慢性炎症性応答の調節および自己免疫疾患の処置のためのＩＬ−４由来ペプチド
本発明は、サイトカインインターロイキン４（ＩＬ−４）に由来する小ペプチドであって、ＩＬ−４受容体に結合することおよびマクロファージ活性化を阻害すること、それによって炎症性応答の開始を阻止することができる小ペプチドに関する。本発明は、ＩＬ−４が顕著な役割を演ずる様々な病的状態を治療する医薬の生産のための、前記ペプチドの使用にさらに関する。本発明は、ＩＬ−４由来の多くとも３５個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも７０％同一である変異体からなる単離ペプチドを含む化合物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインインターロイキン４（ＩＬ−４）に由来する小ペプチドであって、ＩＬ−４受容体に結合することおよびマクロファージ活性化を阻害すること、それによって炎症性応答の開始を阻止することができる小ペプチドに関する。本発明は、ＩＬ−４が顕著な役割を演ずる様々な病的状態を治療する医薬の生産のための、前記ペプチドの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症に関連する異常は、様々なヒト疾患の基礎をなす、大きな、無関係な障害群を含む。炎症に関連する障害の例には、喘息、慢性炎、および関節リウマチを含む自己免疫疾患が含まれる。慢性炎は、同時並行の活動性炎症、組織破壊および修復の試みを特徴とする病的状態である。関節リウマチ（ＲＡ）は、免疫系が関節を攻撃して、炎症（関節炎）および破壊を引き起こす原因になる、慢性、全身性の自己免疫障害である。それは、一部の器官、例えば肺および皮膚に損傷を与えることもできる。それは、機能および運動性の実質的な喪失をもたらすこともある、障害性および疼痛性の状態となることがある。それは、血液検査（特にリウマチ因子と呼ばれる検査）およびＸ線で診断される。
【０００３】
自己免疫疾患で観察される炎症性反応は、細胞性プレーヤーおよび可溶性プレーヤーの両方を含む。ＲＡの原因は、未知である。それは、様々な細胞、サイトカインおよび酵素の複雑な相互作用を含む。本疾患は、刺激性の抗原が関節に接して、免疫応答を誘発するときに始まる。抗原性の刺激は、ＣＤ４＋リンパ球（Ｔ細胞）を活性化する。ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化されると、マクロファージ、Ｂ細胞、線維芽細胞、軟骨細胞および破骨細胞の刺激を含む生物学的事象の複雑なカスケードが起こる。活性化マクロファージは、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などのサイトカインを分泌する（非特許文献１）。
【０００４】
インターロイキン４（ＩＬ−４）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ２細胞）によって分泌される。それは多面的サイトカインであり、様々な細胞型および組織に作用する。免疫細胞へのその作用は、Ｂ細胞の活性化および増殖、ＩｇＧおよびＩｇＥ生成、ＭＨＣクラスＩＩ誘導、Ｔ細胞の増殖および生存、Ｔｈ２分化、肥満細胞増殖の強化、ＮＫ細胞におけるＩＬ−２およびＩＬ−１２誘導のインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）分泌の強化、単球およびＭｏ由来樹状細胞におけるＣ５ａおよびＣ３ａの下方制御、ならびにマクロファージ活性化の阻害をもたらす（非特許文献２；非特許文献３；Ｒｏｌａｎｄ、２００３年）。
【０００５】
組換えヒトＩＬ−４の構造は、いくつかの研究室でＮＭＲおよびＸ線回折の両方法で決定された。それは、古典的な４ヘリックス束サイトカイン構造を有する（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９５年）。ＩＬ−４は、他のサイトカインのように、細胞表面の受容体への結合によってその生物学的な活性を発揮する。ある受容体複合体は、２つの成分、ＩＬ−４Ｒα鎖（ＩＬ−４Ｒα）およびＩＬ−２Ｒγ鎖（γｃ、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１によって共有される）によって構成され、Ｉ型ＩＬ−４Ｒと表され、一方、他の受容体複合体は、ＩＬ−４ＲαおよびＩＬ１３α鎖（ＩＬ−１３Ｒα１）によって構成され、ＩＩ型ＩＬ−４Ｒと呼ばれる。γｃはほとんどの造血細胞および免疫細胞で発現されるので、ＩＬ−４は、Ｉ型ＩＬ−４Ｒを通してこれらの細胞に作用すると推定される。対照的に、ＩＬ−１３Ｒα１の発現は、造血細胞および免疫細胞の中では、Ｂ細胞などの一部の系統に限定されているが、非免疫細胞では遍在的に検出される（Ｉｚｕｈａｒａら、２００２年）。したがって、ＩＬ４は、ＩＩ型ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒを通して非免疫細胞に作用する。
【０００６】
その受容体α鎖（ＩＬ−４Ｒα）へのＩＬ−４の結合は、Ｔｈ２支配下の初期免疫応答の生成のための重要な事象である。ヒトＩＬ−４とＩＬ４−ＢＰ間の中間複合体の結晶構造は、２．３Å分解能で決定された（ＰＤＢ ＩＤ：１ＩＡＲ）。それは、２つのタンパク質の新規空間配向性、受容体に結合したＩＬ−４の小さいが予想外の立体配置的変化、およびトランス相互作用残基の３つの別々のクラスターとの界面を明らかにする（Ｈａｇｅら、１９９９年）。Ｉｌ４−Ｉｌ４ｒ共通のガンマ三元複合体の結晶構造が、最近解析された（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＰＬ；ＬａＰｏｒｔｅら、２００８年）。
【０００７】
組換えＩＬ−４は、いくつかの臨床試験を経ている。ＩＬ−４は、乾癬患者で有益であり、免疫機能のアンバランスを効果的に修正することが示された（Ｍａｒｔｉｎ ２００３年）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の組換えヒトインターロイキン４（ｒｈｕＩＬ−４）の安全性および耐容性は、様々な悪性腫瘍を有するヒト患者の第Ｉ相および第ＩＩ相試験で評価されている。臨床試験は、ｒｈｕＩＬ−４の皮下投与が５μｇ／ｋｇ／日という高用量で、さらに週３回の投与の場合には１０μｇ／ｋｇという高用量で、安全であり、かつ良好な耐容性を示すことを証明している。カニクイザルでの前臨床安全性試験は、ｒｈｕＩＬ−４による毎日の反復投与の後にいくつかの有害作用を証明したが、ヒト患者では類似した影響は一般に観察されていない（Ｌｅａｃｈら、１９９７年）。最も一般的な毒性は、肝臓機能検査値の上昇、吐き気／嘔吐／下痢、倦怠感／疲労、浮腫、頭痛、筋痛／関節痛および発熱／悪寒であった。有望な前臨床の増殖阻害性および免疫調節性の効果にもかかわらず、この用量およびスケジュールのＩＬ−４は、低い抗腫瘍活性しか示さなかった（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、１９９８年）。
【０００８】
多くのヒト自己免疫疾患および炎症性疾患は、今でもコルチコステロイドと一般免疫抑制剤との組合せによって治療される。これらの疾患の病因のより深い理解は、より特異的である療法をもたらしている。これらの中で、組換えヒト化タンパク質は、将来の療法とみなされている。しかし、組換えタンパク質に基づく薬剤は、高い生産費、大きいバッチ間変動および保存中の変性を含むいくつかの欠点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＦＯ， Ｓｉｃａ Ａ， Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ， Ｌｏｃａｔｉ Ｍ． Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．（２００８）１３、４５３〜６１
【非特許文献２】Ａｇｎｅｌｌｏ Ｄ， Ｌａｎｋｆｏｒｄ ＣＳ， Ｂｒｅａｍ Ｊ， Ｍｏｒｉｎｏｂｕ Ａ， Ｇａｄｉｎａ Ｍ， Ｏ’Ｓｈｅａ ＪＪ， Ｆｒｕｃｈｔ ＤＭ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ： ｎｅｗ ｐｌａｙｅｒｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）２３， １４７〜６１
【非特許文献３】Ｓｚｅｇｅｄｉ Ａ， Ａｌｅｋｓｚａ Ｍ， Ｇｏｎｄａ Ａ， Ｉｒｉｎｙｉ Ｂ， Ｓｉｐｋａ Ｓ， Ｈｕｎｙａｄｉ Ｊ， Ａｎｔａｌ−Ｓｚａｌｍaｓ Ｐ． Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｒａｔｅ ｏｆ Ｔｈｅｌｐｅｒ１ （Ｔ（Ｈ）１） ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．（２００３）８６， ２７７〜８０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、化学的に合成して、ＩＬ−４の機能的模倣薬として用いることができるＩＬ−４の断片に関する。
【００１１】
本発明は、ＩＬ−４由来の多くとも３５個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも７０％同一である変異体からなる単離ペプチドを含む化合物に関する。そのようなアミノ酸配列を含む化合物は、本発明によると、ｉ）ＩＬ−４受容体に結合すること、ｉｉ）炎症性応答を阻害すること、ｉｉｉ）マクロファージ活性化を阻害すること、ｉｉｉ）Ｂ細胞を活性化すること、ｉｖ）Ｔ細胞の増殖および生存を活性化すること、ｖ）単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御すること、ｖｉ）ＩＬ−４受容体の活性を調節することが可能である。
【００１２】
したがって、本発明の別の態様は、本発明の化合物の医薬としての使用、および状態または疾患の治療のための医薬の調製のための使用に関し、ｉ）ＩＬ−４受容体に結合すること、ｉｉ）炎症性応答を阻害すること、ｉｉｉ）マクロファージ活性化を阻害すること、ｉｉｉ）Ｂ細胞を活性化すること、ｉｖ）Ｔ細胞の増殖および生存を活性化すること、ｖ）単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御すること、ｖｉ）ＩＬ−４受容体の活性を調節することは、前記治療の一部である。
【００１３】
さらに、別の態様では、本発明のペプチドまたは前記ペプチドを含む化合物は、抗体の生成のために用いてもよい。そのような抗体は、本発明のペプチド中のエピトープに結合する。
【００１４】
本発明は、本発明のペプチド、または本発明のペプチド中のエピトープを認識することができる抗体を含む医薬組成物にさらに関する。
【００１５】
本発明は、ｉ）ＩＬ−４受容体に結合すること、ｉｉ）炎症性応答を阻害すること、ｉｉｉ）マクロファージ活性化を阻害すること、ｉｉｉ）Ｂ細胞を活性化すること、ｉｖ）Ｔ細胞の増殖および生存を活性化すること、ｖ）単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御すること、ｖｉ）ＩＬ−４受容体の活性を調節することが有益である状態の治療法であって、本発明の化合物、本発明の抗体、または前記ペプチド配列、前記化合物もしくは前記抗体を含む医薬組成物を、必要とする個体に投与するステップを含む方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＩＬ−４Ｒαの外部ドメインと複合体形成したＩＬ−４の構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＩＡＲ）を示す図である。ペプチド１（配列番号２）（左）およびペプチド３（配列番号３）（右）の位置を、灰色で示す。
【図２】図２は、ＩＬ−４Ｒαの外部ドメインと複合体形成したＩＬ−４の構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＩＡＲ）を示す図である。ペプチド３ａ（配列番号１）（左）およびペプチド４（配列番号４）（右）の位置を、灰色で示す。
【図３】図３は、γｃ共通受容体の外部ドメインと複合体形成したＩＬ−４の構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＰＬ）を示す図である。ペプチド１（配列番号２）（左）およびペプチド３（配列番号３）（右）の位置を、灰色で示す。
【図４】図４は、ＩＬ−４Ｒαおよびγｃ共通受容体の外部ドメインと複合体形成したＩＬ−４の構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＰＬ）を示す図である。ペプチド３ａ（配列番号１）（左）およびペプチド４（配列番号４）（右）の位置を、灰色で示す。
【図５】図５は、小脳顆粒ニューロン（ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｎｅｕｒｏｎ）の培養での神経突起成長に対するＩＬ−４由来のペプチドＰｈ１（配列番号２）の効果を示す図である。Ｐ２ｄペプチドを、陽性対照として用いた（Ｓｏｒｏｋａら、２００２年を参照）。
【図６】図６は、小脳顆粒ニューロンの培養での神経突起成長に対するＰｈ２（配列番号３）の効果を示す図である。対照と比較した有意水準を以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。７回の独立した実験を実施した。
【図７】図７は、Ｐｈ２（配列番号３）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ２で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプの棒）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白い棒）、または１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒い棒）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（白い棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ２で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（０の棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。両図面の結果は、ＩＦＮ−γによって活性化されただけの未処置対照に対する割合（％）として示す。６回の独立した実験からの結果を、対照についてと、Ｐｈ２濃度９、２７、８１および２４３μｇ／ｍｌについて示す。
【図８】図８は、ＩＬ４ｒαへのＰｈ２（配列番号３）の結合を示す図である。表面プラズモン共鳴の適用による結合試験。Ａ：対照として、ＩＬ４とＩＬ４ｒαとの間の結合を、ＩＬ４ｒαをチップ上に固定し、次にＩＬ４を溶液中のチップの上に流すことによって調査した。Ｂ：Ｐｈ２とＩＬ４ｒαとの間の結合を、Ｐｈ２をチップ上に固定し、ＩＬ４ｒαを溶液中のチップの上に流すことによって調査した。結果を分析し、ＫＤをコンピュータソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎで計算した。
【図９】図９は、小脳顆粒ニューロンの培養での神経突起成長に対するＰｈ３（配列番号１）の効果を示す図である。対照と比較した有意水準を以下のように表す：＊＊＝ｐ＜０．０１。７回の独立した実験を実施した。
【図１０】図１０は、Ｐｈ３（配列番号１）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ３で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプの棒）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白い棒）、または１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒い棒）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（白い棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ３で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（０の棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。両図面の結果は、ＩＦＮ−γによって活性化されただけの未処置対照に対する割合（％）として示す。６回の独立した実験からの結果を、対照についてと、Ｐｈ３濃度９、２７および８１μｇ／ｍｌについて示す。
【図１１】図１１は、ＩＬ４ｒαへのＰｈ３（配列番号１）の結合を示す図である。表面プラズモン共鳴の適用による結合試験。Ａ：対照として、ＩＬ４とＩＬ４ｒαとの間の結合を、ＩＬ４ｒαをチップ上に固定し、次にＩＬ４を溶液中のチップの上に流すことによって調査した。Ｂ：Ｐｈ３とＩＬ４ｒαとの間の結合を、Ｐｈ３をチップ上に固定し、ＩＬ４ｒαを溶液中のチップの上に流すことによって調査した。結果を分析し、ＫＤをコンピュータソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎで計算した。
【図１２】図１２は、小脳顆粒ニューロンの培養での神経突起成長に対するＰｈ４（配列番号４）の効果を示す。対照と比較した有意水準を以下のように表す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。５回の独立した実験を実施した。
【図１３】図１３は、Ｐｈ５（配列番号５）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ４で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプ）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白色）、および１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒色）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に９μｇ／ｍｌのＰｈ５で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。２回の独立した実験を実施した。
【図１４】図１４は、Ｐｈ６（配列番号６）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ４で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプ）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白色）、および１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒色）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ６で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。２回の独立した実験を実施した。
【図１５】図１５は、Ｐｈ８（配列番号１）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ３で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプの棒）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白い棒）、または１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒い棒）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（白い棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ８で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（０の棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。両図面の結果は、ＩＦＮ−γによって活性化されただけの未処置対照に対する割合（％）として示す。６回の独立した実験からの結果を、対照についてと、Ｐｈ８濃度９、２７、８１および２４３μｇ／ｍｌについて示す。
【図１６】図１６は、Ｐｈ１０（配列番号１）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ１０で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプの棒）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白い棒）、または１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒い棒）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（白い棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＝ｐ＜０．０１。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ１０で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（０の棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＝ｐ＜０．０１。両図面の結果は、ＩＦＮ−γによって活性化されただけの未処置対照に対する割合（％）として示す。４回の独立した実験からの結果を、対照についてと、Ｐｈ１０濃度９、２７、８１および２４３μｇ／ｍｌについて示す。濃度５４μｇ／ｍｌのＰｈ１０では２つの実験だけしか実施されなかったので、これらのデータは統計分析に含まれなかった。
【図１７】図１７は、Ｐｈ１２（配列番号１９）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ１２で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプ）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白色）、および１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒色）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ１２で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。２回の独立した実験を実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明による化合物は、インターロイキン４に由来する断片であってもよく、あるいは、天然もしくは組換えのインターロイキン４変異体などのインターロイキン４の変異体、例えば選択的スプライシングによって生成されるインターロイキン４変異体、または遺伝的多型、または任意の種類の組換えインターロイキン４に由来することができる。
【００１８】
本発明によるペプチドは、ＩＬ−４受容体と相互作用すること、ＩＬ−４受容体シグナル伝達を調節すること、Ｂ細胞を活性化すること、Ｔ細胞の増殖および生存を活性化すること、単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御すること、またはマクロファージ活性化を阻害することができるペプチドである。
【００１９】
用語「調節」または「調節すること」は、変化、例えば阻害または刺激を意味する。用語「相互作用する」は、ペプチドとＩＬ−４受容体との間の、影響を引き起こす結合などの作用を意味する。
【００２０】
アミノ酸配列
本発明による化合物は、ＩＬ−４またはその断片もしくは変異体に由来する連続するアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
【００２１】
一実施形態では、本発明による化合物は、インターロイキン４（配列番号３８）もしくはその断片に由来する多くとも３５個の連続するアミノ酸、または配列番号３８もしくはその断片と少なくとも７０％同一である変異体からなるペプチドを含むことができる。
【００２２】
ヒトＩＬ−４前駆体のアミノ酸配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０５１１２）は、以下の通りである：
ＭＧＬＴＳＱＬＬＰＰ ＬＦＦＬＬＡＣＡＧＮ ＦＶＨＧＨＫＣＤＩＴ ＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳ ＬＴＥＱＫＴＬＣＴＥ
ＬＴＶＴＤＩＦＡＡＳ ＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣ ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹ ＳＨＨＥＫＤＴＲＣＬ ＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨ
ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬ ＤＲＮＬＷＧＬＡＧＬ ＮＳＣＰＶＫＥＡＮＱ ＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬ ＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫ ＣＳＳ
（配列番号３８）。
【００２３】
本発明によるペプチド配列は、多くとも３５個の連続するアミノ酸残基、例えば３〜３５アミノ酸残基、例えば３〜３０、例えば３〜２５、例えば５〜２５、例えば７〜２５、例えば８〜２５、例えば１０〜２５、または１２〜２５、例えば１４〜２５個からなる。５〜２５個の連続するアミノ酸残基を含む配列が好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明の前記ペプチドは、ＩＬ−４のαヘリックスに由来する多くとも３５個の連続するアミノ酸を含む。
【００２５】
用語「αヘリックス」は、タンパク質の二次構造での共通モチーフを意味し、アルファヘリックス（αヘリックス）は右巻きまたは左巻きの立体構造であり、そこにおいてすべての骨格Ｎ−Ｈ基は、４残基前のアミノ酸の骨格Ｃ＝Ｏ基に水素結合を供与する。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の前記ペプチドは、式
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する配列を含み、式中、
Ｘ１はＬであり、
Ｘ２は、Ｉ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、または荷電アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｑ、Ｔまたは荷電アミノ酸である。
【００２７】
好ましい一実施形態では、Ｘ２はＩまたはＱである。
【００２８】
より好ましい実施形態では、Ｘ２はＩである。
【００２９】
別のより好ましい実施形態では、Ｘ２はＱである。
【００３０】
好ましい一実施形態では、Ｘ２は荷電アミノ酸である。
【００３１】
好ましい実施形態では、Ｘ３は荷電アミノ酸である。
【００３２】
より好ましい実施形態では、Ｘ３はＲまたはＥである。
【００３３】
最も好ましい一実施形態では、Ｘ３はＲである。
【００３４】
別のより好ましい実施形態では、Ｘ３はＥである。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、Ｘ３はＱまたはＴである。
【００３６】
さらにより好ましい実施形態では、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＩであり、Ｘ３はＲである。
【００３７】
別のさらにより好ましい実施形態では、Ｘ１はＬである、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＥである。
【００３８】
最も好ましい実施形態では、本発明の前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ 配列番号１
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ 配列番号２
ＡＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＧ 配列番号３
ＡＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＳ 配列番号４
ＬＱＥＩＫＴＬＮ 配列番号５
ＫＲＬＱＱＮＬＦＧＧ 配列番号６
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ 配列番号７
ＱＥＩＩＫＫＬ 配列番号８
ＡＩＱＮＱＥＥＩＫＹＬＮＳ 配列番号９
ＡＩＩＬＱＥＩ 配列番号１０
ＩＶＬＱＥＩＩ 配列番号１１
ＴＬＧＥＩＩＫＧＶＮＳ 配列番号１２
ＶＴＬＩＤＨＳＥＥＩＦＫＴＬＮ 配列番号１３
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ 配列番号１４
ＲＬＤＲＥＮＶＡＶＹＮＬＷ 配列番号１５
ＬＲＳＬＤＲＮＬ 配列番号１６
ＲＬＬＲＬＤＲＮ 配列番号１７
ＲＦＬＫＲＹＦＹＮＬＥＥＮＬ 配列番号１８
ＲＮＫＱＶＩＤＳＬＡＫＦＬＫＲ 配列番号１９
ＲＨＫＡＬＩＲ 配列番号２０
ＫＫＬＩＲＹＬＫ 配列番号２１
ＲＨＫＴＬＩＲ 配列番号２２
ＭＱＤＫＹＳＫＳ 配列番号２３
ＡＥＲＶＫＩＥＱＲＥＹＫＫＹＳ 配列番号２４
ＳＱＬＩＲＦＬＫＲＬＡ 配列番号２５
ＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴ 配列番号２６
ＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＡ 配列番号２７
ＴＥＫＥＶＬＲＱＦＹＳＡ 配列番号２８
ＫＴＬＴＥＬＴＫＴＬＮＳ 配列番号２９
ＡＨＫＥＩＩＫＴＬＮＳＬＱＫＡ 配列番号３０
ＡＫＴＬＳＴＥＬＴＶＴＡ 配列番号３１
ＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＡ 配列番号３２
ＮＥＥＲＬＫＴＩＭＲＡ 配列番号３３
ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＲ 配列番号３４
ＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴ 配列番号３５
ＡＨＲＨＫＱＬＩＲＡ 配列番号３６
ＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＡ 配列番号３７
の１つ、またはその変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００３９】
一実施形態では、本発明の前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号１）
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号７）
ＲＨＫＡＬＩＲ （配列番号２０）
ＫＫＬＩＲＹＬＫ （配列番号２１）
ＲＨＫＴＬＩＲ （配列番号２２）
ＳＱＬＩＲＦＬＫＲＬＡ （配列番号２５）
ＡＨＲＨＫＱＬＩＲＡ （配列番号３６）
の１つ、またはその変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４０】
一実施形態では、本発明の前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ （配列番号２）
ＬＱＥＩＫＴＬＮ （配列番号５）
ＡＩＩＬＱＥＩ （配列番号１０）
ＩＶＬＱＥＩＩ （配列番号１１）
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ （配列番号１４）
ＡＨＫＥＩＩＫＴＬＮＳＬＱＫＡ （配列番号３０）
の１つ、またはその変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４１】
本文脈では、アミノ酸残基の標準の１文字コードに加えて、標準の３文字コードを適用する。アミノ酸の略記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８４年、１８４巻、９〜３７頁の推奨に従う。明細書および請求項全体で、天然のアミノ酸の３文字コードまたは１文字コードを用いる。Ｌ形またはＤ形が指定されていない場合、問題のアミノ酸は天然のＬ形、Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ． ５６巻（５号）５９５〜６２４頁（１９８４年）を参照、またはＤ形を有することを理解すべきであり、したがって形成されるペプチドは、Ｌ形、Ｄ形またはＬ形およびＤ形の混合した配列のアミノ酸によって構成されてもよい。
【００４２】
何も指定されていない場合、本発明による使用のためのペプチドのＣ末端アミノ酸は、遊離のカルボン酸として存在することを理解すべきであり、これは「−ＯＨ」と指定することもできる。しかし、本発明による使用のためのペプチドのＣ末端アミノ酸はアミド化された誘導体であることができ、それは「−ＮＨ２」と示される。他に明示されていない場合、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸は遊離のアミノ基を含み、これは「Ｈ−」と指定することもできる。
【００４３】
本発明によるペプチド、その断片または変異体は、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含むこともできる。
【００４４】
本発明による好ましいペプチドは、ＩＬ−４の多くとも３５個のアミノ酸残基を含む、単離された連続ペプチド配列である。本発明によるすべてのペプチドは、配列番号１〜３７の配列のいずれかまたはその断片もしくは変異体から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を含むものと理解される。
【００４５】
したがって、本発明の一部の実施形態は、配列番号１〜３７から選択される配列の断片を含むペプチドに関するものでもよい。別の実施形態は、配列番号１〜３７の変異体に関するものでもよい。
【００４６】
一実施形態では、変異体断片は、配列番号３８の断片と比較して異なる。変異体断片は、１つまたは複数の位置に異なるアミノ酸を有することによって、配列番号３８の断片と異なることができる。好ましくは、変異体は最高１０個のアミノ酸位置、より好ましくは最高８個の位置、例えば最高６個の位置、例えば最高５個の位置、例えば４、３、２または１個の位置で配列番号３８の断片と異なる。そのような変異体は、１つまたは複数の化学的改変を有することなど、他の方法で配列番号３８の断片と異なることもできる。
【００４７】
配列番号１〜３８の配列から選択されるアミノ酸配列の本発明による変異体は、以下であることができる。
【００４８】
ｉ） 選択された配列と少なくとも７０％の同一性、例えば７１〜７５％の同一性、例えば７６〜８０％の同一性、例えば８１〜８５％の同一性、例えば８６〜９０％の同一性、例えば９１〜９５％の同一性、例えば９６〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列であって、同一性は、それを選択された配列と照合したときの前記配列中の同一のアミノ酸の割合と定義される。アミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＯＳＵＭ ３０、ＢＬＯＳＵＭ ４０、ＢＬＯＳＵＭ ４５、ＢＬＯＳＵＭ ５０、ＢＬＯＳＵＭ ５５、ＢＬＯＳＵＭ ６０、ＢＬＯＳＵＭ ６２、ＢＬＯＳＵＭ ６５、ＢＬＯＳＵＭ ７０、ＢＬＯＳＵＭ ７５、ＢＬＯＳＵＭ ８０、ＢＬＯＳＵＭ ８５またはＢＬＯＳＵＭ ９０などの周知のアルゴリズムを用いて計算することができる。
【００４９】
ｉｉ） 選択された配列と少なくとも７０％の正のアミノ酸マッチ、例えば７１〜８０％の正のアミノ酸マッチ、例えば８１〜８５％の正のアミノ酸マッチ、例えば８６〜９０％の正のアミノ酸マッチ、例えば９１〜９５％の正のアミノ酸マッチ、例えば９６〜９９％の正のアミノ酸マッチを有するアミノ酸配列であって、正のアミノ酸マッチは、類似した物理的および／または化学的特性を有するアミノ酸残基の、２つの比較した配列の同じ位置での存在と定義される。本発明の好ましい正のアミノ酸マッチは、ＫとＲ、ＥとＤ、ＬとＭ、ＱとＥ、ＩとＶ、ＩとＬ、ＡとＳ、ＹとＷ、ＫとＱ、ＳとＴ、ＮとＳおよびＱとＲである。
【００５０】
ｉｉｉ） 選択された配列と同一であるか、または前記配列と少なくとも７０％の同一性、例えば７１〜８０％の同一性、例えば８１〜８５％の同一性、例えば８６〜９０％の同一性、例えば９１〜９５％の同一性、例えば９６〜９９％の同一性を有するか、または選択された配列と少なくとも７５％の正のアミノ酸マッチ、例えば７６〜８０％の正のアミノ酸マッチ、例えば８１〜８５％の正のアミノ酸マッチ、例えば８６〜９０％の正のアミノ酸マッチ、例えば９１〜９５％の正のアミノ酸マッチ、例えば９６〜９９％の正のアミノ酸マッチを有し、他の化学部分、例えばホスホリル、硫黄、アセチル、グリコシル部分を含むアミノ酸配列。
【００５１】
用語「ペプチド配列の変異体」は、ペプチド配列が、例えばアミノ酸残基の１つまたは複数の置換によって改変されてもよいことも意味する。Ｌアミノ酸およびＤアミノ酸の両方を用いることができる。他の改変は、エステル、糖などの誘導体、例えばメチルおよびアセチルエステル、ならびにポリエチレングリコール改変を含むことができる。
【００５２】
さらに、ペプチドのアミン基は、アミドの酸部分が脂肪酸であるアミドに変換されてもよい。
【００５３】
別の態様では、本発明によるアミノ酸配列の変異体は、同じ変異体もしくはその断片の中に、または異なる変異体もしくはその断片の間で、少なくとも１つの置換、例えばお互いに独立に導入される複数の置換を含むことができる。複合体の変異体、またはその断片は、したがってお互いに独立に保存的置換を含むことができ、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのアラニン（Ａｌａ）は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのバリン（Ｖａｌ）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＬｅｕおよびＩｌｅ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのロイシン（Ｌｅｕ）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＩｌｅ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのイソロイシン（Ｉｌｅ）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＬｅｕ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのアスパラギン酸（Ａｓｐ）は、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのアスパラギン（ａｓｐａｒｇｉｎｅ）（Ａｓｎ）は、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）は、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏからなるアミノ酸の群から選択され、好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのチロシン（Ｔｙｒ）は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰｈｅおよびＴｒｐ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記断片の少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）は、ＬｙｓおよびＨｉｓ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのリジン（Ｌｙｓ）は、ＡｒｇおよびＨｉｓ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのプロリン（Ｐｒｏ）は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＨｉｓ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換される。
【００５４】
したがって上記から、ペプチド断片の同じ変異体または前記変異体の断片は、本明細書の上で定義される保存的アミノ酸の複数の群からの複数の保存的アミノ酸置換を含むことができることがわかる。用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書で用語「同種のアミノ酸置換」と同義で用いられる。
【００５５】
保存的アミノ酸の群は、以下の通りである。
Ａ、Ｇ（中性、弱疎水性）、
Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ（親水性の、非荷電）
Ｅ、Ｄ（親水性、酸性）
Ｈ、Ｋ、Ｒ（親水性、塩基性）
Ｌ、Ｐ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ（疎水性、芳香族）
Ｃ（架橋形成性） 。
【００５６】
保存的置換は、本発明による使用のための好ましい所定のペプチドまたはその断片の、任意の位置に導入されてもよい。しかし、非保存的置換、特に、それに限定されないが、任意の１つまたは複数の位置に非保存的置換を導入することが望ましいこともある。
【００５７】
本発明による使用のためのペプチドの変異体断片の形成をもたらす非保存的置換は、例えば極性が相当異なり、例えば無極性側鎖を有する残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＭｅｔ）が、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎもしくはＧｌｎなどの極性側鎖を有する残基、またはＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇもしくはＬｙｓなどの荷電アミノ酸を置換し、または荷電したもしくは極性の残基で無極性のものを置換し、ならびに／あるいはｉｉ）別の残基によるＰｒｏもしくはＧｌｙの置換またはＰｒｏもしくはＧｌｙへの置換などのように、ペプチド骨格の配向性に及ぼすその影響が相当異なり、ならびに／あるいはｉｉｉ）例えばＧｌｕまたはＡｓｐなどの負荷電残基のＬｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇなどの正荷電残基に対する置換（および、その逆）のように、電荷が相当異なり、ならびに／あるいはｉｖ）例えばＨｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒなどのかさ高い残基のより小さな側鎖を有するもの、例えばＡｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒに対する置換（および、その逆）のように、立体的なかさが相当異なる。
【００５８】
一実施形態では、アミノ酸の置換は、それらの疎水性および親水性の値、ならびに電荷、サイズなどを含むアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性に基づいて加えることができる。
【００５９】
本発明によるペプチドは、ＩＬ−４受容体と相互作用することができるペプチドである。
【００６０】
一実施形態では、本発明によるペプチドは、ＩＬ−４受容体シグナル伝達を調節することができる。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、ＩＬ−４シグナル伝達を刺激することができる。別の好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、ＩＬ−４受容体シグナル伝達を阻害することができる。
【００６２】
別の実施形態では、本発明によるペプチドは、Ｂ細胞を活性化することができる。
【００６３】
さらなる実施形態では、本発明によるペプチドは、Ｔ細胞の増殖および生存を活性化することができる。
【００６４】
別の実施形態では、本発明によるペプチドは、単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御することができる。
【００６５】
さらに別の実施形態では、本発明によるペプチドは、マクロファージ活性化を阻害することができる。
【００６６】
本発明によるアミノ酸配列の断片および変異体の両方は、前記配列の機能的同等物である。
【００６７】
本文脈で、アミノ酸配列の「機能的同等物」という用語は、上記の前記アミノ酸配列の変異体または断片の基準を満たし、前記配列または前記配列を含む化合物の１つまたは複数の機能的活性が可能な分子を意味する。好ましい実施形態では、本発明によるアミノ酸配列の機能的同等物は、ＩＬ−４受容体と相互作用して、ＩＬ−４受容体シグナル伝達を調節することができる。
【００６８】
本発明は、本発明による単離されたペプチドおよび本発明によるペプチドを含む融合タンパク質の両方に関する。
【００６９】
一実施形態では、本発明によるペプチドは、単離されたペプチドである。用語「単離されたペプチド」は、本発明によるペプチドが個々の化合物であって、別の化合物の一部でないことを意味する。単離されたペプチドは、任意の組換え技法または化学合成の使用によって生成すること、および他の化合物から分離することができ、または、それは酵素的切断もしくは化学的切断の方法によってより長いポリペプチドもしくはタンパク質から分離すること、および他のタンパク質断片からさらに分離することができる。
【００７０】
ペプチド配列は、単一コピーとして、すなわちペプチド配列の単量体として製剤化されて化合物に存在することができ、または、それは同じ配列のいくつかのコピーとして、例えば配列番号１〜３７から選択される配列の２つ以上のコピー、または前記配列の断片もしくは変異体の２つ以上のコピーを含む多量体として存在することができる。
【００７１】
別の実施形態では、本発明による単離されたペプチドは、配列番号１〜３７またはその変異体から選択される、インターロイキン４に由来する連続するアミノ酸配列からなるインターロイキン４の断片を含むことができる。別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１〜３７の配列の１つまたは複数からなることができる。
【００７２】
ペプチド配列の生成
本発明のペプチド配列は、任意の従来の合成法、組換えＤＮＡ技術、ペプチド配列が由来する完全長タンパク質の酵素的切断、または前記方法の組合せによって調製することができる。
【００７３】
合成調製物
ペプチドの合成的生成の方法は、当技術分野で周知である。合成ペプチドを生成するための詳細な説明ならびに実際的なアドバイスは、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒａｎｔ Ｇ． Ａ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００２年、またはＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＦｒｏｋｊａｅｒおよびＨｏｖｇａａｒｄ編、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ、１９９９年で見ることができる。
【００７４】
例えばペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いて、およびＡｃｍ保護システインで合成することができる。逆相ＨＰＬＣによる精製の後、例えば環状の、またはＣ末端もしくはＮ末端が改変されたアイソフォームを得るために、ペプチドをさらに処理することができる。環化および末端改変のための方法は当技術分野で周知であり、上で引用したマニュアルで詳細に記載されている。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明のペプチド配列は、合成的に、特にＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＡＰＳ）法によって生成される。
【００７６】
ペプチドは、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器でバッチ式に、または、側鎖官能基のためのＮ−ａ−アミノ保護基および適する共通保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を用いる、完全自動化ペプチドシンセサイザー上でのポリアミド固相法（Ｄｒｙｌａｎｄ， Ａ．およびＳｈｅｐｐａｒｄ， Ｒ．Ｃ．、（１９８６年）Ｊ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． Ｉ、１２５〜１３７頁）の連続フローバージョンで合成することができる。
【００７７】
組換え調製物
したがって、一実施形態では、本発明のペプチドは組換えＤＮＡ技術を用いて生成される。
【００７８】
ペプチドまたはそのペプチドが由来する対応している完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、確立された標準の方法、例えばＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２２巻：１８５９〜１８６９頁によって記載されるホスホアミジン（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｎｅ）法、またはＭａｔｔｈｅｓら、１９８４年、ＥＭＢＯ Ｊ． ３巻：８０１〜８０５頁によって記載される方法によって、合成的に調製することができる。ホスホアミジン法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーで合成され、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適するベクターにクローニングされる。
【００７９】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、標準のプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第２版、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ、１９８９年）に従ってＤＮＡアーゼＩを用いて、ペプチド起源の対応する完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列の断片化によって調製することもできる。本発明は、上で特定されるタンパク質の群から選択される完全長タンパク質に関する。あるいは、本発明の完全長タンパク質をコードするＤＮＡは、特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて断片化することができる。ＤＮＡの断片は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第２版、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ、１９８９年に記載の標準手順を用いてさらに精製される。
【００８０】
完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ゲノム起源またはｃＤＮＡ起源でもよく、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準手法に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによって完全長タンパク質のすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることによって得られる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９年を参照）。ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号またはＳａｉｋｉら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：４８７〜４９１頁に記載の特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
【００８１】
ＤＮＡ配列は、都合よく組換えＤＮＡ手順にかけることができる任意のベクターであってもよい組換え発現ベクターに次に挿入される。ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞にしばしば依存する。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製は染色体複製に依存しない染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミドであることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってもよい。
【００８２】
ベクターでは、ペプチドまたは完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適するプロモーター配列に作動可能に連結されるべきである。プロモーターは、選択された宿主細胞で転写活性を示し、宿主細胞と同種または異種であるタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい、任意のＤＮＡ配列であることができる。哺乳動物の細胞でコードＤＮＡ配列の転写を指示するのに適するプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、１９８１年、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １巻：８５４〜８６４頁）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２巻：８０９〜８１４頁）またはアデノウイルス２主要後期プロモーターである。昆虫細胞で用いるのに適するプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター（Ｖａｓｕｖｅｄａｎら、１９９２年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３１１巻：７〜１１頁）である。酵母宿主細胞で用いるのに適するプロモーターには、酵母糖分解遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８０年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５巻：１２０７３〜１２０８０頁、ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、１９８２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １巻：４１９〜４３４頁）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇら、１９８２年、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）からのプロモーター、またはＴＰＩ１（米国特許第４，５９９，３１１号）もしくはＡＤＨ２−４ｃ（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ ３０４巻：６５２〜６５４頁）プロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞で用いるのに適するプロモーターは、例えばＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、１９８５年、ＥＭＢＯ Ｊ． ４巻：２０９３〜２０９９年）またはｔｐｉＡプロモーターである。
【００８３】
コードＤＮＡ配列は、適するターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、前掲書）、または（真菌宿主の場合）ＴＰＩ１（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、前掲書）もしくはＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、前掲書）プロモーターに、作動可能に連結されてもよい。ベクターは、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅｌｂ領域から）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの）などのエレメントをさらに含むことができる。
【００８４】
組換え発現ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞で複製することを可能にするＤＮＡ配列をさらに含むことができる。そのような配列の例（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）は、ＳＶ４０複製起点である。ベクターは、選択可能なマーカー、例えばその生成物は宿主細胞の欠損を補う遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子またはネオマイシン、ハイドロマイシンもしくはメトトレキセートなどの薬剤に対する抵抗性を与えるものを含むこともできる。
【００８５】
ペプチドまたは完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれライゲーションして、複製のために必要な情報を含む適するベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は、当分野の技術者に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲書を参照）。
【００８６】
本発明の組換えペプチドを得るために、コードＤＮＡ配列を、第二のペプチドコード配列およびプロテアーゼ切断部位コード配列と有効に融合させ、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を与えることができ、そこで、プロテアーゼ切断部位コード配列は、ＨＢＰ断片と第二のペプチドコードＤＮＡとの間に位置し、組換え発現ベクターに挿入され、組換え宿主細胞で発現される。一実施形態では、前記第二のペプチドは、それらに限定されないが、グルタチオン−Ｓ−レダクターゼ、子ウシサイモシン、細菌チオレドキシンまたはヒトユビキチンの天然もしくは合成変異体、またはそのペプチドを含む群から選択される。別の実施形態では、プロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列は、アミノ酸配列ＩＥＧＲ、エンテロキナーゼ、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ、トロンビン、アミノ酸配列ＬＶＰＲ／ＧＳを有する第Ｘａ因子、またはアミノ酸配列ＸＫＸを有するＡｃｈａｒｏｍｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ切断部位であることができる。
【００８７】
発現ベクターが導入される宿主細胞は、ペプチドまたは完全長タンパク質の発現が可能である任意の細胞であることができ、好ましくは真核細胞、例えば無脊椎動物（昆虫）の細胞または脊椎動物の細胞、例えばＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞または哺乳動物の細胞、特に昆虫および哺乳動物の細胞である。適する哺乳動物細胞系の例は、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ＣＯＳ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）またはＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）細胞系である。哺乳動物細胞をトランスフェクトして、細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９巻、１９８２年、６０１〜６２１頁、ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、１９８２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １巻：３２７〜３４１頁、Ｌｏｙｔｅｒら、１９８２年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９巻：４２２〜４２６頁、Ｗｉｇｌｅｒら、１９７８年、Ｃｅｌｌ １４巻：７２５頁、ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、１９８１年、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７巻、６０３頁、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年、Ｖｉｒｏｌ． ５２巻：４５６頁、およびＮｅｕｍａｎｎら、１９８２年、ＥＭＢＯ Ｊ． １巻：８４１〜８４５頁に記載されている。
【００８８】
あるいは、真菌細胞（酵母細胞を含む）を、宿主細胞として用いることができる。適する酵母細胞の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の細胞、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株が含まれる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ種、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの株の細胞である。タンパク質の発現のためのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種の使用は、例えば欧州特許第２３８０２３号に記載されている。
【００８９】
細胞を培養するために用いられる培地は、適当な補助剤を含む血清含有培地もしくは無血清培地などの、哺乳動物細胞の増殖に適する任意の従来の培地、または昆虫、酵母もしくは真菌の細胞の増殖に適する培地であることができる。適する培地は民間の納入業者から入手可能であるか、または公開レシピ（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）に従って調製することができる。
【００９０】
次に、細胞によって組換えで生成されるペプチドまたは完全長タンパク質は、遠心分離またはろ過によって宿主細胞を培地から分離すること、塩、例えば硫安によって上清またはろ液のタンパク性成分を沈殿させること、様々なクロマトグラフィー法、例えばＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を含む従来の方法によって培地から回収することができる。
【００９１】
医薬
本発明の目的は、ＩＬ−４の活性を調節することができる化合物を提供することであり、本発明による前記化合物は、ＩＬ−４シグナル伝達の調節が治療のための必須の条件とみなすことができる疾患の治療のための医薬として用いることができる。
【００９２】
したがって、本発明は、医薬の製造のための、ＩＬ−４由来の配列またはその断片もしくは変異体を含むペプチドの１つまたは複数の使用に関する。
【００９３】
一実施形態では、本発明の医薬は、配列番号１〜３７に示すアミノ酸配列、または前記配列の断片もしくは変異体の少なくとも１つを含む。別の実施形態では、本発明の医薬は、ＩＬ−４のエピトープもしくはその断片に結合することができる抗体、または前記抗体の断片もしくは変異体を含む。
【００９４】
本発明の医薬は、上で定義される化合物の１つまたは複数、または上で定義される化合物を含む組成物の有効量を、薬学的に許容される添加剤と組み合わされて含む。そのような医薬は、経口、経皮、皮下、局所、筋肉内、静脈内、頭蓋内、クモ膜下、脳室内、経鼻（ｎａｓａｌ）、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）または肺内投与（ｐｕｌｍｏｎａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のために、あるいは関節包内またはその近くへの関節内投与（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）で補われる非経口投与のために、適切に製剤化することができる。
【００９５】
一般に、本発明のペプチドに基づく医薬および組成物の製剤開発での戦略は、他の任意のタンパク質に基づく薬品の製剤戦略に対応する。可能性のある問題およびこれらの問題を克服するために必要とされる指針は、いくつかの教科書、例えば「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａ．Ｋ． Ｂａｎｇａ編、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、１９９５年で扱われている。
【００９６】
通常は、注射剤は、液体の溶液または懸濁液、注射の前に液体の溶液または懸濁液にするのに適する固体の形で調製される。調製物は、乳状にされてもよい。有効成分は、薬学的に許容され、有効成分に適合する賦形剤としばしば混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組合せである。さらに、所望により、調製物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助物質、または調製物の有効性もしくは輸送を強化する補助物質を少量含むことができる。
【００９７】
本発明の化合物の製剤は、当分野の技術者に公知である技術によって調製することができる。製剤は、薬学的に許容される担体および賦形剤、例えばマイクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子などを含むことができる。
【００９８】
調製物は、任意選択で有効成分がその効果を発揮する部位に、注射によって好適に投与することができる。他の投与様式に適するさらなる製剤には、坐薬、鼻、肺および、場合によっては経口用の製剤が含まれる。坐薬のために、従来の結合剤および担体には、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。そのような坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲の有効成分（複数可）を含む混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば医薬用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続的放出製剤または粉末の形をとり、一般に、１０〜９５％の有効成分（複数可）、好ましくは２５〜７０％を含有する。
【００９９】
他の製剤は、鼻および肺投与に適するもの、例えば吸入器およびエアゾールである。
【０１００】
活性化合物は、中性または塩の形として製剤化することができる。
【０１０１】
薬学的に許容される塩には、酸付加塩（例えば、ペプチド化合物の遊離アミノ基と形成される）、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などの無機酸と形成される塩、またはギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、サリチル酸ビスメチレン、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸と形成される塩が含まれる。遊離のカルボキシル基で形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【０１０２】
薬学的に許容される無機または有機酸の付加塩のさらなる例には、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． １９７７年、６６巻、２頁に記載の薬学的に許容される塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウムの塩などが含まれる。アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムの塩などが含まれる。
【０１０３】
調製物は、投薬製剤に適合する方法で、および治療的に有効となる量で投与される。投与される量は、例えば対象の体重および年齢を含む治療対象、治療する疾患ならびに疾患の病期によって決まる。適する投薬量範囲は、投与につき通常キロ体重あたり数百μｇ位の有効成分であり、好ましい範囲はキロ体重あたり約０．１μｇ〜５０００μｇである。化合物の単量体形を用いると、適する投薬量は、しばしば、キロ体重あたり０．１μｇ〜５０００μｇの範囲、例えばキロ体重あたり約０．１μｇ〜３０００μｇの範囲、特にキロ体重あたり約０．１μｇ〜１０００μｇの範囲である。化合物の多量体形を用いると、適する投薬量は、しばしば、キロ体重あたり０．１μｇ〜１０００μｇの範囲、例えばキロ体重あたり約０．１μｇ〜７５０μｇの範囲、特にキロ体重あたり約０．１μｇ〜５００μｇの範囲、例えばキロ体重あたり約０．１μｇ〜２５０μｇの範囲である。特に鼻から投与する場合、他の経路で投与するよりも小さな投薬量が用いられる。投与は１回実施することができるか、または以降の投与が続くことができる。投薬量は投与経路にも依存し、治療対象の年齢および体重によって異なる。多量体形の好ましい投薬量は、その間隔において７０ｋｇ体重につき１ｍｇ〜７０ｍｇであろう。
【０１０４】
ほとんどの適用のために、局在化された、または実質的に局在化された適用が好ましい。
【０１０５】
本発明の化合物のいくつかは十分に活性であるが、他のいくつかについては、その調製物が薬学的に許容される添加剤および／または担体をさらに含む場合に、その効果は増強される。そのような添加剤および担体は、当技術分野で公知である。場合によっては、その標的への活性物質の送達を促進する化合物を含むことが有利となる。
【０１０６】
多くの例では、製剤を複数回投与する必要性がある。投与は脳室内注入などの連続注入であってもよく、または１日により多くの回数、毎日、１週により多くの回数、毎週など、より多くの用量での投与であってもよい。医薬の投与は、細胞死をもたらすことができる因子（複数可）に個体をさらす前または直後に開始されることが好ましい。好ましくは、医薬は因子の開始から８時間以内、例えば因子の開始から５時間以内に投与される。化合物の多くは長期間の効果を示し、それによって、化合物の投与は長い間隔、例えば１週間または２週間で行うことができる。
【０１０７】
神経ガイドでの使用に関連して、投与は、活性化合物（複数可）の制御放出に基づき、連続的であっても小部分に分けてもよい。さらに、放出の速度および／または放出の部位を制御するために、前駆体を用いてもよい。他の種類のインプラントおよび経口投与も、制御放出および／または前駆体の使用に同様に基づくことができる。
【０１０８】
上記のように、本発明は、分化を誘導するため、増殖を調節するため、再生、ニューロンプラスティシティおよび細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ生存を刺激するための個体の治療に関し、その治療は、上で定義される１つまたは複数の化合物の有効量を投与することを含む。
【０１０９】
投与のための別の戦略は、問題の化合物を発現および分泌することができる細胞を移植または注入することである。それによって、化合物は、それが作用する場所で生成させることができる。
【０１１０】
治療
本発明による化合物は、炎症性の疾患および状態を治療するために特に有用である。化合物は、下記疾患および状態のために有用であり、特に、関節リウマチおよび自己免疫疾患、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病に関連する炎症の治療のために有用である。
【０１１１】
本発明の化合物で治療することができる炎症関連の障害の例には、以下のものが含まれる。神経炎、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病、喘息および他のアレルギー反応、自己免疫疾患、例えば急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、ＡＬＳ、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、水疱性類天疱瘡、腹腔疾患、シャガス病、慢性閉塞性肺疾患、皮膚筋炎、１型糖尿病、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、エリテマトーデス、斑状強皮症、多発性硬化症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、尋常天疱瘡、悪性貧血、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、ＳＬＥ、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても公知である）、血管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症；慢性炎、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏性、炎症性腸疾患、骨盤炎症性疾患、再灌流損傷、関節リウマチ、移植拒絶、血管炎、骨関節炎、腱鞘炎および関節炎。
【０１１２】
治療は、非分解性病原体、持続的外来物体または自己免疫反応による持続的な急性炎症、中枢神経系の炎症性疾患、例えば急性感染性多発性神経炎、組織損傷を有する炎症性障害、ＨＩＶ、肝炎、骨関節炎、腱鞘炎および関節炎を含む、髄膜炎、脳炎、炎症性および毒性神経障害の治療でもよい。
【０１１３】
一実施形態では、治療は、癌、アテローム硬化症および虚血性心疾患を含む、炎症過程に病原学的起源を有する非免疫性疾患のものでもよい。
【０１１４】
抗体
本発明の目的は、インターロイキン４に由来する連続アミノ酸配列またはその断片、同族体もしくは変異体を含むエピトープに選択的に結合することができる抗体、その抗原結合性断片または組換えタンパク質の使用を提供することである。本発明は、配列番号１〜３７に示す配列のいずれかから選択されるインターロイキン４に由来する連続アミノ酸配列、または前記配列の断片もしくは変異体を含むエピトープに選択的に結合することができる任意の抗体に関する。
【０１１５】
用語「エピトープ」は、（その抗原の）抗体によって認識される特異的原子団（抗原分子上の）を意味する。用語「エピトープ」は、用語「抗原決定基」と同等である。エピトープは、近接して、例えば連続するアミノ酸配列中に位置するか、または抗原のアミノ酸配列の遠い部分に位置するがタンパク質の折たたみのために互いに近づいている、３つ以上のアミノ酸残基、例えば４、５、６、７、８個のアミノ酸残基を含むことができる。
【０１１６】
抗体分子は免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質のファミリーに属し、その基本的なビルディングブロックである免疫グロブリン折たたみまたはドメインは、免疫系および他の生体認識系の多くの分子で様々な形で用いられる。一般的な免疫グロブリンは、可変領域として公知である抗原結合性領域および定常領域として公知である非可変領域を含む、４つのポリペプチド鎖を有する。
【０１１７】
天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖は、規則正しく間隔をあけた鎖内部のジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、その一端に可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、その他方の端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変領域の間で界面を形成すると考えられている（Ｎｏｖｏｔｎｙ Ｊ．およびＨａｂｅｒ Ｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８２巻（１４号）：４５９２〜６頁、１９８５年）。
【０１１８】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの少なくとも五（５）個の主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の１つに割り当てることができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
【０１１９】
抗体の可変ドメインとの関連で用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列が広く異なることを指す。可変ドメインは結合のためであり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の特異性を決定する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方の、超可変領域としても公知である相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの区分に集中している。
【０１２０】
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、そのほとんどはβシート配置を採用し、３つのＣＤＲによって連結され、それらはβシート構造を連結するループを、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって他の鎖のＣＤＲに近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与していないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【０１２１】
したがって本発明で使用することが企図されている抗体は、完全体免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂ、類似した断片などの抗体断片、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む単鎖抗体、および類似形態を含む様々な形態のいずれかでよく、それらのすべては、本明細書で用いる広い用語「抗体」に入る。本発明は、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体の任意の特異性の使用を企図し、特異的抗原を認識してそれと免疫反応する抗体に限定されない。下記の治療方法およびスクリーニング方法との関連で、好ましい実施形態は、本発明の抗原またはエピトープに免疫特異的である抗体またはその断片の使用である。
【０１２２】
用語「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般には抗原結合性または可変性の領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片を生成し、それぞれは単一の抗原結合部位、および、容易に結晶化するその能力のためにそのように呼ばれる、残留性「Ｆｃ」断片を含む。ペプシン処理は、抗原を架橋することができる２つの抗原結合性断片を有するＦ（ａｂ’）２断片、および残留性の他の断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）を与える。さらなる断片には、抗体断片から形成されるダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子および多重特異性抗体を含めることができる。本明細書で用いるように、抗体に関する「機能的断片」は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片を指す。
【０１２３】
用語「抗体断片」は、用語「抗原結合性断片」と互換的に用いられる。
【０１２４】
抗体断片は、約４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、９アミノ酸、約１２アミノ酸、約１５アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸以上と同じくらい小さくてもよい。一般に、配列番号１〜３７と本明細書で同定される配列のいずれかから選択されるペプチド配列または前記配列の断片を含むエピトープに特異的に結合する抗体と比較して、それが類似のまたは免疫学的特性を有する限り、本発明の抗体断片は、任意のサイズ上限を有することができる。したがって、本発明の文脈では、用語「抗体断片」は、用語「抗原結合性断片」と同一である。
【０１２５】
抗体断片は、その抗原または受容体に選択的に結合する多少の能力を保持する。数種類の抗体断片は、以下の通りに定義される。
【０１２６】
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含む断片である。Ｆａｂ断片は、完全体抗体を酵素パパインで消化して完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を与えることによって生成することができる。
【０１２７】
（２）Ｆａｂ’は、完全体抗体をペプシンで処理し、続いて還元して、完全な軽鎖および重鎖の一部を与えることによって得ることができる抗体分子の断片である。抗体分子につき２つのＦａｂ’断片が得られる。
【０１２８】
Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の付加によって、Ｆａｂ断片と異なる。
【０１２９】
（３）（Ｆａｂ’）２は、完全体抗体を酵素ペプシンで処理し、その後還元しないことによって得ることができる抗体の断片である。
【０１３０】
（４）Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片の二量体である。
【０１３１】
Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含む、最小限の抗体断片である。この領域は、密接な、非共有的に結合した１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる（ＶＨ−ＶＬ二量体）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を規定するのは、この配置においてである。一緒になって、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識して結合する能力を有するが、親和性は結合部位全体よりも低い。
【０１３２】
（５）適するポリペプチドリンカーによって遺伝的に融合された単鎖分子として連結される、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子として定義される単鎖抗体（「ＳＣＡ」）。そのような単鎖抗体は、「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片とも呼ばれる。一般には、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成するのを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖのレビューのためには、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １１３巻：２６９〜３１５頁、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１９９４年、の中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照。
【０１３３】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖の上で２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を形成することが強制される。ダイアボディは、例えば欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）でより詳細に記載されている。
【０１３４】
本発明は、少なくとも２つの結合性ドメインを有する多価抗体も企図する。結合性ドメインは、同じリガンドまたは異なるリガンドに対する特異性を有することができる。一実施形態では、多重特異的分子は、二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）であり、それは少なくとも２つの異なる結合性ドメインを運び、そのうちの少なくとも１つは抗体起源である。多価抗体は、いくつかの方法によって生成することができる。二価または多価抗体を調製するための様々な方法が、例えば米国特許第５，２６０，２０３号、第５，４５５，０３０号、第４，８８１，１７５号、第５，１３２，４０５号、第５，０９１，５１３号、第５，４７６，７８６号、第５，０１３，６５３号、第５，２５８，４９８号および第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１３５】
本発明は、本発明によるエピトープに結合することができるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方、抗原結合性断片およびその組換えタンパク質を企図する。
【０１３６】
ポリクローナル抗体の調製は、当分野の技術者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒｅｅｎら、１９９２年、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編）、１〜５頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ， Ｒａｔｓ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、セクション２．４．１を参照。
【０１３７】
モノクローナル抗体の調製は、同様に従来通りである。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜７頁（１９７５年）、Ｃｏｌｉｇａｎら、セクション２．５．１〜２．６．７、およびＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、７２６頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ．（１９８８年）を参照。モノクローナル抗体は、様々な確立された技術によってハイブリドーマ培養から単離、精製することができる。そのような単離技術には、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、セクション２．７．１〜２．７．１２およびセクション２．９．１〜２．９．３、Ｂａｒｎｅｓら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ （ＩｇＧ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０巻：７９〜１０４頁、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照。
【０１３８】
モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ操作の方法は、当分野の技術者に周知である。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５〜７頁によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換え法によって作製することができる。本発明で用いるためのモノクローナル抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４〜６２８頁、ならびにＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２巻：５８１〜５９７頁に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。別の方法は、組換え手段によってモノクローナル抗体をヒト化して、ヒト特異的および認識可能な配列を含む抗体を生成することを含む。レビューのためには、Ｈｏｌｍｅｓら、１９９７年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８巻：２１９２〜２２０１頁およびＶａｓｗａｎｉら、１９９８年、Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８１巻：１０５〜１１５頁を参照。
【０１３９】
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在することのある可能な天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を一般に含む従来のポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンに汚染されずに、ハイブリドーマ培養によって合成されるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を要求するものと解釈されてはならない。
【０１４０】
本明細書で、具体的にモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するか別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに、それらが所望の生物学的な活性を示す限り、そのような抗体の断片の対応配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１巻：６８５１〜６８５５頁。
【０１４１】
抗体断片を作製する方法も、当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹを参照）。本発明の抗体断片は、抗体のタンパク分解性加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉでの発現によって調製することができる。抗体断片は、従来の方法による完全体抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素切断によって、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓ断片を提供することによって生成することができる。この断片は、チオール還元剤、および任意選択でジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロック基を用いてさらに切断し、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを用いる酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ’断片およびＦｃ断片を直接に生成する。これらの方法は、例えば米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号、およびそこに含まれる参考文献に記載されている。これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
完全な抗体によって認識される抗原にその断片が結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖断片を形成すること、さらなる断片切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術を用いることもできる。例えば、Ｆｖ断片は、ＶＨおよびＶＬ鎖の結合を含む。この結合は非共有結合であってもよく、または、可変鎖は分子間ジスルフィド結合によって連結されてもよく、もしくはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋されてもよい。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されるＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合性タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されるＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後、それはＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドで、単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成する方法は、例えばＷｈｉｔｌｏｗら、１９９１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２巻：９７頁、Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３〜４２６頁、米国特許第４，９４６，７７８号およびＰａｃｋら、１９９３年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１巻：１２７１〜７７頁に記載されている。
【０１４３】
抗体断片の別の形は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、抗原の認識および結合にしばしば関与する。ＣＤＲペプチドは、対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子をクローニングまたは構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ： ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２巻、１０６頁（１９９１年）を参照。
【０１４４】
本発明は、ヒト以外（例えばマウス）の抗体のヒト形態およびヒト化形態を企図する。そのようなヒト化抗体は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小限の配列、例えばエピトープ認識配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合性部分配列）である。大部分、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。本発明の抗体（複数可）の最小限の配列（複数可）を含むヒト化抗体（複数可）、例えば本明細書に記載のエピトープ（複数可）を認識する配列（複数可）は、本発明の好ましい実施形態の１つである。
【０１４５】
場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応するヒト以外の残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でもインポートされたＣＤＲおよびフレームワーク配列でも見出されない残基を含むこともできる。これらの改変は、抗体能力をさらに洗練および最適化するために加えられる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、そのＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト以外の免疫グロブリンのそれらに対応し、そのＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含む。詳しくは、以下を参照のこと。Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻、５２２〜５２５頁、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻、３２３〜３２９頁、Ｐｒｅｓｔａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ２巻：５９３〜５９６頁、Ｈｏｌｍｅｓら、１９９７年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８巻：２１９２〜２２０１頁およびＶａｓｗａｎｉら、１９９８年、Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８１巻：１０５〜１１５頁。
【０１４６】
抗体の生成は、配列番号１〜３７と同定される配列のいずれかから選択される配列の天然または組換えの断片を抗原として用いる、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するための当技術分野の任意の標準方法によって達成することができる。そのような抗体は、配列番号１〜３７の変異体または断片を用いて生成することもできる。
【０１４７】
抗体は、例えば、その個体に本発明による免疫原性断片を投与することによって、治療される個体がｉｎ ｖｉｖｏで生成することもできる。したがって、本発明は、上記の免疫原性断片を含むワクチンにさらに関する。
【０１４８】
本出願は、上記の免疫原性断片を提供するステップを含む、本発明の抗体を生成する方法にも関する。
【０１４９】
本発明は、ＩＬ−４の生物機能、特に炎症に関係する機能を調節すること、例えば増強または減弱させることができる抗体、およびその生物学的な活性を調節することなくＩＬ−４を認識し、特異的に結合することができる抗体の両方に関する。
【０１５０】
本発明は、ＩＬ−４の活性の調節を含む治療的適用のための上記抗体の使用に関する。
【０１５１】
一態様では、本発明は、上記抗体を含む医薬組成物の使用に関する。
【実施例】
【０１５２】
（実施例１）
ＩＬ−４に由来する４つのペプチドを設計、合成した（配列番号１〜４）。ペプチド位置のマッピングを、ＰｙＭＯＬ ｖ０．９９（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＬＣ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ）に基づいてＰｙＭＯＬ（商標）ソフトウェアを使用して実施した。これは、ヒトＩｌ４−Ｉｌ４ｒ−Ｉｌ１３ｒａ、ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＰＮおよび３ＢＰＬの三元複合体の結晶構造に基づいて実行された（ＬａＰｏｒｔｅら、２００８年）。
【０１５３】
ＩＬ−４は、ＩＬ−４Ｒαの細胞外部分の２つのフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３−１およびＦＮ３−２）と相互作用する（図１および２）。ＩＬ−４は、ＩＬ−４Ｒαおよびγｃの細胞外部分の２つのフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３−１およびＦＮ３−２）と相互作用する（図３および４）。
【０１５４】
（実施例２）
それらが任意の生物学的な活性を有するかどうかにかかわらず、ＩＬ−４に由来する４つのペプチドを神経突起成長アッセイで試験した。
【０１５５】
小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）は、出産後（Ｐ）３日または７日のウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ＧｅｒｍａｎｙまたはＴａｃｏｎｉｃ、Ｅｊｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から調製した。小脳は髄膜および血管を取り除き、チョッピングによって粗くホモジナイズし、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｂｒｏｎｄｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のトリプシンでトリプシン処理をした。ニューロンをＤＮアーゼ１および大豆トリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で洗浄し、細胞破片は平板培養の前に遠心分離によってペレットにした。単細胞培養実験のために、Ｐ７のＣＧＮを、０．４％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中の未コーティング８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋチャンバスライド（ＮＵＮＣ、Ｓｌａｎｇｅｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の上へ、１０，０００細胞／ウェルの密度で平板培養した。平板培養の直後に様々な濃度のペプチドを培地に加え、細胞を３７℃および５％ＣＯ２に２４時間維持した。次に、前に記載のとおり、培養物を固定、ブロックし、ラットＧＡＰ−４３に対するポリクローナルウサギ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とインキュベートし、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）とのインキュベーションが続いた（Ｎｅｉｉｅｎｄａｍら、２００４年）。免疫染色した培養のすべてを、Ｎｉｋｏｎ Ｐｌａｎｅ ２０×対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本国）を用いて、コンピュータによる蛍光顕微鏡検査によって記録した。画像は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で開発されたソフトウェアパッケージＰｒｉｍａを用いて、電荷結合素子ビデオカメラ（Ｇｒｕｎｄｉｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｎｕｒｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で獲得した。細胞あたりのニューロン突起の長さは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｒｏｎｎら２０００年）で開発されたソフトウェアパッケージＰｒｏｃｅｓｓ Ｌｅｎｇｔｈを用いて推定した。神経突起成長の推定のために、個々の各実験の群ごとに、少なくとも２００±２０細胞を処理した。
【０１５６】
結果：
ＩＬ−４結合部位からの配列番号１、２、３および４を有するペプチドは、一次ニューロンから神経突起生成応答を誘発することが見出された。小脳神経突起成長に及ぼす配列番号１、２、３および４の影響の結果を、それぞれ図５、６、９および１２に示す。
【０１５７】
（実施例３）
一次マクロファージ細胞（または、ＡＭＪ２Ｃ８マクロファージ細胞系の細胞、Ｒｙａｎら、１９９７年を参照）は、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度の１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｓｌａｎｇｅｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で、６×１０−５細胞／ｍｌの密度で２４時間培養することができる。ＬＰＳ刺激に応じるＴＮＦ−α放出の測定のために、３反復の培養を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで２４時間培養し、次に０〜１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで追加の２４時間刺激し、その後培養上清を収集した。ＬＰＳ処理マクロファージからのならし培地中のＴＮＦ−α濃度の測定は、アクチノマイシンＤへの曝露後にＴＮＦ−α感受性であったＬ９２９線維芽細胞様細胞を使用して実行した（Ｈｅら、２００２年）。Ｌ９２９細胞を、ウェルにつき２０，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の、１０％ＦＣＳおよび０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ １６４０で維持した。ＴＮＦ−αバイオアッセイとして用いる１時間前に、Ｌ９２９細胞を５μｇ／ｍｌアクチノマイシン（ａｃｔｒｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ｄ（Ｓｉｇｍａ）で前処理し、ＬＰＳ処理マクロファージ培養からの様々な希釈のならし培地とさらにインキュベートした。次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて細胞生存度を評価した。
【０１５８】
マクロファージ活性化試験系
・マクロファージを、１ウェルにつき９．６ｃｍ２を有する６ウェルマルチディッシュに、密度１０，０００細胞／ウェルで播種した。
【０１５９】
・潜在的な抗炎症効果を有するペプチドまたはタンパク質を、培養に加えた。陰性対照として、培地を１つのウェルに加え、陽性対照として、１００μＭヒドロコルチゾンを１つのウェルに加えた。
【０１６０】
・細胞培養を、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１６１】
・マクロファージを活性化するために、ＩＦＮ−γを濃度０．０１μｇ／ｍｌでマクロファージ培養に加えた。対照として、１つのウェルには培地以外ＩＦＮ−γを加えなかった。
【０１６２】
・線維芽細胞を、濃度０．２×１０２細胞／ｍｌで９６ウェルプレートに播種した。
【０１６３】
・両細胞培養を、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１６４】
マクロファージからのならし培地は、１２００ｒｐｍで５分間細胞液を遠心回転させることによって収集した。ならし培地を線維芽細胞に加え、ＴＮＦ−αを滴定曲線のために加え、最後に、アクチノマイシンＤを濃度０．５μｇ／ｍｌで線維芽細胞に加えた。
【０１６５】
結果：
マクロファージ細胞培養での炎症性応答の阻害に及ぼす、配列番号１、３、５、６および１９を有するペプチドの影響を試験した。結果を、図７、１０および１３〜１７に示す。
【０１６６】
（実施例４）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を用いる結合試験
組換えＩＬ４Ｒαを、ＣＭ５センサーチップの上に固定した。固定化工程は、３５μｌの活性化液でカルボキシメチル化デキストランマトリックスを活性化し、続いて１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）中のタンパク質の注射によって実行した。所望レベルのタンパク質を固定化した後、３５μｌの失活液を注入して、デキストランマトリックス中のあらゆる遊離のカルボキシメチル化基を不活性化する。対照として、１つのフローセルは常に空であった。各分析物（組換えＩＬ−４またはＩＬ−４由来のペプチド）をＰＢＳで希釈し、１０μｌ／分の流速で注入した。得られたデータは、ＢｉａｃｏｒｅのソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖ．４を用いて非線形カーブフィッティングを実施することによって分析した。１：１の複合体の２つの分子の相互作用を記載する、１：１のラングミュア結合モデルに曲線をあてはめた。結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）から、親和定数（ＫＤ）を計算した。これは、以下の式を用いて実行し、式中、Ｌは固定化リガンドであり、Ａは分析物であり、ＬＡは分析物−リガンド複合体である。
【０１６７】
ラングミュア１：１モデル：
【０１６８】
【化１】
リガンド濃度の低下速度：
【０１６９】
【化２】
生成物濃度の増加速度：
【０１７０】
【化３】
【０１７１】
【化４】
結果：
Ｐｈ２（配列番号３）とＩＬ４ｒαとの間、およびＰｈ３（配列番号１）とＩＬ４ｒαとの間の結合を試験した。結果をそれぞれ図８および１１に示す。
【０１７２】
参考文献
【０１７３】
【化５】
【０１７４】
【化６】
【０１７５】
【化７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインインターロイキン４（ＩＬ−４）に由来する小ペプチドであって、ＩＬ−４受容体に結合することおよびマクロファージ活性化を阻害すること、それによって炎症性応答の開始を阻止することができる小ペプチドに関する。本発明は、ＩＬ−４が顕著な役割を演ずる様々な病的状態を治療する医薬の生産のための、前記ペプチドの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症に関連する異常は、様々なヒト疾患の基礎をなす、大きな、無関係な障害群を含む。炎症に関連する障害の例には、喘息、慢性炎、および関節リウマチを含む自己免疫疾患が含まれる。慢性炎は、同時並行の活動性炎症、組織破壊および修復の試みを特徴とする病的状態である。関節リウマチ（ＲＡ）は、免疫系が関節を攻撃して、炎症（関節炎）および破壊を引き起こす原因になる、慢性、全身性の自己免疫障害である。それは、一部の器官、例えば肺および皮膚に損傷を与えることもできる。それは、機能および運動性の実質的な喪失をもたらすこともある、障害性および疼痛性の状態となることがある。それは、血液検査（特にリウマチ因子と呼ばれる検査）およびＸ線で診断される。
【０００３】
自己免疫疾患で観察される炎症性反応は、細胞性プレーヤーおよび可溶性プレーヤーの両方を含む。ＲＡの原因は、未知である。それは、様々な細胞、サイトカインおよび酵素の複雑な相互作用を含む。本疾患は、刺激性の抗原が関節に接して、免疫応答を誘発するときに始まる。抗原性の刺激は、ＣＤ４＋リンパ球（Ｔ細胞）を活性化する。ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化されると、マクロファージ、Ｂ細胞、線維芽細胞、軟骨細胞および破骨細胞の刺激を含む生物学的事象の複雑なカスケードが起こる。活性化マクロファージは、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などのサイトカインを分泌する（非特許文献１）。
【０００４】
インターロイキン４（ＩＬ−４）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ２細胞）によって分泌される。それは多面的サイトカインであり、様々な細胞型および組織に作用する。免疫細胞へのその作用は、Ｂ細胞の活性化および増殖、ＩｇＧおよびＩｇＥ生成、ＭＨＣクラスＩＩ誘導、Ｔ細胞の増殖および生存、Ｔｈ２分化、肥満細胞増殖の強化、ＮＫ細胞におけるＩＬ−２およびＩＬ−１２誘導のインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）分泌の強化、単球およびＭｏ由来樹状細胞におけるＣ５ａおよびＣ３ａの下方制御、ならびにマクロファージ活性化の阻害をもたらす（非特許文献２；非特許文献３；Ｒｏｌａｎｄ、２００３年）。
【０００５】
組換えヒトＩＬ−４の構造は、いくつかの研究室でＮＭＲおよびＸ線回折の両方法で決定された。それは、古典的な４ヘリックス束サイトカイン構造を有する（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９５年）。ＩＬ−４は、他のサイトカインのように、細胞表面の受容体への結合によってその生物学的な活性を発揮する。ある受容体複合体は、２つの成分、ＩＬ−４Ｒα鎖（ＩＬ−４Ｒα）およびＩＬ−２Ｒγ鎖（γｃ、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１によって共有される）によって構成され、Ｉ型ＩＬ−４Ｒと表され、一方、他の受容体複合体は、ＩＬ−４ＲαおよびＩＬ１３α鎖（ＩＬ−１３Ｒα１）によって構成され、ＩＩ型ＩＬ−４Ｒと呼ばれる。γｃはほとんどの造血細胞および免疫細胞で発現されるので、ＩＬ−４は、Ｉ型ＩＬ−４Ｒを通してこれらの細胞に作用すると推定される。対照的に、ＩＬ−１３Ｒα１の発現は、造血細胞および免疫細胞の中では、Ｂ細胞などの一部の系統に限定されているが、非免疫細胞では遍在的に検出される（Ｉｚｕｈａｒａら、２００２年）。したがって、ＩＬ４は、ＩＩ型ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒを通して非免疫細胞に作用する。
【０００６】
その受容体α鎖（ＩＬ−４Ｒα）へのＩＬ−４の結合は、Ｔｈ２支配下の初期免疫応答の生成のための重要な事象である。ヒトＩＬ−４とＩＬ４−ＢＰ間の中間複合体の結晶構造は、２．３Å分解能で決定された（ＰＤＢ ＩＤ：１ＩＡＲ）。それは、２つのタンパク質の新規空間配向性、受容体に結合したＩＬ−４の小さいが予想外の立体配置的変化、およびトランス相互作用残基の３つの別々のクラスターとの界面を明らかにする（Ｈａｇｅら、１９９９年）。Ｉｌ４−Ｉｌ４ｒ共通のガンマ三元複合体の結晶構造が、最近解析された（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＰＬ；ＬａＰｏｒｔｅら、２００８年）。
【０００７】
組換えＩＬ−４は、いくつかの臨床試験を経ている。ＩＬ−４は、乾癬患者で有益であり、免疫機能のアンバランスを効果的に修正することが示された（Ｍａｒｔｉｎ ２００３年）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の組換えヒトインターロイキン４（ｒｈｕＩＬ−４）の安全性および耐容性は、様々な悪性腫瘍を有するヒト患者の第Ｉ相および第ＩＩ相試験で評価されている。臨床試験は、ｒｈｕＩＬ−４の皮下投与が５μｇ／ｋｇ／日という高用量で、さらに週３回の投与の場合には１０μｇ／ｋｇという高用量で、安全であり、かつ良好な耐容性を示すことを証明している。カニクイザルでの前臨床安全性試験は、ｒｈｕＩＬ−４による毎日の反復投与の後にいくつかの有害作用を証明したが、ヒト患者では類似した影響は一般に観察されていない（Ｌｅａｃｈら、１９９７年）。最も一般的な毒性は、肝臓機能検査値の上昇、吐き気／嘔吐／下痢、倦怠感／疲労、浮腫、頭痛、筋痛／関節痛および発熱／悪寒であった。有望な前臨床の増殖阻害性および免疫調節性の効果にもかかわらず、この用量およびスケジュールのＩＬ−４は、低い抗腫瘍活性しか示さなかった（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、１９９８年）。
【０００８】
多くのヒト自己免疫疾患および炎症性疾患は、今でもコルチコステロイドと一般免疫抑制剤との組合せによって治療される。これらの疾患の病因のより深い理解は、より特異的である療法をもたらしている。これらの中で、組換えヒト化タンパク質は、将来の療法とみなされている。しかし、組換えタンパク質に基づく薬剤は、高い生産費、大きいバッチ間変動および保存中の変性を含むいくつかの欠点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＦＯ， Ｓｉｃａ Ａ， Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ， Ｌｏｃａｔｉ Ｍ． Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．（２００８）１３、４５３〜６１
【非特許文献２】Ａｇｎｅｌｌｏ Ｄ， Ｌａｎｋｆｏｒｄ ＣＳ， Ｂｒｅａｍ Ｊ， Ｍｏｒｉｎｏｂｕ Ａ， Ｇａｄｉｎａ Ｍ， Ｏ’Ｓｈｅａ ＪＪ， Ｆｒｕｃｈｔ ＤＭ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ： ｎｅｗ ｐｌａｙｅｒｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）２３， １４７〜６１
【非特許文献３】Ｓｚｅｇｅｄｉ Ａ， Ａｌｅｋｓｚａ Ｍ， Ｇｏｎｄａ Ａ， Ｉｒｉｎｙｉ Ｂ， Ｓｉｐｋａ Ｓ， Ｈｕｎｙａｄｉ Ｊ， Ａｎｔａｌ−Ｓｚａｌｍaｓ Ｐ． Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｒａｔｅ ｏｆ Ｔｈｅｌｐｅｒ１ （Ｔ（Ｈ）１） ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．（２００３）８６， ２７７〜８０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、化学的に合成して、ＩＬ−４の機能的模倣薬として用いることができるＩＬ−４の断片に関する。
【００１１】
本発明は、ＩＬ−４由来の多くとも３５個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも７０％同一である変異体からなる単離ペプチドを含む化合物に関する。そのようなアミノ酸配列を含む化合物は、本発明によると、ｉ）ＩＬ−４受容体に結合すること、ｉｉ）炎症性応答を阻害すること、ｉｉｉ）マクロファージ活性化を阻害すること、ｉｉｉ）Ｂ細胞を活性化すること、ｉｖ）Ｔ細胞の増殖および生存を活性化すること、ｖ）単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御すること、ｖｉ）ＩＬ−４受容体の活性を調節することが可能である。
【００１２】
したがって、本発明の別の態様は、本発明の化合物の医薬としての使用、および状態または疾患の治療のための医薬の調製のための使用に関し、ｉ）ＩＬ−４受容体に結合すること、ｉｉ）炎症性応答を阻害すること、ｉｉｉ）マクロファージ活性化を阻害すること、ｉｉｉ）Ｂ細胞を活性化すること、ｉｖ）Ｔ細胞の増殖および生存を活性化すること、ｖ）単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御すること、ｖｉ）ＩＬ−４受容体の活性を調節することは、前記治療の一部である。
【００１３】
さらに、別の態様では、本発明のペプチドまたは前記ペプチドを含む化合物は、抗体の生成のために用いてもよい。そのような抗体は、本発明のペプチド中のエピトープに結合する。
【００１４】
本発明は、本発明のペプチド、または本発明のペプチド中のエピトープを認識することができる抗体を含む医薬組成物にさらに関する。
【００１５】
本発明は、ｉ）ＩＬ−４受容体に結合すること、ｉｉ）炎症性応答を阻害すること、ｉｉｉ）マクロファージ活性化を阻害すること、ｉｉｉ）Ｂ細胞を活性化すること、ｉｖ）Ｔ細胞の増殖および生存を活性化すること、ｖ）単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御すること、ｖｉ）ＩＬ−４受容体の活性を調節することが有益である状態の治療法であって、本発明の化合物、本発明の抗体、または前記ペプチド配列、前記化合物もしくは前記抗体を含む医薬組成物を、必要とする個体に投与するステップを含む方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＩＬ−４Ｒαの外部ドメインと複合体形成したＩＬ−４の構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＩＡＲ）を示す図である。ペプチド１（配列番号２）（左）およびペプチド３（配列番号３）（右）の位置を、灰色で示す。
【図２】図２は、ＩＬ−４Ｒαの外部ドメインと複合体形成したＩＬ−４の構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＩＡＲ）を示す図である。ペプチド３ａ（配列番号１）（左）およびペプチド４（配列番号４）（右）の位置を、灰色で示す。
【図３】図３は、γｃ共通受容体の外部ドメインと複合体形成したＩＬ−４の構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＰＬ）を示す図である。ペプチド１（配列番号２）（左）およびペプチド３（配列番号３）（右）の位置を、灰色で示す。
【図４】図４は、ＩＬ−４Ｒαおよびγｃ共通受容体の外部ドメインと複合体形成したＩＬ−４の構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＰＬ）を示す図である。ペプチド３ａ（配列番号１）（左）およびペプチド４（配列番号４）（右）の位置を、灰色で示す。
【図５】図５は、小脳顆粒ニューロン（ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｎｅｕｒｏｎ）の培養での神経突起成長に対するＩＬ−４由来のペプチドＰｈ１（配列番号２）の効果を示す図である。Ｐ２ｄペプチドを、陽性対照として用いた（Ｓｏｒｏｋａら、２００２年を参照）。
【図６】図６は、小脳顆粒ニューロンの培養での神経突起成長に対するＰｈ２（配列番号３）の効果を示す図である。対照と比較した有意水準を以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。７回の独立した実験を実施した。
【図７】図７は、Ｐｈ２（配列番号３）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ２で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプの棒）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白い棒）、または１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒い棒）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（白い棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ２で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（０の棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。両図面の結果は、ＩＦＮ−γによって活性化されただけの未処置対照に対する割合（％）として示す。６回の独立した実験からの結果を、対照についてと、Ｐｈ２濃度９、２７、８１および２４３μｇ／ｍｌについて示す。
【図８】図８は、ＩＬ４ｒαへのＰｈ２（配列番号３）の結合を示す図である。表面プラズモン共鳴の適用による結合試験。Ａ：対照として、ＩＬ４とＩＬ４ｒαとの間の結合を、ＩＬ４ｒαをチップ上に固定し、次にＩＬ４を溶液中のチップの上に流すことによって調査した。Ｂ：Ｐｈ２とＩＬ４ｒαとの間の結合を、Ｐｈ２をチップ上に固定し、ＩＬ４ｒαを溶液中のチップの上に流すことによって調査した。結果を分析し、ＫＤをコンピュータソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎで計算した。
【図９】図９は、小脳顆粒ニューロンの培養での神経突起成長に対するＰｈ３（配列番号１）の効果を示す図である。対照と比較した有意水準を以下のように表す：＊＊＝ｐ＜０．０１。７回の独立した実験を実施した。
【図１０】図１０は、Ｐｈ３（配列番号１）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ３で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプの棒）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白い棒）、または１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒い棒）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（白い棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ３で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（０の棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。両図面の結果は、ＩＦＮ−γによって活性化されただけの未処置対照に対する割合（％）として示す。６回の独立した実験からの結果を、対照についてと、Ｐｈ３濃度９、２７および８１μｇ／ｍｌについて示す。
【図１１】図１１は、ＩＬ４ｒαへのＰｈ３（配列番号１）の結合を示す図である。表面プラズモン共鳴の適用による結合試験。Ａ：対照として、ＩＬ４とＩＬ４ｒαとの間の結合を、ＩＬ４ｒαをチップ上に固定し、次にＩＬ４を溶液中のチップの上に流すことによって調査した。Ｂ：Ｐｈ３とＩＬ４ｒαとの間の結合を、Ｐｈ３をチップ上に固定し、ＩＬ４ｒαを溶液中のチップの上に流すことによって調査した。結果を分析し、ＫＤをコンピュータソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎで計算した。
【図１２】図１２は、小脳顆粒ニューロンの培養での神経突起成長に対するＰｈ４（配列番号４）の効果を示す。対照と比較した有意水準を以下のように表す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。５回の独立した実験を実施した。
【図１３】図１３は、Ｐｈ５（配列番号５）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ４で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプ）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白色）、および１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒色）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に９μｇ／ｍｌのＰｈ５で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。２回の独立した実験を実施した。
【図１４】図１４は、Ｐｈ６（配列番号６）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ４で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプ）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白色）、および１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒色）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ６で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。２回の独立した実験を実施した。
【図１５】図１５は、Ｐｈ８（配列番号１）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ３で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプの棒）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白い棒）、または１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒い棒）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（白い棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ８で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（０の棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＊＝ｐ＜０．００１。両図面の結果は、ＩＦＮ−γによって活性化されただけの未処置対照に対する割合（％）として示す。６回の独立した実験からの結果を、対照についてと、Ｐｈ８濃度９、２７、８１および２４３μｇ／ｍｌについて示す。
【図１６】図１６は、Ｐｈ１０（配列番号１）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ１０で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプの棒）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白い棒）、または１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒い棒）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（白い棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＝ｐ＜０．０１。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ１０で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。非前処置の活性化マクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量（０の棒）と比較した有意水準を、以下のように表す：＊＊＝ｐ＜０．０１。両図面の結果は、ＩＦＮ−γによって活性化されただけの未処置対照に対する割合（％）として示す。４回の独立した実験からの結果を、対照についてと、Ｐｈ１０濃度９、２７、８１および２４３μｇ／ｍｌについて示す。濃度５４μｇ／ｍｌのＰｈ１０では２つの実験だけしか実施されなかったので、これらのデータは統計分析に含まれなかった。
【図１７】図１７は、Ｐｈ１２（配列番号１９）で前処置したときのマクロファージによるＴＮＦ−αの分泌を示す図である。Ａ：Ｐｈ１２で前処置せず、ＩＦＮ−γによって活性化しなかったとき（ストライプ）、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（白色）、および１００μＭヒドロコルチゾンで前処置し、０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γで活性化したとき（黒色）のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。Ｂ：０．０１μｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γによる活性化の前に様々な濃度のＰｈ１２で前処置したときのマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの量の棒グラフ。２回の独立した実験を実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明による化合物は、インターロイキン４に由来する断片であってもよく、あるいは、天然もしくは組換えのインターロイキン４変異体などのインターロイキン４の変異体、例えば選択的スプライシングによって生成されるインターロイキン４変異体、または遺伝的多型、または任意の種類の組換えインターロイキン４に由来することができる。
【００１８】
本発明によるペプチドは、ＩＬ−４受容体と相互作用すること、ＩＬ−４受容体シグナル伝達を調節すること、Ｂ細胞を活性化すること、Ｔ細胞の増殖および生存を活性化すること、単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御すること、またはマクロファージ活性化を阻害することができるペプチドである。
【００１９】
用語「調節」または「調節すること」は、変化、例えば阻害または刺激を意味する。用語「相互作用する」は、ペプチドとＩＬ−４受容体との間の、影響を引き起こす結合などの作用を意味する。
【００２０】
アミノ酸配列
本発明による化合物は、ＩＬ−４またはその断片もしくは変異体に由来する連続するアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
【００２１】
一実施形態では、本発明による化合物は、インターロイキン４（配列番号３８）もしくはその断片に由来する多くとも３５個の連続するアミノ酸、または配列番号３８もしくはその断片と少なくとも７０％同一である変異体からなるペプチドを含むことができる。
【００２２】
ヒトＩＬ−４前駆体のアミノ酸配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０５１１２）は、以下の通りである：
ＭＧＬＴＳＱＬＬＰＰ ＬＦＦＬＬＡＣＡＧＮ ＦＶＨＧＨＫＣＤＩＴ ＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳ ＬＴＥＱＫＴＬＣＴＥ
ＬＴＶＴＤＩＦＡＡＳ ＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣ ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹ ＳＨＨＥＫＤＴＲＣＬ ＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨ
ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬ ＤＲＮＬＷＧＬＡＧＬ ＮＳＣＰＶＫＥＡＮＱ ＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬ ＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫ ＣＳＳ
（配列番号３８）。
【００２３】
本発明によるペプチド配列は、多くとも３５個の連続するアミノ酸残基、例えば３〜３５アミノ酸残基、例えば３〜３０、例えば３〜２５、例えば５〜２５、例えば７〜２５、例えば８〜２５、例えば１０〜２５、または１２〜２５、例えば１４〜２５個からなる。５〜２５個の連続するアミノ酸残基を含む配列が好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明の前記ペプチドは、ＩＬ−４のαヘリックスに由来する多くとも３５個の連続するアミノ酸を含む。
【００２５】
用語「αヘリックス」は、タンパク質の二次構造での共通モチーフを意味し、アルファヘリックス（αヘリックス）は右巻きまたは左巻きの立体構造であり、そこにおいてすべての骨格Ｎ−Ｈ基は、４残基前のアミノ酸の骨格Ｃ＝Ｏ基に水素結合を供与する。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の前記ペプチドは、式
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する配列を含み、式中、
Ｘ１はＬであり、
Ｘ２は、Ｉ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、または荷電アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｑ、Ｔまたは荷電アミノ酸である。
【００２７】
好ましい一実施形態では、Ｘ２はＩまたはＱである。
【００２８】
より好ましい実施形態では、Ｘ２はＩである。
【００２９】
別のより好ましい実施形態では、Ｘ２はＱである。
【００３０】
好ましい一実施形態では、Ｘ２は荷電アミノ酸である。
【００３１】
好ましい実施形態では、Ｘ３は荷電アミノ酸である。
【００３２】
より好ましい実施形態では、Ｘ３はＲまたはＥである。
【００３３】
最も好ましい一実施形態では、Ｘ３はＲである。
【００３４】
別のより好ましい実施形態では、Ｘ３はＥである。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、Ｘ３はＱまたはＴである。
【００３６】
さらにより好ましい実施形態では、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＩであり、Ｘ３はＲである。
【００３７】
別のさらにより好ましい実施形態では、Ｘ１はＬである、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＥである。
【００３８】
最も好ましい実施形態では、本発明の前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ 配列番号１
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ 配列番号２
ＡＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＧ 配列番号３
ＡＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＳ 配列番号４
ＬＱＥＩＫＴＬＮ 配列番号５
ＫＲＬＱＱＮＬＦＧＧ 配列番号６
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ 配列番号７
ＱＥＩＩＫＫＬ 配列番号８
ＡＩＱＮＱＥＥＩＫＹＬＮＳ 配列番号９
ＡＩＩＬＱＥＩ 配列番号１０
ＩＶＬＱＥＩＩ 配列番号１１
ＴＬＧＥＩＩＫＧＶＮＳ 配列番号１２
ＶＴＬＩＤＨＳＥＥＩＦＫＴＬＮ 配列番号１３
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ 配列番号１４
ＲＬＤＲＥＮＶＡＶＹＮＬＷ 配列番号１５
ＬＲＳＬＤＲＮＬ 配列番号１６
ＲＬＬＲＬＤＲＮ 配列番号１７
ＲＦＬＫＲＹＦＹＮＬＥＥＮＬ 配列番号１８
ＲＮＫＱＶＩＤＳＬＡＫＦＬＫＲ 配列番号１９
ＲＨＫＡＬＩＲ 配列番号２０
ＫＫＬＩＲＹＬＫ 配列番号２１
ＲＨＫＴＬＩＲ 配列番号２２
ＭＱＤＫＹＳＫＳ 配列番号２３
ＡＥＲＶＫＩＥＱＲＥＹＫＫＹＳ 配列番号２４
ＳＱＬＩＲＦＬＫＲＬＡ 配列番号２５
ＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴ 配列番号２６
ＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＡ 配列番号２７
ＴＥＫＥＶＬＲＱＦＹＳＡ 配列番号２８
ＫＴＬＴＥＬＴＫＴＬＮＳ 配列番号２９
ＡＨＫＥＩＩＫＴＬＮＳＬＱＫＡ 配列番号３０
ＡＫＴＬＳＴＥＬＴＶＴＡ 配列番号３１
ＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＡ 配列番号３２
ＮＥＥＲＬＫＴＩＭＲＡ 配列番号３３
ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＲ 配列番号３４
ＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴ 配列番号３５
ＡＨＲＨＫＱＬＩＲＡ 配列番号３６
ＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＡ 配列番号３７
の１つ、またはその変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００３９】
一実施形態では、本発明の前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号１）
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号７）
ＲＨＫＡＬＩＲ （配列番号２０）
ＫＫＬＩＲＹＬＫ （配列番号２１）
ＲＨＫＴＬＩＲ （配列番号２２）
ＳＱＬＩＲＦＬＫＲＬＡ （配列番号２５）
ＡＨＲＨＫＱＬＩＲＡ （配列番号３６）
の１つ、またはその変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４０】
一実施形態では、本発明の前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ （配列番号２）
ＬＱＥＩＫＴＬＮ （配列番号５）
ＡＩＩＬＱＥＩ （配列番号１０）
ＩＶＬＱＥＩＩ （配列番号１１）
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ （配列番号１４）
ＡＨＫＥＩＩＫＴＬＮＳＬＱＫＡ （配列番号３０）
の１つ、またはその変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４１】
本文脈では、アミノ酸残基の標準の１文字コードに加えて、標準の３文字コードを適用する。アミノ酸の略記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８４年、１８４巻、９〜３７頁の推奨に従う。明細書および請求項全体で、天然のアミノ酸の３文字コードまたは１文字コードを用いる。Ｌ形またはＤ形が指定されていない場合、問題のアミノ酸は天然のＬ形、Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ． ５６巻（５号）５９５〜６２４頁（１９８４年）を参照、またはＤ形を有することを理解すべきであり、したがって形成されるペプチドは、Ｌ形、Ｄ形またはＬ形およびＤ形の混合した配列のアミノ酸によって構成されてもよい。
【００４２】
何も指定されていない場合、本発明による使用のためのペプチドのＣ末端アミノ酸は、遊離のカルボン酸として存在することを理解すべきであり、これは「−ＯＨ」と指定することもできる。しかし、本発明による使用のためのペプチドのＣ末端アミノ酸はアミド化された誘導体であることができ、それは「−ＮＨ２」と示される。他に明示されていない場合、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸は遊離のアミノ基を含み、これは「Ｈ−」と指定することもできる。
【００４３】
本発明によるペプチド、その断片または変異体は、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含むこともできる。
【００４４】
本発明による好ましいペプチドは、ＩＬ−４の多くとも３５個のアミノ酸残基を含む、単離された連続ペプチド配列である。本発明によるすべてのペプチドは、配列番号１〜３７の配列のいずれかまたはその断片もしくは変異体から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を含むものと理解される。
【００４５】
したがって、本発明の一部の実施形態は、配列番号１〜３７から選択される配列の断片を含むペプチドに関するものでもよい。別の実施形態は、配列番号１〜３７の変異体に関するものでもよい。
【００４６】
一実施形態では、変異体断片は、配列番号３８の断片と比較して異なる。変異体断片は、１つまたは複数の位置に異なるアミノ酸を有することによって、配列番号３８の断片と異なることができる。好ましくは、変異体は最高１０個のアミノ酸位置、より好ましくは最高８個の位置、例えば最高６個の位置、例えば最高５個の位置、例えば４、３、２または１個の位置で配列番号３８の断片と異なる。そのような変異体は、１つまたは複数の化学的改変を有することなど、他の方法で配列番号３８の断片と異なることもできる。
【００４７】
配列番号１〜３８の配列から選択されるアミノ酸配列の本発明による変異体は、以下であることができる。
【００４８】
ｉ） 選択された配列と少なくとも７０％の同一性、例えば７１〜７５％の同一性、例えば７６〜８０％の同一性、例えば８１〜８５％の同一性、例えば８６〜９０％の同一性、例えば９１〜９５％の同一性、例えば９６〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列であって、同一性は、それを選択された配列と照合したときの前記配列中の同一のアミノ酸の割合と定義される。アミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＯＳＵＭ ３０、ＢＬＯＳＵＭ ４０、ＢＬＯＳＵＭ ４５、ＢＬＯＳＵＭ ５０、ＢＬＯＳＵＭ ５５、ＢＬＯＳＵＭ ６０、ＢＬＯＳＵＭ ６２、ＢＬＯＳＵＭ ６５、ＢＬＯＳＵＭ ７０、ＢＬＯＳＵＭ ７５、ＢＬＯＳＵＭ ８０、ＢＬＯＳＵＭ ８５またはＢＬＯＳＵＭ ９０などの周知のアルゴリズムを用いて計算することができる。
【００４９】
ｉｉ） 選択された配列と少なくとも７０％の正のアミノ酸マッチ、例えば７１〜８０％の正のアミノ酸マッチ、例えば８１〜８５％の正のアミノ酸マッチ、例えば８６〜９０％の正のアミノ酸マッチ、例えば９１〜９５％の正のアミノ酸マッチ、例えば９６〜９９％の正のアミノ酸マッチを有するアミノ酸配列であって、正のアミノ酸マッチは、類似した物理的および／または化学的特性を有するアミノ酸残基の、２つの比較した配列の同じ位置での存在と定義される。本発明の好ましい正のアミノ酸マッチは、ＫとＲ、ＥとＤ、ＬとＭ、ＱとＥ、ＩとＶ、ＩとＬ、ＡとＳ、ＹとＷ、ＫとＱ、ＳとＴ、ＮとＳおよびＱとＲである。
【００５０】
ｉｉｉ） 選択された配列と同一であるか、または前記配列と少なくとも７０％の同一性、例えば７１〜８０％の同一性、例えば８１〜８５％の同一性、例えば８６〜９０％の同一性、例えば９１〜９５％の同一性、例えば９６〜９９％の同一性を有するか、または選択された配列と少なくとも７５％の正のアミノ酸マッチ、例えば７６〜８０％の正のアミノ酸マッチ、例えば８１〜８５％の正のアミノ酸マッチ、例えば８６〜９０％の正のアミノ酸マッチ、例えば９１〜９５％の正のアミノ酸マッチ、例えば９６〜９９％の正のアミノ酸マッチを有し、他の化学部分、例えばホスホリル、硫黄、アセチル、グリコシル部分を含むアミノ酸配列。
【００５１】
用語「ペプチド配列の変異体」は、ペプチド配列が、例えばアミノ酸残基の１つまたは複数の置換によって改変されてもよいことも意味する。Ｌアミノ酸およびＤアミノ酸の両方を用いることができる。他の改変は、エステル、糖などの誘導体、例えばメチルおよびアセチルエステル、ならびにポリエチレングリコール改変を含むことができる。
【００５２】
さらに、ペプチドのアミン基は、アミドの酸部分が脂肪酸であるアミドに変換されてもよい。
【００５３】
別の態様では、本発明によるアミノ酸配列の変異体は、同じ変異体もしくはその断片の中に、または異なる変異体もしくはその断片の間で、少なくとも１つの置換、例えばお互いに独立に導入される複数の置換を含むことができる。複合体の変異体、またはその断片は、したがってお互いに独立に保存的置換を含むことができ、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのアラニン（Ａｌａ）は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのバリン（Ｖａｌ）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＬｅｕおよびＩｌｅ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのロイシン（Ｌｅｕ）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＩｌｅ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのイソロイシン（Ｉｌｅ）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＬｅｕ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのアスパラギン酸（Ａｓｐ）は、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのアスパラギン（ａｓｐａｒｇｉｎｅ）（Ａｓｎ）は、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）は、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏからなるアミノ酸の群から選択され、好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのチロシン（Ｔｙｒ）は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰｈｅおよびＴｒｐ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記断片の少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）は、ＬｙｓおよびＨｉｓ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのリジン（Ｌｙｓ）は、ＡｒｇおよびＨｉｓ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのプロリン（Ｐｒｏ）は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＨｉｓ、ならびにそれとは独立に変異体またはその断片からなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、前記変異体またはその断片の少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換される。
【００５４】
したがって上記から、ペプチド断片の同じ変異体または前記変異体の断片は、本明細書の上で定義される保存的アミノ酸の複数の群からの複数の保存的アミノ酸置換を含むことができることがわかる。用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書で用語「同種のアミノ酸置換」と同義で用いられる。
【００５５】
保存的アミノ酸の群は、以下の通りである。
Ａ、Ｇ（中性、弱疎水性）、
Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ（親水性の、非荷電）
Ｅ、Ｄ（親水性、酸性）
Ｈ、Ｋ、Ｒ（親水性、塩基性）
Ｌ、Ｐ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ（疎水性、芳香族）
Ｃ（架橋形成性） 。
【００５６】
保存的置換は、本発明による使用のための好ましい所定のペプチドまたはその断片の、任意の位置に導入されてもよい。しかし、非保存的置換、特に、それに限定されないが、任意の１つまたは複数の位置に非保存的置換を導入することが望ましいこともある。
【００５７】
本発明による使用のためのペプチドの変異体断片の形成をもたらす非保存的置換は、例えば極性が相当異なり、例えば無極性側鎖を有する残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＭｅｔ）が、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎもしくはＧｌｎなどの極性側鎖を有する残基、またはＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇもしくはＬｙｓなどの荷電アミノ酸を置換し、または荷電したもしくは極性の残基で無極性のものを置換し、ならびに／あるいはｉｉ）別の残基によるＰｒｏもしくはＧｌｙの置換またはＰｒｏもしくはＧｌｙへの置換などのように、ペプチド骨格の配向性に及ぼすその影響が相当異なり、ならびに／あるいはｉｉｉ）例えばＧｌｕまたはＡｓｐなどの負荷電残基のＬｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇなどの正荷電残基に対する置換（および、その逆）のように、電荷が相当異なり、ならびに／あるいはｉｖ）例えばＨｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒなどのかさ高い残基のより小さな側鎖を有するもの、例えばＡｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒに対する置換（および、その逆）のように、立体的なかさが相当異なる。
【００５８】
一実施形態では、アミノ酸の置換は、それらの疎水性および親水性の値、ならびに電荷、サイズなどを含むアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性に基づいて加えることができる。
【００５９】
本発明によるペプチドは、ＩＬ−４受容体と相互作用することができるペプチドである。
【００６０】
一実施形態では、本発明によるペプチドは、ＩＬ−４受容体シグナル伝達を調節することができる。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、ＩＬ−４シグナル伝達を刺激することができる。別の好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、ＩＬ−４受容体シグナル伝達を阻害することができる。
【００６２】
別の実施形態では、本発明によるペプチドは、Ｂ細胞を活性化することができる。
【００６３】
さらなる実施形態では、本発明によるペプチドは、Ｔ細胞の増殖および生存を活性化することができる。
【００６４】
別の実施形態では、本発明によるペプチドは、単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御することができる。
【００６５】
さらに別の実施形態では、本発明によるペプチドは、マクロファージ活性化を阻害することができる。
【００６６】
本発明によるアミノ酸配列の断片および変異体の両方は、前記配列の機能的同等物である。
【００６７】
本文脈で、アミノ酸配列の「機能的同等物」という用語は、上記の前記アミノ酸配列の変異体または断片の基準を満たし、前記配列または前記配列を含む化合物の１つまたは複数の機能的活性が可能な分子を意味する。好ましい実施形態では、本発明によるアミノ酸配列の機能的同等物は、ＩＬ−４受容体と相互作用して、ＩＬ−４受容体シグナル伝達を調節することができる。
【００６８】
本発明は、本発明による単離されたペプチドおよび本発明によるペプチドを含む融合タンパク質の両方に関する。
【００６９】
一実施形態では、本発明によるペプチドは、単離されたペプチドである。用語「単離されたペプチド」は、本発明によるペプチドが個々の化合物であって、別の化合物の一部でないことを意味する。単離されたペプチドは、任意の組換え技法または化学合成の使用によって生成すること、および他の化合物から分離することができ、または、それは酵素的切断もしくは化学的切断の方法によってより長いポリペプチドもしくはタンパク質から分離すること、および他のタンパク質断片からさらに分離することができる。
【００７０】
ペプチド配列は、単一コピーとして、すなわちペプチド配列の単量体として製剤化されて化合物に存在することができ、または、それは同じ配列のいくつかのコピーとして、例えば配列番号１〜３７から選択される配列の２つ以上のコピー、または前記配列の断片もしくは変異体の２つ以上のコピーを含む多量体として存在することができる。
【００７１】
別の実施形態では、本発明による単離されたペプチドは、配列番号１〜３７またはその変異体から選択される、インターロイキン４に由来する連続するアミノ酸配列からなるインターロイキン４の断片を含むことができる。別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１〜３７の配列の１つまたは複数からなることができる。
【００７２】
ペプチド配列の生成
本発明のペプチド配列は、任意の従来の合成法、組換えＤＮＡ技術、ペプチド配列が由来する完全長タンパク質の酵素的切断、または前記方法の組合せによって調製することができる。
【００７３】
合成調製物
ペプチドの合成的生成の方法は、当技術分野で周知である。合成ペプチドを生成するための詳細な説明ならびに実際的なアドバイスは、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒａｎｔ Ｇ． Ａ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００２年、またはＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＦｒｏｋｊａｅｒおよびＨｏｖｇａａｒｄ編、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ、１９９９年で見ることができる。
【００７４】
例えばペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いて、およびＡｃｍ保護システインで合成することができる。逆相ＨＰＬＣによる精製の後、例えば環状の、またはＣ末端もしくはＮ末端が改変されたアイソフォームを得るために、ペプチドをさらに処理することができる。環化および末端改変のための方法は当技術分野で周知であり、上で引用したマニュアルで詳細に記載されている。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明のペプチド配列は、合成的に、特にＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＡＰＳ）法によって生成される。
【００７６】
ペプチドは、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器でバッチ式に、または、側鎖官能基のためのＮ−ａ−アミノ保護基および適する共通保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を用いる、完全自動化ペプチドシンセサイザー上でのポリアミド固相法（Ｄｒｙｌａｎｄ， Ａ．およびＳｈｅｐｐａｒｄ， Ｒ．Ｃ．、（１９８６年）Ｊ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． Ｉ、１２５〜１３７頁）の連続フローバージョンで合成することができる。
【００７７】
組換え調製物
したがって、一実施形態では、本発明のペプチドは組換えＤＮＡ技術を用いて生成される。
【００７８】
ペプチドまたはそのペプチドが由来する対応している完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、確立された標準の方法、例えばＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２２巻：１８５９〜１８６９頁によって記載されるホスホアミジン（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｎｅ）法、またはＭａｔｔｈｅｓら、１９８４年、ＥＭＢＯ Ｊ． ３巻：８０１〜８０５頁によって記載される方法によって、合成的に調製することができる。ホスホアミジン法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーで合成され、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適するベクターにクローニングされる。
【００７９】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、標準のプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第２版、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ、１９８９年）に従ってＤＮＡアーゼＩを用いて、ペプチド起源の対応する完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列の断片化によって調製することもできる。本発明は、上で特定されるタンパク質の群から選択される完全長タンパク質に関する。あるいは、本発明の完全長タンパク質をコードするＤＮＡは、特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて断片化することができる。ＤＮＡの断片は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第２版、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ、１９８９年に記載の標準手順を用いてさらに精製される。
【００８０】
完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ゲノム起源またはｃＤＮＡ起源でもよく、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準手法に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによって完全長タンパク質のすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることによって得られる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９年を参照）。ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号またはＳａｉｋｉら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：４８７〜４９１頁に記載の特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
【００８１】
ＤＮＡ配列は、都合よく組換えＤＮＡ手順にかけることができる任意のベクターであってもよい組換え発現ベクターに次に挿入される。ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞にしばしば依存する。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製は染色体複製に依存しない染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミドであることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってもよい。
【００８２】
ベクターでは、ペプチドまたは完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適するプロモーター配列に作動可能に連結されるべきである。プロモーターは、選択された宿主細胞で転写活性を示し、宿主細胞と同種または異種であるタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい、任意のＤＮＡ配列であることができる。哺乳動物の細胞でコードＤＮＡ配列の転写を指示するのに適するプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、１９８１年、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １巻：８５４〜８６４頁）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２巻：８０９〜８１４頁）またはアデノウイルス２主要後期プロモーターである。昆虫細胞で用いるのに適するプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター（Ｖａｓｕｖｅｄａｎら、１９９２年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３１１巻：７〜１１頁）である。酵母宿主細胞で用いるのに適するプロモーターには、酵母糖分解遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８０年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５巻：１２０７３〜１２０８０頁、ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、１９８２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １巻：４１９〜４３４頁）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇら、１９８２年、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）からのプロモーター、またはＴＰＩ１（米国特許第４，５９９，３１１号）もしくはＡＤＨ２−４ｃ（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ ３０４巻：６５２〜６５４頁）プロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞で用いるのに適するプロモーターは、例えばＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、１９８５年、ＥＭＢＯ Ｊ． ４巻：２０９３〜２０９９年）またはｔｐｉＡプロモーターである。
【００８３】
コードＤＮＡ配列は、適するターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、前掲書）、または（真菌宿主の場合）ＴＰＩ１（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、前掲書）もしくはＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、前掲書）プロモーターに、作動可能に連結されてもよい。ベクターは、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅｌｂ領域から）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの）などのエレメントをさらに含むことができる。
【００８４】
組換え発現ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞で複製することを可能にするＤＮＡ配列をさらに含むことができる。そのような配列の例（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）は、ＳＶ４０複製起点である。ベクターは、選択可能なマーカー、例えばその生成物は宿主細胞の欠損を補う遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子またはネオマイシン、ハイドロマイシンもしくはメトトレキセートなどの薬剤に対する抵抗性を与えるものを含むこともできる。
【００８５】
ペプチドまたは完全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれライゲーションして、複製のために必要な情報を含む適するベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は、当分野の技術者に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲書を参照）。
【００８６】
本発明の組換えペプチドを得るために、コードＤＮＡ配列を、第二のペプチドコード配列およびプロテアーゼ切断部位コード配列と有効に融合させ、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を与えることができ、そこで、プロテアーゼ切断部位コード配列は、ＨＢＰ断片と第二のペプチドコードＤＮＡとの間に位置し、組換え発現ベクターに挿入され、組換え宿主細胞で発現される。一実施形態では、前記第二のペプチドは、それらに限定されないが、グルタチオン−Ｓ−レダクターゼ、子ウシサイモシン、細菌チオレドキシンまたはヒトユビキチンの天然もしくは合成変異体、またはそのペプチドを含む群から選択される。別の実施形態では、プロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列は、アミノ酸配列ＩＥＧＲ、エンテロキナーゼ、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ、トロンビン、アミノ酸配列ＬＶＰＲ／ＧＳを有する第Ｘａ因子、またはアミノ酸配列ＸＫＸを有するＡｃｈａｒｏｍｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ切断部位であることができる。
【００８７】
発現ベクターが導入される宿主細胞は、ペプチドまたは完全長タンパク質の発現が可能である任意の細胞であることができ、好ましくは真核細胞、例えば無脊椎動物（昆虫）の細胞または脊椎動物の細胞、例えばＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞または哺乳動物の細胞、特に昆虫および哺乳動物の細胞である。適する哺乳動物細胞系の例は、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ＣＯＳ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）またはＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）細胞系である。哺乳動物細胞をトランスフェクトして、細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９巻、１９８２年、６０１〜６２１頁、ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、１９８２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １巻：３２７〜３４１頁、Ｌｏｙｔｅｒら、１９８２年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９巻：４２２〜４２６頁、Ｗｉｇｌｅｒら、１９７８年、Ｃｅｌｌ １４巻：７２５頁、ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、１９８１年、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７巻、６０３頁、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年、Ｖｉｒｏｌ． ５２巻：４５６頁、およびＮｅｕｍａｎｎら、１９８２年、ＥＭＢＯ Ｊ． １巻：８４１〜８４５頁に記載されている。
【００８８】
あるいは、真菌細胞（酵母細胞を含む）を、宿主細胞として用いることができる。適する酵母細胞の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の細胞、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株が含まれる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ種、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの株の細胞である。タンパク質の発現のためのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種の使用は、例えば欧州特許第２３８０２３号に記載されている。
【００８９】
細胞を培養するために用いられる培地は、適当な補助剤を含む血清含有培地もしくは無血清培地などの、哺乳動物細胞の増殖に適する任意の従来の培地、または昆虫、酵母もしくは真菌の細胞の増殖に適する培地であることができる。適する培地は民間の納入業者から入手可能であるか、または公開レシピ（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）に従って調製することができる。
【００９０】
次に、細胞によって組換えで生成されるペプチドまたは完全長タンパク質は、遠心分離またはろ過によって宿主細胞を培地から分離すること、塩、例えば硫安によって上清またはろ液のタンパク性成分を沈殿させること、様々なクロマトグラフィー法、例えばＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を含む従来の方法によって培地から回収することができる。
【００９１】
医薬
本発明の目的は、ＩＬ−４の活性を調節することができる化合物を提供することであり、本発明による前記化合物は、ＩＬ−４シグナル伝達の調節が治療のための必須の条件とみなすことができる疾患の治療のための医薬として用いることができる。
【００９２】
したがって、本発明は、医薬の製造のための、ＩＬ−４由来の配列またはその断片もしくは変異体を含むペプチドの１つまたは複数の使用に関する。
【００９３】
一実施形態では、本発明の医薬は、配列番号１〜３７に示すアミノ酸配列、または前記配列の断片もしくは変異体の少なくとも１つを含む。別の実施形態では、本発明の医薬は、ＩＬ−４のエピトープもしくはその断片に結合することができる抗体、または前記抗体の断片もしくは変異体を含む。
【００９４】
本発明の医薬は、上で定義される化合物の１つまたは複数、または上で定義される化合物を含む組成物の有効量を、薬学的に許容される添加剤と組み合わされて含む。そのような医薬は、経口、経皮、皮下、局所、筋肉内、静脈内、頭蓋内、クモ膜下、脳室内、経鼻（ｎａｓａｌ）、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）または肺内投与（ｐｕｌｍｏｎａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のために、あるいは関節包内またはその近くへの関節内投与（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）で補われる非経口投与のために、適切に製剤化することができる。
【００９５】
一般に、本発明のペプチドに基づく医薬および組成物の製剤開発での戦略は、他の任意のタンパク質に基づく薬品の製剤戦略に対応する。可能性のある問題およびこれらの問題を克服するために必要とされる指針は、いくつかの教科書、例えば「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａ．Ｋ． Ｂａｎｇａ編、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、１９９５年で扱われている。
【００９６】
通常は、注射剤は、液体の溶液または懸濁液、注射の前に液体の溶液または懸濁液にするのに適する固体の形で調製される。調製物は、乳状にされてもよい。有効成分は、薬学的に許容され、有効成分に適合する賦形剤としばしば混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組合せである。さらに、所望により、調製物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助物質、または調製物の有効性もしくは輸送を強化する補助物質を少量含むことができる。
【００９７】
本発明の化合物の製剤は、当分野の技術者に公知である技術によって調製することができる。製剤は、薬学的に許容される担体および賦形剤、例えばマイクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子などを含むことができる。
【００９８】
調製物は、任意選択で有効成分がその効果を発揮する部位に、注射によって好適に投与することができる。他の投与様式に適するさらなる製剤には、坐薬、鼻、肺および、場合によっては経口用の製剤が含まれる。坐薬のために、従来の結合剤および担体には、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。そのような坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲の有効成分（複数可）を含む混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば医薬用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続的放出製剤または粉末の形をとり、一般に、１０〜９５％の有効成分（複数可）、好ましくは２５〜７０％を含有する。
【００９９】
他の製剤は、鼻および肺投与に適するもの、例えば吸入器およびエアゾールである。
【０１００】
活性化合物は、中性または塩の形として製剤化することができる。
【０１０１】
薬学的に許容される塩には、酸付加塩（例えば、ペプチド化合物の遊離アミノ基と形成される）、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などの無機酸と形成される塩、またはギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、サリチル酸ビスメチレン、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸と形成される塩が含まれる。遊離のカルボキシル基で形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【０１０２】
薬学的に許容される無機または有機酸の付加塩のさらなる例には、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． １９７７年、６６巻、２頁に記載の薬学的に許容される塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウムの塩などが含まれる。アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムの塩などが含まれる。
【０１０３】
調製物は、投薬製剤に適合する方法で、および治療的に有効となる量で投与される。投与される量は、例えば対象の体重および年齢を含む治療対象、治療する疾患ならびに疾患の病期によって決まる。適する投薬量範囲は、投与につき通常キロ体重あたり数百μｇ位の有効成分であり、好ましい範囲はキロ体重あたり約０．１μｇ〜５０００μｇである。化合物の単量体形を用いると、適する投薬量は、しばしば、キロ体重あたり０．１μｇ〜５０００μｇの範囲、例えばキロ体重あたり約０．１μｇ〜３０００μｇの範囲、特にキロ体重あたり約０．１μｇ〜１０００μｇの範囲である。化合物の多量体形を用いると、適する投薬量は、しばしば、キロ体重あたり０．１μｇ〜１０００μｇの範囲、例えばキロ体重あたり約０．１μｇ〜７５０μｇの範囲、特にキロ体重あたり約０．１μｇ〜５００μｇの範囲、例えばキロ体重あたり約０．１μｇ〜２５０μｇの範囲である。特に鼻から投与する場合、他の経路で投与するよりも小さな投薬量が用いられる。投与は１回実施することができるか、または以降の投与が続くことができる。投薬量は投与経路にも依存し、治療対象の年齢および体重によって異なる。多量体形の好ましい投薬量は、その間隔において７０ｋｇ体重につき１ｍｇ〜７０ｍｇであろう。
【０１０４】
ほとんどの適用のために、局在化された、または実質的に局在化された適用が好ましい。
【０１０５】
本発明の化合物のいくつかは十分に活性であるが、他のいくつかについては、その調製物が薬学的に許容される添加剤および／または担体をさらに含む場合に、その効果は増強される。そのような添加剤および担体は、当技術分野で公知である。場合によっては、その標的への活性物質の送達を促進する化合物を含むことが有利となる。
【０１０６】
多くの例では、製剤を複数回投与する必要性がある。投与は脳室内注入などの連続注入であってもよく、または１日により多くの回数、毎日、１週により多くの回数、毎週など、より多くの用量での投与であってもよい。医薬の投与は、細胞死をもたらすことができる因子（複数可）に個体をさらす前または直後に開始されることが好ましい。好ましくは、医薬は因子の開始から８時間以内、例えば因子の開始から５時間以内に投与される。化合物の多くは長期間の効果を示し、それによって、化合物の投与は長い間隔、例えば１週間または２週間で行うことができる。
【０１０７】
神経ガイドでの使用に関連して、投与は、活性化合物（複数可）の制御放出に基づき、連続的であっても小部分に分けてもよい。さらに、放出の速度および／または放出の部位を制御するために、前駆体を用いてもよい。他の種類のインプラントおよび経口投与も、制御放出および／または前駆体の使用に同様に基づくことができる。
【０１０８】
上記のように、本発明は、分化を誘導するため、増殖を調節するため、再生、ニューロンプラスティシティおよび細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ生存を刺激するための個体の治療に関し、その治療は、上で定義される１つまたは複数の化合物の有効量を投与することを含む。
【０１０９】
投与のための別の戦略は、問題の化合物を発現および分泌することができる細胞を移植または注入することである。それによって、化合物は、それが作用する場所で生成させることができる。
【０１１０】
治療
本発明による化合物は、炎症性の疾患および状態を治療するために特に有用である。化合物は、下記疾患および状態のために有用であり、特に、関節リウマチおよび自己免疫疾患、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病に関連する炎症の治療のために有用である。
【０１１１】
本発明の化合物で治療することができる炎症関連の障害の例には、以下のものが含まれる。神経炎、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病、喘息および他のアレルギー反応、自己免疫疾患、例えば急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、ＡＬＳ、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、水疱性類天疱瘡、腹腔疾患、シャガス病、慢性閉塞性肺疾患、皮膚筋炎、１型糖尿病、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、エリテマトーデス、斑状強皮症、多発性硬化症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、尋常天疱瘡、悪性貧血、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、ＳＬＥ、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても公知である）、血管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症；慢性炎、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏性、炎症性腸疾患、骨盤炎症性疾患、再灌流損傷、関節リウマチ、移植拒絶、血管炎、骨関節炎、腱鞘炎および関節炎。
【０１１２】
治療は、非分解性病原体、持続的外来物体または自己免疫反応による持続的な急性炎症、中枢神経系の炎症性疾患、例えば急性感染性多発性神経炎、組織損傷を有する炎症性障害、ＨＩＶ、肝炎、骨関節炎、腱鞘炎および関節炎を含む、髄膜炎、脳炎、炎症性および毒性神経障害の治療でもよい。
【０１１３】
一実施形態では、治療は、癌、アテローム硬化症および虚血性心疾患を含む、炎症過程に病原学的起源を有する非免疫性疾患のものでもよい。
【０１１４】
抗体
本発明の目的は、インターロイキン４に由来する連続アミノ酸配列またはその断片、同族体もしくは変異体を含むエピトープに選択的に結合することができる抗体、その抗原結合性断片または組換えタンパク質の使用を提供することである。本発明は、配列番号１〜３７に示す配列のいずれかから選択されるインターロイキン４に由来する連続アミノ酸配列、または前記配列の断片もしくは変異体を含むエピトープに選択的に結合することができる任意の抗体に関する。
【０１１５】
用語「エピトープ」は、（その抗原の）抗体によって認識される特異的原子団（抗原分子上の）を意味する。用語「エピトープ」は、用語「抗原決定基」と同等である。エピトープは、近接して、例えば連続するアミノ酸配列中に位置するか、または抗原のアミノ酸配列の遠い部分に位置するがタンパク質の折たたみのために互いに近づいている、３つ以上のアミノ酸残基、例えば４、５、６、７、８個のアミノ酸残基を含むことができる。
【０１１６】
抗体分子は免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質のファミリーに属し、その基本的なビルディングブロックである免疫グロブリン折たたみまたはドメインは、免疫系および他の生体認識系の多くの分子で様々な形で用いられる。一般的な免疫グロブリンは、可変領域として公知である抗原結合性領域および定常領域として公知である非可変領域を含む、４つのポリペプチド鎖を有する。
【０１１７】
天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖は、規則正しく間隔をあけた鎖内部のジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、その一端に可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、その他方の端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変領域の間で界面を形成すると考えられている（Ｎｏｖｏｔｎｙ Ｊ．およびＨａｂｅｒ Ｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８２巻（１４号）：４５９２〜６頁、１９８５年）。
【０１１８】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの少なくとも五（５）個の主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の１つに割り当てることができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
【０１１９】
抗体の可変ドメインとの関連で用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列が広く異なることを指す。可変ドメインは結合のためであり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の特異性を決定する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方の、超可変領域としても公知である相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの区分に集中している。
【０１２０】
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、そのほとんどはβシート配置を採用し、３つのＣＤＲによって連結され、それらはβシート構造を連結するループを、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって他の鎖のＣＤＲに近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与していないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【０１２１】
したがって本発明で使用することが企図されている抗体は、完全体免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂ、類似した断片などの抗体断片、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む単鎖抗体、および類似形態を含む様々な形態のいずれかでよく、それらのすべては、本明細書で用いる広い用語「抗体」に入る。本発明は、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体の任意の特異性の使用を企図し、特異的抗原を認識してそれと免疫反応する抗体に限定されない。下記の治療方法およびスクリーニング方法との関連で、好ましい実施形態は、本発明の抗原またはエピトープに免疫特異的である抗体またはその断片の使用である。
【０１２２】
用語「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般には抗原結合性または可変性の領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片を生成し、それぞれは単一の抗原結合部位、および、容易に結晶化するその能力のためにそのように呼ばれる、残留性「Ｆｃ」断片を含む。ペプシン処理は、抗原を架橋することができる２つの抗原結合性断片を有するＦ（ａｂ’）２断片、および残留性の他の断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）を与える。さらなる断片には、抗体断片から形成されるダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子および多重特異性抗体を含めることができる。本明細書で用いるように、抗体に関する「機能的断片」は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片を指す。
【０１２３】
用語「抗体断片」は、用語「抗原結合性断片」と互換的に用いられる。
【０１２４】
抗体断片は、約４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、９アミノ酸、約１２アミノ酸、約１５アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸以上と同じくらい小さくてもよい。一般に、配列番号１〜３７と本明細書で同定される配列のいずれかから選択されるペプチド配列または前記配列の断片を含むエピトープに特異的に結合する抗体と比較して、それが類似のまたは免疫学的特性を有する限り、本発明の抗体断片は、任意のサイズ上限を有することができる。したがって、本発明の文脈では、用語「抗体断片」は、用語「抗原結合性断片」と同一である。
【０１２５】
抗体断片は、その抗原または受容体に選択的に結合する多少の能力を保持する。数種類の抗体断片は、以下の通りに定義される。
【０１２６】
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含む断片である。Ｆａｂ断片は、完全体抗体を酵素パパインで消化して完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を与えることによって生成することができる。
【０１２７】
（２）Ｆａｂ’は、完全体抗体をペプシンで処理し、続いて還元して、完全な軽鎖および重鎖の一部を与えることによって得ることができる抗体分子の断片である。抗体分子につき２つのＦａｂ’断片が得られる。
【０１２８】
Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の付加によって、Ｆａｂ断片と異なる。
【０１２９】
（３）（Ｆａｂ’）２は、完全体抗体を酵素ペプシンで処理し、その後還元しないことによって得ることができる抗体の断片である。
【０１３０】
（４）Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片の二量体である。
【０１３１】
Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含む、最小限の抗体断片である。この領域は、密接な、非共有的に結合した１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる（ＶＨ−ＶＬ二量体）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を規定するのは、この配置においてである。一緒になって、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識して結合する能力を有するが、親和性は結合部位全体よりも低い。
【０１３２】
（５）適するポリペプチドリンカーによって遺伝的に融合された単鎖分子として連結される、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子として定義される単鎖抗体（「ＳＣＡ」）。そのような単鎖抗体は、「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片とも呼ばれる。一般には、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成するのを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖのレビューのためには、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １１３巻：２６９〜３１５頁、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１９９４年、の中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照。
【０１３３】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖の上で２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を形成することが強制される。ダイアボディは、例えば欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）でより詳細に記載されている。
【０１３４】
本発明は、少なくとも２つの結合性ドメインを有する多価抗体も企図する。結合性ドメインは、同じリガンドまたは異なるリガンドに対する特異性を有することができる。一実施形態では、多重特異的分子は、二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）であり、それは少なくとも２つの異なる結合性ドメインを運び、そのうちの少なくとも１つは抗体起源である。多価抗体は、いくつかの方法によって生成することができる。二価または多価抗体を調製するための様々な方法が、例えば米国特許第５，２６０，２０３号、第５，４５５，０３０号、第４，８８１，１７５号、第５，１３２，４０５号、第５，０９１，５１３号、第５，４７６，７８６号、第５，０１３，６５３号、第５，２５８，４９８号および第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１３５】
本発明は、本発明によるエピトープに結合することができるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方、抗原結合性断片およびその組換えタンパク質を企図する。
【０１３６】
ポリクローナル抗体の調製は、当分野の技術者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒｅｅｎら、１９９２年、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編）、１〜５頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ， Ｒａｔｓ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、セクション２．４．１を参照。
【０１３７】
モノクローナル抗体の調製は、同様に従来通りである。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜７頁（１９７５年）、Ｃｏｌｉｇａｎら、セクション２．５．１〜２．６．７、およびＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、７２６頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ．（１９８８年）を参照。モノクローナル抗体は、様々な確立された技術によってハイブリドーマ培養から単離、精製することができる。そのような単離技術には、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、セクション２．７．１〜２．７．１２およびセクション２．９．１〜２．９．３、Ｂａｒｎｅｓら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ （ＩｇＧ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０巻：７９〜１０４頁、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照。
【０１３８】
モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ操作の方法は、当分野の技術者に周知である。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５〜７頁によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換え法によって作製することができる。本発明で用いるためのモノクローナル抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４〜６２８頁、ならびにＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２巻：５８１〜５９７頁に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。別の方法は、組換え手段によってモノクローナル抗体をヒト化して、ヒト特異的および認識可能な配列を含む抗体を生成することを含む。レビューのためには、Ｈｏｌｍｅｓら、１９９７年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８巻：２１９２〜２２０１頁およびＶａｓｗａｎｉら、１９９８年、Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８１巻：１０５〜１１５頁を参照。
【０１３９】
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在することのある可能な天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を一般に含む従来のポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンに汚染されずに、ハイブリドーマ培養によって合成されるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を要求するものと解釈されてはならない。
【０１４０】
本明細書で、具体的にモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するか別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに、それらが所望の生物学的な活性を示す限り、そのような抗体の断片の対応配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１巻：６８５１〜６８５５頁。
【０１４１】
抗体断片を作製する方法も、当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹを参照）。本発明の抗体断片は、抗体のタンパク分解性加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉでの発現によって調製することができる。抗体断片は、従来の方法による完全体抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素切断によって、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓ断片を提供することによって生成することができる。この断片は、チオール還元剤、および任意選択でジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロック基を用いてさらに切断し、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを用いる酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ’断片およびＦｃ断片を直接に生成する。これらの方法は、例えば米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号、およびそこに含まれる参考文献に記載されている。これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
完全な抗体によって認識される抗原にその断片が結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖断片を形成すること、さらなる断片切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術を用いることもできる。例えば、Ｆｖ断片は、ＶＨおよびＶＬ鎖の結合を含む。この結合は非共有結合であってもよく、または、可変鎖は分子間ジスルフィド結合によって連結されてもよく、もしくはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋されてもよい。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されるＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合性タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されるＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後、それはＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドで、単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成する方法は、例えばＷｈｉｔｌｏｗら、１９９１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２巻：９７頁、Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３〜４２６頁、米国特許第４，９４６，７７８号およびＰａｃｋら、１９９３年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１巻：１２７１〜７７頁に記載されている。
【０１４３】
抗体断片の別の形は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、抗原の認識および結合にしばしば関与する。ＣＤＲペプチドは、対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子をクローニングまたは構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ： ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２巻、１０６頁（１９９１年）を参照。
【０１４４】
本発明は、ヒト以外（例えばマウス）の抗体のヒト形態およびヒト化形態を企図する。そのようなヒト化抗体は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小限の配列、例えばエピトープ認識配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合性部分配列）である。大部分、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。本発明の抗体（複数可）の最小限の配列（複数可）を含むヒト化抗体（複数可）、例えば本明細書に記載のエピトープ（複数可）を認識する配列（複数可）は、本発明の好ましい実施形態の１つである。
【０１４５】
場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応するヒト以外の残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でもインポートされたＣＤＲおよびフレームワーク配列でも見出されない残基を含むこともできる。これらの改変は、抗体能力をさらに洗練および最適化するために加えられる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、そのＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト以外の免疫グロブリンのそれらに対応し、そのＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含む。詳しくは、以下を参照のこと。Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻、５２２〜５２５頁、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻、３２３〜３２９頁、Ｐｒｅｓｔａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ２巻：５９３〜５９６頁、Ｈｏｌｍｅｓら、１９９７年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８巻：２１９２〜２２０１頁およびＶａｓｗａｎｉら、１９９８年、Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８１巻：１０５〜１１５頁。
【０１４６】
抗体の生成は、配列番号１〜３７と同定される配列のいずれかから選択される配列の天然または組換えの断片を抗原として用いる、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するための当技術分野の任意の標準方法によって達成することができる。そのような抗体は、配列番号１〜３７の変異体または断片を用いて生成することもできる。
【０１４７】
抗体は、例えば、その個体に本発明による免疫原性断片を投与することによって、治療される個体がｉｎ ｖｉｖｏで生成することもできる。したがって、本発明は、上記の免疫原性断片を含むワクチンにさらに関する。
【０１４８】
本出願は、上記の免疫原性断片を提供するステップを含む、本発明の抗体を生成する方法にも関する。
【０１４９】
本発明は、ＩＬ−４の生物機能、特に炎症に関係する機能を調節すること、例えば増強または減弱させることができる抗体、およびその生物学的な活性を調節することなくＩＬ−４を認識し、特異的に結合することができる抗体の両方に関する。
【０１５０】
本発明は、ＩＬ−４の活性の調節を含む治療的適用のための上記抗体の使用に関する。
【０１５１】
一態様では、本発明は、上記抗体を含む医薬組成物の使用に関する。
【実施例】
【０１５２】
（実施例１）
ＩＬ−４に由来する４つのペプチドを設計、合成した（配列番号１〜４）。ペプチド位置のマッピングを、ＰｙＭＯＬ ｖ０．９９（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＬＣ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ）に基づいてＰｙＭＯＬ（商標）ソフトウェアを使用して実施した。これは、ヒトＩｌ４−Ｉｌ４ｒ−Ｉｌ１３ｒａ、ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＰＮおよび３ＢＰＬの三元複合体の結晶構造に基づいて実行された（ＬａＰｏｒｔｅら、２００８年）。
【０１５３】
ＩＬ−４は、ＩＬ−４Ｒαの細胞外部分の２つのフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３−１およびＦＮ３−２）と相互作用する（図１および２）。ＩＬ−４は、ＩＬ−４Ｒαおよびγｃの細胞外部分の２つのフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３−１およびＦＮ３−２）と相互作用する（図３および４）。
【０１５４】
（実施例２）
それらが任意の生物学的な活性を有するかどうかにかかわらず、ＩＬ−４に由来する４つのペプチドを神経突起成長アッセイで試験した。
【０１５５】
小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）は、出産後（Ｐ）３日または７日のウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ＧｅｒｍａｎｙまたはＴａｃｏｎｉｃ、Ｅｊｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から調製した。小脳は髄膜および血管を取り除き、チョッピングによって粗くホモジナイズし、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｂｒｏｎｄｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のトリプシンでトリプシン処理をした。ニューロンをＤＮアーゼ１および大豆トリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で洗浄し、細胞破片は平板培養の前に遠心分離によってペレットにした。単細胞培養実験のために、Ｐ７のＣＧＮを、０．４％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中の未コーティング８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋチャンバスライド（ＮＵＮＣ、Ｓｌａｎｇｅｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の上へ、１０，０００細胞／ウェルの密度で平板培養した。平板培養の直後に様々な濃度のペプチドを培地に加え、細胞を３７℃および５％ＣＯ２に２４時間維持した。次に、前に記載のとおり、培養物を固定、ブロックし、ラットＧＡＰ−４３に対するポリクローナルウサギ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とインキュベートし、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）とのインキュベーションが続いた（Ｎｅｉｉｅｎｄａｍら、２００４年）。免疫染色した培養のすべてを、Ｎｉｋｏｎ Ｐｌａｎｅ ２０×対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本国）を用いて、コンピュータによる蛍光顕微鏡検査によって記録した。画像は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で開発されたソフトウェアパッケージＰｒｉｍａを用いて、電荷結合素子ビデオカメラ（Ｇｒｕｎｄｉｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｎｕｒｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で獲得した。細胞あたりのニューロン突起の長さは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｒｏｎｎら２０００年）で開発されたソフトウェアパッケージＰｒｏｃｅｓｓ Ｌｅｎｇｔｈを用いて推定した。神経突起成長の推定のために、個々の各実験の群ごとに、少なくとも２００±２０細胞を処理した。
【０１５６】
結果：
ＩＬ−４結合部位からの配列番号１、２、３および４を有するペプチドは、一次ニューロンから神経突起生成応答を誘発することが見出された。小脳神経突起成長に及ぼす配列番号１、２、３および４の影響の結果を、それぞれ図５、６、９および１２に示す。
【０１５７】
（実施例３）
一次マクロファージ細胞（または、ＡＭＪ２Ｃ８マクロファージ細胞系の細胞、Ｒｙａｎら、１９９７年を参照）は、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度の１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｓｌａｎｇｅｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で、６×１０−５細胞／ｍｌの密度で２４時間培養することができる。ＬＰＳ刺激に応じるＴＮＦ−α放出の測定のために、３反復の培養を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで２４時間培養し、次に０〜１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで追加の２４時間刺激し、その後培養上清を収集した。ＬＰＳ処理マクロファージからのならし培地中のＴＮＦ−α濃度の測定は、アクチノマイシンＤへの曝露後にＴＮＦ−α感受性であったＬ９２９線維芽細胞様細胞を使用して実行した（Ｈｅら、２００２年）。Ｌ９２９細胞を、ウェルにつき２０，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の、１０％ＦＣＳおよび０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ １６４０で維持した。ＴＮＦ−αバイオアッセイとして用いる１時間前に、Ｌ９２９細胞を５μｇ／ｍｌアクチノマイシン（ａｃｔｒｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ｄ（Ｓｉｇｍａ）で前処理し、ＬＰＳ処理マクロファージ培養からの様々な希釈のならし培地とさらにインキュベートした。次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて細胞生存度を評価した。
【０１５８】
マクロファージ活性化試験系
・マクロファージを、１ウェルにつき９．６ｃｍ２を有する６ウェルマルチディッシュに、密度１０，０００細胞／ウェルで播種した。
【０１５９】
・潜在的な抗炎症効果を有するペプチドまたはタンパク質を、培養に加えた。陰性対照として、培地を１つのウェルに加え、陽性対照として、１００μＭヒドロコルチゾンを１つのウェルに加えた。
【０１６０】
・細胞培養を、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１６１】
・マクロファージを活性化するために、ＩＦＮ−γを濃度０．０１μｇ／ｍｌでマクロファージ培養に加えた。対照として、１つのウェルには培地以外ＩＦＮ−γを加えなかった。
【０１６２】
・線維芽細胞を、濃度０．２×１０２細胞／ｍｌで９６ウェルプレートに播種した。
【０１６３】
・両細胞培養を、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１６４】
マクロファージからのならし培地は、１２００ｒｐｍで５分間細胞液を遠心回転させることによって収集した。ならし培地を線維芽細胞に加え、ＴＮＦ−αを滴定曲線のために加え、最後に、アクチノマイシンＤを濃度０．５μｇ／ｍｌで線維芽細胞に加えた。
【０１６５】
結果：
マクロファージ細胞培養での炎症性応答の阻害に及ぼす、配列番号１、３、５、６および１９を有するペプチドの影響を試験した。結果を、図７、１０および１３〜１７に示す。
【０１６６】
（実施例４）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を用いる結合試験
組換えＩＬ４Ｒαを、ＣＭ５センサーチップの上に固定した。固定化工程は、３５μｌの活性化液でカルボキシメチル化デキストランマトリックスを活性化し、続いて１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）中のタンパク質の注射によって実行した。所望レベルのタンパク質を固定化した後、３５μｌの失活液を注入して、デキストランマトリックス中のあらゆる遊離のカルボキシメチル化基を不活性化する。対照として、１つのフローセルは常に空であった。各分析物（組換えＩＬ−４またはＩＬ−４由来のペプチド）をＰＢＳで希釈し、１０μｌ／分の流速で注入した。得られたデータは、ＢｉａｃｏｒｅのソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖ．４を用いて非線形カーブフィッティングを実施することによって分析した。１：１の複合体の２つの分子の相互作用を記載する、１：１のラングミュア結合モデルに曲線をあてはめた。結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）から、親和定数（ＫＤ）を計算した。これは、以下の式を用いて実行し、式中、Ｌは固定化リガンドであり、Ａは分析物であり、ＬＡは分析物−リガンド複合体である。
【０１６７】
ラングミュア１：１モデル：
【０１６８】
【化１】
リガンド濃度の低下速度：
【０１６９】
【化２】
生成物濃度の増加速度：
【０１７０】
【化３】
【０１７１】
【化４】
結果：
Ｐｈ２（配列番号３）とＩＬ４ｒαとの間、およびＰｈ３（配列番号１）とＩＬ４ｒαとの間の結合を試験した。結果をそれぞれ図８および１１に示す。
【０１７２】
参考文献
【０１７３】
【化５】
【０１７４】
【化６】
【０１７５】
【化７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン４（配列番号３８）もしくはその断片に由来する多くとも３５個の連続するアミノ酸残基、または配列番号３８と少なくとも７０％同一である変異体もしくはその断片からなるペプチドを含む化合物。
【請求項２】
前記ペプチドが、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する配列を含み、式中、
Ｘ１はＬであり、
Ｘ２は、Ｉ、Ｑ、Ｇ、Ｔまたは荷電アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｑ、Ｔまたは荷電アミノ酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ２がＩまたはＱである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ２がＩである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ２がＱである、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ２が荷電アミノ酸である、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ３が荷電アミノ酸である、請求項２から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ３がＲまたはＥである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ３がＲである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ３がＥである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ３がＱまたはＴである、請求項２から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘ１がＬ、Ｘ２がＩ、Ｘ３がＲである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ１がＬ、Ｘ２がＱ、Ｘ３がＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ペプチドがＩＬ−４受容体と相互作用することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
前記ペプチドがＩＬ−４のαヘリックスの一部を含む、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
前記ペプチドがＩＬ−４受容体シグナル伝達を調節することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
前記ペプチドがＩＬ−４受容体シグナル伝達を刺激することができる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ペプチドがＩＬ−４受容体シグナル伝達を阻害することができる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
前記ペプチドが以下の配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号１）
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ （配列番号２）
ＡＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＧ （配列番号３）
ＡＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＳ （配列番号４）
ＬＱＥＩＫＴＬＮ （配列番号５）
ＫＲＬＱＱＮＬＦＧＧ （配列番号６）
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号７）
ＱＥＩＩＫＫＬ （配列番号８）
ＡＩＱＮＱＥＥＩＫＹＬＮＳ （配列番号９）
ＡＩＩＬＱＥＩ （配列番号１０）
ＩＶＬＱＥＩＩ （配列番号１１）
ＴＬＧＥＩＩＫＧＶＮＳ （配列番号１２）
ＶＴＬＩＤＨＳＥＥＩＦＫＴＬＮ （配列番号１３）
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ （配列番号１４）
ＲＬＤＲＥＮＶＡＶＹＮＬＷ （配列番号１５）
ＬＲＳＬＤＲＮＬ （配列番号１６）
ＲＬＬＲＬＤＲＮ （配列番号１７）
ＲＦＬＫＲＹＦＹＮＬＥＥＮＬ （配列番号１８）
ＲＮＫＱＶＩＤＳＬＡＫＦＬＫＲ （配列番号１９）
ＲＨＫＡＬＩＲ （配列番号２０）
ＫＫＬＩＲＹＬＫ （配列番号２１）
ＲＨＫＴＬＩＲ （配列番号２２）
ＭＱＤＫＹＳＫＳ （配列番号２３）
ＡＥＲＶＫＩＥＱＲＥＹＫＫＹＳ （配列番号２４）
ＳＱＬＩＲＦＬＫＲＬＡ （配列番号２５）
ＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴ （配列番号２６）
ＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＡ （配列番号２７）
ＴＥＫＥＶＬＲＱＦＹＳＡ （配列番号２８）
ＫＴＬＴＥＬＴＫＴＬＮＳ （配列番号２９）
ＡＨＫＥＩＩＫＴＬＮＳＬＱＫＡ （配列番号３０）
ＡＫＴＬＳＴＥＬＴＶＴＡ （配列番号３１）
ＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＡ （配列番号３２）
ＮＥＥＲＬＫＴＩＭＲＡ （配列番号３３）
ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＲ （配列番号３４）
ＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴ （配列番号３５）
ＡＨＲＨＫＱＬＩＲＡ （配列番号３６）
ＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＡ （配列番号３７）
の１つ、または
その断片もしくは変異体を含む、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
前記ペプチドが以下の配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号１）
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号７）
ＲＨＫＡＬＩＲ （配列番号２０）
ＫＫＬＩＲＹＬＫ （配列番号２１）
ＲＨＫＴＬＩＲ （配列番号２２）
ＳＱＬＩＲＦＬＫＲＬＡ （配列番号２５）
ＡＨＲＨＫＱＬＩＲＡ （配列番号３６）
の１つ、または
その断片もしくは変異体を含む、請求項１２に記載の化合物。
【請求項２１】
前記ペプチドが以下の配列
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ （配列番号２）
ＬＱＥＩＫＴＬＮ （配列番号５）
ＡＩＩＬＱＥＩ （配列番号１０）
ＩＶＬＱＥＩＩ （配列番号１１）
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ （配列番号１４）
ＡＨＫＥＩＩＫＴＬＮＳＬＱＫＡ （配列番号３０）
の１つ、または
その断片もしくは変異体を含む、請求項１３に記載の化合物。
【請求項２２】
前記ペプチドがＢ細胞を活性化することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
前記ペプチドがＴ細胞の増殖および生存を活性化することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
前記ペプチドが単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
前記ペプチドがマクロファージ活性化を阻害することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
以下の配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号１）
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ （配列番号２）
ＡＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＧ （配列番号３）
ＡＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＳ （配列番号４）
ＬＱＥＩＫＴＬＮ （配列番号５）
ＫＲＬＱＱＮＬＦＧＧ （配列番号６）
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号７）
ＱＥＩＩＫＫＬ （配列番号８）
ＡＩＱＮＱＥＥＩＫＹＬＮＳ （配列番号９）
ＡＩＩＬＱＥＩ （配列番号１０）
ＩＶＬＱＥＩＩ （配列番号１１）
ＴＬＧＥＩＩＫＧＶＮＳ （配列番号１２）
ＶＴＬＩＤＨＳＥＥＩＦＫＴＬＮ （配列番号１３）
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ （配列番号１４）
ＲＬＤＲＥＮＶＡＶＹＮＬＷ （配列番号１５）
ＬＲＳＬＤＲＮＬ （配列番号１６）
ＲＬＬＲＬＤＲＮ （配列番号１７）
ＲＦＬＫＲＹＦＹＮＬＥＥＮＬ （配列番号１８）
ＲＮＫＱＶＩＤＳＬＡＫＦＬＫＲ （配列番号１９）
ＲＨＫＡＬＩＲ （配列番号２０）
ＫＫＬＩＲＹＬＫ （配列番号２１）
ＲＨＫＴＬＩＲ （配列番号２２）
ＭＱＤＫＹＳＫＳ （配列番号２３）
ＡＥＲＶＫＩＥＱＲＥＹＫＫＹＳ （配列番号２４）
の１つ、または
その断片もしくは変異体からなる単離されたペプチド配列。
【請求項２７】
請求項１から２５に記載の少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物。
【請求項２８】
医薬を製造するための、請求項１から２５のいずれかに記載の化合物または請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２９】
前記医薬が、ＩＬ−４受容体シグナル伝達の調節が必須である疾患または状態の治療のためのものである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記医薬が炎症性の疾患または状態の治療のためのものである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記医薬が自己免疫性の疾患または状態の治療のためのものである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記医薬が関節リウマチの治療のためのものである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記医薬が、皮下、静脈内、経口、経鼻、肺内、局所投与、または関節包内もしくはその近くへの関節内投与で補われる非経口投与のためである、請求項２８から３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
抗体の生成のための、請求項１から２５のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項３５】
配列番号１から３７のアミノ酸配列の少なくとも１つを含むエピトープに結合することができる抗体。
【請求項３６】
前記抗体が、ＩＬ−４によって媒介される生物学的な活性を調節することができる、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
炎症性の疾患または状態の治療のための医薬の製造のための、請求項３５から３６に記載の抗体の使用。
【請求項３８】
請求項３５から３６のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１から２５のいずれかに記載の化合物、請求項３５に記載の抗体、または請求項２７もしくは３８に記載の医薬組成物の有効量を、治療を必要とする個体に投与することを含む、治療法。
【請求項１】
インターロイキン４（配列番号３８）もしくはその断片に由来する多くとも３５個の連続するアミノ酸残基、または配列番号３８と少なくとも７０％同一である変異体もしくはその断片からなるペプチドを含む化合物。
【請求項２】
前記ペプチドが、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する配列を含み、式中、
Ｘ１はＬであり、
Ｘ２は、Ｉ、Ｑ、Ｇ、Ｔまたは荷電アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｑ、Ｔまたは荷電アミノ酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ２がＩまたはＱである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ２がＩである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ２がＱである、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ２が荷電アミノ酸である、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ３が荷電アミノ酸である、請求項２から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ３がＲまたはＥである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ３がＲである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ３がＥである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ３がＱまたはＴである、請求項２から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘ１がＬ、Ｘ２がＩ、Ｘ３がＲである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ１がＬ、Ｘ２がＱ、Ｘ３がＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ペプチドがＩＬ−４受容体と相互作用することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
前記ペプチドがＩＬ−４のαヘリックスの一部を含む、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
前記ペプチドがＩＬ−４受容体シグナル伝達を調節することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
前記ペプチドがＩＬ−４受容体シグナル伝達を刺激することができる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ペプチドがＩＬ−４受容体シグナル伝達を阻害することができる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
前記ペプチドが以下の配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号１）
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ （配列番号２）
ＡＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＧ （配列番号３）
ＡＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＳ （配列番号４）
ＬＱＥＩＫＴＬＮ （配列番号５）
ＫＲＬＱＱＮＬＦＧＧ （配列番号６）
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号７）
ＱＥＩＩＫＫＬ （配列番号８）
ＡＩＱＮＱＥＥＩＫＹＬＮＳ （配列番号９）
ＡＩＩＬＱＥＩ （配列番号１０）
ＩＶＬＱＥＩＩ （配列番号１１）
ＴＬＧＥＩＩＫＧＶＮＳ （配列番号１２）
ＶＴＬＩＤＨＳＥＥＩＦＫＴＬＮ （配列番号１３）
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ （配列番号１４）
ＲＬＤＲＥＮＶＡＶＹＮＬＷ （配列番号１５）
ＬＲＳＬＤＲＮＬ （配列番号１６）
ＲＬＬＲＬＤＲＮ （配列番号１７）
ＲＦＬＫＲＹＦＹＮＬＥＥＮＬ （配列番号１８）
ＲＮＫＱＶＩＤＳＬＡＫＦＬＫＲ （配列番号１９）
ＲＨＫＡＬＩＲ （配列番号２０）
ＫＫＬＩＲＹＬＫ （配列番号２１）
ＲＨＫＴＬＩＲ （配列番号２２）
ＭＱＤＫＹＳＫＳ （配列番号２３）
ＡＥＲＶＫＩＥＱＲＥＹＫＫＹＳ （配列番号２４）
ＳＱＬＩＲＦＬＫＲＬＡ （配列番号２５）
ＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴ （配列番号２６）
ＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＡ （配列番号２７）
ＴＥＫＥＶＬＲＱＦＹＳＡ （配列番号２８）
ＫＴＬＴＥＬＴＫＴＬＮＳ （配列番号２９）
ＡＨＫＥＩＩＫＴＬＮＳＬＱＫＡ （配列番号３０）
ＡＫＴＬＳＴＥＬＴＶＴＡ （配列番号３１）
ＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＡ （配列番号３２）
ＮＥＥＲＬＫＴＩＭＲＡ （配列番号３３）
ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＲ （配列番号３４）
ＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴ （配列番号３５）
ＡＨＲＨＫＱＬＩＲＡ （配列番号３６）
ＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＡ （配列番号３７）
の１つ、または
その断片もしくは変異体を含む、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
前記ペプチドが以下の配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号１）
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号７）
ＲＨＫＡＬＩＲ （配列番号２０）
ＫＫＬＩＲＹＬＫ （配列番号２１）
ＲＨＫＴＬＩＲ （配列番号２２）
ＳＱＬＩＲＦＬＫＲＬＡ （配列番号２５）
ＡＨＲＨＫＱＬＩＲＡ （配列番号３６）
の１つ、または
その断片もしくは変異体を含む、請求項１２に記載の化合物。
【請求項２１】
前記ペプチドが以下の配列
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ （配列番号２）
ＬＱＥＩＫＴＬＮ （配列番号５）
ＡＩＩＬＱＥＩ （配列番号１０）
ＩＶＬＱＥＩＩ （配列番号１１）
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ （配列番号１４）
ＡＨＫＥＩＩＫＴＬＮＳＬＱＫＡ （配列番号３０）
の１つ、または
その断片もしくは変異体を含む、請求項１３に記載の化合物。
【請求項２２】
前記ペプチドがＢ細胞を活性化することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
前記ペプチドがＴ細胞の増殖および生存を活性化することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
前記ペプチドが単球および樹状細胞でＣ５ａおよびＣ３ａを下方制御することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
前記ペプチドがマクロファージ活性化を阻害することができる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
以下の配列
ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号１）
ＡＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＡ （配列番号２）
ＡＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＧ （配列番号３）
ＡＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＳ （配列番号４）
ＬＱＥＩＫＴＬＮ （配列番号５）
ＫＲＬＱＱＮＬＦＧＧ （配列番号６）
Ａｃ−ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ （配列番号７）
ＱＥＩＩＫＫＬ （配列番号８）
ＡＩＱＮＱＥＥＩＫＹＬＮＳ （配列番号９）
ＡＩＩＬＱＥＩ （配列番号１０）
ＩＶＬＱＥＩＩ （配列番号１１）
ＴＬＧＥＩＩＫＧＶＮＳ （配列番号１２）
ＶＴＬＩＤＨＳＥＥＩＦＫＴＬＮ （配列番号１３）
ＬＱＥＲＩＫＳＬＮ （配列番号１４）
ＲＬＤＲＥＮＶＡＶＹＮＬＷ （配列番号１５）
ＬＲＳＬＤＲＮＬ （配列番号１６）
ＲＬＬＲＬＤＲＮ （配列番号１７）
ＲＦＬＫＲＹＦＹＮＬＥＥＮＬ （配列番号１８）
ＲＮＫＱＶＩＤＳＬＡＫＦＬＫＲ （配列番号１９）
ＲＨＫＡＬＩＲ （配列番号２０）
ＫＫＬＩＲＹＬＫ （配列番号２１）
ＲＨＫＴＬＩＲ （配列番号２２）
ＭＱＤＫＹＳＫＳ （配列番号２３）
ＡＥＲＶＫＩＥＱＲＥＹＫＫＹＳ （配列番号２４）
の１つ、または
その断片もしくは変異体からなる単離されたペプチド配列。
【請求項２７】
請求項１から２５に記載の少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物。
【請求項２８】
医薬を製造するための、請求項１から２５のいずれかに記載の化合物または請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２９】
前記医薬が、ＩＬ−４受容体シグナル伝達の調節が必須である疾患または状態の治療のためのものである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記医薬が炎症性の疾患または状態の治療のためのものである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記医薬が自己免疫性の疾患または状態の治療のためのものである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記医薬が関節リウマチの治療のためのものである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記医薬が、皮下、静脈内、経口、経鼻、肺内、局所投与、または関節包内もしくはその近くへの関節内投与で補われる非経口投与のためである、請求項２８から３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
抗体の生成のための、請求項１から２５のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項３５】
配列番号１から３７のアミノ酸配列の少なくとも１つを含むエピトープに結合することができる抗体。
【請求項３６】
前記抗体が、ＩＬ−４によって媒介される生物学的な活性を調節することができる、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
炎症性の疾患または状態の治療のための医薬の製造のための、請求項３５から３６に記載の抗体の使用。
【請求項３８】
請求項３５から３６のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１から２５のいずれかに記載の化合物、請求項３５に記載の抗体、または請求項２７もしくは３８に記載の医薬組成物の有効量を、治療を必要とする個体に投与することを含む、治療法。
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図４】
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１２−５０８６９８（Ｐ２０１２−５０８６９８Ａ）
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３５８８０（Ｐ２０１１−５３５８８０）
【出願日】平成２１年１１月１７日（２００９．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３０４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５４６６７
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５１１０９６７１０）コーベンハブンス ウニベルシテト (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１７日（２００９．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０３０４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５４６６７
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５１１０９６７１０）コーベンハブンス ウニベルシテト (3)
【Ｆターム（参考）】
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