悪液質治療剤
【課題】悪液質治療剤の提供。
【解決手段】副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む悪液質治療剤。
【解決手段】副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む悪液質治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Parathyroid hormone related protein（PTHrP））とその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有する悪液質治療剤に関する。具体的には、本発明は副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む悪液質治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
末期癌患者にみられる悪液質は、悪性腫瘍の随伴性症候群の一つであり、食欲不振、体重減少、貧血、水電解質の異常、免疫異常などを主症状とする全身状態の不良をきたす。癌患者にとって、悪液質の発症は、生命を脅かす終末期症状をもたらすのみならず、患者のQOL（Quality of life）を著しく損ない、患者自身はもちろん、家族や周囲の人に強い精神的、身体的、社会的影響を及ぼす。
【０００３】
近年、癌悪液質の原因物質であると考えられていたカケクチンが、腫瘍壊死因子（TNF）と同一因子であることが明らかになった。その後、インターロイキン１（IL-1）やIL-6、LIF、IFNなどのサイトカインにも同様の作用が明らかになり、癌悪液質は、複数の因子による複合的に作用する病態であることが明らかになってきた。
【０００４】
ヒト口腔底癌由来OCC-1細胞株は、このような癌悪液質に関連する種々の液性因子を産生することが知られており、OCC-1細胞をヌードマウスに移植すると、悪液質などの諸症状を発症させる（Kajimura N. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1996, 38 Suppl. pS48-52、Tanaka R. et al., Jpn. J. Clin. Oncology Apr.1996, 26（2）p88-94）。これは、ヌードマウスに移植されたOCC-1細胞株が、増殖と共に種々のサイトカイン（G-CSF、IL-6、LIF、IL-11、PTHrP など）を産生し、これらの因子が複合的に作用して、上記諸症状を発症させると考えられる。
【０００５】
このように、OCC-1細胞株を移植したヌードマウスの症状は、ヒト末期癌患者の症状ときわめて共通性が高いと考えられる。しかしながら、現在に至るまでこのような悪液質に対する薬剤についての報告は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、悪液質に対する治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、かかる治療剤を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質により、目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含む悪液質治療剤である。上記悪液質としては癌由来のものが挙げられる。
【０００８】
すなわち本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む悪液質治療剤に関する。
【０００９】
上記副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体は、ヒト型化又はキメラ化されたものであることが好ましい。
【００１０】
例えばヒト型化抗体は、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを含むものでありうる：
（ａ）配列番号４８〜５１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域、
（ｂ）配列番号５２〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域、
（ｃ）配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域。
【００１１】
またヒト型化抗体は、例えば配列番号４８〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域と、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域を含むものである。
【００１２】
上記ヒト型化抗体は、さらにヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域及び／又はＨ鎖Ｃ領域を含むものであってもよい。上記ヒト型化抗体は好ましくはヒト型化#23-57-137-1抗体である。
【００１３】
上記副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体は、例えば抗体断片及び／又はその修飾物であってもよい。また上記副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体はモノクローナル抗体であってもよい。
【００１４】
上記副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体は、例えば
(a)悪液質の治療に有効であり、
(b)ヒト口腔底癌OCC-1細胞の増殖には有意な影響を及ぼさない
ものを用いることもできる。
上記悪液質治療剤の対象となる悪液質は、例えば癌由来のものでありうる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有する悪液質治療剤が提供される。上記物質は、悪液質モデル動物での薬効試験において、体重減少を対照と比較して抑制し、また、生存期間の延長効果も奏することから、悪液質治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Parathyroid hormone related protein：PTHrP）とその受容体（PTHrP受容体）との結合を阻害する物質を有効成分として含む悪液質治療剤である。
【００１７】
本明細書中で「PTHrP受容体」とは、例えば特表平6-506598号公報に記載されているPTHrPと結合する受容体を指し、標的器官上（例えば骨や腎臓）に存在するPTHrP受容体か否かを問わない。
【００１８】
また、「PTHrPとPTHrP受容体との結合を阻害する物質」とは、PTHrPに結合することにより、PTHrPがPTHrP受容体と結合することを阻害する物質（例えば抗PTHrP抗体）、およびPTHrP受容体に結合することにより、PTHrPがPTHrP受容体と結合することを阻害する物質（例えばPTHrP受容体に対するアンタゴニスト（PTHrPアンタゴニストともいう）、具体的にはPTHrPペプチドの少なくとも一つのアミノ酸を置換、欠失したものやPTHrPペプチドの部分配列などを指す）のいずれか一方又は両方を指す。
【００１９】
抗PTHrP抗体としては、例えばヒト型化抗体、ヒト抗体（WO96/33735号公報）又はキメラ抗体（特開平4-228089号公報）などの公知の抗体のほか、本発明における抗体（#23-57-137-1抗体）などが挙げられる。なお、抗体はポリクローナル抗体でもよいがモノクローナル抗体であることが好ましい。また、PTHrPアンタゴニストとしては、ポリペプチドや低分子を含むが、例えばPTHrPに対して拮抗的にPTHrP受容体に結合する物質、例えば特開平7-165790号公報、Peptides（UNITED STATES）1995, 16（6）1031-1037、Biochemistry（UNITED STATES）Apr.28 1992, 31（16）4026-4033、特表平5-509098号公報に記載のPTHrPアンタゴニスト活性を有するポリペプチドが挙げられる。また、上記例示のポリペプチドのうち、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、付加、挿入されたポリペプチドで、同等のPTHrPアンタゴニスト活性を有するものも本発明のPTHrPアンタゴニストに含まれる。
本発明では、「PTHrPとPTHrP受容体との結合を阻害する物質」として抗PTHrP抗体を例に説明する。
【００２０】
１．抗PTHrP抗体
本発明で使用される抗PTHrP抗体は、悪液質の治療効果を有するものであれば、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問うものではない。
【００２１】
本発明で使用される抗PTHrP抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗PTHrP抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。この抗体はPTHrPと結合することにより、PTHrPがPTH／PTHrP受容体に結合するのを阻害してPTHrPのシグナル伝達を遮断し、PTHrPの生物学的活性を阻害する抗体である。
【００２２】
このような抗体としては、ハイブリドーマクローン#23-57-137-1により産生される#23-57-137-1抗体が挙げられる。
【００２３】
なお、ハイブリドーマクローン#23-57-137-1 は、mouse-mouse hybridoma #23-57-137-1 として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月１５日に、FERM BP-5631としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００２４】
２．抗体産生ハイブリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、PTHrPを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２５】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトPTHrPを、Suva, L. J. et al., Science（1987）237, 893に開示されたPTHrP遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、PTHrPをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のPTHrPタンパク質を公知の方法で精製する。
【００２６】
次に、この精製PTHrPタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、PTHrPのN末端の34個のペプチドについて、化学合成により作製することもでき、これを感作抗原として使用することもできる。
【００２７】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
【００２８】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００２９】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００３０】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics inMicrobiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D. H.et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978） 276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
【００３１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００３２】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００３３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1-10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【００３４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液（例えば平均分子量1000-6000程度）を通常30-60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００３５】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００３６】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでPTHrPに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、PTHrPへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるPTHrPを投与して抗PTHrP抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からPTHrPに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 94/25585 号公報、WO 93/12227 号公報、WO 92/03918 号公報、WO 94/02602 号公報参照）。
【００３７】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００３８】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００３９】
３．組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。
【００４０】
具体的には、抗PTHrP抗体を産生するハイブリドーマから、抗PTHrP抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit（Pharmacia製）等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
【００４１】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、cDNAの合成および増幅を行うには、5'-AmpliFINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。
【００４２】
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認する。
【００４３】
目的とする抗PTHrP抗体のV領域をコードするDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
【００４４】
本発明で使用される抗PTHrP抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００４５】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（H鎖）または軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523 号公報参照）。
【００４６】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【００４７】
４．改変抗体
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Humanized）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００４８】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００４９】
ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
【００５０】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDR及びFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることによりヒト型化抗体が得られる（EP 239400号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
【００５１】
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., CancerRes.（1993）53, 851-856）。
【００５２】
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
【００５３】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
【００５４】
本発明に使用できるヒト型化抗体としてはヒト型化#23-57-137-1抗体が挙げられる。ヒト型化#23-57-137-1抗体は、マウス由来の#23-57-137-1抗体の相補性決定領域を、Ｌ鎖についてはヒト抗体HSU03868（GEN-BANK, Deftos Mら, Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994）由来の３つのFR断片（FR1、FR2およびFR3）並びにヒト抗体S25755（NBRF-PDB）由来のFR断片（FR4）に連結したものであり、Ｈ鎖についてはヒト抗体S31679（NBRF-PDB、Cuisinier AMら, Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993）のフレームワーク領域と連結し、抗原結合活性を有するようにフレームワーク領域のアミノ酸残基を一部置換したものである。
【００５５】
なお、ヒト型化#23-57-137-1抗体のＬ鎖またはＨ鎖をコードするDNAを含むプラスミドを有する大腸菌は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月15日に、Ｈ鎖をコードするDNAを含むプラスミドを有する大腸菌であるEscherichia coli JM109（ hMBC1HcDNA/pUC19 ）についてはFERM BP-5629として、Ｌ鎖をコードするDNAを含むプラスミドを有する大腸菌であるEscherichia coli JM109（ hMBC1Lqλ/pUC19）についてはFERM BP-5630として、ブダペスト条約に基づきそれぞれ国際寄託されている。
【００５６】
５．抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、PTHrPに結合し、PTHrPの活性を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab')2 、Fv、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００５７】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００５８】
scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００５９】
また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。
【００６０】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００６１】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗PTHrP抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００６２】
６．組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００６３】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV 40）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
【００６４】
SV 40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）により、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
【００６５】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlaczプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。laczプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546；FASEB J.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはaraBプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。
【００６６】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（refold）使用する。
【００６７】
複製起源としては、SV 40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００６８】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
【００６９】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばCHO、COS、ミエローマ、BHK、Vero、HeLa細胞中で発現される。
【００７０】
次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【００７１】
７．抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００７２】
８．抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）、リガンドレセプター結合阻害活性（Harada, A. et al., International Immunology（1993）5, 681-690）の測定には公知の手段を使用することができる。
【００７３】
本発明で使用される抗PTHrP抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、PTHrP（1-34）をコーティングしたプレートに、抗PTHrP抗体を含む試料、例えば、抗PTHrP抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。本発明で使用される抗体の活性を確認するには、抗PTHrP抗体の中和活性を測定する。
【００７４】
９．投与方法および製剤
本発明の治療剤は、悪液質に対する治療又は改善を目的として使用される。また、悪液質の種類は癌由来のものであるか否かを問わない。例えば、癌由来のものとして、J. Urol.（UNITED STATES）Mar 1995, 153（3 Pt 1）p854-857、Langenbecks Arch. Chir. Suppl II Verh Dtsch Ges Chir（GERMANY）1990, p261-265、Oncology（SWITZERLAND）1990, 47（1）p87-91、Int. J. Pancreatol.（UNITED STATES）Aug-Nov 1990, 7（1-3）p141-150、J. Natl. Cancer Inst.（UNITEDSTATES）Dec 19, 1990,82（24）p1922-1926などに記載の悪液質が挙げられる。
【００７５】
また、癌由来でないものとして、JPEN J. Parenter. Enteral Nutr.（UNITEDSTATES）Nov-Dec 1990, 14（6）p605-609、Chest（UNITED STATES）Nov 1990, 98（5）p1091-1094、Bone Marrow Transplant.（ENGLAND）Jul 1990, 6（1）p53-57などに記載の悪液質が挙げられる。
【００７６】
本発明の抗PTHrP抗体を有効成分として含有する治療剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には経肺剤型（例えばネフライザーなどの器具を用いた経肺投与剤）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.001mg から1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり0.01〜100000mg/bodyの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗PTHrP抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００７７】
また、投与時期としては、悪液質が生ずる前後を問わず投与してもよく、あるいは体重減少が予測される時に投与してもよい。
【００７８】
本発明の抗PTHrP抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
【００７９】
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００８０】
実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗PTHrP抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００８１】
以下、参考例および実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例等にその技術的範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００８２】
悪液質モデル動物での薬効試験
ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の悪液質モデル動物を用いて、PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の悪液質に対する治療効果を検討した。
【００８３】
モデル動物としてヒト口腔底癌OCC-1（（財）実験動物中央研究所より購入）を移植したヌードマウスを用いた。ヒト口腔底癌OCC-1を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの悪液質症状を発症する。ヒト口腔底癌OCC-1によって引き起こされる悪液質症状を、マウスモノクローナル抗体が改善することを、血中カルシウム濃度、体重および延命効果を指標にして評価した。
【００８４】
ヒト口腔底癌OCC-1の継代は、BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を用いてin vivoで行った。薬効評価には、6週齢雄性BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、7週齢の動物を使用した。
【００８５】
悪液質モデル動物の作製および群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト口腔底癌OCC-1を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、10日目に腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認した後、血中カルシウム濃度、体重および腫瘍体積を指標として各指標が平均化するように群分けし、悪液質モデル動物とした。
【００８６】
悪液質に対する治療効果の検討は、以下のようにして行った。
（1）生存期間の観察
延命効果の検討では、マウスモノクローナル抗体を週２回投与して、生存期間の観察を行った。また、既に高カルシウム血症治療薬として処方されているパミドロネート（アレディア）を、15mg/Kgの用量で尾静脈内に単回投与した。対照として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.2ml/mouseで尾静脈内に週２回投与した。その結果を図１に示す。
（2）血中カルシウム濃度の観察
上記で作製、群分けした悪液質モデル動物に、マウス１匹あたり10μgまたは100μgのPTHrPに対するマウスモノクローナル抗体を尾静脈内に２日おきに２回投与した。また、既に高カルシウム血症治療薬として処方されているパミドロネート（アレディア）を、15mg/Kgの用量で尾静脈内に単回投与した。対照として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.2ml/mouseで尾静脈内に２日おきに２回投与した。
（3）血中カルシウムの測定
マウスモノクローナル抗体投与後、１日および４日目に血中カルシウム濃度を測定し、各抗体の薬効評価を行った。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、643自動Ca/pHアナライザー（CIBA-CORNING）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。体重は、抗体投与後４日目まで毎日測定した。その結果を、図２および図３に示す。
（4）腫瘍重量の測定
腫瘍体積は、抗体投与後４日目に、腫瘍の長径（a mm）および短径（b mm）を測定し、ギャランの計算式ab2/2により腫瘍体積として算出した。その結果を、図４に示す。
【００８７】
以上の結果より、血中カルシウム濃度については、抗体濃度10μgでは、パミドロネート投与群と差がないにも関わらず、悪性腫瘍に伴う体重減少をパミドロネート投与群又は対照群に比べて抑制した。抗体濃度100μgを投与した群では、血中カルシウム濃度の上昇をパミドロネート投与群又は対照群に比べて抑制し、体重減少もパミドロネート投与群又は対照群に比べて抑制した。また、抗PTHrP中和抗体100μgを週２回投与した群では、パミドロネート投与群又は対照群に比べて有意な生存期間の延長（p=0.0003：Log Rank test）が認められた。このことから、PTHrPに対する中和マウスモノクローナル抗体は体重減少抑制、生存期間の延長など既存の高カルシウム血症治療薬にはない効果を有する。したがって本抗体の悪性腫瘍に伴う悪液質の治療薬としての有用性が示された。
【実施例２】
【００８８】
高カルシウム血症・悪液質モデル動物での薬効試験
ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の悪液質モデル動物を用いて、PTHrPに対するヒト型化抗体バージョンｑの悪液質に対する治療効果を検討した。
【００８９】
モデル動物としてヒト口腔底癌OCC-1（（財）実験動物中央研究所より購入）を移植したヌードマウスを用いた。ヒト口腔底癌OCC-1を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの悪液質症状を発症する。ヒト口腔底癌OCC-1によって引き起こされる悪液質症状を、ヒト型化抗体バージョンqが改善することを、血中カルシウム濃度、体重および延命効果を指標にして評価した。
【００９０】
ヒト口腔底癌OCC-1の継代は、BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を用いてin vivoで行った。薬効評価には、6週齢雄性BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、7週齢の動物を使用した。
【００９１】
悪液質モデル動物の作製および群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト口腔底癌OCC-1を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、10日目に腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認した後、腫瘍体積、血中カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けし、悪液質モデル動物とした。
【００９２】
悪液質に対する治療効果の検討は、以下のようにして行った。
（1）生存期間の観察
延命効果の検討では、ヒト型化抗体バージョンｑを週２回尾静脈内に投与して、生存期間の観察を行った。対照として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.1ml/mouseで尾静脈内に週２回投与した。その結果を図16に示す。
（2）血中カルシウム濃度の観察
上記で作製、群分けした悪液質モデル動物に、マウス１匹あたり10μgまたは100μgのヒト型化抗体バージョンｑを尾静脈内に２日あけて２回投与した。対照として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.1ml/mouseで同様に投与した。
（3）血中カルシウムの測定
ヒト型化抗体バージョンｑ初回投与後、１日および４日目に血中カルシウム濃度を測定し、抗体の薬効評価を行った。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、643自動Ca/pHアナライザー（CHIRON）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。体重は、４日目まで毎日測定した。その結果を、図17および図18に示す。
（4）腫瘍重量の測定
腫瘍体積は、初回投与時および４日目に、腫瘍の長径（ａmm）および短径（ｂmm）を測定し、ギャランの計算式ab2/2により算出した。その結果を図19に示す。
【００９３】
以上の結果のように、ヒト型化抗体バージョンｑを10μgあるいは100μgを投与することで、悪性腫瘍に伴う血中カルシウム濃度の上昇及び体重の減少は対照群に比べて抑制された。また、ヒト型化抗体バージョンｑを100μg、週2回投与し続けた場合、対照群に比べて有意な生存期間の延長（p=0.0108：Log Rank test）が認められた。今回のヒト型化抗体バージョンｑの悪性腫瘍に伴う悪液質モデル動物に対する効果は、すでに報告したマウスモノクローナル抗体の効果と同様のものであった。このことから、本抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症・悪液質の治療薬としての有用性が示された。
【００９４】
［参考例１］
抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）（配列番号75) に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ#23-57-154 および#23-57-137-1を、佐藤幹二らにより作製された（Sato, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 1993)。
【００９５】
免疫原として使用するために、ＰＴＨｒＰ（１−３４）（Peninsula 製）とキャリアータンパクであるサイログロブリンをカルボジイミド（Dojinn）を用いて結合した。サイログロブリンと結合したＰＴＨｒＰ（１−３４）を透析し、タンパク濃度として２μg/mlとなるように調製した後、フロイントアジュバント（Difco)と１:１で混合し、エマルジョン作製後、16匹の雌性BALB/Cマウスの背部皮下又は腹腔内に動物あたり100 μｇを11回免疫した。初回免疫は、フロイント完全アジュバントを用い、二回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバントを使用した。
【００９６】
免疫したマウスの血清中の抗体価の測定は、以下の方法で行った。すなわち、マウス尾静脈より採血し、血清分離後ＲＩＡバッファーで希釈した抗血清と125I標識ＰＴＨｒＰ（１−３４）を混合し、結合活性を測定した。抗体価の上昇したマウスの腹腔に、キャリアータンパクを結合していないＰＴＨｒＰ（１−３４）を動物あたり50μｇを最終免疫した。
【００９７】
最終免疫３日目にマウスを屠殺し、脾臓を摘出後、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3x63Ag8U.1 を50％ポリエチレングリコール4000を用いる常法にしたがって細胞融合した。細胞融合した細胞を２×104／ウェルの細胞数で85枚の96穴プレートに蒔き込んだ。ハイブリドーマの選別はＨＡＴ培地を用いて行った。
【００９８】
ハイブリドーマのスクリーニングは、ＨＡＴ培地中で生育の認められた穴の培養上清を固相化ＲＩＡ法にてＰＴＨｒＰ認識抗体の有無を測定し選択することにより行った。抗体との結合能の認められた穴からハイブリドーマを回収し、15％ＦＣＳを含むRPMI-1640 培地にＯＰＩ-supplement(Sigma)を添加した培地に懸濁し、限界希釈法にてハイブリドーマの単一化を実施した。ＰＴＨｒＰ（１−３４）との結合能の強いクローン#23-57-154 および#23-57-137-1を得た。
【００９９】
なお、ハイブリドーマクローン#23-57-137-1は、mouse-mouse hybridoma #23-57-137-1として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月１５日に、FERM BP-5631としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０１００】
［参考例２］
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするDNAのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体#23-57-137-1の可変領域をコードするDNAを次の様にしてクローニングした。
(1) ｍＲＮＡの調製
ハイブリドーマ#23-57-137-1からのｍＲＮＡをQuick Prep mRNA PurificationKit(Pharmacia Biotech社) を用いて調製した。ハイブリドーマ#23-57-137-1の細胞をExtraction Buffer で完全にホモジナイズし、キット添付の処方に従い、oligo(dT)-Cellulose Spun Column にてｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿をおこなった。ｍＲＮＡ沈殿物をElution Bufferに溶解した。
【０１０１】
(2) マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のｃDNAの作製および増幅
(i) #23-57-137-1抗体Ｈ鎖Ｖ領域ｃDNAのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５'−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) により行った。５'−ＲＡＣＥ法には５'-Ampli FINDER RACE kit (CLONETECH社) を用い、操作はキット添付の処方にしたがって行った。ｃDNA合成に使用するプライマーは、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするＭＨＣ２プライマー（配列番号１）を用いた。前記のようにして調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてＭＨＣ２プライマー10pmole を加え、逆転写酵素と52℃、30分間反応させることによりｃDNAへの逆転写を行った。
【０１０２】
６Ｎ NaOH でＲＮＡを加水分解（65℃、30分間）した後、エタノール沈殿によりｃDNAを精製した。Ｔ４ＲＮＡリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間反応することにより、合成したｃDNAの５'末端にAmpli FINDER Anchor(配列番号42)を連結した。これを鋳型としてPCRにより増幅するためのプライマーとしてAnchorプライマー（配列番号２）およびＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号３）（S.T.Jones,et al.,Biotechnology,9,88,1991) を使用した。
【０１０３】
PCR溶液は、その50μｌ中に10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、1.5 mM MgCl2、2.5 ユニットのTaKaRa Taq（宝酒造）、10pmole のアンカー(Anchor)プライマー、並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー及びAmpli FINDER Anchor を連結したｃDNAの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。PCRはThermal Cycler Mode 1480J(Perkin Elmer) を用い、94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。
【０１０４】
(ii) #23-57-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域のｃDNAのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５'−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)により行った。５'-ＲＡＣＥ法には５'-AmpliFinder RACE Kit(Clonetech)を用い、操作は添付の処方に従った。ｃDNA合成に使用するプライマーは、oligo-dTプライマーを用いた。前記のように調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてoligo-dTプライマーを加え、逆転写酵素と52℃、30分間反応させることによりｃDNAへの逆転写を行った。６N NaOHでＲＮＡを加水分解（65℃、30分間）した後、エタノール沈殿によりｃDNAを精製した。合成したｃDNAの５'末端に前記Ampli FINDER Anchor をＴ４ＲＮＡリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間反応させることにより連結した。
【０１０５】
マウスＬ鎖λ鎖定常領域の保存配列からPCRプライマーＭＬＣ（配列番号４）を設計し、394 DNA/RNA シンセサイザー (ABI 社）を用いて合成した。PCR溶液は、その100 μｌ中に10 mM Tris-HCl（pH８．３）、50mM KCl、0.25mM ｄＮＴＰｓ（dATP, dGTP，dCTP，dTTP）、1.5mM MgCl2 、2.5 ユニットの AmpliTaq （PERKIN ELMER）、50pmole のAnchorプライマー（配列番号２）、並びにＭＬＣ（配列番号４）およびAmpli FINDER Anchor を連結したｃDNAの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。PCRはThermal Cycler Model480J（Perkin Elmer）を用い、94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで３５回行った。
【０１０６】
(3) PCR生成物の精製および断片化
前記のようにしてPCR法により増幅したDNA断片を３％Nu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products)を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。Ｈ鎖Ｖ領域として約550bp 長、Ｌ鎖Ｖ領域として約550bp 長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、10mM Tris-HCl(pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。得られたDNA溶液１μｌを制限酵素XmaI（New England Biolabs)により37℃で１時間消化し、次いで制限酵素EcoRI （宝酒造）により37℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりDNAを回収した。
【０１０７】
こうして、５'−末端にEcoRI 認識配列を有し、３'−末端にＸｍａＩ認識配列を有するマウスＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むDNA断片を得た。
【０１０８】
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むEcoRI-XmaI DNA断片とEcoRI 及びXmaIで消化することにより調製したpUC19 ベクターをDNAライゲーションキットver.2 （宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で１時間反応させ連結した。次に10μｌの上記連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μｌに加え、この細胞を氷上で15分間、42℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。次いで300 μｌのＳＯＣ培地（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を加え37℃にて30分間インキュベートした後、100μｇ／ｍｌ又は50μｇ／ｍｌのアンピシリン、0.1mM のIPTG、20μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地または２ｘＹＴ寒天培地（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０１０９】
この形質転換体を100 μｇ／ｍｌ又は50μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地または２×ＹＴ培地２ｍｌで37℃にて一夜培養し、菌体画分からプラスミド抽出機PI-100Σ（クラボウ）又はQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行った。
【０１１０】
(4) マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミド中のｃDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を用い、DNA Sequencer 373A (ABI社Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4 （宝酒造）（配列番号５）及びM13 Primer RV （宝酒造）（配列番号６）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
【０１１１】
こうして得られたハイブリドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをMBC1H04 、Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをMBC1L24 と命名した。プラスミドMBC1H04 およびMBC1L24 に含まれるマウス#23-57-137-1抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号57、65に示す。Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域断片のポリペプチドは、ともに配列番号57、65で表される塩基配列の第58番目（グルタミンをコードする）から開始されている。これらのアミノ酸配列を、Ｈ鎖Ｖ領域の断片については配列番号46、Ｌ鎖Ｖ領域の断片については配列番号45に示す。
【０１１２】
なお、前記プラスミドMBC1H04 およびMBC1L24 を有する大腸菌はEscherichiacoli JM109（MBC1H04 ）およびEscherichia coli JM109（MBC1L24 ）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月１５日に、Escherichia coli JM109 (MBC1H04)についてはFERM BP-5628、Escherichia coli JM109 (MBC1L24)についてはFERM BP-5627としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０１１３】
(5) ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体#23-57-137-1のＣＤＲの決定
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全般の構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat,E.A.et al., 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983) 。
【０１１４】
このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をKabatらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表１に示すごとく決定した。
【０１１５】
なお、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号59〜61に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号62〜64に示した。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
［参考例３］
キメラ抗体の構築
(1) キメラ抗体Ｈ鎖の構築
(i) Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムDNAを含む発現ベクターに連結するために、クローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領域をPCR法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１−Ｓ１（配列番号７）はＶ領域のリーダー配列の５'−側をコードするDNAにハイブリダイズし且つKozak コンセンサス配列（Kozak, M. et al., J. Mol.Biol., 196, 947-950, 1987)及び制限酵素Hind IIIの認識配列を有するように設計した。前方プライマーＭＢＣ１−ａ（配列番号８）はＪ領域の３'−側をコードするDNA配列にハイブリダイズし、且つ、スプライスドナー配列及び制限酵素BamHIの認識配列を有するように設計した。PCRは、TaKaRa Ex Taq （宝酒造）を用い、50μｌの反応混合液に鋳型DNAとして0.07μｇのプラスミドMBC1H04 、プライマーとしてMBC1-aおよびMBC1-S1 をそれぞれ50pmole 、2.5UのTaKaRa Ex Taq 、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で添付緩衝液を使用して50μｌの鉱油を上層し、94℃にて１分間、55℃にて１分間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。PCR法により増幅したDNA断片を３％Nu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products)を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１１８】
437bp 長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。得られたDNA溶液１μｌを制限酵素BamHI、Hind III（宝酒造）により37℃１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりDNAを回収した。
【０１１９】
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むHind III-BamHI DNA断片をHind IIIおよびBamHIで消化することにより調製したpUC19ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するためプライマーM13 Primer M4 およびM13 Primer RV をプライマーとして、Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer)により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５'−側にHind III認識配列及びKozak 配列、３'−側にBamHI認識配列を持つプラスミドをMBC1H/pUC19 と命名した。
【０１２０】
(ii)ｃDNAタイプのマウス−ヒトキメラＨ鎖の作製のためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃDNAと連結するために、上記のようにして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をPCR法により修飾した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーMBC1HVS2（配列番号９）はＶ領域のリーダー配列の最初をコードする配列の２番のアスパラギンをグリシンに変換し、且つKozak コンセンサス配列（Kozak, M.et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987)並びにHind IIIおよびEcoRI 認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーMBC1HVR2（配列番号10）はＪ領域の３'−側をコードするDNA配列にハイブリダイズし、且つ、Ｃ領域の５'−側の配列をコードしＡpaＩおよびSmaI認識配列を有するように設計した。
【０１２１】
PCRはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を用い、50μｌの反応混合液に鋳型DNAとして0.6 μｇのプラスミドMBC1H/pUC19 、プライマーとしてMBC1HVS2およびMBC1HVR2をそれぞれ50pmole 、TaKaRa Ex Taq を2.5U、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で添付の緩衝液を使用して50μｌの鉱油を上層して94℃１分間、55℃１分間、72℃１分間の温度サイクルで30回行った。PCR法により増幅したDNA断片を１％Sea Kem GTG アガロース（FMC Bio.Products) を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。456bp 長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノール沈殿させた後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。
【０１２２】
得られたDNA溶液１μｌを制限酵素EcoRI およびSmaI（宝酒造）により37℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりDNAを回収した。上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むEcoRI-SmaI DNA断片をEcoRI およびSmaIで消化することにより調製したpUC19 ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するため、プライマーM13 Primer M4 及びM13 Primer RV をプライマーとして、Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を用い、DNA Sequencer 373A(Perkin-Elmer)により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５'−側にEcoRI およびHind III認識配列及びKozak 配列、３'−側にＡpaＩおよびSmaI認識配列を持つプラスミドをMBC1Hv/pUC19と命名した。
【０１２３】
(iii) キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃDNAは、以下のようにして調製した。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域ＩｇＧ１のゲノムDNA（N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982）をコードする発現ベクターDHFR-△E-RVh-PM-1-f（WO92/19759参照）と、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムDNAをコードする発現ベクターRV1-PM1a（WO92/19759参照）とを導入したＣＨＯ細胞よりｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−PCR法でヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃDNAをクローニングし、pUC19 のHind IIIとBamHI部位にサブクローニングした。塩基配列を確認した後、正しい配列を持つプラスミドをpRVh-PM1f-ｃDNAと命名した。
【０１２４】
DHFR-△E-RVh-PM-1-f上のＳＶ４０プロモーターとＤＨＦＲ遺伝子との間にあるHind III部位、およびＥＦ−１αプロモーターとヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域との間にあるEcoRI 部位を欠失した発現ベクターを作製し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃDNAの発現ベクターの構築のために使用した。
【０１２５】
pRVh-PM1f-ｃDNAをBamHIで消化した後、Klenowフラグメントで平滑化し、さらにHind IIIで消化し、Hind III-BamHI平滑化断片を調製した。このHind III-BamHI平滑化断片を、上記のHind III部位およびEcoRI 部位が欠失したDHFR-△E-RVh-PM1-f をHind IIIおよびSmaIで消化することにより調製した発現ベクターに連結し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含む発現ベクターRVh-PM1f−ｃDNAを構築した。
【０１２６】
ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含む発現ベクターRVh-PM1f−ｃDNAをApaIおよびBamHIで消化した後、Ｈ鎖Ｃ領域を含むDNA断片を回収し、ApaIおよびBamHIで消化することにより調製したMBC1Hv/pUC19に導入した。こうして作製したプラスミドをMBC1HcDNA ／pUC19 と命名した。このプラスミドはマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含み、５'-末端にEcoRI およびHind III認識配列、３'-末端にBamHI認識配列を持つ。
【０１２７】
プラスミドMBC1HcDNA/pUC19 をEcoRI およびBamHIで消化し、得られたキメラ抗体のＨ鎖をコードする塩基配列を含むDNA断片を、EcoRI およびBamHIで消化することにより調製した発現ベクターpCOS1に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをMBC1HcDNA/pCOS1と命名した。なお、発現ベクターpCOS1は、HEF-PMh-gγ1（WO92/19759参照）から、EcoRI およびSmaI消化により抗体遺伝子を削除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構築した。
【０１２８】
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するため、プラスミドMBC1HcDNA/pUC19 をEcoRI およびBamHIで消化し、得られたキメラ抗体Ｈ鎖配列を含むDNA断片を、EcoRI およびBamHIで消化することにより調製した発現プラスミドpCHO1に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをMBC1HcDNA/pCHO1 と命名した。なお、発現ベクターpCHO1は、DHFR- △E-rvH-PM1-f（WO92/19759参照）から、EcoRI およびSmaI消化により抗体遺伝子を削除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構築した。
【０１２９】
(2) ヒトＬ鎖定常領域の構築
(i) クローニングベクターの作製
ヒトＬ鎖定常領域を含むpUC19 ベクターを構築するために、Hind III部位欠失pUC19 ベクターを作製した。pUC19 ベクター２μｇを20mM Tris-HCl（pH8.5 ）、10mM MgCl2、１mM DTT、100 mM KCl、８Ｕの Hind III （宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、DNAをエタノール沈殿により回収した。回収したDNAを50mM Tris-HCl （pH7.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM NaCl、0.5mM dNTP、６Ｕのクレノウ(Klenow)フラグメント（GIBCO BRL)を含有する50μｌの反応混合液中で室温にて20分間反応させ、末端を平滑化させた。反応混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ベクターDNAをエタノール沈殿により回収した。
【０１３０】
回収したベクターDNAを50mM Tris-HCl （pH7.6)、 10mM MgCl2 、１mM ATP、１mM DTT、５％(v/v) ポリエチレングリコール-8000 、0.5 ＵのT4 DNAリガーゼ（GIBCO BRL)を含有する反応混合液10μｌ中で16℃で２時間反応させ、自己連結させた。反応混合液５μｌを大腸菌JM109 コンピテント細胞（ニッポンジーン）100 μｌに加え、氷上で30分間静置した後、42℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。ＳＯＣ培地500 μｌを加えて、37℃で１時間インキュベーションした後、X-gal とIPTGを表面に塗布した２×ＹＴ寒天培地（50μg/mlアンピシリン含有）（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にまき、37℃で一夜培養して形質転換体を得た。
【０１３１】
形質転換体を、50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地20mlで37℃一夜培養し、菌体画分からPlasmid Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付の処方に従ってプラスミドDNAを精製した。精製したプラスミドをHind IIIで消化し、Hind III部位が欠失していることを確認したプラスミドをpUC19ΔHind IIIと命名した。
【０１３２】
(ii)ヒトＬ鎖λ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
ヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域は、Ｍｃｇ+ Ｋｅ+ Ｏｚ- 、Ｍｃｇ- Ｋｅ- Ｏｚ- 、Ｍｃｇ- Ｋｅ- Ｏｚ+ 、Ｍｃｇ- Ｋｅ+ Ｏｚ- の少なくとも４種類のアイソタイプが知られている（P.Dariavach,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,9074-9078,1987) 。#23-57-137-1マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域と相同性を有するヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をＥＭＢＬデータベースで検索した結果、アイソタイプがＭｃｇ+ Ｋｅ+ Ｏｚ- （accession No.X57819)（P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987)のヒト抗体Ｌ鎖λ鎖が最も高い相同性を示し、#23-57-137-1マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域との相同性はアミノ酸配列で64.4％、塩基配列で73.4％であった。
【０１３３】
そこで、このヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の構築をPCR法を用いて行った。各プライマーの合成は、394 DNA/RNA 合成機(ABI社) を用いて行った。HLAMB1（配列番号11）およびHLAMB3（配列番号13）はセンスDNA配列を有し、HLAMB2（配列番号12）およびHLAMB4（配列番号14）はアンチセンスDNA配列を有し、それぞれのプライマーの両端に20から23bpの相補的配列を有する。
【０１３４】
外部プライマーHLAMBS（配列番号15）、HLAMBR（配列番号16）はHLAMB1、HLAMB4とそれぞれ相同な配列を有しており、またHLAMBSはEcoRI 、Hind III、BlnI認識配列を、HLAMBRはEcoRI 認識配列をそれぞれ含んでいる。第一PCRでHLAMB1-HLAMB2 とHLAMB3-HLAMB4 の反応を行った。反応後、それらを等量混合し、第二PCRでアセンブリを行った。さらに外部プライマーHLAMBSおよびHLAMBRを添加し、第三PCRにより全長DNAを増幅させた。
【０１３５】
PCRはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を使い、添付の処方に従って行った。第一PCRでは、５pmole のHLAMB1および 0.5pmole のHLAMB2と５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μｌの反応混合液、あるいは0.5pmoleのHLAMB3および５pmole のHLAMB4と５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで５回行った。
【０１３６】
第二PCR は、反応液を50μｌずつ混合し、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで３回行った。
【０１３７】
第三PCRは、反応液に外部プライマーHLAMBSおよびHLAMBRを各50pmole ずつ添加し、94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。
【０１３８】
第三PCR産物のDNA断片を３％低融点アガロースゲル（NuSieve GTG Agarose, FMC) で電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用い、添付の処方に従ってゲルから回収、精製した。
【０１３９】
得られたDNA断片を50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、 100mM NaCl 、８ＵのEcoRI （宝酒造）を含有する20μｌの反応混合液中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液８μｌに溶解した。
【０１４０】
プラスミドpUC19ΔHind III 0.8μｇを同様にEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿により回収した。消化したプラスミドpUC19ΔHind IIIを50 mM Tris-HCl（pH9.0)、１mM MgCl2、アルカリホスファターゼ(E.coli C75, 宝酒造）を含有する反応混合液50μｌ中で37℃、30分間反応させ脱リン酸処理（ＢＡＰ処理）した。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿により回収した後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mMEDTA溶液10μｌに溶解した。
【０１４１】
上記のＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 ΔHind III１μｌと先のPCR産物４μｌをDNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌JM109 コンピテント細胞に形質転換した。得られた形質転換体を50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。
【０１４２】
上記プラスミドについて、クローニングされたDNAの塩基配列の確認を行った。塩基配列の決定には373A DNA シークエンサー (ABI 社) を用い、プライマーにはM13 Primer M4 およびM13 Pricer RV （宝酒造）を用いた。その結果、クローニングされたDNAの内部に12bpの欠失があることが判明した。このDNAを含むプラスミドをＣλΔ／pUC19 と命名した。そこで、その部分を補うためのプライマーHCLMS （配列番号17）、 HCLMR（配列番号18）を新たに合成し、PCRで再度正しいDNAの構築を行った。
【０１４３】
第一PCRで欠失DNAを含むプラスミドＣλΔ／pUC19 を鋳型とし、プライマーHLAMBSとHCLMR 、HCLMS とHLAMB4で反応を行った。PCR産物をそれぞれ精製し、第二PCRでアセンブリを行った。さらに外部プライマーHLAMBSおよびHLAMB4を添加し、第三PCRにより全長DNAを増幅させた。
【０１４４】
第一PCRでは、鋳型としてＣλΔ／pUC19 0.1μｇ、プライマーHLAMBSおよびHCLMR 各50pmole 、あるいはHCLMS およびHLAMB4各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。
【０１４５】
PCR産物HLAMBS-HCLMR(236bp) 、HCLMS-HLAMB4(147bp) をそれぞれ３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。第二PCRでは精製DNA断片各40ng、１ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する20μｌの反応混合液を用い、25μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルを５回行った。
【０１４６】
第三PCRでは、第二PCR反応液２μｌ、外部プライマーHLAMBS、HLAMB4各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層した。PCRは、94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。第三PCR産物である357bp のDNA断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。
【０１４７】
得られたDNA断片0.1μｇをEcoRI で消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミド pUC19ΔHind IIIにサブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。
【０１４８】
精製したプラスミドについて塩基配列をM13 Primer M4 、M13 Primer RV （宝酒造）を用い、373A DNAシークエンサー(ABI社）にて決定した。欠失のない正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣλ／pUC19 とした。
【０１４９】
(iii) ヒトＬ鎖κ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
プラスミドHEF-PM1k-gk （WO92/19759）からＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするDNA断片をPCR法を用いてクローニングした。394 DNA/RNA 合成機(ABI社）を用いて合成した前方プライマーHKAPS （配列番号19）はEcoRI 、Hind III、BlnI認識配列を、後方プライマーHKAPA （配列番号20）はEcoRI 認識配列を有するように設計した。
【０１５０】
鋳型となるプラスミドHEF-PM1k-gk 0.1 μｇ、プライマーHKAPS 、HKAPA 各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層した。94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の反応を30サイクル行った。360bp のPCR産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。
【０１５１】
得られたDNA断片をEcoRI で消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 ΔHind IIIにクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドの塩基配列をM13 Primer M4 、M13 Primer RV （宝酒造）を用い、373A DNAシークエンサー(ABI社）にて決定した。正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣκ／pUC19 とした。
【０１５２】
(3) キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
キメラ#23-57-137-1抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した。プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 のヒト抗体定常領域の直前にあるHind III、BlnI部位に、#23-57-137-1Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を連結することによって、それぞれキメラ#23-57-137-1抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびＬ鎖λ鎖またはＬ鎖κ鎖定常領域をコードするpUC19 ベクターを作製した。EcoRI 消化によってキメラ抗体Ｌ鎖遺伝子を切り出し、ＨＥＦ発現ベクターへサブクローニングを行った。
【０１５３】
すなわち、プラスミドMBC1L24 から#23-57-137-1抗体Ｌ鎖Ｖ領域をPCR法を用いてクローニングした。各プライマーの合成は、394 DNA/RNA 合成機(ABI社）を用いて行った。後方プライマーMBCCHL1 （配列番号２１）はHind III認識配列とKozak 配列（Kozak,M.et al.,J.Mol.Biol.196,947-950,1987) を、前方プライマーMBCCHL3 （配列番号２２）はBglII 、EcoRI 認識配列を有するように設計した。
【０１５４】
PCRは、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.2mM ｄＮＴＰ、0.1 μｇのMBC1L24 、プライマーとしてMBCCHL1 およびMBCCHL3 を各50pmole 、１μｌの AmpliTaq(PERKIN ELMER) を含有する100μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。
【０１５５】
４４４ｂｐのPCR産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEAN II kit(BIO101)を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。PCR産物１μｌをそれぞれ10mM Tris-HCl （pH7.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、50mM NaCl 、８ＵのHind III（宝酒造）および８ＵのEcoRI （宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収し、10mM Tris-HCl （pH7.4)、１mM EDTA 溶液８μｌに溶解した。
【０１５６】
プラスミドpUC19１μｇを同様にHind IIIおよびEcoRIで消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿により回収し、アルカリホスファターゼ(E.coli C75 ，宝酒造）でＢＡＰ処理した。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１５７】
ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 １μｌと先のPCR産物４μｌをDNA LigationKit Ver.2 （宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）に前述と同様に形質転換した。これを50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。得られた形質転換体を、50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで37℃で一夜培養した。菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。塩基配列を決定後、正しい塩基配列を有するプラスミドをCHL/pUC19 とした。
【０１５８】
プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 各１μｇをそれぞれ20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM KCl、８Ｕの Hind III（宝酒造）および２ＵのBlnI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した後、37℃で30分間ＢＡＰ処理を行った。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、DNAをエタノール沈殿で回収し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１５９】
#23-57-137-1Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドCHL/pUC19 から８μｇを同様にHindIIIおよびBlnIで消化した。得られた409bp のDNA断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl（pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１６０】
このＬ鎖Ｖ領域DNA ４μｌをＢＡＰ処理したプラスミドＣλ／pUC19 またはＣκ／pUC19 各１μｌにサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地３mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドMBC1L(λ)/pUC19 、MBC1L(κ)/pUC19 とした。
【０１６１】
プラスミドMBC1L(λ)/pUC19 およびMBC1L(κ)/pUC19 をそれぞれEcoRI で消化し、３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、743bp のDNA断片をGENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mMEDTA溶液10μｌに溶解した。
【０１６２】
発現ベクターとしてプラスミドHEF-PM1k-gk 2.7 μｇをEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した。回収したDNA断片をＢＡＰ処理した後、１％低融点アガロースゲルで電気泳動し、6561bpのDNA断片をGENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１６３】
ＢＡＰ処理したＨＥＦベクター２μｌを上記プラスミドMBC1L(λ) またはMBC1L(κ) EcoRI 断片各３μｌと連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。
【０１６４】
精製したプラスミドを、20mM Tris-HCl (pH8.5) 、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM KCl 、８ＵのHind III（宝酒造）および２ＵのPvuI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば5104/2195bp 、逆方向に挿入されていれば4378/2926bp の消化断片が生じることより、正しい方向に挿入されていたプラスミドをそれぞれMBC1L(λ)/neo 、MBC1L(κ)/neo とした。
【０１６５】
(4) ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
キメラ抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。
【０１６６】
すなわちキメラ抗体の一過性発現は、プラスミドMBC1HcDNA/pCOS1とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏまたはMBC1HcDNA/pCOS1とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０7細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドDNA１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のUltra Low IgGウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。 また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いてキット添付の処方に従って行った。
【０１６７】
(5) ＥＬＩＳＡ
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（0.1M NaHCO3 、0.02％ NaN3 ）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（50mM Tris-HCl、１mM MgCl2 、0.1M NaCl 、0.05％ Tween20、0.02％ NaN3 、１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、pH7.2 ）でブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ ＩｇＧ１λ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いた。
【０１６８】
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥｌＩＳＡプレートでは、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）（ペプチド研究所）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。その結果、キメラ抗体は、ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する結合能を有しており、クローニングしたマウス抗体Ｖ領域の正しい構造を有することが示された（図５）。また、キメラ抗体においてＬ鎖Ｃ領域がλ鎖あるいはκ鎖のいずれであっても抗体のＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する結合能は変化しないことから、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｃ領域は、ヒト型化抗体Ｌ鎖λ鎖を用いて構築した。
【０１６９】
(6) ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
【０１７０】
すなわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏまたはＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖DNAにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でDNAを回収してエレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞0.8ml に、各プラスミドDNA 10μｇを加え、1,500 Ｖ，25μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加したＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、３枚の９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてCO2インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭーα培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地を交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。
【０１７１】
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のUltra Low IgGウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、0.2μmのフィルター（Millipore）により細胞破片を除去した。
【０１７２】
ＣＨＯ細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、POROSプロテインAカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ ＬＣ１００（Millipore）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製キメラ抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
【０１７３】
［参考例４］
ヒト型化抗体の構築
(1) ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築
(i) ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒト型化#23-57-137-1抗体Ｈ鎖を、PCR法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体S31679（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ、Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ Ａ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１１０−１１８，１９９３）由来のＦＲを有するヒト型化#23-57-137-1抗体Ｈ鎖（バージョン"ａ"）の作製のために６個のPCRプライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号２４）はセンスDNA配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号２５）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号２６）はアンチセンスDNA配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１（配列番号２７）及びＭＢＣ１ＨＶＲ１（配列番号２８）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１及びＭＢＣ１ＨＧＰ４とホモロジーを有する。
【０１７４】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ ａｎｄｓｏａｋ法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。
【０１７５】
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのDNA断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液に溶解した。PCRは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１及びＭＢＣ１ＨＶＲ１を加え、同じ温度サイクルを３０回行った。PCR法により増幅したDNA断片を４％Ｎｕ ＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１７６】
４２１ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたPCR反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
【０１７７】
（ii) ヒト型化Ｈ鎖ｃDNAのためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃDNAと連結するために、上記のようにして構築したヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をPCR法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ２はＶ領域のリーダー配列の５'−側をコードする配列とハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＢＣ１ＨＶＲ２はＪ領域の３'−側をコードするDNA配列にハイブリダイズし且つＣ領域の５'−側の配列をコードしＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を有するように設計した。
【０１７８】
PCRはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、鋳型DNAとして０．４μｇのｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９を用い、プライマーとしてＭＢＣ１ＨＶＳ２およびＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付緩衝液を使用し、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。PCR法により増幅したDNA断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（ＦＭＣＢｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１７９】
４５６ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたPCR反応混合物をＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化することで調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたハイブリドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５'−側にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３'−側にＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を持つプラスミドをｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
【０１８０】
（２）ヒト型化抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ｈＰＭ１抗体Ｈ鎖ｃDNAの配列を含むプラスミドＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃDNAをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩにて消化し、Ｈ鎖Ｃ領域を含むDNA断片を回収し、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製したｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドはヒト型化#23-57-137-1抗体のＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含み、５'-末端にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３'-末端にＢａｍＨＩ認識配列を持つ。プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９に含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"の塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号５８に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号５６に示す。
【０１８１】
ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むDNA断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドpCOS1に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈMBC1HcDNA/pCOS1と命名した。
【０１８２】
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するためｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むDNA断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドpCHO1に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1と命名した。
【０１８３】
（３）Ｌ鎖ハイブリッド可変領域の構築
(i) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体の作製
ヒト型化抗体とマウス（キメラ）抗体のＦＲ領域を組み換えたＬ鎖遺伝子を構築し、ヒト型化のための各領域の評価を行った。ＣＤＲ２内にある制限酵素ＡｆｌＩＩ切断部位を利用することによって、ＦＲ１及び２はヒト抗体由来、ＦＲ３及び４はマウス抗体由来とするハイブリッド抗体を作製した。
【０１８４】
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ各１０μｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＡｆｌＩＩ（宝酒造）１０Ｕを含有する反応混合液１００μｌ中で３７℃にて１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｃ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｃ２とする）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｈ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｈ２とする）を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
【０１８５】
回収したｃ１、ｈ１断片各１μｇについてＢＡＰ処理を行った。DNAをフェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。ＢＡＰ処理したｃ１及びｈ１断片１μｌをそれぞれｈ２、ｃ２断片４μｌに連結し（４℃、一夜）、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
【０１８６】
精製したプラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭMgCl2 ，１ｍＭＤＴＴ，ＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕ、またはＢａｍＨＩ（宝酒造）８Ｕ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃、１時間消化した。ｃ１-ｈ２が正しく連結されていれば、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで７１３４／２６９ｂｐの消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。
【０１８７】
これをヒトＦＲ１，２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。一方、ｈ１-ｃ２のクローンが得られなかったので、ｐＵＣベクター上で組換えてからＨＥＦベクターにクローニングした。その際、アミノ酸置換のないヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、及びＦＲ３内の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに置換したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９を鋳型として用いた。
【０１８８】
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９の各１０μｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＨｉｎｄＩＩＩ１６Ｕ，ＡｆｌＩＩ４Ｕを含有する反応混合液３０μｌ中で３７℃、１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９から２１５ｂｐ（ｃ２'）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９からそれぞれ３２１８ｂｐ（ｈａ１'，ｈｄ１'）のDNA断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
【０１８９】
ｈａ１'、ｈｄ１'断片をそれぞれｃ２'断片に連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９とした。
【０１９０】
得られたプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９，ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化した。それぞれ７４３ｂｐのDNA断片を２％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。
【０１９１】
各DNA断片４μｌを前述のＢＡＰ処理したＨＥＦベクター１μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
【０１９２】
精製した各プラスミドを、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭＫＣｌ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕ，ＰｖｕＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば５１０４／２１９５ｂｐ、逆方向に挿入されていれば４３７８／２９２６ｂｐの消化断片が生じることより、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれマウスＦＲ１，２／ヒトＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏとした。
【０１９３】
(ii)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体の作製
ＣＤＲ１内にあるＳｎａＢＩ切断部位を利用することによって、同様にＦＲ１とＦＲ２のハイブリッド抗体を作製した。
【０１９４】
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏの各１０μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＳｎａＢＩ（宝酒造）６Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。次に２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＰｖｕＩ６Ｕを含有する反応混合液５０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
【０１９５】
反応液を１．５％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｍ１）および２３４９ｂｐ（ｍ２）、プラスミドｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｈｍ１）および２３４９ｂｐ（ｈｍ２）の各DNA断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液４０μｌに溶解した。
【０１９６】
ｍ１、ｈｍ１断片１μｌをそれぞれｈｍ２、ｍ２断片４μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
【０１９７】
精製した各プラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭＤＴＴ，ＡｐａＩ（宝酒造）８Ｕ、またはＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
【０１９８】
各断片が正しく連結されていれば、ＡｐａＩで７３０４ｂｐ、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ（ｍ１-ｈｍ２）、ＡｐａＩで６５３８／７６６ｂｐ、ＡｐａＬＩで３５３５／２０２５／１２４６／４９８ｂｐ（ｈｍ１-ｍ２）の消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれヒトＦＲ１／マウスＦＲ２，３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、マウスＦＲ１／ヒトＦＲ２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。
【０１９９】
（４）ヒト型化抗体Ｌ鎖の構築
ヒト型化#23-57-137-1抗体Ｌ鎖を、PCR法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（ＧＥＮ-ＢＡＮＫ、Ｄｅｆｔｏｓ Ｍら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，９５−１０３，１９９４）由来のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、並びにヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ-ＰＤＢ）由来のＦＲ４を有するヒト型化#23-57-137-1抗体Ｌ鎖（バージョン"ａ"）の作製のために６個のPCRプライマーを使用した。
【０２００】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配列番号３０）はセンスDNA配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ２（配列番号３１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３２）はアンチセンスDNA配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番号３３）及びＭＢＣ１ＬＶＲ１（配列番号３４）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ４とホモロジーを有する。
【０２０１】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢＣ１ＬＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ ａｎｄｓｏａｋ法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。
【０２０２】
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのDNA断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液に溶解した。
【０２０３】
PCRは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢＣ１ＬＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、この反応混合液に５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＶＲ１を加え、さらに同じ温度サイクルで３０回反応させた。PCR法により増幅したDNA断片を３％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２０４】
４２１ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。得られたPCR反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９と命名した。しかしながらＣＤＲ４の１０４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号９６位）のアミノ酸がアルギニンになっていたため、これをチロシンに修正するための修正プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒ（配列番号３５）を設計し、合成した。PCRはＴａＫａＲａ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に鋳型DNAとして０．６μｇのプラスミドｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９、プライマーとしてＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。PCR法により増幅したDNA断片を３％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２０５】
４２１ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。得られたPCR反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
【０２０６】
Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４プライマー及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶプライマーを用いて塩基配列を決定した結果、正しい配列を得ることができたので、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、４１６ｂｐの断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。得られたPCR反応混合物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９に導入し、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌａλ／pCOS1と命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン"ａ"の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号66に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号47に示す。
【０２０７】
バージョン"ｂ"をPCR法による変異導入を用いて作製した。バージョン"ｂ"では４３位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４３位）のグリシンをプロリンに、４９位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４９位）のリジンをアスパラギン酸に変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ５Ｒ（配列番号３６）とプライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。塩基配列決定後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。
【０２０８】
こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするDNAを含む断片をプラスミドpCOS1に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／pCOS1と命名した。
【０２０９】
バージョン"ｃ"をPCR法による変異導入を用いて作製した。バージョン"ｃ"では８４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８０位）のセリンをプロリンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ６Ｓ（配列番号３７）とプライマーＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶによりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
【０２１０】
塩基配列決定後、制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化し、ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／pCOS1と命名した。
【０２１１】
バージョン"ｄ" 、"ｅ" 及び"ｆ" をPCR法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に"ａ" 、"ｂ" 、"ｃ" バージョンの９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１１Ｒ（配列番号３８）とプライマーＭ-Ｓ１（配列番号４４）によりそれぞれｈＭＢＣ１Ｌａλ／pCOS1，ｈＭＢＣ１Ｌｂλ／pCOS1，ｈＭＢＣ１Ｌｃλ／pCOS1を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することより調製したＣλ／ｐＵＣ１９と連結した。
【０２１２】
こうして得られたプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＵＣ１９とした。これらのプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／pCOS1、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／pCOS1、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／pCOS1と命名した。
【０２１３】
バージョン"ｇ" 及び"ｈ" をPCR法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に"ａ" 、"ｄ" バージョンの３６位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号３６位）のヒスチジンをチロシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ９Ｒ（配列番号３９）およびＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶをプライマーとして用いて、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたPCR産物とＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４をプライマーとして用いて、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてさらにPCRを行った。得られたDNA断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することで調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。このプラスミドを鋳型として、プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１３Ｒ（配列番号４０）とＭＢＣ１ＬＶＳ１をプライマーとしたPCRを行った。得られたPCR断片をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩでＩ消化し、ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９に導入した。塩基配列を決定し、正しい配列を含むプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＵＣ１９とし、これらのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／pCOS1およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／pCOS1と命名した。
【０２１４】
バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｋ" 、"ｌ" 、"ｍ" 、"ｎ" および"ｏ" をPCR法による変異導入を用いて作製した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１４Ｓ（配列番号４１）とプライマーＶｌＲＶ（λ）（配列番号４３）によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定を行い、それぞれのバージョンに対応した変異が導入されたクローンを選択した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＵＣ１９（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）と命名した。バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、"ｍ" および"ｏ" の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号67、68、69、70に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号48、49、50、51に示す。
【０２１５】
バージョン"ｐ" 、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" および"ｔ" は、バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ" または"ｏ" のアミノ酸配列の８７位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョンであり、ＦＲ３内にある制限酵素Ａｏｒ５１ＭＩ切断部位を利用して、バージョン"ｈ" を、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ"または"ｏ" とつなぎ換えることにより作製したものである。すなわち、発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ｉ，ｊ，ｍ，ｌ，ｏ）中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐを除き、ここに発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｈλ／pCOS1中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐをつなぐことにより９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンとなるようにした。塩基配列決定を行い、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ" および"ｏ" の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンに置換されたクローンを選択し、対応するバージョンをそれぞれ"ｐ"、"ｑ" 、"ｓ" 、"ｒ" および"ｔ" とし、得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ｐ，ｑ，ｓ，ｒ，ｔ）と命名した。バージョン"ｑ" 、"ｒ"、"ｓ" および"ｔ" の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号71、72、73、74に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号52、53、54、55に示す。
【０２１６】
プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／pCOS1をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９にサブクローニングし、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９と命名した。ヒト型化Ｌ鎖の各バージョンにおける置換アミノ酸の位置を表２に示す。
【０２１７】
【表２】
【０２１８】
表中、Ｙはチロシン、Ｐはプロリン、Ｋはリジン、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｉはイソロイシンを示す。
【０２１９】
なお、前記プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９を有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９）および Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ ＢＰ−５６２９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ ＢＰ−５６３０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０２２０】
（５）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ハイブリッド抗体およびヒト型化#23-57-137-1抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。すなわちＬ鎖ハイブリッド抗体の一過性発現では、プラスミドｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、またはｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとの組み合わせを、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドDNA１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のUltra Low IgGウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。
【０２２１】
ヒト型化#23-57-137-1抗体の一過性発現では、プラスミドｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ａ〜ｔ）のいずれかの組み合わせをＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、前記ハイブリッド抗体の場合と同様の方法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、得られた培養上清をＥＬＩＳＡに供した。
【０２２２】
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのハイブリッド抗体またはヒト型化抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、キット添付の処方に従って行った。
【０２２３】
（６）ＥＬＩＳＡ
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 、０．０２％ ＮａＮ3 ）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％ ＮａＮ3 、１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ ＩｇＧ１λ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（ＴｈｅＢｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いた。
【０２２４】
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳー７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。
【０２２５】
（７）活性確認
(i) ヒト型化Ｈ鎖の評価
ヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体とＰＴＨｒＰ結合能が同等であった（図６）。この結果は、Ｈ鎖Ｖ領域のヒト型化はバージョン"ａ"で十分なことを示す。以下、ヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"をヒト型化抗体のＨ鎖として供した。
【０２２６】
(ii)ハイブリッド抗体の活性
(ii-a) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλあるいはｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλの場合はいずれもキメラ#23-57-137-1抗体と同等の結合活性を示した（図７）。これらの結果は、ＦＲ３，４はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ１，２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
【０２２７】
(ii-b)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合はキメラ#23-57-137-1抗体と同等の結合活性を示した（図８）。これらの結果は、ＦＲ１，２のうちＦＲ１はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
【０２２８】
(iii) ヒト型化抗体の活性
Ｌ鎖としてバージョン"ａ" から"ｔ" の各々一つを用いたヒト型化抗体について、抗原結合活性を測定した。その結果、Ｌ鎖バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、" ｍ"、"ｏ" 、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" 、"ｔ" を有するヒト型化抗体はキメラ抗体と同等のＰＴＨｒＰ結合能を示した（図９〜12）。
【０２２９】
（８）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
【０２３０】
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とｈＭＢＣ１Ｌｍλ／pCOS1またはｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とｈＭＢＣ１Ｌｑλ／pCOS1あるいはｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とｈＭＢＣ１Ｌｒλ／pCOS1の組み合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖DNAにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でDNAを回収し、エレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、各プラスミドDNA１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）添加、ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生能の高い細胞を選別した。
【０２３１】
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のUltra Low IgGウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、0.2μmのフィルター（Millipore）により細胞破片を除去した。ＣＨＯ細胞の培養上清からのヒト型化抗体の精製は、POROSプロテインAカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐＬＣ１００（Millipore）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製ヒト型化抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
【０２３２】
［参考例５］
中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性の測定は、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を用いて行った。すなわち、ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）中にて、ＣＯ2 インキュベーターで培養した。ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を９６穴プレートに１０4 細胞／１００μｌ／穴で蒔込み１日間培養し、４ｍＭのヒドロコルチゾンと１０％牛胎児血清を含むＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）に交換する。さらに３ないし４日間培養した後、２６０μｌのＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）にて洗浄し、１ｍＭのイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、ＳＩＧＭＡ）および１０％の牛胎児血清と１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む８０μｌのＨａｍ' ｓＦ-１２を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。
【０２３３】
中和活性を測定するマウス抗体、キメラ抗体またはヒト型化抗体を、あらかじめ１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌおよび０．３７μｇ／ｍｌの群、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの群、または１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６３μｇ／ｍｌおよび０．３１μｇ／ｍｌの群に段階希釈し、４ｎｇ／ｍｌに調製したＰＴＨｒＰ（１−３４）と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ（１−３４）の混合液８０μｌを各穴に添加した。各抗体の最終濃度は、上記抗体濃度の４分の１になり、ＰＴＨｒＰ（１−３４）の濃度は、１ｎｇ／ｍｌになる。１０分間室温にて処理した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて３回洗浄したした後、１００μｌの０．３％塩酸９５％エタノールにて細胞内のｃＡＭＰを抽出する。水流アスピレーターにて塩酸エタノールを蒸発させ、ｃＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'Ｓ）付属のＥＩＡバッファー１２０μｌを添加しｃＡＭＰを抽出後、ｃＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'Ｓ）添付の処方に従ってｃＡＭＰを測定した。その結果、キメラ抗体と同等の抗原結合を有するＬ鎖バージョンのうち、９１位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョン"ｑ"、"ｒ"、"ｓ"、"ｔ"を有するヒト型化抗体がキメラ抗体に近い中和能を示し、その中でも、バージョン"ｑ"がもっとも強い中和能を示した（図１３〜１５）。
【産業上の利用可能性】
【０２３４】
本発明により、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有する悪液質治療剤が提供される。
【０２３５】
上記物質は、悪液質モデル動物での薬効試験において、体重減少を対照と比較して抑制し、また、生存期間の延長効果も奏することから、悪液質治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図２】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図３】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図４】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図５】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図６】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図７】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図８】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図９】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１０】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１１】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１２】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１３】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１４】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１５】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１６】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図１７】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図１８】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図１９】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０２３７】
配列番号１〜４４：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Parathyroid hormone related protein（PTHrP））とその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有する悪液質治療剤に関する。具体的には、本発明は副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む悪液質治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
末期癌患者にみられる悪液質は、悪性腫瘍の随伴性症候群の一つであり、食欲不振、体重減少、貧血、水電解質の異常、免疫異常などを主症状とする全身状態の不良をきたす。癌患者にとって、悪液質の発症は、生命を脅かす終末期症状をもたらすのみならず、患者のQOL（Quality of life）を著しく損ない、患者自身はもちろん、家族や周囲の人に強い精神的、身体的、社会的影響を及ぼす。
【０００３】
近年、癌悪液質の原因物質であると考えられていたカケクチンが、腫瘍壊死因子（TNF）と同一因子であることが明らかになった。その後、インターロイキン１（IL-1）やIL-6、LIF、IFNなどのサイトカインにも同様の作用が明らかになり、癌悪液質は、複数の因子による複合的に作用する病態であることが明らかになってきた。
【０００４】
ヒト口腔底癌由来OCC-1細胞株は、このような癌悪液質に関連する種々の液性因子を産生することが知られており、OCC-1細胞をヌードマウスに移植すると、悪液質などの諸症状を発症させる（Kajimura N. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1996, 38 Suppl. pS48-52、Tanaka R. et al., Jpn. J. Clin. Oncology Apr.1996, 26（2）p88-94）。これは、ヌードマウスに移植されたOCC-1細胞株が、増殖と共に種々のサイトカイン（G-CSF、IL-6、LIF、IL-11、PTHrP など）を産生し、これらの因子が複合的に作用して、上記諸症状を発症させると考えられる。
【０００５】
このように、OCC-1細胞株を移植したヌードマウスの症状は、ヒト末期癌患者の症状ときわめて共通性が高いと考えられる。しかしながら、現在に至るまでこのような悪液質に対する薬剤についての報告は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、悪液質に対する治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、かかる治療剤を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質により、目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含む悪液質治療剤である。上記悪液質としては癌由来のものが挙げられる。
【０００８】
すなわち本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む悪液質治療剤に関する。
【０００９】
上記副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体は、ヒト型化又はキメラ化されたものであることが好ましい。
【００１０】
例えばヒト型化抗体は、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを含むものでありうる：
（ａ）配列番号４８〜５１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域、
（ｂ）配列番号５２〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域、
（ｃ）配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域。
【００１１】
またヒト型化抗体は、例えば配列番号４８〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域と、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域を含むものである。
【００１２】
上記ヒト型化抗体は、さらにヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域及び／又はＨ鎖Ｃ領域を含むものであってもよい。上記ヒト型化抗体は好ましくはヒト型化#23-57-137-1抗体である。
【００１３】
上記副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体は、例えば抗体断片及び／又はその修飾物であってもよい。また上記副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体はモノクローナル抗体であってもよい。
【００１４】
上記副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体は、例えば
(a)悪液質の治療に有効であり、
(b)ヒト口腔底癌OCC-1細胞の増殖には有意な影響を及ぼさない
ものを用いることもできる。
上記悪液質治療剤の対象となる悪液質は、例えば癌由来のものでありうる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有する悪液質治療剤が提供される。上記物質は、悪液質モデル動物での薬効試験において、体重減少を対照と比較して抑制し、また、生存期間の延長効果も奏することから、悪液質治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Parathyroid hormone related protein：PTHrP）とその受容体（PTHrP受容体）との結合を阻害する物質を有効成分として含む悪液質治療剤である。
【００１７】
本明細書中で「PTHrP受容体」とは、例えば特表平6-506598号公報に記載されているPTHrPと結合する受容体を指し、標的器官上（例えば骨や腎臓）に存在するPTHrP受容体か否かを問わない。
【００１８】
また、「PTHrPとPTHrP受容体との結合を阻害する物質」とは、PTHrPに結合することにより、PTHrPがPTHrP受容体と結合することを阻害する物質（例えば抗PTHrP抗体）、およびPTHrP受容体に結合することにより、PTHrPがPTHrP受容体と結合することを阻害する物質（例えばPTHrP受容体に対するアンタゴニスト（PTHrPアンタゴニストともいう）、具体的にはPTHrPペプチドの少なくとも一つのアミノ酸を置換、欠失したものやPTHrPペプチドの部分配列などを指す）のいずれか一方又は両方を指す。
【００１９】
抗PTHrP抗体としては、例えばヒト型化抗体、ヒト抗体（WO96/33735号公報）又はキメラ抗体（特開平4-228089号公報）などの公知の抗体のほか、本発明における抗体（#23-57-137-1抗体）などが挙げられる。なお、抗体はポリクローナル抗体でもよいがモノクローナル抗体であることが好ましい。また、PTHrPアンタゴニストとしては、ポリペプチドや低分子を含むが、例えばPTHrPに対して拮抗的にPTHrP受容体に結合する物質、例えば特開平7-165790号公報、Peptides（UNITED STATES）1995, 16（6）1031-1037、Biochemistry（UNITED STATES）Apr.28 1992, 31（16）4026-4033、特表平5-509098号公報に記載のPTHrPアンタゴニスト活性を有するポリペプチドが挙げられる。また、上記例示のポリペプチドのうち、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、付加、挿入されたポリペプチドで、同等のPTHrPアンタゴニスト活性を有するものも本発明のPTHrPアンタゴニストに含まれる。
本発明では、「PTHrPとPTHrP受容体との結合を阻害する物質」として抗PTHrP抗体を例に説明する。
【００２０】
１．抗PTHrP抗体
本発明で使用される抗PTHrP抗体は、悪液質の治療効果を有するものであれば、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問うものではない。
【００２１】
本発明で使用される抗PTHrP抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗PTHrP抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。この抗体はPTHrPと結合することにより、PTHrPがPTH／PTHrP受容体に結合するのを阻害してPTHrPのシグナル伝達を遮断し、PTHrPの生物学的活性を阻害する抗体である。
【００２２】
このような抗体としては、ハイブリドーマクローン#23-57-137-1により産生される#23-57-137-1抗体が挙げられる。
【００２３】
なお、ハイブリドーマクローン#23-57-137-1 は、mouse-mouse hybridoma #23-57-137-1 として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月１５日に、FERM BP-5631としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００２４】
２．抗体産生ハイブリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、PTHrPを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２５】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトPTHrPを、Suva, L. J. et al., Science（1987）237, 893に開示されたPTHrP遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、PTHrPをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のPTHrPタンパク質を公知の方法で精製する。
【００２６】
次に、この精製PTHrPタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、PTHrPのN末端の34個のペプチドについて、化学合成により作製することもでき、これを感作抗原として使用することもできる。
【００２７】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
【００２８】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００２９】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００３０】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics inMicrobiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D. H.et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978） 276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
【００３１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００３２】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００３３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1-10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【００３４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液（例えば平均分子量1000-6000程度）を通常30-60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００３５】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００３６】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでPTHrPに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、PTHrPへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるPTHrPを投与して抗PTHrP抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からPTHrPに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 94/25585 号公報、WO 93/12227 号公報、WO 92/03918 号公報、WO 94/02602 号公報参照）。
【００３７】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００３８】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００３９】
３．組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。
【００４０】
具体的には、抗PTHrP抗体を産生するハイブリドーマから、抗PTHrP抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit（Pharmacia製）等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
【００４１】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、cDNAの合成および増幅を行うには、5'-AmpliFINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。
【００４２】
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認する。
【００４３】
目的とする抗PTHrP抗体のV領域をコードするDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
【００４４】
本発明で使用される抗PTHrP抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００４５】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（H鎖）または軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523 号公報参照）。
【００４６】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【００４７】
４．改変抗体
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Humanized）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００４８】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００４９】
ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
【００５０】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDR及びFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることによりヒト型化抗体が得られる（EP 239400号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
【００５１】
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., CancerRes.（1993）53, 851-856）。
【００５２】
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
【００５３】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
【００５４】
本発明に使用できるヒト型化抗体としてはヒト型化#23-57-137-1抗体が挙げられる。ヒト型化#23-57-137-1抗体は、マウス由来の#23-57-137-1抗体の相補性決定領域を、Ｌ鎖についてはヒト抗体HSU03868（GEN-BANK, Deftos Mら, Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994）由来の３つのFR断片（FR1、FR2およびFR3）並びにヒト抗体S25755（NBRF-PDB）由来のFR断片（FR4）に連結したものであり、Ｈ鎖についてはヒト抗体S31679（NBRF-PDB、Cuisinier AMら, Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993）のフレームワーク領域と連結し、抗原結合活性を有するようにフレームワーク領域のアミノ酸残基を一部置換したものである。
【００５５】
なお、ヒト型化#23-57-137-1抗体のＬ鎖またはＨ鎖をコードするDNAを含むプラスミドを有する大腸菌は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月15日に、Ｈ鎖をコードするDNAを含むプラスミドを有する大腸菌であるEscherichia coli JM109（ hMBC1HcDNA/pUC19 ）についてはFERM BP-5629として、Ｌ鎖をコードするDNAを含むプラスミドを有する大腸菌であるEscherichia coli JM109（ hMBC1Lqλ/pUC19）についてはFERM BP-5630として、ブダペスト条約に基づきそれぞれ国際寄託されている。
【００５６】
５．抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、PTHrPに結合し、PTHrPの活性を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab')2 、Fv、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００５７】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００５８】
scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００５９】
また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。
【００６０】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００６１】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗PTHrP抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００６２】
６．組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００６３】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV 40）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
【００６４】
SV 40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）により、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
【００６５】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlaczプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。laczプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546；FASEB J.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはaraBプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。
【００６６】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（refold）使用する。
【００６７】
複製起源としては、SV 40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００６８】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
【００６９】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばCHO、COS、ミエローマ、BHK、Vero、HeLa細胞中で発現される。
【００７０】
次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【００７１】
７．抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００７２】
８．抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）、リガンドレセプター結合阻害活性（Harada, A. et al., International Immunology（1993）5, 681-690）の測定には公知の手段を使用することができる。
【００７３】
本発明で使用される抗PTHrP抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、PTHrP（1-34）をコーティングしたプレートに、抗PTHrP抗体を含む試料、例えば、抗PTHrP抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。本発明で使用される抗体の活性を確認するには、抗PTHrP抗体の中和活性を測定する。
【００７４】
９．投与方法および製剤
本発明の治療剤は、悪液質に対する治療又は改善を目的として使用される。また、悪液質の種類は癌由来のものであるか否かを問わない。例えば、癌由来のものとして、J. Urol.（UNITED STATES）Mar 1995, 153（3 Pt 1）p854-857、Langenbecks Arch. Chir. Suppl II Verh Dtsch Ges Chir（GERMANY）1990, p261-265、Oncology（SWITZERLAND）1990, 47（1）p87-91、Int. J. Pancreatol.（UNITED STATES）Aug-Nov 1990, 7（1-3）p141-150、J. Natl. Cancer Inst.（UNITEDSTATES）Dec 19, 1990,82（24）p1922-1926などに記載の悪液質が挙げられる。
【００７５】
また、癌由来でないものとして、JPEN J. Parenter. Enteral Nutr.（UNITEDSTATES）Nov-Dec 1990, 14（6）p605-609、Chest（UNITED STATES）Nov 1990, 98（5）p1091-1094、Bone Marrow Transplant.（ENGLAND）Jul 1990, 6（1）p53-57などに記載の悪液質が挙げられる。
【００７６】
本発明の抗PTHrP抗体を有効成分として含有する治療剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には経肺剤型（例えばネフライザーなどの器具を用いた経肺投与剤）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.001mg から1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり0.01〜100000mg/bodyの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗PTHrP抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００７７】
また、投与時期としては、悪液質が生ずる前後を問わず投与してもよく、あるいは体重減少が予測される時に投与してもよい。
【００７８】
本発明の抗PTHrP抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
【００７９】
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００８０】
実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗PTHrP抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００８１】
以下、参考例および実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例等にその技術的範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００８２】
悪液質モデル動物での薬効試験
ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の悪液質モデル動物を用いて、PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の悪液質に対する治療効果を検討した。
【００８３】
モデル動物としてヒト口腔底癌OCC-1（（財）実験動物中央研究所より購入）を移植したヌードマウスを用いた。ヒト口腔底癌OCC-1を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの悪液質症状を発症する。ヒト口腔底癌OCC-1によって引き起こされる悪液質症状を、マウスモノクローナル抗体が改善することを、血中カルシウム濃度、体重および延命効果を指標にして評価した。
【００８４】
ヒト口腔底癌OCC-1の継代は、BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を用いてin vivoで行った。薬効評価には、6週齢雄性BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、7週齢の動物を使用した。
【００８５】
悪液質モデル動物の作製および群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト口腔底癌OCC-1を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、10日目に腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認した後、血中カルシウム濃度、体重および腫瘍体積を指標として各指標が平均化するように群分けし、悪液質モデル動物とした。
【００８６】
悪液質に対する治療効果の検討は、以下のようにして行った。
（1）生存期間の観察
延命効果の検討では、マウスモノクローナル抗体を週２回投与して、生存期間の観察を行った。また、既に高カルシウム血症治療薬として処方されているパミドロネート（アレディア）を、15mg/Kgの用量で尾静脈内に単回投与した。対照として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.2ml/mouseで尾静脈内に週２回投与した。その結果を図１に示す。
（2）血中カルシウム濃度の観察
上記で作製、群分けした悪液質モデル動物に、マウス１匹あたり10μgまたは100μgのPTHrPに対するマウスモノクローナル抗体を尾静脈内に２日おきに２回投与した。また、既に高カルシウム血症治療薬として処方されているパミドロネート（アレディア）を、15mg/Kgの用量で尾静脈内に単回投与した。対照として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.2ml/mouseで尾静脈内に２日おきに２回投与した。
（3）血中カルシウムの測定
マウスモノクローナル抗体投与後、１日および４日目に血中カルシウム濃度を測定し、各抗体の薬効評価を行った。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、643自動Ca/pHアナライザー（CIBA-CORNING）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。体重は、抗体投与後４日目まで毎日測定した。その結果を、図２および図３に示す。
（4）腫瘍重量の測定
腫瘍体積は、抗体投与後４日目に、腫瘍の長径（a mm）および短径（b mm）を測定し、ギャランの計算式ab2/2により腫瘍体積として算出した。その結果を、図４に示す。
【００８７】
以上の結果より、血中カルシウム濃度については、抗体濃度10μgでは、パミドロネート投与群と差がないにも関わらず、悪性腫瘍に伴う体重減少をパミドロネート投与群又は対照群に比べて抑制した。抗体濃度100μgを投与した群では、血中カルシウム濃度の上昇をパミドロネート投与群又は対照群に比べて抑制し、体重減少もパミドロネート投与群又は対照群に比べて抑制した。また、抗PTHrP中和抗体100μgを週２回投与した群では、パミドロネート投与群又は対照群に比べて有意な生存期間の延長（p=0.0003：Log Rank test）が認められた。このことから、PTHrPに対する中和マウスモノクローナル抗体は体重減少抑制、生存期間の延長など既存の高カルシウム血症治療薬にはない効果を有する。したがって本抗体の悪性腫瘍に伴う悪液質の治療薬としての有用性が示された。
【実施例２】
【００８８】
高カルシウム血症・悪液質モデル動物での薬効試験
ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の悪液質モデル動物を用いて、PTHrPに対するヒト型化抗体バージョンｑの悪液質に対する治療効果を検討した。
【００８９】
モデル動物としてヒト口腔底癌OCC-1（（財）実験動物中央研究所より購入）を移植したヌードマウスを用いた。ヒト口腔底癌OCC-1を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの悪液質症状を発症する。ヒト口腔底癌OCC-1によって引き起こされる悪液質症状を、ヒト型化抗体バージョンqが改善することを、血中カルシウム濃度、体重および延命効果を指標にして評価した。
【００９０】
ヒト口腔底癌OCC-1の継代は、BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を用いてin vivoで行った。薬効評価には、6週齢雄性BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、7週齢の動物を使用した。
【００９１】
悪液質モデル動物の作製および群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト口腔底癌OCC-1を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、10日目に腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認した後、腫瘍体積、血中カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けし、悪液質モデル動物とした。
【００９２】
悪液質に対する治療効果の検討は、以下のようにして行った。
（1）生存期間の観察
延命効果の検討では、ヒト型化抗体バージョンｑを週２回尾静脈内に投与して、生存期間の観察を行った。対照として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.1ml/mouseで尾静脈内に週２回投与した。その結果を図16に示す。
（2）血中カルシウム濃度の観察
上記で作製、群分けした悪液質モデル動物に、マウス１匹あたり10μgまたは100μgのヒト型化抗体バージョンｑを尾静脈内に２日あけて２回投与した。対照として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.1ml/mouseで同様に投与した。
（3）血中カルシウムの測定
ヒト型化抗体バージョンｑ初回投与後、１日および４日目に血中カルシウム濃度を測定し、抗体の薬効評価を行った。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、643自動Ca/pHアナライザー（CHIRON）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。体重は、４日目まで毎日測定した。その結果を、図17および図18に示す。
（4）腫瘍重量の測定
腫瘍体積は、初回投与時および４日目に、腫瘍の長径（ａmm）および短径（ｂmm）を測定し、ギャランの計算式ab2/2により算出した。その結果を図19に示す。
【００９３】
以上の結果のように、ヒト型化抗体バージョンｑを10μgあるいは100μgを投与することで、悪性腫瘍に伴う血中カルシウム濃度の上昇及び体重の減少は対照群に比べて抑制された。また、ヒト型化抗体バージョンｑを100μg、週2回投与し続けた場合、対照群に比べて有意な生存期間の延長（p=0.0108：Log Rank test）が認められた。今回のヒト型化抗体バージョンｑの悪性腫瘍に伴う悪液質モデル動物に対する効果は、すでに報告したマウスモノクローナル抗体の効果と同様のものであった。このことから、本抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症・悪液質の治療薬としての有用性が示された。
【００９４】
［参考例１］
抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）（配列番号75) に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ#23-57-154 および#23-57-137-1を、佐藤幹二らにより作製された（Sato, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 1993)。
【００９５】
免疫原として使用するために、ＰＴＨｒＰ（１−３４）（Peninsula 製）とキャリアータンパクであるサイログロブリンをカルボジイミド（Dojinn）を用いて結合した。サイログロブリンと結合したＰＴＨｒＰ（１−３４）を透析し、タンパク濃度として２μg/mlとなるように調製した後、フロイントアジュバント（Difco)と１:１で混合し、エマルジョン作製後、16匹の雌性BALB/Cマウスの背部皮下又は腹腔内に動物あたり100 μｇを11回免疫した。初回免疫は、フロイント完全アジュバントを用い、二回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバントを使用した。
【００９６】
免疫したマウスの血清中の抗体価の測定は、以下の方法で行った。すなわち、マウス尾静脈より採血し、血清分離後ＲＩＡバッファーで希釈した抗血清と125I標識ＰＴＨｒＰ（１−３４）を混合し、結合活性を測定した。抗体価の上昇したマウスの腹腔に、キャリアータンパクを結合していないＰＴＨｒＰ（１−３４）を動物あたり50μｇを最終免疫した。
【００９７】
最終免疫３日目にマウスを屠殺し、脾臓を摘出後、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3x63Ag8U.1 を50％ポリエチレングリコール4000を用いる常法にしたがって細胞融合した。細胞融合した細胞を２×104／ウェルの細胞数で85枚の96穴プレートに蒔き込んだ。ハイブリドーマの選別はＨＡＴ培地を用いて行った。
【００９８】
ハイブリドーマのスクリーニングは、ＨＡＴ培地中で生育の認められた穴の培養上清を固相化ＲＩＡ法にてＰＴＨｒＰ認識抗体の有無を測定し選択することにより行った。抗体との結合能の認められた穴からハイブリドーマを回収し、15％ＦＣＳを含むRPMI-1640 培地にＯＰＩ-supplement(Sigma)を添加した培地に懸濁し、限界希釈法にてハイブリドーマの単一化を実施した。ＰＴＨｒＰ（１−３４）との結合能の強いクローン#23-57-154 および#23-57-137-1を得た。
【００９９】
なお、ハイブリドーマクローン#23-57-137-1は、mouse-mouse hybridoma #23-57-137-1として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月１５日に、FERM BP-5631としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０１００】
［参考例２］
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするDNAのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体#23-57-137-1の可変領域をコードするDNAを次の様にしてクローニングした。
(1) ｍＲＮＡの調製
ハイブリドーマ#23-57-137-1からのｍＲＮＡをQuick Prep mRNA PurificationKit(Pharmacia Biotech社) を用いて調製した。ハイブリドーマ#23-57-137-1の細胞をExtraction Buffer で完全にホモジナイズし、キット添付の処方に従い、oligo(dT)-Cellulose Spun Column にてｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿をおこなった。ｍＲＮＡ沈殿物をElution Bufferに溶解した。
【０１０１】
(2) マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のｃDNAの作製および増幅
(i) #23-57-137-1抗体Ｈ鎖Ｖ領域ｃDNAのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５'−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) により行った。５'−ＲＡＣＥ法には５'-Ampli FINDER RACE kit (CLONETECH社) を用い、操作はキット添付の処方にしたがって行った。ｃDNA合成に使用するプライマーは、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするＭＨＣ２プライマー（配列番号１）を用いた。前記のようにして調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてＭＨＣ２プライマー10pmole を加え、逆転写酵素と52℃、30分間反応させることによりｃDNAへの逆転写を行った。
【０１０２】
６Ｎ NaOH でＲＮＡを加水分解（65℃、30分間）した後、エタノール沈殿によりｃDNAを精製した。Ｔ４ＲＮＡリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間反応することにより、合成したｃDNAの５'末端にAmpli FINDER Anchor(配列番号42)を連結した。これを鋳型としてPCRにより増幅するためのプライマーとしてAnchorプライマー（配列番号２）およびＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号３）（S.T.Jones,et al.,Biotechnology,9,88,1991) を使用した。
【０１０３】
PCR溶液は、その50μｌ中に10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、1.5 mM MgCl2、2.5 ユニットのTaKaRa Taq（宝酒造）、10pmole のアンカー(Anchor)プライマー、並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー及びAmpli FINDER Anchor を連結したｃDNAの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。PCRはThermal Cycler Mode 1480J(Perkin Elmer) を用い、94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。
【０１０４】
(ii) #23-57-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域のｃDNAのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５'−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)により行った。５'-ＲＡＣＥ法には５'-AmpliFinder RACE Kit(Clonetech)を用い、操作は添付の処方に従った。ｃDNA合成に使用するプライマーは、oligo-dTプライマーを用いた。前記のように調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてoligo-dTプライマーを加え、逆転写酵素と52℃、30分間反応させることによりｃDNAへの逆転写を行った。６N NaOHでＲＮＡを加水分解（65℃、30分間）した後、エタノール沈殿によりｃDNAを精製した。合成したｃDNAの５'末端に前記Ampli FINDER Anchor をＴ４ＲＮＡリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間反応させることにより連結した。
【０１０５】
マウスＬ鎖λ鎖定常領域の保存配列からPCRプライマーＭＬＣ（配列番号４）を設計し、394 DNA/RNA シンセサイザー (ABI 社）を用いて合成した。PCR溶液は、その100 μｌ中に10 mM Tris-HCl（pH８．３）、50mM KCl、0.25mM ｄＮＴＰｓ（dATP, dGTP，dCTP，dTTP）、1.5mM MgCl2 、2.5 ユニットの AmpliTaq （PERKIN ELMER）、50pmole のAnchorプライマー（配列番号２）、並びにＭＬＣ（配列番号４）およびAmpli FINDER Anchor を連結したｃDNAの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。PCRはThermal Cycler Model480J（Perkin Elmer）を用い、94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで３５回行った。
【０１０６】
(3) PCR生成物の精製および断片化
前記のようにしてPCR法により増幅したDNA断片を３％Nu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products)を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。Ｈ鎖Ｖ領域として約550bp 長、Ｌ鎖Ｖ領域として約550bp 長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、10mM Tris-HCl(pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。得られたDNA溶液１μｌを制限酵素XmaI（New England Biolabs)により37℃で１時間消化し、次いで制限酵素EcoRI （宝酒造）により37℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりDNAを回収した。
【０１０７】
こうして、５'−末端にEcoRI 認識配列を有し、３'−末端にＸｍａＩ認識配列を有するマウスＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むDNA断片を得た。
【０１０８】
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むEcoRI-XmaI DNA断片とEcoRI 及びXmaIで消化することにより調製したpUC19 ベクターをDNAライゲーションキットver.2 （宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で１時間反応させ連結した。次に10μｌの上記連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μｌに加え、この細胞を氷上で15分間、42℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。次いで300 μｌのＳＯＣ培地（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を加え37℃にて30分間インキュベートした後、100μｇ／ｍｌ又は50μｇ／ｍｌのアンピシリン、0.1mM のIPTG、20μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地または２ｘＹＴ寒天培地（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０１０９】
この形質転換体を100 μｇ／ｍｌ又は50μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地または２×ＹＴ培地２ｍｌで37℃にて一夜培養し、菌体画分からプラスミド抽出機PI-100Σ（クラボウ）又はQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行った。
【０１１０】
(4) マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミド中のｃDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を用い、DNA Sequencer 373A (ABI社Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4 （宝酒造）（配列番号５）及びM13 Primer RV （宝酒造）（配列番号６）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
【０１１１】
こうして得られたハイブリドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをMBC1H04 、Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをMBC1L24 と命名した。プラスミドMBC1H04 およびMBC1L24 に含まれるマウス#23-57-137-1抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号57、65に示す。Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域断片のポリペプチドは、ともに配列番号57、65で表される塩基配列の第58番目（グルタミンをコードする）から開始されている。これらのアミノ酸配列を、Ｈ鎖Ｖ領域の断片については配列番号46、Ｌ鎖Ｖ領域の断片については配列番号45に示す。
【０１１２】
なお、前記プラスミドMBC1H04 およびMBC1L24 を有する大腸菌はEscherichiacoli JM109（MBC1H04 ）およびEscherichia coli JM109（MBC1L24 ）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月１５日に、Escherichia coli JM109 (MBC1H04)についてはFERM BP-5628、Escherichia coli JM109 (MBC1L24)についてはFERM BP-5627としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０１１３】
(5) ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体#23-57-137-1のＣＤＲの決定
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全般の構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat,E.A.et al., 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983) 。
【０１１４】
このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をKabatらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表１に示すごとく決定した。
【０１１５】
なお、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号59〜61に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号62〜64に示した。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
［参考例３］
キメラ抗体の構築
(1) キメラ抗体Ｈ鎖の構築
(i) Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムDNAを含む発現ベクターに連結するために、クローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領域をPCR法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１−Ｓ１（配列番号７）はＶ領域のリーダー配列の５'−側をコードするDNAにハイブリダイズし且つKozak コンセンサス配列（Kozak, M. et al., J. Mol.Biol., 196, 947-950, 1987)及び制限酵素Hind IIIの認識配列を有するように設計した。前方プライマーＭＢＣ１−ａ（配列番号８）はＪ領域の３'−側をコードするDNA配列にハイブリダイズし、且つ、スプライスドナー配列及び制限酵素BamHIの認識配列を有するように設計した。PCRは、TaKaRa Ex Taq （宝酒造）を用い、50μｌの反応混合液に鋳型DNAとして0.07μｇのプラスミドMBC1H04 、プライマーとしてMBC1-aおよびMBC1-S1 をそれぞれ50pmole 、2.5UのTaKaRa Ex Taq 、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で添付緩衝液を使用して50μｌの鉱油を上層し、94℃にて１分間、55℃にて１分間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。PCR法により増幅したDNA断片を３％Nu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products)を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１１８】
437bp 長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。得られたDNA溶液１μｌを制限酵素BamHI、Hind III（宝酒造）により37℃１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりDNAを回収した。
【０１１９】
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むHind III-BamHI DNA断片をHind IIIおよびBamHIで消化することにより調製したpUC19ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するためプライマーM13 Primer M4 およびM13 Primer RV をプライマーとして、Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer)により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５'−側にHind III認識配列及びKozak 配列、３'−側にBamHI認識配列を持つプラスミドをMBC1H/pUC19 と命名した。
【０１２０】
(ii)ｃDNAタイプのマウス−ヒトキメラＨ鎖の作製のためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃDNAと連結するために、上記のようにして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をPCR法により修飾した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーMBC1HVS2（配列番号９）はＶ領域のリーダー配列の最初をコードする配列の２番のアスパラギンをグリシンに変換し、且つKozak コンセンサス配列（Kozak, M.et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987)並びにHind IIIおよびEcoRI 認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーMBC1HVR2（配列番号10）はＪ領域の３'−側をコードするDNA配列にハイブリダイズし、且つ、Ｃ領域の５'−側の配列をコードしＡpaＩおよびSmaI認識配列を有するように設計した。
【０１２１】
PCRはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を用い、50μｌの反応混合液に鋳型DNAとして0.6 μｇのプラスミドMBC1H/pUC19 、プライマーとしてMBC1HVS2およびMBC1HVR2をそれぞれ50pmole 、TaKaRa Ex Taq を2.5U、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で添付の緩衝液を使用して50μｌの鉱油を上層して94℃１分間、55℃１分間、72℃１分間の温度サイクルで30回行った。PCR法により増幅したDNA断片を１％Sea Kem GTG アガロース（FMC Bio.Products) を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。456bp 長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノール沈殿させた後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。
【０１２２】
得られたDNA溶液１μｌを制限酵素EcoRI およびSmaI（宝酒造）により37℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりDNAを回収した。上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むEcoRI-SmaI DNA断片をEcoRI およびSmaIで消化することにより調製したpUC19 ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するため、プライマーM13 Primer M4 及びM13 Primer RV をプライマーとして、Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を用い、DNA Sequencer 373A(Perkin-Elmer)により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５'−側にEcoRI およびHind III認識配列及びKozak 配列、３'−側にＡpaＩおよびSmaI認識配列を持つプラスミドをMBC1Hv/pUC19と命名した。
【０１２３】
(iii) キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃDNAは、以下のようにして調製した。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域ＩｇＧ１のゲノムDNA（N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982）をコードする発現ベクターDHFR-△E-RVh-PM-1-f（WO92/19759参照）と、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムDNAをコードする発現ベクターRV1-PM1a（WO92/19759参照）とを導入したＣＨＯ細胞よりｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−PCR法でヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃDNAをクローニングし、pUC19 のHind IIIとBamHI部位にサブクローニングした。塩基配列を確認した後、正しい配列を持つプラスミドをpRVh-PM1f-ｃDNAと命名した。
【０１２４】
DHFR-△E-RVh-PM-1-f上のＳＶ４０プロモーターとＤＨＦＲ遺伝子との間にあるHind III部位、およびＥＦ−１αプロモーターとヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域との間にあるEcoRI 部位を欠失した発現ベクターを作製し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃDNAの発現ベクターの構築のために使用した。
【０１２５】
pRVh-PM1f-ｃDNAをBamHIで消化した後、Klenowフラグメントで平滑化し、さらにHind IIIで消化し、Hind III-BamHI平滑化断片を調製した。このHind III-BamHI平滑化断片を、上記のHind III部位およびEcoRI 部位が欠失したDHFR-△E-RVh-PM1-f をHind IIIおよびSmaIで消化することにより調製した発現ベクターに連結し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含む発現ベクターRVh-PM1f−ｃDNAを構築した。
【０１２６】
ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含む発現ベクターRVh-PM1f−ｃDNAをApaIおよびBamHIで消化した後、Ｈ鎖Ｃ領域を含むDNA断片を回収し、ApaIおよびBamHIで消化することにより調製したMBC1Hv/pUC19に導入した。こうして作製したプラスミドをMBC1HcDNA ／pUC19 と命名した。このプラスミドはマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含み、５'-末端にEcoRI およびHind III認識配列、３'-末端にBamHI認識配列を持つ。
【０１２７】
プラスミドMBC1HcDNA/pUC19 をEcoRI およびBamHIで消化し、得られたキメラ抗体のＨ鎖をコードする塩基配列を含むDNA断片を、EcoRI およびBamHIで消化することにより調製した発現ベクターpCOS1に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをMBC1HcDNA/pCOS1と命名した。なお、発現ベクターpCOS1は、HEF-PMh-gγ1（WO92/19759参照）から、EcoRI およびSmaI消化により抗体遺伝子を削除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構築した。
【０１２８】
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するため、プラスミドMBC1HcDNA/pUC19 をEcoRI およびBamHIで消化し、得られたキメラ抗体Ｈ鎖配列を含むDNA断片を、EcoRI およびBamHIで消化することにより調製した発現プラスミドpCHO1に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをMBC1HcDNA/pCHO1 と命名した。なお、発現ベクターpCHO1は、DHFR- △E-rvH-PM1-f（WO92/19759参照）から、EcoRI およびSmaI消化により抗体遺伝子を削除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構築した。
【０１２９】
(2) ヒトＬ鎖定常領域の構築
(i) クローニングベクターの作製
ヒトＬ鎖定常領域を含むpUC19 ベクターを構築するために、Hind III部位欠失pUC19 ベクターを作製した。pUC19 ベクター２μｇを20mM Tris-HCl（pH8.5 ）、10mM MgCl2、１mM DTT、100 mM KCl、８Ｕの Hind III （宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、DNAをエタノール沈殿により回収した。回収したDNAを50mM Tris-HCl （pH7.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM NaCl、0.5mM dNTP、６Ｕのクレノウ(Klenow)フラグメント（GIBCO BRL)を含有する50μｌの反応混合液中で室温にて20分間反応させ、末端を平滑化させた。反応混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ベクターDNAをエタノール沈殿により回収した。
【０１３０】
回収したベクターDNAを50mM Tris-HCl （pH7.6)、 10mM MgCl2 、１mM ATP、１mM DTT、５％(v/v) ポリエチレングリコール-8000 、0.5 ＵのT4 DNAリガーゼ（GIBCO BRL)を含有する反応混合液10μｌ中で16℃で２時間反応させ、自己連結させた。反応混合液５μｌを大腸菌JM109 コンピテント細胞（ニッポンジーン）100 μｌに加え、氷上で30分間静置した後、42℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。ＳＯＣ培地500 μｌを加えて、37℃で１時間インキュベーションした後、X-gal とIPTGを表面に塗布した２×ＹＴ寒天培地（50μg/mlアンピシリン含有）（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にまき、37℃で一夜培養して形質転換体を得た。
【０１３１】
形質転換体を、50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地20mlで37℃一夜培養し、菌体画分からPlasmid Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付の処方に従ってプラスミドDNAを精製した。精製したプラスミドをHind IIIで消化し、Hind III部位が欠失していることを確認したプラスミドをpUC19ΔHind IIIと命名した。
【０１３２】
(ii)ヒトＬ鎖λ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
ヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域は、Ｍｃｇ+ Ｋｅ+ Ｏｚ- 、Ｍｃｇ- Ｋｅ- Ｏｚ- 、Ｍｃｇ- Ｋｅ- Ｏｚ+ 、Ｍｃｇ- Ｋｅ+ Ｏｚ- の少なくとも４種類のアイソタイプが知られている（P.Dariavach,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,9074-9078,1987) 。#23-57-137-1マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域と相同性を有するヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をＥＭＢＬデータベースで検索した結果、アイソタイプがＭｃｇ+ Ｋｅ+ Ｏｚ- （accession No.X57819)（P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987)のヒト抗体Ｌ鎖λ鎖が最も高い相同性を示し、#23-57-137-1マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域との相同性はアミノ酸配列で64.4％、塩基配列で73.4％であった。
【０１３３】
そこで、このヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の構築をPCR法を用いて行った。各プライマーの合成は、394 DNA/RNA 合成機(ABI社) を用いて行った。HLAMB1（配列番号11）およびHLAMB3（配列番号13）はセンスDNA配列を有し、HLAMB2（配列番号12）およびHLAMB4（配列番号14）はアンチセンスDNA配列を有し、それぞれのプライマーの両端に20から23bpの相補的配列を有する。
【０１３４】
外部プライマーHLAMBS（配列番号15）、HLAMBR（配列番号16）はHLAMB1、HLAMB4とそれぞれ相同な配列を有しており、またHLAMBSはEcoRI 、Hind III、BlnI認識配列を、HLAMBRはEcoRI 認識配列をそれぞれ含んでいる。第一PCRでHLAMB1-HLAMB2 とHLAMB3-HLAMB4 の反応を行った。反応後、それらを等量混合し、第二PCRでアセンブリを行った。さらに外部プライマーHLAMBSおよびHLAMBRを添加し、第三PCRにより全長DNAを増幅させた。
【０１３５】
PCRはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を使い、添付の処方に従って行った。第一PCRでは、５pmole のHLAMB1および 0.5pmole のHLAMB2と５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μｌの反応混合液、あるいは0.5pmoleのHLAMB3および５pmole のHLAMB4と５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで５回行った。
【０１３６】
第二PCR は、反応液を50μｌずつ混合し、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで３回行った。
【０１３７】
第三PCRは、反応液に外部プライマーHLAMBSおよびHLAMBRを各50pmole ずつ添加し、94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。
【０１３８】
第三PCR産物のDNA断片を３％低融点アガロースゲル（NuSieve GTG Agarose, FMC) で電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用い、添付の処方に従ってゲルから回収、精製した。
【０１３９】
得られたDNA断片を50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、 100mM NaCl 、８ＵのEcoRI （宝酒造）を含有する20μｌの反応混合液中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液８μｌに溶解した。
【０１４０】
プラスミドpUC19ΔHind III 0.8μｇを同様にEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿により回収した。消化したプラスミドpUC19ΔHind IIIを50 mM Tris-HCl（pH9.0)、１mM MgCl2、アルカリホスファターゼ(E.coli C75, 宝酒造）を含有する反応混合液50μｌ中で37℃、30分間反応させ脱リン酸処理（ＢＡＰ処理）した。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿により回収した後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mMEDTA溶液10μｌに溶解した。
【０１４１】
上記のＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 ΔHind III１μｌと先のPCR産物４μｌをDNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌JM109 コンピテント細胞に形質転換した。得られた形質転換体を50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。
【０１４２】
上記プラスミドについて、クローニングされたDNAの塩基配列の確認を行った。塩基配列の決定には373A DNA シークエンサー (ABI 社) を用い、プライマーにはM13 Primer M4 およびM13 Pricer RV （宝酒造）を用いた。その結果、クローニングされたDNAの内部に12bpの欠失があることが判明した。このDNAを含むプラスミドをＣλΔ／pUC19 と命名した。そこで、その部分を補うためのプライマーHCLMS （配列番号17）、 HCLMR（配列番号18）を新たに合成し、PCRで再度正しいDNAの構築を行った。
【０１４３】
第一PCRで欠失DNAを含むプラスミドＣλΔ／pUC19 を鋳型とし、プライマーHLAMBSとHCLMR 、HCLMS とHLAMB4で反応を行った。PCR産物をそれぞれ精製し、第二PCRでアセンブリを行った。さらに外部プライマーHLAMBSおよびHLAMB4を添加し、第三PCRにより全長DNAを増幅させた。
【０１４４】
第一PCRでは、鋳型としてＣλΔ／pUC19 0.1μｇ、プライマーHLAMBSおよびHCLMR 各50pmole 、あるいはHCLMS およびHLAMB4各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。
【０１４５】
PCR産物HLAMBS-HCLMR(236bp) 、HCLMS-HLAMB4(147bp) をそれぞれ３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。第二PCRでは精製DNA断片各40ng、１ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する20μｌの反応混合液を用い、25μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルを５回行った。
【０１４６】
第三PCRでは、第二PCR反応液２μｌ、外部プライマーHLAMBS、HLAMB4各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層した。PCRは、94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。第三PCR産物である357bp のDNA断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。
【０１４７】
得られたDNA断片0.1μｇをEcoRI で消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミド pUC19ΔHind IIIにサブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。
【０１４８】
精製したプラスミドについて塩基配列をM13 Primer M4 、M13 Primer RV （宝酒造）を用い、373A DNAシークエンサー(ABI社）にて決定した。欠失のない正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣλ／pUC19 とした。
【０１４９】
(iii) ヒトＬ鎖κ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
プラスミドHEF-PM1k-gk （WO92/19759）からＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするDNA断片をPCR法を用いてクローニングした。394 DNA/RNA 合成機(ABI社）を用いて合成した前方プライマーHKAPS （配列番号19）はEcoRI 、Hind III、BlnI認識配列を、後方プライマーHKAPA （配列番号20）はEcoRI 認識配列を有するように設計した。
【０１５０】
鋳型となるプラスミドHEF-PM1k-gk 0.1 μｇ、プライマーHKAPS 、HKAPA 各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層した。94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の反応を30サイクル行った。360bp のPCR産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。
【０１５１】
得られたDNA断片をEcoRI で消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 ΔHind IIIにクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドの塩基配列をM13 Primer M4 、M13 Primer RV （宝酒造）を用い、373A DNAシークエンサー(ABI社）にて決定した。正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣκ／pUC19 とした。
【０１５２】
(3) キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
キメラ#23-57-137-1抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した。プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 のヒト抗体定常領域の直前にあるHind III、BlnI部位に、#23-57-137-1Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を連結することによって、それぞれキメラ#23-57-137-1抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびＬ鎖λ鎖またはＬ鎖κ鎖定常領域をコードするpUC19 ベクターを作製した。EcoRI 消化によってキメラ抗体Ｌ鎖遺伝子を切り出し、ＨＥＦ発現ベクターへサブクローニングを行った。
【０１５３】
すなわち、プラスミドMBC1L24 から#23-57-137-1抗体Ｌ鎖Ｖ領域をPCR法を用いてクローニングした。各プライマーの合成は、394 DNA/RNA 合成機(ABI社）を用いて行った。後方プライマーMBCCHL1 （配列番号２１）はHind III認識配列とKozak 配列（Kozak,M.et al.,J.Mol.Biol.196,947-950,1987) を、前方プライマーMBCCHL3 （配列番号２２）はBglII 、EcoRI 認識配列を有するように設計した。
【０１５４】
PCRは、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.2mM ｄＮＴＰ、0.1 μｇのMBC1L24 、プライマーとしてMBCCHL1 およびMBCCHL3 を各50pmole 、１μｌの AmpliTaq(PERKIN ELMER) を含有する100μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。
【０１５５】
４４４ｂｐのPCR産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEAN II kit(BIO101)を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。PCR産物１μｌをそれぞれ10mM Tris-HCl （pH7.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、50mM NaCl 、８ＵのHind III（宝酒造）および８ＵのEcoRI （宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収し、10mM Tris-HCl （pH7.4)、１mM EDTA 溶液８μｌに溶解した。
【０１５６】
プラスミドpUC19１μｇを同様にHind IIIおよびEcoRIで消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿により回収し、アルカリホスファターゼ(E.coli C75 ，宝酒造）でＢＡＰ処理した。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１５７】
ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 １μｌと先のPCR産物４μｌをDNA LigationKit Ver.2 （宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）に前述と同様に形質転換した。これを50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。得られた形質転換体を、50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで37℃で一夜培養した。菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。塩基配列を決定後、正しい塩基配列を有するプラスミドをCHL/pUC19 とした。
【０１５８】
プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 各１μｇをそれぞれ20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM KCl、８Ｕの Hind III（宝酒造）および２ＵのBlnI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した後、37℃で30分間ＢＡＰ処理を行った。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、DNAをエタノール沈殿で回収し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１５９】
#23-57-137-1Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドCHL/pUC19 から８μｇを同様にHindIIIおよびBlnIで消化した。得られた409bp のDNA断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl（pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１６０】
このＬ鎖Ｖ領域DNA ４μｌをＢＡＰ処理したプラスミドＣλ／pUC19 またはＣκ／pUC19 各１μｌにサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地３mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドMBC1L(λ)/pUC19 、MBC1L(κ)/pUC19 とした。
【０１６１】
プラスミドMBC1L(λ)/pUC19 およびMBC1L(κ)/pUC19 をそれぞれEcoRI で消化し、３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、743bp のDNA断片をGENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mMEDTA溶液10μｌに溶解した。
【０１６２】
発現ベクターとしてプラスミドHEF-PM1k-gk 2.7 μｇをEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した。回収したDNA断片をＢＡＰ処理した後、１％低融点アガロースゲルで電気泳動し、6561bpのDNA断片をGENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１６３】
ＢＡＰ処理したＨＥＦベクター２μｌを上記プラスミドMBC1L(λ) またはMBC1L(κ) EcoRI 断片各３μｌと連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。
【０１６４】
精製したプラスミドを、20mM Tris-HCl (pH8.5) 、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM KCl 、８ＵのHind III（宝酒造）および２ＵのPvuI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば5104/2195bp 、逆方向に挿入されていれば4378/2926bp の消化断片が生じることより、正しい方向に挿入されていたプラスミドをそれぞれMBC1L(λ)/neo 、MBC1L(κ)/neo とした。
【０１６５】
(4) ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
キメラ抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。
【０１６６】
すなわちキメラ抗体の一過性発現は、プラスミドMBC1HcDNA/pCOS1とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏまたはMBC1HcDNA/pCOS1とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０7細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドDNA１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のUltra Low IgGウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。 また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いてキット添付の処方に従って行った。
【０１６７】
(5) ＥＬＩＳＡ
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（0.1M NaHCO3 、0.02％ NaN3 ）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（50mM Tris-HCl、１mM MgCl2 、0.1M NaCl 、0.05％ Tween20、0.02％ NaN3 、１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、pH7.2 ）でブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ ＩｇＧ１λ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いた。
【０１６８】
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥｌＩＳＡプレートでは、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）（ペプチド研究所）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。その結果、キメラ抗体は、ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する結合能を有しており、クローニングしたマウス抗体Ｖ領域の正しい構造を有することが示された（図５）。また、キメラ抗体においてＬ鎖Ｃ領域がλ鎖あるいはκ鎖のいずれであっても抗体のＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する結合能は変化しないことから、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｃ領域は、ヒト型化抗体Ｌ鎖λ鎖を用いて構築した。
【０１６９】
(6) ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
【０１７０】
すなわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏまたはＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖DNAにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でDNAを回収してエレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞0.8ml に、各プラスミドDNA 10μｇを加え、1,500 Ｖ，25μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加したＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、３枚の９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてCO2インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭーα培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地を交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。
【０１７１】
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のUltra Low IgGウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、0.2μmのフィルター（Millipore）により細胞破片を除去した。
【０１７２】
ＣＨＯ細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、POROSプロテインAカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ ＬＣ１００（Millipore）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製キメラ抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
【０１７３】
［参考例４］
ヒト型化抗体の構築
(1) ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築
(i) ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒト型化#23-57-137-1抗体Ｈ鎖を、PCR法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体S31679（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ、Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ Ａ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１１０−１１８，１９９３）由来のＦＲを有するヒト型化#23-57-137-1抗体Ｈ鎖（バージョン"ａ"）の作製のために６個のPCRプライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号２４）はセンスDNA配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号２５）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号２６）はアンチセンスDNA配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１（配列番号２７）及びＭＢＣ１ＨＶＲ１（配列番号２８）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１及びＭＢＣ１ＨＧＰ４とホモロジーを有する。
【０１７４】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ ａｎｄｓｏａｋ法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。
【０１７５】
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのDNA断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液に溶解した。PCRは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１及びＭＢＣ１ＨＶＲ１を加え、同じ温度サイクルを３０回行った。PCR法により増幅したDNA断片を４％Ｎｕ ＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１７６】
４２１ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたPCR反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
【０１７７】
（ii) ヒト型化Ｈ鎖ｃDNAのためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃDNAと連結するために、上記のようにして構築したヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をPCR法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ２はＶ領域のリーダー配列の５'−側をコードする配列とハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＢＣ１ＨＶＲ２はＪ領域の３'−側をコードするDNA配列にハイブリダイズし且つＣ領域の５'−側の配列をコードしＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を有するように設計した。
【０１７８】
PCRはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、鋳型DNAとして０．４μｇのｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９を用い、プライマーとしてＭＢＣ１ＨＶＳ２およびＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付緩衝液を使用し、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。PCR法により増幅したDNA断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（ＦＭＣＢｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１７９】
４５６ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたPCR反応混合物をＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化することで調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたハイブリドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５'−側にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３'−側にＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を持つプラスミドをｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
【０１８０】
（２）ヒト型化抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ｈＰＭ１抗体Ｈ鎖ｃDNAの配列を含むプラスミドＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃDNAをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩにて消化し、Ｈ鎖Ｃ領域を含むDNA断片を回収し、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製したｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドはヒト型化#23-57-137-1抗体のＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含み、５'-末端にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３'-末端にＢａｍＨＩ認識配列を持つ。プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９に含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"の塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号５８に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号５６に示す。
【０１８１】
ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むDNA断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドpCOS1に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈMBC1HcDNA/pCOS1と命名した。
【０１８２】
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するためｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むDNA断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドpCHO1に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1と命名した。
【０１８３】
（３）Ｌ鎖ハイブリッド可変領域の構築
(i) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体の作製
ヒト型化抗体とマウス（キメラ）抗体のＦＲ領域を組み換えたＬ鎖遺伝子を構築し、ヒト型化のための各領域の評価を行った。ＣＤＲ２内にある制限酵素ＡｆｌＩＩ切断部位を利用することによって、ＦＲ１及び２はヒト抗体由来、ＦＲ３及び４はマウス抗体由来とするハイブリッド抗体を作製した。
【０１８４】
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ各１０μｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＡｆｌＩＩ（宝酒造）１０Ｕを含有する反応混合液１００μｌ中で３７℃にて１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｃ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｃ２とする）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｈ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｈ２とする）を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
【０１８５】
回収したｃ１、ｈ１断片各１μｇについてＢＡＰ処理を行った。DNAをフェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。ＢＡＰ処理したｃ１及びｈ１断片１μｌをそれぞれｈ２、ｃ２断片４μｌに連結し（４℃、一夜）、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
【０１８６】
精製したプラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭMgCl2 ，１ｍＭＤＴＴ，ＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕ、またはＢａｍＨＩ（宝酒造）８Ｕ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃、１時間消化した。ｃ１-ｈ２が正しく連結されていれば、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで７１３４／２６９ｂｐの消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。
【０１８７】
これをヒトＦＲ１，２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。一方、ｈ１-ｃ２のクローンが得られなかったので、ｐＵＣベクター上で組換えてからＨＥＦベクターにクローニングした。その際、アミノ酸置換のないヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、及びＦＲ３内の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに置換したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９を鋳型として用いた。
【０１８８】
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９の各１０μｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＨｉｎｄＩＩＩ１６Ｕ，ＡｆｌＩＩ４Ｕを含有する反応混合液３０μｌ中で３７℃、１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９から２１５ｂｐ（ｃ２'）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９からそれぞれ３２１８ｂｐ（ｈａ１'，ｈｄ１'）のDNA断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
【０１８９】
ｈａ１'、ｈｄ１'断片をそれぞれｃ２'断片に連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９とした。
【０１９０】
得られたプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９，ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化した。それぞれ７４３ｂｐのDNA断片を２％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。
【０１９１】
各DNA断片４μｌを前述のＢＡＰ処理したＨＥＦベクター１μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
【０１９２】
精製した各プラスミドを、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭＫＣｌ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕ，ＰｖｕＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば５１０４／２１９５ｂｐ、逆方向に挿入されていれば４３７８／２９２６ｂｐの消化断片が生じることより、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれマウスＦＲ１，２／ヒトＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏとした。
【０１９３】
(ii)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体の作製
ＣＤＲ１内にあるＳｎａＢＩ切断部位を利用することによって、同様にＦＲ１とＦＲ２のハイブリッド抗体を作製した。
【０１９４】
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏの各１０μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＳｎａＢＩ（宝酒造）６Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。次に２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＰｖｕＩ６Ｕを含有する反応混合液５０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
【０１９５】
反応液を１．５％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｍ１）および２３４９ｂｐ（ｍ２）、プラスミドｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｈｍ１）および２３４９ｂｐ（ｈｍ２）の各DNA断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液４０μｌに溶解した。
【０１９６】
ｍ１、ｈｍ１断片１μｌをそれぞれｈｍ２、ｍ２断片４μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
【０１９７】
精製した各プラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ MgCl2，１ｍＭＤＴＴ，ＡｐａＩ（宝酒造）８Ｕ、またはＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
【０１９８】
各断片が正しく連結されていれば、ＡｐａＩで７３０４ｂｐ、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ（ｍ１-ｈｍ２）、ＡｐａＩで６５３８／７６６ｂｐ、ＡｐａＬＩで３５３５／２０２５／１２４６／４９８ｂｐ（ｈｍ１-ｍ２）の消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれヒトＦＲ１／マウスＦＲ２，３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、マウスＦＲ１／ヒトＦＲ２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。
【０１９９】
（４）ヒト型化抗体Ｌ鎖の構築
ヒト型化#23-57-137-1抗体Ｌ鎖を、PCR法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（ＧＥＮ-ＢＡＮＫ、Ｄｅｆｔｏｓ Ｍら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，９５−１０３，１９９４）由来のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、並びにヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ-ＰＤＢ）由来のＦＲ４を有するヒト型化#23-57-137-1抗体Ｌ鎖（バージョン"ａ"）の作製のために６個のPCRプライマーを使用した。
【０２００】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配列番号３０）はセンスDNA配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ２（配列番号３１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３２）はアンチセンスDNA配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番号３３）及びＭＢＣ１ＬＶＲ１（配列番号３４）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ４とホモロジーを有する。
【０２０１】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢＣ１ＬＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ ａｎｄｓｏａｋ法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。
【０２０２】
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのDNA断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液に溶解した。
【０２０３】
PCRは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢＣ１ＬＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、この反応混合液に５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＶＲ１を加え、さらに同じ温度サイクルで３０回反応させた。PCR法により増幅したDNA断片を３％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２０４】
４２１ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。得られたPCR反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９と命名した。しかしながらＣＤＲ４の１０４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号９６位）のアミノ酸がアルギニンになっていたため、これをチロシンに修正するための修正プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒ（配列番号３５）を設計し、合成した。PCRはＴａＫａＲａ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に鋳型DNAとして０．６μｇのプラスミドｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９、プライマーとしてＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。PCR法により増幅したDNA断片を３％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２０５】
４２１ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。得られたPCR反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
【０２０６】
Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４プライマー及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶプライマーを用いて塩基配列を決定した結果、正しい配列を得ることができたので、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、４１６ｂｐの断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。得られたPCR反応混合物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９に導入し、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌａλ／pCOS1と命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン"ａ"の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号66に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号47に示す。
【０２０７】
バージョン"ｂ"をPCR法による変異導入を用いて作製した。バージョン"ｂ"では４３位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４３位）のグリシンをプロリンに、４９位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４９位）のリジンをアスパラギン酸に変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ５Ｒ（配列番号３６）とプライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。塩基配列決定後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。
【０２０８】
こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするDNAを含む断片をプラスミドpCOS1に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／pCOS1と命名した。
【０２０９】
バージョン"ｃ"をPCR法による変異導入を用いて作製した。バージョン"ｃ"では８４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８０位）のセリンをプロリンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ６Ｓ（配列番号３７）とプライマーＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶによりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
【０２１０】
塩基配列決定後、制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化し、ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／pCOS1と命名した。
【０２１１】
バージョン"ｄ" 、"ｅ" 及び"ｆ" をPCR法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に"ａ" 、"ｂ" 、"ｃ" バージョンの９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１１Ｒ（配列番号３８）とプライマーＭ-Ｓ１（配列番号４４）によりそれぞれｈＭＢＣ１Ｌａλ／pCOS1，ｈＭＢＣ１Ｌｂλ／pCOS1，ｈＭＢＣ１Ｌｃλ／pCOS1を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することより調製したＣλ／ｐＵＣ１９と連結した。
【０２１２】
こうして得られたプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＵＣ１９とした。これらのプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／pCOS1、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／pCOS1、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／pCOS1と命名した。
【０２１３】
バージョン"ｇ" 及び"ｈ" をPCR法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に"ａ" 、"ｄ" バージョンの３６位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号３６位）のヒスチジンをチロシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ９Ｒ（配列番号３９）およびＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶをプライマーとして用いて、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたPCR産物とＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４をプライマーとして用いて、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてさらにPCRを行った。得られたDNA断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することで調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。このプラスミドを鋳型として、プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１３Ｒ（配列番号４０）とＭＢＣ１ＬＶＳ１をプライマーとしたPCRを行った。得られたPCR断片をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩでＩ消化し、ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９に導入した。塩基配列を決定し、正しい配列を含むプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＵＣ１９とし、これらのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／pCOS1およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／pCOS1と命名した。
【０２１４】
バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｋ" 、"ｌ" 、"ｍ" 、"ｎ" および"ｏ" をPCR法による変異導入を用いて作製した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１４Ｓ（配列番号４１）とプライマーＶｌＲＶ（λ）（配列番号４３）によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定を行い、それぞれのバージョンに対応した変異が導入されたクローンを選択した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＵＣ１９（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）と命名した。バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、"ｍ" および"ｏ" の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号67、68、69、70に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号48、49、50、51に示す。
【０２１５】
バージョン"ｐ" 、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" および"ｔ" は、バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ" または"ｏ" のアミノ酸配列の８７位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョンであり、ＦＲ３内にある制限酵素Ａｏｒ５１ＭＩ切断部位を利用して、バージョン"ｈ" を、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ"または"ｏ" とつなぎ換えることにより作製したものである。すなわち、発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ｉ，ｊ，ｍ，ｌ，ｏ）中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐを除き、ここに発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｈλ／pCOS1中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐをつなぐことにより９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンとなるようにした。塩基配列決定を行い、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ" および"ｏ" の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンに置換されたクローンを選択し、対応するバージョンをそれぞれ"ｐ"、"ｑ" 、"ｓ" 、"ｒ" および"ｔ" とし、得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ｐ，ｑ，ｓ，ｒ，ｔ）と命名した。バージョン"ｑ" 、"ｒ"、"ｓ" および"ｔ" の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号71、72、73、74に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号52、53、54、55に示す。
【０２１６】
プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／pCOS1をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９にサブクローニングし、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９と命名した。ヒト型化Ｌ鎖の各バージョンにおける置換アミノ酸の位置を表２に示す。
【０２１７】
【表２】
【０２１８】
表中、Ｙはチロシン、Ｐはプロリン、Ｋはリジン、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｉはイソロイシンを示す。
【０２１９】
なお、前記プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９を有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９）および Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成８年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ ＢＰ−５６２９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ ＢＰ−５６３０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０２２０】
（５）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ハイブリッド抗体およびヒト型化#23-57-137-1抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。すなわちＬ鎖ハイブリッド抗体の一過性発現では、プラスミドｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、またはｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとの組み合わせを、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドDNA１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のUltra Low IgGウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。
【０２２１】
ヒト型化#23-57-137-1抗体の一過性発現では、プラスミドｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ａ〜ｔ）のいずれかの組み合わせをＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、前記ハイブリッド抗体の場合と同様の方法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、得られた培養上清をＥＬＩＳＡに供した。
【０２２２】
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのハイブリッド抗体またはヒト型化抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、キット添付の処方に従って行った。
【０２２３】
（６）ＥＬＩＳＡ
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 、０．０２％ ＮａＮ3 ）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％ ＮａＮ3 、１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ ＩｇＧ１λ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（ＴｈｅＢｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いた。
【０２２４】
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳー７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。
【０２２５】
（７）活性確認
(i) ヒト型化Ｈ鎖の評価
ヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体とＰＴＨｒＰ結合能が同等であった（図６）。この結果は、Ｈ鎖Ｖ領域のヒト型化はバージョン"ａ"で十分なことを示す。以下、ヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"をヒト型化抗体のＨ鎖として供した。
【０２２６】
(ii)ハイブリッド抗体の活性
(ii-a) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλあるいはｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλの場合はいずれもキメラ#23-57-137-1抗体と同等の結合活性を示した（図７）。これらの結果は、ＦＲ３，４はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ１，２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
【０２２７】
(ii-b)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合はキメラ#23-57-137-1抗体と同等の結合活性を示した（図８）。これらの結果は、ＦＲ１，２のうちＦＲ１はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
【０２２８】
(iii) ヒト型化抗体の活性
Ｌ鎖としてバージョン"ａ" から"ｔ" の各々一つを用いたヒト型化抗体について、抗原結合活性を測定した。その結果、Ｌ鎖バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、" ｍ"、"ｏ" 、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" 、"ｔ" を有するヒト型化抗体はキメラ抗体と同等のＰＴＨｒＰ結合能を示した（図９〜12）。
【０２２９】
（８）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
【０２３０】
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とｈＭＢＣ１Ｌｍλ／pCOS1またはｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とｈＭＢＣ１Ｌｑλ／pCOS1あるいはｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とｈＭＢＣ１Ｌｒλ／pCOS1の組み合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖DNAにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でDNAを回収し、エレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、各プラスミドDNA１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）添加、ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生能の高い細胞を選別した。
【０２３１】
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のUltra Low IgGウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、0.2μmのフィルター（Millipore）により細胞破片を除去した。ＣＨＯ細胞の培養上清からのヒト型化抗体の精製は、POROSプロテインAカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐＬＣ１００（Millipore）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製ヒト型化抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
【０２３２】
［参考例５］
中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性の測定は、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を用いて行った。すなわち、ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）中にて、ＣＯ2 インキュベーターで培養した。ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を９６穴プレートに１０4 細胞／１００μｌ／穴で蒔込み１日間培養し、４ｍＭのヒドロコルチゾンと１０％牛胎児血清を含むＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）に交換する。さらに３ないし４日間培養した後、２６０μｌのＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）にて洗浄し、１ｍＭのイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、ＳＩＧＭＡ）および１０％の牛胎児血清と１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む８０μｌのＨａｍ' ｓＦ-１２を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。
【０２３３】
中和活性を測定するマウス抗体、キメラ抗体またはヒト型化抗体を、あらかじめ１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌおよび０．３７μｇ／ｍｌの群、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの群、または１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６３μｇ／ｍｌおよび０．３１μｇ／ｍｌの群に段階希釈し、４ｎｇ／ｍｌに調製したＰＴＨｒＰ（１−３４）と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ（１−３４）の混合液８０μｌを各穴に添加した。各抗体の最終濃度は、上記抗体濃度の４分の１になり、ＰＴＨｒＰ（１−３４）の濃度は、１ｎｇ／ｍｌになる。１０分間室温にて処理した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて３回洗浄したした後、１００μｌの０．３％塩酸９５％エタノールにて細胞内のｃＡＭＰを抽出する。水流アスピレーターにて塩酸エタノールを蒸発させ、ｃＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'Ｓ）付属のＥＩＡバッファー１２０μｌを添加しｃＡＭＰを抽出後、ｃＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'Ｓ）添付の処方に従ってｃＡＭＰを測定した。その結果、キメラ抗体と同等の抗原結合を有するＬ鎖バージョンのうち、９１位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョン"ｑ"、"ｒ"、"ｓ"、"ｔ"を有するヒト型化抗体がキメラ抗体に近い中和能を示し、その中でも、バージョン"ｑ"がもっとも強い中和能を示した（図１３〜１５）。
【産業上の利用可能性】
【０２３４】
本発明により、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有する悪液質治療剤が提供される。
【０２３５】
上記物質は、悪液質モデル動物での薬効試験において、体重減少を対照と比較して抑制し、また、生存期間の延長効果も奏することから、悪液質治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図２】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図３】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図４】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図５】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図６】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図７】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図８】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図９】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１０】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１１】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１２】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１３】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１４】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１５】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１６】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図１７】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図１８】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【図１９】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０２３７】
配列番号１〜４４：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む悪液質治療剤。
【請求項２】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体がヒト型化又はキメラ化されたものである、請求項１記載の悪液質治療剤。
【請求項３】
ヒト型化抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを含むものである、請求項２記載の悪液質治療剤。
（ａ）配列番号４８〜５１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域、
（ｂ）配列番号５２〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域、
（ｃ）配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域
【請求項４】
ヒト型化抗体が、配列番号４８〜５１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域を含むものである、請求項２又は３記載の悪液質治療剤。
【請求項５】
ヒト型化抗体が、配列番号５２〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域を含むものである、請求項２又は３記載の悪液質治療剤。
【請求項６】
ヒト型化抗体が、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域を含むものである、請求項２又は３記載の悪液質治療剤。
【請求項７】
ヒト型化抗体が、配列番号４８〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域と、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域を含むものである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項８】
ヒト型化抗体が、さらにヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域及び／又はＨ鎖Ｃ領域を含むものである、請求項２〜７のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項９】
ヒト型化抗体がヒト型化#23-57-137-1抗体である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１０】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体が、抗体断片及び／又はその修飾物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１１】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１２】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体が
(a)悪液質の治療に有効であり、
(b)ヒト口腔底癌OCC-1細胞の増殖には有意な影響を及ぼさない
ものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１３】
悪液質が癌由来のものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む悪液質治療剤。
【請求項２】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体がヒト型化又はキメラ化されたものである、請求項１記載の悪液質治療剤。
【請求項３】
ヒト型化抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを含むものである、請求項２記載の悪液質治療剤。
（ａ）配列番号４８〜５１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域、
（ｂ）配列番号５２〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域、
（ｃ）配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域
【請求項４】
ヒト型化抗体が、配列番号４８〜５１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域を含むものである、請求項２又は３記載の悪液質治療剤。
【請求項５】
ヒト型化抗体が、配列番号５２〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域を含むものである、請求項２又は３記載の悪液質治療剤。
【請求項６】
ヒト型化抗体が、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域を含むものである、請求項２又は３記載の悪液質治療剤。
【請求項７】
ヒト型化抗体が、配列番号４８〜５５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するＬ鎖Ｖ領域と、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域を含むものである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項８】
ヒト型化抗体が、さらにヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域及び／又はＨ鎖Ｃ領域を含むものである、請求項２〜７のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項９】
ヒト型化抗体がヒト型化#23-57-137-1抗体である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１０】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体が、抗体断片及び／又はその修飾物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１１】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１２】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体が
(a)悪液質の治療に有効であり、
(b)ヒト口腔底癌OCC-1細胞の増殖には有意な影響を及ぼさない
ものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【請求項１３】
悪液質が癌由来のものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２００６−３０６８９５（Ｐ２００６−３０６８９５Ａ）
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２１４２３３（Ｐ２００６−２１４２３３）
【出願日】平成１８年８月７日（２００６．８．７）
【分割の表示】特願平１０−１３０７１５の分割
【原出願日】平成１０年５月１３日（１９９８．５．１３）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月７日（２００６．８．７）
【分割の表示】特願平１０−１３０７１５の分割
【原出願日】平成１０年５月１３日（１９９８．５．１３）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
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