抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤
【課題】 抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤を提供する。
【解決手段】 キリンソウ（Sedum kamtschaticum Fisch.、Sedum aizoon L.、Sedum aizoon L. var. floribundum Nakai）抽出物を有効成分とする抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤。
【解決手段】 キリンソウ（Sedum kamtschaticum Fisch.、Sedum aizoon L.、Sedum aizoon L. var. floribundum Nakai）抽出物を有効成分とする抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キリンソウ抽出物を有効成分とする抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索及び配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤、経口組成物への応用が検討されてきた。
【０００３】
例えば、皮膚の保湿効果と安全性に優れた保湿剤としてハリブキ属植物の抽出物（特許文献１参照）、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るために、真皮線維芽細胞の賦活あるいは増殖促進作用を有する成分としてポンカンのエッセンス（特許文献２参照）、ツリガネニンジン属植物の抽出物（特許文献３参照）、クロレラ抽出物（特許文献４参照）、ビワ抽出物（特許文献５参照）等が開示されている。美白剤としては、白鶴霊芝の抽出物（特許文献６参照）等が、抗酸化剤としてはサルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献７参照）等が、生体内の脂肪蓄積を抑制する成分としては、哺乳動物の乳由来リン脂質（特許文献８参照）、褐藻の酵素分解物（特許文献９参照）等がそれぞれすでに知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−７７０７２号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献３】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献４】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献５】特公平５−１７２０６号公報
【特許文献６】特開２００３−８９６３０号公報
【特許文献７】特開平１０−１８２４１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた抗老化作用、抗酸化作用、及び美白作用を有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、キリンソウ抽出物に優れた抗老化作用、抗炎症作用、美白作用、及び抗酸化作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、キリンソウ抽出物を有効成分とする抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、キリンソウ抽出物を有効成分とすることにより、優れた効果を有する抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤を提供することができる。
【０００９】
これらの抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤を皮膚外用剤および経口組成物に配合することにより、シワ、タルミ、皮膚の弾力低下、シミ、くすみいった種々の皮膚症状の発現防止や改善に優れた効果を発揮する、様々な組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いるキリンソウは、ベンケイソウ科マンネングサ属に属する双子葉植物であり、九州から北海道に分布し、変異種も多く見られる。本発明においては、キリンソウであれば特に限定されない。キリンソウの学名としては、Sedum kamtschaticum Fisch.、Sedum aizoon L.、Sedum aizoon L. var. floribundum Nakaiなどが例示される。
【００１１】
これらキリンソウを使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、葉、茎、花、根などの任意の部分を使用することができる。複数の部位を組み合わせて使用してもよい。
【００１２】
抽出の際は、キリンソウを生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
【００１３】
抽出は、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬して行うことができる。抽出溶媒は、必要に応じて加熱してもよい。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１４】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができる。これらは、単独で用いられるほか、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよい。
【００１５】
キリンソウの上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間そのまま静置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。或いは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。キリンソウの前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００１６】
キリンソウ抽出物は、優れた抗老化作用、抗炎症作用、美白作用、抗酸化作用を有し、抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、抗酸化剤として利用することができる。
【００１７】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞の細胞賦活効果、真皮線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン産生促進効果を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１８】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ阻害効果を有し、炎症の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１９】
キリンソウ抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたメラニン産生抑制効果を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防および改善して、優れた美白作用を発揮する。
【００２０】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れたラジカル消去効果、スーパーオキサイドアニオン消去効果を有し、優れた抗酸化作用を発揮する。
【実施例】
【００２１】
［抽出物１］
キリンソウの地上部位を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の精製水を加え、オートクレーブにより２０分間、１２０℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行い、キリンソウの熱水抽出物（抽出物１）を得た。
【００２２】
［抽出物２］
キリンソウの地上部位を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の５０質量％エタノールを加え、室温で撹拌しながら２時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、キリンソウのエタノール抽出物（抽出物２）を得た。
【００２３】
上記抽出物を用いて、各効果の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊及び＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊でそれぞれ表したものである。
【００２４】
［真皮線維芽細胞賦活作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物１を含有するサンプル培養液に交換しさらに４８時間培養した。次にＭＴＴ試薬を４００μｇ／ｍＬとなるように培地にて調整し、上清を除いた細胞に添加し約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価は抽出物１無添加時のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行い結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
結果は、表１に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞賦活作用を示した。
【００２７】
［真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物２を含有するサンプル培養液に交換しさらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプ１コラーゲン量はＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして０．５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価は抽出物無添加時の細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。具体的には、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにてタンパク量を測定し単位細胞又は単位タンパク量当りのコラーゲン産生量を求め、ネガティブコントロールの単位当りＩ型コラーゲン産生量を１００とした時の相対値を求めた。
【００２８】
【表２】
【００２９】
結果は、表２に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用を示した。
【００３０】
表１及び表２に示したとおり、キリンソウ抽出物は高い真皮線維芽細胞賦活作用及び真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用を有し、抗老化効果を発揮する。
【００３１】
［ヒアルロニダーゼ阻害作用］
市販のヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。なお酵素溶液は用時調製とした。試験管に、緩衝液で各濃度に調製した抽出物２含有溶液０．１ｍＬ、及び酵素溶液０．０３ｍＬをとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４規定のＮａＯＨを０．０６ｍＬ加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸した後さらに氷冷した。ｐ−ジメチルベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢＡ）溶液溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、各試験管から９６ウェルマイクロプレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、抽出物無添加の緩衝溶液のみを加えたものを用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミンが減少し。ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。このことを利用し、阻害活性は次式より求めた。結果を表３にまとめる。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
【００３２】
【表３】
【００３３】
表３に示したとおり、キリンソウ抽出物はヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、抗炎症効果を発揮する。
【００３４】
［メラニン産生抑制作用］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を９０ｍｍディッシュ１ディッシュ当り１．８×１０４個となるように播種し、５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。２４時間後に５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に試料を添加して各濃度に調整した抽出物２を含有する培養液に交換した。さらに５日間培養し、培養終了後にトリプシンにより細胞を剥離して回収した。回収した細胞を遠心し、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記に示した判定基準によりその黒化状況を目視で判定した。評価では、抽出物２を添加せず５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地のみで培養し、ネガティブコントロールとし、抽出物２のかわりに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを添加して培養し、ポジティブコントロールとした。
評価基準
判定１：ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白色）
判定２：ポジティブコントロールより僅かに黒い（薄い褐色）
判定３：ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
判定４：ネガティブコントロールより僅かに白い（黒褐色）
判定５：ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒色）
【００３５】
【表４】
【００３６】
結果は、表４に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、明らかなメラニン産生抑制作用を示し、美白作用を発揮する。
【００３７】
［ＤＰＰＨラジカル消去作用］
抽出物２を５０質量％エタノール水溶液を用いて各濃度に調整し、９６ウェルマイクロプレートに１００μＬずつ添加した。さらに０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μＬずつ添加し、充分に混合後室温、暗所にて２４時間静置後、５１６ｎｍの吸光度を測定した。抽出物２無添加のブランクの吸光度を（Ａ）、抽出物２を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、次式（２）の値をラジカル消去率とした。
ＤＰＰＨラジカル消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％） （２）
【００３８】
【表５】
【００３９】
結果は、表５に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、明らかなＤＰＰＨラジカル消去作用を示した。
【００４０】
［ＳＯＤ様活性作用］
０．２５ｍＭ ＷＳＴ−１及び１ｍＭハイポキサンチンを含有するＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μＬに、抽出物２をＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液を用いて各濃度に調整したサンプル溶液２５μＬを添加する。さらに、キサンチンオキシダーゼ２５μＬ（０．００７５ユニット）を添加し、３７℃で１５分間反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプル溶液に替えてＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液のみを添加した場合の吸光度を（Ａ）、サンプル溶液を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式（３）によって求めた。スーパーオキサイドアニオン消去率（％）＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００ （３）
【００４１】
【表６】
【００４２】
結果は、表１２に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、明らかなスーパーオキサイドアニオン消去作用を示した。
【００４３】
表１１、表１２に示したとおり、キリンソウ抽出物はＤＰＰＨラジカル消去効果、スーパーオキサイドアニオン消去効果を有し、抗酸化作用を発揮する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キリンソウ抽出物を有効成分とする抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索及び配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤、経口組成物への応用が検討されてきた。
【０００３】
例えば、皮膚の保湿効果と安全性に優れた保湿剤としてハリブキ属植物の抽出物（特許文献１参照）、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るために、真皮線維芽細胞の賦活あるいは増殖促進作用を有する成分としてポンカンのエッセンス（特許文献２参照）、ツリガネニンジン属植物の抽出物（特許文献３参照）、クロレラ抽出物（特許文献４参照）、ビワ抽出物（特許文献５参照）等が開示されている。美白剤としては、白鶴霊芝の抽出物（特許文献６参照）等が、抗酸化剤としてはサルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献７参照）等が、生体内の脂肪蓄積を抑制する成分としては、哺乳動物の乳由来リン脂質（特許文献８参照）、褐藻の酵素分解物（特許文献９参照）等がそれぞれすでに知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−７７０７２号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献３】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献４】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献５】特公平５−１７２０６号公報
【特許文献６】特開２００３−８９６３０号公報
【特許文献７】特開平１０−１８２４１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた抗老化作用、抗酸化作用、及び美白作用を有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、キリンソウ抽出物に優れた抗老化作用、抗炎症作用、美白作用、及び抗酸化作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、キリンソウ抽出物を有効成分とする抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、キリンソウ抽出物を有効成分とすることにより、優れた効果を有する抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤を提供することができる。
【０００９】
これらの抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、及び抗酸化剤を皮膚外用剤および経口組成物に配合することにより、シワ、タルミ、皮膚の弾力低下、シミ、くすみいった種々の皮膚症状の発現防止や改善に優れた効果を発揮する、様々な組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いるキリンソウは、ベンケイソウ科マンネングサ属に属する双子葉植物であり、九州から北海道に分布し、変異種も多く見られる。本発明においては、キリンソウであれば特に限定されない。キリンソウの学名としては、Sedum kamtschaticum Fisch.、Sedum aizoon L.、Sedum aizoon L. var. floribundum Nakaiなどが例示される。
【００１１】
これらキリンソウを使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、葉、茎、花、根などの任意の部分を使用することができる。複数の部位を組み合わせて使用してもよい。
【００１２】
抽出の際は、キリンソウを生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
【００１３】
抽出は、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬して行うことができる。抽出溶媒は、必要に応じて加熱してもよい。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１４】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができる。これらは、単独で用いられるほか、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよい。
【００１５】
キリンソウの上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間そのまま静置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。或いは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。キリンソウの前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００１６】
キリンソウ抽出物は、優れた抗老化作用、抗炎症作用、美白作用、抗酸化作用を有し、抗老化剤、抗炎症剤、美白剤、抗酸化剤として利用することができる。
【００１７】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞の細胞賦活効果、真皮線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン産生促進効果を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１８】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ阻害効果を有し、炎症の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１９】
キリンソウ抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたメラニン産生抑制効果を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防および改善して、優れた美白作用を発揮する。
【００２０】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れたラジカル消去効果、スーパーオキサイドアニオン消去効果を有し、優れた抗酸化作用を発揮する。
【実施例】
【００２１】
［抽出物１］
キリンソウの地上部位を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の精製水を加え、オートクレーブにより２０分間、１２０℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行い、キリンソウの熱水抽出物（抽出物１）を得た。
【００２２】
［抽出物２］
キリンソウの地上部位を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の５０質量％エタノールを加え、室温で撹拌しながら２時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、キリンソウのエタノール抽出物（抽出物２）を得た。
【００２３】
上記抽出物を用いて、各効果の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊及び＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊でそれぞれ表したものである。
【００２４】
［真皮線維芽細胞賦活作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物１を含有するサンプル培養液に交換しさらに４８時間培養した。次にＭＴＴ試薬を４００μｇ／ｍＬとなるように培地にて調整し、上清を除いた細胞に添加し約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価は抽出物１無添加時のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行い結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
結果は、表１に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞賦活作用を示した。
【００２７】
［真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物２を含有するサンプル培養液に交換しさらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプ１コラーゲン量はＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして０．５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価は抽出物無添加時の細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。具体的には、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにてタンパク量を測定し単位細胞又は単位タンパク量当りのコラーゲン産生量を求め、ネガティブコントロールの単位当りＩ型コラーゲン産生量を１００とした時の相対値を求めた。
【００２８】
【表２】
【００２９】
結果は、表２に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用を示した。
【００３０】
表１及び表２に示したとおり、キリンソウ抽出物は高い真皮線維芽細胞賦活作用及び真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用を有し、抗老化効果を発揮する。
【００３１】
［ヒアルロニダーゼ阻害作用］
市販のヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。なお酵素溶液は用時調製とした。試験管に、緩衝液で各濃度に調製した抽出物２含有溶液０．１ｍＬ、及び酵素溶液０．０３ｍＬをとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４規定のＮａＯＨを０．０６ｍＬ加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸した後さらに氷冷した。ｐ−ジメチルベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢＡ）溶液溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、各試験管から９６ウェルマイクロプレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、抽出物無添加の緩衝溶液のみを加えたものを用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミンが減少し。ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。このことを利用し、阻害活性は次式より求めた。結果を表３にまとめる。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
【００３２】
【表３】
【００３３】
表３に示したとおり、キリンソウ抽出物はヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、抗炎症効果を発揮する。
【００３４】
［メラニン産生抑制作用］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を９０ｍｍディッシュ１ディッシュ当り１．８×１０４個となるように播種し、５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。２４時間後に５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に試料を添加して各濃度に調整した抽出物２を含有する培養液に交換した。さらに５日間培養し、培養終了後にトリプシンにより細胞を剥離して回収した。回収した細胞を遠心し、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記に示した判定基準によりその黒化状況を目視で判定した。評価では、抽出物２を添加せず５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地のみで培養し、ネガティブコントロールとし、抽出物２のかわりに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを添加して培養し、ポジティブコントロールとした。
評価基準
判定１：ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白色）
判定２：ポジティブコントロールより僅かに黒い（薄い褐色）
判定３：ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
判定４：ネガティブコントロールより僅かに白い（黒褐色）
判定５：ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒色）
【００３５】
【表４】
【００３６】
結果は、表４に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、明らかなメラニン産生抑制作用を示し、美白作用を発揮する。
【００３７】
［ＤＰＰＨラジカル消去作用］
抽出物２を５０質量％エタノール水溶液を用いて各濃度に調整し、９６ウェルマイクロプレートに１００μＬずつ添加した。さらに０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μＬずつ添加し、充分に混合後室温、暗所にて２４時間静置後、５１６ｎｍの吸光度を測定した。抽出物２無添加のブランクの吸光度を（Ａ）、抽出物２を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、次式（２）の値をラジカル消去率とした。
ＤＰＰＨラジカル消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％） （２）
【００３８】
【表５】
【００３９】
結果は、表５に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、明らかなＤＰＰＨラジカル消去作用を示した。
【００４０】
［ＳＯＤ様活性作用］
０．２５ｍＭ ＷＳＴ−１及び１ｍＭハイポキサンチンを含有するＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μＬに、抽出物２をＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液を用いて各濃度に調整したサンプル溶液２５μＬを添加する。さらに、キサンチンオキシダーゼ２５μＬ（０．００７５ユニット）を添加し、３７℃で１５分間反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプル溶液に替えてＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液のみを添加した場合の吸光度を（Ａ）、サンプル溶液を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式（３）によって求めた。スーパーオキサイドアニオン消去率（％）＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００ （３）
【００４１】
【表６】
【００４２】
結果は、表１２に示した通りであり、キリンソウ抽出物は、明らかなスーパーオキサイドアニオン消去作用を示した。
【００４３】
表１１、表１２に示したとおり、キリンソウ抽出物はＤＰＰＨラジカル消去効果、スーパーオキサイドアニオン消去効果を有し、抗酸化作用を発揮する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項２】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項３】
キリンソウ抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項４】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項１】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項２】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項３】
キリンソウ抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項４】
キリンソウ抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【公開番号】特開２０１０−１２０８６９（Ｐ２０１０−１２０８６９Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９４６０４（Ｐ２００８−２９４６０４）
【出願日】平成２０年１１月１８日（２００８．１１．１８）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１８日（２００８．１１．１８）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
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