ基を有するので、複合機能分子４を作用電極１２１上に直接結合することができ、簡単かつ迅速に抗生物質４１を作用電極１２１に固定化することができる。
【００８１】
また、本工程の他の構成例として、第１の工程の式３で得られた複合機能分子４を、作用電極１２１表面に直接供給して該複合機能分子４を作用電極１２１上に固定化することもできる。この場合、該複合機能分子４のペニシリンＶは、ペニシリンＶ（抗生物質４１）のベンゼン環の４位に結合した硫黄原子を介して作用電極１２１上に固定化される。そのため、ペニシリンＶが作用電極１２１表面に配向性よく固定化され、高感度に微生物１５２の存在を検出することができる。
以上の工程により、図４に示す微生物センサー１００を得ることができる。この微生物センサー１００は、医療分野、食品分野、医薬分野、化粧品分野など微生物１５２を検出し得る種々の分野で用いることができる。
【００８２】
３．微生物センサーの動作方法
次に、図１に示す微生物センサー１００の動作方法について説明する。
まず、図４に示すように、本発明の微生物センサー１００の試料供給空間１５０に微生物１５２を含む液体試料１５１を供給する。
試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給すると、反応層１と液体試料１５１とが接触する。反応層１と液体試料１５１とが接触すると、反応層１の最表面に存在する抗生物質４１が液体試料１５１中に含まれる微生物１５２の細胞壁のペプチドグリカン生合成に関与する酵素に作用する。そして、抗生物質４１は、ペプチドグリカンの架橋形成を阻止する。すなわち、抗生物質４１は、細胞壁（細胞表面５）と反応し、結合する。
【００８３】
このとき、作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加しておくと、抗生物質４１と微生物１５２との結合により、電流値が変化し、その変化を処理回路２００が検出する。そして、処理回路２００は当該検出結果に基づいて所定の処理を行い、インピーダンスを算出する。
以上のような動作により、抗生物質４１に微生物１５２が結合した場合と結合していない場合とで電流値が変化するので、インピーダンスも変化し、液体試料１５１中の微生物１５２の量を検出することができる。
【００８４】
液体試料１５１中の微生物１５２の濃度を測定する場合は、予め濃度既知の微生物１５２含有液体試料１５１を段階的に複数調製する。そして、本発明の微生物センサー１００を用いて、各濃度の液体試料１５１中の微生物１５２を測定する。測定により得られた各液体試料１５１中の微生物１５２のインピーダンスを縦軸に、微生物１５２の濃度を横軸として検量線を作成する。次に、微生物１５２の濃度未知の液体試料１５１を前述したように微生物センサー１００に供給し、該液体試料１５１中の微生物１５２を測定する。そして、測定により得られたインピーダンスと前記検量線とから液体試料１５１中に存在する微生物１５２の濃度を定量することができる。
以上のような方法により、微生物１５２の存在を検出することができ、微生物１５２の濃度を定量することもできる。
【００８５】
＜第２実施形態＞
図７は、図１に示す微生物センサーの第２実施形態を模式的に示す平面図、図８は、図７に示す微生物センサーのＢ−Ｂ線断面図である。
なお、以下の説明では、図７中の紙面手前側を「上」、紙面奥側を「下」と言う。また、図８中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
以下、第２実施形態の微生物センサーおよびその製造方法について説明するが、それぞれ、前記第１実施形態の微生物センサーおよびその製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【００８６】
１．微生物センサー
図７に示す微生物センサー１００は、図７、図８に示すように、基板１２０上に設けられた水晶振動子１８０と、水晶振動子１８０を保護する外枠１９０とを有している。この水晶振動子１８０は、水晶で構成された圧電体層１８１と、該圧電体層１８１の両側の面に設けられた一対の電極１８２、１８３とで構成されている。各電極１８２、１８３は、配線１３０、１３２を介して処理回路２００と電気的に接続されている。
【００８７】
なお、処理回路２００は、発振回路として機能し、周波数をカウントする機能を有する。
また、水晶振動子１８０は、図８に示すように、外枠１９０で覆われている。外枠１９０は、開口部１９１を有しており、該開口部１９１において電極１８２が露出している。この電極１８２の露出部分の表面に反応層１が形成され、検出部１１０を構成している。
水晶振動子１８０は、周波数３〜３０ＭＨｚのものであることが好ましく、９〜２７ＭＨｚのものであることがより好ましい。
【００８８】
２．微生物センサーの製造方法
本実施形態の微生物センサーの製造方法は、まず、図５（ａ）、（ｂ）に示す第１実施形態の［２］電極形成工程と同様の方法により、基板１２０の所定の位置に電極１８３と配線１３０とを形成する。
次に、電極１８３上に水晶板（圧電体層１８１）を設置し、第１実施形態の［２］電極形成工程と同様の方法により、該水晶板上に電極１８２を形成する。これにより、水晶振動子１８０を得ることができる。
次に、水晶振動子１８０、配線１３０を保護するように、外枠１９０を覆う。
そして、開口部１９１に露出する電極１８２に第１実施形態と同様の方法により、反応層１を形成する。これにより、図７、図８に示す微生物センサー１００を得ることができる。
【００８９】
３．微生物センサーの動作方法
このような微生物センサー１００は、図７、図８に示すように、基板１２０と外枠１９０とで画成される試料供給空間１５０に、液体試料１５１を供給することにより、電極１８１上に設けられた反応層１と液体試料１５１とが接触する。
反応層１と液体試料１５１とが接触すると、反応層１の最表面に存在する抗生物質４１が液体試料１５１中に含まれる微生物１５２の細胞壁のペプチドグリカン生合成に関与する酵素に作用する。そして、抗生物質４１は、ペプチドグリカンの架橋形成を阻止する。すなわち、抗生物質４１は、細胞壁と反応し、結合する。
【００９０】
このとき、電極１８２、１８３との間に電圧を印加しておくと、微生物１５２と抗生物質４１との結合により、水晶振動子１８０が発振する振動周波数が変化し、その変化を処理回路２００が検出する。そして、処理回路２００は、その検出結果に基づいて所定の処理を行い、周波数を算出する。
このように、微生物１５２が抗生物質４１に結合することによる重量変化を振動周波数の変化に基づいて、液体試料１５１中の微生物１５２の存在を検出することができる。
以上のように、液体試料１５１中の微生物１５２を測定するのに、水晶振動子１８０を用いることにより、前述した自己組織化単分子膜形成工程などの工程を不要とし、簡単かつ迅速に微生物センサー１００を得ることができる。
【００９１】
以上、本発明の微生物センサーについて、図示の各実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。微生物センサーを構成する各部は、同様の機能を発揮し得る任意の構成のものと置換することができる。また、任意の構成物が付加されていてもよい。
また、本発明の微生物センサーは、前記各実施形態を組み合わせたものであってもよい。
以下、本発明の微生物センサーの具体的実施例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
〔実施例１〕
１．微生物センサーの製造
＜１＞まず、ペニシリンＶのベンゼン環の４位にアミノ基が導入された化合物とＢｉｏｔｉｎ ＰＥＧ ａｃｉｄ（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製；３７１４１−１１９５）とをそれぞれ１ｍｍｏｌ用意する。
これらの化合物と、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）および無水ＤＭＦの混合液２０ｍＬとを容器に入れた。そして、下記式に示すように、攪拌しながら５０℃で１０時間反応した。その後、沈殿物をろ過し、ＤＭＦで洗浄した後、真空乾燥した。これにより、ビオチン−ペニシリン複合機能分子を得た。
【００９３】
（式４）
（式中、ｎは１１を示す。）
【００９４】
＜２＞次に、樹脂製基板を用意した。そして、この樹脂製基板に金を真空蒸着法により形成した。次に、フォトリソグラフィー法により、作用電極、対向電極、参照電極および配線の形状に対応する形状のレジスト層を形成した。このレジスト層をマスクとして、プラズマエッチング法により、金膜の不要部分を除去した。そして、このレジスト層を除去することにより作用電極、対向電極、参照電極および配線を得た。
【００９５】
＜３＞次に、厚さ４００ｎｍの二酸化ケイ素を積層し、絶縁膜を形成した。これに、検出部を形成すべき領域にマスクを設置して、絶縁膜に向けて光を照射した。これにより、絶縁膜を得た。
＜４＞下記化合物（Ｉ）（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製；１１１５６−０６９５）と下記化合物（ＩＩ）で表される化合物（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製；４１１５１−０８９５）とを９：１のモル比で１ｍｍｏｌ／Ｌの無水エタノール中に溶かして、１ｍｍｏｌ／Ｌ混合液を作成した。
【００９６】
【化８】
（式中、ｎは６を示す。）
【００９７】
【化９】
（式中、ｎは８を示す。）
【００９８】
そして、該混合液を作用電極の金表面に接触させた。その後、無水エタノールにて洗浄し、窒素乾燥した。これにより、ビオチンもつ自己組織化単分子膜を得た。
＜５＞次に、この自己組織化単分子膜に３０μＬのＴｒｉｓ緩衝溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を供給し、さらに１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン溶液（Ｔｒｉｓ緩衝溶液５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を１０μＬ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）添加し、１時間放置した。放置後、無水エタノールにて洗浄、窒素乾燥した。
これにより、ストレプトアビジン処理された自己組織化単分子膜を得た。
＜６＞＜１＞で得られたビオチン−ペニシリン複合機能分子を＜５＞で得られた自己組織化単分子膜を有する作用電極に供給した。１時間放置した後、洗浄、乾燥し、ペニシリンＶが固定化された微生物センサーを得た。
【００９９】
〔実施例２〕
実施例１において、Ｂｉｏｔｉｎ ＰＥＧ ａｃｉｄの代わりに、ＰＥＧ ｔｈｉｏｌ ａｃｉｄ（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製；３７１５６−０７９５）を用い、作用電極の金に直接供給した以外は実施例１と同様に行い、微生物センサーを得た。
〔実施例３〕
実施例１において、ビオチン−ペニシリン複合機能分子の代わりに、ペニシリンＶチオールを用い、作用電極の金に直接供給した以外は実施例１と同様に行い、微生物センサーを得た。
【０１００】
２．評価
＜１＞乳酸菌の試験菌株を０．０１−１．０ＣＦＵ／ｍｌとなるように希釈して液体試料を調製した。また、乳酸菌を含まないブランク試料も調製した。
＜２＞この液体試料と実施例１〜３で得られた微生物センサーとを接触した。微生物の検出については、インピーダンスの変化により評価した。
その結果、いずれの微生物センサーにおいても、インピーダンス値がブランク試料のインピーダンス値から２０％程度変化し、抗菌剤に各細菌が結合していることが分かった。
したがって、本発明の微生物センサーは、微生物を簡便かつ迅速に、しかも高感度で検出することができるので、関連産業に寄与するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明の微生物センサーの第１実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１に示す微生物センサーを模式的に示す平面図である。
【図３】図２に示す微生物センサーのＡ−Ａ線断面図である
【図４】図３に示すＡ−Ａ線断面図の部分拡大図である。
【図５】図２に示す微生物センサーの製造方法を説明するための図（縦断面図）である。
【図６】図２に示す微生物センサーの製造方法を説明するための図（縦断面図）である。
【図７】本発明の微生物センサーの第２実施形態を模式的に示す平面図である。
【図８】図７に示す微生物センサーのＢ−Ｂ線断面図である。
【符号の説明】
【０１０２】
１……反応層 ２……自己組織化単分子膜 ２１……有機分子 ２２……ビオチン ３……ストレプトアビジン ４……複合機能分子 ４１……抗生物質 ４２……ビオチン ５……細胞表面 ９……金属膜 １００……微生物センサー １０１……測定装置 １０２……演算装置 １１０……検出部 １２０……基板 １２１……作用電極 １２２……対向電極 １２３……参照電極 １３０……配線 １３１……コネクタ １３２……配線 １５０……試料供給空間 １５１……液体試料 １５２……微生物 １６０……絶縁膜 １６５……開口部 １７０……マスク １８０……水晶振動子 １８１……圧電体層 １８２……電極 １８３……電極 １９０……外枠 １９１……開口部 ２００……処理回路
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物センサーおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
飲食品、医薬品、化粧品等においては、微生物汚染の有無の判定を目的として微生物の菌種同定及び菌数測定が行われている。
従来、検体中の菌数、例えば、火落ち菌数を定量する方法としては、主に寒天培地に菌含有溶液を散布して数日間培養した後、発現するコロニー数を目視あるいは検出器でカウントする。その結果から逆算することにより求める方法が行われている。
また、菌種を同定する方法としては、主に寒天培地に特定菌がコロニーを形成すると特定の色を発色するような添加物を培地に添加して、その発色により同定する方法等が一般に行われている。
【０００３】
しかしながら、従来の寒天培地で培養する方法においては、約２４〜１２０時間と長時間の培養を必要とする。また、培地の作製、菌液の調整、菌液の培地への散布、培養条件検討及びコロニーカウント等その実施には熟練を要する。そのため、より迅速かつ簡便な測定法が望まれている。
また、最近では、電気化学反応、遺伝子を利用した検出方法、免疫反応、ＡＴＰの発光等を用いる方法が考案されている。
【０００４】
しかしながら、電気化学反応、遺伝子を利用した検出方法、免疫反応、ＡＴＰの発光等を用いる方法においては、いずれも前培養や操作に熟練を必要とする。また、検出感度の問題や装置の価格等の問題等があり、前述の寒天培地を用いた培養法に置き換わっていない。
このように、菌を簡単にかつ高感度に検出できる測定手法および原理の開発が、酒類のより高い品質管理の点から強く望まれている。
【０００５】
一方で、電極表面への微生物の結合で生じる周波数の変化により当該微生物を測定する方法において、電極表面に抗微生物抗体を固定化した水晶振動子を用いる方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この方法は、測定感度が低く、実用化されるに至っていない。
また、測定感度を高める目的で電極表面にプロテインＡ又はプロテインＧを介して抗微生物抗体を固定化した水晶振動子微生物センサーが提案されている（例えば、特許文献２参照）。このセンサーは、複数種の微生物を同時的に測定したいという目的に際しては適当ではない。
さらに、試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材を備え、該基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置からなる微生物の迅速検出装置が提案されている（例えば、特許文献３参照）。この方法も、複数種の微生物を同時的に測定したいという目的に際しては適当ではない。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−６４９３４号
【特許文献２】特開２００２−３４０７６６号
【特許文献３】特開２００５−１７２６８０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、感度よく、複数種の微生物の存在を同時的に検出できる微生物センサーおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の微生物センサーは、被検体中の微生物の存在を検出する微生物センサーであって、
電極と、抗生物質とを有し、前記抗生物質は、前記電極の表面に自己組織化単分子膜を介して固定化されていることを特徴とする。
これにより、微生物が抗生物質に結合するので、複数種の微生物を高感度に検出することができる。
【０００９】
本発明の微生物センサーでは、前記自己組織化単分子膜は、前記電極の表面に結合し得るスルフィド基、ジスルフィド基またはメルカプト基を含み、当該自己組織化単分子膜において前記電極の表面に結合していることが好ましい。
これにより、電極表面に自己組織化単分子膜が効率的に形成するので、抗生物質を自己組織化単分子膜を介して電極表面に容易に固定化することができる。
本発明の微生物センサーでは、前記自己組織化単分子膜は、ストレプトアビジンと結合するビオチンを有するものであることが好ましい。
これにより、抗生物質を自己組織化単分子膜を介して電極表面に効率的に固定化することできる。
【００１０】
本発明の微生物センサーでは、前記抗生物質を含む複合機能分子を有し、
当該複合機能分子は、前記抗生物質に結合するカルボキシル基、アミド基、エーテル基、エステル基またはチオエステル基を有することが好ましい。
これにより、抗生物質が確実に結合した複合機能分子を得ることができる。
本発明の微生物センサーでは、前記複合機能分子は、重合性基を含むものであることが好ましい。
これにより、重合性基に機能性分子などを結合することができるので、より高感度に微生物の存在を検出することができる。
【００１１】
本発明の微生物センサーでは、前記複合機能分子は、ストレプトアビジンと結合するビオチンを含むものであることが好ましい。
これにより、ストレプトアビジンに２つの複合機能分子が結合するので、より高感度に微生物の存在を検出することができる。
本発明の微生物センサーでは、前記抗生物質は、抗菌剤または抗ウイルス剤で構成されるものであることが好ましい。
これにより、高感度に細菌またはウイルスの存在を検出することができる。
【００１２】
本発明の微生物センサーでは、前記抗菌剤は、β−ラクタム系抗生物質で構成されるものであることが好ましい。
これにより、抗生物質が細菌と効率的に結合するので、感度よく、複数種の細菌の存在を検出することができる。
本発明の微生物センサーでは、前記β−ラクタム系抗生物質は、ペニシリンで構成されるものであることが好ましい。
これにより、抗生物質が細菌とより効率的に結合するので、より感度よく、複数種の細菌の存在を検出することができる。
【００１３】
本発明の微生物センサーでは、前記抗生物質と前記微生物との結合で生じる周波数の変化により前記微生物の存在を検出するものであることが好ましい。
これにより、簡易、迅速かつ高感度に複数種の微生物の存在を検出することができる。
本発明の微生物センサーでは、前記抗生物質と前記微生物との結合で生じるインピーダンスの変化により前記微生物の存在を検出するものであることが好ましい。
これにより、簡易、迅速かつ高感度に複数種の微生物の存在を検出することができる。
【００１４】
本発明の微生物センサーの製造方法は、抗生物質を含む複合機能分子を用意する第１の工程と、
前記複合機能分子を電極の一方の面側に供給して前記複合機能分子を前記電極表面に固定化する第２の工程とを有することを特徴とする。
これにより、複合機能分子と電極の一方の面側とを接触するだけでセンサーが得られるので、簡易かつ迅速に微生物センサーを得ることができる。
【００１５】
本発明の微生物センサーの製造方法では、前記複合機能分子は、前記抗生物質と反対側の末端にビオチンを有することが好ましい。
これにより、ストレプトアビジンを用いた場合に、該ストレプトアビジンにビオチンを強固に結合することができる。
本発明の微生物センサーの製造方法では、前記第２の工程において、前記複合機能分子を固定化する前に、ビオチンを含む自己組織化単分子膜を形成した後、当該自己組織化単分子膜をストレプトアビジンで処理することが好ましい。
これにより、自己組織化単分子膜上のストレプトアビジンと複合機能分子のビオチンとが強固に結合するので、安定な微生物センサーを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の微生物センサーおよび微生物センサーの製造方法について、図を用いて詳細に説明する。
＜第１実施形態＞
１．微生物センサー
図１は、本実施形態の微生物センサーを測定装置に装着した状態を示す模式図（斜視図）、図２は、図１に示す微生物センサーを模式的に示す平面図、図３は、図２に示す微生物センサーのＡ−Ａ線断面図、図４は、図３に示すＡ−Ａ線断面図の部分拡大図である。
なお、以下の説明では、図２中の紙面手前側を「上」、紙面奥側を「下」と言う。また、図３および図４中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【００１７】
図１に示す測定装置（電子機器）１０１は、微生物センサー１００と、微生物センサー１００で得られた電流値（インピーダンス）を解析する処理回路２００を備えた演算装置１０２と、微生物センサー１００を装着するコネクタ１３１と、処理回路２００とコネクタ１３１とを接続する配線１３２とを有する。
微生物センサー１００は、図２に示すように、基板１２０上に、作用電極１２１、対向電極１２２および参照電極１２３を備える検出部１１０を有している。
【００１８】
これらの各電極１２１、１２２、１２３は、それぞれ独立して、配線１３０、コネクタ１３１および配線１３２を介して、処理回路２００と電気的に接続されている。また、微生物センサー１００は、コネクタ１３１において着脱可能となっている。
また、検出部１１０以外の基板１２０上の範囲は、図３に示すように、絶縁膜１６０で覆われている。すなわち、基板１２０上に絶縁膜１６０が設けられ、検出部１１０は、絶縁膜１６０の一部に設けられた開口部１６５から露出している。
【００１９】
このような微生物センサー１００は、図３に示すように、基板１２０と絶縁膜１６０とで画成される試料供給空間１５０に、液体試料１５１を供給することにより、作用電極１２１上に設けられた後述する反応層１と液体試料１５１とが接触する。そして、図４に示すように、液体試料１５１中の微生物１５２と反応層１とが反応することにより、電流値が変化する。これにより、この電流値と電圧とからインピーダンスの変化に基づいて、液体試料１５１中の微生物１５２の量を測定することができる。
【００２０】
ここで、液体試料（被検体）１５１としては、例えば、血液、尿、汗、リンパ液、髄液、胆汁、唾液等の体液や、これらの体液に各種処理を施した処理済み液、清涼飲料水やお酒などの飲食品、医薬品、化粧品等が挙げられる。
また、液体試料１５１中に含まれる微生物１５２は、その細胞表面５で後述する抗生物質４１と反応することにより、抗生物質４１と結合するものである。
このような微生物１５２としては、例えば、乳酸菌、火落ち菌、ブドウ球菌のような細菌、インフルエンザウイルス、ノロウイルスなどのようなウイルス、酵母やカビなどのような真菌類などが挙げられる。
【００２１】
基板１２０は、微生物センサー１００を構成する各部を支持するとともに、前述した各電極１２１、１２２、１２３および配線１３０を、互いに絶縁するものである。
基板１２０の構成材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＳ）、ポリイミド（ＰＩ）等の各種樹脂材料、石英ガラスのような各種ガラス材料、アルミナ、ジルコニアのような各種セラミックス材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２２】
作用電極１２１の構成材料としては、例えば、金、銀、銅、白金またはこれらを含む合金のような金属材料、ＩＴＯ（インジウム−酸化スズ）のような金属酸化物系材料、グラファイトのような炭素系材料等が挙げられる。これらのうち、金属材料であることが好ましく、金または銀であることがより好ましい。作用電極１２１の構成材料が金または銀であることにより、後述する自己組織化単分子膜２を構成する有機分子２１と接触するだけで自己組織化単分子膜２を形成できるので、より簡単に微生物センサー１００を製造することができる。
【００２３】
作用電極１２１の上側には、反応層１が設けられている。
図３に示すように、反応層１の一部は、試料供給空間１５０に露出している。そして、試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給することにより、液体試料１５１を反応層１に接触させることができる。
対向電極１２２は、作用電極１２１との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給した状態で、作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加すると、微生物１５２と抗生物質４１との結合により、電流値の変化を確実に捉えることができる。
【００２４】
対向電極１２２の構成材料としては、前述の作用電極１２１の構成材料と同様の材料が挙げられる。
また、対向電極１２２の面積は、作用電極１２１の２倍以上であるのが好ましく、１０倍以上であるのがより好ましい。これにより、より高い精度で電流値を測定することができる。
【００２５】
参照電極１２３は、対向電極１２２との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給した状態で、参照電極１２３と対向電極１２２との間に電圧を印加する。そして、これらの電極間に流れる電流値と、前述の作用電極１２１と対向電極１２２との間に流れる電流値とを比較することにより、微生物１５２と抗生物質４１との反応により生じた電流値を、より高い精度で測定することができる。
参照電極１２３の構成材料としては、例えば、銀−塩化銀、水銀−塩化水銀等が挙げられる。
【００２６】
また、前述の作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３、および配線１３０は、導電性材料粉末の集合体で構成されていてもよい。これにより、これらの電極１２１、１２２、１２３および配線１３０を、各種印刷法を用いて容易に形成することができる。その結果、微生物センサー１００の製造工程を大幅に簡素化することができ、微生物センサー１００の低コスト化を図ることができる。
作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３の平均厚さは、特に限定されないが、１０〜５００ｎｍであることが好ましく、５０〜３００ｎｍであることがより好ましい。
【００２７】
絶縁膜１６０は、前述したように、検出部１１０付近に開口する開口部１６５を有し、この開口部１６５により試料供給空間１５０を形成している。
このような絶縁膜１６０は、絶縁性の材料で構成されている。絶縁膜１６０の種類は特に限定されず、有機材料や無機材料のいずれも用いることができる。
有機材料としては、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルフェノール、ポリイミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテートなどの高分子化合物が挙げられる。これらは、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２８】
無機材料としては、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化タンタル、酸化ジルコニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、酸化コバルトなどの金属酸化物、窒化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ジルコニウム、窒化セリウム、窒化亜鉛、窒化コバルト、窒化チタン、窒化タンタルなどの金属窒化物、チタン酸バリウムストロンチウム、ジルコニウムチタン酸鉛などの金属複合酸化物が挙げられる。これらは、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
このような絶縁膜１６０の平均厚さは、特に限定されないが、１０〜５０００ｎｍ程度であるのが好ましく、５０〜１０００ｎｍ程度であるのがより好ましい。絶縁膜１６０の厚さを前記範囲とすることにより、各電極１２１、１２２、１２３同士および配線１３０同士を、確実に絶縁することができる。
【００２９】
さて、本実施形態の微生物センサー１００は、作用電極１２１表面側に微生物１５２が結合することにより微生物１５２の存在の有無を検出するセンサーである。この微生物センサー１００では、作用電極１２１に抗生物質４１が自己組織化単分子膜２を介して固定化され、反応層１を形成している。
すなわち、図４に示す反応層１は、作用電極１２１表面に自己組織化単分子膜２が形成されている。この自己組織化単分子膜２（ビオチン２２）上には、ストレプトアビジン３が吸着（結合）している。そして、このストレプトアビジン３に複合機能分子４のビオチン４２が結合している。以下、各部の構成について説明する。
【００３０】
自己組織化単分子膜２は、作用電極１２１を保護し、抗生物質４１を作用電極１２１に固定化（固相化）するためのものである。
この自己組織化単分子膜２は、作用電極１２１の上面と結合する結合基を有する有機分子２１で構成されている。
この結合基は、本実施形態では、スルフィド基で構成されるものであるが、ジスルフィド基またはメルカプト基などであってもよい。
このような有機分子２１としては、例えば、次のような化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）に示す化合物が挙げられる。
【００３１】
【化１】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００３２】
【化２】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００３３】
【化３】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００３４】
【化４】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００３５】
これらの化合物のうち、有機分子２１は化合物（Ｉ）および（ＩＩ）であることが好ましい。
このように分子の一端にメルカプト基を有することにより、メルカプト基が作用電極１２１と容易に反応し、スルフィド結合（金属−チオール結合）を形成するので、簡単かつ迅速に作用電極１２１上に有機分子２１を結合することができる。
【００３６】
また、他端にビオチン２２を有することにより、該ビオチン２２を後述するストレプトアビジン３で処理すれば、２つのビオチン２２がストレプトアビジン３と結合できる。このため、図４に示すように、ストレプトアビジン３に複合機能分子４のビオチン４２を２つ結合させることができる。その結果、１つのストレプトアビジン３からビオチン４２を介して２つの抗生物質４１を結合させることができ、微生物センサー１００としての感度を向上させることができる。
【００３７】
また、化合物（ＩＩＩ）および（ＶＩ）は、カルボキシル基またはスクシンイミドなどの活性基を有するので、抗生物質を４１を有機分子２１（自己組織化単分子膜２）に直接結合することができる。
以上のような有機分子２１が作用電極１２２に結合することにより、図４に示すように、自己組織化単分子膜２が形成される。なお、図４中のＢは、上記化合物（ＩＩ）のビオチン２２を意味する。
【００３８】
自己組織化単分子膜２の上端部に位置するビオチン２２には、ストレプトアビジン３が結合（吸着）している。ストレプトアビジン３は、一般に４つのアビジンと結合する。本実施形態では、ストレプトアビジン３は、その下端で自己組織化単分子膜２の２つのビオチン２２と、上端で複合機能分子の２つのビオチン４２と結合する。
ストレプトアビジン３の上端側には、複合機能分子４が結合している。この複合機能分子４は、抗生物質４１とビオチン４２とを有している。そして、複合機能分子４は、ストレプトアビジン３に結合することで、微生物１５２を検出する機能を有する。
【００３９】
抗生物質４１は、前述したように、液体試料１５１中の微生物１５２の細胞表面５と結合する。微生物１５２が抗生物質４１に結合すると、例えば、微生物１５２の表面電気等に基づいて、反応層１における荷電量が変化する。これにより、反応層１のインピーダンスが変化する。
このような抗生物質４１としては、微生物１５２の種類によって異なるが、測定対象である微生物１５２の細胞表面５に作用するものであればよい。
【００４０】
微生物１５２が細菌である場合には、例えば、抗菌剤が用いられる。該抗菌剤としては、例えば、β−ラクタム系、グリコペプチド系などの抗菌剤が挙げられる。これらのうち、特にβ−ラクタム系の抗菌剤が好ましい。
細菌の細胞壁のペプチドグリカン生合成においては、トランスペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼが直鎖状ペプチドグリカンに作用し、末端のＤ−アラニンが離脱するとともにペプチドによる架橋が形成される。このとき、β−ラクタム系の抗菌剤は、これらの酵素に作用し、架橋形成を阻止する。
【００４１】
すなわち、直鎖状ペプチドグリカンのペプチド末端のＤ−アラニルアラニンの立体構造とβ−ラクタム系の抗菌剤の立体構造とが類似しているため、β−ラクタム系の抗菌剤はトランスペプチダーゼと結合し、その活性中心をアシル化することによって不活性化する。
したがって、抗生物質４１がβ−ラクタム系の抗菌剤であることにより、抗生物質４１が細菌の細胞壁と効率的に結合する。そのため、液体試料１５１に含まれる細胞壁を有する種々の細菌（微生物１５２）の存在を検出することができる。
【００４２】
β−ラクタム系の抗菌剤としては、例えば、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、ペニシリンＮ、ペニシリンＯ、メチシリン、クロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、ピペラシリン、オキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、フェネチシリン、プロピシリン、バカンピシリン、タランピシリン、テモシリン、アパラシリン、ヘタシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、スルタミシリン、アゾシリン、ビブメシリナムまたはスルベニシリンなどのペニシリン系、セファロジン、セファピリン、セファロリジン、セファゾリン、セファレキシン、セファラジ、セファドロキシル、セフマンドール、セフォニシド、セフォラニド、セファクロル、セフィキシム、セフプロジル、セフトリアキソン、セフタジシム、セホキシチン、セフォタテン、セフメタゾール、セフロキシム、セフチゾキシム、セフォタキシム、セフブペラゾン、セフミノクス、セフスロジン、セフォペラゾン、セフチブテン、セフィキシム、セフェタメット、セフェピム、セフピロム、セフェム系、メシリナム、キサラクタム、ノカルジシン、スルファゼシンなどが挙げられる。
【００４３】
これらのうち、ペニシリン系であることが好ましく、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）であることがより好ましい。
ペニシリン系の抗菌剤、特にペニシリンＶは、前述したトランスペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼの活性をより強く阻害する。そのため、ペニシリン系の抗菌剤は、各種細菌と容易かつ強固に結合することができる。
【００４４】
また、微生物１５２がウイルスである場合は、例えば、抗ウイルス剤が用いられる。該抗ウイルス剤としては、例えば、ノイラミターゼ阻害剤、オセルタミビル、リン酸オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、リマンタジンなどが挙げられる。
このような抗生物質４１を含む複合機能分子４は、例えば、次に示すような化合物（Ｖ）、（ＶＩ）が挙げられる。
【００４５】
【化５】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００４６】
【化６】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００４７】
これらの複合機能分子４は、その末端に抗生物質（ペニシリン）４１がアミド結合で結合しているので、脱水反応により容易に複合機能分子４を得ることができる。
また、抗生物質４１の反対側の端部にビオチン４２を有するので、当該ビオチン４２がストレプトアビジン３に共有結合に匹敵する強さで強固に結合することができる。その結果、ストレプトアビジン３、自己組織化単分子膜２を介して抗生物質４１を有する複合機能分子４を作用電極１２１に確実に固定化することができる。
【００４８】
また、図４に示すように、ストレプトアビジン３は２つのビオチン４２と結合できるので、ストレプトアビジン３に２つの複合機能分子４を結合することができる。その結果、微生物１５２に対する検出感度を向上することができる。
特に、化合物（Ｖ）は、抗生物質４１とビオチン４２との間にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する。そのため、抗生物質４１が、作用電極１２１から所定距離離間し、微生物１５２の検出感度を高めることができる。
複合機能分子４の他の構成例として、例えば、下記に示す化合物（ＶＩＩ）であってもよい。
【００４９】
【化７】
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００５０】
化合物（ＶＩＩ）は、自己組織化単分子膜２に前記化合物（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表される有機分子２１を用いた場合に、化合物（ＶＩＩ）のアミノ基と化合物（ＩＩＩ）のカルボキシル基または化合物（ＩＶ）のスクシンイミドとで容易に反応することができる。そのため、複合機能分子４を自己組織化単分子膜２を介して作用電極１２１に容易に固定化することができる。
なお、複合機能分子４中の抗生物質４１に結合する基としては、アミド基に限らず、カルボキシル基、エーテル基、エステル基またはチオエステル基などであってもよく、結合する抗生物質４１の種類によって適宜選択される。
【００５１】
複合機能分子４には、アクリル基、メタクリル基などの重合性基を含んでいてもよい。これにより、重合性基に別途フェロセンなどの機能性物質など種々の化合物を結合することができる。このため、微生物センサー１００に目的に応じた種々の機能を持たせることができる。
例えば、この重合性基に抗生物質４１とは異なる抗生物質を結合すれば、抗生物質４１以外に、複数の抗生物質が結合するので、微生物１５２に対する検出感度が向上する。
【００５２】
以上説明したように、反応層１が図４のように構成されることにより、前述した効果を有する。また、抗生物質４１が、例えば、抗菌剤であるペニシリンＶで構成されている場合、ペニシリンＶが細菌の細胞壁に結合し、種々の細菌を同時に検出することができる。その結果、微生物センサー１００の感度が向上する。
また、本実施形態の反応層１には、図４に示すように、前記化合物（Ｉ）がスルフィド結合で作用電極１２１に結合している。これにより、自己組織化単分子膜２において、ビオチン２２同士の間に適度の間隔が生じる。したがって、ストレプトアビジン３に複合機能分子４が２つ結合しても、複合機能分子４同士の立体障害を防止または低減できる。その結果、各抗生物質４１が確実に機能し、微生物１５２を補足することができる。
なお、反応層１には、電子を後述する作用電極１２１に媒介するメディエータ（媒介体）を含むのが好ましい。メディエータを電子移動の媒介とすることにより、反応層１から電子を効率よく移動させ、検出部１１０から、より高い感度で電流を取り出すことができる。
【００５３】
このメディエータとしては、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセンまたはフェロセン誘導体、ニッケロセンまたはニッケロセン誘導体、ピリジンまたはピリジン誘導体、キノンまたはキノン誘導体（例えばｐ−ベンゾキノン、ピロロキノリンキノン等）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のようなフラビン誘導体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のようなニコチンアミド誘導体、フェナジンメトサルファート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ヘキサシアノ鉄（III）酸塩、オクタシアノタングステンイオン、ポルフィリン誘導体、フタロシアニン誘導体等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５４】
２．微生物センサーの製造方法
次に、図３に示す微生物センサーの製造方法について説明する。
図５および図６は、それぞれ、図３に示す微生物センサーの製造方法を説明するための図（縦断面図）である。
なお、以下の説明では、図５および図６中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
本実施形態の微生物センサー１００の製造方法は、［１］複合機能分子４を合成するの工程と、［２］基板１２０上に電極１２１、１２２、１２３を形成する工程と、［３］検出部１１０の領域以外に絶縁膜１６０を形成する工程と、［４］作用電極１２１上に反応層１を形成する工程とを有している。以下、これらの各工程について、順次説明する。
【００５５】
［１］複合機能分子合成工程
＜１＞まず、抗生物質４１とビオチン含有化合物とを用意する。
抗生物質４１の濃度としては、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、ビオチン含有化合物の濃度としては、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌあることが好ましく、０．５〜５ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
抗生物質４１およびビオチン含有化合物の濃度が前記範囲であることにより、抗生物質４１とビオチン含有化合物とが過不足なく反応するので、複合機能分子４を効率的に得ることができる。
【００５６】
＜２＞次に、抗生物質４１とビオチン含有化合物とを反応させて複合機能分子４を合成する。
抗生物質４１とビオチン含有化合物とを反応する時間は、０．１〜１０時間であることが好ましく、０．５〜３時間であることがより好ましい。
抗生物質４１とビオチン含有化合物とを反応する温度は、０〜８０℃であることが好ましく、２０〜６０℃であることがより好ましい。
【００５７】
抗生物質４１とビオチン含有化合物とを反応する時間、温度が前記範囲であることにより、抗生物質４１とビオチン含有化合物とが過不足なく反応するので、複合機能分子４を収率よく得ることができる。
本実施形態では、例えば、下記式に示すような反応により、複合機能分子（ビオチン−ペニシリン複合機能分子）４を得ることができる。
【００５８】
（式１）
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００５９】
このような複合機能分子４を得ることにより、ストレプトアビジン３と複合機能分子４中のビオチン４２とが簡単に結合するので、作用電極１２１に自己組織化単分子膜２を介して抗生物質４１を容易に固定化することができる。
また、抗生物質４１が少なくともビオチン４２−ＰＥＧ鎖を介して作用電極１２１に結合することができるので、抗生物質４１は、作用電極１２１と離間し、より感度よく液体試料１５１中の微生物１５２を検出することができる。
本工程の他の構成例として、下記式に示すような反応により、複合機能分子４を得ることもできる。
【００６０】
（式２）
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
【００６１】
このような反応では、ビオチン含有化合物を使用していないので、使用する原料を簡単に得ることができ、結果として、複合機能分子４を容易に得ることができる。
また、本工程の他の構成例として、下記式に示すような反応により、複合機能分子４を得ることもできる。
【００６２】
（式３）
（式中、ｎは１〜１５を示す。）
（Ｘは、臭素、塩素、ヨウ素などのハロゲン、ｃａｔは塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化銅などの触媒を示す。）
【００６３】
このような反応により、抗生物質４１であるペニシリンＶにメルカプト基が直接結合しているので、複合機能分子４をより一層簡単に得ることができる。
【００６４】
［２］電極形成工程
＜１＞まず、基板１２０を用意する。
そして、図５（ａ）に示すように、基板１２０上に金属膜（金属層）９を形成する。
これは、例えば、プラズマＣＶＤ、熱ＣＶＤ、レーザーＣＶＤのような化学蒸着法（ＣＶＤ）、真空蒸着、スパッタリング（低温スパッタリング）、イオンプレーティング等の乾式メッキ法、電解メッキ、浸漬メッキ、無電解メッキ等の湿式メッキ法、溶射法、ゾル・ゲル法、ＭＯＤ法、金属箔の接合等により形成することができる。
【００６５】
＜２＞この金属膜９上に、フォトリソグラフィー法により、作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３および配線１３０の形状に対応する形状のレジスト層を形成する。このレジスト層をマスクとして用いて、金属膜９の不要部分を除去する。
この金属膜９の除去には、例えば、プラズマエッチング、リアクティブイオンエッチング、ビームエッチング、光アシストエッチング等の物理的エッチング法、ウェットエッチング等の化学的エッチング法等のうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６６】
＜３＞その後、レジスト層を除去することにより、図５（ｂ）に示すように、基板１２０上に、作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３および配線１３０（図示せず）が得られる。
なお、これらの作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３および配線１３０（図示せず）は、それぞれ、例えば、導電性粒子を含有するコロイド液（分散液）、導電性ポリマーを含有する液体（溶液または分散液）等の液状材料を基板１２０上に供給して被膜を形成した後、必要に応じて、この被膜に対して後処理（例えば加熱、赤外線の照射、超音波の付与等）を施すことにより形成することもできる。
【００６７】
前記液状材料を基板１２０上に供給する方法としては、例えば、ディッピング法、スピンコート法、キャスティング法、マイクログラビアコート法、グラビアコート法、バーコート法、ロールコート法、ワイヤーバーコート法、ディップコート法、スプレーコート法、スクリーン印刷法、フレキソ印刷法、オフセット印刷法、インクジェット法、マイクロコンタクトプリンティング法等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
これらの中でも、特に、インクジェット法（液滴吐出法）を用いるのが好ましい。インクジェット法（液滴吐出法）によれば、作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３および配線１３０を、容易かつ寸法精度よく形成することができる。
【００６８】
［３］絶縁膜形成工程
＜１＞図５（ｅ）に示すように、検出部１１０の領域に対応した開口部１６５を有する絶縁膜１６０を形成する。
まず、所定の絶縁性材料を含む液状材料を調製する。そして、この液状材料を、前記工程［２］で各電極１２１、１２２、１２３および配線１３０が形成された基板１２０上に供給する。これにより、図５（ｃ）に示すような絶縁膜１６０を得る。
【００６９】
絶縁膜１６０を無機材料で構成する場合、絶縁膜１６０は、例えば、熱酸化法、ＣＶＤ法、ＳＯＧ法により形成することができる。また、原材料にポリシラザンを用いることにより、絶縁膜１６０として、シリカ膜、窒化珪素膜を湿式プロセスで成膜することが可能となる。
絶縁膜１６０を有機材料で構成する場合、絶縁膜１６０は、有機材料またはその前駆体を含む液体材料を、基板１２０上を覆うように塗布した後、必要に応じて、この塗膜に対して後処理（例えば加熱、赤外線の照射、超音波の付与等）を施すことにより形成することができる。有機材料またはその前駆体を含む液体材料を、基板１２０上へ塗布する方法としては、スピンコート法やディップコート法のような塗布法、インクジェット法やスクリーン法などの印刷法等を用いることができる。
なお、本工程において調製する液状材料には、前述の絶縁性材料の他に、必要に応じて、バインダ等の添加剤を添加することができる。
【００７０】
＜２＞次に、図５（ｄ）に示すように、検出部１１０を形成すべき領域にマスク１７０を設置して、絶縁膜１６０に向けて光を照射する。これにより、絶縁膜１６０をパターニングする。これにより、図５（ｅ）に示すような絶縁膜１６０を得る。
なお、絶縁膜１６０に向けて光を照射した後、必要に応じて、絶縁膜１６０を洗浄液等で洗浄してもよい。これにより、マスク１７０の遮光部に対応する領域に存在する絶縁膜１６０を効率よく除去することができる。
【００７１】
［４］反応層形成工程
図５（ｆ）に示すように、作用電極１２１上に反応層１を形成する。
本工程は、［４−１］作用電極１２１表面にビオチン２２を含む自己組織化単分子膜２を形成する工程と、［４−２］自己組織化単分子膜２をストレプトアビジン３で処理する工程と、［４−３］複合機能分子４をストレプトアビジン３に接触して複合機能分子４をストレプトアビジン３に固定化する工程とを有する。
【００７２】
以下、各工程について説明する。
［４−１］自己組織化単分子膜形成工程
本工程では、図４に示すような反応層１の場合を例に、その形成方法を拡大図を用いて説明する。
図６は、作用電極１２１に反応層１の一部を構成する自己組織化単分子膜２を形成する方法を模式的に示す図である。
【００７３】
まず、有機分子２１、例えば、前記化合物（Ｉ）および（ＩＩ）を混合した液状材料を調製し、これを作用電極１２１上に供給する。
この場合、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）とは、９．５：０．５〜５．５：４．５の比で用いることが好ましい。このような比で化合物（Ｉ）を用いることにより、化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）とが作用電極１２１表面に結合したとき、化合物（Ｉ）で表される化合物の方が作用電極１２１上に多く結合する。このため、後述するストレプトアビジン３処理により、ストレプトアビジン３に２つの複合機能分子４が結合しても立体障害を生じることを防止または低減することができる。その結果、複合機能分子４をストレプトアビジン３を介して自己組織化単分子膜２に効率的に結合することができる。
なお、液状材料中には、必要に応じて、架橋剤などを添加してもよい。
化合物（ＩＩ）の濃度（使用量）は、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌとなるように設定する。
【００７４】
化合物（ＩＩ）の作用電極１２１表面への供給方法は、前記［２］＜３＞の液状材料を基板１２０上に供給する方法と同様の方法で行うことができる。
そして、化合物（ＩＩ）を含有する液状材料を作用電極１２１表面へ供給した後、一定時間放置し、洗浄、乾燥することにより、図６（ａ）に示すように、ビオチン２２を含む自己組織化単分子膜２を形成することができる。
【００７５】
［４−２］ストレプトアビジン処理工程
ストレプトアビジン３溶液を調製し、これを用いて［４−１］の工程で得られた自己組織化単分子膜２を処理する。すなわち、自己組織化単分子膜２のビオチン２２にストレプトアビジン３を吸着させる。
ストレプトアビジン３溶液は、ストレプトアビジン３を緩衝液に溶解して調製する。この緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液などが挙げられる。
【００７６】
ストレプトアビジン３溶液中のストレプトアビジン３の濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．１〜５ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。
ストレプトアビジン３溶液の自己組織化単分子膜２への供給方法は、前記［２］＜３＞の液状材料を基板１２０上に供給する方法と同様の方法で行うことができる。
そして、ストレプトアビジン３溶液を自己組織化単分子膜２へ供給した後、一定時間放置し、洗浄、乾燥することにより、図６の（ｂ）に示すように、自己組織化単分子膜２が処理され、自己組織化単分子膜２のビオチン２２にストレプトアビジン３が吸着する。
このように自己組織化単分子膜２をストレプトアビジン３で処理することにより、自己組織化単分子膜２のビオチン２２とストレプトアビジン３が共有結合に匹敵する強さで結合する。そのため、ストレプトアビジン３の一端に自己組織化単分子膜２のビオチン２２を強固に結合することができる。
【００７７】
また、自己組織化単分子膜２をストレプトアビジン３で処理することにより、ストレプトアビジン３は、４つのビオチンと結合することができるので、ストレプトアビジン３の上端に複合機能分子４のビオチン４２を２つ結合することができる。
すなわち、図４に示すように、ストレプトアビジン３は、その下端で２つのビオチン２２と、上端で２つのビオチン４２と結合するので、１つのストレプトアビジン３を介して複合機能分子４を２つ結合することができる。その結果、微生物１５２の検出感度を一層向上することができる。
【００７８】
［４−３］複合機能分子固定化工程
前記第１の工程で得られた複合機能分子４を前記［４−２］でストレプトアビジン３処理された自己組織化単分子膜２（作用電極１２１の一方の面側）に供給する。
複合機能分子４の供給方法は、前記［２］＜３＞の液状材料を基板１２０上に供給する方法と同様の方法で行うことができる。
【００７９】
供給する複合機能分子４の濃度は、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜８ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
そして、一定時間放置した後、洗浄、乾燥する。
これにより、図４に示すように、作用電極１２１に自己組織化単分子膜２、ストレプトアビジン３を介して抗生物質４１が固定化される。
【００８０】
本工程の他の構成例として、第１の工程の式２で得られた複合機能分子４を、作用電極１２１表面に直接供給して該複合機能分子４を作用電極１２１上に固定化することもできる。この場合、複合機能分子４がＳＨ基を有するので、複合機能分子４を作用電極１２１上に直接結合することができ、簡単かつ迅速に抗生物質４１を作用電極１２１に固定化することができる。
【００８１】
また、本工程の他の構成例として、第１の工程の式３で得られた複合機能分子４を、作用電極１２１表面に直接供給して該複合機能分子４を作用電極１２１上に固定化することもできる。この場合、該複合機能分子４のペニシリンＶは、ペニシリンＶ（抗生物質４１）のベンゼン環の４位に結合した硫黄原子を介して作用電極１２１上に固定化される。そのため、ペニシリンＶが作用電極１２１表面に配向性よく固定化され、高感度に微生物１５２の存在を検出することができる。
以上の工程により、図４に示す微生物センサー１００を得ることができる。この微生物センサー１００は、医療分野、食品分野、医薬分野、化粧品分野など微生物１５２を検出し得る種々の分野で用いることができる。
【００８２】
３．微生物センサーの動作方法
次に、図１に示す微生物センサー１００の動作方法について説明する。
まず、図４に示すように、本発明の微生物センサー１００の試料供給空間１５０に微生物１５２を含む液体試料１５１を供給する。
試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給すると、反応層１と液体試料１５１とが接触する。反応層１と液体試料１５１とが接触すると、反応層１の最表面に存在する抗生物質４１が液体試料１５１中に含まれる微生物１５２の細胞壁のペプチドグリカン生合成に関与する酵素に作用する。そして、抗生物質４１は、ペプチドグリカンの架橋形成を阻止する。すなわち、抗生物質４１は、細胞壁（細胞表面５）と反応し、結合する。
【００８３】
このとき、作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加しておくと、抗生物質４１と微生物１５２との結合により、電流値が変化し、その変化を処理回路２００が検出する。そして、処理回路２００は当該検出結果に基づいて所定の処理を行い、インピーダンスを算出する。
以上のような動作により、抗生物質４１に微生物１５２が結合した場合と結合していない場合とで電流値が変化するので、インピーダンスも変化し、液体試料１５１中の微生物１５２の量を検出することができる。
【００８４】
液体試料１５１中の微生物１５２の濃度を測定する場合は、予め濃度既知の微生物１５２含有液体試料１５１を段階的に複数調製する。そして、本発明の微生物センサー１００を用いて、各濃度の液体試料１５１中の微生物１５２を測定する。測定により得られた各液体試料１５１中の微生物１５２のインピーダンスを縦軸に、微生物１５２の濃度を横軸として検量線を作成する。次に、微生物１５２の濃度未知の液体試料１５１を前述したように微生物センサー１００に供給し、該液体試料１５１中の微生物１５２を測定する。そして、測定により得られたインピーダンスと前記検量線とから液体試料１５１中に存在する微生物１５２の濃度を定量することができる。
以上のような方法により、微生物１５２の存在を検出することができ、微生物１５２の濃度を定量することもできる。
【００８５】
＜第２実施形態＞
図７は、図１に示す微生物センサーの第２実施形態を模式的に示す平面図、図８は、図７に示す微生物センサーのＢ−Ｂ線断面図である。
なお、以下の説明では、図７中の紙面手前側を「上」、紙面奥側を「下」と言う。また、図８中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
以下、第２実施形態の微生物センサーおよびその製造方法について説明するが、それぞれ、前記第１実施形態の微生物センサーおよびその製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【００８６】
１．微生物センサー
図７に示す微生物センサー１００は、図７、図８に示すように、基板１２０上に設けられた水晶振動子１８０と、水晶振動子１８０を保護する外枠１９０とを有している。この水晶振動子１８０は、水晶で構成された圧電体層１８１と、該圧電体層１８１の両側の面に設けられた一対の電極１８２、１８３とで構成されている。各電極１８２、１８３は、配線１３０、１３２を介して処理回路２００と電気的に接続されている。
【００８７】
なお、処理回路２００は、発振回路として機能し、周波数をカウントする機能を有する。
また、水晶振動子１８０は、図８に示すように、外枠１９０で覆われている。外枠１９０は、開口部１９１を有しており、該開口部１９１において電極１８２が露出している。この電極１８２の露出部分の表面に反応層１が形成され、検出部１１０を構成している。
水晶振動子１８０は、周波数３〜３０ＭＨｚのものであることが好ましく、９〜２７ＭＨｚのものであることがより好ましい。
【００８８】
２．微生物センサーの製造方法
本実施形態の微生物センサーの製造方法は、まず、図５（ａ）、（ｂ）に示す第１実施形態の［２］電極形成工程と同様の方法により、基板１２０の所定の位置に電極１８３と配線１３０とを形成する。
次に、電極１８３上に水晶板（圧電体層１８１）を設置し、第１実施形態の［２］電極形成工程と同様の方法により、該水晶板上に電極１８２を形成する。これにより、水晶振動子１８０を得ることができる。
次に、水晶振動子１８０、配線１３０を保護するように、外枠１９０を覆う。
そして、開口部１９１に露出する電極１８２に第１実施形態と同様の方法により、反応層１を形成する。これにより、図７、図８に示す微生物センサー１００を得ることができる。
【００８９】
３．微生物センサーの動作方法
このような微生物センサー１００は、図７、図８に示すように、基板１２０と外枠１９０とで画成される試料供給空間１５０に、液体試料１５１を供給することにより、電極１８１上に設けられた反応層１と液体試料１５１とが接触する。
反応層１と液体試料１５１とが接触すると、反応層１の最表面に存在する抗生物質４１が液体試料１５１中に含まれる微生物１５２の細胞壁のペプチドグリカン生合成に関与する酵素に作用する。そして、抗生物質４１は、ペプチドグリカンの架橋形成を阻止する。すなわち、抗生物質４１は、細胞壁と反応し、結合する。
【００９０】
このとき、電極１８２、１８３との間に電圧を印加しておくと、微生物１５２と抗生物質４１との結合により、水晶振動子１８０が発振する振動周波数が変化し、その変化を処理回路２００が検出する。そして、処理回路２００は、その検出結果に基づいて所定の処理を行い、周波数を算出する。
このように、微生物１５２が抗生物質４１に結合することによる重量変化を振動周波数の変化に基づいて、液体試料１５１中の微生物１５２の存在を検出することができる。
以上のように、液体試料１５１中の微生物１５２を測定するのに、水晶振動子１８０を用いることにより、前述した自己組織化単分子膜形成工程などの工程を不要とし、簡単かつ迅速に微生物センサー１００を得ることができる。
【００９１】
以上、本発明の微生物センサーについて、図示の各実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。微生物センサーを構成する各部は、同様の機能を発揮し得る任意の構成のものと置換することができる。また、任意の構成物が付加されていてもよい。
また、本発明の微生物センサーは、前記各実施形態を組み合わせたものであってもよい。
以下、本発明の微生物センサーの具体的実施例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
〔実施例１〕
１．微生物センサーの製造
＜１＞まず、ペニシリンＶのベンゼン環の４位にアミノ基が導入された化合物とＢｉｏｔｉｎ ＰＥＧ ａｃｉｄ（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製；３７１４１−１１９５）とをそれぞれ１ｍｍｏｌ用意する。
これらの化合物と、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）および無水ＤＭＦの混合液２０ｍＬとを容器に入れた。そして、下記式に示すように、攪拌しながら５０℃で１０時間反応した。その後、沈殿物をろ過し、ＤＭＦで洗浄した後、真空乾燥した。これにより、ビオチン−ペニシリン複合機能分子を得た。
【００９３】
（式４）
（式中、ｎは１１を示す。）
【００９４】
＜２＞次に、樹脂製基板を用意した。そして、この樹脂製基板に金を真空蒸着法により形成した。次に、フォトリソグラフィー法により、作用電極、対向電極、参照電極および配線の形状に対応する形状のレジスト層を形成した。このレジスト層をマスクとして、プラズマエッチング法により、金膜の不要部分を除去した。そして、このレジスト層を除去することにより作用電極、対向電極、参照電極および配線を得た。
【００９５】
＜３＞次に、厚さ４００ｎｍの二酸化ケイ素を積層し、絶縁膜を形成した。これに、検出部を形成すべき領域にマスクを設置して、絶縁膜に向けて光を照射した。これにより、絶縁膜を得た。
＜４＞下記化合物（Ｉ）（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製；１１１５６−０６９５）と下記化合物（ＩＩ）で表される化合物（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製；４１１５１−０８９５）とを９：１のモル比で１ｍｍｏｌ／Ｌの無水エタノール中に溶かして、１ｍｍｏｌ／Ｌ混合液を作成した。
【００９６】
【化８】
（式中、ｎは６を示す。）
【００９７】
【化９】
（式中、ｎは８を示す。）
【００９８】
そして、該混合液を作用電極の金表面に接触させた。その後、無水エタノールにて洗浄し、窒素乾燥した。これにより、ビオチンもつ自己組織化単分子膜を得た。
＜５＞次に、この自己組織化単分子膜に３０μＬのＴｒｉｓ緩衝溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を供給し、さらに１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン溶液（Ｔｒｉｓ緩衝溶液５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を１０μＬ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）添加し、１時間放置した。放置後、無水エタノールにて洗浄、窒素乾燥した。
これにより、ストレプトアビジン処理された自己組織化単分子膜を得た。
＜６＞＜１＞で得られたビオチン−ペニシリン複合機能分子を＜５＞で得られた自己組織化単分子膜を有する作用電極に供給した。１時間放置した後、洗浄、乾燥し、ペニシリンＶが固定化された微生物センサーを得た。
【００９９】
〔実施例２〕
実施例１において、Ｂｉｏｔｉｎ ＰＥＧ ａｃｉｄの代わりに、ＰＥＧ ｔｈｉｏｌ ａｃｉｄ（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製；３７１５６−０７９５）を用い、作用電極の金に直接供給した以外は実施例１と同様に行い、微生物センサーを得た。
〔実施例３〕
実施例１において、ビオチン−ペニシリン複合機能分子の代わりに、ペニシリンＶチオールを用い、作用電極の金に直接供給した以外は実施例１と同様に行い、微生物センサーを得た。
【０１００】
２．評価
＜１＞乳酸菌の試験菌株を０．０１−１．０ＣＦＵ／ｍｌとなるように希釈して液体試料を調製した。また、乳酸菌を含まないブランク試料も調製した。
＜２＞この液体試料と実施例１〜３で得られた微生物センサーとを接触した。微生物の検出については、インピーダンスの変化により評価した。
その結果、いずれの微生物センサーにおいても、インピーダンス値がブランク試料のインピーダンス値から２０％程度変化し、抗菌剤に各細菌が結合していることが分かった。
したがって、本発明の微生物センサーは、微生物を簡便かつ迅速に、しかも高感度で検出することができるので、関連産業に寄与するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明の微生物センサーの第１実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１に示す微生物センサーを模式的に示す平面図である。
【図３】図２に示す微生物センサーのＡ−Ａ線断面図である
【図４】図３に示すＡ−Ａ線断面図の部分拡大図である。
【図５】図２に示す微生物センサーの製造方法を説明するための図（縦断面図）である。
【図６】図２に示す微生物センサーの製造方法を説明するための図（縦断面図）である。
【図７】本発明の微生物センサーの第２実施形態を模式的に示す平面図である。
【図８】図７に示す微生物センサーのＢ−Ｂ線断面図である。
【符号の説明】
【０１０２】
１……反応層 ２……自己組織化単分子膜 ２１……有機分子 ２２……ビオチン ３……ストレプトアビジン ４……複合機能分子 ４１……抗生物質 ４２……ビオチン ５……細胞表面 ９……金属膜 １００……微生物センサー １０１……測定装置 １０２……演算装置 １１０……検出部 １２０……基板 １２１……作用電極 １２２……対向電極 １２３……参照電極 １３０……配線 １３１……コネクタ １３２……配線 １５０……試料供給空間 １５１……液体試料 １５２……微生物 １６０……絶縁膜 １６５……開口部 １７０……マスク １８０……水晶振動子 １８１……圧電体層 １８２……電極 １８３……電極 １９０……外枠 １９１……開口部 ２００……処理回路
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体中の微生物の存在を検出する微生物センサーであって、
電極と、抗生物質とを有し、前記抗生物質は、前記電極の表面に自己組織化単分子膜を介して固定化されていることを特徴とする微生物センサー。
【請求項２】
前記自己組織化単分子膜は、前記電極の表面に結合し得るスルフィド基、ジスルフィド基またはメルカプト基を含み、当該自己組織化単分子膜において前記電極の表面に結合している請求項１に記載の微生物センサー。
【請求項３】
前記自己組織化単分子膜は、ストレプトアビジンと結合するビオチンを有するものである請求項１または２に記載の微生物センサー。
【請求項４】
前記抗生物質を含む複合機能分子を有し、
当該複合機能分子は、前記抗生物質に結合するカルボキシル基、アミド基、エーテル基、エステル基またはチオエステル基を有する請求項１ないし３のいずれかに記載の微生物センサー。
【請求項５】
前記複合機能分子は、重合性基を含むものである請求項４に記載の微生物センサー。
【請求項６】
前記複合機能分子は、ストレプトアビジンと結合するビオチンを含むものである請求項４または５に記載の微生物センサー。
【請求項７】
前記抗生物質は、抗菌剤または抗ウイルス剤で構成されるものである請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物センサー。
【請求項８】
前記抗菌剤は、β−ラクタム系抗生物質で構成されるものである請求項７に記載の微生物センサー。
【請求項９】
前記β−ラクタム系抗生物質は、ペニシリンで構成されるものである請求項８に記載の微生物センサー。
【請求項１０】
前記抗生物質と前記微生物との結合で生じる周波数の変化により前記微生物の存在を検出するものである請求項１ないし９のいずれかに記載の微生物センサー。
【請求項１１】
前記抗生物質と前記微生物との結合で生じるインピーダンスの変化により前記微生物の存在を検出するものである請求項１ないし９のいずれかに記載の微生物センサー。
【請求項１２】
抗生物質を含む複合機能分子を用意する第１の工程と、
前記複合機能分子を電極の一方の面側に供給して前記複合機能分子を前記電極表面に固定化する第２の工程とを有することを特徴とする微生物センサーの製造方法。
【請求項１３】
前記複合機能分子は、前記抗生物質と反対側の末端にビオチンを有する請求項１２に記載の微生物センサーの製造方法。
【請求項１４】
前記第２の工程において、前記複合機能分子を固定化する前に、ビオチンを含む自己組織化単分子膜を形成した後、当該自己組織化単分子膜をストレプトアビジンで処理する請求項１３に記載の微生物センサーの製造方法。
【請求項１】
被検体中の微生物の存在を検出する微生物センサーであって、
電極と、抗生物質とを有し、前記抗生物質は、前記電極の表面に自己組織化単分子膜を介して固定化されていることを特徴とする微生物センサー。
【請求項２】
前記自己組織化単分子膜は、前記電極の表面に結合し得るスルフィド基、ジスルフィド基またはメルカプト基を含み、当該自己組織化単分子膜において前記電極の表面に結合している請求項１に記載の微生物センサー。
【請求項３】
前記自己組織化単分子膜は、ストレプトアビジンと結合するビオチンを有するものである請求項１または２に記載の微生物センサー。
【請求項４】
前記抗生物質を含む複合機能分子を有し、
当該複合機能分子は、前記抗生物質に結合するカルボキシル基、アミド基、エーテル基、エステル基またはチオエステル基を有する請求項１ないし３のいずれかに記載の微生物センサー。
【請求項５】
前記複合機能分子は、重合性基を含むものである請求項４に記載の微生物センサー。
【請求項６】
前記複合機能分子は、ストレプトアビジンと結合するビオチンを含むものである請求項４または５に記載の微生物センサー。
【請求項７】
前記抗生物質は、抗菌剤または抗ウイルス剤で構成されるものである請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物センサー。
【請求項８】
前記抗菌剤は、β−ラクタム系抗生物質で構成されるものである請求項７に記載の微生物センサー。
【請求項９】
前記β−ラクタム系抗生物質は、ペニシリンで構成されるものである請求項８に記載の微生物センサー。
【請求項１０】
前記抗生物質と前記微生物との結合で生じる周波数の変化により前記微生物の存在を検出するものである請求項１ないし９のいずれかに記載の微生物センサー。
【請求項１１】
前記抗生物質と前記微生物との結合で生じるインピーダンスの変化により前記微生物の存在を検出するものである請求項１ないし９のいずれかに記載の微生物センサー。
【請求項１２】
抗生物質を含む複合機能分子を用意する第１の工程と、
前記複合機能分子を電極の一方の面側に供給して前記複合機能分子を前記電極表面に固定化する第２の工程とを有することを特徴とする微生物センサーの製造方法。
【請求項１３】
前記複合機能分子は、前記抗生物質と反対側の末端にビオチンを有する請求項１２に記載の微生物センサーの製造方法。
【請求項１４】
前記第２の工程において、前記複合機能分子を固定化する前に、ビオチンを含む自己組織化単分子膜を形成した後、当該自己組織化単分子膜をストレプトアビジンで処理する請求項１３に記載の微生物センサーの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−２８６７６３（Ｐ２００８−２８６７６３Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３４６８８（Ｐ２００７−１３４６８８）
【出願日】平成１９年５月２１日（２００７．５．２１）
【出願人】（５９１１１８７７５）白鶴酒造株式会社 (16)
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２１日（２００７．５．２１）
【出願人】（５９１１１８７７５）白鶴酒造株式会社 (16)
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
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