抗血管新生剤とＴＮＦαとを用いる組合せ療法
【課題】本発明は、腫瘍転移の治療を目的とする組合せ療法を提供する。
【解決手段】本発明は、場合によっては、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）などの他の細胞傷害薬、あるいは抗ＥＧＦＲ抗体などの他の化学療法剤と一緒に、抗血管新生剤と腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）との投与を含む、腫瘍転移の治療を目的とする組合せ療法に関する。該手法ならびに前記薬剤複数を含む医薬組成物は、各個治療薬の腫瘍細胞増殖阻害効果の相乗的強化をもたらし、個々の成分の単独投与で見出されるものよりも、より効果的な治療をもたらすことができる。
【解決手段】本発明は、場合によっては、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）などの他の細胞傷害薬、あるいは抗ＥＧＦＲ抗体などの他の化学療法剤と一緒に、抗血管新生剤と腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）との投与を含む、腫瘍転移の治療を目的とする組合せ療法に関する。該手法ならびに前記薬剤複数を含む医薬組成物は、各個治療薬の腫瘍細胞増殖阻害効果の相乗的強化をもたらし、個々の成分の単独投与で見出されるものよりも、より効果的な治療をもたらすことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血管新生剤、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）またはＴＮＦαの生物活性を有する分子を、場合によっては、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）など他の細胞傷害薬剤やシスプラチンなどの化学療法剤、あるいは、抗ＥＧＦＲ抗体などのＥｒｂＢ受容体阻害剤と一緒に、投与することを含んでなる、腫瘍および腫瘍転移の治療用の組合せ療法に関する。該手法ならびに前記薬剤複数を含んでなる医薬組成物は、各個治療薬の腫瘍細胞増殖阻害効果の相乗的な強化をもたらし、個々の成分の単独投与において見出されるよりも、より効果的な治療をもたらすことができる
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、また新血管形成とも呼ばれるが、新しく発生中の血管の組織内への伸長を伴う、組織血管形成のプロセスである。このプロセスは、内皮細胞および平滑筋細胞の浸潤によって媒介されている。このプロセスは、（１）血管は、既存の血管から出芽することができる、（２）血管の新規発生は、前駆細胞から発することができる（脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））、または（３）存在する細い血管は、その直径を拡大することができる、該３つの経路のいずれかにより、進行すると考えられている（Ｂｌｏｏｄ他、１９９０、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０３２、８９）。血管内皮細胞は、ビトロネクチン受容体（αVβ3またはαVβ5）、コラーゲン・タイプＩおよびＩＶの受容体、ラミニン受容体、フィブロネクチン／ラミニン／コラーゲン受容体、フィブロネクチン受容体を含む、少なくとも５つのＲＧＤ依存性インテグリンを含有していることが知られている（Ｄａｖｉｓ他、１９９３、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５１、２０６）。平滑筋細胞は、αVβ3およびαVβ5を含む、少なくとも６つのＲＧＤ依存性インテグリンを含有していることが知られている。
【０００３】
血管新生は、新生児の生育における重要なプロセスであり、また、創傷治癒、ならびに組織炎症、関節炎、乾癬、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、および他の新血管形成性の眼疾患を含む、様々な臨床的に重要な疾病の病因においても、重要である。血管新生に関連したこれらの臨床的病態は、血管新生病と呼ばれる（Ｆｏｌｋｍａｎ他、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、４４２）。
【０００４】
様々なインテグリンのαまたはβサブユニットに免疫特異的なモノクローナル抗体を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏな細胞接着の阻害により、微小血管内皮細胞を含めて様々な細胞種の細胞接着にビトロネクチン受容体αVβ3が関連付けられた（Ｄａｖｉｓ他、１９９３、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、２０６）。
【０００５】
インテグリンは、細胞外基質タンパク質と結合し、従って、一般的に細胞接着現象と呼ばれている、細胞−細胞および細胞−細胞外基質の相互作用を媒介することが知られている、細胞性受容体の１クラスである。このインテグリン受容体は、αおよびβサブユニットから形成される非共有結合性ヘテロ二量体糖タンパク質複合体に共通する構造的特徴を有するタンパク質のファミリーを構成する。ビトロネクチンと優先的に結合する、その本来の特徴により命名されたビトロネクチン受容体は、現在では、αVβ1、αVβ3、αVβ5と呼ばれる３つの異なるインテグリンを指すことが知られている。αVβ1は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンと結合する。αVβ3は、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、フォンウィルブランド因子を含めた様々なリガンドと結合する。αVβ5は、ビトロネクチンと結合する。共通の生物学的特異性を有する、異なるインテグリンやサブユニットと同様に、異なる生物学的機能を有する様々なインテグリンが存在することも明白である。多くのインテグリンに対する、リガンド内の１つの重要な認識部位は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）のトリペプチド配列である。ビトロネクチン受容体インテグリンに対する、上で特定したリガンドの全てにおいて、ＲＧＤが見出されている。
【０００６】
このＲＧＤ認識部位は、ＲＧＤ配列を含む直線状および環状（ポリ）ペプチドによって模倣することができる。かかるＲＧＤペプチドは、それぞれ、インテグリン機能の阻害剤または拮抗剤であることが知られている。しかし、ＲＧＤペプチドの配列および構造に応じて、特異的なインテグリンを標的にするように阻害の特異性が改変できることを特記することが重要である。異なるインテグリン特異性を有する、様々なＲＧＤポリペプチドが、例えば、Ｃｈｅｒｅｓｈ他、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、９４５、Ａｕｍａｉｌｌｅｙ他、１９９１、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．、２９１、５０、および数々の特許出願や特許（例えば、米国特許第４，５１７，６８６号、第４，５７８，０７９号、第４，５８９，８８１号、第４，６１４，５１７号、第４，６６１，１１１号、第４，７９２，５２５号、ヨーロッパ特許第０７７０ ６２２号）に記載されている。
【０００７】
新しい血管の生成、あるいは、血管新生は、悪性腫瘍疾患において、主な役割を担っており、血管新生を阻害する薬剤の開発に対する多くの関心が起こさせている（例えば、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ他、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１、１４９；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１，２７；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９、３１５ 参照）。血管新生を阻害するための、αVβ3インテグリン拮抗剤の使用は、固形腫瘍への血液供給を減少させることにより固形腫瘍の成長を阻害する方法において、知られている（例えば、合成ポリペプチド、モノクローナル抗体、αVβ3受容体に結合して血管新生を阻害するαVβ3の模倣体など、αVβ3の拮抗剤の使用を記載している、米国特許第５，７５３，２３０号および米国特許第５，７６６，５９１号 参照）。ビトロネクチン受容体αVβ5の拮抗剤を使用して、αVβ5に媒介された組織の血管新生を阻害する方法および組成物は、国際公開 ＷＯ ９７／４５４４７号パンフレットに開示されている。
【０００８】
血管新生は、内皮細胞の浸潤、遊走、および増殖によって特徴づけられ、細胞の細胞外基質成分との相互作用に依存している。この関係では、インテグリン型細胞−基質受容体が、細胞の拡散および遊走を媒介する。インテグリンαVβ3型の内皮接着受容体は、抗血管新生の治療戦略における血管特異的標的を提供する、中心的なプレーヤーであることが示された（Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、５６９；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ他、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０）。血管新生における血管性インテグリンαVβ3の必要性は、いくつかのｉｎ ｖｉｖｏモデルによって実証され、すなわち、移植したヒト腫瘍による新しい血管の生成が、前述のように、インテグリンαVβ3およびαVβ5のペプチド拮抗剤の全身投与、あるいはその代わりに、抗αVβ3抗体ＬＭ６０９によって、完全に阻害された（Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９、１１５７；ＡＴＣＣ９５３７）。この抗体は、その天然リガンドによるその活性化は、増殖性血管新生血管細胞のアポトーシスを阻害するαVβ3インテグリン受容体を阻害し、そして、それによって腫瘍増殖に必須の現象である、新しく形成中の血管の成熟を乱す。とはいえ、内皮細胞が存在していなくても、黒色腫細胞は、クモの巣状パターンの血管を形成できることが最近報告されており（Ｂａｒｉｎａｇａ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、１４７５）、腫瘍が、内皮組織の存在下でのみ有効である一部の抗血管新生剤を無効化することができる可能性を暗示している。
【０００９】
ＶＥＧＦ、Ａｎｇ１、およびｂＦＧＦを含む、数々の分子は、内皮の増殖、遊走、および集合を刺激し、また、重要な生存因子である。ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）は、内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激することができる、選択的血管新生成長因子として同定されている。特に、ＶＥＧＦは、原発腫瘍における、および虚血性眼球疾病における血管新生の主要な媒介者であると考えられている。ＶＥＧＦは、チロシンキナーゼ活性を有する高親和性の膜結合受容体に結合する（Ｊａｋｅｍａｎ他、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８９、２４４）、内皮細胞に特異的な血管新生性因子（Ｆｅｒｒａｒａ他、１９９２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｒｅｖ．、１３、１８）および血管透過性因子である（Ｓｅｎｇｅｒ他、１９８６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４６５６２９）、ホモ二量体（ＭＷ：４６，０００）である。ヒト腫瘍バイオプシーでは、悪性腫瘍細胞によるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの、また近隣の内皮細胞中におけるＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡの発現の増強が示される。ＶＥＧＦの発現は、血管の壊死領域に近隣する腫瘍領域中で最大であるように見える（総説として、Ｔｈｏｍａｓ他、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（２）、６０３；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１、２７ 参照）。国際公開 ＷＯ ９７／４５４４７号パンフレットは、αVβ5インテグリンを、特には、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αによって誘発される新血管形成と関連づけ、また、αVβ5拮抗剤がＶＥＧＦによって促進される血管新生を阻害することができることを開示している。効果的な抗腫瘍療法では、モノクローナル抗体を使用して血管新生を阻害するために、ＶＥＧＦ受容体を標的にすることを利用することもできる（Ｗｉｔｔｅ他、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、１７（２）、１５５）。ＭＡｂ ＤＣ−１０１は、腫瘍細胞の血管新生を阻害することが知られている。
【００１０】
チロシンキナーゼは、アデノシン三リン酸の末端リン酸をタンパク質基質のチロシン残基への転移を触媒している、酵素の一群である。チロシンキナーゼは、基質のリン酸化を通じて、数々の細胞機能のシグナル伝達において、必須な役割を担っていると信じらている。シグナル伝達の正確な機構は依然として不明確であるが、チロシンキナーゼは、細胞増殖、発癌、および細胞分化に寄与する重要な因子であることが示されている。
【００１１】
チロシンキナーゼは、受容体型または非受容体型に分類することができる。受容体型および非受容体型のチロシンキナーゼの双方とも、癌、乾癬、過免疫応答を含む、数々の発病状態をもたらす細胞性シグナル経路に関与している。多くのチロシンキナーゼが、細胞成長のみならず血管新生にも関与している。
【００１２】
受容体型のチロシンキナーゼは、細胞外、膜貫通、ならびに細胞内も部分を有しているが、受容体型でないチロシンキナーゼは、完全に細胞内にある。受容体と連結されたチロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通配列、および細胞質内チロシンキナーゼドメインを含有する膜貫通タンパク質である。受容体型のチロシンキナーゼは、多様な生物活性を有する、多数の膜貫通受容体を含んでいる。実際、受容体型のチロシンキナーゼの様々なサブファミリーが同定されている。包含されるチロシンキナーゼには、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ＥｒｂＢ主要クラスファミリーの上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体が含まれる。また、神経成長因子（ＮＧＮ）受容体、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）受容体、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）受容体、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）受容体も、包含されている。
【００１３】
ＨＥＲまたはＥｒｂＢサブファミリーと命名された、受容体型チロシンキナーゼの１サブファミリーは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含んでなる。この受容体サブファミリーのリガンドには、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−ａ、アンフィレギュリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリン、ヘレグリンが含まれる。ＰＤＧＦサブファミリーには、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）を含んでなるＦＬＫファミリーが含まれる。
【００１４】
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされる、ＥＧＦＲは、ヒト悪性腫瘍との因果関係が関係付けられた。具体的には、乳房、膀胱、肺、頭部、頚部、および胃の癌だけでなくグリア芽細胞種でも、ＥＧＦＲ発現の増大が観察された。ＥＧＦＲ受容体の発現の増大は、しばしば、オートクリン刺激性経路による受容体活性化をもたらす同じ腫瘍細胞による、ＥＧＦＲリガンド、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ａ）、の生成の増大を付随している（ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．、６４：１２７〜１５４、１９９４）。ＥＧＦ受容体は、１７０，０００の分子量を有し、多くの上皮細胞種で見出される膜貫通糖タンパク質である。これは、少なくとも３つのリガンド、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング成長因子アルファ）、およびアンフィレギュリンによって活性化される。上皮成長因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−ａ）は共にＥＧＦ受容体に結合し、細胞性増殖および腫瘍成長を引き起こすことが実証されている。これらの成長因子は、ＨＥＲ２には結合しない（ＵｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、１９９０、Ｃｅｌｌ、６１、２０３）。それ自体の二量体の性質に基づき、受容体の二量体化を誘導する、成長因子のいくつかのファミリー（例えば、ＰＤＧＦ）とは異なり、ＥＧＦなどの単量体型成長因子は、その受容体用に結合部位２つを含み、従って、近隣するＥＧＦ受容体２つを架橋連結することができる（Ｌｅｍｍｏｎ他、１９９７、ＥＭＢＯ Ｊ．、１６、２８１）。受容体の二量体化は、内因性触媒活性の刺激および成長因子受容体の自己リン酸化に対して、必須である。受容体型タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、ホモならびにヘテロ二量体化のいずれをも受けることができることには、注意すべきである。
【００１５】
抗ＥＧＦ受容体抗体は、ＥＧＦおよびＴＧＦ−ａの受容体への結合を妨害することで、腫瘍細胞の増殖を阻害できることが実証された。これらの知見を考慮して、ＥＧＦ受容体に対するネズミおよびラットモノクローナル抗体多数が開発され、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、腫瘍細胞の成長を阻害するその能力が試験された（ＭｏｄｊｔａｈｅｄｉおよびＤｅａｎ、１９９４、Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、４、２２７）。いずれもＥＧＦ受容体に特異性を有する、ヒト化モノクローナル抗体４２５（ｈＭＡｂ４２５、米国特許第５，５５８，８６４号、ヨーロッパ特許第０５３１ ４７２号）およびキメラモノクローナル抗体２２５（ｃＭＡｂ２２５、米国特許第４，９４３，５３３号およびヨーロッパ特許第０３５９ ２８２号）は、臨床試験において、その有効性を示した。該Ｃ２２５抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＦ媒介腫瘍細胞成長を阻害し、また、ヌードマウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト腫瘍形成を阻害することが検証された。さらに、該抗体は、とりわけ、特定の化学療法薬（すなわち、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソール、シスプラチン）と相乗的に作用して、異種移植マウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト腫瘍を根絶させるように見えた。Ｙｅ他（１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８、７３１）は、ＨＥＲ２受容体に対するヒト化ＭＡｂ４Ｄ５と、ｃＭＡｂ２２５との組合せによって、ヒト卵巣癌細胞の治療に成功したことを報告した。
【００１６】
ＥｒｂＢファミリーの第２のメンバーである、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２あるいはｐ１８５ｎｅｕ）は、最初、化学的に処置したラットの神経芽細胞腫より、形質転換遺伝子の産物として同定された。該ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域内における、点突然変異（バリンからグルタミン酸）により起こされる。ｎｅｕのヒト相同体の増幅は、乳房および卵巣癌中で観察され、予後不良と関連している（Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：１７７〜１８２、１９８７；Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：７０７〜７ １２、１９８９；米国特許第４，９６８，６０３号）。ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）は、約１８５，０００の分子量を有し、ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ１）と相当な相同性を有するが、現在までのところ、まだ、ＨＥＲ２の特異的リガンドは明確に同定されていない。
【００１７】
さらに、ＨＥＲ２に対する抗体４Ｄ５は、ＴＮＦαの細胞傷害効果に対して、ＥｒｂＢ２過剰発現乳房腫瘍細胞系を感受的にすることが見出された（米国特許第５，６７７，１７１号）。ネズミ抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５のヒト化組換え体（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）米国特許第５，８２１，３３７号）は、継続的に、事前の抗癌療法を受けている、ＥｒｂＢ２過剰発現転移性乳癌を有する患者において、臨床的な実効がある（Ｂａｓｅｌｇａ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１４：７３７〜７４４、１９９６）。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、その腫瘍はＥｒｂＢ２タンパク質を過剰発現している、転移性乳癌を有する患者の治療用に、１９９８年に販売承認を受けている。
【００１８】
ＴＮＦαは、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンド、ＴＲＡＩＬ、リンホトキシンなどの重要なサイトカインを含む、分子の大きなファミリーに属する（Ｌｏｃｋｓｌｅｙ他、２００１、Ｃｅｌｌ、１０４：４８７〜５０１）。多くの細胞種から放出されるほか、ＴＮＦαはまた、細胞膜に結合した、より高分子量の形態で、細胞上に存在しており、この形態も、様々な生物効果を媒介しているように見える。ＴＮＦαは、正常な発生および生理機能においては、殆ど役割を持っていないと考えられているが、しかし、これは、多くの疾病状態において、多くの組織に有害で破壊的な効果を及ぼす（Ｔｒａｃｅｙ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ、１９９４、４５：４９１）。ＴＮＦαが主要な役割を果たすことが示された疾病状態には、敗血性ショック症、癌悪液質、関節リウマチ等が含まれる。
【００１９】
ヒトＴＮＦαは、１９８５年に最初に精製された（Ａｇｇａｒｗａｌ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６０、２３４５〜２３５４参照）。そのすぐ後、ＴＮＦ ｃＤＮＡのクローニングおよびヒトＴＮＦ座位のクローニングがなされた（Ｐｅｎｎｉｃａ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９８４、３１２、１２４〜７２９；Ｗａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５、３１３、８０３〜８０６）。ＴＮＦαは、主にマクロファージによって産生される、三量体型の１７ＫＤａのポリペプチドである。このペプチドは、最初、２６ＫＤａの膜貫通タンパク質として発現され、そこから、タンパク質分解切断によって、該１７ＫＤａのサブユニットが切断され、放出される。ＴＮＦαは、通常、様々な細胞、例えば、活性化されたマクロファージや線維芽細胞により産生される。ＴＮＦαは、多くの多様な因子を誘導することが報告されている。ＴＮＦαはまた、直接的にまたは間接的に、伝染性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）や関節炎などの自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、敗血症、および特定の種類の感染症など、様々な疾病に関与することが報告されている。
【００２０】
ＴＮＦαならびに炎症応答性感染および組織傷害は、総称して炎症応答と呼ばれる、免疫系の複雑な反応の開始を誘起する、生化学変化のカスケードを誘発する。この応答の展開は、少なくとも部分的には、局部血管拡張または血管透過性の亢進や血管内皮の活性化に基づいており、それは、白血球の効率的な循環と損傷部位への遊走を可能とし、従って、なんらかの抗原へ結合し、破壊する確率を増進させる。その後、血管内皮が活性化するまたは炎症性になると考えられる。一般的に、炎症は、様々な予想外の刺激物に対する、即答性の免疫応答であり、それ故、迅速な開始および短い持続を（急性炎症）示す。しかし、その持続的なまたは制御されていない活性（慢性炎症）は、身体に有害な効果を有しており、敗血性ショック、関節リウマチ、炎症性腸疾患、うっ血性心不全などいくつかの免疫疾患の病因となる（「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、ＢｏｎａおよびＲｅｖｉｌｌａｒｄ（編）、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム、２０００、１１８〜１４８の「ＴＮＦ ａｎｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ」参照）。
【００２１】
ＴＮＦαだけでなく多くの他のサイトカインは、炎症応答の開始の直後に、マクロファージから分泌され、血液凝固を誘発し、血管透過性を増大させ、血管内皮細胞上の接着分子の発現を活性化させる。
【００２２】
ＴＮＦαは、宿主にとっては、完全に有利でも完全に破壊的でもない。従って、ＴＮＦαは、内皮細胞機能に対する強力なモジュレーターである。血管の状況に応じて、これは内皮細胞の活性化を誘発することによって炎症ならびに生存を促進し、あるいは、内皮細胞アポトーシスを誘発することによって組織壊死ならびに血管破壊を引き起こす（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．、Ｐａｔｈｏｌ Ｂｉｏｌ、Ｐａｒｉｓ、４６、１５９〜１６３、１９９８；ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．、７、９３〜１２４、１９９６）。これら２つの相反する応答を媒介する多くの細胞内シグナル経路が、特定さられているが（Ｗａｌｌａｃｈ他、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７、３３１〜３６７、１９９９）、ＴＮＦαに暴露された内皮細胞が、生存するか死滅するかを決定する、細胞外の合図（ｃｕｅ）は、未だに特定できていない。
【００２３】
確かに、その過程において、宿主の快適な状態を損なうことなく、宿主が侵入する微生物に対して、効率良く反応することを保証するために、その生成と制御の均衡は、維持される。炎症反応の媒体であるので、ＴＮＦαは、適切な免疫応答をブーストすることによって、細菌性感染および組織損傷に対する戦いにおいて、身体を助る。しかし、その過生産は、慢性炎症をもたらし、身体に有害な効果を有し、いくつかの疾患の発症に主要な役割を果たす。
【００２４】
ＩＦＮγは、ＴＮＦαの強力なエンハンサーである（Ｄｅａｌｔｒｙ他、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７、６８９〜６９３、１９８７）。ＴＮＦαが細胞アポトーシスを引き起こす場合、細胞の生存を促進する転写因子である、ＮＦ−кＢの活性化は、ＴＮＦα誘発性アポトーシスを抑制する可能性がある（Ｖａｎ Ａｎｔｗｅｒｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７８７〜７８９、１９９６）。
【００２５】
ＴＮＦαは、増殖、活性化、分化など細胞応答の他、プログラムされた細胞死をももたらす、幅広い種類の細胞性シグナルを誘導する。ＴＮＦαに対する細胞シグナリングは、キナーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、転写因子の活性化などの初期応答、ならびに、後期応答、従って、ミトコンドリア内の電子伝達鎖の摂動、ラジカル生成、オキシド生成、および様々な物質の放出などの、より間接的な応答に分類される。死亡ドメイン含有アダプタータンパク質の供給、ＮＦкＢの活性化、カスパーゼ活性化などの初期細胞応答の多くもまた、ＴＮＦリガンドファミリーの他のメンバーがそれぞれの受容体に結合することによって開始される。従って、リンホトキシン、ＦａｓリガンドやＴＲＡＩＬなどの分子は、ＴＮＦとともに、余分に作用することができる（ＧｒｅｌｌおよびＣｌａｕｓｓ、Ｉ．ｃ．）。
【００２６】
インテグリンによって媒介される細胞外基質（ＥＣＭ）への接着は、内皮細胞を含めたほとんどの細胞の生存にとって、必須である。例えば、血管性インテグリンαＶβ３は、血管新生内皮細胞の増殖および生存を促進し、αＶβ３拮抗剤は、血管新生内皮細胞のアポトーシスを誘導し、血管新生を抑制する（Ｂｒｏｏｋｓ他、Ｃｅｌｌ、７９、１１５７〜１１６４、１９９４）。ＰＩ ３−Ｋ／ＡＫＴ（Ｋｈｗａｊａ他、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ、１６、２７８３〜２７９３、１９９７）ならびにＮＦ−кＢ（Ｓｃａｔｅｎａ他、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１４１、１０８３〜１０９３、１９９８）のシグナル経路の活性化を含む、インテグリン媒介細胞生存に関連する生化学現象のいくつかが同定された。インテグリンの他に、ＰＥＣＡＭ−１およびＶＥカドヘリンの細胞−細胞接着分子も、内皮細胞生存を促進する（Ｂｉｒｄ他、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ、１１２、１９８９〜１９９７、１９９９；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ他、Ｃｅｌｌ、９８、１４７〜１５７、１９９９）。
【００２７】
ＴＮＦは、一部の腫瘍細胞系にとって細胞傷害性であるが、これらのほとんどは、増殖には影響を受けない。従って、一部の動物モデルにおけるＴＮＦの抗腫瘍性効果（Ｂａｌｋｗｉｌｌ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４６：３９９０〜３９９３、１９８６）は、腫瘍細胞に対するサイトカインの直接的な作用に起因するとは考えにくい。いくつかの研究では、宿主媒介機構が、ＴＮＦによって誘起された腫瘍退行に関与していることが示された（Ｍａｎｄａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３７０７〜３７１１、１９８７）。累積されたデータは、ＴＮＦによる腫瘍の出血性壊死は、腫瘍内血管の内皮細胞レベルで開始されていることを示唆している（Ｈａｖｅｌｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７：１９６７〜１９８５、１９８８）。
【００２８】
癌患者における、ＴＮＦの臨床研究の結果は、概して、期待はずれである（Ｈａｒａｎａｋａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄ．、７：５２５〜５３４、１９８８の総説）。一般的に、ＴＮＦの抗腫瘍性効果は、相当な副作用によって制限されている。ＴＮＦの副作用を制限する１つのアプローチは、ＴＮＦ受容体型１に特異的な活性あるいは異なった薬力学特性を示しているＴＮＦ突然変異体の創製であった（Ｂｒｏｕｃｋａｅｒｔ他、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ、４３：１８５〜１９０、１９９４；Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１８：３８９９〜３９０５、１９９８；Ｌｕｃａｓ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１５：５４３〜５４９、２００１）。最近、黒色腫や末肢の肉腫を患っている患者において、進展が見られた。分離灌流技術（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって、有意で有益な効果を得ることができる。細胞増殖抑制剤またはＩＦＮと組み合わせて、４ｍｇに達するＴＮＦの極端な用量が利用される（Ｌｉｅｎａｒｄ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１０：５２〜６０、１９９２）。局部応答には、ネズミの系におけるＴＮＦ媒介抗腫瘍効果と類似する、強い炎症応答に付随した、腫瘍の急性軟化および赤色化が含まれる。
【００２９】
肢部の転移性黒色腫を有する患者に対するこの処置は、腫瘍血管構造を選択的に破壊するが、静止状態の血管を無傷のままに残すことが示された。この効果は、ＴＮＦおよびＩＦＮγによって誘発された、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、内皮細胞中のインテグリンαＶβ３機能の抑制、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの内皮細胞アポトーシスの誘発に関連している（Ｒｕｅｇｇ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、４、４０８〜４１４、１９９８）。これらの結果は、付加的な治療薬と組み合わせた、ＴＮＦは、全身性毒性を制御できることを条件として、一部の腫瘍の治療において、臨床的に非常に効果的となりえることを証明している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明では次に、インテグリンなどの、血管新生に寄与する分子は、ＴＮＦα活性を調節するが、抗癌剤としての、ＴＮＦαの臨床的使用に直接関与している可能性があることを説明する。ＴＮＦαとともに、抗血管新生剤、好ましくは、インテグリン拮抗剤を共投与すると、血管新生受容体を有する内皮細胞を、ＴＮＦのアポトーシス活性に対して、選択的に感受性とさせ、その結果、改良された腫瘍血管破壊を起こせる可能性がある。従って、この組合せ療法では、ＴＮＦの用量削減を可能とし、ＴＮＦの全身性副作用の回避が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、初めて、ＴＮＦα、ＴＮＦ突然変異体またはＴＮＦ様分子とともに、血管新生を妨害または抑制する薬剤を個体に投与するという、腫瘍の治療における新しい着想を記載する。場合によっては、本発明にかかる組成物は、下記により詳細に記載するように、好ましくは、細胞傷害剤、化学療法剤、ならびに、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤または拮抗剤からなる群から選択される、治療上活性のある化合物をさらに含む。
【００３２】
従って、本発明は、好ましい抗血管新生剤として、インテグリン（受容体）拮抗剤、ならびに、ＴＮＦα、ＴＮＦ突然変異体またはＴＮＦ様分子を治療有効量含んでなる医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、直鎖または環状のＲＧＤペプチドおよびＴＮＦαを、場合によっては、ＩＦＮγと一緒に含んでなる医薬組成物に関する。本発明にかかる好ましい組成物は、環状ペプチド シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅ−Ｖａｌ）、ＴＮＦαおよびＩＦＮγが含まれる。本発明によれば、前記治療的に活性のある薬剤は、１つまたは複数の抗血管新生剤、ＴＮＦα、ならびに、場合によっては、１つまたは複数の細胞傷害剤／化学療法剤／抗ＥｒｂＢ剤を、単一のパッケージまたは別個の容器中に含んでなる、パッケージを含む製薬キットによって、提供することもできる。
【００３３】
より具体的には、本発明は、それぞれ、少なくとも、一つの分子は、血管新生阻害活性を有し、他の一つは、ＴＮＦαである、２つまたはそれ以上の分子の適用および投与からなる、組合せ療法に関する。また、本発明はさらに、抗血管新生活性およびＴＮＦα活性を有する、単一の（融合）分子のみの、場合によっては、１つまたは複数の細胞傷害剤／化学療法剤と共に、投与することからなる、組合せ療法に関する。例えば、実質的に、ＴＮＦαに対して、直接またはリンカー分子を介して融合された、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅ−Ｖａｌ）からなるタンパク質を患者に施用することができる。別の例は、そのＦｃ部分のＣ末端において、ＴＮＦαと融合されている、以下に記載するＬＭ６０９のような、抗インテグリン抗体である。さらなる例は、特異性の１つは、インテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体に向けられ、もう１つは、ＥＧＦ受容体に向けられる、ＴＮＦαと融合された、二重特異性抗体である。
【００３４】
一般に、投与は、放射線療法を伴って行うことができ、放射線治療は、薬物投与と実質的に同時に、あるいはその前または後に行うことができる。本発明かかる組合せ療法の異なる薬剤の投与もまた、実質的に同時にあるいは順序に従って行うことができる。腫瘍の血管発生に関与する、受容体をその細胞表面に具えている腫瘍は、本発明の組合せ療法によりうまく治療することができる。
【００３５】
腫瘍は、その発生および増殖のため、代替ルートを誘導することが知られている。１つの経路が阻害された場合、これらは、しばしば、他の受容体とシグナル経路とを発現および利用して、別のルートに切り替える能力を有している。従って、本発明の薬剤組合せでは、腫瘍のこのような可能な発生戦略のいくつかを妨害して、その結果、様々な利点を提供する。本発明にかかる組合せは、下により詳細に記載するように、腫瘍、腫瘍様ならびに異常増殖性疾患、および腫瘍転移の治療および防止に有用である。好ましくは、本発明の組み合わせられる、個々の薬剤は、低用量、すなわち臨床の場で従来使用されてきた用量より低い用量で、組み合わせて投与する。個体に投与される、本発明の化合物、組成物、薬剤、および療法の用量を低下させることの利点には、より高い用量に付随する副作用の影響を低下させることが含まれる。例えば、メトトレキセートなどの化学療法剤の用量を減らすことによって、より高い用量において観察されるものに比べて、嘔気および嘔吐の頻度および重篤度の軽減がもたらされる。副作用の影響を軽減させることによって、癌患者の生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）の改善が図られる。副作用の影響を低下させるさらなる利点には、患者の負担の改善、副作用の治療のために必要な入院回数の減少、副作用に付随する苦痛を治療するのに必要な鎮痛剤の投与の低減が含まれる。あるいは、本発明の方法および組合せは、より高い用量では、治療効果を最大限にすることもできる。
【００３６】
本発明にかかる組合せは、驚くほどの相乗効果を示す。この薬剤の組合せを投与すると、顕著な薬物の悪い反応は検出できなかったが、臨床研究中に現実の腫瘍縮小および分解が観察される。
【００３７】
詳細には、本発明は、下記のものに関する：
・少なくとも（ｉ）１つの抗血管新生剤および（ｉｉ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはＴＮＦαの生物活性を有する分子を、治療有効量で、場合によっては、製薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と共に含んでなる医薬組成物；
・前記抗血管新生剤は、インテグリン（受容体）阻害剤／拮抗剤またはＶＥＧＦ（受容体）阻害剤／拮抗剤であることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記インテグリン受容体阻害剤／拮抗剤は、ＲＧＤ含有の直鎖または環状のペプチドであることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記ＲＧＤ含有ペプチドは、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）であることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記抗血管新生剤は、インテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体と結合する、抗体あるいは免疫療法的に活性なその断片であることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記抗血管新生剤とＴＮＦαとが連結されて、１つの融合分子を形成することを特徴とする、対応の医薬組成物；
・少なくとも１つの細胞傷害剤およびまたは化学療法剤をさらに含むことを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記細胞傷害剤は、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）および／または別の効果的なサイトカインであることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記化学療法化合物は、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル（タキソール）、ブレオマイシンからなる群から選択されることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤または拮抗剤をさらに含むことを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ−２抗体あるいは免疫療法的に活性なその断片であることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・（ｉ）少なくとも１つの抗血管新生剤、好ましくはインテグリン受容体阻害剤／拮抗剤、（ｉｉ）ＴＮＦα、ならびに、場合によっては、（ｉｉｉ）さらに細胞傷害剤および／または化学療法剤を含んでなるパッケージからなる製薬キット；
・（ｉ）シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）、（ｉｉ）ＴＮＦα、および（ｉｉｉ）ＩＦＮγ、ならびに、場合によっては、（ｉｉｉ）さらなる細胞傷害剤および／または化学療法剤および／またはＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤または拮抗剤を含んでなる、対応の好ましい製薬キット；
・前記製薬的に活性な薬剤は、前記パッケージ中において、個別の容器内で提供されることを特徴とする、対応の製薬キット；
・腫瘍および腫瘍転移を治療するための医薬または医薬組成物の製造における、特許請求の範囲中、ならびに上に定義されている医薬組成物の使用；ならびに
・上に定義されている、治療的に有効な医薬組成物を、同時にまたは順序に従って、個体に投与することを含む、個体中における腫瘍または腫瘍転移を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１ａ】ＨＵＶＥＣ球状体の形成および生存は、インテグリン・ライゲーションを必要としない。（ａ）阻害性の抗ＶＥカドヘリン（７５）ｍＡｂまたはＣａ2+欠乏（ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／Ｃａ2+）は、ＨＵＶＥＣ球状体の形成を阻害したが、インテグリンα１（Ｌｉａ１／２）、α５（ＳＡＭ−１）、αＶβ３（ＬＭ６０９）およびＰＥＣＡＭ−１（１０Ｄ９）やＲＧＤペプチドに対する阻害性ｍＡｂは、阻害しなかった。
【図１ｂ】（ｂ）生存度。球状体（○）またはフィブロネクチン（●）培養物から回収されたＨＵＶＥＣは、類似の生存プロフィールを有していた。
【図２ａ】インテグリン依存性接着は、ＨＵＶＥＣをＴＮＦ誘発性アポトーシスから保護する。（ａ）ＹｏＰｒｏ−１の取り込み：ＴＮＦ（Ｔ）およびＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）への暴露は、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣ中でＹｏＰｒｏ−１染色を誘発しなかったが、ＨＵＶＥＣ球状体中では、強いＹｏＰｒｏ−１染色を引き起こし、カスパーゼ阻害剤ＢＯＣおよびＺＶＡＤにより抑制された。ＴＮＦ±ＩＦＮγ（ＴＩ）。Ｃ、非処理の培養物
【図２ｂ】（ｂ）ＴＮＦ／ＩＦＮγで処理した（ＴＩ）球状体における、ウェスタン・ブロッティングによる、カスパーゼ−３の活性化とＰＡＲＰの切断（矢印）を示し、しかし、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣ中では生じていない。Ｃ、非処理の培養物。
【図２ｃ】（ｃ）ＴＮＦ（■）、ＴＮＦ／ＩＦＮγ（▲）、対照培地（○）に暴露させた、ＨＵＶＥＣの生存度曲線である。
【図２ｄ】（ｄ）ＴＮＦ（■）、ＴＮＦ／ＩＦＮγ（▲）、対照培地（○）に暴露させた、ＨＵＶＥＣの生存度曲線である。
【図２ｅ】（ｅ）α１（△／▲）、αＶβ３（□／■）、α４インテグリン（○／●）に対する特異的な固定化抗体（ｉｍＡｂｓ）上で、ＴＮＦ／ＩＦＮγの非存在下（中空記号）または存在下（中実記号）で培養したＨＵＶＥＣの生存度である。
【図３ａ】ＴＮＦ誘発性のＮＦ−κＢ活性化はインテグリン・ライゲーションを必要としない。（ａ）ウエスタン・ブロットおよび（ｂ）電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、ＴＮＦ／ＩＦＮγに暴露させた球状体ならびにフィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣにおける、Ｉ−κＢリン酸化（Ｐｉ−κＢ）、Ｉ−κＢ分解（Ｉ−κＢ）およびＮＦ−κＢ核移行（ＥＭＳＡ）の平行した動態を示す。
【図３ｂ】（ａ）ウエスタン・ブロットおよび（ｂ）電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、ＴＮＦ／ＩＦＮγに暴露させた球状体ならびにフィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣにおける、Ｉ−κＢリン酸化（Ｐｉ−κＢ）、Ｉ−κＢ分解（Ｉ−κＢ）およびＮＦ−κＢ核移行（ＥＭＳＡ）の平行した動態を示す。
【図３ｃ】（ｃ）ＴＮＦ（−−−）またはＴＮＦ／ＩＦＮγ（−）に暴露させたフィブロネクチンおよび球状体ＨＵＶＥＣ培養物上における、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現の、同一の誘導を示すフロー・サイトメトリー解析。（．．．）非処理の細胞。ＰＥＣＡＭ−１の発現を、対照として示す。
【図４ａ】Ａｋｔの活性化は、ＨＵＶＥＣの生存に必須であり、インテグリン・ライゲーションを要する。（ａ）表示の時間、ＴＮＦ／ＩＦＮγで刺激したフィブロネクチン接着性および球状体ＨＵＶＥＣの培養物中のリン酸化Ａｋｔ（Ｐｉ−Ａｋｔ）および全Ａｋｔ（Ａｋｔ）。
【図４ｂ】（ｂ）左パネル：ＰＩ−３キナーゼ阻害剤ワートマニン（Ｗ）およびＬＹ２９４００２（ＬＹ）は、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣをＴＮＦ（Ｔ）およびＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）誘発性アポトーシスに対して、感受性とさせた。死亡細胞を、ＹｏＰｒｏ−１染色によって可視化した。右パネル：ＬＹ２９４００２（●）、ＴＮＦ／ＩＦＮγ（△）、ＬＹ２９４００２／ＴＮＦ／ＩＦＮγ（▲）に曝した、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣの生存曲線である。（○）、非処理培養物。
【図４ｃ】（ｃ）構成的に活性な、ＰＩ−３キナーゼ（ｐ１１０*）およびＡｋｔ（Ａｋｔｍｐ）は、ＴＮＦ（●）またはＴＮＦ／ＩＦＮγ（▲）に曝した球状体の生存を促進したが、野生型Ａｋｔ（Ａｋｔｗｔ）または対照プラスミド（ｐＢＳ）は促進しなかった。（○）非処理の培養物。挿入は、形質移入された細胞のＥＧＦＰ蛍光のフロー・サイトメトリー解析を示す（％陽性細胞）。
【図４ｄ】（ｄ）対照プラスミド（ｐＢＳ）または構成的に活性のあるＡｋｔ（Ａｋｔ*）を用いて電気穿孔し、ＡｄΔＮＩ−κＢまたはＡｄＬａｃＺで感染させたＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ（Ｔ）またはＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）の存在下、あるいは非存在下（Ｃ）において、フィブロネクチン接着性単層または球状体として、培養した。アポトーシス細胞を、ＹｏＰｒｏ−１染色によって検出した。生存しているフィブロネクチン接着性細胞は、クリスタル・バイオレットによって染色した。
【図４ｅ】（ｅ）対照プラスミド（中空記号）およびｐＡｋｔｍｐ（中実記号）を用いて電気穿孔し、ＡｄΔＮＩ−κＢ（○／●）またはＡｄＬａｃＺ（△／▲）で感染させたＨＵＶＥＣをフィブロネクチン上、段階的な濃度のＴＮＦの存在下で培養し、生存している接着細胞を、クリスタル・バイオレットで染色したウェルのＯ．Ｄ．を測定することによって決定した。
【図４ｆ】（ｆ）非処理のＨＵＶＥＣ（．．．）、ならびにＴＮＦ（−−−）およびＴＮＦ／ＬＹ２９４００２（−）で処置したＨＵＶＥＣ中（左パネル）、ならびにＴＮＦ（−−−）およびＴＮＦ／ＩＦＮγ（−）に曝した、ＡｄΔＮＩ−κＢ（中央パネル）またはＡｄＬａｃＺで感染させたＨＵＶＥＣ中における、ＩＣＡＭ−１発現のフロー・サイトメトリー解析。
【図５ａ】（ａ〜ｃ）表示した時間、ＴＮＦ／ＩＦＮγに曝した、フィブロネクチンならびに球状体ＨＵＶＥＣ培養物中における、Ｐｉ−Ａｋｔ、ＭＤＭ２、ｐ５３、Ｐｉ−ＦＫＨＲ／ＦＲＫＨＬ１（ａ）、およびＰｉ−ＭＥＫ、Ｐｉ−ｐ３８、Ｐｉ−ＪＮＫ（ｂ）、およびＰｉ−ＥＲＫ（ｃ）のウエスタン・ブロット分析。全Ａｋｔ、ＦＫＨＲ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、およびＪＮＫタンパク質は、等量の全タンパク質を証明するため、示されている。球状体培養物は、フィブロネクチン接着性細胞に比べて、ＴＮＦ／ＩＦＮγへの応答において、ＡｋｔおよびＦＫＨＲ／ＦＫＲＬ１のリン酸化の欠乏、増大したレベルのｐ５３、およびＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫのリン酸化の増強を有する。
【図５ｂ】（ａ〜ｃ）表示した時間、ＴＮＦ／ＩＦＮγに曝した、フィブロネクチンならびに球状体ＨＵＶＥＣ培養物中における、Ｐｉ−Ａｋｔ、ＭＤＭ２、ｐ５３、Ｐｉ−ＦＫＨＲ／ＦＲＫＨＬ１（ａ）、およびＰｉ−ＭＥＫ、Ｐｉ−ｐ３８、Ｐｉ−ＪＮＫ（ｂ）、およびＰｉ−ＥＲＫ（ｃ）のウエスタン・ブロット分析。全Ａｋｔ、ＦＫＨＲ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、およびＪＮＫタンパク質は、等量の全タンパク質を証明するため、示されている。球状体培養物は、フィブロネクチン接着性細胞に比べて、ＴＮＦ／ＩＦＮγへの応答において、ＡｋｔおよびＦＫＨＲ／ＦＫＲＬ１のリン酸化の欠乏、増大したレベルのｐ５３、およびＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫのリン酸化の増強を有する。
【図５ｃ】（ａ〜ｃ）表示した時間、ＴＮＦ／ＩＦＮγに曝した、フィブロネクチンならびに球状体ＨＵＶＥＣ培養物中における、Ｐｉ−Ａｋｔ、ＭＤＭ２、ｐ５３、Ｐｉ−ＦＫＨＲ／ＦＲＫＨＬ１（ａ）、およびＰｉ−ＭＥＫ、Ｐｉ−ｐ３８、Ｐｉ−ＪＮＫ（ｂ）、およびＰｉ−ＥＲＫ（ｃ）のウエスタン・ブロット分析。全Ａｋｔ、ＦＫＨＲ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、およびＪＮＫタンパク質は、等量の全タンパク質を証明するため、示されている。球状体培養物は、フィブロネクチン接着性細胞に比べて、ＴＮＦ／ＩＦＮγへの応答において、ＡｋｔおよびＦＫＨＲ／ＦＫＲＬ１のリン酸化の欠乏、増大したレベルのｐ５３、およびＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫのリン酸化の増強を有する。
【図６ａ】低下したインテグリン・ライゲーションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦの細胞傷害を増強させる。（ａ）フィブロネクチンまたはＰＬＬ上で１６時間、ＴＮＦ（Ｔ）またはＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）の存在下、あるいは非存在下（Ｃ）、ＨＵＶＥＣを培養する。アポトーシスおよび生存の接着性細胞を、それぞれ、ＹｏＰｒｏ−１およびクリスタル・バイオレット染色により明らかにした。
【図６ｂ】（ｂ）ＥＭＤ１２１９７４は、αＶβ３媒介のＨＵＶＥＣのゼラチンへの接着（■）を破壊したが、α５β１／αＶβ３に媒介されたフィブロネクチンへの接着のα５β１成分（●）では、これは起こらなかった。対照ペプチドＥＭＤ１３５９８１は、効果がなかった（中空記号）。
【図６ｃ】（ｃ）ＨＵＶＥＣをフィブロネクチン上で、表示するように、ＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）、ＥＭＤ１２１９７４、ＥＭＤ１３５９８１の存在下、または非存在下（Ｃ）に培養した。アポトーシスおよび接着細胞は、それぞれ、ＹｏＰｒｏ−１染色および対比顕微鏡観察によって明らかにした。
【図６ｄ】（ｄ）パネルｃの実験におけるＨＵＶＥＣの生存曲線。ペプチドなし（○／●）；ＥＭＤ１２１９７４（△／▲）；ＥＭＤ１３５９８１（□／■）。非処理培養物、中空記号。ＴＮＦ／ＩＦＮγで処置した培養物、中実記号。
【図６ｅ】（ｅ）Ａｋｔｍｐ（中空記号）またはｐＢＳ（中実記号）を用いて電気穿孔し、フィブロネクチン上で培養し、そのまま、（○／●）、またはＥＭＤ１２１９７４（△／▲）、ＥＭＤ１３５９８１（□／■）ペプチドの存在下において、ＴＮＦ／ＩＦＮγに曝したのＨＵＶＥＣの生存曲線を示す。Ａｋｔｍｐは、ＥＭＤ１２１９７４とＴＮＦ／ＩＦＮγとの組合せ治療によって誘発された細胞死を防止した。
【図７】インテグリン・ライゲーションの減少は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦ細胞傷害を増強させる。ＢＮ−１７５同系軟組織肉腫を保有するＢＮラットを、ＩＬＰ技術によってＥＭＤ１２１９７４（□）、ＴＮＦ（△）、ＥＭＤ１２１９７４／ＴＮＦ（■）を用いて治療した。（○）偽治療のラット。ＩＬＰ後の６日間腫瘍の増殖を測定した。結果は、腫瘍体積の平均±平均値の標準誤差（ｎ＝６）を表す。同系軟組織肉腫ＢＮ−１７５の小さな断片を雄ＭＮラットの右後肢に移植し、直径が１２〜１４ｍｍに達した時に治療を開始した（Ｍａｎｕｓａｍａ他、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、６、１７３〜１７７、１９９９）。大腿動脈および静脈をシラスチック・チューブを用いてカニューレ処置し、圧迫帯を用いて側肢を閉塞させた。３０分間、５ｍｌのＨｅａｍａｃｃｅｌ（登録商標）（２．４ｍｌ／分）を用いて灌流を実施し、薬剤は大量瞬時投与として加えた（ＥＭＤ１２１９７４、５００μｇ、灌流液での最終濃度１７０μＭ；ＴＮＦ、５０μｇ）。灌流液に酸素添加し、肢を暖かいマットレス上で３８〜３９℃に保った。ＥＭＤ１２１９７４を用いて灌流したラットには、ＩＬＰの２時間前および３時間後にペプチドの全身投与も受けさせた（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）。カリパー測定によって腫瘍の直径を２方向で測定し、腫瘍体積（Ｖ）を計算した（Ｖ＝０．４）（Ａ2×Ｂ、式中Ｂはより長い直径、ＡはＢに垂直な直径）。各グループ６匹のラットを治療した。局所的および全身性の副作用を、記載のように評価した（Ｍａｎｕｓａｍａ他、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、６、１７３〜１７７、１９９９）。
【図８】インテグリン・ライゲーションの低下はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、およびＦａｓＬ誘発性細胞傷害を増強させる。ＨＵＶＥＣを終夜、フィブロネクチンでコーティングしたマイクロタイタープレート上で、ＥＭＤ１２１９７４（３００μＭ）、ＴＮＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＦａｓＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＩＧＨＴ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（３３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、または存在させずに、指示どおり培養した。生存度はＭＳＴアッセイによって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
別段に指示しない限り、本発明中で使用される用語および表現は、以下に与える意味および定義を有する。さらに、これらの定義および意味は、本発明、含まれる、好ましい態様をより詳細に説明する。
【００４０】
「生体分子」には、原則として、約３００より大きい分子量を有する、天然または合成された分子が含まれ、好ましくは、ポリ−およびオリゴ糖類、オリゴ−およびポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリ−およびオリゴヌクレオチド、ならびにそれらのグリコシル化された脂質誘導体である。最も典型的には、生体分子には、免疫療法薬剤、上記の全ての抗体またはその断片、あるいは、融合タンパク質を含む、これら抗体または断片の機能的な誘導体断片が含まれる。
【００４１】
「受容体」または「受容体分子」とは、リガンドが結合して、受容体−リガンド複合体を形成する、１つまたは複数のドメインを含んでなる、可溶性または膜結合型／連結型のタンパク質あるいは糖タンパク質である。受容体の作用剤または拮抗剤である可能性のある、リガンドと結合することで、該受容体は、活性化または不活性化され、信号伝達の経路を開始あるいは妨害する可能性がある。
【００４２】
「リガンド」または「受容体リガンド」とは、受容体分子と結合して、受容体−リガンド複合体を形成する、天然または合成の化合物を意味する。リガンドの用語は、作用剤、拮抗剤、ならびに、部分的な作用剤／拮抗剤作用を有する化合物を含む。本発明の具体的な分野によると、この用語には、特に、ＴＮＦ様リガンドが含まれる。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「ＴＮＦα」は、具体的に限定されていなければ、天然および合成の、ペプチド性または非ペプチド性のＴＮＦ突然変異体、変異体またはＴＮＦ様リガンドを含む、全ての種類のＴＮＦ分子ならびにＴＮＦαの生物活性を有する分子を含む。好ましくは、この用語は、天然のペプチド性ＴＮＦαを意味する。
【００４４】
「作用剤」または「受容体作用剤」とは、前記受容体および受容体−作用剤複合体を活性化させることによって、それぞれ、信号伝達の経路ならびにさらなる生体プロセスを開始させる、受容体と結合して、受容体−作用剤複合体を形成する、天然または合成の化合物である。
【００４５】
「拮抗剤」または「受容体拮抗剤」とは、作用剤と反対の生物学的効果を有する天然または合成化合物を意味する。拮抗剤は、受容体と結合して、受容体に対する作用剤と競合することによって、受容体作用剤の作用を妨害する。拮抗剤は、作用剤の作用を妨害するその能力によって、定義される。受容体拮抗剤は、抗体や免疫療法上有効なその断片であってもよい。本発明にかかる、好ましい拮抗剤は、以下に列挙し、論じる。
【００４６】
用語「治療上有効」または「治療有効量」とは、哺乳動物中の疾患または傷害を治療するのに有効な薬物の量をいう。癌の場合、薬物の治療有効量は、癌細胞の数を減らす、腫瘍の大きさを縮小させる、癌細胞の末梢組織への浸潤を阻害する（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させる）、ある程度まで腫瘍増殖を阻害する、および／または癌に付随する１つまたは複数の症状をある程度まで軽減させることができる。この薬物が、存在する癌細胞の増殖を阻止かつ／または死滅させる限り、これは、細胞増殖抑制的および／または細胞傷害性であるあってもよい。癌の療法では、有効性は、例えば、疾病の進行までの時間（ＴＴＰ）の評価、および／または応答速度（ＲＲ）の決定により、測定することができる。
【００４７】
用語「免疫療法上効果的」とは、哺乳動物内で免疫応答を引き起こす生物学的分子をいう。より具体的には、この用語は、抗原を認識して結合することができる分子をいう。通常は、その抗原結合部位（相補性決定領域、ＣＤＲ）を含む抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は、免疫療法上効果的である。
【００４８】
本出願中で使用する用語「プロドラッグ」とは、親薬物に比べて、腫瘍細胞に対する細胞傷害性は低いが、酵素的に活性化されるまたはより活性のある親の形態へと変換され得る、製薬的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を意味する（例えば、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、ページ３７５〜３８２、６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ、１９８６参照）。
【００４９】
「抗血管新生剤」とは、血管の発生を妨害する、またはある程度まで妨げる、天然または合成化合物をいう。抗血管新生分子は、例えば、血管新生増殖因子または増殖因子受容体に結合して、妨害する生物学的分子であってもよい。本明細書中において、好ましい抗血管新生分子は、受容体、好ましくは、インテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体に結合する。本発明によれば、この用語は、前記血管新生剤のプロドラッグも含む。
【００５０】
抗血管新生特性を発揮する、異なる構造および起源を有する多くの分子が存在する。本発明に適した、血管新生阻害または妨害剤の最も適切なクラスは、例えば、以下のものある。
（ｉ）抗有糸分裂剤：フルロウラシル、マイトマイシン−Ｃ、タキソールなど；
（ｉｉ）エストロゲン代謝産物：２−メトキシエストラジオールなど；
（ｉｉｉ）マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤：亜鉛メタロプロテイナーゼ（メタロプロテアーゼ）（例えば、ベチマスタット（ｂｅｔｉｍａｓｔａｔ）、ＢＢ１６、ＴＩＭＰ類、ミノサイクリン、ＧＭ６００１）を阻害するもの、あるいは「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｇｏｌｕｂ、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第８７８ａ巻、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｚｕｃｋｅｒ（編集）、１９９９）に記載のもの；
（ｉｖ）抗血管新生性多機能薬剤および因子：ＩＦＮα（米国特許第４，５３０，９０１号、米国特許第４，５０３，０３５号、米国特許第５，２３１，１７６号）；アンギオスタチンおよびプラスミノーゲン断片（例えば、クリングル１−４、クリングル５、クリングル３（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｍ．Ｓ．他、Ｃｅｌｌ（マサチューセッツ州ケインブリッジ）、７９（２）：３１５〜３２８、１９９４；Ｃａｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２９４６１〜２９４６７、１９９６；Ｃａｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７２：２２９２４〜２２９２８、１９９７）；エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．他、Ｃｅｌｌ、８８（２）、２７７、１９９７および国際公開公報ＷＯ ９７／１５６６６号）；トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１；Ｆｒａｚｉｅｒ、１９９１、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、３（５）：７９２）；血小板因子４（ＰＦ４）など；
（ｖ）プラスミノーゲン活性化剤／ウロキナーゼ阻害剤；
（ｖｉ）ウロキナーゼ受容体拮抗剤；
（ｖｉｉ）ヘパリナーゼ；
（ｖｉｉｉ）フマギリン類似体：ＴＮＰ−４７０など；
（ｉｘ）チロシンキナーゼ阻害剤：ＳＵＩ０１など（上および下に述べるＥｒｂＢ受容体拮抗剤（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２拮抗剤）の多くも、チロシンキナーゼ阻害剤であり、従って、腫瘍増殖の阻害をもたらす抗ＥＧＦ受容体阻害活性と同様に、血管および内皮細胞の発生の阻害をもたらす、抗血管形新生活性をも示す可能性がある）；
（ｘ）スラミンおよびスラミン類似体；
（ｘｉ）血管新生抑制性ステロイド；
（ｘｉｉ）ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ拮抗剤；
（ｘｉｉｉ）ＶＥＧＦ受容体拮抗剤：抗ＶＥＧＦ受容体抗体（ＤＣ−１０１）など；
（ｘｉｖ）ｆｌｋ−１およびｆｌｔ−１拮抗剤；
（ｘｖ）シクロオキシゲナーゼ−ＩＩ阻害剤：ＣＯＸ−ＩＩなど；
（ｘｖｉ）インテグリン拮抗剤およびインテグリン受容体拮抗剤：αｖ拮抗剤およびαｖ受容体拮抗剤、例えば、抗αｖ受容体抗体およびＲＧＤペプチドなど。本発明によれば、インテグリン（受容体）拮抗剤が好ましい。
【００５１】
用語「インテグリン拮抗剤／阻害剤」または「インテグリン受容体拮抗剤／阻害剤」とは、インテグリン受容体を妨害および阻害する、天然または合成分子をいう。ある場合には、この用語には、前記インテグリン受容体のリガンドに対する拮抗剤を含む（例えば、αVβ3に対しては：ビトロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、フォンウィルブランド因子、トロンボスポンジン、ラミニン、αVβ5に対しては：ビトロネクチン、αVβ1に対しては：フィブロネクチンおよびビトロネクチン、αVβ6に対しては：フィブロネクチン）。
【００５２】
本発明によれば、インテグリン受容体に対する拮抗剤が好ましい。インテグリン（受容体）拮抗剤は、天然または合成ペプチド、非ペプチド、ペプチド擬態、免疫グロブリン、抗体やその機能的断片などの、あるいは、免疫複合体（融合タンパク質）であってよい。
【００５３】
本発明の好ましいインテグリン阻害剤は、αVインテグリン（例えば、αVβ3、αVβ5、αVβ6、およびサブクラス）受容体に対するものである。好ましいインテグリン阻害剤は、αV拮抗剤、特に、αVβ3拮抗剤である。本発明にかかるαV拮抗剤は、ＲＧＤペプチド、ペプチド擬態（非ペプチド）拮抗剤、およびαV受容体を阻害する抗体などの、抗インテグリン受容体抗体である。
【００５４】
例示すれは、非免疫性αVβ3拮抗剤は、米国特許第５，７５３，２３０号および米国特許第５，７６６，５９１号の教示に記載されている。好ましい拮抗剤は、直鎖および環状のＲＧＤ含有ペプチドである。環状ペプチドは、一般的に、より安定であり、延長された血清半減期を発揮する。しかし、本発明の最も好ましいインテグリン拮抗剤は、インテグリンαVβ3、αVβ1、αVβ6、αVβ8、αIIbβ3の阻害に効果的である、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（ＥＭＤ１２１９７４、Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ、ドイツ；ヨーロッパ特許第０７７０ ６２２号）である。
【００５５】
αVβ3／αVβ5／αVβ6インテグリン受容体の適切なペプチド型およびペプチド擬態（非ペプチド）拮抗剤は、科学文献ならびに特許文献のいずれかに記載されている。例えば、ＨｏｅｋｓｔｒａおよびＰｏｕｌｔｅｒ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５、１９５；国際公開 ＷＯ ９５／３２７１０号；国際公開 ＷＯ ９５／３７６５５号；国際公開 ＷＯ ９７／０１５４０号；国際公開 ＷＯ ９７／３７６５５号；国際公開 ＷＯ ９７／４５１３７号；国際公開 ＷＯ ９７／４１８４４号；国際公開 ＷＯ ９８／０８８４０号；国際公開 ＷＯ ９８／１８４６０号；国際公開 ＷＯ ９８／１８４６１号；国際公開 ＷＯ ９８／２５８９２号；国際公開 ＷＯ ９８／３１３５９号；国際公開 ＷＯ ９８／３０５４２号；国際公開 ＷＯ ９９／１５５０６号；国際公開 ＷＯ ９９／１５５０７号；国際公開 ＷＯ ９９／３１０６１号；国際公開 ＷＯ ００／０６１６９号パンフレット；ヨーロッパ特許第０８５３ ０８４号；ヨーロッパ特許第０８５４ １４０号；ヨーロッパ特許第０８５４ １４５号；米国特許第５，７８０，４２６号；および米国特許第６，０４８，８６１号を参照する。また、本発明中での使用に適する、ベンズアゼピン、ならびに、関連するベンゾジアゼピンおよびベンゾシクロヘプテンαVβ3インテグリン受容体拮抗剤を開示する特許には、国際公開 ＷＯ ９６／００５７４号、国際公開 ＷＯ ９６／００７３０号、国際公開 ＷＯ ９６／０６０８７号、国際公開 ＷＯ ９６／２６１９０号、国際公開 ＷＯ ９７／２４１１９号、国際公開 ＷＯ ９７／２４１２２号、国際公開 ＷＯ ９７／２４１２４号、国際公開 ＷＯ ９８／１５２７８号、国際公開 ＷＯ ９９／０５１０７号、国際公開 ＷＯ ９９／０６０４９号、国際公開 ＷＯ ９９／１５１７０号、国際公開 ＷＯ ９９／１５１７８号、国際公開 ＷＯ ９７／３４８６５号、国際公開 ＷＯ ９７／０１５４０号、国際公開 ＷＯ ９８／３０５４２号、国際公開 ＷＯ ９９／１１６２６号、および国際公開 ＷＯ ９９／１５５０８号パンフレットが含まれる。主鎖の立体的な環状パッキングを特徴とする他のインテグリン受容体拮抗剤は、国際公開 ＷＯ ９８／０８８４０号；国際公開 ＷＯ ９９／３０７０９号；国際公開 ＷＯ ９９／３０７１３号；国際公開 ＷＯ ９９／３１０９９号；国際公開 ＷＯ ００／０９５０３号パンフレット；米国特許第５，９１９，７９２号；米国特許第５，９２５，６５５号；米国特許第５，９８１，５４６号；および米国特許第６，０１７，９２６号に開示されている。米国特許第６，０４８，８６１号および国際公開 ＷＯ ００／７２８０１号パンフレットには、強力なαVβ3インテグリン受容体拮抗剤である、一連のノナン酸誘導体が開示されている。他の化学的な低分子インテグリン拮抗剤（ほとんどは、ビトロネクチン拮抗剤）は、国際公開 ＷＯ ００／３８６６５号パンフレットに記載されている。他のαVβ3受容体拮抗剤は、血管新生の阻害に効果的であることが示された。例えば、合成受容体拮抗剤、（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［３−（ピリジン−２−イルアミノ）−１−プロピロキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸（ＳＢ−２６５１２３として知られる）は、様々な哺乳動物モデルシステムで試験されてきた（Ｋｅｅｎａｎ他、１９９８、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８（２２）、３１７１；Ｗａｒｄ他、１９９９、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．、２７（１１）、１２３２）。拮抗剤として使用するのに適したインテグリン拮抗剤を同定するためのアッセイは、例えば、Ｓｍｉｔｈ他、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１２２６７、および参照されている特許文献中に記載されている。
【００５６】
抗インテグリン受容体抗体も、よく知られている。適切な抗インテグリン（例えば、αVβ3、αVβ5、αVβ6）モノクローナル抗体は、Ｆ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ）、および遺伝子操作したＦｖや一本鎖抗体などを含む、その抗原結合断片を含むように改変することができる。インテグリン受容体αVβ3に対する、適切な、好んで使用されるモノクローナル抗体の１つは、ＬＭ６０９と同定された（Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９、１１５７；ＡＴＣＣ ＨＢ９５３７）。強力な特異的抗αVβ5抗体、Ｐ１Ｆ６は、やはり本発明によって好ましく、国際公開 ＷＯ ９７／４５４４７号パンフレットに開示されている。さらなる、適切なαVβ6選択的抗体は、ＭＡｂ１４Ｄ９．Ｆ８（国際公開 ＷＯ ９９／３７６８３号、ＤＳＭ ＡＣＣ２３３１、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ドイツ）、ならびにインテグリン受容体のαV鎖に選択的に向けられる、ＭＡｂ１７．Ｅ６（ヨーロッパ特許第０７１９ ８５９、ＤＳＭ ＡＣＣ２１６０、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）である。別の適切な抗インテグリン抗体は、商品化されている、Ｖｉｔｒａｘｉｎ（登録商標）である。
【００５７】
「血管新生増殖因子または増殖因子受容体」とは、その活性化によって血管の増殖および発生を促進する因子または受容体である。通常、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体がこの群に属する。
【００５８】
本明細書中の用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、最も広い意味で使用され、具体的には、完全な抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全型抗体から作製された多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および、所望する生物学的活性を示す限り、抗体断片をもカバーする。この用語は一般的に、２つまたはそれ以上の抗体から構成されるヘテロ抗体や、互いに連結された、異なる結合特異性のその断片を含む。
【００５９】
定常領域のアミノ酸配列に応じて、完全型の抗体は、様々な「抗体（免疫グロブリン）クラス」に帰属させることができる。
【００６０】
完全型の抗体には、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、「サブクラス」（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに区分することができる。抗体の様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれている。本発明にかかる、好ましい主要な抗体クラスは、ＩｇＧ、より詳細には、ＩｇＧ１とＩｇＧ２である。
【００６１】
抗体は、通常、分子量約１５０，０００の糖タンパク質で、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって、重鎖と連結されているが、ジスルフィド連結の数は、様々な免疫グロブリンのイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、一定の間隔を有する鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインがそれに続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖の可変ドメインの間で境界面を形成すると考えられている。任意の脊椎動物由来の抗体の「軽鎖」を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれている２つの明確に異なるタイプの一方に帰属することができる。
【００６２】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種な抗体の集団をいう。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性がある、自然に存在する突然変異を除けば、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に向けられているので、高度に特異的である。
【００６３】
さらに、様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体に汚染されることなく合成することができるという点で有利である。モノクローナル抗体を作製する方法には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５）、ならびに「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（１９８５、Ｂｕｒｄｏｎ他、編集、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム）に記載される、ハイブリドーマ法が含まれ、または周知の組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８、１９９１、およびＭａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８、１〜５９７、１９９１に記載されている手法を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００６４】
用語「キメラ抗体」とは、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種由来の抗体内の、対応する配列に同一または相同的、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属すが、鎖の残りは、別の種由来の抗体内の、対応する配列に同一または相同的、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属している抗体、ならびに、所望する生物学的活性を示す限り、かかる抗体の断片を意味する（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５、１９８４）。
【００６５】
キメラ抗体およびヒト化抗体を作製する方法も、当分野で周知である。例えば、キメラ抗体を作製する方法には、Ｂｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）およびＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（米国特許第４，８１６，３９７号；米国特許第４，８１６，５６７号）による特許に記載されているものを含む。
【００６６】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限含む、非ヒト（例えば、げっ歯類）キメラ抗体の形態である。たいていは、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変性領域（ＣＤＲ）由来の残基を、マウス、ラット、ウサギ、または所望の特異性、親和性、能力を有する、ヒトでない霊長類など非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域（ＣＤＲ）由来の残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。
【００６７】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体内には見つからない残基を含むこともできる。これらの改変は、抗体性能がさらに洗練されるように行う。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変領域の全体を実質的に含み、その内、超可変性のループの全体または実質上全体が非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲの全体または実質上全体がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ヒト化抗体を作製する方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）およびＢｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、米国特許第４，８１６，３９７号）に記載されている。
【００６８】
用語「可変」または「ＦＲ」とは、可変ドメインの特定部分の配列は、抗体間で大幅に異なっており、特定の抗原に対する、特定の抗体夫々の結合および特異性に利用されている事実をいう。
【００６９】
しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン内に均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖ならびに重鎖の可変ドメイン中の双方にある、超可変領域と呼ばれる３つのセグメント内に集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
【００７０】
天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、βシート構造を連結するループを形成する、またはある場合にはβシート構造の一部を形成する、３つの超可変領域によって連結されている、概ねβシート立体配置を採っている、４つのＦＲ（ＦＲ１〜ＦＲ４）を含む。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって、緊密にホールディングされており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセズダ、１９９１）。
【００７１】
定常ドメインは、抗体を抗原に結合するのに直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など様々な効果機能を示す。
【００７２】
本明細書中で使用する場合の用語「超可変領域」または「ＣＤＲ」とは、抗原結合を担っている、抗体中のアミノ酸残基をいう。
【００７３】
超可変領域は一般的に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン内の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、９５〜１０２（Ｈ３））、および／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、９６〜１０１（Ｈ３）、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７、１９８７）を含む。
【００７４】
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基とは、本明細書中で定義した超可変領域残基以外の可変ドメインの残基である。
【００７５】
「抗体断片」は、好ましくは、その抗原結合領域または可変領域を含んでいる、完全型の抗体の一部を含んでなる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、Ｆｃの断片、二重抗体、直鎖抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から作成された多重特異性抗体が含まれる。「完全型」の抗体は、抗原結合可変領域のみならず、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３を含む抗体である。好ましくは、完全型の抗体は１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００７６】
抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部位とＣＬおよびＣＨ１領域とを含む２つの同一の抗原結合断片、ならびに容易に結晶化する能力が命名に反映されている残留「Ｆｃ」断片を含む断片が生成される。
【００７７】
抗体の「Ｆｃ」領域は、原則として、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体主要クラスのヒンジ領域を含む。ヒンジ領域とは、ＣＨ１領域をＣＨ２〜ＣＨ３領域に結合させる約１５アミノ酸残基の群である。
【００７８】
ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と交差結合することができる「Ｆ（ａｂ’）2」断片が得られる。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗原断片である。この領域は、１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインとが、密な非共有結合をしている二量体からなる。それは、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＣＤＲ）が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を定義する、立体配置をとっている。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含んでなる、Ｆｖの半分）は、全結合部位に比べて、低い親和性ではあるものの、抗原を認識して結合する能力を有している。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。「Ｆａｂ’」断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む、いくつかの残基の付加がある点で、Ｆａｂ断片と異なっている。Ｆ（ａｂ’）2抗体は、最初、その間にシステイン・ヒンジを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的カップリング法も知られている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９６；米国特許第４，３４２，５６６号参照）。
【００７９】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨとＶＬのドメインを含んでなり、これらドメインは、単一ポリペプチド鎖として存在している。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、抗原結合に所望される構造をｓｃＦｖが形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖ＦＶ抗体は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、ページ２６９〜３１５、１９９４）、国際公開 ＷＯ ９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、米国特許第５，５８７，４５８号、Ｈｕｓｔｏｎ他（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５、５８７９）またはＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０３８）から知られている。
【００８０】
用語「二重抗体」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片をいい、断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内に、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に結合した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間での対形成には短すぎるリンカーをに使用することによって、このドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対になって、二つの抗原結合部位を形成することを強いられている。二重抗体は、例えば、ヨーロッパ特許第４０４，０９７号、国際公開 ＷＯ ９３／１１１６１号に、より十分的に記載されている。
【００８１】
「二重特異性抗体」とは、２つの異なる特異的抗原結合部位を有する単一の２価の抗体（または免疫療法上効果的なその断片）である。例えば、第１抗原結合部位は、血管新生受容体（例えば、インテグリンやＶＥＧＦ受容体）に向けられるが、第２抗原結合部位は、ＥｒｂＢ受容体（例えば、ＥＧＦＲやＨＥＲ２）に向けられる。
【００８２】
二重特異性抗体は、全て、それ自体は既知である、化学的技術（例えば、Ｋｒａｎｚ他、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ／Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、５８０７参照）、「ポリドーマ」技術（米国特許第４，４７４，８９３号参照）、または組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。さらなる方法は、国際公開 ＷＯ ９１／００３６０号、国際公開 ＷＯ ９２／０５７９３号、および国際公開 ＷＯ ９６／０４３０５号に記載されている。二重特異性抗体はまた、一本鎖抗体から調製することもできる（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５、５８７９；ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０３８）。単一ポリペプチド鎖として生成された抗体可変領域の類似体もある。二重特異性結合剤を形成するためには、一本鎖抗体を、当分野で既知の化学的方法または遺伝工学方法によって、共にカップリングさせる。ロイシン・ジッパー配列を使用することによって、本発明にかかる、二重特異性抗体を作製することも可能である。利用される配列は、転写因子ＦｏｓおよびＪｕｎのロイシン・ジッパー領域に由来する（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ他、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１７５９；総説には、ＭａｎｉａｔｉｓおよびＡｂｅｌ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、２４参照）。ロイシン・ジッパーは、ロイシンが７残基毎に起こる、約２０〜２４残基長の特異的なアミノ酸配列である。このようなジッパー配列では、二量体形成のためにロイシン残基が疎水性側に並んで両親媒性のαへリックスを形成する。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質のロイシン・ジッパーに対応するペプチドは、優先的にヘテロ二量体を形成する（Ｏ’Ｓｈｅａ他、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５、６４６）。ジッパーを含む二重特異性抗体およびそれらを作製する方法も、国際公開 ＷＯ ９２／１０２０９号および国際公開 ＷＯ ９３／１１１６２号に開示されている。本発明にかかる、二重特異性抗体は、単一の特異性を有する抗体に関しては、上に記載したＶＥＧＦ受容体およびαＶβ３受容体に対する抗体にすることができる。
【００８３】
用語「免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、免疫的な効果を示さない分子に対して、共有結合によって融合された、それぞれ、抗体または免疫グロブリン、あるいは免疫学的に効果的なその断片をいう。好ましくは、この融合パートナーは、グリコシル化されていてもよい、ペプチドまたはタンパク質である。前記非抗体分子は、抗体の定常重鎖のＣ末端、あるいは可変軽鎖および／または重鎖のＮ末端に連結することができる。融合パートナーは、一般的に、３〜１５個のアミノ酸残基を含有するペプチドである、リンカー分子を介して、連結することができる。本発明にかかる、免疫複合体は、好ましくは、血管新生受容体、好ましくは、インテグリンまたはＶＥＧＦ受容体に対する、免疫グロブリンまたは免疫療法上効果的なその断片と、ＴＮＦαとからなる融合タンパク質、あるいは、前記免疫グロブリンのＣ末端、好ましくはそのＦｃ部分にそのＮ末端が連結されている、ＴＮＦαおよびＩＦＮγまたは別の適切なサイトカインとから実質的になる融合タンパク質を包含している。
【００８４】
用語「融合タンパク質」とは、異なる特異性を有する１つまたは複数の免疫療法的な効果を有さない（非抗体の）タンパク質またはペプチドからなり、場合によっては、リンカー分子によって融合されている、天然または合成分子をいう。本発明にかかる融合タンパク質は、例えば、ＴＮＦαおよび／またはＩＦＮγに融合されたシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）からなる分子でもよい。
【００８５】
「ヘテロ抗体」とは、それぞれが異なる結合特異性を有する、互いに連結されている、２つまたはそれ以上の抗体または抗原結合性抗体断片である。ヘテロ抗体は、２つまたはそれ以上の抗体または抗体断片を互いに結合させることによって調製することができる。好ましいヘテロ抗体は、交差結合されたＦａｂ／Ｆａｂ’断片を含んでなる。様々なカップリングまたは交差結合剤を使用して、抗体複数を結合させることができる。一例は、タンパク質Ａ、カルボイイミド（ｃａｒｂｏｉｉｍｉｄｅ）、Ｎ−コハク酸イミジル−Ｓ−アセチル−チオ酢酸（ＳＡＴＡ）、Ｎ−コハク酸イミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ他、１９８４、Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．、１６０、１６８６；Ｌｉｕ他、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、８６４８参照）である。その他の手法には、Ｐａｕｌｕｓ、Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．、第７８号、１１８、１９８５；Ｂｒｅｎｎａｎ他、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０ｍ：８１、またはＧｌｅｎｎｉｅ他、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９、２３６７に記載されているものが含まれる。別の方法では、３つのＦａｂ’断片をカップリングするために、ｏ−フェニレンジマレイン酸イミド（ｏＰＤＭ）を利用する（国際公開 ＷＯ ９１／０３４９３号）。本発明に関係して、多重特異性抗体もまた適切であり、国際公開 ＷＯ ９４／１３８０４号および国際公開 ＷＯ ９８／５０４３１号の教示に従って調製することができる。
【００８６】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（Ｆｃ領域の天然配列または変異Ｆｃ領域のアミノ酸配列）に由来する生物学的な活性をいう。抗体のエフェクター機能の例には、相補性依存的細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方制御（例えば、Ｂ細胞受容体）などが含まれる。
【００８７】
用語「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ）が、標的細胞上に結合された抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解を引き起こす、細胞に媒介された反応をいう。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞である、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、先行技術（米国特許第５，５００，３６２号、米国特許第５，８２１，３３７号）に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。
【００８８】
「ヒト・エフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発現する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を遂行する。ＡＤＣＣを媒介する、ヒト白血球の例には、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれる。
【００８９】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合する（γ受容体）ものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これら受容体の対立変異体ならびに選択的スプライシングされた形態も含まれる。ＦｃＲは、例えば、ＲａｖａｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、９：４５７〜９２、１９９１に、その総説が記載されている。
【００９０】
用語「サイトカイン」とは、細胞間媒体として別の細胞に作用する、一細胞集団から放出されたタンパク質の総称的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンなど成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン：濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）など糖タンパク質ホルモン；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦβなど神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦαやＴＧＦβなどトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；ＩＮＦα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなどインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦなどコロニー刺激因子；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などインターロイキン；およびＴＮＦαやＴＮＦβが含まれる。本発明にかかる、好ましいサイトカインは、インターフェロンおよびＴＮＦαである。
【００９１】
本明細書中で使用する用語「細胞傷害剤」とは、細胞の機能を阻害または抑制し、かつ／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、動物起源の酵素的に活性のある毒素など毒素、あるいは。その断片を含めるつもりである。この用語は、サイトカイン・ファミリーの成員、好ましくはＩＦＮγを含むことができる。
【００９２】
用語「化学療法剤」または「抗異常増殖剤」には、抗異常増殖性作用を及ぼす、すなわち、生物学的応答の改変など機構を介した間接的にではなく、例えば、細胞増殖抑制または細胞傷害効果によって、腫瘍細胞に直接的に、異常増殖細胞の発生、成熟、拡散を阻止する化学薬剤が含まれる。本発明にかかる、適当な化学療法剤は、好ましくは、天然または合成化学化合物であるが、タンパク質、ポリペプチドなどの生物学的分子も、明示的に排除されていない。ＴＮＦαと上に列挙した抗血管新生剤、場合によっては、ＥＧＦ受容体拮抗剤など他の薬剤をも一緒に用いる組合せ治療による、腫瘍／異常増殖の治療のための本発明に含めることができる、市販、臨床評価および前臨床開発段階の、入手可能な、多数の抗異常増殖剤が存在する。化学療法剤は、場合によっては、上述する薬物の組合せと一緒に投与することができることは、指摘すべき点である。
【００９３】
化学療法剤または薬剤の例には、アルキル化剤、例えば、窒素マスタード、エチレンイミン化合物、アルキルスルホン酸、およびニトロソ尿素、シスプラチン、ダカルバジンなどのアルキル化作用を有する他の化合物；抗代謝剤、例えば、葉酸、プリンまたはピリミジン拮抗剤；有糸分裂阻害剤、例えば、ビンカ・アルカロイドおよびポドフィロトキシンの誘導体；細胞傷害抗生物質およびカンプトセチン誘導体が含まれる。好ましい化学療法剤または化学療法には、ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ（ｅｔｈｙｏｌ）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（窒素マスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルヌシチン（ｃａｒｒｎｕｓｔｉｎｅ）（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシン・リポ（ｄｏｘｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｚａｒ）、ダウノルビシン、ダウノルビシン・リポ（ｄａｕｎｏｘｏｍｅ）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトセシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトセシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ、ペントスタチン、ピポブロマン、ピリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ならびに、それらの組合せが含まれる。
【００９４】
本発明にかかる、最も好ましい化学療法剤は、シスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（タキソール）およびブレオマイシンである。
【００９５】
用語「癌」および「腫瘍」とは、典型的には、制御されない細胞増殖によって特徴づけられる、哺乳類の生理学的状態のことを意味し、または述べる。乳房、心臓、肺、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頚部、および肝臓の腫瘍などの、腫瘍は、本発明にかかる医薬組成物によって、治療することができる。より具体的には、腫瘍は、腺腫、血管肉腫、星状細胞腫、上皮癌腫、胚細胞腫、グリア芽細胞腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫および奇形腫からなる群から選択される。
【００９６】
詳細には、腫瘍は、末端黒子型黒色腫、光線性角化症、腺癌腫、腺様嚢胞癌腫、脂肪腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌腫、星錠腫瘍、バルトリン腺癌腫、基底細胞癌腫、気管支腺癌腫、毛細血管、癌様体、癌腫、癌肉腫、海綿状、胆管癌腫、軟骨芽肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌腫、明細胞癌腫、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質部肉腫、子宮内膜様卵巣癌腫、脳質上皮、類上皮細胞、ユーイング肉腫、繊維性層状（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ）、巣状結節性過形成、ガストリン産生腫瘍、生殖細胞腫瘍、グリア細胞腫、グルカゴン産生腫瘍、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝細胞癌腫、膵島細胞腺腫、上皮内異常増殖、上皮間扁平細胞異常増殖、浸潤性扁平細胞癌腫、大細胞癌腫、平滑筋肉腫、悪性黒色黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、中皮、転移性癌腫、粘膜表皮性癌腫、神経細胞腫、神経上皮腺癌腫結節性癌腫、燕麦細胞癌腫、オリゴデンドログリア、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、乳頭漿液腺癌腫、松果体細胞、下垂体腫瘍、プラズマ細胞腫、偽肉腫、肺性細胞腫、腎細胞癌腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液癌腫、小細胞癌腫、軟組織癌腫、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌腫、中皮下、表在性拡大型癌腫、未分化癌腫、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌腫、ビポーマ、高分化癌腫、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【００９７】
「ＥｒｂＢ受容体」とは、ＥｒｂＢ受容体ファミリーに属す受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４受容体および将来同定されるであろう、該ファミリーの他のメンバーを含む。ＥｒｂＢ受容体は一般的に、ＥｒｂＢリガンドと結合し得る細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；リン酸化され得るいくつかのチロシン残基を有するカルボキシ末端のシグナル伝達ドメインを含む。ＥｒｂＢ受容体は「天然配列」のＥｒｂＢ受容体またはその「アミノ酸配列変異体」であってよい。好ましくは、ＥｒｂＢ受容体は、天然配列のヒト・ＥｒｂＢ受容体である。ＥｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子をいう。最も好ましいのは、ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ１）である。表現「ＥｒｂＢ１」と「ＨＥＲ１」は、本明細書中で互換的に使用されており、ヒトＨＥＲ１タンパク質を指す。表現「ＥｒｂＢ２」と「ＨＥＲ２」は、本明細書中で互換的に使用されており、ヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。本発明によれば、ＥｒｂＢ１受容体（ＥＧＦＲ）が好ましい。
【００９８】
「ＥｒｂＢリガンド」とは、ＥｒｂＢ受容体に結合し、かつ／または活性化させるポリペプチドである。ＥＧＦＲと結合するＥｒｂＢリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、エピレギュリンが含まれる。
【００９９】
用語「ＥｒｂＢ受容体拮抗剤／阻害剤」とは、ＥｒｂＢ受容体に結合して、妨害または阻害する、天然または合成分子をいう。従って、受容体を妨害することによって、拮抗剤は、ＥｒｂＢリガンド（作用剤）の結合、および作用剤／リガンド受容体複合体の活性化を防止する。ＥｒｂＢ拮抗剤は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）またはＨＥＲ２に特異的できる。本発明の好ましい拮抗剤は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１）に特異的である。このＥｒｂＢ受容体は、抗体または免疫療法上効果的なその断片、あるいはペプチド、ポリペプチドタンパク質など非免疫性生物学的分子であってもよい。化学的分子も含まれるが、抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＨＥＲ２抗体が、本発明にかかる、好ましい拮抗剤である。
【０１００】
本発明の好ましい抗体は、抗Ｈｅｒ１および抗Ｈｅｒ２抗体、より好ましくは、抗Ｈｅｒ１抗体である。好ましい抗Ｈｅｒ１抗体は、ＭＡｂ４２５、好ましくは、ヒト化ＭＡｂ４２５（ｈＭＡｂ４２５、米国特許第５，５５８，８６４号；ヨーロッパ特許第０５３１ ４７２号）、およびキメラＭＡｂ２２５（ｃＭＡｂ２２５、米国特許第４，９４３，５３３号およびヨーロッパ特許第０３５９ ２８２号）である。最も好ましいのは、単一薬物治療においても、抑制された有害ならびに副作用とともに、高い効果を示した、モノクローナル抗体ｈ４２５である。最も好ましい抗ＨＥＲ２抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅにより商品化されている、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）である。
【０１０１】
本発明にかかる、有効なＥＧＦ受容体拮抗剤は、天然または合成の化学化合物であってもよい。この種の好ましい分子の一例には、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩が含まれる。
【０１０２】
ＨＥＲ２受容体拮抗剤の例は、スチリル置換の複素芳香族化合物（米国特許第 ５，６５６，６５５号）；ビス単環式および／または二環式アリール−ヘテロアリール、炭素環、およびヘテロ炭素環化合物（米国特許第５，６４６，１５３号）；三環式ピリミジン化合物（米国特許第５，６７９，６８３号）；受容体型チロシンキナーゼ阻害活性を有するキナゾリン誘導体（米国特許第５，６１６，５８２号）；ヘテロアリールエテネジイルまたはヘテロアリールエテネジイル アリール化合物（米国特許第５，１９６，４４６号）；受容体のＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲファミリーを阻害する、６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−ジエチル−アミノエトキシ）フェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド（２，３）−５−ピリミジン−７−オン（Ｐａｎｅｋ他、１９９７、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．、２８３、１４３３）と命名された化合物である。
【０１０３】
「放射線療法」：本発明にかかる医薬組成物を用いて治療することができる腫瘍は、さらに、放射線または放射性薬剤により処置することができる。放射線源は、治療される患者の外部または内部のどちらでもよい。放射線源が患者の外部の場合、この療法は外部照射放射線療法（ＥＢＲＴ）として知られている。放射線源が患者の内部の場合、この療法は近接照射療法（ＢＴ）と呼ばれている。利用されてきた典型的な放射性原子には、ラジウム、セシウム−１３７、およびイリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、および金−１９８、コバルト−５７；銅−６７；テクネチウム−９９；ヨウ素−１２３；ヨウ素−１３１；およびインジウム−１１１が含まれる。本発明にかかる薬剤を、放射性同位元素を用いて標識することも可能である。
【０１０４】
今日では、放射線療法は、切除不能や手術不能な腫瘍および／または腫瘍転移を抑制するための、標準的な治療法である。放射線治療を、化学療法と組み合わせると、改善された結果が見られる。放射線療法は、標的区域に照射された高線量の放射線が、腫瘍組織と正常組織のどちらもの再生細胞の死滅をもたらすという原理に基づいている。
【０１０５】
放射線線量処方は、一般的に、放射線吸収線量（ｒａｄ）、時間、および画分の点から決定され、癌専門医によって注意深く決定されなければならない。患者が受ける放射線の量は、様々な考慮事項に依存するが、最も重要な２つの考慮事項は、身体の他の重要な構造または組織に対する、腫瘍の位置、ならびに、腫瘍が拡散している範囲である。放射線療法を受ける患者に対する、好ましい治療過程は、５〜６週間の期間にわたり、総線量５０〜６０Ｇｙを、１．８〜２．０Ｇｙの単一の一日画分を、週に５日、患者に施す治療スケジュールである。Ｇｙは、グレイの略記であり、１００ｒａｄの照射量をいう。好ましい実施態様では、ヒト患者の腫瘍を、血管新生拮抗剤とＴＮＦα／ＩＦＮγならびに放射線で治療した際には、相乗効果がある。言い換えれば、前記化合物による腫瘍増殖の阻害は、放射線および／または化学療法剤と組み合わせた場合に増強される。本発明に従って、場合によっては、放射線療法を使用することができる。それは、本発明かかる薬剤を、十分な量患者に投与することができない場合に、推奨され、また、好ましい。
【０１０６】
「薬剤治療」：本発明の方法は、本発明を実施するためのステップとして、様々な形式を含む。例えば、本発明にかかる薬剤は、同時に、順序に従って、あるいは、個別に、投与することができる。さらに、該薬剤は、投与間に、約３週間までの時間間隔内で、すなわち、実質的に、第１活性薬剤を投与した直後から、第１薬剤を投与した後、約３週間までに、個別に投与することもできる。この方法は、外科的処置に引き続いて、実施することができる。あるいは、第１活性薬剤と第２活性薬剤の投与の間に、外科的処置を実施することができる。この方法の典型は、本発明の方法と、外科的な腫瘍除去との組合せである。この方法による治療は、一般的に、１つまたは複数の投与サイクルにおける、治療組成物の投与を含む。例えば、同時投与を実施した場合、両方の薬剤を含む治療組成物を、約２日〜約３週間の期間を、一サイクルとして、投与する。
【０１０７】
その後は、該治療サイクルを、担当する医者の判断に従って、必要に応じて、繰り返すことができる。同様に、順序に従った施用を計画する場合、それぞれの個々の療法剤の投与時間が、一般的に同じ期間に及ぶように調整する。サイクル間の間隔は、約０から２カ月まで変えることができる。
【０１０８】
本発明の薬剤を、非経口的に注入、または時間をかけたゆっくりしたインフージョンによって投与することができる。一般的に、治療すべき組織には、通常全身投与によって、身体内から接近することができ、従って、最も頻繁には、治療組成物の静脈内投与によって治療されるが、標的組織のみが標的分子を含むような、他の組織的な送達手段も予期される。従って、本発明の薬剤は、眼内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、または正所位注入およびインフージョンによって投与することができ、または蠕動手段によって送達することもできる。例えば、本発明のインテグリン拮抗剤を含む治療的組成物は、従来、例えば、単位用量の注入として静脈内に投与されてきた。
【０１０９】
本発明の治療組成物は、生理的に許容される担体を、有効成分として、本明細書中に記載されている好適な薬剤を、それの中に溶解または分散させ、共に含んでいる。本明細書中で使用する用語「製薬的に許容される」とは、嘔気、眩暈、胃のむかつきなども望ましくない生理効果を生じることなしに、哺乳動物内またはその表面に投与することが可能な物質を表している、組成物、担体、希釈剤、および試薬をいう。その中に有効成分を溶解または分散させた薬理組成物の調製は、当分野でよく理解されており、処方に基づいたものに限定する必要はない。通常、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかのような、注射可能なものに調製されるが、使用に先立ち、液体中に加えて、溶液または懸濁液とするのに適した固体形状に調製することもできる。この調製物は、エマルジョン状とすることもできる。有効成分を、製薬的に許容され、有効成分に適合する賦形剤と共に、本明細書中に記載する治療方法での使用に適した量で、混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらを組み合わせたものである。加えて、必要に応じて、組成物は、有効成分の有効性を増強させる、浸潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の補助的な物質を少量含有することができる。本発明の治療組成物は、それに含まれる成分の製薬的に許容される塩を含むこともできる。製薬的に許容される塩には、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸を用いて形成される、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、二価の鉄の水酸化物などの、無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。特に好ましいのは、環状ポリペプチドαｖ拮抗剤の調製に使用する場合には、ＨＣｌ塩である。生理的に許容される担体は、当分野で周知である。液体担体の例は、有効成分と水以外の追加の物質を含まない、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝成分、生理的食塩、あるいは、リン酸緩衝生理食塩水などの双方を含む、無菌水性溶液である。さらに、水性担体は、１つ以上の緩衝塩だけでなく、塩化ナトリウムや塩化カリウムなど塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含むこともできる。液体組成物はまた、水に加えて、また、水を含まない液相を含むこともできる。このような追加の液相の典型は、グリセリン、綿実油など植物油、水−油エマルジョンである。
【０１１０】
通常、例えば、インテグリン受容体阻害抗体、抗体断片または抗体複合体、あるいは抗ＶＥＧＦ受容体阻害抗体、断片または複合体の形態の、免疫療法剤の治療有効量は、生理的に許容される組成物として投与した際、血漿濃度を、１ミリリットル（ｍｌ）あたり約０．０１マイクログラム（μｇ）〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、通常は、約５μｇ／ｍｌとするために、十分な量である。
【０１１１】
言い換えれば、一日または複数日、一日当たり、１つまたは複数回の用量投与においては、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲で変動させることができる。免疫療法剤が、モノクローナル抗体の断片または複合体である場合、この量は、完全な抗体の質量に対する、断片／複合体の質量の比に基づいて、容易に調節することができる。好ましい血漿中のモル濃度は、約２マイクロモーラー（μＭ）〜約５ミリモーラー（ｍＭ）であり、好ましくは、約１００μＭ〜１ｍＭの抗体型拮抗剤である。
【０１１２】
非免疫療法性ペプチドまたはタンパク質ペプチド（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）、あるいは類似した大きさの他の生物学的分子である、本発明にかかる薬剤の療法的に有効な量は、通常、生理的に許容される組成物として投与した際に、血漿濃度を、１ミリリットル（ｍｌ）あたり約０．１マイクログラム（μｇ）〜約２００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌとするために、十分なポリペプチド量である。１モルあたり約５００グラムの質量を有するポリペプチドに基づくと、好ましい血漿中モル濃度は、約２マイクロモーラー（μＭ）〜約５ミリモーラー（ｍＭ）、好ましくは約１００μＭ〜１ｍＭのポリペプチド拮抗剤である。
【０１１３】
好ましくは、本発明にかかる、化学的拮抗剤または（化学的）化学療法剤（免疫療法剤でも非免疫療法性ペプチド／タンパク質でもない）である、活性薬剤の通常用量は、１日あたり、体重１キログラムあたり１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約２０〜２００ｍｇ、より好ましくは５０〜１００ｍｇである。
【０１１４】
本発明の医薬組成物には、それに限定はされないが、例えば、骨吸収阻害剤、心保護剤など、抗癌剤の毒性を軽減させる薬剤を含む、本発明の組合せ療法に付随する副作用を軽減または回避する薬剤（「アジュバント療法」）を用いる、患者の包括的な治療を含むことができる。前記アジュバント剤は、化学療法、放射線療法、手術に付随する嘔気や嘔吐の頻度を阻止または軽減する、あるいは骨髄抑制性抗癌剤の投与に付随する感染症の発生率を軽減させる。アジュバント剤は当分野で周知である。
【０１１５】
本発明による免疫療法剤はさらに、ＢＣＧや免疫系刺激剤などのアジュバントと一緒に投与することができる。
【０１１６】
さらに、この組成物は、細胞傷害効果の放射標識同位元素を含有する免疫療法剤または化学療法剤、あるいは、細胞傷害性ペプチド（例えば、サイトカイン）、細胞傷害性薬剤などの、他の細胞傷害性剤を含んでいてもよい。
【０１１７】
腫瘍または腫瘍転移を治療するための「製薬キット」という用語は、腫瘍および腫瘍転移を治療する方法において、該試薬を使用するための、パッケージ、および、原則として、指示書をいう。本発明のキット内の試薬は通常、本明細書中に記載の治療組成物として、処方されており、従って、キットにおいて、配布に適した様々な形態のいずれであってもよい。このような形態には、本発明の拮抗剤および／または融合タンパク質を提供するためには、液体、粉末、錠剤、懸濁液などの剤形が含まれる。試薬は、本発明の方法に従って、個別の投与に適した個別の容器として提供することができ、あるいは、パッケージ中において、単一の容器内の組成物として、組み合わせて提供することもできる。このパッケージは、本明細書中に記載の治療方法に従って、１つまたは複数回の用量に十分な量の試薬を含むことができる。本発明のキットはまた、パッケージに含まれる物質の「使用説明書」も含む。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例によって、本発明をより詳細に説明する。
【０１１９】
実施例１：
ＴＮＦα誘発性アポトーシスに対する内皮細胞のインテグリン依存性接着
ＨＵＶＥＣ球状体の形成および生存にはインテグリンは必要ない
ＴＮＦ誘発性アポトーシスに対するインテグリン・ライゲーションの効果を試験するために、本発明者らは、インテグリン依存性の接着なしに内皮細胞を培養できる条件を同定した。内皮細胞の単一細胞懸濁液は、アノイキスによって急速に死滅し（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．、４、９５３〜９６１、１９９３）、従ってさらなる分析が妨げられた。しかし、ＢＳＡでコーティングしたウェルにヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を高密度（１．０×１０６個の細胞／ｍｌ）で播種することにより、２〜４時間以内に多細胞性球状体が形成され、インテグリンからの検出可能な寄与なしに、２４時間以上、ＶＥ−カドヘリンに依存して維持することができた。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を妨害すること、またはＥＤＴＡを用いたＣａ2+−Ｍｇ2+の欠乏によるＶＥ−カドヘリン活性の阻害は球状体の形成を妨害したが、α２、α３、α５、α６、β１、αＶβ３、αＶβ５インテグリンに対する阻害性ｍＡｂ、ＲＧＤに基づいた妨害ペプチド、および妨害性抗ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂの単体または組合せは、ＨＵＶＥＣ球状体に影響を与えなかった（図１ａ、データは示さず）。
【０１２０】
細胞生存度に対する球状体培養物の影響を決定するために、球状体およびフィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣをプレートした６〜７２時間後に回収し、連続的に希釈し、相対細胞数を決定する前に追加の４８時間さらに培養した。左寄りの曲線、すなわち希釈曲線の平坦化は、生存度の低下を示す。プレートした６、１２、１６、２４時間後に球状体培養物から回収したＨＵＶＥＣの生存度はフィブロネクチン接着性培養物と比較可能であったが、３６時間以降では、徐々に低下した（図１ｂは１６時間、データは示さず）。
【０１２１】
総合すると、これらの結果は、ＨＵＶＥＣは球状体を形成することができ、インテグリン依存性の接着なしに２４時間以上生存可能であることを実証している。
【０１２２】
実施例２：
フィブロネクチンへの接着はＨＵＶＥＣをＴＮＦ誘発性アポトーシスから保護する
インテグリンがＴＮＦ誘発性アポトーシスを変調させるかどうかを試験するために、本発明者らはＨＵＶＥＣをフィブロネクチン上で（インテグリン依存性接着）、または球状体として（インテグリン非依存性接着）、ＴＮＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ細胞傷害の増強剤であるＩＦＮγ（３３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｄｅａｌｔｒｙ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７、６８９〜６９３、１９８７）を存在させてまたは存在させずに培養した。フィブロネクチン上のＨＵＶＥＣの単層（「フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣ」）をＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露させることによっては、ＹｏＰｒｏ−１が取り込まれていないことにより実証されたアポトーシス（Ｉｄｚｉｏｒｅｋ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８５、２４９〜２５８、１９９５）、アネキシンＶの細胞表面結合、カスパーゼ−３の活性化およびその基質ＰＡＲＰの切断は、増大されなかった（図２ａ、２ｂ、データは示さず）。
【０１２３】
それとは反対に、ＴＮＦ±ＩＦＮγを用いて処置した球状体は、ＹｏＰｒｏ−１の取り込みが増加し（ＢＯＣ、Ｚ−ＶＡＤ、ＩＥＴＤ、ＤＶＥＤのカスパーゼ阻害剤によって抑制された増加）、ＤＮＡの断片化、カスパーゼ−３活性化およびＰＡＲＰの切断が増大した（図２ａ、２ｂ、データは示さず）。細胞生存度に対するＴＮＦ±ＩＦＮγの効果を検査するために、本発明者らは非処理および処理した培養物の生存度を決定した。フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣをＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露しても、細胞生存度に影響は与えられなかった（図２ｃ）。ＴＮＦを用いた球状体の処置は８０％を超える細胞の死滅をもたらし、組み合わせたＴＮＦ／ＩＦＮγの処置は完全な細胞死滅を引き起こした（図２ｄ）。ＩＦＮγのみを用いた処置は細胞傷害性ではなかった（データ示さず）。ＨＵＶＥＣは、αＶβ３およびα５β１インテグリンを介して、固定したフィブロネクチンに接着する（Ｒｕｅｇｇ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、４、４０８〜４１４、１９９８）。フィブロネクチン上の細胞生存度に対するこれらインテグリンの個々の寄与を試験するために、本発明者らは、プラスチックに固定した、αＶβ３、α１、α５、α４インテグリンに対するｍＡｂｓ（ｉｍＡｂｓ）上でＨＵＶＥＣを培養した。固定化抗αＶβ３、抗α５、抗α１ ｍＡｂｓはＨＵＶＥＣをＴＮＦ誘発性細胞死から保護したが、抗α４ ｍＡｂｓは保護しなかった（図２ｅ、データ示さず）。
【０１２４】
これらの結果から、本発明者らは、αＶβ３およびαＶβ１インテグリンに媒介される接着がＴＮＦ誘発性アポトーシスを抑制し、それが欠乏するとＨＵＶＥＣがＴＮＦおよびカスパーゼ媒介アポトーシスに対して感作されることを結論づけた。
【０１２５】
実施例２：
インテグリン依存性シグナリングは内皮細胞をＴＮＦα誘発性アポトーシスから保護する
ＴＮＦ誘発性のＮＦ−κＢ活性化はインテグリン・ライゲーションを必要としない
核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）は、ＴＮＦに暴露させた細胞の生存を促進する（ＢｅｇおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７８２〜７８４；Ｖａｎ Ａｎｔｗｅｒｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７８７〜７８９、１９９６）。インテグリンを介した細胞接着がＮＦ−κＢを活性化させるので（Ｓｃａｔｅｎａ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４１、１０８３〜１０９３、１９９８）、本発明者らは、ＴＮＦ誘発性アポトーシスに対する球状体の感受性がＮＦ−κＢ活性化の不足によるものかどうかを調査した。ＮＦ−κＢ活性化は、Ｉ−κＢのリン酸化および解離、ＮＦ−κＢ核転移、ならびにＮＦ−κＢ誘発性遺伝子であるＩＣＡＭ−１の細胞表面での発現（Ｃｏｌｌｉｎｓ他、Ｆａｓｅｂ Ｊ．、９、８９９〜９０９、１９９５）を、ＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露させた球状体およびフィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣ培養物で測定することで評価した。Ｉ−κＢのリン酸化および解離、ＮＦ−κＢの核転移またはＩＣＡＭ−１の発現で有意な差は観察されず（図３ａ〜ｃ）、これは、球状体中で培養したＨＵＶＥＣのＴＮＦ誘発性アポトーシスは、損なわれたＮＦ−κＢ活性化によるものではないことを示す。
【０１２６】
実施例３：
活性化はインテグリン・ライゲーションに依存し、細胞の生存に重要である
次に、内皮細胞の生存を促進する、ＴＮＦによって活性化されるタンパク質キナーゼであるＡｋｔ／ＰＫＢの活性化を分析した（ＭａｄｇｅおよびＰｏｂｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、１５４５８〜１５４６５、２０００）。フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣのＡｋｔの基礎的リン酸化は、ＴＮＦ／ＩＦＮγへの暴露によって増加し、これは構成的なＡｋｔの活性化およびＴＮＦ誘発性のＡｋｔ活性化に矛盾しない。反対に、非処理の球状体ではＡｋｔのリン酸化は観察されず、ＴＮＦ／ＩＦＮ□への暴露は弱いリン酸化のみを誘発した（図４ａ）。ＨＵＶＥＣの生存に対するＡｋｔ活性化の関連性を評価するために、本発明者らは、ホスホイノシチド−３（ＰＩ−３）キナーゼであり、Ａｋｔの上流活性化因子である２つの薬理的阻害剤、ワートマニンおよびＬＹ２９４００２を用いてフィブロネクチン接着性細胞を処置した（ＫａｎｄｅｌおよびＨａｙ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２５３、２１０〜２２９、１９９９）。
【０１２７】
本発明者らはまた、球状体中で、構成的に活性のある形のＡｋｔ（Ａｋｔｍｐ）およびＰＩ−３キナーゼ触媒サブユニット（ｐ１１０*）を発現させた。ワートマニンおよびＬＹ２９４００２の治療はアポトーシスを引き起こし、ＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露させたフィブロネクチン接着性細胞の生存度を低下させたが（図４ｂ）、野生型Ａｋｔ（Ａｋｔｗｔ）や対照プラスミド（ｐＢＳ）はそうではないが、Ａｋｔｍｐおよびｐ１１０*は球状体をＴＮＦ±ＩＦＮγ誘発性アポトーシスから保護した（図４ｃ）。
【０１２８】
これらの結果から、本発明者らは、Ａｋｔの活性化がＴＮＦ＋ＩＦＮγに暴露されたＨＵＶＥＣの生存に重要であり、基礎的Ａｋｔ活性化およびＴＮＦ誘発性のＡｋｔ活性化のどちらもがインテグリン・ライゲーションに依存していたことを結論づけた。
【０１２９】
実施例４：
ＴＮＦで処置したＨＵＶＥＣの生存にはＡｋｔおよびＮＦ−κＢの活性化が必要
Ａｋｔｍｐは、活性ＮＦ−κＢの存在下で球状体のＴＮＦ誘導アポトーシスを抑制する。本発明者らはまた、ＮＦ−κＢ活性化および活性Ａｋｔシグナリングのどちらもが生存に必要かどうか、または活性Ａｋｔのみで十分かどうかを試験した。本発明者らは、非分解性Ｉ−κＢを発現しているアデノウイルスでＨＵＶＥＣを感染させることによって（ＩｋＢ−ＮＦκＢの解離を防止するＡｄΔＮＩ−κＢ（Ｂｒｏｗｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７、１４８５〜１４８８、１９９５）、構成的に活性のあるＡｋｔ（Ａｋｔｍｐ）を発現している細胞のＮＦ−κＢ活性化を妨害した。ＡｄΔＮＩ−κＢは、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣをＴＮＦ±ＩＦＮγ誘発性アポトーシスに感作させ、これはＡｋｔｍｐに影響を受けなかった。対照の電気穿孔（ｐＢＳ）またはアデノウイルス感染（ＡｄＬａｃＺ）は効果がなかった。ＡｄΔＮＩ−κＢはまた、Ａｋｔｍｐを過発現している球状体をＴＮＦ＋ＩＦＮγ誘発性アポトーシスに感作させた（図４ｄ）。ＮＦ−κＢの活性化を欠いているＨＵＶＥＣ中でＡｋｔが低用量のＴＮＦに対して保護できるかどうかを試験するために、ｗｔおよびＡｋｔｍｐを発現しているＨＵＶＥＣの単層をＡｄΔＮＩ−κＢで感染させ、ＴＮＦ（０．３３〜１００ｎｇ／ｍｌ）に暴露させた。ＡｄΔＮＩ−κＢはＨＵＶＥＣをアポトーシスに感作させたが（ＴＮＦ＞０．１ｎｇ／ｍｌ）、ＡｋｔｍｐはこのようなＨＵＶＥＣを、低用量のＴＮＦでさえも保護しなかった（図４ｅ）。さらに、ＬＹ２９４００２およびワートマニンはＴＮＦに誘導されるＩＣＡＭ−１の発現を阻害せず、これはＨＵＶＥＣ中のＮＦ−κＢ活性化にはＡｋｔシグナリングが必要なかったことを示し（図４ｆ、データは示さず）、球状体中のＩＣＡＭ−１の誘発に矛盾しない（図３ｃ参照）。対照的に、ＡｄΔＮＩ−κＢを用いたＨＵＶＥＣの感染では、ＴＮＦ±ＩＦＮγに応答してＩＣＡＭ−１の発現が抑制された（図４ｆ）。
【０１３０】
総合すると、これらの結果により、ＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露させたＨＵＶＥＣの生存には、ＡｋｔおよびＮＦ−κＢの同時活性化が必要であることが実証された。
【０１３１】
実施例５：
インテグリン・ライゲーションはＦＫＨＲおよびＭＤＭ２の活性化を促進し、ＭＥＫ、ｐ３８、ＪＮＫのリン酸化を抑制する
Ａｋｔの抗アポトーシス活性は最初、そのカスパーゼ−９およびＢａｄのリン酸化および阻害に起因しているとされていた（Ｄａｔｔａ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１３、２９０５〜２９２７、１９９９）。しかし、現在では、Ａｋｔ依存性の生存には、フォークヘッド転写因子（ＦＫＨＲ／ＦＫＨＲＬ１）（Ｄａｔｔａ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１３、２９０５〜２９２７、１９９９；Ｂｒｕｎｅｔ他、Ｃｅｌｌ、９６、８５７〜８６８、１９９９）およびＭＤＭ２のリン酸化および阻害、ｐ５３の分解（ＭａｙｏおよびＤｏｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８、１１５９８〜１１６０３、２００１）、ならびにタンパク質キナーゼＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの活性化の抑制（Ｒｏｍｍｅｌ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、１７３８〜１７４１、１９９９；Ｇｒａｔｔｏｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、３０３５９〜３０３６５、２００１；Ｐａｒｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７、２５７３〜２５７８、２００２；ＭａｄｇｅおよびＰｏｂｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、１５４５８〜１５４６５、２０００）が必要であることが示されている。本発明者らは、インテグリン・ライゲーションおよびＡｋｔシグナリングの欠乏が、これらシグナル経路の改変に関連しているかどうかを調査した。本発明者らは、ＴＮＦ／ＩＦＮγに暴露させた接着性ＨＵＶＥＣおよび球状体中のＭＤＭ２、ｐ５３、リン酸化ＦＫＨＲ／ＦＲＫＨＬ１、ＭＥＫ、ｐ３８、−ＪＮＫのレベルを決定した。
【０１３２】
このような球状体は、フィブロネクチン接着性細胞と比べてＦＫＨＲ／ＦＫＲＬ１のリン酸化が不足しており、ＭＤＭ２レベルが低下しており、ｐ５３が蓄積している（図５ａ）。さらに、球状体は、ＭＥＫ、ｐ３８、ＪＮＫの基礎的なリン酸化およびＴＮＦ／ＩＦＮγ誘発性リン酸化が増加している（図５ｂ）。
【０１３３】
これらの結果は、ＦＫＨＲ／ＦＫＨＲＬ１を阻害することによって、ｐ５３レベルを低下させることによって、およびＭＥＫ、ｐ３８、ＪＮＫのリン酸化を抑制することによって生存を促進する点で、Ａｋｔの役割と矛盾しない。
【０１３４】
実施例６：
小さな分子化合物によるインテグリン依存性接着の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで内皮細胞をＴＮＦα誘発性アポトーシスに感作させる
インテグリン・ライゲーションの低下は接着性ＨＵＶＥＣのＴＮＦ誘発性アポトーシスを感作させる
インテグリン・ライゲーションが減少した条件下でＴＮＦに対する感受性が増加することは、球状体に独特なことではない。インテグリン依存性接着を促進する基質であるポリＬ−リシン（ＰＬＬ）（Ｂｅｒｓｈａｄｓｋｙ他、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、６、１２７９〜１２８９、１９９６）上で培養したＨＵＶＥＣはＰＬＬ上で生存し、ＴＮＦ±ＩＦＮγの添加は大量死滅を引き起こし（図６ａ）、これはＡｋｔｍｐの発現により防止された（示さず）。さらに、本発明者らは、フィブロネクチン上へのα５β１／αＶβ３依存性接着の□５□１成分に影響を与えないＥＭＤ１２１９７４（（シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）、αＶβ３／αＶβ５拮抗性環状ペプチド）（Ｄｅｃｈａｎｔｓｒｅｉｔｅｒ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４２、３０３３〜３０４０、１９９９）を用いて、フィブロネクチン上のＨＵＶＥＣ中のインテグリンαＶβ３選択的に阻害した（図６ｂ）。ＴＮＦ／ＩＦＮγおよびＥＭＤ１２１９７４のいずれもが単体では生存に影響を与えなかったが、ＴＮＦ／ＩＦＮγとＥＭＤ１２１９７４に組み合わせて暴露させると（非阻害性対照ペプチドＥＭＤ１３５９８１ではない）、アポトーシスおよび解離が増加し（図６ｃ）、生存度が低下した（図６ｄ）。Ａｋｔｍｐの発現は、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＥＭＤ１２１９７４に誘発されたアポトーシスから保護した（図６ｅ）。
【０１３５】
実施例７：
インテグリン・ライゲーションの低下は、ＴＮＦリガンドファミリーの様々なデスリガンドに誘発されるアポトーシスに接着性ＨＵＶＥＣを感作させる
インテグリン・ライゲーションの低下の際の、デス受容体シグナリングのプロアポトーシスに対する感受性の増大はＴＮＦに限定されておらず、フィブロネクチン上で培養したＨＵＶＥＣをＥＭＤ１２１９７４の存在下ＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬに暴露させた場合も観察された。デスドメインを欠いた受容体に結合するリガンドであるＬＩＧＨＴは、αＶβ３妨害に相乗効果をまったく示さなかった（図７）。
【０１３６】
実施例８：
ＥＭＤ１２１９７４が確立した腫瘍をＴＮＦの抗腫瘍活性に感作させた
血管新生内皮細胞はαＶβ３インテグリンを発現し、αＶβ３ライゲーションは内皮細胞の生存を促進する（Ｂｒｏｏｋｓ他、Ｃｅｌｌ、７９、１１５７〜１１６４、１９９４；Ｂｒｏｏｋｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、５６９〜５７１、１９９４）。ＥＭＤ１２１９７４がｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞をＴＮＦ誘発性アポトーシスに感作させたという観察は、この化合物がＴＮＦの抗腫瘍活性を増強させることができることを示唆した。この仮定を試験するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦの細胞傷害に耐性の腫瘍である、高度に活動的で血管形成された同系ＢＮ１７５軟組織肉腫を有するラットを処置した（Ｍａｎｕｓａｍａ他、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、６、１７３〜１７７、１９９９）。本発明者らは、分離肢灌流（ＩＬＰ）技術を使用して、ＴＮＦ、ＥＭＤ１２１９７４、またはその組合せを腫瘍を有する肢に投与した。ＴＮＦまたはペプチドのみを用いた治療では、腫瘍の増殖にまったく影響が与えられなかった。対照的に、ＴＮＦとＥＭＤ１２１９７４を組み合わせた投与では、５０％の動物で完全な腫瘍退行、および全体的に有意な腫瘍増殖の低下がもたらされた（図８）。局部または全身性の毒性は、ＥＭＤ１２１９７４／ＴＮＦで治療した動物で観察されず、これは、ＥＭＤ１２１９７４が腫瘍を選択的にＴＮＦ細胞傷害に対して感作させたことを示す。ＢＮ１７５腫瘍細胞はＴＮＦに非感受性であり、高いＭｎ2+の存在下ででもフィブリノーゲンへの接着が弱いこと、およびＥＭＤ１２１９７４などαＶβ３選択的阻害剤に対する感受性が低いことから評価されるように、活性のあるαＶβ３インテグリンを発現しないので（発表していない観察）、相乗強化的な抗腫瘍効果が腫瘍血管形成の破壊を要することが最も可能性が高いと結論づけられる。
【０１３７】
本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏデータをまとめると、このことは、内皮生存を制御するこのシステムにおいてインテグリンαＶβ３がαＶβ１より重要であることを強く支持する。
【０１３８】
実施例９：
ＨＵＶＥＣの培養および電気穿孔
既に記載のようにＨＵＶＥＣを調製し（Ｒｕｅｇｇ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、４、４０８〜４１４、１９９８）、パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）３と７の間で使用した。完全な培地は、Ｍ１９９（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、スイス、バーゼル）、１０％のＦＣＳ（Ｓｅｒｏｍｅｄ、ドイツ、ベルリン）、１２μｇ／ｍｌのウシ脳抽出物（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ−Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、米国メリーランド州ウォーカーズビル）、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＥＧＦ（ｈｕｍａｎ ｒｅｃ． ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、英国ロンドン）、２５Ｕ／ｍｌのヘパリン、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。電気穿孔には、ＨＵＶＥＣを完全培地に再懸濁させ、氷上で５分間、ＤＮＡ（２０μｇの指定したプラスミドおよび５μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１）と共にインキュベートし、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ、スイス、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、）を用いて電気穿孔した。電気穿孔したＨＵＶＥＣを使用前に４８時間培養した。細胞の約８０％が電気穿孔の４０時間後にＥＧＦＰを発現した。
【０１３９】
実施例１０：
球状体の形成
トリプシン処理によってＨＵＶＥＣを回収し、完全培地に１．０×１０6個の細胞／ｍｌで再懸濁させ、事前に１％のＢＳＡでコーティングした１２ウェルの非組織培養プレート（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州ロサンゼルス）に１ｍｌ／ウェルで播種した。凝集体の調査には、２００μｌの細胞懸濁液を１％のＢＳＡでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉｓｏｒｐＩＩ、ＮＵＮＣ、デンマーク、ロスキレ）のマイクロウェルに、単独で、あるいはｍＡｂｓ（１０μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、またはＣａ2+／ＥＤＴＡ（１０／５ｍＭ）の存在下で播種した。球状体の形成を６時間および１６時間に評価した。Ｔｅｌｅｖａｌ３１顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ、スイス、チューリッヒ）を用いてマイクログラフを記録した。
【０１４０】
実施例１１：
球状体の形態学分析
形態学の評価のために、球状体をＥｐｏｎ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ）に包埋し、厚い部分を１％のメチレン／アズールブルーを用いて染色した。免疫染色には、凍結させた球状体の切片を４％の（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｓ、スイス、ブーフス）ホルムアルデヒド中で固定した。１％のＢＳＡでブロックした後、切片を連続的に１時間、一次ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）およびＣｙａｎ３で標識したＧａＭ抗血清（米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）と共にインキュベートした。ＴＵＮＥＬ反応には、凍結させた球状体切片を４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、記載のように処理した（Ｒｕｅｇｇ他、Ｉ．ｃ．）。
【０１４１】
全ＤＮＡ含量のために、ヨウ化プロピジウムを用いて球状体を対比染色した。
【０１４２】
ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ、英国Ｍｉｌｈａｍ）を備えた落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）、またはレーザー共焦点顕微鏡（ＬＳＭ４１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）を用いて切片を視察した。アポトーシス指数は、緑（断片化されたＤＮＡのＴＵＮＥＬ染色）と赤（全ＤＮＡによるヨウ化プロピジウム染色）のピクセルの比を計算することによって決定した。
【０１４３】
各条件で分析した球状体の数は、Ｃ、３１；Ｔ、２１；ＴＩ、１２であった。培養物中のアポトーシス細胞の検出には、全培養物または回収した浮遊細胞にＤＮＡ染料ＹｏＰｒｏ−１（２５０ｎＭ）を加えた（Ｄｅｌｈａｓｅ，Ｍ．、Ｌｉ，Ｎ．およびＫａｒｉｎ，Ｍ．、「Ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．」、Ｎａｔｕｒｅ、４０６、３６７〜３６８、２０００）。培養物は、倒立蛍光顕微鏡観察（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ、スイス、Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ）によって視察した。電子顕微鏡観察には、２．５％のグルタルアルデヒドを用いて１００ｍＭのカコジレート緩衝液中で球状体を固定し、１％のＯｓＯ4中で後固定した。細胞をエタノール中で脱水し、Ｅｐｏｎに包埋した。Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１０透過型電子顕微鏡を使用して、超薄の切片を検査した。
【０１４４】
実施例１２：
細胞の生存および増殖
生存度には、１％のＢＳＡでコーティングした２４ｍｍのウェルに１×１０6個の細胞／ｍｌでプレートしたＨＵＶＥＣ球状体、または３μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングした３５ｍｍの非組織培養プレート（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェル中の４×１０5個の細胞を、ＴＮＦα（２００ｎｇ／ｍｌ＝１０4Ｕ／ｍｌ）±ＩＦＮγ（３３０ｎｇ／ｍｌ＝１０4Ｕ／ｍｌ）を用いて刺激した。キナーゼ阻害剤またはＥＭＤペプチドを以下の濃度、すなわち、ワートマニン、１００ｎＭ；ＬＹ２９４００２、２０μＭ；ＥＭＤペプチド、３００μＭで、それぞれ刺激の１時間または４時間前に加えた。１６時間の培養後、５ｍＭのＥＤＴＡを用いて（球状体、２０℃で５分間）、または１×トリプシン（接着培養物）を用いて解離することによって細胞を収穫し、洗浄し、完全培地に４×１０5個の細胞／ｍｌで再懸濁させ、マイクロタイター組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に１００μｌ／ウェルでアリコートし、３つ組、１：２ステップで滴定した。４８時間後に、最後の４時間の間のＭＴＴ変換を測定することによって相対的な細胞数を評価した。結果を５４０ｎｍでのＯ．Ｄ．値で示し（Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔ、米国コネチカット州メリディアン）、これは３つ組のウェルの平均値±標準偏差を示す。
【０１４５】
実施例１３：
細胞脱離アッセイ
１μｇ／ウェルのフィブロネクチンまたは０．５％のゼラチンを用いて、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＩＩ ＥＬＩＳＡプレートを終夜、４℃、ＰＢＳ中でコーティングした。コーティングしたウェルを洗浄し、１％のＢＳＡを用いて２時間、３７℃でブロックし、使用前に洗浄した。ＦＣＳなしの基礎培地中で２×１０4ｃ／ウェルを加え、遠心分離（４０×ｇ）によって手短に沈降させた。段階的な濃度でペプチドを加える前に、細胞を３７℃で２時間接着させた。２時間後、温かいＰＢＳを用いてウェルを洗浄し、接着した細胞を２％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．５％のクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ）で染色し、６２０ｎｍでのＯ．Ｄ．読み取り値によって定量した（Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔ）。結果をＯ．Ｄ．値として示し、これは、２つ組ウェルの平均±特定の接着の標準偏差（＝ＥＣＭタンパク質への接着マイナスＢＳＡへの接着）を表す。
【０１４６】
実施例１４：
フロー・サイトメトリー法
ＨＵＶＥＣおよびＥＧＦＰ発現の間接的な免疫染色を、以下の標準プロトコルに従って実施した（Ｒｕｅｇｇ他、Ｉ．ｃ．）。ヨウ化プロピジウム染色によって死亡細胞を排除した。すべての試料は、ＦＡＣＳｃａｎＩＩ（登録商標）およびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて分析した。
【０１４７】
実施例１５：
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＨＵＶＥＣ（各条件１×１０6個の細胞）を記載のように調製し（Ｃａｉ他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７２、９６〜１０１、１９９７）、Ｔ４キナーゼで末端を［γ−３２Ｐ］標識したヒトＨＩＶ末端反復配列のｋＢ配列を含む合成二本鎖３１量体のオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。ＮＦ−κＢが３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドに結合したことは、ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって決定された。
【０１４８】
実施例１６：
ウェスタン・ブロッティング
５０μｌの細胞溶解物上清（２５０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に１×１０6）を、７．５％〜１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェットブロット（Ｂｉｏ Ｒａｄ）によってＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、スイス、フォルケツヴィル）に移した。膜を連続的に、５％の乾燥乳中で１時間、一次抗体と共に終夜４℃で、およびＨＲＰ標識ＧａＭ（Ｄａｋｏ、スイス、ツーク）と共に１時間インキュベートした。検出にはＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した。再プロービングには、膜を２％のＳＤＳ、５０ｍＭのトリスおよび１００ｍＭのＢＭＥ中、５０℃で３０分間ストリップした。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血管新生剤、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）またはＴＮＦαの生物活性を有する分子を、場合によっては、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）など他の細胞傷害薬剤やシスプラチンなどの化学療法剤、あるいは、抗ＥＧＦＲ抗体などのＥｒｂＢ受容体阻害剤と一緒に、投与することを含んでなる、腫瘍および腫瘍転移の治療用の組合せ療法に関する。該手法ならびに前記薬剤複数を含んでなる医薬組成物は、各個治療薬の腫瘍細胞増殖阻害効果の相乗的な強化をもたらし、個々の成分の単独投与において見出されるよりも、より効果的な治療をもたらすことができる
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、また新血管形成とも呼ばれるが、新しく発生中の血管の組織内への伸長を伴う、組織血管形成のプロセスである。このプロセスは、内皮細胞および平滑筋細胞の浸潤によって媒介されている。このプロセスは、（１）血管は、既存の血管から出芽することができる、（２）血管の新規発生は、前駆細胞から発することができる（脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））、または（３）存在する細い血管は、その直径を拡大することができる、該３つの経路のいずれかにより、進行すると考えられている（Ｂｌｏｏｄ他、１９９０、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０３２、８９）。血管内皮細胞は、ビトロネクチン受容体（αVβ3またはαVβ5）、コラーゲン・タイプＩおよびＩＶの受容体、ラミニン受容体、フィブロネクチン／ラミニン／コラーゲン受容体、フィブロネクチン受容体を含む、少なくとも５つのＲＧＤ依存性インテグリンを含有していることが知られている（Ｄａｖｉｓ他、１９９３、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５１、２０６）。平滑筋細胞は、αVβ3およびαVβ5を含む、少なくとも６つのＲＧＤ依存性インテグリンを含有していることが知られている。
【０００３】
血管新生は、新生児の生育における重要なプロセスであり、また、創傷治癒、ならびに組織炎症、関節炎、乾癬、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、および他の新血管形成性の眼疾患を含む、様々な臨床的に重要な疾病の病因においても、重要である。血管新生に関連したこれらの臨床的病態は、血管新生病と呼ばれる（Ｆｏｌｋｍａｎ他、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、４４２）。
【０００４】
様々なインテグリンのαまたはβサブユニットに免疫特異的なモノクローナル抗体を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏな細胞接着の阻害により、微小血管内皮細胞を含めて様々な細胞種の細胞接着にビトロネクチン受容体αVβ3が関連付けられた（Ｄａｖｉｓ他、１９９３、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、２０６）。
【０００５】
インテグリンは、細胞外基質タンパク質と結合し、従って、一般的に細胞接着現象と呼ばれている、細胞−細胞および細胞−細胞外基質の相互作用を媒介することが知られている、細胞性受容体の１クラスである。このインテグリン受容体は、αおよびβサブユニットから形成される非共有結合性ヘテロ二量体糖タンパク質複合体に共通する構造的特徴を有するタンパク質のファミリーを構成する。ビトロネクチンと優先的に結合する、その本来の特徴により命名されたビトロネクチン受容体は、現在では、αVβ1、αVβ3、αVβ5と呼ばれる３つの異なるインテグリンを指すことが知られている。αVβ1は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンと結合する。αVβ3は、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、フォンウィルブランド因子を含めた様々なリガンドと結合する。αVβ5は、ビトロネクチンと結合する。共通の生物学的特異性を有する、異なるインテグリンやサブユニットと同様に、異なる生物学的機能を有する様々なインテグリンが存在することも明白である。多くのインテグリンに対する、リガンド内の１つの重要な認識部位は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）のトリペプチド配列である。ビトロネクチン受容体インテグリンに対する、上で特定したリガンドの全てにおいて、ＲＧＤが見出されている。
【０００６】
このＲＧＤ認識部位は、ＲＧＤ配列を含む直線状および環状（ポリ）ペプチドによって模倣することができる。かかるＲＧＤペプチドは、それぞれ、インテグリン機能の阻害剤または拮抗剤であることが知られている。しかし、ＲＧＤペプチドの配列および構造に応じて、特異的なインテグリンを標的にするように阻害の特異性が改変できることを特記することが重要である。異なるインテグリン特異性を有する、様々なＲＧＤポリペプチドが、例えば、Ｃｈｅｒｅｓｈ他、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、９４５、Ａｕｍａｉｌｌｅｙ他、１９９１、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．、２９１、５０、および数々の特許出願や特許（例えば、米国特許第４，５１７，６８６号、第４，５７８，０７９号、第４，５８９，８８１号、第４，６１４，５１７号、第４，６６１，１１１号、第４，７９２，５２５号、ヨーロッパ特許第０７７０ ６２２号）に記載されている。
【０００７】
新しい血管の生成、あるいは、血管新生は、悪性腫瘍疾患において、主な役割を担っており、血管新生を阻害する薬剤の開発に対する多くの関心が起こさせている（例えば、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ他、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１、１４９；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１，２７；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９、３１５ 参照）。血管新生を阻害するための、αVβ3インテグリン拮抗剤の使用は、固形腫瘍への血液供給を減少させることにより固形腫瘍の成長を阻害する方法において、知られている（例えば、合成ポリペプチド、モノクローナル抗体、αVβ3受容体に結合して血管新生を阻害するαVβ3の模倣体など、αVβ3の拮抗剤の使用を記載している、米国特許第５，７５３，２３０号および米国特許第５，７６６，５９１号 参照）。ビトロネクチン受容体αVβ5の拮抗剤を使用して、αVβ5に媒介された組織の血管新生を阻害する方法および組成物は、国際公開 ＷＯ ９７／４５４４７号パンフレットに開示されている。
【０００８】
血管新生は、内皮細胞の浸潤、遊走、および増殖によって特徴づけられ、細胞の細胞外基質成分との相互作用に依存している。この関係では、インテグリン型細胞−基質受容体が、細胞の拡散および遊走を媒介する。インテグリンαVβ3型の内皮接着受容体は、抗血管新生の治療戦略における血管特異的標的を提供する、中心的なプレーヤーであることが示された（Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、５６９；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ他、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０）。血管新生における血管性インテグリンαVβ3の必要性は、いくつかのｉｎ ｖｉｖｏモデルによって実証され、すなわち、移植したヒト腫瘍による新しい血管の生成が、前述のように、インテグリンαVβ3およびαVβ5のペプチド拮抗剤の全身投与、あるいはその代わりに、抗αVβ3抗体ＬＭ６０９によって、完全に阻害された（Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９、１１５７；ＡＴＣＣ９５３７）。この抗体は、その天然リガンドによるその活性化は、増殖性血管新生血管細胞のアポトーシスを阻害するαVβ3インテグリン受容体を阻害し、そして、それによって腫瘍増殖に必須の現象である、新しく形成中の血管の成熟を乱す。とはいえ、内皮細胞が存在していなくても、黒色腫細胞は、クモの巣状パターンの血管を形成できることが最近報告されており（Ｂａｒｉｎａｇａ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、１４７５）、腫瘍が、内皮組織の存在下でのみ有効である一部の抗血管新生剤を無効化することができる可能性を暗示している。
【０００９】
ＶＥＧＦ、Ａｎｇ１、およびｂＦＧＦを含む、数々の分子は、内皮の増殖、遊走、および集合を刺激し、また、重要な生存因子である。ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）は、内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激することができる、選択的血管新生成長因子として同定されている。特に、ＶＥＧＦは、原発腫瘍における、および虚血性眼球疾病における血管新生の主要な媒介者であると考えられている。ＶＥＧＦは、チロシンキナーゼ活性を有する高親和性の膜結合受容体に結合する（Ｊａｋｅｍａｎ他、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８９、２４４）、内皮細胞に特異的な血管新生性因子（Ｆｅｒｒａｒａ他、１９９２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｒｅｖ．、１３、１８）および血管透過性因子である（Ｓｅｎｇｅｒ他、１９８６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４６５６２９）、ホモ二量体（ＭＷ：４６，０００）である。ヒト腫瘍バイオプシーでは、悪性腫瘍細胞によるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの、また近隣の内皮細胞中におけるＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡの発現の増強が示される。ＶＥＧＦの発現は、血管の壊死領域に近隣する腫瘍領域中で最大であるように見える（総説として、Ｔｈｏｍａｓ他、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（２）、６０３；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１、２７ 参照）。国際公開 ＷＯ ９７／４５４４７号パンフレットは、αVβ5インテグリンを、特には、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αによって誘発される新血管形成と関連づけ、また、αVβ5拮抗剤がＶＥＧＦによって促進される血管新生を阻害することができることを開示している。効果的な抗腫瘍療法では、モノクローナル抗体を使用して血管新生を阻害するために、ＶＥＧＦ受容体を標的にすることを利用することもできる（Ｗｉｔｔｅ他、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、１７（２）、１５５）。ＭＡｂ ＤＣ−１０１は、腫瘍細胞の血管新生を阻害することが知られている。
【００１０】
チロシンキナーゼは、アデノシン三リン酸の末端リン酸をタンパク質基質のチロシン残基への転移を触媒している、酵素の一群である。チロシンキナーゼは、基質のリン酸化を通じて、数々の細胞機能のシグナル伝達において、必須な役割を担っていると信じらている。シグナル伝達の正確な機構は依然として不明確であるが、チロシンキナーゼは、細胞増殖、発癌、および細胞分化に寄与する重要な因子であることが示されている。
【００１１】
チロシンキナーゼは、受容体型または非受容体型に分類することができる。受容体型および非受容体型のチロシンキナーゼの双方とも、癌、乾癬、過免疫応答を含む、数々の発病状態をもたらす細胞性シグナル経路に関与している。多くのチロシンキナーゼが、細胞成長のみならず血管新生にも関与している。
【００１２】
受容体型のチロシンキナーゼは、細胞外、膜貫通、ならびに細胞内も部分を有しているが、受容体型でないチロシンキナーゼは、完全に細胞内にある。受容体と連結されたチロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通配列、および細胞質内チロシンキナーゼドメインを含有する膜貫通タンパク質である。受容体型のチロシンキナーゼは、多様な生物活性を有する、多数の膜貫通受容体を含んでいる。実際、受容体型のチロシンキナーゼの様々なサブファミリーが同定されている。包含されるチロシンキナーゼには、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ＥｒｂＢ主要クラスファミリーの上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体が含まれる。また、神経成長因子（ＮＧＮ）受容体、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）受容体、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）受容体、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）受容体も、包含されている。
【００１３】
ＨＥＲまたはＥｒｂＢサブファミリーと命名された、受容体型チロシンキナーゼの１サブファミリーは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含んでなる。この受容体サブファミリーのリガンドには、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−ａ、アンフィレギュリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリン、ヘレグリンが含まれる。ＰＤＧＦサブファミリーには、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）を含んでなるＦＬＫファミリーが含まれる。
【００１４】
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされる、ＥＧＦＲは、ヒト悪性腫瘍との因果関係が関係付けられた。具体的には、乳房、膀胱、肺、頭部、頚部、および胃の癌だけでなくグリア芽細胞種でも、ＥＧＦＲ発現の増大が観察された。ＥＧＦＲ受容体の発現の増大は、しばしば、オートクリン刺激性経路による受容体活性化をもたらす同じ腫瘍細胞による、ＥＧＦＲリガンド、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ａ）、の生成の増大を付随している（ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．、６４：１２７〜１５４、１９９４）。ＥＧＦ受容体は、１７０，０００の分子量を有し、多くの上皮細胞種で見出される膜貫通糖タンパク質である。これは、少なくとも３つのリガンド、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング成長因子アルファ）、およびアンフィレギュリンによって活性化される。上皮成長因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−ａ）は共にＥＧＦ受容体に結合し、細胞性増殖および腫瘍成長を引き起こすことが実証されている。これらの成長因子は、ＨＥＲ２には結合しない（ＵｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、１９９０、Ｃｅｌｌ、６１、２０３）。それ自体の二量体の性質に基づき、受容体の二量体化を誘導する、成長因子のいくつかのファミリー（例えば、ＰＤＧＦ）とは異なり、ＥＧＦなどの単量体型成長因子は、その受容体用に結合部位２つを含み、従って、近隣するＥＧＦ受容体２つを架橋連結することができる（Ｌｅｍｍｏｎ他、１９９７、ＥＭＢＯ Ｊ．、１６、２８１）。受容体の二量体化は、内因性触媒活性の刺激および成長因子受容体の自己リン酸化に対して、必須である。受容体型タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、ホモならびにヘテロ二量体化のいずれをも受けることができることには、注意すべきである。
【００１５】
抗ＥＧＦ受容体抗体は、ＥＧＦおよびＴＧＦ−ａの受容体への結合を妨害することで、腫瘍細胞の増殖を阻害できることが実証された。これらの知見を考慮して、ＥＧＦ受容体に対するネズミおよびラットモノクローナル抗体多数が開発され、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、腫瘍細胞の成長を阻害するその能力が試験された（ＭｏｄｊｔａｈｅｄｉおよびＤｅａｎ、１９９４、Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、４、２２７）。いずれもＥＧＦ受容体に特異性を有する、ヒト化モノクローナル抗体４２５（ｈＭＡｂ４２５、米国特許第５，５５８，８６４号、ヨーロッパ特許第０５３１ ４７２号）およびキメラモノクローナル抗体２２５（ｃＭＡｂ２２５、米国特許第４，９４３，５３３号およびヨーロッパ特許第０３５９ ２８２号）は、臨床試験において、その有効性を示した。該Ｃ２２５抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＦ媒介腫瘍細胞成長を阻害し、また、ヌードマウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト腫瘍形成を阻害することが検証された。さらに、該抗体は、とりわけ、特定の化学療法薬（すなわち、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソール、シスプラチン）と相乗的に作用して、異種移植マウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト腫瘍を根絶させるように見えた。Ｙｅ他（１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８、７３１）は、ＨＥＲ２受容体に対するヒト化ＭＡｂ４Ｄ５と、ｃＭＡｂ２２５との組合せによって、ヒト卵巣癌細胞の治療に成功したことを報告した。
【００１６】
ＥｒｂＢファミリーの第２のメンバーである、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２あるいはｐ１８５ｎｅｕ）は、最初、化学的に処置したラットの神経芽細胞腫より、形質転換遺伝子の産物として同定された。該ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域内における、点突然変異（バリンからグルタミン酸）により起こされる。ｎｅｕのヒト相同体の増幅は、乳房および卵巣癌中で観察され、予後不良と関連している（Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：１７７〜１８２、１９８７；Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：７０７〜７ １２、１９８９；米国特許第４，９６８，６０３号）。ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）は、約１８５，０００の分子量を有し、ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ１）と相当な相同性を有するが、現在までのところ、まだ、ＨＥＲ２の特異的リガンドは明確に同定されていない。
【００１７】
さらに、ＨＥＲ２に対する抗体４Ｄ５は、ＴＮＦαの細胞傷害効果に対して、ＥｒｂＢ２過剰発現乳房腫瘍細胞系を感受的にすることが見出された（米国特許第５，６７７，１７１号）。ネズミ抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５のヒト化組換え体（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）米国特許第５，８２１，３３７号）は、継続的に、事前の抗癌療法を受けている、ＥｒｂＢ２過剰発現転移性乳癌を有する患者において、臨床的な実効がある（Ｂａｓｅｌｇａ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１４：７３７〜７４４、１９９６）。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、その腫瘍はＥｒｂＢ２タンパク質を過剰発現している、転移性乳癌を有する患者の治療用に、１９９８年に販売承認を受けている。
【００１８】
ＴＮＦαは、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンド、ＴＲＡＩＬ、リンホトキシンなどの重要なサイトカインを含む、分子の大きなファミリーに属する（Ｌｏｃｋｓｌｅｙ他、２００１、Ｃｅｌｌ、１０４：４８７〜５０１）。多くの細胞種から放出されるほか、ＴＮＦαはまた、細胞膜に結合した、より高分子量の形態で、細胞上に存在しており、この形態も、様々な生物効果を媒介しているように見える。ＴＮＦαは、正常な発生および生理機能においては、殆ど役割を持っていないと考えられているが、しかし、これは、多くの疾病状態において、多くの組織に有害で破壊的な効果を及ぼす（Ｔｒａｃｅｙ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ、１９９４、４５：４９１）。ＴＮＦαが主要な役割を果たすことが示された疾病状態には、敗血性ショック症、癌悪液質、関節リウマチ等が含まれる。
【００１９】
ヒトＴＮＦαは、１９８５年に最初に精製された（Ａｇｇａｒｗａｌ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６０、２３４５〜２３５４参照）。そのすぐ後、ＴＮＦ ｃＤＮＡのクローニングおよびヒトＴＮＦ座位のクローニングがなされた（Ｐｅｎｎｉｃａ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９８４、３１２、１２４〜７２９；Ｗａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５、３１３、８０３〜８０６）。ＴＮＦαは、主にマクロファージによって産生される、三量体型の１７ＫＤａのポリペプチドである。このペプチドは、最初、２６ＫＤａの膜貫通タンパク質として発現され、そこから、タンパク質分解切断によって、該１７ＫＤａのサブユニットが切断され、放出される。ＴＮＦαは、通常、様々な細胞、例えば、活性化されたマクロファージや線維芽細胞により産生される。ＴＮＦαは、多くの多様な因子を誘導することが報告されている。ＴＮＦαはまた、直接的にまたは間接的に、伝染性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）や関節炎などの自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、敗血症、および特定の種類の感染症など、様々な疾病に関与することが報告されている。
【００２０】
ＴＮＦαならびに炎症応答性感染および組織傷害は、総称して炎症応答と呼ばれる、免疫系の複雑な反応の開始を誘起する、生化学変化のカスケードを誘発する。この応答の展開は、少なくとも部分的には、局部血管拡張または血管透過性の亢進や血管内皮の活性化に基づいており、それは、白血球の効率的な循環と損傷部位への遊走を可能とし、従って、なんらかの抗原へ結合し、破壊する確率を増進させる。その後、血管内皮が活性化するまたは炎症性になると考えられる。一般的に、炎症は、様々な予想外の刺激物に対する、即答性の免疫応答であり、それ故、迅速な開始および短い持続を（急性炎症）示す。しかし、その持続的なまたは制御されていない活性（慢性炎症）は、身体に有害な効果を有しており、敗血性ショック、関節リウマチ、炎症性腸疾患、うっ血性心不全などいくつかの免疫疾患の病因となる（「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、ＢｏｎａおよびＲｅｖｉｌｌａｒｄ（編）、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム、２０００、１１８〜１４８の「ＴＮＦ ａｎｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ」参照）。
【００２１】
ＴＮＦαだけでなく多くの他のサイトカインは、炎症応答の開始の直後に、マクロファージから分泌され、血液凝固を誘発し、血管透過性を増大させ、血管内皮細胞上の接着分子の発現を活性化させる。
【００２２】
ＴＮＦαは、宿主にとっては、完全に有利でも完全に破壊的でもない。従って、ＴＮＦαは、内皮細胞機能に対する強力なモジュレーターである。血管の状況に応じて、これは内皮細胞の活性化を誘発することによって炎症ならびに生存を促進し、あるいは、内皮細胞アポトーシスを誘発することによって組織壊死ならびに血管破壊を引き起こす（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．、Ｐａｔｈｏｌ Ｂｉｏｌ、Ｐａｒｉｓ、４６、１５９〜１６３、１９９８；ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．、７、９３〜１２４、１９９６）。これら２つの相反する応答を媒介する多くの細胞内シグナル経路が、特定さられているが（Ｗａｌｌａｃｈ他、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７、３３１〜３６７、１９９９）、ＴＮＦαに暴露された内皮細胞が、生存するか死滅するかを決定する、細胞外の合図（ｃｕｅ）は、未だに特定できていない。
【００２３】
確かに、その過程において、宿主の快適な状態を損なうことなく、宿主が侵入する微生物に対して、効率良く反応することを保証するために、その生成と制御の均衡は、維持される。炎症反応の媒体であるので、ＴＮＦαは、適切な免疫応答をブーストすることによって、細菌性感染および組織損傷に対する戦いにおいて、身体を助る。しかし、その過生産は、慢性炎症をもたらし、身体に有害な効果を有し、いくつかの疾患の発症に主要な役割を果たす。
【００２４】
ＩＦＮγは、ＴＮＦαの強力なエンハンサーである（Ｄｅａｌｔｒｙ他、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７、６８９〜６９３、１９８７）。ＴＮＦαが細胞アポトーシスを引き起こす場合、細胞の生存を促進する転写因子である、ＮＦ−кＢの活性化は、ＴＮＦα誘発性アポトーシスを抑制する可能性がある（Ｖａｎ Ａｎｔｗｅｒｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７８７〜７８９、１９９６）。
【００２５】
ＴＮＦαは、増殖、活性化、分化など細胞応答の他、プログラムされた細胞死をももたらす、幅広い種類の細胞性シグナルを誘導する。ＴＮＦαに対する細胞シグナリングは、キナーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、転写因子の活性化などの初期応答、ならびに、後期応答、従って、ミトコンドリア内の電子伝達鎖の摂動、ラジカル生成、オキシド生成、および様々な物質の放出などの、より間接的な応答に分類される。死亡ドメイン含有アダプタータンパク質の供給、ＮＦкＢの活性化、カスパーゼ活性化などの初期細胞応答の多くもまた、ＴＮＦリガンドファミリーの他のメンバーがそれぞれの受容体に結合することによって開始される。従って、リンホトキシン、ＦａｓリガンドやＴＲＡＩＬなどの分子は、ＴＮＦとともに、余分に作用することができる（ＧｒｅｌｌおよびＣｌａｕｓｓ、Ｉ．ｃ．）。
【００２６】
インテグリンによって媒介される細胞外基質（ＥＣＭ）への接着は、内皮細胞を含めたほとんどの細胞の生存にとって、必須である。例えば、血管性インテグリンαＶβ３は、血管新生内皮細胞の増殖および生存を促進し、αＶβ３拮抗剤は、血管新生内皮細胞のアポトーシスを誘導し、血管新生を抑制する（Ｂｒｏｏｋｓ他、Ｃｅｌｌ、７９、１１５７〜１１６４、１９９４）。ＰＩ ３−Ｋ／ＡＫＴ（Ｋｈｗａｊａ他、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ、１６、２７８３〜２７９３、１９９７）ならびにＮＦ−кＢ（Ｓｃａｔｅｎａ他、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１４１、１０８３〜１０９３、１９９８）のシグナル経路の活性化を含む、インテグリン媒介細胞生存に関連する生化学現象のいくつかが同定された。インテグリンの他に、ＰＥＣＡＭ−１およびＶＥカドヘリンの細胞−細胞接着分子も、内皮細胞生存を促進する（Ｂｉｒｄ他、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ、１１２、１９８９〜１９９７、１９９９；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ他、Ｃｅｌｌ、９８、１４７〜１５７、１９９９）。
【００２７】
ＴＮＦは、一部の腫瘍細胞系にとって細胞傷害性であるが、これらのほとんどは、増殖には影響を受けない。従って、一部の動物モデルにおけるＴＮＦの抗腫瘍性効果（Ｂａｌｋｗｉｌｌ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４６：３９９０〜３９９３、１９８６）は、腫瘍細胞に対するサイトカインの直接的な作用に起因するとは考えにくい。いくつかの研究では、宿主媒介機構が、ＴＮＦによって誘起された腫瘍退行に関与していることが示された（Ｍａｎｄａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３７０７〜３７１１、１９８７）。累積されたデータは、ＴＮＦによる腫瘍の出血性壊死は、腫瘍内血管の内皮細胞レベルで開始されていることを示唆している（Ｈａｖｅｌｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７：１９６７〜１９８５、１９８８）。
【００２８】
癌患者における、ＴＮＦの臨床研究の結果は、概して、期待はずれである（Ｈａｒａｎａｋａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄ．、７：５２５〜５３４、１９８８の総説）。一般的に、ＴＮＦの抗腫瘍性効果は、相当な副作用によって制限されている。ＴＮＦの副作用を制限する１つのアプローチは、ＴＮＦ受容体型１に特異的な活性あるいは異なった薬力学特性を示しているＴＮＦ突然変異体の創製であった（Ｂｒｏｕｃｋａｅｒｔ他、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ、４３：１８５〜１９０、１９９４；Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１８：３８９９〜３９０５、１９９８；Ｌｕｃａｓ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１５：５４３〜５４９、２００１）。最近、黒色腫や末肢の肉腫を患っている患者において、進展が見られた。分離灌流技術（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって、有意で有益な効果を得ることができる。細胞増殖抑制剤またはＩＦＮと組み合わせて、４ｍｇに達するＴＮＦの極端な用量が利用される（Ｌｉｅｎａｒｄ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１０：５２〜６０、１９９２）。局部応答には、ネズミの系におけるＴＮＦ媒介抗腫瘍効果と類似する、強い炎症応答に付随した、腫瘍の急性軟化および赤色化が含まれる。
【００２９】
肢部の転移性黒色腫を有する患者に対するこの処置は、腫瘍血管構造を選択的に破壊するが、静止状態の血管を無傷のままに残すことが示された。この効果は、ＴＮＦおよびＩＦＮγによって誘発された、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、内皮細胞中のインテグリンαＶβ３機能の抑制、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの内皮細胞アポトーシスの誘発に関連している（Ｒｕｅｇｇ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、４、４０８〜４１４、１９９８）。これらの結果は、付加的な治療薬と組み合わせた、ＴＮＦは、全身性毒性を制御できることを条件として、一部の腫瘍の治療において、臨床的に非常に効果的となりえることを証明している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明では次に、インテグリンなどの、血管新生に寄与する分子は、ＴＮＦα活性を調節するが、抗癌剤としての、ＴＮＦαの臨床的使用に直接関与している可能性があることを説明する。ＴＮＦαとともに、抗血管新生剤、好ましくは、インテグリン拮抗剤を共投与すると、血管新生受容体を有する内皮細胞を、ＴＮＦのアポトーシス活性に対して、選択的に感受性とさせ、その結果、改良された腫瘍血管破壊を起こせる可能性がある。従って、この組合せ療法では、ＴＮＦの用量削減を可能とし、ＴＮＦの全身性副作用の回避が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、初めて、ＴＮＦα、ＴＮＦ突然変異体またはＴＮＦ様分子とともに、血管新生を妨害または抑制する薬剤を個体に投与するという、腫瘍の治療における新しい着想を記載する。場合によっては、本発明にかかる組成物は、下記により詳細に記載するように、好ましくは、細胞傷害剤、化学療法剤、ならびに、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤または拮抗剤からなる群から選択される、治療上活性のある化合物をさらに含む。
【００３２】
従って、本発明は、好ましい抗血管新生剤として、インテグリン（受容体）拮抗剤、ならびに、ＴＮＦα、ＴＮＦ突然変異体またはＴＮＦ様分子を治療有効量含んでなる医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、直鎖または環状のＲＧＤペプチドおよびＴＮＦαを、場合によっては、ＩＦＮγと一緒に含んでなる医薬組成物に関する。本発明にかかる好ましい組成物は、環状ペプチド シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅ−Ｖａｌ）、ＴＮＦαおよびＩＦＮγが含まれる。本発明によれば、前記治療的に活性のある薬剤は、１つまたは複数の抗血管新生剤、ＴＮＦα、ならびに、場合によっては、１つまたは複数の細胞傷害剤／化学療法剤／抗ＥｒｂＢ剤を、単一のパッケージまたは別個の容器中に含んでなる、パッケージを含む製薬キットによって、提供することもできる。
【００３３】
より具体的には、本発明は、それぞれ、少なくとも、一つの分子は、血管新生阻害活性を有し、他の一つは、ＴＮＦαである、２つまたはそれ以上の分子の適用および投与からなる、組合せ療法に関する。また、本発明はさらに、抗血管新生活性およびＴＮＦα活性を有する、単一の（融合）分子のみの、場合によっては、１つまたは複数の細胞傷害剤／化学療法剤と共に、投与することからなる、組合せ療法に関する。例えば、実質的に、ＴＮＦαに対して、直接またはリンカー分子を介して融合された、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅ−Ｖａｌ）からなるタンパク質を患者に施用することができる。別の例は、そのＦｃ部分のＣ末端において、ＴＮＦαと融合されている、以下に記載するＬＭ６０９のような、抗インテグリン抗体である。さらなる例は、特異性の１つは、インテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体に向けられ、もう１つは、ＥＧＦ受容体に向けられる、ＴＮＦαと融合された、二重特異性抗体である。
【００３４】
一般に、投与は、放射線療法を伴って行うことができ、放射線治療は、薬物投与と実質的に同時に、あるいはその前または後に行うことができる。本発明かかる組合せ療法の異なる薬剤の投与もまた、実質的に同時にあるいは順序に従って行うことができる。腫瘍の血管発生に関与する、受容体をその細胞表面に具えている腫瘍は、本発明の組合せ療法によりうまく治療することができる。
【００３５】
腫瘍は、その発生および増殖のため、代替ルートを誘導することが知られている。１つの経路が阻害された場合、これらは、しばしば、他の受容体とシグナル経路とを発現および利用して、別のルートに切り替える能力を有している。従って、本発明の薬剤組合せでは、腫瘍のこのような可能な発生戦略のいくつかを妨害して、その結果、様々な利点を提供する。本発明にかかる組合せは、下により詳細に記載するように、腫瘍、腫瘍様ならびに異常増殖性疾患、および腫瘍転移の治療および防止に有用である。好ましくは、本発明の組み合わせられる、個々の薬剤は、低用量、すなわち臨床の場で従来使用されてきた用量より低い用量で、組み合わせて投与する。個体に投与される、本発明の化合物、組成物、薬剤、および療法の用量を低下させることの利点には、より高い用量に付随する副作用の影響を低下させることが含まれる。例えば、メトトレキセートなどの化学療法剤の用量を減らすことによって、より高い用量において観察されるものに比べて、嘔気および嘔吐の頻度および重篤度の軽減がもたらされる。副作用の影響を軽減させることによって、癌患者の生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）の改善が図られる。副作用の影響を低下させるさらなる利点には、患者の負担の改善、副作用の治療のために必要な入院回数の減少、副作用に付随する苦痛を治療するのに必要な鎮痛剤の投与の低減が含まれる。あるいは、本発明の方法および組合せは、より高い用量では、治療効果を最大限にすることもできる。
【００３６】
本発明にかかる組合せは、驚くほどの相乗効果を示す。この薬剤の組合せを投与すると、顕著な薬物の悪い反応は検出できなかったが、臨床研究中に現実の腫瘍縮小および分解が観察される。
【００３７】
詳細には、本発明は、下記のものに関する：
・少なくとも（ｉ）１つの抗血管新生剤および（ｉｉ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはＴＮＦαの生物活性を有する分子を、治療有効量で、場合によっては、製薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と共に含んでなる医薬組成物；
・前記抗血管新生剤は、インテグリン（受容体）阻害剤／拮抗剤またはＶＥＧＦ（受容体）阻害剤／拮抗剤であることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記インテグリン受容体阻害剤／拮抗剤は、ＲＧＤ含有の直鎖または環状のペプチドであることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記ＲＧＤ含有ペプチドは、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）であることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記抗血管新生剤は、インテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体と結合する、抗体あるいは免疫療法的に活性なその断片であることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記抗血管新生剤とＴＮＦαとが連結されて、１つの融合分子を形成することを特徴とする、対応の医薬組成物；
・少なくとも１つの細胞傷害剤およびまたは化学療法剤をさらに含むことを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記細胞傷害剤は、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）および／または別の効果的なサイトカインであることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記化学療法化合物は、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル（タキソール）、ブレオマイシンからなる群から選択されることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤または拮抗剤をさらに含むことを特徴とする、対応の医薬組成物；
・前記阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ−２抗体あるいは免疫療法的に活性なその断片であることを特徴とする、対応の医薬組成物；
・（ｉ）少なくとも１つの抗血管新生剤、好ましくはインテグリン受容体阻害剤／拮抗剤、（ｉｉ）ＴＮＦα、ならびに、場合によっては、（ｉｉｉ）さらに細胞傷害剤および／または化学療法剤を含んでなるパッケージからなる製薬キット；
・（ｉ）シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）、（ｉｉ）ＴＮＦα、および（ｉｉｉ）ＩＦＮγ、ならびに、場合によっては、（ｉｉｉ）さらなる細胞傷害剤および／または化学療法剤および／またはＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤または拮抗剤を含んでなる、対応の好ましい製薬キット；
・前記製薬的に活性な薬剤は、前記パッケージ中において、個別の容器内で提供されることを特徴とする、対応の製薬キット；
・腫瘍および腫瘍転移を治療するための医薬または医薬組成物の製造における、特許請求の範囲中、ならびに上に定義されている医薬組成物の使用；ならびに
・上に定義されている、治療的に有効な医薬組成物を、同時にまたは順序に従って、個体に投与することを含む、個体中における腫瘍または腫瘍転移を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１ａ】ＨＵＶＥＣ球状体の形成および生存は、インテグリン・ライゲーションを必要としない。（ａ）阻害性の抗ＶＥカドヘリン（７５）ｍＡｂまたはＣａ2+欠乏（ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／Ｃａ2+）は、ＨＵＶＥＣ球状体の形成を阻害したが、インテグリンα１（Ｌｉａ１／２）、α５（ＳＡＭ−１）、αＶβ３（ＬＭ６０９）およびＰＥＣＡＭ−１（１０Ｄ９）やＲＧＤペプチドに対する阻害性ｍＡｂは、阻害しなかった。
【図１ｂ】（ｂ）生存度。球状体（○）またはフィブロネクチン（●）培養物から回収されたＨＵＶＥＣは、類似の生存プロフィールを有していた。
【図２ａ】インテグリン依存性接着は、ＨＵＶＥＣをＴＮＦ誘発性アポトーシスから保護する。（ａ）ＹｏＰｒｏ−１の取り込み：ＴＮＦ（Ｔ）およびＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）への暴露は、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣ中でＹｏＰｒｏ−１染色を誘発しなかったが、ＨＵＶＥＣ球状体中では、強いＹｏＰｒｏ−１染色を引き起こし、カスパーゼ阻害剤ＢＯＣおよびＺＶＡＤにより抑制された。ＴＮＦ±ＩＦＮγ（ＴＩ）。Ｃ、非処理の培養物
【図２ｂ】（ｂ）ＴＮＦ／ＩＦＮγで処理した（ＴＩ）球状体における、ウェスタン・ブロッティングによる、カスパーゼ−３の活性化とＰＡＲＰの切断（矢印）を示し、しかし、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣ中では生じていない。Ｃ、非処理の培養物。
【図２ｃ】（ｃ）ＴＮＦ（■）、ＴＮＦ／ＩＦＮγ（▲）、対照培地（○）に暴露させた、ＨＵＶＥＣの生存度曲線である。
【図２ｄ】（ｄ）ＴＮＦ（■）、ＴＮＦ／ＩＦＮγ（▲）、対照培地（○）に暴露させた、ＨＵＶＥＣの生存度曲線である。
【図２ｅ】（ｅ）α１（△／▲）、αＶβ３（□／■）、α４インテグリン（○／●）に対する特異的な固定化抗体（ｉｍＡｂｓ）上で、ＴＮＦ／ＩＦＮγの非存在下（中空記号）または存在下（中実記号）で培養したＨＵＶＥＣの生存度である。
【図３ａ】ＴＮＦ誘発性のＮＦ−κＢ活性化はインテグリン・ライゲーションを必要としない。（ａ）ウエスタン・ブロットおよび（ｂ）電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、ＴＮＦ／ＩＦＮγに暴露させた球状体ならびにフィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣにおける、Ｉ−κＢリン酸化（Ｐｉ−κＢ）、Ｉ−κＢ分解（Ｉ−κＢ）およびＮＦ−κＢ核移行（ＥＭＳＡ）の平行した動態を示す。
【図３ｂ】（ａ）ウエスタン・ブロットおよび（ｂ）電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、ＴＮＦ／ＩＦＮγに暴露させた球状体ならびにフィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣにおける、Ｉ−κＢリン酸化（Ｐｉ−κＢ）、Ｉ−κＢ分解（Ｉ−κＢ）およびＮＦ−κＢ核移行（ＥＭＳＡ）の平行した動態を示す。
【図３ｃ】（ｃ）ＴＮＦ（−−−）またはＴＮＦ／ＩＦＮγ（−）に暴露させたフィブロネクチンおよび球状体ＨＵＶＥＣ培養物上における、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現の、同一の誘導を示すフロー・サイトメトリー解析。（．．．）非処理の細胞。ＰＥＣＡＭ−１の発現を、対照として示す。
【図４ａ】Ａｋｔの活性化は、ＨＵＶＥＣの生存に必須であり、インテグリン・ライゲーションを要する。（ａ）表示の時間、ＴＮＦ／ＩＦＮγで刺激したフィブロネクチン接着性および球状体ＨＵＶＥＣの培養物中のリン酸化Ａｋｔ（Ｐｉ−Ａｋｔ）および全Ａｋｔ（Ａｋｔ）。
【図４ｂ】（ｂ）左パネル：ＰＩ−３キナーゼ阻害剤ワートマニン（Ｗ）およびＬＹ２９４００２（ＬＹ）は、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣをＴＮＦ（Ｔ）およびＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）誘発性アポトーシスに対して、感受性とさせた。死亡細胞を、ＹｏＰｒｏ−１染色によって可視化した。右パネル：ＬＹ２９４００２（●）、ＴＮＦ／ＩＦＮγ（△）、ＬＹ２９４００２／ＴＮＦ／ＩＦＮγ（▲）に曝した、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣの生存曲線である。（○）、非処理培養物。
【図４ｃ】（ｃ）構成的に活性な、ＰＩ−３キナーゼ（ｐ１１０*）およびＡｋｔ（Ａｋｔｍｐ）は、ＴＮＦ（●）またはＴＮＦ／ＩＦＮγ（▲）に曝した球状体の生存を促進したが、野生型Ａｋｔ（Ａｋｔｗｔ）または対照プラスミド（ｐＢＳ）は促進しなかった。（○）非処理の培養物。挿入は、形質移入された細胞のＥＧＦＰ蛍光のフロー・サイトメトリー解析を示す（％陽性細胞）。
【図４ｄ】（ｄ）対照プラスミド（ｐＢＳ）または構成的に活性のあるＡｋｔ（Ａｋｔ*）を用いて電気穿孔し、ＡｄΔＮＩ−κＢまたはＡｄＬａｃＺで感染させたＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ（Ｔ）またはＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）の存在下、あるいは非存在下（Ｃ）において、フィブロネクチン接着性単層または球状体として、培養した。アポトーシス細胞を、ＹｏＰｒｏ−１染色によって検出した。生存しているフィブロネクチン接着性細胞は、クリスタル・バイオレットによって染色した。
【図４ｅ】（ｅ）対照プラスミド（中空記号）およびｐＡｋｔｍｐ（中実記号）を用いて電気穿孔し、ＡｄΔＮＩ−κＢ（○／●）またはＡｄＬａｃＺ（△／▲）で感染させたＨＵＶＥＣをフィブロネクチン上、段階的な濃度のＴＮＦの存在下で培養し、生存している接着細胞を、クリスタル・バイオレットで染色したウェルのＯ．Ｄ．を測定することによって決定した。
【図４ｆ】（ｆ）非処理のＨＵＶＥＣ（．．．）、ならびにＴＮＦ（−−−）およびＴＮＦ／ＬＹ２９４００２（−）で処置したＨＵＶＥＣ中（左パネル）、ならびにＴＮＦ（−−−）およびＴＮＦ／ＩＦＮγ（−）に曝した、ＡｄΔＮＩ−κＢ（中央パネル）またはＡｄＬａｃＺで感染させたＨＵＶＥＣ中における、ＩＣＡＭ−１発現のフロー・サイトメトリー解析。
【図５ａ】（ａ〜ｃ）表示した時間、ＴＮＦ／ＩＦＮγに曝した、フィブロネクチンならびに球状体ＨＵＶＥＣ培養物中における、Ｐｉ−Ａｋｔ、ＭＤＭ２、ｐ５３、Ｐｉ−ＦＫＨＲ／ＦＲＫＨＬ１（ａ）、およびＰｉ−ＭＥＫ、Ｐｉ−ｐ３８、Ｐｉ−ＪＮＫ（ｂ）、およびＰｉ−ＥＲＫ（ｃ）のウエスタン・ブロット分析。全Ａｋｔ、ＦＫＨＲ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、およびＪＮＫタンパク質は、等量の全タンパク質を証明するため、示されている。球状体培養物は、フィブロネクチン接着性細胞に比べて、ＴＮＦ／ＩＦＮγへの応答において、ＡｋｔおよびＦＫＨＲ／ＦＫＲＬ１のリン酸化の欠乏、増大したレベルのｐ５３、およびＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫのリン酸化の増強を有する。
【図５ｂ】（ａ〜ｃ）表示した時間、ＴＮＦ／ＩＦＮγに曝した、フィブロネクチンならびに球状体ＨＵＶＥＣ培養物中における、Ｐｉ−Ａｋｔ、ＭＤＭ２、ｐ５３、Ｐｉ−ＦＫＨＲ／ＦＲＫＨＬ１（ａ）、およびＰｉ−ＭＥＫ、Ｐｉ−ｐ３８、Ｐｉ−ＪＮＫ（ｂ）、およびＰｉ−ＥＲＫ（ｃ）のウエスタン・ブロット分析。全Ａｋｔ、ＦＫＨＲ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、およびＪＮＫタンパク質は、等量の全タンパク質を証明するため、示されている。球状体培養物は、フィブロネクチン接着性細胞に比べて、ＴＮＦ／ＩＦＮγへの応答において、ＡｋｔおよびＦＫＨＲ／ＦＫＲＬ１のリン酸化の欠乏、増大したレベルのｐ５３、およびＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫのリン酸化の増強を有する。
【図５ｃ】（ａ〜ｃ）表示した時間、ＴＮＦ／ＩＦＮγに曝した、フィブロネクチンならびに球状体ＨＵＶＥＣ培養物中における、Ｐｉ−Ａｋｔ、ＭＤＭ２、ｐ５３、Ｐｉ−ＦＫＨＲ／ＦＲＫＨＬ１（ａ）、およびＰｉ−ＭＥＫ、Ｐｉ−ｐ３８、Ｐｉ−ＪＮＫ（ｂ）、およびＰｉ−ＥＲＫ（ｃ）のウエスタン・ブロット分析。全Ａｋｔ、ＦＫＨＲ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、およびＪＮＫタンパク質は、等量の全タンパク質を証明するため、示されている。球状体培養物は、フィブロネクチン接着性細胞に比べて、ＴＮＦ／ＩＦＮγへの応答において、ＡｋｔおよびＦＫＨＲ／ＦＫＲＬ１のリン酸化の欠乏、増大したレベルのｐ５３、およびＭＥＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫのリン酸化の増強を有する。
【図６ａ】低下したインテグリン・ライゲーションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦの細胞傷害を増強させる。（ａ）フィブロネクチンまたはＰＬＬ上で１６時間、ＴＮＦ（Ｔ）またはＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）の存在下、あるいは非存在下（Ｃ）、ＨＵＶＥＣを培養する。アポトーシスおよび生存の接着性細胞を、それぞれ、ＹｏＰｒｏ−１およびクリスタル・バイオレット染色により明らかにした。
【図６ｂ】（ｂ）ＥＭＤ１２１９７４は、αＶβ３媒介のＨＵＶＥＣのゼラチンへの接着（■）を破壊したが、α５β１／αＶβ３に媒介されたフィブロネクチンへの接着のα５β１成分（●）では、これは起こらなかった。対照ペプチドＥＭＤ１３５９８１は、効果がなかった（中空記号）。
【図６ｃ】（ｃ）ＨＵＶＥＣをフィブロネクチン上で、表示するように、ＴＮＦ／ＩＦＮγ（ＴＩ）、ＥＭＤ１２１９７４、ＥＭＤ１３５９８１の存在下、または非存在下（Ｃ）に培養した。アポトーシスおよび接着細胞は、それぞれ、ＹｏＰｒｏ−１染色および対比顕微鏡観察によって明らかにした。
【図６ｄ】（ｄ）パネルｃの実験におけるＨＵＶＥＣの生存曲線。ペプチドなし（○／●）；ＥＭＤ１２１９７４（△／▲）；ＥＭＤ１３５９８１（□／■）。非処理培養物、中空記号。ＴＮＦ／ＩＦＮγで処置した培養物、中実記号。
【図６ｅ】（ｅ）Ａｋｔｍｐ（中空記号）またはｐＢＳ（中実記号）を用いて電気穿孔し、フィブロネクチン上で培養し、そのまま、（○／●）、またはＥＭＤ１２１９７４（△／▲）、ＥＭＤ１３５９８１（□／■）ペプチドの存在下において、ＴＮＦ／ＩＦＮγに曝したのＨＵＶＥＣの生存曲線を示す。Ａｋｔｍｐは、ＥＭＤ１２１９７４とＴＮＦ／ＩＦＮγとの組合せ治療によって誘発された細胞死を防止した。
【図７】インテグリン・ライゲーションの減少は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦ細胞傷害を増強させる。ＢＮ−１７５同系軟組織肉腫を保有するＢＮラットを、ＩＬＰ技術によってＥＭＤ１２１９７４（□）、ＴＮＦ（△）、ＥＭＤ１２１９７４／ＴＮＦ（■）を用いて治療した。（○）偽治療のラット。ＩＬＰ後の６日間腫瘍の増殖を測定した。結果は、腫瘍体積の平均±平均値の標準誤差（ｎ＝６）を表す。同系軟組織肉腫ＢＮ−１７５の小さな断片を雄ＭＮラットの右後肢に移植し、直径が１２〜１４ｍｍに達した時に治療を開始した（Ｍａｎｕｓａｍａ他、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、６、１７３〜１７７、１９９９）。大腿動脈および静脈をシラスチック・チューブを用いてカニューレ処置し、圧迫帯を用いて側肢を閉塞させた。３０分間、５ｍｌのＨｅａｍａｃｃｅｌ（登録商標）（２．４ｍｌ／分）を用いて灌流を実施し、薬剤は大量瞬時投与として加えた（ＥＭＤ１２１９７４、５００μｇ、灌流液での最終濃度１７０μＭ；ＴＮＦ、５０μｇ）。灌流液に酸素添加し、肢を暖かいマットレス上で３８〜３９℃に保った。ＥＭＤ１２１９７４を用いて灌流したラットには、ＩＬＰの２時間前および３時間後にペプチドの全身投与も受けさせた（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）。カリパー測定によって腫瘍の直径を２方向で測定し、腫瘍体積（Ｖ）を計算した（Ｖ＝０．４）（Ａ2×Ｂ、式中Ｂはより長い直径、ＡはＢに垂直な直径）。各グループ６匹のラットを治療した。局所的および全身性の副作用を、記載のように評価した（Ｍａｎｕｓａｍａ他、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、６、１７３〜１７７、１９９９）。
【図８】インテグリン・ライゲーションの低下はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、およびＦａｓＬ誘発性細胞傷害を増強させる。ＨＵＶＥＣを終夜、フィブロネクチンでコーティングしたマイクロタイタープレート上で、ＥＭＤ１２１９７４（３００μＭ）、ＴＮＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＦａｓＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＩＧＨＴ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（３３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、または存在させずに、指示どおり培養した。生存度はＭＳＴアッセイによって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
別段に指示しない限り、本発明中で使用される用語および表現は、以下に与える意味および定義を有する。さらに、これらの定義および意味は、本発明、含まれる、好ましい態様をより詳細に説明する。
【００４０】
「生体分子」には、原則として、約３００より大きい分子量を有する、天然または合成された分子が含まれ、好ましくは、ポリ−およびオリゴ糖類、オリゴ−およびポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリ−およびオリゴヌクレオチド、ならびにそれらのグリコシル化された脂質誘導体である。最も典型的には、生体分子には、免疫療法薬剤、上記の全ての抗体またはその断片、あるいは、融合タンパク質を含む、これら抗体または断片の機能的な誘導体断片が含まれる。
【００４１】
「受容体」または「受容体分子」とは、リガンドが結合して、受容体−リガンド複合体を形成する、１つまたは複数のドメインを含んでなる、可溶性または膜結合型／連結型のタンパク質あるいは糖タンパク質である。受容体の作用剤または拮抗剤である可能性のある、リガンドと結合することで、該受容体は、活性化または不活性化され、信号伝達の経路を開始あるいは妨害する可能性がある。
【００４２】
「リガンド」または「受容体リガンド」とは、受容体分子と結合して、受容体−リガンド複合体を形成する、天然または合成の化合物を意味する。リガンドの用語は、作用剤、拮抗剤、ならびに、部分的な作用剤／拮抗剤作用を有する化合物を含む。本発明の具体的な分野によると、この用語には、特に、ＴＮＦ様リガンドが含まれる。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「ＴＮＦα」は、具体的に限定されていなければ、天然および合成の、ペプチド性または非ペプチド性のＴＮＦ突然変異体、変異体またはＴＮＦ様リガンドを含む、全ての種類のＴＮＦ分子ならびにＴＮＦαの生物活性を有する分子を含む。好ましくは、この用語は、天然のペプチド性ＴＮＦαを意味する。
【００４４】
「作用剤」または「受容体作用剤」とは、前記受容体および受容体−作用剤複合体を活性化させることによって、それぞれ、信号伝達の経路ならびにさらなる生体プロセスを開始させる、受容体と結合して、受容体−作用剤複合体を形成する、天然または合成の化合物である。
【００４５】
「拮抗剤」または「受容体拮抗剤」とは、作用剤と反対の生物学的効果を有する天然または合成化合物を意味する。拮抗剤は、受容体と結合して、受容体に対する作用剤と競合することによって、受容体作用剤の作用を妨害する。拮抗剤は、作用剤の作用を妨害するその能力によって、定義される。受容体拮抗剤は、抗体や免疫療法上有効なその断片であってもよい。本発明にかかる、好ましい拮抗剤は、以下に列挙し、論じる。
【００４６】
用語「治療上有効」または「治療有効量」とは、哺乳動物中の疾患または傷害を治療するのに有効な薬物の量をいう。癌の場合、薬物の治療有効量は、癌細胞の数を減らす、腫瘍の大きさを縮小させる、癌細胞の末梢組織への浸潤を阻害する（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させる）、ある程度まで腫瘍増殖を阻害する、および／または癌に付随する１つまたは複数の症状をある程度まで軽減させることができる。この薬物が、存在する癌細胞の増殖を阻止かつ／または死滅させる限り、これは、細胞増殖抑制的および／または細胞傷害性であるあってもよい。癌の療法では、有効性は、例えば、疾病の進行までの時間（ＴＴＰ）の評価、および／または応答速度（ＲＲ）の決定により、測定することができる。
【００４７】
用語「免疫療法上効果的」とは、哺乳動物内で免疫応答を引き起こす生物学的分子をいう。より具体的には、この用語は、抗原を認識して結合することができる分子をいう。通常は、その抗原結合部位（相補性決定領域、ＣＤＲ）を含む抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は、免疫療法上効果的である。
【００４８】
本出願中で使用する用語「プロドラッグ」とは、親薬物に比べて、腫瘍細胞に対する細胞傷害性は低いが、酵素的に活性化されるまたはより活性のある親の形態へと変換され得る、製薬的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を意味する（例えば、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、ページ３７５〜３８２、６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ、１９８６参照）。
【００４９】
「抗血管新生剤」とは、血管の発生を妨害する、またはある程度まで妨げる、天然または合成化合物をいう。抗血管新生分子は、例えば、血管新生増殖因子または増殖因子受容体に結合して、妨害する生物学的分子であってもよい。本明細書中において、好ましい抗血管新生分子は、受容体、好ましくは、インテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体に結合する。本発明によれば、この用語は、前記血管新生剤のプロドラッグも含む。
【００５０】
抗血管新生特性を発揮する、異なる構造および起源を有する多くの分子が存在する。本発明に適した、血管新生阻害または妨害剤の最も適切なクラスは、例えば、以下のものある。
（ｉ）抗有糸分裂剤：フルロウラシル、マイトマイシン−Ｃ、タキソールなど；
（ｉｉ）エストロゲン代謝産物：２−メトキシエストラジオールなど；
（ｉｉｉ）マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤：亜鉛メタロプロテイナーゼ（メタロプロテアーゼ）（例えば、ベチマスタット（ｂｅｔｉｍａｓｔａｔ）、ＢＢ１６、ＴＩＭＰ類、ミノサイクリン、ＧＭ６００１）を阻害するもの、あるいは「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｇｏｌｕｂ、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第８７８ａ巻、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｚｕｃｋｅｒ（編集）、１９９９）に記載のもの；
（ｉｖ）抗血管新生性多機能薬剤および因子：ＩＦＮα（米国特許第４，５３０，９０１号、米国特許第４，５０３，０３５号、米国特許第５，２３１，１７６号）；アンギオスタチンおよびプラスミノーゲン断片（例えば、クリングル１−４、クリングル５、クリングル３（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｍ．Ｓ．他、Ｃｅｌｌ（マサチューセッツ州ケインブリッジ）、７９（２）：３１５〜３２８、１９９４；Ｃａｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２９４６１〜２９４６７、１９９６；Ｃａｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７２：２２９２４〜２２９２８、１９９７）；エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．他、Ｃｅｌｌ、８８（２）、２７７、１９９７および国際公開公報ＷＯ ９７／１５６６６号）；トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１；Ｆｒａｚｉｅｒ、１９９１、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、３（５）：７９２）；血小板因子４（ＰＦ４）など；
（ｖ）プラスミノーゲン活性化剤／ウロキナーゼ阻害剤；
（ｖｉ）ウロキナーゼ受容体拮抗剤；
（ｖｉｉ）ヘパリナーゼ；
（ｖｉｉｉ）フマギリン類似体：ＴＮＰ−４７０など；
（ｉｘ）チロシンキナーゼ阻害剤：ＳＵＩ０１など（上および下に述べるＥｒｂＢ受容体拮抗剤（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２拮抗剤）の多くも、チロシンキナーゼ阻害剤であり、従って、腫瘍増殖の阻害をもたらす抗ＥＧＦ受容体阻害活性と同様に、血管および内皮細胞の発生の阻害をもたらす、抗血管形新生活性をも示す可能性がある）；
（ｘ）スラミンおよびスラミン類似体；
（ｘｉ）血管新生抑制性ステロイド；
（ｘｉｉ）ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ拮抗剤；
（ｘｉｉｉ）ＶＥＧＦ受容体拮抗剤：抗ＶＥＧＦ受容体抗体（ＤＣ−１０１）など；
（ｘｉｖ）ｆｌｋ−１およびｆｌｔ−１拮抗剤；
（ｘｖ）シクロオキシゲナーゼ−ＩＩ阻害剤：ＣＯＸ−ＩＩなど；
（ｘｖｉ）インテグリン拮抗剤およびインテグリン受容体拮抗剤：αｖ拮抗剤およびαｖ受容体拮抗剤、例えば、抗αｖ受容体抗体およびＲＧＤペプチドなど。本発明によれば、インテグリン（受容体）拮抗剤が好ましい。
【００５１】
用語「インテグリン拮抗剤／阻害剤」または「インテグリン受容体拮抗剤／阻害剤」とは、インテグリン受容体を妨害および阻害する、天然または合成分子をいう。ある場合には、この用語には、前記インテグリン受容体のリガンドに対する拮抗剤を含む（例えば、αVβ3に対しては：ビトロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、フォンウィルブランド因子、トロンボスポンジン、ラミニン、αVβ5に対しては：ビトロネクチン、αVβ1に対しては：フィブロネクチンおよびビトロネクチン、αVβ6に対しては：フィブロネクチン）。
【００５２】
本発明によれば、インテグリン受容体に対する拮抗剤が好ましい。インテグリン（受容体）拮抗剤は、天然または合成ペプチド、非ペプチド、ペプチド擬態、免疫グロブリン、抗体やその機能的断片などの、あるいは、免疫複合体（融合タンパク質）であってよい。
【００５３】
本発明の好ましいインテグリン阻害剤は、αVインテグリン（例えば、αVβ3、αVβ5、αVβ6、およびサブクラス）受容体に対するものである。好ましいインテグリン阻害剤は、αV拮抗剤、特に、αVβ3拮抗剤である。本発明にかかるαV拮抗剤は、ＲＧＤペプチド、ペプチド擬態（非ペプチド）拮抗剤、およびαV受容体を阻害する抗体などの、抗インテグリン受容体抗体である。
【００５４】
例示すれは、非免疫性αVβ3拮抗剤は、米国特許第５，７５３，２３０号および米国特許第５，７６６，５９１号の教示に記載されている。好ましい拮抗剤は、直鎖および環状のＲＧＤ含有ペプチドである。環状ペプチドは、一般的に、より安定であり、延長された血清半減期を発揮する。しかし、本発明の最も好ましいインテグリン拮抗剤は、インテグリンαVβ3、αVβ1、αVβ6、αVβ8、αIIbβ3の阻害に効果的である、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（ＥＭＤ１２１９７４、Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ、ドイツ；ヨーロッパ特許第０７７０ ６２２号）である。
【００５５】
αVβ3／αVβ5／αVβ6インテグリン受容体の適切なペプチド型およびペプチド擬態（非ペプチド）拮抗剤は、科学文献ならびに特許文献のいずれかに記載されている。例えば、ＨｏｅｋｓｔｒａおよびＰｏｕｌｔｅｒ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５、１９５；国際公開 ＷＯ ９５／３２７１０号；国際公開 ＷＯ ９５／３７６５５号；国際公開 ＷＯ ９７／０１５４０号；国際公開 ＷＯ ９７／３７６５５号；国際公開 ＷＯ ９７／４５１３７号；国際公開 ＷＯ ９７／４１８４４号；国際公開 ＷＯ ９８／０８８４０号；国際公開 ＷＯ ９８／１８４６０号；国際公開 ＷＯ ９８／１８４６１号；国際公開 ＷＯ ９８／２５８９２号；国際公開 ＷＯ ９８／３１３５９号；国際公開 ＷＯ ９８／３０５４２号；国際公開 ＷＯ ９９／１５５０６号；国際公開 ＷＯ ９９／１５５０７号；国際公開 ＷＯ ９９／３１０６１号；国際公開 ＷＯ ００／０６１６９号パンフレット；ヨーロッパ特許第０８５３ ０８４号；ヨーロッパ特許第０８５４ １４０号；ヨーロッパ特許第０８５４ １４５号；米国特許第５，７８０，４２６号；および米国特許第６，０４８，８６１号を参照する。また、本発明中での使用に適する、ベンズアゼピン、ならびに、関連するベンゾジアゼピンおよびベンゾシクロヘプテンαVβ3インテグリン受容体拮抗剤を開示する特許には、国際公開 ＷＯ ９６／００５７４号、国際公開 ＷＯ ９６／００７３０号、国際公開 ＷＯ ９６／０６０８７号、国際公開 ＷＯ ９６／２６１９０号、国際公開 ＷＯ ９７／２４１１９号、国際公開 ＷＯ ９７／２４１２２号、国際公開 ＷＯ ９７／２４１２４号、国際公開 ＷＯ ９８／１５２７８号、国際公開 ＷＯ ９９／０５１０７号、国際公開 ＷＯ ９９／０６０４９号、国際公開 ＷＯ ９９／１５１７０号、国際公開 ＷＯ ９９／１５１７８号、国際公開 ＷＯ ９７／３４８６５号、国際公開 ＷＯ ９７／０１５４０号、国際公開 ＷＯ ９８／３０５４２号、国際公開 ＷＯ ９９／１１６２６号、および国際公開 ＷＯ ９９／１５５０８号パンフレットが含まれる。主鎖の立体的な環状パッキングを特徴とする他のインテグリン受容体拮抗剤は、国際公開 ＷＯ ９８／０８８４０号；国際公開 ＷＯ ９９／３０７０９号；国際公開 ＷＯ ９９／３０７１３号；国際公開 ＷＯ ９９／３１０９９号；国際公開 ＷＯ ００／０９５０３号パンフレット；米国特許第５，９１９，７９２号；米国特許第５，９２５，６５５号；米国特許第５，９８１，５４６号；および米国特許第６，０１７，９２６号に開示されている。米国特許第６，０４８，８６１号および国際公開 ＷＯ ００／７２８０１号パンフレットには、強力なαVβ3インテグリン受容体拮抗剤である、一連のノナン酸誘導体が開示されている。他の化学的な低分子インテグリン拮抗剤（ほとんどは、ビトロネクチン拮抗剤）は、国際公開 ＷＯ ００／３８６６５号パンフレットに記載されている。他のαVβ3受容体拮抗剤は、血管新生の阻害に効果的であることが示された。例えば、合成受容体拮抗剤、（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［３−（ピリジン−２−イルアミノ）−１−プロピロキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸（ＳＢ−２６５１２３として知られる）は、様々な哺乳動物モデルシステムで試験されてきた（Ｋｅｅｎａｎ他、１９９８、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８（２２）、３１７１；Ｗａｒｄ他、１９９９、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．、２７（１１）、１２３２）。拮抗剤として使用するのに適したインテグリン拮抗剤を同定するためのアッセイは、例えば、Ｓｍｉｔｈ他、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１２２６７、および参照されている特許文献中に記載されている。
【００５６】
抗インテグリン受容体抗体も、よく知られている。適切な抗インテグリン（例えば、αVβ3、αVβ5、αVβ6）モノクローナル抗体は、Ｆ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ）、および遺伝子操作したＦｖや一本鎖抗体などを含む、その抗原結合断片を含むように改変することができる。インテグリン受容体αVβ3に対する、適切な、好んで使用されるモノクローナル抗体の１つは、ＬＭ６０９と同定された（Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９、１１５７；ＡＴＣＣ ＨＢ９５３７）。強力な特異的抗αVβ5抗体、Ｐ１Ｆ６は、やはり本発明によって好ましく、国際公開 ＷＯ ９７／４５４４７号パンフレットに開示されている。さらなる、適切なαVβ6選択的抗体は、ＭＡｂ１４Ｄ９．Ｆ８（国際公開 ＷＯ ９９／３７６８３号、ＤＳＭ ＡＣＣ２３３１、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ドイツ）、ならびにインテグリン受容体のαV鎖に選択的に向けられる、ＭＡｂ１７．Ｅ６（ヨーロッパ特許第０７１９ ８５９、ＤＳＭ ＡＣＣ２１６０、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）である。別の適切な抗インテグリン抗体は、商品化されている、Ｖｉｔｒａｘｉｎ（登録商標）である。
【００５７】
「血管新生増殖因子または増殖因子受容体」とは、その活性化によって血管の増殖および発生を促進する因子または受容体である。通常、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体がこの群に属する。
【００５８】
本明細書中の用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、最も広い意味で使用され、具体的には、完全な抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全型抗体から作製された多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および、所望する生物学的活性を示す限り、抗体断片をもカバーする。この用語は一般的に、２つまたはそれ以上の抗体から構成されるヘテロ抗体や、互いに連結された、異なる結合特異性のその断片を含む。
【００５９】
定常領域のアミノ酸配列に応じて、完全型の抗体は、様々な「抗体（免疫グロブリン）クラス」に帰属させることができる。
【００６０】
完全型の抗体には、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、「サブクラス」（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに区分することができる。抗体の様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれている。本発明にかかる、好ましい主要な抗体クラスは、ＩｇＧ、より詳細には、ＩｇＧ１とＩｇＧ２である。
【００６１】
抗体は、通常、分子量約１５０，０００の糖タンパク質で、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって、重鎖と連結されているが、ジスルフィド連結の数は、様々な免疫グロブリンのイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、一定の間隔を有する鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインがそれに続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖の可変ドメインの間で境界面を形成すると考えられている。任意の脊椎動物由来の抗体の「軽鎖」を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれている２つの明確に異なるタイプの一方に帰属することができる。
【００６２】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種な抗体の集団をいう。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性がある、自然に存在する突然変異を除けば、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に向けられているので、高度に特異的である。
【００６３】
さらに、様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体に汚染されることなく合成することができるという点で有利である。モノクローナル抗体を作製する方法には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５）、ならびに「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（１９８５、Ｂｕｒｄｏｎ他、編集、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム）に記載される、ハイブリドーマ法が含まれ、または周知の組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８、１９９１、およびＭａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８、１〜５９７、１９９１に記載されている手法を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００６４】
用語「キメラ抗体」とは、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種由来の抗体内の、対応する配列に同一または相同的、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属すが、鎖の残りは、別の種由来の抗体内の、対応する配列に同一または相同的、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属している抗体、ならびに、所望する生物学的活性を示す限り、かかる抗体の断片を意味する（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５、１９８４）。
【００６５】
キメラ抗体およびヒト化抗体を作製する方法も、当分野で周知である。例えば、キメラ抗体を作製する方法には、Ｂｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）およびＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（米国特許第４，８１６，３９７号；米国特許第４，８１６，５６７号）による特許に記載されているものを含む。
【００６６】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限含む、非ヒト（例えば、げっ歯類）キメラ抗体の形態である。たいていは、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変性領域（ＣＤＲ）由来の残基を、マウス、ラット、ウサギ、または所望の特異性、親和性、能力を有する、ヒトでない霊長類など非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域（ＣＤＲ）由来の残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。
【００６７】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体内には見つからない残基を含むこともできる。これらの改変は、抗体性能がさらに洗練されるように行う。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変領域の全体を実質的に含み、その内、超可変性のループの全体または実質上全体が非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲの全体または実質上全体がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ヒト化抗体を作製する方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）およびＢｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、米国特許第４，８１６，３９７号）に記載されている。
【００６８】
用語「可変」または「ＦＲ」とは、可変ドメインの特定部分の配列は、抗体間で大幅に異なっており、特定の抗原に対する、特定の抗体夫々の結合および特異性に利用されている事実をいう。
【００６９】
しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン内に均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖ならびに重鎖の可変ドメイン中の双方にある、超可変領域と呼ばれる３つのセグメント内に集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
【００７０】
天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、βシート構造を連結するループを形成する、またはある場合にはβシート構造の一部を形成する、３つの超可変領域によって連結されている、概ねβシート立体配置を採っている、４つのＦＲ（ＦＲ１〜ＦＲ４）を含む。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって、緊密にホールディングされており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセズダ、１９９１）。
【００７１】
定常ドメインは、抗体を抗原に結合するのに直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など様々な効果機能を示す。
【００７２】
本明細書中で使用する場合の用語「超可変領域」または「ＣＤＲ」とは、抗原結合を担っている、抗体中のアミノ酸残基をいう。
【００７３】
超可変領域は一般的に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン内の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、９５〜１０２（Ｈ３））、および／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、９６〜１０１（Ｈ３）、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７、１９８７）を含む。
【００７４】
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基とは、本明細書中で定義した超可変領域残基以外の可変ドメインの残基である。
【００７５】
「抗体断片」は、好ましくは、その抗原結合領域または可変領域を含んでいる、完全型の抗体の一部を含んでなる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、Ｆｃの断片、二重抗体、直鎖抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から作成された多重特異性抗体が含まれる。「完全型」の抗体は、抗原結合可変領域のみならず、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３を含む抗体である。好ましくは、完全型の抗体は１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００７６】
抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部位とＣＬおよびＣＨ１領域とを含む２つの同一の抗原結合断片、ならびに容易に結晶化する能力が命名に反映されている残留「Ｆｃ」断片を含む断片が生成される。
【００７７】
抗体の「Ｆｃ」領域は、原則として、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体主要クラスのヒンジ領域を含む。ヒンジ領域とは、ＣＨ１領域をＣＨ２〜ＣＨ３領域に結合させる約１５アミノ酸残基の群である。
【００７８】
ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と交差結合することができる「Ｆ（ａｂ’）2」断片が得られる。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗原断片である。この領域は、１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインとが、密な非共有結合をしている二量体からなる。それは、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＣＤＲ）が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を定義する、立体配置をとっている。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含んでなる、Ｆｖの半分）は、全結合部位に比べて、低い親和性ではあるものの、抗原を認識して結合する能力を有している。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。「Ｆａｂ’」断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む、いくつかの残基の付加がある点で、Ｆａｂ断片と異なっている。Ｆ（ａｂ’）2抗体は、最初、その間にシステイン・ヒンジを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的カップリング法も知られている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９６；米国特許第４，３４２，５６６号参照）。
【００７９】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨとＶＬのドメインを含んでなり、これらドメインは、単一ポリペプチド鎖として存在している。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、抗原結合に所望される構造をｓｃＦｖが形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖ＦＶ抗体は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、ページ２６９〜３１５、１９９４）、国際公開 ＷＯ ９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、米国特許第５，５８７，４５８号、Ｈｕｓｔｏｎ他（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５、５８７９）またはＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０３８）から知られている。
【００８０】
用語「二重抗体」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片をいい、断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内に、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に結合した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間での対形成には短すぎるリンカーをに使用することによって、このドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対になって、二つの抗原結合部位を形成することを強いられている。二重抗体は、例えば、ヨーロッパ特許第４０４，０９７号、国際公開 ＷＯ ９３／１１１６１号に、より十分的に記載されている。
【００８１】
「二重特異性抗体」とは、２つの異なる特異的抗原結合部位を有する単一の２価の抗体（または免疫療法上効果的なその断片）である。例えば、第１抗原結合部位は、血管新生受容体（例えば、インテグリンやＶＥＧＦ受容体）に向けられるが、第２抗原結合部位は、ＥｒｂＢ受容体（例えば、ＥＧＦＲやＨＥＲ２）に向けられる。
【００８２】
二重特異性抗体は、全て、それ自体は既知である、化学的技術（例えば、Ｋｒａｎｚ他、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ／Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、５８０７参照）、「ポリドーマ」技術（米国特許第４，４７４，８９３号参照）、または組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。さらなる方法は、国際公開 ＷＯ ９１／００３６０号、国際公開 ＷＯ ９２／０５７９３号、および国際公開 ＷＯ ９６／０４３０５号に記載されている。二重特異性抗体はまた、一本鎖抗体から調製することもできる（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５、５８７９；ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０３８）。単一ポリペプチド鎖として生成された抗体可変領域の類似体もある。二重特異性結合剤を形成するためには、一本鎖抗体を、当分野で既知の化学的方法または遺伝工学方法によって、共にカップリングさせる。ロイシン・ジッパー配列を使用することによって、本発明にかかる、二重特異性抗体を作製することも可能である。利用される配列は、転写因子ＦｏｓおよびＪｕｎのロイシン・ジッパー領域に由来する（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ他、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１７５９；総説には、ＭａｎｉａｔｉｓおよびＡｂｅｌ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、２４参照）。ロイシン・ジッパーは、ロイシンが７残基毎に起こる、約２０〜２４残基長の特異的なアミノ酸配列である。このようなジッパー配列では、二量体形成のためにロイシン残基が疎水性側に並んで両親媒性のαへリックスを形成する。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質のロイシン・ジッパーに対応するペプチドは、優先的にヘテロ二量体を形成する（Ｏ’Ｓｈｅａ他、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５、６４６）。ジッパーを含む二重特異性抗体およびそれらを作製する方法も、国際公開 ＷＯ ９２／１０２０９号および国際公開 ＷＯ ９３／１１１６２号に開示されている。本発明にかかる、二重特異性抗体は、単一の特異性を有する抗体に関しては、上に記載したＶＥＧＦ受容体およびαＶβ３受容体に対する抗体にすることができる。
【００８３】
用語「免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、免疫的な効果を示さない分子に対して、共有結合によって融合された、それぞれ、抗体または免疫グロブリン、あるいは免疫学的に効果的なその断片をいう。好ましくは、この融合パートナーは、グリコシル化されていてもよい、ペプチドまたはタンパク質である。前記非抗体分子は、抗体の定常重鎖のＣ末端、あるいは可変軽鎖および／または重鎖のＮ末端に連結することができる。融合パートナーは、一般的に、３〜１５個のアミノ酸残基を含有するペプチドである、リンカー分子を介して、連結することができる。本発明にかかる、免疫複合体は、好ましくは、血管新生受容体、好ましくは、インテグリンまたはＶＥＧＦ受容体に対する、免疫グロブリンまたは免疫療法上効果的なその断片と、ＴＮＦαとからなる融合タンパク質、あるいは、前記免疫グロブリンのＣ末端、好ましくはそのＦｃ部分にそのＮ末端が連結されている、ＴＮＦαおよびＩＦＮγまたは別の適切なサイトカインとから実質的になる融合タンパク質を包含している。
【００８４】
用語「融合タンパク質」とは、異なる特異性を有する１つまたは複数の免疫療法的な効果を有さない（非抗体の）タンパク質またはペプチドからなり、場合によっては、リンカー分子によって融合されている、天然または合成分子をいう。本発明にかかる融合タンパク質は、例えば、ＴＮＦαおよび／またはＩＦＮγに融合されたシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）からなる分子でもよい。
【００８５】
「ヘテロ抗体」とは、それぞれが異なる結合特異性を有する、互いに連結されている、２つまたはそれ以上の抗体または抗原結合性抗体断片である。ヘテロ抗体は、２つまたはそれ以上の抗体または抗体断片を互いに結合させることによって調製することができる。好ましいヘテロ抗体は、交差結合されたＦａｂ／Ｆａｂ’断片を含んでなる。様々なカップリングまたは交差結合剤を使用して、抗体複数を結合させることができる。一例は、タンパク質Ａ、カルボイイミド（ｃａｒｂｏｉｉｍｉｄｅ）、Ｎ−コハク酸イミジル−Ｓ−アセチル−チオ酢酸（ＳＡＴＡ）、Ｎ−コハク酸イミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ他、１９８４、Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．、１６０、１６８６；Ｌｉｕ他、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、８６４８参照）である。その他の手法には、Ｐａｕｌｕｓ、Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．、第７８号、１１８、１９８５；Ｂｒｅｎｎａｎ他、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０ｍ：８１、またはＧｌｅｎｎｉｅ他、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９、２３６７に記載されているものが含まれる。別の方法では、３つのＦａｂ’断片をカップリングするために、ｏ−フェニレンジマレイン酸イミド（ｏＰＤＭ）を利用する（国際公開 ＷＯ ９１／０３４９３号）。本発明に関係して、多重特異性抗体もまた適切であり、国際公開 ＷＯ ９４／１３８０４号および国際公開 ＷＯ ９８／５０４３１号の教示に従って調製することができる。
【００８６】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（Ｆｃ領域の天然配列または変異Ｆｃ領域のアミノ酸配列）に由来する生物学的な活性をいう。抗体のエフェクター機能の例には、相補性依存的細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方制御（例えば、Ｂ細胞受容体）などが含まれる。
【００８７】
用語「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ）が、標的細胞上に結合された抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解を引き起こす、細胞に媒介された反応をいう。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞である、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、先行技術（米国特許第５，５００，３６２号、米国特許第５，８２１，３３７号）に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。
【００８８】
「ヒト・エフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発現する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を遂行する。ＡＤＣＣを媒介する、ヒト白血球の例には、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれる。
【００８９】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合する（γ受容体）ものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これら受容体の対立変異体ならびに選択的スプライシングされた形態も含まれる。ＦｃＲは、例えば、ＲａｖａｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、９：４５７〜９２、１９９１に、その総説が記載されている。
【００９０】
用語「サイトカイン」とは、細胞間媒体として別の細胞に作用する、一細胞集団から放出されたタンパク質の総称的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンなど成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン：濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）など糖タンパク質ホルモン；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦβなど神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦαやＴＧＦβなどトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；ＩＮＦα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなどインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦなどコロニー刺激因子；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などインターロイキン；およびＴＮＦαやＴＮＦβが含まれる。本発明にかかる、好ましいサイトカインは、インターフェロンおよびＴＮＦαである。
【００９１】
本明細書中で使用する用語「細胞傷害剤」とは、細胞の機能を阻害または抑制し、かつ／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、動物起源の酵素的に活性のある毒素など毒素、あるいは。その断片を含めるつもりである。この用語は、サイトカイン・ファミリーの成員、好ましくはＩＦＮγを含むことができる。
【００９２】
用語「化学療法剤」または「抗異常増殖剤」には、抗異常増殖性作用を及ぼす、すなわち、生物学的応答の改変など機構を介した間接的にではなく、例えば、細胞増殖抑制または細胞傷害効果によって、腫瘍細胞に直接的に、異常増殖細胞の発生、成熟、拡散を阻止する化学薬剤が含まれる。本発明にかかる、適当な化学療法剤は、好ましくは、天然または合成化学化合物であるが、タンパク質、ポリペプチドなどの生物学的分子も、明示的に排除されていない。ＴＮＦαと上に列挙した抗血管新生剤、場合によっては、ＥＧＦ受容体拮抗剤など他の薬剤をも一緒に用いる組合せ治療による、腫瘍／異常増殖の治療のための本発明に含めることができる、市販、臨床評価および前臨床開発段階の、入手可能な、多数の抗異常増殖剤が存在する。化学療法剤は、場合によっては、上述する薬物の組合せと一緒に投与することができることは、指摘すべき点である。
【００９３】
化学療法剤または薬剤の例には、アルキル化剤、例えば、窒素マスタード、エチレンイミン化合物、アルキルスルホン酸、およびニトロソ尿素、シスプラチン、ダカルバジンなどのアルキル化作用を有する他の化合物；抗代謝剤、例えば、葉酸、プリンまたはピリミジン拮抗剤；有糸分裂阻害剤、例えば、ビンカ・アルカロイドおよびポドフィロトキシンの誘導体；細胞傷害抗生物質およびカンプトセチン誘導体が含まれる。好ましい化学療法剤または化学療法には、ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ（ｅｔｈｙｏｌ）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（窒素マスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルヌシチン（ｃａｒｒｎｕｓｔｉｎｅ）（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシン・リポ（ｄｏｘｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｚａｒ）、ダウノルビシン、ダウノルビシン・リポ（ｄａｕｎｏｘｏｍｅ）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトセシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトセシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ、ペントスタチン、ピポブロマン、ピリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ならびに、それらの組合せが含まれる。
【００９４】
本発明にかかる、最も好ましい化学療法剤は、シスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（タキソール）およびブレオマイシンである。
【００９５】
用語「癌」および「腫瘍」とは、典型的には、制御されない細胞増殖によって特徴づけられる、哺乳類の生理学的状態のことを意味し、または述べる。乳房、心臓、肺、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頚部、および肝臓の腫瘍などの、腫瘍は、本発明にかかる医薬組成物によって、治療することができる。より具体的には、腫瘍は、腺腫、血管肉腫、星状細胞腫、上皮癌腫、胚細胞腫、グリア芽細胞腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫および奇形腫からなる群から選択される。
【００９６】
詳細には、腫瘍は、末端黒子型黒色腫、光線性角化症、腺癌腫、腺様嚢胞癌腫、脂肪腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌腫、星錠腫瘍、バルトリン腺癌腫、基底細胞癌腫、気管支腺癌腫、毛細血管、癌様体、癌腫、癌肉腫、海綿状、胆管癌腫、軟骨芽肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌腫、明細胞癌腫、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質部肉腫、子宮内膜様卵巣癌腫、脳質上皮、類上皮細胞、ユーイング肉腫、繊維性層状（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ）、巣状結節性過形成、ガストリン産生腫瘍、生殖細胞腫瘍、グリア細胞腫、グルカゴン産生腫瘍、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝細胞癌腫、膵島細胞腺腫、上皮内異常増殖、上皮間扁平細胞異常増殖、浸潤性扁平細胞癌腫、大細胞癌腫、平滑筋肉腫、悪性黒色黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、中皮、転移性癌腫、粘膜表皮性癌腫、神経細胞腫、神経上皮腺癌腫結節性癌腫、燕麦細胞癌腫、オリゴデンドログリア、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、乳頭漿液腺癌腫、松果体細胞、下垂体腫瘍、プラズマ細胞腫、偽肉腫、肺性細胞腫、腎細胞癌腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液癌腫、小細胞癌腫、軟組織癌腫、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌腫、中皮下、表在性拡大型癌腫、未分化癌腫、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌腫、ビポーマ、高分化癌腫、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【００９７】
「ＥｒｂＢ受容体」とは、ＥｒｂＢ受容体ファミリーに属す受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４受容体および将来同定されるであろう、該ファミリーの他のメンバーを含む。ＥｒｂＢ受容体は一般的に、ＥｒｂＢリガンドと結合し得る細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；リン酸化され得るいくつかのチロシン残基を有するカルボキシ末端のシグナル伝達ドメインを含む。ＥｒｂＢ受容体は「天然配列」のＥｒｂＢ受容体またはその「アミノ酸配列変異体」であってよい。好ましくは、ＥｒｂＢ受容体は、天然配列のヒト・ＥｒｂＢ受容体である。ＥｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子をいう。最も好ましいのは、ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ１）である。表現「ＥｒｂＢ１」と「ＨＥＲ１」は、本明細書中で互換的に使用されており、ヒトＨＥＲ１タンパク質を指す。表現「ＥｒｂＢ２」と「ＨＥＲ２」は、本明細書中で互換的に使用されており、ヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。本発明によれば、ＥｒｂＢ１受容体（ＥＧＦＲ）が好ましい。
【００９８】
「ＥｒｂＢリガンド」とは、ＥｒｂＢ受容体に結合し、かつ／または活性化させるポリペプチドである。ＥＧＦＲと結合するＥｒｂＢリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、エピレギュリンが含まれる。
【００９９】
用語「ＥｒｂＢ受容体拮抗剤／阻害剤」とは、ＥｒｂＢ受容体に結合して、妨害または阻害する、天然または合成分子をいう。従って、受容体を妨害することによって、拮抗剤は、ＥｒｂＢリガンド（作用剤）の結合、および作用剤／リガンド受容体複合体の活性化を防止する。ＥｒｂＢ拮抗剤は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）またはＨＥＲ２に特異的できる。本発明の好ましい拮抗剤は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１）に特異的である。このＥｒｂＢ受容体は、抗体または免疫療法上効果的なその断片、あるいはペプチド、ポリペプチドタンパク質など非免疫性生物学的分子であってもよい。化学的分子も含まれるが、抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＨＥＲ２抗体が、本発明にかかる、好ましい拮抗剤である。
【０１００】
本発明の好ましい抗体は、抗Ｈｅｒ１および抗Ｈｅｒ２抗体、より好ましくは、抗Ｈｅｒ１抗体である。好ましい抗Ｈｅｒ１抗体は、ＭＡｂ４２５、好ましくは、ヒト化ＭＡｂ４２５（ｈＭＡｂ４２５、米国特許第５，５５８，８６４号；ヨーロッパ特許第０５３１ ４７２号）、およびキメラＭＡｂ２２５（ｃＭＡｂ２２５、米国特許第４，９４３，５３３号およびヨーロッパ特許第０３５９ ２８２号）である。最も好ましいのは、単一薬物治療においても、抑制された有害ならびに副作用とともに、高い効果を示した、モノクローナル抗体ｈ４２５である。最も好ましい抗ＨＥＲ２抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅにより商品化されている、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）である。
【０１０１】
本発明にかかる、有効なＥＧＦ受容体拮抗剤は、天然または合成の化学化合物であってもよい。この種の好ましい分子の一例には、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩が含まれる。
【０１０２】
ＨＥＲ２受容体拮抗剤の例は、スチリル置換の複素芳香族化合物（米国特許第 ５，６５６，６５５号）；ビス単環式および／または二環式アリール−ヘテロアリール、炭素環、およびヘテロ炭素環化合物（米国特許第５，６４６，１５３号）；三環式ピリミジン化合物（米国特許第５，６７９，６８３号）；受容体型チロシンキナーゼ阻害活性を有するキナゾリン誘導体（米国特許第５，６１６，５８２号）；ヘテロアリールエテネジイルまたはヘテロアリールエテネジイル アリール化合物（米国特許第５，１９６，４４６号）；受容体のＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲファミリーを阻害する、６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−ジエチル−アミノエトキシ）フェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド（２，３）−５−ピリミジン−７−オン（Ｐａｎｅｋ他、１９９７、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．、２８３、１４３３）と命名された化合物である。
【０１０３】
「放射線療法」：本発明にかかる医薬組成物を用いて治療することができる腫瘍は、さらに、放射線または放射性薬剤により処置することができる。放射線源は、治療される患者の外部または内部のどちらでもよい。放射線源が患者の外部の場合、この療法は外部照射放射線療法（ＥＢＲＴ）として知られている。放射線源が患者の内部の場合、この療法は近接照射療法（ＢＴ）と呼ばれている。利用されてきた典型的な放射性原子には、ラジウム、セシウム−１３７、およびイリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、および金−１９８、コバルト−５７；銅−６７；テクネチウム−９９；ヨウ素−１２３；ヨウ素−１３１；およびインジウム−１１１が含まれる。本発明にかかる薬剤を、放射性同位元素を用いて標識することも可能である。
【０１０４】
今日では、放射線療法は、切除不能や手術不能な腫瘍および／または腫瘍転移を抑制するための、標準的な治療法である。放射線治療を、化学療法と組み合わせると、改善された結果が見られる。放射線療法は、標的区域に照射された高線量の放射線が、腫瘍組織と正常組織のどちらもの再生細胞の死滅をもたらすという原理に基づいている。
【０１０５】
放射線線量処方は、一般的に、放射線吸収線量（ｒａｄ）、時間、および画分の点から決定され、癌専門医によって注意深く決定されなければならない。患者が受ける放射線の量は、様々な考慮事項に依存するが、最も重要な２つの考慮事項は、身体の他の重要な構造または組織に対する、腫瘍の位置、ならびに、腫瘍が拡散している範囲である。放射線療法を受ける患者に対する、好ましい治療過程は、５〜６週間の期間にわたり、総線量５０〜６０Ｇｙを、１．８〜２．０Ｇｙの単一の一日画分を、週に５日、患者に施す治療スケジュールである。Ｇｙは、グレイの略記であり、１００ｒａｄの照射量をいう。好ましい実施態様では、ヒト患者の腫瘍を、血管新生拮抗剤とＴＮＦα／ＩＦＮγならびに放射線で治療した際には、相乗効果がある。言い換えれば、前記化合物による腫瘍増殖の阻害は、放射線および／または化学療法剤と組み合わせた場合に増強される。本発明に従って、場合によっては、放射線療法を使用することができる。それは、本発明かかる薬剤を、十分な量患者に投与することができない場合に、推奨され、また、好ましい。
【０１０６】
「薬剤治療」：本発明の方法は、本発明を実施するためのステップとして、様々な形式を含む。例えば、本発明にかかる薬剤は、同時に、順序に従って、あるいは、個別に、投与することができる。さらに、該薬剤は、投与間に、約３週間までの時間間隔内で、すなわち、実質的に、第１活性薬剤を投与した直後から、第１薬剤を投与した後、約３週間までに、個別に投与することもできる。この方法は、外科的処置に引き続いて、実施することができる。あるいは、第１活性薬剤と第２活性薬剤の投与の間に、外科的処置を実施することができる。この方法の典型は、本発明の方法と、外科的な腫瘍除去との組合せである。この方法による治療は、一般的に、１つまたは複数の投与サイクルにおける、治療組成物の投与を含む。例えば、同時投与を実施した場合、両方の薬剤を含む治療組成物を、約２日〜約３週間の期間を、一サイクルとして、投与する。
【０１０７】
その後は、該治療サイクルを、担当する医者の判断に従って、必要に応じて、繰り返すことができる。同様に、順序に従った施用を計画する場合、それぞれの個々の療法剤の投与時間が、一般的に同じ期間に及ぶように調整する。サイクル間の間隔は、約０から２カ月まで変えることができる。
【０１０８】
本発明の薬剤を、非経口的に注入、または時間をかけたゆっくりしたインフージョンによって投与することができる。一般的に、治療すべき組織には、通常全身投与によって、身体内から接近することができ、従って、最も頻繁には、治療組成物の静脈内投与によって治療されるが、標的組織のみが標的分子を含むような、他の組織的な送達手段も予期される。従って、本発明の薬剤は、眼内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、または正所位注入およびインフージョンによって投与することができ、または蠕動手段によって送達することもできる。例えば、本発明のインテグリン拮抗剤を含む治療的組成物は、従来、例えば、単位用量の注入として静脈内に投与されてきた。
【０１０９】
本発明の治療組成物は、生理的に許容される担体を、有効成分として、本明細書中に記載されている好適な薬剤を、それの中に溶解または分散させ、共に含んでいる。本明細書中で使用する用語「製薬的に許容される」とは、嘔気、眩暈、胃のむかつきなども望ましくない生理効果を生じることなしに、哺乳動物内またはその表面に投与することが可能な物質を表している、組成物、担体、希釈剤、および試薬をいう。その中に有効成分を溶解または分散させた薬理組成物の調製は、当分野でよく理解されており、処方に基づいたものに限定する必要はない。通常、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかのような、注射可能なものに調製されるが、使用に先立ち、液体中に加えて、溶液または懸濁液とするのに適した固体形状に調製することもできる。この調製物は、エマルジョン状とすることもできる。有効成分を、製薬的に許容され、有効成分に適合する賦形剤と共に、本明細書中に記載する治療方法での使用に適した量で、混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらを組み合わせたものである。加えて、必要に応じて、組成物は、有効成分の有効性を増強させる、浸潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の補助的な物質を少量含有することができる。本発明の治療組成物は、それに含まれる成分の製薬的に許容される塩を含むこともできる。製薬的に許容される塩には、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸を用いて形成される、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、二価の鉄の水酸化物などの、無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。特に好ましいのは、環状ポリペプチドαｖ拮抗剤の調製に使用する場合には、ＨＣｌ塩である。生理的に許容される担体は、当分野で周知である。液体担体の例は、有効成分と水以外の追加の物質を含まない、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝成分、生理的食塩、あるいは、リン酸緩衝生理食塩水などの双方を含む、無菌水性溶液である。さらに、水性担体は、１つ以上の緩衝塩だけでなく、塩化ナトリウムや塩化カリウムなど塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含むこともできる。液体組成物はまた、水に加えて、また、水を含まない液相を含むこともできる。このような追加の液相の典型は、グリセリン、綿実油など植物油、水−油エマルジョンである。
【０１１０】
通常、例えば、インテグリン受容体阻害抗体、抗体断片または抗体複合体、あるいは抗ＶＥＧＦ受容体阻害抗体、断片または複合体の形態の、免疫療法剤の治療有効量は、生理的に許容される組成物として投与した際、血漿濃度を、１ミリリットル（ｍｌ）あたり約０．０１マイクログラム（μｇ）〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、通常は、約５μｇ／ｍｌとするために、十分な量である。
【０１１１】
言い換えれば、一日または複数日、一日当たり、１つまたは複数回の用量投与においては、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲で変動させることができる。免疫療法剤が、モノクローナル抗体の断片または複合体である場合、この量は、完全な抗体の質量に対する、断片／複合体の質量の比に基づいて、容易に調節することができる。好ましい血漿中のモル濃度は、約２マイクロモーラー（μＭ）〜約５ミリモーラー（ｍＭ）であり、好ましくは、約１００μＭ〜１ｍＭの抗体型拮抗剤である。
【０１１２】
非免疫療法性ペプチドまたはタンパク質ペプチド（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）、あるいは類似した大きさの他の生物学的分子である、本発明にかかる薬剤の療法的に有効な量は、通常、生理的に許容される組成物として投与した際に、血漿濃度を、１ミリリットル（ｍｌ）あたり約０．１マイクログラム（μｇ）〜約２００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌとするために、十分なポリペプチド量である。１モルあたり約５００グラムの質量を有するポリペプチドに基づくと、好ましい血漿中モル濃度は、約２マイクロモーラー（μＭ）〜約５ミリモーラー（ｍＭ）、好ましくは約１００μＭ〜１ｍＭのポリペプチド拮抗剤である。
【０１１３】
好ましくは、本発明にかかる、化学的拮抗剤または（化学的）化学療法剤（免疫療法剤でも非免疫療法性ペプチド／タンパク質でもない）である、活性薬剤の通常用量は、１日あたり、体重１キログラムあたり１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約２０〜２００ｍｇ、より好ましくは５０〜１００ｍｇである。
【０１１４】
本発明の医薬組成物には、それに限定はされないが、例えば、骨吸収阻害剤、心保護剤など、抗癌剤の毒性を軽減させる薬剤を含む、本発明の組合せ療法に付随する副作用を軽減または回避する薬剤（「アジュバント療法」）を用いる、患者の包括的な治療を含むことができる。前記アジュバント剤は、化学療法、放射線療法、手術に付随する嘔気や嘔吐の頻度を阻止または軽減する、あるいは骨髄抑制性抗癌剤の投与に付随する感染症の発生率を軽減させる。アジュバント剤は当分野で周知である。
【０１１５】
本発明による免疫療法剤はさらに、ＢＣＧや免疫系刺激剤などのアジュバントと一緒に投与することができる。
【０１１６】
さらに、この組成物は、細胞傷害効果の放射標識同位元素を含有する免疫療法剤または化学療法剤、あるいは、細胞傷害性ペプチド（例えば、サイトカイン）、細胞傷害性薬剤などの、他の細胞傷害性剤を含んでいてもよい。
【０１１７】
腫瘍または腫瘍転移を治療するための「製薬キット」という用語は、腫瘍および腫瘍転移を治療する方法において、該試薬を使用するための、パッケージ、および、原則として、指示書をいう。本発明のキット内の試薬は通常、本明細書中に記載の治療組成物として、処方されており、従って、キットにおいて、配布に適した様々な形態のいずれであってもよい。このような形態には、本発明の拮抗剤および／または融合タンパク質を提供するためには、液体、粉末、錠剤、懸濁液などの剤形が含まれる。試薬は、本発明の方法に従って、個別の投与に適した個別の容器として提供することができ、あるいは、パッケージ中において、単一の容器内の組成物として、組み合わせて提供することもできる。このパッケージは、本明細書中に記載の治療方法に従って、１つまたは複数回の用量に十分な量の試薬を含むことができる。本発明のキットはまた、パッケージに含まれる物質の「使用説明書」も含む。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例によって、本発明をより詳細に説明する。
【０１１９】
実施例１：
ＴＮＦα誘発性アポトーシスに対する内皮細胞のインテグリン依存性接着
ＨＵＶＥＣ球状体の形成および生存にはインテグリンは必要ない
ＴＮＦ誘発性アポトーシスに対するインテグリン・ライゲーションの効果を試験するために、本発明者らは、インテグリン依存性の接着なしに内皮細胞を培養できる条件を同定した。内皮細胞の単一細胞懸濁液は、アノイキスによって急速に死滅し（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．、４、９５３〜９６１、１９９３）、従ってさらなる分析が妨げられた。しかし、ＢＳＡでコーティングしたウェルにヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を高密度（１．０×１０６個の細胞／ｍｌ）で播種することにより、２〜４時間以内に多細胞性球状体が形成され、インテグリンからの検出可能な寄与なしに、２４時間以上、ＶＥ−カドヘリンに依存して維持することができた。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を妨害すること、またはＥＤＴＡを用いたＣａ2+−Ｍｇ2+の欠乏によるＶＥ−カドヘリン活性の阻害は球状体の形成を妨害したが、α２、α３、α５、α６、β１、αＶβ３、αＶβ５インテグリンに対する阻害性ｍＡｂ、ＲＧＤに基づいた妨害ペプチド、および妨害性抗ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂの単体または組合せは、ＨＵＶＥＣ球状体に影響を与えなかった（図１ａ、データは示さず）。
【０１２０】
細胞生存度に対する球状体培養物の影響を決定するために、球状体およびフィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣをプレートした６〜７２時間後に回収し、連続的に希釈し、相対細胞数を決定する前に追加の４８時間さらに培養した。左寄りの曲線、すなわち希釈曲線の平坦化は、生存度の低下を示す。プレートした６、１２、１６、２４時間後に球状体培養物から回収したＨＵＶＥＣの生存度はフィブロネクチン接着性培養物と比較可能であったが、３６時間以降では、徐々に低下した（図１ｂは１６時間、データは示さず）。
【０１２１】
総合すると、これらの結果は、ＨＵＶＥＣは球状体を形成することができ、インテグリン依存性の接着なしに２４時間以上生存可能であることを実証している。
【０１２２】
実施例２：
フィブロネクチンへの接着はＨＵＶＥＣをＴＮＦ誘発性アポトーシスから保護する
インテグリンがＴＮＦ誘発性アポトーシスを変調させるかどうかを試験するために、本発明者らはＨＵＶＥＣをフィブロネクチン上で（インテグリン依存性接着）、または球状体として（インテグリン非依存性接着）、ＴＮＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ細胞傷害の増強剤であるＩＦＮγ（３３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｄｅａｌｔｒｙ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７、６８９〜６９３、１９８７）を存在させてまたは存在させずに培養した。フィブロネクチン上のＨＵＶＥＣの単層（「フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣ」）をＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露させることによっては、ＹｏＰｒｏ−１が取り込まれていないことにより実証されたアポトーシス（Ｉｄｚｉｏｒｅｋ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８５、２４９〜２５８、１９９５）、アネキシンＶの細胞表面結合、カスパーゼ−３の活性化およびその基質ＰＡＲＰの切断は、増大されなかった（図２ａ、２ｂ、データは示さず）。
【０１２３】
それとは反対に、ＴＮＦ±ＩＦＮγを用いて処置した球状体は、ＹｏＰｒｏ−１の取り込みが増加し（ＢＯＣ、Ｚ−ＶＡＤ、ＩＥＴＤ、ＤＶＥＤのカスパーゼ阻害剤によって抑制された増加）、ＤＮＡの断片化、カスパーゼ−３活性化およびＰＡＲＰの切断が増大した（図２ａ、２ｂ、データは示さず）。細胞生存度に対するＴＮＦ±ＩＦＮγの効果を検査するために、本発明者らは非処理および処理した培養物の生存度を決定した。フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣをＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露しても、細胞生存度に影響は与えられなかった（図２ｃ）。ＴＮＦを用いた球状体の処置は８０％を超える細胞の死滅をもたらし、組み合わせたＴＮＦ／ＩＦＮγの処置は完全な細胞死滅を引き起こした（図２ｄ）。ＩＦＮγのみを用いた処置は細胞傷害性ではなかった（データ示さず）。ＨＵＶＥＣは、αＶβ３およびα５β１インテグリンを介して、固定したフィブロネクチンに接着する（Ｒｕｅｇｇ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、４、４０８〜４１４、１９９８）。フィブロネクチン上の細胞生存度に対するこれらインテグリンの個々の寄与を試験するために、本発明者らは、プラスチックに固定した、αＶβ３、α１、α５、α４インテグリンに対するｍＡｂｓ（ｉｍＡｂｓ）上でＨＵＶＥＣを培養した。固定化抗αＶβ３、抗α５、抗α１ ｍＡｂｓはＨＵＶＥＣをＴＮＦ誘発性細胞死から保護したが、抗α４ ｍＡｂｓは保護しなかった（図２ｅ、データ示さず）。
【０１２４】
これらの結果から、本発明者らは、αＶβ３およびαＶβ１インテグリンに媒介される接着がＴＮＦ誘発性アポトーシスを抑制し、それが欠乏するとＨＵＶＥＣがＴＮＦおよびカスパーゼ媒介アポトーシスに対して感作されることを結論づけた。
【０１２５】
実施例２：
インテグリン依存性シグナリングは内皮細胞をＴＮＦα誘発性アポトーシスから保護する
ＴＮＦ誘発性のＮＦ−κＢ活性化はインテグリン・ライゲーションを必要としない
核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）は、ＴＮＦに暴露させた細胞の生存を促進する（ＢｅｇおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７８２〜７８４；Ｖａｎ Ａｎｔｗｅｒｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７８７〜７８９、１９９６）。インテグリンを介した細胞接着がＮＦ−κＢを活性化させるので（Ｓｃａｔｅｎａ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４１、１０８３〜１０９３、１９９８）、本発明者らは、ＴＮＦ誘発性アポトーシスに対する球状体の感受性がＮＦ−κＢ活性化の不足によるものかどうかを調査した。ＮＦ−κＢ活性化は、Ｉ−κＢのリン酸化および解離、ＮＦ−κＢ核転移、ならびにＮＦ−κＢ誘発性遺伝子であるＩＣＡＭ−１の細胞表面での発現（Ｃｏｌｌｉｎｓ他、Ｆａｓｅｂ Ｊ．、９、８９９〜９０９、１９９５）を、ＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露させた球状体およびフィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣ培養物で測定することで評価した。Ｉ−κＢのリン酸化および解離、ＮＦ−κＢの核転移またはＩＣＡＭ−１の発現で有意な差は観察されず（図３ａ〜ｃ）、これは、球状体中で培養したＨＵＶＥＣのＴＮＦ誘発性アポトーシスは、損なわれたＮＦ−κＢ活性化によるものではないことを示す。
【０１２６】
実施例３：
活性化はインテグリン・ライゲーションに依存し、細胞の生存に重要である
次に、内皮細胞の生存を促進する、ＴＮＦによって活性化されるタンパク質キナーゼであるＡｋｔ／ＰＫＢの活性化を分析した（ＭａｄｇｅおよびＰｏｂｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、１５４５８〜１５４６５、２０００）。フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣのＡｋｔの基礎的リン酸化は、ＴＮＦ／ＩＦＮγへの暴露によって増加し、これは構成的なＡｋｔの活性化およびＴＮＦ誘発性のＡｋｔ活性化に矛盾しない。反対に、非処理の球状体ではＡｋｔのリン酸化は観察されず、ＴＮＦ／ＩＦＮ□への暴露は弱いリン酸化のみを誘発した（図４ａ）。ＨＵＶＥＣの生存に対するＡｋｔ活性化の関連性を評価するために、本発明者らは、ホスホイノシチド−３（ＰＩ−３）キナーゼであり、Ａｋｔの上流活性化因子である２つの薬理的阻害剤、ワートマニンおよびＬＹ２９４００２を用いてフィブロネクチン接着性細胞を処置した（ＫａｎｄｅｌおよびＨａｙ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２５３、２１０〜２２９、１９９９）。
【０１２７】
本発明者らはまた、球状体中で、構成的に活性のある形のＡｋｔ（Ａｋｔｍｐ）およびＰＩ−３キナーゼ触媒サブユニット（ｐ１１０*）を発現させた。ワートマニンおよびＬＹ２９４００２の治療はアポトーシスを引き起こし、ＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露させたフィブロネクチン接着性細胞の生存度を低下させたが（図４ｂ）、野生型Ａｋｔ（Ａｋｔｗｔ）や対照プラスミド（ｐＢＳ）はそうではないが、Ａｋｔｍｐおよびｐ１１０*は球状体をＴＮＦ±ＩＦＮγ誘発性アポトーシスから保護した（図４ｃ）。
【０１２８】
これらの結果から、本発明者らは、Ａｋｔの活性化がＴＮＦ＋ＩＦＮγに暴露されたＨＵＶＥＣの生存に重要であり、基礎的Ａｋｔ活性化およびＴＮＦ誘発性のＡｋｔ活性化のどちらもがインテグリン・ライゲーションに依存していたことを結論づけた。
【０１２９】
実施例４：
ＴＮＦで処置したＨＵＶＥＣの生存にはＡｋｔおよびＮＦ−κＢの活性化が必要
Ａｋｔｍｐは、活性ＮＦ−κＢの存在下で球状体のＴＮＦ誘導アポトーシスを抑制する。本発明者らはまた、ＮＦ−κＢ活性化および活性Ａｋｔシグナリングのどちらもが生存に必要かどうか、または活性Ａｋｔのみで十分かどうかを試験した。本発明者らは、非分解性Ｉ−κＢを発現しているアデノウイルスでＨＵＶＥＣを感染させることによって（ＩｋＢ−ＮＦκＢの解離を防止するＡｄΔＮＩ−κＢ（Ｂｒｏｗｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７、１４８５〜１４８８、１９９５）、構成的に活性のあるＡｋｔ（Ａｋｔｍｐ）を発現している細胞のＮＦ−κＢ活性化を妨害した。ＡｄΔＮＩ−κＢは、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣをＴＮＦ±ＩＦＮγ誘発性アポトーシスに感作させ、これはＡｋｔｍｐに影響を受けなかった。対照の電気穿孔（ｐＢＳ）またはアデノウイルス感染（ＡｄＬａｃＺ）は効果がなかった。ＡｄΔＮＩ−κＢはまた、Ａｋｔｍｐを過発現している球状体をＴＮＦ＋ＩＦＮγ誘発性アポトーシスに感作させた（図４ｄ）。ＮＦ−κＢの活性化を欠いているＨＵＶＥＣ中でＡｋｔが低用量のＴＮＦに対して保護できるかどうかを試験するために、ｗｔおよびＡｋｔｍｐを発現しているＨＵＶＥＣの単層をＡｄΔＮＩ−κＢで感染させ、ＴＮＦ（０．３３〜１００ｎｇ／ｍｌ）に暴露させた。ＡｄΔＮＩ−κＢはＨＵＶＥＣをアポトーシスに感作させたが（ＴＮＦ＞０．１ｎｇ／ｍｌ）、ＡｋｔｍｐはこのようなＨＵＶＥＣを、低用量のＴＮＦでさえも保護しなかった（図４ｅ）。さらに、ＬＹ２９４００２およびワートマニンはＴＮＦに誘導されるＩＣＡＭ−１の発現を阻害せず、これはＨＵＶＥＣ中のＮＦ−κＢ活性化にはＡｋｔシグナリングが必要なかったことを示し（図４ｆ、データは示さず）、球状体中のＩＣＡＭ−１の誘発に矛盾しない（図３ｃ参照）。対照的に、ＡｄΔＮＩ−κＢを用いたＨＵＶＥＣの感染では、ＴＮＦ±ＩＦＮγに応答してＩＣＡＭ−１の発現が抑制された（図４ｆ）。
【０１３０】
総合すると、これらの結果により、ＴＮＦ±ＩＦＮγに暴露させたＨＵＶＥＣの生存には、ＡｋｔおよびＮＦ−κＢの同時活性化が必要であることが実証された。
【０１３１】
実施例５：
インテグリン・ライゲーションはＦＫＨＲおよびＭＤＭ２の活性化を促進し、ＭＥＫ、ｐ３８、ＪＮＫのリン酸化を抑制する
Ａｋｔの抗アポトーシス活性は最初、そのカスパーゼ−９およびＢａｄのリン酸化および阻害に起因しているとされていた（Ｄａｔｔａ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１３、２９０５〜２９２７、１９９９）。しかし、現在では、Ａｋｔ依存性の生存には、フォークヘッド転写因子（ＦＫＨＲ／ＦＫＨＲＬ１）（Ｄａｔｔａ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１３、２９０５〜２９２７、１９９９；Ｂｒｕｎｅｔ他、Ｃｅｌｌ、９６、８５７〜８６８、１９９９）およびＭＤＭ２のリン酸化および阻害、ｐ５３の分解（ＭａｙｏおよびＤｏｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８、１１５９８〜１１６０３、２００１）、ならびにタンパク質キナーゼＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの活性化の抑制（Ｒｏｍｍｅｌ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、１７３８〜１７４１、１９９９；Ｇｒａｔｔｏｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、３０３５９〜３０３６５、２００１；Ｐａｒｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７、２５７３〜２５７８、２００２；ＭａｄｇｅおよびＰｏｂｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、１５４５８〜１５４６５、２０００）が必要であることが示されている。本発明者らは、インテグリン・ライゲーションおよびＡｋｔシグナリングの欠乏が、これらシグナル経路の改変に関連しているかどうかを調査した。本発明者らは、ＴＮＦ／ＩＦＮγに暴露させた接着性ＨＵＶＥＣおよび球状体中のＭＤＭ２、ｐ５３、リン酸化ＦＫＨＲ／ＦＲＫＨＬ１、ＭＥＫ、ｐ３８、−ＪＮＫのレベルを決定した。
【０１３２】
このような球状体は、フィブロネクチン接着性細胞と比べてＦＫＨＲ／ＦＫＲＬ１のリン酸化が不足しており、ＭＤＭ２レベルが低下しており、ｐ５３が蓄積している（図５ａ）。さらに、球状体は、ＭＥＫ、ｐ３８、ＪＮＫの基礎的なリン酸化およびＴＮＦ／ＩＦＮγ誘発性リン酸化が増加している（図５ｂ）。
【０１３３】
これらの結果は、ＦＫＨＲ／ＦＫＨＲＬ１を阻害することによって、ｐ５３レベルを低下させることによって、およびＭＥＫ、ｐ３８、ＪＮＫのリン酸化を抑制することによって生存を促進する点で、Ａｋｔの役割と矛盾しない。
【０１３４】
実施例６：
小さな分子化合物によるインテグリン依存性接着の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで内皮細胞をＴＮＦα誘発性アポトーシスに感作させる
インテグリン・ライゲーションの低下は接着性ＨＵＶＥＣのＴＮＦ誘発性アポトーシスを感作させる
インテグリン・ライゲーションが減少した条件下でＴＮＦに対する感受性が増加することは、球状体に独特なことではない。インテグリン依存性接着を促進する基質であるポリＬ−リシン（ＰＬＬ）（Ｂｅｒｓｈａｄｓｋｙ他、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、６、１２７９〜１２８９、１９９６）上で培養したＨＵＶＥＣはＰＬＬ上で生存し、ＴＮＦ±ＩＦＮγの添加は大量死滅を引き起こし（図６ａ）、これはＡｋｔｍｐの発現により防止された（示さず）。さらに、本発明者らは、フィブロネクチン上へのα５β１／αＶβ３依存性接着の□５□１成分に影響を与えないＥＭＤ１２１９７４（（シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）、αＶβ３／αＶβ５拮抗性環状ペプチド）（Ｄｅｃｈａｎｔｓｒｅｉｔｅｒ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４２、３０３３〜３０４０、１９９９）を用いて、フィブロネクチン上のＨＵＶＥＣ中のインテグリンαＶβ３選択的に阻害した（図６ｂ）。ＴＮＦ／ＩＦＮγおよびＥＭＤ１２１９７４のいずれもが単体では生存に影響を与えなかったが、ＴＮＦ／ＩＦＮγとＥＭＤ１２１９７４に組み合わせて暴露させると（非阻害性対照ペプチドＥＭＤ１３５９８１ではない）、アポトーシスおよび解離が増加し（図６ｃ）、生存度が低下した（図６ｄ）。Ａｋｔｍｐの発現は、フィブロネクチン接着性ＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＥＭＤ１２１９７４に誘発されたアポトーシスから保護した（図６ｅ）。
【０１３５】
実施例７：
インテグリン・ライゲーションの低下は、ＴＮＦリガンドファミリーの様々なデスリガンドに誘発されるアポトーシスに接着性ＨＵＶＥＣを感作させる
インテグリン・ライゲーションの低下の際の、デス受容体シグナリングのプロアポトーシスに対する感受性の増大はＴＮＦに限定されておらず、フィブロネクチン上で培養したＨＵＶＥＣをＥＭＤ１２１９７４の存在下ＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬに暴露させた場合も観察された。デスドメインを欠いた受容体に結合するリガンドであるＬＩＧＨＴは、αＶβ３妨害に相乗効果をまったく示さなかった（図７）。
【０１３６】
実施例８：
ＥＭＤ１２１９７４が確立した腫瘍をＴＮＦの抗腫瘍活性に感作させた
血管新生内皮細胞はαＶβ３インテグリンを発現し、αＶβ３ライゲーションは内皮細胞の生存を促進する（Ｂｒｏｏｋｓ他、Ｃｅｌｌ、７９、１１５７〜１１６４、１９９４；Ｂｒｏｏｋｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、５６９〜５７１、１９９４）。ＥＭＤ１２１９７４がｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞をＴＮＦ誘発性アポトーシスに感作させたという観察は、この化合物がＴＮＦの抗腫瘍活性を増強させることができることを示唆した。この仮定を試験するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦの細胞傷害に耐性の腫瘍である、高度に活動的で血管形成された同系ＢＮ１７５軟組織肉腫を有するラットを処置した（Ｍａｎｕｓａｍａ他、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、６、１７３〜１７７、１９９９）。本発明者らは、分離肢灌流（ＩＬＰ）技術を使用して、ＴＮＦ、ＥＭＤ１２１９７４、またはその組合せを腫瘍を有する肢に投与した。ＴＮＦまたはペプチドのみを用いた治療では、腫瘍の増殖にまったく影響が与えられなかった。対照的に、ＴＮＦとＥＭＤ１２１９７４を組み合わせた投与では、５０％の動物で完全な腫瘍退行、および全体的に有意な腫瘍増殖の低下がもたらされた（図８）。局部または全身性の毒性は、ＥＭＤ１２１９７４／ＴＮＦで治療した動物で観察されず、これは、ＥＭＤ１２１９７４が腫瘍を選択的にＴＮＦ細胞傷害に対して感作させたことを示す。ＢＮ１７５腫瘍細胞はＴＮＦに非感受性であり、高いＭｎ2+の存在下ででもフィブリノーゲンへの接着が弱いこと、およびＥＭＤ１２１９７４などαＶβ３選択的阻害剤に対する感受性が低いことから評価されるように、活性のあるαＶβ３インテグリンを発現しないので（発表していない観察）、相乗強化的な抗腫瘍効果が腫瘍血管形成の破壊を要することが最も可能性が高いと結論づけられる。
【０１３７】
本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏデータをまとめると、このことは、内皮生存を制御するこのシステムにおいてインテグリンαＶβ３がαＶβ１より重要であることを強く支持する。
【０１３８】
実施例９：
ＨＵＶＥＣの培養および電気穿孔
既に記載のようにＨＵＶＥＣを調製し（Ｒｕｅｇｇ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、４、４０８〜４１４、１９９８）、パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）３と７の間で使用した。完全な培地は、Ｍ１９９（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、スイス、バーゼル）、１０％のＦＣＳ（Ｓｅｒｏｍｅｄ、ドイツ、ベルリン）、１２μｇ／ｍｌのウシ脳抽出物（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ−Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、米国メリーランド州ウォーカーズビル）、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＥＧＦ（ｈｕｍａｎ ｒｅｃ． ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、英国ロンドン）、２５Ｕ／ｍｌのヘパリン、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。電気穿孔には、ＨＵＶＥＣを完全培地に再懸濁させ、氷上で５分間、ＤＮＡ（２０μｇの指定したプラスミドおよび５μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１）と共にインキュベートし、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ、スイス、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、）を用いて電気穿孔した。電気穿孔したＨＵＶＥＣを使用前に４８時間培養した。細胞の約８０％が電気穿孔の４０時間後にＥＧＦＰを発現した。
【０１３９】
実施例１０：
球状体の形成
トリプシン処理によってＨＵＶＥＣを回収し、完全培地に１．０×１０6個の細胞／ｍｌで再懸濁させ、事前に１％のＢＳＡでコーティングした１２ウェルの非組織培養プレート（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州ロサンゼルス）に１ｍｌ／ウェルで播種した。凝集体の調査には、２００μｌの細胞懸濁液を１％のＢＳＡでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉｓｏｒｐＩＩ、ＮＵＮＣ、デンマーク、ロスキレ）のマイクロウェルに、単独で、あるいはｍＡｂｓ（１０μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、またはＣａ2+／ＥＤＴＡ（１０／５ｍＭ）の存在下で播種した。球状体の形成を６時間および１６時間に評価した。Ｔｅｌｅｖａｌ３１顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ、スイス、チューリッヒ）を用いてマイクログラフを記録した。
【０１４０】
実施例１１：
球状体の形態学分析
形態学の評価のために、球状体をＥｐｏｎ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ）に包埋し、厚い部分を１％のメチレン／アズールブルーを用いて染色した。免疫染色には、凍結させた球状体の切片を４％の（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｓ、スイス、ブーフス）ホルムアルデヒド中で固定した。１％のＢＳＡでブロックした後、切片を連続的に１時間、一次ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）およびＣｙａｎ３で標識したＧａＭ抗血清（米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）と共にインキュベートした。ＴＵＮＥＬ反応には、凍結させた球状体切片を４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、記載のように処理した（Ｒｕｅｇｇ他、Ｉ．ｃ．）。
【０１４１】
全ＤＮＡ含量のために、ヨウ化プロピジウムを用いて球状体を対比染色した。
【０１４２】
ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ、英国Ｍｉｌｈａｍ）を備えた落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）、またはレーザー共焦点顕微鏡（ＬＳＭ４１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）を用いて切片を視察した。アポトーシス指数は、緑（断片化されたＤＮＡのＴＵＮＥＬ染色）と赤（全ＤＮＡによるヨウ化プロピジウム染色）のピクセルの比を計算することによって決定した。
【０１４３】
各条件で分析した球状体の数は、Ｃ、３１；Ｔ、２１；ＴＩ、１２であった。培養物中のアポトーシス細胞の検出には、全培養物または回収した浮遊細胞にＤＮＡ染料ＹｏＰｒｏ−１（２５０ｎＭ）を加えた（Ｄｅｌｈａｓｅ，Ｍ．、Ｌｉ，Ｎ．およびＫａｒｉｎ，Ｍ．、「Ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．」、Ｎａｔｕｒｅ、４０６、３６７〜３６８、２０００）。培養物は、倒立蛍光顕微鏡観察（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ、スイス、Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ）によって視察した。電子顕微鏡観察には、２．５％のグルタルアルデヒドを用いて１００ｍＭのカコジレート緩衝液中で球状体を固定し、１％のＯｓＯ4中で後固定した。細胞をエタノール中で脱水し、Ｅｐｏｎに包埋した。Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１０透過型電子顕微鏡を使用して、超薄の切片を検査した。
【０１４４】
実施例１２：
細胞の生存および増殖
生存度には、１％のＢＳＡでコーティングした２４ｍｍのウェルに１×１０6個の細胞／ｍｌでプレートしたＨＵＶＥＣ球状体、または３μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングした３５ｍｍの非組織培養プレート（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェル中の４×１０5個の細胞を、ＴＮＦα（２００ｎｇ／ｍｌ＝１０4Ｕ／ｍｌ）±ＩＦＮγ（３３０ｎｇ／ｍｌ＝１０4Ｕ／ｍｌ）を用いて刺激した。キナーゼ阻害剤またはＥＭＤペプチドを以下の濃度、すなわち、ワートマニン、１００ｎＭ；ＬＹ２９４００２、２０μＭ；ＥＭＤペプチド、３００μＭで、それぞれ刺激の１時間または４時間前に加えた。１６時間の培養後、５ｍＭのＥＤＴＡを用いて（球状体、２０℃で５分間）、または１×トリプシン（接着培養物）を用いて解離することによって細胞を収穫し、洗浄し、完全培地に４×１０5個の細胞／ｍｌで再懸濁させ、マイクロタイター組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に１００μｌ／ウェルでアリコートし、３つ組、１：２ステップで滴定した。４８時間後に、最後の４時間の間のＭＴＴ変換を測定することによって相対的な細胞数を評価した。結果を５４０ｎｍでのＯ．Ｄ．値で示し（Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔ、米国コネチカット州メリディアン）、これは３つ組のウェルの平均値±標準偏差を示す。
【０１４５】
実施例１３：
細胞脱離アッセイ
１μｇ／ウェルのフィブロネクチンまたは０．５％のゼラチンを用いて、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＩＩ ＥＬＩＳＡプレートを終夜、４℃、ＰＢＳ中でコーティングした。コーティングしたウェルを洗浄し、１％のＢＳＡを用いて２時間、３７℃でブロックし、使用前に洗浄した。ＦＣＳなしの基礎培地中で２×１０4ｃ／ウェルを加え、遠心分離（４０×ｇ）によって手短に沈降させた。段階的な濃度でペプチドを加える前に、細胞を３７℃で２時間接着させた。２時間後、温かいＰＢＳを用いてウェルを洗浄し、接着した細胞を２％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．５％のクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ）で染色し、６２０ｎｍでのＯ．Ｄ．読み取り値によって定量した（Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔ）。結果をＯ．Ｄ．値として示し、これは、２つ組ウェルの平均±特定の接着の標準偏差（＝ＥＣＭタンパク質への接着マイナスＢＳＡへの接着）を表す。
【０１４６】
実施例１４：
フロー・サイトメトリー法
ＨＵＶＥＣおよびＥＧＦＰ発現の間接的な免疫染色を、以下の標準プロトコルに従って実施した（Ｒｕｅｇｇ他、Ｉ．ｃ．）。ヨウ化プロピジウム染色によって死亡細胞を排除した。すべての試料は、ＦＡＣＳｃａｎＩＩ（登録商標）およびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて分析した。
【０１４７】
実施例１５：
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＨＵＶＥＣ（各条件１×１０6個の細胞）を記載のように調製し（Ｃａｉ他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７２、９６〜１０１、１９９７）、Ｔ４キナーゼで末端を［γ−３２Ｐ］標識したヒトＨＩＶ末端反復配列のｋＢ配列を含む合成二本鎖３１量体のオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。ＮＦ−κＢが３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドに結合したことは、ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって決定された。
【０１４８】
実施例１６：
ウェスタン・ブロッティング
５０μｌの細胞溶解物上清（２５０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に１×１０6）を、７．５％〜１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェットブロット（Ｂｉｏ Ｒａｄ）によってＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、スイス、フォルケツヴィル）に移した。膜を連続的に、５％の乾燥乳中で１時間、一次抗体と共に終夜４℃で、およびＨＲＰ標識ＧａＭ（Ｄａｋｏ、スイス、ツーク）と共に１時間インキュベートした。検出にはＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した。再プロービングには、膜を２％のＳＤＳ、５０ｍＭのトリスおよび１００ｍＭのＢＭＥ中、５０℃で３０分間ストリップした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも（ｉ）抗血管新生剤、および（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）またはＴＮＦαの生物活性を有する分子を、治療有効量において、場合によっては、製薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を共に含んでなる、医薬組成物。
【請求項２】
前記抗血管新生剤は、インテグリン（受容体）阻害剤／拮抗剤、またはＶＥＧＦ（受容体）阻害剤／拮抗剤であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記血管新生剤は、インテグリン受容体阻害剤／拮抗剤であることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記インテグリン受容体阻害剤／拮抗剤は、ＲＧＤ含有の直鎖または環状ペプチドであることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＲＧＤ含有ペプチドは、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）であることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記血管新生剤は、インテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体に対して結合する、抗体あるいは、免疫療法上有効な、その断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記血管新生剤およびＴＮＦαは、互いに連結されて、１つの融合分子を形成していることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
細胞傷害剤および／または化学療法剤を少なくとも１つ、さらに含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記細胞傷害剤は、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）であることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記化学療法化合物は、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル（タキソール）、ブレオマイシンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＥｒｂＢ受容体・チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、または免疫療法上活性を示す、その断片であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
（ｉ）少なくとも１つの抗血管新生剤、
（ｉｉ）ＴＮＦαまたはＴＮＦαの生物活性を有する分子、および
場合によっては、（ｉｉｉ）さらに細胞傷害剤および／または化学療法剤を含んでなるパッケージを含む製薬キット。
【請求項１４】
（ｉ）インテグリン受容体阻害剤／拮抗剤
（ｉｉ）ＴＮＦα
（ｉｉｉ）ＩＦＮγ
を含んでなる、請求項１３に記載の製薬キット。
【請求項１５】
（ｉ）シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）
（ｉｉ）ＴＮＦα
（ｉｉｉ）ＩＦＮγ
を含んでなる、請求項１４に記載の製薬キット。
【請求項１６】
前記パッケージ中において、前記製薬的に活性な薬剤複数は、個別の容器内にて提供されることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の製薬キット。
【請求項１７】
腫瘍ならびに腫瘍転移を治療するための医薬品または医薬組成物の製造を目的とする、請求項１〜１２のいずれか一項に定義される医薬組成物、あるいは、請求項１３〜１６のいずれか一項に定義される製薬キットの使用。
【請求項１８】
（ｉ）抗血管新生剤、および
（ｉｉ）ＴＮＦα
の治療有効量を、同時または連続的に、該個体に対して投与することを含む、個体における腫瘍または腫瘍転移を治療する方法。
【請求項１９】
細胞傷害剤および／または化学療法剤の治療有効量を、前記個体に対してさらに投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞傷害剤は、ＩＦＮγであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化学療法化合物は、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル（タキソール）、ブレオマイシンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）
（ｉｉ）ＴＮＦα、および
（ｉｉｉ）ＩＦＮγ
の治療有効量を、同時または連続的に、前記個体に対して投与することを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記個体に対して、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤の治療有効量をさらに投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、または免疫療法上活性な、それらの断片であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも（ｉ）抗血管新生剤、および（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）またはＴＮＦαの生物活性を有する分子を、治療有効量において、場合によっては、製薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を共に含んでなる、医薬組成物。
【請求項２】
前記抗血管新生剤は、インテグリン（受容体）阻害剤／拮抗剤、またはＶＥＧＦ（受容体）阻害剤／拮抗剤であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記血管新生剤は、インテグリン受容体阻害剤／拮抗剤であることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記インテグリン受容体阻害剤／拮抗剤は、ＲＧＤ含有の直鎖または環状ペプチドであることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＲＧＤ含有ペプチドは、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）であることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記血管新生剤は、インテグリン受容体またはＶＥＧＦ受容体に対して結合する、抗体あるいは、免疫療法上有効な、その断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記血管新生剤およびＴＮＦαは、互いに連結されて、１つの融合分子を形成していることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
細胞傷害剤および／または化学療法剤を少なくとも１つ、さらに含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記細胞傷害剤は、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）であることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記化学療法化合物は、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル（タキソール）、ブレオマイシンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＥｒｂＢ受容体・チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、または免疫療法上活性を示す、その断片であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
（ｉ）少なくとも１つの抗血管新生剤、
（ｉｉ）ＴＮＦαまたはＴＮＦαの生物活性を有する分子、および
場合によっては、（ｉｉｉ）さらに細胞傷害剤および／または化学療法剤を含んでなるパッケージを含む製薬キット。
【請求項１４】
（ｉ）インテグリン受容体阻害剤／拮抗剤
（ｉｉ）ＴＮＦα
（ｉｉｉ）ＩＦＮγ
を含んでなる、請求項１３に記載の製薬キット。
【請求項１５】
（ｉ）シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）
（ｉｉ）ＴＮＦα
（ｉｉｉ）ＩＦＮγ
を含んでなる、請求項１４に記載の製薬キット。
【請求項１６】
前記パッケージ中において、前記製薬的に活性な薬剤複数は、個別の容器内にて提供されることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の製薬キット。
【請求項１７】
腫瘍ならびに腫瘍転移を治療するための医薬品または医薬組成物の製造を目的とする、請求項１〜１２のいずれか一項に定義される医薬組成物、あるいは、請求項１３〜１６のいずれか一項に定義される製薬キットの使用。
【請求項１８】
（ｉ）抗血管新生剤、および
（ｉｉ）ＴＮＦα
の治療有効量を、同時または連続的に、該個体に対して投与することを含む、個体における腫瘍または腫瘍転移を治療する方法。
【請求項１９】
細胞傷害剤および／または化学療法剤の治療有効量を、前記個体に対してさらに投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞傷害剤は、ＩＦＮγであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化学療法化合物は、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル（タキソール）、ブレオマイシンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）
（ｉｉ）ＴＮＦα、および
（ｉｉｉ）ＩＦＮγ
の治療有効量を、同時または連続的に、前記個体に対して投与することを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記個体に対して、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ・ファミリーの阻害剤の治療有効量をさらに投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、または免疫療法上活性な、それらの断片であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図６ｅ】
【図７】
【図８】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図６ｅ】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２５６３７３（Ｐ２００９−２５６３７３Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８１４４５（Ｐ２００９−１８１４４５）
【出願日】平成２１年８月４日（２００９．８．４）
【分割の表示】特願２００２−５８２９７８（Ｐ２００２−５８２９７８）の分割
【原出願日】平成１４年４月１８日（２００２．４．１８）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月４日（２００９．８．４）
【分割の表示】特願２００２−５８２９７８（Ｐ２００２−５８２９７８）の分割
【原出願日】平成１４年４月１８日（２００２．４．１８）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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