抗炎症剤及び抗酸化剤
【課題】長時間に亘り効果が維持される安全な抗炎症剤及び抗酸化剤を提供する。
【解決手段】(1)シデロフォアを有効成分とする抗炎症剤。この抗炎症剤は、特に経口投与する場合の消化管の炎症の予防又は治療に有効である。シデロフォアとしては、代表的にはデフェリフェリクリシンが挙げられる。デフェリフェリクリシンは清酒成分として人類が古くから摂取してきた安全な物質である。(2) シデロフォアを有効成分とする抗酸化剤。シデロフォアの抗酸化作用には、キレート作用以外のメカニズムが関与していると考えられる。
【解決手段】(1)シデロフォアを有効成分とする抗炎症剤。この抗炎症剤は、特に経口投与する場合の消化管の炎症の予防又は治療に有効である。シデロフォアとしては、代表的にはデフェリフェリクリシンが挙げられる。デフェリフェリクリシンは清酒成分として人類が古くから摂取してきた安全な物質である。(2) シデロフォアを有効成分とする抗酸化剤。シデロフォアの抗酸化作用には、キレート作用以外のメカニズムが関与していると考えられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性食品や医薬品の有効成分として用いられる抗炎症剤、特に消化管の炎症の予防又は治療剤に関する。また、本発明は、飲食品、化粧品、医薬品、試薬などに添加される抗酸化剤に関する。さらに本発明は、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質又は組成物の酸化を抑制する方法、及び酸化が抑制されたこれらの物質又は組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素は、喫煙、飲酒、激しいスポーツ、紫外線照射、加齢、ストレス、脂肪分の多い食品の摂取、細菌感染などの種々の原因で体内に発生する。体内で発生した活性酸素は不安定であり、正常な細胞から電子を奪って自身が安定化するとともに、細胞を破壊する。また、直接ＤＮＡに損傷を与えることもある。このため、老化、ガン、生活習慣病の原因となる。
スーパーオキサイドやヒドロキシラジカルのような活性酸素の生成には、遷移金属イオンが関与していることが知られている。中でも、鉄イオンは環境中や生体内に比較的多く存在することから、活性酸素生成に与える影響が大きい。２価鉄イオンは、例えば、過酸化水素と反応して３価鉄イオンに酸化されるとともにヒドロキシラジカルを生じる。この３価鉄は生体内で還元されて２価鉄に戻る。このようにして、鉄イオンは連続的にラジカルを発生する。
【０００３】
ここで、特許文献１には、デスフェリオキサミンのような３価鉄イオンキレーターがラジカル消去能を有し、ラジカルによる細胞の障害を低減させることが記載されている。しかし、従来公知の鉄イオンキレーターによる抗酸化活性は、活性酸素を生成する鉄イオンのキレート化作用によるものであることから、環境中に存在する鉄イオンをキレートすると抗酸化活性が無くなってしまう。このため、抗酸化活性が弱く、また長時間に亘り抗酸化活性が維持されない。特に、消化管内には鉄イオンが多く存在するため、鉄イオンキレーターを食品に添加して摂取したり、医薬品として経口投与したりすると、キレート化能が速やかに失われて、抗酸化活性が持続しない。また、従来の鉄イオンキレーターは、ヒトが摂取できる程度の十分な安全性が確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biochemical Pharmacology, Vol.55,1327-1332,1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、長時間に亘り効果が維持される安全な抗炎症剤及び抗酸化剤を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) 消化管に炎症を有するラットやマウスに、デフェリフェリクリシンを経口投与すると、消化管の炎症が抑制される。
(ii) デフェリフェリクリシンは、in vitroで活性酸素の消去作用を有する。また、フェリクリシンも活性酸素消去作用を有することから、デフェリフェリクリシンの抗酸化作用には、３価鉄イオンのキレート作用だけでなくその他の作用も寄与していると考えられる。
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の抗炎症剤、抗酸化剤などを提供する。
【０００７】
項１． シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む抗炎症剤。
項２． シデロフォアがフェリクローム類である項１に記載の抗炎症剤。
項３． フェリクローム類がデフェリフェリクリシンである項２に記載の抗炎症剤。
項４． 炎症が消化管の炎症である項１〜３のいずれかに記載の抗炎症剤。
項５． 消化管の炎症が大腸炎である項４に記載の抗炎症剤。
項６． 経口投与用である項１〜５のいずれかに記載の抗炎症剤。
項７． シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む抗酸化剤。
項８． シデロフォアがフェリクローム類である項７に記載の抗酸化剤。
項９． フェリクローム類がデフェリフェリクリシンである項８に記載の抗酸化剤。
項１０． シデロフォア及び／又はその鉄錯体を飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に添加する工程を含む、酸化が抑制された物質の製造方法。
項１１． シデロフォア及びその鉄錯体を飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に添加する工程を含む、物質の酸化抑制方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、シデロフォアがヒドロキシラジカルやスーパーオキサイドを消去する抗酸化活性を有し、また炎症（中でも消化管の炎症）を効果的に予防及び改善することが見出された。
詳述すれば、シデロフォアの抗酸化活性は、鉄イオンをキレートした後も残る。この点で、シデロフォアは従来の抗酸化剤とは異なるメカニズムで酸化を抑制していると考えられる。
【０００９】
シデロフォアの抗酸化活性は鉄イオンをキレートした後も残ることから、シデロフォアは、飲食品や医薬品としてヒトが摂取する場合に、消化管に存在する鉄イオンによって抗酸化活性及び抗炎症活性が阻害されない。従って、経口投与することができ、消化管の炎症の予防又は治療剤や、消化管内の抗酸化剤として有効である。また、鉄は消化管を始めとする生体内に多く存在するが、シデロフォアは鉄イオンをキレートした後も抗炎症及び抗酸化活性を有することから、シデロフォアを含む本発明の抗炎症剤及び抗酸化剤は、投与量当たりの効果が高く、かつ長期に亘り抗炎症活性及び抗酸化活性が維持される。
【００１０】
また、水を含む環境中にはほとんどの場合鉄が存在する。この点、シデロフォアは、飲食品、医薬品、化粧品、種々の試薬などに添加する場合に、その中に混在する鉄イオンによって抗酸化活性が阻害されず、含有量当たりの抗酸化活性が高く、抗酸化活性が長期にわたり維持されるものとなる。従って、長期保存や遠方への輸送も可能である。
さらに、シデロフォアの中でもデフェリフェリクリシンは、清酒やもろみの成分として人類が古くから摂取してきたものであり、他の抗炎症剤や抗酸化剤にはない高い安全性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用を示す図である。
【図２】Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用を既知の抗酸化剤と比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）抗炎症剤
本発明の抗炎症剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含み、特にこれを有効成分として含む。中でも、シデロフォアを含むものであることが好ましい。炎症の部位及び種類は特に限定されない。本発明の抗炎症剤は、特に消化管の炎症の予防又は治療に有効である。消化管の炎症としては、虚血性腸炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、薬剤性大腸炎、放射線大腸炎、劇症大腸炎のような腸の炎症；びらん性胃炎、出血性胃炎、ストレス胃炎、NSAID胃炎、アルコール性胃炎、ピロリ胃炎、悪性貧血胃炎、感染性胃炎、肉芽種性胃炎、好酸球性胃炎、リンパ球性胃炎のような胃炎；感染性食道炎、薬剤性食道炎、腐食性食道炎、びらん性食道炎のような食道炎などが挙げられる。中でも、腸炎の予防又は治療に有効であり、潰瘍性大腸炎、クローン病のような炎症性腸疾患の予防又は治療により有効である。摂取された本発明の抗炎症剤は、食道及び胃を通って腸管に入り、また長い腸管内を移動する。本発明の抗炎症剤は、消化管内に存在する鉄イオンをキレートした後にも抗炎症効果を維持することから、腸管の炎症を有効に抑制することができる。また、中性領域のｐＨを有する腸管内で本発明の抗炎症剤は分解され難い。
予防とは発症を回避または抑制することをいう。また治療には完治の他に改善も含まれる。
【００１３】
シデロフォア
シデロフォアは、３価鉄イオンをキレート化できる化合物をいう。本発明においてシデロフォアの鉄錯体は３価鉄イオンをキレート化した錯体である。
シデロフォアの由来は特に限定されず、どのような生物に由来するものであってもよい。多くの微生物は、外界の鉄濃度が低いときに必須成分である鉄を効率的に取り込むためにシデロフォアを生産する。微生物は容易に増殖させることができるため、微生物を用いることによりシデロフォアを容易に大量生産することができる。この点で微生物に由来するシデロフォアが好ましい。さらに、シデロフォア合成酵素群をコードする遺伝子の組換えによりシデロフォアを多量に生産する宿主を容易に作製できる点でも、微生物に由来するシデロフォアが好ましい。
【００１４】
微生物由来のシデロフォアの種類は特に限定されない。例えば、エンテロバクチン、ビブリオバクチン、アグロバクチン、アングイバクチンのようなカテコール類；コプロゲン、フェリクローム類、フェリオキサミン、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’―トリアセチルフザリニンＣのようなヒドロキサメート類；及びリゾフェリンのようなポリカルボキシレート類などが挙げられる。
特に、鉄キレート力の点で、ヒドロキサメート類（ヒドロキサム酸を含むシデロフォア）が好ましい。その中でも安定性の点で、環状であるフェリクローム類がより好ましい。
【００１５】
フェリクローム類は、３個のヒドロキサム酸を含む環状ペプチド化合物の総称であり、下記一般式（１）で表される化合物を含む。
【化１】
（式中、R1は水素原子、又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ２は水素原子、メチル基又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一又は異なって、メチル基、Ｎ５−（トランス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、Ｎ５−（シス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、又はＮ５−（トランス−４−カルボキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基を示す。）
一般式（１）の化合物の中では、フェリクローム、ジグリシルフェリクローム、デフェリフェリクリシン、フェリクロームＣ、フェリクロシン、アスペルクロームＤ１、アスペルクロームＢ１、フェリルビン、フェリロジン、フェリクロームＡ、デス（ジセリルグリシル）フェリロジン（フェリロジンにおいて＝Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−を除いた化合物）が好ましく、デフェリフェリクリシンが最も好ましい。
【００１６】
これらの化合物の一般式(1)における官能基であるＲ１〜Ｒ５を以下の表１にまとめて示す。
【表１】
これらのフェリクローム類は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属などの真菌により生産される。アスペルギルス属糸状菌であるアスペルギルス・オリゼは、清酒、味噌、醤油などの生産において使用されてきたため、ヒトは古くからフェリクローム類を摂取してきた。従って、フェリクロームは、その安全性が歴史的に確認されている点で好ましい。麹菌が生産するフェリクローム類の中でもデフェリフェリクリシンは、アスペルギルス・オリゼが比較的多量に生産するため、生産性がよい点で好ましい。
【００１７】
本発明において、シデロフォアは、天然型シデロフォアの他、３価鉄のキレート作用を有する天然型シデロフォアの誘導体も使用できる。天然型シデロフォアの誘導体としては、アセチル化、ニトロ化したものや、アミノ酸の一部が置換されたもの等が挙げられる。
シデロフォアは、生物から回収することにより製造できる。生物を鉄制限下で生育させると、鉄を含まないデフェリ体（シデロフォア）が生成される。生物から回収されたシデロフォアは粗標品のままであってもよく、精製されたものであってもよい。
シデロフォアの精製は、公知の精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲル濾過、アフィニティのような各種クロマトグラフィー等により行えばよい。例えば、糸状菌からシデロフォアを回収する場合は、液体培養して上清中に生産されたものを回収してもよく、固体培養して固体培養物から水又は緩衝液を用いて抽出した抽出液から回収してもよい。いずれにしても本発明の抗炎症剤には、例えば生物由来の夾雑物が含まれる場合がある。
またシデロフォアは、市販品を購入することもできる。また、これらのシデロフォアの混合物であってもよい。
【００１８】
デフェリフェリクリシン
デフェリフェリクリシンは、麹造り(固体培養)においてアスペルギルス・オリゼが多量に生産することが知られているフェリクローム類の１種である。アスペルギルス・オリゼが生産するフェリクローム類の殆どがデフェリフェリクリシンである。デフェリフェリクリシンは３価鉄イオンをキレートしてフェリクリシンになる。
【００１９】
デフェリフェリクリシンは、例えば以下の方法でアスペルギルス・オリゼから回収することができる。即ち、アスペルギルス・オリゼを培養する培地として、例えばポテトデキストロース培地（ニッスイ社）またはＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（２％グルコース（又はスターチ）、０．３％ＮａＮＯ３、０．２％ＫＣｌ、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．０）等を使用できる。培地は、固体培地でも液体培地でもよいが、デフェリフェリクリシンを回収し易い点で、液体培地を使用することが好ましい。また、米麹のような固体培地も、そこからデフェリフェリクリシンを回収、精製することなく、そのまま食品などに添加できる点で好ましい。
【００２０】
培養温度は、アスペルギルス・オリゼの生育可能温度範囲であればよく、例えば２５〜４２℃程度が挙げられる。培養時間は、その他の条件によって異なるが、通常２〜７日間程度とすればよい。
培養終了後、菌体を濾過後、培養液からデフェリフェリクリシンを回収する。さらに、この培養上清を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲル濾過、アフィニティなどの各種クロマトグラフィーに供することにより精製デフェリフェリクリシンが得られる。
【００２１】
製造方法
＜医薬組成物＞
本発明の抗炎症剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体と薬学的に許容される添加剤や溶剤とを混合して適当な製剤にすることにより医薬製剤（医薬組成物）として製造することができる。
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤(内服剤)；注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤などの各種製剤形態を挙げることができる。シデロフォアが分解され難い点で、経口投与剤が非経口投与剤に比べて好ましい。特に、消化管の炎症の予防又は治療に用いられるものである場合は、経口投与剤とすればよい。
【００２２】
固形の内服剤に添加される公知の添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤等が挙げられる。賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類、バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、結晶セルロース等の各種セルロース類、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。結合剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。潤沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトールなどが挙げられる。
【００２３】
また液体の内服剤には例えば蒸留水、エタノールなどの溶剤が使用される。また、液体の内服剤に添加される公知の添加剤としては、アラビアゴム、カンテン、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような懸濁化剤；ポリソルベート８０、アラビアゴムのような乳化剤；単シロップ、ハチミツ、白糖、酒石酸のような矯味剤；サリチル酸メチル、ウイキョウ油、オレンジ油、メントールのような芳香剤；安息香酸、安息香酸ナトリウムのような保存剤；クエン酸、炭酸水素のような緩衝剤などが挙げられる。
【００２４】
製剤中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、シデロフォアの種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、１日投与量が通常５００〜１０００ｍｇ程度になる量とすればよい。
また、製剤中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような内服用固形製剤の場合は５〜３０重量％程度であればよく、シロップ剤のような内服用液体製剤の場合は０．２〜１重量％程度であればよく、注射剤、点滴剤の場合は０．４〜２重量％程度であればよく、外用剤の場合は１〜１０重量％程度であればよく、座剤の場合は２〜２０重量％程度であればよい。上記の含有量の範囲であれば、炎症抑制効果が十分に得られるとともに、副作用が現れることがない。なお、点滴剤は、例えば肝臓のような、消化管以外の組織の炎症の抑制に有効である。
シデロフォア及びその鉄錯体は高温（例えば１２０℃程度）高圧（例えば２００ｋＰａ程度）処理によっても変性しない又は変性し難いことから、医薬組成物の成分として用いる場合に、加熱加圧滅菌できるという利点を有する。
【００２５】
＜飲食品用添加剤＞
本発明の抗炎症剤は、飲食品に添加する添加剤とすることができる。
＜飲食品組成物＞
また、本発明の抗炎症剤は、上記例示した薬学的に許容される添加剤や溶剤と混合して、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの形態にして、機能性の飲食品組成物にすることができる。
このような機能性飲食品組成物中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、シデロフォアの種類や摂取対象の年齢、体重、状態等によって異なり一概に規定できないが、シデロフォアに換算した１日摂取量が通常１００〜５００ｍｇ程度になる量とすればよい。
【００２６】
また、組成物中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような固形製剤の場合は１０〜３０重量％程度であればよく、シロップ剤のような液体製剤の場合は０．２〜１重量％程度であればよい。上記の含有量の範囲であれば、炎症抑制効果が十分に得られるとともに、副作用が現れることがない。
【００２７】
また、本発明の抗炎症剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を飲食品に添加して食品組成物として製造することもできる。シデロフォア及び／又はその鉄錯体は従来清酒に含まれている成分であり、食品の風味を損ねるような味や匂いを有さない。従って、食品の種類は特に限定されない。例えば、飴、ガム、ケーキ、パイ、クッキー、クラッカー、ゼリー、チョコレート、プディング、アイスクリーム、ポテトチップス、羊羹、煎餅、饅頭、中華饅頭のような菓子；酒類、茶類、コーヒー類、ドリンク剤（スポーツドリンク類、清涼飲料水など）、スープ、乳飲料のような飲料；ヨーグルト、バター、チーズのような乳製品；ハム、ソーセージ、蒲鉾、竹輪のような練り物；ソース、ドレッシング、マヨネーズ、醤油、味噌、酢、味醂、トマト加工品（ケチャップ、トマトペースト、トマトピューレ）、カレールウ、酒粕、顆粒だしのような調味料；ふりかけ、漬物、佃煮、塩昆布のような常備惣菜類；惣菜；麺、米飯、粥のような主食類などが挙げられる。中でも、飲料が好ましく、スポーツドリンク類、清涼飲料水のようなドリンク剤がより好ましい。
【００２８】
シデロフォア及び／又はその鉄錯体は、高い水溶性を有しているため、飲料に好適に添加できる。シデロフォア及び／又はその鉄錯体は低ｐＨ条件下でも高い水溶性を示すため、液状酸性食品の添加剤としても好適に使用できる。また、前述したように高温高圧処理に耐えるため、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を添加した飲食品の加熱加圧滅菌を行えるとともに、レトルト処理のような特殊な製造工程を経ることもできる。さらにシデロフォア及び／又はその鉄錯体は、従来麹を用いた食品に含まれていることから、その安全性が歴史的に確認されている点でも、食品添加物として好適である。
【００２９】
このように、通常の飲食品にシデロフォア及び／又はその鉄錯体を添加する場合は、飲食品組成物中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、シデロフォアの種類、投与対象の年齢、体重、状態等によって異なり一概に規定できないが、１日摂取量が、１００〜５００ｍｇ程度になる量とすればよい。また、食品中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の濃度は、食品の種類などによって異なるが、固体状又はゲル状食品の場合は１〜３００ｍｇ／ｇ程度が好ましく、１〜１００ｍｇ／ｇ程度がより好ましく、２〜５０ｍｇ／ｇ程度がさらにより好ましく、２〜２５ｍｇ／ｇ程度がさらにより好ましい。ヨーグルトのような半固体状食品も、飲むものではなく食する上で流動性が必要とされない点で固体状食品に含まれる。液状又は流動状食品の場合は、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ程度が好ましく、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ程度がより好ましく、０．２〜５ｍｇ／ｍｌ程度がさらに好ましい。食品の形態によって異なるが、一般的な固形状食品の１回の摂取量は１０〜５０ｇ程度であり、液体形状の食品の１回摂取量は５０ｍｌ〜５００ｍｌ程度であることから、上記の含有量の範囲であれば、１日１回から数回の摂取により十分な炎症の予防又は改善などの効果が得られるとともに、副作用が現れる恐れがない。
【００３０】
本発明の飲食品組成物には、飲食品組成物の調製に当たり慣用されている各種添加剤を添加配合することができる。添加剤としては、例えば、安定化剤、ｐＨ調整剤、糖類、甘味料、香料、各種ビタミン類、ミネラル類、抗酸化剤、賦形剤、可溶化剤、結合剤、滑沢剤、懸濁剤、湿潤剤、皮膜形成物質、矯味剤、矯臭剤、着色料、保存剤等を例示することができる。
【００３１】
（ＩＩ）抗酸化剤
本発明の抗酸化剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含み、特にこれを有効成分として含む。中でも、シデロフォアを含むものであることが好ましい。本発明の抗酸化剤は、スーパーオキサイドやヒドロキシラジカルのような活性酸素種を消去する作用を有することから、老化、発ガン、生活習慣病などを予防したり、進行を抑制したりすることができる。本発明の抗酸化剤は、特に消化管内での活性酸素種の消去作用に優れる。
従って、本発明の抗酸化剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む医薬製剤として製造することもでき、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む機能性飲食品組成物として製造することもでき、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む通常の飲食品組成物として製造することもできる。このときのシデロフォア及び／又はその鉄錯体の使用量やその他の成分の種類などは抗炎症剤の項目で説明した通りである。
【００３２】
（ＩＩＩ）酸化抑制方法
また、本発明の抗酸化剤は、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬などの物質又は組成物に添加されてそれらの成分の酸化を抑制する添加剤であってもよい。添加量は、添加される飲食品などの成分の種類によって異なるが、例えば、酸化を抑制しようとする物質又は組成物に対して、０．０２〜０．２重量％程度、好ましくは０．０４〜０．１重量％程度とすればよい。
即ち、本発明は、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬などの物質又は組成物にシデロフォアを添加することにより、これらの物質又は組成物の酸化を抑制する方法、及び飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬などの物質又は組成物にシデロフォアを添加することにより、酸化が抑制された物質又は組成物を製造する方法を提供する。
【００３３】
(ＩＶ)炎症の予防又は治療方法
シデロフォア及び／又はその鉄錯体を炎症（特に消化管の炎症）を起こしている人や、炎症の予兆のある人に投与することにより、炎症を予防、改善、又は治療することができる。投与経路及び投与量は、抗炎症剤の項目で説明した通りである。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例及び試験例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
＜デフェリフェリクリシンの調製＞
米麹を水で抽出した抽出液（デフェリフェリクリシン含有）を、限外濾過膜を用いて分子量５０００以上のタンパク質などの高分子を除去し、濾液を疎水カラムクロマトグラフィー（アンバーライト・オルガノ株式会社製）により濃縮した。フェリクリシンは４３０ｎｍに極大吸収を示す性質が知られているため（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１２，ｐ１４８２）、上記の手法で調製された溶液と、その溶液に塩化第二鉄溶液を加えたものとをＨＰＬＣ分析し、鉄を添加した場合にのみ４３０ｎｍの吸収を示す物質の大半がフェリクリシンであったことから、上記操作でデフェリフェリクリシンが濃縮されていることを確認した。さらに、上記濃縮液を凍結乾燥処理することで60％（w/w）デフェリフェリクリシン含有粉末を得た。
【００３５】
＜フェリクリシンの調製＞
米麹を水で抽出した抽出液（デフェリフェリクリシン含有）に、デフェリフェリクリシンと等モルの塩化第二鉄を加えてフェリクリシン溶液を作製した後、デフェリフェリクリシンの調整方法と同様の方法でフェリクリシン濃縮溶液を得た。調製された溶液をＨＰＬＣ分析し、４３０ｎｍの吸収を示す物質の大半がフェリクリシンであることを確認した。さらに、上記濃縮液を凍結乾燥処理することで60％（w/w）フェリクリシン含有粉末を得た。
【００３６】
以下の実施例において、Dfcyはデフェリフェリクリシンを表し、Fcyはフェリクリシンを表す。
【実施例１】
【００３７】
デフェリフェリクリシンのラット小腸虚血再灌流障害に対する効果
活性酸素が関与するとされる、虚血再灌流により惹起されるラット小腸粘膜障害モデルに対するDfcyの抗炎症作用について検討した。
Wistar系雄性ラットを18時間絶食した後、ウレタン麻酔下に正中開腹し、腹腔動脈根部を結紮し、同時に血管クリップで上腸間膜動脈の血流を遮断し、30分後クリップを取り除き、再灌流を行った。これにより、腸管虚血再灌流障害が惹起された。
【００３８】
また、Dfcy水溶液、及びFcy水溶液は蒸留水で調製後、クリップで上腸間膜動脈の血流を遮断することにより腸管虚血を惹起する3時間前に経口投与した。Dfcy投与量は、10,30,100,300 mg/kgとし、Fcy投与量は100 mg/kgとした。虚血再灌流障害を与えなかった正常群、及び虚血再灌流障害を有するがDfcyもFcyも投与しないコントロール群には同量の蒸留水を投与した。再灌流60分後、大動脈より脱血屠殺し、小腸を摘出後、以下の項目について検討した。１群６匹のラットを使用した。
【００３９】
傷害の程度を評価するため、小腸腔内漏出ヘモグロビン(Hb)量及び漏出蛋白量を測定した。また、小腸粘膜の脂質過酸化の指標として、粘膜内チオバルビツール酸(TBA)反応物質を測定した。好中球集積の指標として小腸粘膜内ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性を測定した。また胃粘膜内の炎症性サイトカインとしてCINC-1をELISA法にて測定した。
【００４０】
＜小腸腔内漏出ヘモグロビン量及び漏出蛋白量の測定方法＞
小腸腔内漏出ヘモグロビンおよび蛋白質量は定法により測定し、腸１ｃｍあたりの漏出ｍｇで評価した。
＜粘膜内チオバルビツール酸反応物質量の測定方法＞
腸粘膜内のチオバルビツール酸（ＴＢＡＲＳ）反応物質量、つまり脂質の過酸化指数はOhkawaらの方法（Ohkawa H, Ohnishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides for animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979; 95: 351-358）に従って測定した。すなわち、小腸を縦に切開し腸粘膜は二枚のスライドグラスを用いて掻き取った。粘膜組織は30mmolの塩化カリウムを含有する10mmol/Lのカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ 7.8）とともにホモジナイズした。粘膜ホモジネート中のＴＢＡＲＳ量は1,1,3,3-テトラメトキシプロパンを標準物質として湿重量あたりのマロンジアルデヒドのnmol量で表した。
【００４１】
＜小腸粘膜内ミエロペルオキシダーゼ活性の測定方法＞
小腸粘膜内ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性、つまり多形核白血球の蓄積指数はGrishamらの方法（Grisham MB, Hernandez LA, Granger DN. Xanthine oxidase and neutrophil infiltration in intestinal ischemia. Am J Phystol 1986; 251: G567-G574）を改変して測定した。すなわち２ｍｌの粘膜ホモジネートを20,000g、15分、4℃で遠心分離し不溶性画分を回収した。沈殿は5g/Lのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含む、等量の0.05mol/Lカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ ５．４）で再ホモジネートした。ＭＰＯ活性は3,3’,5,5’-テトラメチルベンザイジンの過酸化水素依存的な酸化を測定することによって評価した。１酵素単位は25℃において655nmの吸光度を１分間に１上昇させるＭＰＯの量として定義した。
【００４２】
＜CINC-1量の測定方法＞
腸粘膜ホモジネート中の好中球活性化因子CINC-1量はELISAキット（株式会社 免疫生物研究所、群馬）を用い、説明書に従って測定した。各ウェルの490nmにおける吸光度はマイクロプレートリーダー（MPR-A4i；東ソー株式会社、東京）を用いて測定した。
【００４３】
結果を以下の表２及び表３に示す。
【表２】
【表３】
【００４４】
表２から分かるように、上腸間膜動脈の30分間虚血60分間再灌流により、小腸腔内漏出ヘモグロビン量及び漏出蛋白質量は顕著に増加し、虚血再灌流による小腸粘膜障害が認められた。また、Dfcyは濃度依存的に漏出ヘモグロビン量及び漏出蛋白質量の増加を抑制し、100mg/kg投与群及び300mg/kg投与群でコントロール群との間に増加の抑制について有意差が認められた。一方、Fcyの100mg/kg投与群はコントロール群に比べると、漏出ヘモグロビン量及び漏出蛋白質量がやや少なかったが、両群間に有意差は認められなかった。
また表３から分かるように、上腸間膜動脈の30分間虚血60分間再灌流により、粘膜内TBA反応物質、粘膜内MPO活性、及びCINC-1量は、対照群に比較し顕著な増加を示した。さらに、Dfcy投与によりTBA反応物質量、MPO活性、及びCINC-1の増加は抑制された。100mg/kg投与群及び300mg/kg投与群でコントロール群との間に増加の抑制について有意差が認められた。
表２及び表３より、Dfcyは、好中球浸潤、脂質過酸化の抑制、炎症性サイトカイン誘導抑制などの炎症作用により、小腸における虚血再灌流惹起性粘膜傷害を抑制することが分かる。
【実施例２】
【００４５】
マウスデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)大腸炎におけるDfcyの効果
慢性炎症性腸疾患モデルの一つであるマウスDSS大腸炎モデルを用い、Dfcyの効果について検討した。
７週齢BALB/cマウス（雄）に対して分子量5000のDSSの8重量％水溶液を7日間自由摂取させることにより大腸炎を誘発させた。DfcyはDSS投与と同時に経口投与を始め、100mg/kg/dayの量を7日間連続して経口投与した。DSS投与しない正常マウスにはDSS水溶液に代えて蒸留水を自由摂取させた。また、DSS投与したがDfcyを投与しないコントロールマウスには8重量％DSS水溶液を自由摂取させたが、Dfcyは投与しなかった。各群１０匹のマウスを用いた。
【００４６】
大腸炎の程度を示す指標として大腸の長さを測定した。結果を以下の表４に示す。
【表４】
DSS投与によりマウス大腸は有意に短くなった。さらに、100mg/kg/dayのDfcy投与により腸管短縮の有意な改善が認められた。また、DSS惹起性大腸炎の臨床評価であるDAI(Disease activity index)を、体重変化、血便、下痢の程度により決定し、経時的に以下の表５に示した。
【表５】
【００４７】
DSS投与7日目に、Dfcy100mg/kg/day投与により、DAIの上昇が有意に抑えられた。
また、DSS惹起性大腸炎の診断の指標の一つである体重の測定結果を以下の表６に示す。体重は、DSS投与日の体重を１とした場合の相対値で示した。
【表６】
【００４８】
DSS投与7日目に体重は有意に減少したが、Dfcy100mg/kg/day投与により、体重の減少は有意に抑えられた。
以上より、Dfcyの100mg/kg/dayの経口投与により、DSS惹起性大腸炎を予防又は改善できることが分かる。
【実施例３】
【００４９】
Dfcy及びFcyの抗酸化能の評価
以下の各試験において、活性酸素発生量をESR(電子スピン共鳴)装置を用いて測定した。ESR測定条件(装置ESR-JES-TE200：日本電子製)は、以下の通りである。
共鳴周波数：9.43GHz
出力：4.0mＷ
磁場変調：100kＨｚ
観測磁場：338.5±5mＴ
測定時間：1分間
変調幅：0.1mＴ
増幅率：100（ヒドロキシラジカル消去能測定時）
160（スーパーオキサイド消去能測定時）
応答時間：0.1秒間
【００５０】
(3-1)ヒドロキシラジカル(・OH)消去能
(i)→(v)の順でエッペンチューブ(1.5ml容)に溶液を加えた。濃度は終濃度を示す。
(i) 200μM DATAPAC／PBS 100μL (終濃度 100μM)
(ii) 500μM 硫酸鉄／大塚蒸留水 20μL (終濃度 50μM)
(iii)100mＭ DMPO／大塚蒸留水 20μL (終濃度 10ｍM)
(iv)Dfcy溶液・Fcy溶液／大塚蒸留水 40μL
(v)10mＭ H2O2／大塚蒸留水 20μL (終濃度 1ｍM)
全量200μLをESR測定用扁平セルに移し、(v)の溶液添加後、5分間以内に測定した。
【００５１】
なお、DETAPAC（di-ethylene triamine penta acetic acid：ジエチレントリアミン5酢酸）は金属キレート剤であり、水溶液中の微量な遷移金属の影響を除去するために添加した。上記反応系では大塚蒸留水を使用しているが、ｐH調整のためにリン酸緩衝液を用いるため、微量な遷移金属が必ず混入する。混入した微量の遷移金属が活性酸素と直接反応したり、ヒドロキシラジカル系の過酸化水素やスーパーオキシド系の酵素と非特異的な反応を引き起こしたりする危険を回避するために100μM程度で存在させている。
また、DMPO（5,5-ジメチル-1-ピロリン-N-オキサイド）は発生したラジカルをトラップするために使用される。活性酸素は極めて短寿命であることから、スピントラップ剤であるDMPOで補足する。
また、硫酸鉄は酸化促進剤として添加した。Dfcyは２価鉄イオンをキレートできないため、添加した硫酸鉄によりDfcyがFcyに変化することはない。
ESRの測定値に基づき、以下の式（A）によりDfcy又はFcyによるヒドロキシラジカル消去率を算出した。式（A）においてコントロールは、Dfcy溶液もFcy溶液も添加しない場合を指す。
ラジカル消去率＝
テストサンプルのラジカル発生量／コントロールのラジカル発生量
・・・・・式（Ａ）
【００５２】
Fをラジカル消去率（％）とした時、横軸をDfcy又はFcy濃度とし、縦軸をF／(F-1)としたグラフを作成すると、一次曲線の関係が得られた（図示せず）。このことからDfcy及びFcyが濃度依存的にラジカル消去反応をしていることが分かった。この検量線から得られたIC５０（ラジカルを50％消去する濃度（F=50％となる濃度））を以下の表７に示す。
【表７】
IC50は、Dfcyが0.0507%(w/v)であり、Fcyが0.1041%(w/v)であることから、FcyよりDfcyの方がラジカル消去能が高いことが分かる。
【００５３】
(3-2)スーパーオキサイドアニオンラジカル(・O2-)消去能
(i)→(v)の順でエッペンチューブ(1.5ml容)に溶液を加えた。濃度は終濃度を示す。
(i)ヒポキサンチン／Delbecco’s PBS 2mＭ 50μL (終濃度500μM)
(ii) DETAPAC ／Delbecco’s PBS 1.33mＭ 15μL (終濃度100μM)
(iii) DMPO／大塚蒸留水 原液（8.9M） 15μL (終濃度 667.5ｍM)
(iv)Dfcy溶液・Fcy溶液／2％DMF水溶液 各濃度(終濃度ｘ2) 100μL
(v)XOD／Delbecco’s PBS 200U／ml 20μL (終濃度 20U／ml)
【００５４】
活性酸素種を生産するキサンチンオキシダーゼ（XOD）添加後全量200μLをESR測定用扁平セルに移し、1分間後に測定開始した。
ESRの測定値から、式（Ａ）に従い、Dfcy又はFcyによるスーパーオキサイドアニオンラジカル消去率を算出した。
Fをラジカル消去率（％）とした時、横軸をDfcy又はFcy濃度とし、縦軸をF／(F-1)としたグラフを作成すると、一次曲線の関係が得られた(図示せず)。このことからDfcy及びFcyが濃度依存的にラジカル消去反応をしていることが分かった。この検量線から得られたIC５０（ラジカルを50％消去する濃度（F=50％となる濃度））を以下の表８に示す。
【００５５】
【表８】
IC50は、Dfcyが0.3884%(w/v)であり、Fcyが0.6161%(w/v)であることから、FcyよりDfcyの方がラジカル消去能が高いことが分かる。
(3-3) DATAPAC非存在下でのヒドロキシラジカル(・OH)消去能
(i)→(v)の順でエッペンチューブ(1.5ml容)に溶液を加えた。濃度は終濃度を示す。
(i) Dfcy溶液・Fcy溶液／PBS 100μL (終濃度0.5％又は1％で評価)
(ii)500μM 硫酸鉄／大塚蒸留水 20μL (終濃度 50μM)
(iii)100mＭ DMPO／大塚蒸留水 20μL (終濃度 10ｍM)
(iv)大塚蒸留水 40μL
(v)10mＭ H2O2／大塚蒸留水 20μL (終濃度 1ｍM)
【００５６】
全量200μLをESR測定用扁平セルに移し、(v)の溶液添加後、5分間以内に測定した。
測定されたシグナルの最大強度を表９に示す。DfcyもFcyも添加しなかったコントロールのシグナルの最大強度は約13であった。Dfcy及びFcyはESRのシグナルをコントロールに比べて減少させた。このことから、Dfcy及びFcyはヒドロキシラジカル消去能を有することが分かる。また、シグナル強度の減少の大きさより、Dfcyの方がFcyよりもヒドロキシラジカル消去能が高いことが分かった。
【００５７】
【表９】
【実施例４】
【００５８】
Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用の評価
(i)→(vi)の順でエッペンチューブ(1.5ml容)に溶液を加えた。
(i)蒸留水 0.22ml
(ii) 0.5M リン酸バッファー（ｐH7.0）0.5ml
(iii) 7% リノール酸（V/V）メタノール溶液 0.01ml
(iv)テストサンプル メタノール溶液0.01ml
(v) 10mＭ 硫酸鉄水溶液 0.01ml
(vi) 70ｍM アスコルビン酸水溶液 0.01ml
よく混和し、６０℃で２４時間保温する。
これに以下の溶液を加えた。
(vii) 25％TCA 1ml
(viii) 0.67％ チオバルビルツール酸 2 ml
沸騰水浴中で15分加熱
(ix)ｎ-ブタノール2 ml
【００５９】
よく攪拌した後、3500rpmで15分間遠心分離を行い、上清の532nmの吸光度を測定した。テストサンプルはDfcy 5ｍM、10ｍMおよび20mMのメタノール溶液を作成し、添加した。
過酸化脂質の生成の抑制率は、下記の式（Ｂ）により算出した。式（Ｂ）において、ブランク１は（リノール酸を添加しないときの値）を指し、ブランク２は（硫酸鉄およびアスコルビン酸を添加しないときの値）を指す。
過酸化脂質生成抑制率＝（100-A532テストサンプル）／
(A532コントロール−A532ブランク1−A532ブランク2)
・・・・・式（Ｂ）
結果を図１に示す。Dfcyは非常に強い過酸化脂質生成抑制作用を示し、その作用は濃度依存的であった。
【実施例５】
【００６０】
Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用の評価
Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用を抗酸化作用を有する既知の物質と比較した。具体的には、実施例４において、(i)〜(vi)に加えて被験物質の各15mg／mlのメタノール溶液を添加した他は、実施例４と同様の操作を行った。被験物質としては、ラクトフェリン、α-トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン、及びDfcyを用いた。過酸化脂質の生成の抑制率は、実施例４と同様にして算出した。結果を図２に示す。Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用は、食品用抗酸化剤として汎用されているαトコフェロールやブチルヒドロキシトルエンと同程度であり、同じ鉄キレートタンパク質であるラクトフェリンより強かった。
【００６１】
処方例
以下に、本発明の抗炎症剤、抗酸化剤の処方例を示す。
食品組成物
＜処方例１ クッキー＞
小麦粉（薄力粉）１００ｇ、ベーキングパウダー２．５ｇ、食塩１．５ｇ、デフェリフェリクリシン２００ｍｇを混合し、これにバター４０ｇとミルク５０ｇを加え、これをオーブンで１８０℃、１０分間焼き上げ、シデロフォア強化クッキーを得た。得られたクッキーには、デフェリフェリクリシンが１．５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６２】
＜処方例２ ゼリー＞
ゼラチン５ｇ、ショ糖２０ｇ、水５０ｇから膨潤ゼラチンを作る。プレーンヨーグルト１４０ｇにデフェリフェリクリシン１６０ｍｇを加え、上記膨潤ゼラチンを加えて冷やす。これを固めてシデロフォア強化ゼリーを得た。得られたゼリーには、デフェリフェリクリシンが０．７５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６３】
＜処方例３ 飴＞
上白糖５００ｇ、水飴４４０ｇを少量の水に溶解し、さらにデフェリフェリクリシン４ｇを添加して減圧下１３０℃で煮詰めた。その後、クエン酸３．５ｇ、酒石酸１．５ｇ、脱脂卵黄蛋白分解物１ｇを添加した。これを冷却してシデロフォア強化飴を得た。得られた飴には、デフェリフェリクリシンが５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６４】
＜処方例４ アイスクリーム＞
牛乳１２００ｇ、生クリーム３１０ｇ、上白糖３００ｇ、脱脂粉乳６０ｇ、脱脂卵黄蛋白分解物１ｇ、増粘安定剤６ｇ、デフェリフェリクリシン８００ｍｇに水を加えて全量２０００ｍｌにして溶解した。これを８０℃まで加熱した後、ホモミキサーで予備乳化し、引き続きホモゲナイズした。冷却し熟成させた後バニラエッセンス２ｇを加えフリージングを行った。その後−４０℃まで急冷してシデロフォア強化アイスクリームを得た。得られたアイスクリームには、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６５】
＜処方例５ 羊羹＞
糸寒天７．５ｇを溶かし、これに小豆漉し餡６６０ｇ、グラニュー糖３００ｇ、水５５０ｍｌ、デフェリフェリクリシン２ｇを混ぜて溶かして煮詰め、冷やしてシデロフォア強化羊羹を得た。得られた羊羹には、デフェリフェリクリシンが２ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６６】
＜処方例６ ヨーグルト＞
２０％脱脂乳を１２０℃で、３秒間殺菌した後、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・カゼイの種菌を培養してヨーグルトベース４００ｇを得た。さらに、砂糖７０ｇ、ペクチン３ｇ、デフェリフェリクリシン８００ｍｇを水に溶解させ、水を加え全量を６００ｇとした。この溶液を１２０℃で、３秒間殺菌してシロップを得た。上記のヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を１ｇ添加した後、均質化して、シデロフォア強化ヨーグルトを得た。得られたヨーグルトには、デフェリフェリクリシンが０．８ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６７】
＜処方例７ 牛乳＞
牛乳１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを入れてよく撹拌し、シデロフォア強化牛乳を得た。得られた牛乳には、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６８】
＜処方例８ チョコレート＞
カカオマス２５ｇ、カカオバター１５ｇ、全脂粉乳１５ｇ、粉砂糖３０ｇ、粉ミルク１５ｇとデフェリフェリクリシン２５０ｍｇを混和し、４５℃で暖めた後に冷却し、シデロフォア強化チョコレートを得た。得られたチョコレートには、デフェリフェリクリシンが２．５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６９】
＜処方例９ マヨネーズ＞
卵黄２０ｇに食塩２．５ｇ、蔗糖１．５ｇ、マスタード１．５ｇ、胡椒０．１ｇ、レモン汁５ｇ、デフェリフェリクリシン３．２ｇを加え、これに酢１０ｇとサラダ油１６０ｇとを加えてよく攪拌してシデロフォア強化マヨネーズを得た。得られたマヨネーズには、デフェリフェリクリシンが１６ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７０】
＜処方例１０ ケチャップ＞
トマト１ｋｇを皮をむいてミキサーにかけ、加熱して煮詰めた後、すりおろしたタマネギ１０ｇ、ニンニク３ｇを加え、さらに砂糖１０ｇ、塩２ｇ、デフェリフェリクリシン４．８ｇを加える。弱火にして香辛料（シナモンスティック、クローブ、胡椒、唐辛子）１ｇ、酢を３０ｇ加え、一度加熱した後、冷ましてシデロフォア強化ケチャップを得た。得られたケチャップには、デフェリフェリクリシンが１６ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７１】
＜処方例１１ カレールウ＞
小麦粉（薄力粉）１２５ｇ、バター１００ｇ、カレー粉２０ｇとデフェリフェリクリシン１．０ｇに、少量の水を加えて混和し、固めてシデロフォア強化カレールウを得た。得られたカレールウには、デフェリフェリクリシンが４ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７２】
＜処方例１２ 蒲鉾＞
魚のすり身１００ｇ、粉末マッシュポテト１０ｇ、小麦粉５ｇ、卵白５０ｇ、塩２ｇ、砂糖０．２ｇ、みりん１０ｇ、デフェリフェリクリシン１．３ｇを加え、これらを混ぜてペースト状にし、蒸し器で蒸してシデロフォア強化蒲鉾を得た。得られた蒲鉾には、デフェリフェリクリシンが７ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７３】
＜処方例１３ 佃煮＞
戻した昆布２５ｇ、かつおだし１５０ｍｌ、砂糖１５ｇ、醤油１５ｇ、酢１０ｇ、デフェリフェリクリシン４００ｍｇを混合し、沸騰させてから中火で煮詰めてシデロフォア強化佃煮を得た。得られた佃煮には、デフェリフェリクリシンが５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７４】
＜処方例１４ ふりかけ＞
いりごま１５ｇ、味付けごま２０ｇ、味付け削り節１０ｇ、味付けかつお塩顆粒１０ｇ、味付けのり顆粒１０ｇ、デフェリフェリクリシン１．６ｇをよく混合して、シデロフォア強化ふりかけを得た。得られたふりかけには、デフェリフェリクリシンが２５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７５】
＜処方例１５ 米飯＞
白米１５０ｇ、水２２０ｇとデフェリフェリクリシン１６０ｍｇを混合し、炊飯器で炊き上げ、シデロフォア強化米飯を得た。得られた米飯には、デフェリフェリクリシンが０．５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７６】
＜処方例１６ うどん麺＞
水４００ｇ、塩５０ｇを混合して塩を溶かし、これに小麦粉（中力粉）１０００ｇ、デフェリフェリクリシン１．６ｇを混ぜ、よくこねる。固まったらこれをよく伸ばし、５ｍｍ幅に切る。これを１０分茹でて、その後冷やしてシデロフォア強化うどん麺を得た。得られたうどん麺には、デフェリフェリクリシンが３ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７７】
＜処方例１７ 清酒＞
清酒１００ｍｌにデフェリフェリクリシン２０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化清酒を得た。得られた清酒には、デフェリフェリクリシンが０．２ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７８】
＜処方例１８ 焼酎＞
焼酎１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化焼酎を得た。得られた焼酎には、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７９】
＜処方例１９ ワイン＞
ワイン１００ｍｌにデフェリフェリクリシン２０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化ワインを得た。得られたワインには、デフェリフェリクリシンが０．２ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８０】
＜処方例２０ ビール＞
ビール１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１２ｍｇを加え、撹拌してシデロフォア強化ビールを得た。得られたビールには、デフェリフェリクリシンが０．１２ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８１】
＜処方例２１ ウィスキー＞
ウィスキー１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化ウィスキーを得た。得られたウィスキーには、デフェリフェリクリシンが1ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８２】
＜処方例２２ ブランデー＞
ブランデー１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化ブランデーを得た。得られたブランデーには、デフェリフェリクリシンが１ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８３】
＜処方例２３ スピリッツ＞
スピリッツ１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化スピリッツを得た。得られたスピリッツには、デフェリフェリクリシンが１ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８４】
＜処方例２４ リキュール＞
リキュ−ル１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化リキュールを得た。得られたリキュールには、デフェリフェリクリシンが１ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８５】
＜処方例２５ みりん＞
みりん１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化みりんを得た。得られたみりんには、デフェリフェリクリシンが４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８６】
＜処方例２６ 茶＞
お茶１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化茶を得た。得られた茶には、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８７】
＜処方例２７ コーヒー＞
コーヒー１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化コーヒーを得た。得られたコーヒーには、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８８】
＜処方例２８ スポーツドリンク＞
水１００ｍｌ、果糖５ｇ、ショ糖２ｇ、クエン酸０．３ｇ、ナトリウム２０ｍｇ、カルシウム２ｍｇ、カリウム２０ｍｇ、アルギニン２０ｍｇ、イソロイシン１０ｍｇ、バリン１０ｍｇ、ロイシン１０ｍｇ、ビタミンC１００ｍｇ、β-カロチン１ｍｇにデフェリフェリクリシン１５ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化スポーツドリンクを得た。得られたスポーツドリンクには、デフェリフェリクリシンが０．１５ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８９】
＜処方例２９ 清涼飲料水＞
バレンシアオレンジ果汁３０ｍｌ、レモン果汁３ｍｌ、果糖１．５ｇ、クエン酸０．５ｇ、ビタミンC０．１ｇ、デフェリフェリクリシン１５ｍｇを加え、これに水を加えて１００ｍｌとし、よく撹拌した後に炭酸ガスを封入し、シデロフォア強化清涼飲料水を得た。得られた清涼飲料水には、デフェリフェリクリシンが０．１５ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００９０】
＜処方例３０ スープ＞
ポタージュスープ１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化スープを得た。得られたスープには、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００９１】
医薬組成物
＜処方例３１ 錠剤＞
デフェリフェリクリシン２０ｇとバレイショデンプン５０ｇ、アルギン酸ナトリウム１０ｇ、カルボキシメチルセルロース１０ｇを混合し、１００錠を造粒し、１０ｇのステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、打錠して、抗炎症剤、抗酸化剤の錠剤を得た。
【００９２】
＜処方例３２ 散剤＞
デフェリフェリクリシン２０ｇとバレイショデンプン１００ｇを混合して、これにアルギン酸ナトリウム１０ｇを加え、造粒してほぼ均一な大きさの小粒とした後にこれを乾燥させ、抗炎症剤、抗酸化剤の散剤を得た。
【００９３】
＜処方例３３ シロップ剤＞
安息香酸ナトリウム０．７ｇに精製水１０００ｍｌを加えて安息香酸ナトリウムを溶解させ、白糖７００ｇを加えて溶解させた。これにデフェリフェリクリシン２０ｇを加えて混合し、さらに酒石酸２０ｇを加えて混合して抗炎症剤、抗酸化剤のシロップ剤を得た。
【００９４】
＜処方例３４ 注射剤＞
デフェリフェリクリシン１０００ｍｇとプロピレングリコール０．１ｍｌ、ポリエチレングリコール０．１ｍｌ、ベンジルアルコール０．１ｍｌを日本薬局方に規定された注射用水５０ｍｌに溶解させ、濾過後、アンプルに充填して密封し、滅菌して抗炎症剤、抗酸化剤の注射剤を得た。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性食品や医薬品の有効成分として用いられる抗炎症剤、特に消化管の炎症の予防又は治療剤に関する。また、本発明は、飲食品、化粧品、医薬品、試薬などに添加される抗酸化剤に関する。さらに本発明は、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質又は組成物の酸化を抑制する方法、及び酸化が抑制されたこれらの物質又は組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素は、喫煙、飲酒、激しいスポーツ、紫外線照射、加齢、ストレス、脂肪分の多い食品の摂取、細菌感染などの種々の原因で体内に発生する。体内で発生した活性酸素は不安定であり、正常な細胞から電子を奪って自身が安定化するとともに、細胞を破壊する。また、直接ＤＮＡに損傷を与えることもある。このため、老化、ガン、生活習慣病の原因となる。
スーパーオキサイドやヒドロキシラジカルのような活性酸素の生成には、遷移金属イオンが関与していることが知られている。中でも、鉄イオンは環境中や生体内に比較的多く存在することから、活性酸素生成に与える影響が大きい。２価鉄イオンは、例えば、過酸化水素と反応して３価鉄イオンに酸化されるとともにヒドロキシラジカルを生じる。この３価鉄は生体内で還元されて２価鉄に戻る。このようにして、鉄イオンは連続的にラジカルを発生する。
【０００３】
ここで、特許文献１には、デスフェリオキサミンのような３価鉄イオンキレーターがラジカル消去能を有し、ラジカルによる細胞の障害を低減させることが記載されている。しかし、従来公知の鉄イオンキレーターによる抗酸化活性は、活性酸素を生成する鉄イオンのキレート化作用によるものであることから、環境中に存在する鉄イオンをキレートすると抗酸化活性が無くなってしまう。このため、抗酸化活性が弱く、また長時間に亘り抗酸化活性が維持されない。特に、消化管内には鉄イオンが多く存在するため、鉄イオンキレーターを食品に添加して摂取したり、医薬品として経口投与したりすると、キレート化能が速やかに失われて、抗酸化活性が持続しない。また、従来の鉄イオンキレーターは、ヒトが摂取できる程度の十分な安全性が確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biochemical Pharmacology, Vol.55,1327-1332,1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、長時間に亘り効果が維持される安全な抗炎症剤及び抗酸化剤を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) 消化管に炎症を有するラットやマウスに、デフェリフェリクリシンを経口投与すると、消化管の炎症が抑制される。
(ii) デフェリフェリクリシンは、in vitroで活性酸素の消去作用を有する。また、フェリクリシンも活性酸素消去作用を有することから、デフェリフェリクリシンの抗酸化作用には、３価鉄イオンのキレート作用だけでなくその他の作用も寄与していると考えられる。
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の抗炎症剤、抗酸化剤などを提供する。
【０００７】
項１． シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む抗炎症剤。
項２． シデロフォアがフェリクローム類である項１に記載の抗炎症剤。
項３． フェリクローム類がデフェリフェリクリシンである項２に記載の抗炎症剤。
項４． 炎症が消化管の炎症である項１〜３のいずれかに記載の抗炎症剤。
項５． 消化管の炎症が大腸炎である項４に記載の抗炎症剤。
項６． 経口投与用である項１〜５のいずれかに記載の抗炎症剤。
項７． シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む抗酸化剤。
項８． シデロフォアがフェリクローム類である項７に記載の抗酸化剤。
項９． フェリクローム類がデフェリフェリクリシンである項８に記載の抗酸化剤。
項１０． シデロフォア及び／又はその鉄錯体を飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に添加する工程を含む、酸化が抑制された物質の製造方法。
項１１． シデロフォア及びその鉄錯体を飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に添加する工程を含む、物質の酸化抑制方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、シデロフォアがヒドロキシラジカルやスーパーオキサイドを消去する抗酸化活性を有し、また炎症（中でも消化管の炎症）を効果的に予防及び改善することが見出された。
詳述すれば、シデロフォアの抗酸化活性は、鉄イオンをキレートした後も残る。この点で、シデロフォアは従来の抗酸化剤とは異なるメカニズムで酸化を抑制していると考えられる。
【０００９】
シデロフォアの抗酸化活性は鉄イオンをキレートした後も残ることから、シデロフォアは、飲食品や医薬品としてヒトが摂取する場合に、消化管に存在する鉄イオンによって抗酸化活性及び抗炎症活性が阻害されない。従って、経口投与することができ、消化管の炎症の予防又は治療剤や、消化管内の抗酸化剤として有効である。また、鉄は消化管を始めとする生体内に多く存在するが、シデロフォアは鉄イオンをキレートした後も抗炎症及び抗酸化活性を有することから、シデロフォアを含む本発明の抗炎症剤及び抗酸化剤は、投与量当たりの効果が高く、かつ長期に亘り抗炎症活性及び抗酸化活性が維持される。
【００１０】
また、水を含む環境中にはほとんどの場合鉄が存在する。この点、シデロフォアは、飲食品、医薬品、化粧品、種々の試薬などに添加する場合に、その中に混在する鉄イオンによって抗酸化活性が阻害されず、含有量当たりの抗酸化活性が高く、抗酸化活性が長期にわたり維持されるものとなる。従って、長期保存や遠方への輸送も可能である。
さらに、シデロフォアの中でもデフェリフェリクリシンは、清酒やもろみの成分として人類が古くから摂取してきたものであり、他の抗炎症剤や抗酸化剤にはない高い安全性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用を示す図である。
【図２】Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用を既知の抗酸化剤と比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）抗炎症剤
本発明の抗炎症剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含み、特にこれを有効成分として含む。中でも、シデロフォアを含むものであることが好ましい。炎症の部位及び種類は特に限定されない。本発明の抗炎症剤は、特に消化管の炎症の予防又は治療に有効である。消化管の炎症としては、虚血性腸炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、薬剤性大腸炎、放射線大腸炎、劇症大腸炎のような腸の炎症；びらん性胃炎、出血性胃炎、ストレス胃炎、NSAID胃炎、アルコール性胃炎、ピロリ胃炎、悪性貧血胃炎、感染性胃炎、肉芽種性胃炎、好酸球性胃炎、リンパ球性胃炎のような胃炎；感染性食道炎、薬剤性食道炎、腐食性食道炎、びらん性食道炎のような食道炎などが挙げられる。中でも、腸炎の予防又は治療に有効であり、潰瘍性大腸炎、クローン病のような炎症性腸疾患の予防又は治療により有効である。摂取された本発明の抗炎症剤は、食道及び胃を通って腸管に入り、また長い腸管内を移動する。本発明の抗炎症剤は、消化管内に存在する鉄イオンをキレートした後にも抗炎症効果を維持することから、腸管の炎症を有効に抑制することができる。また、中性領域のｐＨを有する腸管内で本発明の抗炎症剤は分解され難い。
予防とは発症を回避または抑制することをいう。また治療には完治の他に改善も含まれる。
【００１３】
シデロフォア
シデロフォアは、３価鉄イオンをキレート化できる化合物をいう。本発明においてシデロフォアの鉄錯体は３価鉄イオンをキレート化した錯体である。
シデロフォアの由来は特に限定されず、どのような生物に由来するものであってもよい。多くの微生物は、外界の鉄濃度が低いときに必須成分である鉄を効率的に取り込むためにシデロフォアを生産する。微生物は容易に増殖させることができるため、微生物を用いることによりシデロフォアを容易に大量生産することができる。この点で微生物に由来するシデロフォアが好ましい。さらに、シデロフォア合成酵素群をコードする遺伝子の組換えによりシデロフォアを多量に生産する宿主を容易に作製できる点でも、微生物に由来するシデロフォアが好ましい。
【００１４】
微生物由来のシデロフォアの種類は特に限定されない。例えば、エンテロバクチン、ビブリオバクチン、アグロバクチン、アングイバクチンのようなカテコール類；コプロゲン、フェリクローム類、フェリオキサミン、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’―トリアセチルフザリニンＣのようなヒドロキサメート類；及びリゾフェリンのようなポリカルボキシレート類などが挙げられる。
特に、鉄キレート力の点で、ヒドロキサメート類（ヒドロキサム酸を含むシデロフォア）が好ましい。その中でも安定性の点で、環状であるフェリクローム類がより好ましい。
【００１５】
フェリクローム類は、３個のヒドロキサム酸を含む環状ペプチド化合物の総称であり、下記一般式（１）で表される化合物を含む。
【化１】
（式中、R1は水素原子、又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ２は水素原子、メチル基又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一又は異なって、メチル基、Ｎ５−（トランス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、Ｎ５−（シス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、又はＮ５−（トランス−４−カルボキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基を示す。）
一般式（１）の化合物の中では、フェリクローム、ジグリシルフェリクローム、デフェリフェリクリシン、フェリクロームＣ、フェリクロシン、アスペルクロームＤ１、アスペルクロームＢ１、フェリルビン、フェリロジン、フェリクロームＡ、デス（ジセリルグリシル）フェリロジン（フェリロジンにおいて＝Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−を除いた化合物）が好ましく、デフェリフェリクリシンが最も好ましい。
【００１６】
これらの化合物の一般式(1)における官能基であるＲ１〜Ｒ５を以下の表１にまとめて示す。
【表１】
これらのフェリクローム類は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属などの真菌により生産される。アスペルギルス属糸状菌であるアスペルギルス・オリゼは、清酒、味噌、醤油などの生産において使用されてきたため、ヒトは古くからフェリクローム類を摂取してきた。従って、フェリクロームは、その安全性が歴史的に確認されている点で好ましい。麹菌が生産するフェリクローム類の中でもデフェリフェリクリシンは、アスペルギルス・オリゼが比較的多量に生産するため、生産性がよい点で好ましい。
【００１７】
本発明において、シデロフォアは、天然型シデロフォアの他、３価鉄のキレート作用を有する天然型シデロフォアの誘導体も使用できる。天然型シデロフォアの誘導体としては、アセチル化、ニトロ化したものや、アミノ酸の一部が置換されたもの等が挙げられる。
シデロフォアは、生物から回収することにより製造できる。生物を鉄制限下で生育させると、鉄を含まないデフェリ体（シデロフォア）が生成される。生物から回収されたシデロフォアは粗標品のままであってもよく、精製されたものであってもよい。
シデロフォアの精製は、公知の精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲル濾過、アフィニティのような各種クロマトグラフィー等により行えばよい。例えば、糸状菌からシデロフォアを回収する場合は、液体培養して上清中に生産されたものを回収してもよく、固体培養して固体培養物から水又は緩衝液を用いて抽出した抽出液から回収してもよい。いずれにしても本発明の抗炎症剤には、例えば生物由来の夾雑物が含まれる場合がある。
またシデロフォアは、市販品を購入することもできる。また、これらのシデロフォアの混合物であってもよい。
【００１８】
デフェリフェリクリシン
デフェリフェリクリシンは、麹造り(固体培養)においてアスペルギルス・オリゼが多量に生産することが知られているフェリクローム類の１種である。アスペルギルス・オリゼが生産するフェリクローム類の殆どがデフェリフェリクリシンである。デフェリフェリクリシンは３価鉄イオンをキレートしてフェリクリシンになる。
【００１９】
デフェリフェリクリシンは、例えば以下の方法でアスペルギルス・オリゼから回収することができる。即ち、アスペルギルス・オリゼを培養する培地として、例えばポテトデキストロース培地（ニッスイ社）またはＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（２％グルコース（又はスターチ）、０．３％ＮａＮＯ３、０．２％ＫＣｌ、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．０）等を使用できる。培地は、固体培地でも液体培地でもよいが、デフェリフェリクリシンを回収し易い点で、液体培地を使用することが好ましい。また、米麹のような固体培地も、そこからデフェリフェリクリシンを回収、精製することなく、そのまま食品などに添加できる点で好ましい。
【００２０】
培養温度は、アスペルギルス・オリゼの生育可能温度範囲であればよく、例えば２５〜４２℃程度が挙げられる。培養時間は、その他の条件によって異なるが、通常２〜７日間程度とすればよい。
培養終了後、菌体を濾過後、培養液からデフェリフェリクリシンを回収する。さらに、この培養上清を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲル濾過、アフィニティなどの各種クロマトグラフィーに供することにより精製デフェリフェリクリシンが得られる。
【００２１】
製造方法
＜医薬組成物＞
本発明の抗炎症剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体と薬学的に許容される添加剤や溶剤とを混合して適当な製剤にすることにより医薬製剤（医薬組成物）として製造することができる。
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤(内服剤)；注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤などの各種製剤形態を挙げることができる。シデロフォアが分解され難い点で、経口投与剤が非経口投与剤に比べて好ましい。特に、消化管の炎症の予防又は治療に用いられるものである場合は、経口投与剤とすればよい。
【００２２】
固形の内服剤に添加される公知の添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤等が挙げられる。賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類、バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、結晶セルロース等の各種セルロース類、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。結合剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。潤沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトールなどが挙げられる。
【００２３】
また液体の内服剤には例えば蒸留水、エタノールなどの溶剤が使用される。また、液体の内服剤に添加される公知の添加剤としては、アラビアゴム、カンテン、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような懸濁化剤；ポリソルベート８０、アラビアゴムのような乳化剤；単シロップ、ハチミツ、白糖、酒石酸のような矯味剤；サリチル酸メチル、ウイキョウ油、オレンジ油、メントールのような芳香剤；安息香酸、安息香酸ナトリウムのような保存剤；クエン酸、炭酸水素のような緩衝剤などが挙げられる。
【００２４】
製剤中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、シデロフォアの種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、１日投与量が通常５００〜１０００ｍｇ程度になる量とすればよい。
また、製剤中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような内服用固形製剤の場合は５〜３０重量％程度であればよく、シロップ剤のような内服用液体製剤の場合は０．２〜１重量％程度であればよく、注射剤、点滴剤の場合は０．４〜２重量％程度であればよく、外用剤の場合は１〜１０重量％程度であればよく、座剤の場合は２〜２０重量％程度であればよい。上記の含有量の範囲であれば、炎症抑制効果が十分に得られるとともに、副作用が現れることがない。なお、点滴剤は、例えば肝臓のような、消化管以外の組織の炎症の抑制に有効である。
シデロフォア及びその鉄錯体は高温（例えば１２０℃程度）高圧（例えば２００ｋＰａ程度）処理によっても変性しない又は変性し難いことから、医薬組成物の成分として用いる場合に、加熱加圧滅菌できるという利点を有する。
【００２５】
＜飲食品用添加剤＞
本発明の抗炎症剤は、飲食品に添加する添加剤とすることができる。
＜飲食品組成物＞
また、本発明の抗炎症剤は、上記例示した薬学的に許容される添加剤や溶剤と混合して、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの形態にして、機能性の飲食品組成物にすることができる。
このような機能性飲食品組成物中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、シデロフォアの種類や摂取対象の年齢、体重、状態等によって異なり一概に規定できないが、シデロフォアに換算した１日摂取量が通常１００〜５００ｍｇ程度になる量とすればよい。
【００２６】
また、組成物中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような固形製剤の場合は１０〜３０重量％程度であればよく、シロップ剤のような液体製剤の場合は０．２〜１重量％程度であればよい。上記の含有量の範囲であれば、炎症抑制効果が十分に得られるとともに、副作用が現れることがない。
【００２７】
また、本発明の抗炎症剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を飲食品に添加して食品組成物として製造することもできる。シデロフォア及び／又はその鉄錯体は従来清酒に含まれている成分であり、食品の風味を損ねるような味や匂いを有さない。従って、食品の種類は特に限定されない。例えば、飴、ガム、ケーキ、パイ、クッキー、クラッカー、ゼリー、チョコレート、プディング、アイスクリーム、ポテトチップス、羊羹、煎餅、饅頭、中華饅頭のような菓子；酒類、茶類、コーヒー類、ドリンク剤（スポーツドリンク類、清涼飲料水など）、スープ、乳飲料のような飲料；ヨーグルト、バター、チーズのような乳製品；ハム、ソーセージ、蒲鉾、竹輪のような練り物；ソース、ドレッシング、マヨネーズ、醤油、味噌、酢、味醂、トマト加工品（ケチャップ、トマトペースト、トマトピューレ）、カレールウ、酒粕、顆粒だしのような調味料；ふりかけ、漬物、佃煮、塩昆布のような常備惣菜類；惣菜；麺、米飯、粥のような主食類などが挙げられる。中でも、飲料が好ましく、スポーツドリンク類、清涼飲料水のようなドリンク剤がより好ましい。
【００２８】
シデロフォア及び／又はその鉄錯体は、高い水溶性を有しているため、飲料に好適に添加できる。シデロフォア及び／又はその鉄錯体は低ｐＨ条件下でも高い水溶性を示すため、液状酸性食品の添加剤としても好適に使用できる。また、前述したように高温高圧処理に耐えるため、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を添加した飲食品の加熱加圧滅菌を行えるとともに、レトルト処理のような特殊な製造工程を経ることもできる。さらにシデロフォア及び／又はその鉄錯体は、従来麹を用いた食品に含まれていることから、その安全性が歴史的に確認されている点でも、食品添加物として好適である。
【００２９】
このように、通常の飲食品にシデロフォア及び／又はその鉄錯体を添加する場合は、飲食品組成物中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の含有量は、シデロフォアの種類、投与対象の年齢、体重、状態等によって異なり一概に規定できないが、１日摂取量が、１００〜５００ｍｇ程度になる量とすればよい。また、食品中のシデロフォア及び／又はその鉄錯体の濃度は、食品の種類などによって異なるが、固体状又はゲル状食品の場合は１〜３００ｍｇ／ｇ程度が好ましく、１〜１００ｍｇ／ｇ程度がより好ましく、２〜５０ｍｇ／ｇ程度がさらにより好ましく、２〜２５ｍｇ／ｇ程度がさらにより好ましい。ヨーグルトのような半固体状食品も、飲むものではなく食する上で流動性が必要とされない点で固体状食品に含まれる。液状又は流動状食品の場合は、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ程度が好ましく、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ程度がより好ましく、０．２〜５ｍｇ／ｍｌ程度がさらに好ましい。食品の形態によって異なるが、一般的な固形状食品の１回の摂取量は１０〜５０ｇ程度であり、液体形状の食品の１回摂取量は５０ｍｌ〜５００ｍｌ程度であることから、上記の含有量の範囲であれば、１日１回から数回の摂取により十分な炎症の予防又は改善などの効果が得られるとともに、副作用が現れる恐れがない。
【００３０】
本発明の飲食品組成物には、飲食品組成物の調製に当たり慣用されている各種添加剤を添加配合することができる。添加剤としては、例えば、安定化剤、ｐＨ調整剤、糖類、甘味料、香料、各種ビタミン類、ミネラル類、抗酸化剤、賦形剤、可溶化剤、結合剤、滑沢剤、懸濁剤、湿潤剤、皮膜形成物質、矯味剤、矯臭剤、着色料、保存剤等を例示することができる。
【００３１】
（ＩＩ）抗酸化剤
本発明の抗酸化剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含み、特にこれを有効成分として含む。中でも、シデロフォアを含むものであることが好ましい。本発明の抗酸化剤は、スーパーオキサイドやヒドロキシラジカルのような活性酸素種を消去する作用を有することから、老化、発ガン、生活習慣病などを予防したり、進行を抑制したりすることができる。本発明の抗酸化剤は、特に消化管内での活性酸素種の消去作用に優れる。
従って、本発明の抗酸化剤は、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む医薬製剤として製造することもでき、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む機能性飲食品組成物として製造することもでき、シデロフォア及び／又はその鉄錯体を含む通常の飲食品組成物として製造することもできる。このときのシデロフォア及び／又はその鉄錯体の使用量やその他の成分の種類などは抗炎症剤の項目で説明した通りである。
【００３２】
（ＩＩＩ）酸化抑制方法
また、本発明の抗酸化剤は、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬などの物質又は組成物に添加されてそれらの成分の酸化を抑制する添加剤であってもよい。添加量は、添加される飲食品などの成分の種類によって異なるが、例えば、酸化を抑制しようとする物質又は組成物に対して、０．０２〜０．２重量％程度、好ましくは０．０４〜０．１重量％程度とすればよい。
即ち、本発明は、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬などの物質又は組成物にシデロフォアを添加することにより、これらの物質又は組成物の酸化を抑制する方法、及び飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬などの物質又は組成物にシデロフォアを添加することにより、酸化が抑制された物質又は組成物を製造する方法を提供する。
【００３３】
(ＩＶ)炎症の予防又は治療方法
シデロフォア及び／又はその鉄錯体を炎症（特に消化管の炎症）を起こしている人や、炎症の予兆のある人に投与することにより、炎症を予防、改善、又は治療することができる。投与経路及び投与量は、抗炎症剤の項目で説明した通りである。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例及び試験例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
＜デフェリフェリクリシンの調製＞
米麹を水で抽出した抽出液（デフェリフェリクリシン含有）を、限外濾過膜を用いて分子量５０００以上のタンパク質などの高分子を除去し、濾液を疎水カラムクロマトグラフィー（アンバーライト・オルガノ株式会社製）により濃縮した。フェリクリシンは４３０ｎｍに極大吸収を示す性質が知られているため（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１２，ｐ１４８２）、上記の手法で調製された溶液と、その溶液に塩化第二鉄溶液を加えたものとをＨＰＬＣ分析し、鉄を添加した場合にのみ４３０ｎｍの吸収を示す物質の大半がフェリクリシンであったことから、上記操作でデフェリフェリクリシンが濃縮されていることを確認した。さらに、上記濃縮液を凍結乾燥処理することで60％（w/w）デフェリフェリクリシン含有粉末を得た。
【００３５】
＜フェリクリシンの調製＞
米麹を水で抽出した抽出液（デフェリフェリクリシン含有）に、デフェリフェリクリシンと等モルの塩化第二鉄を加えてフェリクリシン溶液を作製した後、デフェリフェリクリシンの調整方法と同様の方法でフェリクリシン濃縮溶液を得た。調製された溶液をＨＰＬＣ分析し、４３０ｎｍの吸収を示す物質の大半がフェリクリシンであることを確認した。さらに、上記濃縮液を凍結乾燥処理することで60％（w/w）フェリクリシン含有粉末を得た。
【００３６】
以下の実施例において、Dfcyはデフェリフェリクリシンを表し、Fcyはフェリクリシンを表す。
【実施例１】
【００３７】
デフェリフェリクリシンのラット小腸虚血再灌流障害に対する効果
活性酸素が関与するとされる、虚血再灌流により惹起されるラット小腸粘膜障害モデルに対するDfcyの抗炎症作用について検討した。
Wistar系雄性ラットを18時間絶食した後、ウレタン麻酔下に正中開腹し、腹腔動脈根部を結紮し、同時に血管クリップで上腸間膜動脈の血流を遮断し、30分後クリップを取り除き、再灌流を行った。これにより、腸管虚血再灌流障害が惹起された。
【００３８】
また、Dfcy水溶液、及びFcy水溶液は蒸留水で調製後、クリップで上腸間膜動脈の血流を遮断することにより腸管虚血を惹起する3時間前に経口投与した。Dfcy投与量は、10,30,100,300 mg/kgとし、Fcy投与量は100 mg/kgとした。虚血再灌流障害を与えなかった正常群、及び虚血再灌流障害を有するがDfcyもFcyも投与しないコントロール群には同量の蒸留水を投与した。再灌流60分後、大動脈より脱血屠殺し、小腸を摘出後、以下の項目について検討した。１群６匹のラットを使用した。
【００３９】
傷害の程度を評価するため、小腸腔内漏出ヘモグロビン(Hb)量及び漏出蛋白量を測定した。また、小腸粘膜の脂質過酸化の指標として、粘膜内チオバルビツール酸(TBA)反応物質を測定した。好中球集積の指標として小腸粘膜内ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性を測定した。また胃粘膜内の炎症性サイトカインとしてCINC-1をELISA法にて測定した。
【００４０】
＜小腸腔内漏出ヘモグロビン量及び漏出蛋白量の測定方法＞
小腸腔内漏出ヘモグロビンおよび蛋白質量は定法により測定し、腸１ｃｍあたりの漏出ｍｇで評価した。
＜粘膜内チオバルビツール酸反応物質量の測定方法＞
腸粘膜内のチオバルビツール酸（ＴＢＡＲＳ）反応物質量、つまり脂質の過酸化指数はOhkawaらの方法（Ohkawa H, Ohnishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides for animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979; 95: 351-358）に従って測定した。すなわち、小腸を縦に切開し腸粘膜は二枚のスライドグラスを用いて掻き取った。粘膜組織は30mmolの塩化カリウムを含有する10mmol/Lのカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ 7.8）とともにホモジナイズした。粘膜ホモジネート中のＴＢＡＲＳ量は1,1,3,3-テトラメトキシプロパンを標準物質として湿重量あたりのマロンジアルデヒドのnmol量で表した。
【００４１】
＜小腸粘膜内ミエロペルオキシダーゼ活性の測定方法＞
小腸粘膜内ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性、つまり多形核白血球の蓄積指数はGrishamらの方法（Grisham MB, Hernandez LA, Granger DN. Xanthine oxidase and neutrophil infiltration in intestinal ischemia. Am J Phystol 1986; 251: G567-G574）を改変して測定した。すなわち２ｍｌの粘膜ホモジネートを20,000g、15分、4℃で遠心分離し不溶性画分を回収した。沈殿は5g/Lのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含む、等量の0.05mol/Lカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ ５．４）で再ホモジネートした。ＭＰＯ活性は3,3’,5,5’-テトラメチルベンザイジンの過酸化水素依存的な酸化を測定することによって評価した。１酵素単位は25℃において655nmの吸光度を１分間に１上昇させるＭＰＯの量として定義した。
【００４２】
＜CINC-1量の測定方法＞
腸粘膜ホモジネート中の好中球活性化因子CINC-1量はELISAキット（株式会社 免疫生物研究所、群馬）を用い、説明書に従って測定した。各ウェルの490nmにおける吸光度はマイクロプレートリーダー（MPR-A4i；東ソー株式会社、東京）を用いて測定した。
【００４３】
結果を以下の表２及び表３に示す。
【表２】
【表３】
【００４４】
表２から分かるように、上腸間膜動脈の30分間虚血60分間再灌流により、小腸腔内漏出ヘモグロビン量及び漏出蛋白質量は顕著に増加し、虚血再灌流による小腸粘膜障害が認められた。また、Dfcyは濃度依存的に漏出ヘモグロビン量及び漏出蛋白質量の増加を抑制し、100mg/kg投与群及び300mg/kg投与群でコントロール群との間に増加の抑制について有意差が認められた。一方、Fcyの100mg/kg投与群はコントロール群に比べると、漏出ヘモグロビン量及び漏出蛋白質量がやや少なかったが、両群間に有意差は認められなかった。
また表３から分かるように、上腸間膜動脈の30分間虚血60分間再灌流により、粘膜内TBA反応物質、粘膜内MPO活性、及びCINC-1量は、対照群に比較し顕著な増加を示した。さらに、Dfcy投与によりTBA反応物質量、MPO活性、及びCINC-1の増加は抑制された。100mg/kg投与群及び300mg/kg投与群でコントロール群との間に増加の抑制について有意差が認められた。
表２及び表３より、Dfcyは、好中球浸潤、脂質過酸化の抑制、炎症性サイトカイン誘導抑制などの炎症作用により、小腸における虚血再灌流惹起性粘膜傷害を抑制することが分かる。
【実施例２】
【００４５】
マウスデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)大腸炎におけるDfcyの効果
慢性炎症性腸疾患モデルの一つであるマウスDSS大腸炎モデルを用い、Dfcyの効果について検討した。
７週齢BALB/cマウス（雄）に対して分子量5000のDSSの8重量％水溶液を7日間自由摂取させることにより大腸炎を誘発させた。DfcyはDSS投与と同時に経口投与を始め、100mg/kg/dayの量を7日間連続して経口投与した。DSS投与しない正常マウスにはDSS水溶液に代えて蒸留水を自由摂取させた。また、DSS投与したがDfcyを投与しないコントロールマウスには8重量％DSS水溶液を自由摂取させたが、Dfcyは投与しなかった。各群１０匹のマウスを用いた。
【００４６】
大腸炎の程度を示す指標として大腸の長さを測定した。結果を以下の表４に示す。
【表４】
DSS投与によりマウス大腸は有意に短くなった。さらに、100mg/kg/dayのDfcy投与により腸管短縮の有意な改善が認められた。また、DSS惹起性大腸炎の臨床評価であるDAI(Disease activity index)を、体重変化、血便、下痢の程度により決定し、経時的に以下の表５に示した。
【表５】
【００４７】
DSS投与7日目に、Dfcy100mg/kg/day投与により、DAIの上昇が有意に抑えられた。
また、DSS惹起性大腸炎の診断の指標の一つである体重の測定結果を以下の表６に示す。体重は、DSS投与日の体重を１とした場合の相対値で示した。
【表６】
【００４８】
DSS投与7日目に体重は有意に減少したが、Dfcy100mg/kg/day投与により、体重の減少は有意に抑えられた。
以上より、Dfcyの100mg/kg/dayの経口投与により、DSS惹起性大腸炎を予防又は改善できることが分かる。
【実施例３】
【００４９】
Dfcy及びFcyの抗酸化能の評価
以下の各試験において、活性酸素発生量をESR(電子スピン共鳴)装置を用いて測定した。ESR測定条件(装置ESR-JES-TE200：日本電子製)は、以下の通りである。
共鳴周波数：9.43GHz
出力：4.0mＷ
磁場変調：100kＨｚ
観測磁場：338.5±5mＴ
測定時間：1分間
変調幅：0.1mＴ
増幅率：100（ヒドロキシラジカル消去能測定時）
160（スーパーオキサイド消去能測定時）
応答時間：0.1秒間
【００５０】
(3-1)ヒドロキシラジカル(・OH)消去能
(i)→(v)の順でエッペンチューブ(1.5ml容)に溶液を加えた。濃度は終濃度を示す。
(i) 200μM DATAPAC／PBS 100μL (終濃度 100μM)
(ii) 500μM 硫酸鉄／大塚蒸留水 20μL (終濃度 50μM)
(iii)100mＭ DMPO／大塚蒸留水 20μL (終濃度 10ｍM)
(iv)Dfcy溶液・Fcy溶液／大塚蒸留水 40μL
(v)10mＭ H2O2／大塚蒸留水 20μL (終濃度 1ｍM)
全量200μLをESR測定用扁平セルに移し、(v)の溶液添加後、5分間以内に測定した。
【００５１】
なお、DETAPAC（di-ethylene triamine penta acetic acid：ジエチレントリアミン5酢酸）は金属キレート剤であり、水溶液中の微量な遷移金属の影響を除去するために添加した。上記反応系では大塚蒸留水を使用しているが、ｐH調整のためにリン酸緩衝液を用いるため、微量な遷移金属が必ず混入する。混入した微量の遷移金属が活性酸素と直接反応したり、ヒドロキシラジカル系の過酸化水素やスーパーオキシド系の酵素と非特異的な反応を引き起こしたりする危険を回避するために100μM程度で存在させている。
また、DMPO（5,5-ジメチル-1-ピロリン-N-オキサイド）は発生したラジカルをトラップするために使用される。活性酸素は極めて短寿命であることから、スピントラップ剤であるDMPOで補足する。
また、硫酸鉄は酸化促進剤として添加した。Dfcyは２価鉄イオンをキレートできないため、添加した硫酸鉄によりDfcyがFcyに変化することはない。
ESRの測定値に基づき、以下の式（A）によりDfcy又はFcyによるヒドロキシラジカル消去率を算出した。式（A）においてコントロールは、Dfcy溶液もFcy溶液も添加しない場合を指す。
ラジカル消去率＝
テストサンプルのラジカル発生量／コントロールのラジカル発生量
・・・・・式（Ａ）
【００５２】
Fをラジカル消去率（％）とした時、横軸をDfcy又はFcy濃度とし、縦軸をF／(F-1)としたグラフを作成すると、一次曲線の関係が得られた（図示せず）。このことからDfcy及びFcyが濃度依存的にラジカル消去反応をしていることが分かった。この検量線から得られたIC５０（ラジカルを50％消去する濃度（F=50％となる濃度））を以下の表７に示す。
【表７】
IC50は、Dfcyが0.0507%(w/v)であり、Fcyが0.1041%(w/v)であることから、FcyよりDfcyの方がラジカル消去能が高いことが分かる。
【００５３】
(3-2)スーパーオキサイドアニオンラジカル(・O2-)消去能
(i)→(v)の順でエッペンチューブ(1.5ml容)に溶液を加えた。濃度は終濃度を示す。
(i)ヒポキサンチン／Delbecco’s PBS 2mＭ 50μL (終濃度500μM)
(ii) DETAPAC ／Delbecco’s PBS 1.33mＭ 15μL (終濃度100μM)
(iii) DMPO／大塚蒸留水 原液（8.9M） 15μL (終濃度 667.5ｍM)
(iv)Dfcy溶液・Fcy溶液／2％DMF水溶液 各濃度(終濃度ｘ2) 100μL
(v)XOD／Delbecco’s PBS 200U／ml 20μL (終濃度 20U／ml)
【００５４】
活性酸素種を生産するキサンチンオキシダーゼ（XOD）添加後全量200μLをESR測定用扁平セルに移し、1分間後に測定開始した。
ESRの測定値から、式（Ａ）に従い、Dfcy又はFcyによるスーパーオキサイドアニオンラジカル消去率を算出した。
Fをラジカル消去率（％）とした時、横軸をDfcy又はFcy濃度とし、縦軸をF／(F-1)としたグラフを作成すると、一次曲線の関係が得られた(図示せず)。このことからDfcy及びFcyが濃度依存的にラジカル消去反応をしていることが分かった。この検量線から得られたIC５０（ラジカルを50％消去する濃度（F=50％となる濃度））を以下の表８に示す。
【００５５】
【表８】
IC50は、Dfcyが0.3884%(w/v)であり、Fcyが0.6161%(w/v)であることから、FcyよりDfcyの方がラジカル消去能が高いことが分かる。
(3-3) DATAPAC非存在下でのヒドロキシラジカル(・OH)消去能
(i)→(v)の順でエッペンチューブ(1.5ml容)に溶液を加えた。濃度は終濃度を示す。
(i) Dfcy溶液・Fcy溶液／PBS 100μL (終濃度0.5％又は1％で評価)
(ii)500μM 硫酸鉄／大塚蒸留水 20μL (終濃度 50μM)
(iii)100mＭ DMPO／大塚蒸留水 20μL (終濃度 10ｍM)
(iv)大塚蒸留水 40μL
(v)10mＭ H2O2／大塚蒸留水 20μL (終濃度 1ｍM)
【００５６】
全量200μLをESR測定用扁平セルに移し、(v)の溶液添加後、5分間以内に測定した。
測定されたシグナルの最大強度を表９に示す。DfcyもFcyも添加しなかったコントロールのシグナルの最大強度は約13であった。Dfcy及びFcyはESRのシグナルをコントロールに比べて減少させた。このことから、Dfcy及びFcyはヒドロキシラジカル消去能を有することが分かる。また、シグナル強度の減少の大きさより、Dfcyの方がFcyよりもヒドロキシラジカル消去能が高いことが分かった。
【００５７】
【表９】
【実施例４】
【００５８】
Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用の評価
(i)→(vi)の順でエッペンチューブ(1.5ml容)に溶液を加えた。
(i)蒸留水 0.22ml
(ii) 0.5M リン酸バッファー（ｐH7.0）0.5ml
(iii) 7% リノール酸（V/V）メタノール溶液 0.01ml
(iv)テストサンプル メタノール溶液0.01ml
(v) 10mＭ 硫酸鉄水溶液 0.01ml
(vi) 70ｍM アスコルビン酸水溶液 0.01ml
よく混和し、６０℃で２４時間保温する。
これに以下の溶液を加えた。
(vii) 25％TCA 1ml
(viii) 0.67％ チオバルビルツール酸 2 ml
沸騰水浴中で15分加熱
(ix)ｎ-ブタノール2 ml
【００５９】
よく攪拌した後、3500rpmで15分間遠心分離を行い、上清の532nmの吸光度を測定した。テストサンプルはDfcy 5ｍM、10ｍMおよび20mMのメタノール溶液を作成し、添加した。
過酸化脂質の生成の抑制率は、下記の式（Ｂ）により算出した。式（Ｂ）において、ブランク１は（リノール酸を添加しないときの値）を指し、ブランク２は（硫酸鉄およびアスコルビン酸を添加しないときの値）を指す。
過酸化脂質生成抑制率＝（100-A532テストサンプル）／
(A532コントロール−A532ブランク1−A532ブランク2)
・・・・・式（Ｂ）
結果を図１に示す。Dfcyは非常に強い過酸化脂質生成抑制作用を示し、その作用は濃度依存的であった。
【実施例５】
【００６０】
Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用の評価
Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用を抗酸化作用を有する既知の物質と比較した。具体的には、実施例４において、(i)〜(vi)に加えて被験物質の各15mg／mlのメタノール溶液を添加した他は、実施例４と同様の操作を行った。被験物質としては、ラクトフェリン、α-トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン、及びDfcyを用いた。過酸化脂質の生成の抑制率は、実施例４と同様にして算出した。結果を図２に示す。Dfcyの過酸化脂質生成抑制作用は、食品用抗酸化剤として汎用されているαトコフェロールやブチルヒドロキシトルエンと同程度であり、同じ鉄キレートタンパク質であるラクトフェリンより強かった。
【００６１】
処方例
以下に、本発明の抗炎症剤、抗酸化剤の処方例を示す。
食品組成物
＜処方例１ クッキー＞
小麦粉（薄力粉）１００ｇ、ベーキングパウダー２．５ｇ、食塩１．５ｇ、デフェリフェリクリシン２００ｍｇを混合し、これにバター４０ｇとミルク５０ｇを加え、これをオーブンで１８０℃、１０分間焼き上げ、シデロフォア強化クッキーを得た。得られたクッキーには、デフェリフェリクリシンが１．５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６２】
＜処方例２ ゼリー＞
ゼラチン５ｇ、ショ糖２０ｇ、水５０ｇから膨潤ゼラチンを作る。プレーンヨーグルト１４０ｇにデフェリフェリクリシン１６０ｍｇを加え、上記膨潤ゼラチンを加えて冷やす。これを固めてシデロフォア強化ゼリーを得た。得られたゼリーには、デフェリフェリクリシンが０．７５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６３】
＜処方例３ 飴＞
上白糖５００ｇ、水飴４４０ｇを少量の水に溶解し、さらにデフェリフェリクリシン４ｇを添加して減圧下１３０℃で煮詰めた。その後、クエン酸３．５ｇ、酒石酸１．５ｇ、脱脂卵黄蛋白分解物１ｇを添加した。これを冷却してシデロフォア強化飴を得た。得られた飴には、デフェリフェリクリシンが５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６４】
＜処方例４ アイスクリーム＞
牛乳１２００ｇ、生クリーム３１０ｇ、上白糖３００ｇ、脱脂粉乳６０ｇ、脱脂卵黄蛋白分解物１ｇ、増粘安定剤６ｇ、デフェリフェリクリシン８００ｍｇに水を加えて全量２０００ｍｌにして溶解した。これを８０℃まで加熱した後、ホモミキサーで予備乳化し、引き続きホモゲナイズした。冷却し熟成させた後バニラエッセンス２ｇを加えフリージングを行った。その後−４０℃まで急冷してシデロフォア強化アイスクリームを得た。得られたアイスクリームには、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６５】
＜処方例５ 羊羹＞
糸寒天７．５ｇを溶かし、これに小豆漉し餡６６０ｇ、グラニュー糖３００ｇ、水５５０ｍｌ、デフェリフェリクリシン２ｇを混ぜて溶かして煮詰め、冷やしてシデロフォア強化羊羹を得た。得られた羊羹には、デフェリフェリクリシンが２ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６６】
＜処方例６ ヨーグルト＞
２０％脱脂乳を１２０℃で、３秒間殺菌した後、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・カゼイの種菌を培養してヨーグルトベース４００ｇを得た。さらに、砂糖７０ｇ、ペクチン３ｇ、デフェリフェリクリシン８００ｍｇを水に溶解させ、水を加え全量を６００ｇとした。この溶液を１２０℃で、３秒間殺菌してシロップを得た。上記のヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を１ｇ添加した後、均質化して、シデロフォア強化ヨーグルトを得た。得られたヨーグルトには、デフェリフェリクリシンが０．８ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６７】
＜処方例７ 牛乳＞
牛乳１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを入れてよく撹拌し、シデロフォア強化牛乳を得た。得られた牛乳には、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６８】
＜処方例８ チョコレート＞
カカオマス２５ｇ、カカオバター１５ｇ、全脂粉乳１５ｇ、粉砂糖３０ｇ、粉ミルク１５ｇとデフェリフェリクリシン２５０ｍｇを混和し、４５℃で暖めた後に冷却し、シデロフォア強化チョコレートを得た。得られたチョコレートには、デフェリフェリクリシンが２．５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００６９】
＜処方例９ マヨネーズ＞
卵黄２０ｇに食塩２．５ｇ、蔗糖１．５ｇ、マスタード１．５ｇ、胡椒０．１ｇ、レモン汁５ｇ、デフェリフェリクリシン３．２ｇを加え、これに酢１０ｇとサラダ油１６０ｇとを加えてよく攪拌してシデロフォア強化マヨネーズを得た。得られたマヨネーズには、デフェリフェリクリシンが１６ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７０】
＜処方例１０ ケチャップ＞
トマト１ｋｇを皮をむいてミキサーにかけ、加熱して煮詰めた後、すりおろしたタマネギ１０ｇ、ニンニク３ｇを加え、さらに砂糖１０ｇ、塩２ｇ、デフェリフェリクリシン４．８ｇを加える。弱火にして香辛料（シナモンスティック、クローブ、胡椒、唐辛子）１ｇ、酢を３０ｇ加え、一度加熱した後、冷ましてシデロフォア強化ケチャップを得た。得られたケチャップには、デフェリフェリクリシンが１６ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７１】
＜処方例１１ カレールウ＞
小麦粉（薄力粉）１２５ｇ、バター１００ｇ、カレー粉２０ｇとデフェリフェリクリシン１．０ｇに、少量の水を加えて混和し、固めてシデロフォア強化カレールウを得た。得られたカレールウには、デフェリフェリクリシンが４ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７２】
＜処方例１２ 蒲鉾＞
魚のすり身１００ｇ、粉末マッシュポテト１０ｇ、小麦粉５ｇ、卵白５０ｇ、塩２ｇ、砂糖０．２ｇ、みりん１０ｇ、デフェリフェリクリシン１．３ｇを加え、これらを混ぜてペースト状にし、蒸し器で蒸してシデロフォア強化蒲鉾を得た。得られた蒲鉾には、デフェリフェリクリシンが７ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７３】
＜処方例１３ 佃煮＞
戻した昆布２５ｇ、かつおだし１５０ｍｌ、砂糖１５ｇ、醤油１５ｇ、酢１０ｇ、デフェリフェリクリシン４００ｍｇを混合し、沸騰させてから中火で煮詰めてシデロフォア強化佃煮を得た。得られた佃煮には、デフェリフェリクリシンが５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７４】
＜処方例１４ ふりかけ＞
いりごま１５ｇ、味付けごま２０ｇ、味付け削り節１０ｇ、味付けかつお塩顆粒１０ｇ、味付けのり顆粒１０ｇ、デフェリフェリクリシン１．６ｇをよく混合して、シデロフォア強化ふりかけを得た。得られたふりかけには、デフェリフェリクリシンが２５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７５】
＜処方例１５ 米飯＞
白米１５０ｇ、水２２０ｇとデフェリフェリクリシン１６０ｍｇを混合し、炊飯器で炊き上げ、シデロフォア強化米飯を得た。得られた米飯には、デフェリフェリクリシンが０．５ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７６】
＜処方例１６ うどん麺＞
水４００ｇ、塩５０ｇを混合して塩を溶かし、これに小麦粉（中力粉）１０００ｇ、デフェリフェリクリシン１．６ｇを混ぜ、よくこねる。固まったらこれをよく伸ばし、５ｍｍ幅に切る。これを１０分茹でて、その後冷やしてシデロフォア強化うどん麺を得た。得られたうどん麺には、デフェリフェリクリシンが３ｍｇ／ｇ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７７】
＜処方例１７ 清酒＞
清酒１００ｍｌにデフェリフェリクリシン２０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化清酒を得た。得られた清酒には、デフェリフェリクリシンが０．２ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７８】
＜処方例１８ 焼酎＞
焼酎１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化焼酎を得た。得られた焼酎には、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００７９】
＜処方例１９ ワイン＞
ワイン１００ｍｌにデフェリフェリクリシン２０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化ワインを得た。得られたワインには、デフェリフェリクリシンが０．２ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８０】
＜処方例２０ ビール＞
ビール１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１２ｍｇを加え、撹拌してシデロフォア強化ビールを得た。得られたビールには、デフェリフェリクリシンが０．１２ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８１】
＜処方例２１ ウィスキー＞
ウィスキー１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化ウィスキーを得た。得られたウィスキーには、デフェリフェリクリシンが1ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８２】
＜処方例２２ ブランデー＞
ブランデー１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化ブランデーを得た。得られたブランデーには、デフェリフェリクリシンが１ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８３】
＜処方例２３ スピリッツ＞
スピリッツ１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化スピリッツを得た。得られたスピリッツには、デフェリフェリクリシンが１ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８４】
＜処方例２４ リキュール＞
リキュ−ル１００ｍｌにデフェリフェリクリシン１００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化リキュールを得た。得られたリキュールには、デフェリフェリクリシンが１ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８５】
＜処方例２５ みりん＞
みりん１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４００ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化みりんを得た。得られたみりんには、デフェリフェリクリシンが４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８６】
＜処方例２６ 茶＞
お茶１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化茶を得た。得られた茶には、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８７】
＜処方例２７ コーヒー＞
コーヒー１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化コーヒーを得た。得られたコーヒーには、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８８】
＜処方例２８ スポーツドリンク＞
水１００ｍｌ、果糖５ｇ、ショ糖２ｇ、クエン酸０．３ｇ、ナトリウム２０ｍｇ、カルシウム２ｍｇ、カリウム２０ｍｇ、アルギニン２０ｍｇ、イソロイシン１０ｍｇ、バリン１０ｍｇ、ロイシン１０ｍｇ、ビタミンC１００ｍｇ、β-カロチン１ｍｇにデフェリフェリクリシン１５ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化スポーツドリンクを得た。得られたスポーツドリンクには、デフェリフェリクリシンが０．１５ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００８９】
＜処方例２９ 清涼飲料水＞
バレンシアオレンジ果汁３０ｍｌ、レモン果汁３ｍｌ、果糖１．５ｇ、クエン酸０．５ｇ、ビタミンC０．１ｇ、デフェリフェリクリシン１５ｍｇを加え、これに水を加えて１００ｍｌとし、よく撹拌した後に炭酸ガスを封入し、シデロフォア強化清涼飲料水を得た。得られた清涼飲料水には、デフェリフェリクリシンが０．１５ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００９０】
＜処方例３０ スープ＞
ポタージュスープ１００ｍｌにデフェリフェリクリシン４０ｍｇを加え、よく撹拌してシデロフォア強化スープを得た。得られたスープには、デフェリフェリクリシンが０．４ｍｇ／ｍｌ含まれていた。これは抗炎症剤、抗酸化剤として用いることができる。
【００９１】
医薬組成物
＜処方例３１ 錠剤＞
デフェリフェリクリシン２０ｇとバレイショデンプン５０ｇ、アルギン酸ナトリウム１０ｇ、カルボキシメチルセルロース１０ｇを混合し、１００錠を造粒し、１０ｇのステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、打錠して、抗炎症剤、抗酸化剤の錠剤を得た。
【００９２】
＜処方例３２ 散剤＞
デフェリフェリクリシン２０ｇとバレイショデンプン１００ｇを混合して、これにアルギン酸ナトリウム１０ｇを加え、造粒してほぼ均一な大きさの小粒とした後にこれを乾燥させ、抗炎症剤、抗酸化剤の散剤を得た。
【００９３】
＜処方例３３ シロップ剤＞
安息香酸ナトリウム０．７ｇに精製水１０００ｍｌを加えて安息香酸ナトリウムを溶解させ、白糖７００ｇを加えて溶解させた。これにデフェリフェリクリシン２０ｇを加えて混合し、さらに酒石酸２０ｇを加えて混合して抗炎症剤、抗酸化剤のシロップ剤を得た。
【００９４】
＜処方例３４ 注射剤＞
デフェリフェリクリシン１０００ｍｇとプロピレングリコール０．１ｍｌ、ポリエチレングリコール０．１ｍｌ、ベンジルアルコール０．１ｍｌを日本薬局方に規定された注射用水５０ｍｌに溶解させ、濾過後、アンプルに充填して密封し、滅菌して抗炎症剤、抗酸化剤の注射剤を得た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分がデフェリフェリクリシンである抗酸化剤。
【請求項２】
デフェリフェリクリシンを飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に添加する工程を含む、酸化が抑制された物質の製造方法。
【請求項３】
デフェリフェリクリシンを、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に対して、０．０２〜０．２重量％添加する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
デフェリフェリクリシンを飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に添加する工程を含む、物質の酸化抑制方法。
【請求項５】
デフェリフェリクリシンを、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に対して、０．０２〜０．２重量％添加する、請求項４に記載の方法。
【請求項１】
有効成分がデフェリフェリクリシンである抗酸化剤。
【請求項２】
デフェリフェリクリシンを飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に添加する工程を含む、酸化が抑制された物質の製造方法。
【請求項３】
デフェリフェリクリシンを、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に対して、０．０２〜０．２重量％添加する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
デフェリフェリクリシンを飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に添加する工程を含む、物質の酸化抑制方法。
【請求項５】
デフェリフェリクリシンを、飲食品、化粧品、医薬品、及び試薬からなる群より選ばれる物質に対して、０．０２〜０．２重量％添加する、請求項４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１６２５６６（Ｐ２０１２−１６２５６６Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１１３９４２（Ｐ２０１２−１１３９４２）
【出願日】平成２４年５月１８日（２０１２．５．１８）
【分割の表示】特願２００７−３５９７４（Ｐ２００７−３５９７４）の分割
【原出願日】平成１９年２月１６日（２００７．２．１６）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月１８日（２０１２．５．１８）
【分割の表示】特願２００７−３５９７４（Ｐ２００７−３５９７４）の分割
【原出願日】平成１９年２月１６日（２００７．２．１６）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
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