抗腫瘍薬、医薬品、組成物、及びその使用
【課題】本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有する活性ポリペプチド、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は前記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドであるが、但し配列番号２、その変異体及び抗原性断片、配列番号１６又は配列番号１７でないポリペプチドに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌のための治療の分野に関する。さらに特定的には、本発明は、テトラスパニン・スーパーファミリーに属するタンパク質由来のポリペプチドによる癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、細胞の非制御分裂、並びに侵襲による隣接組織中への直接増殖により、又は転移による遠位部位への移植により（この場合、癌細胞は血流又はリンパ系を介して運搬される）広がるこれらの細胞の能力により特性化される疾患又は障害の一クラスである。癌は全ての年齢の人々に影響を及ぼし得るが、しかし危険は年齢に伴って増大する傾向がある。それは、先進国における死亡の主因の1つである。
【０００３】
多数の型の癌が存在する。症候の重症度は、悪性疾患の部位及び特質に、そして転移が存在するか否かによっている。一旦診断されると、癌は通常は、外科手術、化学療法及び放射線療法の組合せで治療される。研究が発展するにつれて、治療は癌病態の型により特異的になりつつある。特定の癌を標的にする薬は、いくつかの癌に関してはすでに存在する。治療されない場合、癌は最終的には疾病及び死を引き起こすが、しかしこれはいつもそうであるわけではない。
【０００４】
最新治療は、悪性細胞の別個の特性、例えばアポトーシスの回避、テロメラーゼの過多のための無限増殖能力（不死化）、増殖因子の自給自足性、抗増殖因子に対する非感受性、細胞分裂速度の増大、分化能力変更、接触抑制に関する無能力、隣接組織を侵襲する能力、遠位部位に転移を形成する能力、血管成長（血管新生）を促進する能力を標的にする。
【０００５】
腫瘍血管新生は、腫瘍中に貫入して、栄養素及び酸素を供給し、そして老廃物を除去する血管の網状構造の増殖である。腫瘍血管新生は、実際は、周囲の正常な宿主組織にシグナルを送る分子を放出する癌性腫瘍細胞をもって開始する。このシグナル伝達は、宿主組織中のある種の遺伝子を活性化し、これが順次、新規血管の成長を促進させるタンパク質を生成する。固形腫瘍は、それらの増殖のために必要な栄養素及び酸素を得るために、新規血管の形成を促進しなければならず、したがって腫瘍が遠位部位に転移し得る経路を提供する。
【０００６】
実験的証拠は、種々の因子、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、腫瘍壊死増殖因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、並びに多数のその他のもの（Liotta et al., 1991, Cell 64: 327-336；Hanahan et al., Cell 86: 353-364）の生成により悪性腫瘍が血管新生を誘導し得る、ということを示唆している。
【０００７】
今日では、血管新生をターゲッティングする多数の化学療法分子が市販されている。良く知られた天然血管新生阻害剤は、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、血小板因子４、プロラクチン16 Kd断片、トロンボスポンジン、ＴＩＭＰ−１（メタロプロテアーゼ−1の組織阻害剤）、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−３である。これらの分子は、化学療法的治療薬として、並びにその他の薬剤、例えばコンブレスタチンＡ４、ＥＭＤ121974、ＴＮＰ−４７０、スクアラミン、サリドマイド、インターフェロン−アルファ、抗ＶＥＧＦ、抗体として用いられ得る。しかしながら、それらの効率は決して十分でなく、代替的治療が望ましい。
【０００８】
したがって、効率増大を示し、低侵襲性又は低毒性であり、そして回復率増大を生じる、腫瘍の治療のための代替的化学療法薬が必要とされている。
【０００９】
WO 03/074073（出願人名で）は、血管新生の調節に関与する54遺伝子の一ファミリーを記載する。これらの遺伝子の中で、「タンパク質４９７」をコードする「遺伝子４９７」（本明細書中では配列番号２）（WO 03/074073においてはＴＭ４ＳＦ２とも呼ばれる）は、血管新生の活性化（血管新生促進性）において暗示されるとして記載されている。遺伝子497の発現は、血管新生が血管新生促進因子、例えばＶＥＧＦ及びＦＧＦ2により刺激されると、増強される。WO03/074073は、ヒト内皮細胞における遺伝子４９７のアンチセンスの発現、即ち、遺伝子４９７の発現の抑制が毛細管の形成を抑制する、ということも記載する。
【００１０】
バイオインフォマティクス分析は、244のアミノ酸を含むタンパク質４９７Ｃが1つの細胞外ループＳＥＬ（小細胞外ループ）、1つの細胞外ループＬＥＬ（大細胞外ループ）、4つの膜貫通スパン、及びＮ−及びＣ末端に対応する2つの細胞内尾部を含有する、ということを明示した。したがってこのタンパク質は、テトラスパニン・スーパーファミリーの一メンバーとして分類されている（Levy et al., Nat Rev Immunol. 2005 Feb; 5(2):
136-48）。
【００１１】
テトラスパニンは、広範囲の生物体において発現される進化的に保存された細胞表面タンパク質の大ファミリーである。このファミリーのメンバーは、細胞内シグナル伝達成分への外部刺激の伝達のための足場を提供する膜マイクロドメインにおいて、それらの相手と一緒に、互いに関連する傾向がある。基本的には、テトラスパニンは、保存された極性残基を含有し、小及び大細胞外ループ（それぞれＳＥＬ及びＬＥＬ）の側面に位置する4つの膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む。ＬＥＬは、らせんａ、ｂ及びｅにより形成されるコアからなり、このコア構造はテトラスパニンの間で保存される。らせんｃ及びｄはＬＥＬの可変部分を含み、そしてそれらはＣＣＧモチーフを側面に置かれ、システイン残基をさらに保存される。この領域は、ジスルフィド架橋の結果として折りたたまれて、マッシュルーム様構造を形成する。
【００１２】
このスーパーファミリーのメンバーは、ＬＥＬドメイン中に存在するシステイン残基の数に基づいて、3つの群に分類されている。群１はＬＥＬドメイン中に4つのシステインを含有し、群２はＬＥＬドメイン中に6つのシステインを含有し、そして群３はＬＥＬドメイン中に8つのシステインを含有する。
【００１３】
タンパク質４９７ＣはそのＬＥＬドメイン内に6つのシステインを含有するため、それはしたがって、このファミリーの別のメンバーであるタンパク質ＣＤ１５１と同様に、群２に分類され得た。これらのタンパク質のＬＥＬドメインは、6つのドメイン:ａ、ｂ、ｃ、ｄ１、ｄ２及びｅを含み、これらの中で、ｄ１、ｄ２及びｃはＬＥＬの可変部分に存する。
【００１４】
さらに深く研究して、本発明人等は、タンパク質497Ｃの細胞外ドメインＳＥＬ及びＬＥＬの種々の断片に対応するタンパク質４９７Ｃの短小化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形を作り出した:
− ４９７Ｃ−Ｔ２： 本明細書における配列番号３により同定されるタンパク質４９７Ｃの全ＬＥＬドメイン（112アミノ酸）；
− ４９７Ｃ−Ｔ３： 本明細書における配列番号４により同定されるＬＥＬドメインのｃ、ｄ１、ｄ２及びｅドメイン（74アミノ酸）；
− ４９７Ｃ−Ｔ４： 本明細書における配列番号５により同定されるＬＥＬドメインのｄ１、ｄ２及びｅドメイン（49アミノ酸）；
− ４９７Ｃ−Ｔ５： 本明細書における配列番号６により同定されるＬＥＬドメインのｄ２及びｅドメイン（43アミノ酸）；
【００１５】
これらの断片の三次元立体配置、即ちＬＥＬドメインの三次元立体配座を、したがってそれらの潜在的活性を確証するために、本発明人等は、一実施形態によって、断片のＣ末端に尾部を付加した。この尾部は、30〜70アミノ酸、好ましくは45〜65アミノ酸、さらに好ましくは50〜60アミノ酸、さらに好ましくは約55アミノ酸で構成された。この尾部はそれ自体活性を有さず、その推定される役割は、ＬＥＬ断片の三次元構造を安定化すること、即ち、生物学的活性形態で折りたたまれたポリペプチドを保持することである。
【００１６】
第一の実施形態において、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２が用量依存的にin vitroでヒト内皮細胞増殖を抑制し得る、ということを本発明人等は見出した。
【００１７】
次に、第二の実施形態では、短小化形のタンパク質４９７Ｃが用量依存的にin vitroで毛細管形成を抑制するための強力な活性を有し得る、ということを本発明人等は意外にも見出した。
【００１８】
本発明人等により実行された他の実施形態は、短小化形のタンパク質４９７Ｃが用量依存的にin vitroで内皮細胞の遊走の抑制を誘導する、ということを示した。４９７Ｃ−Ｔ２による血管新生の抑制に関する用量反応研究の結果は、270 nMでは、組換えタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２は小抑制を誘導するが、一方、540 nMでは、４９７Ｃ−Ｔ２はin vitroでの血管新生を50％より多く抑制し得る（即ち、ＩＣ５０＜540 nM）、ということを明示した。これは、組換えタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２が強力な抗血管新生化合物であるということを、そしてそれが抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ及び／又はＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ）ベースの同定されたペプチドより少なくとも200倍以上強力であり得る、ということを実証した（Binetruy-Tournaire R et al., Identification of a peptides blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis, EMBO J. 2000; 19: 1525-1533）。
【００１９】
毛細管形成、ヒト内皮細胞増殖及びヒト内皮細胞遊走は、血管新生の3つの必須ステップである。その結果として、４９７Ｃ−Ｔ２が用量依存的に毛細管形成、ヒト内皮細胞増殖及び／叉は遊走をin vitroで抑制し得るという事実は、したがって、短小化形のタンパク質４９７Ｃの強力な抗血管新生活性の強固な証拠を構成した。
【００２０】
ネイティブタンパク質４９７Ｃは血管新生促進性があるとして、そしてヒト内皮細胞における遺伝子４９７のアンチセンスの発現、即ち、遺伝子４９７の抑制が毛細管の形成を抑制すると開示されているため、これらの結果は全て、全く予測されなかった。したがって、短小化形のタンパク質４９７Ｃが抗血管新生活性を有するということは、本当に意外であった。
【００２１】
さらに、高濃度でも如何なる検出可能な抗増殖作用も伴わない多数の細胞株、例えば繊維芽細胞株ＭＲＣ５、ＣＨＯ、腫瘍細胞株Ｃａｌｕ−６、ＮＣＩ−Ｈ４６０等の増殖に及ぼす４９７Ｃ−Ｔ２の作用を、本発明人等は試験した。それに反して、４９７Ｃ−Ｔ２は、500 nMという低い濃度に関してヒト内皮細胞増殖を有意に抑制し、5 μMで75％抑制を達成した。それゆえ、今日利用可能な抗ＶＥＧＦ療法的戦略より強力であるということのほかに、４９７Ｃ−Ｔ２は内皮細胞に対して高特異性である。
【００２２】
興味深いことに、ａ及びｂドメインを欠く短小化形４９７Ｃ−Ｔ３は血管新生及び細胞遊走の抑制に関して４９７Ｃ−Ｔ２と比べてほぼ同じくらい強力であるということを本発明人等は見出したが、これは、ａ及びｂドメインは４９７Ｃ−Ｔ２の生物学的活性に、及び／又は生物学的活性に必要な三次元立体配座にわずかに寄与するだけである、ということを示す。短小化形４９７Ｃ−Ｔ４（ａ、ｂ及びｃドメインを欠く）及び４９７Ｃ−Ｔ５（ａ、ｂ、ｃ及びｄ１ドメインを欠く）は４９７Ｃ−Ｔ２に比して限定された活性を有したが、これは、ｃ及びｄ１ドメインがともにタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の活性に必要である、ということを示す。
【００２３】
これらの結果も予測されなかったことであり、in vivoでのマウスにおける４９７Ｃ−Ｔ２の抗腫瘍活性を本発明人等に試験させた。
【００２４】
さらに意外なことに、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２がin vivoでの強力な抗腫瘍活性を、そして他の化学療法薬、例えばシスプラチンと組合せて強力な相乗活性を有する、ということを本発明人等は見出した。
【００２５】
試験物質４９７Ｃ−Ｔ２は、異なる試験用量でヒトＮＣＩ Ｈ４６０又はＣＡＬＵ−６腫瘍を保有するヌードマウスにおいて有毒でない、ということを本発明人等は見出した。さらに、４９７Ｃ−Ｔ２は、治療（ＣＤＤＰと組合せた二次ＩＰ注射）の開始後2日という早期に、ＮＣＩ Ｈ４６０及びＣＡＬＵ−６腫瘍に対する強力な統計学的に有意の抗腫瘍活性を示した。この抗腫瘍活性は、治療期間中、持続した。ヒト肺癌のこのモデルにおける４９７Ｃ−Ｔ２の抗腫瘍作用は、単剤療法としての現実的療法的アプローチを表した。その効能は、腫瘍増殖を抑制する細胞傷害性抗癌薬ＣＤＤＰ（シスプラチン）と組合された場合、強く高められた。他方で、シスプラチン単独は、腫瘍増殖を根絶しなかった。
【００２６】
４９７Ｃ−Ｔ２の抗血管新生活性が単にその抗腫瘍活性の原因であるか否かは明らかでない。生物学的化合物、例えばインターフェロン、ＥＧＦ及びＨｅｒ−２受容体アンタゴニストは、宿主応答を調整し、そして標準化学療法の効力を増強し得る、ということが目下、是認されている。４９７Ｃ−Ｔ２は一次抗腫瘍薬として、又は癌の治療のための一次細胞傷害性薬への追加的な相乗療法として用いるためのものであり得る、ということをデータは強力に示唆した。
【００２７】
上記のように、タンパク質４９７Ｃは内皮細胞中で発現され、そしてその発現は、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２のような血管新生促進因子により刺激されると増強される、ということが、目下、確立されている（WO 2003/074073参照）。タンパク質４９７Ｃは、テトラスパニン・スーパーファミリーに属するが、これは、細胞外シグナルの認識において暗示される2つの細胞外ループ、そしてシグナルの伝達において暗示される2つの細胞内尾部（Ｃ末端及びＮ末端）を含む膜貫通受容体である。シグナル伝達における重要な一特徴は、受容体およびリガンドの細胞外ループ間のリガンド−受容体複合体の形成である。理論と結びつけずに、短小化形の４９７Ｃは「可溶性受容体メカニズム」を介してそれらの役割を演じ得る、と出願人等は考える：短小化形の４９７Ｃは、細胞の表面で依然として可溶性であり得るし、リガンドにより認識され得る。その結果、可溶性形態の４９７Ｃ（本発明の断片）及びネイティブ膜貫通性タンパク質との間のリガンドの認識、その結果として、血管新生促進シグナルの伝達の用量依存的な低減において競合が認められ、したがって血管新生の抑制を、次に腫瘍容積の低減を生じ得る。
【００２８】
したがって本発明は、第一の態様において、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有する活性ポリペプチド、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドに関するが、但し上記ポリペプチドは配列番号２、その抗原性断片、配列番号１６又はその断片、及び配列番号１７又はその断片でない。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「ペプチド」は、100未満のアミノ酸の、限定順序での連結から形成される短い分子を意味する。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、少なくとも100のアミノ酸の、限定順序での連結から形成される分子を意味する。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「活性ポリペプチド」は、生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。本発明において、ポリペプチドは、抗血管新生及び抗腫瘍活性を有する。
【００３２】
本発明の一実施形態では、上記活性ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有し、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドを含むが、但し上記ポリペプチドは、配列番号２、その変異体及び抗原性断片、配列番号１６又はその断片、及び配列番号１７又はその断片でない。
【００３３】
配列番号２の「変異体」は、1、2又はそれより多くのアミノ酸が突然変異化される配列番号２を指す。このような変異体としては、例えば配列番号２内の残基からの欠失、又は残基への挿入又はその置換、あるいは欠失、挿入及び置換の任意の組合せが挙げられる。欠失、挿入及び置換の一例は、配列番号２と比較してその配列が5つの付加的Ｎ末端アミノ酸を有する２４９ｍｅｒ膜貫通４スーパーファミリーメンバー２タンパク質（Ｐ４１７３２）に対応する配列番号３７である。
【００３４】
本発明の一実施形態では、上記活性ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するか、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドを含むが、但し上記ポリペプチドは、配列番号２、その抗原性断片、配列番号３７のような配列番号２の変異体、配列番号１６又はその断片、及び配列番号１７又はその断片でない。
【００３５】
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、活性三次元立体配座で折りたたまれたそれを有するための手段をさらに包含する。好ましくは、活性立体配座で折りたたまれたそれを有するための上記手段は、30〜70アミノ酸、好ましくは45〜65アミノ酸、さらに好ましくは50〜60アミノ酸、さらに好ましくは約55アミノ酸を含む任意の配列にあり、上記配列は上記ポリペプチドのＣ末端に融合される。好ましい一実施形態では、上記ポリペプチドのＣ末端に融合されている上記配列は、配列番号１８（ＤＲＡＳＰ ＱＰＷＲＹＲＩＲＩＬ ＡＰＳＴＳＬＲＰＨＳ ＳＴＴＴＴＴＴＸＩＲ ＬＬＴＫＰＥＲＫＬＳ ＷＬＬＰＰＬＳＮＮ）である。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、「三次元立体配座」は、ポリペプチドの第三次構造、即ちポリペプチドが生物学的機能を実施するその全体形状を意味する。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「断片」という用語は、抗腫瘍活性を有するタンパク質４９７ＣのＬＥＬドメインの短小化形を意味する。上記断片は、好ましくは、配列番号３の少なくとも21連続アミノ酸のアミノ酸配列を有する。特定の一実施形態では、断片は、少なくとも43連続アミノ酸のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、上記断片は、配列番号４（74アミノ酸）、配列番号５（49アミノ酸）、又は配列番号６（43アミノ酸配列）のアミノ酸配列を有する。断片は、上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有し、そして抗腫瘍活性を有するペプチドも含む。
【００３８】
別の実施形態では、上記断片は、以下の配列を有する。：
配列番号１９： ＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲＳＬＳＣＣＧＶＱ ＮＹＴＮＷＳＴＳＰＹ ＦＬＥＨＧＩＰＰＳＣ ＣＭＮＥＴＤＣＮＰＱ ＤＬＨＮＬＴＶＡＡＴ ＫＶＮＱＫＧＣＹＤＬ ＶＴＳＦＭＥＴＮＭＧ ＩＩＡＧ
配列番号２０： ＡＡＴ ＫＶＮＱＫＧＣＹＤＬ ＶＴＳＦＭＥＴＮＭＧ ＩＩＡＧ
配列番号２１： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳ
配列番号２２： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮ
配列番号２３： ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ Ｎ
配列番号２４： ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬＨ
配列番号２５： ＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬ／ＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧ
配列番号２６： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ
配列番号２７： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ Ｎ
配列番号２８： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ
配列番号２９： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧ
配列番号３０： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ Ｎ
配列番号３１： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ
配列番号３２： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧ
配列番号３３： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧＣＹＤＬＶＴ ＳＦＭＥＴＮＭＧＩＩ ＡＧ
配列番号３４： ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤ
配列番号３５： ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ
配列番号３６： ＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧ
上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有し、そして抗腫瘍活性を有するペプチドも本発明に包含される。
【００３９】
一実施形態では、少なくとも21連続アミノ酸を有する配列番号３の上記断片は、配列番号４〜６、及び配列番号１９〜３６、あるいは上記断片と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドから選択される。
【００４０】
好ましい一実施形態では、少なくとも21連続アミノ酸を有する配列番号３の上記断片は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６、あるいは上記断片と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドの中から選択される。
【００４１】
第二の態様では、本発明は、上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチドを含む医薬品に関する。
【００４２】
第三の態様では、本発明は、上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、並びに１つ又は複数の薬学上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００４３】
第四の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体の癌及び／又は腫瘍の治療方法に用いるための上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、並びに１つ又は複数の薬学上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００４４】
特定の一実施形態では、上記のような医薬組成物は、抗血管形成物質又は抗腫瘍物質から選択される少なくとも1つの別の活性物質をさらに含む。これらの物質は、達成されるべき作用に関して、当業者に選択され得る。好ましくはこれらの物質は、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル及びイリノテカン等から選択され得る。
【００４５】
第五の態様では、本発明は、相乗的有効量の以下の：
− 上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、並びに
− シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択されるプラチナ錯体
を含む医薬組成物に関する。
【００４６】
本発明の実行に有用な医薬品又は組成物は、既知の慣用的経路により哺乳類に投与される。本明細書中に記載される医薬品又は組成物は、同一経路により、又は異なる経路により投与され得る。例えば医薬品又は組成物は、経口的に又は非経口的に（静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内等）投与され得る。
【００４７】
非経口的に投与される場合、組成物は、好ましくは、少なくとも1つの薬学上許容可能な賦形剤を用いて、単位投与量注射可能形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で処方される。このような賦形剤は、典型的には、非毒性及び非治療性である。このような賦形剤の例は、水、水性ビヒクル、例えば生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液及びハンクス溶液、並びに非水性ビヒクル、例えば不揮発性油（例えばトウモロコシ、綿実、落花生及びゴマ）、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルである。滅菌生理食塩水は、好ましい賦形剤である。賦形剤は、少量の添加剤、例えば溶解性、等張性及び化学的安定性を増強する物質、例えば酸化防止剤、緩衝剤及び防腐剤を含有し得る。経口（又は直腸）投与される場合、化合物は、通常は、錠剤、カプセル、座薬又はカシェ剤のような単位剤形中に処方される。このような処方物は、典型的には、固体、半固体又は液体担体又は希釈剤を含む。例示的な希釈剤及び賦形剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、ココアバター、カカオ脂、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、メチルセルロース、ポリオキシエチレン、モノラウリン酸ソルビタン、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク及びステアリン酸マグネシウムである。好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は、静脈内に投与される。
【００４８】
本発明によれば、医薬品又は組成物中に存在するポリペプチドの量は、感受性腫瘍を治療するのに有効である。好ましくはポリペプチドは、0.01〜90重量％、好ましくは0.1〜10重量％、さらに好ましくは１〜5重量％の量で、医薬品中に又は組成物中に存在する。これらの量は当業者によりルーチンに適用可能であって、彼等は回復を達成するために患者に投与するのに最良の量を選択し得る。
【００４９】
第六の態様では、本発明は、癌及び／又は腫瘍の治療のための、上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチドの、あるいは上記のような医薬品の、又は上記のような医薬組成物の使用に関する。
【００５０】
本発明によれば、治療されるべき腫瘍は、好ましくは固形腫瘍である。さらに好ましくは、治療されるべき腫瘍は、肉腫、癌腫及びリンパ腫から選択される。このような腫瘍の例は、膀胱癌、黒色腫、乳癌、非ホジキンリンパ腫、脳癌、骨癌、結腸及び直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌（非黒色腫）、甲状腺癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌）である。
【００５１】
第七の態様では、本発明は、癌又は腫瘍増殖を抑制するのに十分な量で上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、あるいは上記のような医薬品、又は上記のような医薬組成物を治療を必要とする被験者に投与することを包含する治療方法に関する。
【００５２】
特定の一実施形態では、本発明は、少なくとも1つの他の抗新生物薬又は抗腫瘍薬を投与することをさらに包含する上記のような治療方法に関する。
【００５３】
これらの方法において、投与することは、局所投与、経口投与、静脈内投与又は腹腔内投与を包含する。
【００５４】
第八の態様では、本発明は、癌又は腫瘍増殖を抑制するのに十分である相乗的有効量の以下の：
− 上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、並びに
− シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択されるプラチナ錯体
を治療を必要とする被験者に投与することを包含する治療方法に関する。
【００５５】
一実施形態では、上記のポリペプチド又はその断片及び上記のプラチナ錯体は同時に投与される。
【００５６】
別の実施形態では、上記ポリペプチド又はその断片及び上記プラチナ錯体は逐次的に投与される。好ましくは、上記ポリペプチド又はその断片及び上記プラチナ錯体は、別個の経路により、即ち、経口的に又は非経口的に（静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内等）投与される。
【００５７】
特定の一実施形態では、上記プラチナ錯体はシスプラチンである。
【００５８】
別の特定の実施形態では、上記プラチナ錯体はカルボプラチンである。
【００５９】
以下の非限定実施例に関して本発明をさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明のタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の漸増濃度に伴うin vitroでの内皮細胞増殖の抑制％を示す図である。
【図２】２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｆ、２ｇ、２ｈ及び２ｉは、異なる条件での内皮細胞のin vitro血管新生の写真である： − 図２ａ： 対照（緩衝液尿素 2 M） − 図２ｂ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 6.5 μg/mL（0.27 μM） − 図２ｃ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 13 μg/mL（0.54 μM） − 図２ｄ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 26 μg/mL（1.08 μM） − 図２ｅ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 48 μg/mL（2 μM） − 図２ｆ： ４９７Ｃ−Ｔ３ 51 μg/mL（2.55 μM） − 図２ｇ： ４９７Ｃ−Ｔ４ 55 μg/mL（3.18 μM） − 図２ｈ： ４９７Ｃ−Ｔ５ 56 μg/mL（3.35 μM） − 図２ｉ： Ｃ末端尾部 53 μg/mL（4.14 μM）
【図３】３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇは、異なる条件で実施された内皮細胞に関する創傷検定の写真である： − 図３ｂ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 20 μg/mL（0.83 μM） − 図３ｃ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 40 μg/mL（1.66 μM） − 図３ｄ： ４９７Ｃ−Ｔ３ 48 μg/mL（2.4 μM） − 図３ｅ： ４９７Ｃ−Ｔ４ 60 μg/mL（3.52 μM） − 図３ｆ： ４９７Ｃ−Ｔ５ 61 μg/mL（3.65 μM） − 図３ｇ： Ｃ末端尾部 63 μg/mL（4.92 μM）
【図４】実施例７に従って処置されたマウスの異なる群に関する平均腫瘍容積（mm3）対時間（日）を表すグラフである。
【図５】実施例７に従って処置されたマウスの異なる群に関する平均相対腫瘍容積（単位なし）対時間（日）を表すグラフである。
【図６】実施例８に従って処置されたマウスの異なる群に関する平均腫瘍容積（mm3）対時間（日）を表すグラフである。
【図７】実施例８に従って処置されたマウスの異なる群に関する平均相対腫瘍容積（単位なし）対時間（日）を表すグラフである。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の産生
挿入４９７Ｃ−Ｔ２の合成：
第一に、既知の手順に従って、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔイージー・ベクターシステム（Promega（登録商標））で、遺伝子４９７Ｃをクローン化した（得られたベクターは「ｐＧＥＭ−Ｔ−４９７」と呼ばれた）。
【００６２】
第二に、プラスミド「ｐＧＥＭ−Ｔ−４９７Ｃ」、並びに2つのプライマーＣＤＳ５（配列番号９）及びＣＤＳ４（配列番号１０）（表１）（それぞれ５’及び３’においてＬＥＬドメインを枠にはめる）を用いて、ＰＣＲにより、タンパク質４９７Ｃの細胞外部分ＬＥＬに対応する挿入物Ｔ２（配列番号３）を増幅した。
【００６３】
【表１】
【００６４】
第三に、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２をコードするＤＮＡ配列を、既知の手法に従って、ベクターｐＥＴ−３０ ＥＫ／ＬＩＣ（Novagen（登録商標））中に挿入した（ｐＥＴ−３０−４９７Ｃ−Ｔ２）。ｐＥＴ−３０ベクター内の４９７Ｃ−Ｔ２をコードする核酸配列は、配列番号７で示される。
【００６５】
次に、タンパク質産生のために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ中に精製ベクターを導入した。ベクター及びＰＣＲによる挿入物の両方の存在によって、コロニーを制御した。
【００６６】
産生タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２のサイズは24 kDであり、それは予測サイズより大きかった。これは、シーケンシングにより確証されるように、Ｃ末端での補足的尾部（54無作為アミノ酸）の、並びにＮ末端でのＨｉｓ−Ｔａｇの付加のためであった。産生された場合のタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２のアミノ酸配列は、配列番号８で示される。タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２を細菌の不溶性分画内で産生したが、これは、変性状態での抽出を必要とした。
【００６７】
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の抽出及び精製
培養後、細菌を溶解し、遠心分離し、上清を捨てた。得られた不溶性画分をトリス−ＨＣｌ 20 mM、尿素 8 M、イミダゾール 5 mM、ＮａＣｌ 0.5 M、ＧＳＨ 5 mM、ｐＨ8.0で処理した。この処理後、懸濁液を遠心分離し、上清を収集して、0.45 μm膜上で濾過して、不溶性物質を捨てた。次に、ＨＰＬＣ系（Amersham）に連結されたＨｉｓ−Ｔｒａｐカラム（Amersham（登録商標））を用いることによりタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２を精製するために、濾過抽出物を用いた。
【００６８】
得られた精製タンパク質を、4 M尿素及び0.3 Mイミダゾール中に希釈した。調製物からこれらの作用物質を除去するために、溶液を4℃で透析に付した。
【００６９】
透析のこれらのステップ後、精製タンパク質を15分間4,000×gで遠心分離し、0.45 μm上で濾過して、考え得る沈殿物を排除した。1976年にBradfordにより記載された方法（Anal. Biochem. 72: 248-54）に従って、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質含量に関して精製タンパク質調製物を制御した。Gene Geniusソフトウェアを用いてゲルを分析して、画像分析により純度を定量した。
【００７０】
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の純度を上げるために、イオン交換液体クロマトグラフィーを用いることにより、二次精製ステップを実施した。ＨｉｓＴｒａｐ精製調製物を緩衝液トリス−ＨＣｌ 20 mM、ｐＨ8、2 M尿素で3回希釈し（ＮａＣｌの濃度を50 mMに低減するため）、そしてUnicornソフトウェア（Amersham, GE, Saclay, France）により実行されるＨＰＬＣ系に連結されたモノＳカラム上に載せた。次にカラムを徹底的に洗浄し、イオン力の線形勾配（トリス−ＨＣｌ 20 mM、ｐＨ8、2 M尿素中の0.05 M〜0.5 M ＮａＣｌ）で溶離した。Bradfordにより、並びにそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質含量に関して精製タンパク質調製物を制御した。
【００７１】
（実施例２）
短小化形４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５の設計及び製造
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の活性部位を同定するために、４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５と呼ばれる3つの他の短小化形を、ベクターに由来するＮ末端付着Ｈｉｓ−Ｔａｇ及びＣ末端尾部の両方に対応する対照ポリペプチドと同様に、設計し、製造した。そのようにするために、５’特異的プライマーを設計して、製造された短小化形の精製に必要なＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇに影響を及ぼすことなく、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２のＮ末端配列の漸進的な短小化を可能にする。
【００７２】
４９７Ｃ−Ｔ３
鋳型としてのベクターｐＥＴ３０−４９７Ｃ−Ｔ２、５’特異的プライマー４９７ｃ−ｃｄｓ７（配列番号１１）（ｂドメインのほとんどを排除すること、そして一次Ｃ−Ｃ架橋を保存することを可能にする）、及び３’特異的プライマー４９７Ｃ−ｃｄｓ４（配列番号１０）を用いたＤＮＡのＰＣＲ増幅により、短小化４９７Ｃ−Ｔ３を構築した。
【００７３】
【表２】
【００７４】
４９７Ｃ−Ｔ４
鋳型としてのベクターｐＥＴ３０−４９７Ｃ−Ｔ２、５’特異的プライマー４９７ｃ−ｃｄｓ９（配列番号１２）（一次Ｃ−Ｃ架橋、ｂドメインおよびｃドメインを削除し、ｄ１ドメインを保存することを可能にする）、及び３’特異的プライマー４９７Ｃ−ｃｄｓ４（配列番号１０）を用いたＤＮＡのＰＣＲ増幅により、短小化４９７Ｃ−Ｔ４を構築した。
【００７５】
【表３】
【００７６】
４９７Ｃ−Ｔ５
鋳型としてのベクターｐＥＴ３０−４９７Ｃ−Ｔ２、５’特異的プライマー４９７ｃ−ｃｄｓ１１（配列番号１３）（一次及び二次Ｃ−Ｃ架橋、ｂ、ｃ及びｄ１ドメインを排除すること、そしてｄ２及びｅドメインに対応する線状配列を保存することを可能にする）、並びに３’特異的プライマー４９７Ｃ−ｃｄｓ４（配列番号１０）を用いたＤＮＡのＰＣＲ増幅により、短小化４９７Ｃ−Ｔ４を構築した。
【００７７】
【表４】
【００７８】
Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ及びＣ末端尾部に関して、以下のプライマーを用いて構築物を得たが、これは、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の配列を全体的に排除した。
【００７９】
【表５】
【００８０】
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２に関して記載したように、短小化形４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４、４９７Ｃ−Ｔ５及びＣ末端尾部に対応する増幅産物をクローン化し、製造した。
【００８１】
（実施例３）
in vitroでの４９７Ｃ−Ｔ２による内皮細胞増殖の抑制の試験
細胞培養
37℃で5％ＣＯ２加湿大気中で、完全ＥＧＭ２−ＭＶ培地（Cambrex）中で、ＨＵＶＥＣ細胞をコンフルエントに培養した。次に、トリプシン−ＥＤＴＡ消化（Versen, Eurobio）により、細胞を収集した。5分後、5％ＦＣＳを含有する培地3 mlを添加することにより、酵素反応を停止した。次に、細胞を室温で10分間、220gで遠心分離し、5 mlの培地で2回洗浄し、完全培地中に懸濁し、計数して、50000細胞／mlに調整した。次に100 μL／ウエルを９６ウエル細胞培養マイクロプレートに配分して（5 000細胞／ウエル）、150 mMＮａＣｌ及び尿素2 Mを含有するトリス−ＨＣｌ 20 mM緩衝液（ｐＨ8）中の異なる濃度の精製タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２とともにインキュベートした；この緩衝液を対照として用いた。
【００８２】
37℃で42時間後、チアゾリルブルー・テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）法を用いて細胞増殖を測定した。要するに、ＭＴＴ（Sigma）を5 mg/mlでPＢＳ中に溶解し、溶液を濾過（0.22 μm）して、10 μlを９６ウエル・マイクロプレートの各ウエルに添加した。37℃、5％ＣＯ２加湿大気で3時間のインキュベーション後、マイクロプレートを220×gで10分間遠心分離し、上清を捨てて、100μlのＤＭＳＯを各ウエルに添加することにより結晶を溶解した。次に、ＫＣ４（Bio-Tek）ソフトウエアに接続されたμQuant マイクロプレート・リーダー（Bio-Tek Instrument gmbh, Colmar, France）を用いて、570 nmでの光学濃度（ＯＤ）を測定した。ブランク・ウエルＯＤ値（細胞を有さないウエルから得られた値）を差し引くことによりＯＤを補正し、細胞増殖の抑制を対照（最大増殖応答、即ち100％を表す未処理ＨＵＶＥＣを有するウエルから得られたＯＤ）と比較して測定した。
【００８３】
図１に示したように、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２は、用量依存的にヒト内皮細胞増殖を抑制した。この抑制は、122 μｇ（即ち5 μM）のタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２で77％を示した。
【００８４】
（実施例４）
４９７Ｃ−Ｔ２、４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５によるin vitro血管新生の抑制
精製タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２、４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５を、マトリゲル上のＦＧＦ２及びＶＥＧＦにより誘導されるＨＵＶＥＣの血管新生に関してin vitroで試験した。
【００８５】
24ウエルプレートを240 μLのＢＤマトリゲル（商標）／ウエルで調製し、次にインキュベータ中で30分間インキュベートした。次にＨＵＶＥＣ細胞を実施例３に記載されたように調製し、そしてウエル当たり70 000個の細胞を植え付けて、150mMＮａＣｌ及び尿素2 Mを含有するトリス−ＨＣｌ 20 mM緩衝液（ｐＨ8）中の異なる濃度の精製タンパク質４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４又は４９７Ｃ−Ｔ５とともにインキュベートした；この緩衝液を対照として用いた：
− 図２ａ： 対照（緩衝液尿素 2 M）
− 図２ｂ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 6.5 μg/mL（0.27 μM）
− 図２ｃ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 13 μg/mL（0.54 μM）
− 図２ｄ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 26 μg/mL（1.08 μM）
− 図２ｅ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 48 μg/mL（2 μM）
− 図２ｆ： ４９７Ｃ−Ｔ３ 51 μg/mL（2.55 μM）
− 図２ｇ： ４９７Ｃ−Ｔ４ 55 μg/mL（3.18 μM）
− 図２ｈ： ４９７Ｃ−Ｔ５ 56 μg/mL（3.35 μM）
− 図２ｉ： Ｃ末端尾部 53 μg/mL（4.14 μM）
【００８６】
図２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅに示したように、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２は用量依存的にin vitro血管新生を抑制した。
【００８７】
さらに、図２ｆ、２ｇ及び２ｈに示したように、短小化形４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５は異なるレベルの活性を示した：４９７Ｃ−Ｔ３（図２ｆ）及び４９７Ｃ−Ｔ４（図２ｇ）は抗血管新生活性に関して４９７Ｃ−Ｔ２とほぼ同じく効率的であったが、これは、ａ、ｂ及びｃＬＥＬドメインがタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の抗血管新生活性に必要というわけではない、ということを示唆する。これに反して、４９７Ｃ−Ｔ５（図２ｈ）は残りの抑制活性のみを示し、一方、Ｃ末端尾部は全体的に不活性であった（図２ｉ）。
【００８８】
（実施例５）
４９７Ｃ−Ｔ２、４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５によるヒト内皮細胞の遊走の抑制
Sato and Rifkin(J Cell Biol. 1988; 107: 1199)により記載された創傷アッセイにより（多少の修正を加えて）、細胞遊走を試験した。増殖培地ＥＧＭ−２ＭＶ（Cambrex）中で増殖させたＨＵＶＥＣを、500μLの増殖培地中で80 000細胞／ウエルで24−ウエルプレート中に植え付けて、5％ＣＯ２を含有する加湿大気中で37℃でコンフルエントに増殖させた。細胞を、1列だけプラスチック先端で掻き取った。傷をつけた後、培地を新しい培地（対照、図３ａ）、又は以下のものを添加した新鮮な培地と取り替えた：
− 図３ｂ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 20 μg/mL（0.83 μM）
− 図３ｃ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 40 μg/mL（1.66 μM）
− 図３ｄ： ４９７Ｃ−Ｔ３ 48 μg/mL（2.4 μM）
− 図３ｅ： ４９７Ｃ−Ｔ４ 60 μg/mL（3.52 μM）
− 図３ｆ： ４９７Ｃ−Ｔ５ 61 μg/mL（3.65 μM）
− 図３ｇ： Ｃ末端尾部 63 μg/mL（4.92 μM）。
【００８９】
18時間の培養後、細胞を倒立顕微鏡下で観察し、写真撮影した（Analysis, Olympus, Rungis, France）。
【００９０】
図３ｂ及び３ｃに示したように、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２は、用量依存的にヒト内皮細胞の遊走を抑制した。
【００９１】
さらに、図３ｄ、３ｄ、３ｅ及び３ｆに示したように、短小化形４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５は異なるレベルの活性を示した。短小化形４９７Ｃ−Ｔ３はタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２と同様に細胞遊走を抑制した（図３ｄ）。これに反して、短小化形４９７Ｃ−Ｔ４（図３ｅ）は４９７Ｃ−Ｔ２より低活性であり、４９７Ｃ−Ｔ５（図３ｆ）は非常に限定された抗遊走活性を示し、そしてＣ末端尾部（図３ｇ）は全体的に不活性であった。したがってこれらの結果は、ａ及びｂＬＥＬドメインがタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の抗遊走活性に必要でない、ということを示唆した。
【００９２】
（実施例６）
腫瘍試料におけるタンパク質４９７Ｃの発現
多数の異なるヒト腫瘍試料を、遺伝子４９７Ｃの発現に関してスクリーニングした。各病理試料に関して、腫瘍の周辺部を腫瘍の中心部から分離し、そしてこれら2つの領域における遺伝子４９７Ｃの発現を、ｍＲＮＡ抽出とその後のＲＴ−ＰＣＲ後に比較した。
【００９３】
腎臓腫瘍試料
腎臓腫瘍からの19の病理学生検材料を分析した。19例の患者のうち13例では、４９７Ｃの発現は、腫瘍の周辺部より中心部においてより高かった。
【００９４】
肺腫瘍試料
ヒト肺腫瘍からの40の病理生検材料を分析した。40例の患者のうち37例では、４９７Ｃの発現は、腫瘍の中心部より周辺部においてより高かった。腫瘍の周辺部での４９７Ｃの発現のレベルと患者のnod状態（即ち、転移可能性）との間の密接な関係も認められた。試料の解剖学的検査は、腫瘍の周辺部は腫瘍の中心部より多く血管新生が起こる（概して肺癌に関して確立されているように）、ということも明示した。
【００９５】
ヒト結腸腫瘍からの33の病理生検材料を分析した。33例の患者のうち25例では、４９７Ｃの発現は、腫瘍の中心部より周辺部においてより高かった。
【００９６】
（実施例７）
in vivoでのスイス・ヌードマウスにおけるＮＣＩ Ｈ４６０ヒト腫瘍に関する４９７Ｃ−Ｔ２の試験
ＮＣＩ Ｈ４６０細胞の調製
4.5 g/Lグルコースに調整し（Ref. G7528、バッチ番号003K0121、Sigma, France）、10 mM ＨＥＰＥＳ（Ref. H0887、バッチ番号113K2338、Sigma, France）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（Ref. CSTVAT00-0U、バッチ番号520818、Sigma, France）及び10％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ref. CVFSVF00-01、バッチ番号S13021、Eurobio, France）を添加した2 mM Ｌ−グルタミンを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地（Ref. CM1RPM08-01、バッチ番号623615、 Eurobio, France）中で、37℃、5％ＣＯ２加湿大気下で、接着細胞としてＮＣＩ Ｈ４６０細胞を培養した。それらを、90×106細胞に到達するよう75 cm2フラスコ中で増幅した。
【００９７】
0日目に、培地を除去し、3 mlのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ref. CEZTDA00-0U、バッチ番号633920、Eurobio, France）を添加することにより、75cm2フラスコからＮＣＩ Ｈ４６０細胞（ヒト肺癌）を収集した。37℃で5分のインキュベーション後、細胞をプラスチックから剥がして、そして10％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地 3 mlを添加することにより、酵素反応を停止した。次に、細胞を、室温で5分間、700 gで遠心分離した。それらを、Ｌ−グルタミン（2 mM）、グルコース（4.5 g/l）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）を含有し、ＨＥＰＥＳ（10 mM）で緩衝した無血清ＲＰＭＩ １６４０培地中に再懸濁した。細胞を計数し、生育可能なＮＣＩ Ｈ４６０細胞の数は、＞99％であった。次に細胞の数を、無血清培地中で25.106細胞／mlに調整した。
【００９８】
腫瘍誘導
ケタミン−キシラジン（80 mg/kg〜12 mg/kg；Ref. K-113、Sigma, France）の腹腔内注射により、30匹の健常雌スイス・ヌードマウスを麻酔した。次にＮＣＩ Ｈ４６０細胞（無血清培地200 μL中5.106細胞／マウス）を、各マウスの右脇腹に皮下移植した。
【００９９】
処置日程
ＮＣＩ Ｈ４６０細胞の移植後12日目に、30匹のマウスを無作為に6つの群（各々5匹）に分けた。腫瘍容積は228〜468 mm3に達し、平均腫瘍容積は無作為に分けられた群間で統計学的に異ならなかった。
【０１００】
処置日程（12日目に開始し、28日目に終了する）は、表６に要約されている：
− 群１の動物を、ビヒクル溶液（バッチＣ）で処置する：トリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5、2 M 尿素、150 mM ＮａＣｌ、0.1 mM ＣａＣｌ２、
− 群２の動物を、生理学的血清0.5 ml/mL（ＣＤＤＰ、シス−ジアミンプラチナ（ＩＩ）二塩化物、Ref. P4394、バッチ番号014K0993、Sigma, France、純度100％、分子量300）中のシスプラチンの溶液で処置する、
− 群３及び４の動物を、1 mg/mLの試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクル溶液（バッチＡ）で処置する、
− 群５の動物を、1 mg/mLの試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクル溶液（バッチＡ）で処置し、さらにＣＤＤＰを施す、
− 群６の動物を、1.8 mg/mLの試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクル溶液（バッチＢ）で処置し、さらにＣＤＤＰを施す。
【０１０１】
溶液は全て、腹腔内に注射した。群１、２、３、５及び６における注射は、日程Ｑ２ＤＸ８に従って、即ち、2日毎に1用量を8回、実施した。群４における注射は、日程Ｑ１ＤＸ１６に従って、即ち、毎日1用量を、16回、実施した。
【０１０２】
ＣＤＤＰを、0.5 mg/mLの濃度で滅菌生理学的血清中に再懸濁し、処置日程Ｑ２ＤＸ８に従って、10 mL/kgの容積で、5 mg/kgの濃度で腹腔内注射した。
【０１０３】
注射後2時間、マウスを観察した。ケタミン／キシラジン（80mg/kg〜12 mg/kg；Ref. K-113、Sigma, France）を用いて動物を麻酔した後、頚椎脱臼により屠殺した。
【０１０４】
マウスのモニタリング
動物を毎日観察した。動物行動における変容を、実験ノートに記録した。体重及び腫瘍容積を、2日毎に、実験終了まで報告した。
【０１０５】
以下に略記するデータを算定した：
− 腫瘍増殖曲線を、平均腫瘍容積（ＭＴＶ）を用いて描いた。
− 平均相対腫瘍容積（ＭＲＴＶ）を、時間ｔでのＭＴＶと注射時（ｔ＝12日目）の容積との間の比として算定した。
− 腫瘍増殖抑制（Ｔ／Ｃ、％）を、処置群対ビヒクル群の腫瘍容積の中央値の比として評価した。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
統計学的試験
腫瘍容積（Ｖ）、「Ｖ」に到達する時間、腫瘍倍加時間（ＤＴ）、相対腫瘍容積（ＲＴＶ）及び腫瘍増殖抑制（Ｔ／Ｃ）の統計学的分析を、全ての群に関して実施した。データは、平均±ＳＤとして表される。データ群は、正規に分布された。一変量分析を実施して、群間の差を査定した。次に、スチューデントｔ検定を用いて、統計学的有意を確定した。ｐ＜0.05は、統計学的に有意であるとみなされた。ＸＬＳＴＡＴ（Addinsoft, France）を用いて、統計学的分析を実施した。
【０１０９】
体重モニタリング
表７に示したように、ビヒクルは体重に影響を及ぼさなかった：マウスの行動及び体重増加は正常で、早期に死亡した動物はいなかった。試験した両方の用量（10及び18 mg/kg）での試験物質４９７Ｃ−Ｔ２による処置の経過中に、毒性は観察されなかった。それに対比して、ＣＤＤＰで処置した群２、５及び６では、重要な毒性を観察した（−12〜−18％の体重減；ｐ＜0.05）。
【０１１０】
平均腫瘍容積（ＭＴＶ）、平均相対腫瘍容積（ＭＲＴＶ）、腫瘍容積及び腫瘍増殖パラメーターの結果を、図４、５に並びに表８及び表９に示す。
【０１１１】
表８に示すように、ＭＴＶは、ビヒクル群１のマウス（4441±1135 mm3）と比較して、ＣＤＤＰで処置した群２のマウスでは28日目に低減された（1440±1097 mm3）。ＭＴＶは、28日目には、それぞれ1回注射／日（2482±2075 mm3）及び1回注射／1日置き（3167±1681 mm3）で、10 mg/kgで試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を用いて処置した群３及び４においても低減された。群１のビヒクル処置動物（4441±1135 mm3）と比較して、群５（807±692 mm3）及び群６（639±416 mm3）からの動物において、ＭＴＶの顕著な低減が観察された。
【０１１２】
腫瘍増殖抑制の一パラメーターであるＴ／Ｃ比は、28日目の群２からのマウスでは32％を示したが、これは、ビヒクル処置群１と比較した場合にＣＤＤＰが腫瘍サイズを68％低減するということを実証する。Ｔ／Ｃは、群３からのマウスでは56％、群４からのマウスでは71％であったが、これは、単剤療法として用いられた場合、試験物質の中等度の抗腫瘍活性を明示する。しかしながらＣＤＤＰと併用した場合、Ｔ／Ｃは、群５及び６からのマウスでは、それぞれ18％及び14％に低下した。これは、細胞傷害剤、例えばＣＤＤＰと併用した場合、４９７Ｃ−Ｔ２が強力な抗腫瘍活性を有する、ということを実証する。
【０１１３】
腫瘍サイズ倍加時間（ＤＴ）は、ビヒクル処置群１では1.23±0.49日であった。ＤＴは、ＣＤＤＰ単独で処置した群２のマウスでは4倍に増大した（5.12±2.89日）。群３及び４に関しては、ＤＴ（それぞれ4.08±1.4及び5.9±1.21日）は、群２と同様であった。これは、４９７Ｃ−Ｔ２が、単剤療法として用いられた場合に腫瘍活性を低減するのに、ＣＤＤＰと同じくらい強力である、ということを示す。しかし最も重要なのは、４９７Ｃ−Ｔ２及びＣＤＤＰを用いる二剤療法は、ビヒクル処置郡１からのマウスで測定されたＤＴと比較して、群５及び６（それぞれ25.02±29.89及び20.07±9.28）からの動物ではＤＴが20倍に増大したことである。これは、単独で又はＣＤＤＰと組合せて用いられる場合、試験物質４９７Ｃ−Ｔ２の強力な抗腫瘍活性をさらに確証する。
【０１１４】
表９に示すように、ＭＲＴＶ測定は、群６の動物が、試験した両方の濃度で（群５、６）、腫瘍容積の最も強い減少を示す、ということを確証した。４９７Ｃ−Ｔ２単独での処置は、28日目に、7.37（群３）又は6.76（群４）のＭＲＴＶをもたらし、そしてシスプラチンによる処置は、4.88（群２）のＭＲＴＶをもたらした。
【０１１５】
これらの結果はすべて、４９７Ｃ−Ｔ２が、単独で又はシスプラチンとの相乗的組合せで用いられる強力な抗腫瘍剤である、ということを確証する。
【０１１６】
（実施例８）
in vivoでのスイス・ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌（ＣＡＬＵ−６）異種移植片モデルに関する４９７Ｃ−Ｔ２の試験
ＣＡＬＵ−６細胞の調製
完全ＥＭＥＭ培地（Ref. CM1RPM18-01、バッチ番号462502、 Eurobio, France）10％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ref. CVFSVF00-01、バッチ番号S13021、Eurobio, France）中で、37℃、5％ＣＯ２加湿大気下で、接着細胞としてＣＡＬＵ−６細胞を培養した。それらを、90×106細胞に到達するよう75 cm2フラスコ中で増幅した。
【０１１７】
0日目に、培地を除去し、3 mlのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ref.
CEZTDA00-0U、バッチ番号633920、Eurobio, France）を添加することにより、75cm2フラスコからＣＡＬＵ−６細胞（ヒト肺癌）を収集した。37℃で5分のインキュベーション後、細胞をプラスチックから剥がして、そして10％ウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地 3 mlを添加することにより、酵素反応を停止した。次に、細胞を、室温で5分間、700 gで遠心分離した。それらを、無血清ＥＭＥＭ培地中に再懸濁した。細胞を計数し、トリパンブルー排除により生育可能性を査定した（Ref. CSTCOL03-0U、バッチ番号434511、 Eurobio, France）。ＣＡＬＵ−６細胞の数は、＞99％であった。次に細胞の数を、無血清培地中で25×106細胞／mlに調整した。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
腫瘍誘導
ケタミン−キシラジン（80 mg/kg〜12 mg/kg；Ref. K-113、Sigma, France）の腹腔内注射により、30匹の健常雌スイス・ヌードマウスを麻酔した。次にＣＡＬＵ−６細胞（無血清培地200 μL中5×106細胞／マウス）を、各マウスの右脇腹に皮下移植した。移植後2時間、マウスを観察した。
【０１２１】
処置日程
ＣＡＬＵ−６細胞の移植後12日目に、30匹のマウスを無作為に6つの群（各々5匹）に分けた。腫瘍容積は228〜468 mm3に達し、平均腫瘍容積は無作為に分けられた群間で統計学的に異ならなかった。
【０１２２】
処置日程（12日目に開始し、28日目に終了する）は、表１０に要約されている。
− 群１の動物を、ビヒクル溶液（トリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5、2 M 尿素、150 mM ＮａＣｌ、0.1 mM ＣａＣｌ２）（バッチＣ）で処置する、
− 群２の動物を、生理学的血清0.5 ml/mL（ＣＤＤＰ、シス−ジアミンプラチナ（ＩＩ）二塩化物、Ref. P4394、バッチ番号014K0993、Sigma, France、純度100％、分子量300）中のシスプラチンの溶液で処置する、
− 群３の動物を、10 mg/mLの用量で試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクルで処置する、
− 群４の動物を、10 mg/mLの用量で試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクルで処置し、さらにＣＤＤＰを施す。
【０１２３】
群１、２、３及び４における注射は、日程Ｑ２ＤＸ８に従って、即ち、2日毎に1用量を8回、実施した。
【０１２４】
ＣＤＤＰを、0.5 mg/mLの濃度で滅菌生理学的血清中に再懸濁し、処置日程Ｑ２ＤＸ８に従って、10 mL/kgの容積で、5 mg/kgの濃度で腹腔内注射した。
【０１２５】
注射後2時間、マウスを観察した。ケタミン／キシラジン（80
mg/kg〜12 mg/kg；Ref. K-113、Sigma, France）を用いて動物を麻酔した後、頚椎脱臼により屠殺した。全動物に関して、カリパスを用いて週2回、腫瘍サイズを測定した。式:（長さ×幅２）／２（４）に従って、腫瘍容積（mm3）を測定した。
【０１２６】
統計学的試験
平均腫瘍容積（ＭＴＶ）、平均相対腫瘍容積（ＭＲＴＶ）及び腫瘍増殖抑制（Ｔ／Ｃ）を、実施例７に関するものと同様に算定した。
【０１２７】
体重
表１１に示したように、ビヒクルは影響を及ぼさなかった：マウスの行動及び体重増加は正常で、早期に死亡した動物はいなかった（群１のマウス５を除く）。10 mg/kgの用量での試験物質４９７Ｃ−Ｔ２による処置の経過中に、毒性は観察されず、わずかな体重増加が観察された（＋1.44 g）。
【０１２８】
それに対比して、ＣＤＤＰで処置した群２、４において、重要な毒性が観察された（それぞれ12.6％及び8.7％の体重減少）。群１対２及び４と群３対２及び４の間の差は、統計学的に有意であった（ｐ＜0.0001）が、しかし群２及び４間の差は統計学的に有意でなかった。
【０１２９】
【表１０】
【０１３０】
【表１１】
【０１３１】
平均腫瘍容積（ＭＴＶ）、平均相対腫瘍容積（ＭＲＴＶ）、腫瘍容積及び腫瘍増殖パラメーターの結果を、図６、７に並びに表１２及び１３に示す。
【０１３２】
ＭＴＶは、ビヒクル群１のマウス（1 233.44±663.82 mm3）と比較して、ＣＤＤＰで処置した群２のマウスでは28日目に低減された（742.44±215.85 mm3）。ＭＴＶは、28日目には、1回注射／2日（813.70±439.00 mm3）で、10 mg/kgで試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を用いて処置した群３においても低減された。これらの結果を、28日目のＭＲＴＶの分析により確証した（表１３）。群１のビヒクル処置動物（1 233.44±663.82 mm3）と比較して、群４（430.89±290.89 mm3）からの動物において、ＭＴＶの顕著な低減が観察された。
【０１３３】
試験物質で処置した群１及び群２間の差は、統計学的有意に達する（ｐ＜0.0001対4、ｐ＝0.003対3）。群２及び４間の差も有意であった（ｐ＝0.001）。これに対比して、群２（ＣＤＤＰ単独）及び群３（４９７Ｃ−Ｔ２単独）間に統計学的差は観察されなかった。群１及び処置群間の最初に統計学的有意は、群３に関しては22日目に、群４に関しては20日目にそれぞれ観察された。28日目のＭＲＴＶの分析により、これらの結果を確証した（表１３）。群１のビヒクル処置動物（1 233.44±663.82 mm3）と比較して、群４（430.89±290.89 mm3）からの動物において、ＭＴＶの重要な低減が観察された。
【０１３４】
【表１２】
【０１３５】
腫瘍増殖抑制の一パラメーターであるＴ／Ｃ比（表１２）は、ビヒクル処置群１と比較してそれは腫瘍サイズを27％低減するので、単剤療法として用いた場合、試験物質のわずかな抗腫瘍活性を明示する。しかしながら、ＣＤＤＰと併用した場合、抑制率は、ビヒクル処置群１に比して腫瘍サイズの64％低減に達する。これらの結果は、細胞傷害剤、例えばＣＤＤＰと併用して用いた場合、４９７Ｃ−Ｔ２が強力な抗腫瘍活性を有する、ということを直接的に実証する。
【０１３６】
【表１３】
【０１３７】
図１３に示したように、ＭＲＴＶは、郡４の動物に関して、28日目に2.96に達したが、これは、シスプラチンとの４９７Ｃ−Ｔ２の相乗効果を確証する。さらに単独で用いられるシスプラチン（群２）又は単独で用いられる４９７Ｃ−Ｔ２（群３）は28日目で非常に近いＭＲＴＶを示したが、これは、４９７Ｃ−Ｔ２が強力な単剤療法抗腫瘍剤でもある、ということを示唆する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌のための治療の分野に関する。さらに特定的には、本発明は、テトラスパニン・スーパーファミリーに属するタンパク質由来のポリペプチドによる癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、細胞の非制御分裂、並びに侵襲による隣接組織中への直接増殖により、又は転移による遠位部位への移植により（この場合、癌細胞は血流又はリンパ系を介して運搬される）広がるこれらの細胞の能力により特性化される疾患又は障害の一クラスである。癌は全ての年齢の人々に影響を及ぼし得るが、しかし危険は年齢に伴って増大する傾向がある。それは、先進国における死亡の主因の1つである。
【０００３】
多数の型の癌が存在する。症候の重症度は、悪性疾患の部位及び特質に、そして転移が存在するか否かによっている。一旦診断されると、癌は通常は、外科手術、化学療法及び放射線療法の組合せで治療される。研究が発展するにつれて、治療は癌病態の型により特異的になりつつある。特定の癌を標的にする薬は、いくつかの癌に関してはすでに存在する。治療されない場合、癌は最終的には疾病及び死を引き起こすが、しかしこれはいつもそうであるわけではない。
【０００４】
最新治療は、悪性細胞の別個の特性、例えばアポトーシスの回避、テロメラーゼの過多のための無限増殖能力（不死化）、増殖因子の自給自足性、抗増殖因子に対する非感受性、細胞分裂速度の増大、分化能力変更、接触抑制に関する無能力、隣接組織を侵襲する能力、遠位部位に転移を形成する能力、血管成長（血管新生）を促進する能力を標的にする。
【０００５】
腫瘍血管新生は、腫瘍中に貫入して、栄養素及び酸素を供給し、そして老廃物を除去する血管の網状構造の増殖である。腫瘍血管新生は、実際は、周囲の正常な宿主組織にシグナルを送る分子を放出する癌性腫瘍細胞をもって開始する。このシグナル伝達は、宿主組織中のある種の遺伝子を活性化し、これが順次、新規血管の成長を促進させるタンパク質を生成する。固形腫瘍は、それらの増殖のために必要な栄養素及び酸素を得るために、新規血管の形成を促進しなければならず、したがって腫瘍が遠位部位に転移し得る経路を提供する。
【０００６】
実験的証拠は、種々の因子、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、腫瘍壊死増殖因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、並びに多数のその他のもの（Liotta et al., 1991, Cell 64: 327-336；Hanahan et al., Cell 86: 353-364）の生成により悪性腫瘍が血管新生を誘導し得る、ということを示唆している。
【０００７】
今日では、血管新生をターゲッティングする多数の化学療法分子が市販されている。良く知られた天然血管新生阻害剤は、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、血小板因子４、プロラクチン16 Kd断片、トロンボスポンジン、ＴＩＭＰ−１（メタロプロテアーゼ−1の組織阻害剤）、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−３である。これらの分子は、化学療法的治療薬として、並びにその他の薬剤、例えばコンブレスタチンＡ４、ＥＭＤ121974、ＴＮＰ−４７０、スクアラミン、サリドマイド、インターフェロン−アルファ、抗ＶＥＧＦ、抗体として用いられ得る。しかしながら、それらの効率は決して十分でなく、代替的治療が望ましい。
【０００８】
したがって、効率増大を示し、低侵襲性又は低毒性であり、そして回復率増大を生じる、腫瘍の治療のための代替的化学療法薬が必要とされている。
【０００９】
WO 03/074073（出願人名で）は、血管新生の調節に関与する54遺伝子の一ファミリーを記載する。これらの遺伝子の中で、「タンパク質４９７」をコードする「遺伝子４９７」（本明細書中では配列番号２）（WO 03/074073においてはＴＭ４ＳＦ２とも呼ばれる）は、血管新生の活性化（血管新生促進性）において暗示されるとして記載されている。遺伝子497の発現は、血管新生が血管新生促進因子、例えばＶＥＧＦ及びＦＧＦ2により刺激されると、増強される。WO03/074073は、ヒト内皮細胞における遺伝子４９７のアンチセンスの発現、即ち、遺伝子４９７の発現の抑制が毛細管の形成を抑制する、ということも記載する。
【００１０】
バイオインフォマティクス分析は、244のアミノ酸を含むタンパク質４９７Ｃが1つの細胞外ループＳＥＬ（小細胞外ループ）、1つの細胞外ループＬＥＬ（大細胞外ループ）、4つの膜貫通スパン、及びＮ−及びＣ末端に対応する2つの細胞内尾部を含有する、ということを明示した。したがってこのタンパク質は、テトラスパニン・スーパーファミリーの一メンバーとして分類されている（Levy et al., Nat Rev Immunol. 2005 Feb; 5(2):
136-48）。
【００１１】
テトラスパニンは、広範囲の生物体において発現される進化的に保存された細胞表面タンパク質の大ファミリーである。このファミリーのメンバーは、細胞内シグナル伝達成分への外部刺激の伝達のための足場を提供する膜マイクロドメインにおいて、それらの相手と一緒に、互いに関連する傾向がある。基本的には、テトラスパニンは、保存された極性残基を含有し、小及び大細胞外ループ（それぞれＳＥＬ及びＬＥＬ）の側面に位置する4つの膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む。ＬＥＬは、らせんａ、ｂ及びｅにより形成されるコアからなり、このコア構造はテトラスパニンの間で保存される。らせんｃ及びｄはＬＥＬの可変部分を含み、そしてそれらはＣＣＧモチーフを側面に置かれ、システイン残基をさらに保存される。この領域は、ジスルフィド架橋の結果として折りたたまれて、マッシュルーム様構造を形成する。
【００１２】
このスーパーファミリーのメンバーは、ＬＥＬドメイン中に存在するシステイン残基の数に基づいて、3つの群に分類されている。群１はＬＥＬドメイン中に4つのシステインを含有し、群２はＬＥＬドメイン中に6つのシステインを含有し、そして群３はＬＥＬドメイン中に8つのシステインを含有する。
【００１３】
タンパク質４９７ＣはそのＬＥＬドメイン内に6つのシステインを含有するため、それはしたがって、このファミリーの別のメンバーであるタンパク質ＣＤ１５１と同様に、群２に分類され得た。これらのタンパク質のＬＥＬドメインは、6つのドメイン:ａ、ｂ、ｃ、ｄ１、ｄ２及びｅを含み、これらの中で、ｄ１、ｄ２及びｃはＬＥＬの可変部分に存する。
【００１４】
さらに深く研究して、本発明人等は、タンパク質497Ｃの細胞外ドメインＳＥＬ及びＬＥＬの種々の断片に対応するタンパク質４９７Ｃの短小化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形を作り出した:
− ４９７Ｃ−Ｔ２： 本明細書における配列番号３により同定されるタンパク質４９７Ｃの全ＬＥＬドメイン（112アミノ酸）；
− ４９７Ｃ−Ｔ３： 本明細書における配列番号４により同定されるＬＥＬドメインのｃ、ｄ１、ｄ２及びｅドメイン（74アミノ酸）；
− ４９７Ｃ−Ｔ４： 本明細書における配列番号５により同定されるＬＥＬドメインのｄ１、ｄ２及びｅドメイン（49アミノ酸）；
− ４９７Ｃ−Ｔ５： 本明細書における配列番号６により同定されるＬＥＬドメインのｄ２及びｅドメイン（43アミノ酸）；
【００１５】
これらの断片の三次元立体配置、即ちＬＥＬドメインの三次元立体配座を、したがってそれらの潜在的活性を確証するために、本発明人等は、一実施形態によって、断片のＣ末端に尾部を付加した。この尾部は、30〜70アミノ酸、好ましくは45〜65アミノ酸、さらに好ましくは50〜60アミノ酸、さらに好ましくは約55アミノ酸で構成された。この尾部はそれ自体活性を有さず、その推定される役割は、ＬＥＬ断片の三次元構造を安定化すること、即ち、生物学的活性形態で折りたたまれたポリペプチドを保持することである。
【００１６】
第一の実施形態において、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２が用量依存的にin vitroでヒト内皮細胞増殖を抑制し得る、ということを本発明人等は見出した。
【００１７】
次に、第二の実施形態では、短小化形のタンパク質４９７Ｃが用量依存的にin vitroで毛細管形成を抑制するための強力な活性を有し得る、ということを本発明人等は意外にも見出した。
【００１８】
本発明人等により実行された他の実施形態は、短小化形のタンパク質４９７Ｃが用量依存的にin vitroで内皮細胞の遊走の抑制を誘導する、ということを示した。４９７Ｃ−Ｔ２による血管新生の抑制に関する用量反応研究の結果は、270 nMでは、組換えタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２は小抑制を誘導するが、一方、540 nMでは、４９７Ｃ−Ｔ２はin vitroでの血管新生を50％より多く抑制し得る（即ち、ＩＣ５０＜540 nM）、ということを明示した。これは、組換えタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２が強力な抗血管新生化合物であるということを、そしてそれが抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ及び／又はＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ）ベースの同定されたペプチドより少なくとも200倍以上強力であり得る、ということを実証した（Binetruy-Tournaire R et al., Identification of a peptides blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis, EMBO J. 2000; 19: 1525-1533）。
【００１９】
毛細管形成、ヒト内皮細胞増殖及びヒト内皮細胞遊走は、血管新生の3つの必須ステップである。その結果として、４９７Ｃ−Ｔ２が用量依存的に毛細管形成、ヒト内皮細胞増殖及び／叉は遊走をin vitroで抑制し得るという事実は、したがって、短小化形のタンパク質４９７Ｃの強力な抗血管新生活性の強固な証拠を構成した。
【００２０】
ネイティブタンパク質４９７Ｃは血管新生促進性があるとして、そしてヒト内皮細胞における遺伝子４９７のアンチセンスの発現、即ち、遺伝子４９７の抑制が毛細管の形成を抑制すると開示されているため、これらの結果は全て、全く予測されなかった。したがって、短小化形のタンパク質４９７Ｃが抗血管新生活性を有するということは、本当に意外であった。
【００２１】
さらに、高濃度でも如何なる検出可能な抗増殖作用も伴わない多数の細胞株、例えば繊維芽細胞株ＭＲＣ５、ＣＨＯ、腫瘍細胞株Ｃａｌｕ−６、ＮＣＩ−Ｈ４６０等の増殖に及ぼす４９７Ｃ−Ｔ２の作用を、本発明人等は試験した。それに反して、４９７Ｃ−Ｔ２は、500 nMという低い濃度に関してヒト内皮細胞増殖を有意に抑制し、5 μMで75％抑制を達成した。それゆえ、今日利用可能な抗ＶＥＧＦ療法的戦略より強力であるということのほかに、４９７Ｃ−Ｔ２は内皮細胞に対して高特異性である。
【００２２】
興味深いことに、ａ及びｂドメインを欠く短小化形４９７Ｃ−Ｔ３は血管新生及び細胞遊走の抑制に関して４９７Ｃ−Ｔ２と比べてほぼ同じくらい強力であるということを本発明人等は見出したが、これは、ａ及びｂドメインは４９７Ｃ−Ｔ２の生物学的活性に、及び／又は生物学的活性に必要な三次元立体配座にわずかに寄与するだけである、ということを示す。短小化形４９７Ｃ−Ｔ４（ａ、ｂ及びｃドメインを欠く）及び４９７Ｃ−Ｔ５（ａ、ｂ、ｃ及びｄ１ドメインを欠く）は４９７Ｃ−Ｔ２に比して限定された活性を有したが、これは、ｃ及びｄ１ドメインがともにタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の活性に必要である、ということを示す。
【００２３】
これらの結果も予測されなかったことであり、in vivoでのマウスにおける４９７Ｃ−Ｔ２の抗腫瘍活性を本発明人等に試験させた。
【００２４】
さらに意外なことに、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２がin vivoでの強力な抗腫瘍活性を、そして他の化学療法薬、例えばシスプラチンと組合せて強力な相乗活性を有する、ということを本発明人等は見出した。
【００２５】
試験物質４９７Ｃ−Ｔ２は、異なる試験用量でヒトＮＣＩ Ｈ４６０又はＣＡＬＵ−６腫瘍を保有するヌードマウスにおいて有毒でない、ということを本発明人等は見出した。さらに、４９７Ｃ−Ｔ２は、治療（ＣＤＤＰと組合せた二次ＩＰ注射）の開始後2日という早期に、ＮＣＩ Ｈ４６０及びＣＡＬＵ−６腫瘍に対する強力な統計学的に有意の抗腫瘍活性を示した。この抗腫瘍活性は、治療期間中、持続した。ヒト肺癌のこのモデルにおける４９７Ｃ−Ｔ２の抗腫瘍作用は、単剤療法としての現実的療法的アプローチを表した。その効能は、腫瘍増殖を抑制する細胞傷害性抗癌薬ＣＤＤＰ（シスプラチン）と組合された場合、強く高められた。他方で、シスプラチン単独は、腫瘍増殖を根絶しなかった。
【００２６】
４９７Ｃ−Ｔ２の抗血管新生活性が単にその抗腫瘍活性の原因であるか否かは明らかでない。生物学的化合物、例えばインターフェロン、ＥＧＦ及びＨｅｒ−２受容体アンタゴニストは、宿主応答を調整し、そして標準化学療法の効力を増強し得る、ということが目下、是認されている。４９７Ｃ−Ｔ２は一次抗腫瘍薬として、又は癌の治療のための一次細胞傷害性薬への追加的な相乗療法として用いるためのものであり得る、ということをデータは強力に示唆した。
【００２７】
上記のように、タンパク質４９７Ｃは内皮細胞中で発現され、そしてその発現は、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２のような血管新生促進因子により刺激されると増強される、ということが、目下、確立されている（WO 2003/074073参照）。タンパク質４９７Ｃは、テトラスパニン・スーパーファミリーに属するが、これは、細胞外シグナルの認識において暗示される2つの細胞外ループ、そしてシグナルの伝達において暗示される2つの細胞内尾部（Ｃ末端及びＮ末端）を含む膜貫通受容体である。シグナル伝達における重要な一特徴は、受容体およびリガンドの細胞外ループ間のリガンド−受容体複合体の形成である。理論と結びつけずに、短小化形の４９７Ｃは「可溶性受容体メカニズム」を介してそれらの役割を演じ得る、と出願人等は考える：短小化形の４９７Ｃは、細胞の表面で依然として可溶性であり得るし、リガンドにより認識され得る。その結果、可溶性形態の４９７Ｃ（本発明の断片）及びネイティブ膜貫通性タンパク質との間のリガンドの認識、その結果として、血管新生促進シグナルの伝達の用量依存的な低減において競合が認められ、したがって血管新生の抑制を、次に腫瘍容積の低減を生じ得る。
【００２８】
したがって本発明は、第一の態様において、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有する活性ポリペプチド、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドに関するが、但し上記ポリペプチドは配列番号２、その抗原性断片、配列番号１６又はその断片、及び配列番号１７又はその断片でない。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「ペプチド」は、100未満のアミノ酸の、限定順序での連結から形成される短い分子を意味する。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、少なくとも100のアミノ酸の、限定順序での連結から形成される分子を意味する。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「活性ポリペプチド」は、生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。本発明において、ポリペプチドは、抗血管新生及び抗腫瘍活性を有する。
【００３２】
本発明の一実施形態では、上記活性ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有し、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドを含むが、但し上記ポリペプチドは、配列番号２、その変異体及び抗原性断片、配列番号１６又はその断片、及び配列番号１７又はその断片でない。
【００３３】
配列番号２の「変異体」は、1、2又はそれより多くのアミノ酸が突然変異化される配列番号２を指す。このような変異体としては、例えば配列番号２内の残基からの欠失、又は残基への挿入又はその置換、あるいは欠失、挿入及び置換の任意の組合せが挙げられる。欠失、挿入及び置換の一例は、配列番号２と比較してその配列が5つの付加的Ｎ末端アミノ酸を有する２４９ｍｅｒ膜貫通４スーパーファミリーメンバー２タンパク質（Ｐ４１７３２）に対応する配列番号３７である。
【００３４】
本発明の一実施形態では、上記活性ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するか、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドを含むが、但し上記ポリペプチドは、配列番号２、その抗原性断片、配列番号３７のような配列番号２の変異体、配列番号１６又はその断片、及び配列番号１７又はその断片でない。
【００３５】
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、活性三次元立体配座で折りたたまれたそれを有するための手段をさらに包含する。好ましくは、活性立体配座で折りたたまれたそれを有するための上記手段は、30〜70アミノ酸、好ましくは45〜65アミノ酸、さらに好ましくは50〜60アミノ酸、さらに好ましくは約55アミノ酸を含む任意の配列にあり、上記配列は上記ポリペプチドのＣ末端に融合される。好ましい一実施形態では、上記ポリペプチドのＣ末端に融合されている上記配列は、配列番号１８（ＤＲＡＳＰ ＱＰＷＲＹＲＩＲＩＬ ＡＰＳＴＳＬＲＰＨＳ ＳＴＴＴＴＴＴＸＩＲ ＬＬＴＫＰＥＲＫＬＳ ＷＬＬＰＰＬＳＮＮ）である。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、「三次元立体配座」は、ポリペプチドの第三次構造、即ちポリペプチドが生物学的機能を実施するその全体形状を意味する。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「断片」という用語は、抗腫瘍活性を有するタンパク質４９７ＣのＬＥＬドメインの短小化形を意味する。上記断片は、好ましくは、配列番号３の少なくとも21連続アミノ酸のアミノ酸配列を有する。特定の一実施形態では、断片は、少なくとも43連続アミノ酸のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、上記断片は、配列番号４（74アミノ酸）、配列番号５（49アミノ酸）、又は配列番号６（43アミノ酸配列）のアミノ酸配列を有する。断片は、上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有し、そして抗腫瘍活性を有するペプチドも含む。
【００３８】
別の実施形態では、上記断片は、以下の配列を有する。：
配列番号１９： ＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲＳＬＳＣＣＧＶＱ ＮＹＴＮＷＳＴＳＰＹ ＦＬＥＨＧＩＰＰＳＣ ＣＭＮＥＴＤＣＮＰＱ ＤＬＨＮＬＴＶＡＡＴ ＫＶＮＱＫＧＣＹＤＬ ＶＴＳＦＭＥＴＮＭＧ ＩＩＡＧ
配列番号２０： ＡＡＴ ＫＶＮＱＫＧＣＹＤＬ ＶＴＳＦＭＥＴＮＭＧ ＩＩＡＧ
配列番号２１： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳ
配列番号２２： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮ
配列番号２３： ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ Ｎ
配列番号２４： ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬＨ
配列番号２５： ＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬ／ＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧ
配列番号２６： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ
配列番号２７： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ Ｎ
配列番号２８： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ
配列番号２９： ＩＳＧＦＶＦＲＨＥＩ ＫＤＴＦＬＲＴＹＴＤ ＡＭＱＴＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧ
配列番号３０： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ Ｎ
配列番号３１： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ
配列番号３２： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧ
配列番号３３： ＹＮＧＮＤＥ ＲＳＲＡＶＤＨＶＱＲ ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧＣＹＤＬＶＴ ＳＦＭＥＴＮＭＧＩＩ ＡＧ
配列番号３４： ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤ
配列番号３５： ＳＬＳＣＣＧＶＱＮＹ ＴＮＷＳＴＳＰＹＦＬ ＥＨＧＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ
配列番号３６： ＩＰＰＳＣＣＭ ＮＥＴＤＣＮＰＱＤＬ ＨＮＬＴＶＡＡＴＫＶ ＮＱＫＧ
上記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有し、そして抗腫瘍活性を有するペプチドも本発明に包含される。
【００３９】
一実施形態では、少なくとも21連続アミノ酸を有する配列番号３の上記断片は、配列番号４〜６、及び配列番号１９〜３６、あるいは上記断片と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドから選択される。
【００４０】
好ましい一実施形態では、少なくとも21連続アミノ酸を有する配列番号３の上記断片は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６、あるいは上記断片と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドの中から選択される。
【００４１】
第二の態様では、本発明は、上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチドを含む医薬品に関する。
【００４２】
第三の態様では、本発明は、上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、並びに１つ又は複数の薬学上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００４３】
第四の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体の癌及び／又は腫瘍の治療方法に用いるための上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、並びに１つ又は複数の薬学上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００４４】
特定の一実施形態では、上記のような医薬組成物は、抗血管形成物質又は抗腫瘍物質から選択される少なくとも1つの別の活性物質をさらに含む。これらの物質は、達成されるべき作用に関して、当業者に選択され得る。好ましくはこれらの物質は、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル及びイリノテカン等から選択され得る。
【００４５】
第五の態様では、本発明は、相乗的有効量の以下の：
− 上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、並びに
− シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択されるプラチナ錯体
を含む医薬組成物に関する。
【００４６】
本発明の実行に有用な医薬品又は組成物は、既知の慣用的経路により哺乳類に投与される。本明細書中に記載される医薬品又は組成物は、同一経路により、又は異なる経路により投与され得る。例えば医薬品又は組成物は、経口的に又は非経口的に（静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内等）投与され得る。
【００４７】
非経口的に投与される場合、組成物は、好ましくは、少なくとも1つの薬学上許容可能な賦形剤を用いて、単位投与量注射可能形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で処方される。このような賦形剤は、典型的には、非毒性及び非治療性である。このような賦形剤の例は、水、水性ビヒクル、例えば生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液及びハンクス溶液、並びに非水性ビヒクル、例えば不揮発性油（例えばトウモロコシ、綿実、落花生及びゴマ）、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルである。滅菌生理食塩水は、好ましい賦形剤である。賦形剤は、少量の添加剤、例えば溶解性、等張性及び化学的安定性を増強する物質、例えば酸化防止剤、緩衝剤及び防腐剤を含有し得る。経口（又は直腸）投与される場合、化合物は、通常は、錠剤、カプセル、座薬又はカシェ剤のような単位剤形中に処方される。このような処方物は、典型的には、固体、半固体又は液体担体又は希釈剤を含む。例示的な希釈剤及び賦形剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、ココアバター、カカオ脂、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、メチルセルロース、ポリオキシエチレン、モノラウリン酸ソルビタン、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク及びステアリン酸マグネシウムである。好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は、静脈内に投与される。
【００４８】
本発明によれば、医薬品又は組成物中に存在するポリペプチドの量は、感受性腫瘍を治療するのに有効である。好ましくはポリペプチドは、0.01〜90重量％、好ましくは0.1〜10重量％、さらに好ましくは１〜5重量％の量で、医薬品中に又は組成物中に存在する。これらの量は当業者によりルーチンに適用可能であって、彼等は回復を達成するために患者に投与するのに最良の量を選択し得る。
【００４９】
第六の態様では、本発明は、癌及び／又は腫瘍の治療のための、上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチドの、あるいは上記のような医薬品の、又は上記のような医薬組成物の使用に関する。
【００５０】
本発明によれば、治療されるべき腫瘍は、好ましくは固形腫瘍である。さらに好ましくは、治療されるべき腫瘍は、肉腫、癌腫及びリンパ腫から選択される。このような腫瘍の例は、膀胱癌、黒色腫、乳癌、非ホジキンリンパ腫、脳癌、骨癌、結腸及び直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌（非黒色腫）、甲状腺癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌）である。
【００５１】
第七の態様では、本発明は、癌又は腫瘍増殖を抑制するのに十分な量で上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、あるいは上記のような医薬品、又は上記のような医薬組成物を治療を必要とする被験者に投与することを包含する治療方法に関する。
【００５２】
特定の一実施形態では、本発明は、少なくとも1つの他の抗新生物薬又は抗腫瘍薬を投与することをさらに包含する上記のような治療方法に関する。
【００５３】
これらの方法において、投与することは、局所投与、経口投与、静脈内投与又は腹腔内投与を包含する。
【００５４】
第八の態様では、本発明は、癌又は腫瘍増殖を抑制するのに十分である相乗的有効量の以下の：
− 上記のようなポリペプチド、断片及び／又はペプチド、並びに
− シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択されるプラチナ錯体
を治療を必要とする被験者に投与することを包含する治療方法に関する。
【００５５】
一実施形態では、上記のポリペプチド又はその断片及び上記のプラチナ錯体は同時に投与される。
【００５６】
別の実施形態では、上記ポリペプチド又はその断片及び上記プラチナ錯体は逐次的に投与される。好ましくは、上記ポリペプチド又はその断片及び上記プラチナ錯体は、別個の経路により、即ち、経口的に又は非経口的に（静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内等）投与される。
【００５７】
特定の一実施形態では、上記プラチナ錯体はシスプラチンである。
【００５８】
別の特定の実施形態では、上記プラチナ錯体はカルボプラチンである。
【００５９】
以下の非限定実施例に関して本発明をさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明のタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の漸増濃度に伴うin vitroでの内皮細胞増殖の抑制％を示す図である。
【図２】２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｆ、２ｇ、２ｈ及び２ｉは、異なる条件での内皮細胞のin vitro血管新生の写真である： − 図２ａ： 対照（緩衝液尿素 2 M） − 図２ｂ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 6.5 μg/mL（0.27 μM） − 図２ｃ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 13 μg/mL（0.54 μM） − 図２ｄ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 26 μg/mL（1.08 μM） − 図２ｅ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 48 μg/mL（2 μM） − 図２ｆ： ４９７Ｃ−Ｔ３ 51 μg/mL（2.55 μM） − 図２ｇ： ４９７Ｃ−Ｔ４ 55 μg/mL（3.18 μM） − 図２ｈ： ４９７Ｃ−Ｔ５ 56 μg/mL（3.35 μM） − 図２ｉ： Ｃ末端尾部 53 μg/mL（4.14 μM）
【図３】３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇは、異なる条件で実施された内皮細胞に関する創傷検定の写真である： − 図３ｂ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 20 μg/mL（0.83 μM） − 図３ｃ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 40 μg/mL（1.66 μM） − 図３ｄ： ４９７Ｃ−Ｔ３ 48 μg/mL（2.4 μM） − 図３ｅ： ４９７Ｃ−Ｔ４ 60 μg/mL（3.52 μM） − 図３ｆ： ４９７Ｃ−Ｔ５ 61 μg/mL（3.65 μM） − 図３ｇ： Ｃ末端尾部 63 μg/mL（4.92 μM）
【図４】実施例７に従って処置されたマウスの異なる群に関する平均腫瘍容積（mm3）対時間（日）を表すグラフである。
【図５】実施例７に従って処置されたマウスの異なる群に関する平均相対腫瘍容積（単位なし）対時間（日）を表すグラフである。
【図６】実施例８に従って処置されたマウスの異なる群に関する平均腫瘍容積（mm3）対時間（日）を表すグラフである。
【図７】実施例８に従って処置されたマウスの異なる群に関する平均相対腫瘍容積（単位なし）対時間（日）を表すグラフである。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の産生
挿入４９７Ｃ−Ｔ２の合成：
第一に、既知の手順に従って、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔイージー・ベクターシステム（Promega（登録商標））で、遺伝子４９７Ｃをクローン化した（得られたベクターは「ｐＧＥＭ−Ｔ−４９７」と呼ばれた）。
【００６２】
第二に、プラスミド「ｐＧＥＭ−Ｔ−４９７Ｃ」、並びに2つのプライマーＣＤＳ５（配列番号９）及びＣＤＳ４（配列番号１０）（表１）（それぞれ５’及び３’においてＬＥＬドメインを枠にはめる）を用いて、ＰＣＲにより、タンパク質４９７Ｃの細胞外部分ＬＥＬに対応する挿入物Ｔ２（配列番号３）を増幅した。
【００６３】
【表１】
【００６４】
第三に、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２をコードするＤＮＡ配列を、既知の手法に従って、ベクターｐＥＴ−３０ ＥＫ／ＬＩＣ（Novagen（登録商標））中に挿入した（ｐＥＴ−３０−４９７Ｃ−Ｔ２）。ｐＥＴ−３０ベクター内の４９７Ｃ−Ｔ２をコードする核酸配列は、配列番号７で示される。
【００６５】
次に、タンパク質産生のために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ中に精製ベクターを導入した。ベクター及びＰＣＲによる挿入物の両方の存在によって、コロニーを制御した。
【００６６】
産生タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２のサイズは24 kDであり、それは予測サイズより大きかった。これは、シーケンシングにより確証されるように、Ｃ末端での補足的尾部（54無作為アミノ酸）の、並びにＮ末端でのＨｉｓ−Ｔａｇの付加のためであった。産生された場合のタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２のアミノ酸配列は、配列番号８で示される。タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２を細菌の不溶性分画内で産生したが、これは、変性状態での抽出を必要とした。
【００６７】
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の抽出及び精製
培養後、細菌を溶解し、遠心分離し、上清を捨てた。得られた不溶性画分をトリス−ＨＣｌ 20 mM、尿素 8 M、イミダゾール 5 mM、ＮａＣｌ 0.5 M、ＧＳＨ 5 mM、ｐＨ8.0で処理した。この処理後、懸濁液を遠心分離し、上清を収集して、0.45 μm膜上で濾過して、不溶性物質を捨てた。次に、ＨＰＬＣ系（Amersham）に連結されたＨｉｓ−Ｔｒａｐカラム（Amersham（登録商標））を用いることによりタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２を精製するために、濾過抽出物を用いた。
【００６８】
得られた精製タンパク質を、4 M尿素及び0.3 Mイミダゾール中に希釈した。調製物からこれらの作用物質を除去するために、溶液を4℃で透析に付した。
【００６９】
透析のこれらのステップ後、精製タンパク質を15分間4,000×gで遠心分離し、0.45 μm上で濾過して、考え得る沈殿物を排除した。1976年にBradfordにより記載された方法（Anal. Biochem. 72: 248-54）に従って、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質含量に関して精製タンパク質調製物を制御した。Gene Geniusソフトウェアを用いてゲルを分析して、画像分析により純度を定量した。
【００７０】
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の純度を上げるために、イオン交換液体クロマトグラフィーを用いることにより、二次精製ステップを実施した。ＨｉｓＴｒａｐ精製調製物を緩衝液トリス−ＨＣｌ 20 mM、ｐＨ8、2 M尿素で3回希釈し（ＮａＣｌの濃度を50 mMに低減するため）、そしてUnicornソフトウェア（Amersham, GE, Saclay, France）により実行されるＨＰＬＣ系に連結されたモノＳカラム上に載せた。次にカラムを徹底的に洗浄し、イオン力の線形勾配（トリス−ＨＣｌ 20 mM、ｐＨ8、2 M尿素中の0.05 M〜0.5 M ＮａＣｌ）で溶離した。Bradfordにより、並びにそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質含量に関して精製タンパク質調製物を制御した。
【００７１】
（実施例２）
短小化形４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５の設計及び製造
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の活性部位を同定するために、４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５と呼ばれる3つの他の短小化形を、ベクターに由来するＮ末端付着Ｈｉｓ−Ｔａｇ及びＣ末端尾部の両方に対応する対照ポリペプチドと同様に、設計し、製造した。そのようにするために、５’特異的プライマーを設計して、製造された短小化形の精製に必要なＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇに影響を及ぼすことなく、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２のＮ末端配列の漸進的な短小化を可能にする。
【００７２】
４９７Ｃ−Ｔ３
鋳型としてのベクターｐＥＴ３０−４９７Ｃ−Ｔ２、５’特異的プライマー４９７ｃ−ｃｄｓ７（配列番号１１）（ｂドメインのほとんどを排除すること、そして一次Ｃ−Ｃ架橋を保存することを可能にする）、及び３’特異的プライマー４９７Ｃ−ｃｄｓ４（配列番号１０）を用いたＤＮＡのＰＣＲ増幅により、短小化４９７Ｃ−Ｔ３を構築した。
【００７３】
【表２】
【００７４】
４９７Ｃ−Ｔ４
鋳型としてのベクターｐＥＴ３０−４９７Ｃ−Ｔ２、５’特異的プライマー４９７ｃ−ｃｄｓ９（配列番号１２）（一次Ｃ−Ｃ架橋、ｂドメインおよびｃドメインを削除し、ｄ１ドメインを保存することを可能にする）、及び３’特異的プライマー４９７Ｃ−ｃｄｓ４（配列番号１０）を用いたＤＮＡのＰＣＲ増幅により、短小化４９７Ｃ−Ｔ４を構築した。
【００７５】
【表３】
【００７６】
４９７Ｃ−Ｔ５
鋳型としてのベクターｐＥＴ３０−４９７Ｃ−Ｔ２、５’特異的プライマー４９７ｃ−ｃｄｓ１１（配列番号１３）（一次及び二次Ｃ−Ｃ架橋、ｂ、ｃ及びｄ１ドメインを排除すること、そしてｄ２及びｅドメインに対応する線状配列を保存することを可能にする）、並びに３’特異的プライマー４９７Ｃ−ｃｄｓ４（配列番号１０）を用いたＤＮＡのＰＣＲ増幅により、短小化４９７Ｃ−Ｔ４を構築した。
【００７７】
【表４】
【００７８】
Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ及びＣ末端尾部に関して、以下のプライマーを用いて構築物を得たが、これは、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の配列を全体的に排除した。
【００７９】
【表５】
【００８０】
タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２に関して記載したように、短小化形４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４、４９７Ｃ−Ｔ５及びＣ末端尾部に対応する増幅産物をクローン化し、製造した。
【００８１】
（実施例３）
in vitroでの４９７Ｃ−Ｔ２による内皮細胞増殖の抑制の試験
細胞培養
37℃で5％ＣＯ２加湿大気中で、完全ＥＧＭ２−ＭＶ培地（Cambrex）中で、ＨＵＶＥＣ細胞をコンフルエントに培養した。次に、トリプシン−ＥＤＴＡ消化（Versen, Eurobio）により、細胞を収集した。5分後、5％ＦＣＳを含有する培地3 mlを添加することにより、酵素反応を停止した。次に、細胞を室温で10分間、220gで遠心分離し、5 mlの培地で2回洗浄し、完全培地中に懸濁し、計数して、50000細胞／mlに調整した。次に100 μL／ウエルを９６ウエル細胞培養マイクロプレートに配分して（5 000細胞／ウエル）、150 mMＮａＣｌ及び尿素2 Mを含有するトリス−ＨＣｌ 20 mM緩衝液（ｐＨ8）中の異なる濃度の精製タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２とともにインキュベートした；この緩衝液を対照として用いた。
【００８２】
37℃で42時間後、チアゾリルブルー・テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）法を用いて細胞増殖を測定した。要するに、ＭＴＴ（Sigma）を5 mg/mlでPＢＳ中に溶解し、溶液を濾過（0.22 μm）して、10 μlを９６ウエル・マイクロプレートの各ウエルに添加した。37℃、5％ＣＯ２加湿大気で3時間のインキュベーション後、マイクロプレートを220×gで10分間遠心分離し、上清を捨てて、100μlのＤＭＳＯを各ウエルに添加することにより結晶を溶解した。次に、ＫＣ４（Bio-Tek）ソフトウエアに接続されたμQuant マイクロプレート・リーダー（Bio-Tek Instrument gmbh, Colmar, France）を用いて、570 nmでの光学濃度（ＯＤ）を測定した。ブランク・ウエルＯＤ値（細胞を有さないウエルから得られた値）を差し引くことによりＯＤを補正し、細胞増殖の抑制を対照（最大増殖応答、即ち100％を表す未処理ＨＵＶＥＣを有するウエルから得られたＯＤ）と比較して測定した。
【００８３】
図１に示したように、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２は、用量依存的にヒト内皮細胞増殖を抑制した。この抑制は、122 μｇ（即ち5 μM）のタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２で77％を示した。
【００８４】
（実施例４）
４９７Ｃ−Ｔ２、４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５によるin vitro血管新生の抑制
精製タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２、４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５を、マトリゲル上のＦＧＦ２及びＶＥＧＦにより誘導されるＨＵＶＥＣの血管新生に関してin vitroで試験した。
【００８５】
24ウエルプレートを240 μLのＢＤマトリゲル（商標）／ウエルで調製し、次にインキュベータ中で30分間インキュベートした。次にＨＵＶＥＣ細胞を実施例３に記載されたように調製し、そしてウエル当たり70 000個の細胞を植え付けて、150mMＮａＣｌ及び尿素2 Mを含有するトリス−ＨＣｌ 20 mM緩衝液（ｐＨ8）中の異なる濃度の精製タンパク質４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４又は４９７Ｃ−Ｔ５とともにインキュベートした；この緩衝液を対照として用いた：
− 図２ａ： 対照（緩衝液尿素 2 M）
− 図２ｂ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 6.5 μg/mL（0.27 μM）
− 図２ｃ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 13 μg/mL（0.54 μM）
− 図２ｄ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 26 μg/mL（1.08 μM）
− 図２ｅ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 48 μg/mL（2 μM）
− 図２ｆ： ４９７Ｃ−Ｔ３ 51 μg/mL（2.55 μM）
− 図２ｇ： ４９７Ｃ−Ｔ４ 55 μg/mL（3.18 μM）
− 図２ｈ： ４９７Ｃ−Ｔ５ 56 μg/mL（3.35 μM）
− 図２ｉ： Ｃ末端尾部 53 μg/mL（4.14 μM）
【００８６】
図２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅに示したように、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２は用量依存的にin vitro血管新生を抑制した。
【００８７】
さらに、図２ｆ、２ｇ及び２ｈに示したように、短小化形４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５は異なるレベルの活性を示した：４９７Ｃ−Ｔ３（図２ｆ）及び４９７Ｃ−Ｔ４（図２ｇ）は抗血管新生活性に関して４９７Ｃ−Ｔ２とほぼ同じく効率的であったが、これは、ａ、ｂ及びｃＬＥＬドメインがタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の抗血管新生活性に必要というわけではない、ということを示唆する。これに反して、４９７Ｃ−Ｔ５（図２ｈ）は残りの抑制活性のみを示し、一方、Ｃ末端尾部は全体的に不活性であった（図２ｉ）。
【００８８】
（実施例５）
４９７Ｃ−Ｔ２、４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５によるヒト内皮細胞の遊走の抑制
Sato and Rifkin(J Cell Biol. 1988; 107: 1199)により記載された創傷アッセイにより（多少の修正を加えて）、細胞遊走を試験した。増殖培地ＥＧＭ−２ＭＶ（Cambrex）中で増殖させたＨＵＶＥＣを、500μLの増殖培地中で80 000細胞／ウエルで24−ウエルプレート中に植え付けて、5％ＣＯ２を含有する加湿大気中で37℃でコンフルエントに増殖させた。細胞を、1列だけプラスチック先端で掻き取った。傷をつけた後、培地を新しい培地（対照、図３ａ）、又は以下のものを添加した新鮮な培地と取り替えた：
− 図３ｂ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 20 μg/mL（0.83 μM）
− 図３ｃ： ４９７Ｃ−Ｔ２ 40 μg/mL（1.66 μM）
− 図３ｄ： ４９７Ｃ−Ｔ３ 48 μg/mL（2.4 μM）
− 図３ｅ： ４９７Ｃ−Ｔ４ 60 μg/mL（3.52 μM）
− 図３ｆ： ４９７Ｃ−Ｔ５ 61 μg/mL（3.65 μM）
− 図３ｇ： Ｃ末端尾部 63 μg/mL（4.92 μM）。
【００８９】
18時間の培養後、細胞を倒立顕微鏡下で観察し、写真撮影した（Analysis, Olympus, Rungis, France）。
【００９０】
図３ｂ及び３ｃに示したように、タンパク質４９７Ｃ−Ｔ２は、用量依存的にヒト内皮細胞の遊走を抑制した。
【００９１】
さらに、図３ｄ、３ｄ、３ｅ及び３ｆに示したように、短小化形４９７Ｃ−Ｔ３、４９７Ｃ−Ｔ４及び４９７Ｃ−Ｔ５は異なるレベルの活性を示した。短小化形４９７Ｃ−Ｔ３はタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２と同様に細胞遊走を抑制した（図３ｄ）。これに反して、短小化形４９７Ｃ−Ｔ４（図３ｅ）は４９７Ｃ−Ｔ２より低活性であり、４９７Ｃ−Ｔ５（図３ｆ）は非常に限定された抗遊走活性を示し、そしてＣ末端尾部（図３ｇ）は全体的に不活性であった。したがってこれらの結果は、ａ及びｂＬＥＬドメインがタンパク質４９７Ｃ−Ｔ２の抗遊走活性に必要でない、ということを示唆した。
【００９２】
（実施例６）
腫瘍試料におけるタンパク質４９７Ｃの発現
多数の異なるヒト腫瘍試料を、遺伝子４９７Ｃの発現に関してスクリーニングした。各病理試料に関して、腫瘍の周辺部を腫瘍の中心部から分離し、そしてこれら2つの領域における遺伝子４９７Ｃの発現を、ｍＲＮＡ抽出とその後のＲＴ−ＰＣＲ後に比較した。
【００９３】
腎臓腫瘍試料
腎臓腫瘍からの19の病理学生検材料を分析した。19例の患者のうち13例では、４９７Ｃの発現は、腫瘍の周辺部より中心部においてより高かった。
【００９４】
肺腫瘍試料
ヒト肺腫瘍からの40の病理生検材料を分析した。40例の患者のうち37例では、４９７Ｃの発現は、腫瘍の中心部より周辺部においてより高かった。腫瘍の周辺部での４９７Ｃの発現のレベルと患者のnod状態（即ち、転移可能性）との間の密接な関係も認められた。試料の解剖学的検査は、腫瘍の周辺部は腫瘍の中心部より多く血管新生が起こる（概して肺癌に関して確立されているように）、ということも明示した。
【００９５】
ヒト結腸腫瘍からの33の病理生検材料を分析した。33例の患者のうち25例では、４９７Ｃの発現は、腫瘍の中心部より周辺部においてより高かった。
【００９６】
（実施例７）
in vivoでのスイス・ヌードマウスにおけるＮＣＩ Ｈ４６０ヒト腫瘍に関する４９７Ｃ−Ｔ２の試験
ＮＣＩ Ｈ４６０細胞の調製
4.5 g/Lグルコースに調整し（Ref. G7528、バッチ番号003K0121、Sigma, France）、10 mM ＨＥＰＥＳ（Ref. H0887、バッチ番号113K2338、Sigma, France）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（Ref. CSTVAT00-0U、バッチ番号520818、Sigma, France）及び10％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ref. CVFSVF00-01、バッチ番号S13021、Eurobio, France）を添加した2 mM Ｌ−グルタミンを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地（Ref. CM1RPM08-01、バッチ番号623615、 Eurobio, France）中で、37℃、5％ＣＯ２加湿大気下で、接着細胞としてＮＣＩ Ｈ４６０細胞を培養した。それらを、90×106細胞に到達するよう75 cm2フラスコ中で増幅した。
【００９７】
0日目に、培地を除去し、3 mlのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ref. CEZTDA00-0U、バッチ番号633920、Eurobio, France）を添加することにより、75cm2フラスコからＮＣＩ Ｈ４６０細胞（ヒト肺癌）を収集した。37℃で5分のインキュベーション後、細胞をプラスチックから剥がして、そして10％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地 3 mlを添加することにより、酵素反応を停止した。次に、細胞を、室温で5分間、700 gで遠心分離した。それらを、Ｌ−グルタミン（2 mM）、グルコース（4.5 g/l）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）を含有し、ＨＥＰＥＳ（10 mM）で緩衝した無血清ＲＰＭＩ １６４０培地中に再懸濁した。細胞を計数し、生育可能なＮＣＩ Ｈ４６０細胞の数は、＞99％であった。次に細胞の数を、無血清培地中で25.106細胞／mlに調整した。
【００９８】
腫瘍誘導
ケタミン−キシラジン（80 mg/kg〜12 mg/kg；Ref. K-113、Sigma, France）の腹腔内注射により、30匹の健常雌スイス・ヌードマウスを麻酔した。次にＮＣＩ Ｈ４６０細胞（無血清培地200 μL中5.106細胞／マウス）を、各マウスの右脇腹に皮下移植した。
【００９９】
処置日程
ＮＣＩ Ｈ４６０細胞の移植後12日目に、30匹のマウスを無作為に6つの群（各々5匹）に分けた。腫瘍容積は228〜468 mm3に達し、平均腫瘍容積は無作為に分けられた群間で統計学的に異ならなかった。
【０１００】
処置日程（12日目に開始し、28日目に終了する）は、表６に要約されている：
− 群１の動物を、ビヒクル溶液（バッチＣ）で処置する：トリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5、2 M 尿素、150 mM ＮａＣｌ、0.1 mM ＣａＣｌ２、
− 群２の動物を、生理学的血清0.5 ml/mL（ＣＤＤＰ、シス−ジアミンプラチナ（ＩＩ）二塩化物、Ref. P4394、バッチ番号014K0993、Sigma, France、純度100％、分子量300）中のシスプラチンの溶液で処置する、
− 群３及び４の動物を、1 mg/mLの試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクル溶液（バッチＡ）で処置する、
− 群５の動物を、1 mg/mLの試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクル溶液（バッチＡ）で処置し、さらにＣＤＤＰを施す、
− 群６の動物を、1.8 mg/mLの試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクル溶液（バッチＢ）で処置し、さらにＣＤＤＰを施す。
【０１０１】
溶液は全て、腹腔内に注射した。群１、２、３、５及び６における注射は、日程Ｑ２ＤＸ８に従って、即ち、2日毎に1用量を8回、実施した。群４における注射は、日程Ｑ１ＤＸ１６に従って、即ち、毎日1用量を、16回、実施した。
【０１０２】
ＣＤＤＰを、0.5 mg/mLの濃度で滅菌生理学的血清中に再懸濁し、処置日程Ｑ２ＤＸ８に従って、10 mL/kgの容積で、5 mg/kgの濃度で腹腔内注射した。
【０１０３】
注射後2時間、マウスを観察した。ケタミン／キシラジン（80mg/kg〜12 mg/kg；Ref. K-113、Sigma, France）を用いて動物を麻酔した後、頚椎脱臼により屠殺した。
【０１０４】
マウスのモニタリング
動物を毎日観察した。動物行動における変容を、実験ノートに記録した。体重及び腫瘍容積を、2日毎に、実験終了まで報告した。
【０１０５】
以下に略記するデータを算定した：
− 腫瘍増殖曲線を、平均腫瘍容積（ＭＴＶ）を用いて描いた。
− 平均相対腫瘍容積（ＭＲＴＶ）を、時間ｔでのＭＴＶと注射時（ｔ＝12日目）の容積との間の比として算定した。
− 腫瘍増殖抑制（Ｔ／Ｃ、％）を、処置群対ビヒクル群の腫瘍容積の中央値の比として評価した。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
統計学的試験
腫瘍容積（Ｖ）、「Ｖ」に到達する時間、腫瘍倍加時間（ＤＴ）、相対腫瘍容積（ＲＴＶ）及び腫瘍増殖抑制（Ｔ／Ｃ）の統計学的分析を、全ての群に関して実施した。データは、平均±ＳＤとして表される。データ群は、正規に分布された。一変量分析を実施して、群間の差を査定した。次に、スチューデントｔ検定を用いて、統計学的有意を確定した。ｐ＜0.05は、統計学的に有意であるとみなされた。ＸＬＳＴＡＴ（Addinsoft, France）を用いて、統計学的分析を実施した。
【０１０９】
体重モニタリング
表７に示したように、ビヒクルは体重に影響を及ぼさなかった：マウスの行動及び体重増加は正常で、早期に死亡した動物はいなかった。試験した両方の用量（10及び18 mg/kg）での試験物質４９７Ｃ−Ｔ２による処置の経過中に、毒性は観察されなかった。それに対比して、ＣＤＤＰで処置した群２、５及び６では、重要な毒性を観察した（−12〜−18％の体重減；ｐ＜0.05）。
【０１１０】
平均腫瘍容積（ＭＴＶ）、平均相対腫瘍容積（ＭＲＴＶ）、腫瘍容積及び腫瘍増殖パラメーターの結果を、図４、５に並びに表８及び表９に示す。
【０１１１】
表８に示すように、ＭＴＶは、ビヒクル群１のマウス（4441±1135 mm3）と比較して、ＣＤＤＰで処置した群２のマウスでは28日目に低減された（1440±1097 mm3）。ＭＴＶは、28日目には、それぞれ1回注射／日（2482±2075 mm3）及び1回注射／1日置き（3167±1681 mm3）で、10 mg/kgで試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を用いて処置した群３及び４においても低減された。群１のビヒクル処置動物（4441±1135 mm3）と比較して、群５（807±692 mm3）及び群６（639±416 mm3）からの動物において、ＭＴＶの顕著な低減が観察された。
【０１１２】
腫瘍増殖抑制の一パラメーターであるＴ／Ｃ比は、28日目の群２からのマウスでは32％を示したが、これは、ビヒクル処置群１と比較した場合にＣＤＤＰが腫瘍サイズを68％低減するということを実証する。Ｔ／Ｃは、群３からのマウスでは56％、群４からのマウスでは71％であったが、これは、単剤療法として用いられた場合、試験物質の中等度の抗腫瘍活性を明示する。しかしながらＣＤＤＰと併用した場合、Ｔ／Ｃは、群５及び６からのマウスでは、それぞれ18％及び14％に低下した。これは、細胞傷害剤、例えばＣＤＤＰと併用した場合、４９７Ｃ−Ｔ２が強力な抗腫瘍活性を有する、ということを実証する。
【０１１３】
腫瘍サイズ倍加時間（ＤＴ）は、ビヒクル処置群１では1.23±0.49日であった。ＤＴは、ＣＤＤＰ単独で処置した群２のマウスでは4倍に増大した（5.12±2.89日）。群３及び４に関しては、ＤＴ（それぞれ4.08±1.4及び5.9±1.21日）は、群２と同様であった。これは、４９７Ｃ−Ｔ２が、単剤療法として用いられた場合に腫瘍活性を低減するのに、ＣＤＤＰと同じくらい強力である、ということを示す。しかし最も重要なのは、４９７Ｃ−Ｔ２及びＣＤＤＰを用いる二剤療法は、ビヒクル処置郡１からのマウスで測定されたＤＴと比較して、群５及び６（それぞれ25.02±29.89及び20.07±9.28）からの動物ではＤＴが20倍に増大したことである。これは、単独で又はＣＤＤＰと組合せて用いられる場合、試験物質４９７Ｃ−Ｔ２の強力な抗腫瘍活性をさらに確証する。
【０１１４】
表９に示すように、ＭＲＴＶ測定は、群６の動物が、試験した両方の濃度で（群５、６）、腫瘍容積の最も強い減少を示す、ということを確証した。４９７Ｃ−Ｔ２単独での処置は、28日目に、7.37（群３）又は6.76（群４）のＭＲＴＶをもたらし、そしてシスプラチンによる処置は、4.88（群２）のＭＲＴＶをもたらした。
【０１１５】
これらの結果はすべて、４９７Ｃ−Ｔ２が、単独で又はシスプラチンとの相乗的組合せで用いられる強力な抗腫瘍剤である、ということを確証する。
【０１１６】
（実施例８）
in vivoでのスイス・ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌（ＣＡＬＵ−６）異種移植片モデルに関する４９７Ｃ−Ｔ２の試験
ＣＡＬＵ−６細胞の調製
完全ＥＭＥＭ培地（Ref. CM1RPM18-01、バッチ番号462502、 Eurobio, France）10％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ref. CVFSVF00-01、バッチ番号S13021、Eurobio, France）中で、37℃、5％ＣＯ２加湿大気下で、接着細胞としてＣＡＬＵ−６細胞を培養した。それらを、90×106細胞に到達するよう75 cm2フラスコ中で増幅した。
【０１１７】
0日目に、培地を除去し、3 mlのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ref.
CEZTDA00-0U、バッチ番号633920、Eurobio, France）を添加することにより、75cm2フラスコからＣＡＬＵ−６細胞（ヒト肺癌）を収集した。37℃で5分のインキュベーション後、細胞をプラスチックから剥がして、そして10％ウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地 3 mlを添加することにより、酵素反応を停止した。次に、細胞を、室温で5分間、700 gで遠心分離した。それらを、無血清ＥＭＥＭ培地中に再懸濁した。細胞を計数し、トリパンブルー排除により生育可能性を査定した（Ref. CSTCOL03-0U、バッチ番号434511、 Eurobio, France）。ＣＡＬＵ−６細胞の数は、＞99％であった。次に細胞の数を、無血清培地中で25×106細胞／mlに調整した。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
腫瘍誘導
ケタミン−キシラジン（80 mg/kg〜12 mg/kg；Ref. K-113、Sigma, France）の腹腔内注射により、30匹の健常雌スイス・ヌードマウスを麻酔した。次にＣＡＬＵ−６細胞（無血清培地200 μL中5×106細胞／マウス）を、各マウスの右脇腹に皮下移植した。移植後2時間、マウスを観察した。
【０１２１】
処置日程
ＣＡＬＵ−６細胞の移植後12日目に、30匹のマウスを無作為に6つの群（各々5匹）に分けた。腫瘍容積は228〜468 mm3に達し、平均腫瘍容積は無作為に分けられた群間で統計学的に異ならなかった。
【０１２２】
処置日程（12日目に開始し、28日目に終了する）は、表１０に要約されている。
− 群１の動物を、ビヒクル溶液（トリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5、2 M 尿素、150 mM ＮａＣｌ、0.1 mM ＣａＣｌ２）（バッチＣ）で処置する、
− 群２の動物を、生理学的血清0.5 ml/mL（ＣＤＤＰ、シス−ジアミンプラチナ（ＩＩ）二塩化物、Ref. P4394、バッチ番号014K0993、Sigma, France、純度100％、分子量300）中のシスプラチンの溶液で処置する、
− 群３の動物を、10 mg/mLの用量で試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクルで処置する、
− 群４の動物を、10 mg/mLの用量で試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を添加したビヒクルで処置し、さらにＣＤＤＰを施す。
【０１２３】
群１、２、３及び４における注射は、日程Ｑ２ＤＸ８に従って、即ち、2日毎に1用量を8回、実施した。
【０１２４】
ＣＤＤＰを、0.5 mg/mLの濃度で滅菌生理学的血清中に再懸濁し、処置日程Ｑ２ＤＸ８に従って、10 mL/kgの容積で、5 mg/kgの濃度で腹腔内注射した。
【０１２５】
注射後2時間、マウスを観察した。ケタミン／キシラジン（80
mg/kg〜12 mg/kg；Ref. K-113、Sigma, France）を用いて動物を麻酔した後、頚椎脱臼により屠殺した。全動物に関して、カリパスを用いて週2回、腫瘍サイズを測定した。式:（長さ×幅２）／２（４）に従って、腫瘍容積（mm3）を測定した。
【０１２６】
統計学的試験
平均腫瘍容積（ＭＴＶ）、平均相対腫瘍容積（ＭＲＴＶ）及び腫瘍増殖抑制（Ｔ／Ｃ）を、実施例７に関するものと同様に算定した。
【０１２７】
体重
表１１に示したように、ビヒクルは影響を及ぼさなかった：マウスの行動及び体重増加は正常で、早期に死亡した動物はいなかった（群１のマウス５を除く）。10 mg/kgの用量での試験物質４９７Ｃ−Ｔ２による処置の経過中に、毒性は観察されず、わずかな体重増加が観察された（＋1.44 g）。
【０１２８】
それに対比して、ＣＤＤＰで処置した群２、４において、重要な毒性が観察された（それぞれ12.6％及び8.7％の体重減少）。群１対２及び４と群３対２及び４の間の差は、統計学的に有意であった（ｐ＜0.0001）が、しかし群２及び４間の差は統計学的に有意でなかった。
【０１２９】
【表１０】
【０１３０】
【表１１】
【０１３１】
平均腫瘍容積（ＭＴＶ）、平均相対腫瘍容積（ＭＲＴＶ）、腫瘍容積及び腫瘍増殖パラメーターの結果を、図６、７に並びに表１２及び１３に示す。
【０１３２】
ＭＴＶは、ビヒクル群１のマウス（1 233.44±663.82 mm3）と比較して、ＣＤＤＰで処置した群２のマウスでは28日目に低減された（742.44±215.85 mm3）。ＭＴＶは、28日目には、1回注射／2日（813.70±439.00 mm3）で、10 mg/kgで試験物質４９７Ｃ−Ｔ２を用いて処置した群３においても低減された。これらの結果を、28日目のＭＲＴＶの分析により確証した（表１３）。群１のビヒクル処置動物（1 233.44±663.82 mm3）と比較して、群４（430.89±290.89 mm3）からの動物において、ＭＴＶの顕著な低減が観察された。
【０１３３】
試験物質で処置した群１及び群２間の差は、統計学的有意に達する（ｐ＜0.0001対4、ｐ＝0.003対3）。群２及び４間の差も有意であった（ｐ＝0.001）。これに対比して、群２（ＣＤＤＰ単独）及び群３（４９７Ｃ−Ｔ２単独）間に統計学的差は観察されなかった。群１及び処置群間の最初に統計学的有意は、群３に関しては22日目に、群４に関しては20日目にそれぞれ観察された。28日目のＭＲＴＶの分析により、これらの結果を確証した（表１３）。群１のビヒクル処置動物（1 233.44±663.82 mm3）と比較して、群４（430.89±290.89 mm3）からの動物において、ＭＴＶの重要な低減が観察された。
【０１３４】
【表１２】
【０１３５】
腫瘍増殖抑制の一パラメーターであるＴ／Ｃ比（表１２）は、ビヒクル処置群１と比較してそれは腫瘍サイズを27％低減するので、単剤療法として用いた場合、試験物質のわずかな抗腫瘍活性を明示する。しかしながら、ＣＤＤＰと併用した場合、抑制率は、ビヒクル処置群１に比して腫瘍サイズの64％低減に達する。これらの結果は、細胞傷害剤、例えばＣＤＤＰと併用して用いた場合、４９７Ｃ−Ｔ２が強力な抗腫瘍活性を有する、ということを直接的に実証する。
【０１３６】
【表１３】
【０１３７】
図１３に示したように、ＭＲＴＶは、郡４の動物に関して、28日目に2.96に達したが、これは、シスプラチンとの４９７Ｃ−Ｔ２の相乗効果を確証する。さらに単独で用いられるシスプラチン（群２）又は単独で用いられる４９７Ｃ−Ｔ２（群３）は28日目で非常に近いＭＲＴＶを示したが、これは、４９７Ｃ−Ｔ２が強力な単剤療法抗腫瘍剤でもある、ということを示唆する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有する活性ポリペプチド、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は前記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドであるが、但し前記ポリペプチドが配列番号２、その変異体及び抗原性断片、配列番号１６又は配列番号１７でない活性ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが活性三次元立体配座で折りたたまれたそれを有するための手段をさらに包含する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
活性立体配座で折りたたまれたそれを有するための前記手段が30〜70アミノ酸、好ましくは45〜65アミノ酸、さらに好ましくは50〜60アミノ酸、さらにより好ましくは約55アミノ酸を含む任意の配列にあり、前記配列が前記ポリペプチドのＣ末端に融合される請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記断片が配列番号４、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
抗腫瘍活性を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬品。
【請求項７】
請求項1〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
ヒト又は動物身体の癌及び／又は腫瘍の治療方法に用いるための請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
抗血管形成物質又は抗腫瘍物質から選択される少なくとも1つの別の活性物質をさらに含む請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
相乗的有効量の以下の：
− 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び
− シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択されるプラチナ錯体
を含む医薬組成物。
【請求項１１】
局所、全身、経口、皮下、経皮、筋肉内又は腹腔内投与に適した形態である請求項７〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
0.01〜90重量％、好ましくは0.1〜10重量％、さらに好ましくは１〜5重量％の量で存在する請求項７〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌及び／又は腫瘍の治療のための請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項６記載の医薬品、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
腫瘍が固形腫瘍である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
固形腫瘍が肉腫、癌腫及びリンパ腫から選択される請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
癌及び／又は腫瘍増殖の抑制方法であって、癌又は腫瘍増殖を抑制するのに十分な量で、請求項1〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項６記載の医薬品、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物を治療を必要とする対象に投与することを包含する方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が固形腫瘍である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1つの他の抗新生物薬又は抗腫瘍薬を投与することをさらに包含する請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
投与することが局所投与、経口投与、静脈内投与又は腹腔内投与を包含する請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
癌又は腫瘍増殖の抑制方法であって、癌又は腫瘍増殖を抑制するのに十分である相乗的有効量の以下の：
− 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び
− シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択されるプラチナ錯体
を治療を必要とする対象に投与することを包含する方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチド及び前記プラチナ錯体が同時に投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチド及び前記プラチナ錯体が逐次的に投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチド及び前記プラチナ錯体が別個の経路により投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記プラチナ錯体がシスプラチンである請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記プラチナ錯体がカルボプラチンである請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有する活性ポリペプチド、あるいは少なくとも21連続アミノ酸を有するその断片、又は前記断片のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは70％、さらに好ましくは90％の同一性を有するペプチドであるが、但し前記ポリペプチドが配列番号２、その変異体及び抗原性断片、配列番号１６又は配列番号１７でない活性ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが活性三次元立体配座で折りたたまれたそれを有するための手段をさらに包含する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
活性立体配座で折りたたまれたそれを有するための前記手段が30〜70アミノ酸、好ましくは45〜65アミノ酸、さらに好ましくは50〜60アミノ酸、さらにより好ましくは約55アミノ酸を含む任意の配列にあり、前記配列が前記ポリペプチドのＣ末端に融合される請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記断片が配列番号４、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
抗腫瘍活性を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬品。
【請求項７】
請求項1〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
ヒト又は動物身体の癌及び／又は腫瘍の治療方法に用いるための請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
抗血管形成物質又は抗腫瘍物質から選択される少なくとも1つの別の活性物質をさらに含む請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
相乗的有効量の以下の：
− 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び
− シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択されるプラチナ錯体
を含む医薬組成物。
【請求項１１】
局所、全身、経口、皮下、経皮、筋肉内又は腹腔内投与に適した形態である請求項７〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
0.01〜90重量％、好ましくは0.1〜10重量％、さらに好ましくは１〜5重量％の量で存在する請求項７〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌及び／又は腫瘍の治療のための請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項６記載の医薬品、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
腫瘍が固形腫瘍である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
固形腫瘍が肉腫、癌腫及びリンパ腫から選択される請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
癌及び／又は腫瘍増殖の抑制方法であって、癌又は腫瘍増殖を抑制するのに十分な量で、請求項1〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項６記載の医薬品、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物を治療を必要とする対象に投与することを包含する方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が固形腫瘍である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1つの他の抗新生物薬又は抗腫瘍薬を投与することをさらに包含する請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
投与することが局所投与、経口投与、静脈内投与又は腹腔内投与を包含する請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
癌又は腫瘍増殖の抑制方法であって、癌又は腫瘍増殖を抑制するのに十分である相乗的有効量の以下の：
− 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び
− シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択されるプラチナ錯体
を治療を必要とする対象に投与することを包含する方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチド及び前記プラチナ錯体が同時に投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチド及び前記プラチナ錯体が逐次的に投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチド及び前記プラチナ錯体が別個の経路により投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記プラチナ錯体がシスプラチンである請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記プラチナ錯体がカルボプラチンである請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２ａ−２ｉ】
【図３ａ−３ｇ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２ａ−２ｉ】
【図３ａ−３ｇ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２３６２８（Ｐ２０１０−５２３６２８Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２５２７（Ｐ２０１０−５０２５２７）
【出願日】平成２０年４月１１日（２００８．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５４４３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２５６３５
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０９２７０３９５）ジェネ シグナル インターナショナル エスエー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１１日（２００８．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５４４３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２５６３５
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０９２７０３９５）ジェネ シグナル インターナショナル エスエー (2)
【Ｆターム（参考）】
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