成長因子に誘発されるユークロマチン化（ｅｕｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）に必要な、ＳＲＣ−ファミリーチロシンキナーゼの核局在
【課題】核のピクセルイメージングを使用してクロマチン構造変化を定量的に評価する方法を提供する。
【解決手段】核のピクセルイメージングは、核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の、１つ又は複数の画像をキャプチャし、染色強度は、その強度を定量する。１ピクセル当たりの染色強度の平均及び／又は標準偏差を、クロマチン凝縮レベル又はクロマチン構造変化を判定するために使用する。
【解決手段】核のピクセルイメージングは、核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の、１つ又は複数の画像をキャプチャし、染色強度は、その強度を定量する。１ピクセル当たりの染色強度の平均及び／又は標準偏差を、クロマチン凝縮レベル又はクロマチン構造変化を判定するために使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマチン構造変化の定量的解析のためのツールとしてのピクセルイメージングの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
非受容体型タンパク質−チロシンキナーゼの最大のサブファミリーを形成するＳｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼ（ＳＦＫ）は、原癌遺伝子産物および構造的に関連するタンパク質から成り、少なくとも８種類の高度に相同なタンパク質（ｃ−Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、ｃ−Ｙｅｓ、ｃ−Ｆｇｒ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ及びＢｌｋ）を含む（非特許文献１、２）。ｃ−Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ及びｃ−Ｙｅｓは、様々な細胞型において広範に発現されるが、一方、ｃ−Ｆｇｒ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ及びＢｌｋは主に造血細胞に見出される（非特許文献２）。ＳＦＫのチロシンキナーゼ活性は、チロシンのリン酸化及び脱リン酸化により緊密に調節され、ＳＦＫは細胞の増殖と、分化と、移動と、細胞骨格の再構築とに中心的な役割を果たす（非特許文献１、２）。ＳＦＫは細胞膜の細胞質面に主に位置するが、後期エンドソーム／リソソーム、分泌顆粒／ファゴソーム及びゴルジ装置で見出される（非特許文献１〜９）。
【０００３】
チロシンキナーゼ及びホスファターゼが細胞膜での細胞外刺激の下流でシグナル伝達分子として機能することは周知である。しかし、幾つかのチロシンキナーゼ及びホスファターゼは核中に存在し、核タンパク質のチロシンのリン酸化及び脱リン酸化を調節し得る（非特許文献１０〜１２）。様々なシグナル伝達事象に関与するＳｒｃ−ファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）が、細胞膜だけでなく、核を含む幾つかの細胞内コンパートメントでも見出される。新たな証拠によれば、ＳＦＫの幾つかは核に局在し、ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス及び細胞周期調節においてシグナル伝達分子として機能することが示され（非特許文献１３〜１９）、核のチロシンリン酸化と関連する核の事象におけるＳＦＫの重要性が示唆されている。核の構造変化は、転写、細胞分化、老化、腫瘍形成及び細胞周期時に頻繁に観察される。しかし、クロマチンの構造（texture）の変化におけるシグナル伝達の役割は、過去に広範に調査されてはいない。
【０００４】
クロマチンは、ＤＮＡがヒストンと共に核中に詰め込まれた状態である。クロマチンは、たいてい、転写的に許容状態である低凝縮度のユークロマチンと、高凝縮度であり抑制されていることが多いヘテロクロマチンとから構成される（非特許文献２０）。間期におけるクロマチン構築（organization）は、遺伝子発現、ＤＮＡの複製、損傷及び修復に影響を及ぼす。クロマチン構造は動的に変化し、エピジェネティックな遺伝子調節と関連する。クロマチン構造変化を含む核の構造（architecture）の変化は、或る所定の腫瘍の種類及びステージの特徴である傾向があり、癌の診断にしばしば使用される（非特許文献２１）。最近の証拠によれば、リン酸化がクロマチン構造変化に関与することが示唆されている。ヒストンＨ３の１０番目のセリン残基（ヒストンＨ３Ｓ１０）のリン酸化が、有糸分裂時及び減数分裂時のクロマチン凝縮にとって重要である（非特許文献２２、２３）。
【０００５】
しかし、クロマチン構造（architecture）における核のチロシンリン酸化の役割は、これまで明らかにされていない。
【０００６】
以下の文献と、本明細書で言及する全ての刊行物とは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０００７】
【非特許文献１】M.T. Brown, J.A. Cooper, Regulation, substrates and functions ofsrc, Biochim. Biophys. Acta 1287 (1996) 121-149.
【非特許文献２】S.M. Thomas, J.S. Brugge, Cellular functions regulated by Src familykinases, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13 (1997) 513-609.
【非特許文献３】K.B. Kaplan, J.R. Swedlow, H.E. Varmus, D.O. Morgan, Association ofp60c-src with endosomal membranes in mammalian fibroblasts, J. CellBiol. 118 (1992) 321-333.
【非特許文献４】H. Moehn, V. Le Cabec, S. Fischer, I. Maridonneau-Parini, Thesrc-family protein-tyrosine kinase p59hck is located on thesecretory granules in human neutrophils and translocates towards the phagosomeduring cell activation, Biochem. J. 309 (1995) 657-665.
【非特許文献５】K. Kasahara, Y. Nakayama, K. Ikeda, Y. Fukushima, D. Matsuda, S.Horimoto, N. Yamaguchi, Trafficking of Lyn through the Golgi caveolin involvesthe charged residues on αE and αI helices in the kinase domain, J. Cell Biol. 165 (2004) 641-652.
【非特許文献６】D. Matsuda, Y. Nakayama, S. Horimoto, T. Kuga, K. Ikeda, K.Kasahara, N. Yamaguchi, Involvement of Golgi-associated Lyn tyrosine kinase inthe translocation of annexin II to the endoplasmic reticulum under oxidativestress, Exp. Cell Res. 312 (2006) 1205-1217.
【非特許文献７】K. Kasahara, Y. Nakayama, A. Kihara, D. Matsuda, K. Ikeda, T. Kuga,Y. Fukumoto, Y. Igarashi, N. Yamaguchi, Rapid trafficking of c-Src, anon-palmitoylated Src-family kinase, between the plasma membrane and lateendosomes/lysosomes, Exp. Cell Res. 313 (2007) 2651-2666.
【非特許文献８】K. Kasahara, Y. Nakayama, I. Sato, K. Ikeda, M. Hoshino, T. Endo, N.Yamaguchi, Role of Src-family kinases in formation and trafficking ofmacropinosomes, J. Cell. Physiol. 211 (2007) 220-232.
【非特許文献９】K. Kasahara, Y. Nakayama, N. Yamaguchi, v-Src and c-Src,nonpalmitoylated Src-family kinases, induce perinuclear accumulation oflysosomes through Rab7 in a kinase activity-independent manner, Cancer Lett.262 (2008) 19-27.
【非特許文献１０】C. Cans, R. Mangano, D. Barila, G. Neubauer, G. Superti-Furga, Nucleartyrosine phosphorylation: the beginning of a map, Biochem. Pharmacol. 60 (2000)1203-1215.
【非特許文献１１】M. Bollen, M. Beullens, Signaling by protein phosphatases in thenucleus, Trends Cell Biol. 12 (2002) 138-145.
【非特許文献１２】G.B. Moorhead, L. Trinkle-Mulcahy, A. Ulke-Lemee, Emerging roles ofnuclear protein phosphatases, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (2007) 234-244.
【非特許文献１３】S. Kharbanda, A. Saleem, Z.M. Yuan, S. Kraeft, R. Weichselbaum, L.B.Chen, D. Kufe, Nuclear signaling induced by ionizing radiation involvescolocalization of the activated p56/p53lyn tyrosine kinase with p34cdc2,Cancer Res. 56 (1996) 3617-3621.
【非特許文献１４】Z.M. Yuan, Y. Huang, S.K. Kraeft, L.B. Chen, S. Kharbanda, D. Kufe,Interaction of cyclin-dependent kinase 2 and the Lyn tyrosine kinase in cellstreated with 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, Oncogene 13 (1996) 939-946.
【非特許文献１５】K. Yoshida, R. Weichselbaum, S. Kharbanda, D. Kufe, Role for Lyntyrosine kinase as a regulator of stress-activated protein kinase activity inresponse to DNA damage, Mol. Cell. Biol. 20 (2000) 5370-5380.
【非特許文献１６】N. Yamaguchi, Y. Nakayama, T. Urakami, S. Suzuki, T. Nakamura, T.Suda, N. Oku, Overexpression of the Csk homologous kinase (Chk tyrosine kinase)induces multinucleation: a possible role for chromosome-associated Chk inchromosome dynamics, J. Cell Sci. 114 (2001) 1631-1641.
【非特許文献１７】K. Ikeda, Y. Nakayama, Y. Togashi, Y. Obata, T. Kuga, K. Kasahara,Y. Fukumoto, N. Yamaguchi, Nuclear localization of Lyn tyrosine kinase mediatedby inhibition of its kinase activity, Exp. Cell Res. 314 (2008) 3392-3404.
【非特許文献１８】I. Chu, J. Sun, A. Arnaout, H. Kahn, W. Hanna, S. Narod, P. Sun,C.K. Tan, L. Hengst, J. Slingerland, p27 phosphorylation by Src regulatesinhibition of cyclin E-Cdk2, Cell 128 (2007) 281-294.
【非特許文献１９】M. Grimmler, Y. Wang, T. Mund, Z. Cilensek, E.M. Keidel, M.B. Waddell,H. Jaekel, M. Kullmann, R.W. Kriwacki, L. Hengst, Cdk-inhibitory activity andstability of p27Kip1 are directly regulated by oncogenic tyrosine kinases, Cell128 (2007) 269-280.
【非特許文献２０】A.I. Lamond, W.C. Earnshaw, Structure and function in the nucleus,Science 280 (1998) 547-553.
【非特許文献２１】D. Zink, A.H. Fischer, J.A. Nickerson, Nuclear structure in cancercells, Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 677-687.
【非特許文献２２】C. Prigent, S. Dimitrov, Phosphorylation of serine 10 in histone H3,what for?, J. Cell Sci. 116 (2003) 3677-3685.
【非特許文献２３】S.J. Nowak, V.G. Corces, Phosphorylation of histone H3: a balancingact between chromosome condensation and transcriptional activation, TrendsGenet. 20 (2004) 214-220.
【非特許文献２４】J.D. Bjorge, C. Bellagamba, H.C. Cheng, A. Tanaka, J.H. Wang, D.J.Fujita, Characterization of two activated mutants of human pp60c-srcthat escape c-Src kinase regulation by distinct mechanisms, J. Biol. Chem. 270(1995) 24222-24228.
【非特許文献２５】Y. Yamanashi, S. Fukushige, K. Semba, J. Sukegawa, N. Miyajima, K.Matsubara, T. Yamamoto, K. Toyoshima, The yes-related cellular gene lyn encodesa possible tyrosine kinase similar to p56lck, Mol. Cell. Biol. 7(1987) 237-243.
【非特許文献２６】T. Tezuka, H. Umemori, T. Akiyama, S. Nakanishi, T. Yamamoto, PSD-95promotes Fyn-mediated tyrosine phosphorylation of the N-methyl-D-aspartatereceptor subunit NR2A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 435-440.
【非特許文献２７】J. Sukegawa, K. Semba, Y. Yamanashi, M. Nishizawa, N. Miyajima, T.Yamamoto, K. Toyoshima, Characterization of cDNA clones for the human c-yesgene, Mol. Cell. Biol. 7 (1987) 41-47.
【非特許文献２８】C.L. Law, S.P. Sidorenko, K.A. Chandran, K.E. Draves, A.C. Chan, A.Weiss, S. Edelhoff, C.M. Disteche, E.A. Clark, Molecular cloning of human Syk.A B cell protein-tyrosine kinase associated with the surface immunoglobulin M-Bcell receptor complex, J. Biol. Chem. 269 (1994) 12310-12319.
【非特許文献２９】S. Huebner, C.Y. Xiao, D.A. Jans, The protein kinase CK2 site(Ser111/112) enhances recognition of the simian virus 40 large T-antigennuclear localization sequence by importin, J. Biol. Chem. 272 (1997)17191-17195.
【非特許文献３０】Y. Nakayama, N. Yamaguchi, Multi-lobulation of the nucleus inprolonged S phase by nuclear expression of Chk tyrosine kinase, Exp. Cell Res.304 (2005) 570-581.
【非特許文献３１】Y. Nakayama, A. Kawana, A. Igarashi, N. Yamaguchi, Involvement ofthe N-terminal unique domain of Chk tyrosine kinase in Chk-induced tyrosinephosphorylation in the nucleus, Exp. Cell Res. 312 (2006) 2252-2263.
【非特許文献３２】N. Fujita, S. Watanabe, T. Ichimura, S. Tsuruzoe, Y. Shinkai, M.Tachibana, T. Chiba, M. Nakao, Methyl-CpG binding domain 1 (MBD1) interactswith the Suv39h1-HP1 heterochromatic complex for DNA methylation-basedtranscriptional repression, J. Biol. Chem. 278 (2003) 24132-24138.
【非特許文献３３】Y. Nakatani, V. Ogryzko, Immunoaffinitypurification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370(2003) 430-444.
【非特許文献３４】T. Tamura, T. Kunimatsu, S.T. Yee, O. Igarashi, M. Utsuyama, S.Tanaka, S. Miyazaki, K. Hirokawa, H. Nariuchi, Molecular mechanism of theimpairment in activation signal transduction in CD4+ T cells fromold mice, Int. Immunol. 12 (2000) 1205-1215.
【非特許文献３５】N. Yamaguchi, M.N. Fukuda, Golgi retention mechanism of β-1,4-galactosyltransferase: membrane-spanning domain-dependenthomodimerization and association with α- and β-tubulins, J. Biol. Chem. 270 (1995) 12170-12176.
【非特許文献３６】M. Shimizu, H. Nakamura, T. Hirabayashi, A. Suganami, Y. Tamura, T.Murayama, Ser515 phosphorylation-independent regulation of cytosolicphospholipase A2α (cPLA2α) bycalmodulin-dependent protein kinase: possible interaction with catalytic domainA of cPLA2α, Cell. Signal. 20 (2008) 815-824.
【非特許文献３７】R.A. Klinghoffer, C. Sachsenmaier, J.A. Cooper, P. Soriano, Srcfamily kinases are required for integrin but not PDGFR signal transduction,EMBO J. 18 (1999) 2459-2471.
【非特許文献３８】Y. Durocher, S. Perret, A. Kamen, High-level and high-throughputrecombinant protein production by transient transfection of suspension-growinghuman 293-EBNA1 cells, Nucleic Acids Res. 30 (2002) E9.
【非特許文献３９】M. Izumi, H. Miyazawa, T. Kamakura, I. Yamaguchi, T. Endo, F.Hanaoka, Blasticidin S-resistance gene (bsr): a novel selectable marker formammalian cells, Exp. Cell Res. 197 (1991) 229-233.
【非特許文献４０】T. Kanda, K.F. Sullivan, G.M. Wahl, Histone-GFP fusion proteinenables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells,Curr. Biol. 8 (1998) 377-385.
【非特許文献４１】Y.W. Lam, C.E. Lyon, A.I. Lamond, Large-scale isolation of Cajalbodies from HeLa cells, Mol. Biol. Cell 13 (2002) 2461-2473.
【非特許文献４２】K. Kasahara, Y. Nakayama, Y. Nakazato, K. Ikeda, T. Kuga, N.Yamaguchi, Src signaling regulates completion of abscission in cytokinesisthrough ERK/MAPK activation at the midbody, J. Biol. Chem. 282 (2007)5327-5339.
【非特許文献４３】T. Kuga, M. Hoshino, Y. Nakayama, K. Kasahara, K. Ikeda, Y. Obata,A. Takahashi, Y. Higashiyama, Y. Fukumoto, N. Yamaguchi, Role of Src-familykinases in formation of the cortical actin cap at the dorsal cell surface, Exp.Cell Res. 314 (2008) 2040-2054.
【非特許文献４４】J. Tada, M. Omine, T. Suda, N. Yamaguchi, A common signaling pathwayvia Syk and Lyn tyrosine kinases generated from capping of the sialomucins CD34and CD43 in immature hematopoietic cells, Blood 93 (1999) 3723-3735.
【非特許文献４５】E. Minc, Y. Allory, H.J. Worman, J.C. Courvalin, B. Buendia,Localization and phosphorylation of HP1 proteins during the cell cycle inmammalian cells, Chromosoma 108 (1999) 220-234.
【非特許文献４６】A. Hirao, I. Hamaguchi, T. Suda, N. Yamaguchi, Translocation of theCsk homologous kinase (Chk/Hyl) controls activity of CD36-anchored Lyn tyrosinekinase in thrombin-stimulated platelets, EMBO J. 16 (1997) 2342-2351.
【非特許文献４７】J.P. Mitchell, N.S. Cohn, M. Van der Ploeg, Quantitative changes inthe degree of chromatin condensation during the cell cycle in differentiatingPisum sativum vascular tissue, Histochemistry 78 (1983) 101-109.
【非特許文献４８】H. Santos-Rosa, R. Schneider, A.J. Bannister, J. Sherriff, B.E.Bernstein, N.C. Emre, S.L. Schreiber, J. Mellor, T. Kouzarides, Active genesare tri-methylated at K4 of histone H3, Nature 419 (2002) 407-411.
【非特許文献４９】S. Gupta, D. Campbell, B. Derijard, R.J. Davis, Transcription factorATF2 regulation by the JNK signal transduction pathway, Science 267 (1995)389-393.
【非特許文献５０】C. Livingstone, G. Patel, N. Jones, ATF-2 contains aphosphorylation-dependent transcriptional activation domain, EMBO J. 14 (1995)1785-1797.
【非特許文献５１】I. Hers, C.J. Bell, A.W. Poole, D. Jiang, R.M. Denton, E. Schaefer,J.M. Tavare, Reciprocal feedback regulation of insulin receptor and insulinreceptor substrate tyrosine phosphorylation by phosphoinositide 3-kinase inprimary adipocytes, Biochem. J. 368 (2002) 875-884.
【非特許文献５２】G. Huyer, S. Liu, J. Kelly, J. Moffat, P. Payette, B. Kennedy, G.Tsaprailis, M.J. Gresser, C. Ramachandran, Mechanism of inhibition ofprotein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate, J. Biol. Chem. 272(1997) 843-851.
【非特許文献５３】A.K. Jain, A.K. Jaiswal, GSK-3β actsupstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2related factor 2, J. Biol. Chem. 282 (2007) 16502-16510.
【非特許文献５４】R. Schmitz, G. Baumann, H. Gram, Catalytic specificity ofphosphotyrosine kinases Blk, Lyn, c-Src and Syk as assessed by phage display,J. Mol. Biol. 260 (1996) 664-677.
【非特許文献５５】M. Tachibana,K. Sugimoto,M. Nozaki,J. Ueda,T. Ohta,M. Ohki,M. Fukuda,N. Takeda,H. Niida,H. Kato,Y. Shinkai,G9a histone methyltransferase plays a dominant role in euchromatic histone H3lysine 9 methylation and is essential for early embryogenesis, Genes Dev. 16(2002) 1779-1791.
【非特許文献５６】R.H. Tao, I.N. Maruyama, All EGF (ErbB) receptors have preformedhomo- and heterodimeric structures in living cells. J. Cell Sci. 121 (2008)3207-3217.
【非特許文献５７】T. Kuga, Y. Nakayama, M. Hoshino, Y. Higashiyama, Y. Obata, D.Matsuda, K. Kasahara, Y. Fukumoto, N. Yamaguchi, Differential mitoticactivation of endogenous c-Src, c-Yes, and Lyn in HeLa cells, Arch. Biochem.Biophys. 466 (2007) 116-124.
【非特許文献５８】T. Cremer, M. Cremer, S. Dietzel, S. Mueller, I. Solovei, S. Fakan, Chromosometerritories--a functional nuclear landscape, Curr. Opin. Cell Biol. 18 (2006) 307-316.
【非特許文献５９】E. Meshorer, T. Misteli, Chromatin in pluripotent embryonic stemcells and differentiation, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (2006) 540-546.
【非特許文献６０】P. Blume-Jensen, T. Hunter, Oncogenic kinase signaling, Nature 411(2001) 355-365.
【非特許文献６１】D. Plehn-Dujowich, P. Bell, A.M. Ishov, C. Baumann, G.G. Maul,Non-apoptotic chromosome condensation induced by stress: delineation ofinterchromosomal spaces, Chromosoma 109 (2000) 266-279.
【非特許文献６２】Y. Shav-Tal, X. Darzacq, S.M. Shenoy, D. Fusco, S.M. Janicki, D.L.Spector, R.H. Singer, Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells,Science 304 (2004) 1797-1800.
【非特許文献６３】H. Albiez, M. Cremer, C. Tiberi, L. Vecchio, L. Schermelleh, S. Dittrich,K. Kuepper, B. Joffe, T. Thormeyer, J. von Hase, S. Yang, K. Rohr, H. Leonhardt,I. Solovei, C. Cremer, S. Fakan, T. Cremer, Chromatin domains and theinterchromatin compartment form structurally defined and functionallyinteracting nuclear networks, Chromosome Res. 14 (2006) 707-733.
【非特許文献６４】G. Manning, D.B. Whyte, R. Martinez, T. Hunter, S. Sudarsanam, Theprotein kinase complement of the human genome, Science 298 (2002) 1912–1934.
【非特許文献６５】S.H. Ahn, W.L. Cheung, J.Y. Hsu, R.L. Diaz, M.M. Smith, C.D. Allis,Sterile 20 kinase phosphorylates histone H2B at serine 10 during hydrogenperoxide-induced apoptosis in S. cerevisiae, Cell 120 (2005) 25-36.
【非特許文献６６】W. Fischle, B.S. Tseng, H.L. Dormann, B.M. Ueberheide, B.A. Garcia,J. Shabanowitz, D.F. Hunt, H. Funabiki, C.D. Allis, Regulation of HP1-chromatinbinding by histone H3 methylation and phosphorylation, Nature 438 (2005)1116-1122.
【非特許文献６７】T. Kouzarides, Chromatin modifications and their function, Cell 128(2007) 693-705.
【非特許文献６８】M. Dundr, T. Misteli, Functional architecture in the cell nucleus,Biochem. J. 356 (2001) 297-310.
【非特許文献６９】D.K. Pokholok, J. Zeitlinger, N.M. Hannett, D.B. Reynolds, R.A.Young, Activated signal transduction kinases frequently occupy target genes,Science 313 (2006) 533-536.
【非特許文献７０】M.A. Meyn III, S.J. Schreiner, T.P. Dumitrescu, G.J. Nau, T.E.Smithgall, SRC family kinase activity is required for murine embryonic stemcell growth and differentiation, Mol. Pharmacol. 68 (2005) 1320-1330.
【非特許文献７１】A.H. Fischer, D.N. Chadee, J.A. Wright, T.S. Gansler, J.R. Davie,Ras-associated nuclear structural change appears functionally significant andindependent of the mitotic signaling pathway, J. Cell. Biochem. 70 (1998)130-140.
【非特許文献７２】D. Komitowski, C. Janson, Quantitative features of chromatinstructure in the prognosis of breast cancer, Cancer 65 (1990) 2725-2730.
【発明の概要】
【０００８】
本発明の特徴は、ピクセルイメージング法を使用して１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造変化を定量的に評価することである。１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を評価する方法は、１つ又は複数の細胞の試料を用意すること、及び該１つ又は複数の細胞を核酸染色剤で処理することを含み得る。核酸染色剤で処理した細胞のうち１つ又は複数の細胞の核の画像（複数のピクセルを含む）をキャプチャーする（capture）ことができる。該複数のピクセルの各ピクセルで染色強度を定量することができ、１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出することができる。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値に基づき定量することができる。クロマチン構造変化を、クロマチン凝縮のレベルに基づき判定することができる。
【０００９】
本発明の別の特徴は、クロマチン構造を評価する方法を使用して被験体における病変を診断、予後診断（prognosis）又はモニタリングする方法を提供することである。クロマチン構造を、被験体由来の病変細胞の試料に関して評価することができる。疾患状態を、１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値に基づき判定することができる。
【００１０】
本発明の別の特徴は、クロマチン構造を評価する方法を使用して被験体における癌を診断、予後診断又はモニタリングする方法を提供することである。クロマチン構造を、被験体由来の癌性細胞の試料に関して評価することができる。悪性疾患を、１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値に基づき判定することができる。
【００１１】
本発明の別の特徴は、クロマチン構造を評価する方法を使用して細胞のクロマチン構造を調節する（modulate）化合物をスクリーニングする方法を提供することである。細胞の試料を該化合物と接触させることができ、細胞の試料におけるクロマチン構造を評価することができる。化合物と接触させた細胞の１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値を、対照細胞の１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値と比較し、細胞のクロマチン構造を調節する化合物を同定することができる。
【００１２】
本発明の別の特徴は、細胞におけるクロマチン構造を評価するシステムを提供することである。該システムは、核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の、少なくとも１つの画像をキャプチャする光学機器と、該画像の各ピクセルでの染色強度を定量する分光計機器とを含み得る。該分光計機器は、該光学機器と光学的に接続されていてもよく、また、計算機器と動作可能に接続されていてもよい。該システムは、１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出する計算機器と、算出した平均値及びＳＤ値を表示する表示機器とをさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図１Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図１Ｃ】図１Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイル（2D isometric intensity profile）を示す図である。
【図２Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図２Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図２Ｃ】図２Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図３Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図３Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図３Ｃ】図３Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図４Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図４Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図４Ｃ】図４Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図５Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図５Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図５Ｃ】図５Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図６Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図６Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図６Ｃ】図６Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図７Ａ】非同期化した（asynchronized）細胞集団に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図７Ｂ】Ｓ期が豊富な（enriched）細胞集団に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図７Ｃ】Ｇ２期が豊富な細胞集団に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図８】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図９】抗リン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０抗体及びＰＩで染色した細胞の蛍光画像である。
【図１０】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１１Ａ】表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１１Ｂ】表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１１Ｃ】表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１１Ｄ】表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１２】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１３】ＤＮＡ及びヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰの染色の蛍光画像である。
【図１４Ａ】低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図１４Ｂ】低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、血清で（５％ＦＢＳ）で５時間刺激したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図１５】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１６】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１７Ａ】低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、表示した時間血清（５％ＦＢＳ）で刺激したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１７Ｂ】低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、表示した時間血清（５％ＦＢＳ）で刺激したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１８Ａ】ＰＩ及び抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図１８Ｂ】ＰＩ及び抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体に関する蛍光強度プロットである。
【図１９Ａ】ＰＩ及び抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図１９Ｂ】ＰＩ及び抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体に関する蛍光強度プロットである。
【図２０Ａ】ＰＩ及び抗ＨＰ１α抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２０Ｂ】ＰＩ及び抗ＨＰ１α抗体に関する蛍光強度プロットである。
【図２１Ａ】血清飢餓状態にした（serum-starved）ＣＯＳ−１細胞に関するＰＩ及び抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２１Ｂ】血清飢餓状態にし、５％ＦＢＳで３０分間刺激したＣＯＳ−１細胞に関するＰＩ及び抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２２】ＤＭＳＯ、１０μＭのＰＰ２、又は１００ｎＭのワートマニンで２４時間処理し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２３】ＤＭＳＯ単独で、又は１０μＭのＰＰ２で２１時間前処理し、その後３ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）で３時間インキュベーションしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２４】０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でｉｎ ｓｉｔｕで抽出し、その後固定して抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色した細胞に関するＤＮＡ及びｐＴｙｒの染色の蛍光画像である。
【図２５】図２４に関して説明した実験から得られたデータに基づく核中抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度を示すグラフである。
【図２６】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図２７Ａ】表示したように処理したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図２７Ｂ】表示したように処理したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図２７Ｃ】表示したように処理したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図２７Ｄ】表示したように処理したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図２８】３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、ＰＩと抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体又は抗ＨＰ１α抗体とで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２９】ＣＯＳ−１細胞から調製した精製核に関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３０】精製核中のｐＴｙｒ及びＤＮＡの蛍光画像である。
【図３１】精製核中の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度を示すグラフである。
【図３２】ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ及びＮＬＳ−Ｓｙｋの模式図である。ＮＬＳ、核局在シグナル；ＳＨ、Ｓｒｃ相同ドメイン；ＰＴＫ、タンパク質−チロシンキナーゼドメイン；ＨＡ、ＨＡ−エピトープタグ；ＫＤ、キナーゼ活性のない（kinase-dead）Ｋ２７５Ａ突然変異。
【図３３】表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養して抗ｐＴｙｒ抗体と抗ＨＡ又は抗Ｓｙｋ抗体とで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するｐＴｙｒ染色の蛍光画像である。
【図３４Ａ】全細胞に関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３４Ｂ】表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養したＣＯＳ−１細胞から調製した精製核に関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３５】表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養してＰＩ及び抗ＨＡ抗体で二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図３６】表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養してＰＩ及び抗Ｓｙｋ抗体で二重に染色したか、又はＧＦＰ蛍光で可視化した、ＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図３７】核中のタンパク質発現を細胞質中のタンパク質発現と比較するグラフである。
【図３８Ａ】何もトランスフェクションしていないＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図３８Ｂ】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図３８Ｃ】Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図３９】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を示すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図４０Ａ】Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１又はＦｌａｇ−Ｇ９ａをトランスフェクションし、３６時間培養して抗Ｆｌａｇ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４０Ｂ】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を示すプロットである。
【図４１】核中の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）対で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図４２】核中の抗ＨＡ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）対で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図４３】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、２４時間培養して抗ＨＡ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞、並びに、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、ＰIと抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体、又は抗ＨＰ１α抗体とで二重に染色した細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４４】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図４５Ａ】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現しているＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４５Ｂ】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図４６】何によっても処理せず、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、そして抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色したＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４７Ａ】何によっても処理しない、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理した、野生型Ｌｙｎ（Ｌｙｎ−ｗｔ）を安定的に発現しているＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４７Ｂ】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡをトランスフェクションし３６時間培養したＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４８Ａ】何によっても処理しない、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理した、野生型ｃ−Ｓｒｃ（ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ）を安定的に発現しているＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４８Ｂ】ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡをトランスフェクションし、３６時間培養したＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４９】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図５０Ａ】何もトランスフェクションしていないＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図５０Ｂ】Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図５０Ｃ】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図５１Ａ】Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、３６時間培養して抗Ｆｌａｇ抗体又は抗ＨＡ抗体とＰＩとで二重に染色したＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図５１Ｂ】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図５２】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図５３】播種し５％ＦＢＳ中で１日間培養し、５％又は０．５％ＦＢＳ中で表示した期間増殖させた、ＣＯＳ−１及びＳＹＦ細胞に関して計測及びプロットした細胞数を示すグラフである。
【図５４】Ｎａ３ＶＯ４で処理し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで染色したＨｅＬａ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図５５】ＨｅＬａ細胞から調製した高度に精製した核のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図５６Ａ】ＮＬＳ−Ｙｅｓ−ＨＡ（キナーゼ活性がある）及びＮＬＳ−Ｆｙｎ−ＨＡ（キナーゼ活性がある）をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図５６Ｂ】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットを示す図である。
【図５７】核と対応する全細胞との間の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度比（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図５８】核中の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図５９Ａ】ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした細胞における、核と対応する全細胞との間の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度比（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図５９Ｂ】ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡの模式図である。
【図６０】ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞から調製した全細胞可溶化物に関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図６１】ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、２４時間培養して抗ＨＡ抗体又は抗ｐＴｙｒ抗体とＰＩとで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図６２】ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡをトランスフェクションした細胞における、核中の抗ＨＡ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図６３】ＮＬＳ−ＧＦＰをトランスフェクションした細胞における、核中のＧＦＰの平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、核のピクセルイメージングを使用してクロマチン構造変化を定量的に評価する方法に関する。核のピクセルイメージングは、核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の１つ又は複数の画像をキャプチャすることを含み得る。染色強度は、その強度を定量することにより測定することができる。１ピクセル当たりの染色強度の平均及び／又は標準偏差をクロマチン凝縮レベル又はクロマチン構造変化を判定するために使用することができる。
【００１５】
本発明者らは、クロマチン構造（architecture）におけるＳＦＫの役割を、クロマチン凝縮レベルを測定することにより判定することができることも見出した。本発明の教示によれば、成長因子刺激は、ＳＦＫにより媒介される核のチロシンリン酸化を通じて、ユークロマチンの低凝縮及び付随するヘテロクロマチンの高凝縮のレベルを増大させ得る。成長因子刺激により、核中のキナーゼ活性があるＳＦＫは、クロマチン構造の動的変化において重要な役割を果たし得る。本発明者らは、成長因子刺激が、Ｇ１期におけるユークロマチンの低凝縮及び付随するヘテロクロマチンの高凝縮を増大させることがあり、そのレベルは３０分までにプラトーに到達し、少なくとも５時間持続し、２４時間後に基礎レベルに戻ることを見出した。本発明者らは、また、ユークロマチン領域においてヘテロクロマチン領域よりもより頻繁に、核中の血清により活性化した（serum-activated）ＳＦＫを検出した。キナーゼ活性があるＳＦＫの核発現が、核のチロシンリン酸化のレベルに応じて、ユークロマチン化及びヘテロクロマチン化（heterochromatinization）の両方を劇的に増大させ得るが、関連のない（unrelated）Ｓｙｋキナーゼではそうならないことも測定された。しかし、成長因子刺激は、ＳＦＫを欠くＳＹＦ細胞におけるクロマチン構造変化を誘発せず、ＳＹＦ細胞へのＳＦＫのメンバーの１つの再導入は、不十分にではあるが、クロマチン構造変化を誘発し得る。これらの結果は、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化が、成長因子刺激によるクロマチン構造変化において重要な役割を果たすことを示唆する。
【００１６】
本発明は、細胞（複数可）におけるクロマチン構造を評価する多数の方法及びシステムに関し、それらは核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の１つ又は複数の画像をキャプチャすることを含み得る。染色強度は、例えばその強度を定量することにより、測定することができる。平均及び／又は標準偏差、例えば画像（複数可）のピクセル（複数可）の平均及び／又は標準偏差を測定又は判定することができる。さらに、クロマチン構造をイメージングにより判定することができる。例えば、標準偏差を、クロマチン凝縮のレベルを理解する方法として、クロマチン構造を判定するのに使用することができる。一例として、本発明は、１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を評価する方法であって、
１つ又は複数の細胞の試料を用意すること、
１つ又は複数の細胞を、例えば核酸染色剤で、処理すること、
核酸染色剤で処理した細胞のうち１つ又は複数の細胞の核の画像（複数のピクセルを含み得る）をキャプチャすること、
複数のピクセルの各ピクセルで染色強度を定量すること、
１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び／又は標準偏差（ＳＤ）値を算出すること、及び
クロマチン構造を判定すること（例えば、ここでＳＤ値がクロマチン凝縮のレベルの指標である）、
を含む、クロマチン構造を評価する方法に関する。１つ又は複数の細胞は、１つ又は複数の生細胞であり得るか、又は、１つ又は複数の真核細胞であり得るか、又は、１つ又は複数の哺乳動物細胞、及び／又は他の種類の細胞、若しくはその任意の組合せであり得る。複数の画像を、任意の期間にわたりキャプチャすることができる。１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び／又はＳＤ値を、各画像に関して算出することができる。その期間にわたるＳＤ値の変化は、例えば任意の期間にわたり、クロマチン構造の変化と相関し得る。核酸染色剤は、蛍光染色剤、又は他の種類の染色剤であり得る。核酸染色剤は、例えばヨウ化プロピジウムであり得る。本発明の方法は、核酸染色剤で処理する前にＲＮａｓｅで細胞を処理することをさらに含み得る。任意選択として、画像を、共焦点顕微鏡又は他の種類の顕微鏡若しくは検出機器を利用して、キャプチャすることができる。１つ又は複数の細胞の試料は、平切断切片（planar section slice）を含み得る。画像は、約５１２×５１２ピクセルの解像度に代えて、任意の解像度で、例えば、１ピクセル当たりの染色強度を理解することを可能にするような解像度で、キャプチャすることができる。平均値及び／又はＳＤ値を、各核の少なくとも２つのキャプチャした画像の平均から算出することができる。核の画像は、任意の量のピクセル、例えば５００ピクセル以上、又は１０００ピクセル以上、又は約６０００ピクセル以上を含み得る。本発明の方法は、１ピクセル当たりの平均染色強度に基づき、クロマチン構造を低凝縮度の、中程度の凝縮度の、又は高凝縮度のものと判定することをさらに含み得る。核酸染色剤はヨウ化プロピジウムを含むことができ、及び／又は１ピクセル当たりの染色強度の平均値は、約２４００〜約３０００の範囲であり得る。この範囲外の他の範囲を使用することができる。
【００１７】
本発明は、被験体における病変を診断、予後診断及び／又はモニタリングする（ｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｉｎ ｖｉｖｏで）方法であって、例えば本発明の方法（複数可）を使用して、被験体由来の病変細胞のうち１つ又は複数の細胞の試料におけるクロマチン構造を評価することを含む、方法にも関する。ＳＤ値は、疾患状態の指標であり得る。該方法は、被験体由来の１つ又は複数の非病変細胞の試料におけるクロマチン構造を評価することをさらに含んでもよく、１つ又は複数の病変細胞の算出したＳＤ値を１つ又は複数の非病変細胞の算出したＳＤ値と比較することを含んでもよい。該方法は、１つ又は複数の病変細胞の算出したＳＤ値を、正常な組織から疾患状態までの進行曲線に沿う範囲にある同じ種類の病変のこれまでに算出したＳＤ値の範囲と比較することをさらに含み得る。その工程は、任意の回数繰り返すことができる。例えば、該工程を、所定の時間の経過後に、該病変が疾患状態に進行しているのか、又は疾患状態から退行して（regressed）いるのかを判定するために、繰り返すことができる。病変の進行（例えば、所定の時間の間の）を、病変を治療する方法の有効性を測定するために利用することができる。本発明は、被験体における癌を診断、予後診断及び／又はモニタリングする方法（ｉｎ ｖｉｖｏで又はｉｎ ｖｉｔｒｏで）であって、被験体由来の１つ又は複数の癌性細胞の試料におけるクロマチン構造を本発明に従って評価することを含む方法に関し、ここでＳＤ値は悪性疾患又は病状の指標であり得る。該方法は、被験体由来の１つ又は複数の非癌性細胞の試料におけるクロマチン構造を本発明に従って評価すること、及び任意に、１つ又は複数の癌性細胞の算出したＳＤ値を、１つ又は複数の非癌性細胞の算出したＳＤ値と比較することをさらに含み得る。該方法は、１つ又は複数の癌性細胞の算出したＳＤ値を、正常な組織から悪性疾患までの進行曲線に沿う範囲にある同じ種類の癌のこれまでに算出したＳＤ値の範囲と比較することをさらに含み得る。その工程は、任意の回数繰り返すことができる。該工程を、所定の時間の経過後に、癌が悪性疾患に進行しているのか、又は悪性疾患から退行しているのかを判定するために、繰り返すことができる。
【００１８】
本発明は、１つ又は複数の細胞のクロマチン構造を調節する化合物をスクリーニングする（又は判定する）方法にも関し得る。この方法は、
１つ又は複数の細胞を化合物と接触させること、
１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を上述したように評価すること、及び
化合物と接触させた１つ又は複数の細胞のＳＤ値を１つ又は複数の対照細胞のＳＤ値と比較すること、
を含み得る。該化合物は、１つ又は複数の細胞の有糸分裂の進行を刺激することができる。該化合物は、１つ又は複数の細胞におけるアポトーシスを誘発することができる。該化合物は、成長因子を含み得る。
【００１９】
本発明は、１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を評価するシステムにも関する。このシステムは、
核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の、少なくとも１つの画像をキャプチャする光学機器（又は他の機器）、
画像の各ピクセルで染色強度を定量する分光計機器（又は他の機器）であって、光学機器に光学的に接続されており、計算機器と動作可能に接続されている分光計機器、並びに
任意に、１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出する計算機器、及び
任意に、算出した平均値及びＳＤ値を表示する表示機器、
を含み得る。該光学機器は、共焦点顕微鏡を含み得る。該分光計機器は、ヨウ化プロピジウム又は他の化合物により放射される光を検出することができる。
【実施例】
【００２０】
本発明は、以下の実施例と得られたデータとを参照して、さらにより十分に理解することができる。
【００２１】
材料及び方法
プラスミド。ヒト野生型ｃ−Ｓｒｃ（ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ、１−５３６、開始メチオニンを１と定める）（（非特許文献２４）、D. J. Fujitaにより提供された）をコードするｃＤＮＡを、従前（非特許文献７）のようにｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Invitrogen）中にサブクローニングした。Ｃ−末端にＨＡエピトープタグを付したＳｒｃ−ＨＡ（１−５３２）は、ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ ｃＤＮＡをｐＭＨベクター（Roche）中にサブクローニングすることにより構築した。ヒト野生型Ｌｙｎ（Ｌｙｎ−ｗｔ）をコードするｃＤＮＡは、T. Yamamotoにより提供された（１−５１２、（非特許文献２５））。Ｃ−末端の負の調節テールを欠くＬｙｎにＨＡ−タグを付した構築物、Ｌｙｎ−ＨＡ（１−５０６、キナーゼ活性がある）及びＬｙｎ（Ｋ２７５Ａ）−ＨＡ（１−５０６、キナーゼ活性がない）は、以前に説明した（非特許文献５）。ヒト野生型Ｆｙｎ（１−５３７、（非特許文献２６））及びヒト野生型ｃ−Ｙｅｓ（１−５４３、（非特許文献２７））（T. Yamamotoにより提供された）をコードするｃＤＮＡは、Ｃ−末端にＨＡエピトープタグを付した。Ｃ−末端の負の調節テールを欠くＨＡ−タグを付した構築物、Ｆｙｎ−ＨＡ（１−５２４、キナーゼ活性がある）及びＹｅｓ−ＨＡ（１−５３０、キナーゼ活性がある）は、ｐＭＨ中にサブクローニングすることにより構築した。ヒト野生型Ｓｙｋ（１−６３５、（非特許文献２８））（E.A. Clarkにより提供された）をコードするｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ中にサブクローニングした。構築物のＮ−末端に核局在シグナル（ＮＬＳ）（非特許文献２９）を導入するために、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＮＬＳ−ｍｃｓベクターを、ＮＬＳ−Ｃｈｋ（ＰＴＫ）−ＦＬＡＧ（非特許文献３０）をコードするｐｃＤＮＡ４／ＴＯのＢａｌＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片と、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクターのＥｃｏＲＶ−ＢｓｓＨＩＩ断片とを置換することにより構築した。ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＮＬＳ−ｍｃｓ中のＳｒｃ−ＨＡ、Ｌｙｎ−ＨＡ、Ｌｙｎ（Ｋ２７５Ａ）−ＨＡ、Ｆｙｎ−ＨＡ、Ｙｅｓ−ＨＡ及びＳｙｋのＮ−末端にＮＬＳを添加した。ＮＬＳ融合緑色蛍光タンパク質（ＮＬＳ−ＧＦＰ）を、以前に説明したように構築し、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ中にサブクローニングした（非特許文献３０、３１）。ｐｃＤＮＡ３／Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びｐｃＤＮＡ３／Ｆｌａｇ−Ｇ９ａは、M. Nakao及びY. Shinkaiにより提供された（非特許文献３２）。ヒトＣＤ２５をコードするｃＤＮＡは、A. Iwamaにより提供された（非特許文献３３）。ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡは、Ｌｙｎ−ＨＡのＮ末端でのＣＤ２５（１−２７０）との融合により構築し、配列番号１の配列（Ｉ−Ｐ−Ｅ−Ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｃ−Ｗ−Ｔ−Ｒ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｓ−Ｐ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｎ）をＣＤ２５及びＬｙｎ−ＨＡの間に挿入した。
【００２２】
抗体。以下の抗体を使用した：リン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）（４Ｇ１０及びポリクローナル抗体：Upstate Biotechnology, Inc、T. Tamura及びT. Yoshimoto（非特許文献３４）により提供された）、ＨＡエピトープ（Ｆ−７及びＹ−１１、Santa Cruz Biotechnology、及び１２ＣＡ５）、Ｆｌａｇエピトープ（Ｍ２、Sigma）、Ｓｒｃ（ＧＤ１１、Upstate Biotechnology, Inc.）、Ｌｙｎ（Ｌｙｎ４４、Santa Cruz Biotechnology）、Ｙｅｓ（Ｙｅｓ１、BD PharMingen）、Ｆｙｎ（Ｆｙｎ−３、Santa Cruz Biotechnology）、Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］（リン酸化Ｓｒｃ−ファミリー、Cell Signaling Technology）、ラミンＢ１（Ｌ−５、Zymed）、Ｓｙｋ（４Ｄ１０、Santa Cruz Biotechnology）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）（（非特許文献３５）、M.N. Fukudaにより提供された）、デスモグレイン（クローン６２、BD TransductionLaboratories）、アクチン（クローンＣ４、CHEMICON International）、細胞質ホスホリパーゼＡ２α（ｃＰＬＡ２α）（４−４Ｂ−３Ｃ、Santa Cruz Biotechnology、T. Murayamaにより提供された（非特許文献３６））、リジン４がトリメチル化されたヒストンＨ３（ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３）（ａｂ１０１２及びａｂ８５８０、Abcam）、ヘテロクロマチンタンパク質−１α（ＨＰ１α）（ＭＡＢ３４４６、CHEMICONInternational）、リン酸化ＡＴＦ−２（リン酸化スレオニン６９及びリン酸化スレオニン７１、ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１）（ＡＴＦ−２２Ｐ、Sigma）及びリン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（リン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０）（６Ｇ３、Cell Signaling Technology）。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−Ｆ（ａｂ’）２二次抗体は、Amersham Bioscienceから購入した。ＩｇＧのＦＩＴＣ−Ｆ（ａｂ’）２、又はＴＲＩＴＣ−ＩｇＧ二次抗体は、BioSource International及びSigma−Aldrichから入手した。
【００２３】
細胞及びトランスフェクション。ＣＯＳ−１、ＨｅＬａ細胞（Japanese Collection of Research Bioresources、Osaka）、ＭＣＦ−７（H. Sayaにより提供された）、Ａ４３１（M.N. Fukudaにより提供された）、ＨＥＫ２９３（M. Tagawaにより提供された）、ＨＣＴ１１６（T. Tomonagaにより提供された）及びＳＹＦ（（非特許文献３７）、M. Okada及びS. Nadaにより提供された）は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するイスコブ変法ＤＭＥ中で細胞を培養した。細胞の一過性トランスフェクションは、Ｔｒａｎｓ ＩＴ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Mirus）（非特許文献１６）を使用して０．５μｇのプラスミドベクターで行うか、又は直鎖ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ）（Polyscience, Inc.）（非特許文献３８）を使用して１μｇのプラスミドベクターで行った。成長因子刺激のために、ＣＯＳ−１細胞を低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、血清（５％ＦＢＳ）で再刺激した。内在性ＳＦＫの刺激のために、細胞を３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、そしてＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化を、Ｎａ３ＶＯ４処理の前に１０μＭのＰＰ２（ＳＦＫ阻害剤、Calbiochem）、又は１００ｎＭのワートマニン（ＰＩ３Ｋ阻害剤、AlomoneLabs）で２１時間処理することにより確認した。Ｎａ３ＶＯ４は、使用前に５００ｍＭの非緩衝化ＨＥＰＥＳ中に５００ｍＭで溶解した。安定なトランスフェクタントクローンの調製のために、ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ又はＬｙｎ−ｗｔをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞は３３３μｇ／ｍＬのゼオシン（Invitrogen）中で選択し、そしてＣＯＳ−１細胞はＧＦＰ−タグを付したヒストンＨ２Ｂ（（非特許文献３９、４０）、H. Sayaにより提供された）をコードするＢＯＳＨ２ＢＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクションして３μｇ／ｍＬのブラストサイジン中で選択した。
【００２４】
核の精製。核を、以前に説明した（非特許文献４１）ように調製した。簡潔には、ＣＯＳ−１及びＨｅＬａ細胞を、プロテアーゼ阻害剤（２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、５０μｇ／ｍＬ アプロチニン、１００μＭ ロイペプチン、及び２５μＭ ペプスタチンＡ）を含有する低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、及び１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）中で４℃にて２０分間膨張させ、その後、密着式（tight-fitting）の１ｍｌ容のＤｏｕｎｃｅホモジナイザ中で２０ストロークを行い均質化した。細胞懸濁液を２００×ｇで５分間遠心分離した後、細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＮａ３ＶＯ４を含有する０．２５Ｍのショ糖中で再懸濁した。得られた懸濁液を、プロテアーゼ阻害剤、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＮａ３ＶＯ４を含有する０．３５Ｍのショ糖層の最上部に装荷し、１６４０×ｇで５分間、遠心分離した。ペレットを低張緩衝液で洗浄し、２００×ｇで５分間、遠心分離し、ＳＤＳ−試料緩衝液中で可溶化した。
【００２５】
免疫蛍光。共焦点画像及びノマルスキー微分干渉コントラスト画像は、４０×１．００ＮＡ油浸及び１００×１．３５ＮＡ油浸対物レンズを有するＦｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ５００共焦点レーザー走査式顕微鏡（オリンパス株式会社、東京）と、６３×１．４０ＮＡ油浸対物レンズを有するＬＳＭ ５１０共焦点レーザー走査式顕微鏡（Zeiss）とを使用して、記載のように（非特許文献７、８、１６、３０、４２、４３）得た。１枚の平（ｘｙ）切断切片（０．６μｍ厚）を、全ての実験で示す。簡潔には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、０．１％サポニン及び３％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で室温にて透過処理した（非特許文献３５）。細胞をその後適当な一次抗体と１時間反応させ、０．１％サポニンを含有するＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ−又はＴＲＩＴＣ−結合型二次抗体で１時間染色した。ＤＮＡ染色に関しては、細胞をその後、２００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａで１時間、及び２０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で３０分間処理し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ａｎｔｉｆａｄｅ（商標）試薬（Molecular Probes）でマウントした。フルオレセインシグナルから赤のチャネルへの漏れ（bleed-through）がないことを確実にするために、フルオレセイン及びローダミンをそれぞれ４８８ｎｍ又は５４３ｎｍで独立して励起させた。ＰＩは４８８ｎｍ又は５４３ｎｍで励起させた。発光シグナルは、フルオレセインに関しては５０５ｎｍ〜５２５ｎｍで、ローダミンに関しては５６０ｎｍ超で、ＰＩに関しては６１０ｎｍ超で、検出した（非特許文献４４）。混成図は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０及びＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ９．０ソフトウェア（Adobe）を使用して作成した。抗ｐＴｙｒ抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体及び抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体での核染色のために、細胞は、４％パラホルムアルデヒドでの固定の前に、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いてｉｎ ｓｉｔｕで４℃にて３分間抽出した（非特許文献３１）。ＨＰ１α染色に関しては、細胞を、−２０℃で１０分間、１００％メタノール中で固定し、その後０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中で、室温で３０分間透過処理した。細胞を、抗ＨＰ１α抗体と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで４回洗浄し、二次抗体で１時間染色した（非特許文献４５）。抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体及び抗ＨＰ１α抗体での染色、並びにＰＩ染色の蛍光強度プロット（それぞれ図１８Ｂ、図１９Ｂ及び図２０Ｂを参照されたい）を、Ｆｌｕｏｖｉｅｗバージョン４．３ ソフトウェア（オリンパス株式会社、東京）を使用して生成した。核ＳＦＫのキナーゼ活性の検出に関しては、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、及び０．１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）中に懸濁した精製核を、１０μＭ ＰＰ２と共に又は無しで３０℃にて３０分間プレインキュベーションし、次いで５μＭ又は１０μＭのＡＴＰと共に３０℃で３０分間インキュベーションし、その後２００×ｇで５分間、細胞遠心分離（cytocentrifugation）し、そして４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＤＮＡは、２０μｇ／ｍＬのＰＩ、及び２００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａと共に３０分間染色した。核中のチロシン−リン酸化タンパク質の平均蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（National Institutes of Health）を使用して測定した。
【００２６】
クロマチン凝縮レベルの定量。ＰＩ染色した核の共焦点画像は、上述のように得た。５１２×５１２ピクセルの解像度で表示したプロファイルは、同じ焦点面での５回のスキャンの平均から得た。１つの平（ｘｙ）切断切片の厚みは０．６μｍであり１個の核は６０００ピクセル〜１００００ピクセルを含有する。各ピクセルのＰＩ蛍光強度を定量し、そして個々の核に関する１ピクセル当たりの蛍光強度のヒストグラムを、Ｆｌｕｏｖｉｅｗバージョン４．３ソフトウェア（オリンパス株式会社、東京）を使用して生成した。１つの低凝縮度クロマチン領域は、通常、２００を超えるピクセルを含む。１ピクセル当たりの蛍光強度のバックグラウンドレベルは、０〜７００の範囲内であった。１ピクセル当たりの蛍光強度の平均値及びＳＤ値を、各細胞において核を占有する全ピクセルから算出した。クロマチン凝縮のレベルは、各細胞に関する１ピクセル当たりの蛍光強度の平均値が２４００〜３０００の範囲である条件下での各細胞に関するＳ．Ｄ．値により表した。ＰＩ染色の２次元（２Ｄ）等角投影法による強度プロファイル（画像解像度:７０×７０ピクセル）は、Ｆｌｕｏｖｉｅｗバージョン４．３（オリンパス株式会社、東京）とＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００４ソフトウェアとを使用して生成した。核を約３０００ピクセルに分割し、１つの表示されたピクセルは、２〜３ピクセルを含み、これらのピクセルを平均値及びＳ．Ｄ．値の定量のために使用した。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃから図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃまでは、Ｐ．Ｉ．染色した核の各表示されたピクセルに関する平均値及びＳ．Ｄ．値と、対応するヒストグラムと、Ｐ．Ｉ．染色の２Ｄ等角投影法による強度プロファイルとを示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値の、個々の核内の抗ｐＴｙｒ染色若しくは抗ＨＡ染色又はＧＦＰの平均蛍光強度に対する２Ｄ−プロット解析は、図４１、図４２、図６２及び図６３に示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値の２Ｄ−プロット解析は、Ｆｌｕｏｖｉｅｗバージョン４．３ソフトウェアを使用して生成し、（ａ）核中の抗ｐＴｙｒ染色の積分蛍光強度と対応する全細胞中の抗ｐＴｙｒ染色の積分蛍光強度との比（核／全細胞）に対するものは、図５７及び図５９Ａに示し、（ｂ）核中の抗ｐＴｙｒ染色の積分蛍光強度に対するものは、図５８に示す。
【００２７】
細胞周期分析。Ｓ期及びＧ２期の細胞を得るために、５％ＦＢＳを含有するイスコブ変法ＤＭＥ中で増殖させたＣＯＳ−１細胞を、３ｍＭのチミジンに１８時間曝露することによりＳ期で停止させた（blocked）。細胞を、ＰＢＳで洗浄してチミジンを含まないものとし、さらに２時間又は５時間培養した。細胞をトリプシン処理により引き剥し、１．５％ パラホルムアルデヒド中で４℃にて１時間固定し、その後７０％ エタノールで−３０℃で１時間以上、透過処理した。固定した細胞を、３％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、２００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ及び５０μｇ／ｍｌ ＰＩで３７℃にて３０分間処理しＤＮＡを染色した。細胞周期は、４８８ｎｍアルゴンレーザー（Beckman Coulter）を備え付けたＭｏＦｌｏセルソーターを使用するフローサイトメトリーにより分析した。Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした細胞を、３６時間培養し、上述のように固定及び透過処理した。固定した細胞は３％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄し、抗ＨＡ抗体で１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ−結合型二次抗体で１時間染色した。上述のようにＰＩでのＤＮＡ染色の後、Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡを発現している細胞において、細胞周期を分析した。
【００２８】
ウェスタンブロッティング。ウェスタンブロッティングは、化学発光増幅（enhanced chemiluminescence）（AmershamBioscience）で、以前に説明したように（非特許文献５、１６、４６）行った。全細胞又は精製核の可溶化物をＳＤＳ−試料緩衝液中で調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、二フッ化ポリビニリデン膜上への電気的転写を行った。タンパク質バンドを適当な抗体で検出し、Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士フィルム株式会社、東京）を使用してＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅソフトウェアで分析した。製造業者の取扱説明書に従い、剥離緩衝液中での膜からの一次抗体の完全な除去後、又は０．１％のＮａＮ３によるＨＲＰの不活性化後に、様々な抗体での膜の連続的再プローブ（reprobing）を行った。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０及びＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ９．０ソフトウェア（Adobe）を使用して混成図を作成した。
【００２９】
結果
クロマチン構造変化の定量。図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ及び図６Ａは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像を示す。「材料及び方法」で説明したように、画像を多数のピクセルに等しく分割した。各ピクセルの蛍光強度を測定し、平均強度及びＳ．Ｄ．値を各細胞に関して算出した。スケールバーは１０μｍを示す。図１Ｂ、図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ、図５Ｂ及び図６Ｂに示すヒストグラムは、低凝縮度のＤＮＡ（７００≦１ピクセル当たりの蛍光強度＜２２００、緑色）、中程度の凝縮度のＤＮＡ（２２００≦１ピクセル当たりの蛍光強度≦３２００、黄色）、高凝縮度のＤＮＡ（１ピクセル当たりの蛍光強度＞３２００、赤色）及びバックグラウンド（１ピクセル当たりの蛍光強度＜７００、青色）の領域を表す。２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを、図１Ｃ、図２Ｃ、図３Ｃ、図４Ｃ、図５Ｃ及び図６Ｃに示す。右に示すＰＩ蛍光強度のスペクトル（０〜４０９５）は、高凝縮度のＤＮＡ（赤色）、中程度の凝縮度のＤＮＡ（黄色）、低凝縮度のＤＮＡ（緑色）及びバックグラウンド（青色）を表す。図７Ａ〜図７Ｃ及び図８は、「材料及び方法」で説明したように、Ｓ期又はＧ２期で同期化したＣＯＳ−１細胞に関する。ＤＮＡ含有量は、非同期化した細胞と、Ｓ期及びＧ２期が豊富な細胞集団とに関してフローサイトメトリーにより分析し、結果はそれぞれ図７Ａ〜図７Ｃにヒストグラムとして示す。Ｇ２期が豊富な細胞集団は、Ｇ２期に同期化した細胞から得た。ピークは、２Ｎ（Ｇ１期）及び４Ｎ（Ｇ２期）のＤＮＡ含有量を表す。図８に示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数８１〜９４）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意でない）。図９及び図１０は、３ｍＭのチミジンに１８時間曝露することによりＳ期で停止させ、洗浄してチミジンを含まないものとし、さらに９時間培養したＣＯＳ−１細胞に関する。細胞を、ＤＮＡに関して抗リン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０抗体及びＰＩで染色し、有糸分裂の染色体を検出した。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を図９に示す。スケールバーは１０μｍを示す。図１０におけるプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は代表的な実験（細胞数３５〜７４）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１１Ａ〜図１１Ｄ及び図１２は、表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関する。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析し、結果を図１１Ａ〜図１１Ｄにヒストグラムとして示す。図１２におけるプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は代表的な実験（細胞数６１〜７８）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１３は、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現している、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関する。ＤＮＡ及びヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰの染色の蛍光画像を図１３に示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を、図１３に示した画像の上部に示す。スケールバーは１０μｍを示す。
【００３０】
血清成長因子に誘発されるクロマチン構造の変化。ＣＯＳ−１細胞を、低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、血清（５％ＦＢＳ）で５時間刺激し、その後ＤＮＡに関してＰＩで染色した。ＤＮＡ染色の蛍光画像を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を、図１４Ａ及び図１４Ｂに示した画像の上部に示す。スケールバーは１０μｍを示す。図１５及び図１６は、Ｓ．Ｄ．値を使用してクロマチン凝縮レベルを定量するグラフである。図１５及び図１６では血清刺激を、表示した時間で、１０μＭのＰＰ２の存在下又は非存在下において示す。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は溶媒対照である。図１５及び図１６におけるプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数７１〜１１６）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した飢餓と刺激との間の有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意でない）。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析した。図１７Ａ及び図１７Ｂは、ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。図１８Ａ〜図１８Ｂ、図１９Ａ〜図１９Ｂ及び図２０Ａ〜図２０Ｂは、「材料及び方法」で説明したように、血清飢餓状態にしたＣＯＳ−１細胞を５％ＦＢＳで５時間刺激し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でｉｎ ｓｉｔｕで抽出し、その後固定し、ＰＩと抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体又は抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体とで二重に染色したもの、並びに、血清飢餓状態にしたＣＯＳ−１細胞をメタノール中で固定して、その後抗ＨＰ１α抗体とＰＩとで二重に染色したものに関する。スケールバーは１０μｍを示す。染色した細胞の蛍光画像を、図１８Ａ、図１９Ａ及び図２０Ａに示す。抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体及び抗ＨＰ１α抗体の蛍光強度プロットを、それぞれ図１８Ｂ、図１９Ｂ及び図２０Ｂに示す。重ね合わせた画像に描いた線に沿った強度プロットを右に示す。赤色はＰＩ強度を示し、緑色は抗体染色強度を示す。図２１Ａ及び２１Ｂは、血清飢餓状態にしたＣＯＳ−１細胞を５％ＦＢＳで３０分間刺激する（刺激）か刺激せず（飢餓）、抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体及びＰＩで二重に染色したものに関する。破線は核の輪郭を示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を、図２１Ａ及び図２１ＢのＤＮＡ画像に示す。正方形の領域の拡大画像を、右に示す。スケールバーは１０μｍを示す。
【００３１】
ＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化によるクロマチン構造変化の誘発。図２２は、ＤＭＳＯ、１０μＭのＰＰ２、又は１００ｎＭのワートマニンで２４時間処理し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。正方形の領域の拡大画像を右に示す。スケールバーは１０μｍを示す。図２３は、ＤＭＳＯ単独で、又は１０μＭのＰＰ２で２１時間前処理し、その後３ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）で３時間インキュベーションしたＣＯＳ−１細胞に関する。チロシン−リン酸化タンパク質及びＤＮＡを、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで染色した。正方形の領域の拡大画像を右に示す。スケールバーは１０μｍを示す。細胞質のチロシン−リン酸化タンパク質を低減するために、「材料及び方法」で説明したように、細胞を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でｉｎ ｓｉｔｕで抽出し、その後固定し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色した。染色した細胞の蛍光画像を図２４に示す。正方形の領域の拡大画像を右に示す。破線は核の輪郭を示す。スケールバーは１０μｍを示す。図２５は、図２４に関して説明した実験から得られたデータに基づく核中抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度を示し、データは、少なくとも３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数９６〜１０２）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図２６は、図１Ａ〜図８に関して上述した細胞のように処理したＣＯＳ−１細胞に関する。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価した。プロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は少なくとも３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数４６〜１０４）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意でない）。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析し、結果を、図２７Ａ〜図２７Ｄに示すヒストグラムとして示す。図２８は、「材料及び方法」で説明したように、３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、ＰＩと、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体又は抗ＨＰ１α抗体とで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。スケールバーは１０μｍを示す。
【００３２】
ＳＦＫの核局在、及び精製核のｉｎ ｖｉｔｒｏでのチロシンリン酸化。図２９は、「材料及び方法」で説明したように、ＣＯＳ−１細胞から調製した精製核に関するウェスタンブロッティングの結果を示す。全細胞及び精製核由来の可溶化物のウェスタンブロットを、個々のＳＦＫメンバー、ラミンＢ１、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、デスモグレイン、及び細胞質ホスホリパーゼＡ２α（ｃＰＬＡ２α）に対する抗体でプローブした。図３０は、ＤＭＳＯ単独で、又は１０μＭのＰＰ２で３０分間前処理し、表示した濃度のＡＴＰと共に３０℃で３０分間インキュベーションしたＣＯＳ−１細胞から調製した精製核に関する。チロシン−リン酸化タンパク質及びＤＮＡを、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで染色した。スケールバーは１０μｍを示す。図３０は、精製核中のチロシン−リン酸化（ｐＴｙｒ）の蛍光画像を示す。図３１は、精製核中の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度を示し、データは、少なくとも３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数７２〜８１）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３３】
核標的化（nuclear-targeted）ＳＦＫにより誘発されるクロマチン構造（architecture）の変化。図３２は、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ及びＮＬＳ−Ｓｙｋの模式図を示す。ＮＬＳは核局在シグナルを意味し、ＳＨはＳｒｃ相同ドメインを意味し、ＰＴＫはタンパク質−チロシンキナーゼドメインを意味し、ＨＡはＨＡ−エピトープタグを意味し、ＫＤはキナーゼ活性のないＫ２７５Ａ突然変異を意味する。図３３〜図３４Ｂは、表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養して、抗ｐＴｙｒ抗体及び抗ＨＡ抗体若しくは抗Ｓｙｋ抗体（図３３）で、抗ＨＡ抗体及びＰＩ（図３５）若しくは抗Ｓｙｋ抗体及びＰＩ（図３６）で、又はＧＦＰ蛍光及びＰＩ（図３６）で二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。モック（Mock）は、ベクター単独でのトランスフェクションを示す。スケールバーは１０μｍを示す。表示した構築物をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞から得られた全細胞可溶化物（図３４Ａ）又は核可溶化物（図３４Ｂ）を、ウェスタンブロッティングに供し、抗ｐＴｙｒ抗体でプローブし、そして抗ＨＡ抗体、抗Ｓｙｋ抗体及び抗アクチン抗体で、並びに抗ＨＡ抗体及び抗ラミンＢ１抗体で順番に再プローブした。図３５〜図３７は、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ、Ｌｙｎ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｓｙｋ及びＮＬＳ−ＧＦＰの局在の定量的解析に関する。図３７は、核中のタンパク質発現（Ｎｕｃ）が細胞質中のタンパク質発現（Ｃｙｔｏ）よりも高い［Ｎｕｃ＞Ｃｙｔｏ］場合と、核中のタンパク質発現が細胞質中のタンパク質発現よりも低いか又は等しい［Ｎｕｃ≦Ｃｙｔｏ］場合とを示すグラフである。図３８Ａ〜図３８Ｃは、何もトランスフェクションしなかったＣＯＳ−１細胞、Ｌｙｎ−ＨＡ、又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションして３６時間培養したＣＯＳ−１細胞に関する。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析し、図３８Ａ〜図３８Ｃに示すヒストグラムとして結果を示す。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価した。図３９に示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数５１〜１０７）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意でない）。図４０Ａ及び図４０Ｂは、Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１又はＦｌａｇ−Ｇ９ａでトランスフェクションし、３６時間培養して抗Ｆｌａｇ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。スケールバーは１０μｍを示す。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は代表的な実験（細胞数６０〜１０９）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図４０Ｂに示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図４１及び図４２に示すグラフは、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ又はＬｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、２４時間培養して抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで、並びに抗ＨＡ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。図４１及び図４２では、２Ｄ−プロット解析を、核中の抗ｐＴｙｒ染色又は抗ＨＡ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）対で示す。「ｎ」は細胞数を示し、「ｒ」は回帰係数を示す。図４３は、「材料及び方法」で説明したように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、２４時間培養して抗ＨＡ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞と、そして、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、ＰＩと抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体又は抗ＨＰ１α抗体とで二重に染色した細胞とに関する。スケールバーは１０μｍを示す。ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした、又はトランスフェクションしない様々な種類の細胞を、２４時間培養し、抗ＨＡ抗体及びＰＩで染色した。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は代表的な実験（細胞数６３〜１４５）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図４４に示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図４５Ａ及び図４５Ｂは、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし３６時間培養した、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現しているＣＯＳ−１細胞に関する。細胞を、ＧＦＰ蛍光及び抗ＨＡ抗体で可視化した。スケールバーは１０μｍを示す。クロマチン凝縮のレベルを、各細胞に関する１ピクセル当たりの平均蛍光強度の平均値が２１００〜２７００の範囲にある条件下での１ピクセル当たりのヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰ蛍光強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は代表的な実験（細胞数１１２）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図４５Ｂに示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＧＦＰ蛍光強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３４】
ＳＹＦ（ｃ−Ｓｒｃ−／− ｃ−Ｙｅｓ−／− Ｆｙｎ−／−）細胞においてＳＦＫの導入により誘発されるクロマチン構造変化。図４６は、何によっても処理せず、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色したＳＹＦ細胞に関する。染色の蛍光画像を図４６に示す。正方形の領域の拡大画像を右に示す。スケールバーは１０μｍを示す。図４７Ａ及び図４７Ｂは、何によっても処理せず、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理した、野生型Ｌｙｎ（Ｌｙｎ−ｗｔ）を安定的に発現しているＳＹＦ細胞（図４７Ａ）と、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡをトランスフェクションし３６時間培養したＳＹＦ細胞（図４７Ｂ）とに関する。細胞を、抗Ｌｙｎ抗体又は抗ＨＡ抗体とＰＩとで二重に染色した。スケールバーは１０μｍを示す。図４８Ａ及び図４８Ｂは、何によっても処理せず、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理した、野生型ｃ−Ｓｒｃ（ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ）を安定的に発現しているＳＹＦ細胞（図４８Ａ）と、３６時間培養した、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞（図４８Ｂ）とに関する。細胞を、抗Ｓｒｃ抗体又は抗ＨＡ抗体とＰＩとで二重に染色した。スケールバーは１０μｍを示す。図４９は、表示した構築物をトランスフェクションし上述のようにＮａ３ＶＯ４で処理したＳＹＦ細胞に関する。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数４２〜９８）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。プロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図５０Ａ〜図５０Ｃは、３６時間培養した、何もトランスフェクションしていない、Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした、又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞に関する。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析し、図５０Ａ〜図５０Ｃに示すヒストグラムとして結果を示す。図５１Ａ及び５１Ｂは、Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞を、３６時間培養して抗Ｆｌａｇ抗体又は抗ＨＡ抗体とＰＩとで二重に染色したものに関する。図５１Ａでは、ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を上部に示す。スケールバーは１０μｍを示す。クロマチン凝縮のレベルを１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は代表的な実験（細胞数７６〜９１）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図５１Ｂに示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図５２は、低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にした、及び血清（５％ＦＢＳ）で表示した時間刺激したＳＹＦ細胞に関する。図５２に示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は代表的な実験（細胞数１０４〜１１３）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。スチューデントｔ検定により算出されるように、飢餓と刺激との間の差異は有意でなかった（ＮＳ）。図５３は、播種して５％ＦＢＳ中で１日間培養し、５％又は０．５％ＦＢＳ中で表示した期間増殖させた、ＣＯＳ−１細胞及びＳＹＦ細胞に関する。図示したように、細胞数を計測及びプロットし、値は三連の測定に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【００３５】
クロマチン構造変化を評価する定量的な方法。間期の間のクロマチン構造（texture）の変化は、クロマチン構造変化を反映する。クロマチン構造の状態を明確にするために、ＤＮＡ凝縮のレベルを評価する定量的な方法が使用され得る。例えば、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ蛍光強度の平均値及びＳ．Ｄ．値は、「材料及び方法」で説明したように、コンピュータで計算され得る。図１Ａ〜図１Ｃ、図２Ａ〜図２Ｃ、図３Ａ〜図３Ｃ、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ａ〜図５Ｃ及び図６Ａ〜図６Ｃは、各々コンピュータで計算したＰＩ蛍光強度の平均値及びＳＤ値に対応して、蛍光画像、ヒストグラム及び２Ｄ等角投影法による強度プロファイルをそれぞれ示す。全ピクセルを、以下の３群に分類した：（ｉ）低凝縮度のＤＮＡ領域（１ピクセル当たりのＰＩ強度＜２２００）、（ｉｉ）中程度の凝縮度のＤＮＡ領域（２２００≦１ピクセル当たりのＰＩ強度≦３２００）、（ｉｉｉ）高凝縮度のＤＮＡ領域（１ピクセル当たりのＰＩ強度＞３２００）。興味深いことに、ＰＩ染色のヒストグラム及び２Ｄ等角投影法による強度プロファイルにより、図１Ａ〜図１Ｃ及び図６Ａ〜図６Ｃに示すように、Ｓ．Ｄ．値の増大が、低凝縮度及び高凝縮度のＤＮＡのレベルの増大と高度に相関することが明らかになった。
【００３６】
初期の研究では、ＤＮＡに関する植物細胞のフォイルゲン染色により、凝縮したクロマチンはＧ１期では減少し、Ｓ期では迅速に増大し、Ｇ２期及び次のＧ１期では減少することが示された（非特許文献４７）。ピクセルイメージング法がＤＮＡ凝縮の細胞周期依存性変化を検出するのに十分高感度であるかどうかを試験するために、本発明者らは、そのほとんどがＧ１期に入る非同期化した細胞と、Ｓ期及びＧ２期が豊富な細胞集団とを調製した。非同期化した細胞と、Ｓ期が豊富な細胞集団と、Ｇ２期が豊富な細胞集団とに関するＤＮＡ含有量のヒストグラムを、それぞれ図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示す。ＤＮＡ含有量のヒストグラムにより、各細胞周期の濃縮化が確認された。Ｓ．Ｄ．値を利用するＤＮＡ凝縮の定量では、Ｓ期の間のＤＮＡ凝縮のレベルの少しではあるが有意な増大を示した（図８）。Ｍ期の進行中にＤＮＡ凝縮を分析する際にピクセルイメージング法が有用であるかどうかをさらに試験するために、Ｍ期が豊富な細胞を調製し、ＤＮＡに関して抗リン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０抗体及びＰＩで染色した。ヒストンＨ３Ｓ１０のリン酸化が前期の間に開始し中期の間にピークレベルが検出される（非特許文献２３）ことを考慮すると、前中期は、核膜破壊と高レベルのリン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０とにより前期と区別された。図９に示す画像と、図１０に示す対応するヒストグラムとに示されるように、Ｓ．Ｄ．値を利用するＤＮＡ凝縮の定量により、有糸分裂の進行時における前期から前中期までのＤＮＡ凝縮のレベルの連続的な増大が示された。その後、ピクセルイメージング法がアポトーシス性ＤＮＡ凝縮を認識することができるかどうかを試験するために、細胞を、１ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処理した。ＤＮＡ含有量のヒストグラムにより、図１１Ａ〜図１１Ｄに示すように、アポトーシス性サブＧ１細胞の用量依存的な誘発が確認された。Ｓ．Ｄ．値を利用するＤＮＡ凝縮の定量は、図１２に示すように、ＤＮＡ凝縮のレベルがアポトーシスの程度に対応することを示した。これらの結果は、個々の変動の存在にも関わらず、Ｓ．Ｄ．値の平均が細胞周期におけるＤＮＡ凝縮のレベルとアポトーシス誘発とを忠実に反映することを示唆する。さらに、ＤＮＡ染色及びヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰの蛍光画像は、図１３に示すように、完全に重複し、ＤＮＡとヒストンとの間の相互作用が保持されることを示した。総合すると、これらの結果は、クロマチン凝縮のレベルを１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値で定量することができることを示唆する。したがって、ピクセルイメージングは、本明細書に記載のように、クロマチン構造変化の定量的解析のための有用なツールであり得る。
【００３７】
成長因子刺激はクロマチン構造変化を誘発する。成長因子刺激がクロマチン凝縮の状態を変化させるかどうかを検証するために、細胞を、成長因子シグナル伝達の休止のために低血清条件下で２４時間飢餓状態にし（飢餓）、血清で５時間刺激した（刺激）。図１４Ａ及び図１４Ｂは、飢餓及び刺激の両方の条件に関するＰＩでのＤＮＡ染色の画像を示す。ＰＩでのＤＮＡ染色で、血清刺激がクロマチン凝縮レベルの変化を誘発することが示された。Ｓ．Ｄ．値を利用するクロマチン凝縮レベルの定量により、血清刺激が低凝縮度及び高凝縮度の両方のクロマチン領域を迅速に増大させることが明らかになり、増大したレベルは、図１５に示すように、３０分までにプラトーに到達し、少なくとも５時間持続し、刺激の２４時間後に基礎レベルに戻った。興味深いことに、血清で刺激したクロマチンの低凝縮及び高凝縮は、図１６に示すように、ＳＦＫ阻害剤であるＰＰ２での処理により有意に抑止された。図１７Ａ及び図１７Ｂは、飢餓時及び刺激時のＤＮＡ含有量のヒストグラムを示す。ＤＮＡ含有量のヒストグラムは、サブＧ１期、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２期における細胞数の増大を示さず、飢餓及び刺激の処理がアポトーシス、又はＳ期への移行を誘発しないことが確認された。図１８Ａは、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体に関するＰＩ染色を示し、図１８Ｂは、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体の対応する蛍光強度プロットを示す。図１９Ａは、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体に関するＰＩ染色を示し、図１９Ｂは、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体の対応する蛍光強度プロットを示す。図２０Ａは、抗ＨＰ１α抗体に関するＰＩ染色を示し、図２０Ｂは、抗ＨＰ１α抗体の対応する蛍光強度プロットを示す。リジン４がトリメチル化されたヒストンＨ３（ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３）（非特許文献４８）と、スレオニン６９及びスレオニン７１がリン酸化された転写的に活性なＡＴＦ−２（ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１）（非特許文献４９、５０）とは、低凝縮度のクロマチンの領域に主に局在したが、一方、ヘテロクロマチンタンパク質−１α（ＨＰ１α）は高凝縮度のクロマチンの領域にその多くが局在した。重要なことには、抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体での免疫染色により、血清刺激が細胞質に加えて核内でのＳＦＫの活性化を誘発することが示された。図２１Ｂに示すように、血清で活性化したＳＦＫは、高凝縮度のクロマチンの領域よりも、低凝縮度のクロマチンの領域において、より頻繁に検出された。これらの結果は、成長因子刺激が、ＳＦＫの活性化を通じてクロマチン構造変化を誘発し、中程度の凝縮度のクロマチンの領域の減少の代わりに、低凝縮度のユークロマチンと高凝縮度のヘテロクロマチンとの両方の領域を増大させることを示唆する。
【００３８】
ＳＦＫによるチロシンリン酸化は、クロマチン構造変化に関与する。対照細胞（なし（None）、無処理）のＳ．Ｄ．値は、クロマチン凝縮の基礎レベルが個々の細胞の間で変動することを反映して、４５０から７００まで変動した（図１５及び図１６）。ＳＦＫがチロシンリン酸化のレベルを調節することにより基礎クロマチン凝縮に関して或る役割を果たすかどうかを試験するために、ＰＰ２又はワートマニン（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤）で処理したＣＯＳ−１細胞を、チロシンリン酸化に関しては抗リン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）抗体で、及びＤＮＡに関してはＰＩで二重に染色した。図２２及び図２６に示すように、ＰＰ２処理によりチロシンリン酸化及びクロマチン凝縮の基礎レベルが有意に低減することが見出された。対照的に、ワートマニン処理は、図２２及び図２６に示すように、チロシンリン酸化のレベルを増大させたとしても、クロマチン凝縮の基礎レベルを変化させなかった。チロシンリン酸化のこの増大は、ワートマニンがチロシンリン酸化を増強するという報告（非特許文献５１）を連想させる。これらの結果は、クロマチン凝縮の基礎レベルがＳＦＫにより媒介されるチロシンリン酸化と関係することを示唆する。
【００３９】
免疫蛍光染色によりチロシンリン酸化を明瞭に可視化するために、Ｎａ３ＶＯ４（タンパク質−チロシンホスファターゼの阻害剤、（非特許文献５２）を使用して、チロシンホスファターゼの活性を阻害することによりチロシンリン酸化を増大させた。Ｎａ３ＶＯ４で処理したＣＯＳ−１細胞は抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで染色した。Ｎａ３ＶＯ４での処理は、図２３に示すように、細胞全体のチロシンリン酸化を大きく増大させたが、これはＮａ３ＶＯ４がチロシン脱リン酸化の阻害を介して異なる細胞内コンパートメントにおける様々なチロシンキナーゼを活性化し得るためである。興味深いことに、Ｎａ３ＶＯ４での処理は、図２３及び図２６に示すように、低凝縮度及び高凝縮度のクロマチンの状態の劇的な変化を誘発した。同様の結果が、図５４に示すように、ＨｅＬａ細胞において見られた。ＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化のクロマチン構造変化に対する寄与をさらに検証するために、細胞を、ＰＰ２の存在下又は非存在下でＮａ３ＶＯ４により処理した。実際に、ＰＰ２処理は、図２３及び図２６に示すように、クロマチンの低凝縮及び高凝縮の減少と併せて、チロシンリン酸化を低減させた。
【００４０】
ＳＦＫ基質に特異的なものを含むタンパク質−チロシンホスファターゼは核及び細胞質中に存在する（非特許文献１１、１２）ので、Ｎａ３ＶＯ４によるチロシンホスファターゼの阻害が核内でのＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化を増大させることが推測され得る。核のリン酸化を実証するために、細胞質のチロシン−リン酸化タンパク質のほとんどを、固定前に０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で４℃にて３分間ｉｎ ｓｉｔｕで抽出した。結果として、Ｎａ３ＶＯ４により誘発されるチロシンリン酸化の増大は核内で明瞭に目視でき、核のチロシンリン酸化の増大は、図２４及び図２５に示すように、ＰＰ２処理により有意に抑止された。ＤＮＡ含有量のヒストグラムは、サブＧ１期、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２期の細胞数の増加を示さず、図２６に示すように、ＤＭＳＯ、ＰＰ２、Ｎａ３ＶＯ４又はＮａ３ＶＯ４＋ＰＰ２での処理が、アポトーシス、又はＳ期への移行を誘発しないことが確認された。図２４及び図２８に示すように、Ｎａ３ＶＯ４処理した細胞では、チロシン−リン酸化タンパク質並びにヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１が主に低凝縮度のクロマチンの領域に局在したが、一方、ＨＰ１αはその多くが高凝縮度のクロマチンの領域に局在した。これらの結果は、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化がクロマチン構造変化を誘発するという興味深い可能性を提起する。
【００４１】
核のＳＦＫは、チロシンリン酸化を媒介する。以前の研究により、ＳＦＫには核に存在するものがあることが示唆される（非特許文献１３、１６、５３）。ＳＦＫの核局在をさらに実証するために、ＣＯＳ−１細胞から調製した高度に精製した核を、ウェスタンブロッティングにより分析した。実際に、図２９に示すように、精製核内で、ごく少量の４種類のＳＦＫメンバーが（ｃ−Ｓｒｃが６０ｋＤａで、ｃ−Ｙｅｓが６２ｋＤａで、Ｆｙｎが５９ｋＤａで、並びにＬｙｎの２種類のオルタナティブスプライシングアイソフォームが５３ｋＤａ及び５６ｋＤａで）見出された。核ラミナタンパク質であるラミンＢ１の量は、全細胞可溶化物と核可溶化物との間で同程度であった。細胞膜タンパク質デスモグレインも、ゴルジ酵素β−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）も、サイトゾルタンパク質細胞質ホスホリパーゼＡ２α（ｃＰＬＡ２α）も、図２９に示すように、核の可溶化物中に検出されなかった。図３０に示すように、ノマルスキー画像により、精製核中に他のオルガネラ膜の混入がほとんどないことが明白に示された。図５５に示すように、同様の結果がＨｅＬａ細胞において見られた。これらの結果は、ＳＦＫが、小量ではあるが、核中に確かに存在することを示す。
【００４２】
核ＳＦＫのキナーゼ活性を試験するために、精製核を１０μＭのＰＰ２の存在下又は非存在下で５μＭ又は１０μＭのＡＴＰと共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションし、チロシンリン酸化に関しては抗ｐＴｙｒ抗体で、ＤＮＡに関してはＰＩで染色した。図３０及び図３１に示すように、ＡＴＰとのインキュベーションは核のチロシンリン酸化のレベルを増大し、増大はＰＰ２により有意に抑止された。加えて、精製核内のＳＦＫの量は、成長因子刺激と関係なく不変であった（データは示していない）。これらの結果は、ＳＦＫが核のチロシンリン酸化に寄与することを示唆し、核ＳＦＫのキナーゼ活性が核の構造（architecture）において或る役割を果たすことを示す（implicating）。
【００４３】
核へのＳＦＫの導入が、クロマチン構造変化を引き起こす。クロマチン凝縮における核のＳＦＫの関与を実証するために、図３２に示すように、核局在シグナル（ＮＬＳ）と共にタグを付した複数の突然変異体を構築し、これらの構築物をＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションした。図３３及び図３５に示すように、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ（キナーゼ活性がある）、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ（キナーゼ活性がある）、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ（キナーゼ活性がない）及びＮＬＳ−Ｓｙｋ（非関連キナーゼ）が、全て核中に蓄積した。抗ｐＴｙｒ抗体での免疫蛍光染色により、図３３に示すように、核中のチロシンリン酸化のレベルの増大が、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ及びＮＬＳ−Ｓｙｋを発現している細胞の間で同程度であることが示され、抗ｐＴｙｒ抗体でのウェスタンブロッティングにより、図３４Ａ及び図３４Ｂに示すように、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした細胞から調製した精製核中でのチロシン−リン酸化タンパク質の出現が確認された。Ｓ期における細胞集団のほんのわずかな増大にも関わらず、図３５及び図３６、矢頭（arrowheads）並びに図３８Ａ〜図３８Ｃ及び図３９に示すように、クロマチンの低凝縮及び高凝縮が、Ｎａ３ＶＯ４の非存在下でさえも、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ及びＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡにより著しく誘発されたことに言及することは興味があることである。他のＳＦＫのメンバー、ＮＬＳ−Ｙｅｓ−ＨＡ（キナーゼ−活性）及びＮＬＳ−Ｆｙｎ−ＨＡ（キナーゼ−活性）は、図５６Ａ及び図５６Ｂに示すように、クロマチンの低凝縮及び高凝縮を同様に誘発した。しかし、図３５、図３６及び図３９に示すＮＬＳ−Ｓｙｋと、図５６Ａ及び図５６Ｂに示すＳｙｋ−ｗｔとは、クロマチンの低凝縮及び高凝縮を有意に誘発しなかったが、これはおそらく、ＳｙｋとＳＦＫとの触媒領域における配列類似性の低さ（４０％〜４５％にすぎない）が、異なる基質特異性を引き起こす（非特許文献５４）ためである。ＮＬＳ−ＧＦＰ等の無関連の（irrelevant）タンパク質の核内蓄積は、どういうわけかクロマチンの低凝縮及び高凝縮をもたらし得るので、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡは、そのキナーゼ活性が非常に弱いにも関わらず、図３４Ａ及び図３４Ｂに示すように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡの良好な対照であり得る。さらに本発明者らは、ヘテロクロマチン形成（非特許文献３２）及びユークロマチン領域における転写抑制（非特許文献５５）に関与するヒストンＨ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼであるＦｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びＦｌａｇ−Ｇ９ａを使用して、補足的な対照実験を行った。クロマチン凝縮は、図４０Ａ及び図４０Ｂに示すように、Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びＦｌａｇ−Ｇ９ａにより穏やかに誘発された。クロマチン凝縮のレベルが、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡによるものよりずっと低いことに留意されたい（図４０Ａ及び図４０Ｂを図３９と比較されたい）。
【００４４】
核のチロシンリン酸化の強度と個々の核中のＰＩ強度のＳ．Ｄ．値との間の相関を検証するために、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞において、２Ｄ−プロット解析を行った。図４１は、核のｐＴｙｒシグナルのレベルがＳ．Ｄ．値と正の相関を有することを示し、より高レベルの核のチロシンリン酸化が、より強力なクロマチンの低凝縮及び高凝縮をもたらすことを示唆する。一方で、キナーゼ活性があるＬｙｎ−ＨＡは、図３７に示すようにそのごく一部が核中に局在するが、図３９に示すように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡよりも低レベルのクロマチンの低凝縮及び高凝縮を誘発した。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値の相関の２Ｄ−プロット解析を、Ｌｙｎ−ＨＡの核内蓄積のレベル、及びＬｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞における全細胞ｐＴｙｒシグナルと比較した核ｐＴｙｒシグナルのレベルに対して行い、図４２及び図５７に示すように、Ｓ．Ｄ．値が核のＬｙｎ−ＨＡのタンパク質レベル、及び核のチロシンリン酸化のレベルの両方と正の相関を有することを見出した。核内に移行しないＬｙｎ突然変異体を構築することを試みるために、膜貫通ドメインと分泌タンパク質に関するシグナル配列とを含有するＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡキメラを生成した。ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡは約９２ｋＤａのダブレットであり細胞膜に主に局在したが、実際にはＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡの一部が核内に検出された（図６１、矢印）。しかし、Ｌｙｎ−ＨＡと同様に、２Ｄ−プロット解析により、図５９Ａに示すように、核のチロシンリン酸化のレベルと、ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡを発現しているＣＯＳ−１細胞におけるＳ．Ｄ．値との間の相関が示された。換言すれば、細胞質中のＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡの高い発現では、クロマチンの低凝縮及び高凝縮の誘発を説明することができなかった。加えて、受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ３の一部が切断されることなく核中に局在する（非特許文献５６）ことを考慮すると、ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡの核内移行を回避することは困難であり得る。さらに、２Ｄ−プロット解析により、図６２、図６３及び図３９に示すように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ及びＮＬＳ−ＧＦＰのタンパク質レベルと、Ｓ．Ｄ．値との間に相関がないことが示された。
【００４５】
図４３、図１９Ａ、図１９Ｂ及び図２８に示すように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ並びにヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１は低凝縮度のクロマチンの領域に主に局在したが、一方、ＨＰ１αはその多くが高凝縮度のクロマチンの領域に局在した。重要なことには、抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体での免疫染色により、図４３並びに図２１Ａ及び図２１Ｂに示すように、活性化したＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡはその多くが低凝縮度のクロマチンの領域に局在することが示された。さらに、図４４に示すように、ＳＦＫに媒介されるクロマチン構造変化の結果は、サル線維芽細胞ＣＯＳ−１細胞由来のものと同様に、ヒト上皮ＨｅＬａ細胞、ヒト乳房ＭＣＦ−７細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒト大腸ＨＣＴ１１６細胞及びヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３細胞から得られた。これらの結果は、ＳＦＫにより媒介される核のチロシンリン酸化がクロマチン構造変化の原因となることを示唆する。
【００４６】
加えて、図１３に示すように、ＤＮＡ染色及びヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰの間の蛍光画像の完全な重複のために、さらなる調査を行い、各々の核に関する１ピクセル当たりのＧＦＰ蛍光強度のＳ．Ｄ．値を使用してクロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルが定量されるかどうかを判定した。図４５Ｂに示すように、ＰＩ蛍光のＳ．Ｄ．値と同様に、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡはＧＦＰ蛍光強度のレベルを大きく増大させ、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰ蛍光のＳ．Ｄ．値、及びＰＩ蛍光のＳ．Ｄ．値を使用してクロマチンの低凝縮及び高凝縮が定量され得ることを示した。
【００４７】
ＳＦＫは、クロマチン構造変化のために必要である。クロマチン凝縮のための内在性ＳＦＫの必要性を検証するために、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓ及びＦｙｎの発現が遺伝的に欠損しておりＬｙｎを検出可能なレベルで発現しない（非特許文献３７）マウス胚線維芽細胞ＳＹＦ細胞を使用した。ＳＹＦ細胞のＮａ３ＶＯ４処理により、チロシンリン酸化がＣＯＳ−１細胞のチロシンリン酸化レベルと同レベルに増大したが（図４６を図２３と比較されたい）、Ｎａ３ＶＯ４で処理したＳＹＦ細胞におけるクロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルは、Ｎａ３ＶＯ４で処理したＣＯＳ−１細胞におけるクロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルよりもずっと低かった（図４９を図２６と比較されたい）。これらの結果は、ＳＦＫにより主に媒介されるチロシンリン酸化がクロマチン構造変化に寄与することを示唆する。
【００４８】
次に、野生型Ｌｙｎを発現しているＳＹＦ細胞（ＳＹＦ／Ｌｙｎ−ｗｔ細胞）又は野生型ｃ−Ｓｒｃを発現しているＳＹＦ細胞（ＳＹＦ／ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ細胞）のアドバック版（add-back version）を確立した。図４７Ａ及び図４７Ｂに示すように、Ｌｙｎのごく一部の核局在が抗Ｌｙｎ免疫蛍光により検出されたＳＹＦ／Ｌｙｎ−ｗｔ細胞は、クロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルのわずかな増大を示し、図４７Ａ、図４７Ｂ及び図４９に示すように、Ｎａ３ＶＯ４でのＳＹＦ／Ｌｙｎ−ｗｔ細胞の処理は、クロマチンの低凝縮及び高凝縮を増大させることができた。加えて、キナーゼ活性があるＬｙｎ−ＨＡのＳＹＦ細胞へのトランスフェクションは、クロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルのごくわずかな増大を誘発したが、これはおそらく核中のそのわずかな発現のためである。Ｎａ３ＶＯ４で処理しなくても、キナーゼ活性があるＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞は、図４７Ａ、図４７Ｂ及び図４９に示すように、クロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルの増大を示したが、キナーゼ不活性ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡで該レベルの増大は示されなかった。とはいえ、そのレベルはＣＯＳ−１細胞におけるレベルと比較してＳＹＦ細胞では穏やかであった（図４９を図３９と比較されたい）。同様に、クロマチンの低凝縮及び高凝縮の増大は、Ｎａ３ＶＯ４で処理したＳＹＦ／ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ細胞において、及びＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞において見られた（図４８Ａ及び図４９）。ＤＮＡ含有量のヒストグラムは、Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡの発現がＳＹＦ細胞の細胞周期に影響を及ぼさないことを示した（図５０Ａ〜図５０Ｃ）。Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１はその多くがヘテロクロマチンの領域に局在したが、クロマチン凝縮を穏やかに誘発しただけであった（図５１Ａ、図５１Ｂ及び図５２）。Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１により誘発されるクロマチン凝縮のレベルは、大部分がユークロマチンの領域に局在するＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡにより誘発されるクロマチン凝縮のレベルよりも低かった。これらの結果は、核内におけるＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化が、ユークロマチン化及び付随するヘテロクロマチン化を通じて、クロマチンの低凝縮及び高凝縮に寄与し得ることを示唆する。
【００４９】
さらに、血清成長因子でのＳＹＦ細胞の刺激がクロマチンの低凝縮及び高凝縮を誘発するかどうかを試験するために、ＳＹＦ細胞を低血清条件下で２４時間飢餓状態にし（飢餓）、５％ＦＢＳで３０分間、１時間及び５時間刺激した（刺激）。図５２は、血清刺激がＳＹＦ細胞においていかなるクロマチン構造変化も誘発しなかったことを示す。ＳＹＦ細胞及びＣＯＳ−１細胞はその両方がＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するが、それらの間で細胞増殖を比較した。興味深いことに、図５３に示すように、ＳＹＦ細胞は細胞増殖に関して血清成長因子への応答性が乏しいので、ＳＹＦ細胞はＣＯＳ−１細胞よりもずっと緩やかな細胞増殖速度を示した。図２９に示すように（非特許文献５７）、ＣＯＳ−１細胞がＳＦＫの４種類のメンバー、すなわちｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓ、Ｆｙｎ及びＬｙｎを同時発現するという知見と総合すると、これらの結果は、細胞増殖がＳＦＫのメンバーの発現の欠如により大いに影響されることを示唆する。
【００５０】
動的な核の構造変化は、転写、末端細胞分化、老化、腫瘍形成及び細胞周期の間に、頻繁に観察されている（非特許文献２１、５８、５９）。本明細書に記載のように、クロマチン凝縮のレベルを判定及び実証（and demonstrate）する定量的な方法を使用して、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化が、ユークロマチンの低凝縮及び付随するヘテロクロマチンの高凝縮の、成長因子刺激による誘発に必要であることを実証した。本明細書に記載した知見に基づき、ＳＦＫと、成長因子刺激によるユークロマチン化及びヘテロクロマチン化との関連性が存在すると結論することができる。
【００５１】
ピクセルイメージング法により、有糸分裂の進行を含む、細胞周期の間に、またアポトーシス誘発中に、クロマチン凝縮のレベルを定量することが可能である（図１Ａ〜図１Ｃ及び図６Ａ〜図６Ｃ）。この方法を使用すると、成長因子刺激によるクロマチン凝縮の変化（図１５及び図１６）を検出することができ、それはクロマチン凝縮の変化と、Ｇ０期からＧ１期までの細胞周期遷移との間の相関を示唆する。興味深いことに、成長因子に誘発されるクロマチン構造変化は、ＳＦＫのチロシンキナーゼ−活性により、その多くが媒介される（図１４Ａ、図１４Ｂ及び図５２）。核内で、キナーゼ活性があるＳＦＫはユークロマチンの低凝縮度の領域に大部分が局在するが、一方、キナーゼ活性があるＳＦＫのごく一部がヘテロクロマチンの高凝縮度の領域に局在する（図２１Ａ、図２１Ｂ及び図４３）。しかし、クロマチン構造の変化は、ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＡＴＦ−２ｐＴ６９／７１の発現レベルにほとんど影響を有さず（データは示していない）、ＳＦＫにより媒介されるクロマチン構造変化が転写活性を直接的に増大させるようには見えないことを示唆する。むしろ、核中のキナーゼ活性があるＳＦＫは、転写因子が遺伝子に接近することを可能にする「開いたクロマチン（open chromatin）」の形成と、領域に局在するＳＦＫは、付随する「閉じたクロマチン（closed chromatin）」の発達とに主に関与し得る。逆に、Ｓｕｖ３９ｈ１はヘテロクロマチン形成に関与し、ヘテロクロマチンの領域に大部分が局在し（非特許文献３２）、Ｓｕｖ３９ｈ１の過剰発現は穏やかなクロマチン凝縮を誘発する（図４０Ａ、図４０Ｂ、図５１Ａ及び図５１Ｂ）。Ｓｕｖ３９ｈ１によるクロマチン凝縮のレベルは核ＳＦＫによるものよりも低い（図４０Ａ及び図３９）ので、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化は、クロマチンの構造（architecture）において動的な役割を果たす。推測するに、成長因子刺激は、ＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化を介して、クロマチンの低凝縮の誘発だけでなく高凝縮の誘発に対してもシグナルを伝達する。
【００５２】
キナーゼ活性があるＮＬＳ−ＳＦＫでのＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションは、強力なクロマチン凝縮、すなわちユークロマチン化及びヘテロクロマチン化の両方の誘発を誘発し、高レベルの核のチロシンリン酸化はクロマチンのより強力な低凝縮及び高凝縮をもたらす（図４１及び図５８）。部分的に核中に局在する、キナーゼ活性があるＬｙｎ−ＨＡでのＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションは弱いクロマチン凝縮を誘発する（図３９）が、核中のＬｙｎ−ＨＡのタンパク質レベル及び核のチロシンリン酸化レベルの両方が、クロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルと正の相関を有する（図４２及び図５７）。ＮＬＳ−ＳｙｋではなくＮＬＳ−ＧＦＰ及びＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡの場合には、タンパク質の核発現は、どういうわけかクロマチン凝縮をもたらし得る（図３９。図６２及び図６３も参照されたい）。それにも関わらず、図３９に示すように、クロマチン凝縮に及ぼすＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡの効果は、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡよりも有意に強い。したがって、本発明者らの結果は、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化がクロマチンの低凝縮及び高凝縮に重要な役割を果たすことを示唆する。
【００５３】
ＳＦＫメンバーは、非受容体型チロシンキナーゼの中で最大のサブファミリーを形成し（非特許文献６０）、そして４種類のＳＦＫメンバー、ｃ−Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ及びｃ−Ｙｅｓは、上皮細胞及び線維芽細胞において広範に同時発現される（図２９及び図５５、（非特許文献５７））。単一の細胞における各ＳＦＫメンバーの発現の多数の組合せが、チロシンリン酸化を介するシグナル伝達に関して、特異的且つ重複した機能を提供し得る。検出可能なＬｙｎを発現せずｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓ及びＦｙｎを欠くＳＹＦ細胞が血清成長因子刺激に対してクロマチンの低凝縮及び高凝縮を誘発することができない（図５２）ことを考慮すると、ＳＹＦ細胞の血清成長因子に対する増殖性応答の不良（図５３）が、クロマチンの低凝縮及び高凝縮を誘発することができないことと関係する可能性がある。
【００５４】
クロマチン凝縮の基礎レベルは、個々のＳＹＦ細胞及びＰＰ２で処理したＣＯＳ−１細胞において確かに変動し（図１５、図１６、図２６、図３９、図４０Ａ、図４９、図５１Ａ及び図５２）、クロマチン構造変化はＮａ３ＶＯ４で処理したＳＹＦ細胞において穏やかに誘発される（図４９）。これらの結果は、代替的な経路が存在する場合には、ＳＦＫ以外の幾つかのチロシンキナーゼを含み得ることを示唆する。Ｕ０１２６（ＭＥＫ１／２の阻害剤）での細胞の処理が、クロマチン凝縮の基礎レベルをわずかに減少させた（データは示していない）ことは、クロマチン凝縮におけるＭＥＫ／ＥＲＫ経路の限定的な関与を示す。最近の研究は、クロマチン構造の動的変化が、ヒートショック、浸透圧ストレス及びＡＴＰ枯渇により誘発されることを示した（非特許文献６１〜６３）。とはいえ、その様相は同一ではないようである。高浸透圧条件はチロシンリン酸化に効果を有さず、そしてＰＰ２での処理は高浸透圧ストレスで誘発されるクロマチン構造変化を抑止しなかった（データは示していない）。これらの結果は、クロマチン構造変化が広範な刺激に関連し得ることを示唆する。それにも関わらず、成長因子刺激により、ＳＦＫが、核内のチロシンリン酸化を介して、クロマチン構造変化において重要な役割を果たすことを重要視すべきである。
【００５５】
ヒトＤＮＡは、５１８種類のタンパク質キナーゼをコードし、４２８種類はセリン残基及びスレオニン残基をリン酸化することが既知である又は予測されており、９０種類はチロシンキナーゼファミリーに属する（非特許文献６４）。核は、セリン残基及び／又はスレオニン残基がリン酸化された多数のタンパク質を含有する。ヒストンのセリン／スレオニンのリン酸化は、有糸分裂の染色体凝縮、アポトーシス、配偶子形成及び遺伝子発現に関与し（非特許文献２２、２３、６５〜６７）、そしてセリン／スレオニンのリン酸化及び脱リン酸化の周期は、スプライシングスペックル（speckles）から転写部位へのスプライシング因子の動員に関与する（非特許文献６８）。出芽酵母における多くのセリン／スレオニンキナーゼは、それらの標的遺伝子を物理的に占有し、遺伝子発現に影響を及ぼす（非特許文献６９）。一方で、核局在と、チロシンキナーゼ及びホスファターゼの機能とを示す研究の数は限られている。例えば、核中に存在するｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、細胞増殖、ＤＮＡ損傷及びストレス応答において或る役割を果たし、そして核のＰＥＰ−ＰＴＰチロシンホスファターゼはＳＦＫ及びそれらの基質の脱リン酸化に関与する（非特許文献１０〜１２）。最近の研究により、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７がＳＦＫの核基質として認定されることが示された（非特許文献１８、１９）。しかし、現在のところ、ＳＦＫに媒介されるクロマチン構造変化におけるＳＦＫの核基質については、何も知られていない。
【００５６】
ＳＦＫは、分化、腫瘍形成、細胞周期及び転写において活性化される（非特許文献２、７０）。従前、クロマチン構造変化が、ヘテロクロマチンのきめの細かい（finely textured）外観から粗い外観までの変化を含めて、発癌性のｖ−Ｓｒｃ、及びＨ−Ｒａｓを発現している細胞株において観察された（非特許文献７１）。腫瘍の特定の種類が、クロマチンの構造（texture）の特徴的な変化、例えばヘテロクロマチンの粗凝集体、ヘテロクロマチンの非対称凝集体、ヘテロクロマチンの分散、及びヘテロクロマチン凝集体の損失、と関連する（非特許文献２１）。ヘテロクロマチン含有量並びにクロマチンの構造（texture）及び形状の変化は、より侵襲性の乳房腫瘍と密接に関連する（非特許文献７２）。ピクセルイメージング法は、様々な癌の種類及び臨床ステージにおけるクロマチンの構造（texture）の変化を定量的に分析する際に役立ち得る。
【００５７】
本結果に基づくと、クロマチン構造変化におけるＳＦＫに媒介される核のチロシンリン酸化の重要性は明らかである。
【００５８】
出願人は、本開示において引用した全ての文献の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメータが、或る範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値及び好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられる場合、範囲が別々に開示されるかどうかに関わらず、これは、任意の上限範囲限界又は好ましい値と、任意の下限範囲限界又は好ましい値との任意の対から成る全ての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。或る数値範囲が本明細書で言及される場合、他に記載がなければ、その範囲は、その端点（endpoints）と、その範囲内の全ての整数及び分数とを含むことが意図される。本発明の範囲を、或る範囲を規定する際に言及される具体的な値に限定することは意図されない。
【００５９】
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討と本明細書で開示された本発明の実施とから、当業者に明らかであろう。本明細書及び実施例は、特許請求の範囲とその均等範囲とにより示される本発明の真の範囲及び精神を有する例示的なものにすぎないとみなされることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマチン構造変化の定量的解析のためのツールとしてのピクセルイメージングの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
非受容体型タンパク質−チロシンキナーゼの最大のサブファミリーを形成するＳｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼ（ＳＦＫ）は、原癌遺伝子産物および構造的に関連するタンパク質から成り、少なくとも８種類の高度に相同なタンパク質（ｃ−Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、ｃ−Ｙｅｓ、ｃ−Ｆｇｒ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ及びＢｌｋ）を含む（非特許文献１、２）。ｃ−Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ及びｃ−Ｙｅｓは、様々な細胞型において広範に発現されるが、一方、ｃ−Ｆｇｒ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ及びＢｌｋは主に造血細胞に見出される（非特許文献２）。ＳＦＫのチロシンキナーゼ活性は、チロシンのリン酸化及び脱リン酸化により緊密に調節され、ＳＦＫは細胞の増殖と、分化と、移動と、細胞骨格の再構築とに中心的な役割を果たす（非特許文献１、２）。ＳＦＫは細胞膜の細胞質面に主に位置するが、後期エンドソーム／リソソーム、分泌顆粒／ファゴソーム及びゴルジ装置で見出される（非特許文献１〜９）。
【０００３】
チロシンキナーゼ及びホスファターゼが細胞膜での細胞外刺激の下流でシグナル伝達分子として機能することは周知である。しかし、幾つかのチロシンキナーゼ及びホスファターゼは核中に存在し、核タンパク質のチロシンのリン酸化及び脱リン酸化を調節し得る（非特許文献１０〜１２）。様々なシグナル伝達事象に関与するＳｒｃ−ファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）が、細胞膜だけでなく、核を含む幾つかの細胞内コンパートメントでも見出される。新たな証拠によれば、ＳＦＫの幾つかは核に局在し、ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス及び細胞周期調節においてシグナル伝達分子として機能することが示され（非特許文献１３〜１９）、核のチロシンリン酸化と関連する核の事象におけるＳＦＫの重要性が示唆されている。核の構造変化は、転写、細胞分化、老化、腫瘍形成及び細胞周期時に頻繁に観察される。しかし、クロマチンの構造（texture）の変化におけるシグナル伝達の役割は、過去に広範に調査されてはいない。
【０００４】
クロマチンは、ＤＮＡがヒストンと共に核中に詰め込まれた状態である。クロマチンは、たいてい、転写的に許容状態である低凝縮度のユークロマチンと、高凝縮度であり抑制されていることが多いヘテロクロマチンとから構成される（非特許文献２０）。間期におけるクロマチン構築（organization）は、遺伝子発現、ＤＮＡの複製、損傷及び修復に影響を及ぼす。クロマチン構造は動的に変化し、エピジェネティックな遺伝子調節と関連する。クロマチン構造変化を含む核の構造（architecture）の変化は、或る所定の腫瘍の種類及びステージの特徴である傾向があり、癌の診断にしばしば使用される（非特許文献２１）。最近の証拠によれば、リン酸化がクロマチン構造変化に関与することが示唆されている。ヒストンＨ３の１０番目のセリン残基（ヒストンＨ３Ｓ１０）のリン酸化が、有糸分裂時及び減数分裂時のクロマチン凝縮にとって重要である（非特許文献２２、２３）。
【０００５】
しかし、クロマチン構造（architecture）における核のチロシンリン酸化の役割は、これまで明らかにされていない。
【０００６】
以下の文献と、本明細書で言及する全ての刊行物とは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０００７】
【非特許文献１】M.T. Brown, J.A. Cooper, Regulation, substrates and functions ofsrc, Biochim. Biophys. Acta 1287 (1996) 121-149.
【非特許文献２】S.M. Thomas, J.S. Brugge, Cellular functions regulated by Src familykinases, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13 (1997) 513-609.
【非特許文献３】K.B. Kaplan, J.R. Swedlow, H.E. Varmus, D.O. Morgan, Association ofp60c-src with endosomal membranes in mammalian fibroblasts, J. CellBiol. 118 (1992) 321-333.
【非特許文献４】H. Moehn, V. Le Cabec, S. Fischer, I. Maridonneau-Parini, Thesrc-family protein-tyrosine kinase p59hck is located on thesecretory granules in human neutrophils and translocates towards the phagosomeduring cell activation, Biochem. J. 309 (1995) 657-665.
【非特許文献５】K. Kasahara, Y. Nakayama, K. Ikeda, Y. Fukushima, D. Matsuda, S.Horimoto, N. Yamaguchi, Trafficking of Lyn through the Golgi caveolin involvesthe charged residues on αE and αI helices in the kinase domain, J. Cell Biol. 165 (2004) 641-652.
【非特許文献６】D. Matsuda, Y. Nakayama, S. Horimoto, T. Kuga, K. Ikeda, K.Kasahara, N. Yamaguchi, Involvement of Golgi-associated Lyn tyrosine kinase inthe translocation of annexin II to the endoplasmic reticulum under oxidativestress, Exp. Cell Res. 312 (2006) 1205-1217.
【非特許文献７】K. Kasahara, Y. Nakayama, A. Kihara, D. Matsuda, K. Ikeda, T. Kuga,Y. Fukumoto, Y. Igarashi, N. Yamaguchi, Rapid trafficking of c-Src, anon-palmitoylated Src-family kinase, between the plasma membrane and lateendosomes/lysosomes, Exp. Cell Res. 313 (2007) 2651-2666.
【非特許文献８】K. Kasahara, Y. Nakayama, I. Sato, K. Ikeda, M. Hoshino, T. Endo, N.Yamaguchi, Role of Src-family kinases in formation and trafficking ofmacropinosomes, J. Cell. Physiol. 211 (2007) 220-232.
【非特許文献９】K. Kasahara, Y. Nakayama, N. Yamaguchi, v-Src and c-Src,nonpalmitoylated Src-family kinases, induce perinuclear accumulation oflysosomes through Rab7 in a kinase activity-independent manner, Cancer Lett.262 (2008) 19-27.
【非特許文献１０】C. Cans, R. Mangano, D. Barila, G. Neubauer, G. Superti-Furga, Nucleartyrosine phosphorylation: the beginning of a map, Biochem. Pharmacol. 60 (2000)1203-1215.
【非特許文献１１】M. Bollen, M. Beullens, Signaling by protein phosphatases in thenucleus, Trends Cell Biol. 12 (2002) 138-145.
【非特許文献１２】G.B. Moorhead, L. Trinkle-Mulcahy, A. Ulke-Lemee, Emerging roles ofnuclear protein phosphatases, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (2007) 234-244.
【非特許文献１３】S. Kharbanda, A. Saleem, Z.M. Yuan, S. Kraeft, R. Weichselbaum, L.B.Chen, D. Kufe, Nuclear signaling induced by ionizing radiation involvescolocalization of the activated p56/p53lyn tyrosine kinase with p34cdc2,Cancer Res. 56 (1996) 3617-3621.
【非特許文献１４】Z.M. Yuan, Y. Huang, S.K. Kraeft, L.B. Chen, S. Kharbanda, D. Kufe,Interaction of cyclin-dependent kinase 2 and the Lyn tyrosine kinase in cellstreated with 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, Oncogene 13 (1996) 939-946.
【非特許文献１５】K. Yoshida, R. Weichselbaum, S. Kharbanda, D. Kufe, Role for Lyntyrosine kinase as a regulator of stress-activated protein kinase activity inresponse to DNA damage, Mol. Cell. Biol. 20 (2000) 5370-5380.
【非特許文献１６】N. Yamaguchi, Y. Nakayama, T. Urakami, S. Suzuki, T. Nakamura, T.Suda, N. Oku, Overexpression of the Csk homologous kinase (Chk tyrosine kinase)induces multinucleation: a possible role for chromosome-associated Chk inchromosome dynamics, J. Cell Sci. 114 (2001) 1631-1641.
【非特許文献１７】K. Ikeda, Y. Nakayama, Y. Togashi, Y. Obata, T. Kuga, K. Kasahara,Y. Fukumoto, N. Yamaguchi, Nuclear localization of Lyn tyrosine kinase mediatedby inhibition of its kinase activity, Exp. Cell Res. 314 (2008) 3392-3404.
【非特許文献１８】I. Chu, J. Sun, A. Arnaout, H. Kahn, W. Hanna, S. Narod, P. Sun,C.K. Tan, L. Hengst, J. Slingerland, p27 phosphorylation by Src regulatesinhibition of cyclin E-Cdk2, Cell 128 (2007) 281-294.
【非特許文献１９】M. Grimmler, Y. Wang, T. Mund, Z. Cilensek, E.M. Keidel, M.B. Waddell,H. Jaekel, M. Kullmann, R.W. Kriwacki, L. Hengst, Cdk-inhibitory activity andstability of p27Kip1 are directly regulated by oncogenic tyrosine kinases, Cell128 (2007) 269-280.
【非特許文献２０】A.I. Lamond, W.C. Earnshaw, Structure and function in the nucleus,Science 280 (1998) 547-553.
【非特許文献２１】D. Zink, A.H. Fischer, J.A. Nickerson, Nuclear structure in cancercells, Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 677-687.
【非特許文献２２】C. Prigent, S. Dimitrov, Phosphorylation of serine 10 in histone H3,what for?, J. Cell Sci. 116 (2003) 3677-3685.
【非特許文献２３】S.J. Nowak, V.G. Corces, Phosphorylation of histone H3: a balancingact between chromosome condensation and transcriptional activation, TrendsGenet. 20 (2004) 214-220.
【非特許文献２４】J.D. Bjorge, C. Bellagamba, H.C. Cheng, A. Tanaka, J.H. Wang, D.J.Fujita, Characterization of two activated mutants of human pp60c-srcthat escape c-Src kinase regulation by distinct mechanisms, J. Biol. Chem. 270(1995) 24222-24228.
【非特許文献２５】Y. Yamanashi, S. Fukushige, K. Semba, J. Sukegawa, N. Miyajima, K.Matsubara, T. Yamamoto, K. Toyoshima, The yes-related cellular gene lyn encodesa possible tyrosine kinase similar to p56lck, Mol. Cell. Biol. 7(1987) 237-243.
【非特許文献２６】T. Tezuka, H. Umemori, T. Akiyama, S. Nakanishi, T. Yamamoto, PSD-95promotes Fyn-mediated tyrosine phosphorylation of the N-methyl-D-aspartatereceptor subunit NR2A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 435-440.
【非特許文献２７】J. Sukegawa, K. Semba, Y. Yamanashi, M. Nishizawa, N. Miyajima, T.Yamamoto, K. Toyoshima, Characterization of cDNA clones for the human c-yesgene, Mol. Cell. Biol. 7 (1987) 41-47.
【非特許文献２８】C.L. Law, S.P. Sidorenko, K.A. Chandran, K.E. Draves, A.C. Chan, A.Weiss, S. Edelhoff, C.M. Disteche, E.A. Clark, Molecular cloning of human Syk.A B cell protein-tyrosine kinase associated with the surface immunoglobulin M-Bcell receptor complex, J. Biol. Chem. 269 (1994) 12310-12319.
【非特許文献２９】S. Huebner, C.Y. Xiao, D.A. Jans, The protein kinase CK2 site(Ser111/112) enhances recognition of the simian virus 40 large T-antigennuclear localization sequence by importin, J. Biol. Chem. 272 (1997)17191-17195.
【非特許文献３０】Y. Nakayama, N. Yamaguchi, Multi-lobulation of the nucleus inprolonged S phase by nuclear expression of Chk tyrosine kinase, Exp. Cell Res.304 (2005) 570-581.
【非特許文献３１】Y. Nakayama, A. Kawana, A. Igarashi, N. Yamaguchi, Involvement ofthe N-terminal unique domain of Chk tyrosine kinase in Chk-induced tyrosinephosphorylation in the nucleus, Exp. Cell Res. 312 (2006) 2252-2263.
【非特許文献３２】N. Fujita, S. Watanabe, T. Ichimura, S. Tsuruzoe, Y. Shinkai, M.Tachibana, T. Chiba, M. Nakao, Methyl-CpG binding domain 1 (MBD1) interactswith the Suv39h1-HP1 heterochromatic complex for DNA methylation-basedtranscriptional repression, J. Biol. Chem. 278 (2003) 24132-24138.
【非特許文献３３】Y. Nakatani, V. Ogryzko, Immunoaffinitypurification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370(2003) 430-444.
【非特許文献３４】T. Tamura, T. Kunimatsu, S.T. Yee, O. Igarashi, M. Utsuyama, S.Tanaka, S. Miyazaki, K. Hirokawa, H. Nariuchi, Molecular mechanism of theimpairment in activation signal transduction in CD4+ T cells fromold mice, Int. Immunol. 12 (2000) 1205-1215.
【非特許文献３５】N. Yamaguchi, M.N. Fukuda, Golgi retention mechanism of β-1,4-galactosyltransferase: membrane-spanning domain-dependenthomodimerization and association with α- and β-tubulins, J. Biol. Chem. 270 (1995) 12170-12176.
【非特許文献３６】M. Shimizu, H. Nakamura, T. Hirabayashi, A. Suganami, Y. Tamura, T.Murayama, Ser515 phosphorylation-independent regulation of cytosolicphospholipase A2α (cPLA2α) bycalmodulin-dependent protein kinase: possible interaction with catalytic domainA of cPLA2α, Cell. Signal. 20 (2008) 815-824.
【非特許文献３７】R.A. Klinghoffer, C. Sachsenmaier, J.A. Cooper, P. Soriano, Srcfamily kinases are required for integrin but not PDGFR signal transduction,EMBO J. 18 (1999) 2459-2471.
【非特許文献３８】Y. Durocher, S. Perret, A. Kamen, High-level and high-throughputrecombinant protein production by transient transfection of suspension-growinghuman 293-EBNA1 cells, Nucleic Acids Res. 30 (2002) E9.
【非特許文献３９】M. Izumi, H. Miyazawa, T. Kamakura, I. Yamaguchi, T. Endo, F.Hanaoka, Blasticidin S-resistance gene (bsr): a novel selectable marker formammalian cells, Exp. Cell Res. 197 (1991) 229-233.
【非特許文献４０】T. Kanda, K.F. Sullivan, G.M. Wahl, Histone-GFP fusion proteinenables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells,Curr. Biol. 8 (1998) 377-385.
【非特許文献４１】Y.W. Lam, C.E. Lyon, A.I. Lamond, Large-scale isolation of Cajalbodies from HeLa cells, Mol. Biol. Cell 13 (2002) 2461-2473.
【非特許文献４２】K. Kasahara, Y. Nakayama, Y. Nakazato, K. Ikeda, T. Kuga, N.Yamaguchi, Src signaling regulates completion of abscission in cytokinesisthrough ERK/MAPK activation at the midbody, J. Biol. Chem. 282 (2007)5327-5339.
【非特許文献４３】T. Kuga, M. Hoshino, Y. Nakayama, K. Kasahara, K. Ikeda, Y. Obata,A. Takahashi, Y. Higashiyama, Y. Fukumoto, N. Yamaguchi, Role of Src-familykinases in formation of the cortical actin cap at the dorsal cell surface, Exp.Cell Res. 314 (2008) 2040-2054.
【非特許文献４４】J. Tada, M. Omine, T. Suda, N. Yamaguchi, A common signaling pathwayvia Syk and Lyn tyrosine kinases generated from capping of the sialomucins CD34and CD43 in immature hematopoietic cells, Blood 93 (1999) 3723-3735.
【非特許文献４５】E. Minc, Y. Allory, H.J. Worman, J.C. Courvalin, B. Buendia,Localization and phosphorylation of HP1 proteins during the cell cycle inmammalian cells, Chromosoma 108 (1999) 220-234.
【非特許文献４６】A. Hirao, I. Hamaguchi, T. Suda, N. Yamaguchi, Translocation of theCsk homologous kinase (Chk/Hyl) controls activity of CD36-anchored Lyn tyrosinekinase in thrombin-stimulated platelets, EMBO J. 16 (1997) 2342-2351.
【非特許文献４７】J.P. Mitchell, N.S. Cohn, M. Van der Ploeg, Quantitative changes inthe degree of chromatin condensation during the cell cycle in differentiatingPisum sativum vascular tissue, Histochemistry 78 (1983) 101-109.
【非特許文献４８】H. Santos-Rosa, R. Schneider, A.J. Bannister, J. Sherriff, B.E.Bernstein, N.C. Emre, S.L. Schreiber, J. Mellor, T. Kouzarides, Active genesare tri-methylated at K4 of histone H3, Nature 419 (2002) 407-411.
【非特許文献４９】S. Gupta, D. Campbell, B. Derijard, R.J. Davis, Transcription factorATF2 regulation by the JNK signal transduction pathway, Science 267 (1995)389-393.
【非特許文献５０】C. Livingstone, G. Patel, N. Jones, ATF-2 contains aphosphorylation-dependent transcriptional activation domain, EMBO J. 14 (1995)1785-1797.
【非特許文献５１】I. Hers, C.J. Bell, A.W. Poole, D. Jiang, R.M. Denton, E. Schaefer,J.M. Tavare, Reciprocal feedback regulation of insulin receptor and insulinreceptor substrate tyrosine phosphorylation by phosphoinositide 3-kinase inprimary adipocytes, Biochem. J. 368 (2002) 875-884.
【非特許文献５２】G. Huyer, S. Liu, J. Kelly, J. Moffat, P. Payette, B. Kennedy, G.Tsaprailis, M.J. Gresser, C. Ramachandran, Mechanism of inhibition ofprotein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate, J. Biol. Chem. 272(1997) 843-851.
【非特許文献５３】A.K. Jain, A.K. Jaiswal, GSK-3β actsupstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2related factor 2, J. Biol. Chem. 282 (2007) 16502-16510.
【非特許文献５４】R. Schmitz, G. Baumann, H. Gram, Catalytic specificity ofphosphotyrosine kinases Blk, Lyn, c-Src and Syk as assessed by phage display,J. Mol. Biol. 260 (1996) 664-677.
【非特許文献５５】M. Tachibana,K. Sugimoto,M. Nozaki,J. Ueda,T. Ohta,M. Ohki,M. Fukuda,N. Takeda,H. Niida,H. Kato,Y. Shinkai,G9a histone methyltransferase plays a dominant role in euchromatic histone H3lysine 9 methylation and is essential for early embryogenesis, Genes Dev. 16(2002) 1779-1791.
【非特許文献５６】R.H. Tao, I.N. Maruyama, All EGF (ErbB) receptors have preformedhomo- and heterodimeric structures in living cells. J. Cell Sci. 121 (2008)3207-3217.
【非特許文献５７】T. Kuga, Y. Nakayama, M. Hoshino, Y. Higashiyama, Y. Obata, D.Matsuda, K. Kasahara, Y. Fukumoto, N. Yamaguchi, Differential mitoticactivation of endogenous c-Src, c-Yes, and Lyn in HeLa cells, Arch. Biochem.Biophys. 466 (2007) 116-124.
【非特許文献５８】T. Cremer, M. Cremer, S. Dietzel, S. Mueller, I. Solovei, S. Fakan, Chromosometerritories--a functional nuclear landscape, Curr. Opin. Cell Biol. 18 (2006) 307-316.
【非特許文献５９】E. Meshorer, T. Misteli, Chromatin in pluripotent embryonic stemcells and differentiation, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (2006) 540-546.
【非特許文献６０】P. Blume-Jensen, T. Hunter, Oncogenic kinase signaling, Nature 411(2001) 355-365.
【非特許文献６１】D. Plehn-Dujowich, P. Bell, A.M. Ishov, C. Baumann, G.G. Maul,Non-apoptotic chromosome condensation induced by stress: delineation ofinterchromosomal spaces, Chromosoma 109 (2000) 266-279.
【非特許文献６２】Y. Shav-Tal, X. Darzacq, S.M. Shenoy, D. Fusco, S.M. Janicki, D.L.Spector, R.H. Singer, Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells,Science 304 (2004) 1797-1800.
【非特許文献６３】H. Albiez, M. Cremer, C. Tiberi, L. Vecchio, L. Schermelleh, S. Dittrich,K. Kuepper, B. Joffe, T. Thormeyer, J. von Hase, S. Yang, K. Rohr, H. Leonhardt,I. Solovei, C. Cremer, S. Fakan, T. Cremer, Chromatin domains and theinterchromatin compartment form structurally defined and functionallyinteracting nuclear networks, Chromosome Res. 14 (2006) 707-733.
【非特許文献６４】G. Manning, D.B. Whyte, R. Martinez, T. Hunter, S. Sudarsanam, Theprotein kinase complement of the human genome, Science 298 (2002) 1912–1934.
【非特許文献６５】S.H. Ahn, W.L. Cheung, J.Y. Hsu, R.L. Diaz, M.M. Smith, C.D. Allis,Sterile 20 kinase phosphorylates histone H2B at serine 10 during hydrogenperoxide-induced apoptosis in S. cerevisiae, Cell 120 (2005) 25-36.
【非特許文献６６】W. Fischle, B.S. Tseng, H.L. Dormann, B.M. Ueberheide, B.A. Garcia,J. Shabanowitz, D.F. Hunt, H. Funabiki, C.D. Allis, Regulation of HP1-chromatinbinding by histone H3 methylation and phosphorylation, Nature 438 (2005)1116-1122.
【非特許文献６７】T. Kouzarides, Chromatin modifications and their function, Cell 128(2007) 693-705.
【非特許文献６８】M. Dundr, T. Misteli, Functional architecture in the cell nucleus,Biochem. J. 356 (2001) 297-310.
【非特許文献６９】D.K. Pokholok, J. Zeitlinger, N.M. Hannett, D.B. Reynolds, R.A.Young, Activated signal transduction kinases frequently occupy target genes,Science 313 (2006) 533-536.
【非特許文献７０】M.A. Meyn III, S.J. Schreiner, T.P. Dumitrescu, G.J. Nau, T.E.Smithgall, SRC family kinase activity is required for murine embryonic stemcell growth and differentiation, Mol. Pharmacol. 68 (2005) 1320-1330.
【非特許文献７１】A.H. Fischer, D.N. Chadee, J.A. Wright, T.S. Gansler, J.R. Davie,Ras-associated nuclear structural change appears functionally significant andindependent of the mitotic signaling pathway, J. Cell. Biochem. 70 (1998)130-140.
【非特許文献７２】D. Komitowski, C. Janson, Quantitative features of chromatinstructure in the prognosis of breast cancer, Cancer 65 (1990) 2725-2730.
【発明の概要】
【０００８】
本発明の特徴は、ピクセルイメージング法を使用して１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造変化を定量的に評価することである。１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を評価する方法は、１つ又は複数の細胞の試料を用意すること、及び該１つ又は複数の細胞を核酸染色剤で処理することを含み得る。核酸染色剤で処理した細胞のうち１つ又は複数の細胞の核の画像（複数のピクセルを含む）をキャプチャーする（capture）ことができる。該複数のピクセルの各ピクセルで染色強度を定量することができ、１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出することができる。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値に基づき定量することができる。クロマチン構造変化を、クロマチン凝縮のレベルに基づき判定することができる。
【０００９】
本発明の別の特徴は、クロマチン構造を評価する方法を使用して被験体における病変を診断、予後診断（prognosis）又はモニタリングする方法を提供することである。クロマチン構造を、被験体由来の病変細胞の試料に関して評価することができる。疾患状態を、１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値に基づき判定することができる。
【００１０】
本発明の別の特徴は、クロマチン構造を評価する方法を使用して被験体における癌を診断、予後診断又はモニタリングする方法を提供することである。クロマチン構造を、被験体由来の癌性細胞の試料に関して評価することができる。悪性疾患を、１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値に基づき判定することができる。
【００１１】
本発明の別の特徴は、クロマチン構造を評価する方法を使用して細胞のクロマチン構造を調節する（modulate）化合物をスクリーニングする方法を提供することである。細胞の試料を該化合物と接触させることができ、細胞の試料におけるクロマチン構造を評価することができる。化合物と接触させた細胞の１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値を、対照細胞の１ピクセル当たりの染色強度のＳＤ値と比較し、細胞のクロマチン構造を調節する化合物を同定することができる。
【００１２】
本発明の別の特徴は、細胞におけるクロマチン構造を評価するシステムを提供することである。該システムは、核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の、少なくとも１つの画像をキャプチャする光学機器と、該画像の各ピクセルでの染色強度を定量する分光計機器とを含み得る。該分光計機器は、該光学機器と光学的に接続されていてもよく、また、計算機器と動作可能に接続されていてもよい。該システムは、１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出する計算機器と、算出した平均値及びＳＤ値を表示する表示機器とをさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図１Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図１Ｃ】図１Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイル（2D isometric intensity profile）を示す図である。
【図２Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図２Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図２Ｃ】図２Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図３Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図３Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図３Ｃ】図３Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図４Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図４Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図４Ｃ】図４Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図５Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図５Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図５Ｃ】図５Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図６Ａ】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像である。
【図６Ｂ】低凝縮度の、中程度の凝縮度の、及び高凝縮度のＤＮＡの領域を表すヒストグラムである。
【図６Ｃ】図６Ａの画像に対応する２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを示す図である。
【図７Ａ】非同期化した（asynchronized）細胞集団に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図７Ｂ】Ｓ期が豊富な（enriched）細胞集団に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図７Ｃ】Ｇ２期が豊富な細胞集団に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図８】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図９】抗リン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０抗体及びＰＩで染色した細胞の蛍光画像である。
【図１０】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１１Ａ】表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１１Ｂ】表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１１Ｃ】表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１１Ｄ】表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１２】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１３】ＤＮＡ及びヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰの染色の蛍光画像である。
【図１４Ａ】低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図１４Ｂ】低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、血清で（５％ＦＢＳ）で５時間刺激したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図１５】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１６】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１７Ａ】低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、表示した時間血清（５％ＦＢＳ）で刺激したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１７Ｂ】低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、表示した時間血清（５％ＦＢＳ）で刺激したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図１８Ａ】ＰＩ及び抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図１８Ｂ】ＰＩ及び抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体に関する蛍光強度プロットである。
【図１９Ａ】ＰＩ及び抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図１９Ｂ】ＰＩ及び抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体に関する蛍光強度プロットである。
【図２０Ａ】ＰＩ及び抗ＨＰ１α抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２０Ｂ】ＰＩ及び抗ＨＰ１α抗体に関する蛍光強度プロットである。
【図２１Ａ】血清飢餓状態にした（serum-starved）ＣＯＳ−１細胞に関するＰＩ及び抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２１Ｂ】血清飢餓状態にし、５％ＦＢＳで３０分間刺激したＣＯＳ−１細胞に関するＰＩ及び抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体でのＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２２】ＤＭＳＯ、１０μＭのＰＰ２、又は１００ｎＭのワートマニンで２４時間処理し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２３】ＤＭＳＯ単独で、又は１０μＭのＰＰ２で２１時間前処理し、その後３ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）で３時間インキュベーションしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２４】０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でｉｎ ｓｉｔｕで抽出し、その後固定して抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色した細胞に関するＤＮＡ及びｐＴｙｒの染色の蛍光画像である。
【図２５】図２４に関して説明した実験から得られたデータに基づく核中抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度を示すグラフである。
【図２６】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図２７Ａ】表示したように処理したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図２７Ｂ】表示したように処理したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図２７Ｃ】表示したように処理したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図２７Ｄ】表示したように処理したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図２８】３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、ＰＩと抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体又は抗ＨＰ１α抗体とで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図２９】ＣＯＳ−１細胞から調製した精製核に関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３０】精製核中のｐＴｙｒ及びＤＮＡの蛍光画像である。
【図３１】精製核中の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度を示すグラフである。
【図３２】ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ及びＮＬＳ−Ｓｙｋの模式図である。ＮＬＳ、核局在シグナル；ＳＨ、Ｓｒｃ相同ドメイン；ＰＴＫ、タンパク質−チロシンキナーゼドメイン；ＨＡ、ＨＡ−エピトープタグ；ＫＤ、キナーゼ活性のない（kinase-dead）Ｋ２７５Ａ突然変異。
【図３３】表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養して抗ｐＴｙｒ抗体と抗ＨＡ又は抗Ｓｙｋ抗体とで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するｐＴｙｒ染色の蛍光画像である。
【図３４Ａ】全細胞に関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３４Ｂ】表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養したＣＯＳ−１細胞から調製した精製核に関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３５】表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養してＰＩ及び抗ＨＡ抗体で二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図３６】表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養してＰＩ及び抗Ｓｙｋ抗体で二重に染色したか、又はＧＦＰ蛍光で可視化した、ＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図３７】核中のタンパク質発現を細胞質中のタンパク質発現と比較するグラフである。
【図３８Ａ】何もトランスフェクションしていないＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図３８Ｂ】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図３８Ｃ】Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図３９】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を示すプロットであり、バー及び値は代表的な実験に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図４０Ａ】Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１又はＦｌａｇ−Ｇ９ａをトランスフェクションし、３６時間培養して抗Ｆｌａｇ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４０Ｂ】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を示すプロットである。
【図４１】核中の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）対で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図４２】核中の抗ＨＡ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）対で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図４３】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、２４時間培養して抗ＨＡ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞、並びに、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、ＰIと抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体、又は抗ＨＰ１α抗体とで二重に染色した細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４４】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図４５Ａ】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現しているＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４５Ｂ】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図４６】何によっても処理せず、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、そして抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色したＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４７Ａ】何によっても処理しない、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理した、野生型Ｌｙｎ（Ｌｙｎ−ｗｔ）を安定的に発現しているＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４７Ｂ】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡをトランスフェクションし３６時間培養したＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４８Ａ】何によっても処理しない、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理した、野生型ｃ−Ｓｒｃ（ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ）を安定的に発現しているＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４８Ｂ】ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡをトランスフェクションし、３６時間培養したＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図４９】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図５０Ａ】何もトランスフェクションしていないＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図５０Ｂ】Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図５０Ｃ】ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。
【図５１Ａ】Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、３６時間培養して抗Ｆｌａｇ抗体又は抗ＨＡ抗体とＰＩとで二重に染色したＳＹＦ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図５１Ｂ】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図５２】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットである。
【図５３】播種し５％ＦＢＳ中で１日間培養し、５％又は０．５％ＦＢＳ中で表示した期間増殖させた、ＣＯＳ−１及びＳＹＦ細胞に関して計測及びプロットした細胞数を示すグラフである。
【図５４】Ｎａ３ＶＯ４で処理し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで染色したＨｅＬａ細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図５５】ＨｅＬａ細胞から調製した高度に精製した核のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図５６Ａ】ＮＬＳ−Ｙｅｓ−ＨＡ（キナーゼ活性がある）及びＮＬＳ−Ｆｙｎ−ＨＡ（キナーゼ活性がある）をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図５６Ｂ】各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表すプロットを示す図である。
【図５７】核と対応する全細胞との間の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度比（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図５８】核中の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図５９Ａ】ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした細胞における、核と対応する全細胞との間の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度比（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図５９Ｂ】ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡの模式図である。
【図６０】ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞から調製した全細胞可溶化物に関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図６１】ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、２４時間培養して抗ＨＡ抗体又は抗ｐＴｙｒ抗体とＰＩとで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関するＤＮＡ染色の蛍光画像である。
【図６２】ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡをトランスフェクションした細胞における、核中の抗ＨＡ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【図６３】ＮＬＳ−ＧＦＰをトランスフェクションした細胞における、核中のＧＦＰの平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）で示される２Ｄ−プロット解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、核のピクセルイメージングを使用してクロマチン構造変化を定量的に評価する方法に関する。核のピクセルイメージングは、核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の１つ又は複数の画像をキャプチャすることを含み得る。染色強度は、その強度を定量することにより測定することができる。１ピクセル当たりの染色強度の平均及び／又は標準偏差をクロマチン凝縮レベル又はクロマチン構造変化を判定するために使用することができる。
【００１５】
本発明者らは、クロマチン構造（architecture）におけるＳＦＫの役割を、クロマチン凝縮レベルを測定することにより判定することができることも見出した。本発明の教示によれば、成長因子刺激は、ＳＦＫにより媒介される核のチロシンリン酸化を通じて、ユークロマチンの低凝縮及び付随するヘテロクロマチンの高凝縮のレベルを増大させ得る。成長因子刺激により、核中のキナーゼ活性があるＳＦＫは、クロマチン構造の動的変化において重要な役割を果たし得る。本発明者らは、成長因子刺激が、Ｇ１期におけるユークロマチンの低凝縮及び付随するヘテロクロマチンの高凝縮を増大させることがあり、そのレベルは３０分までにプラトーに到達し、少なくとも５時間持続し、２４時間後に基礎レベルに戻ることを見出した。本発明者らは、また、ユークロマチン領域においてヘテロクロマチン領域よりもより頻繁に、核中の血清により活性化した（serum-activated）ＳＦＫを検出した。キナーゼ活性があるＳＦＫの核発現が、核のチロシンリン酸化のレベルに応じて、ユークロマチン化及びヘテロクロマチン化（heterochromatinization）の両方を劇的に増大させ得るが、関連のない（unrelated）Ｓｙｋキナーゼではそうならないことも測定された。しかし、成長因子刺激は、ＳＦＫを欠くＳＹＦ細胞におけるクロマチン構造変化を誘発せず、ＳＹＦ細胞へのＳＦＫのメンバーの１つの再導入は、不十分にではあるが、クロマチン構造変化を誘発し得る。これらの結果は、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化が、成長因子刺激によるクロマチン構造変化において重要な役割を果たすことを示唆する。
【００１６】
本発明は、細胞（複数可）におけるクロマチン構造を評価する多数の方法及びシステムに関し、それらは核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の１つ又は複数の画像をキャプチャすることを含み得る。染色強度は、例えばその強度を定量することにより、測定することができる。平均及び／又は標準偏差、例えば画像（複数可）のピクセル（複数可）の平均及び／又は標準偏差を測定又は判定することができる。さらに、クロマチン構造をイメージングにより判定することができる。例えば、標準偏差を、クロマチン凝縮のレベルを理解する方法として、クロマチン構造を判定するのに使用することができる。一例として、本発明は、１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を評価する方法であって、
１つ又は複数の細胞の試料を用意すること、
１つ又は複数の細胞を、例えば核酸染色剤で、処理すること、
核酸染色剤で処理した細胞のうち１つ又は複数の細胞の核の画像（複数のピクセルを含み得る）をキャプチャすること、
複数のピクセルの各ピクセルで染色強度を定量すること、
１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び／又は標準偏差（ＳＤ）値を算出すること、及び
クロマチン構造を判定すること（例えば、ここでＳＤ値がクロマチン凝縮のレベルの指標である）、
を含む、クロマチン構造を評価する方法に関する。１つ又は複数の細胞は、１つ又は複数の生細胞であり得るか、又は、１つ又は複数の真核細胞であり得るか、又は、１つ又は複数の哺乳動物細胞、及び／又は他の種類の細胞、若しくはその任意の組合せであり得る。複数の画像を、任意の期間にわたりキャプチャすることができる。１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び／又はＳＤ値を、各画像に関して算出することができる。その期間にわたるＳＤ値の変化は、例えば任意の期間にわたり、クロマチン構造の変化と相関し得る。核酸染色剤は、蛍光染色剤、又は他の種類の染色剤であり得る。核酸染色剤は、例えばヨウ化プロピジウムであり得る。本発明の方法は、核酸染色剤で処理する前にＲＮａｓｅで細胞を処理することをさらに含み得る。任意選択として、画像を、共焦点顕微鏡又は他の種類の顕微鏡若しくは検出機器を利用して、キャプチャすることができる。１つ又は複数の細胞の試料は、平切断切片（planar section slice）を含み得る。画像は、約５１２×５１２ピクセルの解像度に代えて、任意の解像度で、例えば、１ピクセル当たりの染色強度を理解することを可能にするような解像度で、キャプチャすることができる。平均値及び／又はＳＤ値を、各核の少なくとも２つのキャプチャした画像の平均から算出することができる。核の画像は、任意の量のピクセル、例えば５００ピクセル以上、又は１０００ピクセル以上、又は約６０００ピクセル以上を含み得る。本発明の方法は、１ピクセル当たりの平均染色強度に基づき、クロマチン構造を低凝縮度の、中程度の凝縮度の、又は高凝縮度のものと判定することをさらに含み得る。核酸染色剤はヨウ化プロピジウムを含むことができ、及び／又は１ピクセル当たりの染色強度の平均値は、約２４００〜約３０００の範囲であり得る。この範囲外の他の範囲を使用することができる。
【００１７】
本発明は、被験体における病変を診断、予後診断及び／又はモニタリングする（ｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｉｎ ｖｉｖｏで）方法であって、例えば本発明の方法（複数可）を使用して、被験体由来の病変細胞のうち１つ又は複数の細胞の試料におけるクロマチン構造を評価することを含む、方法にも関する。ＳＤ値は、疾患状態の指標であり得る。該方法は、被験体由来の１つ又は複数の非病変細胞の試料におけるクロマチン構造を評価することをさらに含んでもよく、１つ又は複数の病変細胞の算出したＳＤ値を１つ又は複数の非病変細胞の算出したＳＤ値と比較することを含んでもよい。該方法は、１つ又は複数の病変細胞の算出したＳＤ値を、正常な組織から疾患状態までの進行曲線に沿う範囲にある同じ種類の病変のこれまでに算出したＳＤ値の範囲と比較することをさらに含み得る。その工程は、任意の回数繰り返すことができる。例えば、該工程を、所定の時間の経過後に、該病変が疾患状態に進行しているのか、又は疾患状態から退行して（regressed）いるのかを判定するために、繰り返すことができる。病変の進行（例えば、所定の時間の間の）を、病変を治療する方法の有効性を測定するために利用することができる。本発明は、被験体における癌を診断、予後診断及び／又はモニタリングする方法（ｉｎ ｖｉｖｏで又はｉｎ ｖｉｔｒｏで）であって、被験体由来の１つ又は複数の癌性細胞の試料におけるクロマチン構造を本発明に従って評価することを含む方法に関し、ここでＳＤ値は悪性疾患又は病状の指標であり得る。該方法は、被験体由来の１つ又は複数の非癌性細胞の試料におけるクロマチン構造を本発明に従って評価すること、及び任意に、１つ又は複数の癌性細胞の算出したＳＤ値を、１つ又は複数の非癌性細胞の算出したＳＤ値と比較することをさらに含み得る。該方法は、１つ又は複数の癌性細胞の算出したＳＤ値を、正常な組織から悪性疾患までの進行曲線に沿う範囲にある同じ種類の癌のこれまでに算出したＳＤ値の範囲と比較することをさらに含み得る。その工程は、任意の回数繰り返すことができる。該工程を、所定の時間の経過後に、癌が悪性疾患に進行しているのか、又は悪性疾患から退行しているのかを判定するために、繰り返すことができる。
【００１８】
本発明は、１つ又は複数の細胞のクロマチン構造を調節する化合物をスクリーニングする（又は判定する）方法にも関し得る。この方法は、
１つ又は複数の細胞を化合物と接触させること、
１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を上述したように評価すること、及び
化合物と接触させた１つ又は複数の細胞のＳＤ値を１つ又は複数の対照細胞のＳＤ値と比較すること、
を含み得る。該化合物は、１つ又は複数の細胞の有糸分裂の進行を刺激することができる。該化合物は、１つ又は複数の細胞におけるアポトーシスを誘発することができる。該化合物は、成長因子を含み得る。
【００１９】
本発明は、１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を評価するシステムにも関する。このシステムは、
核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の、少なくとも１つの画像をキャプチャする光学機器（又は他の機器）、
画像の各ピクセルで染色強度を定量する分光計機器（又は他の機器）であって、光学機器に光学的に接続されており、計算機器と動作可能に接続されている分光計機器、並びに
任意に、１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出する計算機器、及び
任意に、算出した平均値及びＳＤ値を表示する表示機器、
を含み得る。該光学機器は、共焦点顕微鏡を含み得る。該分光計機器は、ヨウ化プロピジウム又は他の化合物により放射される光を検出することができる。
【実施例】
【００２０】
本発明は、以下の実施例と得られたデータとを参照して、さらにより十分に理解することができる。
【００２１】
材料及び方法
プラスミド。ヒト野生型ｃ−Ｓｒｃ（ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ、１−５３６、開始メチオニンを１と定める）（（非特許文献２４）、D. J. Fujitaにより提供された）をコードするｃＤＮＡを、従前（非特許文献７）のようにｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Invitrogen）中にサブクローニングした。Ｃ−末端にＨＡエピトープタグを付したＳｒｃ−ＨＡ（１−５３２）は、ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ ｃＤＮＡをｐＭＨベクター（Roche）中にサブクローニングすることにより構築した。ヒト野生型Ｌｙｎ（Ｌｙｎ−ｗｔ）をコードするｃＤＮＡは、T. Yamamotoにより提供された（１−５１２、（非特許文献２５））。Ｃ−末端の負の調節テールを欠くＬｙｎにＨＡ−タグを付した構築物、Ｌｙｎ−ＨＡ（１−５０６、キナーゼ活性がある）及びＬｙｎ（Ｋ２７５Ａ）−ＨＡ（１−５０６、キナーゼ活性がない）は、以前に説明した（非特許文献５）。ヒト野生型Ｆｙｎ（１−５３７、（非特許文献２６））及びヒト野生型ｃ−Ｙｅｓ（１−５４３、（非特許文献２７））（T. Yamamotoにより提供された）をコードするｃＤＮＡは、Ｃ−末端にＨＡエピトープタグを付した。Ｃ−末端の負の調節テールを欠くＨＡ−タグを付した構築物、Ｆｙｎ−ＨＡ（１−５２４、キナーゼ活性がある）及びＹｅｓ−ＨＡ（１−５３０、キナーゼ活性がある）は、ｐＭＨ中にサブクローニングすることにより構築した。ヒト野生型Ｓｙｋ（１−６３５、（非特許文献２８））（E.A. Clarkにより提供された）をコードするｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ中にサブクローニングした。構築物のＮ−末端に核局在シグナル（ＮＬＳ）（非特許文献２９）を導入するために、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＮＬＳ−ｍｃｓベクターを、ＮＬＳ−Ｃｈｋ（ＰＴＫ）−ＦＬＡＧ（非特許文献３０）をコードするｐｃＤＮＡ４／ＴＯのＢａｌＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片と、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクターのＥｃｏＲＶ−ＢｓｓＨＩＩ断片とを置換することにより構築した。ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＮＬＳ−ｍｃｓ中のＳｒｃ−ＨＡ、Ｌｙｎ−ＨＡ、Ｌｙｎ（Ｋ２７５Ａ）−ＨＡ、Ｆｙｎ−ＨＡ、Ｙｅｓ−ＨＡ及びＳｙｋのＮ−末端にＮＬＳを添加した。ＮＬＳ融合緑色蛍光タンパク質（ＮＬＳ−ＧＦＰ）を、以前に説明したように構築し、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ中にサブクローニングした（非特許文献３０、３１）。ｐｃＤＮＡ３／Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びｐｃＤＮＡ３／Ｆｌａｇ−Ｇ９ａは、M. Nakao及びY. Shinkaiにより提供された（非特許文献３２）。ヒトＣＤ２５をコードするｃＤＮＡは、A. Iwamaにより提供された（非特許文献３３）。ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡは、Ｌｙｎ−ＨＡのＮ末端でのＣＤ２５（１−２７０）との融合により構築し、配列番号１の配列（Ｉ−Ｐ−Ｅ−Ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｃ−Ｗ−Ｔ−Ｒ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｓ−Ｐ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｎ）をＣＤ２５及びＬｙｎ−ＨＡの間に挿入した。
【００２２】
抗体。以下の抗体を使用した：リン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）（４Ｇ１０及びポリクローナル抗体：Upstate Biotechnology, Inc、T. Tamura及びT. Yoshimoto（非特許文献３４）により提供された）、ＨＡエピトープ（Ｆ−７及びＹ−１１、Santa Cruz Biotechnology、及び１２ＣＡ５）、Ｆｌａｇエピトープ（Ｍ２、Sigma）、Ｓｒｃ（ＧＤ１１、Upstate Biotechnology, Inc.）、Ｌｙｎ（Ｌｙｎ４４、Santa Cruz Biotechnology）、Ｙｅｓ（Ｙｅｓ１、BD PharMingen）、Ｆｙｎ（Ｆｙｎ−３、Santa Cruz Biotechnology）、Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］（リン酸化Ｓｒｃ−ファミリー、Cell Signaling Technology）、ラミンＢ１（Ｌ−５、Zymed）、Ｓｙｋ（４Ｄ１０、Santa Cruz Biotechnology）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）（（非特許文献３５）、M.N. Fukudaにより提供された）、デスモグレイン（クローン６２、BD TransductionLaboratories）、アクチン（クローンＣ４、CHEMICON International）、細胞質ホスホリパーゼＡ２α（ｃＰＬＡ２α）（４−４Ｂ−３Ｃ、Santa Cruz Biotechnology、T. Murayamaにより提供された（非特許文献３６））、リジン４がトリメチル化されたヒストンＨ３（ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３）（ａｂ１０１２及びａｂ８５８０、Abcam）、ヘテロクロマチンタンパク質−１α（ＨＰ１α）（ＭＡＢ３４４６、CHEMICONInternational）、リン酸化ＡＴＦ−２（リン酸化スレオニン６９及びリン酸化スレオニン７１、ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１）（ＡＴＦ−２２Ｐ、Sigma）及びリン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（リン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０）（６Ｇ３、Cell Signaling Technology）。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−Ｆ（ａｂ’）２二次抗体は、Amersham Bioscienceから購入した。ＩｇＧのＦＩＴＣ−Ｆ（ａｂ’）２、又はＴＲＩＴＣ−ＩｇＧ二次抗体は、BioSource International及びSigma−Aldrichから入手した。
【００２３】
細胞及びトランスフェクション。ＣＯＳ−１、ＨｅＬａ細胞（Japanese Collection of Research Bioresources、Osaka）、ＭＣＦ−７（H. Sayaにより提供された）、Ａ４３１（M.N. Fukudaにより提供された）、ＨＥＫ２９３（M. Tagawaにより提供された）、ＨＣＴ１１６（T. Tomonagaにより提供された）及びＳＹＦ（（非特許文献３７）、M. Okada及びS. Nadaにより提供された）は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するイスコブ変法ＤＭＥ中で細胞を培養した。細胞の一過性トランスフェクションは、Ｔｒａｎｓ ＩＴ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Mirus）（非特許文献１６）を使用して０．５μｇのプラスミドベクターで行うか、又は直鎖ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ）（Polyscience, Inc.）（非特許文献３８）を使用して１μｇのプラスミドベクターで行った。成長因子刺激のために、ＣＯＳ−１細胞を低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、血清（５％ＦＢＳ）で再刺激した。内在性ＳＦＫの刺激のために、細胞を３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、そしてＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化を、Ｎａ３ＶＯ４処理の前に１０μＭのＰＰ２（ＳＦＫ阻害剤、Calbiochem）、又は１００ｎＭのワートマニン（ＰＩ３Ｋ阻害剤、AlomoneLabs）で２１時間処理することにより確認した。Ｎａ３ＶＯ４は、使用前に５００ｍＭの非緩衝化ＨＥＰＥＳ中に５００ｍＭで溶解した。安定なトランスフェクタントクローンの調製のために、ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ又はＬｙｎ−ｗｔをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞は３３３μｇ／ｍＬのゼオシン（Invitrogen）中で選択し、そしてＣＯＳ−１細胞はＧＦＰ−タグを付したヒストンＨ２Ｂ（（非特許文献３９、４０）、H. Sayaにより提供された）をコードするＢＯＳＨ２ＢＧＦＰ−Ｎ１ベクターでトランスフェクションして３μｇ／ｍＬのブラストサイジン中で選択した。
【００２４】
核の精製。核を、以前に説明した（非特許文献４１）ように調製した。簡潔には、ＣＯＳ−１及びＨｅＬａ細胞を、プロテアーゼ阻害剤（２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、５０μｇ／ｍＬ アプロチニン、１００μＭ ロイペプチン、及び２５μＭ ペプスタチンＡ）を含有する低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、及び１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）中で４℃にて２０分間膨張させ、その後、密着式（tight-fitting）の１ｍｌ容のＤｏｕｎｃｅホモジナイザ中で２０ストロークを行い均質化した。細胞懸濁液を２００×ｇで５分間遠心分離した後、細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＮａ３ＶＯ４を含有する０．２５Ｍのショ糖中で再懸濁した。得られた懸濁液を、プロテアーゼ阻害剤、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＮａ３ＶＯ４を含有する０．３５Ｍのショ糖層の最上部に装荷し、１６４０×ｇで５分間、遠心分離した。ペレットを低張緩衝液で洗浄し、２００×ｇで５分間、遠心分離し、ＳＤＳ−試料緩衝液中で可溶化した。
【００２５】
免疫蛍光。共焦点画像及びノマルスキー微分干渉コントラスト画像は、４０×１．００ＮＡ油浸及び１００×１．３５ＮＡ油浸対物レンズを有するＦｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ５００共焦点レーザー走査式顕微鏡（オリンパス株式会社、東京）と、６３×１．４０ＮＡ油浸対物レンズを有するＬＳＭ ５１０共焦点レーザー走査式顕微鏡（Zeiss）とを使用して、記載のように（非特許文献７、８、１６、３０、４２、４３）得た。１枚の平（ｘｙ）切断切片（０．６μｍ厚）を、全ての実験で示す。簡潔には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、０．１％サポニン及び３％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で室温にて透過処理した（非特許文献３５）。細胞をその後適当な一次抗体と１時間反応させ、０．１％サポニンを含有するＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ−又はＴＲＩＴＣ−結合型二次抗体で１時間染色した。ＤＮＡ染色に関しては、細胞をその後、２００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａで１時間、及び２０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で３０分間処理し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ａｎｔｉｆａｄｅ（商標）試薬（Molecular Probes）でマウントした。フルオレセインシグナルから赤のチャネルへの漏れ（bleed-through）がないことを確実にするために、フルオレセイン及びローダミンをそれぞれ４８８ｎｍ又は５４３ｎｍで独立して励起させた。ＰＩは４８８ｎｍ又は５４３ｎｍで励起させた。発光シグナルは、フルオレセインに関しては５０５ｎｍ〜５２５ｎｍで、ローダミンに関しては５６０ｎｍ超で、ＰＩに関しては６１０ｎｍ超で、検出した（非特許文献４４）。混成図は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０及びＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ９．０ソフトウェア（Adobe）を使用して作成した。抗ｐＴｙｒ抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体及び抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体での核染色のために、細胞は、４％パラホルムアルデヒドでの固定の前に、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いてｉｎ ｓｉｔｕで４℃にて３分間抽出した（非特許文献３１）。ＨＰ１α染色に関しては、細胞を、−２０℃で１０分間、１００％メタノール中で固定し、その後０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中で、室温で３０分間透過処理した。細胞を、抗ＨＰ１α抗体と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで４回洗浄し、二次抗体で１時間染色した（非特許文献４５）。抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体及び抗ＨＰ１α抗体での染色、並びにＰＩ染色の蛍光強度プロット（それぞれ図１８Ｂ、図１９Ｂ及び図２０Ｂを参照されたい）を、Ｆｌｕｏｖｉｅｗバージョン４．３ ソフトウェア（オリンパス株式会社、東京）を使用して生成した。核ＳＦＫのキナーゼ活性の検出に関しては、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、及び０．１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）中に懸濁した精製核を、１０μＭ ＰＰ２と共に又は無しで３０℃にて３０分間プレインキュベーションし、次いで５μＭ又は１０μＭのＡＴＰと共に３０℃で３０分間インキュベーションし、その後２００×ｇで５分間、細胞遠心分離（cytocentrifugation）し、そして４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＤＮＡは、２０μｇ／ｍＬのＰＩ、及び２００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａと共に３０分間染色した。核中のチロシン−リン酸化タンパク質の平均蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（National Institutes of Health）を使用して測定した。
【００２６】
クロマチン凝縮レベルの定量。ＰＩ染色した核の共焦点画像は、上述のように得た。５１２×５１２ピクセルの解像度で表示したプロファイルは、同じ焦点面での５回のスキャンの平均から得た。１つの平（ｘｙ）切断切片の厚みは０．６μｍであり１個の核は６０００ピクセル〜１００００ピクセルを含有する。各ピクセルのＰＩ蛍光強度を定量し、そして個々の核に関する１ピクセル当たりの蛍光強度のヒストグラムを、Ｆｌｕｏｖｉｅｗバージョン４．３ソフトウェア（オリンパス株式会社、東京）を使用して生成した。１つの低凝縮度クロマチン領域は、通常、２００を超えるピクセルを含む。１ピクセル当たりの蛍光強度のバックグラウンドレベルは、０〜７００の範囲内であった。１ピクセル当たりの蛍光強度の平均値及びＳＤ値を、各細胞において核を占有する全ピクセルから算出した。クロマチン凝縮のレベルは、各細胞に関する１ピクセル当たりの蛍光強度の平均値が２４００〜３０００の範囲である条件下での各細胞に関するＳ．Ｄ．値により表した。ＰＩ染色の２次元（２Ｄ）等角投影法による強度プロファイル（画像解像度:７０×７０ピクセル）は、Ｆｌｕｏｖｉｅｗバージョン４．３（オリンパス株式会社、東京）とＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００４ソフトウェアとを使用して生成した。核を約３０００ピクセルに分割し、１つの表示されたピクセルは、２〜３ピクセルを含み、これらのピクセルを平均値及びＳ．Ｄ．値の定量のために使用した。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃから図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃまでは、Ｐ．Ｉ．染色した核の各表示されたピクセルに関する平均値及びＳ．Ｄ．値と、対応するヒストグラムと、Ｐ．Ｉ．染色の２Ｄ等角投影法による強度プロファイルとを示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値の、個々の核内の抗ｐＴｙｒ染色若しくは抗ＨＡ染色又はＧＦＰの平均蛍光強度に対する２Ｄ−プロット解析は、図４１、図４２、図６２及び図６３に示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値の２Ｄ−プロット解析は、Ｆｌｕｏｖｉｅｗバージョン４．３ソフトウェアを使用して生成し、（ａ）核中の抗ｐＴｙｒ染色の積分蛍光強度と対応する全細胞中の抗ｐＴｙｒ染色の積分蛍光強度との比（核／全細胞）に対するものは、図５７及び図５９Ａに示し、（ｂ）核中の抗ｐＴｙｒ染色の積分蛍光強度に対するものは、図５８に示す。
【００２７】
細胞周期分析。Ｓ期及びＧ２期の細胞を得るために、５％ＦＢＳを含有するイスコブ変法ＤＭＥ中で増殖させたＣＯＳ−１細胞を、３ｍＭのチミジンに１８時間曝露することによりＳ期で停止させた（blocked）。細胞を、ＰＢＳで洗浄してチミジンを含まないものとし、さらに２時間又は５時間培養した。細胞をトリプシン処理により引き剥し、１．５％ パラホルムアルデヒド中で４℃にて１時間固定し、その後７０％ エタノールで−３０℃で１時間以上、透過処理した。固定した細胞を、３％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、２００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ及び５０μｇ／ｍｌ ＰＩで３７℃にて３０分間処理しＤＮＡを染色した。細胞周期は、４８８ｎｍアルゴンレーザー（Beckman Coulter）を備え付けたＭｏＦｌｏセルソーターを使用するフローサイトメトリーにより分析した。Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした細胞を、３６時間培養し、上述のように固定及び透過処理した。固定した細胞は３％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄し、抗ＨＡ抗体で１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ−結合型二次抗体で１時間染色した。上述のようにＰＩでのＤＮＡ染色の後、Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡを発現している細胞において、細胞周期を分析した。
【００２８】
ウェスタンブロッティング。ウェスタンブロッティングは、化学発光増幅（enhanced chemiluminescence）（AmershamBioscience）で、以前に説明したように（非特許文献５、１６、４６）行った。全細胞又は精製核の可溶化物をＳＤＳ−試料緩衝液中で調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、二フッ化ポリビニリデン膜上への電気的転写を行った。タンパク質バンドを適当な抗体で検出し、Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士フィルム株式会社、東京）を使用してＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅソフトウェアで分析した。製造業者の取扱説明書に従い、剥離緩衝液中での膜からの一次抗体の完全な除去後、又は０．１％のＮａＮ３によるＨＲＰの不活性化後に、様々な抗体での膜の連続的再プローブ（reprobing）を行った。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０及びＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ９．０ソフトウェア（Adobe）を使用して混成図を作成した。
【００２９】
結果
クロマチン構造変化の定量。図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ及び図６Ａは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で得られるＤＮＡ蛍光画像を示す。「材料及び方法」で説明したように、画像を多数のピクセルに等しく分割した。各ピクセルの蛍光強度を測定し、平均強度及びＳ．Ｄ．値を各細胞に関して算出した。スケールバーは１０μｍを示す。図１Ｂ、図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ、図５Ｂ及び図６Ｂに示すヒストグラムは、低凝縮度のＤＮＡ（７００≦１ピクセル当たりの蛍光強度＜２２００、緑色）、中程度の凝縮度のＤＮＡ（２２００≦１ピクセル当たりの蛍光強度≦３２００、黄色）、高凝縮度のＤＮＡ（１ピクセル当たりの蛍光強度＞３２００、赤色）及びバックグラウンド（１ピクセル当たりの蛍光強度＜７００、青色）の領域を表す。２Ｄ等角投影法による強度プロファイルを、図１Ｃ、図２Ｃ、図３Ｃ、図４Ｃ、図５Ｃ及び図６Ｃに示す。右に示すＰＩ蛍光強度のスペクトル（０〜４０９５）は、高凝縮度のＤＮＡ（赤色）、中程度の凝縮度のＤＮＡ（黄色）、低凝縮度のＤＮＡ（緑色）及びバックグラウンド（青色）を表す。図７Ａ〜図７Ｃ及び図８は、「材料及び方法」で説明したように、Ｓ期又はＧ２期で同期化したＣＯＳ−１細胞に関する。ＤＮＡ含有量は、非同期化した細胞と、Ｓ期及びＧ２期が豊富な細胞集団とに関してフローサイトメトリーにより分析し、結果はそれぞれ図７Ａ〜図７Ｃにヒストグラムとして示す。Ｇ２期が豊富な細胞集団は、Ｇ２期に同期化した細胞から得た。ピークは、２Ｎ（Ｇ１期）及び４Ｎ（Ｇ２期）のＤＮＡ含有量を表す。図８に示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数８１〜９４）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意でない）。図９及び図１０は、３ｍＭのチミジンに１８時間曝露することによりＳ期で停止させ、洗浄してチミジンを含まないものとし、さらに９時間培養したＣＯＳ−１細胞に関する。細胞を、ＤＮＡに関して抗リン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０抗体及びＰＩで染色し、有糸分裂の染色体を検出した。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を図９に示す。スケールバーは１０μｍを示す。図１０におけるプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は代表的な実験（細胞数３５〜７４）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１１Ａ〜図１１Ｄ及び図１２は、表示した濃度のＨ２Ｏ２で１時間処理し、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関する。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析し、結果を図１１Ａ〜図１１Ｄにヒストグラムとして示す。図１２におけるプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は代表的な実験（細胞数６１〜７８）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１３は、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現している、ＤＮＡに関してＰＩで染色したＣＯＳ−１細胞に関する。ＤＮＡ及びヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰの染色の蛍光画像を図１３に示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を、図１３に示した画像の上部に示す。スケールバーは１０μｍを示す。
【００３０】
血清成長因子に誘発されるクロマチン構造の変化。ＣＯＳ−１細胞を、低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にし、血清（５％ＦＢＳ）で５時間刺激し、その後ＤＮＡに関してＰＩで染色した。ＤＮＡ染色の蛍光画像を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を、図１４Ａ及び図１４Ｂに示した画像の上部に示す。スケールバーは１０μｍを示す。図１５及び図１６は、Ｓ．Ｄ．値を使用してクロマチン凝縮レベルを定量するグラフである。図１５及び図１６では血清刺激を、表示した時間で、１０μＭのＰＰ２の存在下又は非存在下において示す。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は溶媒対照である。図１５及び図１６におけるプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数７１〜１１６）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した飢餓と刺激との間の有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意でない）。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析した。図１７Ａ及び図１７Ｂは、ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。図１８Ａ〜図１８Ｂ、図１９Ａ〜図１９Ｂ及び図２０Ａ〜図２０Ｂは、「材料及び方法」で説明したように、血清飢餓状態にしたＣＯＳ−１細胞を５％ＦＢＳで５時間刺激し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でｉｎ ｓｉｔｕで抽出し、その後固定し、ＰＩと抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体又は抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体とで二重に染色したもの、並びに、血清飢餓状態にしたＣＯＳ−１細胞をメタノール中で固定して、その後抗ＨＰ１α抗体とＰＩとで二重に染色したものに関する。スケールバーは１０μｍを示す。染色した細胞の蛍光画像を、図１８Ａ、図１９Ａ及び図２０Ａに示す。抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体及び抗ＨＰ１α抗体の蛍光強度プロットを、それぞれ図１８Ｂ、図１９Ｂ及び図２０Ｂに示す。重ね合わせた画像に描いた線に沿った強度プロットを右に示す。赤色はＰＩ強度を示し、緑色は抗体染色強度を示す。図２１Ａ及び２１Ｂは、血清飢餓状態にしたＣＯＳ−１細胞を５％ＦＢＳで３０分間刺激する（刺激）か刺激せず（飢餓）、抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体及びＰＩで二重に染色したものに関する。破線は核の輪郭を示す。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を、図２１Ａ及び図２１ＢのＤＮＡ画像に示す。正方形の領域の拡大画像を、右に示す。スケールバーは１０μｍを示す。
【００３１】
ＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化によるクロマチン構造変化の誘発。図２２は、ＤＭＳＯ、１０μＭのＰＰ２、又は１００ｎＭのワートマニンで２４時間処理し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。正方形の領域の拡大画像を右に示す。スケールバーは１０μｍを示す。図２３は、ＤＭＳＯ単独で、又は１０μＭのＰＰ２で２１時間前処理し、その後３ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）で３時間インキュベーションしたＣＯＳ−１細胞に関する。チロシン−リン酸化タンパク質及びＤＮＡを、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで染色した。正方形の領域の拡大画像を右に示す。スケールバーは１０μｍを示す。細胞質のチロシン−リン酸化タンパク質を低減するために、「材料及び方法」で説明したように、細胞を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でｉｎ ｓｉｔｕで抽出し、その後固定し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色した。染色した細胞の蛍光画像を図２４に示す。正方形の領域の拡大画像を右に示す。破線は核の輪郭を示す。スケールバーは１０μｍを示す。図２５は、図２４に関して説明した実験から得られたデータに基づく核中抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度を示し、データは、少なくとも３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数９６〜１０２）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図２６は、図１Ａ〜図８に関して上述した細胞のように処理したＣＯＳ−１細胞に関する。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価した。プロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は少なくとも３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数４６〜１０４）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意でない）。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析し、結果を、図２７Ａ〜図２７Ｄに示すヒストグラムとして示す。図２８は、「材料及び方法」で説明したように、３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、ＰＩと、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体又は抗ＨＰ１α抗体とで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。スケールバーは１０μｍを示す。
【００３２】
ＳＦＫの核局在、及び精製核のｉｎ ｖｉｔｒｏでのチロシンリン酸化。図２９は、「材料及び方法」で説明したように、ＣＯＳ−１細胞から調製した精製核に関するウェスタンブロッティングの結果を示す。全細胞及び精製核由来の可溶化物のウェスタンブロットを、個々のＳＦＫメンバー、ラミンＢ１、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、デスモグレイン、及び細胞質ホスホリパーゼＡ２α（ｃＰＬＡ２α）に対する抗体でプローブした。図３０は、ＤＭＳＯ単独で、又は１０μＭのＰＰ２で３０分間前処理し、表示した濃度のＡＴＰと共に３０℃で３０分間インキュベーションしたＣＯＳ−１細胞から調製した精製核に関する。チロシン−リン酸化タンパク質及びＤＮＡを、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで染色した。スケールバーは１０μｍを示す。図３０は、精製核中のチロシン−リン酸化（ｐＴｙｒ）の蛍光画像を示す。図３１は、精製核中の抗ｐＴｙｒ染色の平均蛍光強度を示し、データは、少なくとも３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数７２〜８１）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３３】
核標的化（nuclear-targeted）ＳＦＫにより誘発されるクロマチン構造（architecture）の変化。図３２は、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ及びＮＬＳ−Ｓｙｋの模式図を示す。ＮＬＳは核局在シグナルを意味し、ＳＨはＳｒｃ相同ドメインを意味し、ＰＴＫはタンパク質−チロシンキナーゼドメインを意味し、ＨＡはＨＡ−エピトープタグを意味し、ＫＤはキナーゼ活性のないＫ２７５Ａ突然変異を意味する。図３３〜図３４Ｂは、表示した構築物をトランスフェクションし、３６時間培養して、抗ｐＴｙｒ抗体及び抗ＨＡ抗体若しくは抗Ｓｙｋ抗体（図３３）で、抗ＨＡ抗体及びＰＩ（図３５）若しくは抗Ｓｙｋ抗体及びＰＩ（図３６）で、又はＧＦＰ蛍光及びＰＩ（図３６）で二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。モック（Mock）は、ベクター単独でのトランスフェクションを示す。スケールバーは１０μｍを示す。表示した構築物をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞から得られた全細胞可溶化物（図３４Ａ）又は核可溶化物（図３４Ｂ）を、ウェスタンブロッティングに供し、抗ｐＴｙｒ抗体でプローブし、そして抗ＨＡ抗体、抗Ｓｙｋ抗体及び抗アクチン抗体で、並びに抗ＨＡ抗体及び抗ラミンＢ１抗体で順番に再プローブした。図３５〜図３７は、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ、Ｌｙｎ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｓｙｋ及びＮＬＳ−ＧＦＰの局在の定量的解析に関する。図３７は、核中のタンパク質発現（Ｎｕｃ）が細胞質中のタンパク質発現（Ｃｙｔｏ）よりも高い［Ｎｕｃ＞Ｃｙｔｏ］場合と、核中のタンパク質発現が細胞質中のタンパク質発現よりも低いか又は等しい［Ｎｕｃ≦Ｃｙｔｏ］場合とを示すグラフである。図３８Ａ〜図３８Ｃは、何もトランスフェクションしなかったＣＯＳ−１細胞、Ｌｙｎ−ＨＡ、又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションして３６時間培養したＣＯＳ−１細胞に関する。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析し、図３８Ａ〜図３８Ｃに示すヒストグラムとして結果を示す。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価した。図３９に示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数５１〜１０７）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意でない）。図４０Ａ及び図４０Ｂは、Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１又はＦｌａｇ−Ｇ９ａでトランスフェクションし、３６時間培養して抗Ｆｌａｇ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。スケールバーは１０μｍを示す。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は代表的な実験（細胞数６０〜１０９）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図４０Ｂに示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図４１及び図４２に示すグラフは、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ又はＬｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、２４時間培養して抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで、並びに抗ＨＡ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞に関する。図４１及び図４２では、２Ｄ−プロット解析を、核中の抗ｐＴｙｒ染色又は抗ＨＡ染色の平均蛍光強度（横軸）に対するＰＩ強度のＳ．Ｄ．値（縦軸）対で示す。「ｎ」は細胞数を示し、「ｒ」は回帰係数を示す。図４３は、「材料及び方法」で説明したように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、２４時間培養して抗ＨＡ抗体及びＰＩで二重に染色したＣＯＳ−１細胞と、そして、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし、ＰＩと抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体又は抗ＨＰ１α抗体とで二重に染色した細胞とに関する。スケールバーは１０μｍを示す。ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした、又はトランスフェクションしない様々な種類の細胞を、２４時間培養し、抗ＨＡ抗体及びＰＩで染色した。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は代表的な実験（細胞数６３〜１４５）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図４４に示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図４５Ａ及び図４５Ｂは、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションし３６時間培養した、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現しているＣＯＳ−１細胞に関する。細胞を、ＧＦＰ蛍光及び抗ＨＡ抗体で可視化した。スケールバーは１０μｍを示す。クロマチン凝縮のレベルを、各細胞に関する１ピクセル当たりの平均蛍光強度の平均値が２１００〜２７００の範囲にある条件下での１ピクセル当たりのヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰ蛍光強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は代表的な実験（細胞数１１２）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図４５Ｂに示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＧＦＰ蛍光強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３４】
ＳＹＦ（ｃ−Ｓｒｃ−／− ｃ−Ｙｅｓ−／− Ｆｙｎ−／−）細胞においてＳＦＫの導入により誘発されるクロマチン構造変化。図４６は、何によっても処理せず、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理し、抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで二重に染色したＳＹＦ細胞に関する。染色の蛍光画像を図４６に示す。正方形の領域の拡大画像を右に示す。スケールバーは１０μｍを示す。図４７Ａ及び図４７Ｂは、何によっても処理せず、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理した、野生型Ｌｙｎ（Ｌｙｎ−ｗｔ）を安定的に発現しているＳＹＦ細胞（図４７Ａ）と、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡをトランスフェクションし３６時間培養したＳＹＦ細胞（図４７Ｂ）とに関する。細胞を、抗Ｌｙｎ抗体又は抗ＨＡ抗体とＰＩとで二重に染色した。スケールバーは１０μｍを示す。図４８Ａ及び図４８Ｂは、何によっても処理せず、又は３ｍＭのＮａ３ＶＯ４で３時間処理した、野生型ｃ−Ｓｒｃ（ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ）を安定的に発現しているＳＹＦ細胞（図４８Ａ）と、３６時間培養した、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞（図４８Ｂ）とに関する。細胞を、抗Ｓｒｃ抗体又は抗ＨＡ抗体とＰＩとで二重に染色した。スケールバーは１０μｍを示す。図４９は、表示した構築物をトランスフェクションし上述のようにＮａ３ＶＯ４で処理したＳＹＦ細胞に関する。クロマチン凝縮のレベルを、１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は３回の独立の実験における代表的な実験（細胞数４２〜９８）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。プロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図５０Ａ〜図５０Ｃは、３６時間培養した、何もトランスフェクションしていない、Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした、又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞に関する。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーにより分析し、図５０Ａ〜図５０Ｃに示すヒストグラムとして結果を示す。図５１Ａ及び５１Ｂは、Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞を、３６時間培養して抗Ｆｌａｇ抗体又は抗ＨＡ抗体とＰＩとで二重に染色したものに関する。図５１Ａでは、ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を上部に示す。スケールバーは１０μｍを示す。クロマチン凝縮のレベルを１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値を使用して評価し、バー及び値は代表的な実験（細胞数７６〜９１）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図５１Ｂに示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定により算出した有意差を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図５２は、低血清条件（０．０５％ＦＢＳ）下で２４時間飢餓状態にした、及び血清（５％ＦＢＳ）で表示した時間刺激したＳＹＦ細胞に関する。図５２に示すプロットは、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ強度の各Ｓ．Ｄ．値を表し、バー及び値は代表的な実験（細胞数１０４〜１１３）に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。スチューデントｔ検定により算出されるように、飢餓と刺激との間の差異は有意でなかった（ＮＳ）。図５３は、播種して５％ＦＢＳ中で１日間培養し、５％又は０．５％ＦＢＳ中で表示した期間増殖させた、ＣＯＳ−１細胞及びＳＹＦ細胞に関する。図示したように、細胞数を計測及びプロットし、値は三連の測定に基づく平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【００３５】
クロマチン構造変化を評価する定量的な方法。間期の間のクロマチン構造（texture）の変化は、クロマチン構造変化を反映する。クロマチン構造の状態を明確にするために、ＤＮＡ凝縮のレベルを評価する定量的な方法が使用され得る。例えば、各細胞に関する１ピクセル当たりのＰＩ蛍光強度の平均値及びＳ．Ｄ．値は、「材料及び方法」で説明したように、コンピュータで計算され得る。図１Ａ〜図１Ｃ、図２Ａ〜図２Ｃ、図３Ａ〜図３Ｃ、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ａ〜図５Ｃ及び図６Ａ〜図６Ｃは、各々コンピュータで計算したＰＩ蛍光強度の平均値及びＳＤ値に対応して、蛍光画像、ヒストグラム及び２Ｄ等角投影法による強度プロファイルをそれぞれ示す。全ピクセルを、以下の３群に分類した：（ｉ）低凝縮度のＤＮＡ領域（１ピクセル当たりのＰＩ強度＜２２００）、（ｉｉ）中程度の凝縮度のＤＮＡ領域（２２００≦１ピクセル当たりのＰＩ強度≦３２００）、（ｉｉｉ）高凝縮度のＤＮＡ領域（１ピクセル当たりのＰＩ強度＞３２００）。興味深いことに、ＰＩ染色のヒストグラム及び２Ｄ等角投影法による強度プロファイルにより、図１Ａ〜図１Ｃ及び図６Ａ〜図６Ｃに示すように、Ｓ．Ｄ．値の増大が、低凝縮度及び高凝縮度のＤＮＡのレベルの増大と高度に相関することが明らかになった。
【００３６】
初期の研究では、ＤＮＡに関する植物細胞のフォイルゲン染色により、凝縮したクロマチンはＧ１期では減少し、Ｓ期では迅速に増大し、Ｇ２期及び次のＧ１期では減少することが示された（非特許文献４７）。ピクセルイメージング法がＤＮＡ凝縮の細胞周期依存性変化を検出するのに十分高感度であるかどうかを試験するために、本発明者らは、そのほとんどがＧ１期に入る非同期化した細胞と、Ｓ期及びＧ２期が豊富な細胞集団とを調製した。非同期化した細胞と、Ｓ期が豊富な細胞集団と、Ｇ２期が豊富な細胞集団とに関するＤＮＡ含有量のヒストグラムを、それぞれ図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示す。ＤＮＡ含有量のヒストグラムにより、各細胞周期の濃縮化が確認された。Ｓ．Ｄ．値を利用するＤＮＡ凝縮の定量では、Ｓ期の間のＤＮＡ凝縮のレベルの少しではあるが有意な増大を示した（図８）。Ｍ期の進行中にＤＮＡ凝縮を分析する際にピクセルイメージング法が有用であるかどうかをさらに試験するために、Ｍ期が豊富な細胞を調製し、ＤＮＡに関して抗リン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０抗体及びＰＩで染色した。ヒストンＨ３Ｓ１０のリン酸化が前期の間に開始し中期の間にピークレベルが検出される（非特許文献２３）ことを考慮すると、前中期は、核膜破壊と高レベルのリン酸化ヒストンＨ３Ｓ１０とにより前期と区別された。図９に示す画像と、図１０に示す対応するヒストグラムとに示されるように、Ｓ．Ｄ．値を利用するＤＮＡ凝縮の定量により、有糸分裂の進行時における前期から前中期までのＤＮＡ凝縮のレベルの連続的な増大が示された。その後、ピクセルイメージング法がアポトーシス性ＤＮＡ凝縮を認識することができるかどうかを試験するために、細胞を、１ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処理した。ＤＮＡ含有量のヒストグラムにより、図１１Ａ〜図１１Ｄに示すように、アポトーシス性サブＧ１細胞の用量依存的な誘発が確認された。Ｓ．Ｄ．値を利用するＤＮＡ凝縮の定量は、図１２に示すように、ＤＮＡ凝縮のレベルがアポトーシスの程度に対応することを示した。これらの結果は、個々の変動の存在にも関わらず、Ｓ．Ｄ．値の平均が細胞周期におけるＤＮＡ凝縮のレベルとアポトーシス誘発とを忠実に反映することを示唆する。さらに、ＤＮＡ染色及びヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰの蛍光画像は、図１３に示すように、完全に重複し、ＤＮＡとヒストンとの間の相互作用が保持されることを示した。総合すると、これらの結果は、クロマチン凝縮のレベルを１ピクセル当たりのＰＩ強度のＳ．Ｄ．値で定量することができることを示唆する。したがって、ピクセルイメージングは、本明細書に記載のように、クロマチン構造変化の定量的解析のための有用なツールであり得る。
【００３７】
成長因子刺激はクロマチン構造変化を誘発する。成長因子刺激がクロマチン凝縮の状態を変化させるかどうかを検証するために、細胞を、成長因子シグナル伝達の休止のために低血清条件下で２４時間飢餓状態にし（飢餓）、血清で５時間刺激した（刺激）。図１４Ａ及び図１４Ｂは、飢餓及び刺激の両方の条件に関するＰＩでのＤＮＡ染色の画像を示す。ＰＩでのＤＮＡ染色で、血清刺激がクロマチン凝縮レベルの変化を誘発することが示された。Ｓ．Ｄ．値を利用するクロマチン凝縮レベルの定量により、血清刺激が低凝縮度及び高凝縮度の両方のクロマチン領域を迅速に増大させることが明らかになり、増大したレベルは、図１５に示すように、３０分までにプラトーに到達し、少なくとも５時間持続し、刺激の２４時間後に基礎レベルに戻った。興味深いことに、血清で刺激したクロマチンの低凝縮及び高凝縮は、図１６に示すように、ＳＦＫ阻害剤であるＰＰ２での処理により有意に抑止された。図１７Ａ及び図１７Ｂは、飢餓時及び刺激時のＤＮＡ含有量のヒストグラムを示す。ＤＮＡ含有量のヒストグラムは、サブＧ１期、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２期における細胞数の増大を示さず、飢餓及び刺激の処理がアポトーシス、又はＳ期への移行を誘発しないことが確認された。図１８Ａは、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体に関するＰＩ染色を示し、図１８Ｂは、抗ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体の対応する蛍光強度プロットを示す。図１９Ａは、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体に関するＰＩ染色を示し、図１９Ｂは、抗ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１抗体の対応する蛍光強度プロットを示す。図２０Ａは、抗ＨＰ１α抗体に関するＰＩ染色を示し、図２０Ｂは、抗ＨＰ１α抗体の対応する蛍光強度プロットを示す。リジン４がトリメチル化されたヒストンＨ３（ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３）（非特許文献４８）と、スレオニン６９及びスレオニン７１がリン酸化された転写的に活性なＡＴＦ−２（ＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１）（非特許文献４９、５０）とは、低凝縮度のクロマチンの領域に主に局在したが、一方、ヘテロクロマチンタンパク質−１α（ＨＰ１α）は高凝縮度のクロマチンの領域にその多くが局在した。重要なことには、抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体での免疫染色により、血清刺激が細胞質に加えて核内でのＳＦＫの活性化を誘発することが示された。図２１Ｂに示すように、血清で活性化したＳＦＫは、高凝縮度のクロマチンの領域よりも、低凝縮度のクロマチンの領域において、より頻繁に検出された。これらの結果は、成長因子刺激が、ＳＦＫの活性化を通じてクロマチン構造変化を誘発し、中程度の凝縮度のクロマチンの領域の減少の代わりに、低凝縮度のユークロマチンと高凝縮度のヘテロクロマチンとの両方の領域を増大させることを示唆する。
【００３８】
ＳＦＫによるチロシンリン酸化は、クロマチン構造変化に関与する。対照細胞（なし（None）、無処理）のＳ．Ｄ．値は、クロマチン凝縮の基礎レベルが個々の細胞の間で変動することを反映して、４５０から７００まで変動した（図１５及び図１６）。ＳＦＫがチロシンリン酸化のレベルを調節することにより基礎クロマチン凝縮に関して或る役割を果たすかどうかを試験するために、ＰＰ２又はワートマニン（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤）で処理したＣＯＳ−１細胞を、チロシンリン酸化に関しては抗リン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）抗体で、及びＤＮＡに関してはＰＩで二重に染色した。図２２及び図２６に示すように、ＰＰ２処理によりチロシンリン酸化及びクロマチン凝縮の基礎レベルが有意に低減することが見出された。対照的に、ワートマニン処理は、図２２及び図２６に示すように、チロシンリン酸化のレベルを増大させたとしても、クロマチン凝縮の基礎レベルを変化させなかった。チロシンリン酸化のこの増大は、ワートマニンがチロシンリン酸化を増強するという報告（非特許文献５１）を連想させる。これらの結果は、クロマチン凝縮の基礎レベルがＳＦＫにより媒介されるチロシンリン酸化と関係することを示唆する。
【００３９】
免疫蛍光染色によりチロシンリン酸化を明瞭に可視化するために、Ｎａ３ＶＯ４（タンパク質−チロシンホスファターゼの阻害剤、（非特許文献５２）を使用して、チロシンホスファターゼの活性を阻害することによりチロシンリン酸化を増大させた。Ｎａ３ＶＯ４で処理したＣＯＳ−１細胞は抗ｐＴｙｒ抗体及びＰＩで染色した。Ｎａ３ＶＯ４での処理は、図２３に示すように、細胞全体のチロシンリン酸化を大きく増大させたが、これはＮａ３ＶＯ４がチロシン脱リン酸化の阻害を介して異なる細胞内コンパートメントにおける様々なチロシンキナーゼを活性化し得るためである。興味深いことに、Ｎａ３ＶＯ４での処理は、図２３及び図２６に示すように、低凝縮度及び高凝縮度のクロマチンの状態の劇的な変化を誘発した。同様の結果が、図５４に示すように、ＨｅＬａ細胞において見られた。ＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化のクロマチン構造変化に対する寄与をさらに検証するために、細胞を、ＰＰ２の存在下又は非存在下でＮａ３ＶＯ４により処理した。実際に、ＰＰ２処理は、図２３及び図２６に示すように、クロマチンの低凝縮及び高凝縮の減少と併せて、チロシンリン酸化を低減させた。
【００４０】
ＳＦＫ基質に特異的なものを含むタンパク質−チロシンホスファターゼは核及び細胞質中に存在する（非特許文献１１、１２）ので、Ｎａ３ＶＯ４によるチロシンホスファターゼの阻害が核内でのＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化を増大させることが推測され得る。核のリン酸化を実証するために、細胞質のチロシン−リン酸化タンパク質のほとんどを、固定前に０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で４℃にて３分間ｉｎ ｓｉｔｕで抽出した。結果として、Ｎａ３ＶＯ４により誘発されるチロシンリン酸化の増大は核内で明瞭に目視でき、核のチロシンリン酸化の増大は、図２４及び図２５に示すように、ＰＰ２処理により有意に抑止された。ＤＮＡ含有量のヒストグラムは、サブＧ１期、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２期の細胞数の増加を示さず、図２６に示すように、ＤＭＳＯ、ＰＰ２、Ｎａ３ＶＯ４又はＮａ３ＶＯ４＋ＰＰ２での処理が、アポトーシス、又はＳ期への移行を誘発しないことが確認された。図２４及び図２８に示すように、Ｎａ３ＶＯ４処理した細胞では、チロシン−リン酸化タンパク質並びにヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１が主に低凝縮度のクロマチンの領域に局在したが、一方、ＨＰ１αはその多くが高凝縮度のクロマチンの領域に局在した。これらの結果は、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化がクロマチン構造変化を誘発するという興味深い可能性を提起する。
【００４１】
核のＳＦＫは、チロシンリン酸化を媒介する。以前の研究により、ＳＦＫには核に存在するものがあることが示唆される（非特許文献１３、１６、５３）。ＳＦＫの核局在をさらに実証するために、ＣＯＳ−１細胞から調製した高度に精製した核を、ウェスタンブロッティングにより分析した。実際に、図２９に示すように、精製核内で、ごく少量の４種類のＳＦＫメンバーが（ｃ−Ｓｒｃが６０ｋＤａで、ｃ−Ｙｅｓが６２ｋＤａで、Ｆｙｎが５９ｋＤａで、並びにＬｙｎの２種類のオルタナティブスプライシングアイソフォームが５３ｋＤａ及び５６ｋＤａで）見出された。核ラミナタンパク質であるラミンＢ１の量は、全細胞可溶化物と核可溶化物との間で同程度であった。細胞膜タンパク質デスモグレインも、ゴルジ酵素β−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）も、サイトゾルタンパク質細胞質ホスホリパーゼＡ２α（ｃＰＬＡ２α）も、図２９に示すように、核の可溶化物中に検出されなかった。図３０に示すように、ノマルスキー画像により、精製核中に他のオルガネラ膜の混入がほとんどないことが明白に示された。図５５に示すように、同様の結果がＨｅＬａ細胞において見られた。これらの結果は、ＳＦＫが、小量ではあるが、核中に確かに存在することを示す。
【００４２】
核ＳＦＫのキナーゼ活性を試験するために、精製核を１０μＭのＰＰ２の存在下又は非存在下で５μＭ又は１０μＭのＡＴＰと共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションし、チロシンリン酸化に関しては抗ｐＴｙｒ抗体で、ＤＮＡに関してはＰＩで染色した。図３０及び図３１に示すように、ＡＴＰとのインキュベーションは核のチロシンリン酸化のレベルを増大し、増大はＰＰ２により有意に抑止された。加えて、精製核内のＳＦＫの量は、成長因子刺激と関係なく不変であった（データは示していない）。これらの結果は、ＳＦＫが核のチロシンリン酸化に寄与することを示唆し、核ＳＦＫのキナーゼ活性が核の構造（architecture）において或る役割を果たすことを示す（implicating）。
【００４３】
核へのＳＦＫの導入が、クロマチン構造変化を引き起こす。クロマチン凝縮における核のＳＦＫの関与を実証するために、図３２に示すように、核局在シグナル（ＮＬＳ）と共にタグを付した複数の突然変異体を構築し、これらの構築物をＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションした。図３３及び図３５に示すように、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ（キナーゼ活性がある）、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ（キナーゼ活性がある）、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ（キナーゼ活性がない）及びＮＬＳ−Ｓｙｋ（非関連キナーゼ）が、全て核中に蓄積した。抗ｐＴｙｒ抗体での免疫蛍光染色により、図３３に示すように、核中のチロシンリン酸化のレベルの増大が、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ及びＮＬＳ−Ｓｙｋを発現している細胞の間で同程度であることが示され、抗ｐＴｙｒ抗体でのウェスタンブロッティングにより、図３４Ａ及び図３４Ｂに示すように、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションした細胞から調製した精製核中でのチロシン−リン酸化タンパク質の出現が確認された。Ｓ期における細胞集団のほんのわずかな増大にも関わらず、図３５及び図３６、矢頭（arrowheads）並びに図３８Ａ〜図３８Ｃ及び図３９に示すように、クロマチンの低凝縮及び高凝縮が、Ｎａ３ＶＯ４の非存在下でさえも、ＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡ及びＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡにより著しく誘発されたことに言及することは興味があることである。他のＳＦＫのメンバー、ＮＬＳ−Ｙｅｓ−ＨＡ（キナーゼ−活性）及びＮＬＳ−Ｆｙｎ−ＨＡ（キナーゼ−活性）は、図５６Ａ及び図５６Ｂに示すように、クロマチンの低凝縮及び高凝縮を同様に誘発した。しかし、図３５、図３６及び図３９に示すＮＬＳ−Ｓｙｋと、図５６Ａ及び図５６Ｂに示すＳｙｋ−ｗｔとは、クロマチンの低凝縮及び高凝縮を有意に誘発しなかったが、これはおそらく、ＳｙｋとＳＦＫとの触媒領域における配列類似性の低さ（４０％〜４５％にすぎない）が、異なる基質特異性を引き起こす（非特許文献５４）ためである。ＮＬＳ−ＧＦＰ等の無関連の（irrelevant）タンパク質の核内蓄積は、どういうわけかクロマチンの低凝縮及び高凝縮をもたらし得るので、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡは、そのキナーゼ活性が非常に弱いにも関わらず、図３４Ａ及び図３４Ｂに示すように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡの良好な対照であり得る。さらに本発明者らは、ヘテロクロマチン形成（非特許文献３２）及びユークロマチン領域における転写抑制（非特許文献５５）に関与するヒストンＨ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼであるＦｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びＦｌａｇ−Ｇ９ａを使用して、補足的な対照実験を行った。クロマチン凝縮は、図４０Ａ及び図４０Ｂに示すように、Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１及びＦｌａｇ−Ｇ９ａにより穏やかに誘発された。クロマチン凝縮のレベルが、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡによるものよりずっと低いことに留意されたい（図４０Ａ及び図４０Ｂを図３９と比較されたい）。
【００４４】
核のチロシンリン酸化の強度と個々の核中のＰＩ強度のＳ．Ｄ．値との間の相関を検証するために、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞において、２Ｄ−プロット解析を行った。図４１は、核のｐＴｙｒシグナルのレベルがＳ．Ｄ．値と正の相関を有することを示し、より高レベルの核のチロシンリン酸化が、より強力なクロマチンの低凝縮及び高凝縮をもたらすことを示唆する。一方で、キナーゼ活性があるＬｙｎ−ＨＡは、図３７に示すようにそのごく一部が核中に局在するが、図３９に示すように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡよりも低レベルのクロマチンの低凝縮及び高凝縮を誘発した。ＰＩ強度のＳ．Ｄ．値の相関の２Ｄ−プロット解析を、Ｌｙｎ−ＨＡの核内蓄積のレベル、及びＬｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞における全細胞ｐＴｙｒシグナルと比較した核ｐＴｙｒシグナルのレベルに対して行い、図４２及び図５７に示すように、Ｓ．Ｄ．値が核のＬｙｎ−ＨＡのタンパク質レベル、及び核のチロシンリン酸化のレベルの両方と正の相関を有することを見出した。核内に移行しないＬｙｎ突然変異体を構築することを試みるために、膜貫通ドメインと分泌タンパク質に関するシグナル配列とを含有するＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡキメラを生成した。ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡは約９２ｋＤａのダブレットであり細胞膜に主に局在したが、実際にはＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡの一部が核内に検出された（図６１、矢印）。しかし、Ｌｙｎ−ＨＡと同様に、２Ｄ−プロット解析により、図５９Ａに示すように、核のチロシンリン酸化のレベルと、ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡを発現しているＣＯＳ−１細胞におけるＳ．Ｄ．値との間の相関が示された。換言すれば、細胞質中のＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡの高い発現では、クロマチンの低凝縮及び高凝縮の誘発を説明することができなかった。加えて、受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ３の一部が切断されることなく核中に局在する（非特許文献５６）ことを考慮すると、ＣＤ２５−Ｌｙｎ−ＨＡの核内移行を回避することは困難であり得る。さらに、２Ｄ−プロット解析により、図６２、図６３及び図３９に示すように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡ及びＮＬＳ−ＧＦＰのタンパク質レベルと、Ｓ．Ｄ．値との間に相関がないことが示された。
【００４５】
図４３、図１９Ａ、図１９Ｂ及び図２８に示すように、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡ並びにヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＡＴＦ−２ ｐＴ６９／７１は低凝縮度のクロマチンの領域に主に局在したが、一方、ＨＰ１αはその多くが高凝縮度のクロマチンの領域に局在した。重要なことには、抗Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］抗体での免疫染色により、図４３並びに図２１Ａ及び図２１Ｂに示すように、活性化したＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡはその多くが低凝縮度のクロマチンの領域に局在することが示された。さらに、図４４に示すように、ＳＦＫに媒介されるクロマチン構造変化の結果は、サル線維芽細胞ＣＯＳ−１細胞由来のものと同様に、ヒト上皮ＨｅＬａ細胞、ヒト乳房ＭＣＦ−７細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒト大腸ＨＣＴ１１６細胞及びヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３細胞から得られた。これらの結果は、ＳＦＫにより媒介される核のチロシンリン酸化がクロマチン構造変化の原因となることを示唆する。
【００４６】
加えて、図１３に示すように、ＤＮＡ染色及びヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰの間の蛍光画像の完全な重複のために、さらなる調査を行い、各々の核に関する１ピクセル当たりのＧＦＰ蛍光強度のＳ．Ｄ．値を使用してクロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルが定量されるかどうかを判定した。図４５Ｂに示すように、ＰＩ蛍光のＳ．Ｄ．値と同様に、ＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡはＧＦＰ蛍光強度のレベルを大きく増大させ、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰ蛍光のＳ．Ｄ．値、及びＰＩ蛍光のＳ．Ｄ．値を使用してクロマチンの低凝縮及び高凝縮が定量され得ることを示した。
【００４７】
ＳＦＫは、クロマチン構造変化のために必要である。クロマチン凝縮のための内在性ＳＦＫの必要性を検証するために、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓ及びＦｙｎの発現が遺伝的に欠損しておりＬｙｎを検出可能なレベルで発現しない（非特許文献３７）マウス胚線維芽細胞ＳＹＦ細胞を使用した。ＳＹＦ細胞のＮａ３ＶＯ４処理により、チロシンリン酸化がＣＯＳ−１細胞のチロシンリン酸化レベルと同レベルに増大したが（図４６を図２３と比較されたい）、Ｎａ３ＶＯ４で処理したＳＹＦ細胞におけるクロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルは、Ｎａ３ＶＯ４で処理したＣＯＳ−１細胞におけるクロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルよりもずっと低かった（図４９を図２６と比較されたい）。これらの結果は、ＳＦＫにより主に媒介されるチロシンリン酸化がクロマチン構造変化に寄与することを示唆する。
【００４８】
次に、野生型Ｌｙｎを発現しているＳＹＦ細胞（ＳＹＦ／Ｌｙｎ−ｗｔ細胞）又は野生型ｃ−Ｓｒｃを発現しているＳＹＦ細胞（ＳＹＦ／ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ細胞）のアドバック版（add-back version）を確立した。図４７Ａ及び図４７Ｂに示すように、Ｌｙｎのごく一部の核局在が抗Ｌｙｎ免疫蛍光により検出されたＳＹＦ／Ｌｙｎ−ｗｔ細胞は、クロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルのわずかな増大を示し、図４７Ａ、図４７Ｂ及び図４９に示すように、Ｎａ３ＶＯ４でのＳＹＦ／Ｌｙｎ−ｗｔ細胞の処理は、クロマチンの低凝縮及び高凝縮を増大させることができた。加えて、キナーゼ活性があるＬｙｎ−ＨＡのＳＹＦ細胞へのトランスフェクションは、クロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルのごくわずかな増大を誘発したが、これはおそらく核中のそのわずかな発現のためである。Ｎａ３ＶＯ４で処理しなくても、キナーゼ活性があるＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞は、図４７Ａ、図４７Ｂ及び図４９に示すように、クロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルの増大を示したが、キナーゼ不活性ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡで該レベルの増大は示されなかった。とはいえ、そのレベルはＣＯＳ−１細胞におけるレベルと比較してＳＹＦ細胞では穏やかであった（図４９を図３９と比較されたい）。同様に、クロマチンの低凝縮及び高凝縮の増大は、Ｎａ３ＶＯ４で処理したＳＹＦ／ｃ−Ｓｒｃ−ｗｔ細胞において、及びＮＬＳ−Ｓｒｃ−ＨＡをトランスフェクションしたＳＹＦ細胞において見られた（図４８Ａ及び図４９）。ＤＮＡ含有量のヒストグラムは、Ｌｙｎ−ＨＡ又はＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡの発現がＳＹＦ細胞の細胞周期に影響を及ぼさないことを示した（図５０Ａ〜図５０Ｃ）。Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１はその多くがヘテロクロマチンの領域に局在したが、クロマチン凝縮を穏やかに誘発しただけであった（図５１Ａ、図５１Ｂ及び図５２）。Ｆｌａｇ−Ｓｕｖ３９ｈ１により誘発されるクロマチン凝縮のレベルは、大部分がユークロマチンの領域に局在するＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡにより誘発されるクロマチン凝縮のレベルよりも低かった。これらの結果は、核内におけるＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化が、ユークロマチン化及び付随するヘテロクロマチン化を通じて、クロマチンの低凝縮及び高凝縮に寄与し得ることを示唆する。
【００４９】
さらに、血清成長因子でのＳＹＦ細胞の刺激がクロマチンの低凝縮及び高凝縮を誘発するかどうかを試験するために、ＳＹＦ細胞を低血清条件下で２４時間飢餓状態にし（飢餓）、５％ＦＢＳで３０分間、１時間及び５時間刺激した（刺激）。図５２は、血清刺激がＳＹＦ細胞においていかなるクロマチン構造変化も誘発しなかったことを示す。ＳＹＦ細胞及びＣＯＳ−１細胞はその両方がＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するが、それらの間で細胞増殖を比較した。興味深いことに、図５３に示すように、ＳＹＦ細胞は細胞増殖に関して血清成長因子への応答性が乏しいので、ＳＹＦ細胞はＣＯＳ−１細胞よりもずっと緩やかな細胞増殖速度を示した。図２９に示すように（非特許文献５７）、ＣＯＳ−１細胞がＳＦＫの４種類のメンバー、すなわちｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓ、Ｆｙｎ及びＬｙｎを同時発現するという知見と総合すると、これらの結果は、細胞増殖がＳＦＫのメンバーの発現の欠如により大いに影響されることを示唆する。
【００５０】
動的な核の構造変化は、転写、末端細胞分化、老化、腫瘍形成及び細胞周期の間に、頻繁に観察されている（非特許文献２１、５８、５９）。本明細書に記載のように、クロマチン凝縮のレベルを判定及び実証（and demonstrate）する定量的な方法を使用して、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化が、ユークロマチンの低凝縮及び付随するヘテロクロマチンの高凝縮の、成長因子刺激による誘発に必要であることを実証した。本明細書に記載した知見に基づき、ＳＦＫと、成長因子刺激によるユークロマチン化及びヘテロクロマチン化との関連性が存在すると結論することができる。
【００５１】
ピクセルイメージング法により、有糸分裂の進行を含む、細胞周期の間に、またアポトーシス誘発中に、クロマチン凝縮のレベルを定量することが可能である（図１Ａ〜図１Ｃ及び図６Ａ〜図６Ｃ）。この方法を使用すると、成長因子刺激によるクロマチン凝縮の変化（図１５及び図１６）を検出することができ、それはクロマチン凝縮の変化と、Ｇ０期からＧ１期までの細胞周期遷移との間の相関を示唆する。興味深いことに、成長因子に誘発されるクロマチン構造変化は、ＳＦＫのチロシンキナーゼ−活性により、その多くが媒介される（図１４Ａ、図１４Ｂ及び図５２）。核内で、キナーゼ活性があるＳＦＫはユークロマチンの低凝縮度の領域に大部分が局在するが、一方、キナーゼ活性があるＳＦＫのごく一部がヘテロクロマチンの高凝縮度の領域に局在する（図２１Ａ、図２１Ｂ及び図４３）。しかし、クロマチン構造の変化は、ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＡＴＦ−２ｐＴ６９／７１の発現レベルにほとんど影響を有さず（データは示していない）、ＳＦＫにより媒介されるクロマチン構造変化が転写活性を直接的に増大させるようには見えないことを示唆する。むしろ、核中のキナーゼ活性があるＳＦＫは、転写因子が遺伝子に接近することを可能にする「開いたクロマチン（open chromatin）」の形成と、領域に局在するＳＦＫは、付随する「閉じたクロマチン（closed chromatin）」の発達とに主に関与し得る。逆に、Ｓｕｖ３９ｈ１はヘテロクロマチン形成に関与し、ヘテロクロマチンの領域に大部分が局在し（非特許文献３２）、Ｓｕｖ３９ｈ１の過剰発現は穏やかなクロマチン凝縮を誘発する（図４０Ａ、図４０Ｂ、図５１Ａ及び図５１Ｂ）。Ｓｕｖ３９ｈ１によるクロマチン凝縮のレベルは核ＳＦＫによるものよりも低い（図４０Ａ及び図３９）ので、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化は、クロマチンの構造（architecture）において動的な役割を果たす。推測するに、成長因子刺激は、ＳＦＫに媒介されるチロシンリン酸化を介して、クロマチンの低凝縮の誘発だけでなく高凝縮の誘発に対してもシグナルを伝達する。
【００５２】
キナーゼ活性があるＮＬＳ−ＳＦＫでのＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションは、強力なクロマチン凝縮、すなわちユークロマチン化及びヘテロクロマチン化の両方の誘発を誘発し、高レベルの核のチロシンリン酸化はクロマチンのより強力な低凝縮及び高凝縮をもたらす（図４１及び図５８）。部分的に核中に局在する、キナーゼ活性があるＬｙｎ−ＨＡでのＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションは弱いクロマチン凝縮を誘発する（図３９）が、核中のＬｙｎ−ＨＡのタンパク質レベル及び核のチロシンリン酸化レベルの両方が、クロマチンの低凝縮及び高凝縮のレベルと正の相関を有する（図４２及び図５７）。ＮＬＳ−ＳｙｋではなくＮＬＳ−ＧＦＰ及びＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡの場合には、タンパク質の核発現は、どういうわけかクロマチン凝縮をもたらし得る（図３９。図６２及び図６３も参照されたい）。それにも関わらず、図３９に示すように、クロマチン凝縮に及ぼすＮＬＳ−Ｌｙｎ−ＨＡの効果は、ＮＬＳ−Ｌｙｎ（ＫＤ）−ＨＡよりも有意に強い。したがって、本発明者らの結果は、ＳＦＫによる核のチロシンリン酸化がクロマチンの低凝縮及び高凝縮に重要な役割を果たすことを示唆する。
【００５３】
ＳＦＫメンバーは、非受容体型チロシンキナーゼの中で最大のサブファミリーを形成し（非特許文献６０）、そして４種類のＳＦＫメンバー、ｃ−Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ及びｃ−Ｙｅｓは、上皮細胞及び線維芽細胞において広範に同時発現される（図２９及び図５５、（非特許文献５７））。単一の細胞における各ＳＦＫメンバーの発現の多数の組合せが、チロシンリン酸化を介するシグナル伝達に関して、特異的且つ重複した機能を提供し得る。検出可能なＬｙｎを発現せずｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓ及びＦｙｎを欠くＳＹＦ細胞が血清成長因子刺激に対してクロマチンの低凝縮及び高凝縮を誘発することができない（図５２）ことを考慮すると、ＳＹＦ細胞の血清成長因子に対する増殖性応答の不良（図５３）が、クロマチンの低凝縮及び高凝縮を誘発することができないことと関係する可能性がある。
【００５４】
クロマチン凝縮の基礎レベルは、個々のＳＹＦ細胞及びＰＰ２で処理したＣＯＳ−１細胞において確かに変動し（図１５、図１６、図２６、図３９、図４０Ａ、図４９、図５１Ａ及び図５２）、クロマチン構造変化はＮａ３ＶＯ４で処理したＳＹＦ細胞において穏やかに誘発される（図４９）。これらの結果は、代替的な経路が存在する場合には、ＳＦＫ以外の幾つかのチロシンキナーゼを含み得ることを示唆する。Ｕ０１２６（ＭＥＫ１／２の阻害剤）での細胞の処理が、クロマチン凝縮の基礎レベルをわずかに減少させた（データは示していない）ことは、クロマチン凝縮におけるＭＥＫ／ＥＲＫ経路の限定的な関与を示す。最近の研究は、クロマチン構造の動的変化が、ヒートショック、浸透圧ストレス及びＡＴＰ枯渇により誘発されることを示した（非特許文献６１〜６３）。とはいえ、その様相は同一ではないようである。高浸透圧条件はチロシンリン酸化に効果を有さず、そしてＰＰ２での処理は高浸透圧ストレスで誘発されるクロマチン構造変化を抑止しなかった（データは示していない）。これらの結果は、クロマチン構造変化が広範な刺激に関連し得ることを示唆する。それにも関わらず、成長因子刺激により、ＳＦＫが、核内のチロシンリン酸化を介して、クロマチン構造変化において重要な役割を果たすことを重要視すべきである。
【００５５】
ヒトＤＮＡは、５１８種類のタンパク質キナーゼをコードし、４２８種類はセリン残基及びスレオニン残基をリン酸化することが既知である又は予測されており、９０種類はチロシンキナーゼファミリーに属する（非特許文献６４）。核は、セリン残基及び／又はスレオニン残基がリン酸化された多数のタンパク質を含有する。ヒストンのセリン／スレオニンのリン酸化は、有糸分裂の染色体凝縮、アポトーシス、配偶子形成及び遺伝子発現に関与し（非特許文献２２、２３、６５〜６７）、そしてセリン／スレオニンのリン酸化及び脱リン酸化の周期は、スプライシングスペックル（speckles）から転写部位へのスプライシング因子の動員に関与する（非特許文献６８）。出芽酵母における多くのセリン／スレオニンキナーゼは、それらの標的遺伝子を物理的に占有し、遺伝子発現に影響を及ぼす（非特許文献６９）。一方で、核局在と、チロシンキナーゼ及びホスファターゼの機能とを示す研究の数は限られている。例えば、核中に存在するｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、細胞増殖、ＤＮＡ損傷及びストレス応答において或る役割を果たし、そして核のＰＥＰ−ＰＴＰチロシンホスファターゼはＳＦＫ及びそれらの基質の脱リン酸化に関与する（非特許文献１０〜１２）。最近の研究により、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７がＳＦＫの核基質として認定されることが示された（非特許文献１８、１９）。しかし、現在のところ、ＳＦＫに媒介されるクロマチン構造変化におけるＳＦＫの核基質については、何も知られていない。
【００５６】
ＳＦＫは、分化、腫瘍形成、細胞周期及び転写において活性化される（非特許文献２、７０）。従前、クロマチン構造変化が、ヘテロクロマチンのきめの細かい（finely textured）外観から粗い外観までの変化を含めて、発癌性のｖ−Ｓｒｃ、及びＨ−Ｒａｓを発現している細胞株において観察された（非特許文献７１）。腫瘍の特定の種類が、クロマチンの構造（texture）の特徴的な変化、例えばヘテロクロマチンの粗凝集体、ヘテロクロマチンの非対称凝集体、ヘテロクロマチンの分散、及びヘテロクロマチン凝集体の損失、と関連する（非特許文献２１）。ヘテロクロマチン含有量並びにクロマチンの構造（texture）及び形状の変化は、より侵襲性の乳房腫瘍と密接に関連する（非特許文献７２）。ピクセルイメージング法は、様々な癌の種類及び臨床ステージにおけるクロマチンの構造（texture）の変化を定量的に分析する際に役立ち得る。
【００５７】
本結果に基づくと、クロマチン構造変化におけるＳＦＫに媒介される核のチロシンリン酸化の重要性は明らかである。
【００５８】
出願人は、本開示において引用した全ての文献の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメータが、或る範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値及び好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられる場合、範囲が別々に開示されるかどうかに関わらず、これは、任意の上限範囲限界又は好ましい値と、任意の下限範囲限界又は好ましい値との任意の対から成る全ての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。或る数値範囲が本明細書で言及される場合、他に記載がなければ、その範囲は、その端点（endpoints）と、その範囲内の全ての整数及び分数とを含むことが意図される。本発明の範囲を、或る範囲を規定する際に言及される具体的な値に限定することは意図されない。
【００５９】
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討と本明細書で開示された本発明の実施とから、当業者に明らかであろう。本明細書及び実施例は、特許請求の範囲とその均等範囲とにより示される本発明の真の範囲及び精神を有する例示的なものにすぎないとみなされることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるクロマチン構造を評価する方法であって、
１つ又は複数の細胞の試料を用意すること、
該１つ又は複数の細胞を核酸染色剤で処理すること、
該核酸染色剤で処理した細胞のうち１つ又は複数の細胞の核の画像（複数のピクセルを含む）をキャプチャすること、
該複数のピクセルの各ピクセルで染色強度を定量すること、
１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出すること、
該クロマチン構造を判定すること、ここで該ＳＤ値がクロマチン凝縮のレベルの指標である、
を含むクロマチン構造を評価する方法。
【請求項２】
該１つ又は複数の細胞が１つ又は複数の生細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該１つ又は複数の細胞が１つ又は複数の真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該１つ又は複数の細胞が１つ又は複数の哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の画像を或る期間にわたりキャプチャし、１ピクセル当たりの染色強度の該平均値及び該ＳＤ値を各画像に関して算出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該期間にわたるＳＤ値の変化が、該期間にわたる該クロマチン構造の変化と相関する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該核酸染色剤が蛍光染色剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該核酸染色剤がヨウ化プロピジウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸染色剤で処理する前に、該１つ又は複数の細胞をＲＮａｓｅで処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該画像を、共焦点顕微鏡を利用してキャプチャする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該１つ又は複数の細胞の試料が平切断切片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該画像を約５１２×５１２ピクセルの解像度でキャプチャする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該平均値及び該ＳＤ値を、各核の少なくとも２つのキャプチャした画像の平均から算出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該核の画像が約６０００ピクセル以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１ピクセル当たりの該平均染色強度に基づき、該クロマチン構造を、低凝縮度の、中程度の凝縮度の、又は高凝縮度のものと判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該核酸染色剤がヨウ化プロピジウムを含み、１ピクセル当たりの染色強度の該平均値が約２４００〜約３０００の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
被験体における病変を診断、予後診断又はモニタリングする方法であって、該被験体由来の１つ又は複数の病変細胞の試料における該クロマチン構造を請求項１に従って評価することを含み、ここで該ＳＤ値が疾患状態の指標である、病変を診断、予後診断又はモニタリングする方法。
【請求項１８】
該被験体由来の１つ又は複数の非病変細胞の試料における該クロマチン構造を請求項１に従って評価すること、及び該１つ又は複数の病変細胞の該算出したＳＤ値を、該１つ又は複数の非病変細胞の該算出したＳＤ値と比較することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該１つ又は複数の病変細胞の該算出したＳＤ値を、正常な組織から疾患状態までの進行曲線に沿う範囲である同じ種類の病変の予め算出したＳＤ値の範囲と比較することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該工程を、所定の時間の経過後に繰り返し、該病変が疾患状態に進行しているのか、又は疾患状態から退行しているのかを判定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該所定の時間の間の該病変の進行を、該病変を治療する方法の有効性を測定するために利用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
被験体における癌を診断、予後診断及び／又はモニタリングする方法であって、該被験体由来の１つ又は複数の癌性細胞の試料における該クロマチン構造を請求項１に従って評価することを含み、ここで該ＳＤ値が悪性疾患の指標である、癌を診断、予後診断及び／又はモニタリングする方法。
【請求項２３】
該被験体由来の１つ又は複数の非癌性細胞の試料における該クロマチン構造を請求項１に従って評価すること、及び該１つ又は複数の癌性細胞の該算出したＳＤ値を、該１つ又は複数の非癌性細胞の該算出したＳＤ値と比較することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該１つ又は複数の癌性細胞の該算出したＳＤ値を、正常な組織から悪性疾患までの進行曲線に沿う範囲である同じ種類の癌の予め算出したＳＤ値の範囲と比較することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
該工程を、所定の時間の経過後に繰り返し、該癌が悪性疾患に進行しているのか、又は悪性疾患から退行しているのかを判定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
１つ又は複数の細胞の該クロマチン構造を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
該１つ又は複数の細胞を該化合物と接触させること、
該１つ又は複数の細胞における該クロマチン構造を請求項１に従って評価すること、及び
該化合物と接触させた該１つ又は複数の細胞の該ＳＤ値を、１つ又は複数の対照細胞の該ＳＤ値と比較すること、
を含む、化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
該化合物が該１つ又は複数の細胞の有糸分裂の進行を刺激する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該化合物が該１つ又は複数の細胞におけるアポトーシスを誘発する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
該化合物が成長因子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を評価するシステムであって、
核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の、少なくとも１つの画像をキャプチャする光学機器と、
該画像の各ピクセルで染色強度を定量する分光計機器であって、該光学機器と光学的に接続されており、計算機器と動作可能に接続されている分光計機器と、
１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出する計算機器と、
該算出した平均値及びＳＤ値を表示する表示機器と、
を含む、評価するシステム。
【請求項３１】
該光学機器が共焦点顕微鏡を含む、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
該分光計機器がヨウ化プロピジウムにより放射される光を検出する、請求項３０に記載のシステム。
【請求項１】
細胞におけるクロマチン構造を評価する方法であって、
１つ又は複数の細胞の試料を用意すること、
該１つ又は複数の細胞を核酸染色剤で処理すること、
該核酸染色剤で処理した細胞のうち１つ又は複数の細胞の核の画像（複数のピクセルを含む）をキャプチャすること、
該複数のピクセルの各ピクセルで染色強度を定量すること、
１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出すること、
該クロマチン構造を判定すること、ここで該ＳＤ値がクロマチン凝縮のレベルの指標である、
を含むクロマチン構造を評価する方法。
【請求項２】
該１つ又は複数の細胞が１つ又は複数の生細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該１つ又は複数の細胞が１つ又は複数の真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該１つ又は複数の細胞が１つ又は複数の哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の画像を或る期間にわたりキャプチャし、１ピクセル当たりの染色強度の該平均値及び該ＳＤ値を各画像に関して算出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該期間にわたるＳＤ値の変化が、該期間にわたる該クロマチン構造の変化と相関する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該核酸染色剤が蛍光染色剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該核酸染色剤がヨウ化プロピジウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸染色剤で処理する前に、該１つ又は複数の細胞をＲＮａｓｅで処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該画像を、共焦点顕微鏡を利用してキャプチャする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該１つ又は複数の細胞の試料が平切断切片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該画像を約５１２×５１２ピクセルの解像度でキャプチャする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該平均値及び該ＳＤ値を、各核の少なくとも２つのキャプチャした画像の平均から算出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該核の画像が約６０００ピクセル以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１ピクセル当たりの該平均染色強度に基づき、該クロマチン構造を、低凝縮度の、中程度の凝縮度の、又は高凝縮度のものと判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該核酸染色剤がヨウ化プロピジウムを含み、１ピクセル当たりの染色強度の該平均値が約２４００〜約３０００の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
被験体における病変を診断、予後診断又はモニタリングする方法であって、該被験体由来の１つ又は複数の病変細胞の試料における該クロマチン構造を請求項１に従って評価することを含み、ここで該ＳＤ値が疾患状態の指標である、病変を診断、予後診断又はモニタリングする方法。
【請求項１８】
該被験体由来の１つ又は複数の非病変細胞の試料における該クロマチン構造を請求項１に従って評価すること、及び該１つ又は複数の病変細胞の該算出したＳＤ値を、該１つ又は複数の非病変細胞の該算出したＳＤ値と比較することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該１つ又は複数の病変細胞の該算出したＳＤ値を、正常な組織から疾患状態までの進行曲線に沿う範囲である同じ種類の病変の予め算出したＳＤ値の範囲と比較することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該工程を、所定の時間の経過後に繰り返し、該病変が疾患状態に進行しているのか、又は疾患状態から退行しているのかを判定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該所定の時間の間の該病変の進行を、該病変を治療する方法の有効性を測定するために利用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
被験体における癌を診断、予後診断及び／又はモニタリングする方法であって、該被験体由来の１つ又は複数の癌性細胞の試料における該クロマチン構造を請求項１に従って評価することを含み、ここで該ＳＤ値が悪性疾患の指標である、癌を診断、予後診断及び／又はモニタリングする方法。
【請求項２３】
該被験体由来の１つ又は複数の非癌性細胞の試料における該クロマチン構造を請求項１に従って評価すること、及び該１つ又は複数の癌性細胞の該算出したＳＤ値を、該１つ又は複数の非癌性細胞の該算出したＳＤ値と比較することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該１つ又は複数の癌性細胞の該算出したＳＤ値を、正常な組織から悪性疾患までの進行曲線に沿う範囲である同じ種類の癌の予め算出したＳＤ値の範囲と比較することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
該工程を、所定の時間の経過後に繰り返し、該癌が悪性疾患に進行しているのか、又は悪性疾患から退行しているのかを判定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
１つ又は複数の細胞の該クロマチン構造を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
該１つ又は複数の細胞を該化合物と接触させること、
該１つ又は複数の細胞における該クロマチン構造を請求項１に従って評価すること、及び
該化合物と接触させた該１つ又は複数の細胞の該ＳＤ値を、１つ又は複数の対照細胞の該ＳＤ値と比較すること、
を含む、化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
該化合物が該１つ又は複数の細胞の有糸分裂の進行を刺激する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該化合物が該１つ又は複数の細胞におけるアポトーシスを誘発する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
該化合物が成長因子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
１つ又は複数の細胞におけるクロマチン構造を評価するシステムであって、
核酸染色剤で処理した１つ又は複数の細胞の核の、少なくとも１つの画像をキャプチャする光学機器と、
該画像の各ピクセルで染色強度を定量する分光計機器であって、該光学機器と光学的に接続されており、計算機器と動作可能に接続されている分光計機器と、
１ピクセル当たりの染色強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）値を算出する計算機器と、
該算出した平均値及びＳＤ値を表示する表示機器と、
を含む、評価するシステム。
【請求項３１】
該光学機器が共焦点顕微鏡を含む、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
該分光計機器がヨウ化プロピジウムにより放射される光を検出する、請求項３０に記載のシステム。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２７Ｄ】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８Ａ】
【図３８Ｂ】
【図３８Ｃ】
【図３９】
【図４０Ａ】
【図４０Ｂ】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５Ａ】
【図４５Ｂ】
【図４６】
【図４７Ａ】
【図４７Ｂ】
【図４８Ａ】
【図４８Ｂ】
【図４９】
【図５０Ａ】
【図５０Ｂ】
【図５０Ｃ】
【図５１Ａ】
【図５１Ｂ】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６Ａ】
【図５６Ｂ】
【図５７】
【図５８】
【図５９Ａ】
【図５９Ｂ】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２７Ｄ】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８Ａ】
【図３８Ｂ】
【図３８Ｃ】
【図３９】
【図４０Ａ】
【図４０Ｂ】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５Ａ】
【図４５Ｂ】
【図４６】
【図４７Ａ】
【図４７Ｂ】
【図４８Ａ】
【図４８Ｂ】
【図４９】
【図５０Ａ】
【図５０Ｂ】
【図５０Ｃ】
【図５１Ａ】
【図５１Ｂ】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６Ａ】
【図５６Ｂ】
【図５７】
【図５８】
【図５９Ａ】
【図５９Ｂ】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【公開番号】特開２０１０−１９３８８３（Ｐ２０１０−１９３８８３Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−３２９１４（Ｐ２０１０−３２９１４）
【出願日】平成２２年２月１７日（２０１０．２．１７）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３２９１４（Ｐ２０１０−３２９１４）
【出願日】平成２２年２月１７日（２０１０．２．１７）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]